Биологически активное вещество с эффектом разрушения биоплёнок бактерий Российский патент 2021 года по МПК A61K33/24 A61K33/42 C01G17/00 

Изобретение относится к фармацевтическим средствам, а именно к веществам с эффектом разрушения биопленок бактерий и способам их получения. Развитие в местах операций биопленок, как основной формы существования бактерий в естественных условиях, приводит, например, в ортопедии, к серьезным осложнениям для пациента в послеоперационный период и требует серьезного лечения. Изобретение может быть использовано в стоматологии, хирургии, травматологии и косметологии.

Известны три группы способов борьбы с биопленками: физические, биологические и химические.

Среди физических способов наиболее интересно разрушение биопленок ультразвуком (патент на изобретение RU № 2561333, МПК А61К 31/65, 2014 г.) и воздействие излучением высокоэнергетического итрий-алюмогранатового с неодимом лазера (патент на изобретение RU № 2626594, МПК А61 В 18/20, 2016 г.).

К биологическим способам относятся бактериофаги, которые экспрессируют литические ферменты, разрушающие биопленку (патенты на изобретения US № 2010254950 A1, US № 8182804 B1, RU № 2735103, МПК А61К 38/47, 2013 г.) и комплекс пептидов насекомых, содержащий дефензины, цекропины, диптерицины и пролин-богатые пептиды, в комбинации с антибиотиками или антисептиками (патент на изобретение RU № 2664708, МПК А61К 38/57, 2017 г.).

Наиболее многочисленным методом является борьба с биопленками при помощи различных химических соединений, например нанесение на поверхность, имеющую биопленку композиций, содержащих:

- янтарную кислоту, аконитовую кислоту и носитель, выбранный из воды или водно-спиртовой смеси (патент на изобретение RU № 2734759, МПК А61К 8/362, 2016 г.);

- цинка оксид, фитиновую кислоту или ее соли, глюкозамин в солевой форме и вспомогательные вещества (патент на изобретение RU № 2630612, МПК А61К 31/6615, 2016 г.);

- поверхностно-активное вещество, включающее галлийсодержащую соль в качестве противомикробного средства (патенты на изобретения RU № 2418574 МПК А61К 31/00, 2007 г.; TW № 201340984 A);

- фенольные, фенольные или полифенольные соединения, природного происхождения (заявка на изобретение US № 2017100348 A1);

- ализарин, пурпурин, хинализарин или их солей (патент на изобретение KR № 101763518 B1);

- антимикробный агент, предпочтительно повидон-йод, предпочтительно ферратное соединение и катионо-ионообменную смолу (патент на изобретение US № 8821848 B1);

- устойчивый сложный полиэфирамид, образованный из полиолов, поликарбоновых кислот (или их сложных эфиров, ангидридов или галогенидов) и аргинина (заявка на изобретение JP № 2017513834 A);

- одну или несколько наночастиц оксида железа и перекись водорода (патент на изобретение CN № 107708709 A).

Наиболее близким по выполнению является кремний-замещенный гидроксиапатит кальция /силикофосфат кальция Ca₁₀(PO₄)_6-x(SiO4)_x(OH)_2-x, где 0≤x≤2/ (патент на изобретение RU № 2500840, МПК С30 В 29/14, 2012 г.; Zhi-Ye QIU, In-Sup NOH, Sheng-Min ZHANG, Silicate-doped hydroxyapatite and its promotive effect on bone mineralization// Front. Mater. Sci.2013. Vol.7, №1. P. 40-50). Продукт является производным химически инертного гидроксиапатита кальция Сa₁₀(PO₄)₆(OH)₂ (основного компонента костной ткани, благодаря чему активно применяющегося в стоматологии, хирургии, травматологии и косметологии) и известен, как материал, стимулирующий восстановление дефектов костной ткани, в том числе в стоматологии.

Однако, он не оказывает статистически достоверного влияния на биопленкообразование бактерий, в частности бактерий V. aquamarines ВКПМ В-11245.

Техническим результатом является повышение степени подавления развития биопленок у биогенных материалов на основе гидроксиапатита кальция, стимулирующих восстановление дефектов костной ткани.

Технический результат достигается Ge-замещенным гидроксиапатитом /германофосфатом кальция Ca₅GeP₂O_12.

Соединение описано в литературном источнике (Ширвинская А.К., Бондарь И.А. Фазовые равновесия в системе Ca₂GeO₄-Ca₃(PO₄)₂ // Неорганические материалы. 1978. С.2026-2032). Биологические или какие-либо физико-химические свойства соединения не приведены.

