Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к анти-PD-L1 антителу для детекции PD-L1.

Уровень техники

Злокачественная меланома, возникающая из меланоцитов, является одной из наиболее часто встречающихся злокачественных опухолей в ротовой полости собак (непатентный документ № 1: Todoroff et al., J Am Vet Med Assoc. 1979 Sep 15; 175(6):567-71). Поскольку этот тип меланомы, как правило, имеет тенденцию к высокой инвазии и метастазированию, желательно иметь возможность ранней диагностики и лечения. С другой стороны, злокачественная меланома имеет широкое тканевое разнообразие и различную морфологию, например, эпителиальная, круглоклеточная меланома или меланома с морфологией фибросаркомы. Таким образом, злокачественная меланома относится к опухолям с трудной тканевой диагностикой. Хотя подтверждение наличия пигмента меланина важно для диагностики злокачественных меланом, большое их количество не имеет пигмента меланина и, иногда, диагноз не может быть поставлен только на основе гистологической оценки. Это привело к поиску диагностических маркеров, которые можно использовать в иммуногистохимии. Было описано, что среди таких маркеров, Melan A/MART-1, виментин, S100, нейрон-специфическая енолаза и тому подобное, могут быть эффективными (непатентный документ № 2: Ramos-Vara et al., Vet Pathol. 2000 Nov; 37(6):597-608). Однако даже Melan A/MART-1, наиболее широко используемый диагностический маркер, имеет положительный прогностический показатель не выше 60%, который отличается по разным данным (непатентный документ № 3: Koenig et al., Vet Pathol. 2001 Jul; 38(4):427-35). Из-за проблемы чувствительности эффективность Melan A/MART-1 для диагностики в практике остается спорной. Кроме того, Melan A/MART-1 не окрашивается в беспигментных меланомах (непатентный документ № 3: Koenig et al., Vet Pathol. 2001 Jul; 38(4):427-35), поэтому его применение в диагностике ограничена. В этих условиях желательно разработать высокочувствительные, новые маркеры для диагностики злокачественной меланомы.

Документы уровня техники

Непатентные документы

Непатентный документ № 1: Todoroff et al., J Am Vet Med Assoc. 1979 Sep 15; 175(6):567-71

Непатентный документ № 2: Ramos-Vara et al., Vet Pathol. 2000 Nov; 37(6):597-608).

Непатентный документ № 3: Koenig et al., Vet Pathol. 2001 Jul; 38(4):427-35

Раскрытие сущности изобретения

Задача, решаемая изобретением

Целью настоящего изобретения является получение антитела против PD-L1, способного окрашивать опухолевые клетки, такие как клетки меланомы.

Средства решения задачи

Авторы настоящего изобретения обнаружили ряд моноклональных антител, которые взаимодействуют с белком PD-L1 различных животных. Было обнаружено, что среди этих моноклональных антител крысиное анти-бычье PD-L1 моноклональное антитело (6С11-3А11) способно высокоэффекивно окрашивать опухолевые клетки меланомы. В настоящее время это моноклональное антитело используется для селекции собак-кандидатов для терапии химерными антителами. Исследуемое антитело против PD-L1 (6C11-3A11) также способно иммуногистохимически окрашивать белки PD-L1 овец, свиней и крупного рогатого скота. Кроме того, авторы настоящего изобретения определили CDR (определяющие комплементарность область) вариабельных областей антитела против PD-L1 (6C11-3A11). Настоящее изобретение было осуществлено на основании этих обнаружений.

Краткое описание изобретения

(1) Анти-PD-L1 антитело, содержащее (a) легкую цепь, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью KSISKY (SEQ ID NO:1), CDR2 с аминокислотной последовательностью SGS и CDR3 с аминокислотной последовательностью QQHNEYPLT (SEQ ID NO:2) и (b) тяжелую цепь, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью GYTFTDYI (SEQ ID NO:3), CDR2 с аминокислотной последовательностью INPDSGGN (SEQ ID NO:4) и CDR3 с аминокислотной последовательностью ARGITMMVVISHWKFDF (SEQ ID NO:5).

(2) Антитело по (1) выше, которое получено у крысы.

(3) Антитело по (2) выше, которое представляет собой крысиное анти-бычье PD-L1 антитело.

(4) Антитело по (3) выше, где вариабельная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:6, и вариабельная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:7.

(5) Антитело по любому из (1)-(4) выше, где константная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность константной области легкой цепи каппа.

(6) Антитело по любому из (1)-(5) выше, где константная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность константной области IgG2a.

(7) Антитело по (5) или (6) выше, где константная область легкой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:8, 10-12 и константная область тяжелой цепи имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9 или 13.

(8) Антитело по любому из (1)-(7) выше, которое имеет структуру четырех цепей, содержащую две легкие цепи и две тяжелые цепи.

(9) Композиция для детекции PD-L1, содержащая антитело по любому из (1)-(8) выше в качестве активного ингредиента.

(10) Композиция по (9) выше для применения в диагностике злокачественных новообразований и/или воспалительных процессов.

(11) Композиция по (10) выше, где злокачественные новообразования и /или воспалительные процессы выбраны из группы, включающей неопластические заболевания, лейкоз, болезнь Джона, анаплазмоз, бактериальный мастит, грибковый мастит, инфекции, вызванные микоплазмой (например, мастит, вызванный микоплазмой, пневмония, вызванная микоплазмой, или тому подобное), туберкулез, инфекцию, вызванную Theileria orientalis, криптоспоридоз, кокцидиоз, трипаносомоз и лейшманиоз.

(12) Композиция по (9) выше для применения в селекции животных, подходящих для терапии анти-PD-L1 антителами.

(13) ДНК, кодирующая анти-PD-L1 антитело по (1) выше.

(14) Вектор, содержащий ДНК по (13) выше.

(15) Клетка-хозяин, трансформированная вектором по (14) выше.

(16) Способ получения антитела, включающий культивирование клетки-хозяина по (15) выше и сбор анти-PD-L1 антитела выше из полученной культуры.

(17) ДНК, кодирующая легкую цепи анти-PD-L1 антитела, где указанная легкая цепь содержит CDR1 с аминокислотной последовательностью KSISKY (SEQ ID NO:1), CDR2 с аминокислотной последовательностью SGS, и CDR3 с аминокислотной последовательностью QQHNEYPLT (SEQ ID NO:2).

(18) ДНК, кодирующая тяжелую цепи анти-PD-L1 антитела, где указанная тяжелая цепь содержит CDR1 с аминокислотной последовательностью GYTFTDYI (SEQ ID NO:3), CDR2 с аминокислотной последовательностью INPDSGGN (SEQ ID NO:4), и CDR3 с аминокислотной последовательностью ARGITMMVVISHWKFDF (SEQ ID NO:5).

Эффект изобретения

Согласно настоящему изобретению, было получено новое анти-PD-L1 антитело, способное окрашивать опухолевые клетки, такие как клетки меланомы.

В настоящем описании приведено содержание описания и/или чертежей японской патентной заявки № 2017-61389, на основании которой заявляется приоритет настоящей патентной заявки.

Краткое описание чертежей

[ФИГ.1] Специфичность связывания крысиного анти-бычьего PD-L1 антитела 6С11-3А11. Крысиный анти-бычий PD-L1 антитела 6C11-3A11 не связывались с клетками, экспрессирующими EGFP, но специфически связывались с клетками, экспрессирующими PD-L1-EGFP, собаки.

[ФИГ.2] Спрогнозированные области CDR крысиного анти-бычьего PD-L1 антитела 6С11-3А11. Показаны области CDR1, CDR2 и CDR3 в вариабельной области легкой цепи и вариабельной области тяжелой цепи крысиного анти-бычьего PD-L1 антитела 6С11-3А11.

[ФИГ.3] Фотографии сравнительного иммуногистохимического окрашивания меланомы собак. Слева: окрашено коммерческим антителом (антитело MelanA). Опухолевые клетки окрашивались очень слабо. Справа: окрашено антителом против PD-L1, 6C11-3A11, полученным авторами настоящего изобретения. Опухолевые клетки были значительно окрашены.

[ФИГ.4] Фотография иммуногистохимического окрашивания меланомы собак.

[ФИГ.5-1] Фотографии иммуногистохимического окрашивания других опухолей. Слева вверху: лимфома собак. Справа вверху: остеосаркома собак. Слева внизу: 1-ый пример почечно-клеточного рака у собак. Справа внизу: 2-ой пример почечно-клеточного рака у собак.

[ФИГ.5-2] Фотографии иммуногистохимического окрашивания других опухолей. Слева: случай плоскоклеточного рака у собак. Справа: случай фибросаркомы собак.

[ФИГ.6] Фотографии иммуногистохимического окрашивания листериоза овец. Слева: Фотография с окрашиванием PD-L1 поражения головного мозга при листериозе с неврологическими симптомами у овец. Справа: увеличенная фотография левого изображения.

[ФИГ.7] Фотографии иммуногистохимического окрашивания инфекций у свиней. Слева: инфекция цирковирусом 2-ого типа у свиней. Справа: пневмония, вызванная микоплазмой, у свиней.

[ФИГ.8] Выравнивание аминокислотных последовательностей константной области каппа цепи (легкая цепь) Ig крысы.

[ФИГ.9] Выравнивание аминокислотных последовательностей константной области цепи IgG2a (тяжелая цепь) крысы.

[ФИГ.10] Схематическое изображение вектора pDC6 и химерного крысиного-человеческого анти-PD-L1 антитела.

[ФИГ.11] Связывание крысиных анти-бычьих PD-L1 антител 6C11-3A11 и 6G7-Е1 c клетками, экспрессирующим PD-L1-EGFP, собаки. 6С11-3A11 специфически связывается с клетками, экспрессирующими PD-L1-EGFP, собаки.

[ФИГ.12] Фотография иммуногистохимического окрашивания плоскоклеточного рака кожи, аденокарциномы носа и переходно-клеточного рака у собак. Не было обнаружено специфических сигналов с помощью 6G7-E1. Опухолевые клетки окрашивали 6C11-3A11.

[ФИГ.13] Фотографии иммуногистохимического окрашивания рака анального мешка, саркомы мягких тканей и остеосаркомы у собак. При раке анального мешка и саркоме мягких тканей, не было детектировано специфических сигналов с помощью 6G7-E1, но опухолевые клетки окрашивались 6C11-3A11. При остеосаркоме оба антитела окрашивали опухолевые клетки, но более сильные сигналы были получены с помощью 6C11-3A11.

[ФИГ.14] Фотографии иммуногистохимического окрашивания злокачественной меланомы полости рта, аденокарциномы молочной железы, гистиоцитарной саркомы, диффузной В-крупноклеточной лимфомы и трансмиссивной венерической опухоли у собак с использованием 6C11-3A11. В опухолях, отличных от трансмиссивной венерической опухоли, опухолевые клетки окрашивались PD-L1.

[ФИГ.15] Связывание крысиного анти-бычьего PD-L1 антитела 6C11-3A11 с бычьим клетками, экспрессирующими PD-L1-EGFP. 6С11-3A11 специфически связывается с бычьими клетками, экспрессирующими PD-L1-EGFP.

[ФИГ.16] Фотография иммуногистохимического окрашивания поражений подвздошной кишки крупного рогатого скота, вызванных естественным путем и экспериментально Mycobacterium avium Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis, используя (a) 6C11-3A11 и (b) окрашивание по Цилю-Нильсену).

Варианты осуществления изобретения

Ниже настоящее изобретение описано подробно.

Настоящее изобретение относится к анти-PD-L1 антителу, содержащему (a) легкую цепь, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью KSISKY (SEQ ID NO:1), CDR2 с аминокислотной последовательностью SGS, и CDR3 с аминокислотной последовательностью QQHNEYPLT (SEQ ID NO:2), и (b) тяжелую цепь, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью GYTFTDYI (SEQ ID NO:3), CDR2 с аминокислотной последовательностью INPDSGGN (SEQ ID NO:4), и CDR3 с аминокислотной последовательностью ARGITMMVVISHWKFDF (SEQ ID NO:5).

CDR1, CDR2 и CDR3 в вариабельной области легкой цепи (VL) крысиного анти-бычьего PD-L1 антитела 6C11-3A11 (моноклональное антитело), полученного авторами настоящего изобретения, представляют собой область, состоящую из аминокислотной последовательности KSISKY (SEQ ID NO:1), область, состоящую из аминокислотной последовательности SGS, и область, состоящую из аминокислотной последовательности QQHNEYPLT (SEQ ID NO:2), соответственно (см. ФИГ.2).

Кроме того, CDR1, CDR2 и CDR3 в вариабельной области тяжелой цепи (VH) крысиного анти-бычьего PD-L1 антитела 6C11-3A11 представляют собой область, состоящую из аминокислотной последовательности GYTFTDYI (SEQ ID NO:3), область, состоящую из аминокислотной последовательности INPDSGGN (SEQ ID NO:4), и область, состоящую из аминокислотной последовательности ARGITMMVVISHWKFDF (SEQ ID NO:5), соответственно (см. ФИГ.2).

В аминокислотных последовательностях KSISKY (SEQ ID NO:1), SGS и QQHNEYPLT (SEQ ID NO:2), а также в аминокислотных последовательностях GYTFTDYI (SEQ ID NO:3), INPDSGGN (SEQ ID NO:4) и ARGITMMVVISHWKFDF (SEQ ID NO:5) могут быть удалены, замещены или добавлены одна, две, три, четыре или пять аминокислот. Даже если были введены такие мутации, то у полученных аминокислотных последовательностей остается функция антитела против PD-L1 с CDR VL или CDR VH.

Используемый в настоящем документе термин "антитело" представляет собой понятие, охватывающее не только полноразмерные антитела, но и антитела меньших молекулярных размеров, такие как Fab, F(ab)’₂, ScFv, диатело, V_H, V_L, Sc(Fv)₂, биспецифический sc(Fv)₂, минитело, мономер scFv-Fc и димер scFv-Fc.

Анти-PD-L1 антитело по настоящему изобретению может быть получено у крыс. Например, анти-PD-L1 антитело может быть крысиным анти-бычьим PD-L1 антителом.

Аминокислотная последовательность VL и аминокислотная последовательность VH крысиного анти-бычьего PD-L1 антитела 6С11-3А11 (моноклональное антитело) приведена в SEQ ID NO:6 и 7, соответственно. Аминокислотные последовательности SEQ ID NO:6 и 7 могут иметь делецию(и), замену(ы) или добавление(я) одной или нескольких (например, до пяти, максимум примерно 10) аминокислот. Даже если были введены такие мутации, то у полученных аминокислотных последовательностей остается функция антитела против PD-L1 с VL или VH.

Существует два типа иммуноглобулиновой легкой цепи, которые называются каппа (κ) цепью и лямбда (λ) цепью. В анти-PD-L1 антителе по настоящему изобретению, константная область легкой цепи (CL) может иметь аминокислотную последовательность константной области либо каппа цепи, либо лямбда цепи. При этом, лямбда цепь относительно преобладает у овец, кошек, собак и лошадей, а каппа-цепи преобладает у мышей, крыс, человека и свиней. Крысиное анти-бычье PD-L1 антитело 6C11-3A11 (моноклональное антитело) представляет собой крысиное IgG2a, и его CL имеет аминокислотную последовательность константной области каппа цепи.

Константная область тяжелой цепи (CH) анти-PD-L1 антитела по настоящему изобретению может иметь аминокислотную последовательность константной области крысиного IgG2a. Тяжелая цепь иммуноглобулина классифицируется на цепь γ, цепь μ, цепь α, цепь δ и цепь ε в зависимости от разницы в константной области. В зависимости от типа присутствующей тяжелой цепи образуются пять классов (изотипов) иммуноглобулинов: IgG, IgM, IgA, IgD и IgE.

Иммуноглобулин G (IgG) составляет 70-75% иммуноглобулинов человека и является наиболее часто обнаруживаемым в плазме крови мономерным антителом. IgG имеет структуру из четырех цепей, состоящую из двух легких цепей и двух тяжелых цепей. IgG1, IgG2 и IgG4 человека имеют молекулярную массу примерно 146000, тогда как IgG3 человека имеет длинную шарнирную область, которая соединяет Fab-область и Fc-область и имеет большую молекулярную массу - 170000. IgG1 человека составляет около 65%, IgG2 человека составляет около 25%, IgG3 человека составляет около 7% и IgG4 человека составляет около 3% IgG человека. Они равномерно распределены внутри и снаружи кровеносных сосудов. Обладая сильным сродством к Fc рецепторам и факторам комплемента на поверхности эффекторных клеток, IgG1 человека индуцирует антитело-зависимую клеточную цитотоксичность (ADCC), а также активирует факторы комплемента для индукции комплемент-зависимой клеточной цитотоксичности (CDC). IgG2 и IgG4 человека показывают низкую ADCC и CDC активность, так как у них низкое сродство в отношении Fc рецепторов и факторов комплекта.

