СПОСОБ РАЗДЕЛЬНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕОРГАНИЧЕСКОГО И ОРГАНИЧЕСКОГО МЫШЬЯКА В МОРЕПРОДУКТАХ Российский патент 2021 года по МПК G01N33/12 G01N30/72 

Изобретение относится к области оценки безопасности пищевой продукции, а именно к методам раздельного определения содержания в морепродуктах органического и неорганического мышьяка, и может быть использовано в процессе установления отдельных регламентов содержания этих форм мышьяка в рыбе и других морепродуктах.

В настоящее используются методы: определения общего мышьяка по ГОСТ 34141-2017 «Продукты пищевые, корма, продовольственное сырье. Определение мышьяка, кадмия, ртути и свинца методом масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой»; определение неорганического мышьяка по ГОСТ 34462-2018 «Продукты пищевые, продовольственное сырье и корма. Определение содержания неорганического мышьяка методом высокоэффективной жидкостной хроматографии - масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой». Данный метод основан на извлечении неорганического мышьяка из анализируемой пробы путем обработки ее раствором азотной кислоты и перекиси водорода и количественном определении с помощью ВЭЖХ-ИСП-МС системы.

Официально утвержденного способа раздельного определения органических и неорганических форм мышьяка в рыбе и морепродуктах в Российской Федерации в настоящее время нет.

Необходимость разработки метода обусловлено тем, что органические формы мышьяка вносят значительно больший вклад в общее потребление человеком мышьяка и являются менее токсичными, чем его неорганические формы, которые отнесены Международным агентством по исследованию рака (IARC) к канцерогенам первой группы (Group 1А) - к веществам, которые могут оказывать канцерогенное действие в любых концентрациях. Арсенобетаин не проявляет выраженного токсического действия. Вместе с тем, ряд органических форм мышьяка отнесены IARC ко второй группе канцерогенов (Group 2В), то есть к веществам, которые при определенных условиях могут оказывать канцерогенное воздействие на организм человека. Арсеносахара и арсенолипиды, в процессе метаболизма в организме, могут метилироваться и, таким образом, оказывать генотоксическое воздействие на организм и другие негативные эффекты, характерные для неорганических форм мышьяка. Раздельное определение органических и неорганических форм мышьяка и анализ их содержания будет способствовать решению вопроса о необходимости установления отдельных регламентов содержания этих форм мышьяка в рыбе и других морепродуктах.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является метод раздельного количественного определения органических и неорганических форм мышьяка в морепродуктах с использованием атомно-абсорбционного спектрометра [Круглякова У.С., Багрянцева О.В., Евстратова А.Д., Малинкин А.Д., Гмошинский И.В., Хотимченко С.А. Раздельное количественное определение органических и неорганических форм мышьяка в морепродуктах//Анализ риска здоровью, 2018, №2, с. 112-118, DOI: 10.21668/health.risk/2018.2.13].

Недостатком способа является невозможность раздельного определения органических и неорганических форм мышьяка во влажных образцах и недостаточная точность определения этих показателей в морепродуктах с высоким содержанием белка, а также низкий предел обнаружения мышьяка -3*10^-4 мкг/см³.

Технической задачей заявленного изобретения является создание способа, обеспечивающего раздельного определения органических и неорганических форм мышьяка во влажных образцах рыбы и других морепродуктов.

Техническим результатом предлагаемого способа является достижение большей степени воспроизводимости, стабильности и точности получаемых результатов (0,5 мкг/дм³), при помощи метода твердофазной экстракции в сочетании с масс-спектрометрией с индуктивно-связанной плазмой с использованием квадрупольного масс-спектрометра с индуктивно-связанной плазмой, с диапазоном измерений от 3 до 256 атомных единиц массы (а.е.м.).

