КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ НЕСКОЛЬКИХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПОЛИПЕПТИДОВ С ОДНОГО ВЕКТОРА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ СЕРДЦА И ДРУГИХ ПАТОЛОГИЙ Российский патент 2021 года по МПК C07K14/52 C07K19/00 C12N15/09 C12N15/62 A61K38/17 A61K48/00 A61P9/00 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительной заявки на патент США №62/254,139, поданной 11 ноября 2015 года, содержание которой полностью включено в настоящее описание посредством ссылки.

ССЫЛКА НА ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] Настоящая заявка содержит перечень последовательностей, который был подан в электронном виде в формате ASCII и который полностью включен в настоящее описание посредством ссылки. Указанная копия ASCII, созданная 11 ноября 2016 года, называется INX00339WO_2016111 l_SL.txt и имеет размер 271843 байта.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0003] В настоящем изобретении предложены новые нуклеиновые кислоты и векторы, а также полипептиды, кодируемые этими нуклеиновыми кислотами и векторами, для терапевтического лечения заболеваний, нарушений (расстройств) и патологических состояний с применением полигенных средств. Более конкретно, в настоящем изобретении предложены новые нуклеиновые кислоты, векторы, полипептиды и способы терапевтического лечения и предотвращения заболеваний сердца и сердечных нарушений с применением полигенных средств. Кроме того, в настоящем изобретении предложены новые нуклеиновые кислоты и полипептидные линкеры, которые обеспечивают экспрессию предпочтительного белка с нуклеиновых кислот и векторов, подходящих для терапевтического лечения заболеваний, нарушений и патологических состояний с применением полигенных средств.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

[0004] Потребность в лечении заболевания сердца остается чрезвычайно неудовлетворенной в области медицины; по некоторым оценкам заболевание сердца имеют по меньшей мере 25 миллионов пациентов во всем мире. Более того, согласно данным «Информационного бюллетеня по сердечной недостаточности» Государственных Центров США по контролю и профилактике заболеваний (CDC), по состоянию на 2013 год более 5 миллионов человек в США страдают от сердечной недостаточности. 1

[0005] По оценкам, сердечная недостаточность вызывает 1 из 9 смертей наряду с выявлением почти что 825000 новых случаев каждый год. Средний показатель выживаемости через 5 лет после постановки диагноза составляет приблизительно 40% и данное заболевание имеет самый высокий показатель повторной госпитализации среди любой клинико-статистической группы. Стоимость лечения в США оценивается в 32 млрд долларов в год. Варианты лечения сердечной недостаточности включают лекарственные средства, инвазивные устройства и трансплантацию сердца.

[0006] Застойную сердечную недостаточность (ЗСН) описывают как неспособность сердца обеспечить достаточную объемную скорость кровотока для обеспечения метаболических потребностей организма. В настоящее время во всем мире ЗСН диагностирована более чем у 22 миллионов человек, и свыше, чем у 5 миллионов пациентов в США. Поскольку с возрастом увеличивается уровень заболеваемости заболеваниями сердца и их тяжесть, ожидается, что общий уровень заболеваемости в будущем будет возрастать по причине старения популяции. Для пациентов с ЗСН прогноз остается неудовлетворительным, при этом пятилетний показатель смертности составляет 50%. По данным Американской кардиологической ассоциации (AHA), в 2013 году сердечно-сосудистые заболевания являлись причиной смерти 810000 человек в Соединенных Штатах Америки, что составляет ~1 на каждых из 3 зарегистрированных случаев смерти. Фармакологическое контролирование сердечной недостаточности на конечной стадии сосредоточено на трех следующих целях: 1) улучшение показателей заболеваемости и смертности (ингибиторы АПФ, антагонисты рецепторов ангиотензина II типа I, отдельные β-блокаторы и антагонисты альдостерона); 2) контроль симптомов (диуретики (в конечном итоге тиазид и петлевые диуретики), наперстянка (дигиталис, в низкой дозе), инотропы для временного приема и отдельные антиаритмические средства); и 3) паллиативная терапия (опиоиды, антидепрессанты, анксиолитики, кислород и инотропы для непрерывного приема). Однако по мере прогрессирования заболевания возможности терапии начинают ограничиваться сердечной ресинхронизирующей терапией (CRT), в ряде обстоятельств имплантируемым кардиовертер-дефибриллятором (ICD); трансплантацией (пересадкой) сердца и желудочковыми устройствами вспомогательного кровообращения (VAD), которые применяются как в качестве предшествующей трансплантации терапии, так и все чаще в качестве конечной целевой терапии из-за отсутствия донорских сердец. Хотя общая 5-летняя выживаемость у пациентов с пересаженным сердцем, получающих тройную иммуноподавляющую терапию, составляет 70-80%, пересадка сердца в качестве варианта лечения ограничена продолжающейся нехваткой донорских сердец, увеличением числа кандидатов на пересадку и очень высокой стоимостью, свыше 100000 долларов США в год. Данные, собранные с применением межведомственного регистра для устройств механической поддержки кровообращения (INTERMACS), показали, что с 23 июня 2006 года по 30 июня 2013 года 12335 пациентов получили одобренное американским Управлением по контролю за продуктами и лекарственными средствами (FDA) устройство надежной механической поддержки кровообращения (MCS), при этом частота набора испытуемых в такое исследование составляет 2000 пациентов в год.

[0007] Клеточная и генная терапия, направленные на лечение ЗСН исследуются все больше, однако результаты таких исследований немногочисленны вследствие проблем, связанных с биологическим воздействием, удержанием клеток, сроками доставки и отсутствием механизма или ограниченным воздействием одиночного гена. Тем не менее, во многих клинических испытаниях с применением генной терапии были продемонстрированы незначительные результаты после одного года терапии. Хотя генная терапия обладает определенным механизмом действия, одиночных генов, применяемых для улучшения ангиогенеза, хоуминга (homing) стволовых клеток или инотропии, оказывается недостаточно для лечения ЗСН. Поскольку ЗСН является многофакторным заболеванием по причине рубцевания, пониженной сократительной функции и потери клеток, подход с применением полигенной терапии может обеспечить лучшее адресное лечение таких отдельных факторов, при этом обеспечивая безопасность таких тяжелобольных пациентов.

[0008] Обычно векторы для генной терапии содержат одиночные гены. В последние годы возрос спрос на более сложные полигенные векторы. В частности, этот спрос стимулируется потребностью в комбинированной терапии, включающей лечение рака и противовирусное лечение. Комбинированная генная терапия - это наилучший подход с точки зрения медицины для предотвращения мутации и резистентности к раку. Объединив два или три агента, можно получить более полный и эффективный ответ.

ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСРЕДСТВОМ ССЫЛКИ

[0009] Все публикации, патенты и заявки на патент включены в настоящее описание посредством ссылки в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация, патент или заявка на патент были бы напрямую или косвенно указаны для включения посредством ссылки. В случае разночтений между описанием в настоящем документе и описанием в цитируемом документе, решающее значение будет иметь описание в настоящем документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ОПИСАНИЯ

[0010] Для все большего числа пациентов с застойной сердечной недостаточностью (ЗСН) по-прежнему существуют ограниченные возможности терапии. Например, стандартное лечение ЗСН заканчивается установкой левожелудочкового аппарата вспомогательного кровообращения (LVAD). Соответственно, необходим другой подход с применением биологических возможностей для стимулирования восстановления после ЗСН.

[0011] Подход к лечению сердечных нарушений, основанный на применении одиночных генов, целесообразен для пациентов с уникальными генетическими мутациями, т.е. в тропонине I или тяжелой цепи миозина. Однако у большинства пациентов с сердечной патологией терминальная стадия заболевания обусловлена множеством факторов. Поэтому в таких случаях вероятно, что подход, направленный на один ген, будет неэффективен. У пациентов с сердечной недостаточностью обычно присутствует рубцовая ткань, и им необходимо положительное ремоделирование с помощью постоянного привлечения (рекуртинга) клеток и/или ангиогенеза. Для них также необходимо увеличение инотропной функции через кальциевый или другие пути. Следовательно, комбинация генов, которые совместно действуют на транспорт кальция, рекрутинг клеток и ангиогенез, обеспечивает более подходящий способ лечения и восстановления таких пациентов с терминальной стадией ЗСН. Кроме того, при рассмотрении основанного на генах подхода к лечению сердечных нарушений (таких как, но не ограничиваясь ею, ЗСН), применение вирусных векторов может вызывать противодействие иммунной системы человека, или у пациентов уже могут быть предварительно образованные противовирусные антитела (например, антитела против AAV1/AAV2), что может вызвать проблемы с безопасностью и эффективностью. Таким образом, применение плазмидной ДНК, которая не вызывает или вызывает незначительный побочный иммунный ответ у людей, и применение дозы, которую можно повторно вводить по мере надобности, обеспечивает предпочтительный способ доставки терапевтического гена.

[0012] Таким образом, в одном варианте реализации настоящего изобретения предложен невирусный вектор на основе плазмидной ДНК, содержащий три эффекторных гена, для терапевтического лечения заболеваний сердца и сердечных нарушений (расстройств) (например, но не ограничиваясь ею, ЗСН). В одном из вариантов реализации настоящего изобретения предложен невирусный вектор (конструкция) на основе плазмидной ДНК, содержащий три эффекторых гена. В конкретном варианте реализации настоящего изобретения плазмида экспрессии, обозначенная как рХоХ, кодирует и экспрессирует биологически активные SDF1α, S100A1 и VEGF, при этом эти три представляющих интерес эффекторных гена (GOI) разделены с помощью выборочно разработанных линкерных последовательностей, описанных в настоящем документе.

[0013] Подход с применением полигенной плазмидной ДНК для лечения сердечных заболеваний и нарушений (например, но не ограничиваясь ею, ЗСН) основан на полученных in vitro положительных, доклинических и клинических данных, полученных из других исследований, в которых используются одиночные гены. Каждый из представляющих интерес генов, описанных ниже, обладает специфической функцией в отношении инотропности (например, S100A1), хоуминга клеток (например, SDF-1α) и ангиогенеза (например, VEGF165). Целесообразность выбора одной плазмидной конструкции, содержащей все три гена вместо одиночного гена в составе отдельно доставляемых плазмид, заключается в том, что если в клетки доставляются одиночные гены (в составе индивидуальных, отдельных векторах), то не существует способов, при помощи которых можно контролировать количество трансфекций каждого гена в клетку. Такая изменчивость в доставке генов делает терапию небезопасной и невоспроизводимой, даже в том случае, если она обеспечивает более простой подход в сравнении с одиночными полигенными конструкциями согласно настоящему изобретению. Следовательно, в одном варианте реализации такие векторы, как рХоХ, конститутивно экспрессируют S100A1 (внутриклеточный белок), SDF-1α (секретируемый белок) и VEGF165 (секретируемый белок). В присутствии рХоХ конструкция pDNA транскрибируется в виде одной мРНК, которая транслируется в виде трех отдельных функциональных белков посредством расщепления за счет комбинированной активности фурина и Р2А (fp2a). Способный к саморасщеплению 2А-пептид кодирует последовательность (Р2А), которая опосредует трансляционный эффект, известный как трансляция по механизму «рибосомного перепрыгивания» (ribosome skipping), «stop-go» и «stop-carry on», что приводит к совместной экспрессии нескольких белков с одного транскрипта мРНК под контролем одиночного промотора. Конститутивная экспрессия управляется промоторами, такими как, но не ограничиваясь ими, CAG-промотор (гибридный промотор, содержащий промотор бета-актина курицы (СВА) с CMV-энхансером и гибрид экзон 1 СВА/интрон бета-глобина кролика). Дальнейшее описание трех эффекторов и целесообразность их выбора для включения в конструкции согласно настоящему изобретению описаны ниже.

S100A1

[0014] S100A1 является членом суперсемейства Са²⁺-связывающих белков EF-руки (EF-hand) (Rohde et al., J. Cardiovasc. Transl. Res., vol. 3, №5, pp. 525-537, 2010). S100A1 представляет собой белок с массой 10,4 кДа, который в основном функционирует как гомодимер в кардиомиоцитах для регулирования контролируемых ионами Са²⁺ сетей и потоков для контроля сократительной функции, возбудимости, метаболизма, поддержания и выживания. Исследования на животных и человеке продемонстрировали пониженную экспрессию S100A1 при сердечной недостаточности (Pleger et al., Circulation, vol. 115, №19, pp. 2506-2515, 2007; и Remppis et al., Biochim. Biophys. Acta., vol. 1313, №3, pp. 253-257, 1996). Вирусную доставку S100A1 успешно применяли на моделях сердечной недостаточности у крупных животных. В частности, генная терапия с применением AAV9-S100A1, которую оценивали в модели на свиньях, продемонстрировала защиту от гемодинамического ухудшения, улучшение сердечной функции и нормализацию сердечного ритма (Rohde et al., J. Mol. Cell. Cardiol., vol. 50, №5, pp. 777-784, 2011). Другое исследование с применением AAV6-S100A1 в модели сердечной недостаточности у свиньи продемонстрировало безопасность гиперэкспрессии S100A1, свидетельствуя об отсутствии увеличения аритмий или дисфункции правого желудочка; однако было отмечено значительное увеличение фракции выброса левого желудочка и ремоделирования сердца (Weber et al., Gene Ther., vol. 21, pp. 131-138, 2014). Такие исследования подтверждают эффективность терапии с применением S100A1 у людей с термальной стадией сердечной недостаточности.

SDF-1α

[0015] Фактор-1α стромальной клетки (SDF-1α) представляет собой хемокин с массой 8 кДа, который играет важную роль в рекуртинге мышечных стволовых клеток сердца, ингибировании гибели кардиомиоцитов и улучшении сердечной функции путем связывания с рецептором CXCR4 на поверхности мезенхимальных стволовых клеток (Penn et al, Gene Ther., vol. 19, №6, pp. 583-587, 2012). Невирусную ДНК-плазмиду, кодирующую человеческий SDF-1α, исследовали в нескольких клинических испытаниях (Penn et al., Circ Res, vol. 112, №5, pp. 816-825, 2013; и Chung et al., Eur. Heart. J., vol. 36, pp. 2228-2238, 2015). Результаты этих испытаний показали, что гиперэкспрессия SDF-1α является относительно безопасной без каких-либо серьезных непредвиденных, связанных с гиперэкспрессией, побочных явлений, включая аритмии или прогрессирование до дальнейших приступов сердечной недостаточности. Такое исследование также продемонстрировало, что гиперэкспрессия SDF-1 может улучшать функцию у пациентов с ЗСН при вводимых внутримышечно дозах в 15 мг или 30 мг. Кроме того, было обнаружено, что плазмидная ДНК, доставляемая ретроградно через коронарный синус в дозе 45 мг, является безопасной.

VEGF

[0016] Семейство белков фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) участвует в образовании новых сосудов, миграции и активации эндотелиальных клеток, рекрутинге стволовых клеток и регенерации тканей (Taimeh et al., Nat. Rev. Cardiol., vol. 10, №9, pp. 519-530, 2013). Нарушение сосудистой регуляции является важным компонентом патофизиологии сердечной недостаточности, а пониженные уровни VEGF наблюдаются в моделях прогрессирующей сердечной недостаточности. Существует несколько изоформ VEGF. Тем не менее VEGF165 применяли как в доклинических, так и в клинических моделях. Была продемонстрирована целесообразность выбора VEGF в качестве варианта лечения сердечной недостаточности с применением переноса генов при помощи векторов, таких как «оголенная» плазмидная ДНК и аденовирус, в животных моделях, в которых показаны улучшенная коллатеральная перфузия и общая сердечная функция. Клиническое применение VEGF 165 изучали как при непосредственном введении плазмидной ДНК, так и при введении посредством вирусного вектора с положительными, но немногочисленными результатами. В определенных вариантах реализации VEGF 165 имеет последовательность, содержащую аминокислоты с 27 по 191 последовательности VEGF191, описанной в настоящем документе. В определенных вариантах реализации VEGF 165 имеет последовательность, содержащую аминокислоты 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 или с 34 по 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190 или 191 последовательности VEGF191, описанной в настоящем документе. В определенных вариантах реализации VEGF 165 имеет последовательность, содержащую аминокислоты с 30 по 185 последовательности VEGF191, описанной в настоящем документе.

[0017] CAG-промотор, применяемый в сочетании с каждым отдельным геном (т.е. S100A1, SDF1α и VEGF165), продемонстрировал индивидуальное воздействие на рубцовую ткань, сердечную функцию и ремоделирование. Эффект каждого из генов в сердечной ткани является уникальным. Потенциально улучшенное воздействие всех трех генов исследовали только in vitro. Тем не менее, было продемонстрировано в мышиной модели ишемии тазовой конечности, что местное введение комбинации VEGF с SDF-1α усиливается путем стимулирования индуцированной эндотелиальной клеткой-предшественником неоваскуляризации (Yu et al., J. Vase. Surg., vol. 50, №3, pp. 608-616, 2009).

[0018] В настоящем документе соответственно предложены полинуклеотидные конструкции (такие как, но не ограничиваясь ими, невирусные плазмидные векторы), кодирующие полипептид, содержащий первый функциональный (т.е. биологически активный) полипептид, второй функциональный полипептид и необязательно третий функциональный полипептид.

[0019] В настоящем документе предложены полинуклеотидные конструкции, кодирующие полипептид, содержащий полипептид S100, второй функциональный полипептид и необязательно третий функциональный полипептид, при этом указанный второй и необязательно третий функциональный полипептид содержат любое из цитокина, хемокина или ангиогенного полипептида.

[0020] В настоящем документе предложены полинуклеотидные конструкции, содержащие полинуклеотидные последовательности, кодирующие последовательности полипептидного линкера для разделения первого и второго и необязательно для разделения второго и третьего функциональных полипептидов.

[0021] В настоящем документе предложены полипептиды, кодируемые полинуклеотидом, описанным в настоящем документе. Также предложены клетки, содержащие по меньшей мере один полинуклеотид или вектор, описанные в настоящем документе.

[0022] В настоящем документе предложены способы лечения патологии (заболевания) сердца, включающие приведение в контакт клетки с терапевтически эффективным количеством полинуклеотида, описанного в настоящем документе. В некоторых случаях указанная клетка представляет собой клетку миокарда.

[0023] В настоящем документе предложены способы лечения заболеваний сердца и сердечных нарушений, например, но не ограничиваясь ею, застойной сердечной недостаточности (ЗСН), у субъекта, включающие обеспечение субъекта терапевтически эффективным количеством композиции, содержащей описанные в настоящем документе полинуклеотид или вектор. В некоторых случаях субъект является млекопитающим или человеком. В некоторых случаях указанному субъекту назначают по меньшей мере одну дополнительную терапию.

[0024] В настоящем документе предложены фармацевтические композиции, содержащие полинуклеотид, описанный в настоящем документе, или полипептид, кодируемый описанным в настоящем документе полинуклеотидом, и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

[0025] В настоящем документе предложены композиции, содержащие: по меньшей мере один комплекс плазмиды и микропузырька, при этом указанный микропузырек содержит липид, газ и плазмиду, содержащую описанный в настоящем документе полинуклеотид. В некоторых вариантах реализации указанный липид образует оболочку, окружающую указанные газ и плазмиду. В некоторых случаях указанный газ представляет собой перфторуглеродный газ, как, например, перфторпропан. В некоторых вариантах реализации комплекс плазмиды и микропузырька содержит по меньшей мере одно из 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолина и 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламинглицерина.

[0026] В настоящем документе предложены способы, включающие введение субъекту композиции комплекса плазмиды и микропузырька, описанного в настоящем документе; и воздействие на указанного субъекта энергией ультразвука, достаточной для того, чтобы привести к разрушению ультразвуком по меньшей мере одного микропузырька в заранее определенной ткани или органе. В некоторых случаях разрушение по меньшей мере одного микропузырька в указанной заранее определенной ткани или органе обеспечивает доставку указанной плазмиды в указанную ткань или орган. В некоторых случаях указанная ткань или орган представляет собой орган, который может быть сердцем, печенью или почкой.

[0027] В настоящем документе предложен способ лечения заболевания сердца или сердечного нарушения (например, но не ограничиваясь ими, застойная сердечная недостаточность, кардиомиопатия, аритмия, заболевание перикарда, заболевание аорты, синдром марфана и заболевание коронарной артерии) у субъекта, включающий: введение указанному субъекту количества композиции комплекса плазмиды и микропузырька, описанного в настоящем документе; воздействие на указанного субъекта энергией ультразвука, достаточной для того, чтобы привести к разрушению ультразвуком по меньшей мере одного микропузырька, и доставку плазмиды в сердце указанного субъекта.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0028] Уникальные и предпочтительные характеристики настоящего изобретения подробно изложены в прилагаемой формуле изобретения. Понимание характеристик и преимуществ настоящего изобретения также можно получить со ссылкой на нижеследующее подробное описание, в котором представлены примеры вариантов реализации, в которых используются принципы настоящего изобретения, и сопровождающие их чертежи:

[0029] На ФИГ. 1 представлены способы, в которых невирусную доставку генов кардиальных эффекторных белков осуществляют путем альтернативных конфигураций новых векторных конструкций, содержащих описанные в настоящем документе линкерные последовательности.

[0030] На ФИГ. 2 показана устойчивая экспрессия люциферазы в кардиомиоцитах с конструкций, содержащих линкеры, описанные в настоящем документе, в первичных клетках (in vitro) посредством введения векторов, содержащих att-сайт люциферазы, с трансфекцией SPBc2 (рекомбиназы). Клетки, лишенные либо att-сайта, либо рекомбиназы, быстро возвращались к исходным уровням экспрессии. День 2 (D2), День 5 (D5), День 9 (D9),День 14 (D14).

[0031] На ФИГ. 3 показаны данные полученной в модели грызунов экспрессии люциферазы с остова плазмидного вектора, с которого могут экспрессироваться гены кардиальных эффекторных белков (рХоХ, кодирующий биологически активные SDF1α, S100A1 и VEGF), разделенные описанными в настоящем документе линкерами.

[0032] На ФИГ. 4 показаны различные стадии прогрессирования состояний сердечной недостаточности и соответствующие стандартные режимы лечения и способы для воздействия и лечения.

[0033] На ФИГ. 5А и ФИГ. 5В показан анализ пролиферации эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC). A. HUVEC после обработки рекомбинантным VEGF В. Показана пролиферация HUVEC после обработки супернатантом VEGF-трансфицированных индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC). Клетки iPSC трансфицировали и инкубировали в течение 96 часов. Супернатант собирали и применяли для культивирования HUVECS. Пролиферацию HUVEC измеряли при помощи CellTiter-Glo.

[0034] На ФИГ. 6 показана пролиферация HUVEC после обработки супернатантами трансфицированных iPSC кардиомиоцитов. Клетки iPSC кардиомиоцитов получали от пациентов с дилатационной кардиомиопатией (DCM), гипертрофической кардиомиопатией (НСМ) или здоровых контрольных групп, и они демонстрируют эффективную экспрессию и активность функциональных полипептидов, кодируемых полинуклеотидами, описанными в настоящем документе, содержащих описанные в настоящем документе линкеры.

[0035] На ФИГ. 7 представлены iPSC-CM, трансфицированные конструкциями, содержащими один ген, два гена и три гена полипептида SDF1, показывающие повышенную миграцию лимфоцитов периферической крови (PBL), демонстрирующие эффективную экспрессию и активность функциональных полипептидов, кодируемых полинуклеотидами, описанными в настоящем документе, содержащих описанные в настоящем документе линкеры.

[0036] На ФИГ. 8 показан анализ миграции, где AMD3100 (антагонист CXCR4) специфическим образом ингибирует зависимую от SDF1-CXCR4 миграцию. Данные показывают, что SDF1 является функциональным в конструкциях, содержащих два гена и содержащих три гена, поскольку миграция снижается в присутствии AMD3100.

[0037] На ФИГ. 9 показано исследование на свинье, в котором изображения биолюминесценции показывают ретроградную перфузию репортерной плазмиды через коронарный синус, также содержащей линкер, описанный в настоящем документе, которая приводит к доставке в сердце и экспрессии доставляемого репортерного гена через 24 часа. Интенсивность излучения и распределение через 24 часа после ретроградной инфузии экспрессирующих люциферазу плазмид через коронарный синус сердца свиньи. Три дозы плазмиды (40, 80 и 120 мг) исследовали в трех повторах.

[0038] На ФИГ. 10 показан анализ миграции, в котором кардиомиоциты трансфицировали конструкциями, содержащими два гена и содержащими три гена, экспрессирующими SDF1. Миграция клеток Jurkat с применением супернатанта iPSC-CM показывает, что трансфекция и SDF1-белок является функциональным и вызывает значительную миграцию, демонстрируя эффективную экспрессию и активность функциональных полипептидов, кодируемых описанными в настоящем документе полинуклеотидами, содержащих линкеры, описанные в настоящем документе.

[0039] На ФИГ. 11 показан анализ миграции, в котором кардиомиоциты трансфицировали конструкциями, содержащими два и содержащими три гена, экспрессирующими SDF1. Миграция клеток Jurkat с применением супернатанта iPSC-CM показывает, что трансфекция и SDF1-белок является функциональным и вызывает значительную миграцию. Данные показывают зависимую от дозы миграцию клеток Jurkat, демонстрирующую эффективную экспрессию и активность функциональных полипептидов, кодируемых описанными в настоящем документе полинуклеотидами, содержащих линкеры, описанные в настоящем документе.

[0040] На ФИГ. 12 показаны кардиомиоциты, полученные от субъекта с дилатационной кардиомиопатией, трансфицированные конструкциями, содержащими два гена и содержащими три гена, кодирующими SDF1. Данные показывают SDF1-зависимую миграцию клеток Jurkat. SDF1, экспрессируемый конструкциями, содержащими два и содержащими три гена, в клетках iPSC-CM дилатационной кардиомиопатии, является функциональным.

[0041] На ФИГ. 13 показаны кардиомиоциты, полученные от субъекта с гипертрофической кардиомиопатией, трансфицированные конструкциями, содержащими два гена и содержащими три гена, кодирующими SDF1. Данные показывают SDF1-зависимую миграцию клеток Jurkat. SDF1, экспрессируемый конструкциями, содержащими два гена и содержащими три гена, в клетках iPSC-CM гипертрофической кардиомиопатии, является функциональным.

[0042] На ФИГ. 14А и ФИГ. 14В показан анализ пролиферации, выполненный с применением клеток HUVECS. А. показывает, что полученные от субъекта с DCM кардиомиоциты, трансфицированные конструкциями, содержащими два гена и содержащими три гена, продуцируют функциональный VEGF-белок, способный индуцировать пролиферацию HUVEC. (Примечание. Образец 8 не исследовали в 1 и 2 цикле анализа) На ФИГ. 14В показано, что полученные от здорового субъекта кардиомиоциты, трансфицированные конструкциями, содержащими два гена и содержащими три гена, продуцируют функциональный VEGF-белок, который способен индуцировать пролиферацию HUVEC.

[0043] На ФИГ. 15А и ФИГ. 15В представлена экспрессия белка SDF1 в 293Т-клетках, трансфицированных вектором, содержащим два гена, кодирующих S100A1-SDF1. А. Полученная по результатам анализа ELISA стандартная кривая, показывающая поглощение SDF1. В. Концентрация SDF1 в супернатанте 293Т-клеток. Данные свидетельствуют об эффективной экспрессии функциональных (т.е. биологически активных) полипептидов, кодируемых описанными в настоящем документе полинуклеотидами, содержащих линкеры, описанные в настоящем документе.

[0044] На ФИГ. 16А и ФИГ. 16В представлена экспрессия белка VEGF в 293Т-клетках, трансфицированных вектором, содержащим два гена, кодирующих S100A1-VEGF191. А. Полученная по результатам анализа ELISA стандартная кривая, показывающая поглощение VEGF. В. Концентрация VEGF в супернатанте 293Т-клеток. Эти данные свидетельствуют об эффективной экспрессии функциональных (т.е. биологически активных) полипептидов, кодируемых описанными в настоящем документе полинуклеотидами, содержащих линкеры, описанные в настоящем документе.

[0045] На ФИГ. 17А и ФИГ. 17В представлена экспрессия белка S100A1 в 293Т-клетках, трансфицированных вектором, содержащим два гена, кодирующих S100A1-SDF1. А. Полученная по результатам анализа ELISA стандартная кривая, показывающая поглощение S100A1. В. Концентрация S100A1 в супернатанте 293Т-клеток. Эти данные свидетельствуют об эффективной экспрессии функциональных (т.е. биологически активных) полипептидов, кодируемых описанными в настоящем документе полинуклеотидами, содержащих линкеры, описанные в настоящем документе.

[0046] На ФИГ. 18 показана гистограмма концентраций S100A1, продуцируемого кардиомиоцитами, трансфицированными конструкциями, содержащими один ген, два гена и три гена.

[0047] На ФИГ. 19 показана гистограмма концентраций SDF-1α, продуцируемого кардиомиоцитами, трансфицированными конструкциями, содержащими один ген, два гена и три гена.

[0048] На ФИГ. 20 показана гистограмма концентраций VEGF, продуцируемого кардиомиоцитами, трансфицированными конструкциями, содержащими один ген, два гена и три гена.

[0049] На ФИГ. 21 показано обнаружение методом вестерн-блоттинга (иммуноблоттинга) расщепления полипептида S100A1, продуцируемого кардиомиоцитами, трансфицированными конструкциями, содержащими один ген, два гена и три гена.

[0050] На ФИГ. 22 показано обнаружение методом вестерн-блоттинга (иммуноблоттинга) расщепления полипептида SDF-1α, продуцируемого кардиомиоцитами, трансфицированными конструкциями, содержащими один ген, два гена и три гена.

[0051] На ФИГ. 23 показано обнаружение методом вестерн-блоттинга (иммуноблоттинга) расщепления полипептида VEGF, продуцируемого кардиомиоцитами, трансфицированными конструкциями, содержащими один ген, два гена и три гена.

[0052] На ФИГ. 24 показано образование димерного S100A1 в результате экспрессии генов с конструкций, содержащих три гена, с применением линкеров согласно настоящему изобретению, которые обнаруживаются методами неденатурирующего ПААГ-электрофореза и иммуноблоттинга.

[0053] На ФИГ. 25А и ФИГ. 25В показано сравнение iPSC-клеток, полученных от пациентов с дилатационной кардиомиопатией, со здоровыми клетками контроля в показателях А. частоты биения iPSC-клеток, трансфицированных pStuffer, вектором, кодирующим pS100A1, или вектором, кодирующим S100A1, содержащим 2А-хвост; В. продолжительности сокращения iPSC-клеток, трансфицированных pStuffer, вектором, кодирующим pS100A1, или вектором, кодирующим S100A1, содержащим 2А-хвост. Данные свидетельствуют о том, что наличие 2А-хвоста на 3'-конце вектора, кодирующего S100A1, не влияет на функцию S100A1. (pStuffer представляет собой плазмиду с той же конфигурацией остова, что и у рХоХ, при этом открытая рамка считывания (ОРС) заменена на неэкспрессирующую спейсерную последовательность аналогичного размера).

[0054] На ФИГ. 26А, ФИГ. 26В и ФИГ. 26С показано сравнение iPSC-клеток, полученных от пациентов с дилатационной кардиомиопатией, со здоровыми клетками контроля в показателях А. частоты биения iPSC-клеток, трансфицированных ДНК1 (CAGStufferNXB-V2), ДНК2 (CAG-S100A1 (без последовательности Козак (Kozak)), ДНК3 (CAG-S100A1-fp2a-SDF1), ДНК4 (CAG-S100A1-fp2a-SDF1-fp2a-VEGF), ДНК5 (CAG-S100A1-CMV-SDF1-fp2a-VEGF 191) или нетрансфицированным контролем; В. частоты сокращения iPSC-клеток, трансфицированных ДНК 1, ДНК2, ДНК3, ДНК4, ДНК5 или нетрансфицированным контролем; С. продолжительности сокращения iPSC-клеток, трансфицированных ДНК1, ДНК2, ДНК3, ДНК4, ДНК5 или нетрансфицированным контролем. Данные показывают восстановление сократительных свойств у пациентов с DCM до уровней здорового контроля.

[0055] На ФИГ. 27А и ФИГ. 27В показан вектор, содержащий три гена, которые кодируют S100A1, SDF-1-альфа и VEGF165. На ФИГ. 27А показано схематическое изображение вектора рХоХ, содержащего три гена, которые кодируют биологически активные SDF1α, S100A1 и VEGF. На ФИГ. 27В представлены отдельные генные элементы в векторе, содержащем три гена.

[0056] На ФИГ. 28 показаны данные экспрессии VEGF в экспериментах по титрованию рекомбиназы. Данные свидетельствуют об интеграции VEGF в геномную ДНК.

[0057] На ФИГ. 29 показаны данные экспрессии SDF-1α в экспериментах по титрованию рекомбиназы. Данные свидетельствуют об интеграции SDF-1α в геномную ДНК.

[0058] На ФИГ. 30 показаны данные экспрессии S100A1 в экспериментах по титрованию рекомбиназы. Данные свидетельствуют об интеграции S100A1 в геномную ДНК.

[0059] На ФИГ. 31А-С терапевтические результаты in vivo показаны через измерение структуры сердца с помощью эхокардиографии и как функция фракции сокращения. На ФИГ. 31А результаты представлены как функция фракции сокращения в процентах. На ФИГ. 31В показана толщина задней стенки левого желудочка (см) при введении конструкции pStuffer в сравнении с конструкцией рХоХ. На ФИГ. 31С показана толщина межжелудочковой перегородки в конце диастолы (IVSd) (см) при введении конструкции pStuffer в сравнении с конструкцией рХоХ. Значения представлены как среднее ± средняя ошибка среднего. **Р<0,001 в сравнении с pStuffer.

[0060] На ФИГ. 32 показаны результаты ядерной локализации РНН3 (фосфогистона Н3 (Ser10)). Сигнал митотического маркера в мышечных клетках сердца, демонстрирующий регенерацию кардиомиоцитов. Примеры изображений 4-х из 8 крыс на плазмиду. Масштаб полоски составляет 25 мкм.

[0061] На ФИГ. 33 показаны результаты визуализации, демонстрирующие отрицательные результаты ISL-1, маркер ранних клеток-предшественников мышечных клеток сердца, подтверждающий, что клетки-предшественники не участвует в регенерации. Следовательно, наблюдаемая регенерация кардиомиоцитов является результатом генной терапии с применением UTMD-pXoX. Примеры изображений 4-х из 8 крыс на плазмиду. Масштаб полоски составляет 25 мкм.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0062] Нижеследующее описание и примеры подробно иллюстрируют варианты реализации настоящего изобретения. Следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными вариантами реализации, описанными в настоящем документе, и в этой связи они могут варьироваться. Специалистам в данной области техники будет понятно, что существует многочисленные вариации и модификации настоящего изобретения, которые входят в его объем.

[0063] Все термины предназначены для понимания в том смысле, в котором они их понимает специалист в данной области техники. Если не указано иное, то все технические и научные термины, применяемые в настоящем описании, имеют то же значение, которое обычно понимает специалист в данной области техники, к которой относится настоящее описание. Следующие определения дополняют такие определения в данной области техники и относятся к текущей заявке, и не имеют отношения к какому-либо соединенному или несоединенному случаю, например, к любому совместному патенту или заявке. Хотя любые способы и материалы, аналогичные или эквивалентные тем, которые описаны в настоящем документе, можно применять на практике для исследования настоящего описания, в настоящем документе описаны предпочтительные материалы и способы. Соответственно, применяемая в настоящем документе терминология предназначена только для описания конкретных вариантов реализации и не предназначена для их ограничения.

[0064] Семейство белков S100 включает, например, S100A1, S100A2, S100A3, S100A4, S100A5, S100A6, S100A7, S100A8, S100A9, S100A10, S100A11, S100A12, S100A13, S100A14, S100A15 и S100A16. В некоторых случаях белки похожи на белок S100A, например, S100A7L (подобный S100 кальций-связывающему белку А7). Другие белки S100 включают S100B, S100G, S100P и S100Z, а также их варианты и фрагменты, которые могут быть включены в описанные в настоящем документе варианты реализации. Также в описанные в настоящем документе варианты реализации включены белки S100, являющиеся результатом продуктов псевдогенов, которые могут экспрессироваться описанными в настоящем документе векторами [61].

[0065] Семейство белков SDF включает, например, белок, кодируемый противомикробным геном, который может кодировать фактор стромальной клетки 1 альфа, член интеркринового семейства хемокинов [62]. Описанные в настоящем документе варианты реализации могут включать кодируемые белки, которые могут функционировать в качестве лигандов для рецептора, соединенного с G-белком, рецептора 4 хемокина (СХС-мотив) и могут играть роль во многих разнообразных клеточных функциях, включая эмбриогенез, иммунный надзор, воспалительный ответ, гомеостаз ткани, рост опухоли и метастазирование. Также включены варианты транскриптов, кодирующих различные изоформы, и указанные изоформы и варианты транскриптов могут экспрессироваться векторами, описанными в настоящем документе. Некоторые варианты реализации, описанные в настоящем документе, включают белки семейства SDF, в которых первые два остатка цистеина разделены одной аминокислотой (С-Х-С-хемокин). Следующие изоформы белка были идентифицированы у людей, и они могут экспрессироваться описанными в настоящем документе векторами и включены в описанные в настоящем документе способы и композиции: SDF-1-альфа, SDF-1-бета, SDF-1-гамма, SDF-1-дельта, SDF-1-эпсилон и SDF-1-тета, как и их фрагменты и варианты.

[0066] Семейство белков VEGF, описанное в настоящем документе, включает членов семейства факторов роста PDGF/VEGF. Например, включенные в описанные в настоящем документе способы и композиции могут представлять собой сплайс-варианты и изоформы, и фрагменты и производные VEGF121, VEGF121b, VEGF145, VEGF165, VEGF165b, VEGF189, VEGF191, VEGF206 [63].

[0067] В некоторых случаях полипептид S100 может представлять собой S100A1 и любое его функциональное производное. В некоторых вариантах реализации второй функциональный полипептид может представлять собой ангиогенный полипептид. Ангиогенный полипептид может представлять собой полипептид фактора роста эндотелия сосудов (VEGF). В нескольких вариантах реализации полипептид VEGF выбран из группы, состоящей из VEGF121, VEGF121b, VEGF145, VEGF165, VEGF165b, VEGF189, VEGF191, VEGF206, их фрагментов и вариантов. В некоторых вариантах реализации VEGF 165 имеет последовательность, содержащую аминокислоты с 27 по 191 последовательности VEGF191, описанной в настоящем документе. В определенных вариантах реализации VEGF 165 имеет последовательность, содержащую аминокислоты 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 или с 34 по 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190 или 191 последовательности VEGF191, описанной в настоящем документе. В некоторых вариантах реализации VEGF 165 имеет последовательность, содержащую аминокислоты с 30 по 185 последовательности VEGF191, описанной в настоящем документе. В некоторых случаях описанный в настоящем документе полипептид VEGF может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности VEGF 191 или VEGF165, описанной в настоящем документе. В некоторых случаях полипептид VEGF может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности описанного настоящего в документе полипептида VEGF191.

[0068] В других вариантах реализации третий функциональный полипептид может представлять собой хемокин. Хемокин может представлять собой полипептид фактора стромальной клетки 1 (SDF). Полипептид SDF может быть выбран из группы, состоящей из SDF1, SDF-1α, SDF-1β, их фрагментов и вариантов [62]. Полипептид SDF может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности полипептида SDF1, описанного в настоящем документе.

[0069] В некоторых описанных в настоящем документе вариантах реализации полипептид S100 может быть соединен со вторым полипептидом с помощью первого полипептидного линкера. В некоторых случаях указанный полипептидный линкер может представлять собой расщепляемый линкер или нерасщепляемый линкер.

[0070] В настоящем документе предложены варианты реализации, в которых полипептидная конструкция, кодируемая описанным в настоящем документе полинуклеотидом, может содержать полипептид кальций-связывающего белка (S100), второй функциональный полипептид и дополнительно содержать третий функциональный полипептид. В некоторых случаях указанный третий функциональный полипептид может представлять собой любой из цитокина, хемокина, ангиогенного полипептида и любого их функционального производного.

[0071] В определенных вариантах реализации третий функциональный полипептид может представлять собой ангиогенный полипептид. В некоторых вариантах реализации ангиогенный полипептид может представлять собой полипептид VEGF. Полипептид VEGF может быть выбран из группы, состоящей из VEGF121, VEGF121b, VEGF145, VEGF165, VEGF165b, VEGF189, VEGF191, VEGF206, их фрагментов и вариантов. Полипептид VEGF может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности полипептида VEGF 165. В некоторых случаях полипептид VEGF может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности полипептида VEGF191.

[0072] В некоторых вариантах реализации третий функциональный полипептид может представлять собой хемокин. В определенных вариантах реализации указанный хемокин может представлять собой полипептид SDF. В некоторых вариантах реализации указанный полипептид SDF выбран из группы, состоящей из SDF1, SDF-1α, SDF-1β, их фрагментов и вариантов. В некоторых случаях указанный полипептид SDF может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности описанного в настоящем документе полипептида SDF1.

[0073] В некоторых вариантах реализации третий функциональный полипептид может быть соединен с по меньшей мере одним из указанного полипептида S100 и указанного второго функционального полипептида при помощи второго полипептидного линкера, который может быть необязательно расщепляемым. Полипептидные линкеры могут быть независимо выбраны из линкеров, описанных в настоящем документе.

[0074] В настоящем документе предложены полинуклеотиды, кодирующие по меньшей мере одну полипептидную конструкцию, содержащую по меньшей мере первый полипептид и второй полипептид, при этом первый полипептид может представлять собой ангиогенный полипептид, а второй полипептид может представлять собой хемокин или его вариант или фрагмент. В некоторых случаях ангиогенный полипептид может представлять собой полипептид VEGF, выбранный из группы, состоящей из VEGF121, VEGF121b, VEGF145, VEGF165, VEGF165b, VEGF189, VEGF191, VEGF206, их фрагментов и вариантов. Полипептид может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности полипептида VEGF.

[0075] В настоящем документе предложены полипептиды VEGF, содержащие последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности VEGF191. В некоторых случаях второй полипептид может представлять собой полипептид SDF. Полипептид SDF может быть выбран из группы, состоящей из SDF1, SDF-1α, SDF-1β, их фрагментов и вариантов. В некоторых случаях полипептид SDF может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности SDF1.

[0076] В настоящем документе предложены способы улучшения васкулогенеза у субъекта, включающие обеспечение указанного субъекта терапевтически эффективным количеством композиции, содержащей описанный в настоящем документе полинуклеотид, или полипептид, кодируемый описанным в настоящем документе полинуклеотидом.

[0077] В настоящем документе предложены векторы экспрессии, содержащие по меньшей мере один промотор, функционально соединенный по меньшей мере с двумя полипептидами, выбранными из полипептида SDF1, полипептида S100A1, полипептида VEGF и их фрагментов и вариантов. В некоторых случаях по меньшей мере два полипептида соединены линкером. В некоторых случаях по меньшей мере один промотор может быть выбран из группы, состоящей из промотора CAG, промотора CMV, промотора SV40, промотора аденовируса, промотора бета-актина, промотора металлотионина, промотора EF1a, промотора легкой цепи миозина, промотора тяжелой цепи миозина, промотора NCX1 и других подходящих кардиальных промоторов. Вектор экспрессии может представлять собой вектор для экспрессии в сердце.

[0078] В настоящем документе предложены полипептидные конструкции, содержащие по меньшей мере первый полипептид и второй полипептид, при этом указанный первый полипептид может представлять собой кальций-связывающий белок или его вариант или фрагмент, а указанный второй полипептид может представлять собой ангиогенный полипептид, хемокин или их варианты или фрагменты. Также описаны полипептидные конструкции, содержащие по меньшей мере первый полипептид, второй полипептид и третий полипептид, при этом указанный первый полипептид может представлять собой ангиогенный полипептид или его вариант или фрагмент, второй полипептид может представлять собой хемокин или его вариант или фрагмент, и третий полипептид может представлять собой кальций-связывающий белок или его вариант или фрагмент. В некоторых случаях описанная в настоящем документе полипептидная конструкция может содержать S100A1, его вариант или фрагмент. В некоторых случаях полипептидная конструкция может содержать SDF1, его вариант или фрагмент. В других случаях описанная в настоящем документе полипептидная конструкция может содержать VEGF, его вариант или фрагмент.

[0079] Предложены фармацевтические композиции, содержащие описанный в настоящем документе полинуклеотид, или предложенную в настоящем документе полипептидную конструкцию, или полипептидную конструкцию, кодируемую описанным в настоящем документе полинуклеотидом, и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В настоящем документе предложены способы лечения заболеваний сердца и сердечных нарушений у субъекта, включающие обеспечение субъекта терапевтически эффективным количеством композиции, содержащей описанный в настоящем документе полинуклеотид или предложенную в настоящем документе полипептидную конструкцию, или полипептидную конструкцию, кодируемую описанным в настоящем документе полинуклеотидом.

[0080] В некоторых вариантах реализации полинуклеотидная конструкция, кодирующая описанную в настоящем документе полипептидную конструкцию, дополнительно содержит третий функциональный полипептид, соединенный при помощи второго линкерного полипептида со вторым функциональным полипептидом. В некоторых случаях третий функциональный полипептид может быть выбран из списка, состоящего из VEGF, SDF1, S100A1, их вариантов и производных. В некоторых случаях указанный второй линкер может быть таким же или отличным от первого линкера, описанного в настоящем документе. В некоторых случаях линкеры и функциональные полипептиды могут экспрессироваться внутри рамки считывания.

[0081] В настоящем документе предложены клетки, содержащие описанный в настоящем документе полинуклеотид.

[0082] В настоящем документе предложен способ, включающий: приведение в контакт по меньшей мере одной клетки сердца (cardiac cell) с полинуклеотидом, кодирующим полипептидную конструкцию, содержащую по меньшей мере первый полипептид и второй полипептид, при этом первый полипептид представляет собой вариант ангиогенного полипептида или его фрагмент; и второй полипептид представляет собой по меньшей мере один из хемокина, кальций-связывающего белка или их вариантов или фрагментов. В некоторых вариантах реализации вариант ангиогенного полипептида или его фрагмент может представлять собой полипептид VEGF, выбранный из группы, состоящей из VEGF121, VEGF121b, VEGF145, VEGF165, VEGF165b, VEGF189, VEGF191, VEGF206, их фрагментов и вариантов. Полипептид VEGF может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности VEGF165. В определенных вариантах реализации VEGF 165 имеет последовательность, содержащую аминокислоты с 27 по 191 последовательности VEGF191, описанной в настоящем документе. В определенных вариантах реализации VEGF 165 имеет последовательность, содержащую аминокислоты 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33 или с 34 по 180, 181, 182, 183, 184, 185, 186, 187, 188, 189, 190 или 191 последовательности VEGF191, описанной в настоящем документе. В определенных вариантах реализации VEGF 165 имеет последовательность, содержащую аминокислоты с 30 по 185 последовательности VEGF191, описанной в настоящем документе. В некоторых случаях полипептид VEGF, описанный в настоящем документе, может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности VEGF 191 или VEGF165, описанной в настоящем документе. Полипептид VEGF может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности VEGF191. В некоторых случаях второй полипептид может представлять собой хемокин. Хемокин может представлять собой полипептид фактора стромальной клетки 1 (SDF). В некоторых случаях полипептид SDF, применяемый в предложенных в настоящем документе композициях и способах, может быть выбран из группы, состоящей из SDF1, SDF-1α, SDF-1β, их фрагментов и вариантов. Полипептид SDF может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности SDF1-α.

[0083] В некоторых случаях полинуклеотид, кодирующий полипептидную конструкцию, можно вводить ex vivo. В определенных вариантах реализации полинуклеотид, кодирующий полипептидную конструкцию, можно вводить in vivo. Способ введения in vivo можно выбрать из группы, состоящей из чрескожной катетеризации коронарной артерии, блокады коронарной вены, сердечной рециркуляции, антеградной инфузии коронарной артерии, ретроградной перфузии, прямой инъекции и любой их комбинации.

[0084] В настоящем документе предложены способы лечения заболевания или расстройства сердца у субъекта (например, но не ограничиваясь ими, путем улучшения васкулогенеза, функции сердца или кардиального ремоделирования у субъекта), включающие введение указанному субъекту количества полинуклеотида, кодирующего конструкцию, содержащую полипептид VEGF и по меньшей мере один из полипептида SDF и полипептида S100. Полипептид VEGF в описанном в настоящем документе варианте реализации может быть выбран из группы, состоящей из VEGF121, VEGF121b, VEGF145, VEGF165, VEGF165b, VEGF189, VEGF191, VEGF206, их фрагментов и вариантов. Полипептид VEGF может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности VEGF165. В определенных вариантах реализации VEGF 165 имеет последовательность, содержащую аминокислоты с 27 по 191 последовательности VEGF191, описанной в настоящем документе. Полипептид VEGF может содержать последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности VEGF191. Полипептид SDF может быть выбран из группы, состоящей из SDF1, SDF-1α, SDF-1β, их фрагментов и вариантов. Полипептид S100 может представлять собой S100A1, его фрагмент или вариант.

[0085] В определенных вариантах реализации субъект, который получает лечение способами и композициями согласно настоящему изобретению, может иметь застойную сердечную недостаточность (ЗСН). У субъекта может быть установлен левожелудочковый аппарат вспомогательного кровообращения (LVAD). У субъекта может быть кардиомиопатия. Кардиомиопатия может быть выбрана из группы, состоящей из дилатационной кардиомиопатии (DCM), гипертрофической кардиомиопатии (НСМ), рестриктивной кардиомиопатии (RCM), аритмогенной кардиомиопатии правого желудочка (ARVC) и любой их комбинации.

[0086] В других вариантах реализации у субъекта, который получает лечение способами и композициями согласно настоящему изобретению, может быть по меньшей мере любое одно из: аневризма, атеросклероза, врожденного порока сердца, перикардиального нарушения, острой декомпенсированной сердечной недостаточности, стенокардии, артериосклеротической болезни сердца, синдрома спортивного сердца («сердце атлета»), атриовентрикулярной фистулы, аутоиммунной болезни сердца, бурой атрофии сердца, амилоидоза сердца, аритмии сердца, сердечной астмы, модуляции сердечной сократимости, сердечного синдрома X, кардиогенного шока, кардиомегалии, кардиомиопатии, кардиофобии, кардиоренального синдрома, кардиотоксичности, сердечно-сосудистого заболевания, кардита, хронических ревматических заболеваний сердца, сердца в виде «деревянного башмака» (coeur an sabot), аневризма коронарной артерии, аномалии коронарной артерии, болезни коронарной артерии, рассечения коронарной артерии, эктазии коронарной артерии, коронарной окклюзии, синдрома «обкрадывания» коронарных артерий, коронарного тромбоза, коронароспазма, индуцируемой вирусом Коксаки кардиомиопатии, диастолической сердечной недостаточности, синдрома Дресслера, болезни Дюрозье, синдрома Эйзенменгера, эмбриокардии, эмбрионального отказа (embryonic recall), эндокардиального фиброэластоза, сердечной недостаточности с сохраненной фракцией выброса, сердечной неоплазии, сердечной недостаточности с высоким сердечным выбросом, гипердинамического прекордиума, гипертонической болезни сердца, идиопатического гигантоклеточного миокардита, воспалительного заболевания сердца, межжелудочковой диссинхронии, внутрижелудочковой диссинхронии, ишемической болезни сердца, изолированного амилоидоза предсердий, болезни Кешана, синдрома Коуниса, приема препарата мидикар (mydicar), миокардиального мостика, нарушений миокарда, разрывов миокарда, рубцевания миокарда, поражения миокарда, миокардита, небактериального тромботического эндокардита, остеомиелита, заболевания периферических артерий и неатеросклеротического заболевания сердца и заболевания сердца, вызванного нарушением обмена фосфора, синдрома постпикардиотомии, контролируемой давлением интермиттирующей окклюзии коронарного синуса (picso), восстановления после сердечно-легочной реанимации, восстановления после травматической остановки сердца, отклонения в правой оси сердца, ревматической болезни сердца, синдрома Ремхельда, сердечно-сосудистого заболевания, невызванного употреблением насыщенных жиров, применения силиконовых пластин scar-fc, синдрома Шона, подострого бактериального эндокардита, клапанной болезни сердца, аневризма желудочков и вирусной кардиомиопатии.

[0087] В настоящем документе предложены способы лечения или предотвращения сердечно-сосудистого заболевания у субъекта, включающие: введение субъекту количества конструкции, содержащей полипептид S100A и второй функциональный полипептид, при этом указанный второй функциональный полипептид представляет собой по меньшей мере один из цитокина, хемокина и ангиогенного полипептида. В некоторых случаях введение субъекту можно осуществлять превентивно. В некоторых случаях введение субъекту можно осуществлять терапевтически. В некоторых случаях указанному субъекту можно вводить по меньшей мере одно дополнительное средство лечения. В некоторых случаях второй функциональный полипептид может представлять собой VEGF, SDF или их комбинацию.

[0088] В настоящем документе предложены способы, включающие введение субъекту по меньшей мере одного невирусного вектора, содержащего полинуклеотид, кодирующий описанную в настоящем документе полипептидную последовательность, включающую по меньшей мере два функциональных белка или их участка; по меньшей мере один промотор; и по меньшей мере один сконструированный сайт рекомбинации; при этом указанный по меньшей мере один промотор стимулирует экспрессию указанных по меньшей мере двух функциональных белков. В некоторых случаях по крайней мере один промотор может быть конститутивным. В некоторых случаях по меньшей мере один промотор может быть тканеспецифичным. В некоторых случаях по меньшей мере один промотор может быть индуцируемым. В некоторых случаях по меньшей мере один тканеспецифичный промотор представляет собой промотор легкой цепи миозина (MLC). В некоторых случаях индуцируемый промотор представляет собой индуцируемый низкомолекулярным лигандом переключатель гена на основе двухполипептидного рецептора экдизона.

[0089] Индуцируемый промотор использует лиганд для дозорегулируемого контроля экспрессии указанных по меньшей мере двух генов. В некоторых случаях лиганд может быть выбран из группы, состоящей из экдистероида, 9-цис-ретиноевой кислоты, синтетических аналогов ретиноевой кислоты, N,N'-диацилгидразинов, оксадиазолинов, дибензоилалкилциангидразинов, N-алкил-N,N'-диароилгидразинов, N-ацил-N-алкилкарбонилгидразинов, N-ароил-N-алкил-N'-ароилгидразинов, арнидокетонов, 3,5-ди-трет-бутил-4-гидрокси-N-изобутилбензамида, 8-O-ацетилгарпагида, оксистеролов, 22(R)--гидроксихолестерина, 24(S)-гидроксихолестерина, 25-эпоксихолестерина, Т0901317, 5-альфа-6-альфа-эпоксихолестерин-3-сульфата (ECHS), 7-кетохолестерин-3-сульфата, фрамесола (framesol), желчных кислот, 1,1-бифосфонатных эфиров, ювенильного гормона III, RG-115819 (N-(1-этил-2,2-диметилпропил)-N'-(2-метил-3-метоксибензоил)гидразид 3,5-диметилбензойной кислоты), RG-115932 (N-(1-трет-бутилбутил)-N'-(2-этил-3-метоксибензоил)гидразид (Р)-3,5-диметилбензойной кислоты) и RG-115830 (N-(1-трет-бутилбутил)-N'-(2-этил-3-метоксибензоил)гидразид 3,5-диметилбензойной кислоты) и любой их комбинации. Линкер может представлять собой расщепляемый линкер.

[0090] В некоторых вариантах реализации первый функциональный полипептид и второй функциональный полипептид соединены при помощи первого линкерного полипептида, при этом указанный первый линкерный полипептид содержит последовательность с по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 80% или 100% идентичностью к последовательности APVKQ (SEQ ID №42). В некоторых случаях указанный линкерный полипептид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из APVKQ (SEQ ID №42), GPVKQ (SEQ ID №43), VPVKQ (SEQ ID №44), IPVKQ (SEQ ID №45), MPVKQ (SEQ ID №46), APIKQ (SEQ ID №47), GPIKQ (SEQ ID №48), VPIKQ (SEQ ID №49), IPIKQ (SEQ ID №50), MPIKQ (SEQ ID №51), APAKQ (SEQ ID №52), GPAKQ (SEQ ID №53), VPAKQ (SEQ ID №54), IPAKQ (SEQ ID №55), MPAKQ (SEQ ID №56), APVRQ (SEQ ID №57), GPVRQ (SEQ ID №58), VPVRQ (SEQ ID №59), IPVRQ (SEQ ID №60), MPVRQ (SEQ ID №61), APIRQ (SEQ ID №62), GPIRQ (SEQ ID №63), VPIRQ (SEQ ID №64), IPIRQ (SEQ ID №65), MPIRQ (SEQ ID №66), APARQ (SEQ ID №67), GPARQ (SEQ ID №68), VPARQ (SEQ ID №69), IPARQ (SEQ ID №70), MPARQ (SEQ ID №71), APVKN (SEQ ID №72), GPVKN (SEQ ID №73), VPVKN (SEQ ID №74), IPVKN (SEQ ID №75), MPVKN (SEQ ID №76), APIKN (SEQ ID №77), GPIKN (SEQ ID №78), VPIKN (SEQ ID №79), IPIKN (SEQ ID №80), MPIKN (SEQ ID №81), APAKN (SEQ ID №82), GPAKN (SEQ ID №83), VPAKN (SEQ ID №84), IPAKN (SEQ ID №85), MPAKN (SEQ ID №86), APVRN (SEQ ID №87), GPVRN (SEQ ID №88), VPVRN (SEQ ID №89), IPVRN (SEQ ID №90), MPVRN (SEQ ID №91), APIRN (SEQ ID №92), GPIRN (SEQ ID №93), VPIRN (SEQ ID №94), IPIRN (SEQ ID №95), MPIRN (SEQ ID №96), APARN (SEQ ID №97), GPARN (SEQ ID №98), VPARN (SEQ ID №99), IPARN (SEQ ID №100) и MPARN (SEQ ID №101). В некоторых случаях полипептидный линкер может также содержать по меньшей мере одну последовательность GS-линкера, например, (GS)_n (SEQ ID №109), (SG)_n (SEQ ID №110), (GSG)_n (SEQ Ю №111) и (SGS)_n (SEQ ID №112), где n может быть любым числом от нуля до пятнадцати. В некоторых вариантах реализации указанный первый функциональный полипептид может отличаться от указанного второго функционального полипептида.

[0091] В некоторых вариантах реализации способ может дополнительно включать введение субъекту по меньшей мере одного вторичного вектора. По меньшей мере один вторичный вектор может представлять собой мРНК. По меньшей мере один вторичный вектор может представлять собой плазмиду. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один вторичный вектор может содержать по меньшей мере одну рекомбиназу. Рекомбиназа может быть выбрана из группы, состоящей из рекомбиназы фага Listeria monocytogenes, рекомбиназы фага Streptococcus pyogenes, рекомбиназы фага Bacillus subtilis, рекомбиназы фага Mycobacterium tuberculosis и рекомбиназы фага Mycobacterium smegmatis. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере два гена можно интегрировать в геном субъекта при помощи рекомбиназы. В некоторых вариантах реализации по меньшей мере один сайт рекомбинации может представлять собой сайт присоединения (рекомбинации) в геноме фага (attP) или сайт присоединения (рекомбинации) в бактериальном геноме (attB). В некоторых вариантах реализации рекомбиназа, применяемая в описанном в настоящем документе изобретении, содержит сайт-специфическую сериновую рекомбиназу, как, например, но не ограничиваясь ею, рекомбиназу SpBC2 (см., например, патент США №9034650, выданный 19 мая 2015 г. (патент США №2006/0172377), указанный документ полностью включен в настоящее описание посредством ссылки).

[0092] Вектор может соответствовать стандартам надлежащей производственной практики (GMP).

[0093] Предложены полипептиды, содержащие последовательность с по меньшей мере 40%, 50% 60%, 80% или 100% идентичностью к последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №32, SEQ ID №34, SEQ ID №36, SEQ ID №38 и SEQ ID №40. В некоторых вариантах реализации полипептид содержит последовательность с по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85% 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №32, SEQ ID №34, SEQ ID №36, SEQ ID №38 и SEQ ID №40.

[0094] Предложены полипептиды, содержащие последовательность с по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 80% или 100% идентичностью к последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №102, SEQ ID №104 и SEQ ID № ID №106. В некоторых вариантах реализации такой пептид представляет собой полипептид, содержащий последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID №102, SEQ ID №104 и SEQ ID №106.

[0095] Предложен полипептид, содержащий последовательность с по меньшей мере 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 99% идентичностью к последовательности полипептида, кодируемого нуклеотидной последовательностью SEQ ID №108.

[0096] В настоящем документе предложены полинуклеотиды, кодирующие полипептидную конструкцию, содержащую первый функциональный полипептид и второй функциональный полипептид, соединенные при помощи первого линкерного полипептида, при этом указанный первый линкерный полипептид содержит последовательность с по меньшей мере 40%, 50%, 60%, 80% или 100% идентичностью к последовательности APVKQ. В некоторых случаях указанный линкерный полипептид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из APVKQ (SEQ ID №42). В некоторых случаях линкерный полипептид содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из APVKQ (SEQ ID №42), GPVKQ (SEQ ID №43), VPVKQ (SEQ ID №44), IPVKQ (SEQ ID №45), MPVKQ (SEQ ID №46), APIKQ (SEQ ID №47), GPIKQ (SEQ ID №48), VPIKQ (SEQ ID №49), IPIKQ (SEQ ID №50), MPIKQ (SEQ ID №51), APAKQ (SEQ ID №52), GPAKQ (SEQ ID №53), VPAKQ (SEQ ID №54), IPAKQ (SEQ ID №55), MPAKQ (SEQ ID №56), APVRQ (SEQ ID №57), GPVRQ (SEQ ID №58), VPVRQ (SEQ ID №59), IPVRQ (SEQ ID №60), MPVRQ (SEQ ID №61), APIRQ (SEQ ID №62), GPIRQ (SEQ ID №63), VPIRQ (SEQ ID №64), IPIRQ (SEQ ID №65), MPIRQ (SEQ ID №66), APARQ (SEQ ID №67), GPARQ (SEQ ID №68), VPARQ (SEQ ID №69), IPARQ (SEQ ID №70), MPARQ (SEQ ID №71), APVKN (SEQ ID №72), GPVKN (SEQ ID №73), VPVKN (SEQ ID №74), IPVKN (SEQ ID №75), MPVKN (SEQ ID №76), APIKN (SEQ ID №77), GPIKN (SEQ ID №78), VPIKN (SEQ ID №79), IPIKN (SEQ ID №80), MPIKN (SEQ ID №81), APAKN (SEQ ID №82), GPAKN (SEQ ID №83), VPAKN (SEQ ID №84), IPAKN (SEQ ID №85), MPAKN (SEQ ID №86), APVRN (SEQ ID №87), GPVRN (SEQ ID №88), VPVRN (SEQ ID №89), IPVRN (SEQ ID №90), MPVRN (SEQ ID №91), APIRN (SEQ ID №92), GPIRN (SEQ ID №93), VPIRN (SEQ ID №94), IPIRN (SEQ ID №95), MPIRN (SEQ ID №96), APARN (SEQ ID №97), GPARN (SEQ ID №98), VPARN (SEQ ID №99), IPARN (SEQ ID №100) и MPARN (SEQ ID №101). В некоторых случаях полипептидный линкер может также содержать по меньшей мере одну последовательность GS-линкера, например, (GS)_n (SEQ ID №113), (SG)_n (SEQ ID №114), (GSG)_n (SEQ ID №115) и (SGS)_n (SEQ ID №116), где n может быть любым числом от одного до пятнадцати. В некоторых вариантах реализации первый функциональный полипептид может отличаться от второго функционального полипептида. В других случаях по меньшей мере один из указанных первого и второго функциональных полипептидов может представлять собой белок, гормон, антитело, гликопротеин или их производные или фрагменты.

