Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа к филовирусам: Ebolavirus и/или Marburgvirus, способ использования иммунобиологического средства Российский патент 2021 года по МПК C12N1/00 C12N15/70 C12N15/11 

Область техники

Изобретение относится к иммунологии и вирусологии и может быть использовано для создания специфического профилактического средства против заболеваний, вызванных вирусом Ebola virus (EBOV), Bundibugyo virus (BDBV), Sudan virus (SUDV), Marburg virus (MARV).

Предшествующий уровень техники

Filoviridae – это семейство РНК-содержащих вирусов, которое по современной классификации включает 6 родов: Cuevavirus, Dianlovirus, Ebolavirus, Marburgvirus, Striavirus, Thamnovirus (https://talk.ictvonline.org/ictv-reports/ictv_online_report/negative-sense-rna-viruses/mononegavirales/w/filoviridae). Из них патогенными для человека считаются 2 рода: Marburgvirus и Ebolavirus.

Род Marburgvirus включает два вида: Marburg virus (MARV) и Ravn virus (RAVV). Впервые Marburg virus был выделен в 1967 году, во время вспышки геморрагической лихорадки у работников завода по производству вакцины от полиомиелита, которые контактировали с тканями гриветов. Вспышки были зафиксированы в трех городах: г.Марбурге, г.Франкфурте и г.Белграде. В общей сложности заразился 31 человек, 7 из которых погибли. Впоследствии вспышки болезни и отдельные случаи заболевания регистрировались в Анголе, Демократической Республике Конго, Кении, Уганде и Южной Африке. Ravn virus был впервые описан в 1987 году и назван в честь датского пациента, от которого он был выделен. Оба вида Marburgvirus вызывают марбургскую геморрагическую лихорадку, которая является тяжелым заболеванием с высокой смертностью, которая в некоторых вспышках доходила до 90%. Начальные симптомы заболевания включают высокую температуру, головную боль, озноб, тошноту, рвоту, диарею, фарингит, макулопапулезную сыпь, боль в животе, конъюнктивит. В дальнейшем развивается одышка, отек, инъекция конъюнктивы, вирусная экзантема и нарастают неврологические симптомы: спутанность сознания, делирий, апатию, агрессию, энцефалит. Геморрагические симптомы появляются в конечной стадии заболевания и включают кровавый стул, экхимозы, подтекание крови из мест венепункции, слизистые и висцеральные кровотечения. Гибель больных может наступить от отека легких или мозга, гиповолемического шока, ДВС-синдрома, острой почечной недостаточности. С момента начала наблюдения было зафиксировано 466 случаев заболевания, погибло 373 человека. (https://www.cdc.gov/vhf/marburg/outbreaks/chronology.html)

Род Ebolavirus включает 6 видов: Ebola virus (EBOV), Reston virus (RESTV), Bundibugyo virus (BDBV), Sudan virus (SUDV), Taï Forest virus (TAFV), Bombali virus (BOMV). Три из них являются высокопатогенными для человека (Ebola virus, Bundibugyo virus, Sudan virus) и вызывают геморрагическую лихорадку Эбола. Это тяжелое заболевание, с острой манифестацией, без продромальных явлений. Первые симптомы включают лихорадку, головную боль, катаральные явления, миалгии. Позднее появляется неукротимая рвота, диарея, боли в животе, могут наблюдаться колющие боли в области грудной клетки, развивается обезвоживание организма, у 50% заболевших появляется геморрагическая сыпь, геморрагии в виде кожных кровоизлияний, наружных и внутренних кровотечений. С момента начала наблюдения было зафиксировано более 31 тысячи случаев заболевания, погибло более 12 тысяч человек. Самая крупная эпидемия была связанна с вирусом EBOV и произошла в 2014-2016 гг. Она затронула 5 стран Западной и Центральной Африки и унесла жизни более одиннадцати тысяч человек. SUDV стал причиной нескольких вспышек в Уганде и Южном Судане (412 погибших). BDBV, обнаруженный в 2007 году, был связан с двумя вспышками: в Демократической Республике Конго и в Уганде, и унес жизни 50 человек (https://www.cdc.gov/vhf/ebola/history/distribution-map.html).

Марбургская геморрагическая лихорадка и геморрагическая лихорадка Эбола – это зоонозные инфекции. В настоящее время считается, что естественным резервуаром филовирусов являются рукокрылые (Rousettus aegyptiacus, Mops condylurus, Chaerephon pumilus и др.), которые широко распространены в природе. Развитие сельского хозяйства приводит к тому, что человек все теснее контактирует с дикой природой, а, следовательно, в будущем можно ожидать новых эпидемий связанных с филовирусами.

В настоящее время нет разрешенных к применению профилактических препаратов против марбургской геморрагической лихорадки и ограниченное число вакцин против геморрагической лихорадки Эбола.

Известно решение согласно патенту WO 2011130627 А2, в котором для индукции иммунного ответа к филовирусам (вирус Эбола, вирус Марбург) предполагается использование аденовирусов шимпанзе, которые содержат гены различных белков данных вирусов, в том числе белок GP вируса Эбола.

Существует решение по патенту СА 2821289 А1, согласно которому для индукции иммунного ответа против филовирусов используют рекомбинантный аденовирусный вектор на основе аденовирусов 26 и 35 серотипа, которые экспрессируют антигены филовирусов.

Известно решение согласно патенту US 20100047282 А1, где в качестве вакцины против геморрагической лихорадки Эбола используют рекомбинантный аденовирус, содержащий ген гликопротеина вируса Эбола (GP).

Известно решение согласно патенту СА 2493142 С, в котором для стимуляции иммунного ответа к вирусу Эбола используют рекомбинантный вирус везикулярного стоматита (VSV), содержащий ген гликопротеина, выбранный из группы, состоящей из гликопротеина вируса лихорадки Ласса, гликопротеина вируса Марбург и гликопротеина вируса Эбола, вставленный в вирусный геном так, что данная последовательность заменила исходный ген гликопротеина VSV. Недостатком данного решения является то, что при повторной вакцинации антитела к векторной части могут снижать эффективность вакцинации.

Таким образом, в уровне техники существует потребность в разработке нового иммунобиологического средства для индукции специфического иммунитета против филовирусов на основе различных типов рекомбинантных вирусов.

Раскрытие изобретения

Технической задачей заявленного изобретения является расширение арсенала иммунобиологических средств, обеспечивающих эффективную индукцию иммунного ответа против филовирусов: рода Ebolavirus: Ebola virus (EBOV), Bundibugyo virus (BDBV), Sudan virus (SUDV), и/или филовирусов рода Marburgvirus: Marburg virus (MARV).

Технический результат заключается в создании иммунобиологического средства для индукции специфического иммунитета против вирусов Эбола и/или Марбург на основе рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа, содержащего экспрессионную кассету SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3, или SEQ ID NO:4, или SEQ ID NO:5, или SEQ ID NO:6, или SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8.

Кроме того, технический результат заключается в создании иммунобиологического средства для индукции специфического иммунитета против вирусов Эбола и/или Марбург на основе рекомбинантного аденовируса человека 5 серотипа, содержащего экспрессионную кассету SEQ ID NO:1, или SEQ ID NO:2, или SEQ ID NO:3, или SEQ ID NO:4, или SEQ ID NO:5, или SEQ ID NO:6, или SEQ ID NO:7, или SEQ ID NO:8.

А также, технический результат заключается в создании иммунобиологического средства для индукции специфического иммунитета против вирусов Эбола и/или Марбург на основе рекомбинантного вируса везикулярного стоматита, содержащего нуклеиновую кислоту, соответствующую кДНК SEQ ID NO:9 или SEQ ID NO:10, или SEQ ID NO:11, или SEQ ID NO:12, или SEQ ID NO:13, или SEQ ID NO:14, или SEQ ID NO:15, или SEQ ID NO:16.

Кроме того, был разработан способ использования иммунобиологического средства, заключающийся в его введении в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета против вируса Эбола и/или вируса Марбург.

Также был разработан способ использования, который предусматривает последовательное введение в организм млекопитающих любого из иммунобиологических средств с интервалом более чем в 1 неделю.

Другой вариант использования предусматривает одновременное введение в организм млекопитающих нескольких иммунобиологических средств.

При этом разработанные варианты иммунобиологического средства могут вводиться интраназально и/или подкожно и/или внутримышечно.

Также был разработан вариант способа использования, заключающийся во введении в организм млекопитающих композиции, содержащей любое количество иммунобиологических средств. При этом композиция может вводиться многократно с интервалом более 1 недели.

Реализация изобретения

Гликопротеин (GP) – единственный белок, расположенный на поверхности вириона филовирусов. Он необходим для прикрепления вирусной частицы к клетке и последующей интернализации. Было показано, что GP является мишенью для вируснейтрализующих антител, а титры антител к GP коррелируют с защитой от заболевания. Все это делает его одним из самых перспективных вакцинных антигенов.

Гликопротеин филовируса (GP) синтезируется в виде предшественника GP0, который расщепляется фурином на GP1 и GP2. GP1 содержит рецептор-связывающий домен, гликановый кэп и сильно гликозилированный муцинподобный домен. GP2 включает трансмембранный домен, гибридный пептид и гептадные повторы, необходимые для слияния вируса с клеточной мембраной. GP1 и GP2 соединяются дисульфидной связью и образуют гетеродимер. Затем гетеродимеры GP1/GP2 собираются в тример, образующий шипы на поверхности вириона.

При этом муцинподобный домен характеризуется высокой вариабельностью. Для того, чтобы в результате вакцинации получить антитела к более консервативным эпитопам, из гена гликопротеина филовирусов удалили последовательность, кодирующую муцинподобный домен (GPΔmuc).

На основе генов GP филовирусов (Ebola virus (EBOV), Bundibugyo virus (BDBV), Sudan virus (SUDV), Marburg virus (MARV)) и их модификаций было предложено несколько вариантов экспрессионных кассет для аденовирусных векторов:

1) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:1, которая содержит:

- CMV промотор,

- полноразмерный ген GP Ebola virus (EBOV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ». Изменение последовательности гена GP было выполнено в соответствии с имеющимися в литературе данными о том, что в данном месте образуется петля, которая является сложной структурой для прохождения ферментом полимеразой,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

2) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:2, которая содержит:

- CMV промотор,

- модифицированный ген GPΔmuc Ebola virus (EBOV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

3) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:3, которая содержит:

- CMV промотор,

- полноразмерный ген GP Bundibugyo virus (BDBV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ»,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

4) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:4, которая содержит:

- CMV промотор,

- модифицированный ген GPΔmuc Bundibugyo virus (BDBV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

5) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:5, которая содержит:

- CMV промотор,

- полноразмерный ген GP Sudan virus (SUDV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ»,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

6) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:6, которая содержит:

- CMV промотор,

- модифицированный ген GPΔmuc Sudan virus (SUDV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

7) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:7, которая содержит:

- CMV промотор,

- полноразмерный ген GP Marburg virus (MARV),

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

8) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:8, которая содержит:

- CMV промотор,

- модифицированный ген GPΔmuc Marburg virus (MARV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

Кроме того, было предложено несколько вариантов дискретных транскрипционных единиц для рекомбинантного вируса везикулярного стоматита:

1) Транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:9), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- полноразмерный ген GP Ebola virus (EBOV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ». Изменение последовательности гена GP было выполнено в соответствии с имеющимися в литературе данными о том, что в данном месте образуется петля, которая является сложной структурой для прохождения ферментом полимеразой,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

2) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:10), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- модифицированный ген GPΔmuc Ebola virus (EBOV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

3) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:11), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- полноразмерный ген GP Bundibugyo virus (BDBV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ»,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

4) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:12), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- модифицированный ген GPΔmuc Bundibugyo virus (BDBV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

5) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:13), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- полноразмерный ген GP Sudan virus (SUDV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ»,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

6) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:14), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- модифицированный ген GPΔmuc Sudan virus (SUDV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

7) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:15), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- полноразмерный ген GP Marburg virus (MARV),

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

8) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:16), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- модифицированный ген GPΔmuc Marburg virus (MARV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

В качестве экспрессионных векторов были выбраны рекомбинантные аденовирусы человека 5-го и 26-го серотипов и вектор на основе вируса везикулярного стоматита, которые способны индуцировать устойчивый Т-клеточный и гуморальный ответ, а также показывают высокие профили безопасности.

Таким образом были разработаны варианты иммунобиологического средства для индукции иммунного ответа к филовирусам, который обеспечивают индукцию иммунного ответа к эпидемиологически значимым видам филовирусов.

Осуществление изобретения подтверждается следующими примерами.

Пример 1.

Разработка дизайна экспрессионных кассет.

На первом этапе работы производили выбор последовательности гена GP для каждого филовируса (Ebola virus, Bundibugyo virus, Sudan virus, Marburg virus) отдельно. Для анализа использовали последовательности, опубликованные в открытых базах данных. На основании нуклеотидной последовательности получали аминокислотную последовательность. Далее подсчитывали вариабельность аминокислот в каждой позиции и определяли консенсусную (консервативную) аминокислотную последовательность, которую затем сравнивали с полными последовательностями GP данного филовируса. По результатам проведенного исследования было определено, что самая близкая к консенсусной аминокислотная последовательность для Ebola virus (EBOV) - ID AIG 95977, для Bundibugyo virus (BDBV) - ID AGL73460, для Sudan virus (SUDV) - ID AGB56678, для Marburg virus (MARV) - ID AFV31307. Далее из аминокислотной последовательности получили нуклеотидную последовательность GP-EBOV, GP-BDBV, GP-SUDV, GP-MARV. Затем были разработаны модификации гена GP с удаленной последовательностью, кодирующей муцинподобный домен: GPΔmuc-EBOV, GPΔmuc-BDBV, GPΔmuc-SUDV, GPΔmuc-MARV.

Таким образом был разработан дизайн экспрессионных кассет для аденовирусных рекомбинантных векторов:

1) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:1, которая содержит:

- CMV промотор,

- полноразмерный ген GP Ebola virus (EBOV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ». Изменение последовательности гена GP было выполнено в соответствии с имеющимися в литературе данными о том, что в данном месте образуется петля, которая является сложной структурой для прохождения ферментом полимеразой,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

2) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:2, которая содержит:

- CMV промотор,

- модифицированный ген GPΔmuc Ebola virus (EBOV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

3) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:3, которая содержит:

- CMV промотор,

- полноразмерный ген GP Bundibugyo virus (BDBV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ»,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

4) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:4, которая содержит:

- CMV промотор,

- модифицированный ген GPΔmuc Bundibugyo virus (BDBV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

5) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:5, которая содержит:

- CMV промотор,

- полноразмерный ген GP Sudan virus (SUDV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ»,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

6) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:6, которая содержит:

- CMV промотор,

- модифицированный ген GPΔmuc Sudan virus (SUDV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

7) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:7, которая содержит:

- CMV промотор,

- полноразмерный ген GP Marburg virus (MARV),

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

8) Экспрессионная кассета SEQ ID NO:8, которая содержит:

- CMV промотор,

- модифицированный ген GPΔmuc Marburg virus (MARV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен,

- сигнал полиаденилирования вируса SV40.

Кроме того, было предложено несколько вариантов дискретных транскрипционных единиц для рекомбинантного вируса везикулярного стоматита:

1) Транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:9), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- полноразмерный ген GP Ebola virus (EBOV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ». Изменение последовательности гена GP было выполнено в соответствии с имеющимися в литературе данными о том, что в данном месте образуется петля, которая является сложной структурой для прохождения ферментом полимеразой,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

2) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:10), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- модифицированный ген GPΔmuc Ebola virus (EBOV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

3) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:11), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- полноразмерный ген GP Bundibugyo virus (BDBV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ»,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

4) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:12), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- модифицированный ген GPΔmuc Bundibugyo virus (BDBV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

5) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:13), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- полноразмерный ген GP Sudan virus (SUDV), который был модифицирован путем замены последовательности «АСТАААААААССТ» на «АСТААААААААССТ»,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

6) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:14), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- модифицированный ген GPΔmuc Sudan virus (SUDV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен и последовательность «АСТАААААААССТ» заменена на «АСТААААААААССТ»,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

7) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:15), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- полноразмерный ген GP Marburg virus (MARV),

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

8) Дискретная транскрипционная единица (соответствующая кДНК SEQ ID NO:16), которая содержит:

- сайт инициации транскрипции,

- модифицированный ген GPΔmuc Marburg virus (MARV), в котором удалена последовательность, кодирующая муцинподобный домен,

- сигнал для терминации и полиаденилирования.