Требуемый технический результат достигается способом раздельного количественного определения органического и неорганического мышьяка в морепродуктах в отборе образцов, их обработке с получением гомогенизированного влажного или сухого образца, которые помещают в пробирки, проведении экстракции каждого образца раствором 3% по массе перекиси водорода в 0,055М соляной кислоте на деионизованной воде, на водяной бане с шейкером при температуре 95°С в течение 45 мин. с дополнительным ручным встряхиванием пробирки с образцом через каждые 10 мин., затем охлаждении до комнатной температуры, центрифугировании в течение 10 минут при 4000 об./мин в центрифуге с угловым ротором, затем перенесении супернатантов в полипропиленовые пробирки, с доведением деионизованной водой до объема 10 см³, определении содержания общего мышьяка в 5 см³ отобранного образца супернатанта, разделении мышьяка на органическую и неорганическую фракции в 3 см³ оставшегося количества отобранного образца при помощи проведения твердофазной экстракции с использованием SPE-картриджей с сильной анионообменной неподвижной фазой, минерализации аликвот образцов фракций общего, органического и неорганического мышьяка, с дальнейшим определением количества общего мышьяка, а определение количества общего мышьяка, органического и неорганического мышьяка проводят на квадрупольном масс-спектрометре с индуктивно связанной плазмой ICP-MS автоматически.

Способ осуществляется следующим образом.

Подготовка образцов к анализу проводится с использованием или без использования сублимационной сушки. Влажные образцы морепродуктов после очистки от несъедобной части в количестве 50-100 г помещают в лабораторный измельчитель тканей и гомогенизируют в течение 2-3 минут при охлаждении камеры гомогенизатора льдом до состояния однородной пасты.

Для получения сухих образцов морепродукты измельчают ножницами на кусочки размером 1-3 мм, взвешивают с точностью до ±0,01 г, помещают в чашку Петри, замораживают и подвергают вакуумной сублимационной сушке при температуре испарителя от минус 45 до минус 50°С. Сушка проводится в течение 24-36 часов до достижения постоянного остаточного давления в сушильной камере не выше 1,2*10^-1 тор в течение часа и постоянной разности температур плиты сушильной камеры и высушиваемых образцов. За 2 часа до окончания процесса сушки температуру в камере повышают до +35°С для удаления остаточных количеств влаги из образцов. Высушенные образцы повторно взвешивают для определения влажности, после чего растирают в порошок в ступке.

Влажный образец массой 0,250 г или сухой образец массой 0,050 г взвешивают на аналитических весах с точностью ±0,001 г, вносят в стеклянную пробирку со шлифом №14 вместимостью 20 см³, добавляют 10 см³ раствора для экстракции (3% по массе перекиси водорода в 0,055 М соляной кислоте на деионизованной воде) и помещают на водяную баню с шейкером при температуре 95°С на 45 минут. Для более полного извлечения мышьяка, образцы в ходе экстрагирования дополнительно перемешивают путем ручного встряхивания пробирки через каждые 10 минут.

Далее образцы охлаждают до комнатной температуры, помещают в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 10 минут при 4000 g в центрифуге с угловым ротором. Супернатанты переносят в полипропиленовые пробирки и доводят деионизованной водой до объема 10 см³. По 5 см³ каждого образца супернатанта отбирали для определения содержания общего мышьяка. Из остатка отбирали по 3 см³ супернатанта для дальнейшего проведения твердофазной экстракции.