[0097] В настоящем документы представлены полинуклеотиды, кодирующие полипептидную конструкцию, содержащую полипептид фурина и 2А-полипептид, при этом указанные полипептид фурина и 2А-полипептид соединены полипептидным линкером, содержащим по меньшей мере три гидрофобные аминокислоты. В некоторых случаях по меньшей мере три гидрофобные аминокислоты выбраны из списка, состоящего из глицина (Gly) (G), аланина (Ala) (А), валина (Val) (V), лейцина (Leu) (L), изолейцина (Ile) (I), пролина (Pro) (Р), фенилаланина (Phe) (F), метионина (Met) (M), триптофана (Trp) (W).

[0098] Предложены полипептиды, кодируемые описанными в настоящем документе полинуклеотидами, и композиции, содержащие такие полипептиды. Также предложены способы терапии и/или диагностики, включающие приведение в контакт индивидуума с полинуклеотидом, описанным в настоящем документе, или экспрессируемым с него полипептидом, или его производным или конъюгатом.

[0099] Предложены способы получения улучшенной экспрессии полипептидной конструкции, включающие: обеспечение полинуклеотида, кодирующего указанную полипептидную конструкцию, содержащую первый функциональный полипептид и второй функциональный полипептид, при этом указанный первый функциональный полипептид и второй функциональный полипептид соединены при помощи линкерного полипептида, содержащего последовательность с по меньшей мере 60% идентичностью к последовательности APVKQ (SEQ ID №42); и экспрессию указанного полинуклеотида в клетке-хозяине, при этом указанная экспрессия приводит к улучшенной экспрессии полипептидной конструкции в сравнении с соответствующей полипептидной конструкцией, которая не содержит линкерный полипептид, содержащий последовательность с по меньшей мере 60% идентичностью к последовательности APVKQ (SEQ) ID №42).

[0100] В контексте настоящего описания термин «приблизительно» при ссылке на числовые значения и их грамматические эквиваленты может включать само числовое значение и диапазон значений плюс или минус 10% от этого числового значения. Например, количество «приблизительно 10» включает 10 и любые количества от 9 до 11. Например, термин «приблизительно» при ссылке на числовое значение также может включать диапазон значений плюс или минус 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% или 1% от этого значения.

[0101] Термин «сердечно-сосудистые заболевания» и «нарушение кровообращения» применяются взаимозаменяемо, и в контексте настоящего описания применяются для описания заболевания или нарушения, которое вызвано поражением системы кровообращения, и такое поражение можно снизить и/или уменьшить, обеспечивая терапевтически эффективным количеством описанного в настоящем документе полинуклеотида или полипептидной конструкции, кодируемой полинуклеотидом, описанным в настоящем документе, пораженные заболеванием области сердца и/или систему кровообращения у указанного субъекта. В контексте настоящего описания термин «поражение кровообращения» применяется для обозначения повреждения системы кровообращения, которое может быть вызвано любым из ряда заболеваний или нарушений. Примеры сердечно-сосудистых заболеваний, которые можно лечить с применением описанного в настоящем документе полинуклеотида или полипептидной конструкции, кодируемой полинуклеотидом, описанным в настоящем документе, и способов в соответствии с настоящим изобретением, включают, например, инфаркт миокарда, кардиомиопатию, заболевание периферических сосудов, врожденный порок сердца, другие генетические заболевания, повреждения или травмы, вызванные ишемией, несчастными случаями, экологическим воздействием. Кроме того, терапевтически эффективное количество описанного в настоящем документе полинуклеотида или полипептидной конструкции, кодируемой полинуклеотидом, описанным в настоящем описании, можно применять для уменьшения и/или устранения последствий сердечного приступа на центральную нервную систему у субъекта, которые в противном случае обусловлены отсутствием кровообращения или ишемией на участке головного мозга указанного субъекта или которые произошли от физического повреждения головного и/или спинного мозга.

[0102] В контексте настоящего описания термин «вектор» или его грамматический эквивалент может относиться к любой полинуклеотидной конструкции, способной управлять экспрессией представляющей интерес полипептидной конструкции, и которая является подходящей для переноса указанной интересующей полипептидной конструкции в клетки-мишени. Таким образом, этот термин включает носители для клонирования и экспрессии, а также интегрирующие векторы.

[0103] На основании роста числа пациентов с застойной сердечной недостаточностью (ЗСН) с ограниченными возможностями (например, в результате обычно возникает необходимость в терапии с применением левожелудочкового аппарата вспомогательного кровообращения (LVAD)), требуются биологические возможности для стимулирования восстановления после ЗСН. Таким образом, в одном варианте реализации настоящего изобретения предложен вектор рХоХ на основе плазмидной ДНК, содержащей три эффекторных гена (SDF1α, S100A1 и VEGF), для улучшения работоспособности сердца (например, но не ограничиваясь этим, которую оценивают измерением числа и продолжительности временных отключений от поддержки LVAD у пациентов, которым были имплантированы назначенные LVAD, по меньшей мере в течение тридцать дней после операции). Имплантация только LVAD может привести к улучшению работоспособности сердца, большинство случаев из которых происходит в течение первых 30 дней или около того после имплантации. Кроме того, обычно связанные с хирургическим вмешательством воспалительные процессы нормализуются до нового исходного уровня на 30 день после операции, что может привести к снижению риска лечения рХоХ для этой популяции пациентов с высоким риском.

[0104] Плазмида рХоХ конститутивно экспрессирует три белка (S100A1, SDF-1α и VEGF165) под контролем CAG-промотора в виде одной мРНК, которая процессируется до отдельных эффекторных белков во время трансляции посредством расщепления за счет комбинированной активности фурина и способных к саморасщеплению 2А-пептидов (fp2a). Остов плазмиды содержит селективный маркер к канамицину и точку начала репликации, полученный из pBR322. Пример плазмиды рХоХ представлен ниже на ФИГ. 27А и ФИГ. 27В.

[0105] В настоящем изобретении также предложены линкеры для применения, например, в композициях и способах, подходящих для лечения патологий сердца, заболеваний сердца и сердечных нарушений (например, сердечной недостаточности, кардиомиопатии, аритмии, заболевания перикарда, заболеваний аорты, синдрома марфана и заболеваний коронарной артерии), с применением новых полигенных векторов, комбинаций генетических последовательностей, белков (полипептидов) и методов, описанных и предложенных в настоящем документе. В контексте настоящего описания термин «линкер» может означать любую полинуклеотидную или полипептидную последовательность, которая применяется для соединения любой одной полинуклеотидной или полипептидной последовательности с другой полинуклеотидной или полипептидной последовательностью соответственно (например, первый GOI-Лмнкер-Второй GOI-Лмнкер-Третий GOI-Линкер-и т.д.). Например, в некоторых случаях линкер может представлять собой полинуклеотидную открытую рамку считывания, кодирующую белок слияния, так что первая полипептидная последовательность ковалентно связана («слита») при помощи промежуточной аминокислотной последовательности со второй полипептидной последовательностью (и так далее для третьей, четвертой, пятой и т.д. полипептидной последовательности в одной и той же открытой рамке считывания). В контексте настоящего описания термин «линкер» также может представлять собой некодирующую, связывающую полинуклеотидную последовательность, такую как промотор (например, CAG-промотор или CMV-промотор), или IRES (участок внутренней посадки рибосомы), которая функционирует для соединения первой полинуклеотидной кодирующей области (ОРС) со второй полинуклеотидной кодирующей областью (ОРС) (и так далее для третьей, четвертой, пятой и т.д. полинуклеотидных открытых рамок считывания).

[0106] В контексте настоящего описания генная терапия относится к переносу представляющего интерес полинуклеотида, описанного в настоящем документе (например, ДНК или РНК), в организм субъекта для лечения или предотвращения генетического или приобретенного заболевания или состояния. Представляющий интерес полинуклеотид может кодировать продукт (например, полипептидную конструкцию), продуцирование которого желательно in vivo. В некоторых вариантах реализации представляющий интерес полинуклеотид также кодирует суицидальный ген. В некоторых случаях генную терапию можно применять для лечения сердечно-сосудистого заболевания, описанного в настоящем документе.

Векторы

[0107] В настоящем документе предложены векторы для генной терапии нарушения, включающей применение описанного в настоящем документе полинуклеотида. Вектор можно использовать для введения экзогенных нуклеиновых кислот, таких как ДНК, мРНК, малая интерферирующая РНК (миРНК), микроРНК или антисмысловые олигонуклеотиды. Учитывая большой размер и отрицательный заряд этих макромолекул, их доставка может быть опосредована носителями или векторами. Представляющие интерес векторы включают, в частности, любой эписомальный вектор, например, вирусные векторы, плазмидные векторы, искусственные хромосомы, миникольца и им подобные.

[0108] Системы доставки генов можно разделить на две категории: невирусные системы и рекомбинантные вирусные системы, каждая из которых может иметь уникальные профили экспрессии переносимых генов. Невирусные векторы могут включать «оголенную» плазмидную ДНК, комплексы липосомальной ДНК, ДНК, нанесенную на полимер, и олигонуклеотиды. Плазмиды могут представлять собой содержащие двухцепочечные кольцевые ДНК трансгены, кодирующие представляющие интерес белки, а также они могут содержать энхансерные и промоторные последовательности. Вектор может представлять собой невирусный вектор.

[0109] Вектор может содержать гены или их фрагменты или варианты, при этом по меньшей мере один ген, его фрагмент или вариант соединен с другим геном, его фрагментом или вариантом при помощи описанного в настоящем документе линкера. Вектор может содержать один ген или несколько генов, или их фрагменты или варианты. Вектор может содержать гены или их фрагменты или варианты, при этом по меньшей мере один ген, его фрагмент или вариант могут быть соединены с другим геном, его фрагментом или вариантом при помощи описанного в настоящем документе линкера. Например, вектор может представлять собой один ген, два гена (см., например, Таблицу 1) или три гена, при этом по меньшей мере один ген, его фрагмент или вариант соединены с другим геном, его фрагментом или вариантом при помощи описанного в настоящем документе линкера. Вектор может содержать несколько генов от 1 до 10 или их фрагментов или вариантов. Вектор может содержать 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 генов, их фрагментов или вариантов. Пример вектора, содержащего три гена, показан на ФИГ. 20А и ФИГ. 20В. Пример векторной последовательности показан в Таблице 5. В некоторых случаях вектор может обеспечивать одновременную отдельную экспрессию двух, трех или более полипептидов из одного и того же транскрипта РНК. Вектор также может содержать репортерный полипептид. Например, вектор может экспрессировать один, два, три или более полипептида и репортерный полипептид.

[0110] В некоторых случаях вектор можно сконструировать так, чтобы он содержал по меньшей мере один ген или его фрагмент. В других случаях вектор может содержать вплоть до 10 генов или их фрагментов. Гены или их фрагменты, которые могут экспрессироваться, можно описать при помощи последовательностей от SEQ ID №102 до 107. Любые гомологи, изоформы, предшественники или их модифицированные части, соответствующие SEQ ID №№102-107, также могут экспрессироваться векторами, описанными в настоящем документе. Гены или их фрагменты могут быть разделены при помощи описанного в настоящем документе линкера. Различные линкеры, которые могут быть использованы в векторе, могут содержать последовательности, представленные, например, в SEQ ID №№32-41. В других случаях соответствующие линкеры, которые могут быть использованы в векторе, могут содержать, например, последовательность, представленную любой последовательностью из SEQ ID №№42-101. Например, участок гена может представлять собой по меньшей мере один из гена SDF (кодируемый SEQ ID №103 или на 60%, 70%, 80%, 90% или 95% к ней идентичной), гена VEGF (кодируемый SEQ ID №105 или на 60%, 70%, 80%, 90% или 95% к ней идентичной) и гена S100A (кодируемый SEQ ID №107 или на 60%, 70% 80%, 90% или 95% к ней идентичной), за которым может следовать первая линкерная последовательность, второй ген или его участок, который выбран из гена SDF (кодируемый SEQ ID №103 или на 60%, 70% 80%, 90% или 95% к ней идентичной), гена VEGF (кодируемый SEQ ID №105 или на 60%, 70%, 80%, 90% или 95% к ней идентичной) и гена S100A (кодируемый SEQ ID №107 или на 60%, 70%, 80%, 90% или 95% к ней идентичной), за которым необязательно следует вторая линкерная последовательность и затем третий ген или его участок, выбранный из гена SDF (кодируемый SEQ ID №103 или на 60%, 70%, 80%, 90% или 95% к ней идентичной), ген VEGF (кодируемый SEQ ID №105 или на 60%, 70%, 80%, 90% или 95% к ней идентичной) и гена S100A (кодируемый SEQ ID №107 или на 60%, 70%, 80%, 90% или 95% к ней идентичной). Различные комбинации таких конструкций, например, описываются SEQ ID №№1-31, и их можно использовать для терапевтических целей.

[0111] Вектор может быть модульным. Модульный вектор может обеспечивать замещение одного гена или сегмента нуклеиновой кислоты на другой ген или сегмент нуклеиновой кислоты, например, с применением расщепления рестрикционным ферментом.

[0112] Полигенная экспрессия представляющих интерес генов и белков может опосредоваться вектором. Можно применять любую векторную систему включая, но не ограничиваясь ими, плазмидные векторы, ретровирусные векторы, лентивирусные векторы, аденовирусные векторы, поксвирусные векторы, векторы на основе вируса герпеса, векторы на основе аденоассоциированного вируса и т.д. Плазмидные векторы являются преимущественными для предотвращения противовирусного иммунного ответа хозяина. Плазмиды могут представлять собой эписомальные и неинтегрирующие плазмиды, что может снизить риск инсерционного мутагенеза по сравнению с вирусными векторами. В некоторых случаях в полинуклеотидных конструкциях согласно настоящему изобретению можно применять энхансер. Энхансер может относиться к последовательности, которая может функционировать на свободном (нефиксированном) расстоянии от сайта начала транскрипции и может располагаться либо на 5'-, либо на 3'-конце единицы транскрипции. Кроме того, энхансеры могут находиться внутри интрона, а также внутри самой кодирующей последовательности. Длина энхансеров обычно составляет от 10 до 300 пар оснований, и они действуют в cis. Длина энхансера может составлять от 10 до 50 п. о., от 50 до 100 п. о., от 100 до 150 п. о., от 150 п. н. до 200 п. о., от 200 до 250 п. о., от 250 до 300 п. о. Энхансеры могут функционировать для того, чтобы повысить транскрипцию с соседних промоторов. Энхансеры также могут содержать элементы ответа, которые опосредуют регуляцию транскрипции. Хотя в настоящее время известно о многих последовательностях энхансеров, полученных из генов млекопитающих (глобин, эластаза, альбумин, фетопротеин и инсулин), для общей экспрессии можно также применять энхансер, полученный из вируса эукариотической клетки. Выбор комбинации энхансер-промотор оказывает большое влияние как на уровень, так и на продолжительность экспрессии трансгена. Среди прочих, энхансер может представлять собой энхансер вируса обезъян 40 (SV40), энхансер вируса иммунодефицита человека I (ВИЧ-1), энхансер вируса гепатита земляной белки (GHV), энхансер аденовируса, энхансер протромбина человека (hTHGB) или энхансер гена комплемента С2 человека (hC2).

[0113] В некоторых вариантах реализации последовательность энхансера можно применять для повышения экспрессии гена. Например, энхансер CMV может повышать экспрессию трансгена под контролем различных клеточноспецифичных промоторов и различных типов клеток, что делает его широко применимым инструментом для повышения уровней экспрессии трансгена.

[0114] В некоторых случаях может применять миникольцевой вектор. Миникольцевые векторы могут отличаться от бактериальных плазмидных векторов тем, что у них может отсутствовать точка начала репликации, и они могут не содержать маркеры отбора по чувствительности к лекарственному средству, обычно обнаруживаемые в бактериальных плазмидах, например, β-лактамаза, tet и им подобные. Миникольцо может по существу не содержать векторные последовательности, отличные от последовательности гибридного продукта рекомбиназы и представляющей интерес последовательности, т.е. транскрибируемой последовательности и регуляторных последовательностей, необходимых для экспрессии. В некоторых случаях можно использовать вектор dog bone. Вектор dog bone можно получить без применения бактерий, и он может содержать пониженное количество бактериальных элементов по сравнению с плазмидой. Пониженное количество бактериальных элементов могут снижать токсичность введения вектора в клетку, в субъект или комбинацию их обоих.

[0115] Некоторые описанные в настоящем документе варианты реализации включают полинуклеотиды (и полипептиды, кодируемые указанными полинуклеотидами), которые могу быть введены в векторы (включая невирусные и вирусные векторы (включая ДНК- и РНК/мРНК-векторы, которые могут представлять собой линейные или кольцевые векторы)), при этом указанные полинуклеотиды содержат конфигурацию конструкции, выбранную из группы, состоящей из:

a) 5'-(промотор)-S100-(линкер)-SDF-(линкер)-VEGF-3';

b) 5'-(промотор)-S100-(линкер)-VEGF-(линкер)-SDF-3';

c) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-SDR1-(линкер)-VEGF-3';

d) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-VEGF-(линкер)-SDF1-3';

e) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-SDF1-(линкер)-VEGF165-3';

f) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-VEGF165-(линкер)-SDF1-3';

g) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-SDF1α-(линкер)-VEGF165-3';

h) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-VEGF165-(линкер)-SDF1α-3';

i) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-SDF1-(линкер)-VEGF191-3';

j) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-VEGF191-(линкер)-SDF1-3';

k) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-SDF1α-(линкер)-VEGF191-3';

l) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-VEGF191-(линкер)-SDF1α-3';

m) 5'-(промотор)-S100-(fp2a)-SDF-(линкер)-VEGF-3';

n) 5'-(промотор)-S100-(fp2a)-VEGF-(линкер)-SDF-3';

о) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(линкер)-VEGF-3';

p) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF-(линкер)-SDF1-3';

q) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(линкер)-VEGF165-3';

r) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(линкер)-SDF1-3';

s) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(линкер)-VEGF165-3';

t) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(линкер)-SDF1α-3';

u) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(линкер)-VEGF191-3';

v) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(линкер)-SDF1-3';

w) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(линкер)-VEGF191-3';

x) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(линкер)-SDF1α-3';

y) 5'-(промотор)-S100-(fp2a)-SDF-(fp2a)-VEGF-3';

z) 5'-(промотор)-S100-(fp2a)-VEGF-(fp2a)-SDF-3';

aa) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fp2a)-VEGF-3';

ab) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF-(fp2a)-SDF1-3';

ac) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fp2a)-VEGF165-3';

ad) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(fp2a)-SDF1-3';

ae) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(fp2a)-VEGF165-3';

af) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(fp2a)-SDF1α-3';

ag) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fp2a)-VEGF191-3';

ah) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(fp2a)-SDF1-3';

ai) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(fp2a)-VEGF191-3';

aj) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(fp2a)-SDF1α-3';

ak) 5'-(промотор)-S100-(fp2a)-SDF-(fmdv)-VEGF-3';

al) 5'-(промотор)-S100-(fp2a)-VEGF-(fmdv)-SDF-3';

am) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fmdv)-VEGF-3';

an) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF-(fmdv)-SDF1-3';

ao) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fmdv)-VEGF165-3';

ap) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(fmdv)-SDF1-3';

aq) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(fmdv)-VEGF165-3';

ar) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(fmdv)-SDF1α-3';

as) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(fmdv)-VEGF191-3';

at) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(fmdv)-SDF1-3';

au) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(fmdv)-VEGF191-3';

av) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(fmdv)-SDF1α-3';

aw) 5'-(промотор)-S100-(fp2a)-SDF-(p2a)-VEGF-3';

ax) 5'-(промотор)-S100-(fp2a)-VEGF-(p2a)-SDF-3';

ay) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(p2a)-VEGF-3';

az) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF-(p2a)-SDF1-3';

ba) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(p2a)-VEGF165-3';

bb) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(p2a)-SDF1-3';

bc) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(p2a)-VEGF165-3';

db) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(p2a)-SDF1α-3';

be) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(p2a)-VEGF191-3';

bf) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(p2a)-SDF1-3';

bg) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(p2a)-VEGF191-3';

bh) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(p2a)-SDF1α-3',

bi) 5'-(промотор)-S100-(fp2a)-SDF-(GSG-p2a)-VEGF-3';

bk) 5'-(промотор)-S100-(fp2a)-VEGF-(GSG-p2a)-SDF-3';

bl) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(GSG-p2a)-VEGF-3';

bm) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF-(GSG-p2a)-SDF1-3';

bn) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(GSG-p2a)-VEGF165-3';

bo) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(GSG-p2a)-SDF1-3';

bp) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(GSG-p2a)-VEGF165-3';

bq) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(GSG-p2a)-SDF1α-3';

br) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1-(GSG-p2a)-VEGF191-3';

bs) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(GSG-p2a)-SDF1-3';

bt) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(GSG-p2a)-VEGF191-3' и

bu) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(GSG-p2a)-SDF1α-3';

где «промотор» представляет собой любую транскрипционную промоторную последовательность;

где «S100» кодирует любой полипептид, изоформу или их фрагмент в семействе белков S100;

где «SDF» кодирует любой полипептид, изоформу или их фрагмент в семействе белков SDF;

где «VEGF» кодирует любой полипептид, изоформу или их фрагмент в семействе белков VEGF;

где условные символы "("и")" обозначают любое число дополнительных нуклеотидов (nts) (от 0 до 1000 nts) независимо от того, являются ли последовательности кодирующими или некодирующими;

где «линкер» обозначает любой линкер, подходящий для экспрессии смежных биологически активных полипептидов;

где «S100A1» по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% идентична или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID №105 или аминокислотной последовательности SEQ ID №104 в контексте полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно;

где «SDF-1» по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% идентична или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID №103 или аминокислотной последовательности SEQ ID №102 в контексте полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно;

где «VEGF165» по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% идентична или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID №127 или аминокислотной последовательности SEQ ID №126 в контексте полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно;

где «VEGF191» по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% идентична или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID №107 или аминокислотной последовательности SEQ ID №106 в контексте полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно;

где «fp2a» по меньшей мере на 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% идентична или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID №41 или аминокислотной последовательности SEQ ID №40 в контексте полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно;

где «fmdv» по меньшей мере на 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% идентична или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID №35 или аминокислотной последовательности SEQ ID №34 в контексте полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно;

где «р2а» по меньшей мере на 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% идентична или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID №37 или аминокислотной последовательности SEQ ID №36 в контексте полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно; а также

где «GSG-p2a» по меньшей мере на 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% идентична или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID №39 или аминокислотной последовательности SEQ ID №40 в контексте полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно.

В некоторых вариантах реализации кандидаты-лидеры на роль терапевтических полинуклеотидов согласно настоящему изобретению включают полинуклеотиды (и полипептиды, кодируемые указанными полинуклеотидами), которые могут быть введены в векторы (включая невирусные и вирусные векторы (включая ДНК- и РНК/мРНК-векторы, которые могут представлять собой линейные или кольцевые векторы)), при этом указанные полинуклеотиды содержат конфигурацию конструкции, выбранную из группы, состоящей из:

a) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-SDF1α-(линкер)-VEGF191-3';

b) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-VEGF191-(линкер)-SDF1α-3';

c) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-SDF1α-(линкер)-VEGF165-3';

d) 5'-(промотор)-S100A1-(линкер)-VEGF165-(линкер)-SDF1α-3';

e) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(линкер)-VEGF191-3';

f) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(линкер)-SDF1α-3';

g) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(линкер)-VEGF165-3';

h) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(линкер)-SDF1α-3';

i) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(fp2a)-VEGF191-3';

j) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(fp2a)-SDF1α-3';

k) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(fp2a)-VEGF165-3';

1) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(fp2a)-SDF1α-3';

m) 5'-(промотор)-S100A1 -(fp2a)-SDF1α-(fmdv)-VEGF191-3';

n) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(fmdv)-SDF1α-3';

о) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(fmdv)-VEGF165-3';

p) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(fmdv)-SDF1α-3';

q) 5'-(промотор)-S100A1 -(fp2a)-SDF1α-(p2a)-VEGF191-3';

r) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(p2a)-SDF1α-3';

s) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(p2a)-VEGF165-3';

t) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(p2a)-SDF1α-3';

u) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(GSG-p2a)-VEGF191-3';

v) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF191-(GSG-p2a)-SDF1α-3';

w) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-SDF1α-(GSG-p2a)-VEGF165-3' и

x) 5'-(промотор)-S100A1-(fp2a)-VEGF165-(GSG-p2a)-SDF1α-3';

где «промотор» представляет собой любую транскрипционную промоторную последовательность;

где «S100» кодирует любой полипептид, изоформу или их фрагмент в семействе белков S100;

где «SDF» кодирует любой полипептид, изоформу или их фрагмент в семействе белков SDF;

где «VEGF» кодирует любой полипептид, изоформу или их фрагмент в семействе белков VEGF;

где условные символы "("и")" обозначают любое число дополнительных нуклеотидов (nts) (от 0 до 1000 nts) независимо от того, являются ли последовательности кодирующими или некодирующими;

где «линкер» обозначает любой линкер, подходящий для экспрессии смежных биологически активных полипептидов;

где «S100A1» по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% идентична или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID №105 или аминокислотной последовательности SEQ ID №104 в контексте полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно;

где «SDF-1α» по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% идентична или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID №103 или аминокислотной последовательности SEQ ID №102 в контексте полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно;

где «VEGF165» по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% идентична или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID №127 или аминокислотной последовательности SEQ ID №126 в контексте полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно;

где «VEGF191» по меньшей мере на 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 99% идентична или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID №107 или аминокислотной последовательности SEQ ID №106 в контексте полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно;

где «fp2a» по меньшей мере на 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% идентична или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID №41 или аминокислотной последовательности SEQ ID №40 в контексте полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно;

где «fmdv» по меньшей мере на 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% идентична или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID №35 или аминокислотной последовательности SEQ ID №34 в контексте полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно;

где «р2а» по меньшей мере на 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% идентична или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID №37 или аминокислотной последовательности SEQ ID №36 в контексте полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно; а также

где «GSG-p2a» по меньшей мере на 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% идентична или на 100% идентична нуклеотидной последовательности SEQ ID №39 или аминокислотной последовательности SEQ ID №40 в контексте полинуклеотидных или полипептидных последовательностей соответственно.

[0116] В предпочтительном варианте реализации композиции согласно настоящему изобретению можно применять для лечения застойной сердечной недостаточности (например, композиции согласно настоящему изобретению можно применять для лечения застойной сердечной недостаточности у пациентов с имплантируемыми левожелудочковым аппаратом вспомогательного кровообращения (LVAD)).

[0117] В предпочтительном варианте реализации композиции согласно настоящему изобретению вводят пациентам при помощи ретроградной инфузии через коронарный синус (RCSI).

[0118] В одном варианте реализации композиции согласно настоящему изобретению вводят в животные модели (например, но не ограничиваясь ими, свиньям (свиная модель)), при этом ретроградную инфузию через коронарный синус (RCSI) применяют для изучения модели ишемии миокарда у животных.

[0119] В определенных вариантах реализации функциональность каждого эффектора в рХоХ проверяли в трансфицированных индуцированных плюрипотентных стволовых клетках (iPSC), полученных от здоровых пациентов и пациентов с заболеванием, с применением специфичных к эффектору анализов. В частности, S100A1 продемонстрировал улучшение сократительных свойств. Было показано, что SDF-1α индуцирует CXCR4-зависимую миграцию клеток Jurkat и лимфоцитов периферической крови (PBL). VEGF165 продемонстрировал увеличение пролиферации эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC).

[0120] В другом варианте реализации исследование на определение безопасности in vitro трансфекции рХоХ в кардиомиоциты, полученные из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSC) от здоровых пациентов и пациентов с заболеванием, не продемонстрировало риска возникновения побочных эффектов на сердечную проводимость, которое было основано на оценках изменений продолжительности потенциала поля (с применением системы МЕА), которые тесно коррелируют с воздействиями на интервалы QT электрокардиограммы (ЭКГ).

[0121] В другом варианте реализации трансфекция рХоХ восстанавливала частоту биения, продолжительность сокращения и частоту сокращения в iPSC-CM-клетках пациентов с дилатационной кардиомиопатией до уровней, сравнимых с теми, которые наблюдаются в iPSC-CM-клетках, полученных от здорового фенотипа. В предпочтительном варианте реализации наилучшие улучшения сократительных свойств наблюдали для плазмиды pXoX, содержащей три эффекторных гена, по сравнению с плазмидами, содержащими один и содержащими два эффекторных гена.

[0122] В определенных вариантах реализации векторы и полинуклеотидные конструкции согласно настоящему изобретению содержат последовательности парных генов (двойных генов) (и полипептидов, ими же кодируемых), как, например, те, которые описаны в Таблице 1.

*«CAG» и «NXB-V2» представляют собой CAG-промотор плюс 5' и 3' элементы и новую версию 2 остова вектора X, обнаруженную в конструкциях согласно настоящему изобретению (как, например, в рХоХ, указанную ниже):

Последовательность векторных элементов «CAG» и «NXB-V2»

Промоторы

[0123] Промоторы являются основным цис-действующим элементом в конструкции векторного генома, который может определять общую силу экспрессии, а также клеточную специфичность. Промотор может представлять собой универсальный промотор, клеточноспецифичный промотор или их комбинацию. Универсальный или конститутивный промотор, среди прочих, может представлять собой CMV, CBA (CAG и CBh), EF-1-альфа, PKG, UBC, GUSB (hGBp), UCOE. Промотор может представлять собой промотор, который обладает активностью в представляющей интерес клетке-мишени, например, кардиальный промотор. В некоторых случаях промотор представляет собой CAG. В других случаях промотор представляет собой конститутивный промотор, такой как Ef1a. Промотор может представлять собой человеческий промотор, такой как Ef1a (hEf1a) человека. Также можно применять двунаправленный промотор. Например, конститутивный двунаправленный промотор может представлять собой промотор цитомегаловируса человека.

[0124] В некоторых вариантах реализации, таких как те, в которых секретируется генный продукт, полипептид, может потребоваться универсальная экспрессия во всех или выбранных типах клеток. Такие конститутивные промоторы, как промотор субъединицы фактора элонгации 1α человека (EF1α), немедленно-ранний промотор цитомегаловируса (CMV), промотор β-актина цыпленка (CBA) и его производного CAG, промоторы β-глюкуронидазы (GUSB) или убиквитина С (UBC), можно применять для стимулирования экспрессии в большинстве тканей (Husain et al., 2009; Qin et al., 2010; Norrman et al., 2010). В целом CBA и CAG среди конститутивных промоторов способствуют большей экспрессии (Xu et al., 2001; Yin et al., 2011); однако их размер в ~1,7 тыс. п.о. в сравнении с CMV (~0,8 тыс. п.о.) или EF1α (~1,2 тыс. п.о.) может ограничивать их применение в векторах с точки зрения их упаковки. В некоторых случаях промотор GUSB или UBC может обеспечить универсальную экспрессию генов с меньшим размером в 378 п. о. и 403 п. о. соответственно, однако он может быть значительно слабее, чем CMV-промотор или СВА (Husain et al., 2009; Qin et al., 2010). Таким образом, были осуществлены модификации конститутивных промоторов с целью уменьшения их размера без влияния на их экспрессию, и такие примеры, как CBh (~800 п. о.) и миниСВА (~800 п. о.) могут стимулировать экспрессию, сопоставимую и даже более повышенную в отдельных тканях (Gray et al., 2011). В некоторых случаях «универсальные» промоторы могут иметь тенденцию к подавлению (сайленсингу) или стимулированию экспрессии различной силы в выбранных типах клеток (McCown et al., 1996; Klein et al., 1998; Gray et al., 2011).

[0125] Вирусные энхансеры и промоторы, полученные из цитомегаловируса (ЦМВ), респираторно-синцитиального вируса (RSV) и вируса обезьян 40 (SV40), можно применять для получения высоких уровней экспрессии в ряде типов клеток и тканей млекопитающих, как, например, в кардиомиоцитах. Конститутивные промоторы млекопитающих, такие как промоторы человеческого убиквитина С (UBC) и фактора элонгации трансляции 1 альфа 1 у эукариот (EEF1A1) могут обладать более устойчивой экспрессией. Тканеспецифические промоторы можно использовать для уменьшения экспрессии нецелевых трансгенов. Многочисленные цис-действующие последовательности, включая сигналы полиаденилирования, интроны и области присоединения к скаффолду/матрице (S/MAR) 52, могут в некоторых случаях могут повышать уровень и устойчивую экспрессию трансгенов.

[0126] Компактные ДНК-векторы, которые не имеют бактериального остова (например, миникольца), могут поддерживать высокие уровни и обеспечивать хорошую продолжительность экспрессии гена относительно полноразмерных ДНК-плазмид. Также можно использовать вектор dog bone. Вектор dog bone можно получить без использования бактерий. В некоторых случаях также можно применять ДНК-векторы на основе липидов, в некоторых случаях можно использовать систему транспозонов. Например, система транспозиции может представлять собой или может быть основана на рекомбиназах phiC31, PiggyBac57, «спящая красавица» или их комбинациях.

[0127] В некоторых случаях описанные в настоящем документе векторы, содержащие кардиальные эффекторные гены, можно интегрировать в клеточный геном с применением рекомбиназы, ФИГ. 2. Рекомбиназа может представлять собой рекомбиназу для att-сайта. В некоторых случаях рекомбиназа может быть выбрана из рекомбиназ, описанных в патенте США №9034650; публикации патента США №2015/0275232 и W02008/073154, полное содержание каждой публикации включено в настоящее описание посредством ссылки.

[0128] Рекомбиназу можно вводить в клетку через мРНК, кодирующую рекомбиназу. В определенных вариантах реализации интеграцию рекомбиназы в геном клетки можно предотвратить путем введения и экспрессии рекомбиназы, применяя мРНК, кодирующую рекомбиназу. В некоторых случаях мРНК, кодирующая рекомбиназу, может представлять собой синтетическую мРНК или мРНК класса cGMP, ФИГ. 1.

[0129] В некоторых случаях рекомбиназу можно вводить в клетку посредством плазмиды экспрессии, содержащей «суицидальный ген» и ген, кодирующий рекомбиназу. В некоторых вариантах реализации суицидальный ген и ген рекомбиназы могут быть разделены промежуточным участком внутренней посадки рибосомы (IRES).

[0130] В некоторых случаях клетка, в которую можно ввести или генетически интегрировать векторы (например, посредством рекомбиназы), может представлять собой первичную клетку (например, такую как, но не ограничиваясь ею, кардиомиоцит, ФИГ. 2). В некоторых случаях ген, кодируемый внутри вектора, можно ввести в клетку при помощи генетических методов в целевое местоположение в геноме.

[0131] Элементы участка внутренней посадки рибосомы (IRES) могут способствовать экспрессии нескольких генов с одного транскрипта (Mountford and Smith 1995). В контексте настоящего описания подразумевается, что термин «IRES» обозначает участок внутренней посадки рибосомы. В векторе, содержащем последовательность IRES, первый ген может транслироваться при помощи кэп-зависимого (сканирующего) механизма с участием собственной 5'-НТО, тогда как трансляция последующего гена может осуществляться путем непосредственного рекрутинга рибосомы в IRES кэп-независимым образом.

[0132] Последовательность IRES может способствовать тому, что рибосомы у эукариот связываются и начинают трансляцию без связывания с 5'-кэпированныи концом. В определенных случаях область IRES можно получить из последовательности IRES таких вирусов, как, например, пикорнавируса, вируса энцефаломиокардита, вируса гепатита С. В других случаях последовательность IRES можно получить из вируса энцефаломиокардита. В контексте настоящего описания термин «EMCV» или «вирус энцефаломиокардита» относится к любому члену изолятов или штаммов видов вируса энцефаломиокардита рода семейства Picornaviridae. Примерами являются: штамм вируса EMCV-R (Rueckert), вирус Columbia-SK. В некоторых случаях можно применять клеточный элемент IRES, такой как фактор инициации у эукариот 4G, белок, связывающий тяжелую цепь иммуноглобулина, протоонкоген c-myc, фактор роста эндотелия сосудов, IRES фактора роста фибробластов 1 или любую их комбинацию или модификацию. В некоторых случаях клеточный IRES может обладать повышенной экспрессией гена по сравнению с вирусным IRES.

[0133] В контексте настоящего описания термин «КЭП» или «кэп» относится к модифицированному нуклеотиду, обычно к 7-метилгуанозину, присоединенному в направлении 3' к 5' (7meG-ppp-G), к 5'-концу эукариотической мРНК, который выступает в роли необходимого элемента в нормальном пути инициации трансляции во время экспрессии белка с такой мРНК.

[0134] IRES-последовательность вируса, клетки или их комбинации можно использовать в векторе. IRES можно получить из вируса энцефаломиокардита (EMCV) или полиовируса (PV).

[0135] В некоторых случаях элемент IRES выбран из группы, состоящей из полиовируса (PV), вируса энцефаломиелита (EMCV), вируса ящура (FMDV), тесковируса свиней 1 (PTV-1), аичивируса (AiV), вируса долины Сенека (SVV), вируса гепатита С (HCV), вируса классической чумы свиней (CSFV), вируса иммунодефицита человека 2 (ВИЧ-2), вируса иммунодефицита человека-1 (ВИЧ-1), вируса лейкоза Молони грызунов (MoMLV), вирус иммунодефицита кошачьих (FIV), вирус опухоли молочной железы мыши (MMTV), цитомегаловируса человека, находящегося в латентном состоянии (pUL138), вирус Эпштейна-Барра (EBNA-1), вируса герпеса, вызывающего болезнь Марека (MDV RLORF9), вируса SV40, содержащего полицистронную 19S (SV40 19S), вируса Rhopalosiphum padi (RhPV), вируса паралича крикета (CrPV), пикорнаподобного вируса Ectropis obliqua (EoPV), кишечного вируса Plautia stali (PSIV), вируса Triatoma (TrV), дицистровируса паралича пчел (IAPV, KBV), вируса реверсии черной смородины (BRV), вируса разрыва цветков пеларгонии (PFBV), вируса хлоротической кольцевой пятнистости гибискуса (HCRSV), тобамовируса крестоцветных (CrT MV), полеровируса скручиваемости листьев картофеля (PLRV), вируса травы табака (TEV), гиардиавируса (GLV), РНК-вируса лейшмании 1 (LRV-1) и их комбинаций или модификаций.

[0136] В некоторых случаях IRES выбран из группы, состоящей из Apaf-1, XIAP, HIAP/с-IAP1, DAP5, Bcl-2, c-myc, САТ-1, INR, фактора дифференцировки LEF-1, PDGF2, HIF-1a, VEGF, FGF2, BiP, BAG-1, CIRP, p53, SHMT1, PITSLREp58, CDK1, Rpr, hid, hsp70, grim, skl, Antennapedia, dFoxO, dInR, Adh-Adhr, HSP101, ADH, URE -2, GPR1, NCE102, YMR181a, MSN1, BOI1, FL08, GIC1 и любой их комбинации или модификации.

[0137] Когда элемент IRES расположен между двумя открытыми рамками считывания (ОРС), инициирование трансляции может происходить при помощи канонического 5'-m7GpppN кэп-зависимого механизма в первой ОРС и посредством кэп-независимого механизма во второй ОРС, расположенной после элемента IRES.

[0138] В некоторых случаях гены могут быть соединены при помощи участка внутренней посадки рибосомы (IRES). IRES может способствовать одновременной экспрессии нескольких генов. Например, последовательность IRES может способствовать образованию несколько белков из одного транскрипта мРНК. Рибосомы могут связываться с IRES 5'-кэп-независимым образом и инициировать трансляцию.

[0139] В некоторых случаях последовательность IRES может составлять или может составлять приблизительно 500 пар оснований. Последовательность IRES может составлять от 300 пар оснований до 1000 пар оснований. Например, длина IRES может составлять 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950 или 1000 пар оснований.

[0140] В некоторых случаях можно понизить экспрессию гена внутри вектора, содержащего последовательность IRES, который расположенного за этой последовательностью. Например, экспрессия гена, следующего за последовательностью IRES, может быть понижена по сравнению с уровнем экспрессии гена, находящегося перед последовательностью IRES. Снижение уровня экспрессии может составлять от 1% до 99% от уровня экспрессии предшествующего гена.

[0141] В некоторых случаях можно применять вирусную 2А-последовательность. 2А-последовательность можно получить из 2А-последовательности пикорнавируса. 2А-последовательность пикорнавируса можно выбрать из группы, состоящей из 2А-последовательностей энтеровируса, 2А-последовательностей риновируса, 2А-последовательностей кардиовируса, 2А-последовательностей афтовируса, 2А-последовательностей гепатовируса, последовательностей 2А арбовируса, 2А-последовательностей кобувируса, 2А-последовательностей тесковируса и 2А-последовательностей парэховируса.

[0142] 2А-элементы могут быть короче, чем IRES, от 5 до 100 пар оснований. В некоторых случаях длина 2А-последовательности может составлять 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90 или 100 пар оснований. Соединенные с 2А гены могут экспрессироваться в одной открытой рамке считывания и «саморасщепление» может происходить котрансляционно между двумя последними аминокислотами, GP, на С-конце 2А-полипептида, что приводит к равным количествам совместно экспрессированных белков. В некоторых случаях полипептид, содержащий 2А-последовательность, может не приводить к равным количествам белка после расщепления. В некоторых случаях концентрация первого белка может быть на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или вплоть до 100% больше по сравнению с концентрацией второго белка. В некоторых случаях концентрация второго белка может быть на 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% или вплоть до 100% больше по сравнению с концентрацией второго белка.

[0143] Длина вирусной 2А-последовательности может составлять приблизительно 20 аминокислот. В некоторых случаях вирусная 2А-последовательность может содержать консенсусный мотив Asp-Val/Ile-Glu-X-Asn-Pro-Gly-Pro (SEQ ID №117). Последовательность консенсусного мотива может действовать котрансляционно. Например, можно предотвратить образование нормальной пептидной связи между остатком глицина и пролина, что может привести к «рибосомному перепрыгиванию» и тем самым «расщеплению» зарождающегося полипептида. Несколько генов могут обеспечить такой эффект на эквимолярных уровнях.

[0144] 2А-пептид может способствовать трансляции нескольких белков в одной открытой рамке считывания в полипептид, который впоследствии может быть «расщеплен» до отдельного полипептида через механизм «рибосомного перепрыгивания» (Funston, Kallioinen et al., 2008). В некоторых вариантах реализации «2А»-последовательность может содержать: р2а, GSG-p2a, Т2А, Е2А, F2A и BmCPV2A, BmIFV2A и любую их комбинацию.

[0145] Вектор может также содержать дополнительную 2А/фурин-последовательность, расположенную между полицистронными генами для обеспечения образования продуктов экспрессии, образующихся, например, со второго гена путем ферментативного расщепления полипептидного продукта. В некоторых случаях дополнительные линкеры можно использовать для облегчения расщепления между несколькими генами в полигенном векторе.

[0146] В некоторых случаях вектор может содержать IRES-последовательность и 2А-последовательность. В других случаях экспрессии нескольких генов, соединенных с 2А-пептидами, может способствовать спейсерная последовательность (GSG) перед 2А-пептидами. В некоторых случаях в конструкциях могут комбинироваться спейсеры, линкеры, адаптеры, промоторы или их комбинации. Например, конструкция может содержать сайт расщепления линкера спейсером (SGSG (SEQ ID №118) или GSG) и фурином (RAKR (SEQ ID №32)) с различными 2А-пептидами. Спейсер может представлять собой I-Ceui (интрон-кодирующая эндонуклеаза). В некоторых вариантах реализации по меньшей мере два кардиальных эффекторных гена разделены участком внутренней посадки рибосомы (IRES).

Полинуклеотидные линкеры

[0147] В описанных в настоящем документе вариантах реализации полинуклеотидный линкер можно использовать в описанном в настоящем документе полинуклеотиде. Полинуклеотидный линкер может представлять собой двухцепочечный сегмент ДНК, содержащий требуемые сайты рестрикции, которые можно добавить для создания концевых структур, совместимых с вектором, содержащим описанный в настоящем документе полинуклеотид. В некоторых случаях полинуклеотидный линкер может быть подходящим для модификации векторов, содержащих описанные в настоящем документе полинуклеотиды. Например, модификация вектора, содержащего полинуклеотидный линкер, может представлять собой изменение в сайте множественного клонирования или добавление полигистидинового хвоста. Полинуклеотидные линкеры также можно применять для адаптации тупых концов ДНК-вставки для клонирования в вектор, расщепляемый рестрикционным ферментом с «липкими» концами. Применение полинуклеотидных линкеров может быть более эффективным, чем лигирование тупых концов в векторе, и оно может обеспечить способ высвобождения вставки из вектора в последующих способах применений. В некоторых случаях вставка может представлять собой полинуклеотидную последовательность, кодирующую полипептиды, подходящие для терапевтических применений (например, полипептид SDF1, полипептид S100A1, полипептид VEGF и их фрагменты и варианты).

[0148] Полинуклеотидный линкер может представлять собой олигомер. Например, длина линкера может составлять от приблизительно 5 до 20 нуклеотидов. Длина полинуклеотидного линкера может составлять или может приблизительно составлять от 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 или 20 нуклеотидов. Полинуклеотидный линкер может представлять собой двухцепочечную ДНК, одноцепочечную ДНК или их комбинацию. В некоторых случаях линкер может представлять собой РНК. Полинуклеотидный линкер можно лигировать в вектор, содержащий описанный в настоящем документе полинуклеотид, в некоторых случаях при помощи Т4-лигазы. Для содействия лигированию избыток полинуклеотидных линкеров можно добавить к композиции, содержащей вставку и вектор. В некоторых случаях вставку и вектор предварительно обрабатывают до введения линкера. Например, предварительная обработка метилазой может предотвратить нежелательное расщепление ДНК-вставки.

Полипептидные линкеры

[0149] В определенных вариантах реализации два или более полипептидов, кодируемых описанным в настоящем документе полинуклеотидом, могут быть разделены промежуточной последовательностью, кодирующей полипептидный линкер. В определенных случаях указанный линкер представляет собой чувствительный к расщеплению линкер. В некоторых вариантах реализации представляющие интерес полипептиды экспрессируются в виде белков слияния, связанных при помощи чувствительного к расщеплению полипептидного линкера. В определенных вариантах реализации чувствительный к расщеплению полипептидный линкер(-ы) может представлять собой по меньшей мере один из Furinlink, fmdv, р2а, GSG-p2a и/или fp2a, описанных ниже. В некоторых случаях линкер представляет собой APVKQGSG (SEQ ID №119).

[0150] В некоторых случаях полипептидный линкер может содержать аминокислотную последовательность «RAKR» (SEQ ID №32). В некоторых случаях полипептидный линкер furin может кодироваться полинуклеотидной последовательностью, содержащей «CGTGCAAAGCGT» (SEQ ID №33).

[0151] В некоторых случаях полипептидный линкер может представлять собой линкер, содержащий последовательность, описанную в таблице ниже:

[0152] В некоторых вариантах реализации линкер можно использовать в описанном в настоящем документе полинуклеотиде. Линкер может представлять собой гибкий линкер, негибкий (жесткий) линкер, расщепляемый in vivo линкер или любую их комбинацию. В некоторых случаях линкер может связывать вместе функциональные домены (в случае как гибких, так и негибких линкеров), либо высвобождать свободный функциональный домен in vivo, как, например, в случае расщепляемых in vivo линкеров.

[0153] Линкеры могут улучшать биологическую активность, повышать выход экспрессии и способствовать достижению требуемых фармокинетических профилей. Линкер может также содержать гидразон, пептид, дисульфид или тиоэфир.

[0154] В некоторых случаях описанная в настоящем документе линкерная последовательность может включать последовательность гибкого линкера. Гибкие линкеры можно применять в случае, когда объединенный домен требует определенной степени движения или взаимодействия. Гибкие линкеры могут состоять из низкомолекулярных, неполярных (например, Gly) или полярных (например, Ser или Thr) аминокислот.Гибкий линкер может иметь последовательности, состоящие в основном из участков остатков Gly и Ser («GS» линкер). Пример гибкого линкера может иметь последовательность (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n (SEQ ID №120). Регулируя число копий «n», длину такого приведенного в качестве примера GS-линкера можно оптимизировать для обеспечения соответствующего разделения функциональных доменов или для поддержания необходимых междоменных взаимодействий. Помимо GS-линкеров, для получения рекомбинантных белков слияния можно использовать другие гибкие линкеры. В некоторых случаях гибкие линкеры также могут быть обогащены низкомолекулярными или полярными аминокислотами, такими как Gly и Ser, однако для поддержания гибкости они могут содержать и дополнительные аминокислоты, такие как Thr и Ala. В других случаях полярные аминокислоты, такие как Lys и Glu, можно применять для улучшения растворимости.

[0155] Для обеспечения хорошей гибкости и растворимости, гибкие линкеры, содержащиеся в описанных в настоящем документе линкерных последовательностях, могут быть обогащены низкомолекулярными или полярными аминокислотами, такими как Gly и Ser. Гибкие линкеры могут быть подходящим выбором в случае, когда требуются определенные движения или взаимодействия для доменов белков слияния. Кроме того, хотя гибкие линкеры могут и не иметь жестких структур, они могут служить в качестве пассивных линкеров для сохранения расстояния между функциональными доменами. Длину гибких линкеров можно регулировать для обеспечения надлежащего фолдинга или достижения оптимальной биологической активности указанных белков слияния.

[0156] Описанный в настоящем документе линкер может также включать негибкий линкер. Негибкий линкер можно использовать для поддержания фиксированного расстояния между доменами полипептида. Примерами негибких линкеров, среди прочих, могут быть: образующие альфа-спираль линкеры, богатая пролином последовательность, (XP)_n (SEQ ID №121), X-Pro-осТОВ, A (EAAAK)_nA (n=2-5) (SEQ ID №122). Негибкие линкеры могут представлять собой относительно жесткие структуры, в некоторых случаях за счет принятия формы α-спиральной структуры или содержания несколько остатков пролина (Pro).

[0157] В некоторых случаях описанный в настоящем документе линкер может быть расщепляемым. В других случаях линкер не является расщепляемым. Линкеры, которые не являются расщепляемыми, могут ковалентно соединять функциональные домены, чтобы действовать как одна молекула во всех процессах in vivo или в процессе ex vivo. Линкер также может быть расщепляемым in vivo. Расщепляемый линкер можно вводить для высвобождения свободных функциональных доменов in vivo. Расщепляемый линкер может расщепляться, среди прочего, в присутствии восстанавливающих реагентов, протеаз. Например, для получения расщепляемого линкера можно использовать восстановление дисульфидной связи. В случае дисульфидного линкера расщепление происходит через реакцию дисульфидного обмена с тиолом, как, например, глутатионом. В других случаях расщепление in vivo линкера в рекомбинантном белке слияния также может осуществляться протеазами, которые могут экспрессироваться in vivo в патологических условиях (например, рак или воспаление), в определенных клетках или тканях, или находиться в определенных клеточных компартментах. В некоторых случаях расщепляемый линкер может способствовать целевому расщеплению. Например, специфичность многих протеаз может обеспечить более медленное расщепление линкера в ограниченных компартментах. Расщепляемый линкер может также содержать гидразон, пептиды, дисульфиды или тиоэфир. Например, гидразон может обеспечивать стабильность сыворотки. В других случаях гидразон может обеспечивать расщепление в кислотном компартменте. рН кислотного компартмента может достигать 7. Линкер может также содержать тиоэфир. Тиоэфир может быть невосстанавливаемым. Тиоэфир можно сконструировать для внутриклеточного протеолитического разложения.

[0158] В определенных вариантах реализации полипептидный линкер fmdv содержит последовательность, которая может быть по меньшей мере на приблизительно 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №34. В определенных вариантах реализации линкерный полипептид fmdv представляет собой по меньшей мере один линкер, кодируемый в одном векторе, связывающем два или более белка слияния. В определенных случаях линкерный полипептид fmdv может кодироваться полинуклеотидом нуклеотидной последовательности открытой рамки считывания (ОРС). В некоторых случаях ОРС, кодирующая fmdv, содержит или состоит из последовательности SEQ ID №35. В определенных вариантах реализации полинуклеотидная последовательность, кодирующая fmdv, по меньшей мере на 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №35.

[0159] В определенных случаях линкерный полипептид может представлять собой «р2а» линкер. В определенных вариантах реализации р2а-полипептид может содержать последовательность, которая может быть по меньшей мере на 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №36. В определенных вариантах реализации линкерный полипептид р2а может представлять собой по меньшей мере один из линкеров, кодируемых в одном векторе, связывающем два или более белка слияния. В некоторых случаях линкерный полипептид р2а может кодироваться полинуклеотидом нуклеотидной последовательности открытой рамки считывания (ОРС). В определенных вариантах реализации ОРС, кодирующая р2а, содержит или состоит из последовательности SEQ ID №37. В определенных случаях последовательность полинуклеотида, кодирующего р2а, может быть или может быть по меньшей мере на приблизительно 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №37.

[0160] В некоторых случаях линкерный полипептид может представлять собой линкер «GSG-p2a». В определенных вариантах реализации линкерный полипептид GSG-p2a может содержать последовательность, которая может быть по меньшей мере на 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №38. В определенных вариантах реализации линкерный полипептид GSG-p2a может представлять собой по меньшей мере один из линкеров, кодируемых в одном векторе, связывающем два или более белка слияния. В некоторых случаях линкерный полипептид GSG-p2a может кодироваться полинуклеотидом полинуклеотидной последовательности открытой рамки считывания (ОРС). ОРС, кодирующая GSG-p2a, может содержать последовательность SEQ ID №39. В некоторых случаях последовательность полинуклеотида, кодирующего GSG-p2a, может быть или может быть по меньшей мере на приблизительно 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №39.

[0161] Предложенный в настоящем документе линкерный полипептид может представлять собой линкер «fp2a». В определенных вариантах реализации линкерный полипептид fp2a может содержать последовательность, которая может быть по меньшей мере на приблизительно 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №40. В определенных случаях линкерный полипептид fp2a может представлять собой по меньшей мере один из линкеров, кодируемых в одном векторе, связывающем два или более белка слияния. В некоторых случаях линкерный полипептид fp2a может кодироваться полинуклеотидом полинуклеотидной последовательности открытой рамки считывания (ОРС). В определенных вариантах реализации последовательность полинуклеотида, кодирующего fp2a-линкер, может быть или может быть по меньшей мере на приблизительно 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №41.

[0162] В некоторых случаях вектор можно сконструировать. Например, линкер можно сконструировать таким образом, чтобы он обладал такими химическими характеристиками, как гидрофобность. В некоторых случаях по меньшей мере две линкерные последовательности могут продуцировать один и тот же белок. Последовательность может быть или может быть по меньшей мере на приблизительно 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 99% или 100% идентична последовательностям с SEQ ID №42 по SEQ ID №101. В других случаях в векторе можно применять несколько линкеров. Например, представляющие интерес гены (например, S100A1, SDF-1α и VEGF165) могут быть разделены по меньшей мере двумя линкерами, как это показано на ФИГ. 20А и ФИГ. 20В. В некоторых случаях гены могут быть разделены 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или вплоть до 10 линкерами.

[0163] Линкер может представлять собой сконструированный линкер. Способы конструирования линкеров могут быть вычислительными. В некоторых случаях вычислительные способы могут включать графические методы. Вычислительные способы можно применять для поиска подходящих пептидов из библиотек трехмерных пептидных структур, полученных из баз данных. Например, Брукхейвенский банк данных белков (PDB) можно применять для определения расстояния в пространстве между выбранными аминокислотами линкера.

[0164] В некоторых вариантах реализации предложены полинуклеотиды, кодирующие полипептидную конструкцию, содержащую полипептид фурина и 2А-полипептид, при этом указанный полипептид фурина и 2А-полипептид соединены полипептидным линкером, содержащим по меньшей мере три гидрофобные аминокислоты. В некоторых случаях по меньшей мере три гидрофобные аминокислоты выбраны из списка, состоящего из глицина (Gly) (G), аланина (Ala) (А), валина (Val) (V), лейцина (Leu) (L), изолейцина (Ile) (I), пролина (Pro) (Р), фенилаланина (Phe) (F), метионина (Met) (М), триптофана (Trp) (W). В некоторых случаях указанный линкер содержит последовательность, представленную в Таблице 3, описанную в настоящем документе. В некоторых случаях полипептидный линкер может также содержать по меньшей мере одну последовательность GS-линкера, например, (GS)_n (SEQ ID №109), (SG)_n (SEQ ID №110), (GSG)_n (SEQ ID №111) и (SGS)_n (SEQ ID №112), где n может быть любым числом от нуля до пятнадцати.

Предложены способы получения улучшенной экспрессии полипептидной конструкции, включающие: обеспечение полинуклеотида, кодирующего указанную полипептидную конструкцию, содержащую первый функциональный полипептид и второй функциональный полипептид, при этом указанные первый функциональный полипептид и второй функциональный полипептид соединены при помощи линкерного полипептида, содержащего последовательность с по меньшей мере 60% идентичностью к последовательности APVKQ (SEQ ID №42); и экспрессию указанного полинуклеотида в клетке-хозяине, при этом указанная экспрессия приводит к улучшенной экспрессии указанной полипептидной конструкции по сравнению с соответствующей полипептидной конструкцией, которая не содержит линкерный полипептид, содержащий последовательность с по меньшей мере 60% идентичностью к последовательности APVKQ (SEQ) ID №42). В некоторых случаях указанный линкер содержит последовательность, представленную в Таблице 3, описанную в настоящем документе. В некоторых случаях полипептидный линкер может также содержать по меньшей мере одну последовательность GS-линкера, например, (GS)_n (SEQ ID №109), (SG)_n (SEQ ID №110), (GSG)_n (SEQ ID №111) и (SGS)_n (SEQ ID №112), где n может быть любым числом от нуля до пятнадцати. В некоторых случаях уровень улучшенной экспрессии по меньшей мере приблизительно на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70% 75%, 80%, 85%, 90%, 95% или 100% выше по сравнению с соответствующей полипептидной конструкцией, которая не содержит линкерного полипептида, содержащего последовательность с по меньшей мере 60% идентичностью к последовательности APVKQ (SEQ ID №42).

[0165] В предпочтительных вариантах реализации предложен уникальный аспект согласно настоящему изобретению, который относится к конкретному последовательному порядку полипептидов, кодируемых конструкциями согласно настоящему изобретению. Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения специфическое размещение белка S100A1 вначале конструкции позволяет достичь и способствует функциональной экспрессии биологически активных молекул S100A1, поскольку неожиданно было обнаружено, что оставшийся 2А-хвост на поверхности S100A1 не препятствует биологической активности S100A1. В тоже время было обнаружено, что размещение S100A1 в качестве второго гена приводит к неполному расщеплению генов, экспрессируемых посредством конструкции.

[0166] Соответственно, анализ экспрессии рХоХ методом масс-спектрометрии, как это указано ниже в Таблице 13, показал, что S100A1 является единственным эффектором, который не расщепляет фурин, что приводит к удалению С-концевого 2А-пептида. Следовательно, на поверхности SDF1-α или VEGF не остается С-концевого 2А-хвоста. Только S100A1 имеет 2А-линкерный хвост. Точная концевая аминокислотная последовательность представляет собой PG. Она расщепляется между G и Р концевой PGP-последовательности. Следовательно, С-концевой линкерный хвост на поверхности S100A1, экспрессируемого с рХоХ, содержит последовательность (от N- к С-концу) полипептида S101A1, слитую с последовательностью вида (N-конец)-RAKRAPVKQGSGATNFSLLKQAGDVEENPG-(C-конец) (SEQ ID №123), которая в настоящем документе может упоминаться как «2А-хвост». Например, в одном варианте реализации от исходного метионина S100A1 до С-концевой области хвоста расщепляемого линкера fp2a первый GOI согласно настоящему изобретению содержит последовательность:

которая может кодироваться полинуклеотидной последовательностью:

или вырожденные полинуклеотиды, кодирующие одну и ту же аминокислотную последовательность, или аминокислотные последовательности или нуклеотидные последовательности по меньшей мере на 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95%, 97% 98% или 99% идентичные вышеупомянутому 2А-хвосту.

[0167] Тем не менее, как это показано в представленных в настоящем документе данных, было продемонстрировано, что этот хвост S100A1 является «инертным», т.е. не влияет на функцию (биологическая активность) S100A1.

Векторные модификации

[0168] Полинуклеотидный вектор, подходящий для описанных в настоящем документе способов и композиций, может представлять собой вектор, соответствующий стандартам надлежащей производственной практики (GMP). Например, соответствующий GMP вектор может быть более чистым, чем вектор, не соответствующий GMP. В некоторых случаях чистоту можно измерить с помощью бионагрузки. Например, бионагрузка может представлять собой наличие или отсутствие аэробов, анаэробов, спорообразователей, грибов или их комбинаций в векторной композиции. В некоторых случаях чистый вектор может быть с низким содержанием эндотоксина или не содержать его вовсе. Чистоту можно также измерить методом секвенирования двухцепочечной «блуждающей затравки». Идентификация плазмиды может служить источником определения чистоты вектора. Соответствующий GMP вектор согласно настоящему изобретению может быть на 10%-99% более чистым, чем вектор, не соответствующий GMP. Соответствующий GMP вектор может быть на 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99% более чистым, чем не соответствующий GMP вектор, что измеряется присутствием бионагрузки, эндотоксина, путем секвенирования или при помощи таких комбинаций.

[0169] В некоторых случаях в конце программы первого гена применяют терминирующую последовательность. Терминирующая последовательность может гарантировать, что транскрипт заканчивается до начала программы второго гена. Например, векторы экспрессии могут содержать последовательности, необходимые для прекращения транскрипции и для стабилизации мРНК. Такие последовательности обычно доступны с 5' и иногда 3'-нетранслируемых областей эукариотических или вирусных ДНК или кДНК. Эти области могут содержать нуклеотидные сегменты, транскрибируемые в виде полиаденилированных фрагментов в нетранслируемом участке мРНК. Клетки, содержащие указанный вектор экспрессии, выращивают в условиях, которые обеспечивают экспрессию требуемого полипептида либо in vivo, либо in vitro.

[0170] В некоторых случаях можно применять спейсерную последовательность на конце первого полипептида, кодируемого полинуклеотидом в векторе. В других случаях спейсерную последовательность можно применять на конце второго гена в векторе. Спейсерную последовательность можно также применять после первого и второго генов в векторе.

[0171] Эти векторы можно применять для экспрессии полипептида, кодируемого геном или частью представляющего интерес гена. Часть гена или сам ген можно вставить с применением любого способа, вирусного или невирусного. Например, способ может представлять собой методику, основанную на использовании не-вирусов.

[0172] В некоторых случаях можно произвести векторные модификации. Например, модификация может включать добавление индуцируемого переключателя генов для контролируемой экспрессии генов, изменения порядка и/или отбора кардиальных эффекторных генов, которые необходимо скомбинировать, замену промотора (например, для обеспечения сильной, специфической экспрессии в левом желудочке) и их комбинации.