Синтез генов осуществлялся компанией ЗАО «Евроген» (Москва).

Пример 2.

Способ получения иммунобиологического средства на основе аденовируса человека 26 серотипа.

На первом этапе с помощью методов генной инженерии были получены плазмиды pAd26-Ends-GP-EBOV, pAd26-Ends-GPΔmuc-EBOV, pAd26-Ends-GP-BDBV, pAd26-Ends-GPΔmuc-BDBV, pAd26-Ends-GP-SUDV, pAd26-Ends-GPΔmuc-SUDV, pAd26-Ends-GP-MARV, pAd26-Ends-GPΔmuc-MARV, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, соответственно, а также несущие плечи гомологии генома аденовируса 26-го серотипа. После этого, полученные конструкции линеаризовали по уникальному сайту гидролиза между плечами гомологии, каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pAd26-too, который содержит геном аденовируса человека 26-го серотипа с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа (на месте ORF6 аденовируса человека 26 серотипа) и с делецией E1 и Е3-областей. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pAd26-too-GP-EBOV, pAd26-too-GPΔmuc-EBOV, pAd26-too-GP-BDBV, pAd26-too-GPΔmuc- BDBV, pAd26-too-GP-SUDV, pAd26-too-GPΔmuc-SUDV, pAd26-too-GP-MARV, pAd26-too-GPΔmuc-MARV, несущие геном рекомбинантного аденовируса человека 26 серотипа с открытой рамкой считывания ORF6 аденовируса человека 5-го серотипа (на месте ORF6 аденовируса человека 26 серотипа) и с делецией E1 и Е3-областей, с экспрессионной кассетой SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, соответственно.

Далее, полученные плазмиды гидролизовали специфическими эндонуклеазами рестрикции для удаления векторной части. Полученными препаратами ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293. В результате был получен материал, который затем был использован для накопления препаративных количеств рекомбинантных аденовирусов.

Таким образом, иммунобиологическое средство по варианту 1 представляет собой рекомбинантный аденовирус человека 26 серотипа, содержащий экспрессионную кассету SEQ ID NO:1 (Ad26-GP-EBOV), или SEQ ID NO:2 (Ad26-GPΔmuc-EBOV), или SEQ ID NO:3 (Ad26-GP-BDBV), или SEQ ID NO:4 (Ad26-GPΔmuc-BDBV), или SEQ ID NO:5 (Ad26-GP-SUDV), или SEQ ID NO:6 (Ad26-GPΔmuc-SUDV), или SEQ ID NO:7 (Ad26-GP-MARV), или SEQ ID NO:8 (Ad26-GPΔmuc-MARV), находящийся в буферном растворе. При этом буферный раствор может иметь любой состав, обеспечивающий жизнеспособность и стабильность вирусных частиц и подходящий для введения в организм млекопитающих. Например, состав буферного раствора: трис (0,1831-0,3432масс. %), хлорид натрия (0,3313-0,6212 масс. %), сахароза (3,7821-7,0915 масс. %), магния хлорида гексагидрат (0,0154-0,0289 масс. %), ЭДТА (0,0029-0,0054 масс. %), полисорбат-80 (0,0378-0,0709 масс. %), этанол 95% (0,0004-0,0007 масс. %), вода остальное.

Пример 3.

Способ получения иммунобиологического средства на основе аденовируса человека 5 серотипа.

На первом этапе, с помощью методов генной инженерии были получены плазмиды pAd5-Ends-GP-EBOV, pAd5-Ends-GPΔmuc-EBOV, pAd5-Ends-GP-BDBV, pAd5-Ends-GPΔmuc-BDBV, pAd5-Ends-GP-SUDV, pAd5-Ends-GPΔmuc-SUDV, pAd5-Ends-GP-MARV, pAd5-Ends-GPΔmuc-MARV, содержащие экспрессионные кассеты SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, соответственно, а также несущие плечи гомологии генома аденовируса 5-го серотипа.

Далее полученные конструкции лианеризовали по уникальному сайту гидролиза между плечами гомологи, каждую плазмиду смешивали с рекомбинантным вектором pAd5-too, который содержит геном аденовируса человека 5-го серотипа с делецией E1 и Е3 областей генома. В результате гомологичной рекомбинации были получены плазмиды pAd5-too-GP-EBOV, pAd5-too-GPΔmuc-EBOV, pAd5-too-GP-BDBV, pAd5-too-GPΔmuc-BDBV, pAd5-too-GP-SUDV, pAd5-too-GPΔmuc-SUDV, pAd5-too-GP-MARV, pAd5-too-GPΔmuc-MARV, несущие геном рекомбинантного аденовируса человека 5-го серотипа с делецей Е1 и Е3 областей и экспрессионные кассеты SEQ ID NO:1, SEQ ID NO:2, SEQ ID NO:3, SEQ ID NO:4, SEQ ID NO:5, SEQ ID NO:6, SEQ ID NO:7, SEQ ID NO:8, соответственно.

На четвертом этапе, данные плазмиды гидролизовали специфической эндонуклеазой рестрикции для удаления векторной части. Полученным препаратом ДНК трансфицировали клетки культуры НЕК293. Полученный материал был использован для накопления препаративных количеств рекомбинантных аденовирусов.

Таким образом, иммунобиологическое средство по варианту 2 представляет собой рекомбинантный аденовирус человека 5 серотипа, содержащий экспрессионную кассету SEQ ID NO:1 (Ad5-GP-EBOV), или SEQ ID NO:2 (Ad5-GPΔmuc-EBOV), или SEQ ID NO:3 (Ad5-GP-BDBV), или SEQ ID NO:4 (Ad5-GPΔmuc-BDBV), или SEQ ID NO:5 (Ad5-GP-SUDV), или SEQ ID NO:6 (Ad5-GPΔmuc-SUDV), или SEQ ID NO:7 (Ad5-GP-MARV), или SEQ ID NO:8 (Ad5-GPΔmuc-MARV), находящийся в буферном растворе. При этом буферный раствор может иметь любой состав, обеспечивающий жизнеспособность и стабильность вирусных частиц и подходящий для введения в организм млекопитающих. Например, состав буферного раствора: трис (0,1831-0,3432масс. %), хлорид натрия (0,3313-0,6212 масс. %), сахароза (3,7821-7,0915 масс. %), магния хлорида гексагидрат (0,0154-0,0289 масс. %), ЭДТА (0,0029-0,0054 масс. %), полисорбат-80 (0,0378-0,0709 масс. %), этанол 95% (0,0004-0,0007 масс. %), вода остальное.

Пример 4.

Для получения рекомбинантных вирусов везикулярного стоматита была использована плазмида pVSV-deltaG, представляющая собой кДНК, комплементарную геномной РНК вируса везикулярного стоматита с удаленным геном гликопротеина. Методами генной инженерии из данной плазмиды было получено 8 генетических конструкций: pVSV-deltaG-GP-EBOV, pVSV-deltaG-GPΔmuc-EBOV, pVSV-deltaG-GP-SUDV, pVSV-deltaG-GPΔmuc-SUDV, pVSV-deltaG-GP-BDBV, pVSV-deltaG-GPΔmuc-BDBV, pVSV-deltaG-GP-MARV, pVSV-deltaG-GPΔmuc-MARV, содержащие SEQ ID NO:9, SEQ ID NO:10, SEQ ID NO:11, SEQ ID NO:12, SEQ ID NO:13, SEQ ID NO:14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16, соответственно.

Для получения препаратов рекомбинантных вирусов везикулярного стоматита была проведена трансфекция клеток BHK21 плазмидами, несущими: ен ДНК-зависимой РНК-полимеразы бактериофага Т7; гены - N (нуклеокапсид), Р (фосфопротеин), L (большая субъединица полимеразы) белков VSV; и векторной плазмидой, выбранной из pVSV-deltaG-GP-EBOV, pVSV-deltaG-GPΔmuc-EBOV, pVSV-deltaG-GP-SUDV, pVSV-deltaG-GPΔmuc-SUDV, pVSV-deltaG-GP-BDBV, pVSV-deltaG-GPΔmuc-BDBV, pVSV-deltaG-GP-MARV, pVSV-deltaG-GPΔmuc-MARV. Трансфекцию проводили с помощью реагента Lipofectamine-2000 (Life Technologies) согласно инструкции производителя. Таким образом, было получено 8 препаратов рекомбинантного вируса везикулярного стоматита.

Таким образом, иммунобиологическое средство по варианту 3 представляет собой рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий последовательность, соответствующую кДНК SEQ ID NO:9 (VSV-GP-EBOV), или SEQ ID NO:10 (VSV-GPΔmuc-EBOV), или SEQ ID NO:11 (VSV-GP-BDBV), или SEQ ID NO:12 (VSV-GPΔmuc-BDBV), или SEQ ID NO:13 (VSV-GP-SUDV), или SEQ ID NO:14 (VSV-GPΔmuc-SUDV), или SEQ ID NO:15 (VSV-GP-MARV), или SEQ ID NO:16 (VSV-GPΔmuc-MARV), находящийся в буферном растворе. При этом буферный раствор может иметь любой состав, обеспечивающий жизнеспособность и стабильность вирусных частиц и подходящий для введения в организм млекопитающих. Например, состав буферного раствора: трис(гидроксиметил)аминометан - 0,4-0,7 мг, ЭДТА динатриевая соль - 0,1-0,2 мг, сахароза – 30-70 мг, вода для инъекций до 0,5 мл.

Пример 5.

Проверка безопасности разработанных вариантов иммунобиологического средства.

Целью данного эксперимента являлась проверка токсичности разработанного средства при однократном введении (острая токсичность) на мышах при и внутримышечном введении.

В исследовании были использованы аутбредные мыши, обоих полов, массой 18-20 грамм, возрастом 6-8 недель.

Минимальной дозой для токсикологических экспериментов была выбрана доза для мыши 10⁸в.ч., как наиболее близкая к терапевтической. Для пересчета доз не использовался коэффициент межвидового пересчета, дозы получены путем прямого пересчета на массу тела, согласно рекомендация ВОЗ для вакцинных препаратов.

В результате, для введения мышам в данном эксперименте выбрали следующие дозы средства: 

10⁹в.ч. – увеличенная эффективная доза (ЭД) для мышей в 20 раз; 

10¹⁰в.ч. – увеличенная ЭД для мышей в 200 раз; 

10¹¹в.ч. – увеличенная ЭД для мышей в 2000 раз;

Таким образом, были получены следующие экспериментальные группы животных:

1) Ad26-GP-EBOV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

2) Ad26-GP-EBOV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

3) Ad26-GP-EBOV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

4) Ad26-GPΔmuc-EBOV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

5) Ad26-GPΔmuc-EBOV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

6) Ad26-GPΔmuc-EBOV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

7) Ad26-GP-BDBV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

8) Ad26-GP-BDBV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

9) Ad26-GP-BDBV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

10) Ad26-GPΔmuc-BDBV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

11) Ad26-GPΔmuc-BDBV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

12) Ad26-GPΔmuc-BDBV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

13) Ad26-GP-SUDV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

14) Ad26-GP-SUDV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

15) Ad26-GP-SUDV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

16) Ad26-GPΔmuc-SUDV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

17) Ad26-GPΔmuc-SUDV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

18) Ad26-GPΔmuc-SUDV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

19) Ad26-GP-MARV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

20) Ad26-GP-MARV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

21) Ad26-GP-MARV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

22) Ad26-GPΔmuc-MARV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

23) Ad26-GPΔmuc-MARV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

24) Ad26-GPΔmuc-MARV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

25) Ad5-GP-EBOV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

26) Ad5-GP-EBOV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

27) Ad5-GP-EBOV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

28) Ad5-GPΔmuc-EBOV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

29) Ad5-GPΔmuc-EBOV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

30) Ad5-GPΔmuc-EBOV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

31) Ad5-GP-BDBV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

32) Ad5-GP-BDBV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

33) Ad5-GP-BDBV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

34) Ad5-GPΔmuc-BDBV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

35) Ad5-GPΔmuc-BDBV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

36) Ad5-GPΔmuc-BDBV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

37) Ad5-GP-SUDV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

38) Ad5-GP-SUDV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

39) Ad5-GP-SUDV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

40) Ad5-GPΔmuc-SUDV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

41) Ad5-GPΔmuc-SUDV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

42) Ad5-GPΔmuc-SUDV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

43) Ad5-GP-MARV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

44) Ad5-GP-MARV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

45) Ad5-GP-MARV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

46) Ad5-GPΔmuc-MARV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

47) Ad5-GPΔmuc-MARV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

48) Ad5-GPΔmuc-MARV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

49) VSV-GP-EBOV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

50) VSV -GP-EBOV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

51) VSV -GP-EBOV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

52) VSV -GPΔmuc-EBOV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

53) VSV -GPΔmuc-EBOV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

54) VSV -GPΔmuc-EBOV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

55) VSV -GP-BDBV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

56) VSV -GP-BDBV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

57) VSV -GP-BDBV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

58) VSV -GPΔmuc-BDBV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

59) VSV -GPΔmuc-BDBV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

60) VSV -GPΔmuc-BDBV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

61) VSV -GP-SUDV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

62) VSV -GP-SUDV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

63) VSV -GP-SUDV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

64) VSV -GPΔmuc-SUDV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

65) VSV -GPΔmuc-SUDV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

66) VSV -GPΔmuc-SUDV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

67) VSV -GP-MARV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

68) VSV -GP-MARV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

69) VSV -GP-MARV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

70) VSV -GPΔmuc-MARV,10⁹в.ч./мышь, 20 мышей;

71) VSV -GPΔmuc-MARV,10¹⁰в.ч./мышь, 20 мышей;

72) VSV -GPΔmuc-MARV,10¹¹в.ч./мышь, 20 мышей;

73) плацебо (буферный раствор), 20 мышей.

Клинический осмотр каждого животного проводили ежедневно в течение 14 дней, регистрируя признаки интоксикации и число павших животных.

Фиксировали следующие параметры функционального состояния лабораторных животных: активность, передвижение, внешний вид, состояние шерсти, глаз, ушей, зубов, конечностей. Физиологические функции: дыхание, слюноотделение, слюна, моча, экскрет. -На протяжении эксперимента все животные оставались живы. Во всех группах животные выглядели здоровыми, активно поедали корм, адекватно реагировали на раздражители, проявляли исследовательский интерес. Шерстный покров густой, ровный и блестящий, плотно прилегал к поверхности тела, выпадения или ломкости шерсти не выявлено. Мышечный тонус не отличался повышенной возбудимостью. Ушные раковины без корок, не воспалены, подергиваний не замечено. Зубы обычного цвета, без поломок. Мыши были средней упитанности, истощением не страдали. Область живота в объеме не увеличена. Дыхание ровное, незатрудненное. Слюноотделение в норме. Частота мочеиспускания, цвет мочи, желудочно-кишечные показатели, мышечный тонус, рефлексы соответствовали физиологической норме. Поведение опытных животных не отличалось от контрольных.

На 14 сутки от начала эксперимента, осуществляли запланированную эвтаназию мышей методом дислокации шейных позвонков. В ходе проведения исследования животные в тяжелом состоянии с признаками неминуемой смерти не наблюдались, гибели животных не было.

Проводили полную некропсию тел всех животных. При некропсии исследовали внешнее состояние тела, внутренние поверхности и проходы, полость черепа, грудную, брюшную и тазовую полости с находящимися в них органами и тканями, шею с органами и тканями и скелетно-мышечную систему.

При макроскопическом исследовании не обнаружено влияния средства на состояние внутренних органов мышей, различий между контрольными и опытными группами не найдено. Cтатистически достоверных различий в массе органов между опытными и контрольной группами не обнаружено. Набор массы животных в опытных и контрольных группах не отличался.

Таким образом, в ходе проведенной работы определяли безопасность разработанных средств путем оценки острой токсичности. Исходя из полученных данных можно заключить, что все разработанные иммунобиологические средства безопасны.

Пример 6.

Проверка иммуногенности вариантов иммунобиологического средства, содержащих ген гликопротеина Ebola virus или его производные.

Целью данного эксперимента являлось определение эффективности иммунизации вариантами разработанного иммунобиологического средства по оценке гуморального иммунного ответа. Напряженность гуморального иммунного ответа у иммунизированных животных оценивали по продукции гликопротеин-специфических антител класса IgG в сыворотке крови.

В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на группы по 7 животных, которым внутримышечно вводили разработанное иммунобиологическое средство в дозе 10¹⁰ вирусных частиц/мышь. Контрольным животным вводили рекомбинантные вирусы (Ad26-null, Ad5-null, VSV-null), не содержащие гена GP Ebola virus или буферный раствор.