Неорганический мышьяк отделяется от органического мышьяка на SPE-картриджах с сильной анионообменной неподвижной фазой с массой сорбента 500 мг и объемом 6 см³ (одноразовых), установленных в вакуумную камеру для твердофазной экстракции (от 30 кПа до 90 кПа) при скорости элюирования: 2 см³ жидкости за 5 мин. Предварительно картриджи кондиционируют пропусканием 2 см³ метанола. Сорбентное уравновешивание картриджей выполняется пропусканием 2 см³ раствора, состоящего из равных объемов 40 мМ карбоната аммония и раствора для экстракции. Перед нанесением на картридж супернатант в количестве 3 см3 смешивают с 3 см3 40 мМ карбоната аммония. С помощью универсальной индикаторной бумаги определяется рН смеси, который должен был соответствовать 6,5±1,0. Забуференный раствор образца центрифугируют в течение 10 мин при 4000 об./мин, после чего его аликвоту 4 см³ наносят на предварительно сорбентно уравновешенные картриджи SPE, установленные в вакуумную камеру. После прохождения раствора через картридж (в течение 5 минут) его промывают 6 см³ 0,5 М уксусной кислоты и далее высушивают под вакуумом до полного высыхания. Объединенные растворы, прошедшие через картридж на данной стадии, представляют собой фракцию органического мышьяка. Сорбированную на картрижде фракцию далее элюируют 2,5 см³ 0,4 М соляной кислоты. В ходе элюирования удерживаемую на SPE-картриджах фракцию неорганического мышьяка (V) собирают в полипропиленовые пробирки с дальнейшим высушиванием под вакуумом в течение не менее 5 мин. Аликвоты экстракта образца продукта, и полученных фракций органического и неорганического мышьяка подвергают минерализации согласно ГОСТ 26929-9412.

После минерализации в образцах определяют общее содержание мышьяка, содержание органического и неорганического мышьяка при помощи квадрупольного масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой ICP-MS Расчет концентраций мышьяка проводят с помощью программного обеспечения квадрупольного масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой ICP-MS автоматически, на основании параметров используемого метода и данных проведенной калибровки (Фиг. 1).

Расчет общего содержания мышьяка в образце проводят по формуле:

Х=[(C×V×K] /М, где Х - искомое содержание элемента, мкг/г (мг/кг);

С - концентрация элемента, определенная по калибровочному графику, мкг/дм³, скорректированная на величину сигнала контрольной пробы (бланка), не содержащей образца;

V - объем пробы после минерализации, дм³;

K - коэффициент разведения пробы;

М - навеска пробы, г.

Расчет содержания мышьяка в экстрактах и элюатах SPE проводят по формуле:

Х=[(C×V×K] /w, где

Х - искомое содержание элемента, мкг/см³;

С - концентрация элемента, определенная по калибровочному графику, мкг/дм³, скорректированная на величину сигнала контрольной пробы (бланка), не содержащей образца;

V - объем пробы после минерализации, дм³;

K - коэффициент разведения пробы;

w - объем пробы, см³.

Расчет содержания органически связанного (oAs) и неорганического (iAs) мышьяка в продукции проводят по формулам:

C_o=X_t×X_ow_o/(X_ow_o+X_iW_i)×(1-Z/100)

C_i=X_t×X_iw_i/(X_ow_o+X_iw_i)×(1-Z/100), где

C_o/_i - концентрация (содержание) органического/неорганического мышьяка в мг/кг, X_t - общее содержание мышьяка в сухом (сублимационно высушенном) или влажном образце продукции, X_o/i - содержание мышьяка в элюатах (SPE фракциях) органического/неорганического мышьяка в мкг/см³, w_o/i - объем элюатов (SPE фракций) органического/неорганического мышьяка в см³, Z - влажность образца (потери при сублимационном высушивании) в % по массе.

Примечание: множитель 1-Z/100 представляет собой поправку на влажность исходного образца при использовании для экстракции сухого образца. При использовании в экстракции влажного образца или образца сухих водорослей данная поправка не вносится (Z=0).

Нижний предел количественного определения мышьяка при использовании предлагаемого способа составляет 0,5 мкг/дм³. Ошибка измерения не более 20%.

Сумма содержания органического и неорганического мышьяка в исследованных образцах совпадает с полученными результатами определения общего мышьяка вне зависимости от содержания в нем влаги.

Примеры выполнения способа.

Пример 1

Для определения содержания органических и неорганических форм мышьяка в морепродуктах были взяты образцы следующих видов рыб: скумбрии копченой, палтуса, морского окуня и трески свежемороженных.

Влажные образцы морепродуктов после очистки от несъедобной части в количестве 100 г помещали в измельчитель тканей и гомогенизировали в течение 3 минут при охлаждении камеры гомогенизатора льдом до состояния однородной пасты.