[0173] В определенных вариантах реализации последовательности инициации трансляции, предшествующие кодирующей последовательности кардиального эффекторного полипептида в векторах согласно настоящему изобретению, содержат консенсусную последовательность Козак (Kozak). В настоящем документе это может быть указано в описаниях как «Kozak»=«Да».

[0174] В определенных вариантах реализации последовательности инициации трансляции, предшествующие кодирующей последовательности кардиального эффекторного полипептида в векторах согласно настоящему изобретению, не содержат консенсусной последовательности Kozak. В настоящем документе это может быть указано в описаниях как «Kozak»=«Нет».

[0175] В определенных вариантах реализации экспрессией любого одного, двух или трех кардиальных эффекторных полипептидов (таких как SDF1, S100A1 и VEGF191) можно управлять через конститутивный или индуцируемый промотор. В определенных случаях уровень экспрессии по меньшей мере двух генов является равным. В других случаях уровень экспрессии по меньшей мере двух генов не является равным. В некоторых случаях ген, располагающийся в конструкции выше, может экспрессироваться с более высокой концентрацией, чем ген, располагающийся ниже. В других случаях ген, располагающийся в конструкции ниже, может экспрессироваться с более высокой концентрацией, чем ген, располагающийся выше. Линкер может участвовать в контроле уровней экспрессии. Например, расщепляемый линкер можно сконструировать таким образом, чтобы расщепление было более эффективным или менее эффективным.

[0176] В некоторых случаях индуцируемый промотор может представлять собой индуцируемый низкомолекулярным лигандом переключатель генов на основе двухполипептидного рецептора экдизона. В некоторых случаях переключатель генов может быть выбран из рецепторных компонентов на основе экдизона, описанных, без ограничений, в любой из систем, описанных в: PCT/US2001/009050 (WO 2001/070816); патентах США №№7091038; 7776587; 7807417; 8202718; PCT/US2001/030608 (WO 2002/029075); патентах США №№8105825; 8168426; PCT/1J52002/005235 (WO 2002/066613); публикации патента США №10/468200 (публикация патента США №20120167239); PCT/US2002/005706 (WO 2002/066614); патентах США №№7531326; 8236556; 8598409; PCT/U52002/005090 (WO 2002/066612); патентах США №№8715959 (публикация патента США №20060100416); PCT/US2002/005234 (WO 2003/027266); патентах США №№7601508; 7829676; 7919269; 8030067; PCT/U52002/005708 (WO 2002/066615); публикации патента США №10/468192 (публикация патента США №20110212528); PCT/US2002/005026 (WO 2003/027289); патентах США №№7563879; 8021878; 8497093; PCT/US2005/015089 (WO 2005/108617); патентах США №№7935510; 8076454; PCT/U52008/011270 (WO 2009/045370); публикации патента США №12/241018 (публикация патента США №20090136465); PCT/US2008/011563 (WO 2009/048560); публикации патента США №12/247738 (публикация патента США №20090123441); PCT/US2009/005510 (WO 2010/042189); публикации патента США №13/123129 (публикация патента США №20110268766); PCT/US2011/029682 (WO 2011/119773); публикации патента США №13/636473 (публикация патента США №20130195800); PCT/US2012/027515 (WO 2012/122025) и публикации патента США №14/001943 (публикация патента США №20140308247), каждый документ полностью включен в настоящее описание посредством ссылки.

[0177] В некоторых случаях лиганд, применяемый для регулируемого дозой контроля регуляции индуцируемого переключателя гена на основе рецептора экдизона, можно выбрать из любого одного, без ограничений, экдистероида, такого как экдизон, 20-гидроксиэкдизона, понастерона А, муристерона А и им подобных, 9-цис-ретиноевой кислоты, синтетических аналогов ретиноевой кислоты, N,N'-диацилгидразинов, как, например, тех, которые описаны в патентах США №№6013836; 5117057; 5530028 и 5378726 и опубликованных заявках на патент США №№2005/0209283 и 2006/0020146; оксадиазолинов, описанных в опубликованной заявке на патент США №2004/0171651; дибензоилалкилцианогидразинов, таких как тех, которые описаны в европейской заявке №461809; N-алкил-N,N'-диароилгидразинов, таких как тех, которые описаны в патенте США №5225443; N-ацил-N-алкилкарбонилгидразинов, таких как тех, которые описаны в европейской заявке №234994; N-ароил-N-алкил-N'-ароилгидразинов, таких как тех, которые описаны в патенте США №4985461; арнидокетонов, таких как те, которые описаны в опубликованной заявке на патент США №2004/0049037; каждый из указанных документов включен в настоящее описание посредством ссылки, и других аналогичных материалов, включая 3,5-ди-трет-бутил-4-гидрокси-N-изобутилбензамид, 8-O-ацетилгарпагид, оксистеролы, 22(R)-гидроксихолестерин, 24(S)-гидроксихолестерин, 25-эпоксихолестерин, Т0901317, 5-альфа-6-альфа-эпоксихолестерин-3-сульфат (ECHS), 7-кетохолестерин-3-сульфат, фрамесол (framesol), желчные кислоты, 1,1-бифосфонатные эфиры, ювенильный гормон III и им подобные. Примеры подходящих в настоящем изобретении диацилгидразиновых лигандов включают RG-115819 (N-(1-этил-2,2-диметилпропил)-N'-(2-метил-3-метокси-бензоил)-гидразид 3,5-диметилбензойной кислоты), RG-115932 (N-(1-трет-бутилбутил)-N'-(2-этил-3-метоксибензоил)гидразид (R)-3,5-диметилбензойной кислоты) и RG-115830 (N-(1-трет-бутилбутил)-N'-(2-этил-3-метоксибензоил)гидразид 3,5-диметилбензойной кислоты). См., например, публикацию заявки на патент США серии №12/155111 и публикацию РСТ №PCT/US2008/006757, оба документа полностью включены в настоящее описание посредством ссылки.

[0178] В некоторых вариантах реализации два или три гена, представляющие интерес (например, но не ограничиваясь ими, кардиальные эффекторные гены), которые экспрессируют представляющие интерес полипептиды, можно включить в и/или экспрессировать с одного вектора под контролем одного промотора. В определенных вариантах реализации указанный один промотор представляет собой конститутивный промотор. В определенных вариантах реализации указанный один промотор представляет собой конститутивный тканеспецифичный промотор. В определенных вариантах реализации указанный один промотор представляет собой индуцируемый низкомолекулярным лигандом промотор на основе рецептора экдизона.

[0179] В определенных вариантах реализации экспрессия полипептидов переключателей генов находится под контролем промотора легкой цепи миозина (MLC).

[0180] Векторы можно доставить in vivo путем введения субъекту, обычно путем системного введения (например, внутривенной, внутрибрюшинной, внутримышечной, подкожной или внутричерепной инфузии) или местного нанесения, как это описано ниже. В альтернативном варианте векторы можно доставлять в клетки ex vivo, как, например, клетки, эксплантированные из субъекта (например, кардиомиоциты, биопсия сердечной ткани), с последующей реимплантацией указанных клеток в субъект, обычно после отбора клеток, которые были включены в вектор. Указанные клетки можно размножить до или после отбора.

[0181] Эффективность трансфекции клеток при помощи любой из платформ доставки нуклеиновой кислоты, описанной в настоящем документе, например, методом нуклеофекции или электропорации, может составлять или может составлять приблизительно 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45% 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5%, 99,9% или быть больше, чем 99,9%.

[0182] Эффективность интеграции гена в клетку (например, кардиомиоцит, но не ограничиваясь им) может составлять или может составлять приблизительно 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 99%, 99,5%, 99,9% или быть больше, чем 99,9%.

[0183] В определенных аспектах, описанных в настоящем документе, можно использовать векторы. Например, векторы, которые можно применять, включают, но не ограничиваются ими, бактериальные векторы: pBs, pQE-9 (Qiagen), phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBsKS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia), эукариотические векторы: pWL-neo, pSv2cat, pOG44, pXT1, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPv, pMSG, pSVL (Pharmiacia). Кроме того, можно применять любые другие плазмиды и векторы, если они могут реплицироваться и быть жизнеспособными в выбранном хозяине. Любой вектор и коммерчески доступный вектор (и их варианты или производные) можно сконструировать так, чтобы они содержали по меньшей мере один сайт рекомбинации для применения в способах. Такие векторы можно получить, например, от компаний Vector Laboratories Inc., Invitrogen, Promega, Novagen, NEB, Clontech, Boehringer Mannheim, Pharmacia, EpiCenter, OriGenes Technologies Inc., Stratagene, PerkinElmer, Pharmingen, and Research Genetics. Другие представляющие интерес векторы включают такие эукариотические векторы экспрессии, как pFastBac, pFastBacHT, pFastBacDUAL, pSFV и pTet-Splice (Invitrogen), pEUK-C1, pPUR, pMAM, pMAMneo, pBI101, pBI121, pDR2, pCMVEBNA и pYACneo (Clontech), pSVK3, pSVL, pMSG, pCH110 и pKK232-8 (Pharmacia, Inc.), p3'SS, pXT1, pSG5, pPbac, pMbac, pMClneo и pOG44 (Stratagene, Inc.) и pYES2, pAC360, pBlueBa-cHis А, В и С, pVL1392, pBlueBac111, pCDM8, pcDNA1, pZeoSV, pcDNA3 pREP4, pCEP4 и pEBVHis (Invitrogen, Corp.) и их варианты и производные. Другие векторы включают pUC18, pUC19, pBlueScript, pSPORT, космиды, фагмиды, YAC (искусственные хромосомы дрожжей), ВАС (искусственные хромосомы бактерий), Р1 (фаг Escherichia coli), pQE70, pQE60, pQE9 (quagan), векторы pBS, векторы PhageScript, векторы BlueScript, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene), pcDNA3 (Invitrogen), pGEX, pTrsfus, pTrc99A, pET-5, pET-9, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia), pSPORT1, pSPORT2, pCMVSPORT2.0 и pSYSPORT1 (Invitrogen) и их варианты и производные. Дополнительные представляющие интерес векторы также могут включать pTrxFus, pThioHis, pLEX, pTrcHis, pTrcHis2, pRSET, pBlueBa-cHis2, pcDNA3.1/His, pcDNA3.1(-)/Myc-His, pSecTag, pEBVHis, pPIC9K, pPIC3.5K, pA081S, pPICZ, pPICZA, pPICZB, pPICZC, pGAPZA, pGAPZB, pGAPZC, pBIue-Bac4.5, pBlueBacHis2, pMelBac, pSinRep5, pSinHis, pIND, pIND(SP1), pVgRXR, pcDNA2.1, pYES2, pZEr01.1, pZErO-2.1, pCR-Blunt, pSE280, pSE380, pSE420, pVL1392, pVL1393, pCDM8, pcDNA1.1, pcDNA1.1/Amp, pcDNA3.1, pcDNA3.1/Zeo, pSe, SV2, pRc/CMV2, pRc/ RSV, pREP4, pREP7, pREP8, pREP9, pREP 10, pCEP4, pEBVHis, pCR3.1, pCR2.1, pCR3.1-Uni и pCRBac от компании Invitrogen; X ExCell, X gt11, pTrc99A, pKK223-3, pGEX-1X T, pGEX-2T, pGEX-2TK, pGEX-4T-1, pGEX-4T-2, pGEX-4T-3, pGEX-3X, pGEX-5X-1, pGEX-5X-2, pGEX-5X-3, pEZZ18, pRIT2T, pMC1871, pSVK3, pSVL, pMSG, pCH110, pKK232-8, pSL1180, pNEO и pUC4K от компании Pharmacia; pSCREEN-lb(+), pT7Blue(R), pT7Blue-2, pCITE-4-abc(+), pOCUS-2, pTAg, pET-32L1C, pET-30LIC, pBAC-2 cp LIC, pBACgus-2 cp LIC, pT7Blue-2 LIC, pT7Blue-2, X SCREEN-1, X BlueSTAR, pET-3abcd, pET-7abc, pET9abcd, pET11 abcd, pET12abc, pET-14b, pET-15b, pET-16b, pET-17b-pET-17xb, pET-19b, pET-20b(+), pET-21abcd(+), pET-22b(+), pET-23abcd(+), pET-24abcd (+), pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28abc(+), pET-29abc(+), pET-30abc(+), pET-31b(+), pET-32abc(+), pET-33b(+), pBAC-1, pBACgus-1, pBAC4x-1, pBACgus4x-1, pBAC-3 cp, pBACgus-2 cp, pBACsurf-1, pig, Signal pig, pYX, Selecta Vecta-Neo, Selecta Vecta-Hyg и Selecta Vecta-Gpt от компании Novagen; pLexA, pB42AD, pGBT9, pAS2-1, pGAD424, pACT2, pGAD GL, pGAD GH, pGADIO, pGilda, pEZM3, pEGFP, pEGFP-1, pEGFPN, pEGFP-C.

[0184] pEBFP, pGFPuv, pGFP, p6xHis-GFP, pSEAP2-Basic, pSEAP2-Contral, pSEAP2-промотор, pSEAP2-энхансер, p I3gal-Basic, pl3gal-Control, p I3gal-промотор, p I3gal-энхансер, pCMV, pTet-Off, pTet-On, pTK-Hyg, pRetro-Off, pRetro-On, pIRESlneo, pIRES1hyg, pLXSN, pLNCX, pLAPSN, pMAMneo, pMAMneo-CAT, pMAMneo-LUC, pPUR, pSV2neo, pYEX4T-1/2/3, pYEX-S1, pBacPAK-His, pBacPAK8/9, pAcUW31, BacPAK6, pTriplEx, 2Xgt10, Xgt11, pWE15 и X TriplEx от компании Clontech; Lambda ZAP II, pBK-CMV, pBK-RSV, pBluescript II KS+/-, pBluescript II SK+/-, pAD-GAL4, pBD-GAL4 Cam, pSurfscript, Lambda FIX II, Lambda DASH, Lambda EMBL3, Lambda EMBL4, SuperCos, pCR-Scrigt Amp, pCR-Script Cam, pCR-Script Direct, pBS+/-, pBC KS+/-, pBC SK+/, Phag-escript, pCAL-n-EK, pCAL-n, pCAL-c, pCAL-kc, pET-3abcd, pET-llabcd, pSPUTK, pESP-1, pCMVLaI, pOPRSVI/MCS, pOPI3 CAT, pXT1, pSG5, pPbac, pMbac, pMClneo, pMClneo Poly A, pOG44, pOG45, pFRTI3AL, pNE0I3GAL, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pRS413, pRS414, pRS415 и pRS416 от компании Stratagene, pPC86, pDBLeu, pDBTrp, pPC97, p2.5, pGAD1-3, pGAD10, pACt, pACT2, pGADGL, pGADGH, pAS2-1, pGAD424, pGBT8, pGBT9, pGAD-GAL4, pLexA, pBD-GAL4, pHISi, pHISi-1, placZi, pB42AD, pDG202, pJK202, pJG4-5, pNLexA, pYESTrp и их варианты и производные.

Показания к терапии

[0185] В настоящем документе предложены способы и композиции для улучшения васкулогенеза у субъекта. Также предложены способы и композиции для лечения сердечнососудистых заболеваний. В некоторых случаях сердечно-сосудистое заболевание может представлять собой кардиомиопатию. Кардиомиопатию можно определить по патологически аномальному миокарду. Существует четыре основных типа классификации кардиомиопатии: дилатационная (DCM), гипертрофическая (НСМ), рестриктивная (RCM) и аритмогенная RV (ARVC). Векторы, содержащие описанные в настоящем документе полинуклеотиды, можно применять для лечения кардиомиопатии с применением генной терапии. В некоторых случаях по меньшей мере одну дополнительную терапию также вводят до, во время, после лечения генной терапией или при любой такой комбинации.

[0186] В некоторых случаях полипептид можно включить в описанную в настоящем документе полинуклеотидную последовательность и вводить субъекту с нарушением или субъекту, нуждающемуся в улучшенном васкулогенезе. Например, у субъекта может быть кардиомиопатия, и он может получать лечение путем введения описанного в настоящем документе полинуклеотида для лечения указанного нарушения. В некоторых случаях полинуклеотид, кодирующий ген, или полипептид, описанный в настоящем документе, можно вводить при помощи генной терапии. Гены и полипептиды, которые могут быть введены субъекту с кардиомиопатией, могут включать, например: член 9 АТФ-связывающей кассеты подсемейства С (АВСС9), α-актин сердечной мышцы 1 (ACTC1), α-актинин 2 (ACTN2), домен анкинирового повтора 1 (сердечная мышца) (ANKRD1), BCL2-ассоциированный атаноген 3 (BAG3), калсеквестрин 2 (сердечная мышца) (CASQ2), кавеолин 3 (CAV3), гомолог СОХ15, белок сборки цитохром с-оксидазы (СОХ 15), богатый α-В-кристаллином, цистеином и глицином белок 3 (CRYAB), богатый цистеином и глицином белок 3 (CSRP3), кардиотрофин 1 (CTF1), десмин (DES), дистрофии (DMD), гомолог DnaJ (Hsp40), подсемейство С, член 19 (DNAJC19), десмоколлин 2 (DSC2), десмоглиин 2 (DSG2), десмоплакин (DSP), дистробревин α (DTNA), эмерин (EMD), гомолог отсутствия глаз 4 (EYA4), четыре с половиной домена LIM 2 (FHL2), фукутин (FKTN), Forkhead box D4 (FOXD4), галактозидазу-α (GLA), соединительный плакоглобин (JUP), ламинин-α4 (LAMA4), белок лизосомальной мембраны 2 (LAMP2), связывающий LIM-домен белок 3 (LDB3), ламин А/С (LMNA), миозинсвязывающий белок С, кардиальный белок (MYBPC3), а-тяжелую цепь миозина 6 сердечной мышцы (MYH6), α-тяжелую цепь миозина 7 сердечной мышцы (MYH7), регуляторную легкую цепь миозина 2 медленной сердечной мышцы (MYH12), щелочную легкую цепь миозина 3 медленной скелетной и желудочковой мышцы (MYL3), киназу легкой цепи моизина 2 (MYLK2), миозенин 2 (MYOZ2), нексилин (F-актинсвязывающий белок) (NEXN), плакофилин 2 (PKP2), фосфоламбан (PLN), некаталитическую субъединицу γ2 АМФ-активируемой протеинкиназы (PREN), пресенилин 1 (PSEN2), пресенилин 2 (PSEN2), протеин 20 (RBM20), РНК-связывающий мотив белка 20 (RBM20), рианодиновый рецептор 2 (сердечный) (RYR2), α-субъединицу потенциалзависимого натриевого канала V-типа (SCN5A), субъединицу А фловопротеина сукцинатдегидрогеназного комплекса (SDHA), саркогликан δ (SGCD), белок ядерной оболочки 1, содержащий спектриновые повторы (SYNE 1), белок ядерной оболочки 2, содержащий спектриновые повторы (SYNE2), тафазин (TAZ), Titin-кэп (телетонин) (ТСАР), трансмембранный белок 43 (TMEM43), тимопоэтин (ТМРО), тропонин С 1 типа (медленный) (TNNC1), тропонин I 3 типа (сердечный) (TNNi3), тропонин Т типа 2 (сердечный) (TNNT2), (α)титин тропомиозина 1 (TPM1), транстиретин (TTR), титан (TTN), винкулин (VCL) и любые их комбинации частей. Полипептиды или ген, которые могут быть введены для лечения сердечно-сосудистого заболевания и/или улучшенного васкулогенеза, могут представлять собой VEGF, SDF1, S100A1 или их участки или комбинации.

[0187] В настоящем документе представлены полинуклеотидные конструкции, содержащие функциональные полипептиды, соединенные при помощи описанной в настоящем документе линкерной конструкции. Также предложены способы для лечения, диагностики и других терапевтических целей, включающие применение или введение субъекту полинуклеотида, описанного в настоящем документе, или полипептида, им кодируемого, или его конъюгатов или производных. Описанные способы и композиции можно применять для лечения заболеваний и состояний. Пример состояния может представлять собой рак. Рак или злокачественные опухоли могут включать, но не ограничиваться ими: острый лимфобластный лейкоз у детей, острый лимфобластный лейкоз, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоидный лейкоз, адренокортикальный рак, (первичный) гепатоцеллюлярный рак у взрослых, (первичный) рак печени у взрослых, острый лимфоцитарный лейкоз у взрослых, острый миелоидный лейкоз у взрослых, лимфому Ходжкина у взрослых, лимфоцитарный лейкоз у взрослых, неходжкинскую лимфому у взрослых, первичный рак печени у взрослых, саркому мягких тканей у взрослых, связанную с СПИДом лимфому, связанные с СПИДом злокачественные опухоли, анальный рак, астроцитому, рак желчных протоков, рак мочевого пузыря, рак кости, глиому ствола головного мозга, опухоли головного мозга, рак молочной железы, рак почечной лоханки и мочеточника, лимфому (первичную) центральной нервной системы, лимфому центральной нервной системы, астроцитому мозжечка, церебральную астроцитому, рак шейки матки, (первичный) гепатоцеллюлярный рак у детей, (первичный) рак печени у детей, острый лимфобластный лейкоз у детей, острый миелоидный лейкоз у детей, глиому ствола головного мозга у детей, астроцитому мозжечка у детей, церебральную астроцитому у детей, экстракраниальные эмбрионально-клеточные опухоли у детей, болезнь Ходжкина у детей, Ходжкинскую лимфому у детей, гипоталамическую глиому и глиому зрительного пути у детей, лимфобластный лейкоз у детей, медуллобластому у детей, неходжкинскую лимфому у детей, пинеальные и супратенториальные примитивные нейроэктодермальные опухоли у детей, первичный рак печени у детей, рабдомиосаркому у детей, саркому мягкой ткани у детей, глиому зрительного пути и гипоталамическую глиому у детей, хронический лимфоцитарный лейкоз, хронический миелогенный лейкоз, рак толстой кишки, кожную Т-клеточную лимфому, карциному островковых клеток эндокринной части поджелудочной железы, рак эндометрия, эпендимому, эпителиальный рак, рак пищевода, саркому Юинга и связанные с ней опухоли, рак экзокринной части поджелудочной железы, экстракраниальную эмбрионально-клеточную опухоль, внегонадную эмбрионально-клеточную опухоль, внепеченочный рак желчных протоков, рак глаз, рак груди у женщин, болезнь Гоше, рак желчного пузыря, рак желудка, желудочно-кишечную карциноидную опухоль, желудочно-кишечные опухоли, эмбрионально-клеточные опухоли, гестационную трофобластическую опухоль, волосатоклеточный лейкоз, рак головы и шеи, гепатоцеллюлярный рак, лимфому Ходжкина, гипергаммаглобулинемию, гипофарингеальный рак, раки кишечника, внутриглазную меланому, рак островковых клеток, рак островковых клеток поджелудочной железы, саркому Капоши, рак почек, рак гортани, рак губной и ротовой полости, рак печени, рак легких, лимфопролиферативные нарушения, макроглобулинемию, рак груди у мужчин, злокачественную мезотелиому, злокачественную тимому, медуллобластому, меланому, мезотелиому, метастатический оккультный первичный плоскоклеточный рак шеи, метастатический первичный плоскоклеточный рак шеи, метастатический плоскоклеточный рак шеи, множественную миелому, множественную миелому/плазмаклеточную опухоль, миелодисплатический синдром, миелогенный лейкоз, миелоидный лейкоз, миелопролиферативные нарушения, рак полости носа и рак параназального синуса, рак носоглотки, нейробластому, неходжкинскую лимфому, немеланомный рак кожи, немелкоклеточный рак легкого, оккультный первичный метастатический плоскоклеточный рак, рак носоглотки, остео-/злокачественную фиброзную саркому, остеосаркому/злокачественную фиброзную гистиоцитому, остеосаркому/злокачественную фиброзную гистиоцитому кости, рак эпителия яичников, эмбрионально-клеточную опухоль яичника, опухоль яичника с низким потенциалом злокачественности, рак поджелудочной железы, парапротеинемии, истинную полицитемию, рак паращитовидной железы, рак полового члена, феохромоцитому, опухоль гипофиза, первичную лимфому центральной нервной системы, первичный рак печени, рак предстательной железы, рак прямой кишки, почечно-клеточный рак, рак почечной лоханки и мочеточника, ретинобластому, рабдомиосаркому, рак слюнных желез, саркоидные саркомы, синдром сезари, рак кожи, мелкоклеточный рак легкого, рак тонкой кишки, саркому мягких тканей, плоскоклеточный рак шеи, рак желудка, супратенториальные примитивные нейроэктодермальные и пинеальные опухоли, Т-клеточную лимфому, рак яичек, тимому, рак щитовидной железы, переходно-клеточный рак эпителия почечной лоханки и мочеточника, трофобластические опухоли, рак клеток мочеточника и почечной лоханки, рак уретры, рак матки, саркому матки, рак влагалища, гипоталамическую глиому и глиому зрительного пути, рак вульвы, макроглобулинемию Вальденстрема, опухоль Вильмса и любое другое гиперпролиферативное заболевание помимо неоплазии, локализованное в системе органов, перечисленных выше.

[0188] Функциональные полипептиды, соединенные при помощи описанного в настоящем документе линкерного полипептида, могут быть подходящими в описанных в настоящем документе способах и композициях, и их можно применять для лечения злокачественных или предраковых состояний и для предотвращения прогрессирования в неопластическое или злокачественное состояние, включая, но не ограничиваясь ими, описанные выше нарушения. Такие применения показаны для лечения при известных или предполагемых состояниях, предшествующих прогрессированию до неоплазии или рака, в частности, в случае, когда происходит рост неопухолевых клеток, состоящий из гиперплазии, метаплазии или, в частности, дисплазии. Зачастую дисплазия может быть предвестником рака и обнаруживается главным образом в эпителии. Это самая хаотичная форма роста неопухолевых клеток, связанная с потерей однородности в индивидуальной клетке и архитектурной ориентации клеток. Дисплазия характерно возникает там, где существует хроническое раздражение или воспаление. Диспластические расстройства, которые можно лечить, включают, но не ограничиваются ими, ангидродермическую эктодермальную дисплазию, передне-фациальную дисплазию, асфиксическую торакальную дисплазию, атриодигитальную дисплазию, бронхолегочную дисплазию, дисплазию головного мозга, дисплазию шейки матки, дисплазию хондроэктодермальной области, клейдокраниальную дисплазию, врожденную эктодермальную дисплазию, кранио-диафизарную дисплазию, кранио-карпотарзальную дисплазию, кранио-матафизарную дисплазию, дентинную дисплазию, диафизарную дисплазию, эктодермальную дисплазию, дисплазию эмали, энцефало-офтальмологическую дисплазию, гемимелическую эпифазарную дисплазию, множественную эпифазарную дисплазию, эпифазарную дисплазию сетчатки, эпителиальную дисплазию, лице-генитальную дисплазию, семейную фиброзную дисплазию челюстей, семейную дисплазию white folded, фиброзно-мышечную дисплазию, фиброзную дисплазию кости, цементную дисплазию, наследственную дисплазию почек и сетчатки, гидродинамическую этодермальную дисплазию, гипогидротическую эктодермальную дисплазию, лимфопеническую дисплазию тимуса, дисплазию молочных желез, челюстно-лицевую дисплазию, метафизическую дисплазию, дисплазию Мондини, моностатическую фиброзную дисплазию, мукоэпителиальную дисплазию, множественную эпифизарную дисплазию, окулоаурикуловертебральную дисплазию, окулодентодигитальную дисплазию, окуловертебральную дисплазию, одонтогенную дисплазию, офтальмомандибуломическую дисплазию, периапикальную цементную дисплазию, полиостотическую фиброзную дисплазию, псевдоахондропластическую спондилоэпифизарную дисплазию, дисплазию сетчатки, септо-оптическую дисплазию, спондилоэпифизарную дисплазию и вентрикулорадиальную дисплазию. Дополнительные преднеопластические расстройства, которые можно лечить, включают, но не ограничиваются ими, доброкачественные диспролиферативные расстройства (например, доброкачественные опухоли, фиброзно-кистозные состояния, гипертрофию тканей, кишечные полипы или аденомы и дисплазию пищевода), лейкоплакию, кератозы, болезнь Боуэна, ромбовидную кожу шеи («кожу крестьянина»), солнечный хейлит и солнечный кератоз. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения полипептидную конструкцию, кодируемую описанным в настоящем документе полинуклеотидом, содержащую по меньшей мере два функциональных полипептида, соединенных описанным в настоящем документе линкером, применяют для ингибирования роста, прогрессирования и/или метастазирования рака, в частности тех видов рака, которые перечислены выше. Дополнительные гиперпролиферативные заболевания, нарушения и/или состояния включают, но не ограничиваются, прогрессирование и/или метастазы злокачественных новообразований и связанных с ними нарушений, таких как лейкоз (включая острый лейкоз (например, острый лимфоцитарный лейкоз, острый миелоцитарный лейкоз (включая миелобластный, промиелоцитарный, миеломоноцитарный, моноцитарный и эритролейкозный)) и хронические лейкозы (например, хронический миелоцитарный (гранулоцитарный) лейкоз и хронический лимфоцитарный лейкоз)), полицитемия, лимфомы (например, болезнь Ходжкина и неходжкинская болезнь), множественная миелома, макроглобулинемия Вальденстрема, заболевание тяжелой цепи и солидные опухоли, включая, но не ограничиваясь ими, саркомы и карциномы, такие как фибросаркома, миосаркома, липосаркома, хондросаркома, остеогенная саркома, хордома, ангиосаркома, эндотелиосаркома, лимфангиосаркома, лимфангиоэндотелиосаркома, синовиома, мезотелиома, опухоль Юинга, лейомиосаркома, рабдомиосаркома, карцинома толстой кишки, рак поджелудочной железы, рак груди, рак яичников, рак предстательной железы, плоскоклеточная карцинома, базальноклеточный рак, аденокарцинома, карцинома потовых желез, карцинома сальных желез, папиллярная карцинома, папиллярная аденокарцинома, цистаденокарцинома, медуллярная карцинома, бронхогенная карцинома, карцинома почек, гепатома, карцинома желчных протоков, хориокарцинома, семинома, эмбриональная карцинома, опухоль Вильма, рак шейки матки, опухоль яичков, карцинома легкгих, плоскоклеточная карцинома легких, карцинома мочевого пузыря, эпителиальная карцинома, глиома, астроцитома, медуллобластома, краниофарингиома, эпендимома, пинеалома, эмангиобластома, акустическая неврома, олигодендроглиома, менингиома, меланома, нейробластома и ретинобластома.

[0189] В некоторых вариантах реализации полипептидную конструкцию, кодируемую описанным в настоящем документе полинуклеотидом, содержащую по меньшей мере два функциональных полипептида, соединенных описанным в настоящем документе линкером, применяют для лечения заболеваний, включая, но не ограничиваясь ими, болезнь иммунной дисрегуляции и связанные с ней аутоиммунные заболевания, включая аутоиммунные заболевания класса III, такие как иммуно-опосредованные тромбоцитопении, такие как острая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура и хроническая идиопатическая тромбоцитопеническая пурпура, дерматомиозит, синдром Шегрена, множественный склероз, хорею Сиденхама, миастению гравис, системную красную волчанку, волчаночный нефрит, ревматическую лихорадку, полиглоточные синдромы, буллезный пемфигоид, сахарный диабет, пурпуру Хенох-Шонлейна, пост-стрептококковый нефрит, узловатую эритему, артериит Такаясу, болезнь Аддисона, ревматоидный артрит, саркоидоз, язвенный колит, мультиформную эритему, IgA нефропатию, узелковый полиартериит, анкилозирующий спондилит, синдром Гудпасчера, облитерирующий тромбангинит, синдром Шегрена, первичный билиарный цирроз, тиреоидит Хашимото, тиреотоксикоз, склеродермию, хронический активный гепатит, ревматоидный артрит, полимиозит/дерматомиозит, полихондрит, вульгарную пузырчатку, гранулематоз Вегенера, мембранную нефропатию, боковой амиотрофический склероз, сухотку спинного мозга, гигантоклеточный артериит/полимиалгию, пернициозную анемию, быстро прогрессирующий гломерулонефрит и фиброзный альвеолит, а также ювенильный диабет.

[0190] В некоторых вариантах реализации полипептидную конструкцию, кодируемую описанным в настоящем документе полинуклеотидом, содержащую по меньшей мере два функциональных полипептида, соединенных описанным в настоящем документе линкером, применяют для лечения инфекционных заболеваний. Инфекционные заболевания могут представлять собой инфекции, вызываемые патогенами, такими как бактерии, риккетсии, микоплазма, простейшие, грибы, вирусы, паразиты или другие микробные агенты. Примеры включают вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вызывающий СПИД, микобактерии туберкулеза, Streptococcus agalactiae, устойчивые к метициллину Staphylococcus aureus, Legionella pneumophilia, Streptococcus pyogenes, Escherichia coli, Neisseria gonorrhoeae, Neisseria meningitides, Pneumococcus, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum, Hemophilis influenzae B, Treponema pallidum, спирохеты болезни Лайма, вирус Западного Нила, Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium leprae, Brucella abortus, вирус бешенства, вирус гриппа, цитомегаловирус, вирус простого герпеса I, вирус простого герпеса II, парвоподобный вирус сыворотки крови человека, респираторно-синцитиальный вирус, вирус ветряной оспы, вирус гепатита В, вирус гепатита С, вирус кори, аденовирус, вирусы лейкоза Т-клеток человека, вирус Эпштейна-Барра, вирус лейкоза грызунов, вирус свинки, вирус везикулярного стоматита, вирус Синдбис, вирус лимфоцитарного хориоменингита, вирус бородавок, вирус голубого языка, вирус Сендай, вирус лейкоза кошачьих, рео-вирус, вирус полиомиелита, вирус обезьян 40, вирус опухоли молочной железы мыши, вирус лихорадки денге, вирус краснухи, Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Toxoplasma gondii, Trypanosoma rangeli, Trypanosoma cruzi, Trypanosoma rhodesiensei, Trypanosoma brucei, Schistosoma mansoni, Schistosoma japanicum, Babesia bovis, Elmeria tenella, Onchocerca volvulus, Leishmania tropica, Trichinella spiralis, Theileria parva, Taenia hydatigena, Taenia ovis, Taenia saginata, Echinococcus granulosus, Mesocestoides corti, Mycoplasma arthritidis, M. hyorhinis, M. orale, M. arginini, Acholeplasma laidlawii, M. salivarium и M. pneumoniae.

[0191] В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения полипептидную конструкцию, кодируемую описанным в настоящем документе полинуклеотидом, содержащую по меньшей мере два функциональных полипептида, соединенных описанным в настоящем документе линкером, применяют при конъюгации с химиотерапевтическим агентом или в дополнение к химиотерапевтическому агенту, или одновременно с ним. В контексте настоящего описания «химиотерапевтический агент» или «химиотерапевтическое соединение» и их грамматические эквиваленты могут представлять собой химической соединение, подходящее для лечения рака.

[0192] Гены и полипептиды, кодируемые полинуклеотидами, подходящими для генной терапии, можно вводить субъекту последовательно, одновременно или их можно вводить при таких комбинациях. Гены и полипептиды, вводимые субъекту, могут располагаться на одном полинуклеотидном векторе или на отдельных полинуклеотидных векторах. В некоторых случаях полигенный вектор применяется для введения нескольких генов с применением одной векторной конструкции.

Полипептидные конструкции, кодируемые описанными в настоящем документе полинуклеотидами:

[0193] Полинуклеотидные конструкции, описанные в настоящем документе, можно использовать для лечения сердечно-сосудистых заболеваний и/или улучшения васкулогенеза у субъекта. Например, молекулярной мишенью для сердечно-сосудистой терапии могут быть VEGF-A, FGF4, саркоплазматическая Са²⁺-АТФаза, S100A1, бета-адренергический рецептор, аденилил-циаклаза 6 или их комбинации. В некоторых случаях гены, вводимые для генной терапии сердечно-сосудистой системы, могут представлять собой гены SDF1, S100A1, VEGF191 или любую их комбинацию.

[0194] S100 является частью семейства Саβ+-модулированных белков, участвующих в регуляторной активности внутри клетки. S100A1 в сердце может выступать в качестве самой распространенной изоформы белка S100. Он может способствовать сократительной функции сердца, а также сердечной релаксации, усиливая активность как рианодиновых рецепторов (RYR), так и SERCA2a.

[0195] S100 может оказывать глубокие ионотропные действия через модуляцию гомеостаза ионов Са²⁺ в кардиомиоцитах и функции миофиламентов вне зависимости от бета-адренергической стимуляции. S100A1 может взаимодействовать Са²⁺-зависимым образом с RyR, и он стабилизирует комплекс SERCA2a-PLN. S100A1 также может уменьшать диастолическую утечку Са²⁺, и он влияет на сердечный титин и митохондриальную F1-АТФазу.

[0196] В некоторых вариантах реализации ангиогенный полипептид или ген можно использовать для терапии сердечно-сосудистой системы или для улучшения васкулогенеза, как это описано в настоящем документе, путем введения полинуклеотидов, кодирующих ангиогенные факторы роста, такие как VEGF-A165, ангиополиты, FGF, 126, HIF-1a26 или их комбинации. Эти полипептиды могут способствовать развитию коллатеральных кровеносных сосудов при связанных с ишемией заболеваниях, таких как хроническая критическая ишемия конечностей, ишемия миокарда, стенокардия или окклюзионное заболевание периферических артерий. Ангиогенные факторы также могут индуцировать образование новых сосудистых сетей, которые могут сделать их подходящими терапевтическими вариантами лечения острых коронарных синдромов и заболеваний периферических сосудов. Несколько типов ангиогенных факторов могут проявлять различные свойства, что было исследовано при их применениях в терапевтических целях, направленных на лечение сердечно-сосудистых заболеваний. Например, можно применять VEGF и подтипы VEGF. Подтипы VEGF могут включать: VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, плацентарный фактор роста (PlGF) и их комбинации. Некоторые из этих факторов также образуют различимые изоформы. Внутриклеточные сигналы указанных подтипов VEGF могут быть опосредованы в основном тремя различными тирозинкиназными рецепторами: VEGFR1, VEGFR2 и VEGFR3. Конкретное взаимодействие между этими подтипами VEGF и их родственными клеточными рецепторами может вызывать дифференциальный клеточный ответ в эндотелиальных клетках и кардиомиоцитах. В некоторых случаях изоформа VEGF-A, VEGF-A165, может обладать высокой ангиогенностью. VEGF-A165 может взаимодействовать с VEGFR1 и VEGFR2. Взаимодействие VEGF-A165 с VEGFR1 на поверхности эндотелиальных клеток может способствовать устойчивости сосудов в новообразованных сосудов. Его взаимодействие с VEGFR2 на поверхности эндотелиальных клеток может индуцировать ангиогенез, васкулогенез и артериогенез, вазодилатацию, выживание клеток и увеличение проницаемости клеток. Активация VEGFR2 в новообразованных кардиомиоцитах может повышать экспрессию антиапоптотических белков и уменьшать экспрессию проапоптотических белков. В некоторых случаях активация VEGFR2 может индуцировать рекрутинг резидентных стволовых клеток сердца в ишемических областях.

[0197] Проангиогенный фактор или ген может экспрессироваться в векторе согласно настоящему изобретению. Например, проангиогенный фактор может представлять собой VEGF, основной фактор роста фибробластов (bFGF) или трансформирующий фактор роста β-1 (TGFβ-1), кислый фактор роста фибробластов, ангиогенин, фактор роста гепатоцитов, интерлейкин-8, плацентарный фактор роста, фактор роста тромбоцитов, плейотропин, пролиферин, фактор некроза опухоли альфа и любую их комбинацию.

[0198] В некоторых случаях кардиальные эффекторные гены или полипептиды, применяемые и включенные в векторы для экспрессии в сердце (кардиальные векторы) согласно настоящему изобретению, можно выбрать из любого одного, как например, SDF1, S100A1 и VEGF191. В некоторых случаях вектор для экспрессии в сердце согласно настоящему изобретению содержит или состоит из любых двух генов, выбранных из SDF1, S100A1 и VEGF191, в любой комбинации их последовательного порядка на векторе. В определенных вариантах реализации вектор для экспрессии в сердце содержит полинуклеотид, кодирующий SDF1, S100A1 и VEGF191, в любой комбинации их последовательного порядка на векторе.

[0199] В определенных вариантах реализации кодирующая SDF1 последовательность содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид SDF1. В определенных вариантах реализации указанный полипептид последовательность SDF1 по меньшей мере на 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №102. В определенных случаях кодирующая SDF1 последовательность содержит кодон-оптимизированную открытую рамку считывания SDF1 (ОРС), соответствующую SEQ ID №103.

[0200] В определенных вариантах реализации последовательность полинуклеотида, кодирующего SDF1, по меньшей мере на 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №103.

[0201] В определенных случаях кодирующая S100A1 последовательность содержит полинуклеотид, кодирующий полипептид S100A1. В определенных вариантах реализации последовательность полипептида S100A1 по меньшей мере на 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №104. В определенных вариантах реализации кодирующая S100A1 последовательность содержит или состоит из открытой рамки считывания S100A1 (ОРС). В определенных случаях последовательность кодирующего S100A1 полинуклеотида по меньшей мере на 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №105.

[0202] В определенных вариантах реализации кодирующая VEGF191 последовательность может содержать последовательность полинуклеотида, кодирующего полипептид VEGF191. В определенных вариантах реализации последовательность полипептида VEGF191 по меньшей мере на 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №106.

[0203] В определенных случаях кодирующая VEGF191 последовательность может содержать открытую рамку считывания VEGF191 (ОРС). В определенных вариантах реализации последовательность полинуклеотида, кодирующая VEGF191, по меньшей мере на 45%, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID №107.

Фармацевтические композиции и составы:

[0204] Композиции, описанные в настоящем документе, можно ввести в состав фармацевтического лекарственного средства, и их можно применять для лечения человека или млекопитающего, нуждающегося в этом, у которого диагностировано заболевание, например, сердечно-сосудистое заболевание. В некоторых вариантах реализации композиции, описанные в настоящем документе, используются для терапии сердечнососудистой системы или для улучшения васкулогенеза, как это описано в настоящем документе. Эти лекарственные средства можно вводить совместно при помощи по меньшей мере одного вектора.

[0205] Векторы, содержащие описанные в настоящем документе полинуклеотиды, включают вирусные и невирусные векторы, содержащие нуклеиновые кислоты, кодирующие сконструированные молекулы CRISPR, TALEN, Argonaut, молекулы на основе транспозона, ZEN, мегануклеазы или Mega-TAL, транспозоны и/или трансгены также можно вводить непосредственно в организм для трансфекции или трансдукции клеток in vivo.

В альтернативном варианте можно вводить «оголенную» ДНК или мРНК, содержащие полинуклеотиды, описанные в настоящем документе. Введение осуществляют любым путем, обычно применяемом для приведения молекулы в непосредственный контакт с клетками крови или тканевыми клетками, включая, но не ограничиваясь ими, инъекцию, инфузию, местное нанесение и электропорацию. Для введения конкретной композиции можно применять более одного пути. Конкретная композиция для введения частично определяет выбор фармацевтически приемлемых носителей, также как и конкретный способ, применяемый для введения указанной композиции.

[0206] В некоторых случаях векторы, содержащие описанные в настоящем документе полинуклеотиды, можно вводить субъекту, нуждающемуся в этом, в сочетании с препаратами для вторичной терапии или отдельно от них. Вторичная терапия может быть представлена агентами для улучшенного васкулогенеза, легочной гипертензии, антагонистами альдостероновых рецепторов, ингибиторами ангиотензинпревращающего фермента, блокаторами рецепторов ангиотензина, блокаторами рецепторов ангиотензина и ингибиторами неприлизина, антиадренергическими агентами, центрально действующими антиадренергическими агентами, периферийно действующими антиангинальными агентами, антиаритмическими агентами, антиаритмическими агентами группы I, антиаритмическими агентами группы II, антиаритмическими агентами группы III, антиаритмическими агентами группы IV, антиаритмическими агентами группы V, антихолинергическими хронотропными агентами, комбинациями антигипертензивных препаратов, АПФ-ингибиторами с блокирующими агентами кальциевых каналов, АПФ-ингибиторами с тиазидами, ингибиторами ангиотензина II с блокаторами кальциевых каналов, ингибиторами ангиотензина II с тиазидами, антиадренергическими агентами (центральными) с тиазидами, антиадренергическими агентами (периферическими) с тиазидами, бета-блокаторами с тиазидами, калийсберегающими диуретиками с тиазидами, бета-адренергическими блокирующими агентами, кардиоселективными бета-блокаторами, некардиоселективными бета-блокаторами, блокирующими кальциевые каналы агентами, катехоламинами, диуретиками, ингибиторами карбоангидразы, петлевыми диуретиками, калийсберегающими диуретиками, тиазидными диуретиками, инотропными агентами, периферическими сосудорасширяющими средствами, ингибиторами ренина, склерозирующими агентами, сосудорасширяющими средствами, антагонистами вазопрессина, вазопрессорами.

[0207] Антиангиогенные агенты также могут быть использованы в сочетании с описанными в настоящем документе полинуклеотидами. Подходящие антиангиогенные агенты для применения в описанных способах и композициях включают антитела против VEGF, включая гуманизированные и химерные антитела, анти-VEGF аптамеры и антисмысловые олигонуклеотиды. В некоторых случаях, например, в композициях, составах и способах лечения рака, единица дозирования вводимой композиции или состава может составлять 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 мг.

[0208] Другие ингибиторы ангиогенеза включают ангиостатин, эндостатин, интерфероны, интерлейкин 1 (включая α и β) интерлейкин 12, ретиноевую кислоту и тканевые ингибиторы металлопротеиназы-1 и -2. (TIMP-1 и -2). Также можно применять низкомолекулярные вещества, включая топоизомеразы, такие как разоксан, ингибитор топоизомеразы II с антиангиогенной активностью.

[0209] В некоторых случаях, например, в композициях, составах и способах лечения рака единица дозирования вводимой композиции или состава может составлять 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 100 мг. В некоторых случаях общее количество вводимой композиции или состава может составлять 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,5, 2, 2,5, 3, 3,5, 4, 4,5, 5, 5,5, 6, 6,5, 7, 7,5, 8, 8,5, 9, 9,5, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 или 100 г.

Способы и показания

[0210] Векторы, содержащие полинуклеотиды, описанные в настоящем документе, можно сконструировать и ввести субъекту, как это описано в настоящем документе. Эти векторы можно применять для генной терапии. Эти векторы можно применять для лечения заболевания у реципиента (например, человека). Например, полинуклеотиды, описанные в настоящем документе, и/или полипептиды, кодируемые полинуклеотидами, описанными в настоящем документе, можно вводить субъекту для лечения сердечно-сосудистого заболевания или улучшения васкулогенеза у указанного субъекта. Субъект, получивший лечение способом, описанным в настоящем документе, или путем приведения в контакт с композицией или введения композиции, описанной в настоящем документе, может представлять собой млекопитающее, которое может быть человеком, приматом, не являющимся человеком, млекопитающим из семейства псовых, млекопитающим из семейства кошачьих или другим млекопитающим.

[0211] В настоящем документе описан способ лечения заболевания (например, сердечнососудистого заболевания) у реципиента, включающий введение по меньшей мере одного вектора, содержащего по меньшей мере один полинуклеотид, описанный в настоящем документе, субъекту с сердечно-сосудистым заболеванием. В некоторых случаях вектор вводят в клетку.

[0212] В некоторых случаях сердечно-сосудистые заболевания могут представлять собой кардиомиопатию. Кардиомиопатию можно определить по патологически аномальному миокарду. Существует четыре основных типа классификации кардиомиопатии: дилатационная (DCM), гипертрофическая (НСМ), рестриктивная (RCM) и аритмогенная кардиомиопатия правого желудочка (ARVC). Кардиомиопатию можно диагностировать методами визуализации in vivo либо с применением эхокардиографии или, что все более чаще, с помощью МРТ сердца. DCM может относиться к увеличению сердца, что часто затрагивает все четыре камеры, особенно на поздней стадии развития заболевания. Чаще всего DCM может быть ассоциирована с пониженной функцией ЛЖ или систолической функцией, хотя в начале заболевания ЛЖ может быть дилатированным и быть только с минимально пониженной функцией. Напротив, НСМ может характеризоваться увеличением толщины стенки ЛЖ, часто в отношении перегородки, которая отделяет ЛЖ от ПЖ. В некоторых случаях RCM может и не определяться, отчасти потому, что сердце может оказаться морфологически близким к нормальному, с незначительной увеличенной толщиной стенки или умеренно сниженной фракцией выброса ЛЖ. Инфильтративный процесс, лежащий в основе RCM, бывает трудно обнаружить in vivo даже при применении самой чувствительной методик визуализации. RCM можно охарактеризовать как наносящее ущерб здоровью наполнение сердца, известное как диастолическая дисфункция, которая снижает сердечный выброс.ARVC можно охарактеризовать как снижение функции и истончение ПЖ с инфильтрацией фиброфитов, которая может наблюдаться при МРТ. В некоторых случаях пациента с кардиомиопатией можно лечить при помощи вектора согласно настоящему изобретению.

[0213] Предложенный в настоящем документе способ можно применять для лечения или предотвращения заболеваний, включая, но не ограничиваясь ими, рак, сердечнососудистые заболевания, заболевания легких, заболевания печени, кожные заболевания или неврологические заболевания. Предложенный в настоящем документе способ можно применять для улучшенного васкулогенеза у субъекта.

[0214] В контексте настоящего описания «улучшение» и его грамматические эквиваленты могут означать любое улучшение, признанное специалистом в данной области техники. Например, улучшение сердечно-сосудистого заболевания может означать ослабление аритмии, которая может включать уменьшение, ослабление или исчезновение нежелательного эффекта или симптома. В другом примере улучшение заболевания может означать ослабление нагрузки на опухоль, которая может включать уменьшение, ослабление или устранение нежелательного эффекта или симптома. Например, субъект, среди прочих улучшений, может испытывать уменьшение нагрузки на опухоль, продолжительную выживаемость, полную ремиссию, стабилизацию.

[0215] Еще одним признаком улучшения может быть количество дней, в течение которых субъект не нуждается в терапии. Например, после введения предложенного в настоящем документе лекарственного средства реципиент может не нуждаться в терапии по меньшей мере или по меньшей мере приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более дней. Это может свидетельствовать о том, что лечение было успешным. Это также может свидетельствовать об отсутствии токсичности, ассоциированной с введением описанных в настоящем документе полинуклеотидов.

[0216] Субъект может не нуждаться в терапии в течение по меньшей мере 1 дня. Реципиент также может не нуждаться в терапии в течение по меньшей мере 7 дней. Реципиент может не нуждаться в терапии в течение по меньшей мере 14 дней. Реципиент может не нуждаться в терапии в течение по меньшей мере 21 дня. Реципиент может не нуждаться в терапии в течение по меньшей мере 28 дней. Реципиент может не нуждаться в терапии в течение по меньшей мере 60 дней. Кроме того, реципиент может не нуждаться в терапии в течение по меньшей мере 1, 2, 3,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 и более лет.

[0217] Другим признаком улучшения может быть количество дней, в течение которых реципиенту требуется восстановительная терапия. Например, после предложенного в настоящем документе лечения реципиенту может потребоваться назначение восстановительной терапии в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более дней. Это может свидетельствовать о том, что лечение было успешным.

[0218] Например, реципиенту может потребоваться восстановительная терапия в течение по меньшей мере 1 дня. Реципиенту также может потребоваться восстановительная терапия в течение по меньшей мере 7 дней. Реципиенту может потребоваться восстановительная терапия в течение по меньшей мере 14 дней. Реципиенту может потребоваться восстановительная терапия в течение по меньшей мере 21 дня. Реципиенту может потребоваться восстановительная терапия в течение по меньшей мере 28 дней. Реципиенту может потребоваться восстановительная терапия в течение по меньшей мере 60 дней. Кроме того, реципиенту может потребоваться восстановительная терапия в течение по меньшей мере 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более лет.

[0219] При лечении больных с сердечной недостаточностью чрескожная катетеризация коронарной артерии может представлять собой минимально инвазивную процедуру, которая может обеспечить доставку гомогенного гена в каждую область сердца. В некоторых случаях доставка генов может быть затруднена у пациентов с тяжелой формой заболевания коронарной артерии. Например, во время инфузии коронарной артерии вектор может быть введен в катетер без прерывания коронарного кровотока.

[0220] В некоторых случаях увеличенное время нахождения вектора в коронарном кровотоке можно обеспечить путем коронарной венозной блокады. Например, антеградная инфузия коронарной артерии с короткой окклюзией как коронарной артерии, так и коронарной вены, увеличила экспрессию гена в миокарде и может улучшить время нахождения вектора.

[0221] В других случаях для того, чтобы максимизировать длительность воздействия вектора на эндотелий с одновременной минимизацией системного распределения, можно применять подход с применением рециркуляции сердца. В этом случае экстракорпоральное устройство может откачивать кровь из коронарного синуса при помощи окклюзионного катетера и возвращать насыщенную кислородом коронарную венозную кровь в левую основную коронарную артерию через перистальтический насос (V-Focus; Osprey Medical Inc.). Используя этот способ, можно обеспечить селективное введение эндотелиальных пермеабилизирующих агентов без системных побочных эффектов.

[0222] В некоторых случаях эффективность трансфекции может коррелировать с коронарным кровотоком, а также временем воздействия и концентрацией вектора. Например, антеградная инфузия коронарной артерии, поддерживаемая увеличенным коронарным кровотоком, например, с применением внутриаортальной баллонной помпы, может улучшить перенос кардиального гена.

[0223] В некоторых случаях можно осуществить прямую инъекцию вектора в сердце. Вектор можно вводить эпикардиально или эндокардиально в целевую область. В некоторых случаях прямая инъекция может обойти эндотелиальный барьер. Это может привести к высокой локальной концентрации в месте инъекции. В некоторых случаях прямая инъекция позволяет избежать воздействия на циркулирующую кровь. В других случаях прямая инъекция вектора позволяет избежать дезактивации вектора циркулирующими ДНКазами или нейтрализующими антителами. Прямая инъекция вектора также может уменьшить воздействие вектора на нецелевые органы, хотя местное введение не позволяет полностью избежать некоторого системного распределения вектора. Низкие объемы при высоких концентрациях могут также увеличить удержание вектора в миокарде.

[0224] В некоторых случаях вектор можно вводить во время торакотомии. Вектор также можно водить перикардиально. В некоторых случаях вектор можно вводить с применением ретроградной перфузии, например, как это показано на ФИГ. 9.

[0225] После генной терапии трансфицированные клетки могут функционировать у реципиента. Функциональность в некоторых случаях позволяет определить, была ли генная терапия успешной. Например, трансфицированные клетки могут быть функциональными по меньшей мере в течение или по меньшей мере в течение приблизительно 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 или более дней. Это может свидетельствовать об успешной генной терапии. Это также может свидетельствовать об отсутствии отторжения указанных трансплантированных клеток или векторов.

[0226] В некоторых случаях трансфицированные клетки могут быть функциональными в течение по меньшей мере 1 дня. Трансфицированные клетки также могут быть функциональными в течение по меньшей мере 7 дней. Трансфицированные клетки также могут быть функциональными в течение по меньшей мере 14 дней. Трансфицированные клетки также могут быть функциональными в течение по меньшей мере 21 дня. Трансфицированные клетки также могут быть функциональными в течение по меньшей мере 28 дней. Трансфицированные клетки также могут быть функциональными в течение по меньшей мере 60 дней.

[0227] Ранее методы доставки терапевтических средств в сердце включали внутримиокардиальное введение (трансекардиально или трансэндокардиально) или антеградную доставку в коронарную артерию. Недостатком трансепикардиального пути является хирургическая инвазивность. Трансэндокардиальный подход требует сложного электромагнитного картирования с применением таких систем, как, например, устройство NOGA, которое нельзя применять у пациентов с истонченным миокардом, поскольку данный метод может вызвать перфорирование. Другие устройства, такие как Biocardia - инфузионный катетер Helical или Celyad-C-Cath, также имеют ограничение по применению из-за толщины стенки.

[0228] Антеградное введение в коронарную артерию ассоциируют с более низким биологическим удержанием [12] по сравнению с внутримиокардиальным введением. Кроме того, было показано, что введение биологических препаратов в коронарную артерию увеличивает риск развития коронарной эмболии и подъема сегмента ST [13] [14] [15] [16] [17]. Также при введении pDNA прямой контакт с большим объемом крови может уменьшить эффект перед проникновением в ткань-мишень.

Ретроградное введение

[0229] У людей коронарный синус выводит (drain) систему вен полостей желудочков, которые отвечают за большинство сердечных сокращений. Метод ретроградной доставки в коронарный синус широко применяют для введения кардиоплегического раствора, отчасти благодаря превосходному распределению указанного раствора по всему миокарду по сравнению с антеградной доставкой [18]. Кроме того, было продемонстрировано, что данная процедура является клинически безопасной для введения насыщенной кислородом крови во время чрескожной транслюминальной коронарной ангиопластики с высокой степенью риска [19] [20] [21]. Процесс ретроградного введения в коронарный синус включает временную окклюзию афферентного коронарного кровотока при помощи баллонного катетера с последующим введением в противоположном вытекающей крови направлении. Это приводит к тому, что указанный раствор поступает в миокард через посткапиллярные венулы. В отличие от артериолов или капилляров, посткапиллярные венулы имеют наименьший диаметр сосуда и теоретически позволяют обеспечить максимальную передачу материала в интерстиции [22]. С физиологической точки зрения известно, что посткапиллярные венулы являются основной мишенью миграции иммунной/воспалительной клетки через эндотелий, частично вследствие экспрессии молекул адгезии, таких как ELAM-1 [23], ICAM-1 [24], CD18 [25] и CD44 [26], и частично вследствие биомеханических свойств. Patel и др. продемонстрировали в испытании REVIVE, с применением того же катетера доставки, который предлагается и в этом доклиническом исследовании (Cook Regentec), что более 3 миллиардов зародышевых клеток можно безопасно доставить в объеме 60 см в коронарный синус пациентов с терминальной стадией ЗСН [27].

Генная терапия путем ретроградного введения

[0230] В нескольких исследованиях в области регенерации сердца успешно использовали ретроградное введение. Boekstegers и др. [32] доставляли аденовирус, экспрессирующий beta-gal и люциферазу, в миокард свиньи, сравнивая антеградную или ретроградную доставку в коронарную артерию через переднюю сердечную вену. Значительно повышенную экспрессию указанного гена в инфарктной ткани естественным образом наблюдали при применении ретроградного способа по сравнению с антеградным. Об аналогичных результатах сообщал Alino и др. [33], который наблюдал интерстициальную экспрессию eGFP в сердцах свиней, которых инъецировали ретроградным способом с «обнаженной» ДНК. В другом исследовании введение в организм свиней кодирующей beta-gal плазмиды с применением ретроградного способа приводило к более высокой экспрессии гена в миокарде по сравнению с антеградным и внутримышечным введением [34]. Такой превосходный уровень экспрессии генов по сравнению с внутримиокардиальной доставкой был воспроизведен и в других исследованиях [35]. Применение ретроградного введения также успешно осуществляли для доставки белковых терапевтических средств. Von Degenfeld и др. [36] сообщили об исследовании на свиньях, в котором ретроградное введение белка FGF-2 применялось для предотвращения экспериментально индуцированного стеноза. Уровни радиоактивно меченого FGF-2 в миокарде свиней, получавших лечение ретроградным способом, были почти в два раза выше, чем при использовании антеградной инфузии. Кроме того, сообщалось о значительном улучшении трансмурального кровотока и региональной функции миокарда при введении FGF-2 посредством ретроградного способа. Также сообщалось о безопасной ретроградной доставке pDNA SDN-1α у пациентов с сердечной недостаточностью (RETRO-HF).

[0231] Соответственно, предпочтительный вариант реализации настоящего изобретения включает применение ретроградного введения через коронарный синус. Другой вариант реализации настоящего изобретения включает применение внутрикоронарных или внутримиокардиальных путей введения.

Доставка гена методом направленного разрушения микропузырьков ультразвуком (UTMD)

[0232] Наполненные газом микропузырьки являются подходящими ультразвуковыми контрастными агентами. В некоторых вариантах реализации микропузырьки применяют для доставки векторов, генов и/или конструкций, описанных в настоящем документе, в ткани и/или органы у субъекта [65]. В некоторых случаях доставка может быть орган- или тканеспецифичной. Микропузырьки колеблются при обработке их ультразвуком вблизи своей резонансной частоты. При более высоких энергиях ультразвука амплитуды колебаний увеличиваются, что приводит к разрушению микропузырьков. Это явление применяют для доставки вектора или композиции, описанных в настоящем документе, в орган-мишень, например, путем введения микропузырьков, нагруженных описанными в настоящем документе композициями или векторами для генной терапии, например, с помощью в.в. инъекции и последующего на них воздействия энергией ультразвука, приводящей к разрушению микропузырьков в участке-мишени.

[0233] В варианте реализации UTMD биоактивные молекулы, как, например, описанные в настоящем документе плазмидные векторы, полинуклеотиды, кодирующие генные конструкции, описанные в настоящем документе, добавляют, например, к катионным оболочкам липидных микропузырьковых контрастных агентов. Эти переносящие вектор микропузырьки можно вводить субъекту, среди прочих других вариантов введения, например, внутривенно или непосредственно в левый желудочек сердца. Для некоторых пациентов указанные микропузырьки можно вводить через внутрикоронарный катетер. Последующая доставка из кровотока в орган-мишень происходит путем акустической кавитации на резонансной частоте микропузырьков. В некоторых вариантах реализации механическая энергия, создаваемая разрушением микропузырьков, может приводить к образованию транзитных пор внутри или между эндотелиальными клетками микроциркуляторного русла целевой области. В некоторых вариантах реализации эффективность трансфекции во внутрь и через эндотелиальные клетки улучшается, и векторы, кодирующие трансген, накапливаются в окружающей ткани. Таким образом, в некоторых случаях, когда доставку описанного в настоящем документе вектора осуществляют методом UTMD, любая дополнительная плазмидная ДНК, оставшаяся в кровотоке, может быть разрушена нуклеазами в крови, что тем самым приводит к высокоспецифичной нацеленной на орган трансфекции органов, подвергающихся озвучанию ультразвуком, и уменьшению вероятности доставки в неозвученные ткани.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Трансфекции кардиомиоцитов для опосредованной att-сайтом рекомбинации

[0234] Кардиомиоциты трансфицировали люциферазными векторами с или без (например, плюс (+) или минус (-)) att-сайтом и плюс (+) или минус (-) SpBC2 рекомбиназой. После этого экспрессию люциферазы отслеживали в динамике для оценки опосредованной att-сайтом рекомбинации. Чтобы определить специфичность сайта и эффективность SpBC2 и его предполагаемого сайта активности (Att-сайт), кардиомиоциты совместно трансфицировали с помощью плазмиды SpBC2 и плазмидного вектора с геном люциферазы светлячка (FLUC) или Luc Luc, содержащего att-сайт вокруг представляющего интерес гена. Контроли были включены в плазмиду Att-Luc без SpBC2 (для измерения случайной интеграции), плазмиду No-Att-Luc с SpBC2 (для измерения неспецифичной к att-сайту интеграции) и плазмиду No-Att-Luc без SpBC2 (для измерения транзиентной экспрессии). Клетки трансфицировали через DNAfectin (Applied Biological Materials Inc., Richmond, ВС, Канада) и культивировали в течение 14 дней, периодически совместно культивируя клетки, исследуя клетки при помощи люциферазного анализа и собирая клетки для проведения анализов с применением количественной ПЦР.

