СПОСОБ ПРОБОПОДГОТОВКИ БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБРАЗЦОВ ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЙОДА Российский патент 2023 года по МПК G01N25/48 G01N33/02 G01N33/49 G01N33/493 G01N33/50 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам пробоподготовки биологических образцов для дальнейшего определения йода и может быть использовано в химической, медицинской, фармакологической, пищевой, микробиологической промышленности при проведении анализов жидких и твердых биосубстратов, объектов окружающей среды, пищевых продуктов.

Уровень техники

Йод является одним из важнейших для человека и животных микроэлементом. Его дефицит, как и избыток, может быть опасен для здоровья. Оценка содержания йода в организме, продуктах питания, лекарственных препаратах, объектах окружающей среды являются важной задачей в аналитической химии. Большинство аналитических методов неприменимы к нативному образцу и требуют пробоподготовки. Она помогает повысить скорость анализа, точность, чувствительность и воспроизводимость получаемых результатов, снизить пределы обнаружения определяемых аналитов и погрешность.

Из уровня техники известен способ пробоподготовки для определения йода в биологических жидкостях, например, крови, моче, слюне титриметрическим методом (Патент на изобретение RU 2164214 C1), основанный на предварительной фильтрации пробы через колонку с сорбентом, добавлению к фильтрату серной кислоты и бромной воды. Далее смесь при перемешивании кипятят, охлаждают и титруют тиосульфатом натрия.

К недостаткам известного способа относится использование токсичных реактивов (бромная вода) и возможность потерь йода при фильтровании и кипячении. Кроме того, данный способ неприменим для определения йода в твердом материале.

Известен способ пробоподготовки образцов для определения в них йода электрохимическим способом (Патент на изобретение RU 2206086 C1). Способ включает смачивание при комнатной температуре исследуемой пробы раствором карбоната калия в течение 16 часов. Затем образец нагревают до 150-250°С до прекращения выделения дыма, накрывают крышкой и выдерживают в муфельной печи при 250°С в течение 30 минут. Затем температуру поднимают до 500-550°С и продолжают прокаливать пробу до полного сжигания образца. После чего определение количества йода проводят инверсионно-вольтамперометрическим методом с использованием фонового электролита, содержащий нитрат ртути, а в качестве электрода используется ртутный электрод, либо из другого материала, на поверхности которого можно создать слой ртути.

К недостаткам способа относится длительная, более 17 часов, пробоподготовка, использование металлической ртути и ртутьсодержащих растворов, которые представляют угрозу как для здоровья человека, так и для окружающей среды, дополнительные работы для подготовки и очистки электродов, возможность потери йода при озолении.

Известен способ подготовки органического вещества для определения в нем количества йода (Патент на изобретение RU 2209764 C2), основанный на озолении измельченной пробы с поташем при 105-110°С, дальнейшем озолении при 500-550°С с последующим экстрагированием, фильтрацией, выпариванием и сушкой.

К недостаткам способа можно отнести длительную пробоподготовку – более 25 часов, возможность потерь йода при многократных циклах нагрева – охлаждения в негерметичных сосудах.

Известен способ пробоподготовки различных биологических материалов (сыворотка крови, молоко, растения, биоптаты мягких тканей и т.д.) для определения общего йода с использованием метода масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ИСП-МС) (Peter Schramel, Sylvia Hasse. Iodine determination in Biological materials by ICP-MS // Microchim. Acta 1994 V. 116, P. 205-209). Для этого навеску исследуемого материала сжигают в специальной колбе на платиновой проволоке, а продукты горения растворяют в 0,1 М растворе гидроксида натрия и в полученном растворе измеряют содержание йода, используя масс-спектрометр с ИСП с предварительной калибровкой по йоду. При анализе жидких образцов предлагается либо произвести простое разбавление раствором гидроксида натрия, либо пропитать фильтровальную бумагу исследуемым образцом и проводить анализ описанным выше методом, предварительно измерив фоновый сигнал йода фильтровальной бумаги.

