КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ УВЕИТА Российский патент 2021 года по МПК A61K9/00 A61K31/5375 A61K31/5377 A61K31/496 A61K31/397 A61P27/02 

Область техники

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для предупреждения или лечения увеита, содержащей соединение, формулы I, его оптический изомер или его фармацевтически приемлемую соль в качестве активного компонента, а также к способу лечения с использованием соединения, и к применению соединения для производства лекарственного средства для лечения увеита.

Уровень техники

Сосудистая оболочка представляет собой средний слой внутри самого наружного слоя глазного яблока, который представляет собой роговицу и склеру, где сосудистая оболочка состоит из радужной оболочки, ресничного тела и хориоидной оболочки, и воспаление, развивающееся в ней, определяют как увеит. Сосудистая оболочка является подверженной воспалению, поскольку сосудистая оболочка имеет обилие кровеносных сосудов и много соединительной ткани, где его различные симптомы возникают в зависимости от различных причин и степени воспаления. В качестве репрезентативного симптома увеита известно, что происходит снижение остроты зрения, миодезопсия, боль, кровотечение, слезоотделение, ослепление и т.п.

Увеит классифицируют как передний увеит, промежуточный увеит, задний увеит и тотальный увеит в зависимости от положения воспаления. Также увеит подразделяют на инфекционный увеит, вызываемый вирусами или бактериями, и неинфекционный увеит в результате нарушения иммунной системы, где большинство таких случаев увеита вызываются иммунологическими факторами. Однако на настоящий момент точный патогенез увеита еще не описан.

В качестве репрезентативного терапевтического средства от увеита используют стероиды или иммунодепрессанты. Однако стероидный лосьон в виде капель для глаз вызывает серьезные побочные эффекты, такие как катаракта, повышение внутриглазного давления, усиление воспаления и т.д., поскольку стероидный лосьон в виде глазных капель используют в настолько высокой дозировке, чтобы его лекарственное вещество могло проникать в ткань сосудистой оболочки. Также длительное применение пероральных стероидов может приводить к различным побочным эффектам, таким как остеопороз, остеонекроз, подавление гипоталамо-гипофизарно-надпочечниковой оси, усиление инфекции, нарушение метаболизма, электролитов и пищеварительной системы и т.д. С другой стороны, иммунодепрессанты, которые используют в качестве альтернативного стероидам способа терапии, также имеют вероятность возникновения побочных эффектов, таких как подавление функции костного мозга, нарушение почечных и печеночных функций и т.д. Таким образом, несмотря на достаточное лечение стероидами и иммунодепрессантами, в жизни пациентов возникает множество проблем. Например, у 5-10% пациентов в итоге возникает слепота и т.д. Таким образом, существует срочная потребность в разработке терапевтического средства от увеита, которое хорошо проникает в целевую ткань с меньшими побочными эффектами.

Для устранения этих недостатков авторы настоящего изобретения приложили усилия для разработки терапевтического средства против увеита и, таким образом, идентифицировали, что соединение в соответствии с настоящим изобретением можно с пользой использовать для предупреждения или лечения увеита и осуществили настоящее изобретение.

Документы уровня техники

Патентный документ

Публикация заявки на патент Кореи №2014-0128886

Подробное описание изобретения

Техническая проблема

Задачей настоящего изобретения является предоставление фармацевтической композиции для предупреждения или лечения увеита, содержащей соединение, соответствующее следующей формуле I, его оптический изомер или его фармацевтически приемлемую соль в качестве эффективного компонента.

Другой задачей настоящего изобретения является предоставление способа лечения увеита, где способ включает введение терапевтически эффективного количества указанного соединения.

Другой задачей настоящего изобретения является обеспечение применения соединения для производства лекарственного средства для лечения увеита.

Техническое решение

Оно подробно описано ниже. Между тем, каждое описание и форма варианта осуществления, раскрытые в рамках настоящего изобретения, могут быть применены к другим описаниям и формам вариантов его осуществления, соответственно. Иными словами, все комбинации различных элементов, раскрытых в рамках настоящего изобретения, входят в объем настоящего изобретения. Также не следует считать, объем настоящего изобретения ограничивается конкретным описанием, приведенным ниже.

Настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции для предупреждения или лечения увеита, содержащей соединение, соответствующее следующей формуле I, его оптический изомер или его фармацевтически приемлемую соль в качестве эффективного компонента:

[Формула I]

,

где в формуле I,

A представляет собой ,

каждый из Xa и Xb независимо представляет собой CH или N,

каждый из L₁ и L₂ независимо представляет собой водород, галоген, -CF₃ или -C_1-3 прямой или разветвленный алкил,

Q представляет собой C(=O), S(=O)₂, S(=O) или C(=NH),

Y выбран из следующей группы:

,

M представляет собой C, N, O, S или S(=O)₂, где в этом случае, когда M представляет собой C, l и m равны 1; когда M представляет собой N, l равен 1 и m равен 0; и когда M представляет собой O, S или S(=O)₂, l и m равны 0,

каждый из R_a1 и R_a2 независимо представляет собой водород; гидрокси; -C_1-4 прямой или разветвленный алкил, который является незамещенным или замещен по меньшей мере одним галогеном; -C_1-4 прямой или разветвленный спирт; бензгидрил; -C_1-4 прямой или разветвленный алкил, который замещен насыщенным или ненасыщенным 5-7-членным гетероциклическим соединением, содержащим 1-3 гетероатома из N, O или S в качестве членов кольца, где в этом случае гетероциклическое соединение может быть незамещенным или по меньшей мере один атом водорода может быть необязательно замещен OH, OCH₃, CH₃, CH₂CH₃ или галогеном; насыщенное или ненасыщенное 5-7-членное гетероциклическое соединение, содержащее 1-3 гетероатома из N, O или S в качестве представителей кольца, где в этом случае гетероциклическое соединение может быть незамещенным или по меньшей мере один атом водорода может быть необязательно замещен OH, OCH₃, CH₃, CH₂CH₃ или галогеном; фенил, где он является незамещенным или по меньшей мере один атом водорода замещен галогеном, C_1-4 алкокси, C_1-2 алкилом или гидрокси; бензил, где он является незамещенным или по меньшей мере один атом водорода замещен галогеном, C_1-4 алкокси, C_1-2 алкилом или гидрокси; -S(=O)₂CH₃; галоген; -C_1-6 прямой или разветвленный алкокси; -C_2-6 алкоксиалкил; -C(=O)R_x, где R_x представляет собой прямой или разветвленный C_1-3 алкил или C_3-10 циклоалкил; , где каждый из R_c и R_d независимо представляет собой водород, C_1-3 прямой или разветвленный алкил; и или ,

n представляет собой целое число, равное 0, 1 или 2,

R_b представляет собой водород; гидрокси; -C_1-6 прямой или разветвленный алкил, где он является незамещенным или по меньшей мере один атом водорода замещен галогеном; -C(=O)CH₃; -C_1-4 прямой или разветвленный гидроксиалкил; -C_1-6 прямой или разветвленный алкокси; -C_2-6 прямой или разветвленный алкоксиалкил; -CF₃; галоген или ,

каждый из R_e и R_f независимо представляет собой водород или -C_1-3 прямой или разветвленный алкил,

Z выбран из следующей группы:

каждый из P_a и P_b независимо представляет собой ; водород; гидрокси; -C_1-4 прямой или разветвленный алкил, где он является незамещенным или по меньшей мере один атом водорода замещен галогеном; галоген; -CF₃; -OCF₃; -CN; -C_1-6 прямой или разветвленный алкокси; -C_2-6 прямой или разветвленный алкилалкокси; -CH₂F или -C_1-3 спирт,

где представляет собой фенил, пиридин, пиримидин, тиазол, индол, индазол, пиперазин, хинолин, фуран, тетрагидропиридин, пиперидин или кольцо, выбранное из следующей группы:

каждый из x, y и z независимо представляет собой целое число, равное 0 или 1,

каждый из R_g1, R_g2 и R_g3 независимо представляет собой водород; гидрокси; -C_1-3 алкил; -CF₃; -C_1-6 прямой или разветвленный алкокси; -C_2-6 прямой или разветвленный алкилалкокси; -C(=O)CH₃; -C_1-4 прямой или разветвленный гидроксиалкил; -N(CH₃)₂; галоген; фенил; -S((=O)₂)CH₃; или выбран из следующей группы:

Соединение, соответствующее формуле I, в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой соединение, соответствующее следующей формуле Ia:

[Формула Ia]

где

каждый из L₁ и L₂ независимо представляет собой водород или галоген,

Y представляет собой , или ,

Z представляет собой фенил или пиридинил, где по меньшей мере один атом водорода фенила или пиридинила может быть замещен галогеном, CF₃ или CF₂H.

В соответствии с конкретным вариантом осуществления настоящего изобретения соединение, соответствующе формуле Ia выше, представляет собой соединение, описанное в таблице ниже:

Таблица 1

В рамках настоящего изобретения, соединение, соответствующее формуле I выше, можно получать способом, описанным в публикации нерассмотренной патентной заявки Кореи №2014-0128886, но он не ограничивается этим.

В рамках настоящего изобретения фармацевтически приемлемая соль означает соль, обычно используемую в медицинской промышленности, например, соль неорганического иона, полученную из кальция, калия, натрия, магния и т.п.; соль неорганической кислоты, полученную из хлористоводородной кислоты, азотной кислоты, фосфорной кислоты, бромной кислоты, йодной кислоты, перхлорной кислоты, серной кислоты и т.п.; соль органической кислоты, полученную из уксусной кислоты, трифторуксусной кислоты, лимонной кислоты, малеиновой кислоты, янтарной кислоты, щавелевой кислоты, бензойной кислоты, виннокаменной кислоты, фумаровой кислоты, миндальной кислоты, пропионовой кислоты, лимонной кислоты, молочной кислоты, гликолевой кислоты, глюконовой кислоты, галактуроновой кислоты, глутаминовой кислоты, глутаровой кислоты, глюкуроновой кислоты, аспарагиновой кислоты, аскорбиновой кислоты, угольной кислоты, ванилиновой кислоты, йодистоводородной кислоты и т.д.; соль сульфоновой кислоты, полученную из метансульфоновой кислоты, этансульфоновой кислоты, бензолсульфоновой кислоты, п-толуолсульфоновой кислоты, нафталинсульфоновой кислоты и т.п.; соль аминокислоты, полученную из глицина, аргинина, лизина и т.д.; соль амина, полученную из триметиламина, триэтиламина, аммиака, пиридина, пиколина и т.д., и т.п., однако типы солей в рамках настоящего изобретения не ограничиваются этими перечисленными солями.