Таким образом, были получены следующие группы животных:

1) Ad26-GP-EBOV;

2) Ad26-GPΔmuc-EBOV;

3) Ad26-null;

4) Ad5-GP-EBOV;

5) Ad5-GPΔmuc-EBOV;

6) Ad5-null;

7) VSV-GP-EBOV;

8) VSV-GPΔmuc-EBOV;

9) VSV-null;

10) Буферный раствор.

Оценка титра антител к GP Ebola virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных проводилась на 21-й день после иммунизации методом ИФА.

Для иммуноферментного анализа антиген (GP Ebola virus), разведенный в карбонат-бикарбонатном буфере (КББ) (pH 9,6), наносили на 96-луночный планшет в количестве 100 нг на лунку. Планшет инкубировали при +4 ^oС в течение ночи.

На следующий день планшет промывали раствором ТФСБ (Твин 20 - фосфатно-солевой буфер: на 1 л дистиллированной воды 8,00 г NaCl, 0,20 г KCl, 1,44 г Na₂HPO₄, 0,24 г KH₂PO₄, Твин 20 0,1%) в объеме 230 мкл на лунку 5 раз. Далее для избавления от неспецифического связывания проводили обработку планшета ИФА-буфером (ХЕМА, Россия), в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37^oС в течение часа. Планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 230 мкл на лунку 4 раза.

Затем добавляли сыворотки периферической крови мышей в различных разведениях в растворе ИФА-буфера и снова инкубировали час при тех же условиях.

Затем планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 200 мкл на лунку 5 раз, чтобы удалить несвязавшиеся антитела. Далее добавляли вторичные антитела, специфичные к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, разведенные в ИФА-буфере в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37^oС на протяжении часа.

Далее планшет снова промывали раствором ТФСБ 5 раз. После этого в лунки добавили TMB в объеме 100 мкл на лунку и выдерживали в темноте до приобретения раствором голубого цвета 15 минут. Далее останавливали реакцию добавлением 50 мкл 4М серной кислоты и проводили измерение оптической плотности на планшетном спектрофотометре при длине волны света 450 нм.

Результаты эксперимента представлены в таблице 1.

Таблица 1. Титр антител к GP Ebola virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 1

№ Название группы животных Титр антител 1 Ad26-GP-EBOV 220,8 2 Ad26-GPΔmuc-EBOV 243,8 3 Ad26-null 0 4 Ad5-GP-EBOV 7801,7 5 Ad5-GPΔmuc-EBOV 8613,8 6 Ad5-null 0 7 VSV-GP-EBOV 7066,2 8 VSV-GPΔmuc-EBOV 8613,8 9 VSV-null 0 10 Буферный раствор 0

Как видно из представленных результатов все испытуемые варианты разработанного иммунобиологического средства обеспечивают развитие гуморального иммунного ответа к гликопротеину Ebola virus.

Пример 7.

Проверка иммуногенности вариантов иммунобиологического средства, содержащих ген гликопротеина Bundibugyo virus или его производные.

Целью данного эксперимента являлось определение эффективности иммунизации вариантами разработанного иммунобиологического средства по оценке гуморального иммунного ответа. Напряженность гуморального иммунного ответа у иммунизированных животных оценивали по продукции гликопротеин-специфических антител класса IgG в сыворотке крови.

В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на группы по 7 животных, которым внутримышечно вводили разработанное иммунобиологическое средство в дозе 10¹⁰ вирусных частиц/мышь. Контрольным животным вводили рекомбинантные вирусы (Ad26-null, Ad5-null, VSV-null), не содержащие гена GP Bundibugyo virus или буферный раствор.

Таким образом, были получены следующие группы животных:

1) Ad26-GP-BDBV;

2) Ad26-GPΔmuc- BDBV;

3) Ad26-null;

4) Ad5-GP- BDBV;

5) Ad5-GPΔmuc- BDBV;

6) Ad5-null;

7) Буферный раствор.

Оценка титра антител к GP Bundibugyo virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных проводилась на 21-й день после иммунизации методом ИФА.

Для иммуноферментного анализа антиген (GP Bundibugyo virus), разведенный в карбонат-бикарбонатном буфере (КББ) (pH 9,6), наносили на 96-луночный планшет в количестве 100 нг на лунку. Планшет инкубировали при +4 ^oС в течение ночи.

На следующий день планшет промывали раствором ТФСБ (Твин 20 - фосфатно-солевой буфер: на 1 л дистиллированной воды 8,00 г NaCl, 0,20 г KCl, 1,44 г Na₂HPO₄, 0,24 г KH₂PO₄, Твин 20 0,1%) в объеме 230 мкл на лунку 5 раз. Далее для избавления от неспецифического связывания проводили обработку планшета ИФА-буфером (ХЕМА, Россия), в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37^oС в течение часа. Планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 230 мкл на лунку 4 раза.

Затем добавляли сыворотки периферической крови мышей в различных разведениях в растворе ИФА-буфера и снова инкубировали час при тех же условиях.

Затем планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 200 мкл на лунку 5 раз, чтобы удалить несвязавшиеся антитела. Далее добавляли вторичные антитела, специфичные к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, разведенные в ИФА-буфере в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37^oС на протяжении часа.

Далее планшет снова промывали раствором ТФСБ 5 раз. После этого в лунки добавили TMB в объеме 100 мкл на лунку и выдерживали в темноте до приобретения раствором голубого цвета 15 минут. Далее останавливали реакцию добавлением 50 мкл 4М серной кислоты и проводили измерение оптической плотности на планшетном спектрофотометре при длине волны света 450 нм.

Результаты эксперимента представлены в таблице 2.

Таблица 2. Титр антител к GP Bundibugyo virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 2

№ Название группы животных Титр антител 1 Ad26-GP-BDBV 220,8 2 Ad26-GPΔmuc- BDBV 441,6 3 Ad26-null 0 4 Ad5-GP- BDBV 2898,3 5 Ad5-GPΔmuc- BDBV 1076,7 6 Ad5-null 0 7 Буферный раствор 0

Как видно из представленных результатов все испытуемые варианты разработанного иммунобиологического средства обеспечивают развитие гуморального иммунного ответа к гликопротеину Bundibugyo virus.

Пример 8.

Проверка иммуногенности вариантов иммунобиологического средства, содержащих ген гликопротеина Sudan virus или его производные.

Целью данного эксперимента являлось определение эффективности иммунизации вариантами разработанного иммунобиологического средства по оценке гуморального иммунного ответа. Напряженность гуморального иммунного ответа у иммунизированных животных оценивали по продукции гликопротеин-специфических антител класса IgG в сыворотке крови.

В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на группы по 7 животных, которым внутримышечно вводили разработанное иммунобиологическое средство в дозе 10¹⁰ вирусных частиц/мышь. Контрольным животным вводили рекомбинантные вирусы (Ad26-null, Ad5-null, VSV-null), не содержащие гена GP Sudan virus или буферный раствор.

Таким образом, были получены следующие группы животных:

1) Ad26-GP-SUDV;

2) Ad26-GPΔmuc- SUDV;

3) Ad26-null;

4) Ad5-GP- SUDV;

5) Ad5-GPΔmuc- SUDV;

6) Ad5-null;

7) VSV-GP- SUDV;

8) VSV-GPΔmuc- SUDV;

9) VSV-null;

10) Буферный раствор.

Оценка титра антител к GP Sudan virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных проводилась на 21-й день после иммунизации методом ИФА.

Для иммуноферментного анализа антиген (GP Sudan virus), разведенный в карбонат-бикарбонатном буфере (КББ) (pH 9,6), наносили на 96-луночный планшет в количестве 100 нг на лунку. Планшет инкубировали при +4 ^oС в течение ночи.

На следующий день планшет промывали раствором ТФСБ (Твин 20 - фосфатно-солевой буфер: на 1 л дистиллированной воды 8,00 г NaCl, 0,20 г KCl, 1,44 г Na₂HPO₄, 0,24 г KH₂PO₄, Твин 20 0,1%) в объеме 230 мкл на лунку 5 раз. Далее для избавления от неспецифического связывания проводили обработку планшета ИФА-буфером (ХЕМА, Россия), в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37^oС в течение часа. Планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 230 мкл на лунку 4 раза.

Затем добавляли сыворотки периферической крови мышей в различных разведениях в растворе ИФА-буфера и снова инкубировали час при тех же условиях.

Затем планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 200 мкл на лунку 5 раз, чтобы удалить несвязавшиеся антитела. Далее добавляли вторичные антитела, специфичные к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, разведенные в ИФА-буфере в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37^oС на протяжении часа.

Далее планшет снова промывали раствором ТФСБ 5 раз. После этого в лунки добавили TMB в объеме 100 мкл на лунку и выдерживали в темноте до приобретения раствором голубого цвета 15 минут. Далее останавливали реакцию добавлением 50 мкл 4М серной кислоты и проводили измерение оптической плотности на планшетном спектрофотометре при длине волны света 450 нм.

Результаты эксперимента представлены в таблице 3.

Таблица 3.

Титр антител к GP Sudan virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 3

№ Название группы животных Титр антител 1 Ad26-GP- SUDV 220,8 2 Ad26-GPΔmuc- SUDV 181,1 3 Ad26-null 0 4 Ad5-GP- SUDV 34455,0 5 Ad5-GPΔmuc- SUDV 4306,9 6 Ad5-null 0 7 VSV-GP- SUDV 883,3 8 VSV-GPΔmuc- SUDV 800,0 9 VSV-null 0 10 Буферный раствор 0

Как видно из представленных результатов все испытуемые варианты разработанного иммунобиологического средства обеспечивают развитие гуморального иммунного ответа к гликопротеину Sudan virus.

Пример 9.

Проверка иммуногенности вариантов иммунобиологического средства, содержащих ген гликопротеина Marburg virus или его производные.

Целью данного эксперимента являлось определение эффективности иммунизации вариантами разработанного иммунобиологического средства по оценке гуморального иммунного ответа. Напряженность гуморального иммунного ответа у иммунизированных животных оценивали по продукции гликопротеин-специфических антител класса IgG в сыворотке крови.

В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на группы по 7 животных, которым внутримышечно вводили разработанное иммунобиологическое средство в дозе 10¹⁰ вирусных частиц/мышь. Контрольным животным вводили рекомбинантные вирусы (Ad26-null, Ad5-null, VSV-null), не содержащие гена GP Marburg virus или буферный раствор.

Таким образом, были получены следующие группы животных:

1) Ad26-GP-MARV;

2) Ad26-GPΔmuc- MARV;

3) Ad26-null;

4) Ad5-GP- MARV;

5) Ad5-GPΔmuc- MARV;

6) Ad5-null;

7) VSV-GP- MARV;

8) VSV-GPΔmuc- MARV;

9) VSV-null;

10) Буферный раствор.

Оценка титра антител к GP Marburg virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных проводилась на 21-й день после иммунизации методом ИФА.

Для иммуноферментного анализа антиген (GP Marburg virus), разведенный в карбонат-бикарбонатном буфере (КББ) (pH 9,6), наносили на 96-луночный планшет в количестве 100 нг на лунку. Планшет инкубировали при +4 ^oС в течение ночи.

На следующий день планшет промывали раствором ТФСБ (Твин 20 - фосфатно-солевой буфер: на 1 л дистиллированной воды 8,00 г NaCl, 0,20 г KCl, 1,44 г Na₂HPO₄, 0,24 г KH₂PO₄, Твин 20 0,1%) в объеме 230 мкл на лунку 5 раз. Далее для избавления от неспецифического связывания проводили обработку планшета ИФА-буфером (ХЕМА, Россия), в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37^oС в течение часа. Планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 230 мкл на лунку 4 раза.

Затем добавляли сыворотки периферической крови мышей в различных разведениях в растворе ИФА-буфера и снова инкубировали час при тех же условиях.

Затем планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 200 мкл на лунку 5 раз, чтобы удалить несвязавшиеся антитела. Далее добавляли вторичные антитела, специфичные к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, разведенные в ИФА-буфере в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37^oС на протяжении часа.

Далее планшет снова промывали раствором ТФСБ 5 раз. После этого в лунки добавили TMB в объеме 100 мкл на лунку и выдерживали в темноте до приобретения раствором голубого цвета 15 минут. Далее останавливали реакцию добавлением 50 мкл 4М серной кислоты и проводили измерение оптической плотности на планшетном спектрофотометре при длине волны света 450 нм.

Результаты эксперимента представлены в таблице 4.

Таблица 4. Титр антител к GP Marburg virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 4

№ Название группы животных Титр антител 1 Ad26-GP- MARV 243,8 2 Ad26-GPΔmuc- MARV 243,8 3 Ad26-null 0 4 Ad5-GP- MARV 975,2 5 Ad5-GPΔmuc- MARV 2377,6 6 Ad5-null 0 7 VSV-GP- MARV 656,3 8 VSV-GPΔmuc- MARV 883,3 9 VSV-null 0 10 Буферный раствор 0

Как видно из представленных результатов все испытуемые варианты разработанного иммунобиологического средства обеспечивают развитие гуморального иммунного ответа к гликопротеину Marburg virus.

Пример 10.

Проверка эффективности разработанных иммунобиологических средств, путем оценки их способности индуцировать вируснейтрализующие антитела к филовирусам в организме млекопитающих.

В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на группы по 5 животных, которым внутримышечно двукратно с интервалом 21 день вводили смесь из различных вариантов иммунобиологических средств.

Были сформированы следующие группы животных:

1) Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/

Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;

2) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/

Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;

3) VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/

VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;

4) Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/

Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;

5) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/

Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;

6) Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/

VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;

7) VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /

Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;

8) VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /

Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;

9) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/

VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;

10) Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/

VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc-BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV-GPΔmuc-MARV;

11) VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /

Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;

12) VSV- GPΔmuc-EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /

Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;

13) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/

VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV- GPΔmuc –SUDV, VSV- GPΔmuc -MARV;

14) Буферный раствор/ Буферный раствор.

Через 21 день после последней иммунизации у животных отбирали кровь и далее выделяли сыворотку крови.

Для проведения реакции вирус-нейтрализации использовали клеточную линию VeroE6 (клетки почки африканской зеленой мартышки). Клетки сеяли на 12-луночные планшеты в концентрации 5*10⁵ клеток на лунку за 24 часа до проведения реакции. Клетки инкубировали в СО₂-инкубаторе при t = 37ºC и 100% влажности.

Доза псевдотипированного вируса везикулярного стоматита бралась в расчете 100 БОЕ/лунку. Титр препарата псевдотипированного вируса везикулярного стоматита был заранее измерен в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 1 мл суспензии. С помощью 10-ти кратных разведений был приготовлен раствор псевдотипированного вируса везикулярного стоматита с концентрацией 100 БОЕ/100 мкл. Вирус разводили в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCl, 1мМ ЭДТА, 10 % сахарозу. Приготовленный раствор вируса был разаликвочен и хранился при -70°С. Исследуемые инактивированные сыворотки до добавления вирусных частиц разводили в фосфатно-солевом буфере. Первое разведение составляло 1:20, общий объем в каждом разведении – 100 мкл. Далее к каждому разведению вносили одинаковое число вирусных частиц псевдотипированного вируса везикулярного стоматита в объеме 100 мкл. Для образования комплекса АГ+АТ, смесь вирусных частиц и сыворотки инкубировали при t = 37ºC в течение 60 мин и затем вносили в объеме 200 мкл на лунку к клеткам VeroE6 в 12-луночный планшет. Каждое разведение ставилось в трехкратном повторе. В качестве контрольного вируса использовали разведения псевдотипированного вируса с концентрацией 100 БОЕ/100 мкл без добавления сыворотки. Клетки инкубировали при t = 37ºC в течение 2-3 часов. После инкубации среду с комплексом АГ+АТ удаляли из лунок, затем вносили 3 мл покрытия, содержащего 0,4 % агарозу разведенную в ростовой среде DMEM c 5% эмбриональной телячьей сыворотки, и оставляли на 48-96 часов в инкубаторе с 5% CO₂ при t = 37ºC и 100% влажности.

Результаты учитывали через 48-96 часов. Проводили подсчет вирусных бляшек в каждом разведении. За титр вирус-нейтрализующих антител принимали максимальное разведение сыворотки, дающее снижения вирусных бляшек более чем на 50% по сравнению с контрольным вирусом.

Результаты эксперимента представлены в таблицах 5,6,7,8.