К недостаткам способа можно отнести трудоемкость пробоподготовки за счет стадии сжигания, возможность частичной потери образца. Использование достаточно высокой концентрации гидроксида натрия при поглощении продуктов горения или при разбавлении дает высокий общий уровень минерализации проб (не менее 4 г/л), что негативно влияет на срок службы масс-спектрометра и требует более частого сервисного обслуживания для поддержки низких пределов обнаружения.

Известен способ пробоподготовки крови для определения редкоземельных элементов: иттрия, лантана, церия, празеодима, неодима, самария, европия, гадолиния, тербия, диспрозия, гольмия, эрбия, тулия, иттербия и лютеция (Патент на изобретение RU 2696011 C1) методом ИСП-МС, в котором к образцу крови добавляют концентрированную азотную кислоту, смесь нагревают в течение 25-30 минут при температуре 65-70°С, после нагрева добавляют раствор индия в качестве внутреннего стандарта и проводят 10-кратное разбавление 1%-ой азотной кислотой, после чего проводят определение металлов методом ИСП-МС.

Известен способ определения химических элементов в биологических средах (Методические указания МУК 4.1.1483-03 «Определение химических элементов в биологических средах и препаратах методами атомно-эмиссионной спектрометрии с индуктивно связанной плазмой и масс-спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой», утвержденные Минздравом РФ, 2003 г.), согласно которому образец (волосы, ногти, кровь, плазма, грудное молоко, моча, аутопсийные материалы, слюна, зубы и в препаратах аминокислот, поливитаминных препаратов с микроэлементами, биологически активных добавках к пище и в сырье для их изготовления) массой 0,01-0,5 г помещают в герметично закрывающийся фторпластовый сосуд, добавляют 5 мл азотной кислоты, 100 мкл раствора 10 мг/л индия или родия в качестве внутреннего стандарта и помещают сосуд в микроволновую печь с режимом нагрева до 200°С в течение 5 минут и выдерживанием в течение 5 минут при 200°С. После охлаждения из реакционной смеси отбирается аликвотная часть 0,1-0,5 мл и доводится до 10 мл 0,5%-ной азотной кислотой. Полученный раствор анализируют на ИСП-МС и определяют 38 элементов (серебро, алюминий, мышьяк, золото, барий, бериллий, висмут, бор, кальций, кадмий, кобальт, хром, медь, железо, галлий, германий, ртуть, калий, литий, магний, марганец, молибден, натрий, никель, свинец, платина, рубидий, фосфор, сурьма, селен, олово, стронций, титан, таллий, ванадий, вольфрам, цинк, цирконий).

Однако вышеупомянутые способы не позволяют количественно определить содержание йода ввиду его высокой летучести с использованием данных условий пробоподготовки.

Наиболее близким по техническому решению и достигаемым результатам является способ пробоподготовки крови для количественного определения йода в сыворотке крови человека методом ИСП-МС (Sören Meyer, Mariya Markova, Gabriele Pohl, Talke A. Marschall, Olga Pivovarova, Andreas F.H. Pfeiffer, Tanja Schwerdtle. Development, validation and application of an ICP-MS/MS method to quantify minerals and (ultra-)trace elements in human serum // Journal of Trace Elements in Medicine and Biology 2018 V. 49, P. 157-163), в котором 25 мкл сыворотки крови разбавляли 0,1 Н раствором NaOH, содержащий родий с концентрацией 1 мкг/л в качестве внутреннего стандарта, до объема 1 мл. В таких условиях белки не выпадают в осадок и этот раствор непосредственно анализировали на масс-спектрометре с ИСП для количественного определения йода. Для снижения пределов обнаружения, другие элементы (магний, кальций, железо, медь, цинк, молибден и селен) определяли, минерализуя образец 200 мкл сыворотки крови нагреванием с 250 мкл азотной кислоты и 250 мкл перекиси водорода в течение 30 минут, после чего производили 3-кратное разбавление и проводили элементный анализ методом ИСП-МС.

К недостаткам способа можно отнести необходимость использования двух различных пробоподготовок для анализа одного образца, необходимость использования раствора гидроксида натрия высокой концентрации, что дает высокий конечный уровень общей минерализации проб (не менее 6 г/л), что негативно влияет на срок службы масс-спектрометра и требует более частого сервисного обслуживания для поддержки низких пределов обнаружения.

