НОВЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ 1,2,4-ТРИАЗОЛО-[3,4-B]-1,3,4-ТИАДИАЗОЛА Российский патент 2022 года по МПК C07D513/04 A61K31/433 A61K31/4439 A61P35/00 

Техническая область изобретения

Настоящее изобретение относится к новым производным 1,2,4-триазоло-[3,4-b]-1,3,4-тиадиазола, способам их получения и применению в лечении рака.

Уровень техники

Рак все еще остается фатальной проблемой здравоохранения, даже несмотря на отмеченный прогресс в области терапевтических средств. В наше время наблюдается постоянное увеличение летальных исходов от различных типов рака, и считается, что в 2030 году число летальных исходов достигнет 12 миллионов. Обычно противораковую терапию рассматривают как проблематичную из-за сопровождающей ее высокой токсичности. Главными побочными эффектами лекарственных средств против рака являются тошнота, рвота, диарея, алопеция и инфекции (которые обычно вызываются лейкопенией). Следовательно, разработка новых нетоксичных или менее токсичных активных лекарственных средств против рака имеет наибольшее значение и необходимость.

Гетероциклические соединения, включающие тиазольные или тиадиазольные химические структуры, показали очень важную биологическую активность, такую как антибактериальная [a) Holla, B.S., Shivananda, M.K., Akberali, P.M., Baliga, S., Safeer, S., Farmaco, 1996, 51, 785. b) Zhang, Z.Y., Sum, X.W., Chu, C.H., Zhao, L., J. Chim. Chem. Soc., 1997, 44, 535. c) Demirbas, N., Demirbas, A., Karaoglu, S.A., Celik, E., Arkivoc., 2005, 1, 75.], противораковая [a) Ibrahim, D.A., Eur. J. Med. Chem., 2009, 44, 2776 b) Al-Masoudi, N.A., Al-Soud, Y.A., Nucleos:Nucleot. Nucleic Acids, 2008, 27, 1034. c) Chowrasia, D., Karthikeyan, C., Choure, L., Sahabjada, Gupta, M., Arshad, Md., Trivedi, P., Arab. J. of Chem., 2013, doi:10.1016/j.arabjc,2013,08,026. d) Ilango, K., Valentina, P., Eur. J. Chem., 2010, 1, 50.], противовирусная [a) Kritsanida, M., Mouroutsou, A., Marakos, P., Pouli, N., Papakonstantinou-Garoufalias, S., Pannecouque, C., Witvrouw, M., Declercq, E., Farmaco, 2002, 57, 253. b) Invidiata, F.P., Simoni, D., Skintu, F., Pinna, N., Farmaco., 1996, 51, 659. c) Srivastava, V., Sen, S., Shekar, R., Indian J. Chem., 1994, 33B, 344.], противовоспалительная [a) Chawla, G., Kumar, U., Bawa, S., Kumar, J., J. Enzyme Inhib. Med. Chem., 2012, 27, 658. b) Amir, M., Harish, K., Javed, S.A., Eur. J. Med. Chem., 2008, 43, 2056. c) Prasad, A.R., Ramlingam, T., Bhaskar Rao A., Diwan, P.B., Sattur., Indian J. Chem., 1986, 25B, 566.], аналгезирующая [a) Srivastava, V., Sen, S., Shekar, R., Indian J. Chem., 1994, 33B, 344. b) Chawla, G., Kumar, U., Bawa, S., Kumar, J., J. Enzyme Inhib. Med. Chem., 2012, 27, 658.], противогрибковая [a) Karabasanagouda, T., Adhikari, A.V., Suchethasettey, N., Eur. J. Med. Chem., 2007, 42, 521. b) Tiwari, N., Chaturvedi, B., Nizamuddin., Agric. Biol. Chem., 1988, 52, 1229.] и противогельминтозная [α) El-Khawass, S.M., Khalil, M.A., Hazzaa, A.A., Bassiouny, H.A., Loutfy, N.F., Farmaco. 1989, 44, 703. 2. Imitiaz, M., Kumar, V., Indian J. Chem., 1992, 31B, 673.]. В более старых исследованиях некоторые производные амино- и дииминотиадиазола показали противораковую активность [a) Hill, D.L. Cancer Chemother. Pharmacol. 1980, 4, 215. b) Nelson, J.A., Rose, L.M., Benette, L. Cancer Res. 1977, 37, 182. c) Tsukamoto, K., Suno, M., Igarashi, K., Kozai, Y., Sugino, Y., Cancer Res. 1975, 35, 2631].