[0235] Трансфекцию осуществляли с использованием готовой питательной среды и среды для трансфекции (Prigrow I без ФБС/антибиотиков). По меньшей мере за 1 час до трансфекции, среду удаляли из кардиомиоцитов и заменяли свежей питательной средой в количестве 3 мл/лунку в 6-луночном планшете или 1,5 мл/лунку в 12-луночных планшетах. Реагент DNAfectin нагревали до комнатной температуры перед применением и быстро перемешивали для смешивания. Различные комбинации комплексов DNAfectin-плазмидная ДНК получали в средах для трансфекции следующим образом:

[0236] ДНК добавляли в среду для трансфекции. Указанную смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 20 минут. К клеткам добавляли 300 мкл на лунку комплекса DNAfectin-ДНК.

Пассаж и сбор клеток для проведения количественной ПЦР, люциферазного анализа

[0237] Через 48 часов после трансфекции среду удаляли из клеток в 12-луночных планшетах. Клетки трипсинизировали и собирали в микроцентрифужные пробирки. Затем клетки ресуспендировали в 1 мл свежей питательной среды. Клетки высевали в свежий 12-луночный планшет в концентрации 5×10⁴ клеток/лунка и измеряли люциферазу. Оставшиеся клетки собирали для проведения количественной ПЦР.

Результаты:

[0238] В течение двухнедельного курса экспрессия FLUC с вектора Att-Luc + SPBc2 рекомбиназы понизилась приблизительно в 10 раз, тогда как экспрессия FLUC при других условиях трансфекции (без att-сайта или без рекомбиназы) понизилась в 100-1000 раз, возвращаясь почти к фоновому уровню экспрессии (данные не показаны). Также наблюдали опосредованную att-сайтом рекомбинацию FLUC GOI (представляющего интерес гена) в геноме кардиомиоцитов (данные не показаны).

Пример 2: Анализ пролиферации клеток HUVEC

[0239] Анализ пролиферации эндотелиальной клетки пупочной вены человека (HUVEC) применяли для оценки функциональности VEGF165, экспрессируемого рХоХ. Находящиеся в бессывороточных условиях клетки HUVEC обрабатывали кондиционированной средой, полученной от пациентов (с дилатационной, гипертрофической кардиомиопатией), или полученными из здоровых iPSC кардиомиоцитами, трансфицированными рХоХ или одиночным эффектором, представляющими собой контроль (положительный контроль pVEGF165, отрицательный контроль pSDF-1). После 96 часов инкубации пролиферацию HUVEC количественно определяли с применением люциферазного анализа. Анализ повторяли три раза (например, СМ-1,СМ-2, СМ-3).

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки

[0240] Клетки iPSC кардиомиоцитов трансфицировали векторами, содержащими один ген, два гена или три гена, кодирующих S100A1 и VEGF; S100A1, SDF1 и VEGF; или VEGF. Клеточный супернатант собирали через 48 часов после трансфекции. HUVEC высевали в 6-луночные планшеты с плотностью приблизительно 1:10, 1:100 и 1:1000 в супернатанте, собранном из трансфицированных iPSC-клеток. Через 96 часов после введения указанного супернатанта пролиферацию HUVEC измеряли при помощи анализа CellTiter-Glo, на ФИГ. 5А и ФИГ. 5В показаны экспериментальные данные. ФИГ. 14А и ФИГ. 14В показывают аналогичные результаты для iPSC-клеток, полученных от пациента с дилатационной кардиомиопатией.

Кардиомиоциты, полученные от пациентов с кардиомиопатией и здоровых контролей

[0241] Клетки iPSC кардиомиоцитов были получены от пациентов с дилатационной кардиомиопатией (DCM), гипертрофической кардиомиопатией (НСМ) или здоровых контролей. iPSC-клетки трансфицировали векторами, содержащими один ген, два гена или три гена, кодирующих S100A1 и VEGF; S100A1, SDF1 и VEGF; или VEGF. Клеточный супернатант собирали через 48 часов после трансфекции. HUVEC высевали в 6-луночные планшеты с плотностью приблизительно 1:10, 1:100 и 1:1000 в супернатант, собранный из трансфицированных iPSC-клеток. Через 96 часов после введения указанного супернатанта пролиферацию HUVEC измеряли при помощи анализа CellTiter-Glo, на ФИГ. 6 показаны экспериментальные данные.

Результаты

[0242] iPSC-CM, трансфицированные векторными конструкциями, содержащими один ген, два гена или три гена, показали 4-10-кратное увеличение пролиферации HUVEC в обоих случаях. Таким образом, результаты успешно демонстрируют, что VEGF является функциональным (т.е. биологически активным) в случае, когда он экспрессируется как часть связанной полигенной конструкции с векторов экспрессии, содержащих два и содержащих три гена, при применении описанных в настоящем документе линкеров (т.е. индуцирует пролиферацию HUVEC, аналогичную той, которую наблюдали при одной эффекторной плазмиде VEGF 165).

Пример 3: Анализ образования эндотелиальной трубки

[0243] В дополнение к анализу пролиферации клеток HUVEC применяют анализ образования эндотелиальной трубки (СВА200, Cell Biolabs Inc., Сан-Диего, Калифорния, США). Гель ЕСМ оттаивают при 4°С и смешивают до однородности с применением охлажденных наконечников пипеток. Дно планшетов для культивирования клеток (96-луночные планшеты) покрывали тонким слоем геля ЕСМ (50 мкл/лунку), который оставляли для полимеризации при 37°С в течение 60 мин. HUVEC (2-3×10⁴ клеток) высевают в планшет для культивирования клеток в супернатант, собранный из клеток iPSC кардиомиоцитов, которые трансфицировали вектором, содержащим один ген, два гена или три гена, кодирующих S100A1 и VEGF, соединенные описанным в настоящем документе линкером; кодирующих S100A1, SDF1 и VEGF, соединенные описанным в настоящем документе линкером; или кодирующих только VEGF. 150 мкл смеси супернатант-HUVEC добавляют в каждую лунку на затвердевший ЕСМ-гель. Указанные планшеты инкубируют при 37°С в течение 12-18 часов и эндотелиальные трубки количественно определяют при помощи флуоресцентного микроскопа после окрашивания Calcein AM. В случайном порядке отбирают три поля микроскопа и фотографируют. Способность к образованию трубки количественно определяют путем подсчета общего количества клеточных кластеров (узлов) и ветвей при 4-кратном увеличении и в четырех разных полях на лунку. Результаты выражаются как среднее изменение ветвления по сравнению с контрольными группами. Каждый эксперимент выполняют как минимум три раза.

Пример 4: Функционирование SDF-1α - Анализ миграции

[0244] Эксперименты с хемотаксисом проводили с применением 24-луночной камеры системы Трасвел для определения хемотаксиса (Millipore, Billerica, штат Массачусетс, США). Вкратце, лейкоциты периферической крови (PBL) выделяли из образцов, полученных от здоровых добровольцев, и трансфицировали вектором, содержащим два или содержащим три гена, кодирующих S100A1 и VEGF, соединенные описанным в настоящем документе линкером, или кодирующих S100A1, SDF1 и VEGF, соединенные описанным в настоящем документе линкером. В верхнюю камеру (с диаметром пор 8 мкм) высевали в общей сложности 1×10⁵ PBL в 200 мкл среды. Для остановки эксперимента половину PBL предварительно инкубировали с антагонистом CXCR4 (AMD3100) в концентрации 10 нмоль/л в течение 30 мин до посева. Затем PBL и среду транфицировали в верхней камере. Затем указанную камеру инкубировали в течение 12 ч при 37°С в увлажненной атмосфере в атмосфере 5% СО₂. Мембрану (Millipore) удаляли, а ее верхнюю поверхность вытирали ватным тампоном для удаления неподвижных PBL. Затем указанную мембрану фиксировали в нейтральном формалине в течение 10 мин при комнатной температуре и затем окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетовым в течение 5 мин. Число PBL, которые мигрировали на нижнюю поверхность мембраны, подсчитывали в 10 случайно выбранных полях зрения при большом увеличении (HPF) в световом микроскопе (Nikon Eclipse, Nikon Instruments, Inc., Melville, Нью-Йорк, США).

[0245] Был рассчитан хемотаксический индекс (CI) для стимулированной экспрессией миграции: CI = стимулированная миграция (количество CSC на НРР)/случайная миграция (количество CSC на HPF). Каждый анализ проводили в трех лунках.

Результаты

[0246] Подтверждение SDF1-специфичной миграции с применением AMD3100 (антагонист CXCR4) было успешным. AMD3100 показал полное ингибирование зависимой от SDF1-CXCR4 миграции (образец №2, 6). SDF1, экспрессируемый в iPSC-CM является функциональным в предложенных авторами настоящего изобретения конструкциях, содержащих два и содержащих три гена, поскольку миграция уменьшается в присутствии AMD3100 (образец №7,12,13). На ФИГ. 7 и ФИГ. 8 показаны экспериментальные данные. Аналогичный эксперимент, выполненный с векторными конструкциями, экспрессирующими VEGF, показывает аналогичные результаты, ФИГ. 6. Таким образом, эти результаты успешно демонстрируют, что SDF-1a является функциональным (т.е. биологически активным) в случае, когда он экспрессируется как часть полигенных связанных конструкций с векторов экспрессии, содержащих два и содержащих три гена, при применении описанных в настоящем документе линкеров.

Пример 5А: Функционирование SDF-1α - Анализ миграции клеток Jurkat

Трансфицированные клетки Jurkat продуцируют функциональный белок SDF1, который подтверждает клеточную миграцию

[0247] SDF-1α исследовали на определение функциональности, демонстрирующей CXCR4-опосредованную миграцию двух типов клеток: клеток Jurkat и лимфоцитов периферической крови (PBL). Для миграции клеток Jurkat клетки в бессывороточной среде высевали на поверхность вставок системы Трансвел. Нижние камеры заполняли кондиционированными средами, полученными от пациентов (с дилатационной, гипертрофической кардиомиопатией), или полученными из здоровых iPSC кардиомиоцитами, трансфицированными рХоХ или одиночными эффекторами, представляющими собой контроль. Число клеток, которые мигрировали через вставку системы Трансвел в нижнюю камеру, содержащую кондиционированную среду, через два часа количественно определяли при помощи люминесцентного анализа.

[0248] Клетки Jurkat трансфицировали генными конструкциями, содержащими один ген, два гена и три гена, кодирующими SDF1. Контрольные клетки Jurkat и Jurkat, подвергнутые воздействию AMD3100 (антагонист CXCR4), измеряли для определения эффективности миграции через 2 часа после добавления указанного лекарственного средства. На ФИГ. 8 и ФИГ. 10 показаны экспериментальные данные. Подобный эксперимент, проведенный на клетках Jurkat, культивированных в присутствии супернатанта клеток iPSC человека, транфицированных векторными конструкциями, содержащими один ген, два гена и три гена, кодирующими SDF1, показывает сходные результаты; ФИГ. 11.

Результаты

[0249] Миграция клеток Jukart в направлении рекомбинантного SDF1 зависит от CXCR4. Таким образом, эти результаты успешно демонстрируют, что SDF-1α является функциональным (т.е. биологически активным) в случае, когда он экспрессируется как часть полигенных связанных конструкций с векторов экспрессии, содержащих два и содержащих три гена, при применении описанных в настоящем документе линкеров.

Пример 5В: Трансфицированные кардиомиоциты, полученные от пациентов с кардиомиопатией, продуцируют функциональный белок SDF1, который поддерживает клеточную миграцию

[0250] Клетки iPSC кардиомиоцитов (iPSC-CM) были получены от пациентов с дилатационной кардиомиопатией (DCM), гипертрофической кардиомиопатией (НСМ) или здоровых контролей. Клетки iPSC трансфицировали вектором, содержащим один ген, два гена или три гена, кодирующих S100A1 и VEGF, соединенные описанным в настоящем документе линкером; кодирующих S100A1, SDF1 и VEGF, соединенные описанным в настоящем документе линкером; или кодирующих только VEGF. Клеточный супернатант собирали через 48 часов после трансфекции. Клетки Jurkat высевали в 6-луночные планшеты с плотностью приблизительно 1:10, 1:100 и 1:1000 в супернатант, собранный из трансфицированных iPSC-клеток. Через 96 часов после введения супернатанта измеряли миграцию клеток Jurkat, на ФИГ. 12 показаны экспериментальные данные в модели дилатационной кардиомиопатии. На ФИГ. 13 показаны экспериментальные данные в модели гипертрофической кардиомиопатии.

Результаты

[0251] iPSC-CM, трансфицированные векторными конструкциями, содержащими один ген, два гена или три гена, показали 4-10-кратное увеличение пролиферации HUVEC в обоих случаях.

Пример 6: ELISA

Трансфицированные 293Т-клетки продуцируют количественные уровни белка

[0252] 293Т-клетки трансфицировали посредством Fugene 6 (Promega) при помощи генных конструкций Xogenx, содержащих один ген, два гена, три гена, и соответствующих конструкций, представляющих собой контроль. Супернатант клеток и лизат собирали в требуемый момент(-ы) времени. 293Т-клетки трансфицировали векторными конструкциями, кодирующими S100A, SDF1, VEGF191 или их различные комбинации, соединенные описанным в настоящем документе линкером, используя векторы, отличающиеся по наличию или отсутствию последовательностей Козак (Kozak), линкеров (Furin-AP-F2A, GSG-P2A, Furin-APVKQGSG-P2A) (SEQ ID №119) или всех их, как это показано на ФИГ. 15-17. Концентрации продуцируемого белка измеряли методом ELISA.

Результаты

[0253] 293Т-клетки, трансфицированные векторами, содержащими два гена, кодирующих S100A, SDF1, VEGF191 или их различные комбинации, продуцируют измеряемые уровни белка. На ФИГ. 15А и ФИГ. 15В показаны уровни белка SDF1. На ФИГ. 16А и ФИГ. 16В показаны уровни белка VEGF. На ФИГ. 17А и ФИГ. 17 В показаны уровни белка S100A1.

Пример 7: Конструкции экспрессии, содержащие три гена

[0254] Была разработана матрица (многообразие) конструкций, содержащих два гена, три гена и четыре гена, показанная в Таблице 5.

[0256] Экспрессию полипептида и эффективность расщепления исследовали на моделях типов клеток (т.е. 293Т-клетки, 8У40-трансформированные кардиомиоциты и полученные из iPSC кардиомиоциты, каждые полученные от здоровых доноров, доноров (пациентов) с дилатационной кардиомиопатией и гипертрофической кардиомиопатией. Результаты экспрессии, результаты эффективности расщепления и рассмотрение результатов экспрессии для различных комбинаций линкеров (т.е. связывающих последовательностей) показаны ниже в Таблице 6.

[0257] Конфигурации конструкций-лидеров:

[0257] (5')-CAG Промотор-S100A1-fp2a (линкер)-SDF1α-fp2a (линкер)-VEGF191-(3')

[0258] (5')-CAG Промотор-S100A1-fp2a (линкер)-VEGF191-fp2a (линкер)-SDF1α-(3')

[0260] Анализ ELISA - Экспрессия S100A1 с конструкций, содержащих три гена

[0261] Анализы ELISA проводили для количественного определения экспрессии S100A1 с конструкций рХоХ, содержащих три гена, в сравнении с конструкциями рХоХ, содержащими один ген и представляющими собой контроль, и ранее идентифицированным кандидатом-лидером, конструкциями, содержащими два гена. SV40-трансформированные кардиомиоциты трансфицировали каждой из исследуемых плазмидных конструкций, и клеточный супернатант и лизаты собирали в требуемый момент(-ы) времени. Кардиомиоциты трансфицировали векторными конструктами, содержащими гены, кодирующие S100A, SDF1α, VEGF191 или их различные комбинации, соединенные линкерными последовательностями, описанными в настоящем документе и указанными ниже в Таблице 7, соответственно первой, второй и третьей линкерными последовательностями (например, fp2a, fmdv, р2а, IRES, CMV или связывающая последовательность отсутствует). Концентрации продуцируемого белка измеряли методом ELISA. См. ФИГ. 18; номера образцов соответствуют номерам примеров, приведенным ниже в Таблице 7.

[0262] Конфигурация конструкций и результаты экспрессии S100A1 показаны в Таблице 7 (см. ниже).

[0263] Анализ ELISA - Экспрессия SDF1α с конструкций, содержащих три гена

[0264] Анализы ELISA проводили для количественного определения экспрессии S100A1 с конструкций рХоХ, содержащих три гена, в сравнении с конструкциями рХоХ, содержащими один ген и представляющими собой контроль, и ранее идентифицированным кандидатом-лидером, конструкциями, содержащими два гена. 8У40-трансформированные кардиомиоциты трансфицировали каждой из исследуемых плазмидных конструкций, и клеточный супернатант и лизаты собирали в требуемый момент(-ы) времени. Кардиомиоциты трансфицировали векторными конструктами, содержащими гены, кодирующие S100A, SDF1α, VEGF 191 или их различные комбинации, соединенные линкерными последовательностями, описанными в настоящем документе и указанными ниже в Таблице 8, соответственно первой, второй и третьей линкерными последовательностями (например, fp2a, fmdv, р2а, IRES, CMV или связывающая последовательность отсутствует). Концентрации продуцируемого белка измеряли методом ELISA. См. ФИГ. 19; номера образцов соответствуют номерам примеров, приведенным ниже в Таблице 8.

Анализ ELISA - Экспрессия VEGF191 с конструкций, содержащих три гена

[0265] Анализы ELISA проводили для количественного определения экспрессии VEGF191 с конструкций рХоХ, содержащих три гена, в сравнении с конструкциями рХоХ, содержащими один ген и представляющими собой контроль, и ранее идентифицированным кандидатом-лидером, конструкциями, содержащими два гена. SV40-трансформированные кардиомиоциты трансфицировали каждой из исследуемых плазмидных конструкций, и клеточный супернатант и лизаты собирали в требуемый момент(-ы) времени. Кардиомиоциты трансфицировали векторными конструктами, содержащими гены, кодирующие S100A, SDF1α, VEGF191 или их различные комбинации, соединенные линкерными последовательностями, описанными в настоящем документе и указанными ниже в Таблице 9, соответственно первой, второй и третьей линкерными последовательностями (например, fp2a, fmdv, р2а, IRES, CMV или связывающая последовательность отсутствует). Концентрации продуцируемого белка измеряли методом ELISA. См. ФИГ. 20; номера образцов соответствуют номерам примеров, приведенным ниже в Таблице 9.

Вестерн-блот-анализ (иммуноблот-анализ) подтверждает эффективное расщепление S100A1, SDF-1a и VEGF191 с конструкций, содержащих три гена

[0266] Подтверждение соответствующего размера и последовательности отдельных эффекторных белков в соответствующих типах клеток было продемонстрировано при помощи иммуноблот-анализа и масс-спектрометрического анализа (как это описано далее в настоящем документе). Несколько подходящих клеточных линий трансфицировали рХоХ и анализировали либо лизаты клеток (для S100A1), либо кондиционированные среды (для SDF-1α и VEGF 165). Контроли для иммуноблот-анализов представляли собой лизаты/кондиционированные среды клеток, трансфицированных соответствующим одиночным эффектором (pS100A1, pSDF-1α, pVEGF165) и соответствующим коммерчески доступным очищенным рекомбинантным белком.

[0267] Результаты ДСН-ПААГ-электрофореза/иммуноблот-анализа согласовывались во всех исследуемых клеточных линиях (293Т, SV40-иммортализованные кардиомиоциты, полученные из iPSC кардиомиоциты, полученные от здорового индивидуума, пациента с дилатационной кардиомиопатией, пациента с гипертрофической кардиомиопатией). Данные иммуноблот-анализа для SV40-иммортализованных кардиомиоцитов показаны ниже на ФИГ. 21-23 со стрелками, указывающими ожидаемый размер каждого из указанных эффекторных белков.

[0268] Для каждого GOI иммуноблот-анализ проводили с применением стандартных процедур в соответствии с инструкциями производителя. Условия для реагентов для обнаружения были следующими:

Обнаружение S100A1 - Антитело против S100A1 (R&D Systems, Inc.) разбавляли в соотношении 1:200, инкубировали с содержащей антиген мембраной в течение ночи при 4°С; антитело овцы против HRP (пероксидаза хрена) (KPL Inc., Gaithersburg, штат Мэриленд, США) разбавляли в соотношении 1:20000, инкубировали с содержащей антиген мембраной при комнатной температуре (RT) 30 минут; обнаружение сигнала при помощи LUMIGLO® Ultra (KPL Inc.);

Обнаружение SDF-1α - Антитело против SDF-1α (R&D Systems, Inc.) разбавляли в соотношении 1:2000, инкубировали с содержащей антиген мембраной в течение ночи при 4°С; антитело козы против HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grov, штат Пенсильвания, США) разбавляли в соотношении 1:20000, инкубировали с блотом при комнатной температуре (RT) в течение 30 минут; обнаружение сигнала при помощи LUMIGLO® Ultra (KPL Inc.).

Обнаружение VEGF - Антитело против VEGF (Abeam, Pic, Кембридж, штат Массачусетс) разбавляли в соотношении 1:2000, инкубировали с содержащей антиген мембраной в течение ночи при 4°С; антитело кролика против HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grov, штат Пенсильвания, США) разбавляли в соотношении 1:20000, инкубировали с блотом при комнатной температуре (RT) в течение 30 минут; обнаружение сигнала при помощи LUMIGLO® Ultra (KPL Inc.).

[0269] Примеры иммуноблотов приведены на ФИГ. 21, 22 и 23.

[0270] Результаты свидетельствуют о том, что каждый из трех GOI эффективно расщепляется, поскольку экспрессируется с конструкций, содержащих три гена.

Масс-спектрометрический анализ

Продукты полигенной экспрессии оценивали методом масс-спектрометрии.

[0271] Продукты расщепления кандидатов-лидеров подтверждали методом масс-спектрометрии. Расщепление трипсином, химотрипсином и эластазой проводили с применением стандартных процедур. Каждый гелевый гидролизат дополнительно анализировали при помощи наноЖХ/МС/МС* с применением ситемы ВЭЖХ Waters NanoAcquity (Waters Corp., Milford, штат Массачусетс, США), сопряженной с ThermoFisher Q Exactive HF (ThermoFisher Scientific, Waltham, штат Массачусетс, США). Данные обрабатывали с применением базы данных Mascot. DAT-файлы из Mascot анализировали при помощи программного обеспечения Scaffold для подтверждения, фильтрования и создания неизбыточного списка на образец. Данные фильтровали с применением минимального объема белка 90%, минимального объема пептида 50% (оценки Prophet) и обязательным применением по меньшей мере двух уникальных пептидов на белок. В соответствии с описанным выше вестерн-блот-анализом (иммуноблот-анализом), метод масс-спектрометрии дополнительно подтверждает протеолитическое расщепление S100A1, SDF-1 и VEGF при экспрессии с конструкций-лидеров, содержащих два и содержащих три гена; см. Таблицу 11.

*ЖХ/МС/МС обозначает жидкостную хроматографию (ЖХ) с масс-спектрометрией (МС). МС/МС представляет собой комбинацию двух масс-анализаторов в одном приборе для масс-спектрометрии. В первых МС-фильтрах для ионов-предшественников происходит фрагментация иона-предшественника с высокой энергией и, например, газообразного азота. Второй масс-анализатор затем фильтрует продукты ионов, образованные в результате фрагментации. Преимуществом МС/МС является повышенная чувствительность.

[0272] Метод масс-спектрометрии (МС) также применяли для оценки наличия или отсутствия аминокислотных остатков линкера на конце (С-концевой области) каждого GOI. МС проводили так, как это указано выше. Результаты приведены ниже в Таблице 12.

«Да» означает наличие > (более чем) 2 аминокислотных (АА) остатков на С-концевом хвосте (который может упоминаться в настоящем документе как «линкерный хвост»);

«Нет» означает наличие < или = (меньше или равнее) 2А на С-концевом хвосте.

Вестерн-блот-анализ (иммуноблот-анализ) димеризации полипептида S100A1

[0274] Электрофорез в неденатурирующем полиакриламидном геле (ПААГ) проводили для оценки образования димеров полипептидов S100A1, экспрессированных с конструкций, содержащих два и содержащих три гена. Кондиционированную среду трансфицированных 293Т-клеток анализировали методом нативного ПААГ-электрофореза/иммуноблота для мономерных и димерных уровней S100A1. Результаты показывают, что S100A1, расщепляемый из кандидатов-лидеров с двумя и тремя генами, находится преимущественно в димерной форме, тогда как S100A1, экспрессируемый одиночной эффекторной конструкцией pS100A1 и конструкциями, содержащими три гена, имеющими CMV-линкер в С-концевой области S100A1, является преимущественно мономерным; см. ФИГ. 24.

[0275] Следует отметить, что предложен уникальный аспект согласно настоящему изобретению, который относится к конкретному последовательному порядку полипептидов, кодируемых конструкциями согласно настоящему изобретению. Таким образом, в одном аспекте настоящего изобретения специфическое размещение белка S100A1 вначале конструкции позволяет достичь и способствует функциональной экспрессии биологически активных молекул S100A1, поскольку неожиданно было обнаружено, что оставшийся 2А-хвост на поверхности S100A1 не препятствует биологической активности S100A1. В тоже время было обнаружено, что размещение S100A1 в качестве второго гена приводит к неполному расщеплению генов, экспрессируемых через конструкции.

[0276] Соответственно, анализ экспрессии рХоХ методом масс-спектрометрии, как это указано ниже в Таблице 13, показал, что S100A1 был единственным эффектором, который расщеплял фурин, что приводило к удалению С-концевого 2А-пептида. Следовательно, на поверхности SDF1α или VEGF не оставалось С-концевого хвоста 2А. Только S100A1 имеет 2А-линкерный хвост. Точная концевая аминокислотная последовательность представляет собой PG. Она расщепляется между G и Р конечной последовательности PGP. Следовательно, С-концевой линкерный хвост на поверхности S100A1, экспрессируемого с рХоХ, содержит последовательность (otN- до С-концевой области) полипептида S101A1, слитую с последовательностью RAKRAPVKQGSGATNFSLLKQAGDVEENPG (SEQ ID №123); которая может упоминаться в настоящем документе как «2А-хвост». Например, в одном варианте реализации от исходного метионина S100A1 до С-концевой области хвоста расщепляемого линкера fp2a первый GOI согласно настоящему изобретению содержит последовательность:

[0277] Тем не менее как это показано при помощи представленных в настоящем документе данных, было продемонстрировано, что этот хвост S100A1 является «инертным», т.е. не влияет на функцию S100A1 (биологическую активность).

Пример 8: Трансфекции вектора, содержащего три гена

[0279] 293Т-клетки высевали в концентрации 750000 клеток на лунку в 6-луночный планшет и инкубировали в течение ночи в планшете в инкубаторе при 37°С/5% CO₂. На следующий день указанные клетки трансфицировали, применяя FuGENE 6 (Promega) с генными конструкциям, содержащими один ген, два гена, три гена, Таблица 14, и соответствующими представляющими собой контроль конструкциями с применением плазмидного вектора при концентрации 100 нг/мл, разбавленными в среде OptiMEM (LifeTechnologies). После трансфекции клетки инкубировали. В случае необходимости, супернатант и лизат клеток собирали через 72 часа.

Результаты

[0281] Поскольку эффекторы с рХоХ экспрессируются как одна полигенная мРНК, относительный уровень экспрессии каждого эффектора является фиксированным. Чтобы определить относительные уровни экспрессии каждого эффектора рХоХ, трансфицировали несколько соответствующих клеточных линий, а экспрессию белка оценивали методом ELISA. Клетки трансфицировали плазмидами для каждого отдельного эффектора (pS100A1, pSDF-1α или pVEGF165) или всех трех эффекторов (рХоХ).

[0282] Соответственно, как показано в Таблице 16, различные клетки, трансфицированные вектором рХоХ, содержащим три гена, кодирующих S100A1, SDF-1α и VEGF165, продуцировали измеряемые уровни белка, которые были обнаружены при помощи анализов ELISA. Исследуемые типы клеток включали 293Т-клетки, SV40-трансформированные кардиомиоциты, iPSC-CM (кардиомиоциты), полученные от здорового индивидуума, iPSC-CM, полученные от пациента с дилатационной кардиомиопатией, и iPSC-CM, полученные от пациента с гипертрофической кардиомиопатией.

[0283] Через 72 часа после трансфекции среду и лизат клеток собирали и анализировали отдельно для оценки экспрессии секретируемых белков (VEGF165 и SDF-1α) или внутриклеточных белков (S100A1). Ниже в Таблице 16 показаны уровни белка каждого эффектора по сравнению с уровнями, достигаемыми с применением плазмид, экспрессирующих отдельно каждый из эффекторов, выраженными как нг/мл.

Пример 8: Трансфекция кардиомиоцитов

SV40-иммортализованные кардиомиоциты

[0284] SV40-иммортализованные кардиомиоциты трансфицировали при помощи DNAfectin Plus (ABM) с применением конструкций Xogenex, содержащих один ген, два гена и три гена, при этом по меньшей мере два гена связаны описанным в настоящем документе линкером, и соответствующими конструкциями, представляющими собой контроль. 6-луночный планшет покрывали внеклеточной матрицей (АВМ) в течение ночи. Через 24 часа кардиомиоциты высевали в 6-луночный планшет при концентрации 225000 клеток/лунку в каждую покрытую ЕСМ лунку. Клетки инкубировали в течение ночи при 37°С/5% СО₂. Через 72 часа среду собирали из клеток в блок с глубиной 2 мл и хранили для проведения анализа ELISA для определения и количественной оценки образования белка.

Клетки iPSC кардиомиоцитов

[0285] Клетки iPSC кардиомиоцитов трансфицировали при помощи реагента трансфекции GeneJammer (Agilent) с применением конструкций Xogenex, содержащих один ген, два гена и три гена, и соответствующих конструкций, представляющих собой контроль. 12-луночный планшет покрывали фибронектином (ThermoScientiflc) и инкубировали при 37°С/5% СО₂ в течение 1 часа. ДНКазу восстанавливали в ультрачистой воде до конечной концентрации 10 мг/мл. Кардиомиоциты трипсинизировали с применением TrypLE и 1X ДНКазы I и инкубировали в течение 5 минут при 37°С или до тех пор, пока клетки не отсоединялись от колбы. Клетки iPSC высевали при концентрации 4×10⁵ клеток/лунку в каждую покрытую фибронектином лунку 12-луночных планшетов. Клетки в лунках инкубировали в инкубаторе при 37°С/5% СО₂ в течение 24 часов. На следующий день кардиомиоциты трансфицировали с использованием плазмидной ДНК в концентрации 2 мкг (рХоХ и контроли).

Результаты

[0286] Иммортализованные и первичные кардиомиоциты, трансфицированные вектором, содержащим три гена, кодирующих S100A, SDF1, VEGF165, продуцировали измеряемые уровни белка, ФИГ. 21.

Пример 9: Количественное определение образования белка трансфицированными кардиомиоцитами

[0287] Лизаты, полученные из 293Т-клеток, SV40 СМ и iPSC-CM разбавляли в соотношении 1:100 карбонат-бикарбонатном буфере BuPH из упаковки (0,2М) (ThermoFisher) и анализировали с применением анализа ELISA.

Результаты

[0288] Белки S100A1, SDF-1α и VEGF165 определяли в лизатах трансфицированных 293Т-клеток, SV40 СМ и iPSC-CM, ФИГ. 21.

Пример 10: Частота биения и продолжительность сокращения

[0289] Для оценки эффективности рХоХ и функции S100A1, экспрессируемого рХоХ, сократительные свойства iPSC-кардиомиоцитов, полученных от здорового индивидуума и пациента с дилатационной кардиомиопатией (несущего мутацию R173W в кардиальном гене TNNT2), трансфицированных рХоХ или соответствующими контролями, измеряли при помощи системы для визуализации живых клеток Sony SI8000. Клеточные сокращения записывались как видео с высоким разрешением и высокой частотой кадров (2048*2048 пикселей, 150 кадров в секунду, 10 секунд на лунку). Запись сокращений дополнительно анализировали при помощи программного обеспечения для анализатора Sony S18000C, и сократительные параметры были определены для каждой отдельной лунки. Реактивность (ответ) iPSC-CM на β-адренергическую стимуляцию, изопротеренол (ISO, 100 нМ), измеряли на основе сократительных свойств, которые регистрировали в течение 30 минут инкубации. В ходе исследования были оценены три параметра сокращения: частота биений, частота (скорость) сокращений и продолжительность сокращений.

Результаты

[0290] Частота биений и продолжительность сокращений свидетельствуют о том, что наличие 2А-хвоста на 3'-конце вектора, кодирующего S100A1, не влияет на функцию S100A1, ФИГ. 18А и ФИГ. 18В. В отдельном эксперименте показана частота биений и продолжительность сокращений, ФИГ. 19А, ФИГ. 19В и ФИГ. 19С показывают восстановление сократительных свойств у пациента с DCM до здоровых контрольных уровней с применением белка, полученного из трансфицированных клеток iPSC-CM.

[0291] Таким образом, эти результаты свидетельствуют о том, что сократительные свойства in vitro iPSC-кардиомиоцитов, полученных от пациента с дилатационной кардиомиопатией, улучшились при помощи pS100A1, pS100A1-SDF-1α и рХоХ по сравнению с pStuffer и нетрансфицированными контролями (pStuffer представляет собой плазмиду с той же конфигурацией остова, что и у рХоХ, при этом открытая рамка считывания (ОРС) заменена на неэкспрессирующую спейсерную последовательность аналогичного размера).

[0292] pS100A1 и pS100A1-SDF-1α показали сопоставимый функциональный выход (повышенная частота биения, улучшенная продолжительность сокращения), что свидетельствует о том, что наличие 2А-хвоста на 3'-конце гена S100A1 в pS100A1-SDF-1α и рХоХ не влияет на функцию S100A1.

[0293] рХоХ был наиболее эффективен при восстановлении сократительных свойств у пациента с дилатационной кардиомиопатией до уровней, наблюдаемых у здоровых индивидуумов, что свидетельствует о том, что эффекторы в рХоХ являются комплементарными.

Пример 11: Титрование рекомбиназы

[0294] На ФИГ. 28 показаны данные для экспрессии VEGF в экспериментах по титрованию рекомбиназы, в которых проводили анализ ELISA для определения устойчивости экспрессии VEGF при трансфекции SV40-трансформированных кардиомиоцитов различными соотношениями вектора экспрессии рХоХ, содержащего три гена, и рекомбиназы. На 3-й день после трансфекции существенного отличия в экспрессии VEGF между группами с SPBc2 и Stuffer не наблюдали. В течение 10, 17 и 24 дней после трансфекции группы с SPBc2 показали значительно большую секрецию VEGF, чем контрольные (Stuffer) группы, когда соотношение люциферазагрекомбиназа составляло 1:0,2-1:0,04.

[0295] На ФИГ. 29 показаны данные экспрессии SDF-1 в экспериментах по титрованию рекомбиназы, в которых проводили анализ ELISA для определения устойчивости экспрессии VEGF при трансфекции SV40-трансформированных кардиомиоцитов различными соотношениями вектора экспрессии рХоХ, содержащего три гена, и рекомбиназы. На 3-й день после трансфекции существенного отличия в экспрессии SDF-1 между группами с SPBc2 и Stuffer не наблюдали. Уровень белка SDF1 был ниже предела обнаружения на 10 и 17 день после трансфекции. Уровни белка SDF1 обнаружили на 24 день после трансфекции, группы с SPBc2 показали значительно большую секрецию SDF1, чем контрольные (Stuffer) группы, когда соотношение люцифераза : рекомбиназа составляло 1:0,2-1:0,04.

[0296] На ФИГ. 30 показаны данные экспрессии S100A1 в кардиомиоцитах, трансфицированных рекомбиназой и без нее. На 3-й день после трансфекции существенного отличия в экспрессии S100A1 между группами с SPBc2 и Stuffer не наблюдали. На 10, 17 и 24 день после трансфекции группы с SPBc2 показали значительно большую секрецию S100A1, чем контрольные группы (Stuffer).

Пример 12: Исследование экспрессии плазмидного остова на крысах

[0297] рХоХ содержит стандартный плазмидный остов с геном устойчивости к канамицину. Кроме того, экспрессия эффекторных белков регулируется гибридным CAG-промотором, и он использует синтетический 3'НТО/полиА-хвост, описанный в Таблице 15. Для подтверждения способности этой конфигурации остова поддерживать экспрессию гена в сердце в динамике, эффектор ОРС в рХоХ заменяли репортерным геном люциферазы (fLuc) (pCAG-fLuc) и оценивали с применением прижизненной визуализации на определение продолжительности экспрессии люциферазы после инъекции плазмиды в сердце. Аналогичную плазмиду с CMV-промотором и неэкспрессирующую спейсерную последовательность (pCMV-stuffer) применяли в качестве контроля для определения размера плазмиды и фоновой экспрессии fLuc.

[0298] Для этого исследования экспрессии плазмидную ДНК (250 мкг) инъецировали в стенку левого желудочка 12-14-недельных самцов крыс Sprague Dawley (n=5 на группу). За крысами наблюдали в динамике, и уровни экспрессии люциферазы измеряли с применением системы живой визуализации in vivo (IVIS). Активность люциферазы у крыс, инъецированных pCAG-fLuc, была первоначально на значение в 21og выше фоновых уровней, наблюдаемых у крыс, инъецированных конструкцией pCMV-fLuc, представляющей собой контроль. Как и ожидалось, уровни экспрессии постепенно снижались через 28 дней после дозирования транзиентно экспрессирующих плазмид. Эти данные свидетельствуют о том, что данный плазмидный остов способен инициировать экспрессию белка, которая постепенно снижается до почти контрольных уровней приблизительно на 28 день. Данные не показаны.

Пример 13: Метод доставки - ретроградная инфузия через коронарный синус у свиней

[0299] Ретроградная инфузия через коронарный синус является предлагаемым методом доставки для невирусных плазмидных конструкций (таких как, но не ограничиваясь ими, рХоХ) в сердце. Техническая сложность этого метода доставки исключает его оценку на небольших животных моделях, как, например, мышах и крысах. Таким образом, свиньи предложены для применения в фармакологических и токсикологических исследованиях и исследованиях биораспределения. Для проверки осуществимости данного метода, пилотное (экспериментальное) исследование провели на свиньях в качестве исследуемых субъектов. Применяя стандартные интервенционные методы, баллонный катетер (Cook Regentec) размещали в коронарном синусе с применением системы доставки стента по проводнику (over the wire). Баллон увеличивался в размерах, окклюзия подтверждали и затем осуществляли инфузию репортерной плазмиды с геном люциферазы. Исследовали три разных дозы (40 мг, 80 мг и 120 мг) с концентрацией плазмиды 1 мг/мл. В общей сложности было исследовано 9 животных, что обеспечило 3 повтора для каждой дозы. В каждом животном инфузию проводили с шагом повышения дозы в 10 мл до тех пор, пока весь объем не был введен. Инфузия составляла 10 мл/мин, а окклюзия баллона после инфузии составляла 10 минут.

[0300] Приблизительно через 24 часа после инфузии плазмиды проводили катетеризацию большой сердечной вены и в коронарную венозную систему методом инфузии вводили раствор субстрата D-люциферина (в когцентрации приблизительно 0,125 мг/мл). Затем животных подвергали эвтаназии и их сердца эксплантировали. Затем эксплантированные сердца оценивали на определение биолюминесценции с применением CCD-камеры для подсчета, используя системы визуализации IVIS® Lumina. Биолюминесцентные изображения, показывающие интенсивность яркости и распределения люциферазы через 24 часа после инъекции выделенных сердец, представлены на ФИГ. 9, свидетельствуют о том, что опосредованная плазмидой экспрессия люциферазы клетками сердца происходит в течение 24 часов после дозирования.

[0301] Дальнейшее биораспределение опосредованной плазмидой экспрессии люциферазы изучали на срезах сердечной и легочной тканей. Данные ПЦР с обратной транскрипцией дополнительно подтвердили экспрессию люциферазы только в левом желудочке сердца у свиней в группе лечения, получавшей 120 мг (данные не показаны). Ни одно из животных не умерло до начала запланированного умерщвления. Соответственно, данное исследование показало, что доставка невирусных плазмид, таких как рХоХ, является безопасной, практичной и приводит к ограниченному системному распределению указанной плазмиды.

[0302] Пример 14: Регенерация кардиомиоцитов in vivo при помощи рХоХ при индуцированной адриамицином кардиомиопатии методом направленного разрушения микропузырьков ультразвуком (UTMD) [64]

Индуцированная адриамицином кардиомиопатия у крыс представляет собой хорошо себя зарекомендовавшую модель застойной сердечной недостаточности (ЗСН). Метод направленного разрушения микропузырьков ультразвуком (UTMD) применяли для доставки рХоХ (который экспрессирует биологически активные SDF1α, S100A1 и VEGF) в сердца крыс при индуцированной адриамицином кардиомиопатии. В общей сложности 16 крыс с индуцированной адриамицином установленной кардиомиопатией были разделены на 2 группы по восемь штук в каждой. Каждая группа получала лечение одной из 2 плазмид: (1) pStuffer или (2) рХоХ. pStuffer представляет собой плазмиду, являющуюся отрицательным контролем, с той же конфигурацией остова, что и у рХоХ, при этом открытая рамка считывания (ОРС) заменена на неэкспрессирующуюся спейсерную последовательность аналогичного размера. Содержащие плазмиды микропузырьки, стабилизированные при помощи липидов, получали в растворе 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидилхолина с концентрацией 2,5 мг/мл, 1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфатидилэтаноламина с концентрацией 0,5 мг/мл и 10% глицерина, смешанного с 2 мг плазмиды, растворенной в 50 мл липофектамина 3000 (Invitrogen, Карлсбад, штат Калифорния). Аликвоты по 0,5 мл данного раствора фосфолипид-плазмида помещали в 1,5 мл прозрачные флаконы; оставшееся пространство заполняли перфторпропановым газом (Air Products, Inc, Аллентаун, штат Пенсильвания). Каждый флакон инкубировали при 4°С в течение 30 мин, и затем механически встряхивали в течение 30 сек при помощи стоматологического амальгаматора (VialmixTM, Bristol-Myers Squibb Medical Imaging N, Биллерика, штат Массачусетс). Эхокардиографические измерения фракции сокращения, толщины стенки задней стенки левого желудочка (ЛЖ) и межжелудочковой перегородки в конце диастолы и конечной систолы (IVSd) были получены по цифровым изображениям, полученным при помощи 12 МГц широкополосного преобразователя (зонд S12, Philips Ultrasound, Ботелл, штат Вашингтон) в М-режиме в условиях двумерной левой парастернальной позиции по короткой оси левого желудочка.

[0303] Результаты эхокардиографического измерения структуры и функции сердца демонстрируют, что генная терапия с применением UTMD-pXoX восстанавливает индекс фракции сокращения, диаметр задней стенки ЛЖ и IVSd, ФИГ. 31А, ФИГ. 31В и ФИГ. 31С. Значения представлены как среднее ± стандартное отклонение среднего. ** Р<0,001 в сравнении с pStuffer. Результаты показывают, что эхокардиографическое измерение продемонстрировало инверсию установленной ADM-кардиомиопатии после лечения одиночной UTMD-pXoX, тем самым свидетельствуя об успешном лечении кардиомиопатии in vivo в модели застойной сердечной недостаточности путем введения конструкции рХоХ (три гена с линкерами), которая экспрессирует биологически активные SDF1α, S100A1 и VEGF.

[0304] Результаты ядерной локализации РННЗ (фосфогистона Н3 (Ser10))

Сигнал митотического маркера в мышечных клетках сердца крыс, получающих плазмиду pStuffer или рХоХ, показан на ФИГ. 32, и он демонстрирует регенерацию кардиомиоцитов. Митотический маркер РНН3 подтвердил пролиферацию мышечных клеток сердца у взрослых крыс с установленной сердечной недостаточностью при применении UTMD-рХоХ. Отрицательные результаты по ISL-1, маркеру ранних клеток-предшественников мышечных клеток сердца, подтверждают, что клетки-предшественники не участвуют в регенерации у тех же самых крыс; ФИГ. 33. Отрицательные результаты по ISL-1 подтверждают, что регенерация кардиомиоцитов действительно является результатом генной терапии с применением UTMD-pXoX.

[0305] Эти результаты свидетельствуют о том, что введение конструкции рХоХ, которая экспрессирует биологически активные SDF1α, S100A1 и VEGF, является подходящей при регенерации кардиомиоцитов и успешном лечении кардиомиопатии в моделях застойной сердечной недостаточности. Результаты также свидетельствуют о том, что метод направленного разрушения микропузырьков ультразвуком (UTMD) представляет собой эффективный способ введения векторов и генных конструкций, описанных в настоящем документе, например, включая полигенные конструкции, такие как рХоХ, для лечения сердечных заболеваний и других патологий.

[0306] Хотя в настоящем документе были показаны и описаны предпочтительные варианты реализации настоящего изобретения, специалистам в данной области техники будет понятно, что такие варианты реализации предложены только в качестве примера. Многочисленные вариации, изменения и замены теперь могут быть осуществлены специалистами в данной области техники, не отклоняясь от настоящего изобретения. Следует понимать, что различные альтернативные варианты вариантов реализации настоящего изобретения, описанных в настоящем документе, можно использовать при реализации настоящего изобретения на практике. Предполагается, что нижеследующая формула изобретения определяет объем настоящего изобретения, и что тем самым способы и структуры, входящие в объем формулы изобретения, и их эквиваленты также ею охватываются.

[0307] Ссылки

[1] J.L. Hellawell and К.В. Marguiles, "Myocardial reverse remodeling," Cardiovasc. Ther., vol. 30, №3, pp. 172-181, 2012.

[2] D. Rohde, J. Ritterhoff, M. Voelkers, H. Katus, T.G. Parker and P. Most, "S100A1: a multifaceted therapeutic target in cardiovascular disease," J. Cardiovasc. Transl. Res., vol. 3, №5, pp. 525-537, 2010.

[3] S.T. Pleger, P. Most, M. Boucher and S. Soltys, "Stable myocardial-specific AAV6-S100A1 gene therapy results in chronic functional heart failure rescue," Circulation, vol. 115, №19, pp. 2506-2515, 2007.

[4] A. Remppis, T. Greten, B. Schafer and P. Hunziker, "Altered expression of the Ca 2+-binding protein S100A1 in human cardiomyopathy," Biochim. Biophys. Acta., vol. 1313, №3, pp. 253-257, 1996.

[5] D. Rohde, H. Brinks, J. Ritterhoff, G. Qui, S. Ren and P. Most, "S100A1 gene therapy for heart failure: a novel strategy on the verge of clinical trials," J. Mol. Cell Cardiol, vol. 50, №5, pp. 777-784, 2011.

[6] C. Weber, I. Neacsu, B. Krautz, P. Schlegel, S. Sauer, P. Raake, J. Ritterhoff, A. Jungmann, A.B. Remppis, M. Stangassinger, W.J. Koch, H.A. Katus, O.J. Muller, P. Most and S.T. Pleger, "Therapeutic safety of high myocardial expression levels of the molecular inotrope S100A1 in a preclinical heart failure model," Gene Ther., vol. 21, pp. 131-138, 2014.

[7] M.S. Penn, J. Pastore, T. Miller and R. Aras, "SDF-1 in myocardial repair," Gene Ther., vol. 19, №6, pp. 583-587, 2012.

[8] M.S. Penn, F.O. Mendelsohn, G.L. Schaer, W. Sherman, M. Farr, J. Pastore, D. Rouy, R. Clemens, R. Aras and D.W. Losordo, "An open-label dose escalation study to evaluate the safety of administration of nonviral stromal cell-derived factor-1 plasmid to treat symptomatic ischemic heart failure," Circ. Res., vol. 112, №5, pp. 816-825, 2013.

[9] E.S. Chung, L. Miller, A.N. Patel, R.D. Anderson, F.O. Mendelsohn, J. Traverse, К.H. Silver, J. Shin, G. Ewald, M.J. Farr and S. Anwaruddin, "Changes in ventricular remodelling and clinical status during the year following a single administration of stromal cell-derived factor-1 non-viral gene therapy in chronic ischaemic heart failure patients: the STOP-HF randomized Phase II trial," Eur. Heart. J., vol. 36, pp. 2228-2238, 2015.

[10] Z. Taimeh, J. Loughran, E.J. Birks and R. Bolli, "Vascular endothelial growth factor in heart failure," Nat. Rev. Cardiol, vol. 10, №9, pp. 519-530, 2013.

[11] J.X. Yu, X.F. Huang, W.M. Lv, C.S. Ye, X.Z. Peng, H. Zhang, L.B. Xiao and S.M. Wang, "Combination of stromal-derived factor-la and vascular endothelial growth factor gene-modified endothelial progenitor cells is more effective for ischemic neovascularization," J. Vase. Surg., vol. 50, №3, pp. 608-616, 2009.

[12] E. Perin, G.V. Silva, J.A. Assad, D. Vela, L.M. Buja, A.L. Sousa, S. Litovsky, J. Lin, W.K. Vaughn, S. Coulter and M.R. Fernandes, "Comparison of intracoronary and transendocardial delivery of allogeneic mesenchymal cells in a canine model of acute myocardial infarction," J. Mol. Cell Cardiol., vol. 44, №3, pp. 486-95, 2008.

[13] S. Robinson, P.W. Cho, H.I. Levitsky, J.L. Olson, R.H. Hruban, M.A. Acker and P.D. Kessler, "Arterial delivery of genetically labelled skeletal myoblasts to the murine heart: long-term survival and phenotypic modification of implanted myoblasts," Cell Transplant., vol. 5, №1, pp. 77-91, 1996.

[14] K. Suzuki, N.J. Brand, R.T. Smolenski, J. Jayakumar, B. Murtuza and M.H. Yacoub, "Development of a novel method for cell transplantation through the coronary artery," Circulation, vol. 102, №19 Suppl 3, pp. 111359-64, 2000.

[15] K. Suzuki, B. Murtuza, N. Suzuki, R.T. Smolenski and M.H. Yacoub, "Intracoronary infusion of skeletal myoblasts improves cardiac function in doxorubicin-induced heart failure," Circulation, vol. 104, №12 Suppl 1, pp. 1213-7, 2001.

[16] P. Musialek, L. Tekieli, M. Kostkiewicz, M. Majka, W. Szot, Z. Walter and M. Olszowska, "Randomized transcoronary delivery of CD34(+) cells with perfusion versus stop-flow method in patients with recent myocardial infarction: Early cardiac retention of (m)Tc-labeled cells activity," J. Nuclear Cardiol., vol. 18, №1, pp. 104-16, 2011.

[17] P.W. Musialek, A.B. Tracz, K. Skotnicki, P. Zmudka, Z. Pieniazek and W.M. Szostek, "Transcoronary stem cell delivery using physiological endothelium-targeting perfusion technique: the rationale and a pilot study involving a comparison with conventional over-the-wire balloon coronary occlusions in patients after recent myocardial infarcti," Kardiol. Pol., vol. 64, №5, pp. 489-98, 2006.

[18] L. Noyez, J.A. van Son, J.T. Van Der Werf, J. Knape, J. Gimbrere, W.N. van Asten, L.K. Lacquet and W. Flameng, "Retrograde versus antegrade delivery of cardioplegic solution in myocardial revascularization. A clinical trial in patients with three-vessel coronary artery disease who underwent myocardial revascularization with extensive use of the internal mammary art," J. Thorac. Cardiovasc. Surg., vol. 105, №5, pp. 854-63,1993.

[19] P. Boekstegers, W. Giehrl, G. von Degenfeld and G. Steinbeck, "Selective suction and pressure-regulated retroinfusion: an effective and safe approach to retrograde protection against myocardial ischemia in patients undergoing normal and high risk percutaneous transluminal coronary angioplasty," J. Am. Coll. Cardiol., vol. 31, №7, pp. 1525-33,1998.

[20] T. Pohl, W. Giehrl, B. Reichart, C. Kupatt, P. Raake, S. Paul, H. Reichenspurner, G. Steinbeck and P. Boekstegers, "Retroinfusion-supported stenting in high-risk patients for percutaneous intervention and bypass surgery: results of the prospective randomized myoprotect I study," Cath. Cardiovasc. Intervent, vol. 62, №3, pp. 323-30, 2004.

[21] R. Incorvati, S.G. Tauberg, M.J. Pecora, R.S. Macherey, S.B. Dianzumba, В.C. Donohue and M.W. Krucoff, "Clinical applications of coronary sinus retroperfusion during high risk percutaneous transluminal coronary angioplasty," J. Am. Coll. Cardiol., vol. 22, №1, pp. 127-34, 1993.

[22] Z. a. G.M. Lokmic, "Visualisation and stereological assessment of blood and lymphatic vessels," Histolog. Histopathol., vol. 26, №6, pp. 781-96,2011.

[23] D. Rohde, W. Schluter-Wigger, V. Mielke, P. von den Driesch, B. von Gaudecker and W. Sterry, "Infiltration of both T cells and neutrophils in the skin is accompanied by the expression of endothelial leukocyte adhesion molecule-1 (ELAM-1): an immunohistochemical and ultrastructural study," J. Invest. Dermatol., vol. 98, №5, pp. 794-9,1992.

[24] S. Anderson, R. Shiner, M.D. Brown and O. Hudlicka, "ICAM-1 expression and leukocyte behavior in the microcirculation of chronically ischemic rat skeletal muscles," Microvasc. Res., vol. 71, №3, pp. 205-11, 2006.

[25] H. Habazettl, C. Kupatt, S. Zahler, B.F. Becker and K. Messmer, "Selectins and beta 2-integrins mediate post-ischaemic venular adhesion of polymorphonuclear leukocytes, but not capillary plugging, in isolated hearts," Pflugers. Arch., vol. 438, №4, pp. 479-85, 1999.

[26] J. Lesley, I. Gal, D.J. Mahoney, M.R. Cordell, M.S. Rugg, R. Hyman, A.J. Day and K. Mikecz, "TSG-6 modulates the interaction between hyaluronan and cell surface CD44," J. Biol. Chem., vol. 279, №24, pp. 25745-54, 2004.

[27] A.N. Patel, S. Mittal, G. Turan, A.A. Winters, T.D. Henry, H. Ince and N. Trehan, "REVIVE Trial: Retrograde Delivery of Autologous Bone Marrow in Patients With Heart Failure," Stem Cells Transl. Med., vol. 4, pp. 1021-1027, 2015.

[28] R.E. Henschler, E. Deak and E. Seifried, "Homing of Mesenchymal Stem Cells," Infusionsther Transfusionsmed, vol. 35, №4, pp. 306-312, 2008.

[29] В. Ruster, S. Gottig, R.J. Ludwig, R. Bistrian, S. Miiller, E. Seifried, J. Gille and R. Henschler, "Mesenchymal stem cells display coordinated rolling and adhesion behavior on endothelial cells," Blood, vol. 108, №12, pp. 3938-44,2006.

[30] C. Hart, D. Drewel, G. Mueller, J. Grassinger, M. Zaiss, L.A. Kunz-Schughart, R. Andreesen, A. Reichle, E. Holler and B. Hennemann, "Expression and function of homing-essential molecules and enhanced in vivo homing ability of human peripheral blood-derived hematopoietic progenitor cells after stimulation with stem cell factor," Stem Cells, vol. 22, №4, pp. 580-9, 2004.

[31] C. Rampon, N. Weiss, C. Deboux, N. Chaverot, F. Miller, D. Buchet, H. Tricoire-Leignel, S. Cazaubon, B.-V. Evercooren and P.-O. Couraud, "Molecular mechanism of systemic delivery of neural precursor cells to the brain: assembly of brain endothelial apical cups and control of transmigration by CD44," Stem Cells, vol. 26, №7, pp. 1673-82, 2008.

[32] E. Bachrach, A.L. Perez, Y.H. Choi, В.M. Illigens, S.J. Jun, P.D. Nido, F.X. McGowan, S. Li, A. Flint, J. Chamberlain and L. M. Kunkel, "Muscle engraftment of myogenic progenitor cells following intraarterial transplantation," Muscle Nerve, vol. 34, №1, pp. 44-52, 2006.

[33] P. Boekstegers, G. Von Degenfeld, D. Giehrl, R. Heinrich, C. Hullin, G. Kupatt, G. Steinbeck, G. Baretton, G. Middeler, H. Katus and W.M. Franz, "Myocardial gene transfer by selective pressure-regulated retroinfusion of coronary veins," Gene Ther., vol. 7, №3, pp. 232-40, 2000.

[34] S. Alino, M. Jose Herrero, V. Bodi, I. Noguera, L. Mainar, F. Dasi, A. Sempere, M. Sanchez, A. Diaz, L. Sabater and S. Lledo, "Naked DNA delivery to whole pig cardiac tissue by coronary sinus retrograde injection employing non-invasive catheterization," J. Gene Med., vol. 12, №11, pp. 920-6, 2010.

[35] E. Youssef, P. Zhang, P. I. Rogers, P. Tremble, J. Rokovich, В.H. Johnstone, K.L. March and D. Hou, "Enhancing myocardial plasmid expression by retrograde coronary venous delivery," Cath. Cardiovasc. Intervent, vol. 65, №4, pp. 528-34, 2005.

[36] P. Raake, G. von Degenfeld, R. Hinkel, R. Vachenauer, T. Sandner, S. Beller, M. Andrees, C. Kupatt, G. Schuler and P. Boekstegers, "Myocardial gene transfer by selective pressure-regulated retroinfusion of coronary veins: comparison with surgical and percutaneous intramyocardial gene delivery," J. Am. Coll. Cardiol., vol. 44, №5, pp. 1124-9, 2004.

[37] G. von Degenfeld, P. Raake, C. Kupatt, C. Leberhz, R. Hinkel, F.J. Gildehaus, W. Mtinzing, A. Kranz, J. Waltenberger, M. Simoes and M. Schwaiger, "Selective pressure-regulated retroinfusion of fibroblast growth factor-2 into the coronary vein enhances regional myocardial blood flow and function in pigs with chronic myocardial ischemia," J. Am. Coll. Cardiol., vol. 42, №6, pp. 1120-8, 2003.

[38] К. Suzuki, В. Murtuza, S. Fukushima, R. T. Smolenski, A. Varela-Carver, S. R. Coppen and M. H. Yacoub, "Targeted cell delivery into infarcted rat hearts by retrograde intracoronary infusion: distribution, dynamics, and influence on cardiac function," Circulation, vol. 110, №11 Suppl 1, pp. II225-30, 2004.

[39] J. George, J. Goldberg, M. Joseph, N. Abdulhameed, J. Crist, H. Das and V. J. Pompili, "Transvenous intramyocardial cellular delivery increases retention in comparison to intracoronary delivery in a porcine model of acute myocardial infarction," J. Interv. Cardiol., vol. 21, №5, pp. 424-31,2008.

[40] C. Thompson, B. A. Nasseri, J. Makower, S. Houser, M. McGarry, T. Lamson, I. Pomerantseva, J.Y. Chang, H.K. Gold, J.P. Vacanti and S.N. Oesterle, "Percutaneous transvenous cellular cardiomyoplasty: A novel nonsurgical approach for myocardial cell transplantation," J. Am. Coll. Cardiol., vol. 41, №11, pp. 1964-71, 2003.

[41] P.W. Raake, R. Hinkel, S. Muller, S. Delker, R. Kreuzpointner, C. Kupatt, H.A. Katus, J.A. Kleinschmidt, P. Boekstegers and O. J. Mtiller, "Cardio-specific long-term gene expression in a porcine model after selective pressure-regulated retroinfusion of adeno-associated viral (AAV) vectors," Gene Ther., vol. 15, №1, pp. 12-7, 2008.

[42] J. Tuma, R. Fernandez-Vina, A. Carrasco, J. Castillo, C. Cruz, A. Carrillo, J. Ercilla, C. Yarleque, J. Cunza, T.D. Henry and A.N. Patel, "Safety and feasibility of percutaneous retrograde coronary sinus delivery of autologous bone marrow mononuclear cell transplantation in patients with chronic refractory angina," J. Transl. Med., vol. 9, p. 183, 2011.

[43] N.T. Wright, K.M. Varney, K.C. Ellis, J. Markowitz, R.K. Gitti, D.B. Zimmer and D.J. Weber, "The three-dimensional solution structure of Ca(2+)-bound S100A1 as determined by NMR spectroscopy," J. Mol. Biol, vol. 353, №2, pp. 410-426, 2005.

[44] R. Donato, "Functional roles of SI00 proteins, calcium-binding proteins of the EF-hand type," Biochim. Biophys. Acta., vol. 1450, №3, pp. 191-231, 1999.

[45] D.B. Zimmer, P. Wright Sadosky and D.J. Weber, "Molecular mechanisms of S100-target protein interactions," Microsc. Res. Tech., vol. 60, №6, pp. 552-559, 2003.

[46] L. Hove-Madsen and D.M. Bers, "Sarcoplasmic reticulum Ca2+ uptake and thapsigargin sensitivity in permeabilized rabbit and rat ventricular myocytes," Circ. Res., vol. 73, №5, pp. 820-828,1993.

[47] J. James, Y. Zhang, K. Wright, S. Witt and E. Glascock, "Transgenic rabbits expressing mutant essential light chain do not develop hypertrophic cardiomyopathy.," J. Mol. Cell. Cardiol., vol. 34, №7, pp. 872-882, 2002.

[48] J. Woda, S.J. Fisher, J. Pastore and A.N. Patel, "Coronary Sinus Delivery of SDF-1 Plasmid for the Treatment of Heart Failure," American Society of Gene and Cell Therapy, p. poster presentation, 2014.

[49] M. Hedman, J. Hartikainen, M. Syvanne, J. Stjernvall, A. Hedman, A. Kivela, E. Vanninen, H. Mussalo, E. Kauppila, S. Simula and O. Narvanen, "Safety and Feasibility of Catheter-Based Local Intracoronary Vascular Endothelial Growth Factor Gene Transfer in the Prevention of Postangioplasty and In-Stent Restenosis and in the Treatment of Chronic Myocardial Ischemia. Phase II Results of the Kuopio," Circulation, vol. 107, pp. 2677-2683, 2003.

[50] M.G. Katz, A.S. Fargnoli, A.P. Kendle, R.J. Hajjar and C.R. Bridges, "Gene Therapy in Cardiac Surgery: Clinical Trials, Challenges and Perspectives," Ann. Thorac. Surg., vol. 101, pp. 2407-2416,2016.

[51] P. Kolsut, M. Malecki, P. Zelazny, B. Teresinska, P. Firek, P. Janik and Z. Religa, "Gene therapy of coronary artery disease with phvegfl65-early outcome," Kardiol. Pol, vol. 59, pp. 373-384, 2003.

[52] M. Ruel, R.S. Beanlands, M. Lottie, V. Chan, N. Camack, E.J. Suuronen, F.D. Rubens, J.N. DaSilva, F.W. Sellke, D.J. Stewart and T.G. Mesana, "Concomitant treatment with oral L-arginine improves the efficacy of surgical angiogenesis in patients with severe diffuse coronary artery disease: the Endothelial Modulation in Angiogenic Therapy randomized controlled trial," J. Thorac. Cardiovasc. Surg., vol. 135, pp. 762-770, 2008.