Как используют в рамках изобретения, термин “увеит” означает воспаление, развившееся во внутренней части глаза, в частности, воспаление, развившееся в среднем слое (сосудистой оболочке) глаза. Более конкретно, увеит в соответствии с настоящим изобретением включает: передний увеит, который представляет собой воспаление передней части увеальной системы, такое как воспаление радужной оболочки (ирит) и воспаление радужной оболочки и ресничного тела (циклит); промежуточный увеит, который представляет собой воспаление стекловидного тела (периферический увеит или хронический циклит); и задний увеит, который представляет собой воспаление части увеальной системы за кристалликом глаза, такое как воспаление хориоидной оболочки (хориоидит) и воспаление хориоидной оболочки и сетчатки (хориоретинит), а также тотальный увеит, который представляет собой увеит, поражающий всю увеальную систему. Также в соответствии с настоящим изобретением увеит включает инфекционный увеит, вызываемый вирусами или микробами, и неинфекционный увеит в результате аутоиммунного заболевания.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения было идентифицировано, что соединения 255, 280, 374, 416, 461, 476, 500, 530 или 532, соответствующие формуле Ia, имели превосходный эффект подавления продуцирования in vitro молекул воспаления, таких как TNFα и т.д. (фиг. 1), подавления пролиферации реактивных T-клеток (фиг. 2) и улучшения функции регуляторных T-клеток (фиг. 3).

Также было идентифицировано, что соединение 374 в соответствии с настоящим изобретением имеет превосходный эффект снижения очага повреждения увеита в модели индуцированного увеита на животных (фиг. 4-6), ингибирования инфильтрации воспалительных клеток (фиг. 7-10), ингибирование экспрессии воспалительных цитокинов в селезенке и областях воспаления (фиг. 11 и 12), и уменьшения количества иммунных клеток в сетчатке и лимфатических узлах (фиг. 13-21).

Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением, кроме того, может содержать по меньшей мере один тип фармацевтически приемлемого носителя, в дополнение к соединению, соответствующему формуле I выше, его оптическому изомеру или его фармацевтически приемлемой соли для цели введения. В качестве фармацевтически приемлемого носителя можно использовать физиологический раствор, стерилизованную воду, раствор Рингера, буферный солевой раствор, раствор декстрозы, раствор мальтодекстрина, глицерин, этанол и комбинацию по меньшей мере из одного их компонента, где также при необходимости могут быть добавлены другие общепринятые добавки, такие как антиоксидант, буферный раствор, бактериостатическое средство и т.д. Также фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может быть составлена в виде инъекционной дозированной формы, такой как водный раствор, суспензия, эмульсия и т.д., пилюля, капсула, гранула или таблетка, таким образом, чтобы к ним дополнительно добавлять разбавитель, диспергирующее средство, поверхностно-активное вещество, связующее вещество и смазывающее вещество. Таким образом, композиция в соответствии с настоящим изобретением может представлять собой пластырь, жидкое лекарственное средство, пилюлю, капсулу, гранулу, таблетку, суппозиторий и т.д. Эти препараты могут быть составлены посредством общепринятого способа, используемого для составления в области техники, к которой относится настоящее изобретение, в зависимости от каждого заболевания и/или компонента, или способа, описанного в Remington's Pharmaceutical Science (последняя версия), Mack Publishing Company, Easton PA.

Неограничивающим примером препарата для перорального введения с использованием фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением может быть таблетка, троше, пастилка, растворимая в воде суспензия, масляная суспензия, готовый порошок, гранула, эмульсия, твердая капсула, мягкая капсула, сироп, эликсир и т.п. Для составления фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением в препарат для перорального введения также можно использовать связующее вещество, такое как лактоза, сахароза, сорбит, маннит, крахмал, амилопектин, целлюлоза, желатин и т.п.; эксципиент, такой как дикальцийфосфат и т.д.; дезинтегрирующее средство, такое как кукурузный крахмал, сладкий картофельный крахмал и т.п.; смазывающее вещество, такое как стеарат магния, стеарат кальция, стеарилфумарат натрия, полиэтиленгликоль, воск и т.п., и т.д., и также можно использовать подсластитель, вкусовую добавку, сироп и т.д. Более того, в случае капсулы, кроме того, можно использовать жидкий носитель, такой как жирное масло и т.д., в дополнение к вышеупомянутым материалам.

Неограничивающим примером парентерального препарата с использованием фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением может быть инъекционный раствор, суппозиторий, порошок для ингаляции, препарат аэрозоля для распыления, мазь, порошок для нанесения, масло, крем и т.д. Для составления фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением в препарат для парентерального введения можно использовать стерилизованный водный раствор, неводный растворитель, суспензию, эмульсию, лиофилизированный препарат, наружный препарат и т.д. В качестве указанного неводного растворителя и суспензии можно использовать растительное масло, такое как пропиленгликоль, полиэтиленгликоль и оливковое масло; инъекционный сложный эфир, такой как этилолеат; и т.д, например, можно использовать глазной раствор или эмульсию, глазной гель, глазную мазь или масляный лосьон, которые содержат композицию глазных капель, но не ограничиваясь ими.

Фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением можно вводить перорально или парентерально, предпочтительно парентерально, например, посредством глазных капель или внутрибрюшинно, но не ограничиваясь ими.

Если фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением используют в форме композиции глазных капель, указанную композицию глазных капель можно получать путем суспендирования соединения формулы I в соответствии с настоящим изобретением, его оптического изомера или его фармацевтически приемлемой соли в стерильном водном растворе, например, солевом растворе, буферном растворе и т.д., или путем составления вышеупомянутых композиций в форме растворимого порошка перед применением. В композицию глазных капель могут быть включены другие добавки, например, изотоническое вещество (например, хлорид натрия, и т.д.), буферное вещество (например, борная кислота, гидрофосфат натрия, дигидрофосфат натрия, и т.д.), консервант (например, хлорид бензалкония, хлорид бензэтония, хлорбутанол и т.д.), загуститель (например, сахара, например, лактоза, маннит, мальтоза, и т.д.; например, гиалуроновая кислота или ее соли, например, гиалуронат натрия, гиалуронат калия и т.д.; например, мукополисахариды, например, хондроитинсульфат и т.д.; например, полиакрилат натрия, карбоксивиниловый полимер, сшитая соль полиакриловой кислоты и т.д.).

В соответствии с иллюстративным вариантом осуществления настоящего изобретения, было идентифицировано, что соединение, соответствующее формуле I, обеспечивает превосходный ингибиторный эффект в отношении областей воспаления и системного воспаления, когда его закапывают в глаз мыши с индуцированным увеитом, и, таким образом, демонстрирует выраженный эффект в отношении лечения увеита.

Суточная дозировка соединения, соответствующего формуле I, в соответствии с настоящим изобретением, его оптического изомера или его фармацевтически приемлемой соли может находиться в диапазоне, например, приблизительно от 0,1 до 10000 мг/кг, в диапазоне приблизительно от 1 до 8000 мг/кг, в диапазоне приблизительно от 5 до 6000 мг/кг, или в диапазоне приблизительно от 10 до 4000 мг/кг, предпочтительно в диапазоне приблизительно от 50 до 2000 мг/кг, но не ограничиваясь ими, где такую дозировку также можно вводить один раз в сутки или разделять для введения несколько раз в сутки.

Фармацевтически эффективное количество и эффективная дозировка фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением могут быть диверсифицированы посредством способа составления фармацевтической композиции в виде препарата, пути введения, времени введения и/или способа введения и т.д., и также они могут быть диверсифицированы в зависимости от различных факторов, включая тип и степень реакций, которые намереваются достигнуть посредством введения фармацевтической композиции, тип индивидуума, которому намереваются проводить введение, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, симптом или тяжесть заболевания, пол, рацион, экскрецию компонент других лекарственных композиций, используемых вместе в то же время или в другое время для соответствующего индивидуума, и т.д., а также других известных факторов, хорошо известных в области медицины, где специалисты в данной области могут без труда определить и назначить дозировку, эффективную для данного лечения.

В случае введения фармацевтической композиции в соответствии с настоящим изобретением, ее можно вводить один раз в сутки или разделять для введения несколько раз в сутки. Фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением можно вводить в качестве отдельного терапевтического средства или в комбинации с другими терапевтическими средствами, а также ее можно вводить последовательно или одновременно с общепринятым терапевтическим средством. Учитывая все факторы, описанные выше, фармацевтическую композицию в соответствии с настоящим изобретением можно вводить в количестве, которое может демонстрировать максимальный эффект при минимальном количестве без какого-либо побочного эффекта, где такое количество может быть без труда определено специалистами в области, к которой относится настоящее изобретение.

Фармацевтическая композиция в соответствии с настоящим изобретением может демонстрировать превосходный эффект, когда ее используют отдельно, однако, кроме того, ее можно использовать в комбинации с различными способами, такими как гормональная терапия, медикаментозное лечение и т.д. для повышения терапевтической эффективности.

Настоящее изобретение также относится к способу лечения увеита, где способ включает введение терапевтически эффективного количества соединения, соответствующего формуле I выше, его оптического изомера или его фармацевтически приемлемой соли индивидууму, нуждающемуся в этом.

Как используют в рамках изобретения, термин "терапевтически эффективное количество" относится к количеству соединения, соответствующего формуле I выше, его оптическому изомеру или его фармацевтически приемлемой соли, которое является эффективным для лечения увеита.

В способе лечения в соответствии с настоящим изобретением подходящую общую суточную дозировку соединения, соответствующего формуле I выше, его изомера или его фармацевтически приемлемой соли может определять лечащий врач в рамках корректного медицинского решения, и она может находиться в диапазоне, например, приблизительно от 0,1 до 10000 мг/кг, в диапазоне приблизительно от 1 до 8000 мг/кг, в диапазоне приблизительно от 5 до 6000 мг/кг, или в диапазоне приблизительно от 10 до 4000 мг/кг, и предпочтительно такую дозу в диапазоне приблизительно 50-2000 мг/кг можно вводить один раз в сутки или разделять для введения несколько раз в сутки. Однако для цели настоящего изобретения предпочтительно, чтобы определенное терапевтически эффективное количество для определенного пациента применялось по-разному в зависимости от различных факторов, включающих тип и степень реакций, которые намереваются достигнуть, конкретную композицию, включая в некоторых случаях наличие или отсутствие применения других препаратов, возраст пациента, массу тела, общее состояние здоровья, пол и рацион, время введения, путь введения и скорость секреции композиции, период лечения и лекарственное средство, используемое вместе или одновременно с конкретной композицией, а также другие сходные факторы, хорошо известные в области медицины.

Способ лечения увеита в соответствии с настоящим изобретением включает не только борьбу с самим заболеванием перед проявлением его симптомов, но также ингибирование или предотвращение таких симптомов путем введения соединения, соответствующего формуле I выше, его оптического изомера или его фармацевтически приемлемой соли. При управлении течением заболевания профилактическая или терапевтическая доза определенного активного компонента может варьироваться в зависимости от характеристик и тяжести заболевания или состояния, и пути, посредством которого активный компонент вводят. Дозы и их частота могут варьироваться в зависимости от возраста, массы тела и реакций конкретного пациента. Подходящая доза и способ применения могут быть без труда выбраны специалистами в данной области, естественно, с учетом таких факторов. Также способ лечения увеита в соответствии с настоящим изобретением, кроме того, может включать введение терапевтически эффективной дозы дополнительного активного вещества, которое может быть полезным при лечении заболевания, вместе с соединением, соответствующим формуле I выше, его оптического изомера или его фармацевтически приемлемой соли, где дополнительное активное вещество может демонстрировать синергический эффект или аддитивный эффект вместе с соединением формулы I выше, его оптическим изомером или его фармацевтически приемлемой солью.

Настоящее изобретение также относится к применению соединения формулы I выше, его оптического изомера или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного средства для лечения увеита.