Таблица 5. Титр вируснейтрализующих антител к VSV-GP-EBOV в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 5

№ Название группы животных Титр антител 1 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV; 139,3 2 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV 367,6 3 VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/ VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV 367,6 4 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV; 422,2 5 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV; 367,6 6 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV; 367,6 7 VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV 422,2 8 VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV; 640,0 9 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV; 640,0 10 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc-BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV-GPΔmuc-MARV; 320,0 11 VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV; 367,6 12 VSV- GPΔmuc-EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV; 485,0 13 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV- GPΔmuc -SUDV; VSV- GPΔmuc -MARV; 557,2 14 Буферный раствор/ Буферный раствор 0

Таблица 6. Титр вируснейтрализующих антител к VSV-GP-BDBV в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 6

№ Название группы животных Титр антител 1 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV; 139,3 2 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV 367,6 3 VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/ VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV 367,6 4 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV; 422,2 5 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV; 367,6 6 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV; 367,6 7 VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV 422,2 8 VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV; 640,0 9 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV; 640,0 10 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc-BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV-GPΔmuc-MARV; 320,0 11 VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV; 422,2 12 VSV- GPΔmuc-EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV; 557,2 13 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV- GPΔmuc -SUDV; VSV- GPΔmuc -MARV; 557,2 14 Буферный раствор/ Буферный раствор 0

Таблица 7. Титр вируснейтрализующих антител к VSV-GP-SUDV в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 7

№ Название группы животных Титр антител 1 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV; 160,0 2 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV 320,0 3 VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/ VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV 367,6 4 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV; 367,6 5 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV; 320,0 6 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV; 320,0 7 VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV 422,2 8 VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV; 557,2 9 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV; 640,0 10 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc-BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV-GPΔmuc-MARV; 278,6 11 VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV; 320,0 12 VSV- GPΔmuc-EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV; 557,2 13 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV- GPΔmuc -SUDV; VSV- GPΔmuc -MARV; 557,2 14 Буферный раствор/ Буферный раствор 0

Таблица 8. Титр вируснейтрализующих антител к VSV-GP-MARV в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 8

№ Название группы животных Титр антител 1 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV; 139,3 2 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV 422,2 3 VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/ VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV 367,6 4 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV; 557,2 5 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV; 367,6 6 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV; 422,2 7 VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV-GP-SUDV; VSV-GP-MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV 422,2 8 VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV-GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV; 735,2 9 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV-GP-BDBV, VSV-GP-SUDV; VSV -GP-MARV; 640,0 10 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc-BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV-GPΔmuc-MARV; 485,0 11 VSV-GPΔmuc-EBOV, VSV-GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-BDBV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV; 422,2 12 VSV- GPΔmuc-EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV-GPΔmuc-SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV; 640,0 13 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-BDBV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV- GPΔmuc -BDBV, VSV- GPΔmuc -SUDV; VSV- GPΔmuc -MARV; 640,0 14 Буферный раствор/ Буферный раствор 0

Исходя из полученных данных можно сделать вывод, что иммунизация млекопитающих разработанными иммунобиологическими средствами приводит к образованию вируснейтрализующих антител к филовирусам.

Пример 11.

Способ использования иммунобиологических средств, путем введения в организм млекопитающих композиции, состоящей из разработанных средств, для индукции иммунного ответа к филовирусам.

В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на группы по 5 животных, которым внутримышечно двукратно с интервалом 21 день вводили смесь из различных вариантов иммунобиологических средств.

Были сформированы следующие группы животных:

1) Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/

Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;

2) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/

Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;

3) VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/

VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;

4) Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/

Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;

5) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/

Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;

6) Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/

VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;

7) VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /

Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV;

8) VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /

Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV;

9) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/

VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV;

10) Ad26- GP-EBOV, Ad26- GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/

Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV;

11) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/

Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV;

12) Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/

VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV;

13) VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /

Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV;

14) VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /

Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV;

15) Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/

VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV;

16) Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/

Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV;

17) Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/

Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV;

18) Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/

VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV;

19) VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /

Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV;

20) VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /

Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV;

21) Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/

VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV;

22) Буферный раствор/ Буферный раствор.

Через 21 день после последней иммунизации у животных отбирали кровь и далее выделяли сыворотку крови.

Для проведения реакции вирус-нейтрализации использовали клеточную линию VeroE6 (клетки почки африканской зеленой мартышки). Клетки сеяли на 12-луночные планшеты в концентрации 5*10⁵ клеток на лунку за 24 часа до проведения реакции. Клетки инкубировали в СО₂-инкубаторе при t = 37ºC и 100% влажности.

Доза псевдотипированного вируса везикулярного стоматита бралась в расчете 100 БОЕ/лунку. Титр препарата псевдотипированного вируса везикулярного стоматита был заранее измерен в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 1 мл суспензии. С помощью 10-ти кратных разведений был приготовлен раствор псевдотипированного вируса везикулярного стоматита с концентрацией 100 БОЕ/100 мкл. Вирус разводили в буфере, содержащем 10 мМ Трис-HCl, 1мМ ЭДТА, 10 % сахарозу. Приготовленный раствор вируса был разаликвочен и хранился при -70°С. Исследуемые инактивированные сыворотки до добавления вирусных частиц разводили в фосфатно-солевом буфере. Первое разведение составляло 1:20, общий объем в каждом разведении – 100 мкл. Далее к каждому разведению вносили одинаковое число вирусных частиц псевдотипированного вируса везикулярного стоматита в объеме 100 мкл. Для образования комплекса АГ+АТ, смесь вирусных частиц и сыворотки инкубировали при t = 37ºC в течение 60 мин и затем вносили в объеме 200 мкл на лунку к клеткам VeroE6 в 12-луночный планшет. Каждое разведение ставилось в трехкратном повторе. В качестве контрольного вируса использовали разведения псевдотипированного вируса с концентрацией 100 БОЕ/100 мкл без добавления сыворотки. Клетки инкубировали при t = 37ºC в течение 2-3 часов. После инкубации среду с комплексом АГ+АТ удаляли из лунок, затем вносили 3 мл покрытия, содержащего 0,4 % агарозу разведенную в ростовой среде DMEM c 5% эмбриональной телячьей сыворотки, и оставляли на 48-96 часов в инкубаторе с 5% CO₂ при t = 37ºC и 100% влажности.

Результаты учитывали через 48-96 часов. Проводили подсчет вирусных бляшек в каждом разведении. За титр вирус-нейтрализующих антител принимали максимальное разведение сыворотки, дающее снижения вирусных бляшек более чем на 50% по сравнению с контрольным вирусом.

Результаты эксперимента представлены в таблицах 9, 10,11,12.

Таблица 9. Титр вируснейтрализующих антител к VSV-GP-EBOV в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 9

№ Название группы животных Титр антител 1 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV; 121,3 2 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV 320,0 3 VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/ VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV 367,6 4 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV; 367,6 5 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV; 320,0 6 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV; 320,0 7 VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV 367,6 8 VSV-GP-EBOV, VSV-GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV; 640,0 9 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV; 557,2 10 Ad26- GP-EBOV, Ad26- GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV; 278,6 11 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV; 278,6 12 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV; 320,0 13 VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV; 320,0 14 VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV; 557,2 15 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV; 557,2 16 Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV; 367,6 17 Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/ Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV; 278,6 18 Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV; 320,0 19 VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV / Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV; 320,0 20 VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV; 557,2 21 Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/ VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV; 485,0 22 Буферный раствор/ Буферный раствор 0

Таблица 10. Титр вируснейтрализующих антител к VSV-GP-BDBV в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 10

№ Название группы животных Титр антител 1 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV; 52,8 2 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV 121,3 3 VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/ VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV 139,3 4 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV; 139,3 5 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV; 105,6 6 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV; 160,0 7 VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV 121,3 8 VSV-GP-EBOV, VSV-GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV; 160,0 9 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV; 139,3 10 Ad26- GP-EBOV, Ad26- GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV; 121,3 11 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV; 91,9 12 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV; 121,3 13 VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV; 91,9 14 VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV; 139,3 15 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV; 121,3 16 Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV; 105,6 17 Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/ Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV; 91,9 18 Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV; 139,3 19 VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV / Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV; 91,9 20 VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV; 121,3 21 Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/ VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV; 121,3 22 Буферный раствор/ Буферный раствор 0

Таблица 11. Титр вируснейтрализующих антител к VSV-GP-SUDV в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 11

№ Название группы животных Титр антител 1 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV; 139,3 2 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV 367,6 3 VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/ VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV 320,0 4 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV; 367,6 5 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV; 367,6 6 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV; 367,6 7 VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV 422,2 8 VSV-GP-EBOV, VSV-GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV; 485,0 9 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV; 557,2 10 Ad26- GP-EBOV, Ad26- GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV; 320,0 11 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV; 320,0 12 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV; 367,6 13 VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV; 422,2 14 VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV; 422,2 15 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV; 422,2 16 Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV; 320,0 17 Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/ Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV; 367,6 18 Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV; 320,0 19 VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV / Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV; 367,6 20 VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV; 422,2 21 Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/ VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV; 485,0 22 Буферный раствор/ Буферный раствор 0

Таблица 12. Титр вируснейтрализующих антител к VSV-GP-MARV в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 12

№ Название группы животных Титр антител 1 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV; 160,0 2 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV 367,6 3 VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV/ VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV 422,2 4 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/ Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV; 557,2 5 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV; 367,6 6 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV; 422,2 7 VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV 422,2 8 VSV-GP-EBOV, VSV-GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV; 735,2 9 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV; 557,2 10 Ad26- GP-EBOV, Ad26- GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV; 485,0 11 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV; 278,6 12 Ad26-GP-EBOV, Ad26-GP-SUDV; Ad26-GP-MARV/VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV; 367,6 13 VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV / Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV; 367,6 14 VSV-GP-EBOV, VSV -GP-SUDV; VSV -GP-MARV /Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV; 640,0 15 Ad5-GP-EBOV, Ad5-GP-SUDV; Ad5-GP-MARV/ VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV; 485,0 16 Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV; 557,2 17 Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/ Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV; 320,0 18 Ad26- GPΔmuc -EBOV, Ad26- GPΔmuc -SUDV; Ad26- GPΔmuc -MARV/VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV; 367,6 19 VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV / Ad26- GP -EBOV, Ad26- GP -SUDV; Ad26- GP -MARV; 367,6 20 VSV- GPΔmuc -EBOV, VSV - GPΔmuc -SUDV; VSV - GPΔmuc -MARV /Ad5- GP -EBOV, Ad5- GP -SUDV; Ad5- GP -MARV; 640,0 21 Ad5- GPΔmuc -EBOV, Ad5- GPΔmuc -SUDV; Ad5- GPΔmuc -MARV/ VSV- GP -EBOV, VSV - GP -SUDV; VSV - GP -MARV; 367,6 22 Буферный раствор/ Буферный раствор 0

Исходя из полученных данных можно сделать вывод, что иммунизация млекопитающих композицией из трех разработанных иммунобиологических средств, содержащих ген гликопротеина Ebola virus, Sudan virus, Marburg virus приводит к образованию вируснейтрализующих антител против 4 видов филовирусов: Ebola virus, Bundibugyo virus, Sudan virus, Marburg virus.

Специалисту среднего уровня очевидно, что антитела, образующиеся после введения разработанных иммунобиологических средств, могут также связываться с гликопротеином близкородственных видов филовирусов.

Пример 12.

Оценка иммуногенности разработанных иммунобиологических средств в зависимости от пути их введения в организм млекопитающих.

Целью данного эксперимента являлась оценка эффективности иммунизации млекопитающих вариантами разработанного иммунобиологического средства путем их интраназального, внутримышечного или подкожного введения. Напряженность гуморального иммунного ответа у иммунизированных животных оценивали по продукции антител класса IgG специфичных к GP Ebola virus в сыворотке крови.

В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на группы по 5 животных, которым внутримышечно, подкожно или интраназально вводили разработанное иммунобиологическое средство в дозе 10¹⁰ вирусных частиц/мышь.

Таким образом, были получены следующие группы животных:

1) Ad26-GP-EBOV интраназально;

2) Ad26-GP-EBOV внутримышечно;

3) Ad26-GP-EBOV подкожно;

4) Ad5-GP-EBOV интраназально;

5) Ad5-GP-EBOV внутримышечно;

6) Ad5-GP-EBOV подкожно;

7) VSV-GP-EBOV интраназально;

8) VSV-GP-EBOV внутримышечно;

9) VSV-GP-EBOV подкожно;

10) Буферный раствор.

Оценка титра антител к GP Ebola virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных проводилась на 21-й день после иммунизации методом ИФА.

Для иммуноферментного анализа антиген (GP Ebola virus), разведенный в карбонат-бикарбонатном буфере (КББ) (pH 9,6), наносили на 96-луночный планшет в количестве 100 нг на лунку. Планшет инкубировали при +4 ^oС в течение ночи.

На следующий день планшет промывали раствором ТФСБ (Твин 20 - фосфатно-солевой буфер: на 1 л дистиллированной воды 8,00 г NaCl, 0,20 г KCl, 1,44 г Na₂HPO₄, 0,24 г KH₂PO₄, Твин 20 0,1%) в объеме 230 мкл на лунку 5 раз. Далее для избавления от неспецифического связывания проводили обработку планшета ИФА-буфером (ХЕМА, Россия), в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37^oС в течение часа. Планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 230 мкл на лунку 4 раза.

Затем добавляли сыворотки периферической крови мышей в различных разведениях в растворе ИФА-буфера и снова инкубировали час при тех же условиях.

Затем планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 200 мкл на лунку 5 раз, чтобы удалить несвязавшиеся антитела. Далее добавляли вторичные антитела, специфичные к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, разведенные в ИФА-буфере в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37^oС на протяжении часа.

Далее планшет снова промывали раствором ТФСБ 5 раз. После этого в лунки добавили TMB в объеме 100 мкл на лунку и выдерживали в темноте до приобретения раствором голубого цвета 15 минут. Далее останавливали реакцию добавлением 50 мкл 4М серной кислоты и проводили измерение оптической плотности на планшетном спектрофотометре при длине волны света 450 нм.

Результаты эксперимента представлены в таблице 13.

Таблица 13. Титр антител к GP Ebola virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 13

№ Название группы животных Титр антител 1 Ad26-GP-EBOV интраназально; 67,3 2 Ad26-GP-EBOV внутримышечно; 220,8 3 Ad26-GP-EBOV подкожно; 181,1 4 Ad5-GP-EBOV интраназально; 5250,1 5 Ad5-GP-EBOV внутримышечно; 8613,8 6 Ad5-GP-EBOV подкожно; 7066,2 7 VSV-GP-EBOV интраназально; 3533,1 8 VSV-GP-EBOV внутримышечно; 7801,7 9 VSV-GP-EBOV подкожно; 6400,0 10 Буферный раствор. 0

Как видно из представленных результатов, все пути введения разработанных иммунобиологических средств в организм млекопитающих приводят к развитию гуморального иммунного ответа. При этом наиболее высокие титры антител наблюдаются при внутримышечном и подкожном введении.

Пример 13.

Оценка иммуногенности разработанных иммунобиологических средств при последовательной и одновременной иммунизации.

Целью данного эксперимента являлась оценка эффективности иммунизации млекопитающих вариантами разработанного иммунобиологического средства при различных схемах введения средств. Напряженность гуморального иммунного ответа у иммунизированных животных оценивали по продукции антител класса IgG специфичных к GP Ebola virus в сыворотке крови.

В эксперименте использовались млекопитающие - мыши линии BALB/c, самки 18г. Все животные были разделены на группы по 5 животных, которым внутримышечно вводили разработанное иммунобиологическое средство в дозе 10¹⁰ вирусных частиц/мышь.

Таким образом, были получены следующие группы животных:

1) Ad26-GP-EBOV, Ad5-GP-EBOV одновременно,

2) Ad26-GP-EBOV, Ad5-GP-EBOV последовательно с интервалом в 21 день,

3) Ad5-GP-EBOV, Ad26-GP-EBOV последовательно с интервалом 21 день,

4) Ad26-GP-EBOV, VSV-GP-EBOV одновременно,

5) Ad26-GP-EBOV, VSV -GP-EBOV последовательно с интервалом в 21 день,

6) VSV -GP-EBOV, Ad26-GP-EBOV последовательно с интервалом 21 день,

7) VSV -GP-EBOV, Ad5-GP-EBOV одновременно,

8) VSV -GP-EBOV, Ad5-GP-EBOV последовательно с интервалом в 21 день,

9) Ad5-GP-EBOV, VSV -GP-EBOV последовательно с интервалом 21 день,

10) Буферный раствор.

Оценка титра антител к GP Ebola virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных проводилась на 21-й день после иммунизации методом ИФА.