Иммуноглобулин М (IgM), на долю которого приходится около 10% иммуноглобулинов человека, представляет собой пентамерное антитело, состоящее из пяти основных четырех-цепочечных структур, соединенных вместе. Его молекулярный вес составляет 970000. Обычно находящийся только в крови, IgM продуцируется в ответ на инфекционные микроорганизмы и отвечает за ранние стадии иммунитета.

Иммуноглобулин А (IgA) составляет 10-15% иммуноглобулинов человека. Его молекулярный вес составляет 160000. Секретируемый IgA представляет собой димерное антитело, состоящее из двух молекул IgA, соединенных вместе. IgA1 содержится в сыворотке крови, выделениях из носа, слюне и грудном молоке. IgA2 в изобилии представлен в желудочном соке.

Иммуноглобулин D (IgD) представляет собой мономерное антитело, на долю которого приходится не более 1% иммуноглобулинов человека. IgD находится на поверхности В-клеток и участвует в стимуляции продукции антител.

Иммуноглобулин Е (IgE) представляет собой мономерное антитело, которое встречается в чрезвычайно малом количестве, составляя всего 0,001% или менее иммуноглобулинов человека. Считается, что иммуноглобулин Е участвует в иммунном ответе на паразитов, но в развитых странах, где паразиты встречаются редко, IgE в значительной степени связан с бронхиальной астмой и аллергией, среди прочего.

Что касается крыс, то последовательности IgG1, IgG2a, IgG2b и IgG2c у них были идентифицированы как тяжелая цепь IgG. Крысиное анти-бычье PD-L1 антитело 6С11-3А11 имеет аминокислотную последовательность CH IgG2a.

В антителе по настоящему изобретению более предпочтительно, чтобы цепь CL имела аминокислотную последовательность константной области каппа и CH имела аминокислотную последовательность константной области IgG2a.

Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность VL крысиного анти-бычьего PD-L1 антитела 6С11-3А11, идентифицированные авторами настоящего изобретения, показаны в SEQ ID NO:6 и 14, соответственно.

Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность VH крысиного анти-бычьего PD-L1 антитела 6С11-3А11, идентифицированные авторами настоящего изобретения, показаны в SEQ ID NO:7 и 15, соответственно.

Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность CL (каппа цепь) крысиного анти-бычьего PD-L1 антитела 6С11-3А11, идентифицированные авторами настоящего изобретения, показаны в SEQ ID NO:8 и 16, соответственно. Эти последовательности идентичны последовательностям, зарегистрированным в GenBank (база данных по нуклеотидным последовательностям, представленная National Center for Biotechnology Information (NCBI)) с номерами доступа #XM_008775358.2, #BC062802.1, #BC088255.1, #L22653.1, #L22655.1 и #M14434.1.

Аминокислотная последовательность и нуклеотидная последовательность CH (IgG2a) крысиного анти-бычьего PD-L1 антитела 6С11-3А11, идентифицированные авторами настоящего изобретения, показаны в SEQ ID NO:9 и 17, соответственно. Эти последовательности идентичны последовательностям, зарегистрированным в GenBank под номером доступа # BC088240. 1, #BC091257.1, #BC091272.1, #BC088423.1, #L22652.1 и #L22654.1.

Аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности CL и CH для крысиных антител, отличные от указанных выше, могут быть получены из известных баз данных для использования в настоящем изобретении.

В качестве аминокислотной последовательности и нуклеотидной последовательности каппа цепи Ig крысы последовательность, зарегистрированная в GenBank под регистрационным номером #V01241.1 показана в SEQ ID NO:10 и 18.

В качестве аминокислотной последовательности и нуклеотидной последовательности каппа цепи Ig крысы последовательность, зарегистрированная в GenBank под регистрационным номером #X16129.1, показана в SEQ ID NO:11 и 19.

В качестве аминокислотной последовательности и нуклеотидной последовательности каппа цепи Ig крысы последовательность, зарегистрированная в GenBank под регистрационным номером #DQ402471.1, показана в SEQ ID NO:12 и 20.

В качестве CH IgG2a крысы, последовательность, зарегистрированная в Genbank под регистрационным номером #DQ402472. 1, показана в SEQ ID NO:13 и 21.

Анти-PD-L1 антитело по настоящему изобретению может представлять собой анти-PD-L1 антителу, в котором CL имеет аминокислотную последовательность с любой SEQ ID NO:8 и 10-12, и CH имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO:9 или 13.

Аминокислотные последовательности SEQ ID NO:8-13 могут иметь делецию(и), замену(ы) или добавление(я) одной или нескольких (например, до пяти, максимум примерно 10) аминокислот. Даже если были введены такие мутации, то у полученных аминокислотных последовательностей остается функция антитела против PD-L1 с CL или CH.

Выравнивание аминокислотных последовательностей CL и CH крысиного анти-PD-L1 антитела показаны на ФИГ.8 и ФИГ.9, соответственно. Вышеописанные мутации, такие как делеция, замена или добавление аминокислот, могут соответствующим образом происходить на сайтах мутации как показано на ФИГ.8 и 9 или в непосредственной близости от них.

Анти-PD-L1 антитело по настоящему изобретению может быть химерным антителом. VL и VH антитела могут быть соответственно получену у крыс. Например, VL может быть VL крысиного анти-PD-L1 антитела (например, 6C11-3A11); VH может быть VH крысиного анти-PD-L1 антитела; и CL и CH могут быть получены у животного, отличного от крысы. Например, если антитело крысы химеризуется с помощью константных областей антитела мыши, то полученное химерное антитело может использоваться для тестирования и диагностики, поскольку различные вторичные антитела к антителам мыши коммерчески доступны. Аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности CL и CH антител животных, отличных от крыс, могут быть получены из известных баз данных для использования в настоящем изобретении.

Аминокислотные последовательности и нуклеотидные последовательности CL и CH для человека, мыши, крупного рогатого скота, собак, овец, свиней и буйволов приведены в таблице ниже.

Таблица

Аминокислотные последовательности SEQ ID NO:8-13, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66, 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 100, 102, 104, 106, 108, 110, 112, 114, 116, 118, 120 и 122 могут иметь делецию(и), замену(ы) или добавление(я) одной или нескольких(например, до пяти, максимум примерно 10) аминокислот. Даже если были введены такие мутации, то у полученных аминокислотных последовательностей остается функция как у константной области тяжелой или легкой цепи Ig.

Анти-PD-L1 антитело по настоящему изобретению может иметь четырехцепочечную структуру, содержащую две легкие цепи и две тяжелые цепи.

Анти-PD-L1 антитело по настоящему изобретению может быть получено как описано ниже. Коротко, синтезируют искусственный ген, который содержит последовательность легкой цепи (последовательность вариабельной области и последовательность константой области) и последовательность тяжелой цепи (последовательность вариабельной области и последовательность константной области) анти-PD-L1 антитела по настоящему изобретению. Полученный ген встраивают в вектор (например, плазмиду), который затем вводят в клетку-хозяина (например, клетку млекопитающего, такую как клетка CHO). Клетку-хозяина культивируют, и интересующее антитело собирают из полученной культуры. При синтезе искусственного гена могут быть оптимизированы кодоны нуклеотидной последовательности.

Настоящее изобретение относится к ДНК, кодирующей анти-PD-L1 антитело, содержащее (a) легкую цепь, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью KSISKY (SEQ ID NO:1), CDR2 с аминокислотной последовательностью SGS, и CDR3 с аминокислотной последовательностью QQHNEYPLT (SEQ ID NO:2), и (b) тяжелую цепь, содержащую CDR1 с аминокислотной последовательностью GYTFTDYI (SEQ ID NO:3), CDR2 с аминокислотной последовательностью INPDSGGN (SEQ ID NO:4), и CDR3 с аминокислотной последовательностью ARGITMMVVISHWKFDF (SEQ ID NO:5). Настоящее изобретение также относится к ДНК, кодирующей легкую цепь анти-PD-L1 антитела, содержащей CDR1 c аминокислотной последовательностью KSISKY (SEQ ID NO:1), CDR2 с аминокислотной последовательностью SGS, and CDR3 с аминокислотной последовательностью QQHNEYPLT (SEQ ID NO:2) (ДНК по (а’)). Кроме того, настоящее изобретение относится к ДНК, кодирующей тяжелую цепь анти-PD-L1 антитело, содежращей CDR1 с аминокислотной последовательностью GYTFTDYI (SEQ ID NO:3), CDR2 с аминокислотной последовательностью INPDSGGN (SEQ ID NO:4), и CDR3 с аминокислотной последовательностью ARGITMMVVISHWKFDF (SEQ ID NO:5) (ДНК по (b’)).

В случае (а) легкая цепь, содержащая CDR1 с аминокислотной последовательностью KSISKY (SEQ ID NO:1), CDR2 с аминокислотной последовательностью SGS, и CDR3 с аминокислотной последовательностью QQHNEYPLT (SEQ ID NO:2), и (b) тяжелая цепь, содержащая CDR1 с аминокислотной последовательностью GYTFTDYI (SEQ ID NO:3), CDR2 с аминокислотной последовательностью INPDSGGN (SEQ ID NO:4), и CDR3 с аминокислотной последовательностью ARGITMMVVISHWKFDF (SEQ ID NO:5), должна быть сделана ссылка на приведенное выше описание. ДНК, содержащая ДНК (a‘) и ДНК ('b), может быть синтезирована на коммерческом синтезаторе. К этой ДНК могут быть добавлены сайты распознавания ферментов рестрикции, последовательности Козака, последовательности поли-А дополнительного сигнала, промоторные последовательности, интронные последовательности или тому подобное.

Настоящее изобретение также относится к вектору, содержащему указанную выше ДНК, кодирующую анти-PD-L1 антитело.

В качестве вектора можно использовать плазмиды на основе Escherichia coli (например, pBR322, pBR325, pUC12 или pUC13); плазмиды на основе Bacillus subtilis (например, pUB110, pTP5 или pC194), плазмиды на основе дрожжей (например, pSH19 или pSH15); бактериофаги, например фаг λ; вирусы животных, такие как ретровирусы или вирус осповакцины; или вирусы на основе патогенов насекомых, такие как бакуловирус. В примерах, описанных ниже, используется pDC6 (японский патент № 5704753, патент США 9096878, патент ЕС 2385115, патент Гонконга (Китай), патент HK1163739 и патент Австралии 2009331326).

Вектор может также содержать промоторы, усилители, сигналы сплайсинга, поли-А дополнительные сигналы, последовательности интронов, маркеры селекции, точки начала репликации SV40 и тому подобное.

Настоящее изобретение также относится к клетке-хозяину, трансформированной вышеуказанным вектором. Можно получить анти-PD-L1 антитело по настоящему изобретению путем культивирования клетки-хозяина и сбора интересующего антитела из из полученной культуры. Поэтому, настоящее изобретение также относится к способу получения антитела, включающему культивирование вышеописанной клетки-хозяина и сбор анти-PD-L1 антитела по изобретению из культуры. В способе по настоящему изобретению для получения антитела вектор, содержащий ДНК, содержащую ДНК, кодирующую легкую цепь, и ДНК, кодирующую тяжелую цепь, может быть трансфицирован в клетку-хозяин. Альтернативно, вектор, в который встроена ДНК, кодирующая легкую цепь, и вектор, в который встроена ДНК, кодирующая тяжелую цепь, могут быть совместно трансфицированы в клетку-хозяин.

Примеры клеток-хозяев включают, но не ограничиваются ими, бактериальные клетки (например, бактерия Escherichia, бактерия Bacillus или Bacillus subtilis), клетки грибов (например, дрожжи или Aspergillus), клетки насекомых (например, клетки S2 или клетки Sf), животные клетки (такие как клетки CHO, клетки COS, клетки HeLa, клетки C127, клетки 3T3, клетки BHK или клетки HEK 293) и клетки растений. Среди этих клеток предпочтительными являются клетки CHO-DG44 (CHO-DG44(dfhr^-/^-)), которые являются клетками с дефицитом дигидрофолатредуктазы.

Введение рекомбинантного вектора в клетку-хозяин может быть осуществлено способами, описанными в Molecular Cloning 2nd Edition, J. Sambrook et al., Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989 (например, способом с фосфатом кальция, способом с DEAE-декстраном, трансфекцией, микроинъекцией, липофекцией, электропорацией, трансдукцией, введением при соскабливании, метод "дробовика" и тому подобное) или инъекцией.

Полученный трансформант можно культивировать в среде с последующим сбором анти-PD-L1 антитела по настоящему изобретению из культуры. Если антитело секретируется в среду, то среда может быть восстановлена с последующим выделением и очисткой антитела из среды. Если антитело продуцируется внутри трансформированных клеток, то клетки могут быть лизированы с последующим выделением и очисткой антитела от клеточного лизата.

Примеры среды включают, но не ограничиваются ими, среду OptiCHO, среду Dynamis, среду CD CHO, среду ActiCHO, chtle FortiCHO, среду Ex-Cell CD CHO, среду BalanCD CHO, среду ProCHO 5 и среду Cellvento CHO-100.

рН среды изменяется в зависимости от культивируемой клетки. Как правило, используется диапазон рН от 6,8 до 7,6; в основном, подходящим является диапазон рН от 7,0 до 7,4.

Если клетка, подлежащая культивированию, является клеткой СНО, то культивирование можно проводить способами, известными специалистам в данной области. Например, обычно можно проводить культивирование в газофазной атмосфере с концентрацией CO₂, равной 0-40%, предпочтительно 2-10%, при 30-39°С, предпочтительно при примерно 37°C.

Соответствующий период культивирования обычно составляет от одного дня до трех месяцев, предпочтительно от одного дня до трех недель.

Выделение и очистку антитела можно проводить известными способами. Известные способы выделения/очистки, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваются ими, способы, основанные на различной растворимости (такие как высаливание или осаждение); способы на основе разницы в молекулярной массе (такие как диализ, ультрафильтрация, гель-фильтрация или SDS-электрофорез в полиакриламидном геле); способы на основе разницы в электрических зарядов (такие как, ионообменная хроматография); способы на основе специфичности сродства (такие как, аффинная хроматография); способы на основе различие в гидрофобности (такие как, высокоэффективная жидкостная хроматография с обращенной фазой); и способы на основе разницы в изоэлектрической точки (такие как изоэлектрическое фокусирование).

Также можно получать анти-PD-L1 антитела по настоящему изобретению путем культивирования гибридомы, которая может быть получена способом, описанным в литературе (Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K, Immunology. 2014 Aug;142(4):551-61). Гибридома, продуцирующая анти-PD-L1 антитело 6C11-3A11, хранится в лаборатории автором настоящего изобретения (Laboratory of Infectious Diseases, Department of Disease Control, Faculty of Veterinary Medicine, Hokkaido University).

Анти-PD-L1 антитело по настоящему изобретению можно использоваться для детекции PD-1. Таким образом, настоящее изобретение относится к композиции для детекции PD-L1, содержащей анти-PD-L1 антитело в качестве активного ингредиента.

Детекция PD-L1 может быть осуществлена такими способами, включая, но не ограничиваясь ими, как иммуногистохимическое окрашивание, иммуноцитохимическое окрашивание, проточная цитометрия, иммуноферментный анализ (ELISA) и Вестерн-блоттинг.

Аналиты для детекции могут быть представлены образцами, такими как ткани или жидкости организма, взятые из организмов (например, кровь (цельная кровь, плазма, сыворотка или специфические клетки, такие как эритроциты, лейкоциты или лимфоциты), моча, слюна и тому подобное); культура клеток; и культивируемые клетки (разработанные клеточные линии, первичные культивируемые клетки, субкультурные клетки и тому подобное). Источник таких аналитов конкретно не ограничен. Примеры включают крысу, собаку, овцу, козу, свинью, кошку, человека, лошадь, крупный рогатый скот, буйвола, яка, кролика, мышь, хомяка и морскую свинку.

Антитело против PD-L1 по настоящему изобретению может быть мечено радиоизотопами, ферментами, люминесцентными веществами, флуоресцентными веществами, биотином или тому подобное. Если за реакцией с первым антителом (анти-PD-L1 антитело по настоящему изобретению), которое специфически связывается с молекулой-мишенью (PD-L1), следует реакция со вторым антителом, которое связывается с первым антителом для детекции молекулы-мишени, то целесообразно метить второе антитело.