Сущность изобретения

Настоящее изобретение предоставляет новые производные 1,2,4-триазоло-[3,4-b]-1,3,4-тиадиазола и их фармацевтически приемлемые соли, способы их получения и биологическую активность. Соединения согласно настоящему изобретению могут быть использованы в противораковых терапиях вследствие их противораковой активности, сопровождающейся низкой острой токсичностью.

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение предоставляет 1,2,4-триазоло-[3,4-b]-1,3,4-тиадиазолы формулы (I) или их фармацевтически приемлемые соли

в которой,

R₁ и R₂ являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из C₁-C₅ алкила, фенила, метилфенила,

R₃ выбран из группы, состоящей из CH₂R₈, CH₂CH₂R₈, CH=CHR₈, CH₂CH₂CH₂R₈, CH₂CH=CHR₈, CH=CHCH₂R₈, CH=CH-OR₈, CH₂-OR₈, CH₂CH₂-OR₈, CH=CH-NHR₈, CH₂-NHR₈, CH₂CH₂-NHR₈, CH=CH-SR₈, CH₂-SR₈, CH₂CH₂-SR₈,

, , ,

замещенного или незамещенного фенила, бензила, пиридила, пиримидинила, триазинила, триазинанила, оксазинила, оксазинанила, циклогексанила, циклогексенила, циклогексадиенила, пиранила, оксатианила, пиперидинила, циклопентанила, циклопентенила, циклопентадиенила, пирролидинила, пирролила, фуранила, оксазолидинила, пиразолидинила, тиофенила, оксатиинил, оксатиолила, оксатиоланила, причем заместитель или заместители выбраны из группы, состоящей из метила, F, Cl, Br, I, NO₂, CN, NH₂, OCH₂X, CH₂X, CX₃, CH₂CH₂X, OH, причем X выбран из группы, состоящей из H, F, Cl, Br, I,

R₄, R₅, R₆, R₇ являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из H, F, Cl, Br, I, NO₂, CN, NH₂, OCH₃, OH, NHCH₂CH₃, N(CH₃)₂,

R₈ выбран из группы, состоящей из

, , ,

замещенного или незамещенного фенила, бензила, пиридила, пиримидинила, триазинила, триазинанила, оксазинила, оксазинанила, циклогексанила, циклогексенила, циклогексадиенила, пиранила, оксатианила, пиперидинила, циклопентанила, циклопентенила, циклопентадиенила, пирролидинила, пирролила, фуранила, оксазолидинила, пиразолидинила, тиофенила, оксатиинила, оксатиолила, оксатиоланила, причем заместитель или заместители выбраны из группы, состоящей из метила F, Cl, Br, I, NO₂, CN, NH₂, OCH₂X, CH₂X, CX₃, CH₂CH₂X, OH, причем X выбран из группы, состоящей из H, F, Cl, Br, I,

R₉ выбран из группы, состоящей из NHR₁₀, NR₁₁R₁₂,

R₁₀ выбран из группы, состоящей из C₁-C₅ алкила, фенила,

R₁₁ и R₁₂ являются одинаковыми или разными, и они обозначают C₁-C₅ алкил.

Предпочтительно, R₁ и R₂ являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из C₁-C₃ алкила, фенила, метилфенила. Более предпочтительно R₁ и R₂ являются метилом.

Предпочтительно, R₃ выбран из группы, состоящей из CH₂R₈, CH₂CH₂R₈, CH₂CH₂CH₂R₈, CH₂CH=CHR₈,

, , ,

замещенного или незамещенного фенила, бензила, пиридила, причем заместитель или заместители выбраны из группы, состоящей из метила, F, Cl, Br, I, NO₂, CN, NH₂, OCH₂X, CH₂X, CX₃, CH₂CH₂X, OH, причем X выбран из группы, состоящей из H, F, Cl, Br, I. Более предпочтительно, R₃ выбран из группы, состоящей из CH=CHR₈, CH₂CH₂CH₂R₈,

, , ,

замещенного или незамещенного фенила, пиридила, причем заместитель или заместители выбраны из группы, состоящей из F, Cl, NO₂.