Соединение, соответствующее формуле I, выше, его оптический изомер или его фармацевтически приемлемую соль, для изготовления лекарственного средства можно комбинировать с фармацевтически приемлемым адъювантом, разбавителем, носителем и т.д., или можно получать в виде составного средства с другими активными веществами, таким образом, обеспечивая синергическое действие.

Положения, упомянутые в отношении фармацевтической композиции по изобретению, способа лечения и применения, применимы в равной степени, если они не противоречат друг другу.

Преимущественные эффекты

Фармацевтическая композиция, содержащая соединение, соответствующая формуле I в соответствии с настоящим изобретением, его оптический изомер или его фармацевтически приемлемую соль, может демонстрировать превосходный эффект лечения увеита, так что фармацевтическую композицию можно широко использовать для предупреждения или лечения увеита.

Краткое описание чертежей

На фиг. 1 представлены результаты определения эффекта соединения по изобретению на подавление секреции TNFα.

На фиг. 2 представлены результаты определения эффекта соединения по изобретению на подавление пролиферации реактивных T-клеток.

На фиг. 3 представлены результаты определения эффекта соединения по изобретению на изменение функции регуляторных T-клеток.

На фиг. 4 представлен график оценки клинической степени увеита на сетчатке мышей с экспериментальным аутоиммунным увеитом (EAU) (*: p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001 согласно критерию множественных сравнений Тьюки).

На фиг. 5 представлены изображения для определения клинических изменений в сетчатке мыши с EAU.

На фиг. 6 представлены результаты окрашивания гематоксилином и эозином (H&E) сетчатки мыши с EAU.

На фиг. 7 представлены результаты флуоресцентного окрашивания на CD3 и B220 в сетчатке мыши с EAU.

На фиг. 8 представлены результаты иммунофлуоресцентного окрашивания на HDAC6 и CD4 в сетчатке мыши с EAU.

На фиг. 9 представлены результаты иммунофлуоресцентного окрашивания на HDAC6 и B220 в сетчатке мыши с EAU.

На фиг. 10 представлены результаты иммунофлуоресцентного окрашивания на HDAC6 и α-тубулин в сетчатке мыши с EAU.

На фиг. 11 представлены результаты проведения ELISA на IFN-γ и IL-17A в ткани селезенки мыши с EAU (*: p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001 согласно критерию множественных сравнений Тьюки).

На фиг. 12 представлены результаты проведения ПЦР в реальном времени на HDAC, IL-β, IFN-γ, IL-17 и TNF-α в глазной ткани мыши с EAU (V: носитель; C: CKD4; *: p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001 согласно критерию множественных сравнений Тьюки).

На фиг. 13 представлены результаты проведения FACS на иммунных клетках IFN-γ(+)/CD4(+) в ткани сетчатки мыши с EAU, которой вводили соединение в соответствии с настоящим изобретением посредством глазных капель.

На фиг. 14 представлены результаты проведения FACS на иммунных клетках IFN-γ(+)/CD4(+) в ткани сетчатки мыши с EAU, которой внутрибрюшинно вводили соединение в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг. 15 представлены результаты проведения FACS на иммунных клетках IFN-γ(+)/CD4(+) в лимфатическом узле мыши с EAU, которой вводили соединение в соответствии с настоящим изобретением посредством глазных капель.

На фиг. 16 представлены результаты проведения FACS на иммунных клетках IFN-γ(+)/CD4(+) в лимфатическом узле мыши с EAU, которой внутрибрюшинно вводили соединение в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг. 17 представлены результаты проведения FACS на иммунных клетках IL-1β(+) в лимфатическом узле мыши с EAU, которой внутрибрюшинно вводили соединение в соответствии с настоящим изобретением в виде глазных капель.

На фиг. 18 представлены результаты проведения FACS на иммунных клетках IL-1β(+) в ткани сетчатки мыши с EAU, которой внутрибрюшинно вводили соединение в соответствии с настоящим изобретением в виде глазных капель.

На фиг. 19 представлены результаты проведения FACS на иммунных клетках CD11b(+) в лимфатическом узле мыши с EAU, которой внутрибрюшинно вводили соединение в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг. 20 представлены результаты проведения FACS на иммунных клетках CD19(+) в лимфатическом узле мыши с EAU, которой внутрибрюшинно вводили соединение в соответствии с настоящим изобретением.

На фиг. 21 представлены результаты проведения FACS на иммунных клетках F4/80(+) в лимфатическом узле мыши с EAU, которой внутрибрюшинно вводили соединение в соответствии с настоящим изобретением.

Способ осуществления изобретения

Способ осуществления изобретения

Далее настоящее изобретение будет описано подробнее в соответствии с примерами получения и вариантами осуществления. Однако эти примеры получения и варианты осуществления предоставлены только для иллюстрации настоящего изобретения и, таким образом, настоящее изобретение не ограничивается ими.

Соединения 255, 280, 374, 416, 461, 476, 500, 530 или 532 в соответствии с настоящим изобретением получали способом, описанным в публикации нерассмотренной патентной заявки Кореи №2014-0128886, и конкретные примеры получения описаны ниже. Вновь названная формула в каждом примере получения упоминается в рамках только соответствующего примера получения, и формулы, упоминаемые по меньшей мере в двух примерах получения, используются независимо в каждом примере получения.

Пример получения 1. Синтез соединения 255 {N-(3-бромфенил)-N-(4-(гидроксикарбамоил)бензил)морфолин-4-карбоксамид}

[Стадия 1] Синтез метил 4-((N-(3-бромфенил)морфолин-4-карбоксамидо)метил)бензоата

Метил 4-(((3-бромфенил)((4-нитрофенокси)карбонил)амино)метил)бензоат (1,5 г, 3,09 ммоль) растворяли в ацетонитриле (50 мл), а затем к нему медленно добавляли карбонат калия (1,28 г, 9,3 ммоль) и морфолин (0,40 мл, 4,64 ммоль). После этого температуру полученной смеси медленно повышали до 80°С, а затем полученную смесь перемешивали в течение трех часов при этой температуре. Температуру снижали до комнатной температуры, затем дополнительно добавляли диметилформамид (50 мл), затем температуру вновь повышали до 80°С, а затем полученную смесь перемешивали в течение пяти часов при этой температуре. После завершения реакции органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида аммония три раза, затем сушили с использованием сульфата натрия и фильтровали, а затем фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Концентрат очищали посредством колоночной хроматографии (диоксид кремния; этилацетат/гексан=0-50%), с получением указанного в заголовке соединения (0,45 г, 33,6%) в виде прозрачного масла.

[Стадия 2] Синтез N-(3-бромфенил)-N-(4-(гидроксикарбамоил)бензил)морфолин-4-карбоксамида

Метил 4-((N-(3-бромфенил)морфолин-4-карбоксамидо)метил)бензоат (0,05 г, 0,12 ммоль) растворяли в метаноле (2 мл), а затем медленно добавляли хлористоводородную соль гидроксиламина (0,040 г, 0,58 ммоль). После этого к полученной смеси добавляли гидроксид калия (0,065 г, 1,15 ммоль) и перемешивали при комнатной температуре в течение десяти минут, а затем добавляли гидроксиламин (50,0 масс. % водный раствор, 0,14 мл, 2,31 ммоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение суток, затем органический растворитель концентрировали при пониженном давлении и нейтрализовывали добавлением 2 Н хлористоводородной кислоты. Затем органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия три раза, а затем сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали. После этого фильтрат концентрировали при пониженном давлении, а затем концентрат очищали колоночной хроматографией (диоксид кремния; этилацетат/гексан=0-80%) с получением указанного в заголовке соединения (0,036 г, 72%) в белой твердой форме.

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃-d₆) δ 7,63 (д, 2 H, J=7,8 Гц), 7,27-7,20 (м, 4 H), 7,13 (т, 1 H, J=7,8 Гц), 6,96 (д, 1 H, J=7,1 Гц), 4,83 (с, 2 H), 3,49 (ушир. с, 4 H), 3,23 (ушир. с, 4 H); MS (ESI) m/z 436 (M⁺ + H).

Пример получения 2. Синтез соединения 280 {N-(4-(гидроксикарбамоил)бензил)-N-(пиридин-2-ил)морфолин-4-карбоксамид}

[Стадия 1] Синтез метил 4-((пиридин-2-иламино)метил)бензоата

Пиридин-2-амин (0,2 г, 2,13 ммоль) растворяли в метаноле (10 мл), а затем к нему добавляли метил 4-формилбензоат (0,35 г, 2,13 ммоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 минут, а затем к ней медленно добавляли цианоборгидрид натрия (0,13 г, 2,13 ммоль) и уксусную кислоту (0,12 мл. 2,13 ммоль), а затем перемешивали при комнатной температуре в течение пяти часов. Полученную смесь промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия три раза, затем органический слой сушили сульфатом натрия и фильтровали, а затем фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Концентрат очищали колоночной хроматографией (диоксид кремния; этилацетат/гексан=0-30%) с получением указанного в заголовке соединения (0,10 г, 19%) в виде прозрачного масла.

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 8,17 (д, 1 H, J=5,8 Гц), 8,06 (д, 2 H, J=8,4 Гц), 7,66 (т, 1 H, J=7,8 Гц), 7,44 (д, 2 H, J=8,0 Гц), 6,76 (т, 1 H, J=6,7 Гц), 6,58 (д, 1 H, J=8,6 Гц), 4,67 (д, 2 H, J=6,0 Гц), 3,92 (с, 3 H).

[Стадия 2] Синтез метил 4-((((4-нитрофенокси)карбонил)(пиридин-2-ил)амино)метил)бензоата

Метил 4-((пиридин-2-иламино)метил)бензоат (0,040 г, 0,16 ммоль) растворяли в диметилформамиде (3 мл), а затем медленно добавляли карбонат калия (0,046 г, 0,33 ммоль). После этого к полученной смеси добавляли 4-нитрофенилхлорформиат (0,037 г, 0,18 ммоль), а затем температуру полученной смеси медленно повышали до 50°C, а затем полученную смесь перемешивали в течение двух суток при этой температуре. После завершения реакции слой этилацетата промывали насыщенным водным раствором хлорида аммония три раза, а затем органический слой сушили сульфатом натрия и фильтровали, а затем фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Концентрат очищали колоночной хроматографией (диоксид кремния; этилацетат/гексан=0-50%) с получением указанного в заголовке соединения (0,048 г, 71%) в виде желтого масла.

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 8,49-8,48 (м, 1 H), 8,24 (дд, 2 H, J=7,0, 2,2 Гц), 8,17 (дд, 2 H, J=7,2, 2,0 Гц), 8,00 (д, 2 H, J=8,4 Гц), 7,78 (т, 1 H, J=3,8 Гц), 7,44 (д, 2 H, J=8,0 Гц), 6,91 (дд, 2 H, J=7,3, 2,1 Гц), 5,39 (ушир. с, 2 H), 3,92 (с, 3 H); MS (ESI) m/z 408 (M⁺ + H).