Поскольку PD-L1 экспрессируется в раковых клетках и вирусно-инфицированных клетках на высоком уровне, то композиция по настоящему изобретению может быть использована для диагностики злокачественных новообразований и/или инфекций. Обычно количество (концентрация) PD-L1 в аналите определяется на основе количества (концентрации) комплекса PD-L1 и анти-PD-L1 антитела. Если количество (концентрация) PD-L1 в аналите выше, чем в отрицательном контроле (например, в здоровой окружающей ткани (соединительная ткань, кровеносные сосуды и тому подобное)), то аналит может быть диагностирован как пораженный злокачественным новообразованием и/или инфекцией. Альтернативно, если в аналите детектирван PD-L1, то аналит может быть диагностирован как пораженный злокачественным новообразованием и/или инфекцией.

Примеры злокачественных новообразований и/или инфекций включают, но не ограничиваются ими, неопластические заболевания (например, злокачественная меланома, рак легких, рак желудка, рак почки, рак молочной железы, рак мочевого пузыря, рак пищевода, рак яичников и тому подобное), лейкоз, болезнь Джона, анаплазмоз, бактериальный мастит, грибковый мастит, инфекции, вызванные микоплазмой (например, мастит, вызванный микоплазмой, пневмония, вызванная микоплазмой, или тому подобное), туберкулез, инфекцию, вызванную Theileria orientalis, криптоспоридоз, кокцидиоз, трипаносомоз и лейшманиоз.

Композиция по настоящему изобретению может использоваться для селекции подопытных животных, подходящих для терапии на основе анти-PD-L1 антитела. Например, животные, удовлетворяющие следующим двум критериям, могут рассматриваться как животные-кандидаты.

1. В случае диагностирования при медико-патологическом исследовании злокачественного новообразования (например меланомы) или инфекции

2. В случае, считающемся положительным для анти-PD-L1 антитела

Отрицательным контролем может быть здоровая окружающая ткань (соединительная ткань, кровеносные сосуды и тому подобное), а положительным контролем может быть случай злокачественного новообразования (такой как меланома) или инфекции. В основном клинические испытания можно проводить с животными с опухолью, которая является положительной на иммуногистохимическое окрашивание практически во всех областях.

Такие животными являются, но не ограничиваясь ими, крыса, собака, овца, коза, свинья, кошка, человек, лошадь, крупный рогатый скот, буйвол, як, кролик, мышь, хомяк и морская свинка.

Композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать реагенты для детекции меток, разбавители, жидкости для промывки, инструкции, описывающие критерии диагностики/селекции, и тому подобное.

Примеры

Далее, настоящее изобретение описано более подробно со ссылкой на Примеры. Однако, настоящее изобретение не ограничивается этими Примерами.

[Пример 1]

1. Введение

Белок запрограммированной клеточной гибели 1 (PD-1), являющийся иммуноингибиторным рецептором, и лиганд запрограмированной клеточной гибели 1 (PD-L1) являются молекулами, идентифицированными профессором Tasuku Honjo et al., Kyoto University, как факторы, которые ингибируют чрезмерный иммунный ответ и которые тесно связаны с иммунотолерантностью. Недавно было выяснено, что эти молекулы также участвуют в иммуносупрессии при инфекциях и опухолях у различных животных. В рассматриваемом Примере анти-бычье PD-L1 моноклональное антитело получали путем иммунизации крыс, а затем отбирали клон (6Cc11-3А11), способный детектировать PD-L1 собаки. Кроме того, авторы настоящего изобретения провели иммуногистохимическое окрашивание для установления эффективности этого анти-бычьего антитела PD-L1 6C11-3A11 при детекции PD-L1 в злокачественных опухолях собаки (таких как меланома) и инфекциях свиней/овец.

2. Материалы и методы

2.1 Клетки, продуцирующие крысиное анти-бычье PD-L1 моноклональное антитело

Определяли нуклеотидную последовательность бычьего PD-L1 (Ikebuchi R, Konnai S, Shirai T, Sunden Y, Murata S, Onuma M, Ohashi K. Vet Res. 2011 Sep 26;42:103). На основе информации о последовательности получали рекомбинантный бычий PD-L1. Крысу иммунизировали в подушечку стопы этим рекомбинантным белком, и получали гибридомы методом с использованием подвздошных лимфатических узлов. В результате, были получены гибридомы, продуцирующие крысиные анти-бычьи PD-L1 моноклональные антитела (Ikebuchi R, Konnai S, Okagawa T, Yokoyama K, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. Immunology 2014 Aug.; 142(4):551-561). Крысиное анти-бычье PD-L1 антитело 6С11-3А11 является одним из моноклональных антител, полученных от вышеописанной иммунизированной крысы.

2.2 Идентификация полноразмерного гена PD-L1 собаки

Для определения полноразмоной кДНК PD-L1 собаки, сначала конструировали ПЦР-праймеры на основе предполагаемой нуклеотидной последовательности PD-L1 собаки, уже зарегистрированной в The National Center for Biotechnology Information (NCBI) (номер доступа в GenBank; XM_541302). Вкратце, конструировали праймеры для амплификации внутренней последовательности открытой рамки считывания (ORF) этого гена (cPD-1 внутренний F и R), и проводили ПЦР. Для амплифицированных продуктов нуклеотидные последовательности определяли с помощью капиллярного секвенсора согласно общепринятым методам. Затем, для определения нуклеотидной последовательности полноразмерной кДНК PD-L1 констрировали праймеры (cPD-L1 5' GSP и 3' GSP) на основе последовательностей кДНК PD-L1 собами, как определено выше. Осуществляли 5'-RACE и 3'-RACE, используя, соответственно, систему 5′-RACE для быстрой амплификации концов кДНК и систему 3'-RACE для быстрой амплификации концов кДНК (Invitrogen). Полученные фрагменты гена секвенировали, как описано выше (Maekawa N, Konnai S, Ikebuchi R, Okagawa T, Adachi M, Takagi S, Kagawa Y, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. PLoS One. 2014 Jun 10;9(6):e98415).

Праймер (cPD-L1 внутренний F): ATGAGAATGTTTAGTGTCTT (SEQ ID NO:22)

Праймер (cPD-L1 внутренний R): TTATGTCTCTTCAAATTGTATATC (SEQ ID NO:23)

Праймер (cPD-L1 5'GSP): TTTTAGACAGAAAGTGA (SEQ ID NO:24)

Праймер (cPD-L1 3'GSP): GACCAGCTCTTCTTGGGGAA (SEQ ID NO:25)

2.3 Получение клеток COS-7, экспрессирующих PD-L1 собаки

Для получения плазмиды экспрессии PD-L1-EGFP собаки, осуществляли ПЦР, используя в качестве матрицы синтезированную кДНК из PBMC бигля и праймеры, сконструированные путем добавления сайтов распознавания BglII и EcoRI на 5'-конец (cPD-L1-EGFP F и R). Полученные продукты ПЦР расщепляли BglII (New England Biolabs) и EcoRI (Takara), а затем очищали, используя набор Fastgene Gel/ПЦР Extraction Kit (NIPPON Genetics), и затем клонировали в вектор pEGFP-N2 (Clontech), обработанный аналогичным образом ферментами рестрикции. Полученную интересующую плазмиду экспрессии экстрагировали, используя набор QIAGEN Plasmid Midi kit (Qiagen), и хранили при -30°C перед использованием в экспериментах. Далее, полученная таким образом плазмида экспрессии обозначена как pEGFP-N2-cPD-L1.

Праймер (cPD-L1-EGFP F): GAAGATCTATGAGAATGTTTAGTGTC (SEQ ID NO:26)

Праймер (cPD-L1-EGFP R): GGAATTCTGTCTCTTCAAATTGTATATC (SEQ ID NO:27)

Клетки COS-7 субкультивировали при плотности 5х10⁴ клеток/см² в 6-и луночных планшетах, а затем культивировали в течение ночи в среде RPMI 1640, содержащей 10% инактивированной фетальной бычьей сыворотки и 0,01% L-глютамина при 37°C в присутствии 5% CO₂. PEGFP-N2-cPD-L1 или pEGFP-N2 (отрицательный контроль) вводили в клетки COS-7 в количестве 0,4 мкг/см², используя Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Клетки культивировали в течение 48 часов (клетка, экспрессирующая cPD-L1-EGFP собаки, и клетка, экспрессирующая EGFP). Для подтверждения экспрессии PD-L1 в полученных таким образом экспрессирующих клетках, визуализировали внутриклеточную локализацию усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) с помощью инфертированного конфокального лазерного микроскопа LSM700 (ZEISS) (Maekawa N, Konnai S, Ikebuchi R, Okagawa T, Adachi M, Takagi S, Kagawa Y, Nakajima C, Suzuki Y, Murata S, Ohashi K. PLoS One. 2014 Jun 10;9(6):e98415).

2.4 Перекрестное взаимодействие крысиного анти-бычьего PD-L1 антитела 6С11-3А11 с PD-L1 собаки

Для того, чтобы подтвердить, что крысиное анти-бычье PD-L1 антитело 6C11-3A11 специфически связывается с PD-L1 собаки, осуществляли проточную цитометрию с клетками, экспрессирующими cPD-L1-EGFP, или клетками, эксперссирующими EGFP, полученными в разделе 2.3 выше. К клетками в количестве 2×105-1×106 добавляли 10 мкг/мл анти-бычьего антитела PD-L1 6C11-3A11 и проводили реакцию в течение 30 мин при комнатной температуре. После промывки осуществляли дектецию связывания антител на клеточной поверхности с помощью козлиного анти-крысиного Ig антитела, меченного аллофикоцианином (Beckman Coulter). Для анализа использовали FACS Verse (Becton, Dickinson and Company). В качестве отрицательного контрольного антитела использовали изотипический контроль IgG2a (κ) крысы (BD Bioscience). Для каждой операции промывки и разведения антител использовали 10% инактивированную козью сыворотку с добавлением PBS. Результаты приведены на фиг.1.

2.5 Анализ CDR крысиного анти-бычьего PD-L1 антитела 6Cc11-3А11

Из гибридомы, продуцирующей антитело, определяли гены тяжелой цепи и легкой цепи крысиного анти-бычьего PD-L1 антитела 6С11-3А11 из гибридомы, используя метод RACE. Определяющие комплементарность области (CDR) крысиного анти-бычьего PD-L1 антитела 6Cc11-3А11 определяли с помощью NCBI IGBLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/). Результаты приведены на Фиг.2.

2.6 Иммуногистохимическое окрашивание опухолевых тканей собак и инфицированных тканей овец/свиней

Для подтверждения того, что крысиное анти-бычье антитело против PD-L1 6C11-3A11 можно использовать для иммуногистохимического окрашивания PD-L1 опухолей у собак, образцы опухолей, фиксированные формалином в парафине, иммуногистохимически окрашивали. Согласно общепринятым методам полученные образцы депарафинизировали и затем подвергали микроволновой обработке (5 минут, дважды) в цитратном буфере. Затем образцы подвергали воздействию антителом PD-L1 6C11-3A11 (400-кратное разведение) в течение 30 минут, а затем с Simple Stain Mouse MAX-PO (крыса) (Nichirei Bioscience) в течение 30 минут. Для окрашивания обрабатывали диаминобензидином (DAB) в течение 10 минут.

Результаты показаны на Фиг. 3, 4, 5-1, 5-2, 6 и 7.

Анти-MelamA антитело, единственное коммерчески доступное антитело, специфичное к меланоме, окрашивало опухолевые клетки очень плохо (Фиг.3, слева). С другой стороны, анти-PD-L1 антитело (6C11-3A11), полученное авторами настоящего изобретения, окрашивало опухолевые клетки очень хорошо (Фиг.3, справа). Анти-PD-L1 антитело (6C11-3A11) было способно окрашивать меланому почти в каждом случае.

При меланоме собак было обнаружено, что опухолевые клетки являются диффузно положительными для анти-PD-L1 антитела (6C11-3A11). (Положительное число/тестированное число=12/12; уровень положительного результата 100%)

При лимфоме собак было обнаружено, что опухолевые клетки являются диффузно положительными для анти-PD-L1 антитела (6C11-3A11). При остеосаркоме собак некоторые опухолевые клетки окрашивались внутриклеточно. При почечно-клеточном раке собак было обнаружено, что опухолевые клетки являются диффузно положительными в различных типах тканей.

В случае листериоза овец изображение с окрашиванием PD-L1 головного мозга при листериозе овец с неврологическими симптомами показано на Фиг.6, левая панель. На увеличенной фотографии этого изображения экспрессия PD-L1 отмечалась в макрофагах, инфильтрирующих очаги поражения головного мозга (Фиг.6, справа).

В случае цирковирусной инфекции свиней типа 2 PD-L1 окрашивался в лимфоидных фолликулах, и вирус окрашивался в этих клетках (Фиг.7, слева).

В случае микоплазменной пневмонии свиней, большое количество макрофагов инфильтрировали поражения в легких, и PD-L1 окрашивались в эти инфильтрирующих клетках (Фиг.7, справа).

Как описано выше, анти-бычье PD-L1 антитело 6C11-3A11 можно использовать для детекции PD-L1 в различных опухолях собак (таких как злокачественная меланома) и инфекциях овец/свиней при иммуногистохимическом окрашивании. Это говорит о возможности использовать анти-бычье PD-L1 антитело 6C11-3A11 для диагностики различных животных и различных заболеваний.

[Пример 2]

1. Введение

Моноклональные антитела могут быть получены путем культивирования гибридом и очистки антител из полученных культур супернатантов. Альтернативно, если определена нуклеотидная последовательность интересующего антитела, то клетка, экспрессирующая антитело, может быть получена путем трансфекции культивированных клеток вектором для экспрессии нуклеотидной последовательности; полученная таким образом клетка, экспрессирующая антитело, может быть использована в качестве замены гибридомы. В рассматриваемом ниже примере будет приведен пример способа, в котором антитело продуцируется системой для экспрессии белка, используя вектор экспрессии и клетки млекопитающего.

2. Материалы и методы

2.1 Получение вектора экспрессии крысиного анти-бычьего антитела PD-L1 6C11-3A11

На основе нуклеотидной последовательности крысиного анти-бычьего PD-L1 антитела 6C11-3A11, определенной в разделе 2.5 Примера 1 выше, осуществляли синтез гена так, чтобы сайт распознавания фермента рестрикции NotI, последовательность Козака, последовательность легкой цепи антитела, последовательность поли-А дополнительного сигнала (PABGH), последовательность промотора (PCMV), сайт распознавания фермента рестрикции SacI, последовательность интрона (INRBG), последовательность Козака, последовательности тяжелой цепи антитела, сайт распознасвания фермента рестикции XbaI были расположены в приведенном порядке. В этом случае кодоны гена антитела могут быть оптимизированы заранее в зависимости от типа клетки, которая должна экспрессировать ген. Цепь синтезированного гена встраивают в вектор экспрессии pDC6 (любезно предоставлен профессором S. Suzuki, Rsearch Center for Zoonosis Control, Hokkaido University) в сайт клонирования (сайты распознавания ферментов рестрикции NotI и XbaI расположены после PCMV и между INRBG и PABGH), используя сайты распознавания ферментов рестрикции так, что перечисленные выше последовательности будет находиться в указанном выше порядке с получением, тем самым, вектора pDC6, экспрессирующего крысиное анти-бычье PD-L1 антитело.

2.2 Экспрессия крысиного анти-бычьего PD-L1 антитела 6C11-3A11

Вектор, экспрессирующий крысиное анти-бычье антитело PD-L1, pDC6, полученный в разделе 2.1 выше, трансфицировали в клетки CHO-DG44 (CHO-DG44(dfhr^-/^-)), которые являются клетками с дефицитом дигидрофолатредуктазы, и клоны с высокой экспрессией отбирали dot-блоттингом. Для повышения экспрессии амплификацию генов можно выполнять путем добавления нагрузки на клетки в среде, содержащей 60 нМ, 250 нМ или 1000 нМ метотрексата (Mtx). Полученные таким образом клетки, стабильно экспрессирующие крысиное анти-бычье PD-L1 антитело 6C11-3A11, переносили в среду Opti-CHO без Mtx. Путем культивирования этих клеток при встряхивании в течение 14 дней (125 об/мин, 37°C, 5% CO₂) может быть получен супернатант культуры, содержащий представляющее интерес антитело. Для использования в различных экспериментах, антитело в супернатанте может быть очищено известными способами, такими как аффинная хроматография или ионообменная хроматография.

[Пример 3]

1. Введение

С целью создания нового способа диагностики опухолей в этом Примере получали химерное крыса-человек анти-PD-L1 антитело путем культивирования клеток яичников китайского хомяка (клетки CHO), которые экспрессируют ген химерного антитела, в котором ген вариабельной области крысиного анти-бычьего PD-L1 антитела 6С11-3A11 объединяли с геном константной области иммуноглобулина человека (IgG4).