Для иммуноферментного анализа антиген (GP Ebola virus), разведенный в карбонат-бикарбонатном буфере (КББ) (pH 9,6), наносили на 96-луночный планшет в количестве 100 нг на лунку. Планшет инкубировали при +4 ^oС в течение ночи.

На следующий день планшет промывали раствором ТФСБ (Твин 20 - фосфатно-солевой буфер: на 1 л дистиллированной воды 8,00 г NaCl, 0,20 г KCl, 1,44 г Na₂HPO₄, 0,24 г KH₂PO₄, Твин 20 0,1%) в объеме 230 мкл на лунку 5 раз. Далее для избавления от неспецифического связывания проводили обработку планшета ИФА-буфером (ХЕМА, Россия), в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37^oС в течение часа. Планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 230 мкл на лунку 4 раза.

Затем добавляли сыворотки периферической крови мышей в различных разведениях в растворе ИФА-буфера и снова инкубировали час при тех же условиях.

Затем планшет промывали раствором ТФСБ в объеме 200 мкл на лунку 5 раз, чтобы удалить несвязавшиеся антитела. Далее добавляли вторичные антитела, специфичные к иммуноглобулинам мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена, разведенные в ИФА-буфере в объеме 100 мкл на лунку. Инкубировали на шейкере при температуре 37^oС на протяжении часа.

Далее планшет снова промывали раствором ТФСБ 5 раз. После этого в лунки добавили TMB в объеме 100 мкл на лунку и выдерживали в темноте до приобретения раствором голубого цвета 15 минут. Далее останавливали реакцию добавлением 50 мкл 4М серной кислоты и проводили измерение оптической плотности на планшетном спектрофотометре при длине волны света 450 нм.

Результаты эксперимента представлены в таблице 14.

Таблица 14.

Титр антител к GP Ebola virus в сыворотках периферической крови испытуемых животных на 21-й день после иммунизации (среднее геометрическое значение титра антител).

Таблица 14

№ Название группы животных Титр антител 1 Ad26-GP-EBOV, Ad5-GP-EBOV одновременно, 8613,8 2 Ad26-GP-EBOV, Ad5-GP-EBOV последовательно с интервалом в 21 день, 46373,1 3 Ad5-GP-EBOV, Ad26-GP-EBOV последовательно с интервалом 21 день, 34455,0 4 Ad26-GP-EBOV, VSV-GP-EBOV одновременно, 10500,3 5 Ad26-GP-EBOV, VSV -GP-EBOV последовательно с интервалом в 21 день, 42001,2 6 VSV -GP-EBOV, Ad26-GP-EBOV последовательно с интервалом 21 день, 38041,5 7 VSV -GP-EBOV, Ad5-GP-EBOV одновременно, 11593,3 8 VSV -GP-EBOV, Ad5-GP-EBOV последовательно с интервалом в 21 день, 51200,0 9 Ad5-GP-EBOV, VSV -GP-EBOV последовательно с интервалом 21 день, 42001,2 10 Буферный раствор. 0

Как видно из представленных результатов, как одновременное, так и последовательное введение иммунобиологических средств в организм млекопитающих приводят к развитию гуморального иммунного ответа. При этом наиболее высокие титры антител наблюдаются при последовательном введении иммунобиологических средств.

Приведенные примеры подтверждают выполнение технической задачи, а именно: «расширение арсенала иммунобиологических средств, обеспечивающих эффективную индукцию иммунного ответа против филовирусов: рода Ebolavirus: Ebola virus (EBOV), Bundibugyo virus (BDBV), Sudan virus (SUDV), и/или филовирусов рода Marburgvirus: Marburg virus (MARV).

Промышленная применимость

Все приведенные примеры подтверждают промышленную применимость изобретения.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный

исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного

академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации

<120> Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа к патогенным

для человека филовирусам, способ использования иммунобиологического средства

<160> 16

<170> BISSAP1.3.6

<210> 1

<211> 2914

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,

последовательность GP Ebola virus и сигнал полиаденилирования

<400> 1

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 60

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 120

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 180

gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 240

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 300

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 360

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 420

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 480

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 540

ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctgaattcac 600

catgggtgtt acaggaatat tgcagttacc tcgtgatcga ttcaagagga catcattctt 660

tctttgggta attatccttt tccaaagaac attttccatc ccgcttggag ttatccacaa 720

tagtacatta caggttagtg atgtcgacaa actagtttgt cgtgacaaac tgtcatccac 780

aaatcaattg agatcagttg gactgaatct cgaggggaat ggagtggcaa ctgacgtgcc 840

atctgtgact aaaagatggg gcttcaggtc cggtgtccca ccaaaggtgg tcaattatga 900

agctggtgaa tgggctgaaa actgctacaa tcttgaaatc aaaaaacctg acgggagtga 960

gtgtctacca gcagcgccag acgggattcg gggcttcccc cggtgccggt atgtgcacaa 1020

agtatcagga acgggaccat gtgccggaga ctttgccttc cacaaagagg gtgctttctt 1080

cctgtatgat cgacttgctt ccacagttat ctaccgagga acgactttcg ctgaaggtgt 1140

cgttgcattt ctgatactgc cccaagctaa gaaggacttc ttcagctcac accccttgag 1200

agagccggtc aatgcaacgg aggacccgtc gagtggctat tattctacca caattagata 1260

tcaggctacc ggttttggaa ctaatgagac agagtacttg ttcgaggttg acaatttgac 1320

ctacgtccaa cttgaatcaa gattcacacc acagtttctg ctccagctga atgagacaat 1380

atatgcaagt gggaagagga gcaacaccac gggaaaacta atttggaagg tcaaccccga 1440

aattgataca acaatcgggg agtgggcctt ctgggaaact aaaaaaaacc tcactagaaa 1500

aattcgcagt gaagagttgt ctttcacagc tgtatcaaac ggacccaaaa acatcagtgg 1560

tcagagtccg gcgcgaactt cttccgaccc agagaccaac acaacaaatg aagaccacaa 1620

aatcatggct tcagaaaatt cctctgcaat ggttcaagtg cacagtcaag gaaggaaagc 1680

tgcagtgtcg catctgacaa cccttgccac aatctccacg agtcctcaac ctcccacaac 1740

caaaacaggt ccggacaaca gcacccataa tacacccgtg tataaacttg acatctctga 1800

ggcaactcaa gttggacaac atcaccgtag agcagacaac gacagcacag cctccgacac 1860

tccccccgcc acgaccgcag ccggaccctt aaaagcagag aacaccaaca cgagtaagag 1920

cgctgactcc ctggacctcg ccaccacgac aagcccccaa aactacagcg agactgctgg 1980

caacaacaac actcatcacc aagataccgg agaagagagt gccagcagcg ggaagctagg 2040

cttaattacc aatactattg ctggagtagc aggactgatc acaggcggga gaaggactcg 2100

aagagaagta attgtcaatg ctcaacccaa atgcaacccc aatttacatt actggactac 2160

tcaggatgaa ggtgctgcaa tcggattggc ctggatacca tatttcgggc cagcagccga 2220

aggaatttac acagaggggc taatgcacaa ccaagatggt ttaatctgtg ggttgaggca 2280

gctggccaac gaaacgactc aagctctcca actgttcctg agagccacaa ctgagctgcg 2340

aaccttttca atcctcaacc gtaaggcaat tgacttcctg ctgcagcgat ggggtggcac 2400

atgccacatt ttgggaccgg actgctgtat cgaaccacat gattggacca agaacataac 2460

agacaaaatt gatcagatta ttcatgattt tgttgataaa acccttccgg accaggggga 2520

caatgacaat tggtggacag gatggagaca atggataccg gcaggtattg gagttacagg 2580

tgttataatt gcagttatcg ctttattctg tatatgcaaa tttgtctttt gataaggaat 2640

tcaagcttct agataagata tccgatccac cggatctaga taactgatca taatcagcca 2700

taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct 2760

gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt ataatggtta 2820

caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag 2880

ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttaa 2914

<210> 2

<211> 2320

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,

последовательность GPEbolavirus, модифицированная путем удаления области,

кодирующей муцинподобный домен, и сигнал полиаденилирования

<400> 2

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 60

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 120

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 180

gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 240

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 300

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 360

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 420

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 480

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 540

ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctacgcgtat 600

gggtgttaca ggaatattgc agttacctcg tgatcgattc aagaggacat cattctttct 660

ttgggtaatt atccttttcc aaagaacatt ttccatcccg cttggagtta tccacaatag 720

tacattacag gttagtgatg tcgacaaact agtttgtcgt gacaaactct catccacaaa 780

tcaattgaga tcagttggac tgaatctcga ggggaatgga gtggcaactg acgtgccatc 840

tgtgactaaa agatggggct tcaggtccgg tgtcccacca aaggtggtca attatgaagc 900

tggtgaatgg gctgaaaact gctacaatct tgaaatcaaa aaacctgacg ggagtgagtg 960

tctaccagca gcgccagacg ggattcgggg cttcccccgg tgccggtatg tgcacaaagt 1020

atcaggaacg ggaccatgtg ccggagactt tgccttccac aaagagggtg ctttcttcct 1080

gtatgatcga cttgcttcca cagttatcta ccgaggaacg actttcgctg aaggtgtcgt 1140

tgcatttctg atactgcccc aagctaagaa ggacttcttc agctcacacc ccttgagaga 1200

gccggtcaat gcaacggagg acccgtcgag tggctattat tctaccacaa ttagatatca 1260

ggctaccggt tttggaacta atgagacaga gtacttgttc gaggttgaca atttgaccta 1320

cgtccaactt gaatcaagat tcacaccaca gtttctgctc cagctgaatg agacaatata 1380

tgcaagtggg aagaggagca acaccacggg aaaactaatt tggaaggtca accccgaaat 1440

tgatacaaca atcggggagt gggccttctg ggaaactaaa aaaaacctca ctagaaaaat 1500

tcgcagtgaa gagttgtctt tcacagctgt atcaaacaga aggactcgaa gagaagtaat 1560

tgtcaatgct caacccaaat gcaaccccaa tttacattac tggactactc aggatgaagg 1620

tgctgcaatc ggattggcct ggataccata tttcgggcca gcagccgaag gaatttacat 1680

agaggggcta atgcacaacc aagatggttt aatctgtggg ttgaggcagc tggccaacga 1740

aacgactcaa gctctccaac tgttcctgag agccacaact gagctgcgaa ccttttcaat 1800

cctcaaccgt aaggcaattg acttcctgct gcagcgatgg ggtggcacat gccacatttt 1860

gggaccggac tgctgtatcg aaccacatga ttggaccaag aacataacag acaaaattga 1920

tcagattatt catgattttg ttgataaaac ccttccggac cagggggaca atgacaattg 1980

gtggacagga tggagacaat ggataccggc aggtattgga gttacaggtg ttataattgc 2040

agttatcgct ttattctgta tatgcaaatt tgtcttttga gctagataac tgatcataat 2100

cagccatacc acatttgtag aggttttact tgctttaaaa aacctcccac acctccccct 2160

gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa 2220

tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca 2280

ttctagttgt ggtttgtcca aactcatcaa tgtatcttaa 2320

<210> 3

<211> 2903

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,

последовательность GPBundibugyovirus и сигнал полиаденилирования

<400> 3

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 60

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 120

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 180

gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 240

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 300

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 360

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 420

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 480

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 540

ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctggtaccgt 600

cgacgcggcc gctcgagcct aagcttacgc gtatggaggg tcttagccta ctccaattgc 660

ccagagataa atttcgaaaa agctctttct ttgtttgggt catcatctta tttcaaaagg 720

ccttttccat gcctttgggt gttgtgacca acagcacttt agaagtaaca gagattgacc 780

agctagtctg caaggatcat cttgcatcca ctgaccagct gaaatcagtt ggtctcaacc 840

tcgaggggag cggagtatct actgacatcc catctgcgac aaagcgttgg ggcttcaggt 900

ctggtgtgcc tcccaaagtg gtcagctatg aagcaggaga atgggctgaa aattgctaca 960

atcttgaaat aaagaagccg gacgggagcg aatgcttacc cccaccgccg gatggtgtca 1020

gaggctttcc aaggtgccgc tatgttcaca aagcccaagg aaccgggccc tgcccgggtg 1080

actatgcctt tcacaaggat ggagctttct tcctctatga caggctggct tcaactgtaa 1140

tttacagagg agtcaatttt gctgaggggg taattgcctt cttgatattg gctaaaccaa 1200

aggaaacgtt ccttcaatca ccccccattc gagaggcagt aaactacact gagaatacat 1260

caagttacta tgccacatcc tacttggagt acgaaatcga aaattttggt gctcaacact 1320

ccacgaccct tttcaaaatt aacaacaata cttttgttct tctggacagg ccccacacgc 1380

ctcagttcct tttccagctg aatgatacca ttcaccttca ccaacagttg agcaacacaa 1440

ctgggaaact aatttggaca ctagatgcta atatcaatgc tgatattggt gaatgggctt 1500

tttgggaaaa taaaaaaaat ctctccgaac aactacgtgg agaagagctg tctttcgaaa 1560

ctttatcgct caacgagaca gaagacgatg atgcgacatc gtcgagaact acaaagggaa 1620

gaatctccga ccgagccacc aggaagtatt cggacctggt tccaaaggat tcccctggga 1680

tggtttcatt gcacgtacca gaaggggaaa caacattgcc gtctcagaat tcgacagaag 1740

gacgaagagt agatgtgaat actcaggaaa ctatcacaga gacaactgca acaatcatag 1800

gcactaacgg taacaacatg cagatcagca ccatcgggac aggactgagc tccagccaaa 1860

tcctgagttc ctcaccgacc atggcaccaa gccctgagac tcagacctcc acaacctaca 1920

caccaaaact accagtgatg accaccgagg aaccaacaac accaccgaga aactctcctg 1980

gctcaacaac agaagcaccc actctcacca ccccagagaa tataacaaca gcggtgaaaa 2040

ctgttttgcc acaagagtcc acaagcaacg gtctaataac ttcaacagta acaggtattc 2100

ttgggagcct tggacttcga aaacgcagca gaagacaagt taacaccagg gccacgggta 2160

aatgcaatcc caacttacac tactggactg cacaagaaca acataatgct gctgggattg 2220

cctggatccc gtactttgga ccgggtgcag aaggcatata cactgaaggc cttatgcaca 2280

accaaaatgc cttagtctgt ggactcagac aacttgcaaa tgaaaccact caagctctgc 2340

agcttttctt aagggccacg acggagctgc ggacatatac catactcaat aggaaggcca 2400

tagatttcct tctgcgacga tggggcggga catgtaggat cctgggacca gattgttgca 2460

ttgagccaca tgattggacc aaaaacatca ctgataaaat caaccaaatc atccatgatt 2520

tcatcgacaa ccctttaccc aatcaggata atgatgataa ttggtggacg ggctggagac 2580

agtggatccc tgcaggaata ggcattactg gaattattat tgcaatcatt gctcttcttt 2640

gcgtctgcaa gctgctttgt tgagctagat aactgatcat aatcagccat accacatttg 2700

tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa 2760

tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta ttgcagctta taatggttac aaataaagca 2820