Предпочтительно, R₄, R₅, R₆, R₇ являются одинаковыми или разными, и они выбраны из группы, состоящей из H, Cl, Br, I, NH₂, OCH₃. Более предпочтительно, R₄ и R₇ обозначают H, R₅ и R₆ обозначает OCH₃.

Предпочтительно, R₈ выбран из группы, состоящей из

, , ,

замещенного или незамещенного фенила, бензила, пиридила, причем заместитель или заместители выбраны из группы, состоящей из метила, F, Cl, Br, I, NO₂, CN, NH₂, OCH₂X, CH₂X, CX₃, CH₂CH₂X, OH, причем X выбран из группы, состоящей из H, F, Cl, Br, I. Более предпочтительно, R₈ выбран из группы, состоящей из

, , ,

замещенного или незамещенного фенила, пиридила, причем заместитель или заместители выбраны из группы, состоящей из F, Cl, NO₂.

Предпочтительно, R₁₀ выбран из группы, состоящей из C₁-C₃ алкила, фенила. Более предпочтительно, R₁₀ является метилом.

Предпочтительно, R₁₁ и R₁₂ являются одинаковыми или разными, и они обозначают C₁-C₃ алкил. Более предпочтительно R₁₁ и R₁₂ являются метилом.

Соединения формулы (I) содержат по меньшей мере одну основную группу, и, следовательно, они могут образовывать фармацевтически приемлемые соли в результате обработки подходящей кислотой. Подходящие кислоты включают фармацевтически приемлемые органические кислоты, а также фармацевтически приемлемые неорганические кислоты. Примеры фармацевтически приемлемых солей включают хлорид, бромид, сульфат, фосфат, нитрат, ацетат, пропионат, бутират, малеат, тартрат, цитрат, лактат, оксалат, сукцинат и бензоат.

Соединения формулы (I) или их фармацевтически приемлемые соли могут использоваться в лечении различных типов злокачественных опухолей (солидные опухоли, лимфомы и лейкоз). Предпочтительно, они используются в лечении рака яичника, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака легких и лимфом. Более предпочтительно они используются в лечении овариальной аденокарциномы и мелкоклеточного и немелкоклеточного рака легких.

Соединения формулы (I) или их фармацевтически приемлемые соли показывают сильное цитостатическое и цитотоксическое действие и низкую острую и системную токсичность.

Настоящее изобретение также предоставляет фармацевтические композиции, содержащие соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль. Такая фармацевтическая композиция может быть составлена так, чтобы ее можно было вводить подходящим путем, таким как пероральное, внутриносовое, топическое или парентеральное введение. Например, такая фармацевтическая композиция может быть составлена в таблетку, капсулу, порошок, раствор, суспензию, мазь или гель. Такая композиция обычно содержит, кроме соединения формулы (I) или его фармацевтически приемлемой соли, фармацевтически приемлемый носитель. Такой носитель может включать эксципиенты, хорошо известные в данной области техники, такие как разбавители, связующие, наполнители, разрыхлители, лубриканты, растворители, загустители, суспендирующие агенты, желирующие агенты, буферы или консерванты. Эти композиции могут быть получены согласно способам, которые известны в данной области техники.

Настоящее изобретение также предоставляет способ получения соединений формулы (I) или их фармацевтически приемлемых солей.

Общий путь синтеза 1,2,4-триазоло-[3,4-b]-1,3,4-тиадиазола представлен ниже на Схеме 1.

Схема 1

Сульфонилхлориды (V) могут быть синтезированы реакцией ароматических сложных эфиров (VI) с хлорсульфоновой кислотой. Сульфонамиды (IV) могут быть получены реакцией сульфонилхлоридов (V) с аминами. Гидразиды (III) могут быть получены из сульфонамидов (IV) обработкой водным раствором гидразина согласно методологии Camoutsis и его коллег (Ezabadi IR, Camoutsis C, Zoumpoulakis P, Geronikaki A, Soković M, Glamocilija J, Cirić A. Bioorg Med Chem. 2008, 16(3):1150-61). Стадии 4 и 5 могут быть выполнены согласно способу Mathew и его коллег (Mathew, V.; Keshavayya, J; Vaidya, V. P.; Giles, D. Eur. J. Med. Chem., 2007, 42, 521). Таким образом гидразиды (III) могут реагировать с дисульфидом углерода и гидразином, приводя к аминотриазолам (II) через промежуточные калиевые соли дитиокарбаматов. Наконец, аминотриазолы (II) могут быть превращены в 3,6-дизамещенные 1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,2,4-тиазолы (I) реакцией с кислотами в присутствии оксихлорида фосфора.