Способ его получения заключается во взаимодействии исходных реагентов карбоната кальция CaCO₃, двуокиси германия GeO₂ и ортофосфата кальция Ca₃(PO₄)₂, предварительно полученного по твердофазной реакции между карбонатом кальция CaCO₃ и гидроортофосфатом кальция CaHPO₄. Данную смесь растирают с водой, высушивают и подвергают трехкратному обжигу при 1350-1500° C в течение 3-5 часов, с промежуточным сухим растиранием для лучшей кристаллизации продукта реакции, и охлаждением.

Способ предполагает использование высоких температур обжига.

Техническим результатом предлагаемого способа является снижение температуры обжига.

Предлагаемый способ получения указанного продукта заключается во взаимодействии гидроксида кальция Ca(OH)₂, оксида германия GeO₂ и ортофосфорной кислоты H₃PO₄ в присутствии лимонной кислоты и этиленгликоля с последующим обжигом при температуре 600 -1200° С в течение 0,5-4 часов.

5Ca(OH)₂+GeO₂+2H₃PO₄=Ca₅GeP₂O₁₂+8H₂O

Ортофосфорную кислоту используют преимущественно в растворе с концентрацией ортофосфорной кислоты H₃PO₄ 2-3 М. С повышением концентрации размер частиц увеличивается, а с понижением возрастает время проведения реакции.

Обжиг проводят для кристаллизации продукта реакции. С понижением температуры обжига ниже 600° C значительно уменьшится выход реакции, с повышением, выше 1200°C происходит резкое увеличение размера частиц, что влияет на механические свойства материала.

Преимущественная температура обжига составляет 700-1000 в течение 1-3 часов.

Перед обжигом может быть проведена сушка, например, в сушильном шкафу, преимущественно при температуре до 200-400° С в течение 0,5-2 часов для удаления воды, что способствует увеличению выхода продукта за счет равномерного распространения волны реакции.

Взаимодействие Ca(OH)₂, GeO₂ и H₃PO₄ может быть проведено в присутствии небольшого количества воды (200-400 мл на 5-15 г Ca₅GeP₂O₁₂). Растворение помогает гомогенизировать компоненты между собой и увеличить выход конечного продукта химической реакции.

Лимонная кислота и этиленгликоль способствуют лучшему перемешиванию веществ и выступают в качестве стабилизирующих компонентов для исключения быстрого начала реакции (покрывают поверхность частиц реагентов для предотвращения агрегации), тем самым способствуя увеличению выхода конечного продукта и уменьшению образование побочных продуктов.

Соотношение молей этиленгликоля и лимонной кислоты составляет преимущественно 1:1-2.

Соотношение молей смеси Ca(OH)₂+GeO₂ и лимонной кислоты составляет преимущественно 1:1-3.

Ниже приведены примеры получения продукта.

Пример 1

Вводят во взаимодействие перемешиванием 4,92 г (0,066 моль) гидроксида кальция Ca(OH)_2, 1,39 г (0,013 моль) оксида германия GeO₂, и 12,7 мл ортофосфорной кислоты H₃PO₄ концентрацией 2,1 М с 200 мл воды.

Добавляют лимонную кислоту в количестве 30,63 г (0,16 моль) и этиленгликоль в количестве 10,6 мл (0,19 моль, плотность=1,11 г/см³) (соотношение молей лимонной кислоты и этиленгликоля 1:1,2, соотношение молей смеси Ca(OH)₂+GeO₂ и лимонной кислоты 1:2) с перемешиванием смеси. Смесь нагревают в сушильном шкафу при температуре 200° С в течение 2 часов для выпаривания излишней воды, а затем в печи до 700⁰ С и выдерживают в течение 2 часов.

Получают 6,3 г Ca₅GeP₂O₁₂ (выход 90%)

(1а) Аналогично получают продукт добавлением ортофосфорной кислоты H₃PO₄ концентрацией 3 М с 400 мл воды, лимонной кислоты в количестве 30,63 г (0,16 моль) и этиленгликоля в количестве 17,9 мл (0,32 моль, плотность=1,11 г/см³) (соотношение молей лимонной кислоты и этиленгликоля 1:2, соотношение молей смеси Ca(OH)₂+GeO₂ и лимонной кислоты 1:2).

(1в) Аналогично получают продукт выпариванием воды в сушильном шкафу при температуре 400° С в течение 0,5 часа и выдерживанием смеси при температуре 600 °С в течение 4 часа, 700° С в течение 3 часов, 1200 °С в течение 0,5 часа, 1000° С в течение 1 часа.

(1 с) Аналогично получают продукт с использованием 85% ортофосфорной кислоты без добавления воды и нагрева в сушильном шкафу при соотношении молей смеси Ca(OH)₂+GeO₂ и лимонной кислоты 1:1 и 1:3. Выход продукта 80%.