atagcatcac aaatttcaca aataaagcat ttttttcact gcattctagt tgtggtttgt 2880

ccaaactcat caatgtatct taa 2903

<210> 4

<211> 2357

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,

последовательность GPBundibugyovirus, модифицированная путем удаления

области, кодирующей муцинподобный домен, и сигнал полиаденилирования

<400> 4

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 60

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 120

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 180

gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 240

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 300

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 360

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 420

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 480

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 540

ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctggtaccgt 600

cgacgcggcc gctcgagcct aagcttacgc gtatggaggg tcttagccta ctccaattgc 660

ccagagataa atttcgaaaa agctctttct ttgtttgggt catcatctta tttcaaaagg 720

ccttttccat gcctttgggt gttgtgacca acagcacttt agaagtaaca gagattgacc 780

agctagtctg caaggatcat cttgcatcca ctgaccagct gaaatcagtt ggtctcaacc 840

tcgaggggag cggagtatct actgacatcc catctgcgac aaagcgttgg ggcttcaggt 900

ctggtgtgcc tcccaaagtg gtcagctatg aagcaggaga atgggctgaa aattgctaca 960

atcttgaaat aaagaagccg gacgggagcg aatgcttacc cccaccgccg gatggtgtca 1020

gaggctttcc aaggtgccgc tatgttcaca aagcccaagg aaccgggccc tgcccgggtg 1080

actatgcctt tcacaaggat ggagctttct tcctctatga caggctggct tcaactgtaa 1140

tttacagagg agtcaatttt gctgaggggg taattgcctt cttgatattg gctaaaccaa 1200

aggaaacgtt ccttcaatca ccccccattc gagaggcagt aaactacact gagaatacat 1260

caagttacta tgccacatcc tacttggagt acgaaatcga aaattttggt gctcaacact 1320

ccacgaccct tttcaaaatt aacaacaata cttttgttct tctggacagg ccccacacgc 1380

ctcagttcct tttccagctg aatgatacca ttcaccttca ccaacagttg agcaacacaa 1440

ctgggaaact aatttggaca ctagatgcta atatcaatgc tgatattggt gaatgggctt 1500

tttgggaaaa taaaaaaaat ctctccgaac aactacgtgg agaagagctg tctttcgaaa 1560

ctttatcgct caacaaacgc agcagaagac aagttaacac cagggccacg ggtaaatgca 1620

atcccaactt acactactgg actgcacaag aacaacataa tgctgctggg attgcctgga 1680

tcccgtactt tggaccgggt gcagaaggca tatacactga aggccttatg cacaaccaaa 1740

atgccttagt ctgtggactc agacaacttg caaatgaaac cactcaagct ctgcagcttt 1800

tcttaagggc cacgacggag ctgcggacat ataccatact caataggaag gccatagatt 1860

tccttctgcg acgatggggc gggacatgta ggatcctggg accagattgt tgcattgagc 1920

cacatgattg gaccaaaaac atcactgata aaatcaacca aatcatccat gatttcatcg 1980

acaacccttt acccaatcag gataatgatg ataattggtg gacgggctgg agacagtgga 2040

tccctgcagg aataggcatt actggaatta ttattgcaat cattgctctt ctttgcgtct 2100

gcaagctgct ttgttgagct agataactga tcataatcag ccataccaca tttgtagagg 2160

ttttacttgc tttaaaaaac ctcccacacc tccccctgaa cctgaaacat aaaatgaatg 2220

caattgttgt tgttaacttg tttattgcag cttataatgg ttacaaataa agcaatagca 2280

tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc tagttgtggt ttgtccaaac 2340

tcatcaatgt atcttaa 2357

<210> 5

<211> 2909

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,

последовательность GPSudanvirus и сигнал полиаденилирования

<400> 5

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 60

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 120

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 180

gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 240

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 300

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 360

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 420

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 480

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 540

ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctggtaccgt 600

cgacgcggcc gctcgagcct aagcttacgc gtatggttac atcaggaatt ctacaattgc 660

cccgtgaacg cttcaggaaa acatcatttt ttgtttgggt aataatccta ttccataagg 720

ttttccctat cccattgggc gtagttcaca acaacactct ccaggtaagt gatatagata 780

aattggtgtg ccgggataaa ctttcctcca caagtcaact gaaatcggtc gggcttaacc 840

tagaaggtaa tggagttgcc acagatgtac caacagcaac gaagagatgg ggattccgag 900

ccggtgttcc acccaaagtg gtgaactacg aggctgggga gtgggctgaa aactgctaca 960

acctggacat caagaaagca gatggtagcg aatgcctacc tgaagcccct gagggtgtaa 1020

gaggcttccc tcgctgccgt tatgtgcaca aggtttctgg aacagggccg tgtcctgaag 1080

gtttcgcttt ccacaaagaa ggcgctttct tcctgtatga tcgactggca tcaacaatca 1140

tctatcgaag caccacgttt tcagaaggtg ttgtggcttt cttgatcctc cccaagacta 1200

aaaaggactt tttccaatca ccaccactac atgaaccggc caatatgaca acagacccat 1260

ccagctacta ccacacagtc acacttaatt atgtggctga caattttggg accaatatga 1320

ctaactttct gtttcaagtg gatcatctaa cttatgtgca acttgaacca agattcacac 1380

cacaatttct tgtccaactc aatgagacca tttatactaa tgggcgtcgc agcaacacca 1440

caggaacact aatttggaaa gtaaatccta ctgttgacac cggcgtaggt gaatgggcct 1500

tctgggaaaa taaaaaaaac ttcacaaaaa ccctttcaag tgaagagctg tctgtcatac 1560

ttgtaccaag agcccaggat ccaggcagca accagaagac gaaggtcact cccaccagct 1620

tcgccaacaa ccaaacctcc aagaaccacg aagacttggt tccaaaggat cccgcttcag 1680

tcgttcaagt gcgagacctc cagagggaaa acacagtgcc gacctcaccc ttgaacacag 1740

tccccacaac tctgatcccc gacacaatgg aagagcaaac caccagccac tacgaactac 1800

caaacatttc cggaaaccat caagagagga acaacaccgc acaccccgaa actctcgcca 1860

acaatcctcc agacaacaca accccttcga caccacctca agacggtgag cggacaagtt 1920

cccacacaac accctccccc cgcccagtcc caaccagcac aatccatccc accacacgag 1980

agactcaaat tcccaccaca atgataacaa gccatgatac tgacagtaat cgacccaacc 2040

caattgacat cagcgagtct acagagccag gactactcac caacaccata agaggggttg 2100

caaatttgct gacaggttca agaagaaccc ggagggaaat caccttgaga acacaagcca 2160

aatgtaatcc gaacctacac tattggacaa cccaagatga aggggctgcc attggtctag 2220

cctggatacc ttacttcggg cccgcagcag agggaattta tacggaagga ataatgcaca 2280

atcaaaatgg gctaatttgc gggttgaggc aactagcaaa tgagacgact caagccctac 2340

agttattctt gcgtgctacc acggaattgc gcactttctc catattgaat cgaaaagcca 2400

tcgacttctt acttcaaaga tggggaggaa cgtgccacat cttaggccca gattgctgta 2460

ttgagcccca tgattggact aagaacatta ctgacaagat agatcaaatc attcatgatt 2520

tcattgataa acctctacca gatcagacag ataatgacaa ttggtggaca gggtggaggc 2580

aatgggttcc tgctgggatt gggatcacgg gggtaataat cgcagttata gcactgctgt 2640

gtatttgcaa atttctactc taagctagct ctagataact gatcataatc agccatacca 2700

catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa acctcccaca cctccccctg aacctgaaac 2760

ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact tgtttattgc agcttataat ggttacaaat 2820

aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg 2880

gtttgtccaa actcatcaat gtatcttaa 2909

<210> 6

<211> 2360

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,

последовательность GPSudanvirus, модифицированная путем удаления области,

кодирующей муцинподобный домен, и сигнал полиаденилирования

<400> 6

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 60

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 120

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 180

gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 240

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 300

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 360

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 420

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 480

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 540

ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctggtaccgt 600

cgacgcggcc gctcgagcct aagcttacgc gtatggttac atcaggaatt ctacaattgc 660

cccgtgaacg cttcaggaaa acatcatttt ttgtttgggt aataatccta ttccataagg 720

ttttccctat cccattgggc gtagttcaca acaacactct ccaggtaagt gatatagata 780

aattggtgtg ccgggataaa ctttcctcca caagtcaact gaaatcggtc gggcttaacc 840

tagaaggtaa tggagttgcc acagatgtac caacagcaac gaagagatgg ggattccgag 900

ccggtgttcc acccaaagtg gtgaactacg aggctgggga gtgggctgaa aactgctaca 960

acctggacat caagaaagca gatggtagcg aatgcctacc tgaagcccct gagggtgtaa 1020

gaggcttccc tcgctgccgt tatgtgcaca aggtttctgg aacagggccg tgtcctgaag 1080

gtttcgcttt ccacaaagaa ggcgctttct tcctgtatga tcgactggca tcaacaatca 1140

tctatcgaag caccacgttt tcagaaggtg ttgtggcttt cttgatcctc cccaagacta 1200

aaaaggactt tttccaatca ccaccactac atgaaccggc caatatgaca acagacccat 1260

ccagctacta ccacacagtc acacttaatt atgtggctga caattttggg accaatatga 1320

ctaactttct gtttcaagtg gatcatctaa cttatgtgca acttgaacca agattcacac 1380

cacaatttct tgtccaactc aatgagacca tttatactaa tgggcgtcgc agcaacacca 1440

caggaacact aatttggaaa gtaaatccta ctgttgacac cggcgtaggt gaatgggcct 1500

tctgggaaaa taaaaaaaac ttcacaaaaa ccctttcaag tgaagagctg tctgtcatac 1560

ttgtaccaag aagaagaacc cggagggaaa tcaccttgag aacacaagcc aaatgtaatc 1620

cgaacctaca ctattggaca acccaagatg aaggggctgc cattggtcta gcctggatac 1680

cttacttcgg gcccgcagca gagggaattt atacggaagg aataatgcac aatcaaaatg 1740

ggctaatttg cgggttgagg caactagcaa atgagacgac tcaagcccta cagttattct 1800

tgcgtgctac cacggaattg cgcactttct ccatattgaa tcgaaaagcc atcgacttct 1860

tacttcaaag atggggagga acgtgccaca tcttaggccc agattgctgt attgagcccc 1920

atgattggac taagaacatt actgacaaga tagatcaaat cattcatgat ttcattgata 1980

aacctctacc agatcagaca gataatgaca attggtggac agggtggagg caatgggttc 2040

ctgctgggat tgggatcacg ggggtaataa tcgcagttat agcactgctg tgtatttgca 2100

aatttctact ctaagctagc tctagataac tgatcataat cagccatacc acatttgtag 2160

aggttttact tgctttaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga 2220

atgcaattgt tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata 2280

gcatcacaaa tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca 2340

aactcatcaa tgtatcttaa 2360

<210> 7

<211> 2924

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,

последовательность GPMarburgvirus и сигнал полиаденилирования

<400> 7

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 60

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 120

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 180

gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 240

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 300

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 360

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 420

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 480

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 540

ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctggtaccgt 600

cgacgcggcc gctcgagcct aagcttacgc gtatgtggac tacatgcttc tttatcagtc 660

tcatcttaat ccaagggata aaaactctcc ctattttgga gatagccagt aacgatcaac 720

cccaaaatgt ggattcggta tgctccggaa ctctccagaa aactgaagac gtccatctga 780

tgggatttac actgagcggt cagaaagttg ctgattcccc tttggaggca tccaagcgat 840

gggctttcag gacaggtgta cctcctaaga atgttgagta tacggaaggg gaggaagcca 900

aaacatgcta caatataagt gtaacggatc cctctggaaa atccttgctg ttagatcctc 960

ccaccaacgt ccgagactat cctaaatgca agactatcca tcacattcaa ggtcaaaacc 1020

ctcatgcgca ggggattgcc ctccatttgt ggggagcatt tttcctatat gatcgcattg 1080

cctccacaac aatgtaccga ggcaaagtct tcactgaagg gaacatagca gccatgattg 1140

tcaataagac agtgcacaaa atgattttct cgcgtcaagg acaagggtat cgtcacatga 1200

atctgacttc tactaacaag tattggacaa gtagcaacgg aacgcaaaca aatgacactg 1260

gatgtttcgg tactcttcaa gaatacaatt ctacgaagaa ccaaacatgt gctccgtcta 1320

aaacaccccc accaccgccc acagcccatc cggagatcaa acccacaagc accccaaccg 1380

atgccactag actcaacacc acaaacccaa acagtgatga tgaggatctc acaacatccg 1440

gctcggggtc tggggaacag gaaccctata cgacttctga tgcggtcact aagcaagggc 1500

tttcatcaac aatgccaccc actccctcac cgcaaccagg cacgccacag cagggaggaa 1560

acaacacaaa ccactcccag gacgctgcaa ctgaacttga caacaccaat acaactgcac 1620

aacctcccat gccttcccac aacacgacca caatctcgac caacaacacg tccaaacaca 1680

acctcagcac cctctccgaa ccaccacaaa acaccaccaa tcccaacaca caaagcatgg 1740

ccactgaaaa tgagaaaacc agtgcccctc cgaaaacaac cctgcctcca acagaaagtc 1800

ctaccacaga aaagagcacc aacaatacaa aaagccccac cacaatggaa ccaaatacaa 1860

caaatggaca tttcactagt ccctcctcca cctccaactc gactactcaa catcttatct 1920

acttcaggag gaaacgaagt atcctctgga gggaaggcga tatgttccct ttcctagatg 1980

ggttaataaa tgctccaatt gattttgatc cagttccaaa tacaaagaca atctttgatg 2040

aatcttctag ttctggtgct tcagccgagg aagatcaaca tgcatcctcc aatatcagct 2100

tgactttatc ttatcttcct catacaagtg aaaacactgc ctactctgga gagaatgaaa 2160

atgattgtga tgcagagcta agaatttgga gcgttcagga ggacgacctg gcagcagggc 2220

tcagttggat accattcttc ggccctggaa tcgaaggact ttataccgct ggtttaatca 2280

agaaccaaaa caatttggtc tgcaggttga ggcgtctagc caatcaaact gcaaaatctt 2340

tggaactctt actaagggtc acaaccgagg aaagaacatt ttccttgatc aatagacatg 2400

ctattgactt tctactcaca aggtggggag gaacatgcaa agtgcttgga cctgattgtt 2460

gcataggaat agaggacttg tccagaaata tttcagaaca gattgaccaa atcaagaagg 2520

acgaacaaaa agaggggact ggttggggtc tgggtggtaa gtggtggaca tccgactggg 2580

gtgttcttac taacttgggc atcttgctac tattgtccat agctgtcttg attgctctat 2640

cctgtatttg tcgtatcttc actaaatata ttggataggc tagctctaga taactgatca 2700

taatcagcca taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc 2760

ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt 2820

ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac 2880

tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttaa 2924

<210> 8

<211> 2351

<212>DNA

<213>ArtificialSequence

<220>

<223> Разработанная экспрессионная кассета, содержащая CMV-промотор,

последовательность GPMarburgvirus, модифицированная путем удаления области,

кодирующей муцинподобный домен, и сигнал полиаденилирования

<400> 8

atagtaatca attacggggt cattagttca tagcccatat atggagttcc gcgttacata 60

acttacggta aatggcccgc ctggctgacc gcccaacgac ccccgcccat tgacgtcaat 120

aatgacgtat gttcccatag taacgccaat agggactttc cattgacgtc aatgggtgga 180

gtatttacgg taaactgccc acttggcagt acatcaagtg tatcatatgc caagtacgcc 240

ccctattgac gtcaatgacg gtaaatggcc cgcctggcat tatgcccagt acatgacctt 300

atgggacttt cctacttggc agtacatcta cgtattagtc atcgctatta ccatggtgat 360

gcggttttgg cagtacatca atgggcgtgg atagcggttt gactcacggg gatttccaag 420

tctccacccc attgacgtca atgggagttt gttttggcac caaaatcaac gggactttcc 480

aaaatgtcgt aacaactccg ccccattgac gcaaatgggc ggtaggcgtg tacggtggga 540

ggtctatata agcagagctg gtttagtgaa ccgtcagatc cgctagagat ctggtaccgt 600

cgacgcggcc gctcgagcct aagcttacgc gtatgtggac tacatgcttc tttatcagtc 660

tcatcttaat ccaagggata aaaactctcc ctattttgga gatagccagt aacgatcaac 720

cccaaaatgt ggattcggta tgctccggaa ctctccagaa aactgaagac gtccatctga 780

tgggatttac actgagcggt cagaaagttg ctgattcccc tttggaggca tccaagcgat 840

gggctttcag gacaggtgta cctcctaaga atgttgagta tacggaaggg gaggaagcca 900

aaacatgcta caatataagt gtaacggatc cctctggaaa atccttgctg ttagatcctc 960

ccaccaacgt ccgagactat cctaaatgca agactatcca tcacattcaa ggtcaaaacc 1020

ctcatgcgca ggggattgcc ctccatttgt ggggagcatt tttcctatat gatcgcattg 1080

cctccacaac aatgtaccga ggcaaagtct tcactgaagg gaacatagca gccatgattg 1140

tcaataagac agtgcacaaa atgattttct cgcgtcaagg acaagggtat cgtcacatga 1200

atctgacttc tactaacaag tattggacaa gtagcaacgg aacgcaaaca aatgacactg 1260

gatgtttcgg tactcttcaa gaatacaatt ctacgaagaa ccaaacatgt gctccgtcta 1320

aaacaccccc accaccgccc acagctcatc cgaggaggaa acgaagtatc ctctggaggg 1380

aaggcgatat gttccctttc ctagatgggt taataaatgc tccaattgat tttgatccag 1440

ttccaaatac aaagacaatc tttgatgaat cttctagttc tggtgcttca gccgaggaag 1500

atcaacatgc atcctccaat atcagcttga ctttatctta tcttcctcat acaagtgaaa 1560

acactgccta ctctggagag aatgaaaatg attgtgatgc agagctaaga atttggagcg 1620

ttcaggagga cgacctggca gcagggctca gttggatacc attcttcggc cctggaatcg 1680

aaggacttta taccgctggt ttaatcaaga accaaaacaa tttggtctgc aggttgaggc 1740

gtctagccaa tcaaactgca aaatctttgg aactcttact aagggtcaca accgaggaaa 1800

gaacattttc cttgatcaat agacatgcta ttgactttct actcacaagg tggggaggaa 1860

catgcaaagt gcttggacct gattgttgca taggaataga ggacttgtcc agaaatattt 1920

cagaacagat tgaccaaatc aagaaggacg aacaaaaaga ggggactggt tggggtctgg 1980

gtggtaagtg gtggacatcc gactggggtg ttcttactaa cttgggcatc ttgctactat 2040

tgtccatagc tgtcttgatt gctctatcct gtatttgtcg tatcttcact aaatatattg 2100

gataggctag ctctagataa ctgatcataa tcagccatac cacatttgta gaggttttac 2160

ttgctttaaa aaacctccca cacctccccc tgaacctgaa acataaaatg aatgcaattg 2220

ttgttgttaa cttgtttatt gcagcttata atggttacaa ataaagcaat agcatcacaa 2280

atttcacaaa taaagcattt ttttcactgc attctagttg tggtttgtcc aaactcatca 2340

atgtatcttaa 2351

<210> 9

<211> 2147

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Разработанная транскрипционная единица, содержащая сайт инициации