2. Материалы и методы

2.1 Получение вектора, экспрессирующего химерное крыса-человек анти-PD-L1 антитело (Фиг.10)

Ниже показано, что химерное крыса-человека анти-PD-L1 антитело получали с использованием крысиного анти-бычьего PD-L1 моноклонального антитела 6C11-3A11 в качестве его вариабельной области.

Кратко, из гибридомы, продуцирующей крысиное анти-бычье PD-L1 антитело, 6C11-3A11, определяли гены тяжелой цепи и легкой цепи. Затем, получали нуклеотидную последовательность путем соединения генов вариабельной области тяжелой цепи и легкой цепи вышеуказанного крысиного антитела с константной областью тяжелой цепи IgG4 и константой областью легкой цепи каппа известного антитела человека, соответственно. После оптимизации кодонов проводили синтез генов так, чтобы сайт распознавания фермента рестрикции NotI, последовательность Козака, последовательность легкой цепи химерного антитела, последовательность поли-A дополнительного сигнала (PABGH), последовательность промотора (PCMV), сайт распознавания фермента рестрикции SacI, последовательность интрона (INRBG), последовательность Козака, последовательность тяжелой цепи химерного антитела и сайт распознавания фермента рестрикции XbaI были расположены в указанном порядке. Цепь синтезированного гена встраивали в вектор экспрессии pDC6 (любезно представлен профессором S. Suzuki, Research Center for Zoonosis Control, Hokkaido University) в сайт клонирования (сайты распознавания ферментов рестрикции NotI и XbaI расположены ниже PCMV и между INRBG и PABGH), используя сайты распознавания ферментов рестрикции, так что указанные выше последовательности расположены в указанном выше порядке (Фиг.10). Таким образом, контруировали вектор, экспрессирующий химерное крыса-человек анти-PD-L1антитело. Этот вектор экспрессии трансфицировали в клетки CHO-DG44 (CHO-DG44(dfhr^-/^-)), которые являются клетками с дефицитом дигидрофолатредуктазы, и клоны с высокой экспрессией отбирали dot-блоттингом. Для повышения экспрессии амплификацию генов можно выполнять путем добавления нагрузки на клетки в среде, содержащей 60 нМ, 250 нМ или 1000 нМ метотрексата (Mtx). Полученные таким образом клетки, стабильно экспрессирующие химерное крыса-человек анти-PD-L1 антитело 6C11-3A11, переносили в среду Opti-CHO без Mtx. Путем культивирования этих клеток при встряхивании в течение 14 дней (125 об/мин, 37°C, 5% CO₂) может быть получен супернатант культуры, содержащий представляющее интерес антитело. Для использования в различных экспериментах, антитело в супернатанте может быть очищено известными способами, такими как аффинная хроматография или ионообменная хроматография.

[Пример 4]

1. Введение

Что касается PD-L1 в опухолях собак, ранее был описан способ детекции иммуногистохимическим окрашиванием крысиного анти-бычьего анти-PD-L1 антитела 6G7-E1, и профили экспрессии в различных опухолях (Maekawa N, Konnai S, Okagawa T, Ikebuchi R , Izumi Y, Takagi S, Kagawa Y, Nakajima C, Suzuki Y, Kato Y, Murata S, Ohashi K. PLoS One. 2016 Jun 11(6): e0157176). В рассматриваемом примере, для оценки повышенной эффективности крысиного анти-бычьего PD-L1 антитела 6C11-3A11 по сравнению с существующии анти-PD-L1 антителом 6G7-E1 в анализе экспрессии PD-L1 в опухолях собак, осуществляли иммуногистохимические окрашивания различных опухолей собак для непосредственного сравнение чувствительности детекции PD-L1 6G7-E1 и 6C11-3A11.

2. Материалы и методы

2.1 Сравнение методом проточной цитометрии при использовании клеток, стабильно экспрессирующих PD-L1-EGFP собаки, CHO-DG44 (Фиг.11)

Во-первых, для получения клеток, экспрессирующих мембранные PD-L1 собак, в клетки CHO-DG44 в количестве 4×106 вводили 2,5 мкг плазмиды экспрессии PD-L1-EGFP (pEGFP-N2-cPD-L1), полученной в разделе 2,3 Примера 1 или pEGFP-N2 (отрицательный контроль), используя липофектамин LTX (Invitrogen). Через сорок восемь часов среду меняли на среду CD DG44 (Life Technologies), содержащую G418 (Enzo Life Science) в количестве 800 мкг/мл, добавку GlutaMAX (Life Technologies) в количестве 20 мл/л и 10% Pluronic F-68 (Life Technologies) в количестве 18 мл/л, а затем отбирали стабильно экспрессирующие клетки и клонировали путем ограниченого разведения. Полученную таким образом клетку, экспрессирующую мембранные PD-L1 собак, или клетку, экспрессирующую EGFP, подвергали взаимодействию с крысиным анти-бычьим PD-L1 антителом 6C11-3A11 или 6G7-E1 при комнатной температуре в течение 30 мин. После промывки осуществляли дектецию связывания антител на клеточной поверхности с помощью козлиного анти-крысиного Ig антитела, меченного аллофикоцианином (Beckman Coulter). Для анализа использовали FACS Verse (Becton, Dickinson and Company). В качестве отрицательного контрольного использовали IgG2a (κ) или изотипический контроль IgM (κ) (BD Bioscience). Для каждой операции промывки и разведения антител использовали 10% инактивированную козью сыворотку с добавлением PBS.

Результаты приведены на Фиг.11. Крысиные анти-бычьи анти-PD-L1 антитела 6C11-3A11 и 6G7-E1 специфически связывались с клетками, экспрессирующими мембранные PD-L1 собак. Полученная интенсивность флуоресценции была выше для 6C11-3A11, чем с 6G7-E1, что указывает на то, что 6C11-3A11 является антителом с более высоким уровнем сродства.

2.2 Сравнение чувствительности обнаружения обоих антител в анализе экспрессии PD-L1 различных опухолей собак (иммуногистохимическое окрашивание)

Согласно методике, описанной в разделе 2.6 Примера 1 осуществляли окрашивание крысиным анти-бычьим антителом PD-L1 6C11-3A11, используя образцы плоскоклеточного рака кожи собак (n=5), аденокарциномы носы (n=5), переходноклеточной карциномы (n=5), рака анального мешка (n=5), саркомы мягких тканей (n=5) и остеосаркомы (n=5). Иммуногистохимическое окрашивание, используя крысиное анти-бычье антитело PD-L1 6G7-E1 проводили аналогично, используя срезы тех же аналитов. Конечная концентрация 6G7-E1, используемая в этом случае, составила 10 мкг/мл, и в качестве второго антитела использовали меченное биотином козье антитело против крысы (Jackson ImmunoResearch Laboratories).

Результаты приведены на Фиг.12 и 13. Несмотря на то, что специфические сигналы не наблюдали при плоскоклеточной карциномы, аденокарциноме носа, переходно-клеточной карциноме и раке анального мешка и саркоме мягких тканей при окрашивании 6G7-E1, удовлетворительные положительные реакции получали при окрашивании 6C11-3A11. С другой стороны, специфические сигналы также были получены с 6G7-E1 при остеосаркоме, но окрашивание 6C11-3A11 давало более высокую интенсивность сигнала. Положительный прогностический показатель по PD-L1 этих опухолей, полученных при окрашивании 6C11-3A11, составила 100% (5 из 5 случаев) во всех вышеперечисленных видах опухолей, за исключением саркомы мягких тканей, которая имела положительный прогностический показатель PD-L1, равный 80% (4 из 5 случаев).

Затем, иммуногистохимически окрашивали образцы злокачественной меланомы полости рта (n=17), аденокарциномы молочной железы (n=10), гистиоцитарной саркомы (n=10), диффузной крупноклеточной лимфомы (n=10) и трансмиссивной венерической опухоли (n=4) с помщью 6C11-3A11 для анализа экспрессии в PD-L1.

Результаты показаны на Фиг.14. Положительный прогностический показатель по PD-L1 составила 100% (17 из 17 случаев), 100% при аденокарциноме молочной железы (10 из 10 случаев), 20% при гистиоцитарной саркоме (2 из 10 случаев), 20% при диффузной крупноклеточной В-клеточной лимфоме (2 из 10 случаев) и 0% при трансмиссивной венерической опухоли (0 из 4 случаев).

Вышеописанные результаты показали, что 6C11-3A11 превосходит существующее анти-PD-L1 антитело 6G7-E1 для детекции PD-L1 собаки.

[Пример 5]

1. Введение

Болезнь Джона является хронической инфекцией крупного рогатого скота, вызванная Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis. У крупного рогатого скота, пораженного болезнью Джона, экспрессия PD-L1 была подтверждена в клетках, инфицированных M. avium subsp. paratuberculosis, в поражениях подвздошной кишки, которые расположены в месте инфицирования этой бактерией (Okagawa T, Konnai S, Nishimori A, Ikebuchi R, Mizorogi S, Nagata R, Kawaji S, Tanaka S, Kagawa Y, Murata S, Mori Y and Ohashi K. Infect Immun, 84:77-89, 2016). В рассматриваемом примере иммуногистохимическое окрашивание поражений подвздошной кишки крупного рогатого скота с болезнью Джона проводили для проверки того может ли крысиное анти-бычье антитело PD-L1 6C11-3A11 использоваться для детекции бычьего PD-L1 или нет.

2. Материалы и методы

2.1. Конструирование клеток, экспрессирующих PD-L1 крупного рогатого скота

Нуклеотидная последовательность полноразмерной кДНК гена PD-L1 крупного рогатого скота (GenBank accession number AB510902; Ikebuchi R, Konnai S, Shirai T, Sunden Y, Murata S, Onuma M, Ohashi K. Vet. Res. 2011 Sep. 26; 42:103). На основе информации о нуклеотидной последовательности получали клетки, экспрессирующие бычий PD-L1 на мембране. Для получения плазмиды экспрессии бычьего PD-L1, осуществляли ПЦР, используя в качестве матрицы синтезированную кДНК из PBMC быка и праймеры, сконструированные путем добавления сайтов распознавания NheI и XhoI на 5'-конец (boPD-L1-EGFP F и R). Продукты ПЦР расщепляли с помощью NheI (Takara) и XhoI (Takara), очищали с помощью набора для гель экстракции Fastgene Gel/PCR Extraction (NIPPON Genetics) и клонировали в вектор pEGFP-N2 (Clontech), который подвергали аналогичной обработке ферментами рестрикции. Полученную интересующую плазмиду экспрессии экстрагировали, используя набор QIAGEN Plasmid Midi kit (Qiagen), и хранили при -30°C перед использованием в экспериментах. Далее, полученная таким образом плазмида экспрессии обозначена как pEGFP-N2-boPD-L1.

Праймер (boPD-L1-EGFP F): CTAGCTAGCACCATGAGGATATATAGTGTCTTAAC (SEQ ID NO:124)

Праймер (boPD-L1-EGFP R): CAATCTCGAGTTACAGACAGAAGATGACTGC (SEQ ID NO:125)

Клетки, экспрессирующие бычий PD-L1 на мембране, получали методом, описанным ниже. Сначала, 2,5 мкг pEGFP-N2-boPD-L1 или pEGFP-N2 (отрицательный контроль) вводили в клетки 4×106 CHO-DG44, используя Lipofectamine LTX (Invitrogen). Через сорок восемь часов среду меняли на среду CD DG44 (Life Technologies), содержащую G418 (Enzo Life Science) в количестве 800 мкг/мл, добавку GlutaMAX (Life Technologies) в количестве 20 мл/л и 10% Pluronic F-68 (Life Technologies) в количестве 18 мл/л; затем, осуществляли селекцию одновременной с клонированием путем ограниченного разведения (клетки, эксперессирующие бычьи PD-L1, и клетки, экспрессирующие EGFP). Для подтверждения экспрессии бычьих PD-L1 в полученных таким образом клетках, экспрессирующих бычьи PD-L1, визуализировали внутриклеточную локализацию EGFP с помощью инфертированного конфокального лазерного микроскопа LSM700 (ZEISS).

2.2. Специфичность связывания крысиного анти-бычьего PD-L1 антитела 6C11-3A11 с бычьим PD-L1

С помощью проточной цитометрии было подтверждено, что крысиное анти-бычье антитело PD-L1 6C11-3A11 специфически связывается с клеткой, экспрессирующей бычий PD-L1 (описано выше). Во-первых, крысиное анти-бычье PD-L1 антитело 6C11-3A11 или изотипический контроль крысиного IgG2a (κ) (BD Biosciences) в качестве негативного контроля взаимодействовал с клетками, эксперссирующими бычьи PD-L1, или клетками, эксперссирующими EGFP (негативный контроль) при комнатной температуре в течение 30 мин. После промывки APC-меченое анти-крысиное IgG антитело козы (Southern Biotech) взаимодействовало при комнатной температуре в течение 30 минут. После промывки антитела, связанного с клеточной поверхностью, детектировали с помощью FACS Verse (BD Biosciences). Для каждой операции промывки и разведения антител использовали PBS, дополненный 1% бычьим сывороточным альбумином (Sigma-Aldrich).

Результаты показаны на Фиг.15. Было обнаружено, что крысиное анти-бычье антитело PD-L1 6C11-3A11 специфически связывается с клеткой, экспрессирующей бычий PD-L1.

2.3. Иммуногистохимическое окрашивание c использованием образцов тканей инфицированного крупного рогатого скота

Для подтверждения того, что крысиное анти-бычье антитело PD-L1 6C11-3A11 можно использовать для иммуногистохимического окрашивания по PD-L1 тканей крупного рогатого скота, иммуногистохимическое окрашивание проводили с помощью фиксированных формалином образцов бычьей ткани в парафине. Вкратце, для окрашивания использовали фиксированную подвздошную ткань крупного рогатого скота с естественным образом приобретенной болезнью Джона (№ 1, представляющий клинические симптомы болезни Джона, такие как диарея и сильное истощение), крупного рогатого скота, экспериментально зараженного M. avium subsp. paratuberculosis (№ 65, клинические симптомы, такие как распространение M. avium subsp. paratuberculosis и диарея); Okagawa T, Konnai S, Nishimori A, Ikebuchi R, Mizorogi S, Nagata R, Kawaji S, Tanaka S, Kagawa Y, Murata S, Mori Y and Ohashi K. Infect Immun, 84:77-89, 2016) и инфицированного контрольного крупно рогатого скота (C№6) (фиксаты любезно представлены Dr. Yasuyuki Mori, National Institute of Animal Health, National Agriculture and Food Research Organization). Согласно общепринятым методам, окрашенные образцы депарафинизировали и затем подвергали микроволновой обработке (5 мин, дважды) в цитратном буфере. Затем проводили реакцию образцов с крысиным анти-бычьим антителом PD-L1 6C11-3A11 (400-кратное разведение) в течение 30 мин, а затем с Simple Stain Mouse MAX-PO (Rat) (Nichirei Bioscience) в течение 30 мин. Наконец, проводили реакцию образцов с диаминобензидином (DAB) в течение 10 мин для окрашивания, а затем наблюдали под оптическим микроскопом.

Результаты приведены на Фиг.16. Крысиное анти-бычье антитело PD-L1 6C11-3A11 детектировало экспрессию PD-L1 в клетках, инфицированных M. avium subsp. paratuberculosis (подтверждено окрашиванием Циля-Нильсена) в очагах поражения подвздошной кишки крупного рогатого скота № 1 при естественном развитии болезни Джона и у крупного рогатого скота с эксперементально инфицированной болезнью, № 65 (Фиг. 16а, b). С другой стороны, PD-L1 не экспрессировался в подвздошной кишке неинфицированного крупного рогатого скота (C№6), поэтому реакция крысиного анти-бычьего антитела PD-L1 6C11-3A11 (неспецифическая реакция) не распознавалась (Фиг.16а).

Как описано выше, было показано, что крысиное анти-бычье антитело PD-L1 6C11-3A11 может быть использовано для детекции PD-L1 в тканях крупного рогатого скота при иммуногистохимическом окрашивании.

Все публикации, патенты и патентные заявки, цитируемые в настоящем документе, включены в него посредством ссылки в полном объеме.

Промышенная применимость

Анти-PD-L1 антитело по настоящему изобретению можно использоваться для диагностики злокачественных новообразований и/или инфекций. Кроме того, анти-PD-L1 антитело по настоящему изобретения также можно использовать для селекции животных, подходящих для терапии антителами против PD-L1.

Перечень последовательностей

SEQ ID NO:1 соответствует аминокислотной последовательности CDR1 вариабельной области легкой цепи (VL) анти-PD-L1 антитела 6C11-3A11 (IgG2a).

KSISKY

SEQ ID NO:2 соответствует аминокислотной последовательности CDR3 of the VL анти-PD-L1 антитела 6C11-3A11 (IgG2a).