[Стадия 3] Синтез метил 4-((N-(пиридин-2-ил)морфолин-4-карбоксамидо)метил)бензоата

Метил 4-((((4-нитрофенокси)карбонил)(пиридин-2-ил)амино)метил)бензоат (0,040 г, 0,098 ммоль) растворяли в диметилформамиде (5 мл), а затем медленно добавляли карбонат калия (0,040 г, 0,30 ммоль) и морфолин (0,013 мл, 0,15 ммоль). После этого температуру полученной смеси медленно повышали до 80°С, а затем полученную смесь перемешивали в течение трех часов при этой температуре. После завершения реакции полученную смесь промывали насыщенным водным раствором хлорида аммония три раза, затем органический слой сушили сульфатом натрия и фильтровали, а затем фильтрат концентрировали при пониженном давлении. Концентрат очищали колоночной хроматографией (диоксид кремния; этилацетат/гексан=0-50%) с получением указанного в заголовке соединения (0,022 г, 63%) в форме светло-желтого твердого вещества.

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 8,37-8,35 (м, 1 H), 7,95 (д, 2 H, J=8,4 Гц), 7,60-7,58 (м, 1 H), 7,47 (д, 2 H, J=8,4 Гц), 6,94-6,89 (м, 2 H), 5,13 (с, 2 H), 3,89 (с, 3 H), 3,53-3,51 (м, 4 H), 3,31-3,29 (м, 4 H).

[Стадия 4] Синтез N-(4-(гидроксикарбамоил)бензил)-N-(пиридин-2-ил)морфолин-4-карбоксамида

Метил 4-((N-(пиридин-2-ил)морфолин-4-карбоксамидо)метил)бензоат (0,022 г, 0,062 ммоль) растворяли в MeOH (2 мл), а затем медленно добавляли хлористоводородную соль гидроксиламина (0,022 г, 0,31 ммоль). После этого к полученной смеси добавляли гидроксид калия (0,035 г, 0,62 ммоль), затем перемешивали при комнатной температуре в течение десяти минут, а затем добавляли гидроксиламин (50,0 масс. % водный раствор, 0,082 мл, 1,24 ммоль). Полученную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение суток, а затем органический растворитель концентрировали при пониженном давлении и нейтрализовывали добавлением 2 Н HCl, а затем промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия три раза, а затем органический слой сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали с получением указанного в заголовке соединения (0,007 г, 32%) в форме белого твердого вещества.

¹H-ЯМР (400 МГц, MeOD-d₃) δ 8,32 (д, 1 H, J=3,6 Гц), 7,72 (т, 1 H, J=6,6 Гц), 7,67 (д, 2 H, J=8,2 Гц), 7,48 (д, 2 H, J=8,2 Гц), 7,08-7,01 (м, 2 H), 5,08 (с, 2 H), 3,52 (т, 4 H, J=4,8 Гц), 3,29 (т, 4 H, J=4,8 Гц); MS (ESI) m/z 357 (M⁺ + H).

Пример получения 3. Синтез соединения 374 {N-(4-(гидроксикарбамоил)бензил)-N-(3-(трифторметил)фенил)морфолин-4-карбоксамид} (CKD₄)

[Стадия 1] Синтез метил 4-((3-(трифторметил)фениламино)метил)бензоата

3-(трифторметил)бензоламин (0,30 г, 1,84 ммоль) и карбонат калия (0,76 г, 5,53 ммоль) растворяли в диметилформамиде (DMF) (5 мл), а затем добавляли метил 4-(бромметил)бензоат (0,42 г, 1,84 ммоль). Полученную смесь подвергали реакции при комнатной температуре в течение суток и разбавляли этилацетатом. Реагирующие вещества промывали водой и насыщенным водным раствором хлорида натрия, затем сушили безводным сульфатом магния и фильтровали, а затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией (диоксид кремния; этилацетат/гексан=20%) с получением указанного в заголовке соединения (0,37 г, 65%).

¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 7,93 (д, 2 H, J=8,3 Гц), 7,49 (д, 2 H, J=8,3 Гц), 7,24 (т, 1 H, J=7,9 Гц), 6,88-6,78 (м, 4 H), 4,42 (д, 2 H, J=6,1 Гц), 3,83 (с, 3H), MS (ESI) m/z 310 (M⁺ + H).

[Стадия 2] Синтез метил 4-((((4-нитрофенокси)карбонил)(3-(трифторметил)фенил)амино)метил)бензоата

Метил 4-((3-(трифторметил)фениламино)метил)бензоат (0,26 г, 0,82 ммоль) и 4-нитрофенилкарбонохлоридат (0,33 г, 1,65 ммоль) растворяли в ацетонитриле (10 мл), а затем добавляли карбонат калия (0,34 г, 2,47 ммоль). Полученную смесь подвергали реакции при комнатной температуре в течение суток и разбавляли этилацетатом. Реагирующие вещества промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, затем сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали, а затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией (диоксид кремния; этилацетат/гексан=20%) с получением указанного в заголовке соединения (0,35 г, 89%) в виде бесцветного масла.

¹H-ЯМР (400 МГц, CDCl₃) δ 8,20 (д, 2 H, J=10,2 Гц), 8,01 (д, 2 H, J=7,8 Гц), 7,56-7,46 (м, 3H), 7,35 (д, 3 H, J=8,0 Гц), 7,26 (д, 2 H, J=8,1 Гц), 5,01 (ушир. с, 2H), 3,90 (с, 3H).

[Стадия 3] Синтез метил 4-((N-(3-(трифторметил)фенил)морфолин-4-карбоксамидо)метил)бензоата

Метил 4-((((4-нитрофенокси)карбонил)(3-(трифторметил)фенил)амино)метил)бензоат (0,29 г, 0,60 ммоль) растворяли в диметилформамиде (10 мл), а затем добавляли карбонат калия (0,25 г, 1,81 ммоль) и морфолин (0,05 мл, 0,60 ммоль). Полученную смесь подвергали реакции при 60°C в течение двух суток, а затем разбавляли насыщенным раствором хлорида аммония. Проводили экстракцию этилацетатом, а затем экстракт сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали, а затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией (диоксид кремния; этилацетат/гексан=50%) с получением указанного в заголовке соединения (0,15 г, 60%).

¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 7,97 (д, 2 H, J=8,2 Гц), 7,43-7,32 (м, 5H), 7,20 (д, 1 H, J=8,0 Гц), 4,94 (с, 2H), 3,90 (с, 3H), 3,50 (т, 4 H, J=4,8 Гц), 3,25 (т, 4 H, J=4,8 Гц); MS (ESI) m/z 423 (M⁺ + H).

[Стадия 4] Синтез N-(4-(гидроксикарбамоил)бензил)-N-(3-(трифторметил)фенил)морфолин-4-карбоксамида

Метил 4-((N-(3-(трифторметил)фенил)морфолин-4-карбоксамидо)метил)бензоат (0,15 г, 0,36 ммоль) растворяли в метаноле (5 мл), затем добавляли водный раствор гидроксиламина (50 масс. %, 1 мл) и гидроксид калия (0,10 г, 1,81 ммоль), а затем перемешивали в течение ночи. После завершения реакции метанол отгоняли при пониженном давлении и удаляли, а затем проводили экстракцию этилацетатом и водой, а затем собирали. Полученный экстракт сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали, а затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток перемешивали в диэтиловом эфире, а затем получали твердый продукт, фильтровали и сушили с получением указанного в заголовке соединения (0,082 г, 54%) в виде белого твердого вещества.

¹H-ЯМР (400 МГц, MeOD-d₃) δ 11,14 (ушир. с, 1 H), 8,99 (ушир. с, 1 H), 7,85 (д, 2 H, J=8,0 Гц), 7,66-7,27 (м, 6 H), 4,94 (с, 2 H), 3,41 (с, 2 H), 3,15 (с, 2 H). MS (ESI) m/z 424 (M⁺ + H).

Пример получения 4. Синтез соединения 416 {N-(2,4-дифторфенил)-N-(4-(гидроксикарбамоил)бензил)-4-метилпиперазин-1-карбоксамид}

[Стадия 1] Синтез метил 4-((N-(2,4-дифторфенил)-4-метилпиперазин-1-карбоксамидо)метил)бензоата

Метил 4-(((2,4-дифторфенил)((4-нитрофенокси)карбонил)амино)метил)бензоат (0,50 г, 1,13 ммоль) и 1-метилпиперазин (0,126 мл, 1,13 ммоль) растворяли в диметилформамиде (10 мл), а затем нагревали и перемешивали при 60°C в течение двух суток. Диметилформамид удаляли при пониженном давлении, затем в полученную реакционную смесь наливали воду, а затем проводили экстракцию этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, затем дегидратировали посредством безводного сульфата магния, а затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией (диоксид кремния; метанол/дихлорметан=5%) и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения (0,46 г, 101%) в виде желтого масла.

[Стадия 2] Синтез N-(2,4-дифторфенил)-N-(4-(гидроксикарбамоил)бензил)-4-метилпиперазин-1-карбоксамида

Метил 4-((N-(2,4-дифторфенил)-4-метилпиперазин-1-карбоксамидо)метил)бензоат (0,22 г, 0,545 ммоль) растворяли в метаноле (20 мл), затем добавляли хлористоводородную соль гидроксиламина (0,189 г, 2,73 ммоль) и гидроксид калия (0,306 г, 5,45 ммоль) и перемешивали, затем капельно добавляли гидроксиламин (50 масс. % водный раствор; 0,701 мл, 10,9 ммоль), а затем перемешивали при комнатной температуре в течение трех часов. После завершения реакции метанол удаляли при пониженном давлении, затем в полученную смесь наливали воду и проводили экстракцию этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, затем дегидратировали безводным сульфатом магния, а затем концентрировали при пониженном давлении. После этого полученный концентрат растворяли в дихлорметане, затем добавляли гексан, затем твердое вещество преципитировало, а затем его фильтровали и сушили с получение указанного в заголовке соединения (0,154 г, 70%) в форме желтого твердого вещества.

¹H-ЯМР (400 МГц, MeOD-d₃) δ 7,65 (д, 2 H, J=8,2 Гц), 7,40 (д, 2 H, J=8,2 Гц), 7,26-7,25 (м, 1 H), 7,04-6,96 (м, 2 H), 4,79 (с, 2 H), 3,25-3,23 (м, 4 H), 2,24-2,21 (м, 7 H); MS (ESI) m/z 405,1 (M⁺ + H).

Пример получения 5. Синтез соединения 461 {4-этил-N-(4-(гидроксикарбамоил)бензил)-N-(3-(трифторметил)фенил)пиперазин-1-карбоксамид}

[Стадия 1] Синтез метил 4-((4-этил-N-(3-(трифторметил)фенил)пиперазин-1-карбоксамидо)метил)бензоата

Метил 4-((((4-нитрофенокси)карбонил)(3-(трифторметил)фенил)амино)метил)бензоат (0,346 г, 0,73 ммоль) растворяли в диметилформамиде (10 мл), а затем добавляли карбонат калия (0,30 г, 2,19 ммоль) и 1-этилпиперазин (0,09 мл, 0,73 ммоль). Полученную смесь подвергали реакции при 60°С в течение суток, затем разбавляли этилацетатом, а затем промывали насыщенным раствором хлорида аммония. Полученную смесь сушили безводным сульфатом магния и фильтровали, а затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией (диоксид кремния; этилацетат/гексан=50%) с получением указанного в заголовке соединения (0,15 г, 46%).