транскрипции, последовательность GPEbolavirus и сигнал для терминации и

полиаденилирования

<400> 9

aacagagatcgatctgtttacgcgaattcaccatgggtgttacaggaatattgcagttac 60

ctcgtgatcgattcaagaggacatcattctttctttgggtaattatccttttccaaagaa 120

cattttccat cccgcttgga gttatccaca atagtacatt acaggttagt gatgtcgaca 180

aactagtttg tcgtgacaaa ctgtcatcca caaatcaatt gagatcagtt ggactgaatc 240

tcgaggggaa tggagtggca actgacgtgc catctgtgac taaaagatgg ggcttcaggt 300

ccggtgtccc accaaaggtg gtcaattatg aagctggtga atgggctgaa aactgctaca 360

atcttgaaat caaaaaacct gacgggagtg agtgtctacc agcagcgcca gacgggattc 420

ggggcttccc ccggtgccgg tatgtgcaca aagtatcagg aacgggacca tgtgccggag 480

actttgcctt ccacaaagag ggtgctttct tcctgtatga tcgacttgct tccacagtta 540

tctaccgagg aacgactttc gctgaaggtg tcgttgcatt tctgatactg ccccaagcta 600

agaaggactt cttcagctca caccccttga gagagccggt caatgcaacg gaggacccgt 660

cgagtggcta ttattctacc acaattagat atcaggctac cggttttgga actaatgaga 720

cagagtactt gttcgaggtt gacaatttga cctacgtcca acttgaatca agattcacac 780

cacagtttct gctccagctg aatgagacaa tatatgcaag tgggaagagg agcaacacca 840

cgggaaaact aatttggaag gtcaaccccg aaattgatac aacaatcggg gagtgggcct 900

tctgggaaac taaaaaaaac ctcactagaa aaattcgcag tgaagagttg tctttcacag 960

ctgtatcaaa cggacccaaa aacatcagtg gtcagagtcc ggcgcgaact tcttccgacc 1020

cagagaccaa cacaacaaat gaagaccaca aaatcatggc ttcagaaaat tcctctgcaa 1080

tggttcaagt gcacagtcaa ggaaggaaag ctgcagtgtc gcatctgaca acccttgcca 1140

caatctccac gagtcctcaa cctcccacaa ccaaaacagg tccggacaac agcacccata 1200

atacacccgt gtataaactt gacatctctg aggcaactca agttggacaa catcaccgta 1260

gagcagacaa cgacagcaca gcctccgaca ctccccccgc cacgaccgca gccggaccct 1320

taaaagcaga gaacaccaac acgagtaaga gcgctgactc cctggacctc gccaccacga 1380

caagccccca aaactacagc gagactgctg gcaacaacaa cactcatcac caagataccg 1440

gagaagagag tgccagcagc gggaagctag gcttaattac caatactatt gctggagtag 1500

caggactgat cacaggcggg agaaggactc gaagagaagt aattgtcaat gctcaaccca 1560

aatgcaaccc caatttacat tactggacta ctcaggatga aggtgctgca atcggattgg 1620

cctggatacc atatttcggg ccagcagccg aaggaattta cacagagggg ctaatgcaca 1680

accaagatgg tttaatctgt gggttgaggc agctggccaa cgaaacgact caagctctcc 1740

aactgttcct gagagccaca actgagctgc gaaccttttc aatcctcaac cgtaaggcaa 1800

ttgacttcct gctgcagcga tggggtggca catgccacat tttgggaccg gactgctgta 1860

tcgaaccaca tgattggacc aagaacataa cagacaaaat tgatcagatt attcatgatt 1920

ttgttgataa aacccttccg gaccaggggg acaatgacaa ttggtggaca ggatggagac 1980

aatggatacc ggcaggtatt ggagttacag gtgttataat tgcagttatc gctttattct 2040

gtatatgcaa atttgtcttt tgataaggaa ttctagctgt ttaggcgata tccatgctca 2100

aagaggcctc aattatattt gagtttttaa tttttatgaa aaaaact 2147

<210> 10

<211> 1583

<212>DNA

<213>ArtificialSequence

<220>

<223> Разработанная транскрипционная единица, содержащая сайт инициации

транскрипции, последовательность GPEbolavirus, модифицированная путем

удаления области, кодирующей муцинподобный домен, и сигнал для терминации и

полиаденилирования

<400> 10

aacagagatcgatctgtttacgcgtatgggtgttacaggaatattgcagttacctcgtga 60

tcgattcaagaggacatcattctttctttgggtaattatccttttccaaagaacattttc 120

catcccgcttggagttatccacaatagtacattacaggttagtgatgtcgacaaactagt 180

ttgtcgtgacaaactctcatccacaaatcaattgagatcagttggactgaatctcgaggg 240

gaatggagtggcaactgacgtgccatctgtgactaaaagatggggcttcaggtccggtgt 300

cccaccaaaggtggtcaattatgaagctggtgaatgggctgaaaactgctacaatcttga 360

aatcaaaaaacctgacgggagtgagtgtctaccagcagcgccagacgggattcggggctt 420

cccccggtgccggtatgtgcacaaagtatcaggaacgggaccatgtgccggagactttgc 480

cttccacaaagagggtgctttcttcctgtatgatcgacttgcttccacagttatctaccg 540

aggaacgactttcgctgaaggtgtcgttgcatttctgatactgccccaagctaagaagga 600

cttcttcagctcacaccccttgagagagccggtcaatgcaacggaggacccgtcgagtgg 660

ctattattct accacaatta gatatcaggc taccggtttt ggaactaatg agacagagta 720

cttgttcgag gttgacaatt tgacctacgt ccaacttgaa tcaagattca caccacagtt 780

tctgctccag ctgaatgaga caatatatgc aagtgggaag aggagcaaca ccacgggaaa 840

actaatttgg aaggtcaacc ccgaaattga tacaacaatc ggggagtggg ccttctggga 900

aactaaaaaa aacctcacta gaaaaattcg cagtgaagag ttgtctttca cagctgtatc 960

aaacagaagg actcgaagag aagtaattgt caatgctcaa cccaaatgca accccaattt 1020

acattactgg actactcagg atgaaggtgc tgcaatcgga ttggcctgga taccatattt 1080

cgggccagca gccgaaggaa tttacataga ggggctaatg cacaaccaag atggtttaat 1140

ctgtgggttg aggcagctgg ccaacgaaac gactcaagct ctccaactgt tcctgagagc 1200

cacaactgag ctgcgaacct tttcaatcct caaccgtaag gcaattgact tcctgctgca 1260

gcgatggggt ggcacatgcc acattttggg accggactgc tgtatcgaac cacatgattg 1320

gaccaagaac ataacagaca aaattgatca gattattcat gattttgttg ataaaaccct 1380

tccggaccag ggggacaatg acaattggtg gacaggatgg agacaatgga taccggcagg 1440

tattggagtt acaggtgtta taattgcagt tatcgcttta ttctgtatat gcaaatttgt 1500

cttttgagct agctgtttag gcgatatcca tgctcaaaga ggcctcaatt atatttgagt 1560

ttttaatttt tatgaaaaaa act 1583

<210> 11

<211> 2132

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Разработанная транскрипционная единица, содержащая сайт инициации

транскрипции, последовательность GPBundibugyovirus и сигнал для терминации и

полиаденилирования

<400> 11

aacagagatcgatctgtttacgcgtatggagggtcttagcctactccaattgcccagaga 60

taaatttcgaaaaagctctttctttgtttgggtcatcatcttatttcaaaaggccttttc 120

catgcctttgggtgttgtgaccaacagcactttagaagtaacagagattgaccagctagt 180

ctgcaaggatcatcttgcatccactgaccagctgaaatcagttggtctcaacctcgaggg 240

gagcggagtatctactgacatcccatctgcgacaaagcgttggggcttcaggtctggtgt 300

gcctcccaaagtggtcagctatgaagcaggagaatgggctgaaaattgctacaatcttga 360

aataaagaagccggacgggagcgaatgcttacccccaccgccggatggtgtcagaggctt 420

tccaaggtgccgctatgttcacaaagcccaaggaaccgggccctgcccgggtgactatgc 480

ctttcacaaggatggagctttcttcctctatgacaggctggcttcaactgtaatttacag 540

aggagtcaattttgctgagggggtaattgccttcttgatattggctaaaccaaaggaaac 600

gttccttcaatcaccccccattcgagaggcagtaaactacactgagaatacatcaagtta 660

ctatgccacatcctacttggagtacgaaatcgaaaattttggtgctcaacactccacgac 720

ccttttcaaaattaacaacaatacttttgttcttctggacaggccccacacgcctcagtt 780

ccttttccagctgaatgataccattcaccttcaccaacagttgagcaacacaactgggaa 840

actaatttggacactagatgctaatatcaatgctgatattggtgaatgggctttttggga 900

aaataaaaaaaatctctccgaacaactacgtggagaagagctgtctttcgaaactttatc 960

gctcaacgagacagaagacgatgatgcgacatcgtcgagaactacaaagggaagaatctc 1020

cgaccgagccaccaggaagtattcggacctggttccaaaggattcccctgggatggtttc 1080

attgcacgtaccagaaggggaaacaacattgccgtctcagaattcgacagaaggacgaag 1140

agtagatgtgaatactcaggaaactatcacagagacaactgcaacaatcataggcactaa 1200

cggtaacaacatgcagatcagcaccatcgggacaggactgagctccagccaaatcctgag 1260

ttcctcaccgaccatggcaccaagccctgagactcagacctccacaacctacacaccaaa 1320

actaccagtgatgaccaccgaggaaccaacaacaccaccgagaaactctcctggctcaac 1380

aacagaagcacccactctcaccaccccagagaatataacaacagcggtgaaaactgtttt 1440

gccacaagagtccacaagcaacggtctaataacttcaacagtaacaggtattcttgggag 1500

ccttggacttcgaaaacgcagcagaagacaagttaacaccagggccacgggtaaatgcaa 1560

tcccaacttacactactggactgcacaagaacaacataatgctgctgggattgcctggat 1620

cccgtactttggaccgggtgcagaaggcatatacactgaaggccttatgcacaaccaaaa 1680

tgccttagtctgtggactcagacaacttgcaaatgaaaccactcaagctctgcagctttt 1740

cttaagggccacgacggagctgcggacatataccatactcaataggaaggccatagattt 1800

ccttctgcgacgatggggcgggacatgtaggatcctgggaccagattgttgcattgagcc 1860

acatgattggaccaaaaacatcactgataaaatcaaccaaatcatccatgatttcatcga 1920

caaccctttacccaatcaggataatgatgataattggtggacgggctggagacagtggat 1980

ccctgcaggaataggcattactggaattattattgcaatcattgctcttctttgcgtctg 2040

caagctgctttgttgagctagctgtttaggcgatatccatgctcaaagaggcctcaatta 2100

tatttgagtt tttaattttt atgaaaaaaa ct 2132

<210> 12

<211> 1586

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Разработанная транскрипционная единица, содержащая сайт инициации

транскрипции, последовательность GPBundibugyovirus, модифицированная путем

удаления области, кодирующей муцинподобный домен, и сигнал для терминации и

полиаденилирования

<400> 12

aacagagatcgatctgtttacgcgtatggagggtcttagcctactccaattgcccagaga 60

taaatttcgaaaaagctctttctttgtttgggtcatcatcttatttcaaaaggccttttc 120

catgcctttgggtgttgtgaccaacagcactttagaagtaacagagattgaccagctagt 180

ctgcaaggatcatcttgcatccactgaccagctgaaatcagttggtctcaacctcgaggg 240

gagcggagtatctactgacatcccatctgcgacaaagcgttggggcttcaggtctggtgt 300

gcctcccaaagtggtcagctatgaagcaggagaatgggctgaaaattgctacaatcttga 360

aataaagaagccggacgggagcgaatgcttacccccaccgccggatggtgtcagaggctt 420

tccaaggtgccgctatgttcacaaagcccaaggaaccgggccctgcccgggtgactatgc 480

ctttcacaaggatggagctttcttcctctatgacaggctggcttcaactgtaatttacag 540

aggagtcaattttgctgagggggtaattgccttcttgatattggctaaaccaaaggaaac 600

gttccttcaatcaccccccattcgagaggcagtaaactacactgagaatacatcaagtta 660

ctatgccacatcctacttggagtacgaaatcgaaaattttggtgctcaacactccacgac 720

ccttttcaaaattaacaacaatacttttgttcttctggacaggccccacacgcctcagtt 780

ccttttccagctgaatgataccattcaccttcaccaacagttgagcaacacaactgggaa 840

actaatttggacactagatgctaatatcaatgctgatattggtgaatgggctttttggga 900

aaataaaaaaaatctctccgaacaactacgtggagaagagctgtctttcgaaactttatc 960

gctcaacaaacgcagcagaagacaagttaacaccagggccacgggtaaatgcaatcccaa 1020

cttacactactggactgcacaagaacaacataatgctgctgggattgcctggatcccgta 1080

ctttggaccgggtgcagaaggcatatacactgaaggccttatgcacaaccaaaatgcctt 1140

agtctgtggactcagacaacttgcaaatgaaaccactcaagctctgcagcttttcttaag 1200

ggccacgacggagctgcggacatataccatactcaataggaaggccatagatttccttct 1260

gcgacgatggggcgggacatgtaggatcctgggaccagattgttgcattgagccacatga 1320

ttggaccaaaaacatcactgataaaatcaaccaaatcatccatgatttcatcgacaaccc 1380

tttacccaatcaggataatgatgataattggtggacgggctggagacagtggatccctgc 1440

aggaataggcattactggaattattattgcaatcattgctcttctttgcgtctgcaagct 1500

gctttgttgagctagctgtttaggcgatatccatgctcaaagaggcctcaattatatttg 1560

agtttttaat ttttatgaaa aaaact 1586

<210> 13

<211> 2131

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Разработанная транскрипционная единица, содержащая сайт инициации