Образец массой 0,250 г взвешивали на аналитических весах с точностью ±0,001 г, вносили в стеклянную пробирку со шлифом №14 вместимостью 20 см³, добавляли 10 см³ раствора для экстракции (3% по массе перекиси водорода в 0,055 М соляной кислоте на деионизованной воде) и помещали на водяную баню с шейкером при температуре 95°С на 45 минут. Для более полного извлечения мышьяка образцы дополнительно перемешивали путем ручного встряхивания пробирки через каждые 10 минут.

Далее образцы охлаждали до комнатной температуры, помещали в центрифужные пробирки и центрифугируют в течение 10 минут при 4000 об./мин. в центрифуге с угловым ротором. Супернатанты переносили в полипропиленовые пробирки и доводили деионизованной водой до объема 10 см³. По 5 см³ каждого образца супернатанта отбирали для определения содержания общего мышьяка.

Для раздельного определения органического и неорганического мышьяка в образцах из остатка супернатанта отбирали по 3 см³ для дальнейшего проведения твердофазной экстракции на SPE-картриджах с сильной анионообменной неподвижной фазой с массой сорбента 500 мг и объемом 6 см³ (одноразовых), установленных в вакуумную камеру для твердофазной экстракции (от 30 кПа до 90 кПа) при скорости элюирования: 2 см³ жидкости за 5 мин. Предварительно картриджи кондиционировали пропусканием 2 см³ метанола. Сорбентное уравновешивание картриджей выполняли пропусканием 2 см³ раствора, состоящего из равных объемов 40 мМ карбоната аммония и раствора для экстракции. Перед нанесением на картридж супернатант в количестве 3 см³ смешивали с 3 см³ 40 мМ карбоната аммония. С помощью универсальной индикаторной бумаги определяется рН смеси, соответствовал 6,5±1,0. Забуференный раствор образца центрифугировали в течение 10 мин при 4000 об./мин, после чего его аликвоту 4 см³ наносили на предварительно сорбентно уравновешенные картриджи SPE, установленные в вакуумной камере. После прохождения раствора через картридж (в течение 5 минут) его промывали 6 см₃ 0,5 М уксусной кислоты и далее высушивали под вакуумом до полного высыхания. Объединенные растворы, прошедшие через картридж на данной стадии, представляют фракцию органического мышьяка. Сорбированную на картрижде фракцию далее элюировали 2,5 см₃ 0,4 М соляной кислоты. В ходе элюирования удерживаемую на SPE-картриджах фракцию неорганического мышьяка (V) собирали в полипропиленовые пробирки с дальнейшим высушиванием под вакуумом в течение не менее 5 мин.

Аликвоты экстракта образца продукта, и полученные фракции органического и неорганического мышьяка подвергали минерализации согласно ГОСТ 26929-9412.

После минерализации в образцах определяли общее содержание мышьяка, содержание органического и неорганического мышьяка при помощи квадрупольного масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой ICP-MS Расчет концентраций мышьяка проводили с помощью программного обеспечения квадрупольного масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой ICP-MS автоматически, на основании параметров используемого метода и данных проведенной калибровки (Фиг. 1).

Расчет общего содержания мышьяка в образце проводили по приведенной в описании способа формуле с учетом значений калибровочного графика.

Полученные результаты отражены в таблице 1.

Пример 2

Определение органических и неорганических форм мышьяка проводили аналогично примеру 1, за исключением того, что в качестве образцов использовались морепродукты: креветки, крабы, мидии, кальмары. Полученные результаты представлены в табл. 2

Пример 3

Содержание органических и неорганических форм мышьяка в сухих водорослях проводили аналогично примеру 1, за исключение взятых образцов: капуста морская (сибуки), капуста морская (доширак), водоросли фукус сублимированные.