QQHNEYPLT

SEQ ID NO:3 соответствует аминокислотной последовательности CDR1 вариабельной области тяжелой цепи (VH) анти-PD-L1 антитела 6C11-3A11 (IgG2a).

GYTFTDYI

SEQ ID NO:4 соответствует аминокислотной последовательности CDR2 VH анти-PD-L1 антитела 6C11-3A11 (IgG2a).

INPDSGGN

SEQ ID NO:5 соответствует аминокислотной последовательности CDR3 VH анти-PD-L1 антитела 6C11-3A11 (IgG2a).

ARGITMMVVISHWKFDF

SEQ ID NO:6 соответствует аминокислотной последовательности the VL анти-PD-L1 антитела 6C11-3A11 (IgG2a).

MRVQIQFWGLLLLWTSGIQCDVQMTQSPSNLAASPGESVSINCKASKSISKYLAWYQQKPGKANKLLIYSGSTLQSGTPSRFSGSGSGTDFTLTIRNLEPEDFGLYYCQQHNEYPLTFGSGTKLEIK

SEQ ID NO:7 соответствует аминокислотной последовательности VH анти-PD-L1 антитела 6C11-3A11 (IgG2a).

MGWICIIFLVAIATGAHSQVKLLQSGAALVKPGDSVKMSCKASGYTFTDYIIHWVKQSHGKSLEWIGYINPDSGGNNYNEKFKSKATLTVDKSSSTAYMEFSRLTSEDSAIYYCARGITMMVVISHWKFDFWGPGTMVTVSS

SEQ ID NO:8 соответствует аминокислотной последовательности константной области легкой цепи (каппа) анти-PD-L1 антитела 6C11-3A11 (IgG2a).

RADAAPTVSIFPPSTEQLATGGASVVCLMNNFYPRDISVKWKIDGTERRDGVLDSVTDQDSKDSTYSMSSTLSLTKADYESHNLYTCEVVHKTSSSPVVKSFNRNEC*

SEQ ID NO:9 соответствует аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи (CH) анти-PD-L1 антитела 6C11-3A11 (IgG2a).

AETTAPSVYPLAPGTALKSNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGALSSGVHTFPAVLQSGLYTLTSSVTVPSSTWSSQAVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRECNPCGCTGSEVSSVFIFPPKTKDVLTITLTPKVTCVVVDISQNDPEVRFSWFIDDVEVHTAQTHAPEKQSNSTLRSVSELPIVHRDWLNGKTFKCKVNSGAFPAPIEKSISKPEGTPRGPQVYTMAPPKEEMTQSQVSITCMVKGFYPPDIYTEWKMNGQPQENYKNTPPTMDTDGSYFLYSKLNVKKETWQQGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK*

SEQ ID NO:10 соответствует аминокислотной последовательности (GenBank: #V01241.1) констатной области легкой цепи (каппа) антитела крысы (IgG2a).

ADAAPTVSIFPPSTEQLATGGASVVCLMNNFYPRDISVKWKIDGTERRDGVLDSVTDQDSKDSTYSMSSTLSLTKADYESHNLYTCEVVHKTSSSPVVKSFNRNEC*

SEQ ID NO:11 соответствует аминокислотной последовательности (GenBank: #X16129.1) констатной области легкой цепи (каппа) антитела крысы (IgG2a).

RADAAPTVSIFPPSTEQLATGGASVVCLMNNFYPRDISVKWKIDGTERRDGVLDSVTDQDSKDSTYSMSSTLSLSKADYESHNLYTCEVVHKTSSSPVVKSFNRNEC

SEQ ID NO:12 соответствует аминокислотной последовательности (GenBank: #DQ402471.1) констатной области легкой цепи (каппа) антитела крысы (IgG2a).

AAPTVSIFPPSMEQLTSGGATVVCFVNNFYPRDISVKWKIDGSEQRDGVLDSVTDQDSKDSTYSMSSTLSLTKVEYERHNLYTCEVVHKTSSSPVVKSFNRNEC*

SEQ ID NO:13 соответствует аминокислотной последовательности (GenBank: #DQ402472.1) CH антителеа крысы (IgG2a).

APSVYPLAPGTALKSNSMVTLGCLVKGYFPEPVTVTWNSGALSSGVHTFPAVLQSGLYTLTSSVTVPSSTWSSQAVTCNVAHPASSTKVDKKIVPRECNPCGCTGSEVSSVFIFPPKTKDVLTITLTPKVTCVVVDISQNDPEVRFSWFIDDVEVHTAQTHAPEKQSNSTLRSVSELPIVHRDWLNGKTFKCKVNSGAFPAPIEKSISKPEGTPRGPQVYTMAPPKEEMTQSQVSITCMVKGFYPPDIYTEWKMNGQPQENYKNTPPTMDTDGSYFLYSKLNVKKETWQQGNTFTCSVLHEGLHNHHTEKSLSHSPGK*

SEQ ID NO:14 соответствует нуклеотидной последовательности VLанти-PD-L1 антитела 6C11-3A11 (IgG2a).

ATGAGGGTCCAGATTCAGTTTTGGGGGCTTCTTCTGCTCTGGACATCAGGTATACAGTGTGATGTCCAGATGACCCAGTCTCCATCTAATCTTGCTGCCTCTCCTGGAGAAAGTGTTTCCATCAATTGCAAGGCAAGTAAGAGCATTAGCAAGTATTTAGCCTGGTATCAACAGAAACCTGGGAAAGCAAATAAGCTTCTTATCTACTCTGGGTCAACTTTGCAATCTGGAACTCCATCGAGGTTCAGTGGCAGTGGATCTGGTACAGATTTCACTCTCACCATCAGAAACCTGGAGCCTGAAGATTTTGGACTCTATTACTGTCAACAGCATAATGAATACCCGCTCACGTTCGGTTCTGGGACCAAGCTGGAGATCAAA

SEQ ID NO:15 соответствует нуклеотидной последовательности VH анти-PD-L1 антитела 6C11-3A11 (IgG2a).

ATGGGATGGATCTGTATCATCTTTCTTGTGGCAATAGCTACAGGTGCCCACTCCCAGGTCAAGCTGCTGCAGTCTGGGGCTGCACTGGTGAAGCCTGGGGACTCTGTGAAGATGTCTTGCAAAGCTTCTGGTTATACATTCACTGACTACATTATACACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAAAGCCTTGAGTGGATTGGTTATATTAATCCTGACAGTGGTGGTAATAACTACAATGAAAAGTTCAAGAGCAAGGCCACATTGACTGTAGACAAATCCAGCAGCACAGCCTATATGGAGTTTAGCAGATTGACATCTGAGGATTCTGCAATCTACTACTGTGCAAGAGGGATTACCATGATGGTAGTTATTAGCCACTGGAAGTTTGACTTCTGGGGCCCAGGAACCATGGTCACCGTGTCCTCA

SEQ ID NO:16 соответствует нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи (каппа) анти-PD-L1 антитела 6C11-3A11 (IgG2a).

CGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCTATCTTCCCACCATCCACGGAACAGTTAGCAACTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCCTCATGAACAACTTCTATCCCAGAGACATCAGTGTCAAGTGGAAGATTGATGGCACTGAACGACGAGATGGTGTCCTGGACAGTGTTACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACGTACAGCATGAGCAGCACCCTCTCGTTGACCAAGGCTGACTATGAAAGTCATAACCTCTATACCTGTGAGGTTGTTCATAAGACATCATCCTCACCCGTCGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG

SEQ ID NO:17 соответствует нуклеотидной последовательности CH анти-PD-L1 антитела 6C11-3A11 (IgG2a).

GCTGAAACAACAGCCCCATCTGTCTATCCACTGGCTCCTGGAACTGCTCTCAAAAGTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTCACCGTGACCTGGAACTCTGGAGCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGGACTCTACACTCTCACCAGCTCAGTGACTGTACCCTCCAGCACCTGGTCCAGCCAGGCCGTCACCTGCAACGTAGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCAAGGGAATGCAATCCTTGTGGATGTACAGGCTCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGACCAAAGATGTGCTCACCATCACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATTAGCCAGAATGATCCCGAGGTCCGGTTCAGCTGGTTTATAGATGACGTGGAAGTCCACACAGCTCAGACTCATGCCCCGGAGAAGCAGTCCAACAGCACTTTACGCTCAGTCAGTGAACTCCCCATCGTGCACCGGGACTGGCTCAATGGCAAGACGTTCAAATGCAAAGTCAACAGTGGAGCATTCCCTGCCCCCATCGAGAAAAGCATCTCCAAACCCGAAGGCACACCACGAGGTCCACAGGTATACACCATGGCGCCTCCCAAGGAAGAGATGACCCAGAGTCAAGTCAGTATCACCTGCATGGTAAAAGGCTTCTATCCCCCAGACATTTATACGGAGTGGAAGATGAACGGGCAGCCACAGGAAAACTACAAGAACACTCCACCTACGATGGACACAGATGGGAGTTACTTCCTCTACAGCAAGCTCAATGTAAAGAAAGAAACATGGCAGCAGGGAAACACTTTCACGTGTTCTGTGCTGCATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGTCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA

SEQ ID NO:18 соответствует нуклеотидной последовательности (GenBank: #V01241.1) констатной области легкой цепи (каппа) антитела крысы (IgG2a).

GGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCTATCTTCCCACCATCCACGGAACAGTTAGCAACTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCCTCATGAACAACTTCTATCCCAGAGACATCAGTGTCAAGTGGAAGATTGATGGCACTGAACGACGAGATGGTGTCCTGGACAGTGTTACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACGTACAGCATGAGCAGCACCCTCTCGTTGACCAAGGCTGACTATGAAAGTCATAACCTCTATACCTGTGAGGTTGTTCATAAGACATCATCCTCACCCGTCGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG

SEQ ID NO:19 соответствует нуклеотидной последовательности (GenBank: #X16129.1) констатной области легкой цепи (каппа) антитела крысы (IgG2a).

CGGGCTGATGCTGCACCAACTGTATCTATCTTCCCACCATCCACGGAACAGTTAGCAACTGGAGGTGCCTCAGTCGTGTGCCTCATGAACAACTTCTATCCCAGAGACATCAGTGTCAAGTGGAAGATTGATGGCACTGAACGACGAGATGGTGTCCTGGACAGTGTTACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACGTACAGCATGAGCAGCACCCTCTCGTTGTCCAAGGCTGACTATGAAAGTCATAACCTCTATACCTGTGAGGTTGTTCATAAGACATCATCCTCACCCGTCGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG

SEQ ID NO:20 соответствует нуклеотидной последовательности (GenBank: #DQ402471.1) констатной области легкой цепи (каппа) антитела крысы (IgG2a).

GCCGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCATGGAACAGTTAACATCTGGAGGTGCCACAGTCGTGTGCTTCGTGAACAACTTCTATCCCAGAGACATCAGTGTCAAGTGGAAGATTGATGGCAGTGAACAACGAGATGGTGTCCTGGACAGTGTTACTGATCAGGACAGCAAAGACAGCACGTACAGCATGAGCAGCACCCTCTCGTTGACCAAGGTTGAATATGAAAGGCATAACCTCTATACCTGTGAGGTTGTTCATAAGACATCATCCTCACCCGTCGTCAAGAGCTTCAACAGGAATGAGTGTTAG

SEQ ID NO:21 соответствует нуклеотидной последовательности (GenBank: #DQ402472.1) CH антитела крысы (IgG2a).

CAGCCCCCTCTGTCTATCCACTGGCTCCTGGAACTGCTCTCAAAAGTAACTCCATGGTGACCCTGGGATGCCTGGTCAAGGGCTATTTCCCTGAGCCAGTCACCGTGACCTGGAACTCTGGAGCCCTGTCCAGCGGTGTGCACACCTTCCCAGCTGTCCTGCAGTCTGGACTCTACACTCTCACCAGCTCAGTGACTGTACCCTCCAGCACCTGGTCCAGCCAGGCCGTCACCTGCAACGTAGCCCACCCGGCCAGCAGCACCAAGGTGGACAAGAAAATTGTGCCAAGGGAATGCAATCCTTGTGGATGTACAGGCTCAGAAGTATCATCTGTCTTCATCTTCCCCCCAAAGACCAAAGATGTGCTCACCATCACTCTGACTCCTAAGGTCACGTGTGTTGTGGTAGACATTAGCCAGAATGATCCCGAGGTCCGGTTCAGCTGGTTTATAGATGACGTGGAAGTCCACACAGCTCAGACTCATGCCCCGGAGAAGCAGTCCAACAGCACTTTACGCTCAGTCAGTGAACTCCCCATCGTGCACCGGGACTGGCTCAATGGCAAGACGTTCAAATGCAAAGTCAACAGTGGAGCATTCCCTGCCCCCATCGAGAAAAGCATCTCCAAACCCGAAGGCACACCACGAGGTCCACAGGTATACACCATGGCGCCTCCCAAGGAAGAGATGACCCAGAGTCAAGTCAGTATCACCTGCATGGTAAAAGGCTTCTATCCCCCAGACATTTATACGGAGTGGAAGATGAACGGGCAGCCACAGGAAAACTACAAGAACACTCCACCTACGATGGACACAGATGGGAGTTACTTCCTCTACAGCAAGCTCAATGTAAAGAAAGAAACATGGCAGCAGGGAAACACTTTCACGTGTTCTGTGCTGCATGAGGGCCTGCACAACCACCATACTGAGAAGAGTCTCTCCCACTCTCCTGGTAAATGA

SEQ ID NO:22-27 соответствуют нуклеотидным последовательностям праймеров cPD-L1 внутренний F, cPD-L1 внутренний R, cPD-L1 5’GSP, cPD-L1 3’GSP, cPD-L1-EGFP F and cPD-L1-EGFP R, в указанной последовательности.

SEQ ID NO:28 соответствует аминокислотной последовательности константной области легкой цепи (каппа) антитела человека.

SEQ ID NO:29 соответствует нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи (каппа) антитела человека.

SEQ ID NO:30 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела человека (вариант 1 IgG4).

SEQ ID NO:31 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела человека (вариант 1 IgG4).

SEQ ID NO:32 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела человека (вариант 2 IgG4).

SEQ ID NO:33 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела человека (вариант 2 IgG4).

SEQ ID NO:34 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела человека (вариант 3 IgG4).

SEQ ID NO:35 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела человека (вариант 3 IgG4).

SEQ ID NO:36 соответствует аминокислотной последовательности константной области легкой цепи (каппа) антитела мыши.

SEQ ID NO:37 соответствует нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи (каппа) антитела мыши.

SEQ ID NO:38 соответствует аминокислотной последовательности константной области легкой цепи (каппа) антитела мыши.

SEQ ID NO:39 соответствует нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи (каппа) антитела мыши.

SEQ ID NO:40 соответствует аминокислотной последовательности константной области легкой цепи (каппа) антитела мыши.

SEQ ID NO:41 соответствует нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи (каппа) антитела мыши.

SEQ ID NO:42 соответствует аминокислотной последовательности константной области легкой цепи (каппа) антитела мыши.

SEQ ID NO:43 соответствует нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи (каппа) антитела мыши.

SEQ ID NO:44 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела мыши (вариант 1 IgG1).

SEQ ID NO:45 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела мыши (вариант 1 IgG1).

SEQ ID NO:46 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела мыши (вариант 2 IgG1).

SEQ ID NO:47 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела мыши (вариант 2 IgG1).

SEQ ID NO:48 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела мыши (вариант 1 IgG2a).

SEQ ID NO:49 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела мыши (вариант 1 IgG2a).

SEQ ID NO:50 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела мыши (вариант 2 IgG2a).

SEQ ID NO:51 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела мыши (вариант 2 IgG2a).

SEQ ID NO:52 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела мыши (вариант 1 IgG2b).

SEQ ID NO:53 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела мыши (вариант 1 IgG2b).

SEQ ID NO:54 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела мыши (вариант 2 IgG2b).

SEQ ID NO:55 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела мыши (вариант 2 IgG2b).

SEQ ID NO:56 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела мыши (вариант 1 IgG2c).

SEQ ID NO:57 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела мыши (вариант 1 IgG2c).

SEQ ID NO:58 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела мыши (вариант 2 IgG2c).

SEQ ID NO:59 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела мыши (вариант 2 IgG2c).

SEQ ID NO:60 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела мыши (вариант 3 IgG2c).

SEQ ID NO:61 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела мыши (вариант 3 IgG2c).

SEQ ID NO:62 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела мыши (IgG3).

SEQ ID NO:63 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела мыши (IgG3).

SEQ ID NO:64 соответствует аминокислотной последовательности константной области легкой цепи (лямбда) бычьего антитела.