[Стадия 2] Синтез 4-этил-N-(4-(гидроксикарбамоил)бензил)-N-(3-(трифторметил)фенил)пиперазин-1-карбоксамида

Метил 4-((4-этил-N-(3-(трифторметил)фенил)пиперазин-1-карбоксамидо)метил)бензоат (0,15 г, 0,33 ммоль) растворяли в метаноле (10 мл), затем добавляли гидроксиламин (50 масс. % водный раствор, 0,20 мл) и гидроксид калия (0,09 г, 1,67 ммоль), а затем перемешивали в течение ночи. После завершения реакции метанол отгоняли при пониженном давлении и удаляли, затем проводили экстракцию этилацетатом и водой, а затем собирали. Полученный экстракт сушили безводным сульфатом магния и фильтровали, а затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток перемешивали в диэтиловом эфире, а затем образовывалось твердое вещество, и его фильтровали и сушили с получением указанного в заголовке соединения (0,09 г, 61%) в виде желтого твердого вещества.

¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 11,1 (ушир. с, 1 H), 7,65 (д, 2 H, J=8,2 Гц), 7,51 (т, 1 H, J=7,9 Гц), 7,41-7,36 (м, 5 H), 4,92 (с, 2 H), 3,17-3,14 (м, 4 H), 2,25, 2,22 (ABq, 2 H, J=12,4, 7,2 Гц), 2,18-2,15 (м, 4 H), 0,92 (т, 3 H, J=7,2 Гц); MS (ESI) m/z 451,1 (M⁺ + H).

Пример получения 6. Синтез соединения 476 {3,3-дифтор-N-(4-(гидроксикарбамоил)бензил)-N-(3-(трифторметил)фенил)азетидин-1-карбоксамид}

[Стадия 1] Синтез метил 4-((3,3-дифтор-N-(3-(трифторметил)фенил)азетидин-1-карбоксамидо)метил)бензоата

Метил 4-((((4-нитрофенокси)карбонил)(3-(трифторметил)фенил)амино)метил)бензоат (0,24 г, 0,51 ммоль) растворяли в диметилформамиде (5 мл), а затем добавляли карбонат калия (0,21 г, 1,52 ммоль) и гидрохлорид 3,3-дифторазетидина (0,13 г, 1,10 ммоль). Полученную смесь подвергали реакции при 60°С в течение двух суток, а затем разбавляли насыщенным раствором хлорида аммония. Проводили экстракцию этилацетатом, а затем полученный экстракт сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали, а затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией (диоксид кремния; этилацетат/гексан=30%) с получением указанного в заголовке соединения (0,14 г, 63%).

[Стадия 2] Синтез 3,3-дифтор-N-(4-(гидроксикарбамоил)бензил)-N-(3-(трифторметил)фенил)азетидин-1-карбоксамида

Метил 4-((3,3-дифтор-N-(3-(трифторметил)фенил)азетидин-1-карбоксамидо)метил)бензоат (0,14 г, 0,32 ммоль) растворяли в метаноле (10 мл), затем добавляли водный раствор гидроксиламина (50 масс. %, 0,2 мл) и гидроксид калия (0,09 г, 1,60 ммоль), а затем перемешивали в течение ночи. После завершения реакции метанол отгоняли при пониженном давлении и удаляли, а затем проводили экстракцию этилацетатом и водой, и собирали. Полученный экстракт сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали, а затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток перемешивали в диэтилового эфире, а затем образовывался твердый продукт, и его фильтровали и сушили с получением указанного в заголовке соединения (0,072 г, 52%) в форме белого твердого вещества.

Пример получения 7. Синтез соединения 500 {N-(3-(фторметил)фенил)-N-(4-(гидроксикарбамоил)бензил)морфолин-4-карбоксамид}

[Стадия 1] Синтез метил 4-((N-(3-(фторметил)фенил)морфолин-4-карбоксамидо)метил)бензоата

4-((N-(3-(гидроксиметил)фенил)морфолин-4-карбоксамидо)метил)бензойную кислоту (1,25 г, 3,25 ммоль) растворяли в дихлорметане (20 мл), затем добавляли трифторид диэтиламиносеры (DAST, 0,424 мл, 3,58 ммоль) при 0°C, затем перемешивали при той же температуре в течение одного часа, затем в реакционную смесь наливали водный раствор гидрокарбоната натрия, а затем проводили экстракцию дихлорметаном. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, затем дегидратировали безводным сульфатом магния, а затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией (диоксид кремния; этилацетат/гексан=30-50%) и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения (0,617 г, 49%) в виде бесцветной жидкости.

[Стадия 2] Синтез N-(3-(фторметил)фенил)-N-(4-(гидроксикарбамоил)бензил)морфолин-4-карбоксамида

Метил 4-((N-(3-(фторметил)фенил)морфолин-4-карбоксамидо)метил)бензоат (0,100 г, 0,259 ммоль) растворяли в метаноле (10 мл), а затем добавляли гидроксиламин (50,0 масс. % водный раствор, 1,11 мл, 18,1 ммоль) при комнатной температуре. Затем к полученной смеси добавляли гидроксид калия (0,145 г, 2,59 ммоль) и перемешивали при этой же температуре в течение 30 минут. После этого из полученной реакционной смеси удаляли растворитель при пониженном давлении, затем к полученному концентрату добавляли насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия, а затем проводили экстракцию этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, затем дегидратировали посредством безводного сульфата магния, а затем концентрировали при пониженном давлении. К полученному концентрату добавляли дихлорметан (5 мл) и гексан (30 мл) и перемешивали, а затем преципитированное твердое вещество фильтровали и сушили с получением указанного в заголовке соединения (0,089 г, 89%) в виде белого твердого вещества.

¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 11,12 (ушир. с, 1 H), 8,98 (ушир. с, 1 H), 7,64 (д, 2 H, J=8,3 Гц), 7,36-7,32 (м, 3 H), 7,20 (с, 1 H), 7,15 (д, 1 H, J=7,5 Гц), 7,09 (д, 1 H, J=7,4 Гц), 5,36 (д, 2 H, J=47,5 Гц), 4,87 (с, 2 H), 3,39 (т, 4 H, J=4,6 Гц), 3,13 (т, 4 H, J=4,6 Гц). MS (ESI) m/z 388 (M⁺ + H).

Пример получения 8. Синтез соединения 530 {N-(3-фторфенил)-N-(4-(гидроксикарбамоил)бензил)морфолин-4-карбоксамид}

[Стадия 1] Синтез метил 4-((3-фторфениламино)метил)бензоата

Метил 4-формилбензоат (1,47 г, 8,99 ммоль) растворяли в метаноле (50 мл), а затем добавляли 3-фторбензоламин (1,0 г, 8,99 ммоль). Полученную смесь подвергали реакции при комнатной температуре в течение трех часов, а затем добавляли цианоборгидрид натрия (NaCNBH₃) (0,56 г, 8,99 ммоль) и уксусную кислоту (1,03 мл, 17,99 ммоль). После того, как компоненты реакции реагировали при комнатной температуре в течение суток растворитель с реагирующими компонентами помещали под пониженное давление и удаляли, затем в него наливали насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия, а затем проводили экстракцию этилацетатом. Органический слой дегидратировали безводным сульфатом магния, а затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией (диоксид кремния; этилацетат/гексан=20%) с получением указанного в заголовке соединения (1,84 г, 79%).

[Стадия 2] Синтез метил 4-(((3-фторфенил)((4-нитрофенокси)карбонил)амино)метил)бензоата

Метил 4-((3-фторфениламино)метил)бензоат (2,7 г, 10,4 ммоль) и 4-нитрофенилхлорформиат (4,20 г, 20,8 ммоль) растворяли в ацетонитриле (100 мл), а затем добавляли карбонат калия (4,32 г, 31,2 ммоль). Полученную смесь подвергали реакции при комнатной температуре в течение суток и разбавляли этилацетатом. Реакционную смесь промывали насыщенным водном раствором хлорида натрия, затем сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали, а затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией (диоксид кремния; этилацетат/гексан=20%) с получением указанного в заголовке соединения (2,65 г, 60%) в виде бесцветного масла.

[Стадия 3] Синтез метил 4-((N-(3-фторфенил)морфолин-4-карбоксамидо)метил)бензоата

Метил 4-(((3-фторфенил)((4-нитрофенокси)карбонил)амино)метил)бензоат (0,32 г, 0,75 ммоль) растворяли в диметилформамиде (5 мл), а затем добавляли карбонат калия (0,31 г, 2,24 ммоль) и морфолин (0,13 мл, 1,49 ммоль). Полученную смесь подвергали реакции при 60°C в течение суток, а затем разбавляли насыщенным раствором хлорида аммония. Проводили экстракцию этилацетатом, а затем полученный экстракт сушили безводным сульфатом натрия и фильтровали, а затем концентрировали при пониженном давлении. Остаток очищали колоночной хроматографией (диоксид кремния; этилацетат/гексан=30%) с получением указанного в заголовке соединения (0,13 г, 45%).

[Стадия 4] Синтез N-(3-фторфенил)-N-(4-(гидроксикарбамоил)бензил)морфолин-4-карбоксамид

Метил 4-((N-(3-фторфенил)морфолин-4-карбоксамидо)метил)бензоат (0,108 г, 0,290 ммоль) растворяли в метаноле (10 мл), а затем добавляли гидроксиламин (50,0 масс. % водный раствор, 1,19 мл, 19,4 ммоль) при комнатной температуре. Затем к полученной смеси добавляли гидроксид калия (0,156 г, 2,78 ммоль) и перемешивали при той же температуре в течение 16 часов. После этого из полученной реакционной смеси удаляли растворитель при пониженном давлении, затем в полученный концентрат наливали насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия, а затем проводили экстракцию этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, затем дегидратировали безводным сульфатом магния, а затем концентрировали при пониженном давлении. Преципитированное твердое вещество фильтровали и сушили с получением указанного в заголовке соединения (0,062 г, 57%) в виде белого твердого вещества.

¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 11,14 (ушир. с, 1 H), 8,99 (ушир. с, 1 H), 7,65 (д, 2 H, J=7,0 Гц), 7,38-7,30 (м, 3H), 7,05-6,85 (м, 3H), 4,89 (с, 1H), 3,44-3,42 (м, 4H), 3,18-3,15 (м, 4H), 2,08 (с, 3H). MS (ESI) m/z 374 (M⁺ + H).

Пример получения 9. Синтез соединения 532 {N-(2-фтор-4-(гидроксикарбамоил)бензил)-N-(3-(трифторметил)фенил)морфолин-4-карбоксамид}

[Стадия 1] Синтез 3-фтор-4-(((3-(трифторметил)фенил)амино)метил)бензонитрила

3-(трифторметил)анилин (0,998 мл, 8,068 ммоль) растворяли в ацетонитриле (60 мл), а затем добавляли 4-(бромметил)-3-фторбензонитрил (2,072 г, 9,682 ммоль) и DIPEA (2,143 мл, 12,102 ммоль) при комнатной температуре, а затем перемешивали при той же температуре в течение суток. После этого к полученной реакционной смеси добавляли насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия, а затем проводили экстракцию этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, затем дегидратировали безводным сульфатом магния, а затем концентрировали при пониженном давлении. Полученный концентрат очищали колоночной хроматографией (диоксид кремния; этилацетат/гексан=5-20%) и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения (2,380 г, 64,4%) в виде желтой жидкости.