Для получения сухих образцов водоросли измельчали ножницами на кусочки размером 1-3 мм, взвешивали с точностью до ±0,01 г, помещали в чашку Петри, замораживали и подвергали вакуумной сублимационной сушке при температуре испарителя минус 45°С.Сушка проводилась в течение 36 часов до достижения постоянного остаточного давления в сушильной камере не выше 1,2*10^-1 тор в течение часа и постоянной разности температур плиты сушильной камеры и высушиваемых образцов. За 2 часа до окончания процесса сушки температуру в камере повышали до +35°С для удаления остаточных количеств влаги из образцов. Высушенные образцы повторно взвешивали для определения влажности, после чего растирали в порошок в ступке.

Расчет концентраций мышьяка проводили с помощью программного обеспечения квадрупольного масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой ICP-MS автоматически, на основании параметров используемого метода и данных проведенной калибровки (Фиг. 1).

Расчет общего содержания мышьяка в образце проводили по приведенной в описании способа формуле с учетом значений калибровочного графика.

Полученные результаты представлены в табл. 3

Положительным эффектом предлагаемого способа разделения органических и неорганических форм мышьяка на SPE-картриджах с сильной анионообменной неподвижной фазой с дальнейшей детекцией при помощи квадрупольного масс-спектрометра с индуктивно связанной плазмой ICP-MS является то, что данный способ обеспечивает высокую степень воспроизводимости, стабильности и точности определения количества органических и неорганических форм мышьяка в рыбе и морепродуктах с различной степенью влажности. Нижний предел обнаружения мышьяка при использовании данного метода составляет 0,5 мкг/дм³.

Изобретение относится к пищевой промышленности. Способ раздельного определения органического и неорганического мышьяка в морепродуктах заключается в отборе образцов, их обработке с получением гомогенизированного влажного или сухого образца, которые помещают в пробирки, проведении экстракции каждого образца раствором 3% по массе перекиси водорода в 0,055 М соляной кислоте на деионизованной воде, на водяной бане с шейкером при температуре 95°С в течение 45 мин, затем охлаждении до комнатной температуры, центрифугировании в течение 10 минут при 4000 об/мин, затем перенесении супернатантов в полипропиленовые пробирки с доведением деионизованной водой до объема 10 см³, определении содержания общего мышьяка в 5 см³ отобранного образца супернатанта, разделении мышьяка на органическую и неорганическую фракции в 3 см³ оставшегося количества отобранного образца, причем дополнительно во время проведения экстракции образец подвергают ручному встряхиванию пробирки через каждые 10 мин, а определение количества общего мышьяка, органического и неорганического мышьяка проводят на квадрупольном масс-спектрометре с индуктивно связанной плазмой ICP-MS автоматически. Изобретение позволяет достичь большую степень воспроизводимости, стабильности и точности получаемых результатов (0,5 мкг/дм³). 1 ил., 3 табл., 3 пр.

Способ раздельного определения органического и неорганического мышьяка в морепродуктах, заключающийся в отборе образцов, их обработке с получением гомогенизированного влажного или сухого образца, которые помещают в пробирки, проведении экстракции каждого образца раствором 3% по массе перекиси водорода в 0,055 М соляной кислоте на деионизованной воде, на водяной бане с шейкером при температуре 95°С в течение 45 мин, затем охлаждении до комнатной температуры, центрифугировании в течение 10 минут при 4000 об/мин в центрифуге с угловым ротором, затем перенесении супернатантов в полипропиленовые пробирки с доведением деионизованной водой до объема 10 см³, определении содержания общего мышьяка в 5 см³ отобранного образца супернатанта, разделении мышьяка на органическую и неорганическую фракции в 3 см³ оставшегося количества отобранного образца при помощи проведения твердофазной экстракции с использованием SPE-картриджей с сильной анионообменной неподвижной фазой, минерализации аликвот образцов фракций общего, органического и неорганического мышьяка с дальнейшим определением количества общего мышьяка, отличающийся тем, что дополнительно во время проведения экстракции образец подвергают ручному встряхиванию пробирки через каждые 10 мин, а определение количества общего мышьяка, органического и неорганического мышьяка проводят на квадрупольном масс-спектрометре с индуктивно связанной плазмой ICP-MS автоматически.