SEQ ID NO:65 соответствует нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи (лямба) бычьего антитела.

SEQ ID NO:66 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) бычьего антитела (вариант 1 IgG1).

SEQ ID NO:67 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) бычьего антитела (вариант 1 IgG1).

SEQ ID NO:68 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) бычьего антитела (вариант 2 IgG1).

SEQ ID NO:69 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) бычьего антитела (вариант 2 IgG1).

SEQ ID NO:70 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) бычьего антитела (вариант 3 IgG1).

SEQ ID NO:71 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) бычьего антитела (вариант 3 IgG1).

SEQ ID NO:72 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) бычьего антитела (вариант 1 IgG2).

SEQ ID NO:73 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) бычьего антитела (вариант 1 IgG2).

SEQ ID NO:74 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) бычьего антитела (вариант 2 IgG2).

SEQ ID NO:75 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) бычьего антитела (вариант 2 IgG2).

SEQ ID NO:76 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) бычьего антитела (вариант 3 IgG2).

SEQ ID NO:77 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) бычьего антитела (вариант 3 IgG2).

SEQ ID NO:78 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) бычьего антитела (вариант 1 IgG3).

SEQ ID NO:79 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) бычьего антитела (вариант 1 IgG3).

SEQ ID NO:80 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) бычьего антитела (вариант 2 IgG3).

SEQ ID NO:81 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) бычьего антитела (вариант 2 IgG3).

SEQ ID NO:82 соответствует аминокислотной последовательности константной области легкой цепи (лямбда) антитела собаки.

SEQ ID NO:83 соответствует нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи (лямба) антитела собаки.

SEQ ID NO:84 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела собаки (IgG-D).

SEQ ID NO:85 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела собаки (IgG-D).

SEQ ID NO:86 соответствует аминокислотной последовательности константной области легкой цепи (каппа) овечьего антитела.

SEQ ID NO:87 соответствует нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи (каппа) овечьего антитела.

SEQ ID NO:88 соответствует аминокислотной последовательности константной области легкой цепи (лямбда) овечьего антитела.

SEQ ID NO:89 соответствует нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи (лямба) овечьего антитела.

SEQ ID NO:90 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) овечьего антитела (IgG1).

SEQ ID NO:91 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) овечьего антитела (IgG1).

SEQ ID NO:92 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) овечьего антитела (IgG2).

SEQ ID NO:93 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) овечьего антитела (IgG2).

SEQ ID NO:94 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела свиньи (IgG1^a).

SEQ ID NO:95 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела свиньи (IgG1^a).

SEQ ID NO:96 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела свиньи (IgG1^b).

SEQ ID NO:97 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела свиньи (IgG1^b).

SEQ ID NO:98 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела свиньи (IgG2^a).

SEQ ID NO:99 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела свиньи (IgG2^a).

SEQ ID NO:100 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела свиньи (IgG2^b).

SEQ ID NO:101 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела свиньи (IgG2^b).

SEQ ID NO:102 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела свиньи (IgG3).

SEQ ID NO:103 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела свиньи (IgG3).

SEQ ID NO:104 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела свиньи (IgG4^a).

SEQ ID NO:105 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела свиньи (IgG4^a).

SEQ ID NO:106 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела свиньи (IgG4^b).

SEQ ID NO:107 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела свиньи (IgG4^b).

SEQ ID NO:108 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела свиньи (IgG5^a).

SEQ ID NO:109 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела свиньи (IgG5^a).

SEQ ID NO:110 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела свиньи (IgG5^b).

SEQ ID NO:111 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела свиньи (IgG5^b).

SEQ ID NO:112 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела свиньи (IgG6^a).

SEQ ID NO:113 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела свиньи (IgG6^a).

SEQ ID NO:114 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела свиньи (IgG6^b).

SEQ ID NO:115 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела свиньи (IgG6^b).

SEQ ID NO:116 соответствует аминокислотной последовательности константной области легкой цепи (CL)(определена как Ig лямбда) антитела буйвола.

SEQ ID NO:117 соответствует нуклеотидной последовательности константной области легкой цепи (определена как Ig лямбда) (CL) антитела буйвола.

SEQ ID NO:118 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела буйвола (определена как IgG1).

SEQ ID NO:119 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела буйвола (определена как IgG1).

SEQ ID NO:120 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела буйвола (определена как IgG2).

SEQ ID NO:121 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела буйвола (определена как IgG2).

SEQ ID NO:122 соответствует аминокислотной последовательности CH (CH1-CH3) антитела буйвола (определена как IgG3).

SEQ ID NO:123 соответствует нуклеотидной последовательности CH (CH1-CH3) антитела буйвола (определена как IgG3).

SEQ ID NO:124 соответствует нуклеотидной последовательности праймера boPD-L1-EGFP F.

SEQ ID NO:125 соответствует нуклеотидной последовательности праймера boPD-L1-EGFP R.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> НЭШНЛ ЮНИВЕРСИТИ КОРПОРЕЙШН ХОККАЙДО ЮНИВЕРСИТИ

ФУСО ФАРМАСЬЮТИКАЛ ИНДАСТРИЗ, ЛТД.

<120> АНТИ-PD-L1 АНТИТЕЛО ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ PD-L1

<130> FP-233PCT

<150> JP 2017-61389

<151> 2017-03-27

<160> 125

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 6

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 1

Lys Ser Ile Ser Lys Tyr

1 5

<210> 2

<211> 9

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 2

Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 3

<211> 8

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 3

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Ile

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 4

Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Asn

1 5

<210> 5

<211> 17

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 5

Ala Arg Gly Ile Thr Met Met Val Val Ile Ser His Trp Lys Phe Asp

1 5 10 15

Phe

<210> 6

<211> 127

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 6

Met Arg Val Gln Ile Gln Phe Trp Gly Leu Leu Leu Leu Trp Thr Ser

1 5 10 15

Gly Ile Gln Cys Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Asn Leu Ala

20 25 30

Ala Ser Pro Gly Glu Ser Val Ser Ile Asn Cys Lys Ala Ser Lys Ser

35 40 45

Ile Ser Lys Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Asn

50 55 60

Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Thr Pro Ser

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg

85 90 95

Asn Leu Glu Pro Glu Asp Phe Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn

100 105 110

Glu Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

<210> 7

<211> 142

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 7

Met Gly Trp Ile Cys Ile Ile Phe Leu Val Ala Ile Ala Thr Gly Ala

1 5 10 15

His Ser Gln Val Lys Leu Leu Gln Ser Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro

20 25 30

Gly Asp Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr

35 40 45

Asp Tyr Ile Ile His Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu

50 55 60

Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Asp Ser Gly Gly Asn Asn Tyr Asn Glu

65 70 75 80

Lys Phe Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr

85 90 95

Ala Tyr Met Glu Phe Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr

100 105 110

Tyr Cys Ala Arg Gly Ile Thr Met Met Val Val Ile Ser His Trp Lys

115 120 125

Phe Asp Phe Trp Gly Pro Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

<210> 8

<211> 107

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 8

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Thr Glu

1 5 10 15

Gln Leu Ala Thr Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Leu Met Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Asp Ile Ser Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Thr Glu Arg

35 40 45

Arg Asp Gly Val Leu Asp Ser Val Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Ser Leu Thr Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Ser His Asn Leu Tyr Thr Cys Glu Val Val His Lys Thr Ser Ser Ser

85 90 95

Pro Val Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

<210> 9

<211> 322

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 9

Ala Glu Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Thr Ala

1 5 10 15

Leu Lys Ser Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Thr Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Ser Ser Gln Ala Val

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Val Pro Arg Glu Cys Asn Pro Cys Gly Cys Thr Gly Ser Glu Val

100 105 110

Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Thr Lys Asp Val Leu Thr Ile

115 120 125

Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asn

130 135 140

Asp Pro Glu Val Arg Phe Ser Trp Phe Ile Asp Asp Val Glu Val His

145 150 155 160

Thr Ala Gln Thr His Ala Pro Glu Lys Gln Ser Asn Ser Thr Leu Arg

165 170 175

Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Val His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys

180 185 190

Thr Phe Lys Cys Lys Val Asn Ser Gly Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu

195 200 205

Lys Ser Ile Ser Lys Pro Glu Gly Thr Pro Arg Gly Pro Gln Val Tyr

210 215 220

Thr Met Ala Pro Pro Lys Glu Glu Met Thr Gln Ser Gln Val Ser Ile

225 230 235 240

Thr Cys Met Val Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Thr Glu Trp

245 250 255

Lys Met Asn Gly Gln Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr

260 265 270

Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys

275 280 285

Lys Glu Thr Trp Gln Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His

290 295 300

Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro

305 310 315 320

Gly Lys

<210> 10

<211> 106

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 10

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Thr Glu Gln

1 5 10 15

Leu Ala Thr Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Leu Met Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Asp Ile Ser Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Thr Glu Arg Arg

35 40 45

Asp Gly Val Leu Asp Ser Val Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Ser Leu Thr Lys Ala Asp Tyr Glu Ser

65 70 75 80

His Asn Leu Tyr Thr Cys Glu Val Val His Lys Thr Ser Ser Ser Pro

85 90 95

Val Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

<210> 11

<211> 107

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 11

Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Thr Glu

1 5 10 15

Gln Leu Ala Thr Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Leu Met Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Asp Ile Ser Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Thr Glu Arg

35 40 45

Arg Asp Gly Val Leu Asp Ser Val Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Ser Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Ser His Asn Leu Tyr Thr Cys Glu Val Val His Lys Thr Ser Ser Ser

85 90 95

Pro Val Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

<210> 12

<211> 104

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 12

Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Met Glu Gln Leu Thr

1 5 10 15

Ser Gly Gly Ala Thr Val Val Cys Phe Val Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

20 25 30

Asp Ile Ser Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Gln Arg Asp Gly

35 40 45

Val Leu Asp Ser Val Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

50 55 60

Met Ser Ser Thr Leu Ser Leu Thr Lys Val Glu Tyr Glu Arg His Asn

65 70 75 80

Leu Tyr Thr Cys Glu Val Val His Lys Thr Ser Ser Ser Pro Val Val

85 90 95

Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100

<210> 13

<211> 318

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 13

Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Thr Ala Leu Lys Ser Asn

1 5 10 15

Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro

20 25 30

Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ser Gly Val His Thr

35 40 45

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Thr Ser Ser Val

50 55 60

Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Ser Ser Gln Ala Val Thr Cys Asn Val

65 70 75 80

Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg

85 90 95

Glu Cys Asn Pro Cys Gly Cys Thr Gly Ser Glu Val Ser Ser Val Phe

100 105 110

Ile Phe Pro Pro Lys Thr Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro

115 120 125

Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Gln Asn Asp Pro Glu Val

130 135 140

Arg Phe Ser Trp Phe Ile Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr

145 150 155 160

His Ala Pro Glu Lys Gln Ser Asn Ser Thr Leu Arg Ser Val Ser Glu

165 170 175

Leu Pro Ile Val His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys Thr Phe Lys Cys

180 185 190

Lys Val Asn Ser Gly Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Ser Ile Ser

195 200 205

Lys Pro Glu Gly Thr Pro Arg Gly Pro Gln Val Tyr Thr Met Ala Pro

210 215 220

Pro Lys Glu Glu Met Thr Gln Ser Gln Val Ser Ile Thr Cys Met Val

225 230 235 240

Lys Gly Phe Tyr Pro Pro Asp Ile Tyr Thr Glu Trp Lys Met Asn Gly

245 250 255

Gln Pro Gln Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Pro Pro Thr Met Asp Thr Asp

260 265 270

Gly Ser Tyr Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Asn Val Lys Lys Glu Thr Trp

275 280 285

Gln Gln Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His

290 295 300

Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

305 310 315

<210> 14

<211> 381

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 14

atgagggtcc agattcagtt ttgggggctt cttctgctct ggacatcagg tatacagtgt 60

gatgtccaga tgacccagtc tccatctaat cttgctgcct ctcctggaga aagtgtttcc 120

atcaattgca aggcaagtaa gagcattagc aagtatttag cctggtatca acagaaacct 180

gggaaagcaa ataagcttct tatctactct gggtcaactt tgcaatctgg aactccatcg 240

aggttcagtg gcagtggatc tggtacagat ttcactctca ccatcagaaa cctggagcct 300

gaagattttg gactctatta ctgtcaacag cataatgaat acccgctcac gttcggttct 360

gggaccaagc tggagatcaa a 381

<210> 15

<211> 426

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 15

atgggatgga tctgtatcat ctttcttgtg gcaatagcta caggtgccca ctcccaggtc 60

aagctgctgc agtctggggc tgcactggtg aagcctgggg actctgtgaa gatgtcttgc 120

aaagcttctg gttatacatt cactgactac attatacact gggtgaagca gagtcatgga 180

aaaagccttg agtggattgg ttatattaat cctgacagtg gtggtaataa ctacaatgaa 240

aagttcaaga gcaaggccac attgactgta gacaaatcca gcagcacagc ctatatggag 300

tttagcagat tgacatctga ggattctgca atctactact gtgcaagagg gattaccatg 360

atggtagtta ttagccactg gaagtttgac ttctggggcc caggaaccat ggtcaccgtg 420

tcctca 426

<210> 16

<211> 324

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 16

cgggctgatg ctgcaccaac tgtatctatc ttcccaccat ccacggaaca gttagcaact 60

ggaggtgcct cagtcgtgtg cctcatgaac aacttctatc ccagagacat cagtgtcaag 120

tggaagattg atggcactga acgacgagat ggtgtcctgg acagtgttac tgatcaggac 180

agcaaagaca gcacgtacag catgagcagc accctctcgt tgaccaaggc tgactatgaa 240

agtcataacc tctatacctg tgaggttgtt cataagacat catcctcacc cgtcgtcaag 300

agcttcaaca ggaatgagtg ttag 324

<210> 17

<211> 969

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 17

gctgaaacaa cagccccatc tgtctatcca ctggctcctg gaactgctct caaaagtaac 60

tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt caccgtgacc 120

tggaactctg gagccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgga 180

ctctacactc tcaccagctc agtgactgta ccctccagca cctggtccag ccaggccgtc 240

acctgcaacg tagcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgccaagg 300

gaatgcaatc cttgtggatg tacaggctca gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca 360

aagaccaaag atgtgctcac catcactctg actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac 420