[Стадия 2] Синтез 3-фтор-4-(((3-(трифторметил)фенил)амино)метил)бензойной кислоты

3-фтор-4-(((3-(трифторметил)фенил)амино)метил)бензонитрил (2,310 г, 7,850 ммоль) и гидроксид лития (3,294 г, 78,505 ммоль) перемешивали в метаноле (40 мл)/H₂O (20 мл), затем полученную реакционную смесь нагревали при кипячении с обратным холодильником в течение 16 часов, затем охлаждали до комнатной температуры, а затем концентрировали при пониженном давлении. К полученной смеси добавляли 2 M водный раствор хлористоводородной кислоты для достижения pH=1, а затем преципитированное твердое вещество отфильтровывали и сушили с получением указанного в заголовке соединения (1,700 г, 69,1%) в виде белого твердого вещества.

[Стадия 3] Синтез метил 3-фтор-4-(((3-(трифторметил)фенил)амино)метил)бензоата

3-фтор-4-(((3-(трифторметил)фенил)амино)метил)бензойную кислоту (1,700 г, 5,427 ммоль), метанол (4,402 мл, 108,540 ммоль), EDC (2,081 г, 10,854 ммоль), HOBt (1,467 г, 10,854 ммоль) и DIPEA (2,883 мл, 16,281 ммоль) растворяли в тетрагидрофуране (50 мл) при комнатной температуре, затем полученный реакционный раствор перемешивали при той же температуре в течение 16 часов, затем в полученную реакционную смесь наливали насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия, а затем проводили экстракцию этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, затем дегидратировали безводным сульфатом магния, а затем концентрировали при пониженном давлении. Концентрат очищали колоночной хроматографией (диоксид кремния; этилацетат/гексан=10-40%) и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения (1,500 г, 84,5%) в виде бесцветной жидкости.

[Стадия 4] Синтез метил 3-фтор-4-((((4-нитрофенокси)карбонил)(3-(трифторметил)фенил)амино)метил)бензоата

Метил 3-фтор-4-(((3-(трифторметил)фенил)амино)метил)бензоат (1,500 г, 4,583 ммоль), 4-нитрофенилкарбонохлоридат (1,848 г, 9,167 ммоль) и карбонат калия (1,900 г, 13,750 ммоль) растворяли в ацетонитриле (80 мл) при комнатной температуре, затем полученный реакционный раствор перемешивали при той же температуре в течение 16 часов, затем в полученную реакционную смесь наливали насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия, а затем проводили экстракцию этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, затем дегидратировали безводным сульфатом магния, а затем концентрировали при пониженном давлении. Полученный концентрат очищали колоночной хроматографией (диоксид кремния; этилацетат/гексан=10-40%) и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения (0,927 г, 41,1%) в виде бесцветной жидкости.

[Стадия 5] Синтез метил 3-фтор-4-((N-(3-(трифторметил)фенил)морфолин-4-карбоксамидо)метил)бензоата

Метил 3-фтор-4-((((4-нитрофенокси)карбонил)(3-(трифторметил)фенил)амино)метил)бензоат (0,129 г, 0,262 ммоль), морфолин (0,046 мл, 0,524 ммоль) и карбонат калия (0,109 г, 0,786 ммоль) растворяли в N, N-диметилформамиде (5 мл) при 60°С, затем полученный реакционный раствор перемешивали при той же температуре в течение двух суток, затем в полученную реакционную смесь наливали насыщенный водный раствор гидрокарбоната натрия, а затем проводили экстракцию этилацетатом. Органический слой промывали насыщенным водным раствором хлорида натрия, затем дегидратировали безводным сульфатом магния, а затем концентрировали при пониженном давлении. Полученный концентрат очищали колоночной хроматографией (диоксид кремния; этилацетат/гексан=30-60%) и концентрировали с получением указанного в заголовке соединения (0,094 г, 81,5%) в виде бесцветной жидкости.

[Стадия 6] Синтез N-(2-фтор-4-(гидроксикарбамоил)бензил)-N-(3-(трифторметил)фенил)морфолин-4-карбоксамида

Метил 3-фтор-4-((N-(3-(трифторметил)фенил)морфолин-4-карбоксамидо)метил)бензоат (0,094 г, 0,213 ммоль) и гидроксиламин (50,0 масс. % водный раствор, 0,071 г, 2,134 ммоль) растворяли в метаноле (5 мл), затем добавляли гидроксид калия (0,060 г, 1,067 ммоль) при комнатной температуре, а затем перемешивали при той же температуре в течение двух часов, а затем полученную реакционную смесь концентрировали при пониженном давлении. В полученный концентрат добавляли диэтиловый эфир (10 мл) и перемешивали, а затем преципитированное твердое вещество фильтровали и сушили с получением соединения 532 (0,068 г, 72,2%) в виде светло-желтого твердого вещества.

¹H-ЯМР (400 МГц, DMSO-d₆) δ 11,2 (ушир. с, 1 H), 9,13 (ушир. с, 1 H), 7,57-7,42 (м, 7 H), 4,94 (с, 2 H), 3,44-3,34 (м, 4 H), 3,18-3,12 (м, 4 H); MS (ESI) m/z 442,1 (M⁺ + H).

Пример 1. Идентификация супрессивного эффекта на секрецию TNFα в иммунных клеточных линиях (in vitro)

Для идентификации эффективности соединения по изобретению в отношении подавления секреции TNFα при иммунном ответе, подавление продукции TNFα, которое достигали путем обработки соединениями 374, 461, 500, 530 и 532 в соответствии с настоящим изобретением стимулированных LPS клеточных линий моноцитов человека (THP-1), количественно определяли посредством иммуноферментного анализа (ELISA).

В частности, клеточные линии THP-1 (ATCC) культивировали в среде RPMI-1640, содержавшей 10% FBS. Клеточные линии распределяли в 24-луночный планшет в количестве 1×10⁵ клеток на лунку, затем обрабатывали 100 нг/мл PMA (форбол 12-миристат 13-ацетат) в течение 24 часов, а затем подвергали дифференцировке в макрофаги. Затем культуральную среду заменяли новой средой, затем обрабатывали исследуемым лекарственным средством в течение 24 часов, а затем вновь обрабатывали 10 нг/мл LPS (E.Coli, O55:B5) в течение четырех часов для стимуляции. После этого супернатант отбирали и использовали для определения количества TNFα, секретированного из клеток, с использованием набора Human TNFα Instant ELISA kit (eBioscience, BMS223INST) в соответствии с протоколом, предоставленным изготовителем.

В результате, было показано, что уровень секреции TNFα снижался во всех экспериментальных группах по сравнению с контрольной группой, в которой воспалительный ответ индуцировали посредством LPS. На фиг. 1 соединения, обозначаемые как SM374, SM461, SM500, SM530 и SM532, представляют собой соединения 374, 461, 500, 530 и 532, соответственно. В частности, в случае соединений 374, 461 и 500, уровень секреции TNFα был значительно снижен до уровня, при котором воспалительный ответ не индуцировался посредством LPS в концентрациях как 100 нМ, так и 300 нМ. Также в случае увеличения концентрации соединения при обработке от 100 нМ до 300 нМ для соединений 530 и 532, уровень секреции TNFα значительно снижался (фиг. 1).

Результаты эксперимента показывают, что соединение в соответствии с настоящим изобретением очень эффективно подавляет секрецию TNFα, т.е. фактора воспалительного ответа, уровень которого репрезентативно возрастает при увеите, таким образом, таким образом, эффективно подавляя воспалительные ответы, вызываемые увеитом.

Пример 2. Идентификация супрессивного эффекта на пролиферацию реактивных T-клеток (in vitro)

Для идентификации эффективности соединений по изобретению в отношении подавления пролиферации реактивных T-клеток при иммунном ответе, соединения 255, 280, 374, 416 и 476 в соответствии с настоящим изобретением культивировали вместе с реактивными T-клетками и регуляторными T-клетками в стимулированных LPS клеточных линиях моноцитов человека (THP-1), а затем определяли эффективность супрессии регуляторных T-клеток.

В частности, самцов мышей C57BL6 в возрасте шести недель приобретали в Central Lab Animal Inc., затем позволяли им акклиматизироваться в течение одной недели, а затем использовали в эксперименте. Селезенку извлекали из мышей, а затем обрабатывали коллагеназой D (Roche, 11088866001), чтобы выделить из нее спленоциты. Treg (CD4+CD25-) и Teff (CD4+CD25+) выделяли с использованием набора для выделения CD4+CD25+ регуляторных T-клеток (Miltenyi Biotec, 130-091-041) в соответствии с протоколом, предоставляемым изготовителем. Клетки Teff культивировали при 37°С в течение десяти минут посредством eFluor^®670 (Cell Proliferation Dye eFluor^®670, eBioscience), чтобы окрасились клеточные мембраны. Teff и Treg распределяли в 96-луночный планшет в соотношении 2:1, а затем T-клетки активировали в течение трех суток посредством магнитных гранул с mAb против CD3ε и против CD28 (набор для активации/экспансии T-клеток, Miltenyi Biotec, 130-093627), и проводили анализ подавления Treg. Одновременно проводили обработку тестируемым лекарственным средством в течение трех суток, в ходе которых проводили анализ. Величину разведения eFluor^®670, которым были мечены клеточные мембраны Teff, определяли, таким образом, оценивая степень пролиферации T-клеток. График разведения eFluor^®670 строили с использованием проточного цитометра (FACS LSR Fortessa, BD bioscience). Способность к подавлению пролиферации T-клеток вычисляли с использованием следующего уравнения.

Относительное подавление =

В результате было показано, что пролиферация реактивных T-клеток подавлялась во всех экспериментальных группах. На фиг. 2 соединения, обозначаемые как SM255, SM280, SM374, SM416, SM476, представляют собой соединения 255, 280, 374, 416, 476, соответственно. Соединения в соответствии с настоящим изобретением, использованные в эксперименте, продемонстрировали уровень подавления пролиферации реактивных T-клеток, который был более высоким максимум в два раза, когда проводили обработку в концентрации 200 нМ, а также продемонстрировал выраженный эффект подавления пролиферации T-клеток, который максимально достигал четырех раз, при обработке в концентрации 500 нМ (фиг. 2).

Результаты эксперимента, приведенные выше, демонстрируют, что соединения в соответствии с настоящим изобретением эффективно подавляют дифференцировку реактивных T-клеток, которые чрезмерно активировались при увеите.

Пример 3. Идентификация регуляторного эффекта функции регуляторных T-клеток (in vitro)

Для идентификации того, регулируют ли соединения в соответствии с настоящим изобретением функцию регуляторных T-клеток при иммунном ответе, проводили обработку соединениями 255, 280, 374, 416 и 476, а затем определяли уровень экспрессии рецептора иммунной точки контроля CTLA4 (ассоциированный с цитотоксическими T-лимфоцитами белок 4) в регуляторных T-клетках посредством проточной цитометрии.