Пример 1

Синтез 2-(2-(хлорсульфонил)-4,5-диметоксифенил)метилацетата

В колбу, содержащую 2-(3,4-диметоксифенил)метилацетат (3,7 г, 17,65 ммоль), добавляли CHCl₃ (35 мл) и затем хлоросульфоновую кислоту (5,28 мл, 79,4 ммоль) по каплям при 0°C в атмосфере Ar. Раствор приобретал темно-фиолетовый цвет, и его перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. Реакцию останавливали постепенным добавлением воды (35 мл) при 0°C с последующей экстракцией DCM (3×35 мл), высушиванием органического слоя над Na₂SО₄, конденсацией и колоночной хроматографией с элюентом 2:1 PS/ЕА. Каждый продукт собирали в форме твердого вещества белого цвета с 88%-ым выходом.

Синтез 2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметокси-фенилацетилгидразида.

В систему автоклава, содержащую 2-(2-(хлорсульфонил)-4,5-диметоксифенил)метилацетат (450 мг, 1,46 ммоль), растворенный в THF (1,8 мл), добавляли раствор диметиламина в THF 2M (1,47 мл, 2,92 ммоль) при 0°C. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч и наблюдали твердое вещество бледно-желтого цвета. После того, как реакция была закончена, раствор фильтровали в колбу с необходимым количеством DCM, концентрировали на ротационном испарителе, и продукт собирали как твердое вещество бледно-желтого цвета с 100%-ым выходом.

Синтез 5-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметокси-бензил]-4-амино-3-меркапто-1,2,4-триазола.

В холодный раствор 2-(N,N-диметилoсульфамоил)-4,5-диметокси-фенилацетилгидразида (0,01 моль) в абсолютном этаноле (150 мл) добавляли гидроксид калия (0,015 моль) и дисульфид углерода (0,015 моль). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 20 ч. Во время реакции осаждалась промежуточная калиевая соль дитиокарбамата. Затем сухой эфир (150 мл) добавляли для завершения кристаллизации сформированной соли, полученной фильтрацией, и затем высушивали сухим эфиром.

Соль в форме суспензии в 80%-м водном растворе гидразина (0,02 моль) перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение 2 ч. Реакционную смесь охлаждали, растворяли в холодной воде и нейтрализовали 10%-й соляной кислотой. Осадок собирали фильтрацией, промывали холодной водой, высушивали и перекристаллизовывали в метаноле.

Выход: 56%, Т.пл. 222-223°C (CH₃OH), ¹H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) δ 13,30 (с, 1 H), 7,15 (с, 1 H), 6,92 (с, 1 H), 5,46 (с, 2H), 4,20 (с, 2H), 3,71 (с, 3H), 3,68 (с, 3H), 3,22 (с, 6H), ¹³C ЯМР (126 МГц, DMSO-d6) δ 165,8, 151,8, 151,5, 147,1, 127,7, 126,3, 115,6, 112,7, 55,9, 36,8, 28,1. Анализ: C₁₃H₁₉N₅O₄S₂ (373). Рассчит. %: C:41,82, H:5,09, найдено N:18,76: C:41,77, H:5,12, N:18,79

Синтез 3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметокси-бензил]-6-фенил-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазола.

Смесь 5-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметокси-бензил]-4-амино-3-меркапто-1,2,4-триазола (0,01 моль) и бензойной кислоты (0,01 моль) в сухом оксихлориде фосфора (3,7 мл) перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение 2 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и затем выливали на лед. Избыток оксихлорида фосфора нейтрализовали сухим карбонатом калия, и соответствующим количеством гидроксида калия, пока pH реакции не становился равен 8. Твердое вещество отфильтровывали, промывали обильно водой и высушивали.

