СПОСОБ ПРОВОКАЦИИ ПРИ ИЗОЛЯЦИИ ПАСТЕРЕЛЛ ОТ КРОЛИКОВ-БАКТЕРИОНОСИТЕЛЕЙ Российский патент 2021 года по МПК A61K39/00 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, эпизоотологии, иммунологии и биотехнологии, может использоваться в научно-исследовательских работах, лабораторно-диагностической практике и в биотехнологическом производстве для изоляции эпизоотических культур Pasteurella multocida и изготовление из них инактивированных вакцин, антигенов и бактеринов.

Актуальность исследований. Инфекционная патология кроликов представлена разнообразными возбудителями, однако Pasteurella multocida является одним из общих, наиболее распространенных и опасных бактериальных патогенов кроликов. Пастерелл других видов от кроликов изолируют очень редко. Pasteurella multocida у кроликов вызывает пастереллез, которое наносит значительный экономический ущерб. Пастереллез у кроликов может иметь молниеносное, острое, подострое, хроническое течение, но основную проблему составляют клинически здоровые кролики-пастереллоносители. Данная группа животных является наиболее опасным и неконтролируемым источником инфекции в хозяйствах [3, 4].

Выделение культур пастерелл от кроликов-носителей затруднено в клинической и лабораторной практике, что связано с низкой концентрацией бактерий на слизистых оболочках респираторного и плохим ростом на питательных средах. Повышает вероятность и эффективность изоляции чистой культуры Pasteurella multocida от животных-носителей метод провокации инфекционного процесса с помощью интраназального введения 0,5%-го водного раствора бриллиантовой зелени в дозе 0,2 см в течение трех суток. Наличие гнойного ринита у кроликов свидетельствует о бактерионосительстве [1, 5].

Выделение эпизоотических культур пастерелл от кроликов-бактерионосителей даст новые перспективы для поиска высокоантигенных и иммуногенных производственных вакцинных штаммов, усовершенствовать диагностику, лечение и профилактику пастреллезной инфекции у данного вида домашних животных [2, 5, 7].

Технический результат проведения способа провокации по предлагаемой методике состоит в том, что после дополнительной иммунодепрессии кроликов-пастереллоносителей дексаметазоном и циклоспорином, происходит активизация инфекционного процесса, что повышает частоту изоляции культур возбудителя.

Способ провокации кроликов с помощью водного раствора брилиантгрюна и внутримышечных инъекций дексаметазона, который отличается тем, что кроликам проводят дополнительную иммуносупрессию циклоспорином, который применяют перорально в дозе 10 мг на килограмм живой массы один раз в сутки в течение семи дней. Через 24 часа после последнего введения препарата кроликов подвергают эвтаназии и аутопсии. Из легких проводят изоляцию культур Pasteurella multocida.

Аналогом изобретения является сообщение о влиянии глюкокортикоидного гормона гидрокортизона на течение экспериментальной пастереллезной инфекции у кроликов (Al-Haddiwi M.F. Pathogenicity of Pasteurella multocida serotypes A 3, D 1 and D: 3 in rabbits // Dissertation, Thesis. -1999. - 333 p.). Автор у обработанных гидрокортизоном кроликов обнаружил более тяжелую пневмонию и летальность. Действие гидрокортизона на течение пастереллезной инфекции у кроликов объясняются его иммуносупрессивными свойствами. Недостатком методики является недостаточный и непродолжительный эффект угнетения иммунной системы гидрокортизоном.

Из уровня техники известен метод провокации кроликов-пастереллоносителей (Микробиологическая диагностика заболеваний сельскохозяйственных животных / под ред. Розанова Н.И. - М. Государственное издательство сельскохозяйственной литературы. - 1952. - 508 с.), который заключается в интраназальном введении в каждую носовую полость по 0,2 см³ 0,5% водного раствора брилиантгрюна один раз в сутки в течение трех дней. У кроликов, которые являются носителями Pasteurella multocida, появляются клинические признаки гнойно-катарального ринита. Недостаток этого метода провокации заключается в легком течении пастереллезной инфекции. Нередко отмечаются случаи самовыздоровления кроликов. Попытки выделения культур пастерелл из назальной слизи часто оказываются неуспешными из-за контраминации патматериала сапрофитной флорой.

Прототипом изобретения является метод выделения пастерелл от кроликов-пастереллоносителей (Декларацшний патент Украiни на корисну модель №11612. ; ЛНАУ. - №а200506473; Заявл. 01.07.2005; Опубл. 16.01.2006; Бюл. №1. - 2 с.), который заключается в интраназальном введении в каждую носовую полость по 0,2 см 0,5% водного раствора брилиантгрюна один раз в сутки в течение трех дней. У кроликов, которые являются носителями Pasteurella multocida, появляются клинические признаки гнойно-катарального ринита. Больным кроликам проводят дополнительную иммуносупрессию дексаметазоном. Через 24 часа после последнего введения препарата кроликов подвергают эвтаназии и аутопсии. Из кусочков легких изолируют культуры пастерелл.