attagccaga atgatcccga ggtccggttc agctggttta tagatgacgt ggaagtccac 480

acagctcaga ctcatgcccc ggagaagcag tccaacagca ctttacgctc agtcagtgaa 540

ctccccatcg tgcaccggga ctggctcaat ggcaagacgt tcaaatgcaa agtcaacagt 600

ggagcattcc ctgcccccat cgagaaaagc atctccaaac ccgaaggcac accacgaggt 660

ccacaggtat acaccatggc gcctcccaag gaagagatga cccagagtca agtcagtatc 720

acctgcatgg taaaaggctt ctatccccca gacatttata cggagtggaa gatgaacggg 780

cagccacagg aaaactacaa gaacactcca cctacgatgg acacagatgg gagttacttc 840

ctctacagca agctcaatgt aaagaaagaa acatggcagc agggaaacac tttcacgtgt 900

tctgtgctgc atgagggcct gcacaaccac catactgaga agagtctctc ccactctcct 960

ggtaaatga 969

<210> 18

<211> 323

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 18

gggctgatgc tgcaccaact gtatctatct tcccaccatc cacggaacag ttagcaactg 60

gaggtgcctc agtcgtgtgc ctcatgaaca acttctatcc cagagacatc agtgtcaagt 120

ggaagattga tggcactgaa cgacgagatg gtgtcctgga cagtgttact gatcaggaca 180

gcaaagacag cacgtacagc atgagcagca ccctctcgtt gaccaaggct gactatgaaa 240

gtcataacct ctatacctgt gaggttgttc ataagacatc atcctcaccc gtcgtcaaga 300

gcttcaacag gaatgagtgt tag 323

<210> 19

<211> 324

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 19

cgggctgatg ctgcaccaac tgtatctatc ttcccaccat ccacggaaca gttagcaact 60

ggaggtgcct cagtcgtgtg cctcatgaac aacttctatc ccagagacat cagtgtcaag 120

tggaagattg atggcactga acgacgagat ggtgtcctgg acagtgttac tgatcaggac 180

agcaaagaca gcacgtacag catgagcagc accctctcgt tgtccaaggc tgactatgaa 240

agtcataacc tctatacctg tgaggttgtt cataagacat catcctcacc cgtcgtcaag 300

agcttcaaca ggaatgagtg ttag 324

<210> 20

<211> 315

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 20

gccgcaccaa ctgtatccat cttcccacca tccatggaac agttaacatc tggaggtgcc 60

acagtcgtgt gcttcgtgaa caacttctat cccagagaca tcagtgtcaa gtggaagatt 120

gatggcagtg aacaacgaga tggtgtcctg gacagtgtta ctgatcagga cagcaaagac 180

agcacgtaca gcatgagcag caccctctcg ttgaccaagg ttgaatatga aaggcataac 240

ctctatacct gtgaggttgt tcataagaca tcatcctcac ccgtcgtcaa gagcttcaac 300

aggaatgagt gttag 315

<210> 21

<211> 959

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 21

cagccccctc tgtctatcca ctggctcctg gaactgctct caaaagtaac tccatggtga 60

ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt caccgtgacc tggaactctg 120

gagccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgga ctctacactc 180

tcaccagctc agtgactgta ccctccagca cctggtccag ccaggccgtc acctgcaacg 240

tagcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgccaagg gaatgcaatc 300

cttgtggatg tacaggctca gaagtatcat ctgtcttcat cttcccccca aagaccaaag 360

atgtgctcac catcactctg actcctaagg tcacgtgtgt tgtggtagac attagccaga 420

atgatcccga ggtccggttc agctggttta tagatgacgt ggaagtccac acagctcaga 480

ctcatgcccc ggagaagcag tccaacagca ctttacgctc agtcagtgaa ctccccatcg 540

tgcaccggga ctggctcaat ggcaagacgt tcaaatgcaa agtcaacagt ggagcattcc 600

ctgcccccat cgagaaaagc atctccaaac ccgaaggcac accacgaggt ccacaggtat 660

acaccatggc gcctcccaag gaagagatga cccagagtca agtcagtatc acctgcatgg 720

taaaaggctt ctatccccca gacatttata cggagtggaa gatgaacggg cagccacagg 780

aaaactacaa gaacactcca cctacgatgg acacagatgg gagttacttc ctctacagca 840

agctcaatgt aaagaaagaa acatggcagc agggaaacac tttcacgtgt tctgtgctgc 900

atgagggcct gcacaaccac catactgaga agagtctctc ccactctcct ggtaaatga 959

<210> 22

<211> 20

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 22

atgagaatgt ttagtgtctt 20

<210> 23

<211> 24

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 23

ttatgtctct tcaaattgta tatc 24

<210> 24

<211> 17

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 24

ttttagacag aaagtga 17

<210> 25

<211> 20

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 25

gaccagctct tcttggggaa 20

<210> 26

<211> 26

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 26

gaagatctat gagaatgttt agtgtc 26

<210> 27

<211> 28

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 27

ggaattctgt ctcttcaaat tgtatatc 28

<210> 28

<211> 106

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 28

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 29

<211> 321

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 29

actgtggctg caccatctgt cttcatcttc ccgccatctg atgagcagtt gaaatctgga 60

actgcctctg ttgtgtgcct gctgaataac ttctatccca gagaggccaa agtacagtgg 120

aaggtggata acgccctcca atcgggtaac tcccaggaga gtgtcacaga gcaggacagc 180

aaggacagca cctacagcct cagcagcacc ctgacgctga gcaaagcaga ctacgagaaa 240

cacaaagtct acgcctgcga agtcacccat cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc 300

ttcaacaggg gagagtgtta g 321

<210> 30

<211> 229

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 30

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 31

<211> 690

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 31

gagtccaaat atggtccccc atgcccatca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 60

tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 120

gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 180

gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 240

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 300

tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 360

gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 420

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 480

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 540

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 600

gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacacag 660

aagagcctct ccctgtctct gggtaaatga 690

<210> 32

<211> 229

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 32

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro Glu Phe

1 5 10 15

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

20 25 30

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

35 40 45

Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

50 55 60

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser

65 70 75 80

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu

85 90 95

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser

100 105 110

Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

115 120 125

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln

130 135 140

Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

145 150 155 160

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

165 170 175

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu

180 185 190

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

195 200 205

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

210 215 220

Leu Ser Leu Gly Lys

225

<210> 33

<211> 690

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 33

gagtccaaat atggtccccc gtgcccatca tgcccagcac ctgagttcct ggggggacca 60

tcagtcttcc tgttcccccc aaaacccaag gacactctca tgatctcccg gacccctgag 120

gtcacgtgcg tggtggtgga cgtgagccag gaagaccccg aggtccagtt caactggtac 180

gtggatggcg tggaggtgca taatgccaag acaaagccgc gggaggagca gttcaacagc 240

acgtaccgtg tggtcagcgt cctcaccgtc gtgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 300

tacaagtgca aggtctccaa caaaggcctc ccgtcctcca tcgagaaaac catctccaaa 360

gccaaagggc agccccgaga gccacaggtg tacaccctgc ccccatccca ggaggagatg 420

accaagaacc aggtcagcct gacctgcctg gtcaaaggct tctaccccag cgacatcgcc 480

gtggagtggg agagcaatgg gcagccggag aacaactaca agaccacgcc tcccgtgctg 540

gactccgacg gctccttctt cctctacagc aggctaaccg tggacaagag caggtggcag 600

gaggggaatg tcttctcatg ctccgtgatg catgaggctc tgcacaacca ctacacgcag 660

aagagcctct ccctgtctct gggtaaatga 690

<210> 34

<211> 217

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 34

Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

1 5 10 15

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

20 25 30

Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr

35 40 45

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

50 55 60

Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

65 70 75 80

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

85 90 95

Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

100 105 110

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met

115 120 125

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

130 135 140

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

145 150 155 160

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

165 170 175

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val

180 185 190

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

195 200 205

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

210 215

<210> 35

<211> 654

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 35

gcacctgagt tcctgggggg accatcagtc ttcctgttcc ccccaaaacc caaggacact 60

ctcatgatct cccggacccc tgaggtcacg tgcgtggtgg tggacgtgag ccaggaagac 120

cccgaggtcc agttcaactg gtacgtggat ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 180

ccgcgggagg agcagttcaa cagcacgtac cgtgtggtca gcgtcctcac cgtcctgcac 240

caggactggc tgaacggcaa ggagtacaag tgcaaggtct ccaacaaagg cctcccgtcc 300

tccatcgaga aaaccatctc caaagccaaa gggcagcccc gagagccaca ggtgtacacc 360

ctgcccccat cccaggagga gatgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 420

ggcttctacc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac 480

tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc 540

accgtggaca agagcaggtg gcaggagggg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag 600

gctctgcaca accactacac gcagaagagc ctctccctgt ctctgggtaa atga 654

<210> 36

<211> 106

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 36

Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln

1 5 10 15

Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln

35 40 45

Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg

65 70 75 80

His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro

85 90 95

Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

100 105

<210> 37

<211> 321

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 37

gctgatgctg caccaactgt atccatcttc ccaccatcca gtgagcagtt aacatctgga 60

ggtgcctcag tcgtgtgctt cttgaacaac ttctacccca aagacatcaa tgtcaagtgg 120

aagattgatg gcagtgaacg acaaaatggc gtcctgaaca gttggactga tcaggacagc 180

aaagacagca cctacagcat gagcagcacc ctcacgttga ccaaggacga gtatgaacga 240

cataacagct atacctgtga ggccactcac aagacatcaa cttcacccat tgtcaagagc 300

ttcaacagga atgagtgtta g 321

<210> 38

<211> 106

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 38

Gly Gln Pro Lys Ser Ser Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Glu Thr Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Thr Ile Thr Asp

20 25 30

Phe Tyr Pro Gly Val Val Thr Val Asp Trp Lys Val Asp Gly Thr Pro

35 40 45

Val Thr Gln Gly Met Glu Thr Thr Gln Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn

50 55 60

Lys Tyr Met Ala Ser Ser Tyr Leu Thr Leu Thr Ala Arg Ala Trp Glu

65 70 75 80

Arg His Ser Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly His Thr Val

85 90 95

Glu Lys Ser Leu Ser Arg Ala Asp Cys Ser

100 105

<210> 39

<211> 321

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 39

ggccagccca agtcttcgcc atcagtcacc ctgtttccac cttcctctga agagctcgag 60

actaacaagg ccacactggt gtgtacgatc actgatttct acccaggtgt ggtgacagtg 120

gactggaagg tagatggtac ccctgtcact cagggtatgg agacaaccca gccttccaaa 180

cagagcaaca acaagtacat ggctagcagc tacctgaccc tgacagcaag agcatgggaa 240

aggcatagca gttacagctg ccaggtcact catgaaggtc acactgtgga gaagagtttg 300

tcccgtgctg actgttccta g 321

<210> 40

<211> 105

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 40

Gly Gln Pro Lys Ser Thr Pro Thr Leu Thr Val Phe Pro Pro Ser Ser

1 5 10 15

Glu Glu Leu Lys Glu Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asn

20 25 30

Phe Ser Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asn Gly Thr Pro

35 40 45

Ile Thr Gln Gly Val Asp Thr Ser Asn Pro Thr Lys Glu Gly Asn Lys

50 55 60

Phe Met Ala Ser Ser Phe Leu His Leu Thr Ser Asp Gln Trp Arg Ser

65 70 75 80

His Asn Ser Phe Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly Asp Thr Val Glu

85 90 95

Lys Ser Leu Ser Pro Ala Glu Cys Leu

100 105

<210> 41

<211> 318

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 41

ggtcagccca agtccactcc cactctcacc gtgtttccac cttcctctga ggagctcaag 60

gaaaacaaag ccacactggt gtgtctgatt tccaactttt ccccgagtgg tgtgacagtg 120

gcctggaagg caaatggtac acctatcacc cagggtgtgg acacttcaaa tcccaccaaa 180

gagggcaaca agttcatggc cagcagcttc ctacatttga catcggacca gtggagatct 240

cacaacagtt ttacctgtca agttacacat gaaggggaca ctgtggagaa gagtctgtct 300

cctgcagaat gtctctaa 318

<210> 42

<211> 105

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 42

Gly Gln Pro Lys Ser Thr Pro Thr Leu Thr Met Phe Pro Pro Ser Pro

1 5 10 15

Glu Glu Leu Gln Glu Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asn

20 25 30

Phe Ser Pro Ser Gly Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asn Gly Thr Pro

35 40 45

Ile Thr Gln Gly Val Asp Thr Ser Asn Pro Thr Lys Glu Asp Asn Lys

50 55 60

Tyr Met Ala Ser Ser Phe Leu His Leu Thr Ser Asp Gln Trp Arg Ser

65 70 75 80

His Asn Ser Phe Thr Cys Gln Val Thr His Glu Gly Asp Thr Val Glu

85 90 95

Lys Ser Leu Ser Pro Ala Glu Cys Leu

100 105

<210> 43

<211> 318

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 43

ggtcagccca agtccactcc cacactcacc atgtttccac cttcccctga ggagctccag 60

gaaaacaaag ccacactcgt gtgtctgatt tccaattttt ccccaagtgg tgtgacagtg 120

gcctggaagg caaatggtac acctatcacc cagggtgtgg acacttcaaa tcccaccaaa 180

gaggacaaca agtacatggc cagcagcttc ttacatttga catcggacca gtggagatct 240

cacaacagtt ttacctgcca agttacacat gaaggggaca ctgtggagaa gagtctgtct 300

cctgcagaat gtctctaa 318

<210> 44

<211> 324

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 44

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Glu Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Pro Arg Pro Ser Glu Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

100 105 110

Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

115 120 125

Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

130 135 140

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

145 150 155 160

Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

165 170 175

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn

180 185 190

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro

195 200 205

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln

210 215 220

Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val

225 230 235 240

Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val

245 250 255

Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln

260 265 270

Pro Ile Met Asn Thr Asn Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

275 280 285

Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

290 295 300

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His

305 310 315 320

Ser Pro Gly Lys

<210> 45

<211> 975

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 45

gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 60

tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 120

tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct ggagtctgac 180

ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagcc ctcggcccag cgagaccgtc 240

acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg 300

gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc 360

cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg 420

gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag 480

gtgcacacag ctcagacgca accccgggag gagcagttca acagcacttt ccgctcagtc 540

agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc 600

aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 660

aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc 720

agtctgacct gcatgataac agacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 780

aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatgaacac gaatggctct 840

tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 900

acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 960

tctcctggta aatga 975

<210> 46

<211> 324

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 46

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala

1 5 10 15

Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro

100 105 110

Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu

115 120 125

Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser

130 135 140

Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu

145 150 155 160

Val His Thr Ala Gln Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Ile Asn Ser Thr

165 170 175

Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn

180 185 190

Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro

195 200 205

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln

210 215 220

Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val

225 230 235 240

Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asn Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val

245 250 255

Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln

260 265 270

Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn

275 280 285

Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val

290 295 300

Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His

305 310 315 320

Ser Pro Gly Lys

<210> 47

<211> 975

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 47

gccaaaacga cacccccatc tgtctatcca ctggcccctg gatctgctgc ccaaactaac 60

tccatggtga ccctgggatg cctggtcaag ggctatttcc ctgagccagt gacagtgacc 120

tggaactctg gatccctgtc cagcggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 180

ctctacactc tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggcccag ccagaccgtc 240

acctgcaacg ttgcccaccc ggccagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgtgcccagg 300

gattgtggtt gtaagccttg catatgtaca gtcccagaag tatcatctgt cttcatcttc 360

cccccaaagc ccaaggatgt gctcaccatt actctgactc ctaaggtcac gtgtgttgtg 420

gtagacatca gcaaggatga tcccgaggtc cagttcagct ggtttgtaga tgatgtggag 480

gtgcacacag ctcagacgaa accccgggag gagcagatca acagcacttt ccgttcagtc 540

agtgaacttc ccatcatgca ccaggactgg ctcaatggca aggagttcaa atgcagggtc 600

aacagtgcag ctttccctgc ccccatcgag aaaaccatct ccaaaaccaa aggcagaccg 660

aaggctccac aggtgtacac cattccacct cccaaggagc agatggccaa ggataaagtc 720

agtctgacct gcatgataac aaacttcttc cctgaagaca ttactgtgga gtggcagtgg 780

aatgggcagc cagcggagaa ctacaagaac actcagccca tcatggacac agatggctct 840

tacttcgtct acagcaagct caatgtgcag aagagcaact gggaggcagg aaatactttc 900

acctgctctg tgttacatga gggcctgcac aaccaccata ctgagaagag cctctcccac 960

tctcctggta aatga 975

<210> 48

<211> 330

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 48

Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Ile Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp

145 150 155 160

Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg

165 170 175

Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln

180 185 190

His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn

195 200 205

Lys Asp Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly

210 215 220

Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met

245 250 255

Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu

260 265 270

Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe

275 280 285

Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn

290 295 300

Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr

305 310 315 320

Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

325 330

<210> 49

<211> 993

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 49

gccaaaacaa cagccccatc ggtctatcca ctggcccctg tgtgtggaga tacaactggc 60

tcctcggtga ctctaggatg cctggtcaag ggttatttcc ctgagccagt gaccttgacc 120

tggaactctg gatccctgtc cagtggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 180

ctctacaccc tcagcagctc agtgactgta acctcgagca cctggcccag ccagtccatc 240

acctgcaatg tggcccaccc ggcaagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgagcccaga 300

gggcccacaa tcaagccctg tcctccatgc aaatgcccag cacctaacct cttgggtgga 360

ccatccgtct tcatcttccc tccaaagatc aaggatgtac tcatgatctc cctgagcccc 420

atagtcacat gtgtggtggt ggatgtgagc gaggatgacc cagatgtcca gatcagctgg 480

tttgtgaaca acgtggaagt acacacagct cagacacaaa cccatagaga ggattacaac 540

agtactctcc gggtggtcag tgccctcccc atccagcacc aggactggat gagtggcaag 600

gagttcaaat gcaaggtcaa caacaaagac ctcccagcgc ccatcgagag aaccatctca 660

aaacccaaag ggtcagtaag agctccacag gtatatgtct tgcctccacc agaagaagag 720

atgactaaga aacaggtcac tctgacctgc atggtcacag acttcatgcc tgaagacatt 780

tacgtggagt ggaccaacaa cgggaaaaca gagctaaact acaagaacac tgaaccagtc 840

ctggactctg atggttctta cttcatgtac agcaagctga gagtggaaaa gaagaactgg 900

gtggaaagaa atagctactc ctgttcagtg gtccacgagg gtctgcacaa tcaccacacg 960

actaagagct tctcccggac tccgggtaaa tga 993

<210> 50

<211> 330

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 50

Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Ser Ile

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Glu Pro Arg Gly Pro Thr Ile Lys Pro Cys Pro Pro Cys Lys Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Asn Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser Pro Met Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp Val Gln Ile Ser Trp

145 150 155 160

Phe Val Asn Asn Val Glu Val Leu Thr Ala Gln Thr Gln Thr His Arg

165 170 175

Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser Ala Leu Pro Ile Gln

180 185 190

His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys Cys Lys Val Asn Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Arg Thr Ile Ser Lys Pro Lys Gly