В частности, самцов мышей C57BL6 в возрасте шести недель получали в Central Lab Animal Inc., затем позволяли им акклиматизироваться в течение одной недели, а затем использовали в эксперименте. Селезенку извлекали из мыши, а затем обрабатывали коллагеназой D (Roche, 11088866001), выделяя из нее спленоциты. CD4+CD25- T-клетки выделяли с использованием набора для выделения CD4+CD25+ регуляторных T-клеток (Miltenyi Biotec, 130-091-041), а затем CD4+CD25- T-клетки (в количестве 5×10⁵ клеток/лунка) обрабатывали гранулами с mAb против CD3ε/против CD28 (набор для активации/экспансии T-клеток, Miltenyi Biotec, 130-093627) и рекомбинантного TGF-β₂ мыши в течение шести суток, так что они дифференцировались в iTreg. Одновременно проводили обработку тестируемым лекарственным средством в течение шести суток, в ходе которой клетки дифференцировались в iTreg. После этого клетки инкубировали с means mAb против CD4/против CD25 (eBioscience, 25-0042-82, 17-0251-82) при 4°С в течение 20 минут, а затем проводили мечение. Для внутрицитоплазматического окрашивания пермеабилизацию обеспечивали с использованием Fix/буфера для пермеабилизации (eBioscience, 00-5523-00), затем проводили мечение посредством антитела против FOXP3-Alexafluor488 (eBioscience, 53-5773-82) и антитела против CTLA4-PE (eBioscience, 12-1522-82), а затем проводили проточную цитометрию посредством FACS LSR Fortessa (BD bioscience).

В результате, было идентифицировано, что уровень экспрессии CTLA4 в T-клетках возрастал после обработки соединениями в соответствии с настоящим изобретением. На фиг. 3., соединения, обозначаемые как SM255, SM280, SM374, SM416, SM476, представляют собой соединения 255, 280, 374, 416, 476, соответственно. В частности, в случае соединений 255, 374 и 476, было показано, что экспрессия CTLA4 в 40% или более T-клеток возрастала при концентрации 500 нМ или более. Соединение 255 продемонстрировало высокую цитотоксичность при обработке в концентрации 1000 нМ, так что анализ данных не проводили (фиг. 3).

Результаты эксперимента, приведенные выше, демонстрируют, что соединения в соответствии с настоящим изобретением улучшают функцию регуляторных T-клеток, так что можно эффективно регулировать чрезмерную активность реактивных T-клеток при увеите.

Пример получения 10. Создание модели на животных для индуцированного экспериментального аутоиммунного увеита (EAU)

Модель индуцированного экспериментального аутоиммунного увеита (EAU) на животных можно считать клинической моделью для увеита. В качестве указанного животного с EAU использовали мышь, иммунизированную межфоторецепторным ретинол-связывающим белком (IRBP).

В частности, мышам C57BL/6 в возрасте 6-8-недель (состояние заболевания: тяжелое) соответственно инъецировали 0,1 мл смеси через обе стороны подушечки стопы мыши с использованием иглы 23G, где смесь составляли путем комбинирования 250 мкг пептида IRBP человека (651-670) и 250 мкг Mycobacterium tuberculosis с полным адъювантом Фрейнда (CFA) в соотношении 1:1. В тот же день (сутки 0) и через двое суток (сутки 2) мышам проводили внутрибрюшинную инъекцию 0,5 мкг/0,2 мл коклюшного токсина (PTX) в качестве адъюванта. Указанных мышей распределяли на группы, как показано в приведенной ниже таблице 2, в зависимости от того применяли ли соединение (CKD4) в соответствии с настоящим изобретением и пути его введения (глазные капли или внутрибрюшинное (в/б) введение).

[Таблица 2]

Группа Название группы Концентрация Путь введения Количество введений Количество животных (количество глазных яблок) 1 Нормальная (CTL) - - - 4(8) 2 EAU - - - 4(8) 3 EAU+Носитель (V) - Глазные капли Два раза/сутки 4(8) в/б Один раз/сутки 4 EAU+CKD4 0,3% Глазные капли Два раза/сутки 4(8) 10 или 30 мг/кг в/б Один раз/сутки

Группе, которой вводили соединение (CKD4) в соответствии с настоящим изобретением, вводили 0,3% соединение CKD4, растворенное в части водной фазы, посредством глазных капель два раза в сутки с 11 суток (группа введения глазных капель), или внутрибрюшинно в дозе 10 или 30 мг/кг один раз в сутки (группа в/б введения). На 21 сутки проводили клиническую оценку, а затем мышей умерщвляли, а затем глазные яблоки и органы-мишени извлекали из них, чтобы проводить эксперимент с целью наблюдения.

Пример 4. Определение эффекта улучшения на клиническую оценку у мыши с EAU

На 21 сутки клинические индикаторы увеита наблюдали после фотографирования периферии оптических нервов мышей с использованием фундоскопической камеры. Тяжесть увеита оценивали как категория 0 (нормальная), категория 0,5 (очень мягкая), категория 1 (мягкая), категория 2 (умеренная), категория 3 (тяжелая), или категория 4 (очень тяжелая), как описано в документе (Rodent Immunology Model Book; глава 22; фиг. 2).

Из этих результатов было идентифицировано, что клиническая категория в группе EAU возрастала практически до категории 2, однако клиническая категория в группе EAU+CKD4 (группа введения глазных капель) значительно улучшалась с категорией 0,5 или ниже (фиг. 4 и 5). Указанные экспериментальные результаты показывают, что введение соединения по изобретению посредством глазных капель является эффективным для лечения увеита.

Пример 5. Идентификация эффекта улучшения в отношении гистопатологических очагов у мышей с EAU

Чтобы видеть степень воспаления при возникновении увеита, глазные яблоки, которые были извлечены из мышей на 21 сутки, заливали в парафиновый блок, а затем проводили его окрашивание гематоксилином и эозином (H&E) общепринятым способом.

Из этих результатов, наблюдали плотную инфильтрацию воспалительных клеток, гранулематозные очаги и воспалительные очаги, такие как отек и складки, в тканях сетчатки группы EAU, но также было идентифицировано, что такие воспалительные очаги были значительно уменьшены в группе EAU+CKD4 (группа введения глазных капель) (фиг. 6). Указанные результаты эксперимента демонстрируют, что введение соединения по изобретению посредством глазных капель эффективно устраняет воспаление глазного яблока, на котором возник увеит.

Пример 6. Идентификация результатов иммунофлуоресценого окрашивания на иммуномаркер у мышей с EAU

Чтобы видеть, инфильтрируют ли иммунные клетки область воспаления при возникновении увеита, проводили иммунофлуоресцентное окрашивание парафинового блока, полученного согласно примеру 2, нацеленное на CD3, CD4, B220 (Abcam), HDAC6 (клеточная передача сигнала) и α-тубулин Ace (Sigma), а затем получали их изображения посредством конфокального микроскопа (LSM780, Zeiss).

Из этих результатов было идентифицировано, что уровень CD3(+), который является маркером T-клеток, был значительно увеличен в группе EAU, но был значительно снижен до уровня, сходного с уровнем у нормальных мышей в группе EAU+CKD4 (группа введения глазных капель) (фиг. 7). С другой стороны, было обнаружено, что B220, который является B-клеточным маркером, также продемонстрировал признаки положительности в группе EAU, но не продемонстрировал очевидного изменения в группе EAU+CKD4 (группа введения глазных капель) (фиг. 7).

Также HDAC6 продемонстрировал высокую степень соответствия CD4. Было идентифицировано, что инфильтрация CD4(+) иммунных клеток в ткань сетчатки была увеличена в группе EAU, но заметно снижалась и оставалась только под сетчаткой в группе EAU+CKD4 (группа введения глазных капель) (фиг. 8). Между тем, результаты иммунофлуоресцентного окрашивания на B220 и α-тубулин наблюдали в качестве совершенно отличающегося паттерна от HDAC6 (фиг. 9 и 10).

Экспериментальные результаты, приведенные выше, демонстрируют, что введение соединения по изобретению посредством глазных капель эффективно ингибирует инфильтрацию иммунных клеток в область воспаления при увеите.

Пример 7. Определение снижения уровня воспалительных цитокинов посредством твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA) у мышей с EAU

Для получения мононуклеарных клеток селезенки (MNC), селезенку мышей с EAU измельчали посредством клеточного сита, а затем получали MNC посредством HISTOPAQUE 1083. 5×10⁵ MNC высевали в микропланшет для титрования с плоским дном (96-луночный) в количестве 200 мкл/лунка в среде RPMI 1640 без добавления эмбриональной телячьей сыворотки (FBS). Каждую лунку стимулировали пептидом IRBP в концентрации 30 мкл/мл, и подвергали реакции при 37°С, 5% CO₂ в течение 72 часов. После этого получали супернатант и анализировали с использованием набора для (Biolegend) ELISA для IFN-γ, IL-17.

Из этих результатов было идентифицировано, что уровни как INF-γ, так и IL-17A были значительно увеличены в группе EAU по сравнению с нормальной мышью, однако такие уровни INF-γ и IL-17A были значительно снижены в группе EAU+CKD4 (группа введения глазных капель) (фиг. 11). Указанные экспериментальные результаты показывают, что введение соединения по изобретению посредством глазных капель эффективно снижает уровень системных воспалительных цитокинов при увеите.

Пример 8. Определение снижения уровня воспалительных цитокинов посредством ПЦР в реальном времени у мыши с EAU

Для проведения ПЦР в реальном времени, сначала выделяли сетчатку из глазного яблока, которое было извлечено из мыши с EAU, а затем его клетки растворяли в реагенте Trizol. затем синтезировали кДНК с помощью образца РНК с использованием PrimeScript RT Master (TAKARA). После этого проводили ПЦР в реальном времени с использованием системы StepOnePlusReal-Time PCR System (Applied Biosystems), с использованием SYBR Premix Ex Tap (TAKARA) и праймера, специфичного к каждому из генов (IL-1β, TNF-α, IFN-γ, IL-17, HDAC6). Последовательности оснований праймеров, использованных в эксперименте, являются следующими (таблица 3).

[Таблица 3]

Ген-мишень Последовательность оснований mHDAC6 (F) 5'-AAGTGGAAGAAGCCGTGCTA-3'
(SEQ ID NO: 1) (R) 5'-CTCCAGGTGACACATGATGC-3'
(SEQ ID NO: 2) mIL-17 (F) 5'-TCCACCGCAATGAAGACCCTGATA-3'
(SEQ ID NO: 3) (R) 5'-ACCAGCATCTTCTCGACCCTGAAA-3'
(SEQ ID NO: 4) mIFN-γ (F) 5'-ACAAAGATGGCAGAGCACGA-3'
(SEQ ID NO: 5) (R) 5'-TCCACCAACATGTGCGGTTT-3'
(SEQ ID NO: 6) mIL-1β (F) 5'-AAGGGCTGCTTCCAAACCTTTGAC-3'
(SEQ ID NO: 7) (R) 5'-ATACTGCCTGCCTGAAGCTCTTGT-3';
(SEQ ID NO: 8) mIL-6 (F) 5'-TGGCTAAGGACCAAGACCAT-3'
(SEQ ID NO: 9) (R) 5'-TAACGCACTAGGTTTGCCGA-3'
(SEQ ID NO: 10) TNF-α (F) 5'-AGCCGATGGGTTGTACCTTGTCTA-3'
(SEQ ID NO: 11) (R) 5'-TGAGATAGCAAATCGGCTGACGGT-3'
(SEQ ID NO: 12) β-актин (F) 5'-AGGGAAATCGTGCGTGACAT-3'
(SEQ ID NO: 13) (R) 5'-AACCGCTCGTTGCCAATAGT-3'
(SEQ ID NO: 14)

Из этих результатов, было идентифицировано, что уровень HDAC6 возрастал в каждой группе EAU, и уровни IL-1β, INF-γ, IL-17 и TNF-α, которые являются воспалительными факторами, также были значительно увеличены. Однако в группе EAU+CKD4 было идентифицировано, что уровни экспрессии HDAC6 и указанных воспалительных факторов значительно снижались и возвращались к уровню у нормальной мыши в группах введения как посредством глазных капель, так и в/б (фиг. 12). Указанные экспериментальные результаты показывают, что введение соединения по изобретению посредством глазных капель эффективно снижает уровень воспалительных цитокинов в области воспаления при увеите.