Недостатком данного метода является относительно невысокая частота изоляции пастерелл из легких кроликов-пастереллоносителей.

Целью изобретения является повышение частоты изоляции эпизоотических культур пастерелл из легких кроликов, которые являются носителями Pasteurella multocida.

В нашем методе мы применяли комбинацию синтетического глюкокортикоидного гормона дексаметазона и иммунодепрессанта циклоспорина, которые обеспечивают более глубокое угнетение иммунной системы кроликов и благоприятствуют развитию пастереллезного инфекционного процесса.

Описание осуществления предлагаемого способа провокации при изоляции пастерелл от кроликов-бактерионосителей. Кроликам интраназалыю проводят инокуляцию по 0,2 см³ 0,5% водного раствора брилиантгрюна один раз в сутки в течение трех дней. Кроликам, у которых появились признаки гнойно-катарального ринита, проводят дополнительную иммуносупрессию дексаметазоном, который применяют внутримышечно в дозе 2 мг на килограмм живой массы два раза в сутки (в утреннее и обеденное время) в течение семи дней и циклоспорином, который применяют перорально в дозе 10 мг на килограмм живой массы один раз в сутки в течение семи дней. Через 24 часа после последнего введения препаратов кроликов подвергают эвтаназии и аутопсии. Из кусочков легких с соблюдением правил асептики готовят суспензию на физиологическом растворе в соотношении 1:5. Суспензию инокулируют подкожно трем белым мышам в объеме 0,3 см, за которыми ведут наблюдение в течение пяти суток. Изоляцию чистой культуры пастерелл проводят из сердца агонизирующих мышей на мясопептонный бульон.

Отличительными признаками нашего метода является комплексное использование двух иммунодепрессантов (дексаметазона и циклоспорина), которые приводят к снижению иммунорезистентности организма кроликов-бактерионосителей и активизации у них пастереллезного инфекционного процесса, что значительно повышает частоту изоляции культур возбудителя.

Пример 1. С помощью интраназального введения 0,5% водного раствора брилиантгрюна в дозе 0,2 см³ в течение трех суток 29 кроликам в возрасте 3 месяца и живой массой 1,4-1,8 кг было обнаружено 11 голов (37,9%) пастереллоносителей. У кроликов, которые являются носителями Pasteurella multocida, появляются клинические признаки гнойно-катарального ринита. Больным кроликам проводили дополнительную иммуносупрессию дексаметазоном в дозе 2 мг на килограмм живой массы два раза в сутки в течение семи дней. Через 24 часа после последнего введения препарата кроликов подвергли эвтаназии и аутопсии. Из кусочков легких с соблюдением условий стерильности готовили суспензию на физиологическом растворе в соотношении 1:5. Суспензию в дозе 0,3 см³ подкожно вводили по трем белым мышам, за которыми вели наблюдение в течение пяти суток. Изоляцию чистой культуры пастерелл осуществляли из сердца агонизирующих мышей на мясопептонный бульон. От кроликов-пастереллоносителей с помощью прототипа изобретения выделена 1 культура (12,5%).

Пример 2. С помощью интраназального введения 0,5% водного раствора брилиантгрюна в дозе 0,2 см³ в течение трех суток 39 кроликам в возрасте 3 месяца и живой массой 1,4-1,8 кг было обнаружено 17 голов (43,5%) пастереллоносителей. Кроликов пастереллоносителей изолировали от здоровых и разделили на две группы по 9 и 8 голов в каждой, соответственно. Животным первой группы внутримышечно вводили дексаметазон в дозе 2 мг на килограмм живой массы два раза в сутки в течение семи дней и циклоспорин, который применяют перорально в дозе 10 мг на килограмм живой массы один раз в сутки в течение семи дней. Вторую группу домашних животных не обрабатывали и использовали в качестве контроля. Через 24 часа после последнего введения препарата кроликов подвергли эвтаназии и аутопсии. Из кусочков легких с соблюдением условий стерильности готовили суспензию на физиологическом растворе в соотношении 1:5. Суспензию в дозе 0,3 см подкожно вводили по трем белым мышам, за которыми вели наблюдение в течение пяти суток. Изоляцию чистой культуры пастерелл осуществляли из сердца агонизирующих мышей на мясопептонный бульон. Далее проводили идентификацию микроорганизмов по тинкториальным, культуральным и биохимическим свойствам. От кроликов-пастереллоносителей с помощью нашего способа были изолированы 9 (100%) культур пастерелл; в контрольной группе этот показатель составлял 12,5% (1 культура).