[53] S.T. Pleger, C. Shan, J. Ksienzyk, R. Bekeredjian, P. Boekstegers, R. Hinkel, S. Schinkel, B. Leuchs, J. Ludwig, G. Qiu and C. Weber, "Cardiac AAV9-S100A1 gene therapy rescues postishemic heart failure in a preclinical large animal model," Sci. Transl. Med., vol. 3, №92, pp. 92ra64-92ra64, 2011.

[54] R.J. Lee, M.L. Springer, W. E. Blanco-Bose, R. Shaw, P.C. Ursell and H.M. Blau, "VEGF Gene Delivery to Myocardium: Deleterious Effects of Unregulated Expression," Circulation, vol. 102, pp. 898-901, 2000.

[55] J.J. Lopez, R. Laham, A. Stamler, J.D. Pearlman, S. Bunting, A. Kaplan, J.P. Carrozza, F.W. Sellke and M. Simons, "VEGF administration in chronic myocardial ischemia in pigs," Cardiovasc. Res., pp. 272-281, 1998.

[56] M. Katz, A. Fargnoli, R. Williams and C. Bridges, "Gene Therapy Delivery Systems for Enhancing Viral and Nonviral Vectors for Cardiac Diseases: and Nonviral Vectors for Cardiac Diseases: Current Concepts and Future Applications," Human Gene Ther., vol. 24, pp. 914-927, 2013.

[57] Brinks H, D. Rohde, M. Voelkers, G. Qiu and S. Pleger, "S100A1 genetically targeted therapy reverses dysfunction of human failing cardiomyocytes," J. Am. Coll. Cardiol, vol. 58, №9, pp. 966-973, 2011.

[58] F.J. Giordano, "Retrograde coronary perfusion: a superior route to deliver therapeutics to the heart?", J. Am. Coll. Cardiol, vol. 42, №6, pp. 1129-1131,2003.

[59] Y. Wang, F. Wang, R. Wang, P. Zhao and Q. Xia, "2A self-cleaving peptide-based multi-gene expression system in the silkworm Bombyx mori," Sci. Rep., vol. 5, №16273, pp. 1-10, 2015.

[60] M.C. Scimia, A.M. Gumpert and W.J. Koch, "Cardiovascular gene therapy for myocardial infarction," Expert Opin. Biol. Ther., vol. 14, №2, pp. 183-195, 2014.

[61] I. Marenholz, C.W. Heizmann, G. Fritz, "S100 proteins in mouse and man: from evolution to function and pathology (including an update of the nomenclature)," Biochem. Biophys. Res. Commun. vol. 322, №4, pp. 1111-22, 2004.

[62] T. Nagasawa, "CXCL12/SDF-1 and CXCR4," Front. Immunol, vol. 6, pp. 301, 2015.

[63] David I.R. Holmes, I. Zachary, "The Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF) Family: Angiogenic Factors in Health and Disease." Genome Biol Vol. 6, №2, pp. 209, (2005).

[64] S. Chen, J. Chen, P Huang, XL Meng, Clayton, JS Shen, PA Graybum, "Myocardial regeneration in adriamycin cardiomyopathy by nuclear expression of GLP1 using ultrasound targeted microbubble destruction." Biochem. Biophys. Res. Commun. Vol. 458, №4, pp. 823-9, 2015.

[65] C.R. Mayer, N.A. Geis, H.A. Katus, R. Bekeredjian, "Ultrasound targeted microbubble destruction for drug and gene delivery." Expert Opin. DrugDeliv., vol. 5, №10, pp. 1121-38, 2008.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> INTREXON CORPORATION

<120> КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ ЭКСПРЕССИИ НЕСКОЛЬКИХ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ

ПОЛИПЕПТИДОВ С ОДНОГО ВЕКТОРА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ СЕРДЦА И ДРУГИХ

ПАТОЛОГИЙ

<130> INX00339WO2

<140> PCT/US2016/061668

<141> 2016-11-11

<150> 62/254,139

<151> 2015-11-11

<160> 127

<210> 1

<211> 5350

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 1

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

tcgctgctgg cgcggtccgc tatgaggtct ctgatagacc acagacgcgt cgacattgat 120

tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 180

agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 240

gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 300

gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 360

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 420

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 480

ctattaccat gggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc 540

tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg 600

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 660

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 720

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 780

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 840

gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 900

gcgcttggtt taatgacggc tcgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttaaagggct 960

ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1020

tggggagcgc cgcgtgcggc ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg ggcgcggcgc 1080

ggggctttgt gcgctccgcg tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg 1140

tgcggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag 1200

cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt aacccccccc tgcacccccc tccccgagtt 1260

gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtgcgg ggcgtggcgc ggggctcgcc 1320

gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc 1380

ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg 1440

cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt 1500

cccaaatctg gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc accccctcta gcgggcgcgg 1560

gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg 1620

cgccgccgtc cccttctcca tctccagcct cggggctgcc gcagggggac ggctgccttc 1680

gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc tctagagcct 1740

ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac gtgctggttg 1800

ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tccctgcagg aaattgagcc cgcagcctcc 1860

cgcttcgctc tctgctcctc ctgttcgaca gtcagccgca tcttcttttg cgtcgccagc 1920

cgagccacat cgctcagaca ccgctagcat gggcagcgaa ctggaaaccg ccatggagac 1980

tttgataaat gttttccacg cgcatagcgg caaagaaggg gacaagtaca agctgtcaaa 2040

aaaggagctg aaagaactgc tgcagaccga attgagcggc ttcctggacg ctcagaaaga 2100

tgtcgatgcc gtcgacaaag tgatgaaaga gcttgacgag aacggtgacg gtgaagtcga 2160

ttttcaggaa tatgtggtgc tggtggccgc ccttactgta gcatgcaaca atttcttttg 2220

ggaaaattca agagccaaga gggcaccggt gaaacagact ttgaattttg accttctgaa 2280

gttggcagga gacgttgagt ccaaccctgg gcccatgaat gccaaggtcg ttgtggtgct 2340

tgtacttgtg ctgactgctc tgtgtctgag cgacggaaaa ccagtctccc tcagctacag 2400

gtgcccatgc cgattcttcg aatctcatgt ggcccgggcc aatgtgaagc acttgaaaat 2460

cctgaataca cccaactgcg cgttgcagat cgtggcccgc ctgaaaaata ataataggca 2520

ggtatgtatc gatccaaagc ttaagtggat ccaggagtat ctggaaaagg ctctcaataa 2580

ataaatcgat tacgctcctc tactctttga gacatcactg gcctataata aatgggttaa 2640

tttatgtaac aaaattgcct tggcttgtta actttattag acattctgat gtttgcattg 2700

tgtaaatact gttgtattgg aaaagcgtgc caagatggat tattgtaatt cagtgtcttt 2760

tttagtagcg tcacgtgcca aacactgtta gtcacagagg gcatgagaca gcctgtgctg 2820

gaacagctca gttcataggg ctatggagat ggggagaaag gggcgcttct gtcagagaca 2880

agctgtggtc tgggaaggcc ttagcactaa aagcaccaca atgagaagca accgccagaa 2940

gcagggcccg caggcctttg ttccagctgc aaagagaaag gaaaaagtgg ggaataagag 3000

ttggggctgc ggagggggtg gggagcattg tgcaggttcc gtacttgaac agaaagcagg 3060

gaccaacaca aggaaggctc gagctggcgg aataggttcc aatctgtcgc ggccgcatta 3120

ccctgttatc cctaatctcg tttaactatg actctcttaa ggtagccaaa ttccggaact 3180

ataaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca 3240

taaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgcg cttccgcttc 3300

ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 3360

aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 3420

aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 3480

gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 3540

gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 3600

tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 3660

ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 3720

ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 3780

tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 3840

tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 3900

ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 3960

aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 4020

ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 4080

tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 4140

atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta 4200

aagtatatat gagtaaactt ggtctgacat gcgcatctga cgctcagtgg aacgaaaact 4260

cacgttaagg gattttggtc atgcctcaga agaactcgtc aagaaggcga tagaaggcga 4320

tgcgctgcga atcgggagcg gcgataccgt aaagcacgag gaagcggtca gcccattcgc 4380

cgccaagctc ttcagcaata tcacgggtag ccaacgctat gtcctgatag cggtccgcca 4440

cacccagccg gccacagtcg atgaatccag aaaagcggcc attttccacc atgatattcg 4500

gcaagcaggc atcgccatgg gtcacgacga gatcctcgcc gtcgggcatg cgcgccttga 4560

gcctggcgaa cagttcggct ggcgcgagcc cctgatgctc ttcgtccaga tcatcctgat 4620

cgacaagacc ggcttccatc cgagtacgtg ctcgctcgat gcgatgtttc gcttggtggt 4680

cgaatgggca ggtagccgga tcaagcgtat gcagccgccg cattgcatca gccatgatgg 4740

atactttctc ggcaggagca aggtgagatg acaggagatc ctgccccggc acttcgccca 4800

atagcagcca gtcccttccc gcttcagtga caacgtcgag cacagctgcg caaggaacgc 4860

ccgtcgtggc cagccacgat agccgcgctg cctcgtcctg cagttcattc agggcaccgg 4920

acaggtcggt cttgacaaaa agaaccgggc gcccctgcgc tgacagccgg aacacggcgg 4980

catcagagca gccgattgtc tgttgtgccc agtcatagcc gaatagcctc tccacccaag 5040

cggccggaga acctgcgtgc aatccatctt gttcaatcat gcgaaacgat cctcattcat 5100

ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttagg ctgagcatct 5160

atgtcgggtg cggagaaaga ggtaatgaaa tggcaggcgc ctttttcgtt agatatgtag 5220

taagtatctt aatatacagc tttatctgtt ttttaagata cttactactt ttcttagtgg 5280

aaactattag tggctgttaa ttaagctagt actacccaag atttgacaga atgcatcgtt 5340

tgcattcgaa 5350

<210> 2

<211> 5350

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 2

ctagcatgaa tgccaaggtc gttgtggtgc ttgtacttgt gctgactgct ctgtgtctga 60

gcgacggaaa accagtctcc ctcagctaca ggtgcccatg ccgattcttc gaatctcatg 120

tggcccgggc caatgtgaag cacttgaaaa tcctgaatac acccaactgc gcgttgcaga 180

tcgtggcccg cctgaaaaat aataataggc aggtatgtat cgatccaaag cttaagtgga 240

tccaggagta tctggaaaag gctctcaata aaagagccaa gagggcaccg gtgaaacaga 300

ctttgaattt tgaccttctg aagttggcag gagacgttga gtccaaccct gggcccatgg 360

gcagcgaact ggaaaccgcc atggagactt tgataaatgt tttccacgcg catagcggca 420

aagaagggga caagtacaag ctgtcaaaaa aggagctgaa agaactgctg cagaccgaat 480

tgagcggctt cctggacgct cagaaagatg tcgatgccgt cgacaaagtg atgaaagagc 540

ttgacgagaa cggtgacggt gaagtcgatt ttcaggaata tgtggtgctg gtggccgccc 600

ttactgtagc atgcaacaat ttcttttggg aaaattcata aatcgattac gctcctctac 660

tctttgagac atcactggcc tataataaat gggttaattt atgtaacaaa attgccttgg 720

cttgttaact ttattagaca ttctgatgtt tgcattgtgt aaatactgtt gtattggaaa 780

agcgtgccaa gatggattat tgtaattcag tgtctttttt agtagcgtca cgtgccaaac 840

actgttagtc acagagggca tgagacagcc tgtgctggaa cagctcagtt catagggcta 900

tggagatggg gagaaagggg cgcttctgtc agagacaagc tgtggtctgg gaaggcctta 960

gcactaaaag caccacaatg agaagcaacc gccagaagca gggcccgcag gcctttgttc 1020

cagctgcaaa gagaaaggaa aaagtgggga ataagagttg gggctgcgga gggggtgggg 1080

agcattgtgc aggttccgta cttgaacaga aagcagggac caacacaagg aaggctcgag 1140

ctggcggaat aggttccaat ctgtcgcggc cgcattaccc tgttatccct aatctcgttt 1200

aactatgact ctcttaaggt agccaaattc cggaactata aattgcgttg cgctcactgc 1260

ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcataa atgaatcggc caacgcgcgg 1320

ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgcgctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 1380

cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 1440

cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 1500

accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 1560

acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 1620

cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 1680

acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 1740

atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 1800

agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 1860

acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 1920

gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 1980

gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 2040

gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 2100

gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga 2160

acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga 2220

tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt 2280

ctgacatgcg catctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 2340

cctcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg 2400

ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca 2460

cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg 2520

aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc 2580

acgacgagat cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc 2640

gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga 2700

gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca 2760

agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg 2820

tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct 2880

tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc 2940

cgcgctgcct cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga 3000

accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt 3060

tgtgcccagt catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat 3120

ccatcttgtt caatcatgcg aaacgatcct cattcattta tcagggttat tgtctcatga 3180

gcggatacat atttgaatgt atttaggctg agcatctatg tcgggtgcgg agaaagaggt 3240

aatgaaatgg caggcgcctt tttcgttaga tatgtagtaa gtatcttaat atacagcttt 3300

atctgttttt taagatactt actacttttc ttagtggaaa ctattagtgg ctgttaatta 3360

agctagtact acccaagatt tgacagaatg catcgtttgc attcgaataa ctataacggt 3420

cctaaggtag cgacgtacga accgttgggc gcgcctgggg atagcgatcg ctgctggcgc 3480

ggtccgctat gaggtctctg atagaccaca gacgcgtcga cattgattat tgactagtta 3540

ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac 3600

ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc 3660

aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt 3720

ggactattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac 3780

gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac 3840

cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggg 3900

tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 3960

ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg 4020

cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg 4080

gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg 4140

cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgtt gccttcgccc 4200

cgtgccccgc tccgcgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc 4260

ccacaggtga gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagcg cttggtttaa 4320

tgacggctcg tttcttttct gtggctgcgt gaaagcctta aagggctccg ggagggccct 4380

ttgtgcgggg gggagcggct cggggggtgc gtgcgtgtgt gtgtgcgtgg ggagcgccgc 4440

gtgcggcccg cgctgcccgg cggctgtgag cgctgcgggc gcggcgcggg gctttgtgcg 4500

ctccgcgtgt gcgcgagggg agcgcggccg ggggcggtgc cccgcggtgc gggggggctg 4560

cgaggggaac aaaggctgcg tgcggggtgt gtgcgtgggg gggtgagcag ggggtgtggg 4620

cgcggcggtc gggctgtaac ccccccctgc acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc 4680

cggcttcggg tgcggggctc cgtgcggggc gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg 4740

ggtggcggca ggtgggggtg ccgggcgggg cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg 4800

gggaggggcg cggcggcccc ggagcgccgg cggctgtcga ggcgcggcga gccgcagcca 4860

ttgcctttta tggtaatcgt gcgagagggc gcagggactt cctttgtccc aaatctggcg 4920

gagccgaaat ctgggaggcg ccgccgcacc ccctctagcg ggcgcgggcg aagcggtgcg 4980

gcgccggcag gaaggaaatg ggcggggagg gccttcgtgc gtcgccgcgc cgccgtcccc 5040

ttctccatct ccagcctcgg ggctgccgca gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg 5100

cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt 5160

tcatgccttc ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg ctggttgttg tgctgtctca 5220

tcattttggc aaagaattcc ctgcaggaaa ttgagcccgc agcctcccgc ttcgctctct 5280

gctcctcctg ttcgacagtc agccgcatct tcttttgcgt cgccagccga gccacatcgc 5340

tcagacaccg 5350

<210> 3

<211> 5641

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 3

ctagcatgaa tgccaaggtc gttgtggtgc ttgtacttgt gctgactgct ctgtgtctga 60

gcgacggaaa accagtctcc ctcagctaca ggtgcccatg ccgattcttc gaatctcatg 120

tggcccgggc caatgtgaag cacttgaaaa tcctgaatac acccaactgc gcgttgcaga 180

tcgtggcccg cctgaaaaat aataataggc aggtatgtat cgatccaaag cttaagtgga 240

tccaggagta tctggaaaag gctctcaata aaagagccaa gagggcaccg gtgaaacaga 300

ctttgaattt tgaccttctg aagttggcag gagacgttga gtccaaccct gggcccatga 360

attttctgct ctcttgggtg cactggtcac tggcactgct gctgtatctg caccatgcaa 420

aatggtccca agcagctccc atggcagagg gaggtggaca gaatcatcat gaggttgtca 480

aatttatgga tgtctaccag cggagctact gccacccaat tgagacgttg gtagacattt 540

ttcaggaata tccagacgag attgagtaca ttttcaagcc tagctgtgtg cccttgatgc 600

gatgcggtgg ctgttgcaat gatgagggac tcgagtgtgt ccccaccgag gaaagcaata 660

taaccatgca aatcatgcga atcaaacccc accagggcca gcatatcggc gagatgtctt 720

tcttgcaaca taacaaatgc gagtgtcggc caaagaagga cagggctcgc caggaaaatc 780

cctgtggtcc ttgttcagag cgcaggaagc atcttttcgt ccaggatccg cagacttgta 840

aatgttcatg caagaatacc gattctaggt gtaaggcgag gcaactcgag cttaacgaga 900

gaacctgtag gtgtgacaaa cctagaagat aaatcgatta cgctcctcta ctctttgaga 960

catcactggc ctataataaa tgggttaatt tatgtaacaa aattgccttg gcttgttaac 1020

tttattagac attctgatgt ttgcattgtg taaatactgt tgtattggaa aagcgtgcca 1080

agatggatta ttgtaattca gtgtcttttt tagtagcgtc acgtgccaaa cactgttagt 1140

cacagagggc atgagacagc ctgtgctgga acagctcagt tcatagggct atggagatgg 1200

ggagaaaggg gcgcttctgt cagagacaag ctgtggtctg ggaaggcctt agcactaaaa 1260

gcaccacaat gagaagcaac cgccagaagc agggcccgca ggcctttgtt ccagctgcaa 1320

agagaaagga aaaagtgggg aataagagtt ggggctgcgg agggggtggg gagcattgtg 1380

caggttccgt acttgaacag aaagcaggga ccaacacaag gaaggctcga gctggcggaa 1440

taggttccaa tctgtcgcgg ccgcattacc ctgttatccc taatctcgtt taactatgac 1500

tctcttaagg tagccaaatt ccggaactat aaattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc 1560

agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcata aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg 1620

gtttgcgtat tgggcgcgct tccgcttcct cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc 1680

ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat acggttatcc acagaatcag 1740

gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa 1800

aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc 1860

gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata aagataccag gcgtttcccc 1920

ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg 1980

cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt 2040

cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc 2100

gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc 2160

cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag 2220

agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag aacagtattt ggtatctgcg 2280

ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa 2340

ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag 2400

gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact 2460

cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat cttcacctag atccttttaa 2520

attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga gtaaacttgg tctgacatgc 2580

gcatctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gcctcagaag 2640

aactcgtcaa gaaggcgata gaaggcgatg cgctgcgaat cgggagcggc gataccgtaa 2700

agcacgagga agcggtcagc ccattcgccg ccaagctctt cagcaatatc acgggtagcc 2760

aacgctatgt cctgatagcg gtccgccaca cccagccggc cacagtcgat gaatccagaa 2820

aagcggccat tttccaccat gatattcggc aagcaggcat cgccatgggt cacgacgaga 2880

tcctcgccgt cgggcatgcg cgccttgagc ctggcgaaca gttcggctgg cgcgagcccc 2940

tgatgctctt cgtccagatc atcctgatcg acaagaccgg cttccatccg agtacgtgct 3000

cgctcgatgc gatgtttcgc ttggtggtcg aatgggcagg tagccggatc aagcgtatgc 3060

agccgccgca ttgcatcagc catgatggat actttctcgg caggagcaag gtgagatgac 3120

aggagatcct gccccggcac ttcgcccaat agcagccagt cccttcccgc ttcagtgaca 3180

acgtcgagca cagctgcgca aggaacgccc gtcgtggcca gccacgatag ccgcgctgcc 3240

tcgtcctgca gttcattcag ggcaccggac aggtcggtct tgacaaaaag aaccgggcgc 3300

ccctgcgctg acagccggaa cacggcggca tcagagcagc cgattgtctg ttgtgcccag 3360

tcatagccga atagcctctc cacccaagcg gccggagaac ctgcgtgcaa tccatcttgt 3420

tcaatcatgc gaaacgatcc tcattcattt atcagggtta ttgtctcatg agcggataca 3480

tatttgaatg tatttaggct gagcatctat gtcgggtgcg gagaaagagg taatgaaatg 3540

gcaggcgcct ttttcgttag atatgtagta agtatcttaa tatacagctt tatctgtttt 3600

ttaagatact tactactttt cttagtggaa actattagtg gctgttaatt aagctagtac 3660

tacccaagat ttgacagaat gcatcgtttg cattcgaata actataacgg tcctaaggta 3720

gcgacgtacg aaccgttggg cgcgcctggg gatagcgatc gctgctggcg cggtccgcta 3780

tgaggtctct gatagaccac agacgcgtcg acattgatta ttgactagtt attaatagta 3840

atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta cataacttac 3900

ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt caataatgac 3960

gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg tggactattt 4020

acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagta cgccccctat 4080

tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga ccttatggga 4140

ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgg gtcgaggtga 4200

gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct cccccccctc cccaccccca attttgtatt 4260

tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga tgggggcggg gggggggggg gcgcgcgcca 4320

ggcggggcgg ggcggggcga ggggcggggc ggggcgaggc ggagaggtgc ggcggcagcc 4380

aatcagagcg gcgcgctccg aaagtttcct tttatggcga ggcggcggcg gcggcggccc 4440

tataaaaagc gaagcgcgcg gcgggcggga gtcgctgcgt tgccttcgcc ccgtgccccg 4500

ctccgcgccg cctcgcgccg cccgccccgg ctctgactga ccgcgttact cccacaggtg 4560

agcgggcggg acggcccttc tcctccgggc tgtaattagc gcttggttta atgacggctc 4620

gtttcttttc tgtggctgcg tgaaagcctt aaagggctcc gggagggccc tttgtgcggg 4680

ggggagcggc tcggggggtg cgtgcgtgtg tgtgtgcgtg gggagcgccg cgtgcggccc 4740

gcgctgcccg gcggctgtga gcgctgcggg cgcggcgcgg ggctttgtgc gctccgcgtg 4800

tgcgcgaggg gagcgcggcc gggggcggtg ccccgcggtg cgggggggct gcgaggggaa 4860

caaaggctgc gtgcggggtg tgtgcgtggg ggggtgagca gggggtgtgg gcgcggcggt 4920

cgggctgtaa cccccccctg cacccccctc cccgagttgc tgagcacggc ccggcttcgg 4980

gtgcggggct ccgtgcgggg cgtggcgcgg ggctcgccgt gccgggcggg gggtggcggc 5040

aggtgggggt gccgggcggg gcggggccgc ctcgggccgg ggagggctcg ggggaggggc 5100

gcggcggccc cggagcgccg gcggctgtcg aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt 5160

atggtaatcg tgcgagaggg cgcagggact tcctttgtcc caaatctggc ggagccgaaa 5220

tctgggaggc gccgccgcac cccctctagc gggcgcgggc gaagcggtgc ggcgccggca 5280

ggaaggaaat gggcggggag ggccttcgtg cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccatc 5340

tccagcctcg gggctgccgc agggggacgg ctgccttcgg gggggacggg gcagggcggg 5400

gttcggcttc tggcgtgtga ccggcggctc tagagcctct gctaaccatg ttcatgcctt 5460

cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt gctggttgtt gtgctgtctc atcattttgg 5520

caaagaattc cctgcaggaa attgagcccg cagcctcccg cttcgctctc tgctcctcct 5580

gttcgacagt cagccgcatc ttcttttgcg tcgccagccg agccacatcg ctcagacacc 5640

g 5641

<210> 4

<211> 5641

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 4

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

tcgctgctgg cgcggtccgc tatgaggtct ctgatagacc acagacgcgt cgacattgat 120

tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 180

agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 240

gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 300

gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 360

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 420

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 480

ctattaccat gggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc 540

tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg 600

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 660

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 720

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 780

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 840

gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 900

gcgcttggtt taatgacggc tcgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttaaagggct 960

ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1020

tggggagcgc cgcgtgcggc ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg ggcgcggcgc 1080

ggggctttgt gcgctccgcg tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg 1140

tgcggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag 1200

cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt aacccccccc tgcacccccc tccccgagtt 1260

gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtgcgg ggcgtggcgc ggggctcgcc 1320

gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc 1380

ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg 1440

cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt 1500

cccaaatctg gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc accccctcta gcgggcgcgg 1560

gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg 1620

cgccgccgtc cccttctcca tctccagcct cggggctgcc gcagggggac ggctgccttc 1680

gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc tctagagcct 1740

ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac gtgctggttg 1800

ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tccctgcagg aaattgagcc cgcagcctcc 1860

cgcttcgctc tctgctcctc ctgttcgaca gtcagccgca tcttcttttg cgtcgccagc 1920

cgagccacat cgctcagaca ccgctagcat gaattttctg ctctcttggg tgcactggtc 1980

actggcactg ctgctgtatc tgcaccatgc aaaatggtcc caagcagctc ccatggcaga 2040

gggaggtgga cagaatcatc atgaggttgt caaatttatg gatgtctacc agcggagcta 2100

ctgccaccca attgagacgt tggtagacat ttttcaggaa tatccagacg agattgagta 2160

cattttcaag cctagctgtg tgcccttgat gcgatgcggt ggctgttgca atgatgaggg 2220

actcgagtgt gtccccaccg aggaaagcaa tataaccatg caaatcatgc gaatcaaacc 2280

ccaccagggc cagcatatcg gcgagatgtc tttcttgcaa cataacaaat gcgagtgtcg 2340

gccaaagaag gacagggctc gccaggaaaa tccctgtggt ccttgttcag agcgcaggaa 2400

gcatcttttc gtccaggatc cgcagacttg taaatgttca tgcaagaata ccgattctag 2460

gtgtaaggcg aggcaactcg agcttaacga gagaacctgt aggtgtgaca aacctagaag 2520

aagagccaag agggcaccgg tgaaacagac tttgaatttt gaccttctga agttggcagg 2580

agacgttgag tccaaccctg ggcccatgaa tgccaaggtc gttgtggtgc ttgtacttgt 2640

gctgactgct ctgtgtctga gcgacggaaa accagtctcc ctcagctaca ggtgcccatg 2700

ccgattcttc gaatctcatg tggcccgggc caatgtgaag cacttgaaaa tcctgaatac 2760

acccaactgc gcgttgcaga tcgtggcccg cctgaaaaat aataataggc aggtatgtat 2820

cgatccaaag cttaagtgga tccaggagta tctggaaaag gctctcaata aataaatcga 2880

ttacgctcct ctactctttg agacatcact ggcctataat aaatgggtta atttatgtaa 2940

caaaattgcc ttggcttgtt aactttatta gacattctga tgtttgcatt gtgtaaatac 3000

tgttgtattg gaaaagcgtg ccaagatgga ttattgtaat tcagtgtctt ttttagtagc 3060

gtcacgtgcc aaacactgtt agtcacagag ggcatgagac agcctgtgct ggaacagctc 3120

agttcatagg gctatggaga tggggagaaa ggggcgcttc tgtcagagac aagctgtggt 3180

ctgggaaggc cttagcacta aaagcaccac aatgagaagc aaccgccaga agcagggccc 3240

gcaggccttt gttccagctg caaagagaaa ggaaaaagtg gggaataaga gttggggctg 3300

cggagggggt ggggagcatt gtgcaggttc cgtacttgaa cagaaagcag ggaccaacac 3360

aaggaaggct cgagctggcg gaataggttc caatctgtcg cggccgcatt accctgttat 3420

ccctaatctc gtttaactat gactctctta aggtagccaa attccggaac tataaattgc 3480

gttgcgctca ctgcccgctt tccagtcggg aaacctgtcg tgccagctgc ataaatgaat 3540

cggccaacgc gcggggagag gcggtttgcg tattgggcgc gcttccgctt cctcgctcac 3600

tgactcgctg cgctcggtcg ttcggctgcg gcgagcggta tcagctcact caaaggcggt 3660

aatacggtta tccacagaat caggggataa cgcaggaaag aacatgtgag caaaaggcca 3720

gcaaaaggcc aggaaccgta aaaaggccgc gttgctggcg tttttccata ggctccgccc 3780

ccctgacgag catcacaaaa atcgacgctc aagtcagagg tggcgaaacc cgacaggact 3840

ataaagatac caggcgtttc cccctggaag ctccctcgtg cgctctcctg ttccgaccct 3900

gccgcttacc ggatacctgt ccgcctttct cccttcggga agcgtggcgc tttctcatag 3960

ctcacgctgt aggtatctca gttcggtgta ggtcgttcgc tccaagctgg gctgtgtgca 4020

cgaacccccc gttcagcccg accgctgcgc cttatccggt aactatcgtc ttgagtccaa 4080

cccggtaaga cacgacttat cgccactggc agcagccact ggtaacagga ttagcagagc 4140

gaggtatgta ggcggtgcta cagagttctt gaagtggtgg cctaactacg gctacactag 4200

aagaacagta tttggtatct gcgctctgct gaagccagtt accttcggaa aaagagttgg 4260

tagctcttga tccggcaaac aaaccaccgc tggtagcggt ggtttttttg tttgcaagca 4320

gcagattacg cgcagaaaaa aaggatctca agaagatcct ttgatctttt ctacggggtc 4380

tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg gtcatgagat tatcaaaaag 4440

gatcttcacc tagatccttt taaattaaaa atgaagtttt aaatcaatct aaagtatata 4500

tgagtaaact tggtctgaca tgcgcatctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag 4560

ggattttggt catgcctcag aagaactcgt caagaaggcg atagaaggcg atgcgctgcg 4620

aatcgggagc ggcgataccg taaagcacga ggaagcggtc agcccattcg ccgccaagct 4680

cttcagcaat atcacgggta gccaacgcta tgtcctgata gcggtccgcc acacccagcc 4740

ggccacagtc gatgaatcca gaaaagcggc cattttccac catgatattc ggcaagcagg 4800

catcgccatg ggtcacgacg agatcctcgc cgtcgggcat gcgcgccttg agcctggcga 4860

acagttcggc tggcgcgagc ccctgatgct cttcgtccag atcatcctga tcgacaagac 4920

cggcttccat ccgagtacgt gctcgctcga tgcgatgttt cgcttggtgg tcgaatgggc 4980

aggtagccgg atcaagcgta tgcagccgcc gcattgcatc agccatgatg gatactttct 5040

cggcaggagc aaggtgagat gacaggagat cctgccccgg cacttcgccc aatagcagcc 5100

agtcccttcc cgcttcagtg acaacgtcga gcacagctgc gcaaggaacg cccgtcgtgg 5160

ccagccacga tagccgcgct gcctcgtcct gcagttcatt cagggcaccg gacaggtcgg 5220

tcttgacaaa aagaaccggg cgcccctgcg ctgacagccg gaacacggcg gcatcagagc 5280

agccgattgt ctgttgtgcc cagtcatagc cgaatagcct ctccacccaa gcggccggag 5340

aacctgcgtg caatccatct tgttcaatca tgcgaaacga tcctcattca tttatcaggg 5400

ttattgtctc atgagcggat acatatttga atgtatttag gctgagcatc tatgtcgggt 5460

gcggagaaag aggtaatgaa atggcaggcg cctttttcgt tagatatgta gtaagtatct 5520

taatatacag ctttatctgt tttttaagat acttactact tttcttagtg gaaactatta 5580

gtggctgtta attaagctag tactacccaa gatttgacag aatgcatcgt ttgcattcga 5640

a 5641

<210> 5

<211> 5332

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 5

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

tcgctgctgg cgcggtccgc tatgaggtct ctgatagacc acagacgcgt cgacattgat 120

tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 180

agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 240

gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 300

gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 360

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 420

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 480

ctattaccat gggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc 540

tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg 600

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 660

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 720

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 780

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 840

gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 900

gcgcttggtt taatgacggc tcgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttaaagggct 960

ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1020

tggggagcgc cgcgtgcggc ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg ggcgcggcgc 1080

ggggctttgt gcgctccgcg tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg 1140

tgcggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag 1200

cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt aacccccccc tgcacccccc tccccgagtt 1260

gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtgcgg ggcgtggcgc ggggctcgcc 1320

gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc 1380

ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg 1440

cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt 1500

cccaaatctg gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc accccctcta gcgggcgcgg 1560

gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg 1620

cgccgccgtc cccttctcca tctccagcct cggggctgcc gcagggggac ggctgccttc 1680

gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc tctagagcct 1740

ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac gtgctggttg 1800

ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tccctgcagg aaattgagcc cgcagcctcc 1860

cgcttcgctc tctgctcctc ctgttcgaca gtcagccgca tcttcttttg cgtcgccagc 1920

cgagccacat cgctcagaca ccgctagcat gggcagcgaa ctggaaaccg ccatggagac 1980

tttgataaat gttttccacg cgcatagcgg caaagaaggg gacaagtaca agctgtcaaa 2040

aaaggagctg aaagaactgc tgcagaccga attgagcggc ttcctggacg ctcagaaaga 2100

tgtcgatgcc gtcgacaaag tgatgaaaga gcttgacgag aacggtgacg gtgaagtcga 2160

ttttcaggaa tatgtggtgc tggtggccgc ccttactgta gcatgcaaca atttcttttg 2220

ggaaaattca ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga 2280

ggagaaccct ggacctatga atgccaaggt cgttgtggtg cttgtacttg tgctgactgc 2340

tctgtgtctg agcgacggaa aaccagtctc cctcagctac aggtgcccat gccgattctt 2400

cgaatctcat gtggcccggg ccaatgtgaa gcacttgaaa atcctgaata cacccaactg 2460

cgcgttgcag atcgtggccc gcctgaaaaa taataatagg caggtatgta tcgatccaaa 2520

gcttaagtgg atccaggagt atctggaaaa ggctctcaat aaataaatcg attacgctcc 2580

tctactcttt gagacatcac tggcctataa taaatgggtt aatttatgta acaaaattgc 2640

cttggcttgt taactttatt agacattctg atgtttgcat tgtgtaaata ctgttgtatt 2700

ggaaaagcgt gccaagatgg attattgtaa ttcagtgtct tttttagtag cgtcacgtgc 2760

caaacactgt tagtcacaga gggcatgaga cagcctgtgc tggaacagct cagttcatag 2820

ggctatggag atggggagaa aggggcgctt ctgtcagaga caagctgtgg tctgggaagg 2880

ccttagcact aaaagcacca caatgagaag caaccgccag aagcagggcc cgcaggcctt 2940

tgttccagct gcaaagagaa aggaaaaagt ggggaataag agttggggct gcggaggggg 3000

tggggagcat tgtgcaggtt ccgtacttga acagaaagca gggaccaaca caaggaaggc 3060

tcgagctggc ggaataggtt ccaatctgtc gcggccgcat taccctgtta tccctaatct 3120

cgtttaacta tgactctctt aaggtagcca aattccggaa ctataaattg cgttgcgctc 3180

actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cataaatgaa tcggccaacg 3240

cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg cgcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 3300

gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 3360

atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 3420

caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 3480

gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 3540

ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 3600

cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 3660

taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 3720

cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 3780

acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 3840

aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt 3900

atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 3960

atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 4020

gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 4080

gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac 4140

ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 4200

ttggtctgac atgcgcatct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 4260

tcatgcctca gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc gaatcgggag 4320

cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc tcttcagcaa 4380

tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc cggccacagt 4440

cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag gcatcgccat 4500

gggtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca tgcgcgcctt gagcctggcg aacagttcgg 4560

ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga ccggcttcca 4620

tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg caggtagccg 4680

gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc tcggcaggag 4740

caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc cagtcccttc 4800

ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg gccagccacg 4860

atagccgcgc tgcctcgtcc tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg gtcttgacaa 4920

aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag cagccgattg 4980

tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga gaacctgcgt 5040

gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg atcctcattc atttatcagg gttattgtct 5100

catgagcgga tacatatttg aatgtattta ggctgagcat ctatgtcggg tgcggagaaa 5160

gaggtaatga aatggcaggc gcctttttcg ttagatatgt agtaagtatc ttaatataca 5220

gctttatctg ttttttaaga tacttactac ttttcttagt ggaaactatt agtggctgtt 5280

aattaagcta gtactaccca agatttgaca gaatgcatcg tttgcattcg aa 5332

<210> 6

<211> 5332

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 6

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

tcgctgctgg cgcggtccgc tatgaggtct ctgatagacc acagacgcgt cgacattgat 120

tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 180

agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 240

gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 300

gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 360

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 420

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 480

ctattaccat gggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc 540

tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg 600

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 660

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 720

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 780

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 840

gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 900

gcgcttggtt taatgacggc tcgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttaaagggct 960

ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1020

tggggagcgc cgcgtgcggc ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg ggcgcggcgc 1080

ggggctttgt gcgctccgcg tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg 1140

tgcggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag 1200

cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt aacccccccc tgcacccccc tccccgagtt 1260

gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtgcgg ggcgtggcgc ggggctcgcc 1320

gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc 1380

ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg 1440

cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt 1500

cccaaatctg gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc accccctcta gcgggcgcgg 1560

gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg 1620

cgccgccgtc cccttctcca tctccagcct cggggctgcc gcagggggac ggctgccttc 1680

gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc tctagagcct 1740

ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac gtgctggttg 1800

ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tccctgcagg aaattgagcc cgcagcctcc 1860

cgcttcgctc tctgctcctc ctgttcgaca gtcagccgca tcttcttttg cgtcgccagc 1920

cgagccacat cgctcagaca ccgctagcat gaatgccaag gtcgttgtgg tgcttgtact 1980

tgtgctgact gctctgtgtc tgagcgacgg aaaaccagtc tccctcagct acaggtgccc 2040

atgccgattc ttcgaatctc atgtggcccg ggccaatgtg aagcacttga aaatcctgaa 2100

tacacccaac tgcgcgttgc agatcgtggc ccgcctgaaa aataataata ggcaggtatg 2160

tatcgatcca aagcttaagt ggatccagga gtatctggaa aaggctctca ataaaggaag 2220

cggagctact aacttcagcc tgctgaagca ggctggagac gtggaggaga accctggacc 2280

tatgggcagc gaactggaaa ccgccatgga gactttgata aatgttttcc acgcgcatag 2340

cggcaaagaa ggggacaagt acaagctgtc aaaaaaggag ctgaaagaac tgctgcagac 2400

cgaattgagc ggcttcctgg acgctcagaa agatgtcgat gccgtcgaca aagtgatgaa 2460

agagcttgac gagaacggtg acggtgaagt cgattttcag gaatatgtgg tgctggtggc 2520

cgcccttact gtagcatgca acaatttctt ttgggaaaat tcataaatcg attacgctcc 2580

tctactcttt gagacatcac tggcctataa taaatgggtt aatttatgta acaaaattgc 2640

cttggcttgt taactttatt agacattctg atgtttgcat tgtgtaaata ctgttgtatt 2700

ggaaaagcgt gccaagatgg attattgtaa ttcagtgtct tttttagtag cgtcacgtgc 2760

caaacactgt tagtcacaga gggcatgaga cagcctgtgc tggaacagct cagttcatag 2820

ggctatggag atggggagaa aggggcgctt ctgtcagaga caagctgtgg tctgggaagg 2880

ccttagcact aaaagcacca caatgagaag caaccgccag aagcagggcc cgcaggcctt 2940

tgttccagct gcaaagagaa aggaaaaagt ggggaataag agttggggct gcggaggggg 3000

tggggagcat tgtgcaggtt ccgtacttga acagaaagca gggaccaaca caaggaaggc 3060

tcgagctggc ggaataggtt ccaatctgtc gcggccgcat taccctgtta tccctaatct 3120

cgtttaacta tgactctctt aaggtagcca aattccggaa ctataaattg cgttgcgctc 3180

actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cataaatgaa tcggccaacg 3240

cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg cgcttccgct tcctcgctca ctgactcgct 3300

gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg taatacggtt 3360

atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 3420

caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 3480

gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 3540

ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 3600

cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 3660

taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 3720

cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 3780

acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 3840

aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt 3900

atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg gtagctcttg 3960

atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 4020

gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 4080

gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac 4140

ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgagtaaac 4200

ttggtctgac atgcgcatct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 4260

tcatgcctca gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc gaatcgggag 4320

cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc tcttcagcaa 4380

tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc cggccacagt 4440

cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag gcatcgccat 4500

gggtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca tgcgcgcctt gagcctggcg aacagttcgg 4560

ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga ccggcttcca 4620

tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg caggtagccg 4680

gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc tcggcaggag 4740

caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc cagtcccttc 4800

ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg gccagccacg 4860

atagccgcgc tgcctcgtcc tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg gtcttgacaa 4920

aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag cagccgattg 4980

tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga gaacctgcgt 5040

gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg atcctcattc atttatcagg gttattgtct 5100

catgagcgga tacatatttg aatgtattta ggctgagcat ctatgtcggg tgcggagaaa 5160

gaggtaatga aatggcaggc gcctttttcg ttagatatgt agtaagtatc ttaatataca 5220

gctttatctg ttttttaaga tacttactac ttttcttagt ggaaactatt agtggctgtt 5280

aattaagcta gtactaccca agatttgaca gaatgcatcg tttgcattcg aa 5332

<210> 7

<211> 5623

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 7

ctagcatgaa tgccaaggtc gttgtggtgc ttgtacttgt gctgactgct ctgtgtctga 60

gcgacggaaa accagtctcc ctcagctaca ggtgcccatg ccgattcttc gaatctcatg 120

tggcccgggc caatgtgaag cacttgaaaa tcctgaatac acccaactgc gcgttgcaga 180

tcgtggcccg cctgaaaaat aataataggc aggtatgtat cgatccaaag cttaagtgga 240

tccaggagta tctggaaaag gctctcaata aaggaagcgg agctactaac ttcagcctgc 300

tgaagcaggc tggagacgtg gaggagaacc ctggacctat gaattttctg ctctcttggg 360

tgcactggtc actggcactg ctgctgtatc tgcaccatgc aaaatggtcc caagcagctc 420

ccatggcaga gggaggtgga cagaatcatc atgaggttgt caaatttatg gatgtctacc 480

agcggagcta ctgccaccca attgagacgt tggtagacat ttttcaggaa tatccagacg 540

agattgagta cattttcaag cctagctgtg tgcccttgat gcgatgcggt ggctgttgca 600

atgatgaggg actcgagtgt gtccccaccg aggaaagcaa tataaccatg caaatcatgc 660

gaatcaaacc ccaccagggc cagcatatcg gcgagatgtc tttcttgcaa cataacaaat 720

gcgagtgtcg gccaaagaag gacagggctc gccaggaaaa tccctgtggt ccttgttcag 780

agcgcaggaa gcatcttttc gtccaggatc cgcagacttg taaatgttca tgcaagaata 840

ccgattctag gtgtaaggcg aggcaactcg agcttaacga gagaacctgt aggtgtgaca 900

aacctagaag ataaatcgat tacgctcctc tactctttga gacatcactg gcctataata 960

aatgggttaa tttatgtaac aaaattgcct tggcttgtta actttattag acattctgat 1020

gtttgcattg tgtaaatact gttgtattgg aaaagcgtgc caagatggat tattgtaatt 1080

cagtgtcttt tttagtagcg tcacgtgcca aacactgtta gtcacagagg gcatgagaca 1140

gcctgtgctg gaacagctca gttcataggg ctatggagat ggggagaaag gggcgcttct 1200

gtcagagaca agctgtggtc tgggaaggcc ttagcactaa aagcaccaca atgagaagca 1260

accgccagaa gcagggcccg caggcctttg ttccagctgc aaagagaaag gaaaaagtgg 1320

ggaataagag ttggggctgc ggagggggtg gggagcattg tgcaggttcc gtacttgaac 1380

agaaagcagg gaccaacaca aggaaggctc gagctggcgg aataggttcc aatctgtcgc 1440

ggccgcatta ccctgttatc cctaatctcg tttaactatg actctcttaa ggtagccaaa 1500

ttccggaact ataaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt 1560

gccagctgca taaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgcg 1620

cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat 1680

cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 1740

acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 1800

ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 1860

ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 1920

gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 1980

gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 2040

ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 2100

actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 2160

gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 2220

ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 2280

ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 2340

gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 2400

tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 2460

tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 2520

aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacat gcgcatctga cgctcagtgg 2580

aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgcctcaga agaactcgtc aagaaggcga 2640

tagaaggcga tgcgctgcga atcgggagcg gcgataccgt aaagcacgag gaagcggtca 2700

gcccattcgc cgccaagctc ttcagcaata tcacgggtag ccaacgctat gtcctgatag 2760

cggtccgcca cacccagccg gccacagtcg atgaatccag aaaagcggcc attttccacc 2820

atgatattcg gcaagcaggc atcgccatgg gtcacgacga gatcctcgcc gtcgggcatg 2880

cgcgccttga gcctggcgaa cagttcggct ggcgcgagcc cctgatgctc ttcgtccaga 2940

tcatcctgat cgacaagacc ggcttccatc cgagtacgtg ctcgctcgat gcgatgtttc 3000

gcttggtggt cgaatgggca ggtagccgga tcaagcgtat gcagccgccg cattgcatca 3060

gccatgatgg atactttctc ggcaggagca aggtgagatg acaggagatc ctgccccggc 3120

acttcgccca atagcagcca gtcccttccc gcttcagtga caacgtcgag cacagctgcg 3180

caaggaacgc ccgtcgtggc cagccacgat agccgcgctg cctcgtcctg cagttcattc 3240

agggcaccgg acaggtcggt cttgacaaaa agaaccgggc gcccctgcgc tgacagccgg 3300

aacacggcgg catcagagca gccgattgtc tgttgtgccc agtcatagcc gaatagcctc 3360

tccacccaag cggccggaga acctgcgtgc aatccatctt gttcaatcat gcgaaacgat 3420

cctcattcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttagg 3480

ctgagcatct atgtcgggtg cggagaaaga ggtaatgaaa tggcaggcgc ctttttcgtt 3540

agatatgtag taagtatctt aatatacagc tttatctgtt ttttaagata cttactactt 3600

ttcttagtgg aaactattag tggctgttaa ttaagctagt actacccaag atttgacaga 3660

atgcatcgtt tgcattcgaa taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg 3720

ggcgcgcctg gggatagcga tcgctgctgg cgcggtccgc tatgaggtct ctgatagacc 3780

acagacgcgt cgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt 3840

agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg 3900

ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac 3960

gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt 4020

ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa 4080

atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta 4140

catctacgta ttagtcatcg ctattaccat gggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca 4200

ctctccccat ctcccccccc tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat 4260

tttgtgcagc gatgggggcg gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc 4320

gaggggcggg gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc 4380

cgaaagtttc cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg 4440

cggcgggcgg gagtcgctgc gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc 4500

cgcccgcccc ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct 4560

tctcctccgg gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc tcgtttcttt tctgtggctg 4620

cgtgaaagcc ttaaagggct ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg gctcgggggg 4680

tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg tggggagcgc cgcgtgcggc ccgcgctgcc cggcggctgt 4740

gagcgctgcg ggcgcggcgc ggggctttgt gcgctccgcg tgtgcgcgag gggagcgcgg 4800

ccgggggcgg tgccccgcgg tgcggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg 4860

tgtgtgcgtg ggggggtgag cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt aacccccccc 4920

tgcacccccc tccccgagtt gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtgcgg 4980

ggcgtggcgc ggggctcgcc gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg 5040

gggcggggcc gcctcgggcc ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc cccggagcgc 5100

cggcggctgt cgaggcgcgg cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag 5160

ggcgcaggga cttcctttgt cccaaatctg gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc 5220

accccctcta gcgggcgcgg gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg 5280

agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctcca tctccagcct cggggctgcc 5340

gcagggggac ggctgccttc gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt 5400

gaccggcggc tctagagcct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct 5460

cctgggcaac gtgctggttg ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tccctgcagg 5520

aaattgagcc cgcagcctcc cgcttcgctc tctgctcctc ctgttcgaca gtcagccgca 5580

tcttcttttg cgtcgccagc cgagccacat cgctcagaca ccg 5623

<210> 8

<211> 5623

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 8

ctagcatgaa ttttctgctc tcttgggtgc actggtcact ggcactgctg ctgtatctgc 60

accatgcaaa atggtcccaa gcagctccca tggcagaggg aggtggacag aatcatcatg 120

aggttgtcaa atttatggat gtctaccagc ggagctactg ccacccaatt gagacgttgg 180

tagacatttt tcaggaatat ccagacgaga ttgagtacat tttcaagcct agctgtgtgc 240

ccttgatgcg atgcggtggc tgttgcaatg atgagggact cgagtgtgtc cccaccgagg 300

aaagcaatat aaccatgcaa atcatgcgaa tcaaacccca ccagggccag catatcggcg 360

agatgtcttt cttgcaacat aacaaatgcg agtgtcggcc aaagaaggac agggctcgcc 420

aggaaaatcc ctgtggtcct tgttcagagc gcaggaagca tcttttcgtc caggatccgc 480

agacttgtaa atgttcatgc aagaataccg attctaggtg taaggcgagg caactcgagc 540

ttaacgagag aacctgtagg tgtgacaaac ctagaagagg aagcggagct actaacttca 600

gcctgctgaa gcaggctgga gacgtggagg agaaccctgg acctatgaat gccaaggtcg 660

ttgtggtgct tgtacttgtg ctgactgctc tgtgtctgag cgacggaaaa ccagtctccc 720

tcagctacag gtgcccatgc cgattcttcg aatctcatgt ggcccgggcc aatgtgaagc 780

acttgaaaat cctgaataca cccaactgcg cgttgcagat cgtggcccgc ctgaaaaata 840

ataataggca ggtatgtatc gatccaaagc ttaagtggat ccaggagtat ctggaaaagg 900

ctctcaataa ataaatcgat tacgctcctc tactctttga gacatcactg gcctataata 960

aatgggttaa tttatgtaac aaaattgcct tggcttgtta actttattag acattctgat 1020

gtttgcattg tgtaaatact gttgtattgg aaaagcgtgc caagatggat tattgtaatt 1080

cagtgtcttt tttagtagcg tcacgtgcca aacactgtta gtcacagagg gcatgagaca 1140

gcctgtgctg gaacagctca gttcataggg ctatggagat ggggagaaag gggcgcttct 1200

gtcagagaca agctgtggtc tgggaaggcc ttagcactaa aagcaccaca atgagaagca 1260

accgccagaa gcagggcccg caggcctttg ttccagctgc aaagagaaag gaaaaagtgg 1320

ggaataagag ttggggctgc ggagggggtg gggagcattg tgcaggttcc gtacttgaac 1380

agaaagcagg gaccaacaca aggaaggctc gagctggcgg aataggttcc aatctgtcgc 1440

ggccgcatta ccctgttatc cctaatctcg tttaactatg actctcttaa ggtagccaaa 1500

ttccggaact ataaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt 1560

gccagctgca taaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgcg 1620

cttccgcttc ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat 1680

cagctcactc aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga 1740

acatgtgagc aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt 1800

ttttccatag gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt 1860

ggcgaaaccc gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc 1920

gctctcctgt tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa 1980

gcgtggcgct ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct 2040

ccaagctggg ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta 2100

actatcgtct tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg 2160

gtaacaggat tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc 2220

ctaactacgg ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta 2280

ccttcggaaa aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg 2340

gtttttttgt ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt 2400

tgatcttttc tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg 2460

tcatgagatt atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta 2520

aatcaatcta aagtatatat gagtaaactt ggtctgacat gcgcatctga cgctcagtgg 2580

aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgcctcaga agaactcgtc aagaaggcga 2640

tagaaggcga tgcgctgcga atcgggagcg gcgataccgt aaagcacgag gaagcggtca 2700

gcccattcgc cgccaagctc ttcagcaata tcacgggtag ccaacgctat gtcctgatag 2760

cggtccgcca cacccagccg gccacagtcg atgaatccag aaaagcggcc attttccacc 2820

atgatattcg gcaagcaggc atcgccatgg gtcacgacga gatcctcgcc gtcgggcatg 2880

cgcgccttga gcctggcgaa cagttcggct ggcgcgagcc cctgatgctc ttcgtccaga 2940

tcatcctgat cgacaagacc ggcttccatc cgagtacgtg ctcgctcgat gcgatgtttc 3000

gcttggtggt cgaatgggca ggtagccgga tcaagcgtat gcagccgccg cattgcatca 3060

gccatgatgg atactttctc ggcaggagca aggtgagatg acaggagatc ctgccccggc 3120

acttcgccca atagcagcca gtcccttccc gcttcagtga caacgtcgag cacagctgcg 3180

caaggaacgc ccgtcgtggc cagccacgat agccgcgctg cctcgtcctg cagttcattc 3240

agggcaccgg acaggtcggt cttgacaaaa agaaccgggc gcccctgcgc tgacagccgg 3300

aacacggcgg catcagagca gccgattgtc tgttgtgccc agtcatagcc gaatagcctc 3360

tccacccaag cggccggaga acctgcgtgc aatccatctt gttcaatcat gcgaaacgat 3420

cctcattcat ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttagg 3480

ctgagcatct atgtcgggtg cggagaaaga ggtaatgaaa tggcaggcgc ctttttcgtt 3540

agatatgtag taagtatctt aatatacagc tttatctgtt ttttaagata cttactactt 3600

ttcttagtgg aaactattag tggctgttaa ttaagctagt actacccaag atttgacaga 3660

atgcatcgtt tgcattcgaa taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg 3720

ggcgcgcctg gggatagcga tcgctgctgg cgcggtccgc tatgaggtct ctgatagacc 3780

acagacgcgt cgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt 3840

agttcatagc ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg 3900

ctgaccgccc aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac 3960

gccaataggg actttccatt gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt 4020

ggcagtacat caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa 4080

atggcccgcc tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta 4140

catctacgta ttagtcatcg ctattaccat gggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca 4200

ctctccccat ctcccccccc tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat 4260

tttgtgcagc gatgggggcg gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc 4320

gaggggcggg gcggggcgag gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc 4380

cgaaagtttc cttttatggc gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg 4440

cggcgggcgg gagtcgctgc gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc 4500

cgcccgcccc ggctctgact gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct 4560

tctcctccgg gctgtaatta gcgcttggtt taatgacggc tcgtttcttt tctgtggctg 4620

cgtgaaagcc ttaaagggct ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg gctcgggggg 4680

tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg tggggagcgc cgcgtgcggc ccgcgctgcc cggcggctgt 4740

gagcgctgcg ggcgcggcgc ggggctttgt gcgctccgcg tgtgcgcgag gggagcgcgg 4800

ccgggggcgg tgccccgcgg tgcggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg 4860

tgtgtgcgtg ggggggtgag cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt aacccccccc 4920

tgcacccccc tccccgagtt gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtgcgg 4980

ggcgtggcgc ggggctcgcc gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg 5040

gggcggggcc gcctcgggcc ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc cccggagcgc 5100

cggcggctgt cgaggcgcgg cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag 5160

ggcgcaggga cttcctttgt cccaaatctg gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc 5220

accccctcta gcgggcgcgg gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg 5280

agggccttcg tgcgtcgccg cgccgccgtc cccttctcca tctccagcct cggggctgcc 5340

gcagggggac ggctgccttc gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt 5400

gaccggcggc tctagagcct ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct 5460

cctgggcaac gtgctggttg ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tccctgcagg 5520

aaattgagcc cgcagcctcc cgcttcgctc tctgctcctc ctgttcgaca gtcagccgca 5580

tcttcttttg cgtcgccagc cgagccacat cgctcagaca ccg 5623

<210> 9

<211> 5359

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 9

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

tcgctgctgg cgcggtccgc tatgaggtct ctgatagacc acagacgcgt cgacattgat 120

tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 180

agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 240

gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 300

gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 360

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 420

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 480

ctattaccat gggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc 540

tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg 600

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 660

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 720

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 780

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 840

gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 900

gcgcttggtt taatgacggc tcgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttaaagggct 960

ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1020

tggggagcgc cgcgtgcggc ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg ggcgcggcgc 1080

ggggctttgt gcgctccgcg tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg 1140

tgcggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag 1200

cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt aacccccccc tgcacccccc tccccgagtt 1260

gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtgcgg ggcgtggcgc ggggctcgcc 1320

gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc 1380

ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg 1440

cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt 1500

cccaaatctg gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc accccctcta gcgggcgcgg 1560

gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg 1620

cgccgccgtc cccttctcca tctccagcct cggggctgcc gcagggggac ggctgccttc 1680

gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc tctagagcct 1740

ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac gtgctggttg 1800

ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tccctgcagg aaattgagcc cgcagcctcc 1860

cgcttcgctc tctgctcctc ctgttcgaca gtcagccgca tcttcttttg cgtcgccagc 1920

cgagccacat cgctcagaca ccgctagcat gggcagcgaa ctggaaaccg ccatggagac 1980

tttgataaat gttttccacg cgcatagcgg caaagaaggg gacaagtaca agctgtcaaa 2040

aaaggagctg aaagaactgc tgcagaccga attgagcggc ttcctggacg ctcagaaaga 2100

tgtcgatgcc gtcgacaaag tgatgaaaga gcttgacgag aacggtgacg gtgaagtcga 2160

ttttcaggaa tatgtggtgc tggtggccgc ccttactgta gcatgcaaca atttcttttg 2220

ggaaaattca cgtgcaaagc gtgcaccggt gaaacaggga agcggagcta ctaacttcag 2280

cctgctgaag caggctggag acgtggagga gaaccctgga cctatgaatg ccaaggtcgt 2340

tgtggtgctt gtacttgtgc tgactgctct gtgtctgagc gacggaaaac cagtctccct 2400

cagctacagg tgcccatgcc gattcttcga atctcatgtg gcccgggcca atgtgaagca 2460

cttgaaaatc ctgaatacac ccaactgcgc gttgcagatc gtggcccgcc tgaaaaataa 2520

taataggcag gtatgtatcg atccaaagct taagtggatc caggagtatc tggaaaaggc 2580

tctcaataaa taaatcgatt acgctcctct actctttgag acatcactgg cctataataa 2640

atgggttaat ttatgtaaca aaattgcctt ggcttgttaa ctttattaga cattctgatg 2700

tttgcattgt gtaaatactg ttgtattgga aaagcgtgcc aagatggatt attgtaattc 2760

agtgtctttt ttagtagcgt cacgtgccaa acactgttag tcacagaggg catgagacag 2820

cctgtgctgg aacagctcag ttcatagggc tatggagatg gggagaaagg ggcgcttctg 2880

tcagagacaa gctgtggtct gggaaggcct tagcactaaa agcaccacaa tgagaagcaa 2940

ccgccagaag cagggcccgc aggcctttgt tccagctgca aagagaaagg aaaaagtggg 3000

gaataagagt tggggctgcg gagggggtgg ggagcattgt gcaggttccg tacttgaaca 3060

gaaagcaggg accaacacaa ggaaggctcg agctggcgga ataggttcca atctgtcgcg 3120

gccgcattac cctgttatcc ctaatctcgt ttaactatga ctctcttaag gtagccaaat 3180

tccggaacta taaattgcgt tgcgctcact gcccgctttc cagtcgggaa acctgtcgtg 3240

ccagctgcat aaatgaatcg gccaacgcgc ggggagaggc ggtttgcgta ttgggcgcgc 3300

ttccgcttcc tcgctcactg actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc gagcggtatc 3360

agctcactca aaggcggtaa tacggttatc cacagaatca ggggataacg caggaaagaa 3420

catgtgagca aaaggccagc aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt tgctggcgtt 3480

tttccatagg ctccgccccc ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa gtcagaggtg 3540

gcgaaacccg acaggactat aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct ccctcgtgcg 3600

ctctcctgtt ccgaccctgc cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cttcgggaag 3660

cgtggcgctt tctcatagct cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg tcgttcgctc 3720

caagctgggc tgtgtgcacg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct tatccggtaa 3780

ctatcgtctt gagtccaacc cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag cagccactgg 3840

taacaggatt agcagagcga ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga agtggtggcc 3900

taactacggc tacactagaa gaacagtatt tggtatctgc gctctgctga agccagttac 3960

cttcggaaaa agagttggta gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg gtagcggtgg 4020

tttttttgtt tgcaagcagc agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag aagatccttt 4080

gatcttttct acggggtctg acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag ggattttggt 4140

catgagatta tcaaaaagga tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat gaagttttaa 4200

atcaatctaa agtatatatg agtaaacttg gtctgacatg cgcatctgac gctcagtgga 4260

acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgcctcagaa gaactcgtca agaaggcgat 4320

agaaggcgat gcgctgcgaa tcgggagcgg cgataccgta aagcacgagg aagcggtcag 4380

cccattcgcc gccaagctct tcagcaatat cacgggtagc caacgctatg tcctgatagc 4440

ggtccgccac acccagccgg ccacagtcga tgaatccaga aaagcggcca ttttccacca 4500

tgatattcgg caagcaggca tcgccatggg tcacgacgag atcctcgccg tcgggcatgc 4560

gcgccttgag cctggcgaac agttcggctg gcgcgagccc ctgatgctct tcgtccagat 4620

catcctgatc gacaagaccg gcttccatcc gagtacgtgc tcgctcgatg cgatgtttcg 4680

cttggtggtc gaatgggcag gtagccggat caagcgtatg cagccgccgc attgcatcag 4740

ccatgatgga tactttctcg gcaggagcaa ggtgagatga caggagatcc tgccccggca 4800

cttcgcccaa tagcagccag tcccttcccg cttcagtgac aacgtcgagc acagctgcgc 4860

aaggaacgcc cgtcgtggcc agccacgata gccgcgctgc ctcgtcctgc agttcattca 4920

gggcaccgga caggtcggtc ttgacaaaaa gaaccgggcg cccctgcgct gacagccgga 4980

acacggcggc atcagagcag ccgattgtct gttgtgccca gtcatagccg aatagcctct 5040

ccacccaagc ggccggagaa cctgcgtgca atccatcttg ttcaatcatg cgaaacgatc 5100

ctcattcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat gtatttaggc 5160

tgagcatcta tgtcgggtgc ggagaaagag gtaatgaaat ggcaggcgcc tttttcgtta 5220

gatatgtagt aagtatctta atatacagct ttatctgttt tttaagatac ttactacttt 5280

tcttagtgga aactattagt ggctgttaat taagctagta ctacccaaga tttgacagaa 5340

tgcatcgttt gcattcgaa 5359

<210> 10

<211> 5359

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 10

ctagcatgaa tgccaaggtc gttgtggtgc ttgtacttgt gctgactgct ctgtgtctga 60

gcgacggaaa accagtctcc ctcagctaca ggtgcccatg ccgattcttc gaatctcatg 120

tggcccgggc caatgtgaag cacttgaaaa tcctgaatac acccaactgc gcgttgcaga 180

tcgtggcccg cctgaaaaat aataataggc aggtatgtat cgatccaaag cttaagtgga 240

tccaggagta tctggaaaag gctctcaata aacgtgcaaa gcgtgcaccg gtgaaacagg 300

gaagcggagc tactaacttc agcctgctga agcaggctgg agacgtggag gagaaccctg 360

gacctatggg cagcgaactg gaaaccgcca tggagacttt gataaatgtt ttccacgcgc 420

atagcggcaa agaaggggac aagtacaagc tgtcaaaaaa ggagctgaaa gaactgctgc 480

agaccgaatt gagcggcttc ctggacgctc agaaagatgt cgatgccgtc gacaaagtga 540

tgaaagagct tgacgagaac ggtgacggtg aagtcgattt tcaggaatat gtggtgctgg 600

tggccgccct tactgtagca tgcaacaatt tcttttggga aaattcataa atcgattacg 660

ctcctctact ctttgagaca tcactggcct ataataaatg ggttaattta tgtaacaaaa 720

ttgccttggc ttgttaactt tattagacat tctgatgttt gcattgtgta aatactgttg 780

tattggaaaa gcgtgccaag atggattatt gtaattcagt gtctttttta gtagcgtcac 840

gtgccaaaca ctgttagtca cagagggcat gagacagcct gtgctggaac agctcagttc 900

atagggctat ggagatgggg agaaaggggc gcttctgtca gagacaagct gtggtctggg 960

aaggccttag cactaaaagc accacaatga gaagcaaccg ccagaagcag ggcccgcagg 1020

cctttgttcc agctgcaaag agaaaggaaa aagtggggaa taagagttgg ggctgcggag 1080

ggggtgggga gcattgtgca ggttccgtac ttgaacagaa agcagggacc aacacaagga 1140

aggctcgagc tggcggaata ggttccaatc tgtcgcggcc gcattaccct gttatcccta 1200

atctcgttta actatgactc tcttaaggta gccaaattcc ggaactataa attgcgttgc 1260

gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca gctgcataaa tgaatcggcc 1320

aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgcgcttc cgcttcctcg ctcactgact 1380

cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac 1440

ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa 1500

aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg 1560

acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa 1620

gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc 1680

ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac 1740

gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac 1800

cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg 1860

taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa caggattagc agagcgaggt 1920

atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa 1980

cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct 2040

cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga 2100

ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat cttttctacg gggtctgacg 2160

ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat gagattatca aaaaggatct 2220

tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt 2280

aaacttggtc tgacatgcgc atctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 2340

ttggtcatgc ctcagaagaa ctcgtcaaga aggcgataga aggcgatgcg ctgcgaatcg 2400

ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag cggtcagccc attcgccgcc aagctcttca 2460

gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc tgatagcggt ccgccacacc cagccggcca 2520

cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt tccaccatga tattcggcaa gcaggcatcg 2580

ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg ggcatgcgcg ccttgagcct ggcgaacagt 2640

tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg tccagatcat cctgatcgac aagaccggct 2700

tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga tgtttcgctt ggtggtcgaa tgggcaggta 2760

gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca tgatggatac tttctcggca 2820

ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc cccggcactt cgcccaatag cagccagtcc 2880

cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagc 2940

cacgatagcc gcgctgcctc gtcctgcagt tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg 3000

acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca cggcggcatc agagcagccg 3060

attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca cccaagcggc cggagaacct 3120

gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga aacgatcctc attcatttat cagggttatt 3180

gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttaggctga gcatctatgt cgggtgcgga 3240

gaaagaggta atgaaatggc aggcgccttt ttcgttagat atgtagtaag tatcttaata 3300

tacagcttta tctgtttttt aagatactta ctacttttct tagtggaaac tattagtggc 3360

tgttaattaa gctagtacta cccaagattt gacagaatgc atcgtttgca ttcgaataac 3420

tataacggtc ctaaggtagc gacgtacgaa ccgttgggcg cgcctgggga tagcgatcgc 3480

tgctggcgcg gtccgctatg aggtctctga tagaccacag acgcgtcgac attgattatt 3540

gactagttat taatagtaat caattacggg gtcattagtt catagcccat atatggagtt 3600

ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc 3660

attgacgtca ataatgacgt atgttcccat agtaacgcca atagggactt tccattgacg 3720

tcaatgggtg gactatttac ggtaaactgc ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat 3780

gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca 3840

gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat 3900

taccatgggt cgaggtgagc cccacgttct gcttcactct ccccatctcc cccccctccc 3960

cacccccaat tttgtattta tttatttttt aattattttg tgcagcgatg ggggcggggg 4020

gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg 4080

agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg 4140

cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga agcgcgcggc gggcgggagt cgctgcgttg 4200

ccttcgcccc gtgccccgct ccgcgccgcc tcgcgccgcc cgccccggct ctgactgacc 4260

gcgttactcc cacaggtgag cgggcgggac ggcccttctc ctccgggctg taattagcgc 4320

ttggtttaat gacggctcgt ttcttttctg tggctgcgtg aaagccttaa agggctccgg 4380

gagggccctt tgtgcggggg ggagcggctc ggggggtgcg tgcgtgtgtg tgtgcgtggg 4440

gagcgccgcg tgcggcccgc gctgcccggc ggctgtgagc gctgcgggcg cggcgcgggg 4500

ctttgtgcgc tccgcgtgtg cgcgagggga gcgcggccgg gggcggtgcc ccgcggtgcg 4560

ggggggctgc gaggggaaca aaggctgcgt gcggggtgtg tgcgtggggg ggtgagcagg 4620

gggtgtgggc gcggcggtcg ggctgtaacc cccccctgca cccccctccc cgagttgctg 4680

agcacggccc ggcttcgggt gcggggctcc gtgcggggcg tggcgcgggg ctcgccgtgc 4740

cgggcggggg gtggcggcag gtgggggtgc cgggcggggc ggggccgcct cgggccgggg 4800

agggctcggg ggaggggcgc ggcggccccg gagcgccggc ggctgtcgag gcgcggcgag 4860

ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg cagggacttc ctttgtccca 4920

aatctggcgg agccgaaatc tgggaggcgc cgccgcaccc cctctagcgg gcgcgggcga 4980

agcggtgcgg cgccggcagg aaggaaatgg gcggggaggg ccttcgtgcg tcgccgcgcc 5040

gccgtcccct tctccatctc cagcctcggg gctgccgcag ggggacggct gccttcgggg 5100

gggacggggc agggcggggt tcggcttctg gcgtgtgacc ggcggctcta gagcctctgc 5160

taaccatgtt catgccttct tctttttcct acagctcctg ggcaacgtgc tggttgttgt 5220

gctgtctcat cattttggca aagaattccc tgcaggaaat tgagcccgca gcctcccgct 5280

tcgctctctg ctcctcctgt tcgacagtca gccgcatctt cttttgcgtc gccagccgag 5340

ccacatcgct cagacaccg 5359

<210> 11

<211> 5650

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 11

ctagcatgaa tgccaaggtc gttgtggtgc ttgtacttgt gctgactgct ctgtgtctga 60

gcgacggaaa accagtctcc ctcagctaca ggtgcccatg ccgattcttc gaatctcatg 120

tggcccgggc caatgtgaag cacttgaaaa tcctgaatac acccaactgc gcgttgcaga 180

tcgtggcccg cctgaaaaat aataataggc aggtatgtat cgatccaaag cttaagtgga 240

tccaggagta tctggaaaag gctctcaata aacgtgcaaa gcgtgcaccg gtgaaacagg 300

gaagcggagc tactaacttc agcctgctga agcaggctgg agacgtggag gagaaccctg 360

gacctatgaa ttttctgctc tcttgggtgc actggtcact ggcactgctg ctgtatctgc 420

accatgcaaa atggtcccaa gcagctccca tggcagaggg aggtggacag aatcatcatg 480

aggttgtcaa atttatggat gtctaccagc ggagctactg ccacccaatt gagacgttgg 540

tagacatttt tcaggaatat ccagacgaga ttgagtacat tttcaagcct agctgtgtgc 600

ccttgatgcg atgcggtggc tgttgcaatg atgagggact cgagtgtgtc cccaccgagg 660

aaagcaatat aaccatgcaa atcatgcgaa tcaaacccca ccagggccag catatcggcg 720

agatgtcttt cttgcaacat aacaaatgcg agtgtcggcc aaagaaggac agggctcgcc 780

aggaaaatcc ctgtggtcct tgttcagagc gcaggaagca tcttttcgtc caggatccgc 840

agacttgtaa atgttcatgc aagaataccg attctaggtg taaggcgagg caactcgagc 900

ttaacgagag aacctgtagg tgtgacaaac ctagaagata aatcgattac gctcctctac 960

tctttgagac atcactggcc tataataaat gggttaattt atgtaacaaa attgccttgg 1020

cttgttaact ttattagaca ttctgatgtt tgcattgtgt aaatactgtt gtattggaaa 1080

agcgtgccaa gatggattat tgtaattcag tgtctttttt agtagcgtca cgtgccaaac 1140

actgttagtc acagagggca tgagacagcc tgtgctggaa cagctcagtt catagggcta 1200

tggagatggg gagaaagggg cgcttctgtc agagacaagc tgtggtctgg gaaggcctta 1260

gcactaaaag caccacaatg agaagcaacc gccagaagca gggcccgcag gcctttgttc 1320

cagctgcaaa gagaaaggaa aaagtgggga ataagagttg gggctgcgga gggggtgggg 1380

agcattgtgc aggttccgta cttgaacaga aagcagggac caacacaagg aaggctcgag 1440

ctggcggaat aggttccaat ctgtcgcggc cgcattaccc tgttatccct aatctcgttt 1500

aactatgact ctcttaaggt agccaaattc cggaactata aattgcgttg cgctcactgc 1560

ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcataa atgaatcggc caacgcgcgg 1620

ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgcgctt ccgcttcctc gctcactgac tcgctgcgct 1680

cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa ggcggtaata cggttatcca 1740

cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa aggccagcaa aaggccagga 1800

accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct ccgcccccct gacgagcatc 1860

acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac aggactataa agataccagg 1920

cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc gaccctgccg cttaccggat 1980

acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc tcatagctca cgctgtaggt 2040

atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg tgtgcacgaa ccccccgttc 2100

agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga gtccaacccg gtaagacacg 2160

acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag cagagcgagg tatgtaggcg 2220

gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta cactagaaga acagtatttg 2280

gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag agttggtagc tcttgatccg 2340

gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg caagcagcag attacgcgca 2400

gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac ggggtctgac gctcagtgga 2460

acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc aaaaaggatc ttcacctaga 2520

tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag tatatatgag taaacttggt 2580

ctgacatgcg catctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg 2640

cctcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc gctgcgaatc gggagcggcg 2700

ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc caagctcttc agcaatatca 2760

cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac ccagccggcc acagtcgatg 2820

aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca agcaggcatc gccatgggtc 2880

acgacgagat cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc tggcgaacag ttcggctggc 2940

gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga caagaccggc ttccatccga 3000

gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga atgggcaggt agccggatca 3060

agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata ctttctcggc aggagcaagg 3120

tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata gcagccagtc ccttcccgct 3180

tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg tcgtggccag ccacgatagc 3240

cgcgctgcct cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca ggtcggtctt gacaaaaaga 3300

accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac acggcggcat cagagcagcc gattgtctgt 3360

tgtgcccagt catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg ccggagaacc tgcgtgcaat 3420

ccatcttgtt caatcatgcg aaacgatcct cattcattta tcagggttat tgtctcatga 3480

gcggatacat atttgaatgt atttaggctg agcatctatg tcgggtgcgg agaaagaggt 3540

aatgaaatgg caggcgcctt tttcgttaga tatgtagtaa gtatcttaat atacagcttt 3600

atctgttttt taagatactt actacttttc ttagtggaaa ctattagtgg ctgttaatta 3660

agctagtact acccaagatt tgacagaatg catcgtttgc attcgaataa ctataacggt 3720

cctaaggtag cgacgtacga accgttgggc gcgcctgggg atagcgatcg ctgctggcgc 3780

ggtccgctat gaggtctctg atagaccaca gacgcgtcga cattgattat tgactagtta 3840

ttaatagtaa tcaattacgg ggtcattagt tcatagccca tatatggagt tccgcgttac 3900

ataacttacg gtaaatggcc cgcctggctg accgcccaac gacccccgcc cattgacgtc 3960

aataatgacg tatgttccca tagtaacgcc aatagggact ttccattgac gtcaatgggt 4020

ggactattta cggtaaactg cccacttggc agtacatcaa gtgtatcata tgccaagtac 4080

gccccctatt gacgtcaatg acggtaaatg gcccgcctgg cattatgccc agtacatgac 4140

cttatgggac tttcctactt ggcagtacat ctacgtatta gtcatcgcta ttaccatggg 4200

tcgaggtgag ccccacgttc tgcttcactc tccccatctc ccccccctcc ccacccccaa 4260

ttttgtattt atttattttt taattatttt gtgcagcgat gggggcgggg gggggggggg 4320

cgcgcgccag gcggggcggg gcggggcgag gggcggggcg gggcgaggcg gagaggtgcg 4380

gcggcagcca atcagagcgg cgcgctccga aagtttcctt ttatggcgag gcggcggcgg 4440

cggcggccct ataaaaagcg aagcgcgcgg cgggcgggag tcgctgcgtt gccttcgccc 4500

cgtgccccgc tccgcgccgc ctcgcgccgc ccgccccggc tctgactgac cgcgttactc 4560

ccacaggtga gcgggcggga cggcccttct cctccgggct gtaattagcg cttggtttaa 4620

tgacggctcg tttcttttct gtggctgcgt gaaagcctta aagggctccg ggagggccct 4680

ttgtgcgggg gggagcggct cggggggtgc gtgcgtgtgt gtgtgcgtgg ggagcgccgc 4740

gtgcggcccg cgctgcccgg cggctgtgag cgctgcgggc gcggcgcggg gctttgtgcg 4800

ctccgcgtgt gcgcgagggg agcgcggccg ggggcggtgc cccgcggtgc gggggggctg 4860

cgaggggaac aaaggctgcg tgcggggtgt gtgcgtgggg gggtgagcag ggggtgtggg 4920

cgcggcggtc gggctgtaac ccccccctgc acccccctcc ccgagttgct gagcacggcc 4980

cggcttcggg tgcggggctc cgtgcggggc gtggcgcggg gctcgccgtg ccgggcgggg 5040

ggtggcggca ggtgggggtg ccgggcgggg cggggccgcc tcgggccggg gagggctcgg 5100

gggaggggcg cggcggcccc ggagcgccgg cggctgtcga ggcgcggcga gccgcagcca 5160

ttgcctttta tggtaatcgt gcgagagggc gcagggactt cctttgtccc aaatctggcg 5220

gagccgaaat ctgggaggcg ccgccgcacc ccctctagcg ggcgcgggcg aagcggtgcg 5280

gcgccggcag gaaggaaatg ggcggggagg gccttcgtgc gtcgccgcgc cgccgtcccc 5340

ttctccatct ccagcctcgg ggctgccgca gggggacggc tgccttcggg ggggacgggg 5400

cagggcgggg ttcggcttct ggcgtgtgac cggcggctct agagcctctg ctaaccatgt 5460

tcatgccttc ttctttttcc tacagctcct gggcaacgtg ctggttgttg tgctgtctca 5520

tcattttggc aaagaattcc ctgcaggaaa ttgagcccgc agcctcccgc ttcgctctct 5580

gctcctcctg ttcgacagtc agccgcatct tcttttgcgt cgccagccga gccacatcgc 5640

tcagacaccg 5650

<210> 12

<211> 5650

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 12

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

tcgctgctgg cgcggtccgc tatgaggtct ctgatagacc acagacgcgt cgacattgat 120

tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 180

agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 240

gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 300

gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 360

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 420

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 480

ctattaccat gggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc 540

tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg 600

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 660

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 720

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 780

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 840

gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 900

gcgcttggtt taatgacggc tcgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttaaagggct 960

ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1020

tggggagcgc cgcgtgcggc ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg ggcgcggcgc 1080

ggggctttgt gcgctccgcg tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg 1140

tgcggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag 1200

cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt aacccccccc tgcacccccc tccccgagtt 1260

gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtgcgg ggcgtggcgc ggggctcgcc 1320

gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc 1380

ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg 1440

cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt 1500

cccaaatctg gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc accccctcta gcgggcgcgg 1560

gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg 1620

cgccgccgtc cccttctcca tctccagcct cggggctgcc gcagggggac ggctgccttc 1680

gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc tctagagcct 1740

ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac gtgctggttg 1800

ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tccctgcagg aaattgagcc cgcagcctcc 1860

cgcttcgctc tctgctcctc ctgttcgaca gtcagccgca tcttcttttg cgtcgccagc 1920

cgagccacat cgctcagaca ccgctagcat gaattttctg ctctcttggg tgcactggtc 1980

actggcactg ctgctgtatc tgcaccatgc aaaatggtcc caagcagctc ccatggcaga 2040

gggaggtgga cagaatcatc atgaggttgt caaatttatg gatgtctacc agcggagcta 2100

ctgccaccca attgagacgt tggtagacat ttttcaggaa tatccagacg agattgagta 2160

cattttcaag cctagctgtg tgcccttgat gcgatgcggt ggctgttgca atgatgaggg 2220

actcgagtgt gtccccaccg aggaaagcaa tataaccatg caaatcatgc gaatcaaacc 2280

ccaccagggc cagcatatcg gcgagatgtc tttcttgcaa cataacaaat gcgagtgtcg 2340

gccaaagaag gacagggctc gccaggaaaa tccctgtggt ccttgttcag agcgcaggaa 2400

gcatcttttc gtccaggatc cgcagacttg taaatgttca tgcaagaata ccgattctag 2460

gtgtaaggcg aggcaactcg agcttaacga gagaacctgt aggtgtgaca aacctagaag 2520

acgtgcaaag cgtgcaccgg tgaaacaggg aagcggagct actaacttca gcctgctgaa 2580

gcaggctgga gacgtggagg agaaccctgg acctatgaat gccaaggtcg ttgtggtgct 2640

tgtacttgtg ctgactgctc tgtgtctgag cgacggaaaa ccagtctccc tcagctacag 2700

gtgcccatgc cgattcttcg aatctcatgt ggcccgggcc aatgtgaagc acttgaaaat 2760

cctgaataca cccaactgcg cgttgcagat cgtggcccgc ctgaaaaata ataataggca 2820

ggtatgtatc gatccaaagc ttaagtggat ccaggagtat ctggaaaagg ctctcaataa 2880

ataaatcgat tacgctcctc tactctttga gacatcactg gcctataata aatgggttaa 2940

tttatgtaac aaaattgcct tggcttgtta actttattag acattctgat gtttgcattg 3000

tgtaaatact gttgtattgg aaaagcgtgc caagatggat tattgtaatt cagtgtcttt 3060

tttagtagcg tcacgtgcca aacactgtta gtcacagagg gcatgagaca gcctgtgctg 3120

gaacagctca gttcataggg ctatggagat ggggagaaag gggcgcttct gtcagagaca 3180

agctgtggtc tgggaaggcc ttagcactaa aagcaccaca atgagaagca accgccagaa 3240

gcagggcccg caggcctttg ttccagctgc aaagagaaag gaaaaagtgg ggaataagag 3300

ttggggctgc ggagggggtg gggagcattg tgcaggttcc gtacttgaac agaaagcagg 3360

gaccaacaca aggaaggctc gagctggcgg aataggttcc aatctgtcgc ggccgcatta 3420

ccctgttatc cctaatctcg tttaactatg actctcttaa ggtagccaaa ttccggaact 3480

ataaattgcg ttgcgctcac tgcccgcttt ccagtcggga aacctgtcgt gccagctgca 3540

taaatgaatc ggccaacgcg cggggagagg cggtttgcgt attgggcgcg cttccgcttc 3600

ctcgctcact gactcgctgc gctcggtcgt tcggctgcgg cgagcggtat cagctcactc 3660

aaaggcggta atacggttat ccacagaatc aggggataac gcaggaaaga acatgtgagc 3720

aaaaggccag caaaaggcca ggaaccgtaa aaaggccgcg ttgctggcgt ttttccatag 3780

gctccgcccc cctgacgagc atcacaaaaa tcgacgctca agtcagaggt ggcgaaaccc 3840

gacaggacta taaagatacc aggcgtttcc ccctggaagc tccctcgtgc gctctcctgt 3900

tccgaccctg ccgcttaccg gatacctgtc cgcctttctc ccttcgggaa gcgtggcgct 3960

ttctcatagc tcacgctgta ggtatctcag ttcggtgtag gtcgttcgct ccaagctggg 4020

ctgtgtgcac gaaccccccg ttcagcccga ccgctgcgcc ttatccggta actatcgtct 4080

tgagtccaac ccggtaagac acgacttatc gccactggca gcagccactg gtaacaggat 4140

tagcagagcg aggtatgtag gcggtgctac agagttcttg aagtggtggc ctaactacgg 4200

ctacactaga agaacagtat ttggtatctg cgctctgctg aagccagtta ccttcggaaa 4260

aagagttggt agctcttgat ccggcaaaca aaccaccgct ggtagcggtg gtttttttgt 4320

ttgcaagcag cagattacgc gcagaaaaaa aggatctcaa gaagatcctt tgatcttttc 4380

tacggggtct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa gggattttgg tcatgagatt 4440

atcaaaaagg atcttcacct agatcctttt aaattaaaaa tgaagtttta aatcaatcta 4500

aagtatatat gagtaaactt ggtctgacat gcgcatctga cgctcagtgg aacgaaaact 4560

cacgttaagg gattttggtc atgcctcaga agaactcgtc aagaaggcga tagaaggcga 4620

tgcgctgcga atcgggagcg gcgataccgt aaagcacgag gaagcggtca gcccattcgc 4680

cgccaagctc ttcagcaata tcacgggtag ccaacgctat gtcctgatag cggtccgcca 4740

cacccagccg gccacagtcg atgaatccag aaaagcggcc attttccacc atgatattcg 4800

gcaagcaggc atcgccatgg gtcacgacga gatcctcgcc gtcgggcatg cgcgccttga 4860

gcctggcgaa cagttcggct ggcgcgagcc cctgatgctc ttcgtccaga tcatcctgat 4920

cgacaagacc ggcttccatc cgagtacgtg ctcgctcgat gcgatgtttc gcttggtggt 4980

cgaatgggca ggtagccgga tcaagcgtat gcagccgccg cattgcatca gccatgatgg 5040

atactttctc ggcaggagca aggtgagatg acaggagatc ctgccccggc acttcgccca 5100

atagcagcca gtcccttccc gcttcagtga caacgtcgag cacagctgcg caaggaacgc 5160

ccgtcgtggc cagccacgat agccgcgctg cctcgtcctg cagttcattc agggcaccgg 5220

acaggtcggt cttgacaaaa agaaccgggc gcccctgcgc tgacagccgg aacacggcgg 5280

catcagagca gccgattgtc tgttgtgccc agtcatagcc gaatagcctc tccacccaag 5340

cggccggaga acctgcgtgc aatccatctt gttcaatcat gcgaaacgat cctcattcat 5400

ttatcagggt tattgtctca tgagcggata catatttgaa tgtatttagg ctgagcatct 5460

atgtcgggtg cggagaaaga ggtaatgaaa tggcaggcgc ctttttcgtt agatatgtag 5520

taagtatctt aatatacagc tttatctgtt ttttaagata cttactactt ttcttagtgg 5580

aaactattag tggctgttaa ttaagctagt actacccaag atttgacaga atgcatcgtt 5640

tgcattcgaa 5650

<210> 13

<211> 5665

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 13

ctagcatgaa ttttctgctc tcttgggtgc actggtcact ggcactgctg ctgtatctgc 60

accatgcaaa atggtcccaa gcagctccca tggcagaggg aggtggacag aatcatcatg 120

aggttgtcaa atttatggat gtctaccagc ggagctactg ccacccaatt gagacgttgg 180

tagacatttt tcaggaatat ccagacgaga ttgagtacat tttcaagcct agctgtgtgc 240

ccttgatgcg atgcggtggc tgttgcaatg atgagggact cgagtgtgtc cccaccgagg 300

aaagcaatat aaccatgcaa atcatgcgaa tcaaacccca ccagggccag catatcggcg 360

agatgtcttt cttgcaacat aacaaatgcg agtgtcggcc aaagaaggac agggctcgcc 420

aggaaaatcc ctgtggtcct tgttcagagc gcaggaagca tcttttcgtc caggatccgc 480

agacttgtaa atgttcatgc aagaataccg attctaggtg taaggcgagg caactcgagc 540

ttaacgagag aacctgtagg tgtgacaaac ctagaagacg tgcaaagcgt gcaccggtga 600

aacagggaag cggagctact aacttcagcc tgctgaagca ggctggagac gtggaggaga 660

accctggacc tatgggcagc gaactggaaa ccgccatgga gactttgata aatgttttcc 720

acgcgcatag cggcaaagaa ggggacaagt acaagctgtc aaaaaaggag ctgaaagaac 780

tgctgcagac cgaattgagc ggcttcctgg acgctcagaa agatgtcgat gccgtcgaca 840

aagtgatgaa agagcttgac gagaacggtg acggtgaagt cgattttcag gaatatgtgg 900

tgctggtggc cgcccttact gtagcatgca acaatttctt ttgggaaaat tcataaatcg 960

attacgctcc tctactcttt gagacatcac tggcctataa taaatgggtt aatttatgta 1020

acaaaattgc cttggcttgt taactttatt agacattctg atgtttgcat tgtgtaaata 1080

ctgttgtatt ggaaaagcgt gccaagatgg attattgtaa ttcagtgtct tttttagtag 1140

cgtcacgtgc caaacactgt tagtcacaga gggcatgaga cagcctgtgc tggaacagct 1200

cagttcatag ggctatggag atggggagaa aggggcgctt ctgtcagaga caagctgtgg 1260

tctgggaagg ccttagcact aaaagcacca caatgagaag caaccgccag aagcagggcc 1320

cgcaggcctt tgttccagct gcaaagagaa aggaaaaagt ggggaataag agttggggct 1380

gcggaggggg tggggagcat tgtgcaggtt ccgtacttga acagaaagca gggaccaaca 1440

caaggaaggc tcgagctggc ggaataggtt ccaatctgtc gcggccgcat taccctgtta 1500

tccctaatct cgtttaacta tgactctctt aaggtagcca aattccggaa ctataaattg 1560

cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cataaatgaa 1620

tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg cgcttccgct tcctcgctca 1680

ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 1740

taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc 1800

agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 1860

cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 1920

tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 1980

tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata 2040

gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 2100

acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 2160

acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 2220

cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 2280

gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg 2340

gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 2400

agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 2460

ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa 2520

ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat 2580

atgagtaaac ttggtctgac atgcgcatct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 2640

gggattttgg tcatgcctca gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc 2700

gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc 2760

tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc 2820

cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag 2880

gcatcgccat gggtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca tgcgcgcctt gagcctggcg 2940

aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga 3000

ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg 3060

caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc 3120

tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc 3180

cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg 3240

gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtcc tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg 3300

gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag 3360

cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga 3420

gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg atcctcattc atttatcagg 3480

gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta ggctgagcat ctatgtcggg 3540

tgcggagaaa gaggtaatga aatggcaggc gcctttttcg ttagatatgt agtaagtatc 3600

ttaatataca gctttatctg ttttttaaga tacttactac ttttcttagt ggaaactatt 3660

agtggctgtt aattaagcta gtactaccca agatttgaca gaatgcatcg tttgcattcg 3720

aataactata acggtcctaa ggtagcgacg tacgaaccgt tgggcgcgcc tggggatagc 3780

gatcgctgct ggcgcggtcc gctatgaggt ctctgataga ccacagacgc gtcgacattg 3840

attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat 3900

ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc 3960

ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca 4020

ttgacgtcaa tgggtggact atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta 4080

tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta 4140

tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat 4200

cgctattacc atgggtcgag gtgagcccca cgttctgctt cactctcccc atctcccccc 4260

cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt attttgtgca gcgatggggg 4320

cggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg 4380

aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg 4440

gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc gggagtcgct 4500

gcgttgcctt cgccccgtgc cccgctccgc gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga 4560

ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat 4620

tagcgcttgg tttaatgacg gctcgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag ccttaaaggg 4680

ctccgggagg gccctttgtg cgggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg tgtgtgtgtg 4740

cgtggggagc gccgcgtgcg gcccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg cgggcgcggc 4800

gcggggcttt gtgcgctccg cgtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 4860

ggtgcggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg tgggggggtg 4920

agcagggggt gtgggcgcgg cggtcgggct gtaacccccc cctgcacccc cctccccgag 4980

ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtgc ggggcgtggc gcggggctcg 5040

ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 5100

ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gccccggagc gccggcggct gtcgaggcgc 5160

ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg gacttccttt 5220

gtcccaaatc tggcggagcc gaaatctggg aggcgccgcc gcaccccctc tagcgggcgc 5280

gggcgaagcg gtgcggcgcc ggcaggaagg aaatgggcgg ggagggcctt cgtgcgtcgc 5340

cgcgccgccg tccccttctc catctccagc ctcggggctg ccgcaggggg acggctgcct 5400

tcggggggga cggggcaggg cggggttcgg cttctggcgt gtgaccggcg gctctagagc 5460

ctctgctaac catgttcatg ccttcttctt tttcctacag ctcctgggca acgtgctggt 5520

tgttgtgctg tctcatcatt ttggcaaaga attccctgca ggaaattgag cccgcagcct 5580

cccgcttcgc tctctgctcc tcctgttcga cagtcagccg catcttcttt tgcgtcgcca 5640

gccgagccac atcgctcaga caccg 5665

<210> 14

<211> 5656

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 14

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

tcgctgctgg cgcggtccgc tatgaggtct ctgatagacc acagacgcgt cgacattgat 120

tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 180

agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 240

gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 300

gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 360

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 420

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 480

ctattaccat gggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc 540

tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg 600

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 660

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 720

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 780

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 840

gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 900

gcgcttggtt taatgacggc tcgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttaaagggct 960

ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1020

tggggagcgc cgcgtgcggc ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg ggcgcggcgc 1080

ggggctttgt gcgctccgcg tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg 1140

tgcggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag 1200

cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt aacccccccc tgcacccccc tccccgagtt 1260

gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtgcgg ggcgtggcgc ggggctcgcc 1320

gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc 1380

ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg 1440

cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt 1500

cccaaatctg gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc accccctcta gcgggcgcgg 1560

gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg 1620

cgccgccgtc cccttctcca tctccagcct cggggctgcc gcagggggac ggctgccttc 1680

gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc tctagagcct 1740

ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac gtgctggttg 1800

ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tccctgcagg aaattgagcc cgcagcctcc 1860

cgcttcgctc tctgctcctc ctgttcgaca gtcagccgca tcttcttttg cgtcgccagc 1920

cgagccacat cgctcagaca ccgctagcat gggcagcgaa ctggaaaccg ccatggagac 1980

tttgataaat gttttccacg cgcatagcgg caaagaaggg gacaagtaca agctgtcaaa 2040

aaaggagctg aaagaactgc tgcagaccga attgagcggc ttcctggacg ctcagaaaga 2100

tgtcgatgcc gtcgacaaag tgatgaaaga gcttgacgag aacggtgacg gtgaagtcga 2160

ttttcaggaa tatgtggtgc tggtggccgc ccttactgta gcatgcaaca atttcttttg 2220

ggaaaattca agagccaaga gggcaccggt gaaacagact ttgaattttg accttctgaa 2280

gttggcagga gacgttgagt ccaaccctgg gcccatgaat tttctgctct cttgggtgca 2340

ctggtcactg gcactgctgc tgtatctgca ccatgcaaaa tggtcccaag cagctcccat 2400

ggcagaggga ggtggacaga atcatcatga ggttgtcaaa tttatggatg tctaccagcg 2460

gagctactgc cacccaattg agacgttggt agacattttt caggaatatc cagacgagat 2520

tgagtacatt ttcaagccta gctgtgtgcc cttgatgcga tgcggtggct gttgcaatga 2580

tgagggactc gagtgtgtcc ccaccgagga aagcaatata accatgcaaa tcatgcgaat 2640

caaaccccac cagggccagc atatcggcga gatgtctttc ttgcaacata acaaatgcga 2700

gtgtcggcca aagaaggaca gggctcgcca ggaaaatccc tgtggtcctt gttcagagcg 2760

caggaagcat cttttcgtcc aggatccgca gacttgtaaa tgttcatgca agaataccga 2820

ttctaggtgt aaggcgaggc aactcgagct taacgagaga acctgtaggt gtgacaaacc 2880

tagaagataa atcgattacg ctcctctact ctttgagaca tcactggcct ataataaatg 2940

ggttaattta tgtaacaaaa ttgccttggc ttgttaactt tattagacat tctgatgttt 3000

gcattgtgta aatactgttg tattggaaaa gcgtgccaag atggattatt gtaattcagt 3060

gtctttttta gtagcgtcac gtgccaaaca ctgttagtca cagagggcat gagacagcct 3120

gtgctggaac agctcagttc atagggctat ggagatgggg agaaaggggc gcttctgtca 3180

gagacaagct gtggtctggg aaggccttag cactaaaagc accacaatga gaagcaaccg 3240

ccagaagcag ggcccgcagg cctttgttcc agctgcaaag agaaaggaaa aagtggggaa 3300

taagagttgg ggctgcggag ggggtgggga gcattgtgca ggttccgtac ttgaacagaa 3360

agcagggacc aacacaagga aggctcgagc tggcggaata ggttccaatc tgtcgcggcc 3420

gcattaccct gttatcccta atctcgttta actatgactc tcttaaggta gccaaattcc 3480

ggaactataa attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 3540

gctgcataaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgcgcttc 3600

cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 3660

tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 3720

gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 3780

ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 3840

aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 3900

tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 3960

ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 4020

gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 4080

tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 4140

caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 4200

ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 4260

cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 4320

ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 4380

cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 4440

gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 4500

aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacatgcgc atctgacgct cagtggaacg 4560

aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatgc ctcagaagaa ctcgtcaaga aggcgataga 4620

aggcgatgcg ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag cggtcagccc 4680

attcgccgcc aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc tgatagcggt 4740

ccgccacacc cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt tccaccatga 4800

tattcggcaa gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg ggcatgcgcg 4860

ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg tccagatcat 4920

cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga tgtttcgctt 4980

ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca 5040

tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc cccggcactt 5100

cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca gctgcgcaag 5160

gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcctgcagt tcattcaggg 5220

caccggacag gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca 5280

cggcggcatc agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca 5340

cccaagcggc cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga aacgatcctc 5400

attcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttaggctga 5460

gcatctatgt cgggtgcgga gaaagaggta atgaaatggc aggcgccttt ttcgttagat 5520

atgtagtaag tatcttaata tacagcttta tctgtttttt aagatactta ctacttttct 5580

tagtggaaac tattagtggc tgttaattaa gctagtacta cccaagattt gacagaatgc 5640

atcgtttgca ttcgaa 5656

<210> 15

<211> 5656

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 15

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

tcgctgctgg cgcggtccgc tatgaggtct ctgatagacc acagacgcgt cgacattgat 120

tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 180

agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 240

gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 300

gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 360

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 420

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 480

ctattaccat gggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc 540

tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg 600

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 660

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 720

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 780

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 840

gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 900

gcgcttggtt taatgacggc tcgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttaaagggct 960

ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1020

tggggagcgc cgcgtgcggc ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg ggcgcggcgc 1080

ggggctttgt gcgctccgcg tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg 1140

tgcggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag 1200

cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt aacccccccc tgcacccccc tccccgagtt 1260

gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtgcgg ggcgtggcgc ggggctcgcc 1320

gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc 1380

ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg 1440

cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt 1500

cccaaatctg gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc accccctcta gcgggcgcgg 1560

gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg 1620

cgccgccgtc cccttctcca tctccagcct cggggctgcc gcagggggac ggctgccttc 1680

gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc tctagagcct 1740

ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac gtgctggttg 1800

ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tccctgcagg aaattgagcc cgcagcctcc 1860

cgcttcgctc tctgctcctc ctgttcgaca gtcagccgca tcttcttttg cgtcgccagc 1920

cgagccacat cgctcagaca ccgctagcat gaattttctg ctctcttggg tgcactggtc 1980

actggcactg ctgctgtatc tgcaccatgc aaaatggtcc caagcagctc ccatggcaga 2040

gggaggtgga cagaatcatc atgaggttgt caaatttatg gatgtctacc agcggagcta 2100

ctgccaccca attgagacgt tggtagacat ttttcaggaa tatccagacg agattgagta 2160

cattttcaag cctagctgtg tgcccttgat gcgatgcggt ggctgttgca atgatgaggg 2220

actcgagtgt gtccccaccg aggaaagcaa tataaccatg caaatcatgc gaatcaaacc 2280

ccaccagggc cagcatatcg gcgagatgtc tttcttgcaa cataacaaat gcgagtgtcg 2340

gccaaagaag gacagggctc gccaggaaaa tccctgtggt ccttgttcag agcgcaggaa 2400

gcatcttttc gtccaggatc cgcagacttg taaatgttca tgcaagaata ccgattctag 2460

gtgtaaggcg aggcaactcg agcttaacga gagaacctgt aggtgtgaca aacctagaag 2520

aagagccaag agggcaccgg tgaaacagac tttgaatttt gaccttctga agttggcagg 2580

agacgttgag tccaaccctg ggcccatggg cagcgaactg gaaaccgcca tggagacttt 2640

gataaatgtt ttccacgcgc atagcggcaa agaaggggac aagtacaagc tgtcaaaaaa 2700

ggagctgaaa gaactgctgc agaccgaatt gagcggcttc ctggacgctc agaaagatgt 2760

cgatgccgtc gacaaagtga tgaaagagct tgacgagaac ggtgacggtg aagtcgattt 2820

tcaggaatat gtggtgctgg tggccgccct tactgtagca tgcaacaatt tcttttggga 2880

aaattcataa atcgattacg ctcctctact ctttgagaca tcactggcct ataataaatg 2940

ggttaattta tgtaacaaaa ttgccttggc ttgttaactt tattagacat tctgatgttt 3000

gcattgtgta aatactgttg tattggaaaa gcgtgccaag atggattatt gtaattcagt 3060

gtctttttta gtagcgtcac gtgccaaaca ctgttagtca cagagggcat gagacagcct 3120

gtgctggaac agctcagttc atagggctat ggagatgggg agaaaggggc gcttctgtca 3180

gagacaagct gtggtctggg aaggccttag cactaaaagc accacaatga gaagcaaccg 3240

ccagaagcag ggcccgcagg cctttgttcc agctgcaaag agaaaggaaa aagtggggaa 3300

taagagttgg ggctgcggag ggggtgggga gcattgtgca ggttccgtac ttgaacagaa 3360

agcagggacc aacacaagga aggctcgagc tggcggaata ggttccaatc tgtcgcggcc 3420

gcattaccct gttatcccta atctcgttta actatgactc tcttaaggta gccaaattcc 3480

ggaactataa attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 3540

gctgcataaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgcgcttc 3600

cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 3660

tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 3720

gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 3780

ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 3840

aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 3900

tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 3960

ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 4020

gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 4080

tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 4140

caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 4200

ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 4260

cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 4320

ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 4380

cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 4440

gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 4500

aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacatgcgc atctgacgct cagtggaacg 4560

aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatgc ctcagaagaa ctcgtcaaga aggcgataga 4620

aggcgatgcg ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag cggtcagccc 4680

attcgccgcc aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc tgatagcggt 4740

ccgccacacc cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt tccaccatga 4800

tattcggcaa gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg ggcatgcgcg 4860

ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg tccagatcat 4920

cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga tgtttcgctt 4980

ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca 5040

tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc cccggcactt 5100

cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca gctgcgcaag 5160

gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcctgcagt tcattcaggg 5220

caccggacag gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca 5280

cggcggcatc agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca 5340

cccaagcggc cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga aacgatcctc 5400

attcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttaggctga 5460

gcatctatgt cgggtgcgga gaaagaggta atgaaatggc aggcgccttt ttcgttagat 5520

atgtagtaag tatcttaata tacagcttta tctgtttttt aagatactta ctacttttct 5580

tagtggaaac tattagtggc tgttaattaa gctagtacta cccaagattt gacagaatgc 5640

atcgtttgca ttcgaa 5656

<210> 16

<211> 5638

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 16

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

tcgctgctgg cgcggtccgc tatgaggtct ctgatagacc acagacgcgt cgacattgat 120

tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 180

agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 240

gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 300

gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 360

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 420

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 480

ctattaccat gggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc 540

tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg 600

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 660

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 720

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 780

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 840

gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 900

gcgcttggtt taatgacggc tcgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttaaagggct 960

ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1020

tggggagcgc cgcgtgcggc ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg ggcgcggcgc 1080

ggggctttgt gcgctccgcg tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg 1140

tgcggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag 1200

cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt aacccccccc tgcacccccc tccccgagtt 1260

gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtgcgg ggcgtggcgc ggggctcgcc 1320

gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc 1380

ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg 1440

cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt 1500

cccaaatctg gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc accccctcta gcgggcgcgg 1560

gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg 1620

cgccgccgtc cccttctcca tctccagcct cggggctgcc gcagggggac ggctgccttc 1680

gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc tctagagcct 1740

ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac gtgctggttg 1800

ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tccctgcagg aaattgagcc cgcagcctcc 1860

cgcttcgctc tctgctcctc ctgttcgaca gtcagccgca tcttcttttg cgtcgccagc 1920

cgagccacat cgctcagaca ccgctagcat gggcagcgaa ctggaaaccg ccatggagac 1980

tttgataaat gttttccacg cgcatagcgg caaagaaggg gacaagtaca agctgtcaaa 2040

aaaggagctg aaagaactgc tgcagaccga attgagcggc ttcctggacg ctcagaaaga 2100

tgtcgatgcc gtcgacaaag tgatgaaaga gcttgacgag aacggtgacg gtgaagtcga 2160

ttttcaggaa tatgtggtgc tggtggccgc ccttactgta gcatgcaaca atttcttttg 2220

ggaaaattca ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga 2280

ggagaaccct ggacctatga attttctgct ctcttgggtg cactggtcac tggcactgct 2340

gctgtatctg caccatgcaa aatggtccca agcagctccc atggcagagg gaggtggaca 2400

gaatcatcat gaggttgtca aatttatgga tgtctaccag cggagctact gccacccaat 2460

tgagacgttg gtagacattt ttcaggaata tccagacgag attgagtaca ttttcaagcc 2520

tagctgtgtg cccttgatgc gatgcggtgg ctgttgcaat gatgagggac tcgagtgtgt 2580

ccccaccgag gaaagcaata taaccatgca aatcatgcga atcaaacccc accagggcca 2640

gcatatcggc gagatgtctt tcttgcaaca taacaaatgc gagtgtcggc caaagaagga 2700

cagggctcgc caggaaaatc cctgtggtcc ttgttcagag cgcaggaagc atcttttcgt 2760

ccaggatccg cagacttgta aatgttcatg caagaatacc gattctaggt gtaaggcgag 2820

gcaactcgag cttaacgaga gaacctgtag gtgtgacaaa cctagaagat aaatcgatta 2880

cgctcctcta ctctttgaga catcactggc ctataataaa tgggttaatt tatgtaacaa 2940

aattgccttg gcttgttaac tttattagac attctgatgt ttgcattgtg taaatactgt 3000

tgtattggaa aagcgtgcca agatggatta ttgtaattca gtgtcttttt tagtagcgtc 3060

acgtgccaaa cactgttagt cacagagggc atgagacagc ctgtgctgga acagctcagt 3120

tcatagggct atggagatgg ggagaaaggg gcgcttctgt cagagacaag ctgtggtctg 3180

ggaaggcctt agcactaaaa gcaccacaat gagaagcaac cgccagaagc agggcccgca 3240

ggcctttgtt ccagctgcaa agagaaagga aaaagtgggg aataagagtt ggggctgcgg 3300

agggggtggg gagcattgtg caggttccgt acttgaacag aaagcaggga ccaacacaag 3360

gaaggctcga gctggcggaa taggttccaa tctgtcgcgg ccgcattacc ctgttatccc 3420

taatctcgtt taactatgac tctcttaagg tagccaaatt ccggaactat aaattgcgtt 3480

gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcata aatgaatcgg 3540

ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgcgct tccgcttcct cgctcactga 3600

ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 3660

acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 3720

aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 3780

tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 3840

aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 3900

gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 3960

acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 4020

accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 4080

ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 4140

gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 4200

aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 4260

ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 4320

gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 4380

cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 4440

cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 4500

gtaaacttgg tctgacatgc gcatctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 4560

ttttggtcat gcctcagaag aactcgtcaa gaaggcgata gaaggcgatg cgctgcgaat 4620

cgggagcggc gataccgtaa agcacgagga agcggtcagc ccattcgccg ccaagctctt 4680

cagcaatatc acgggtagcc aacgctatgt cctgatagcg gtccgccaca cccagccggc 4740

cacagtcgat gaatccagaa aagcggccat tttccaccat gatattcggc aagcaggcat 4800

cgccatgggt cacgacgaga tcctcgccgt cgggcatgcg cgccttgagc ctggcgaaca 4860

gttcggctgg cgcgagcccc tgatgctctt cgtccagatc atcctgatcg acaagaccgg 4920

cttccatccg agtacgtgct cgctcgatgc gatgtttcgc ttggtggtcg aatgggcagg 4980

tagccggatc aagcgtatgc agccgccgca ttgcatcagc catgatggat actttctcgg 5040

caggagcaag gtgagatgac aggagatcct gccccggcac ttcgcccaat agcagccagt 5100

cccttcccgc ttcagtgaca acgtcgagca cagctgcgca aggaacgccc gtcgtggcca 5160

gccacgatag ccgcgctgcc tcgtcctgca gttcattcag ggcaccggac aggtcggtct 5220

tgacaaaaag aaccgggcgc ccctgcgctg acagccggaa cacggcggca tcagagcagc 5280

cgattgtctg ttgtgcccag tcatagccga atagcctctc cacccaagcg gccggagaac 5340

ctgcgtgcaa tccatcttgt tcaatcatgc gaaacgatcc tcattcattt atcagggtta 5400

ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttaggct gagcatctat gtcgggtgcg 5460

gagaaagagg taatgaaatg gcaggcgcct ttttcgttag atatgtagta agtatcttaa 5520

tatacagctt tatctgtttt ttaagatact tactactttt cttagtggaa actattagtg 5580

gctgttaatt aagctagtac tacccaagat ttgacagaat gcatcgtttg cattcgaa 5638

<210> 17

<211> 5638

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 17

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

tcgctgctgg cgcggtccgc tatgaggtct ctgatagacc acagacgcgt cgacattgat 120

tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 180

agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 240

gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 300

gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 360

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 420

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 480

ctattaccat gggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc 540

tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg 600

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 660

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 720

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 780

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 840

gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 900

gcgcttggtt taatgacggc tcgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttaaagggct 960

ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1020

tggggagcgc cgcgtgcggc ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg ggcgcggcgc 1080

ggggctttgt gcgctccgcg tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg 1140

tgcggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag 1200

cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt aacccccccc tgcacccccc tccccgagtt 1260

gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtgcgg ggcgtggcgc ggggctcgcc 1320

gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc 1380

ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg 1440

cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt 1500

cccaaatctg gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc accccctcta gcgggcgcgg 1560

gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg 1620

cgccgccgtc cccttctcca tctccagcct cggggctgcc gcagggggac ggctgccttc 1680

gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc tctagagcct 1740

ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac gtgctggttg 1800

ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tccctgcagg aaattgagcc cgcagcctcc 1860

cgcttcgctc tctgctcctc ctgttcgaca gtcagccgca tcttcttttg cgtcgccagc 1920

cgagccacat cgctcagaca ccgctagcat gaattttctg ctctcttggg tgcactggtc 1980

actggcactg ctgctgtatc tgcaccatgc aaaatggtcc caagcagctc ccatggcaga 2040

gggaggtgga cagaatcatc atgaggttgt caaatttatg gatgtctacc agcggagcta 2100

ctgccaccca attgagacgt tggtagacat ttttcaggaa tatccagacg agattgagta 2160

cattttcaag cctagctgtg tgcccttgat gcgatgcggt ggctgttgca atgatgaggg 2220

actcgagtgt gtccccaccg aggaaagcaa tataaccatg caaatcatgc gaatcaaacc 2280

ccaccagggc cagcatatcg gcgagatgtc tttcttgcaa cataacaaat gcgagtgtcg 2340

gccaaagaag gacagggctc gccaggaaaa tccctgtggt ccttgttcag agcgcaggaa 2400

gcatcttttc gtccaggatc cgcagacttg taaatgttca tgcaagaata ccgattctag 2460

gtgtaaggcg aggcaactcg agcttaacga gagaacctgt aggtgtgaca aacctagaag 2520

aggaagcgga gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc 2580

tggacctatg ggcagcgaac tggaaaccgc catggagact ttgataaatg ttttccacgc 2640

gcatagcggc aaagaagggg acaagtacaa gctgtcaaaa aaggagctga aagaactgct 2700

gcagaccgaa ttgagcggct tcctggacgc tcagaaagat gtcgatgccg tcgacaaagt 2760

gatgaaagag cttgacgaga acggtgacgg tgaagtcgat tttcaggaat atgtggtgct 2820

ggtggccgcc cttactgtag catgcaacaa tttcttttgg gaaaattcat aaatcgatta 2880

cgctcctcta ctctttgaga catcactggc ctataataaa tgggttaatt tatgtaacaa 2940

aattgccttg gcttgttaac tttattagac attctgatgt ttgcattgtg taaatactgt 3000

tgtattggaa aagcgtgcca agatggatta ttgtaattca gtgtcttttt tagtagcgtc 3060

acgtgccaaa cactgttagt cacagagggc atgagacagc ctgtgctgga acagctcagt 3120

tcatagggct atggagatgg ggagaaaggg gcgcttctgt cagagacaag ctgtggtctg 3180

ggaaggcctt agcactaaaa gcaccacaat gagaagcaac cgccagaagc agggcccgca 3240

ggcctttgtt ccagctgcaa agagaaagga aaaagtgggg aataagagtt ggggctgcgg 3300

agggggtggg gagcattgtg caggttccgt acttgaacag aaagcaggga ccaacacaag 3360

gaaggctcga gctggcggaa taggttccaa tctgtcgcgg ccgcattacc ctgttatccc 3420

taatctcgtt taactatgac tctcttaagg tagccaaatt ccggaactat aaattgcgtt 3480

gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcata aatgaatcgg 3540

ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgcgct tccgcttcct cgctcactga 3600

ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 3660

acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 3720

aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 3780

tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 3840

aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 3900

gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 3960

acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 4020

accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 4080

ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 4140

gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 4200

aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 4260

ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 4320

gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 4380

cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 4440

cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 4500

gtaaacttgg tctgacatgc gcatctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 4560

ttttggtcat gcctcagaag aactcgtcaa gaaggcgata gaaggcgatg cgctgcgaat 4620

cgggagcggc gataccgtaa agcacgagga agcggtcagc ccattcgccg ccaagctctt 4680

cagcaatatc acgggtagcc aacgctatgt cctgatagcg gtccgccaca cccagccggc 4740

cacagtcgat gaatccagaa aagcggccat tttccaccat gatattcggc aagcaggcat 4800

cgccatgggt cacgacgaga tcctcgccgt cgggcatgcg cgccttgagc ctggcgaaca 4860

gttcggctgg cgcgagcccc tgatgctctt cgtccagatc atcctgatcg acaagaccgg 4920

cttccatccg agtacgtgct cgctcgatgc gatgtttcgc ttggtggtcg aatgggcagg 4980

tagccggatc aagcgtatgc agccgccgca ttgcatcagc catgatggat actttctcgg 5040

caggagcaag gtgagatgac aggagatcct gccccggcac ttcgcccaat agcagccagt 5100

cccttcccgc ttcagtgaca acgtcgagca cagctgcgca aggaacgccc gtcgtggcca 5160

gccacgatag ccgcgctgcc tcgtcctgca gttcattcag ggcaccggac aggtcggtct 5220

tgacaaaaag aaccgggcgc ccctgcgctg acagccggaa cacggcggca tcagagcagc 5280

cgattgtctg ttgtgcccag tcatagccga atagcctctc cacccaagcg gccggagaac 5340

ctgcgtgcaa tccatcttgt tcaatcatgc gaaacgatcc tcattcattt atcagggtta 5400

ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttaggct gagcatctat gtcgggtgcg 5460

gagaaagagg taatgaaatg gcaggcgcct ttttcgttag atatgtagta agtatcttaa 5520

tatacagctt tatctgtttt ttaagatact tactactttt cttagtggaa actattagtg 5580

gctgttaatt aagctagtac tacccaagat ttgacagaat gcatcgtttg cattcgaa 5638

<210> 18

<211> 5665

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 18

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

tcgctgctgg cgcggtccgc tatgaggtct ctgatagacc acagacgcgt cgacattgat 120

tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 180

agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 240

gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 300

gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 360

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 420

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 480

ctattaccat gggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc 540

tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg 600

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 660

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 720

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 780

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 840

gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 900

gcgcttggtt taatgacggc tcgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttaaagggct 960

ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1020

tggggagcgc cgcgtgcggc ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg ggcgcggcgc 1080

ggggctttgt gcgctccgcg tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg 1140

tgcggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag 1200

cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt aacccccccc tgcacccccc tccccgagtt 1260

gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtgcgg ggcgtggcgc ggggctcgcc 1320

gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc 1380

ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg 1440

cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt 1500

cccaaatctg gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc accccctcta gcgggcgcgg 1560

gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg 1620

cgccgccgtc cccttctcca tctccagcct cggggctgcc gcagggggac ggctgccttc 1680

gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc tctagagcct 1740

ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac gtgctggttg 1800

ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tccctgcagg aaattgagcc cgcagcctcc 1860

cgcttcgctc tctgctcctc ctgttcgaca gtcagccgca tcttcttttg cgtcgccagc 1920

cgagccacat cgctcagaca ccgctagcat gggcagcgaa ctggaaaccg ccatggagac 1980

tttgataaat gttttccacg cgcatagcgg caaagaaggg gacaagtaca agctgtcaaa 2040

aaaggagctg aaagaactgc tgcagaccga attgagcggc ttcctggacg ctcagaaaga 2100

tgtcgatgcc gtcgacaaag tgatgaaaga gcttgacgag aacggtgacg gtgaagtcga 2160

ttttcaggaa tatgtggtgc tggtggccgc ccttactgta gcatgcaaca atttcttttg 2220

ggaaaattca cgtgcaaagc gtgcaccggt gaaacaggga agcggagcta ctaacttcag 2280

cctgctgaag caggctggag acgtggagga gaaccctgga cctatgaatt ttctgctctc 2340

ttgggtgcac tggtcactgg cactgctgct gtatctgcac catgcaaaat ggtcccaagc 2400

agctcccatg gcagagggag gtggacagaa tcatcatgag gttgtcaaat ttatggatgt 2460

ctaccagcgg agctactgcc acccaattga gacgttggta gacatttttc aggaatatcc 2520

agacgagatt gagtacattt tcaagcctag ctgtgtgccc ttgatgcgat gcggtggctg 2580

ttgcaatgat gagggactcg agtgtgtccc caccgaggaa agcaatataa ccatgcaaat 2640

catgcgaatc aaaccccacc agggccagca tatcggcgag atgtctttct tgcaacataa 2700

caaatgcgag tgtcggccaa agaaggacag ggctcgccag gaaaatccct gtggtccttg 2760

ttcagagcgc aggaagcatc ttttcgtcca ggatccgcag acttgtaaat gttcatgcaa 2820

gaataccgat tctaggtgta aggcgaggca actcgagctt aacgagagaa cctgtaggtg 2880

tgacaaacct agaagataaa tcgattacgc tcctctactc tttgagacat cactggccta 2940

taataaatgg gttaatttat gtaacaaaat tgccttggct tgttaacttt attagacatt 3000

ctgatgtttg cattgtgtaa atactgttgt attggaaaag cgtgccaaga tggattattg 3060

taattcagtg tcttttttag tagcgtcacg tgccaaacac tgttagtcac agagggcatg 3120

agacagcctg tgctggaaca gctcagttca tagggctatg gagatgggga gaaaggggcg 3180

cttctgtcag agacaagctg tggtctggga aggccttagc actaaaagca ccacaatgag 3240

aagcaaccgc cagaagcagg gcccgcaggc ctttgttcca gctgcaaaga gaaaggaaaa 3300

agtggggaat aagagttggg gctgcggagg gggtggggag cattgtgcag gttccgtact 3360

tgaacagaaa gcagggacca acacaaggaa ggctcgagct ggcggaatag gttccaatct 3420

gtcgcggccg cattaccctg ttatccctaa tctcgtttaa ctatgactct cttaaggtag 3480

ccaaattccg gaactataaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct 3540

gtcgtgccag ctgcataaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg 3600

gcgcgcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 3660

ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 3720

aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 3780

ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 3840

gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 3900

cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 3960

gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 4020

tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 4080

cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 4140

cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 4200

gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 4260

agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 4320

cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 4380

tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 4440

tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag 4500

ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacatgcgca tctgacgctc 4560

agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgcc tcagaagaac tcgtcaagaa 4620

ggcgatagaa ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc 4680

ggtcagccca ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct 4740

gatagcggtc cgccacaccc agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt 4800

ccaccatgat attcggcaag caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg 4860

gcatgcgcgc cttgagcctg gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt 4920

ccagatcatc ctgatcgaca agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat 4980

gtttcgcttg gtggtcgaat gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg 5040

catcagccat gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc 5100

ccggcacttc gcccaatagc agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag 5160

ctgcgcaagg aacgcccgtc gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcctgcagtt 5220

cattcagggc accggacagg tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca 5280

gccggaacac ggcggcatca gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata 5340

gcctctccac ccaagcggcc ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa 5400

acgatcctca ttcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 5460

ttaggctgag catctatgtc gggtgcggag aaagaggtaa tgaaatggca ggcgcctttt 5520

tcgttagata tgtagtaagt atcttaatat acagctttat ctgtttttta agatacttac 5580

tacttttctt agtggaaact attagtggct gttaattaag ctagtactac ccaagatttg 5640

acagaatgca tcgtttgcat tcgaa 5665

<210> 19

<211> 5356

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 19

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

tcgctgctgg cgcggtccgc tatgaggtct ctgatagacc acagacgcgt cgacattgat 120

tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 180

agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 240

gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 300

gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 360

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 420

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 480

ctattaccat gggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc 540

tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg 600

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 660

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 720

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 780

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 840

gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 900

gcgcttggtt taatgacggc tcgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttaaagggct 960

ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1020

tggggagcgc cgcgtgcggc ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg ggcgcggcgc 1080

ggggctttgt gcgctccgcg tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg 1140

tgcggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag 1200

cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt aacccccccc tgcacccccc tccccgagtt 1260

gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtgcgg ggcgtggcgc ggggctcgcc 1320

gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc 1380

ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg 1440

cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt 1500

cccaaatctg gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc accccctcta gcgggcgcgg 1560

gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg 1620

cgccgccgtc cccttctcca tctccagcct cggggctgcc gcagggggac ggctgccttc 1680

gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc tctagagcct 1740

ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac gtgctggttg 1800

ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tccctgcagg aaattgagcc cgcagcctcc 1860

cgcttcgctc tctgctcctc ctgttcgaca gtcagccgca tcttcttttg cgtcgccagc 1920

cgagccacat cgctcagaca ccgctagcgc caccatgggc agcgaactgg aaaccgccat 1980

ggagactttg ataaatgttt tccacgcgca tagcggcaaa gaaggggaca agtacaagct 2040

gtcaaaaaag gagctgaaag aactgctgca gaccgaattg agcggcttcc tggacgctca 2100

gaaagatgtc gatgccgtcg acaaagtgat gaaagagctt gacgagaacg gtgacggtga 2160

agtcgatttt caggaatatg tggtgctggt ggccgccctt actgtagcat gcaacaattt 2220

cttttgggaa aattcaagag ccaagagggc accggtgaaa cagactttga attttgacct 2280

tctgaagttg gcaggagacg ttgagtccaa ccctgggccc atgaatgcca aggtcgttgt 2340

ggtgcttgta cttgtgctga ctgctctgtg tctgagcgac ggaaaaccag tctccctcag 2400

ctacaggtgc ccatgccgat tcttcgaatc tcatgtggcc cgggccaatg tgaagcactt 2460

gaaaatcctg aatacaccca actgcgcgtt gcagatcgtg gcccgcctga aaaataataa 2520

taggcaggta tgtatcgatc caaagcttaa gtggatccag gagtatctgg aaaaggctct 2580

caataaataa atcgattacg ctcctctact ctttgagaca tcactggcct ataataaatg 2640

ggttaattta tgtaacaaaa ttgccttggc ttgttaactt tattagacat tctgatgttt 2700

gcattgtgta aatactgttg tattggaaaa gcgtgccaag atggattatt gtaattcagt 2760

gtctttttta gtagcgtcac gtgccaaaca ctgttagtca cagagggcat gagacagcct 2820

gtgctggaac agctcagttc atagggctat ggagatgggg agaaaggggc gcttctgtca 2880

gagacaagct gtggtctggg aaggccttag cactaaaagc accacaatga gaagcaaccg 2940

ccagaagcag ggcccgcagg cctttgttcc agctgcaaag agaaaggaaa aagtggggaa 3000

taagagttgg ggctgcggag ggggtgggga gcattgtgca ggttccgtac ttgaacagaa 3060

agcagggacc aacacaagga aggctcgagc tggcggaata ggttccaatc tgtcgcggcc 3120

gcattaccct gttatcccta atctcgttta actatgactc tcttaaggta gccaaattcc 3180

ggaactataa attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 3240

gctgcataaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgcgcttc 3300

cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 3360

tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 3420

gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 3480

ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 3540

aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 3600

tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 3660

ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 3720

gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 3780

tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 3840

caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 3900

ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 3960

cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 4020

ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 4080

cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 4140

gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 4200

aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacatgcgc atctgacgct cagtggaacg 4260

aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatgc ctcagaagaa ctcgtcaaga aggcgataga 4320

aggcgatgcg ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag cggtcagccc 4380

attcgccgcc aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc tgatagcggt 4440

ccgccacacc cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt tccaccatga 4500

tattcggcaa gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg ggcatgcgcg 4560

ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg tccagatcat 4620

cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga tgtttcgctt 4680

ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca 4740

tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc cccggcactt 4800

cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca gctgcgcaag 4860

gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcctgcagt tcattcaggg 4920

caccggacag gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca 4980

cggcggcatc agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca 5040

cccaagcggc cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga aacgatcctc 5100

attcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttaggctga 5160

gcatctatgt cgggtgcgga gaaagaggta atgaaatggc aggcgccttt ttcgttagat 5220

atgtagtaag tatcttaata tacagcttta tctgtttttt aagatactta ctacttttct 5280

tagtggaaac tattagtggc tgttaattaa gctagtacta cccaagattt gacagaatgc 5340

atcgtttgca ttcgaa 5356

<210> 20

<211> 5356

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 20

ctagcgccac catgaatgcc aaggtcgttg tggtgcttgt acttgtgctg actgctctgt 60

gtctgagcga cggaaaacca gtctccctca gctacaggtg cccatgccga ttcttcgaat 120

ctcatgtggc ccgggccaat gtgaagcact tgaaaatcct gaatacaccc aactgcgcgt 180

tgcagatcgt ggcccgcctg aaaaataata ataggcaggt atgtatcgat ccaaagctta 240

agtggatcca ggagtatctg gaaaaggctc tcaataaaag agccaagagg gcaccggtga 300

aacagacttt gaattttgac cttctgaagt tggcaggaga cgttgagtcc aaccctgggc 360

ccatgggcag cgaactggaa accgccatgg agactttgat aaatgttttc cacgcgcata 420

gcggcaaaga aggggacaag tacaagctgt caaaaaagga gctgaaagaa ctgctgcaga 480

ccgaattgag cggcttcctg gacgctcaga aagatgtcga tgccgtcgac aaagtgatga 540

aagagcttga cgagaacggt gacggtgaag tcgattttca ggaatatgtg gtgctggtgg 600

ccgcccttac tgtagcatgc aacaatttct tttgggaaaa ttcataaatc gattacgctc 660

ctctactctt tgagacatca ctggcctata ataaatgggt taatttatgt aacaaaattg 720

ccttggcttg ttaactttat tagacattct gatgtttgca ttgtgtaaat actgttgtat 780

tggaaaagcg tgccaagatg gattattgta attcagtgtc ttttttagta gcgtcacgtg 840

ccaaacactg ttagtcacag agggcatgag acagcctgtg ctggaacagc tcagttcata 900

gggctatgga gatggggaga aaggggcgct tctgtcagag acaagctgtg gtctgggaag 960

gccttagcac taaaagcacc acaatgagaa gcaaccgcca gaagcagggc ccgcaggcct 1020

ttgttccagc tgcaaagaga aaggaaaaag tggggaataa gagttggggc tgcggagggg 1080

gtggggagca ttgtgcaggt tccgtacttg aacagaaagc agggaccaac acaaggaagg 1140

ctcgagctgg cggaataggt tccaatctgt cgcggccgca ttaccctgtt atccctaatc 1200

tcgtttaact atgactctct taaggtagcc aaattccgga actataaatt gcgttgcgct 1260

cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcataaatga atcggccaac 1320

gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gcgcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 1380

tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt 1440

tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 1500

ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 1560

agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 1620

accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 1680

ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 1740

gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 1800

ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 1860

gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 1920

taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag 1980

tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 2040

gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 2100

cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 2160

agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 2220

cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 2280

cttggtctga catgcgcatc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 2340

gtcatgcctc agaagaactc gtcaagaagg cgatagaagg cgatgcgctg cgaatcggga 2400

gcggcgatac cgtaaagcac gaggaagcgg tcagcccatt cgccgccaag ctcttcagca 2460

atatcacggg tagccaacgc tatgtcctga tagcggtccg ccacacccag ccggccacag 2520

tcgatgaatc cagaaaagcg gccattttcc accatgatat tcggcaagca ggcatcgcca 2580

tgggtcacga cgagatcctc gccgtcgggc atgcgcgcct tgagcctggc gaacagttcg 2640

gctggcgcga gcccctgatg ctcttcgtcc agatcatcct gatcgacaag accggcttcc 2700

atccgagtac gtgctcgctc gatgcgatgt ttcgcttggt ggtcgaatgg gcaggtagcc 2760

ggatcaagcg tatgcagccg ccgcattgca tcagccatga tggatacttt ctcggcagga 2820

gcaaggtgag atgacaggag atcctgcccc ggcacttcgc ccaatagcag ccagtccctt 2880

cccgcttcag tgacaacgtc gagcacagct gcgcaaggaa cgcccgtcgt ggccagccac 2940

gatagccgcg ctgcctcgtc ctgcagttca ttcagggcac cggacaggtc ggtcttgaca 3000

aaaagaaccg ggcgcccctg cgctgacagc cggaacacgg cggcatcaga gcagccgatt 3060

gtctgttgtg cccagtcata gccgaatagc ctctccaccc aagcggccgg agaacctgcg 3120

tgcaatccat cttgttcaat catgcgaaac gatcctcatt catttatcag ggttattgtc 3180

tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt aggctgagca tctatgtcgg gtgcggagaa 3240

agaggtaatg aaatggcagg cgcctttttc gttagatatg tagtaagtat cttaatatac 3300

agctttatct gttttttaag atacttacta cttttcttag tggaaactat tagtggctgt 3360

taattaagct agtactaccc aagatttgac agaatgcatc gtttgcattc gaataactat 3420

aacggtccta aggtagcgac gtacgaaccg ttgggcgcgc ctggggatag cgatcgctgc 3480

tggcgcggtc cgctatgagg tctctgatag accacagacg cgtcgacatt gattattgac 3540

tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 3600

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 3660

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 3720

atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 3780

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 3840

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 3900

catgggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 3960

ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 4020

ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga 4080

ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg 4140

cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgttgcct 4200

tcgccccgtg ccccgctccg cgccgcctcg cgccgcccgc cccggctctg actgaccgcg 4260

ttactcccac aggtgagcgg gcgggacggc ccttctcctc cgggctgtaa ttagcgcttg 4320

gtttaatgac ggctcgtttc ttttctgtgg ctgcgtgaaa gccttaaagg gctccgggag 4380

ggccctttgt gcggggggga gcggctcggg gggtgcgtgc gtgtgtgtgt gcgtggggag 4440

cgccgcgtgc ggcccgcgct gcccggcggc tgtgagcgct gcgggcgcgg cgcggggctt 4500

tgtgcgctcc gcgtgtgcgc gaggggagcg cggccggggg cggtgccccg cggtgcgggg 4560

gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt gagcaggggg 4620

tgtgggcgcg gcggtcgggc tgtaaccccc ccctgcaccc ccctccccga gttgctgagc 4680

acggcccggc ttcgggtgcg gggctccgtg cggggcgtgg cgcggggctc gccgtgccgg 4740

gcggggggtg gcggcaggtg ggggtgccgg gcggggcggg gccgcctcgg gccggggagg 4800

gctcggggga ggggcgcggc ggccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg cggcgagccg 4860

cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt tgtcccaaat 4920

ctggcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct ctagcgggcg cgggcgaagc 4980

ggtgcggcgc cggcaggaag gaaatgggcg gggagggcct tcgtgcgtcg ccgcgccgcc 5040

gtccccttct ccatctccag cctcggggct gccgcagggg gacggctgcc ttcggggggg 5100

acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc ggctctagag cctctgctaa 5160

ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg ttgttgtgct 5220

gtctcatcat tttggcaaag aattccctgc aggaaattga gcccgcagcc tcccgcttcg 5280

ctctctgctc ctcctgttcg acagtcagcc gcatcttctt ttgcgtcgcc agccgagcca 5340

catcgctcag acaccg 5356

<210> 21

<211> 5647

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 21

ctagcgccac catgaatgcc aaggtcgttg tggtgcttgt acttgtgctg actgctctgt 60

gtctgagcga cggaaaacca gtctccctca gctacaggtg cccatgccga ttcttcgaat 120

ctcatgtggc ccgggccaat gtgaagcact tgaaaatcct gaatacaccc aactgcgcgt 180

tgcagatcgt ggcccgcctg aaaaataata ataggcaggt atgtatcgat ccaaagctta 240

agtggatcca ggagtatctg gaaaaggctc tcaataaaag agccaagagg gcaccggtga 300

aacagacttt gaattttgac cttctgaagt tggcaggaga cgttgagtcc aaccctgggc 360

ccatgaattt tctgctctct tgggtgcact ggtcactggc actgctgctg tatctgcacc 420

atgcaaaatg gtcccaagca gctcccatgg cagagggagg tggacagaat catcatgagg 480

ttgtcaaatt tatggatgtc taccagcgga gctactgcca cccaattgag acgttggtag 540

acatttttca ggaatatcca gacgagattg agtacatttt caagcctagc tgtgtgccct 600

tgatgcgatg cggtggctgt tgcaatgatg agggactcga gtgtgtcccc accgaggaaa 660

gcaatataac catgcaaatc atgcgaatca aaccccacca gggccagcat atcggcgaga 720

tgtctttctt gcaacataac aaatgcgagt gtcggccaaa gaaggacagg gctcgccagg 780

aaaatccctg tggtccttgt tcagagcgca ggaagcatct tttcgtccag gatccgcaga 840

cttgtaaatg ttcatgcaag aataccgatt ctaggtgtaa ggcgaggcaa ctcgagctta 900

acgagagaac ctgtaggtgt gacaaaccta gaagataaat cgattacgct cctctactct 960

ttgagacatc actggcctat aataaatggg ttaatttatg taacaaaatt gccttggctt 1020

gttaacttta ttagacattc tgatgtttgc attgtgtaaa tactgttgta ttggaaaagc 1080

gtgccaagat ggattattgt aattcagtgt cttttttagt agcgtcacgt gccaaacact 1140

gttagtcaca gagggcatga gacagcctgt gctggaacag ctcagttcat agggctatgg 1200

agatggggag aaaggggcgc ttctgtcaga gacaagctgt ggtctgggaa ggccttagca 1260

ctaaaagcac cacaatgaga agcaaccgcc agaagcaggg cccgcaggcc tttgttccag 1320

ctgcaaagag aaaggaaaaa gtggggaata agagttgggg ctgcggaggg ggtggggagc 1380

attgtgcagg ttccgtactt gaacagaaag cagggaccaa cacaaggaag gctcgagctg 1440

gcggaatagg ttccaatctg tcgcggccgc attaccctgt tatccctaat ctcgtttaac 1500

tatgactctc ttaaggtagc caaattccgg aactataaat tgcgttgcgc tcactgcccg 1560

ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcataaatg aatcggccaa cgcgcgggga 1620

gaggcggttt gcgtattggg cgcgcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg 1680

tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag 1740

aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 1800

gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 1860

aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 1920

ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 1980

tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc 2040

tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 2100

ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 2160

tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 2220

ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta 2280

tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 2340

aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 2400

aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 2460

aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 2520

ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 2580

acatgcgcat ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgcct 2640

cagaagaact cgtcaagaag gcgatagaag gcgatgcgct gcgaatcggg agcggcgata 2700

ccgtaaagca cgaggaagcg gtcagcccat tcgccgccaa gctcttcagc aatatcacgg 2760

gtagccaacg ctatgtcctg atagcggtcc gccacaccca gccggccaca gtcgatgaat 2820

ccagaaaagc ggccattttc caccatgata ttcggcaagc aggcatcgcc atgggtcacg 2880

acgagatcct cgccgtcggg catgcgcgcc ttgagcctgg cgaacagttc ggctggcgcg 2940

agcccctgat gctcttcgtc cagatcatcc tgatcgacaa gaccggcttc catccgagta 3000

cgtgctcgct cgatgcgatg tttcgcttgg tggtcgaatg ggcaggtagc cggatcaagc 3060

gtatgcagcc gccgcattgc atcagccatg atggatactt tctcggcagg agcaaggtga 3120

gatgacagga gatcctgccc cggcacttcg cccaatagca gccagtccct tcccgcttca 3180

gtgacaacgt cgagcacagc tgcgcaagga acgcccgtcg tggccagcca cgatagccgc 3240

gctgcctcgt cctgcagttc attcagggca ccggacaggt cggtcttgac aaaaagaacc 3300

gggcgcccct gcgctgacag ccggaacacg gcggcatcag agcagccgat tgtctgttgt 3360

gcccagtcat agccgaatag cctctccacc caagcggccg gagaacctgc gtgcaatcca 3420

tcttgttcaa tcatgcgaaa cgatcctcat tcatttatca gggttattgt ctcatgagcg 3480

gatacatatt tgaatgtatt taggctgagc atctatgtcg ggtgcggaga aagaggtaat 3540

gaaatggcag gcgccttttt cgttagatat gtagtaagta tcttaatata cagctttatc 3600

tgttttttaa gatacttact acttttctta gtggaaacta ttagtggctg ttaattaagc 3660

tagtactacc caagatttga cagaatgcat cgtttgcatt cgaataacta taacggtcct 3720

aaggtagcga cgtacgaacc gttgggcgcg cctggggata gcgatcgctg ctggcgcggt 3780

ccgctatgag gtctctgata gaccacagac gcgtcgacat tgattattga ctagttatta 3840

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 3900

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 3960

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 4020

ctatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 4080

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 4140

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatgggtcg 4200

aggtgagccc cacgttctgc ttcactctcc ccatctcccc cccctcccca cccccaattt 4260

tgtatttatt tattttttaa ttattttgtg cagcgatggg ggcggggggg gggggggcgc 4320

gcgccaggcg gggcggggcg gggcgagggg cggggcgggg cgaggcggag aggtgcggcg 4380

gcagccaatc agagcggcgc gctccgaaag tttcctttta tggcgaggcg gcggcggcgg 4440

cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg ctgcgttgcc ttcgccccgt 4500

gccccgctcc gcgccgcctc gcgccgcccg ccccggctct gactgaccgc gttactccca 4560

caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct ccgggctgta attagcgctt ggtttaatga 4620

cggctcgttt cttttctgtg gctgcgtgaa agccttaaag ggctccggga gggccctttg 4680

tgcggggggg agcggctcgg ggggtgcgtg cgtgtgtgtg tgcgtgggga gcgccgcgtg 4740

cggcccgcgc tgcccggcgg ctgtgagcgc tgcgggcgcg gcgcggggct ttgtgcgctc 4800

cgcgtgtgcg cgaggggagc gcggccgggg gcggtgcccc gcggtgcggg ggggctgcga 4860

ggggaacaaa ggctgcgtgc ggggtgtgtg cgtggggggg tgagcagggg gtgtgggcgc 4920

ggcggtcggg ctgtaacccc cccctgcacc cccctccccg agttgctgag cacggcccgg 4980

cttcgggtgc ggggctccgt gcggggcgtg gcgcggggct cgccgtgccg ggcggggggt 5040

ggcggcaggt gggggtgccg ggcggggcgg ggccgcctcg ggccggggag ggctcggggg 5100

aggggcgcgg cggccccgga gcgccggcgg ctgtcgaggc gcggcgagcc gcagccattg 5160

ccttttatgg taatcgtgcg agagggcgca gggacttcct ttgtcccaaa tctggcggag 5220

ccgaaatctg ggaggcgccg ccgcaccccc tctagcgggc gcgggcgaag cggtgcggcg 5280

ccggcaggaa ggaaatgggc ggggagggcc ttcgtgcgtc gccgcgccgc cgtccccttc 5340

tccatctcca gcctcggggc tgccgcaggg ggacggctgc cttcgggggg gacggggcag 5400

ggcggggttc ggcttctggc gtgtgaccgg cggctctaga gcctctgcta accatgttca 5460

tgccttcttc tttttcctac agctcctggg caacgtgctg gttgttgtgc tgtctcatca 5520

ttttggcaaa gaattccctg caggaaattg agcccgcagc ctcccgcttc gctctctgct 5580

cctcctgttc gacagtcagc cgcatcttct tttgcgtcgc cagccgagcc acatcgctca 5640

gacaccg 5647

<210> 22

<211> 5647

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 22

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

tcgctgctgg cgcggtccgc tatgaggtct ctgatagacc acagacgcgt cgacattgat 120

tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 180

agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 240

gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 300

gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 360

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 420

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 480

ctattaccat gggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc 540

tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg 600

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 660

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 720

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 780

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 840

gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 900

gcgcttggtt taatgacggc tcgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttaaagggct 960

ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1020

tggggagcgc cgcgtgcggc ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg ggcgcggcgc 1080

ggggctttgt gcgctccgcg tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg 1140

tgcggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag 1200

cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt aacccccccc tgcacccccc tccccgagtt 1260

gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtgcgg ggcgtggcgc ggggctcgcc 1320

gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc 1380

ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg 1440

cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt 1500

cccaaatctg gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc accccctcta gcgggcgcgg 1560

gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg 1620

cgccgccgtc cccttctcca tctccagcct cggggctgcc gcagggggac ggctgccttc 1680

gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc tctagagcct 1740

ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac gtgctggttg 1800

ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tccctgcagg aaattgagcc cgcagcctcc 1860

cgcttcgctc tctgctcctc ctgttcgaca gtcagccgca tcttcttttg cgtcgccagc 1920

cgagccacat cgctcagaca ccgctagcgc caccatgaat tttctgctct cttgggtgca 1980

ctggtcactg gcactgctgc tgtatctgca ccatgcaaaa tggtcccaag cagctcccat 2040

ggcagaggga ggtggacaga atcatcatga ggttgtcaaa tttatggatg tctaccagcg 2100

gagctactgc cacccaattg agacgttggt agacattttt caggaatatc cagacgagat 2160

tgagtacatt ttcaagccta gctgtgtgcc cttgatgcga tgcggtggct gttgcaatga 2220

tgagggactc gagtgtgtcc ccaccgagga aagcaatata accatgcaaa tcatgcgaat 2280

caaaccccac cagggccagc atatcggcga gatgtctttc ttgcaacata acaaatgcga 2340

gtgtcggcca aagaaggaca gggctcgcca ggaaaatccc tgtggtcctt gttcagagcg 2400

caggaagcat cttttcgtcc aggatccgca gacttgtaaa tgttcatgca agaataccga 2460

ttctaggtgt aaggcgaggc aactcgagct taacgagaga acctgtaggt gtgacaaacc 2520

tagaagaaga gccaagaggg caccggtgaa acagactttg aattttgacc ttctgaagtt 2580

ggcaggagac gttgagtcca accctgggcc catgaatgcc aaggtcgttg tggtgcttgt 2640

acttgtgctg actgctctgt gtctgagcga cggaaaacca gtctccctca gctacaggtg 2700

cccatgccga ttcttcgaat ctcatgtggc ccgggccaat gtgaagcact tgaaaatcct 2760

gaatacaccc aactgcgcgt tgcagatcgt ggcccgcctg aaaaataata ataggcaggt 2820

atgtatcgat ccaaagctta agtggatcca ggagtatctg gaaaaggctc tcaataaata 2880

aatcgattac gctcctctac tctttgagac atcactggcc tataataaat gggttaattt 2940

atgtaacaaa attgccttgg cttgttaact ttattagaca ttctgatgtt tgcattgtgt 3000

aaatactgtt gtattggaaa agcgtgccaa gatggattat tgtaattcag tgtctttttt 3060

agtagcgtca cgtgccaaac actgttagtc acagagggca tgagacagcc tgtgctggaa 3120

cagctcagtt catagggcta tggagatggg gagaaagggg cgcttctgtc agagacaagc 3180

tgtggtctgg gaaggcctta gcactaaaag caccacaatg agaagcaacc gccagaagca 3240

gggcccgcag gcctttgttc cagctgcaaa gagaaaggaa aaagtgggga ataagagttg 3300

gggctgcgga gggggtgggg agcattgtgc aggttccgta cttgaacaga aagcagggac 3360

caacacaagg aaggctcgag ctggcggaat aggttccaat ctgtcgcggc cgcattaccc 3420

tgttatccct aatctcgttt aactatgact ctcttaaggt agccaaattc cggaactata 3480

aattgcgttg cgctcactgc ccgctttcca gtcgggaaac ctgtcgtgcc agctgcataa 3540

atgaatcggc caacgcgcgg ggagaggcgg tttgcgtatt gggcgcgctt ccgcttcctc 3600

gctcactgac tcgctgcgct cggtcgttcg gctgcggcga gcggtatcag ctcactcaaa 3660

ggcggtaata cggttatcca cagaatcagg ggataacgca ggaaagaaca tgtgagcaaa 3720

aggccagcaa aaggccagga accgtaaaaa ggccgcgttg ctggcgtttt tccataggct 3780

ccgcccccct gacgagcatc acaaaaatcg acgctcaagt cagaggtggc gaaacccgac 3840

aggactataa agataccagg cgtttccccc tggaagctcc ctcgtgcgct ctcctgttcc 3900

gaccctgccg cttaccggat acctgtccgc ctttctccct tcgggaagcg tggcgctttc 3960

tcatagctca cgctgtaggt atctcagttc ggtgtaggtc gttcgctcca agctgggctg 4020

tgtgcacgaa ccccccgttc agcccgaccg ctgcgcctta tccggtaact atcgtcttga 4080

gtccaacccg gtaagacacg acttatcgcc actggcagca gccactggta acaggattag 4140

cagagcgagg tatgtaggcg gtgctacaga gttcttgaag tggtggccta actacggcta 4200

cactagaaga acagtatttg gtatctgcgc tctgctgaag ccagttacct tcggaaaaag 4260

agttggtagc tcttgatccg gcaaacaaac caccgctggt agcggtggtt tttttgtttg 4320

caagcagcag attacgcgca gaaaaaaagg atctcaagaa gatcctttga tcttttctac 4380

ggggtctgac gctcagtgga acgaaaactc acgttaaggg attttggtca tgagattatc 4440

aaaaaggatc ttcacctaga tccttttaaa ttaaaaatga agttttaaat caatctaaag 4500

tatatatgag taaacttggt ctgacatgcg catctgacgc tcagtggaac gaaaactcac 4560

gttaagggat tttggtcatg cctcagaaga actcgtcaag aaggcgatag aaggcgatgc 4620

gctgcgaatc gggagcggcg ataccgtaaa gcacgaggaa gcggtcagcc cattcgccgc 4680

caagctcttc agcaatatca cgggtagcca acgctatgtc ctgatagcgg tccgccacac 4740

ccagccggcc acagtcgatg aatccagaaa agcggccatt ttccaccatg atattcggca 4800

agcaggcatc gccatgggtc acgacgagat cctcgccgtc gggcatgcgc gccttgagcc 4860

tggcgaacag ttcggctggc gcgagcccct gatgctcttc gtccagatca tcctgatcga 4920

caagaccggc ttccatccga gtacgtgctc gctcgatgcg atgtttcgct tggtggtcga 4980

atgggcaggt agccggatca agcgtatgca gccgccgcat tgcatcagcc atgatggata 5040

ctttctcggc aggagcaagg tgagatgaca ggagatcctg ccccggcact tcgcccaata 5100

gcagccagtc ccttcccgct tcagtgacaa cgtcgagcac agctgcgcaa ggaacgcccg 5160

tcgtggccag ccacgatagc cgcgctgcct cgtcctgcag ttcattcagg gcaccggaca 5220

ggtcggtctt gacaaaaaga accgggcgcc cctgcgctga cagccggaac acggcggcat 5280

cagagcagcc gattgtctgt tgtgcccagt catagccgaa tagcctctcc acccaagcgg 5340

ccggagaacc tgcgtgcaat ccatcttgtt caatcatgcg aaacgatcct cattcattta 5400

tcagggttat tgtctcatga gcggatacat atttgaatgt atttaggctg agcatctatg 5460

tcgggtgcgg agaaagaggt aatgaaatgg caggcgcctt tttcgttaga tatgtagtaa 5520

gtatcttaat atacagcttt atctgttttt taagatactt actacttttc ttagtggaaa 5580

ctattagtgg ctgttaatta agctagtact acccaagatt tgacagaatg catcgtttgc 5640

attcgaa 5647

<210> 23

<211> 5338

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 23

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

tcgctgctgg cgcggtccgc tatgaggtct ctgatagacc acagacgcgt cgacattgat 120

tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 180

agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 240

gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 300

gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 360

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 420

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 480

ctattaccat gggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc 540

tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg 600

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 660

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 720

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 780

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 840

gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 900

gcgcttggtt taatgacggc tcgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttaaagggct 960

ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1020

tggggagcgc cgcgtgcggc ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg ggcgcggcgc 1080

ggggctttgt gcgctccgcg tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg 1140

tgcggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag 1200

cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt aacccccccc tgcacccccc tccccgagtt 1260

gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtgcgg ggcgtggcgc ggggctcgcc 1320

gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc 1380

ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg 1440

cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt 1500

cccaaatctg gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc accccctcta gcgggcgcgg 1560

gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg 1620

cgccgccgtc cccttctcca tctccagcct cggggctgcc gcagggggac ggctgccttc 1680

gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc tctagagcct 1740

ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac gtgctggttg 1800

ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tccctgcagg aaattgagcc cgcagcctcc 1860

cgcttcgctc tctgctcctc ctgttcgaca gtcagccgca tcttcttttg cgtcgccagc 1920

cgagccacat cgctcagaca ccgctagcgc caccatgggc agcgaactgg aaaccgccat 1980

ggagactttg ataaatgttt tccacgcgca tagcggcaaa gaaggggaca agtacaagct 2040

gtcaaaaaag gagctgaaag aactgctgca gaccgaattg agcggcttcc tggacgctca 2100

gaaagatgtc gatgccgtcg acaaagtgat gaaagagctt gacgagaacg gtgacggtga 2160

agtcgatttt caggaatatg tggtgctggt ggccgccctt actgtagcat gcaacaattt 2220

cttttgggaa aattcaggaa gcggagctac taacttcagc ctgctgaagc aggctggaga 2280

cgtggaggag aaccctggac ctatgaatgc caaggtcgtt gtggtgcttg tacttgtgct 2340

gactgctctg tgtctgagcg acggaaaacc agtctccctc agctacaggt gcccatgccg 2400

attcttcgaa tctcatgtgg cccgggccaa tgtgaagcac ttgaaaatcc tgaatacacc 2460

caactgcgcg ttgcagatcg tggcccgcct gaaaaataat aataggcagg tatgtatcga 2520

tccaaagctt aagtggatcc aggagtatct ggaaaaggct ctcaataaat aaatcgatta 2580

cgctcctcta ctctttgaga catcactggc ctataataaa tgggttaatt tatgtaacaa 2640

aattgccttg gcttgttaac tttattagac attctgatgt ttgcattgtg taaatactgt 2700

tgtattggaa aagcgtgcca agatggatta ttgtaattca gtgtcttttt tagtagcgtc 2760

acgtgccaaa cactgttagt cacagagggc atgagacagc ctgtgctgga acagctcagt 2820

tcatagggct atggagatgg ggagaaaggg gcgcttctgt cagagacaag ctgtggtctg 2880

ggaaggcctt agcactaaaa gcaccacaat gagaagcaac cgccagaagc agggcccgca 2940

ggcctttgtt ccagctgcaa agagaaagga aaaagtgggg aataagagtt ggggctgcgg 3000

agggggtggg gagcattgtg caggttccgt acttgaacag aaagcaggga ccaacacaag 3060

gaaggctcga gctggcggaa taggttccaa tctgtcgcgg ccgcattacc ctgttatccc 3120

taatctcgtt taactatgac tctcttaagg tagccaaatt ccggaactat aaattgcgtt 3180

gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcata aatgaatcgg 3240

ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgcgct tccgcttcct cgctcactga 3300

ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 3360

acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 3420

aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 3480

tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 3540

aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 3600

gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 3660

acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 3720

accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 3780

ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 3840

gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 3900

aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 3960

ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 4020

gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 4080

cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 4140

cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 4200

gtaaacttgg tctgacatgc gcatctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 4260

ttttggtcat gcctcagaag aactcgtcaa gaaggcgata gaaggcgatg cgctgcgaat 4320

cgggagcggc gataccgtaa agcacgagga agcggtcagc ccattcgccg ccaagctctt 4380

cagcaatatc acgggtagcc aacgctatgt cctgatagcg gtccgccaca cccagccggc 4440

cacagtcgat gaatccagaa aagcggccat tttccaccat gatattcggc aagcaggcat 4500

cgccatgggt cacgacgaga tcctcgccgt cgggcatgcg cgccttgagc ctggcgaaca 4560

gttcggctgg cgcgagcccc tgatgctctt cgtccagatc atcctgatcg acaagaccgg 4620

cttccatccg agtacgtgct cgctcgatgc gatgtttcgc ttggtggtcg aatgggcagg 4680

tagccggatc aagcgtatgc agccgccgca ttgcatcagc catgatggat actttctcgg 4740

caggagcaag gtgagatgac aggagatcct gccccggcac ttcgcccaat agcagccagt 4800

cccttcccgc ttcagtgaca acgtcgagca cagctgcgca aggaacgccc gtcgtggcca 4860

gccacgatag ccgcgctgcc tcgtcctgca gttcattcag ggcaccggac aggtcggtct 4920

tgacaaaaag aaccgggcgc ccctgcgctg acagccggaa cacggcggca tcagagcagc 4980

cgattgtctg ttgtgcccag tcatagccga atagcctctc cacccaagcg gccggagaac 5040

ctgcgtgcaa tccatcttgt tcaatcatgc gaaacgatcc tcattcattt atcagggtta 5100

ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttaggct gagcatctat gtcgggtgcg 5160

gagaaagagg taatgaaatg gcaggcgcct ttttcgttag atatgtagta agtatcttaa 5220

tatacagctt tatctgtttt ttaagatact tactactttt cttagtggaa actattagtg 5280

gctgttaatt aagctagtac tacccaagat ttgacagaat gcatcgtttg cattcgaa 5338

<210> 24

<211> 5338

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 24

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

tcgctgctgg cgcggtccgc tatgaggtct ctgatagacc acagacgcgt cgacattgat 120

tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 180

agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 240

gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 300

gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 360

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 420

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 480

ctattaccat gggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc 540

tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg 600

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 660

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 720

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 780

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 840

gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 900

gcgcttggtt taatgacggc tcgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttaaagggct 960

ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1020

tggggagcgc cgcgtgcggc ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg ggcgcggcgc 1080

ggggctttgt gcgctccgcg tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg 1140

tgcggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag 1200

cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt aacccccccc tgcacccccc tccccgagtt 1260

gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtgcgg ggcgtggcgc ggggctcgcc 1320

gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc 1380

ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg 1440

cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt 1500

cccaaatctg gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc accccctcta gcgggcgcgg 1560

gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg 1620

cgccgccgtc cccttctcca tctccagcct cggggctgcc gcagggggac ggctgccttc 1680

gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc tctagagcct 1740

ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac gtgctggttg 1800

ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tccctgcagg aaattgagcc cgcagcctcc 1860

cgcttcgctc tctgctcctc ctgttcgaca gtcagccgca tcttcttttg cgtcgccagc 1920

cgagccacat cgctcagaca ccgctagcgc caccatgaat gccaaggtcg ttgtggtgct 1980

tgtacttgtg ctgactgctc tgtgtctgag cgacggaaaa ccagtctccc tcagctacag 2040

gtgcccatgc cgattcttcg aatctcatgt ggcccgggcc aatgtgaagc acttgaaaat 2100

cctgaataca cccaactgcg cgttgcagat cgtggcccgc ctgaaaaata ataataggca 2160

ggtatgtatc gatccaaagc ttaagtggat ccaggagtat ctggaaaagg ctctcaataa 2220

aggaagcgga gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc 2280

tggacctatg ggcagcgaac tggaaaccgc catggagact ttgataaatg ttttccacgc 2340

gcatagcggc aaagaagggg acaagtacaa gctgtcaaaa aaggagctga aagaactgct 2400

gcagaccgaa ttgagcggct tcctggacgc tcagaaagat gtcgatgccg tcgacaaagt 2460

gatgaaagag cttgacgaga acggtgacgg tgaagtcgat tttcaggaat atgtggtgct 2520

ggtggccgcc cttactgtag catgcaacaa tttcttttgg gaaaattcat aaatcgatta 2580

cgctcctcta ctctttgaga catcactggc ctataataaa tgggttaatt tatgtaacaa 2640

aattgccttg gcttgttaac tttattagac attctgatgt ttgcattgtg taaatactgt 2700

tgtattggaa aagcgtgcca agatggatta ttgtaattca gtgtcttttt tagtagcgtc 2760

acgtgccaaa cactgttagt cacagagggc atgagacagc ctgtgctgga acagctcagt 2820

tcatagggct atggagatgg ggagaaaggg gcgcttctgt cagagacaag ctgtggtctg 2880

ggaaggcctt agcactaaaa gcaccacaat gagaagcaac cgccagaagc agggcccgca 2940

ggcctttgtt ccagctgcaa agagaaagga aaaagtgggg aataagagtt ggggctgcgg 3000

agggggtggg gagcattgtg caggttccgt acttgaacag aaagcaggga ccaacacaag 3060

gaaggctcga gctggcggaa taggttccaa tctgtcgcgg ccgcattacc ctgttatccc 3120

taatctcgtt taactatgac tctcttaagg tagccaaatt ccggaactat aaattgcgtt 3180

gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcata aatgaatcgg 3240

ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgcgct tccgcttcct cgctcactga 3300

ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa aggcggtaat 3360

acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa aaggccagca 3420

aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc tccgcccccc 3480

tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga caggactata 3540

aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc cgaccctgcc 3600

gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt ctcatagctc 3660

acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct gtgtgcacga 3720

accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg agtccaaccc 3780

ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta gcagagcgag 3840

gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct acactagaag 3900

aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa gagttggtag 3960

ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt gcaagcagca 4020

gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta cggggtctga 4080

cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat caaaaaggat 4140

cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa gtatatatga 4200

gtaaacttgg tctgacatgc gcatctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 4260

ttttggtcat gcctcagaag aactcgtcaa gaaggcgata gaaggcgatg cgctgcgaat 4320

cgggagcggc gataccgtaa agcacgagga agcggtcagc ccattcgccg ccaagctctt 4380

cagcaatatc acgggtagcc aacgctatgt cctgatagcg gtccgccaca cccagccggc 4440

cacagtcgat gaatccagaa aagcggccat tttccaccat gatattcggc aagcaggcat 4500

cgccatgggt cacgacgaga tcctcgccgt cgggcatgcg cgccttgagc ctggcgaaca 4560

gttcggctgg cgcgagcccc tgatgctctt cgtccagatc atcctgatcg acaagaccgg 4620

cttccatccg agtacgtgct cgctcgatgc gatgtttcgc ttggtggtcg aatgggcagg 4680

tagccggatc aagcgtatgc agccgccgca ttgcatcagc catgatggat actttctcgg 4740

caggagcaag gtgagatgac aggagatcct gccccggcac ttcgcccaat agcagccagt 4800

cccttcccgc ttcagtgaca acgtcgagca cagctgcgca aggaacgccc gtcgtggcca 4860

gccacgatag ccgcgctgcc tcgtcctgca gttcattcag ggcaccggac aggtcggtct 4920

tgacaaaaag aaccgggcgc ccctgcgctg acagccggaa cacggcggca tcagagcagc 4980

cgattgtctg ttgtgcccag tcatagccga atagcctctc cacccaagcg gccggagaac 5040

ctgcgtgcaa tccatcttgt tcaatcatgc gaaacgatcc tcattcattt atcagggtta 5100

ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttaggct gagcatctat gtcgggtgcg 5160

gagaaagagg taatgaaatg gcaggcgcct ttttcgttag atatgtagta agtatcttaa 5220

tatacagctt tatctgtttt ttaagatact tactactttt cttagtggaa actattagtg 5280

gctgttaatt aagctagtac tacccaagat ttgacagaat gcatcgtttg cattcgaa 5338

<210> 25

<211> 5629

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 25

ctagcgccac catgaatgcc aaggtcgttg tggtgcttgt acttgtgctg actgctctgt 60

gtctgagcga cggaaaacca gtctccctca gctacaggtg cccatgccga ttcttcgaat 120

ctcatgtggc ccgggccaat gtgaagcact tgaaaatcct gaatacaccc aactgcgcgt 180

tgcagatcgt ggcccgcctg aaaaataata ataggcaggt atgtatcgat ccaaagctta 240

agtggatcca ggagtatctg gaaaaggctc tcaataaagg aagcggagct actaacttca 300

gcctgctgaa gcaggctgga gacgtggagg agaaccctgg acctatgaat tttctgctct 360

cttgggtgca ctggtcactg gcactgctgc tgtatctgca ccatgcaaaa tggtcccaag 420

cagctcccat ggcagaggga ggtggacaga atcatcatga ggttgtcaaa tttatggatg 480

tctaccagcg gagctactgc cacccaattg agacgttggt agacattttt caggaatatc 540

cagacgagat tgagtacatt ttcaagccta gctgtgtgcc cttgatgcga tgcggtggct 600

gttgcaatga tgagggactc gagtgtgtcc ccaccgagga aagcaatata accatgcaaa 660

tcatgcgaat caaaccccac cagggccagc atatcggcga gatgtctttc ttgcaacata 720

acaaatgcga gtgtcggcca aagaaggaca gggctcgcca ggaaaatccc tgtggtcctt 780

gttcagagcg caggaagcat cttttcgtcc aggatccgca gacttgtaaa tgttcatgca 840

agaataccga ttctaggtgt aaggcgaggc aactcgagct taacgagaga acctgtaggt 900

gtgacaaacc tagaagataa atcgattacg ctcctctact ctttgagaca tcactggcct 960

ataataaatg ggttaattta tgtaacaaaa ttgccttggc ttgttaactt tattagacat 1020

tctgatgttt gcattgtgta aatactgttg tattggaaaa gcgtgccaag atggattatt 1080

gtaattcagt gtctttttta gtagcgtcac gtgccaaaca ctgttagtca cagagggcat 1140

gagacagcct gtgctggaac agctcagttc atagggctat ggagatgggg agaaaggggc 1200

gcttctgtca gagacaagct gtggtctggg aaggccttag cactaaaagc accacaatga 1260

gaagcaaccg ccagaagcag ggcccgcagg cctttgttcc agctgcaaag agaaaggaaa 1320

aagtggggaa taagagttgg ggctgcggag ggggtgggga gcattgtgca ggttccgtac 1380

ttgaacagaa agcagggacc aacacaagga aggctcgagc tggcggaata ggttccaatc 1440

tgtcgcggcc gcattaccct gttatcccta atctcgttta actatgactc tcttaaggta 1500

gccaaattcc ggaactataa attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc 1560

tgtcgtgcca gctgcataaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg 1620

ggcgcgcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 1680

cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 1740

gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 1800

tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 1860

agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 1920

tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 1980

cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 2040

ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 2100

ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 2160

ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 2220

ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 2280

cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 2340

gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 2400

atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 2460

ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 2520

gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacatgcgc atctgacgct 2580

cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatgc ctcagaagaa ctcgtcaaga 2640

aggcgataga aggcgatgcg ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag 2700

cggtcagccc attcgccgcc aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc 2760

tgatagcggt ccgccacacc cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt 2820

tccaccatga tattcggcaa gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg 2880

ggcatgcgcg ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg 2940

tccagatcat cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga 3000

tgtttcgctt ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt 3060

gcatcagcca tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc 3120

cccggcactt cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca 3180

gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcctgcagt 3240

tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac 3300

agccggaaca cggcggcatc agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat 3360

agcctctcca cccaagcggc cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga 3420

aacgatcctc attcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta 3480

tttaggctga gcatctatgt cgggtgcgga gaaagaggta atgaaatggc aggcgccttt 3540

ttcgttagat atgtagtaag tatcttaata tacagcttta tctgtttttt aagatactta 3600

ctacttttct tagtggaaac tattagtggc tgttaattaa gctagtacta cccaagattt 3660

gacagaatgc atcgtttgca ttcgaataac tataacggtc ctaaggtagc gacgtacgaa 3720

ccgttgggcg cgcctgggga tagcgatcgc tgctggcgcg gtccgctatg aggtctctga 3780

tagaccacag acgcgtcgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 3840

gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 3900

gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 3960

agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gactatttac ggtaaactgc 4020

ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga 4080

cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg 4140

gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatgggt cgaggtgagc cccacgttct 4200

gcttcactct ccccatctcc cccccctccc cacccccaat tttgtattta tttatttttt 4260

aattattttg tgcagcgatg ggggcggggg gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg 4320

cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc 4380

gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga 4440

agcgcgcggc gggcgggagt cgctgcgttg ccttcgcccc gtgccccgct ccgcgccgcc 4500

tcgcgccgcc cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag cgggcgggac 4560

ggcccttctc ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat gacggctcgt ttcttttctg 4620

tggctgcgtg aaagccttaa agggctccgg gagggccctt tgtgcggggg ggagcggctc 4680

ggggggtgcg tgcgtgtgtg tgtgcgtggg gagcgccgcg tgcggcccgc gctgcccggc 4740

ggctgtgagc gctgcgggcg cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcgtgtg cgcgagggga 4800

gcgcggccgg gggcggtgcc ccgcggtgcg ggggggctgc gaggggaaca aaggctgcgt 4860

gcggggtgtg tgcgtggggg ggtgagcagg gggtgtgggc gcggcggtcg ggctgtaacc 4920

cccccctgca cccccctccc cgagttgctg agcacggccc ggcttcgggt gcggggctcc 4980

gtgcggggcg tggcgcgggg ctcgccgtgc cgggcggggg gtggcggcag gtgggggtgc 5040

cgggcggggc ggggccgcct cgggccgggg agggctcggg ggaggggcgc ggcggccccg 5100

gagcgccggc ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg 5160

cgagagggcg cagggacttc ctttgtccca aatctggcgg agccgaaatc tgggaggcgc 5220

cgccgcaccc cctctagcgg gcgcgggcga agcggtgcgg cgccggcagg aaggaaatgg 5280

gcggggaggg ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccatctc cagcctcggg 5340

gctgccgcag ggggacggct gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg 5400

gcgtgtgacc ggcggctcta gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct 5460

acagctcctg ggcaacgtgc tggttgttgt gctgtctcat cattttggca aagaattccc 5520

tgcaggaaat tgagcccgca gcctcccgct tcgctctctg ctcctcctgt tcgacagtca 5580

gccgcatctt cttttgcgtc gccagccgag ccacatcgct cagacaccg 5629

<210> 26

<211> 5629

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 26

ctagcgccac catgaatttt ctgctctctt gggtgcactg gtcactggca ctgctgctgt 60

atctgcacca tgcaaaatgg tcccaagcag ctcccatggc agagggaggt ggacagaatc 120

atcatgaggt tgtcaaattt atggatgtct accagcggag ctactgccac ccaattgaga 180

cgttggtaga catttttcag gaatatccag acgagattga gtacattttc aagcctagct 240

gtgtgccctt gatgcgatgc ggtggctgtt gcaatgatga gggactcgag tgtgtcccca 300

ccgaggaaag caatataacc atgcaaatca tgcgaatcaa accccaccag ggccagcata 360

tcggcgagat gtctttcttg caacataaca aatgcgagtg tcggccaaag aaggacaggg 420

ctcgccagga aaatccctgt ggtccttgtt cagagcgcag gaagcatctt ttcgtccagg 480

atccgcagac ttgtaaatgt tcatgcaaga ataccgattc taggtgtaag gcgaggcaac 540

tcgagcttaa cgagagaacc tgtaggtgtg acaaacctag aagaggaagc ggagctacta 600

acttcagcct gctgaagcag gctggagacg tggaggagaa ccctggacct atgaatgcca 660

aggtcgttgt ggtgcttgta cttgtgctga ctgctctgtg tctgagcgac ggaaaaccag 720

tctccctcag ctacaggtgc ccatgccgat tcttcgaatc tcatgtggcc cgggccaatg 780

tgaagcactt gaaaatcctg aatacaccca actgcgcgtt gcagatcgtg gcccgcctga 840

aaaataataa taggcaggta tgtatcgatc caaagcttaa gtggatccag gagtatctgg 900

aaaaggctct caataaataa atcgattacg ctcctctact ctttgagaca tcactggcct 960

ataataaatg ggttaattta tgtaacaaaa ttgccttggc ttgttaactt tattagacat 1020

tctgatgttt gcattgtgta aatactgttg tattggaaaa gcgtgccaag atggattatt 1080

gtaattcagt gtctttttta gtagcgtcac gtgccaaaca ctgttagtca cagagggcat 1140

gagacagcct gtgctggaac agctcagttc atagggctat ggagatgggg agaaaggggc 1200

gcttctgtca gagacaagct gtggtctggg aaggccttag cactaaaagc accacaatga 1260

gaagcaaccg ccagaagcag ggcccgcagg cctttgttcc agctgcaaag agaaaggaaa 1320

aagtggggaa taagagttgg ggctgcggag ggggtgggga gcattgtgca ggttccgtac 1380

ttgaacagaa agcagggacc aacacaagga aggctcgagc tggcggaata ggttccaatc 1440

tgtcgcggcc gcattaccct gttatcccta atctcgttta actatgactc tcttaaggta 1500

gccaaattcc ggaactataa attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc 1560

tgtcgtgcca gctgcataaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg 1620

ggcgcgcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 1680

cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 1740

gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 1800

tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 1860

agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 1920

tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 1980

cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 2040

ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 2100

ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 2160

ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 2220

ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 2280

cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 2340

gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 2400

atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 2460

ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 2520

gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacatgcgc atctgacgct 2580

cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatgc ctcagaagaa ctcgtcaaga 2640

aggcgataga aggcgatgcg ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag 2700

cggtcagccc attcgccgcc aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc 2760

tgatagcggt ccgccacacc cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt 2820

tccaccatga tattcggcaa gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg 2880

ggcatgcgcg ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg 2940

tccagatcat cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga 3000

tgtttcgctt ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt 3060

gcatcagcca tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc 3120

cccggcactt cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca 3180

gctgcgcaag gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcctgcagt 3240

tcattcaggg caccggacag gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac 3300

agccggaaca cggcggcatc agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat 3360

agcctctcca cccaagcggc cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga 3420

aacgatcctc attcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta 3480

tttaggctga gcatctatgt cgggtgcgga gaaagaggta atgaaatggc aggcgccttt 3540

ttcgttagat atgtagtaag tatcttaata tacagcttta tctgtttttt aagatactta 3600

ctacttttct tagtggaaac tattagtggc tgttaattaa gctagtacta cccaagattt 3660

gacagaatgc atcgtttgca ttcgaataac tataacggtc ctaaggtagc gacgtacgaa 3720

ccgttgggcg cgcctgggga tagcgatcgc tgctggcgcg gtccgctatg aggtctctga 3780

tagaccacag acgcgtcgac attgattatt gactagttat taatagtaat caattacggg 3840

gtcattagtt catagcccat atatggagtt ccgcgttaca taacttacgg taaatggccc 3900

gcctggctga ccgcccaacg acccccgccc attgacgtca ataatgacgt atgttcccat 3960

agtaacgcca atagggactt tccattgacg tcaatgggtg gactatttac ggtaaactgc 4020

ccacttggca gtacatcaag tgtatcatat gccaagtacg ccccctattg acgtcaatga 4080

cggtaaatgg cccgcctggc attatgccca gtacatgacc ttatgggact ttcctacttg 4140

gcagtacatc tacgtattag tcatcgctat taccatgggt cgaggtgagc cccacgttct 4200

gcttcactct ccccatctcc cccccctccc cacccccaat tttgtattta tttatttttt 4260

aattattttg tgcagcgatg ggggcggggg gggggggggc gcgcgccagg cggggcgggg 4320

cggggcgagg ggcggggcgg ggcgaggcgg agaggtgcgg cggcagccaa tcagagcggc 4380

gcgctccgaa agtttccttt tatggcgagg cggcggcggc ggcggcccta taaaaagcga 4440

agcgcgcggc gggcgggagt cgctgcgttg ccttcgcccc gtgccccgct ccgcgccgcc 4500

tcgcgccgcc cgccccggct ctgactgacc gcgttactcc cacaggtgag cgggcgggac 4560

ggcccttctc ctccgggctg taattagcgc ttggtttaat gacggctcgt ttcttttctg 4620

tggctgcgtg aaagccttaa agggctccgg gagggccctt tgtgcggggg ggagcggctc 4680

ggggggtgcg tgcgtgtgtg tgtgcgtggg gagcgccgcg tgcggcccgc gctgcccggc 4740

ggctgtgagc gctgcgggcg cggcgcgggg ctttgtgcgc tccgcgtgtg cgcgagggga 4800

gcgcggccgg gggcggtgcc ccgcggtgcg ggggggctgc gaggggaaca aaggctgcgt 4860

gcggggtgtg tgcgtggggg ggtgagcagg gggtgtgggc gcggcggtcg ggctgtaacc 4920

cccccctgca cccccctccc cgagttgctg agcacggccc ggcttcgggt gcggggctcc 4980

gtgcggggcg tggcgcgggg ctcgccgtgc cgggcggggg gtggcggcag gtgggggtgc 5040

cgggcggggc ggggccgcct cgggccgggg agggctcggg ggaggggcgc ggcggccccg 5100

gagcgccggc ggctgtcgag gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg 5160

cgagagggcg cagggacttc ctttgtccca aatctggcgg agccgaaatc tgggaggcgc 5220

cgccgcaccc cctctagcgg gcgcgggcga agcggtgcgg cgccggcagg aaggaaatgg 5280

gcggggaggg ccttcgtgcg tcgccgcgcc gccgtcccct tctccatctc cagcctcggg 5340

gctgccgcag ggggacggct gccttcgggg gggacggggc agggcggggt tcggcttctg 5400

gcgtgtgacc ggcggctcta gagcctctgc taaccatgtt catgccttct tctttttcct 5460

acagctcctg ggcaacgtgc tggttgttgt gctgtctcat cattttggca aagaattccc 5520

tgcaggaaat tgagcccgca gcctcccgct tcgctctctg ctcctcctgt tcgacagtca 5580

gccgcatctt cttttgcgtc gccagccgag ccacatcgct cagacaccg 5629

<210> 27

<211> 5365

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 27

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

tcgctgctgg cgcggtccgc tatgaggtct ctgatagacc acagacgcgt cgacattgat 120

tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 180

agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 240

gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 300

gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 360

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 420

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 480

ctattaccat gggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc 540

tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg 600

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 660

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 720

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 780

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 840

gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 900

gcgcttggtt taatgacggc tcgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttaaagggct 960

ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1020

tggggagcgc cgcgtgcggc ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg ggcgcggcgc 1080

ggggctttgt gcgctccgcg tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg 1140

tgcggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag 1200

cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt aacccccccc tgcacccccc tccccgagtt 1260

gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtgcgg ggcgtggcgc ggggctcgcc 1320

gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc 1380

ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg 1440

cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt 1500

cccaaatctg gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc accccctcta gcgggcgcgg 1560

gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg 1620

cgccgccgtc cccttctcca tctccagcct cggggctgcc gcagggggac ggctgccttc 1680

gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc tctagagcct 1740

ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac gtgctggttg 1800

ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tccctgcagg aaattgagcc cgcagcctcc 1860

cgcttcgctc tctgctcctc ctgttcgaca gtcagccgca tcttcttttg cgtcgccagc 1920

cgagccacat cgctcagaca ccgctagcgc caccatgggc agcgaactgg aaaccgccat 1980

ggagactttg ataaatgttt tccacgcgca tagcggcaaa gaaggggaca agtacaagct 2040

gtcaaaaaag gagctgaaag aactgctgca gaccgaattg agcggcttcc tggacgctca 2100

gaaagatgtc gatgccgtcg acaaagtgat gaaagagctt gacgagaacg gtgacggtga 2160

agtcgatttt caggaatatg tggtgctggt ggccgccctt actgtagcat gcaacaattt 2220

cttttgggaa aattcacgtg caaagcgtgc accggtgaaa cagggaagcg gagctactaa 2280

cttcagcctg ctgaagcagg ctggagacgt ggaggagaac cctggaccta tgaatgccaa 2340

ggtcgttgtg gtgcttgtac ttgtgctgac tgctctgtgt ctgagcgacg gaaaaccagt 2400

ctccctcagc tacaggtgcc catgccgatt cttcgaatct catgtggccc gggccaatgt 2460

gaagcacttg aaaatcctga atacacccaa ctgcgcgttg cagatcgtgg cccgcctgaa 2520

aaataataat aggcaggtat gtatcgatcc aaagcttaag tggatccagg agtatctgga 2580

aaaggctctc aataaataaa tcgattacgc tcctctactc tttgagacat cactggccta 2640

taataaatgg gttaatttat gtaacaaaat tgccttggct tgttaacttt attagacatt 2700

ctgatgtttg cattgtgtaa atactgttgt attggaaaag cgtgccaaga tggattattg 2760

taattcagtg tcttttttag tagcgtcacg tgccaaacac tgttagtcac agagggcatg 2820

agacagcctg tgctggaaca gctcagttca tagggctatg gagatgggga gaaaggggcg 2880

cttctgtcag agacaagctg tggtctggga aggccttagc actaaaagca ccacaatgag 2940

aagcaaccgc cagaagcagg gcccgcaggc ctttgttcca gctgcaaaga gaaaggaaaa 3000

agtggggaat aagagttggg gctgcggagg gggtggggag cattgtgcag gttccgtact 3060

tgaacagaaa gcagggacca acacaaggaa ggctcgagct ggcggaatag gttccaatct 3120

gtcgcggccg cattaccctg ttatccctaa tctcgtttaa ctatgactct cttaaggtag 3180

ccaaattccg gaactataaa ttgcgttgcg ctcactgccc gctttccagt cgggaaacct 3240

gtcgtgccag ctgcataaat gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg 3300

gcgcgcttcc gcttcctcgc tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc 3360

ggtatcagct cactcaaagg cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg 3420

aaagaacatg tgagcaaaag gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct 3480

ggcgtttttc cataggctcc gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca 3540

gaggtggcga aacccgacag gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct 3600

cgtgcgctct cctgttccga ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc 3660

gggaagcgtg gcgctttctc atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt 3720

tcgctccaag ctgggctgtg tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc 3780

cggtaactat cgtcttgagt ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc 3840

cactggtaac aggattagca gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg 3900

gtggcctaac tacggctaca ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc 3960

agttaccttc ggaaaaagag ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag 4020

cggtggtttt tttgtttgca agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga 4080

tcctttgatc ttttctacgg ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat 4140

tttggtcatg agattatcaa aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag 4200

ttttaaatca atctaaagta tatatgagta aacttggtct gacatgcgca tctgacgctc 4260

agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgcc tcagaagaac tcgtcaagaa 4320

ggcgatagaa ggcgatgcgc tgcgaatcgg gagcggcgat accgtaaagc acgaggaagc 4380

ggtcagccca ttcgccgcca agctcttcag caatatcacg ggtagccaac gctatgtcct 4440

gatagcggtc cgccacaccc agccggccac agtcgatgaa tccagaaaag cggccatttt 4500

ccaccatgat attcggcaag caggcatcgc catgggtcac gacgagatcc tcgccgtcgg 4560

gcatgcgcgc cttgagcctg gcgaacagtt cggctggcgc gagcccctga tgctcttcgt 4620

ccagatcatc ctgatcgaca agaccggctt ccatccgagt acgtgctcgc tcgatgcgat 4680

gtttcgcttg gtggtcgaat gggcaggtag ccggatcaag cgtatgcagc cgccgcattg 4740

catcagccat gatggatact ttctcggcag gagcaaggtg agatgacagg agatcctgcc 4800

ccggcacttc gcccaatagc agccagtccc ttcccgcttc agtgacaacg tcgagcacag 4860

ctgcgcaagg aacgcccgtc gtggccagcc acgatagccg cgctgcctcg tcctgcagtt 4920

cattcagggc accggacagg tcggtcttga caaaaagaac cgggcgcccc tgcgctgaca 4980

gccggaacac ggcggcatca gagcagccga ttgtctgttg tgcccagtca tagccgaata 5040

gcctctccac ccaagcggcc ggagaacctg cgtgcaatcc atcttgttca atcatgcgaa 5100

acgatcctca ttcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 5160

ttaggctgag catctatgtc gggtgcggag aaagaggtaa tgaaatggca ggcgcctttt 5220

tcgttagata tgtagtaagt atcttaatat acagctttat ctgtttttta agatacttac 5280

tacttttctt agtggaaact attagtggct gttaattaag ctagtactac ccaagatttg 5340

acagaatgca tcgtttgcat tcgaa 5365

<210> 28

<211> 5365

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 28

ctagcgccac catgaatgcc aaggtcgttg tggtgcttgt acttgtgctg actgctctgt 60

gtctgagcga cggaaaacca gtctccctca gctacaggtg cccatgccga ttcttcgaat 120

ctcatgtggc ccgggccaat gtgaagcact tgaaaatcct gaatacaccc aactgcgcgt 180

tgcagatcgt ggcccgcctg aaaaataata ataggcaggt atgtatcgat ccaaagctta 240

agtggatcca ggagtatctg gaaaaggctc tcaataaacg tgcaaagcgt gcaccggtga 300

aacagggaag cggagctact aacttcagcc tgctgaagca ggctggagac gtggaggaga 360

accctggacc tatgggcagc gaactggaaa ccgccatgga gactttgata aatgttttcc 420

acgcgcatag cggcaaagaa ggggacaagt acaagctgtc aaaaaaggag ctgaaagaac 480

tgctgcagac cgaattgagc ggcttcctgg acgctcagaa agatgtcgat gccgtcgaca 540

aagtgatgaa agagcttgac gagaacggtg acggtgaagt cgattttcag gaatatgtgg 600

tgctggtggc cgcccttact gtagcatgca acaatttctt ttgggaaaat tcataaatcg 660

attacgctcc tctactcttt gagacatcac tggcctataa taaatgggtt aatttatgta 720

acaaaattgc cttggcttgt taactttatt agacattctg atgtttgcat tgtgtaaata 780

ctgttgtatt ggaaaagcgt gccaagatgg attattgtaa ttcagtgtct tttttagtag 840

cgtcacgtgc caaacactgt tagtcacaga gggcatgaga cagcctgtgc tggaacagct 900

cagttcatag ggctatggag atggggagaa aggggcgctt ctgtcagaga caagctgtgg 960

tctgggaagg ccttagcact aaaagcacca caatgagaag caaccgccag aagcagggcc 1020

cgcaggcctt tgttccagct gcaaagagaa aggaaaaagt ggggaataag agttggggct 1080

gcggaggggg tggggagcat tgtgcaggtt ccgtacttga acagaaagca gggaccaaca 1140

caaggaaggc tcgagctggc ggaataggtt ccaatctgtc gcggccgcat taccctgtta 1200

tccctaatct cgtttaacta tgactctctt aaggtagcca aattccggaa ctataaattg 1260

cgttgcgctc actgcccgct ttccagtcgg gaaacctgtc gtgccagctg cataaatgaa 1320

tcggccaacg cgcggggaga ggcggtttgc gtattgggcg cgcttccgct tcctcgctca 1380

ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac tcaaaggcgg 1440

taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaacatgtga gcaaaaggcc 1500

agcaaaaggc caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc 1560

cccctgacga gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac 1620

tataaagata ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc 1680

tgccgcttac cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata 1740

gctcacgctg taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc 1800

acgaaccccc cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca 1860

acccggtaag acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag 1920

cgaggtatgt aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta 1980

gaagaacagt atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga aaaagagttg 2040

gtagctcttg atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc 2100

agcagattac gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt 2160

ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa 2220

ggatcttcac ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat 2280

atgagtaaac ttggtctgac atgcgcatct gacgctcagt ggaacgaaaa ctcacgttaa 2340

gggattttgg tcatgcctca gaagaactcg tcaagaaggc gatagaaggc gatgcgctgc 2400

gaatcgggag cggcgatacc gtaaagcacg aggaagcggt cagcccattc gccgccaagc 2460

tcttcagcaa tatcacgggt agccaacgct atgtcctgat agcggtccgc cacacccagc 2520

cggccacagt cgatgaatcc agaaaagcgg ccattttcca ccatgatatt cggcaagcag 2580

gcatcgccat gggtcacgac gagatcctcg ccgtcgggca tgcgcgcctt gagcctggcg 2640

aacagttcgg ctggcgcgag cccctgatgc tcttcgtcca gatcatcctg atcgacaaga 2700

ccggcttcca tccgagtacg tgctcgctcg atgcgatgtt tcgcttggtg gtcgaatggg 2760

caggtagccg gatcaagcgt atgcagccgc cgcattgcat cagccatgat ggatactttc 2820

tcggcaggag caaggtgaga tgacaggaga tcctgccccg gcacttcgcc caatagcagc 2880

cagtcccttc ccgcttcagt gacaacgtcg agcacagctg cgcaaggaac gcccgtcgtg 2940

gccagccacg atagccgcgc tgcctcgtcc tgcagttcat tcagggcacc ggacaggtcg 3000

gtcttgacaa aaagaaccgg gcgcccctgc gctgacagcc ggaacacggc ggcatcagag 3060

cagccgattg tctgttgtgc ccagtcatag ccgaatagcc tctccaccca agcggccgga 3120

gaacctgcgt gcaatccatc ttgttcaatc atgcgaaacg atcctcattc atttatcagg 3180

gttattgtct catgagcgga tacatatttg aatgtattta ggctgagcat ctatgtcggg 3240

tgcggagaaa gaggtaatga aatggcaggc gcctttttcg ttagatatgt agtaagtatc 3300

ttaatataca gctttatctg ttttttaaga tacttactac ttttcttagt ggaaactatt 3360

agtggctgtt aattaagcta gtactaccca agatttgaca gaatgcatcg tttgcattcg 3420

aataactata acggtcctaa ggtagcgacg tacgaaccgt tgggcgcgcc tggggatagc 3480

gatcgctgct ggcgcggtcc gctatgaggt ctctgataga ccacagacgc gtcgacattg 3540

attattgact agttattaat agtaatcaat tacggggtca ttagttcata gcccatatat 3600

ggagttccgc gttacataac ttacggtaaa tggcccgcct ggctgaccgc ccaacgaccc 3660

ccgcccattg acgtcaataa tgacgtatgt tcccatagta acgccaatag ggactttcca 3720

ttgacgtcaa tgggtggact atttacggta aactgcccac ttggcagtac atcaagtgta 3780

tcatatgcca agtacgcccc ctattgacgt caatgacggt aaatggcccg cctggcatta 3840

tgcccagtac atgaccttat gggactttcc tacttggcag tacatctacg tattagtcat 3900

cgctattacc atgggtcgag gtgagcccca cgttctgctt cactctcccc atctcccccc 3960

cctccccacc cccaattttg tatttattta ttttttaatt attttgtgca gcgatggggg 4020

cggggggggg gggggcgcgc gccaggcggg gcggggcggg gcgaggggcg gggcggggcg 4080

aggcggagag gtgcggcggc agccaatcag agcggcgcgc tccgaaagtt tccttttatg 4140

gcgaggcggc ggcggcggcg gccctataaa aagcgaagcg cgcggcgggc gggagtcgct 4200

gcgttgcctt cgccccgtgc cccgctccgc gccgcctcgc gccgcccgcc ccggctctga 4260

ctgaccgcgt tactcccaca ggtgagcggg cgggacggcc cttctcctcc gggctgtaat 4320

tagcgcttgg tttaatgacg gctcgtttct tttctgtggc tgcgtgaaag ccttaaaggg 4380

ctccgggagg gccctttgtg cgggggggag cggctcgggg ggtgcgtgcg tgtgtgtgtg 4440

cgtggggagc gccgcgtgcg gcccgcgctg cccggcggct gtgagcgctg cgggcgcggc 4500

gcggggcttt gtgcgctccg cgtgtgcgcg aggggagcgc ggccgggggc ggtgccccgc 4560

ggtgcggggg ggctgcgagg ggaacaaagg ctgcgtgcgg ggtgtgtgcg tgggggggtg 4620

agcagggggt gtgggcgcgg cggtcgggct gtaacccccc cctgcacccc cctccccgag 4680

ttgctgagca cggcccggct tcgggtgcgg ggctccgtgc ggggcgtggc gcggggctcg 4740

ccgtgccggg cggggggtgg cggcaggtgg gggtgccggg cggggcgggg ccgcctcggg 4800

ccggggaggg ctcgggggag gggcgcggcg gccccggagc gccggcggct gtcgaggcgc 4860

ggcgagccgc agccattgcc ttttatggta atcgtgcgag agggcgcagg gacttccttt 4920

gtcccaaatc tggcggagcc gaaatctggg aggcgccgcc gcaccccctc tagcgggcgc 4980

gggcgaagcg gtgcggcgcc ggcaggaagg aaatgggcgg ggagggcctt cgtgcgtcgc 5040

cgcgccgccg tccccttctc catctccagc ctcggggctg ccgcaggggg acggctgcct 5100

tcggggggga cggggcaggg cggggttcgg cttctggcgt gtgaccggcg gctctagagc 5160

ctctgctaac catgttcatg ccttcttctt tttcctacag ctcctgggca acgtgctggt 5220

tgttgtgctg tctcatcatt ttggcaaaga attccctgca ggaaattgag cccgcagcct 5280

cccgcttcgc tctctgctcc tcctgttcga cagtcagccg catcttcttt tgcgtcgcca 5340

gccgagccac atcgctcaga caccg 5365

<210> 29

<211> 5656

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 29

ctagcgccac catgaatgcc aaggtcgttg tggtgcttgt acttgtgctg actgctctgt 60

gtctgagcga cggaaaacca gtctccctca gctacaggtg cccatgccga ttcttcgaat 120

ctcatgtggc ccgggccaat gtgaagcact tgaaaatcct gaatacaccc aactgcgcgt 180

tgcagatcgt ggcccgcctg aaaaataata ataggcaggt atgtatcgat ccaaagctta 240

agtggatcca ggagtatctg gaaaaggctc tcaataaacg tgcaaagcgt gcaccggtga 300

aacagggaag cggagctact aacttcagcc tgctgaagca ggctggagac gtggaggaga 360

accctggacc tatgaatttt ctgctctctt gggtgcactg gtcactggca ctgctgctgt 420

atctgcacca tgcaaaatgg tcccaagcag ctcccatggc agagggaggt ggacagaatc 480

atcatgaggt tgtcaaattt atggatgtct accagcggag ctactgccac ccaattgaga 540

cgttggtaga catttttcag gaatatccag acgagattga gtacattttc aagcctagct 600

gtgtgccctt gatgcgatgc ggtggctgtt gcaatgatga gggactcgag tgtgtcccca 660

ccgaggaaag caatataacc atgcaaatca tgcgaatcaa accccaccag ggccagcata 720

tcggcgagat gtctttcttg caacataaca aatgcgagtg tcggccaaag aaggacaggg 780

ctcgccagga aaatccctgt ggtccttgtt cagagcgcag gaagcatctt ttcgtccagg 840

atccgcagac ttgtaaatgt tcatgcaaga ataccgattc taggtgtaag gcgaggcaac 900

tcgagcttaa cgagagaacc tgtaggtgtg acaaacctag aagataaatc gattacgctc 960

ctctactctt tgagacatca ctggcctata ataaatgggt taatttatgt aacaaaattg 1020

ccttggcttg ttaactttat tagacattct gatgtttgca ttgtgtaaat actgttgtat 1080

tggaaaagcg tgccaagatg gattattgta attcagtgtc ttttttagta gcgtcacgtg 1140

ccaaacactg ttagtcacag agggcatgag acagcctgtg ctggaacagc tcagttcata 1200

gggctatgga gatggggaga aaggggcgct tctgtcagag acaagctgtg gtctgggaag 1260

gccttagcac taaaagcacc acaatgagaa gcaaccgcca gaagcagggc ccgcaggcct 1320

ttgttccagc tgcaaagaga aaggaaaaag tggggaataa gagttggggc tgcggagggg 1380

gtggggagca ttgtgcaggt tccgtacttg aacagaaagc agggaccaac acaaggaagg 1440

ctcgagctgg cggaataggt tccaatctgt cgcggccgca ttaccctgtt atccctaatc 1500

tcgtttaact atgactctct taaggtagcc aaattccgga actataaatt gcgttgcgct 1560

cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct gcataaatga atcggccaac 1620

gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gcgcttccgc ttcctcgctc actgactcgc 1680

tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca ctcaaaggcg gtaatacggt 1740

tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg agcaaaaggc cagcaaaagg 1800

ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca taggctccgc ccccctgacg 1860

agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa cccgacagga ctataaagat 1920

accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc tgttccgacc ctgccgctta 1980

ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc gctttctcat agctcacgct 2040

gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct gggctgtgtg cacgaacccc 2100

ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg tcttgagtcc aacccggtaa 2160

gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag gattagcaga gcgaggtatg 2220

taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta cggctacact agaagaacag 2280

tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg aaaaagagtt ggtagctctt 2340

gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt tgtttgcaag cagcagatta 2400

cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt ttctacgggg tctgacgctc 2460

agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag attatcaaaa aggatcttca 2520

cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat ctaaagtata tatgagtaaa 2580

cttggtctga catgcgcatc tgacgctcag tggaacgaaa actcacgtta agggattttg 2640

gtcatgcctc agaagaactc gtcaagaagg cgatagaagg cgatgcgctg cgaatcggga 2700

gcggcgatac cgtaaagcac gaggaagcgg tcagcccatt cgccgccaag ctcttcagca 2760

atatcacggg tagccaacgc tatgtcctga tagcggtccg ccacacccag ccggccacag 2820

tcgatgaatc cagaaaagcg gccattttcc accatgatat tcggcaagca ggcatcgcca 2880

tgggtcacga cgagatcctc gccgtcgggc atgcgcgcct tgagcctggc gaacagttcg 2940

gctggcgcga gcccctgatg ctcttcgtcc agatcatcct gatcgacaag accggcttcc 3000

atccgagtac gtgctcgctc gatgcgatgt ttcgcttggt ggtcgaatgg gcaggtagcc 3060

ggatcaagcg tatgcagccg ccgcattgca tcagccatga tggatacttt ctcggcagga 3120

gcaaggtgag atgacaggag atcctgcccc ggcacttcgc ccaatagcag ccagtccctt 3180

cccgcttcag tgacaacgtc gagcacagct gcgcaaggaa cgcccgtcgt ggccagccac 3240

gatagccgcg ctgcctcgtc ctgcagttca ttcagggcac cggacaggtc ggtcttgaca 3300

aaaagaaccg ggcgcccctg cgctgacagc cggaacacgg cggcatcaga gcagccgatt 3360

gtctgttgtg cccagtcata gccgaatagc ctctccaccc aagcggccgg agaacctgcg 3420

tgcaatccat cttgttcaat catgcgaaac gatcctcatt catttatcag ggttattgtc 3480

tcatgagcgg atacatattt gaatgtattt aggctgagca tctatgtcgg gtgcggagaa 3540

agaggtaatg aaatggcagg cgcctttttc gttagatatg tagtaagtat cttaatatac 3600

agctttatct gttttttaag atacttacta cttttcttag tggaaactat tagtggctgt 3660

taattaagct agtactaccc aagatttgac agaatgcatc gtttgcattc gaataactat 3720

aacggtccta aggtagcgac gtacgaaccg ttgggcgcgc ctggggatag cgatcgctgc 3780

tggcgcggtc cgctatgagg tctctgatag accacagacg cgtcgacatt gattattgac 3840

tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 3900

cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 3960

gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 4020

atgggtggac tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 4080

aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 4140

catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 4200

catgggtcga ggtgagcccc acgttctgct tcactctccc catctccccc ccctccccac 4260

ccccaatttt gtatttattt attttttaat tattttgtgc agcgatgggg gcgggggggg 4320

ggggggcgcg cgccaggcgg ggcggggcgg ggcgaggggc ggggcggggc gaggcggaga 4380

ggtgcggcgg cagccaatca gagcggcgcg ctccgaaagt ttccttttat ggcgaggcgg 4440

cggcggcggc ggccctataa aaagcgaagc gcgcggcggg cgggagtcgc tgcgttgcct 4500

tcgccccgtg ccccgctccg cgccgcctcg cgccgcccgc cccggctctg actgaccgcg 4560

ttactcccac aggtgagcgg gcgggacggc ccttctcctc cgggctgtaa ttagcgcttg 4620

gtttaatgac ggctcgtttc ttttctgtgg ctgcgtgaaa gccttaaagg gctccgggag 4680

ggccctttgt gcggggggga gcggctcggg gggtgcgtgc gtgtgtgtgt gcgtggggag 4740

cgccgcgtgc ggcccgcgct gcccggcggc tgtgagcgct gcgggcgcgg cgcggggctt 4800

tgtgcgctcc gcgtgtgcgc gaggggagcg cggccggggg cggtgccccg cggtgcgggg 4860

gggctgcgag gggaacaaag gctgcgtgcg gggtgtgtgc gtgggggggt gagcaggggg 4920

tgtgggcgcg gcggtcgggc tgtaaccccc ccctgcaccc ccctccccga gttgctgagc 4980

acggcccggc ttcgggtgcg gggctccgtg cggggcgtgg cgcggggctc gccgtgccgg 5040

gcggggggtg gcggcaggtg ggggtgccgg gcggggcggg gccgcctcgg gccggggagg 5100

gctcggggga ggggcgcggc ggccccggag cgccggcggc tgtcgaggcg cggcgagccg 5160

cagccattgc cttttatggt aatcgtgcga gagggcgcag ggacttcctt tgtcccaaat 5220

ctggcggagc cgaaatctgg gaggcgccgc cgcaccccct ctagcgggcg cgggcgaagc 5280

ggtgcggcgc cggcaggaag gaaatgggcg gggagggcct tcgtgcgtcg ccgcgccgcc 5340

gtccccttct ccatctccag cctcggggct gccgcagggg gacggctgcc ttcggggggg 5400

acggggcagg gcggggttcg gcttctggcg tgtgaccggc ggctctagag cctctgctaa 5460

ccatgttcat gccttcttct ttttcctaca gctcctgggc aacgtgctgg ttgttgtgct 5520

gtctcatcat tttggcaaag aattccctgc aggaaattga gcccgcagcc tcccgcttcg 5580

ctctctgctc ctcctgttcg acagtcagcc gcatcttctt ttgcgtcgcc agccgagcca 5640

catcgctcag acaccg 5656

<210> 30

<211> 5656

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 30

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

tcgctgctgg cgcggtccgc tatgaggtct ctgatagacc acagacgcgt cgacattgat 120

tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 180

agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 240

gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 300

gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 360

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 420

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 480

ctattaccat gggtcgaggt gagccccacg ttctgcttca ctctccccat ctcccccccc 540

tccccacccc caattttgta tttatttatt ttttaattat tttgtgcagc gatgggggcg 600

gggggggggg gggcgcgcgc caggcggggc ggggcggggc gaggggcggg gcggggcgag 660

gcggagaggt gcggcggcag ccaatcagag cggcgcgctc cgaaagtttc cttttatggc 720

gaggcggcgg cggcggcggc cctataaaaa gcgaagcgcg cggcgggcgg gagtcgctgc 780

gttgccttcg ccccgtgccc cgctccgcgc cgcctcgcgc cgcccgcccc ggctctgact 840

gaccgcgtta ctcccacagg tgagcgggcg ggacggccct tctcctccgg gctgtaatta 900

gcgcttggtt taatgacggc tcgtttcttt tctgtggctg cgtgaaagcc ttaaagggct 960

ccgggagggc cctttgtgcg ggggggagcg gctcgggggg tgcgtgcgtg tgtgtgtgcg 1020

tggggagcgc cgcgtgcggc ccgcgctgcc cggcggctgt gagcgctgcg ggcgcggcgc 1080

ggggctttgt gcgctccgcg tgtgcgcgag gggagcgcgg ccgggggcgg tgccccgcgg 1140

tgcggggggg ctgcgagggg aacaaaggct gcgtgcgggg tgtgtgcgtg ggggggtgag 1200

cagggggtgt gggcgcggcg gtcgggctgt aacccccccc tgcacccccc tccccgagtt 1260

gctgagcacg gcccggcttc gggtgcgggg ctccgtgcgg ggcgtggcgc ggggctcgcc 1320

gtgccgggcg gggggtggcg gcaggtgggg gtgccgggcg gggcggggcc gcctcgggcc 1380

ggggagggct cgggggaggg gcgcggcggc cccggagcgc cggcggctgt cgaggcgcgg 1440

cgagccgcag ccattgcctt ttatggtaat cgtgcgagag ggcgcaggga cttcctttgt 1500

cccaaatctg gcggagccga aatctgggag gcgccgccgc accccctcta gcgggcgcgg 1560

gcgaagcggt gcggcgccgg caggaaggaa atgggcgggg agggccttcg tgcgtcgccg 1620

cgccgccgtc cccttctcca tctccagcct cggggctgcc gcagggggac ggctgccttc 1680

gggggggacg gggcagggcg gggttcggct tctggcgtgt gaccggcggc tctagagcct 1740

ctgctaacca tgttcatgcc ttcttctttt tcctacagct cctgggcaac gtgctggttg 1800

ttgtgctgtc tcatcatttt ggcaaagaat tccctgcagg aaattgagcc cgcagcctcc 1860

cgcttcgctc tctgctcctc ctgttcgaca gtcagccgca tcttcttttg cgtcgccagc 1920

cgagccacat cgctcagaca ccgctagcgc caccatgaat tttctgctct cttgggtgca 1980

ctggtcactg gcactgctgc tgtatctgca ccatgcaaaa tggtcccaag cagctcccat 2040

ggcagaggga ggtggacaga atcatcatga ggttgtcaaa tttatggatg tctaccagcg 2100

gagctactgc cacccaattg agacgttggt agacattttt caggaatatc cagacgagat 2160

tgagtacatt ttcaagccta gctgtgtgcc cttgatgcga tgcggtggct gttgcaatga 2220

tgagggactc gagtgtgtcc ccaccgagga aagcaatata accatgcaaa tcatgcgaat 2280

caaaccccac cagggccagc atatcggcga gatgtctttc ttgcaacata acaaatgcga 2340

gtgtcggcca aagaaggaca gggctcgcca ggaaaatccc tgtggtcctt gttcagagcg 2400

caggaagcat cttttcgtcc aggatccgca gacttgtaaa tgttcatgca agaataccga 2460

ttctaggtgt aaggcgaggc aactcgagct taacgagaga acctgtaggt gtgacaaacc 2520

tagaagacgt gcaaagcgtg caccggtgaa acagggaagc ggagctacta acttcagcct 2580

gctgaagcag gctggagacg tggaggagaa ccctggacct atgaatgcca aggtcgttgt 2640

ggtgcttgta cttgtgctga ctgctctgtg tctgagcgac ggaaaaccag tctccctcag 2700

ctacaggtgc ccatgccgat tcttcgaatc tcatgtggcc cgggccaatg tgaagcactt 2760

gaaaatcctg aatacaccca actgcgcgtt gcagatcgtg gcccgcctga aaaataataa 2820

taggcaggta tgtatcgatc caaagcttaa gtggatccag gagtatctgg aaaaggctct 2880

caataaataa atcgattacg ctcctctact ctttgagaca tcactggcct ataataaatg 2940

ggttaattta tgtaacaaaa ttgccttggc ttgttaactt tattagacat tctgatgttt 3000

gcattgtgta aatactgttg tattggaaaa gcgtgccaag atggattatt gtaattcagt 3060

gtctttttta gtagcgtcac gtgccaaaca ctgttagtca cagagggcat gagacagcct 3120

gtgctggaac agctcagttc atagggctat ggagatgggg agaaaggggc gcttctgtca 3180

gagacaagct gtggtctggg aaggccttag cactaaaagc accacaatga gaagcaaccg 3240

ccagaagcag ggcccgcagg cctttgttcc agctgcaaag agaaaggaaa aagtggggaa 3300

taagagttgg ggctgcggag ggggtgggga gcattgtgca ggttccgtac ttgaacagaa 3360

agcagggacc aacacaagga aggctcgagc tggcggaata ggttccaatc tgtcgcggcc 3420

gcattaccct gttatcccta atctcgttta actatgactc tcttaaggta gccaaattcc 3480

ggaactataa attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc tgtcgtgcca 3540

gctgcataaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg ggcgcgcttc 3600

cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag cggtatcagc 3660

tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag gaaagaacat 3720

gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc tggcgttttt 3780

ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc agaggtggcg 3840

aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc tcgtgcgctc 3900

tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt cgggaagcgt 3960

ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg ttcgctccaa 4020

gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat ccggtaacta 4080

tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag ccactggtaa 4140

caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt ggtggcctaa 4200

ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc cagttacctt 4260

cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta gcggtggttt 4320

ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag atcctttgat 4380

cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga ttttggtcat 4440

gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa gttttaaatc 4500

aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacatgcgc atctgacgct cagtggaacg 4560

aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatgc ctcagaagaa ctcgtcaaga aggcgataga 4620

aggcgatgcg ctgcgaatcg ggagcggcga taccgtaaag cacgaggaag cggtcagccc 4680

attcgccgcc aagctcttca gcaatatcac gggtagccaa cgctatgtcc tgatagcggt 4740

ccgccacacc cagccggcca cagtcgatga atccagaaaa gcggccattt tccaccatga 4800

tattcggcaa gcaggcatcg ccatgggtca cgacgagatc ctcgccgtcg ggcatgcgcg 4860

ccttgagcct ggcgaacagt tcggctggcg cgagcccctg atgctcttcg tccagatcat 4920

cctgatcgac aagaccggct tccatccgag tacgtgctcg ctcgatgcga tgtttcgctt 4980

ggtggtcgaa tgggcaggta gccggatcaa gcgtatgcag ccgccgcatt gcatcagcca 5040

tgatggatac tttctcggca ggagcaaggt gagatgacag gagatcctgc cccggcactt 5100

cgcccaatag cagccagtcc cttcccgctt cagtgacaac gtcgagcaca gctgcgcaag 5160

gaacgcccgt cgtggccagc cacgatagcc gcgctgcctc gtcctgcagt tcattcaggg 5220

caccggacag gtcggtcttg acaaaaagaa ccgggcgccc ctgcgctgac agccggaaca 5280

cggcggcatc agagcagccg attgtctgtt gtgcccagtc atagccgaat agcctctcca 5340

cccaagcggc cggagaacct gcgtgcaatc catcttgttc aatcatgcga aacgatcctc 5400

attcatttat cagggttatt gtctcatgag cggatacata tttgaatgta tttaggctga 5460

gcatctatgt cgggtgcgga gaaagaggta atgaaatggc aggcgccttt ttcgttagat 5520

atgtagtaag tatcttaata tacagcttta tctgtttttt aagatactta ctacttttct 5580

tagtggaaac tattagtggc tgttaattaa gctagtacta cccaagattt gacagaatgc 5640

atcgtttgca ttcgaa 5656

<210> 31

<211> 5671

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 31

ctagcgccac catgaatttt ctgctctctt gggtgcactg gtcactggca ctgctgctgt 60

atctgcacca tgcaaaatgg tcccaagcag ctcccatggc agagggaggt ggacagaatc 120

atcatgaggt tgtcaaattt atggatgtct accagcggag ctactgccac ccaattgaga 180

cgttggtaga catttttcag gaatatccag acgagattga gtacattttc aagcctagct 240

gtgtgccctt gatgcgatgc ggtggctgtt gcaatgatga gggactcgag tgtgtcccca 300

ccgaggaaag caatataacc atgcaaatca tgcgaatcaa accccaccag ggccagcata 360

tcggcgagat gtctttcttg caacataaca aatgcgagtg tcggccaaag aaggacaggg 420

ctcgccagga aaatccctgt ggtccttgtt cagagcgcag gaagcatctt ttcgtccagg 480

atccgcagac ttgtaaatgt tcatgcaaga ataccgattc taggtgtaag gcgaggcaac 540

tcgagcttaa cgagagaacc tgtaggtgtg acaaacctag aagacgtgca aagcgtgcac 600

cggtgaaaca gggaagcgga gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg 660

aggagaaccc tggacctatg ggcagcgaac tggaaaccgc catggagact ttgataaatg 720

ttttccacgc gcatagcggc aaagaagggg acaagtacaa gctgtcaaaa aaggagctga 780

aagaactgct gcagaccgaa ttgagcggct tcctggacgc tcagaaagat gtcgatgccg 840

tcgacaaagt gatgaaagag cttgacgaga acggtgacgg tgaagtcgat tttcaggaat 900

atgtggtgct ggtggccgcc cttactgtag catgcaacaa tttcttttgg gaaaattcat 960

aaatcgatta cgctcctcta ctctttgaga catcactggc ctataataaa tgggttaatt 1020

tatgtaacaa aattgccttg gcttgttaac tttattagac attctgatgt ttgcattgtg 1080

taaatactgt tgtattggaa aagcgtgcca agatggatta ttgtaattca gtgtcttttt 1140

tagtagcgtc acgtgccaaa cactgttagt cacagagggc atgagacagc ctgtgctgga 1200

acagctcagt tcatagggct atggagatgg ggagaaaggg gcgcttctgt cagagacaag 1260

ctgtggtctg ggaaggcctt agcactaaaa gcaccacaat gagaagcaac cgccagaagc 1320

agggcccgca ggcctttgtt ccagctgcaa agagaaagga aaaagtgggg aataagagtt 1380

ggggctgcgg agggggtggg gagcattgtg caggttccgt acttgaacag aaagcaggga 1440

ccaacacaag gaaggctcga gctggcggaa taggttccaa tctgtcgcgg ccgcattacc 1500

ctgttatccc taatctcgtt taactatgac tctcttaagg tagccaaatt ccggaactat 1560

aaattgcgtt gcgctcactg cccgctttcc agtcgggaaa cctgtcgtgc cagctgcata 1620

aatgaatcgg ccaacgcgcg gggagaggcg gtttgcgtat tgggcgcgct tccgcttcct 1680

cgctcactga ctcgctgcgc tcggtcgttc ggctgcggcg agcggtatca gctcactcaa 1740

aggcggtaat acggttatcc acagaatcag gggataacgc aggaaagaac atgtgagcaa 1800

aaggccagca aaaggccagg aaccgtaaaa aggccgcgtt gctggcgttt ttccataggc 1860

tccgcccccc tgacgagcat cacaaaaatc gacgctcaag tcagaggtgg cgaaacccga 1920

caggactata aagataccag gcgtttcccc ctggaagctc cctcgtgcgc tctcctgttc 1980

cgaccctgcc gcttaccgga tacctgtccg cctttctccc ttcgggaagc gtggcgcttt 2040

ctcatagctc acgctgtagg tatctcagtt cggtgtaggt cgttcgctcc aagctgggct 2100

gtgtgcacga accccccgtt cagcccgacc gctgcgcctt atccggtaac tatcgtcttg 2160

agtccaaccc ggtaagacac gacttatcgc cactggcagc agccactggt aacaggatta 2220

gcagagcgag gtatgtaggc ggtgctacag agttcttgaa gtggtggcct aactacggct 2280

acactagaag aacagtattt ggtatctgcg ctctgctgaa gccagttacc ttcggaaaaa 2340

gagttggtag ctcttgatcc ggcaaacaaa ccaccgctgg tagcggtggt ttttttgttt 2400

gcaagcagca gattacgcgc agaaaaaaag gatctcaaga agatcctttg atcttttcta 2460

cggggtctga cgctcagtgg aacgaaaact cacgttaagg gattttggtc atgagattat 2520

caaaaaggat cttcacctag atccttttaa attaaaaatg aagttttaaa tcaatctaaa 2580

gtatatatga gtaaacttgg tctgacatgc gcatctgacg ctcagtggaa cgaaaactca 2640

cgttaaggga ttttggtcat gcctcagaag aactcgtcaa gaaggcgata gaaggcgatg 2700

cgctgcgaat cgggagcggc gataccgtaa agcacgagga agcggtcagc ccattcgccg 2760

ccaagctctt cagcaatatc acgggtagcc aacgctatgt cctgatagcg gtccgccaca 2820

cccagccggc cacagtcgat gaatccagaa aagcggccat tttccaccat gatattcggc 2880

aagcaggcat cgccatgggt cacgacgaga tcctcgccgt cgggcatgcg cgccttgagc 2940

ctggcgaaca gttcggctgg cgcgagcccc tgatgctctt cgtccagatc atcctgatcg 3000

acaagaccgg cttccatccg agtacgtgct cgctcgatgc gatgtttcgc ttggtggtcg 3060

aatgggcagg tagccggatc aagcgtatgc agccgccgca ttgcatcagc catgatggat 3120

actttctcgg caggagcaag gtgagatgac aggagatcct gccccggcac ttcgcccaat 3180

agcagccagt cccttcccgc ttcagtgaca acgtcgagca cagctgcgca aggaacgccc 3240

gtcgtggcca gccacgatag ccgcgctgcc tcgtcctgca gttcattcag ggcaccggac 3300

aggtcggtct tgacaaaaag aaccgggcgc ccctgcgctg acagccggaa cacggcggca 3360

tcagagcagc cgattgtctg ttgtgcccag tcatagccga atagcctctc cacccaagcg 3420

gccggagaac ctgcgtgcaa tccatcttgt tcaatcatgc gaaacgatcc tcattcattt 3480

atcagggtta ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttaggct gagcatctat 3540

gtcgggtgcg gagaaagagg taatgaaatg gcaggcgcct ttttcgttag atatgtagta 3600

agtatcttaa tatacagctt tatctgtttt ttaagatact tactactttt cttagtggaa 3660

actattagtg gctgttaatt aagctagtac tacccaagat ttgacagaat gcatcgtttg 3720

cattcgaata actataacgg tcctaaggta gcgacgtacg aaccgttggg cgcgcctggg 3780

gatagcgatc gctgctggcg cggtccgcta tgaggtctct gatagaccac agacgcgtcg 3840

acattgatta ttgactagtt attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc 3900

atatatggag ttccgcgtta cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa 3960

cgacccccgc ccattgacgt caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac 4020

tttccattga cgtcaatggg tggactattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca 4080

agtgtatcat atgccaagta cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg 4140

gcattatgcc cagtacatga ccttatggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt 4200

agtcatcgct attaccatgg gtcgaggtga gccccacgtt ctgcttcact ctccccatct 4260

cccccccctc cccaccccca attttgtatt tatttatttt ttaattattt tgtgcagcga 4320

tgggggcggg gggggggggg gcgcgcgcca ggcggggcgg ggcggggcga ggggcggggc 4380

ggggcgaggc ggagaggtgc ggcggcagcc aatcagagcg gcgcgctccg aaagtttcct 4440

tttatggcga ggcggcggcg gcggcggccc tataaaaagc gaagcgcgcg gcgggcggga 4500

gtcgctgcgt tgccttcgcc ccgtgccccg ctccgcgccg cctcgcgccg cccgccccgg 4560

ctctgactga ccgcgttact cccacaggtg agcgggcggg acggcccttc tcctccgggc 4620

tgtaattagc gcttggttta atgacggctc gtttcttttc tgtggctgcg tgaaagcctt 4680

aaagggctcc gggagggccc tttgtgcggg ggggagcggc tcggggggtg cgtgcgtgtg 4740

tgtgtgcgtg gggagcgccg cgtgcggccc gcgctgcccg gcggctgtga gcgctgcggg 4800

cgcggcgcgg ggctttgtgc gctccgcgtg tgcgcgaggg gagcgcggcc gggggcggtg 4860

ccccgcggtg cgggggggct gcgaggggaa caaaggctgc gtgcggggtg tgtgcgtggg 4920

ggggtgagca gggggtgtgg gcgcggcggt cgggctgtaa cccccccctg cacccccctc 4980

cccgagttgc tgagcacggc ccggcttcgg gtgcggggct ccgtgcgggg cgtggcgcgg 5040

ggctcgccgt gccgggcggg gggtggcggc aggtgggggt gccgggcggg gcggggccgc 5100

ctcgggccgg ggagggctcg ggggaggggc gcggcggccc cggagcgccg gcggctgtcg 5160

aggcgcggcg agccgcagcc attgcctttt atggtaatcg tgcgagaggg cgcagggact 5220

tcctttgtcc caaatctggc ggagccgaaa tctgggaggc gccgccgcac cccctctagc 5280

gggcgcgggc gaagcggtgc ggcgccggca ggaaggaaat gggcggggag ggccttcgtg 5340

cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccatc tccagcctcg gggctgccgc agggggacgg 5400

ctgccttcgg gggggacggg gcagggcggg gttcggcttc tggcgtgtga ccggcggctc 5460

tagagcctct gctaaccatg ttcatgcctt cttctttttc ctacagctcc tgggcaacgt 5520

gctggttgtt gtgctgtctc atcattttgg caaagaattc cctgcaggaa attgagcccg 5580

cagcctcccg cttcgctctc tgctcctcct gttcgacagt cagccgcatc ttcttttgcg 5640

tcgccagccg agccacatcg ctcagacacc g 5671

<210> 32

<211> 4

<212> PRT

<213> Неизвестная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание неизвестной последовательности:

линкер Furinlink1"

<400> 32

Arg Ala Lys Arg

1

<210> 33

<211> 12

<212> ДНК

<213> Неизвестная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание неизвестной последовательности:

линкер Furinlink1"

<400> 33

cgtgcaaagc gt 12

<210> 34

<211> 28

<212> PRT

<213> Неизвестная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание неизвестной последовательности:

линкер fmdv"

<400> 34

Arg Ala Lys Arg Ala Pro Val Lys Gln Thr Leu Asn Phe Asp Leu Leu

1 5 10 15

Lys Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro

20 25

<210> 35

<211> 84

<212> ДНК

<213> Неизвестная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание неизвестной последовательности:

линкер fmdv"

<400> 35

agagccaaga gggcaccggt gaaacagact ttgaattttg accttctgaa gttggcagga 60

gacgttgagt ccaaccctgg gccc 84

<210> 36

<211> 19

<212> PRT

<213> Неизвестная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание неизвестной последовательности:

линкер p2a"

<400> 36

Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn

1 5 10 15

Pro Gly Pro

<210> 37

<211> 57

<212> ДНК

<213> Неизвестная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание неизвестной последовательности:

линкер p2a"

<400> 37

gctactaact tcagcctgct gaagcaggct ggagacgtgg aggagaaccc tggacct 57

<210> 38

<211> 22

<212> PRT

<213> Неизвестная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание неизвестной последовательности:

линкер GSG-p2a"

<400> 38

Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val

1 5 10 15

Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20

<210> 39

<211> 66

<212> ДНК

<213> Неизвестная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание неизвестной последовательности:

линкер GSG-p2a"

<400> 39

ggaagcggag ctactaactt cagcctgctg aagcaggctg gagacgtgga ggagaaccct 60

ggacct 66

<210> 40

<211> 31

<212> PRT

<213> Неизвестная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание неизвестной последовательности:

линкер fp2a"

<400> 40

Arg Ala Lys Arg Ala Pro Val Lys Gln Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe

1 5 10 15

Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly Pro

20 25 30

<210> 41

<211> 93

<212> ДНК

<213> Неизвестная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание неизвестной последовательности:

линкер fp2a"

<400> 41

cgtgcaaagc gtgcaccggt gaaacaggga agcggagcta ctaacttcag cctgctgaag 60

caggctggag acgtggagga gaaccctgga cct 93

<210> 42

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 42

Ala Pro Val Lys Gln

1 5

<210> 43

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 43

Gly Pro Val Lys Gln

1 5

<210> 44

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 44

Val Pro Val Lys Gln

1 5

<210> 45

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 45

Ile Pro Val Lys Gln

1 5

<210> 46

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 46

Met Pro Val Lys Gln

1 5

<210> 47

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 47

Ala Pro Ile Lys Gln

1 5

<210> 48

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 48

Gly Pro Ile Lys Gln

1 5

<210> 49

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 49

Val Pro Ile Lys Gln

1 5

<210> 50

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 50

Ile Pro Ile Lys Gln

1 5

<210> 51

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 51

Met Pro Ile Lys Gln

1 5

<210> 52

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 52

Ala Pro Ala Lys Gln

1 5

<210> 53

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 53

Gly Pro Ala Lys Gln

1 5

<210> 54

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 54

Val Pro Ala Lys Gln

1 5

<210> 55

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 55

Ile Pro Ala Lys Gln

1 5

<210> 56

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 56

Met Pro Ala Lys Gln

1 5

<210> 57

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 57

Ala Pro Val Arg Gln

1 5

<210> 58

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 58

Gly Pro Val Arg Gln

1 5

<210> 59

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 59

Val Pro Val Arg Gln

1 5

<210> 60

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 60

Ile Pro Val Arg Gln

1 5

<210> 61

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 61

Met Pro Val Arg Gln

1 5

<210> 62

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 62

Ala Pro Ile Arg Gln

1 5

<210> 63

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 63

Gly Pro Ile Arg Gln

1 5

<210> 64

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 64

Val Pro Ile Arg Gln

1 5

<210> 65

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 65

Ile Pro Ile Arg Gln

1 5

<210> 66

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 66

Met Pro Ile Arg Gln

1 5

<210> 67

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 67

Ala Pro Ala Arg Gln

1 5

<210> 68

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 68

Gly Pro Ala Arg Gln

1 5

<210> 69

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 69

Val Pro Ala Arg Gln

1 5

<210> 70

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 70

Ile Pro Ala Arg Gln

1 5

<210> 71

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 71

Met Pro Ala Arg Gln

1 5

<210> 72

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 72

Ala Pro Val Lys Asn

1 5

<210> 73

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 73

Gly Pro Val Lys Asn

1 5

<210> 74

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 74

Val Pro Val Lys Asn

1 5

<210> 75

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 75

Ile Pro Val Lys Asn

1 5

<210> 76

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 76

Met Pro Val Lys Asn

1 5

<210> 77

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 77

Ala Pro Ile Lys Asn

1 5

<210> 78

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 78

Gly Pro Ile Lys Asn

1 5

<210> 79

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 79

Val Pro Ile Lys Asn

1 5

<210> 80

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 80

Ile Pro Ile Lys Asn

1 5

<210> 81

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 81

Met Pro Ile Lys Asn

1 5

<210> 82

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 82

Ala Pro Ala Lys Asn

1 5

<210> 83

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 83

Gly Pro Ala Lys Asn

1 5

<210> 84

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 84

Val Pro Ala Lys Asn

1 5

<210> 85

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 85

Ile Pro Ala Lys Asn

1 5

<210> 86

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 86

Met Pro Ala Lys Asn

1 5

<210> 87

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 87

Ala Pro Val Arg Asn

1 5

<210> 88

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 88

Gly Pro Val Arg Asn

1 5

<210> 89

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 89

Val Pro Val Arg Asn

1 5

<210> 90

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 90

Ile Pro Val Arg Asn

1 5

<210> 91

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 91

Met Pro Val Arg Asn

1 5

<210> 92

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 92

Ala Pro Ile Arg Asn

1 5

<210> 93

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 93

Gly Pro Ile Arg Asn

1 5

<210> 94

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 94

Val Pro Ile Arg Asn

1 5

<210> 95

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 95

Ile Pro Ile Arg Asn

1 5

<210> 96

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 96

Met Pro Ile Arg Asn

1 5

<210> 97

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 97

Ala Pro Ala Arg Asn

1 5

<210> 98

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 98

Gly Pro Ala Arg Asn

1 5

<210> 99

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 99

Val Pro Ala Arg Asn

1 5

<210> 100

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 100

Ile Pro Ala Arg Asn

1 5

<210> 101

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 101

Met Pro Ala Arg Asn

1 5

<210> 102

<211> 89

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 102

Met Asn Ala Lys Val Val Val Val Leu Val Leu Val Leu Thr Ala Leu

1 5 10 15

Cys Leu Ser Asp Gly Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys

20 25 30

Arg Phe Phe Glu Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys

35 40 45

Ile Leu Asn Thr Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys

50 55 60

Asn Asn Asn Arg Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln

65 70 75 80

Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Leu Asn Lys

85

<210> 103

<211> 317

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 103

atgaatgcca aggtcgttgt ggtgcttgta cttgtgctga ctgctctgtg tctgagcgac 60

ggaaaaccag tctccctcag ctacaggtgc ccatgccgat tcttcgaatc tcatgtggcc 120

cgggccaatg tgaagcactt gaaaatcctg tcttcgaatc tcatgtggcc cgggccaatg 180

tgaagcactt gaaaatcctg aatacaccca actgcgcgtt gcagatcgtg gcccgcctga 240

aaaataataa taggcaggta tgtatcgatc caaagcttaa gtggatccag gagtatctgg 300

aaaaggctct caataaa 317

<210> 104

<211> 94

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 104

Met Gly Ser Glu Leu Glu Thr Ala Met Glu Thr Leu Ile Asn Val Phe

1 5 10 15

His Ala His Ser Gly Lys Glu Gly Asp Lys Tyr Lys Leu Ser Lys Lys

20 25 30

Glu Leu Lys Glu Leu Leu Gln Thr Glu Leu Ser Gly Phe Leu Asp Ala

35 40 45

Gln Lys Asp Val Asp Ala Val Asp Lys Val Met Lys Glu Leu Asp Glu

50 55 60

Asn Gly Asp Gly Glu Val Asp Phe Gln Glu Tyr Val Val Leu Val Ala

65 70 75 80

Ala Leu Thr Val Ala Cys Asn Asn Phe Phe Trp Glu Asn Ser

85 90

<210> 105

<211> 282

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 105

atgggcagcg aactggaaac cgccatggag actttgataa atgttttcca cgcgcatagc 60

ggcaaagaag gggacaagta caagctgtca aaaaaggagc tgaaagaact gctgcagacc 120

gaattgagcg gcttcctgga cgctcagaaa gatgtcgatg ccgtcgacaa agtgatgaaa 180

gagcttgacg agaacggtga cggtgaagtc gattttcagg aatatgtggt gctggtggcc 240

gcccttactg tagcatgcaa caatttcttt tgggaaaatt ca 282

<210> 106

<211> 191

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 106

Met Asn Phe Leu Leu Ser Trp Val His Trp Ser Leu Ala Leu Leu Leu

1 5 10 15

Tyr Leu His His Ala Lys Trp Ser Gln Ala Ala Pro Met Ala Glu Gly

20 25 30

Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys Phe Met Asp Val Tyr Gln

35 40 45

Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu Val Asp Ile Phe Gln Glu

50 55 60

Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys Pro Ser Cys Val Pro Leu

65 70 75 80

Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Gly Leu Glu Cys Val Pro

85 90 95

Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile Met Arg Ile Lys Pro His

100 105 110

Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe Leu Gln His Asn Lys Cys

115 120 125

Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg Gln Glu Asn Pro Cys Gly

130 135 140

Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe Val Gln Asp Pro Gln Thr

145 150 155 160

Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser Arg Cys Lys Ala Arg Gln

165 170 175

Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys Asp Lys Pro Arg Arg

180 185 190

<210> 107

<211> 573

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 107

atgaattttc tgctctcttg ggtgcactgg tcactggcac tgctgctgta tctgcaccat 60

gcaaaatggt cccaagcagc tcccatggca gagggaggtg gacagaatca tcatgaggtt 120

gtcaaattta tggatgtcta ccagcggagc tactgccacc caattgagac gttggtagac 180

atttttcagg aatatccaga cgagattgag tacattttca agcctagctg tgtgcccttg 240

atgcgatgcg gtggctgttg caatgatgag ggactcgagt gtgtccccac cgaggaaagc 300

aatataacca tgcaaatcat gcgaatcaaa ccccaccagg gccagcatat cggcgagatg 360

tctttcttgc aacataacaa atgcgagtgt cggccaaaga aggacagggc tcgccaggaa 420

aatccctgtg gtccttgttc agagcgcagg aagcatcttt tcgtccagga tccgcagact 480

tgtaaatgtt catgcaagaa taccgattct aggtgtaagg cgaggcaact cgagcttaac 540

gagagaacct gtaggtgtga caaacctaga aga 573

<210> 108

<211> 6034

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 108

taactataac ggtcctaagg tagcgacgta cgaaccgttg ggcgcgcctg gggatagcga 60

tcgctgctgg cgcggtccgc tatgaggtct ctgatagacc acagacgcgt cgacattgat 120

tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 180

agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 240

gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 300

gacgtcaatg ggtggagtat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat caagtgtatc 360

atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc tggcattatg 420

cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta ttagtcatcg 480

ctattaccat ggtcgaggtg agccccacgt tctgcttcac tctccccatc tcccccccct 540

ccccaccccc aattttgtat ttatttattt tttaattatt ttgtgcagcg atgggggcgg 600

gggggggggg ggggcgcgcg ccaggcgggg cggggcgggg cgaggggcgg ggcggggcga 660

ggcggagagg tgcggcggca gccaatcaga gcggcgcgct ccgaaagttt ccttttatgg 720

cgaggcggcg gcggcggcgg ccctataaaa agcgaagcgc gcggcgggcg ggagtcgctg 780

cgcgctgcct tcgccccgtg ccccgctccg ccgccgcctc gcgccgcccg ccccggctct 840

gactgaccgc gttactccca caggtgagcg ggcgggacgg cccttctcct ccgggctgta 900

attagcgctt ggtttaatga cggcttgttt cttttctgtg gctgcgtgaa agccttgagg 960

ggctccggga gggccctttg tgcgggggga gcggctcggg gggtgcgtgc gtgtgtgtgt 1020

gcgtggggag cgccgcgtgc ggctccgcgc tgcccggcgg ctgtgagcgc tgcgggcgcg 1080

gcgcggggct ttgtgcgctc cgcagtgtgc gcgaggggag cgcggccggg ggcggtgccc 1140

cgcggtgcgg ggggggctgc gaggggaaca aaggctgcgt gcggggtgtg tgcgtggggg 1200

ggtgagcagg gggtgtgggc gcgtcggtcg ggctgcaacc ccccctgcac ccccctcccc 1260

gagttgctga gcacggcccg gcttcgggtg cggggctccg tacggggcgt ggcgcggggc 1320

tcgccgtgcc gggcgggggg tggcggcagg tgggggtgcc gggcggggcg gggccgcctc 1380

gggccgggga gggctcgggg gaggggcgcg gcggcccccg gagcgccggc ggctgtcgag 1440

gcgcggcgag ccgcagccat tgccttttat ggtaatcgtg cgagagggcg cagggacttc 1500

ctttgtccca aatctgtgcg gagccgaaat ctgggaggcg ccgccgcacc ccctctagcg 1560

ggcgcggggc gaagcggtgc ggcgccggca ggaaggaaat gggcggggag ggccttcgtg 1620

cgtcgccgcg ccgccgtccc cttctccctc tccagcctcg gggctgtccg cggggggacg 1680

gctgccttcg ggggggacgg ggcagggcgg ggttcggctt ctggcgtgtg accggcggct 1740

ctagagcctc tgctaaccat gttcatgcct tcttcttttt cctacagctc ctgggcaacg 1800

tgctggttat tgtgctgtct catcattttg gcaaagaatt ccctgcagga aattgagccc 1860

gcagcctccc gcttcgctct ctgctcctcc tgttcgacag tcagccgcat cttcttttgc 1920

gtcgccagcc gagccacatc gctcagacac cgctagcatg ggcagcgaac tggaaaccgc 1980

catggagact ttgataaatg ttttccacgc gcatagcggc aaagaagggg acaagtacaa 2040

gctgtcaaaa aaggagctga aagaactgct gcagaccgaa ttgagcggct tcctggacgc 2100

tcagaaagat gtcgatgccg tcgacaaagt gatgaaagag cttgacgaga acggtgacgg 2160

tgaagtcgat tttcaggaat atgtggtgct ggtggccgcc cttactgtag catgcaacaa 2220

tttcttttgg gaaaattcac gtgcaaagcg tgcaccggtg aaacagggaa gcggagctac 2280

taacttcagc ctgctgaagc aggctggaga cgtggaggag aaccctggac ctatgaatgc 2340

caaggtcgtt gtggtgcttg tacttgtgct gactgctctg tgtctgagcg acggaaaacc 2400

agtctccctc agctacaggt gcccatgccg attcttcgaa tctcatgtgg cccgggccaa 2460

tgtgaagcac ttgaaaatcc tgaatacacc caactgcgcg ttgcagatcg tggcccgcct 2520

gaaaaataat aataggcagg tatgtataga tccaaagctt aagtggatcc aggagtatct 2580

ggaaaaggct ctcaataaac gtgcaaagcg tgcaccggtg aaacagggaa gcggagctac 2640

taacttcagc ctgctgaagc aggctggaga cgtggaggag aaccctggac ctatgaattt 2700

tctgctctct tgggtgcact ggtcactggc actgctgctg tatctgcacc atgcaaaatg 2760

gtcccaagca gctcccatgg cagagggagg tggacagaat catcatgagg ttgtcaaatt 2820

tatggatgtc taccagcgga gctactgcca cccaattgag acgttggtag acatttttca 2880

ggaatatcca gacgagattg agtacatttt caagcctagc tgtgtgccct tgatgcgatg 2940

cggtggctgt tgcaatgatg agggactcga gtgtgtcccc accgaggaaa gcaatataac 3000

catgcaaatc atgcgaatca aaccccacca gggccagcat atcggcgaga tgtctttctt 3060

gcaacataac aaatgcgagt gtcggccaaa gaaggacagg gctcgccagg aaaatccctg 3120

tggtccttgt tcagagcgca ggaagcatct tttcgtccag gatccgcaga cttgtaaatg 3180

ttcatgcaag aataccgatt ctaggtgtaa ggcgaggcaa ctcgagctta acgagagaac 3240

ctgtaggtgt gacaaaccta gaagataaat cgattacgct cctctactct ttgagacatc 3300

actggcctat aataaatggg ttaatttatg taacaaaatt gccttggctt gttaacttta 3360

ttagacattc tgatgtttgc attgtgtaaa tactgttgta ttggaaaagc gtgccaagat 3420

ggattattgt aattcagtgt cttttttagt agcgtcacgt gccaaacact gttagtcaca 3480

gagggcatga gacagcctgt gctggaacag ctcagttcat agggctatgg agatggggag 3540

aaaggggcgc ttctgtcaga gacaagctgt ggtctgggaa ggccttagca ctaaaagcac 3600

cacaatgaga agcaaccgcc agaagcaggg cccgcaggcc tttgttccag ctgcaaagag 3660

aaaggaaaaa gtggggaata agagttgggg ctgcggaggg ggtggggagc attgtgcagg 3720

ttccgtactt gaacagaaag cagggaccaa cacaaggaag gctcgagctg gcggaatagg 3780

ttccaatctg tcgcggccgc attaccctgt tatccctaat ctcgtttaac tatgactctc 3840

ttaaggtagc caaattccgg aactataaat tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc 3900

gggaaacctg tcgtgccagc tgcataaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt 3960

gcgtattggg cgcgcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct 4020

gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 4080

taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 4140

cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 4200

ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 4260

aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 4320

tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 4380

gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 4440

cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 4500

ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 4560

cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct 4620

gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 4680

cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 4740

tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 4800

ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta 4860

aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acatgcgcat 4920

ctgacgctca gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgcct cagaagaact 4980

cgtcaagaag gcgatagaag gcgatgcgct gcgaatcggg agcggcgata ccgtaaagca 5040

cgaggaagcg gtcagcccat tcgccgccaa gctcttcagc aatatcacgg gtagccaacg 5100

ctatgtcctg atagcggtcc gccacaccca gccggccaca gtcgatgaat ccagaaaagc 5160

ggccattttc caccatgata ttcggcaagc aggcatcgcc atgggtcacg acgagatcct 5220

cgccgtcggg catgcgcgcc ttgagcctgg cgaacagttc ggctggcgcg agcccctgat 5280

gctcttcgtc cagatcatcc tgatcgacaa gaccggcttc catccgagta cgtgctcgct 5340

cgatgcgatg tttcgcttgg tggtcgaatg ggcaggtagc cggatcaagc gtatgcagcc 5400

gccgcattgc atcagccatg atggatactt tctcggcagg agcaaggtga gatgacagga 5460

gatcctgccc cggcacttcg cccaatagca gccagtccct tcccgcttca gtgacaacgt 5520

cgagcacagc tgcgcaagga acgcccgtcg tggccagcca cgatagccgc gctgcctcgt 5580

cctgcagttc attcagggca ccggacaggt cggtcttgac aaaaagaacc gggcgcccct 5640

gcgctgacag ccggaacacg gcggcatcag agcagccgat tgtctgttgt gcccagtcat 5700

agccgaatag cctctccacc caagcggccg gagaacctgc gtgcaatcca tcttgttcaa 5760

tcatgcgaaa cgatcctcat tcatttatca gggttattgt ctcatgagcg gatacatatt 5820

tgaatgtatt taggctgagc atctatgtcg ggtgcggaga aagaggtaat gaaatggcag 5880

gcgccttttt cgttagatat gtagtaagta tcttaatata cagctttatc tgttttttaa 5940

gatacttact acttttctta gtggaaacta ttagtggctg ttaattaagc tagtactacc 6000

caagatttga cagaatgcat cgtttgcatt cgaa 6034

<210> 109

<211> 30

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(30)

<223> /примечание="Данная последовательность может охватывать 0-15 "Gly

Ser" повторяющиеся единицы,

при этом некоторые позиции могут отсутствовать"

<400> 109

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

20 25 30

<210> 110

<211> 30

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(30)

<223> /примечание="Данная последовательность может охватывать 0-15 "Ser

Gly" повторяющиеся единицы,

при этом некоторые позиции могут отсутствовать"

<400> 110

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly

20 25 30

<210> 111

<211> 45

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(45)

<223> /примечание="Данная последовательность может охватывать 0-15 "Gly Ser

Gly" повторяющиеся единицы,

при этом некоторые позиции могут отсутствовать"

<400> 111

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

35 40 45

<210> 112

<211> 45

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(45)

<223> /примечание="Данная последовательность может охватывать 0-15 "Ser

Gly Ser" повторяющиеся единицы,

при этом некоторые позиции могут отсутствовать"

<400> 112

Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser

1 5 10 15

Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly

20 25 30

Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser

35 40 45

<210> 113

<211> 30

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(30)

<223> /примечание="Данная последовательность может охватывать 1-15 "Gly

Ser" повторяющиеся единицы,

при этом некоторые позиции могут отсутствовать"

<400> 113

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

1 5 10 15

Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser

20 25 30

<210> 114

<211> 30

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(30)

<223> /примечание="Данная последовательность может охватывать 1-15 "Ser

Gly" повторяющиеся единицы,

при этом некоторые позиции могут отсутствовать"

<400> 114

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly

1 5 10 15

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Gly

20 25 30

<210> 115

<211> 45

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(45)

<223> /примечание="Данная последовательность может охватывать 1-15 "Gly

Ser Gly" повторяющиеся единицы,

при этом некоторые позиции могут отсутствовать"

<400> 115

Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10 15

Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser

20 25 30

Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly

35 40 45

<210> 116

<211> 45

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полипептид"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(45)

<223> /примечание="Данная последовательность может охватывать 1-15 "Ser

Gly Ser" повторяющиеся единицы,

при этом некоторые позиции могут отсутствовать"

<400> 116

Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser

1 5 10 15

Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly

20 25 30

Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser Ser Gly Ser

35 40 45

<210> 117

<211> 8

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<220>

<221> ВАРИАНТ

<222> (2)..(2)

<223> /замена="Ile"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(2)

<223> /примечание="Вариант остатка, рассматриваемый в данной

последовательности, не имеет

предпочтения в отношении варианта в комментариях для позиции

варианта"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (4)..(4)

<223> Любая аминокислота

<400> 117

Asp Val Glu Xaa Asn Pro Gly Pro

1 5

<210> 118

<211> 4

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 118

Ser Gly Ser Gly

1

<210> 119

<211> 8

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 119

Ala Pro Val Lys Gln Gly Ser Gly

1 5

<210> 120

<211> 5

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<400> 120

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 121

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<220>

<221> MOD_RES

<222> (1)..(1)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> MOD_RES

<222> (3)..(3)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> MOD_RES

<222> (5)..(5)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> MOD_RES

<222> (7)..(7)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> MOD_RES

<222> (9)..(9)

<223> Любая аминокислота

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (1)..(10)

<223> /примечание="Данная последовательность охватывает 2-5 "Xaa Pro"

повторяющиеся единицы,

при этом некоторые позиции могут отсутствовать"

<400> 121

Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro Xaa Pro

1 5 10

<210> 122

<211> 27

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

пептид"

<220>

<221> MISC_FEATURE

<222> (2)..(26)

<223> /примечание="Данная последовательность может охватывать 2-5 "Glu Ala

Ala Ala Lys"

повторяющиеся единицы,при этом некоторые позиции могут отсутствовать"

<400> 122

Ala Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys

1 5 10 15

Glu Ala Ala Ala Lys Glu Ala Ala Ala Lys Ala

20 25

<210> 123

<211> 30

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: 2A-хвост"

<400> 123

Arg Ala Lys Arg Ala Pro Val Lys Gln Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe

1 5 10 15

Ser Leu Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly

20 25 30

<210> 124

<211> 124

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание Искусственной последовательности: S100A1 с

2А-хвостом"

<400> 124

Met Gly Ser Glu Leu Glu Thr Ala Met Glu Thr Leu Ile Asn Val Phe

1 5 10 15

His Ala His Ser Gly Lys Glu Gly Asp Lys Tyr Lys Leu Ser Lys Lys

20 25 30

Glu Leu Lys Glu Leu Leu Gln Thr Glu Leu Ser Gly Phe Leu Asp Ala

35 40 45

Gln Lys Asp Val Asp Ala Val Asp Lys Val Met Lys Glu Leu Asp Glu

50 55 60

Asn Gly Asp Gly Glu Val Asp Phe Gln Glu Tyr Val Val Leu Val Ala

65 70 75 80

Ala Leu Thr Val Ala Cys Asn Asn Phe Phe Trp Glu Asn Ser Arg Ala

85 90 95

Lys Arg Ala Pro Val Lys Gln Gly Ser Gly Ala Thr Asn Phe Ser Leu

100 105 110

Leu Lys Gln Ala Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro Gly

115 120

<210> 125

<211> 372

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<221> источник

<223> /примечание="Описание искусственной последовательности: Синтетический

полинуклеотид"

<400> 125

atgggcagcg aactggaaac cgccatggag actttgataa atgttttcca cgcgcatagc 60

ggcaaagaag gggacaagta caagctgtca aaaaaggagc tgaaagaact gctgcagacc 120

gaattgagcg gcttcctgga cgctcagaaa gatgtcgatg ccgtcgacaa agtgatgaaa 180

gagcttgacg agaacggtga cggtgaagtc gattttcagg aatatgtggt gctggtggcc 240

gcccttactg tagcatgcaa caatttcttt tgggaaaatt cacgtgcaaa gcgtgcaccg 300

gtgaaacagg gaagcggagc tactaacttc agcctgctga agcaggctgg agacgtggag 360

gagaaccctg ga 372

<210> 126

<211> 165

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 126

Ala Pro Met Ala Glu Gly Gly Gly Gln Asn His His Glu Val Val Lys

1 5 10 15

Phe Met Asp Val Tyr Gln Arg Ser Tyr Cys His Pro Ile Glu Thr Leu

20 25 30

Val Asp Ile Phe Gln Glu Tyr Pro Asp Glu Ile Glu Tyr Ile Phe Lys

35 40 45

Pro Ser Cys Val Pro Leu Met Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu

50 55 60

Gly Leu Glu Cys Val Pro Thr Glu Glu Ser Asn Ile Thr Met Gln Ile

65 70 75 80

Met Arg Ile Lys Pro His Gln Gly Gln His Ile Gly Glu Met Ser Phe

85 90 95

Leu Gln His Asn Lys Cys Glu Cys Arg Pro Lys Lys Asp Arg Ala Arg

100 105 110

Gln Glu Asn Pro Cys Gly Pro Cys Ser Glu Arg Arg Lys His Leu Phe

115 120 125

Val Gln Asp Pro Gln Thr Cys Lys Cys Ser Cys Lys Asn Thr Asp Ser

130 135 140

Arg Cys Lys Ala Arg Gln Leu Glu Leu Asn Glu Arg Thr Cys Arg Cys

145 150 155 160

Asp Lys Pro Arg Arg

165

<210> 127

<211> 495

<212> ДНК

<213> Homo sapiens

<400> 127

gctcccatgg cagagggagg tggacagaat catcatgagg ttgtcaaatt tatggatgtc 60

taccagcgga gctactgcca cccaattgag acgttggtag acatttttca ggaatatcca 120

gacgagattg agtacatttt caagcctagc tgtgtgccct tgatgcgatg cggtggctgt 180

tgcaatgatg agggactcga gtgtgtcccc accgaggaaa gcaatataac catgcaaatc 240

atgcgaatca aaccccacca gggccagcat atcggcgaga tgtctttctt gcaacataac 300

aaatgcgagt gtcggccaaa gaaggacagg gctcgccagg aaaatccctg tggtccttgt 360

tcagagcgca ggaagcatct tttcgtccag gatccgcaga cttgtaaatg ttcatgcaag 420

aataccgatt ctaggtgtaa ggcgaggcaa ctcgagctta acgagagaac ctgtaggtgt 480

gacaaaccta gaaga 495

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к полинуклеотиду для экспрессии функциональных кальций-связывающего белка S100А1, фактора стромальной клетки-1α (SDF-1α) и фактора роста эндотелия сосудов 165 (VEGF165), и может быть использовано в медицине. Полученный полинуклеотид позволяет осуществлять одновременную экспрессию S100А1, SDF-1α и VEGF165 и может быть использован для эффективной терапии заболеваний сердца. 8 н. и 11 з.п. ф-лы, 33 ил., 16 табл., 14 пр.

1. Полинуклеотид для экспрессии функциональных белков, обладающих эффекторными свойствами по отношению к сердцу, при этом указанный полинуклеотид кодирует полипептидную конструкцию, которая содержит полипептид кальций-связывающего белка S100А1 (S100А1), полипептид фактора стромальной клетки-1α (SDF-1α), и полипептид фактора роста эндотелия сосудов 165 (VEGF165), при этом указанный полипептид S100А1, указанный полипептид SDF-1α и указанный полипептид VEGF165 отделены друг от друга по меньшей мере одним расщепляемым линкером, при этом указанный полинуклеотид функционально связан с промотором, и при этом указанные расщепляемые линкеры расщепляются при экспрессии указанного полинуклеотида в клетке с высвобождением функциональной формы указанного полипептида S100А1, указанного полипептида SDF-1α и указанного полипептида VEGF165.

2. Полинуклеотид по п. 1, отличающийся тем, что указанный полипептид S100А1 содержит последовательность SEQ ID NO: 104, указанный полипептид SDF-1α содержит последовательность SEQ ID NO: 102, указанный полипептид VEGF165 содержит последовательность SEQ ID NO: 106.

3. Полинуклеотид по п. 1, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один расщепляемый линкер содержит пептид 2А, который опосредует эффект проскока рибосомы при трансляции.

4. Полинуклеотид по п. 1, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один расщепляемый линкер выбран из группы, состоящей из линкера RAKR, линкера fp2a, линкера p2a, линкера GSG-p2a, и линкера fmdv, или любой их комбинации.

5. Полинуклеотид по п. 1, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один расщепляемый линкер содержит последовательность SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 34, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, или SEQ ID NO: 40.

6. Полинуклеотид по п. 1, отличающийся тем, что указанный по меньшей мере один расщепляемый линкер содержит последовательность, выбранную из группы, состоящей из APVKQ (SEQ ID NO: 42), GPVKQ (SEQ ID NO: 43), VPVKQ (SEQ ID NO: 44), IPVKQ (SEQ ID NO: 45), MPVKQ (SEQ ID NO: 46), APIKQ (SEQ ID NO: 47), GPIKQ (SEQ ID NO: 48), VPIKQ (SEQ ID NO: 49), IPIKQ (SEQ ID NO: 50), MPIKQ (SEQ ID NO: 51), APAKQ (SEQ ID NO: 52), GPAKQ (SEQ ID NO: 53), VPAKQ (SEQ ID NO: 54), IPAKQ (SEQ ID NO: 55), MPAKQ (SEQ ID NO: 56), APVRQ (SEQ ID NO: 57), GPVRQ (SEQ ID NO: 58), VPVRQ (SEQ ID NO: 59), IPVRQ (SEQ ID NO: 60), MPVRQ (SEQ ID NO: 61), APIRQ (SEQ ID NO: 62), GPIRQ (SEQ ID NO: 63), VPIRQ (SEQ ID NO: 64), IPIRQ (SEQ ID NO: 65), MPIRQ (SEQ ID NO: 66), APARQ (SEQ ID NO: 67), GPARQ (SEQ ID NO: 68), VPARQ (SEQ ID NO: 69), IPARQ (SEQ ID NO: 70), MPARQ (SEQ ID NO: 71), APVKN (SEQ ID NO: 72), GPVKN (SEQ ID NO: 73), VPVKN (SEQ ID NO: 74), IPVKN (SEQ ID NO: 75), MPVKN (SEQ ID NO: 76), APIKN (SEQ ID NO: 77), GPIKN (SEQ ID NO: 78), VPIKN (SEQ ID NO: 79), IPIKN (SEQ ID NO: 80), MPIKN (SEQ ID NO: 81), APAKN (SEQ ID NO: 82), GPAKN (SEQ ID NO: 83), VPAKN (SEQ ID NO: 84), IPAKN (SEQ ID NO: 85), IVIPAKN (SEQ ID NO: 86), APVRN (SEQ ID NO: 87), GPVRN (SEQ ID NO: 88), VPVRN (SEQ ID NO: 89), IPVRN (SEQ ID NO: 90), IVIPVRN (SEQ ID NO: 91), APIRN (SEQ ID NO: 92), GPIRN (SEQ ID NO: 93), VPIRN (SEQ ID NO: 94), IPIRN (SEQ ID NO: 95), MPIRN (SEQ ID NO: 96), APARN (SEQ ID NO: 97), GPARN (SEQ ID NO: 98), VPARN (SEQ ID NO: 99), IPARN (SEQ ID NO: 100) или MPARN (SEQ ID NO: 101).

7. Полипептидная конструкция для обеспечения функциональных белков, обладающих эффекторными свойствами по отношению к сердцу, при этом указанная полипептидная конструкция кодирована полинуклеотидом по любому из пп. 1-6.

8. Клетка млекопитающего, содержащая полинуклеотид по любому из пп. 1-6, или полипептидную конструкцию, кодируемую указанным полинуклеотидом, при этом указанная клетка млекопитающего экспрессирует указанный полинуклеотид.

9. Невирусный вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по любому из пп. 1-6.

10. Вектор экспрессии по п. 9, отличающийся тем, что указанный промотор представляет собой конститутивный промотор, тканеспецифичный промотор или индуцируемый промотор.

11. Вектор экспрессии по п. 10, отличающийся тем, что указанный индуцируемый промотор представляет собой индуцируемый низкомолекулярным лигандом переключатель гена на основе двухполипептидного рецептора экдизона.

12. Вектор экспрессии по любому из пп. 9-11, отличающийся тем, что указанный вектор экспрессии представляет собой вектор для экспрессии в сердце.

13. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания сердца, содержащая эффективное количество полинуклеотида по любому из пп. 1-6, полипептидной конструкции, кодируемой указанным полинуклеотидом по любому из пп. 1-6 или вектора экспрессии по любому из пп.9-12 и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

14. Способ лечения заболевания сердца у субъекта, включающий: приведение в контакт клетки сердца указанного субъекта с эффективным количеством полинуклеотида по любому из пп. 1-6, полипептидной конструкции, кодируемой указанным полинуклеотидом по любому из пп. 1-6, или вектора экспрессии по любому из пп. 9-12.

15. Способ по п. 14, в котором указанная клетка представляет собой клетку миокарда.

16. Способ лечения заболевания сердца у субъекта, включающий: введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п. 13, при этом указанное заболевание сердца представляет собой кардиомиопатию, застойную сердечную недостаточность, аритмию, заболевание перикарда, заболевание аорты, синдром Марфана или заболевание коронарной артерии.

17. Способ по любому из пп. 14-16, в котором указанный субъект представляет собой человека.

18. Способ лечения заболевания сердца у субъекта, включающий:

- введение указанного субъекту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей микропузырек, причем указанный микропузырек содержит липид, газ и плазмиду, содержащую полинуклеотид по любому из пп. 1-6;

- осуществление воздействия на указанный микропузырек энергии ультразвука, достаточной для того, чтобы обеспечить нацеленное разрушение микропузырька (UTMD);

- при этом указанное заболевание сердца представляет собой кардиомиопатию, застойную сердечную недостаточность, аритмию, заболевание перикарда, заболевание аорты, синдром Марфана или заболевание коронарной артерии.

19. Способ по п. 18, в котором указанный липид образует оболочку, окружающую указанный газ и плазмиду.