Технической проблемой, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является высокий уровень общей минерализации пробы (не менее 6 г/л) в результате пробоподготовки известными способами, что повышает матричный эффект, снижает чувствительность способов определения йода и повышает частоту необходимого обслуживания оборудования для элементного анализа.

Раскрытие сущности изобретения

Техническим результатом, на достижение которого направлено изобретение, является уменьшение уровня общей минерализации пробы ниже 0,3 г/л, что повышает чувствительность способов определения йода за счет снижения матричного эффекта. Кроме того, снижение уровня минерализации повышает срок службы оборудования для элементного анализа.

Технический результат достигается за счет реализации способа, включающего добавление к биологическому образцу последовательно охлажденной до -10°С и ниже концентрированной азотной кислоты, причем на 1 часть образца берут от 2,5 до 50,0 частей кислоты, и охлажденной до +4°С и ниже концентрированной перекиси водорода, причем на 1 часть образца берут от 0,5 до 10,0 частей перекиси водорода. Полученную смесь подвергают температурному разложению, при этом в течение 5-20 минут смесь нагревают до 100-120°С, затем в течение 10-30 минут выдерживают при 100-120°С, затем в течение 5-10 минут нагревают до 130-150°С, далее в течение 5-20 минут выдерживают при температуре 130-150°С, затем смесь охлаждают до 20°С.

Для перевода пробы в подходящую для дальнейшего анализа форму используется избыток сильной окислительной смеси концентрированных азотной кислоты и перекиси водорода и жесткие температурные условия (свыше 120°С) в герметичном инертном контейнере, позволяющие окислить и растворить природные органические и неорганические соединения, получив гомогенный раствор, подходящий для инструментального анализа. При этом все имеющиеся в образце формы йода окисляются до йодат-ионов, не обладающих летучестью, а углерод органических соединений окисляется до углекислого газа, что снижает общую минерализацию раствора. Чтобы исключить случайные потери молекулярного йода, который может образовываться в процессе окисления йодидов и йодорганических соединений в йодат-ион, компоненты-окислители добавляют в максимально охлажденном состоянии, что существенно снижает первоначальную скорость реакции, и сразу после добавления реагентов, сосуд плотно и герметично закрывается. Низкий уровень общей минерализации достигается за счет использования азотной кислоты и перекиси водорода, которые не увеличивают уровень общей минерализации образца, поскольку являются легколетучими компонентами, при этом окисляют углерод органических соединений в исследуемом образце до углекислого газа, что так же снижает уровень общей минерализации.

Осуществление изобретения

Способ осуществляют следующим образом. Для перевода пробы в подходящую для дальнейшего анализа форму используется избыток сильной окислительной смеси концентрированных азотной кислоты и перекиси водорода и жесткие температурные условия (свыше 120°С) в герметичном инертном контейнере, позволяющие окислить и растворить природные органические и неорганические соединения, получив гомогенный раствор, подходящий для инструментального анализа. Для этого исследуемый жидкий или твердый образец, например, сыворотку крови, мочу, биоптат мягких тканей, но не ограничиваясь ими, объемом 0,1-0,5 мл или массой 0,1-0,5 г помещают в герметично закрывающийся инертный сосуд, объем которого выбирают таким образом, чтобы итоговая реакционная смесь занимала 2,5-30,0% от объема сосуда, добавляют раствор внутреннего стандарта, например, 50 мкл раствора сульфата церия с концентрацией 10 мкМ, но не ограничиваясь им. Затем добавляют охлажденную до -10°С и ниже жидкую концентрированную азотную кислоту (массовая доля кислоты не менее 55%), на 1 часть исследуемого образца берут от 2,5 до 50,0 частей кислоты, затем добавляют охлажденную до +4°С и ниже жидкую концентрированную перекись водорода (массовая доля перекиси водорода не менее 30%), на 1 часть исследуемого образца берут от 0,5 до 10,0 частей перекиси водорода. При этом части могут представлять собой массовые или объемные части, в случае, когда образец определяется по массе, масса кислот может быть переведена в объем в соответствии с плотностью. После добавления к образцу азотной кислоты перекись водорода необходимо добавить в течение 1 минуты, чтобы избежать преждевременного начала химической реакции. Количества азотной кислоты и перекиси водорода варьируют в зависимости от плотности органической матрицы в исследуемом образце, чем плотнее матрица, тем больше кислоты и перекиси необходимо добавить. После сосуд герметично закрывают, и смесь подвергают температурному разложению (минерализации) со следующим температурным режимом: в течение 5-20 минут плавное нагревание смеси до 100-120°С, затем в течение 10-30 минут – выдерживание при 100-120°С, затем в течение 5-10 минут – плавное нагревание до 130-150°С, далее в течение 5-20 минут – выдерживание температуры 130-150°С, затем смесь охлаждают до 20°С. Предложенный температурный режим обеспечивает полное разложение образца и полную гомогенизацию реакционной смеси. В процессе минерализации, все имеющиеся в образце формы йода окисляются до йодат-ионов, не обладающих летучестью, а углерод органических соединений окисляется до углекислого газа, что снижает общий уровень минерализации раствора. Чтобы исключить случайные потери молекулярного йода, который может образовываться в процессе окисления йодидов и йодорганических соединений в йодат-ион, компоненты-окислители добавляют в охлажденном состоянии, что существенно снижает первоначальную скорость реакции, и сразу после добавления реагентов, сосуд плотно и герметично закрывается.