транскрипции, последовательность GPSudanvirus и сигнал для терминации и

полиаденилирования

<400> 13

aacagagatcgatctgtttacgcgtatggttacatcaggaattctacaattgccccgtga 60

acgcttcaggaaaacatcattttttgtttgggtaataatcctattccataaggttttccc 120

tatcccattgggcgtagttcacaacaacactctccaggtaagtgatatagataaattggt 180

gtgccgggataaactttcctccacaagtcaactgaaatcggtcgggcttaacctagaagg 240

taatggagttgccacagatgtaccaacagcaacgaagagatggggattccgagccggtgt 300

tccacccaaagtggtgaactacgaggctggggagtgggctgaaaactgctacaacctgga 360

catcaagaaagcagatggtagcgaatgcctacctgaagcccctgagggtgtaagaggctt 420

ccctcgctgccgttatgtgcacaaggtttctggaacagggccgtgtcctgaaggtttcgc 480

tttccacaaagaaggcgctttcttcctgtatgatcgactggcatcaacaatcatctatcg 540

aagcaccacgttttcagaaggtgttgtggctttcttgatcctccccaagactaaaaagga 600

ctttttccaatcaccaccactacatgaaccggccaatatgacaacagacccatccagcta 660

ctaccacacagtcacacttaattatgtggctgacaattttgggaccaatatgactaactt 720

tctgtttcaagtggatcatctaacttatgtgcaacttgaaccaagattcacaccacaatt 780

tcttgtccaactcaatgagaccatttatactaatgggcgtcgcagcaacaccacaggaac 840

actaatttggaaagtaaatcctactgttgacaccggcgtaggtgaatgggccttctggga 900

aaataaaaaaaacttcacaaaaaccctttcaagtgaagagctgtctgtcatacttgtacc 960

aagagcccaggatccaggcagcaaccagaagacgaaggtcactcccaccagcttcgccaa 1020

caaccaaacctccaagaaccacgaagacttggttccaaaggatcccgcttcagtcgttca 1080

agtgcgagacctccagagggaaaacacagtgccgacctcacccttgaacacagtccccac 1140

aactctgatccccgacacaatggaagagcaaaccaccagccactacgaactaccaaacat 1200

ttccggaaaccatcaagagaggaacaacaccgcacaccccgaaactctcgccaacaatcc 1260

tccagacaacacaaccccttcgacaccacctcaagacggtgagcggacaagttcccacac 1320

aacaccctccccccgcccagtcccaaccagcacaatccatcccaccacacgagagactca 1380

aattcccaccacaatgataacaagccatgatactgacagtaatcgacccaacccaattga 1440

catcagcgagtctacagagccaggactactcaccaacaccataagaggggttgcaaattt 1500

gctgacaggttcaagaagaacccggagggaaatcaccttgagaacacaagccaaatgtaa 1560

tccgaacctacactattggacaacccaagatgaaggggctgccattggtctagcctggat 1620

accttacttcgggcccgcagcagagggaatttatacggaaggaataatgcacaatcaaaa 1680

tgggctaatttgcgggttgaggcaactagcaaatgagacgactcaagccctacagttatt 1740

cttgcgtgctaccacggaattgcgcactttctccatattgaatcgaaaagccatcgactt 1800

cttacttcaaagatggggaggaacgtgccacatcttaggcccagattgctgtattgagcc 1860

ccatgattggactaagaacattactgacaagatagatcaaatcattcatgatttcattga 1920

taaacctctaccagatcagacagataatgacaattggtggacagggtggaggcaatgggt 1980

tcctgctgggattgggatcacgggggtaataatcgcagttatagcactgctgtgtatttg 2040

caaatttctactctagctagctgtttaggcgatatccatgctcaaagaggcctcaattat 2100

atttgagttt ttaattttta tgaaaaaaac t 2131

<210> 14

<211> 1582

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Разработанная транскрипционная единица, содержащая сайт инициации

транскрипции, последовательность GPSudanvirus, модифицированная путем

удаления области, кодирующей муцинподобный домен, и сигнал для терминации и

полиаденилирования

<400> 14

aacagagatcgatctgtttacgcgtatggttacatcaggaattctacaattgccccgtga 60

acgcttcaggaaaacatcattttttgtttgggtaataatcctattccataaggttttccc 120

tatcccattgggcgtagttcacaacaacactctccaggtaagtgatatagataaattggt 180

gtgccgggataaactttcctccacaagtcaactgaaatcggtcgggcttaacctagaagg 240

taatggagttgccacagatgtaccaacagcaacgaagagatggggattccgagccggtgt 300

tccacccaaagtggtgaactacgaggctggggagtgggctgaaaactgctacaacctgga 360

catcaagaaagcagatggtagcgaatgcctacctgaagcccctgagggtgtaagaggctt 420

ccctcgctgccgttatgtgcacaaggtttctggaacagggccgtgtcctgaaggtttcgc 480

tttccacaaagaaggcgctttcttcctgtatgatcgactggcatcaacaatcatctatcg 540

aagcaccacgttttcagaaggtgttgtggctttcttgatcctccccaagactaaaaagga 600

ctttttccaatcaccaccactacatgaaccggccaatatgacaacagacccatccagcta 660

ctaccacacagtcacacttaattatgtggctgacaattttgggaccaatatgactaactt 720

tctgtttcaagtggatcatctaacttatgtgcaacttgaaccaagattcacaccacaatt 780

tcttgtccaactcaatgagaccatttatactaatgggcgtcgcagcaacaccacaggaac 840

actaatttggaaagtaaatcctactgttgacaccggcgtaggtgaatgggccttctggga 900

aaataaaaaaaacttcacaaaaaccctttcaagtgaagagctgtctgtcatacttgtacc 960

aagaagaagaacccggagggaaatcaccttgagaacacaagccaaatgtaatccgaacct 1020

acactattggacaacccaagatgaaggggctgccattggtctagcctggataccttactt 1080

cgggcccgcagcagagggaatttatacggaaggaataatgcacaatcaaaatgggctaat 1140

ttgcgggttgaggcaactagcaaatgagacgactcaagccctacagttattcttgcgtgc 1200

taccacggaattgcgcactttctccatattgaatcgaaaagccatcgacttcttacttca 1260

aagatggggaggaacgtgccacatcttaggcccagattgctgtattgagccccatgattg 1320

gactaagaac attactgaca agatagatca aatcattcat gatttcattg ataaacctct 1380

accagatcag acagataatg acaattggtg gacagggtgg aggcaatggg ttcctgctgg 1440

gattgggatc acgggggtaa taatcgcagt tatagcactg ctgtgtattt gcaaatttct 1500

actctagcta gctgtttagg cgatatccat gctcaaagag gcctcaatta tatttgagtt 1560

tttaattttt atgaaaaaaa ct 1582

<210> 15

<211> 2147

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Разработанная транскрипционная единица, содержащая сайт инициации

транскрипции, последовательность GPMarburgvirus и сигнал для терминации и

полиаденилирования

<400> 15

aacagagatcgatctgtttacgcgtatgtggactacatgcttctttatcagtctcatctt 60

aatccaagggataaaaactctccctattttggagatagccagtaacgatcaaccccaaaa 120

tgtggattcggtatgctccggaactctccagaaaactgaagacgtccatctgatgggatt 180

tacactgagcggtcagaaagttgctgattcccctttggaggcatccaagcgatgggcttt 240

caggacaggtgtacctcctaagaatgttgagtatacggaaggggaggaagccaaaacatg 300

ctacaatataagtgtaacggatccctctggaaaatccttgctgttagatcctcccaccaa 360

cgtccgagactatcctaaatgcaagactatccatcacattcaaggtcaaaaccctcatgc 420

gcaggggattgccctccatttgtggggagcatttttcctatatgatcgcattgcctccac 480

aacaatgtaccgaggcaaagtcttcactgaagggaacatagcagccatgattgtcaataa 540

gacagtgcacaaaatgattttctcgcgtcaaggacaagggtatcgtcacatgaatctgac 600

ttctactaacaagtattggacaagtagcaacggaacgcaaacaaatgacactggatgttt 660

cggtactcttcaagaatacaattctacgaagaaccaaacatgtgctccgtctaaaacacc 720

cccaccaccgcccacagcccatccggagatcaaacccacaagcaccccaaccgatgccac 780

tagactcaacaccacaaacccaaacagtgatgatgaggatctcacaacatccggctcggg 840

gtctggggaacaggaaccctatacgacttctgatgcggtcactaagcaagggctttcatc 900

aacaatgccacccactccctcaccgcaaccaggcacgccacagcagggaggaaacaacac 960

aaaccactcccaggacgctgcaactgaacttgacaacaccaatacaactgcacaacctcc 1020

catgccttcccacaacacgaccacaatctcgaccaacaacacgtccaaacacaacctcag 1080

caccctctccgaaccaccacaaaacaccaccaatcccaacacacaaagcatggccactga 1140

aaatgagaaaaccagtgcccctccgaaaacaaccctgcctccaacagaaagtcctaccac 1200

agaaaagagcaccaacaatacaaaaagccccaccacaatggaaccaaatacaacaaatgg 1260

acatttcact agtccctcct ccacctccaa ctcgactact caacatctta tctacttcag 1320

gaggaaacga agtatcctct ggagggaagg cgatatgttc cctttcctag atgggttaat 1380

aaatgctcca attgattttg atccagttcc aaatacaaag acaatctttg atgaatcttc 1440

tagttctggt gcttcagccg aggaagatca acatgcatcc tccaatatca gcttgacttt 1500

atcttatctt cctcatacaa gtgaaaacac tgcctactct ggagagaatg aaaatgattg 1560

tgatgcagag ctaagaattt ggagcgttca ggaggacgac ctggcagcag ggctcagttg 1620

gataccattc ttcggccctg gaatcgaagg actttatacc gctggtttaa tcaagaacca 1680

aaacaatttg gtctgcaggt tgaggcgtct agccaatcaa actgcaaaat ctttggaact 1740

cttactaagg gtcacaaccg aggaaagaac attttccttg atcaatagac atgctattga 1800

ctttctactc acaaggtggg gaggaacatg caaagtgctt ggacctgatt gttgcatagg 1860

aatagaggac ttgtccagaa atatttcaga acagattgac caaatcaaga aggacgaaca 1920

aaaagagggg actggttggg gtctgggtgg taagtggtgg acatccgact ggggtgttct 1980

tactaacttg ggcatcttgc tactattgtc catagctgtc ttgattgctc tatcctgtat 2040

ttgtcgtatc ttcactaaat atattggata ggctagctgt ttaggcgata tccatgctca 2100

aagaggcctc aattatattt gagtttttaa tttttatgaa aaaaact 2147

<210> 16

<211> 1574

<212>DNA

<213>ArtificialSequence

<220>

<223> Разработанная транскрипционная единица, содержащая сайт инициации

транскрипции, последовательность GPMarburgvirus, модифицированная путем

удаления области, кодирующей муцинподобный домен, и сигнал для терминации и

полиаденилирования

<400> 16

aacagagatcgatctgtttacgcgtatgtggactacatgcttctttatcagtctcatctt 60

aatccaagggataaaaactctccctattttggagatagccagtaacgatcaaccccaaaa 120

tgtggattcggtatgctccggaactctccagaaaactgaagacgtccatctgatgggatt 180

tacactgagcggtcagaaagttgctgattcccctttggaggcatccaagcgatgggcttt 240

caggacaggtgtacctcctaagaatgttgagtatacggaaggggaggaagccaaaacatg 300

ctacaatataagtgtaacggatccctctggaaaatccttgctgttagatcctcccaccaa 360

cgtccgagactatcctaaatgcaagactatccatcacattcaaggtcaaaaccctcatgc 420

gcaggggattgccctccatttgtggggagcatttttcctatatgatcgcattgcctccac 480

aacaatgtaccgaggcaaagtcttcactgaagggaacatagcagccatgattgtcaataa 540

gacagtgcacaaaatgattttctcgcgtcaaggacaagggtatcgtcacatgaatctgac 600

ttctactaacaagtattggacaagtagcaacggaacgcaaacaaatgacactggatgttt 660

cggtactcttcaagaatacaattctacgaagaaccaaacatgtgctccgtctaaaacacc 720

cccaccaccgcccacagctcatccgaggaggaaacgaagtatcctctggagggaaggcga 780

tatgttccctttcctagatgggttaataaatgctccaattgattttgatccagttccaaa 840

tacaaagacaatctttgatgaatcttctagttctggtgcttcagccgaggaagatcaaca 900

tgcatcctccaatatcagcttgactttatcttatcttcctcatacaagtgaaaacactgc 960

ctactctggagagaatgaaaatgattgtgatgcagagctaagaatttggagcgttcagga 1020

ggacgacctggcagcagggctcagttggataccattcttcggccctggaatcgaaggact 1080

ttataccgctggtttaatcaagaaccaaaacaatttggtctgcaggttgaggcgtctagc 1140

caatcaaactgcaaaatctttggaactcttactaagggtcacaaccgaggaaagaacatt 1200

ttccttgatcaatagacatgctattgactttctactcacaaggtggggaggaacatgcaa 1260

agtgcttggacctgattgttgcataggaatagaggacttgtccagaaatatttcagaaca 1320

gattgaccaaatcaagaaggacgaacaaaaagaggggactggttggggtctgggtggtaa 1380

gtggtggacatccgactggggtgttcttactaacttgggcatcttgctactattgtccat 1440

agctgtcttgattgctctatcctgtatttgtcgtatcttcactaaatatattggataggc 1500

tagctgtttaggcgatatccatgctcaaagaggcctcaattatatttgagtttttaattt 1560

ttatgaaaaa aact 1574

<---

Изобретение относится к иммунологии и вирусологии. Создано иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа к патогенным для человека филовирусам, включающее основу, представляющую собой рекомбинантный аденовирус человека 26 серотипа или 5 серотипа, содержащий экспрессионную кассету SEQIDNO:1, или SEQIDNO:2, или SEQIDNO:3, или SEQIDNO:4, или SEQIDNO:5, или SEQIDNO:6, или SEQIDNO:7, или SEQIDNO:8. Кроме того, создано иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа к патогенным для человека филовирусам, включающее основу, представляющую собой рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий нуклеиновую кислоту, соответствующую кДНК SEQIDNO:9, или SEQIDNO:10, или SEQIDNO:11, или SEQIDNO:12, или SEQIDNO:13, или SEQIDNO:14, или SEQIDNO:15, или SEQIDNO:16. Также был разработан способ использования иммунобиологического средства, заключающийся в его введении в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции специфического иммунитета против вируса Эбола и/или вируса Марбург. При этом возможно последовательное введение в организм млекопитающих любого из иммунобиологических средств с интервалом более чем в 1 неделю или одновременное введение в организм млекопитающих нескольких иммунобиологических средств. Разработанные варианты иммунобиологического средства могут вводиться интраназально и/или подкожно и/или внутримышечно. Изобретение может быть использовано в качестве специфического профилактического средства против заболеваний, вызванных вирусом Ebola virus (EBOV), Bundibugyo virus (BDBV), Sudan virus (SUDV), Marburg virus (MARV). 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 14 табл., 13 пр.

1. Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа к патогенным для человека филовирусам, включающее основу, представляющую собой рекомбинантный аденовирус человека 26 серотипа, содержащий экспрессионную кассету SEQIDNO:1, или SEQIDNO:2, или SEQIDNO:3, или SEQIDNO:4, или SEQIDNO:5, или SEQIDNO:6, или SEQIDNO:7, или SEQIDNO:8.

2. Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа к патогенным для человека филовирусам, включающее основу, представляющую собой рекомбинантный аденовирус человека 5 серотипа, содержащий экспрессионную кассету SEQIDNO:1, или SEQIDNO:2, или SEQIDNO:3, или SEQIDNO:4, или SEQIDNO:5, или SEQIDNO:6, или SEQIDNO:7, или SEQIDNO:8.

3. Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа к патогенным для человека филовирусам, включающее основу, представляющую собой рекомбинантный вирус везикулярного стоматита, содержащий нуклеиновую кислоту, соответствующую кДНК SEQIDNO:9, или SEQIDNO:10, или SEQIDNO:11, или SEQIDNO:12, или SEQIDNO:13, или SEQIDNO:14, или SEQIDNO:15, или SEQIDNO:16.

4. Способ использования иммунобиологического средства по пп.1-3, заключающийся во введении иммунобиологического средства по пп.1-3 в организм млекопитающих в эффективном количестве для индукции иммунного ответа к патогенным для человека филовирусам.

5. Способ использования по п.4, где последовательно вводят в организм млекопитающих любое из иммунобиологических средств по п.1, или 2, или 3, а затем вводят любое из иммунобиологических средств по п.1, или 2, или 3 с интервалом более чем в 1 неделю.

6. Способ использования по п.4, где одновременно вводят в организм млекопитающих любое из иммунобиологических средств по п.1, или 2, или 3 и любое из иммунобиологических средств по п.1, или 2, или 3.

7. Способ использования по п.4, где способ введения иммунобиологического средства интраназальный, и/или подкожный, и/или внутримышечный.

8. Способ использования по п.4, заключающийся во введении в организм млекопитающих композиции, содержащей любое количество иммунобиологических средств по любому из пп.1-3.

9. Способ использования по п.8, отличающийся тем, что композицию вводят многократно с интервалом более чем в 1 неделю.

10. Иммунобиологическое средство для индукции иммунного ответа к патогенным для человека филовирусам по пп. 1-3, где филовирусами являются вирусы Эболы и/или Марбург.