210 215 220

Ser Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro Pro Pro Glu Glu Glu

225 230 235 240

Met Thr Lys Lys Gln Val Thr Leu Thr Cys Met Val Thr Asp Phe Met

245 250 255

Pro Glu Asp Ile Tyr Val Glu Trp Thr Asn Asn Gly Lys Thr Glu Leu

260 265 270

Asn Tyr Lys Asn Thr Glu Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Tyr Phe

275 280 285

Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Glu Lys Lys Asn Trp Val Glu Arg Asn

290 295 300

Ser Tyr Ser Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu His Asn His His Thr

305 310 315 320

Thr Lys Ser Phe Ser Arg Thr Pro Gly Lys

325 330

<210> 51

<211> 993

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 51

gccaaaacaa cagccccatc ggtctatcca ctggcccctg tgtgtggaga tacaactggc 60

tcctcggtga ctctaggatg cctggtcaag ggttatttcc ctgagccagt gaccttgacc 120

tggaactctg gatccctgtc cagtggtgtg cacaccttcc cagctgtcct gcagtctgac 180

ctctacaccc tcagcagctc agtgactgta acctcgagca cctggcccag ccagtccatc 240

acctgcaatg tggcccaccc ggcaagcagc accaaggtgg acaagaaaat tgagcccaga 300

gggcccacaa tcaagccctg tcctccatgc aaatgcccag cacctaacct cttgggtgga 360

ccatccgtct tcatcttccc tccaaagatc aaggatgtac tcatgatctc cctgagtccc 420

atggtcacat gtgtggtggt ggatgtgagc gaggatgacc cagatgtcca gatcagctgg 480

ttcgtgaaca acgtggaagt actcacagct cagacacaaa cccatagaga ggattacaac 540

agtactctcc gggtggtcag tgccctcccc atccagcacc aggactggat gagtggcaag 600

gagttcaaat gcaaggtcaa caacaaagcc ctcccagcgc ccatcgagag aaccatctca 660

aaacccaaag ggtcagtaag agctccacag gtatatgtct tgcctccacc agaagaagag 720

atgactaaga aacaggtcac tctgacctgc atggtcacag acttcatgcc tgaagacatt 780

tacgtggagt ggaccaacaa cgggaaaaca gagctaaact acaagaacac tgaaccagtc 840

ctggactctg atggttctta cttcatgtac agcaagctga gagtggaaaa gaagaactgg 900

gtggaaagaa atagctactc ctgttcagtg gtccacgagg gtctgcacaa tcaccacacg 960

actaagagct tctcccggac tccgggtaaa tga 993

<210> 52

<211> 336

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 52

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Ser Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys

85 90 95

Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu

130 135 140

Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro

145 150 155 160

Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala

165 170 175

Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val

180 185 190

Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe

195 200 205

Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr

210 215 220

Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Ile Leu

225 230 235 240

Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys

245 250 255

Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser

260 265 270

Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp

275 280 285

Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser

290 295 300

Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly

305 310 315 320

Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys

325 330 335

<210> 53

<211> 1011

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 53

gccaaaacaa cacccccatc agtctatcca ctggcccctg ggtgtggaga tacaactggt 60

tcctccgtga ctctgggatg cctggtcaag ggctacttcc ctgagtcagt gactgtgact 120

tggaactctg gatccctgtc cagcagtgtg cacaccttcc cagctctcct gcagtctgga 180

ctctacacta tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cttggccaag tcagaccgtc 240

acctgcagcg ttgctcaccc agccagcagc accacggtgg acaaaaaact tgagcccagc 300

gggcccattt caacaatcaa cccctgtcct ccatgcaagg agtgtcacaa atgcccagct 360

cctaacctcg agggtggacc atccgtcttc atcttccctc caaatatcaa ggatgtactc 420

atgatctccc tgacacccaa ggtcacgtgt gtggtggtgg atgtgagcga ggatgaccca 480

gacgtccaga tcagctggtt tgtgaacaac gtggaagtac acacagctca gacacaaacc 540

catagagagg attacaacag tactatccgg gtggtcagca ccctccccat ccagcaccag 600

gactggatga gtggcaagga gttcaaatgc aaggtcaaca acaaagacct cccatcaccc 660

atcgagagaa ccatctcaaa aattaaaggg ctagtcagag ctccacaagt atacatcttg 720

ccgccaccag cagagcagtt gtccaggaaa gatgtcagtc tcacttgcct ggtcgtgggc 780

ttcaaccctg gagacatcag tgtggagtgg accagcaatg ggcatacaga ggagaactac 840

aaggacaccg caccagtcct agactctgac ggttcttact tcatatatag caagctcaat 900

atgaaaacaa gcaagtggga gaaaacagat tccttctcat gcaacgtgag acacgagggt 960

ctgaaaaatt actacctgaa gaagaccatc tcccggtctc cgggtaaatg a 1011

<210> 54

<211> 336

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 54

Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Cys Gly

1 5 10 15

Asp Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Ser Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Ser Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Met

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val

65 70 75 80

Thr Cys Ser Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Thr Val Asp Lys Lys

85 90 95

Leu Glu Pro Ser Gly Pro Ile Ser Thr Ile Asn Pro Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Lys Glu Cys His Lys Cys Pro Ala Pro Asn Leu Glu Gly Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Ile Phe Pro Pro Asn Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu

130 135 140

Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro

145 150 155 160

Asp Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala

165 170 175

Gln Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Ile Arg Val Val

180 185 190

Ser Thr Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe

195 200 205

Lys Cys Lys Val Asn Asn Lys Asp Leu Pro Ser Pro Ile Glu Arg Thr

210 215 220

Ile Ser Lys Ile Lys Gly Leu Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Thr Leu

225 230 235 240

Pro Pro Pro Ala Glu Gln Leu Ser Arg Lys Asp Val Ser Leu Thr Cys

245 250 255

Leu Val Val Gly Phe Asn Pro Gly Asp Ile Ser Val Glu Trp Thr Ser

260 265 270

Asn Gly His Thr Glu Glu Asn Tyr Lys Asp Thr Ala Pro Val Leu Asp

275 280 285

Ser Asp Gly Ser Tyr Phe Ile Tyr Ser Lys Leu Asn Met Lys Thr Ser

290 295 300

Lys Trp Glu Lys Thr Asp Ser Phe Ser Cys Asn Val Arg His Glu Gly

305 310 315 320

Leu Lys Asn Tyr Tyr Leu Lys Lys Thr Ile Ser Arg Ser Pro Gly Lys

325 330 335

<210> 55

<211> 1011

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 55

gccaaaacaa cacccccatc agtctatcca ctggcccctg ggtgtggaga tacaactggt 60

tcctccgtga cctctgggtg cctggtcaag gggtacttcc ctgagccagt gactgtgact 120

tggaactctg gatccctgtc cagcagtgtg cacaccttcc cagctctcct gcagtctgga 180

ctctacacta tgagcagctc agtgactgtc ccctccagca cctggccaag tcagaccgtc 240

acctgcagcg ttgctcaccc agccagcagc accacggtgg acaaaaaact tgagcccagc 300

gggcccattt caacaatcaa cccctgtcct ccatgcaagg agtgtcacaa atgcccagct 360

cctaacctcg agggtggacc atccgtcttc atcttccctc caaatatcaa ggatgtactc 420

atgatctccc tgacacccaa ggtcacgtgt gtggtggtgg atgtgagcga ggatgaccca 480

gacgtccaga tcagctggtt tgtgaacaac gtggaagtac acacagctca gacacaaacc 540

catagagagg attacaacag tactatccgg gtggtcagca ccctccccat ccagcaccag 600

gactggatga gtggcaagga gttcaaatgc aaggtgaaca acaaagacct cccatcaccc 660

atcgagagaa ccatctcaaa aattaaaggg ctagtcagag ctccacaagt atacactttg 720

ccgccaccag cagagcagtt gtccaggaaa gatgtcagtc tcacttgcct ggtcgtgggc 780

ttcaaccctg gagacatcag tgtggagtgg accagcaatg ggcatacaga ggagaactac 840

aaggacaccg caccagttct tgactctgac ggttcttact tcatatatag caagctcaat 900

atgaaaacaa gcaagtggga gaaaacagat tccttctcat gcaacgtgag acacgagggt 960

ctgaaaaatt actacctgaa gaagaccatc tcccggtctc cgggtaaatg a 1011

<210> 56

<211> 335

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 56

Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly

1 5 10 15

Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Asn Thr Trp Pro Ser Gln Thr Ile

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Glu Pro Arg Val Pro Ile Thr Gln Asn Pro Cys Pro Pro Leu Lys

100 105 110

Glu Cys Pro Pro Cys Ala Ala Pro Asp Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser

130 135 140

Pro Met Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp

145 150 155 160

Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln

165 170 175

Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser

180 185 190

Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys

195 200 205

Cys Lys Val Asn Asn Arg Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile

210 215 220

Ser Lys Pro Arg Gly Pro Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro

225 230 235 240

Pro Pro Ala Glu Glu Met Thr Lys Lys Glu Phe Ser Leu Thr Cys Met

245 250 255

Ile Thr Gly Phe Leu Pro Ala Glu Ile Ala Val Asp Trp Thr Ser Asn

260 265 270

Gly Arg Thr Glu Gln Asn Tyr Lys Asn Thr Ala Thr Val Leu Asp Ser

275 280 285

Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Gln Lys Ser Thr

290 295 300

Trp Glu Arg Gly Ser Leu Phe Ala Cys Ser Val Val His Glu Val Leu

305 310 315 320

His Asn His Leu Thr Thr Lys Thr Ile Ser Arg Ser Leu Gly Lys

325 330 335

<210> 57

<211> 1008

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 57

gccaaaacaa cagccccatc ggtctatcca ctggcccctg tgtgtggagg tacaactggc 60

tcctcggtga ctctaggatg cctggtcaag ggttatttcc ctgagccagt gaccttgacc 120

tggaactctg gatccctgtc cagtggtgtg cacaccttcc cagctctcct gcagtctggc 180

ctctacaccc tcagcagctc agtgactgta acctcgaaca cctggcccag ccagaccatc 240

acctgcaatg tggcccaccc ggcaagcagc accaaagtgg acaagaaaat tgagcccaga 300

gtgcccataa cacagaaccc ctgtcctcca ctcaaagagt gtcccccatg cgcagctcca 360

gacctcttgg gtggaccatc cgtcttcatc ttccctccaa agatcaagga tgtactcatg 420

atctccctga gccccatggt cacatgtgtg gtggtggatg tgagcgagga tgacccagac 480

gtccagatca gctggtttgt gaacaacgtg gaagtacaca cagctcagac acaaacccat 540

agagaggatt acaacagtac tctccgggtg gtcagtgccc tccccatcca gcaccaggac 600

tggatgagtg gcaaggagtt caaatgcaag gtcaacaaca gagccctccc atcccccatc 660

gagaaaacca tctcaaaacc cagagggcca gtaagagctc cacaggtata tgtcttgcct 720

ccaccagcag aagagatgac taagaaagag ttcagtctga cctgcatgat cacaggcttc 780

ttacctgccg aaattgctgt ggactggacc agcaatgggc gtacagagca aaactacaag 840

aacaccgcaa cagtcctgga ctctgatggt tcttacttca tgtacagcaa gctcagagta 900

caaaagagca cttgggaaag aggaagtctt ttcgcctgct cagtggtcca cgaggtgctg 960

cacaatcacc ttacgactaa gaccatctcc cggtctctgg gtaaatga 1008

<210> 58

<211> 335

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 58

Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly

1 5 10 15

Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Asn Thr Trp Pro Ser Gln Thr Ile

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Glu Ser Arg Arg Pro Ile Pro Pro Asn Ser Cys Pro Pro Cys Lys

100 105 110

Glu Cys Ser Ile Phe Pro Ala Pro Asp Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser

130 135 140

Pro Ile Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp

145 150 155 160

Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln

165 170 175

Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser

180 185 190

Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys

195 200 205

Cys Lys Val Asn Asn Arg Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile

210 215 220

Ser Lys Pro Arg Gly Pro Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro

225 230 235 240

Pro Pro Ala Glu Glu Met Thr Lys Lys Glu Phe Ser Leu Thr Cys Met

245 250 255

Ile Thr Asp Phe Leu Pro Ala Glu Ile Ala Val Asp Trp Thr Ser Asn

260 265 270

Gly His Lys Glu Leu Asn Tyr Lys Asn Thr Ala Pro Val Leu Asp Thr

275 280 285

Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Gln Lys Ser Thr

290 295 300

Trp Glu Lys Gly Ser Leu Phe Ala Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu

305 310 315 320

His Asn His His Thr Thr Lys Thr Ile Ser Arg Ser Leu Gly Lys

325 330 335

<210> 59

<211> 1008

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 59

gccaaaacaa cagccccatc ggtctatcca ctggcccctg tgtgtggagg tacaactggc 60

tcctcggtga ctctaggatg cctggtcaag ggttatttcc ctgagccagt gaccttgacc 120

tggaactctg gatccctgtc cagtggtgtg cacaccttcc cagctctcct gcagtctggc 180

ctctacaccc tcagcagctc agtgactgta acctcgaaca cctggcccag ccagaccatc 240

acctgcaatg tggcccaccc ggcaagcagc accaaagtgg acaagaaaat tgaatccaga 300

aggcccatac cacccaactc ctgtcctcca tgcaaagagt gttccatatt cccagctcct 360

gacctcttgg gtggaccatc cgtcttcatc ttccctccaa agatcaagga tgtactcatg 420

atctccctga gccccatagt cacatgtgtg gtggtggatg tgagcgagga tgacccagat 480

gtccagatca gctggtttgt gaacaacgtg gaagtacaca cagctcagac acaaacccat 540

agagaggatt acaacagtac tctccgggtg gtcagtgccc tccccatcca gcaccaggac 600

tggatgagtg gcaaggagtt caaatgcaag gtcaacaaca gagccctccc atcccccatc 660

gagaaaacca tctcaaaacc cagagggcca gtaagagctc cacaggtata tgtcttgcct 720

ccaccagcag aagagatgac taagaaagag ttcagtctga cctgcatgat cacagacttc 780

ttacctgccg aaattgctgt ggactggacc agcaatgggc ataaagagct gaactacaag 840

aacaccgcac cagtcctgga cactgatggt tcttacttca tgtacagcaa gctcagagtg 900

caaaagagca cttgggaaaa aggaagtctt ttcgcctgct cagtggtcca cgagggtctg 960

cacaatcacc atacgactaa gaccatctcc cggtctctgg gtaaatga 1008

<210> 60

<211> 335

<212> Белок

<213> Bubalus arnee

<400> 60

Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Val Cys Gly

1 5 10 15

Gly Thr Thr Gly Ser Ser Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Leu Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Leu Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu

50 55 60

Ser Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Asn Thr Trp Pro Ser Gln Thr Ile

65 70 75 80

Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys

85 90 95

Ile Glu Pro Arg Val Pro Ile Thr Gln Asn Pro Cys Pro Pro Leu Lys

100 105 110

Glu Cys Pro Pro Cys Ala Ala Pro Asp Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Ile Phe Pro Pro Lys Ile Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Leu Ser

130 135 140

Pro Met Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Glu Asp Asp Pro Asp

145 150 155 160

Val Gln Ile Ser Trp Phe Val Asn Asn Val Glu Val His Thr Ala Gln

165 170 175

Thr Gln Thr His Arg Glu Asp Tyr Asn Ser Thr Leu Arg Val Val Ser

180 185 190

Ala Leu Pro Ile Gln His Gln Asp Trp Met Ser Gly Lys Glu Phe Lys

195 200 205

Cys Lys Val Asn Asn Arg Ala Leu Pro Ser Pro Ile Glu Lys Thr Ile

210 215 220

Ser Lys Pro Arg Gly Pro Val Arg Ala Pro Gln Val Tyr Val Leu Pro

225 230 235 240

Pro Pro Ala Glu Glu Met Thr Lys Lys Glu Phe Ser Leu Thr Cys Met

245 250 255

Ile Thr Gly Phe Leu Pro Ala Glu Ile Ala Val Asp Trp Thr Ser Asn

260 265 270

Gly Arg Thr Glu Gln Asn Tyr Lys Asn Thr Ala Thr Val Leu Asp Ser

275 280 285

Asp Gly Ser Tyr Phe Met Tyr Ser Lys Leu Arg Val Gln Lys Ser Thr

290 295 300

Trp Glu Arg Gly Ser Leu Phe Ala Cys Ser Val Val His Glu Gly Leu

305 310 315 320

His Asn His Leu Thr Thr Lys Thr Ile Ser Arg Ser Leu Gly Lys

325 330 335

<210> 61

<211> 1008

<212> ДНК

<213> Bubalus arnee

<400> 61