Пример 3. Изучение культурально-морфологических свойств культур пастерелл, изолированных с помощью нашего способа. При микроскопии пастерелл, изолированных от кроликов-бактерионосителей, располагались изолированно, реже парами и короткими цепочками. В мазках, изготовленных из патологического материала и свежевыделенных агаровых культур, окрашенных по методу Михина, пастереллы всегда имели биполярность. При окраске тушью по методу Бурри-Гинса восемь свежевыделенных культур пастерелл (88,9%) имели капсулу. В мясо-пептонном бульоне все культуры пастерелл течение первых суток вызвали равномерное помутнение среды и незначительный слизистый осадок на дне пробирки. На мясо-пептонном агаре через 18-24 часов после инокуляции наблюдали рост мелких полупрозрачных, росинчатых, слегка голубоватых округлых колоний, с ровными краями и гладкой блестящей выпуклой поверхностью. При боковом освещении такие колонии имели своеобразное свечение - "флуоресценцию". Все культуры пастерелл в мясопептонном полужидком агаре росли четко по уколу иглы в виде беловатого стержня, однако среда вокруг посева оставалась прозрачной. На сывороточном и кровяном агаре все эпизоотическая культуры пастерелл давали более пышный и сочный рост, чем на простых средах. Ни один из полученных изолятов не вызывал признаков гемолиза на 5% кровяном агаре.

Пример 4. Биохимические свойства выделенных от кроликов-бактерионосителей с помощью нашего способа культур пастерелл также значительно варьировали. Все культуры обладали каталазной активностью и ферментировали сорбит, образовывали сероводород, орнитиндекарбоксилазу и индол, часто глюкозу (88,9%), сахарозу (88,9%), маннозу (88,9%); расщепляли мальтозу (77,8%); редко - манит (33,3%); очень редко - лактозу (11,1%); вовсе не образовывали лизиндекарбоксилазу, β-галактозидазу, ацетилметилкарбинол, не расщепляли дульцит; не утилизировали цитират и малонат натрия.

Список литературы

1. Микробиологическая диагностика заболеваний сельскохозяйственных животных / под ред. Розанова Н.И. - М. Государственное издательство сельскохозяйственной литературы. - 1952. - 508 с.

2. Декларацiйний патент на корисну модель 11612, МКИ B61L 7/00; А61 K39/102. Руденко А.А.; ЛНАУ. - №а200506473; Заявл. 01.07.2005; Опубл. 16.01.2006; Бюл. №1. - 2 с.

3. Al-Haddiwi M.F. Pathogenicity of Pasteurella multocida serotypes A 3, D 1 and D: 3 in rabbits // Dissertation, Thesis. - 1999. - 333 p.

4. Cazeau G, Jouy E, Haenni M, Madec JY, Jarrige N, Leblond A, Gay E. Antimicrobial resistance of Pasteurella multocida isolated from diseased food-producing animals and pets. Vet Microbiol. 2019;235:280-284.

5. Katoch S, Verma L, Sharma M, Asrani RK, Kumar S, Chahota R, Verma S. Experimental Study of the Pathogenicity of Pasteurella multocida Capsular Type В in Rabbits. J Comp Pathol. 2015;153(2-3):160-166.

6. Corbeil L.B., Strayer D.S., Skaletsky E., Wunderlich A., Sell S. Immunity to pasteurellosis in compromised rabbits. Am J Vet Res. 1983 May;44(5):845-850.

7. Jaglic Z., Jeklova E., Christensen H., Leva L., Register K., Kummer V., Kucerova Z., Faldyna M., Maskova J., Nedbalcova K. Host response in rabbits to infection with Pasteurella multocida serogroup F strains originating from fowl cholera. Can J Vet Res. 2011;75(3):200-208.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой способ провокации при изоляции пастерелл от кроликов-бактерионосителей, при котором кроликам проводят дополнительную иммуносупрессию циклоспорином, который применяют перорально в дозе 10 мг на килограмм живой массы один раз в сутки в течение семи дней. Через 24 часа после последнего введения препарата кроликов подвергают эвтаназии и аутопсии. Из легких проводят изоляцию культур Pasteurella multocida. Использование дополнительной иммуносупрессии циклоспорином приводит к большей частоте изоляции Pasteurella multocida (в 8 раз) по сравнению с классическим способом провокации. 4 пр.

Способ провокации при изоляции пастерелл от кроликов-бактерионосителей, который предусматривает использование провокации кроликов с помощью водного раствора брилиант грюна и внутримышечных инъекций дексаметазона, который отличается тем, что кроликам проводят дополнительную иммуносупрессию циклоспорином, который применяют перорально в дозе 10 мг на килограмм живой массы один раз в сутки в течение семи дней, через 24 часа после последнего введения препарата кроликов подвергают эвтаназии и аутопсии, из легких проводят изоляцию культур Pasteurella multocida.