После минерализации отбирают аликвоту полученного раствора и разбавляют ее деионизованной водой до раствора с содержанием азотной кислоты 2-5%. Таким образом, получают итоговый, подходящий для дальнейшего инструментального анализа раствор.

Готовят калибровочные растворы йодсодержащего препарата, например, йодида калия, но не ограничиваясь им, с концентрацией йода в соответствии с возможными ожидаемыми концентрациями в исследуемом образце. Калибровочные растворы подвергаются тем же операциям, что и исследуемый образец.

Пример 1. Определение йода в сыворотке крови.

В герметично закрывающийся фторпластовый сосуд объемом 70 мл помещают 250 мкл сыворотки крови, добавляют 50 мкл раствора 10 мкМ сульфата церия в качестве внутреннего стандарта, затем добавляют 2 мл охлажденной до -18°С концентрированной (55%) азотной кислоты и 0,5 мл охлажденной до +4°С концентрированной (30%) перекиси водорода.

Сосуд герметично закрывают, и смесь подвергают микроволновому разложению в микроволновой печи Sineo Master 40 с контролем температуры: в течение 10 минут плавное нагревание до 110°С, в течение 20 минут – выдерживание при 110°С, в течение 10 минут – плавное нагревание до 150°С, в течение 10 минут – выдерживание при 150°С, охлаждение до 20°С. После охлаждения готовый для анализа раствор пробы объемом 0,5 мл переносят в пробирку автоматического пробоотборника, добавляют 3,5 мл деионизованной воды, проводят измерение содержания йода и других необходимых элементов в предварительно откалиброванном по ним масс-спектрометре.

Исходя из литературных данных о количественном содержании йода в сыворотке крови, готовят калибровочные растворы йодида калия с содержанием йода 12,5; 25,0; 43,5; 68,5; 100,0; 162,5; 212,5; 237,5; 300,0 мкг/л. Калибровочные растворы подвергаются тем же операциям, что и образец сыворотки крови.

Уровень общей минерализации в подготовленном образце составил 0,17 г/л.

Содержание йода в образце составило 46,3 мкг/л.

Пример 2. Определение йода в моче.

В герметично закрывающийся фторпластовый сосуд объемом 70 мл помещают 500 мкл мочи, добавляют 50 мкл раствора 10 мкМ сульфата церия в качестве внутреннего стандарта, затем добавляют 1,25 мл охлажденной до -10°С концентрированной (65%) азотной кислоты и 0,25 мл охлажденной до 0°С концентрированной (30%) перекиси водорода.

Сосуд герметично закрывают и смесь подвергают микроволновому разложению в микроволновой печи Sineo Master 40 с контролем температуры: в течение 5 минут плавное нагревание до 100°С, в течение 10 минут – выдерживание при 100°С, в течение 5 минут – плавное нагревание до 130°С, в течение 5 минут – выдерживание при 130°С, охлаждение до 20°С. После охлаждения готовый для анализа раствор пробы объемом 0,5 мл переносят в пробирку автоматического пробоотборника, добавляют 3,5 мл деионизованной воды, проводят измерение содержания йода и других необходимых элементов в предварительно откалиброванном по ним масс-спектрометре.