Пример 9. Наблюдение изменений в иммунных клеток посредством проточного цитометра (FACS) у мыши с EAU

Изменения экспрессии цитокинов, а также иммунных клеток, при возникновении увеита, были идентифицированы в сетчатке или дренирующем лимфатическом узле посредством проточного цитометра (клеточный сортер с активацией флуоресценции, FACS).

В частности, сетчатку или ткань дренирующего лимфатического узла преобразовывали в отдельные клетки, а затем проводили окрашивание на CD4, CD19, CD45, CD11b, F4/80 (Biolegend), и т.д. которые являются маркерами клеточной поверхности, а затем проводили окрашивание на IFN-γ, IL-17 и IL-1β (Biolegend), которые являются внутриклеточными маркерами, путем фиксации клеток и проведения пермеабилизации. Затем идентифицировали паттерн экспрессии каждого маркера посредством проточного цитометра (Flow cytometry, Canto II).

Из этих результатов было идентифицировано, что количество клеток INF-γ(+)/CD4(+) было увеличено в тканях сетчатки мышей группы с EAU, но было значительно снижено в группе введения глазных капель (фиг. 13) и группе в/б введения (фиг. 14; что соответствует как 10, так и 30 мг/кг) в случае группы EAU+CKD4 (фиг. 13 и 14). Аналогично, было идентифицировано, что количество клеток INF-γ(+)/CD4(+) также было увеличено в тканях лимфатических узлов мышей группы с EAU, однако количество указанных клеток было значительно снижено как в группе введения глазных капель (фиг. 15), так и в группе в/б введения (фиг. 16) в случае группы EAU+CKD4 (фиг. 15 и 16).

С другой стороны, было идентифицировано, что количество клеток IL-1β(+) было значительно увеличено в тканях как сетчатки, так и лимфатических узлов, мышей группы EAU, однако было значительно снижено в группе введения глазных капель в случае группы EAU+введение CKD4 (фиг. 17 и 18). Также было идентифицировано, что каждое из количества клеток CD11b(+), CD19(+) и F4/80(+) было значительно увеличено в лимфатических узлах мышей группы EAU, но было снижено в группе EAU+введение CKD4 (группа в/б введения) (фиг. 19-21).

Результаты эксперимента, приведенные выше, показывают, что соединение в соответствии с настоящим изобретением достигает превосходного иммунодепрессивного эффекта в отношении увеита, так что оно может выступать в качестве эффективного терапевтического средства против увеита.

В то время как конкретные части настоящего изобретения подробно описаны выше, специалистам в данной области понятно, что такое подробное описание приведено только для иллюстрации предпочтительных иллюстративных вариантов осуществления, и его не следует истолковывать как ограничивающее объем настоящего изобретения. Таким образом, следует понимать, что основной объем настоящего изобретения определяется прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> CHONG KUN DANG PHARMACEUTICAL CORP.

<120> КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ УВЕИТА

<130> P18065-CKD

<150> KR 10-2018-0020058

<151> 2018-02-20

<160> 14

<170> KoPatentIn 3.0

<210> 1

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер(F)_mHDAC6

<400> 1

aagtggaaga agccgtgcta 20

<210> 2

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер(R)_mHDAC6

<400> 2

ctccaggtga cacatgatgc 20

<210> 3

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер (F)_mIL-17

<400> 3

tccaccgcaa tgaagaccct gata 24

<210> 4

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер (R)_mIL-17

<400> 4

accagcatct tctcgaccct gaaa 24

<210> 5

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер (F)_mIFN-gamma

<400> 5

acaaagatgg cagagcacga 20

<210> 6

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер (R)_mIFN-gamma

<400> 6

tccaccaaca tgtgcggttt 20

<210> 7

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер (F)_mIL-1beta

<400> 7

aagggctgct tccaaacctt tgac 24

<210> 8

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер (R)_mIL-1beta

<400> 8

atactgcctg cctgaagctc ttgt 24

<210> 9

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер (F)_mIL-6

<400> 9

tggctaagga ccaagaccat 20

<210> 10

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер (R)_mIL-6

<400> 10

taacgcacta ggtttgccga 20

<210> 11

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер (F)_TNF-alpha

<400> 11

agccgatggg ttgtaccttg tcta 24

<210> 12

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер (R)_TNF-alpha

<400> 12

tgagatagca aatcggctga cggt 24

<210> 13

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер (F)_beta-actin

<400> 13

agggaaatcg tgcgtgacat 20

<210> 14

<211> 20

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Праймер (R)_beta-actin

<400> 14

aaccgctcgt tgccaatagt 20

<---

Настоящая группа изобретения относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и предназначена для лечения увеита. Для предупреждения или лечения увеита примененяют соединения формулы I, где A представляет собой , каждый из Xa и Xb независимо представляет собой CH, каждый из L₁ и L₂ независимо представляет собой водород или галоген, Q представляет собой C(=O), Y выбран из следующей группы: , M представляет собой C, N или O, где в том случае, когда M представляет собой C, l и m равны 1; когда M представляет собой N, l равен 1 и m равен 0; и когда M представляет собой O, l и m равны 0, каждый из R_a1 и R_a2 независимо представляет собой водород; -C_1-4 прямой или разветвленный алкил, который является незамещенным, или галоген; n представляет собой целое число, равное 0, 1 или 2, R_b представляет собой водород, Z выбран из следующей группы: , каждый из P_a и P_b независимо представляет собой водород; -C_1-4 прямой или разветвленный алкил, где он является незамещенным или по меньшей мере один атом водорода замещен галогеном; галоген; или -CF₃; или его фармацевтически приемлемой соли. Кроме того, изобретение описывает способ лечения увеита, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения формулы I и применение соединения формулы I для изготовления лекарственного средства для лечения увеита. Технический результат: обеспечено применение соединения формулы I, демонстрирующего превосходный эффект предупреждения или лечения увеита. 3 н. и 7 з.п. ф-лы, 3 табл., 21 ил., 9 пр.

[Формула I]

1. Применение соединения формулы I:

[Формула I]

,

где

A представляет собой ,

каждый из Xa и Xb независимо представляет собой CH,

каждый из L₁ и L₂ независимо представляет собой водород или галоген,

Q представляет собой C(=O),

Y выбран из следующей группы:

,

M представляет собой C, N или O, где в том случае, когда M представляет собой C, l и m равны 1; когда M представляет собой N, l равен 1 и m равен 0; и когда M представляет собой O, l и m равны 0,

каждый из R_a1 и R_a2 независимо представляет собой водород; -C_1-4 прямой или разветвленный алкил, который является незамещенным, или галоген;

n представляет собой целое число, равное 0, 1 или 2,

R_b представляет собой водород

Z выбран из следующей группы:

,

каждый из P_a и P_b независимо представляет собой водород; -C_1-4 прямой или разветвленный алкил, где он является незамещенным или по меньшей мере один атом водорода замещен галогеном; галоген или -CF₃;

или его фармацевтически приемлемой соли для предупреждения или лечения увеита.

2. Применение по п.1, где соединение, соответствующее формуле I выше, представляет собой соединение, соответствующее следующей формуле Ia:

[Формула Ia]

,

где

каждый L₁ и L₂ независимо представляет собой водород или галоген,

Y представляет собой , или ,

Z представляет собой фенил или пиридинил,

где по меньшей мере один водород фенила или пиридинила может быть замещен галогеном, CF₃ или CH₂F.

3. Применение по п.2, где соединение, соответствующее формуле Ia выше, представляет собой соединение, приведенное в следующей таблице:

4. Применение по п.1, где указанный увеит представляет собой передний увеит, промежуточный увеит, задний увеит или тотальный увеит.

5. Применение по п.1, где указанный увеит представляет собой инфекционный увеит или неинфекционный увеит.

6. Применение по п.1, где указанное соединение или его фармацевтически приемлемую соль вводят парентерально.

7. Применение по п.1, где указанное соединение или его фармацевтически приемлемую соль вводят посредством глазных капель.

8. Применение по п.1, где указанное соединение или его фармацевтически приемлемую соль вводят внутрибрюшинно.

9. Способ лечения увеита, включающий введение терапевтически эффективного количества соединения формулы I:

[Формула I]

,

где

A представляет собой ,

каждый из Xa и Xb независимо представляет собой CH,

каждый из L₁ и L₂ независимо представляет собой водород или галоген,

Q представляет собой C(=O),

Y выбран из следующей группы:

,

M представляет собой C, N или O, где в том случае, когда M представляет собой C, l и m равны 1; когда M представляет собой N, l равен 1 и m равен 0; и когда M представляет собой O, l и m равны 0,

каждый из R_a1 и R_a2 независимо представляет собой водород; -C_1-4 прямой или разветвленный алкил, который является незамещенным, или галоген;

n представляет собой целое число, равное 0, 1 или 2,

R_b представляет собой водород

Z выбран из следующей группы:

,

каждый из P_a и P_b независимо представляет собой водород; -C_1-4 прямой или разветвленный алкил, где он является незамещенным или по меньшей мере один атом водорода замещен галогеном; галоген или -CF₃;

или его фармацевтически приемлемой соли.

10. Применение соединения формулы I:

[Формула I]

,

где

A представляет собой ,

каждый из Xa и Xb независимо представляет собой CH,

каждый из L₁ и L₂ независимо представляет собой водород или галоген,

Q представляет собой C(=O),

Y выбран из следующей группы:

,

M представляет собой C, N или O, где в том случае, когда M представляет собой C, l и m равны 1; когда M представляет собой N, l равен 1 и m равен 0; и когда M представляет собой O, l и m равны 0,

каждый из R_a1 и R_a2 независимо представляет собой водород; -C_1-4 прямой или разветвленный алкил, который является незамещенным или галоген;

n представляет собой целое число, равное 0, 1 или 2,

R_b представляет собой водород

Z выбран из следующей группы:

,

каждый из P_a и P_b независимо представляет собой водород; -C_1-4 прямой или разветвленный алкил, где он является незамещенным или по меньшей мере один атом водорода замещен галогеном; галоген или -CF₃;

или его фармацевтически приемлемой соли для изготовления лекарственного средства для лечения увеита.