Структура полученного соединения идентифицирована методом порошковой рентгенографии. Данные собраны с помощью дифрактометра ARL X'TRA в CuKa-излучении с Ni-фильтрацией. Скорость сканирования 5°/мин при фазовом анализе до 0,5°/мин. Для качественного анализа использовали рентгенометрическую картотеку PDF2. Для доказательства принадлежности фазы к структурному типу гидроксиапатита было проведено уточнение параметров элементарной ячейки. Автокоррекция углов была проведена по семейству плоскостей h00, Уточнение параметров выполнено с помощью программы CELREF3. Приближенные значения параметров взяты в карточке гидроксиапатита из базы данных PCPPDFWIN.

На фиг.1 представлена рентгенограмма продукта реакции. Как видно, пики полученного соединения близки к пикам гидроксиапатита кальция с небольшим смещением, что говорит о небольшом искажении элементарной ячейки вследствие замещения Ge на P и требует уточнения параметров элементарной ячейки.

В таблице 1 представлено уточнение параметров элементарной ячейки продукта реакции (образец имеет гексагональную сингонию, вследствие чего указаны параметры а и с).

Табл.1

Эталон (значение в Å) - параметр элементарной ячейки гидроксиапатита, взятый из базы данных PCPPDFWIN.

Образец (значение в Å) - рассчитанный параметр элементарной ячейки германофосфата кальция с помощью программы CELREF3.

Δ (значение в Å) - абсолютное изменение (разность между значениями эталона и образца).

δ (значение в %) - относительное изменение (отношение между значением абсолютного изменения и образца, умноженное на 100%).

Результаты свидетельствуют о том, что параметры элементарной ячейки образца Ca₅GeP₂O₁₂ успешно уточнены в установках элементарной ячейки гидроксиапатита, что говорит о принадлежности именно к этому структурному типу.

Ниже приведены результаты исследования биологических свойств с эффектом разрушения биопленок бактерий.

На фиг.2 представлены результаты исследование распределения размера частиц.

Как видно распределение частиц по размерам лежит в интервале 1-100 Нм, наибольшее количество частиц с размером порядка 10 Нм.

В таблице 2 представлены результаты исследования токсичности на биолюминисцентных бактериях.

Табл. 2

В качестве образца 1 использован Si- замещенный гидроксиапатит кальция /Si-замещенный ГАП (силикофосфат кальция Ca10(PO4)6-x(SiO4)x(OH)2-x, где 0≤x≤2, полученный по патенту на изобретение RU № 2500840.

В качестве образца 2 использован Ge-замещенный гидроксиапатит кальция, полученный по примеру 1.

Как видно из представленных данных, токсических эффектов у образцов не обнаружено.

На фиг.3 представлены результаты исследования интенсивности образования биопленок штаммом Vibrio aquamarinus ВКПМ В-11245 в присутствии образцов керамики.

В качестве образца 1 использован Si-замещенный гидроксиапатит кальция

В качестве образца 2 использован Ge-замещенный гидроксиапатит кальция, полученный по примеру 1.

Как видно из представленных данных, образец керамики №1 не оказывает статистически достоверного влияния на биопленкообразование V. aquamarines ВКПМ В-11245.

Образец №2 подавляет развитие биопленок, причем чем больше концентрация вещества, тем сильней выражен подавляющий эффект. При концентрации образца керамики №2, равной 0,01 мг/мл, оптическая плотность исследуемых биопленок ниже значений контроля на 11%, при 0,1 мг/мл - на 20,7%, при 1 мг/мл - на 68,8%.

Аналогичные результаты получены при использовании в качестве образца 2, продуктов, полученных по примеру 1 (а-с).

Таким образом, предлагаемый продукт, являясь производным биогенного гидроксиапатита кальция (основного компонента костной ткани) и его кремнийзамещенного, является нетоксичным и подавляет развитие биопленок бактерий за счет их разрушения, в отличие от прототипа кремнийзамещенного гидроксиапатита кальция. Способ получения продукта позволяет получить его при более низкой температуре обжига, чем известный способ его получения.

Изобретение относится к фармацевтическим средствам, а именно к применению германофосфата кальция Ca₅GeP₂O₁₂ в качестве средства с эффектом разрушения биоплёнок бактерий. Техническим результатом изобретения является повышение степени подавления развития биопленок у биогенных материалов на основе гидроксиапатита кальция, стимулирующих восстановление дефектов костной ткани. 1 з.п. ф-лы, 3 ил., 2 табл., 1 пр.

1. Применение германофосфата кальция Ca₅GeP₂O₁₂ в качестве средства с эффектом разрушения биоплёнок бактерий.

2. Применение германофосфата кальция Ca₅GeP₂O₁₂ по п. 1, для изготовления фармацевтической композиции.