Исходя из литературных данных о количественном содержании йода в моче, готовят калибровочные растворы йодида калия с содержанием йода 12,5; 25,0; 43,5; 68,5; 100,0; 162,5; 212,5; 237,5; 300,0 мкг/л. Калибровочные растворы подвергаются тем же операциям, что и образец мочи.

Уровень общей минерализации в подготовленном образце составил 0,22 г/л.

Содержание йода в образце составило 113,9 мкг/л.

Пример 3. Определение йода в биоптате мышечной ткани.

В герметично закрывающийся фторпластовый сосуд объемом 70 мл помещают 0,1 г биоптата мышечной ткани, добавляют 50 мкл раствора 10 мкМ сульфата церия в качестве внутреннего стандарта, затем добавляют 5 мл охлажденной до -15°С концентрированной (69%) азотной кислоты и 1 мл охлажденной до -4°С концентрированной (37%) перекиси водорода.

Сосуд герметично закрывают и смесь подвергают микроволновому разложению в микроволновой печи Sineo Master 40 с контролем температуры: в течение 20 минут плавное нагревание до 120°С, в течение 30 минут – выдерживание при 120°С, в течение 10 минут – плавное нагревание до 150°С, в течение 20 минут – выдерживание при 150°С, охлаждение до 20°С. После охлаждения готовый для анализа раствор пробы объемом 0,5 мл переносят в пробирку автоматического пробоотборника, добавляют 3,5 мл деионизованной воды, проводят измерение содержания йода и других необходимых элементов в предварительно откалиброванном по ним атомно-эмиссионном спектрометре с ИСП.

Исходя из литературных данных о количественном содержании йода в мышечной ткани, готовят калибровочные растворы йодида калия с содержанием йода 20; 40; 70; 100; 150; 200; 250; 400; 700; 1000 мкг/кг. Калибровочные растворы подвергаются тем же операциям, что и образец биоптата.

Уровень общей минерализации в подготовленном образце составил 0,13 г/л.

Содержание йода в образце составило 215 мкг/кг.

Изобретение относится к аналитической химии, а именно к способам пробоподготовки биологических образцов для дальнейшего определения йода. Способ пробоподготовки биологического образца для количественного определения йода включает добавление к образцу последовательно охлажденной до -10°С и ниже концентрированной азотной кислоты, причем на 1 часть образца берут от 2,5 до 50,0 частей кислоты и охлажденной до +4°С и ниже концентрированной перекиси водорода, причем на 1 часть образца берут от 0,5 до 10,0 частей перекиси водорода. Полученную смесь подвергают температурному разложению, при этом в течение 5-20 минут смесь нагревают до 100-120°С, затем в течение 10-30 минут выдерживают при 100-120°С, затем в течение 5-10 минут нагревают до 130-150°С, далее в течение 5-20 минут выдерживают при температуре 130-150°С. Затем смесь охлаждают до 20°С. Предлагаемый способ пробоподготовки биологического образца обеспечивает уменьшение уровня общей минерализации пробы ниже 0,3 г/л, что повышает чувствительность способов определения йода за счет снижения матричного эффекта и повышает срок службы оборудования для элементного анализа. 3 пр.

Способ пробоподготовки биологического образца для количественного определения йода, включающий добавление к образцу последовательно охлажденной до -10°С и ниже концентрированной азотной кислоты, причем на 1 часть образца берут от 2,5 до 50,0 частей кислоты и охлажденной до +4°С и ниже концентрированной перекиси водорода, причем на 1 часть образца берут от 0,5 до 10,0 частей перекиси водорода, полученную смесь подвергают температурному разложению, при этом в течение 5-20 минут смесь нагревают до 100-120°С, затем в течение 10-30 минут выдерживают при 100-120°С, затем в течение 5-10 минут нагревают до 130-150°С, далее в течение 5-20 минут выдерживают при температуре 130-150°С, затем смесь охлаждают до 20°С.