Выход: 74%, Т.пл. 212-214°C (CH₃OH), ¹H-ЯМР (CDCl₃) δ 7,95 (д, J=6,9 Гц, 2H), 7,68 (м, 1H), 7,63 (м, 2H), 7,30 (с, 1H), 7,21 (с, 1H), 4,78 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,80 (с, 3H), 2,63 (с, 6H), ИК v см^{- 1} 1601 (C=N), 1573, 1513, 1470, 1446 (C=C), 1265 (N-N=C), 1328 (S-O антисим.), 1141 (S-O сим.), Анализ: C₂₀H₂₁N₅O₄S₂ (459). Рассчит. %: C:52,28, H:4,57, N:15,25 Найдено: C:52,25, H:4,53, N:15,27

Пример 2

В соответствии с методологией примера 1, осуществляли синтез следующих тиазолов.

3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(4-хлорфенил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.

Выход: 52%. Т.пл. 228-229°C (CH₃OH-CH₂Cl₂), ¹H-ЯМР (CDCl₃) δ 7,97 (д, J=8,5 Гц, 2H), 7,71 (д, J=8,6 Гц, 2H), 7,30 (с, 1H), 7,20 (с, 1H), 4,78 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,79 (с, 3H), 2,62 (с, 6H), ИК v см^-1 1600 (C=N), 1573, 1519, 1470 (C=C), 1272 (N-N=C), 1339 (S-O антисим.), 1138 (S-O сим), Анализ: C₂₀H₂₀N₅O₄S₂Cl (493,5). Рассчит. %: C:48,63, H:4,05, N:14,18 Найдено: C:48,65, H:4,01, N:14,21.

3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(2-хлор-4-нитрофенил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол

Выход: 65%. Т.пл. 216-217°C (CH₃OH), ¹H-ЯМР (CDCl₃) δ 8,57 (д, J=2,3 Гц, 1H), 8,40 (дд, J=8,7, 2,3 Гц, 1H), 8,27 (д, J=8,7 Гц, 1H), 7,30 (с, 1H), 7,20 (с, 1H), 4,80 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,80 (с, 3H), 2,61 (с, 6H), ИК v см^-1 1603 (C=N), 1573, 1518, 1476 (C=C), 1269 (N-N=C), 1331 (S-O антисим.), 1138 (S-O сим.), Анализ: C₂₀H₁₉N₆O₆S₂Cl (538,5). Рассчит. %: C:44,56, H:3,52, N:15,60. Найдено: C:44,53, H:3,55, N:15,63.

3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(3-метил-4-нитрофенил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.

Выход: 46%. Т.пл. 142-144°C (CH₃OH), ¹H-ЯМР (CDCl₃) δ 8,18 (д, J=8,5 Гц, 1H), 8,08 (с, 1H), 8,02 (д, J=8,5 Гц, 1H), 7,30 (с, 1H), 7,22 (с, 1H), 4,80 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,80 (с, 3H), 2,62 (с, 6H), ИК v см^-1 1600 (C=N), 1573, 1510, 1476 (C=C), 1271 (N-N=C), 1344 (S-O антисим.), 1133 (S-O сим.), Анализ: C₂₁H₂₂N₆O₆S₂ (518). Рассчит. %: C:48,64, H:4,24, N:16,21. Найдено: C:48,68, H:4,21, N:16,25.

3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(3,4,5-триметоксифенил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.

Выход: 38%. Т.пл. 169-170°C (CH₃OH),¹H-ЯМР (CDCl₃) δ 7,30 (с, 1H), 7,22 (с, 1H), 7,14 (с, 2H), 4,78 (с, 2H), 3,89 (с, 6H), 3,84 (с, 3H), 3,80 (с, 3H), 3,76 (с, 3H), 2,62 (с, 6H), ИК v см^{-1 1630 (C=N), 1586, 1459, 1414 (C=C), 1267 (N-N=C), 1333 (S-O антисим.), 1127 (S-O сим.), Анализ: C₂₃H₂₇N₅O₇S₂ (549). Рассчит. %: C:50,27, H:4,92, N:12,75. Найдено: C:50,25, H:4,96, N:12,78.}

3-[2-(N,N-диметилoсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(2-аминофенил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.

Выход: 36%. Т.пл. 219-220°C (C₂H₅OH), ¹H-ЯМР (CDCl₃) δ 7,30 (с, 1H), 7,23 (т, J=7,8 Гц, 1H), 7,20 (с, 1H), 7,13 (м, 1H), 7,03 (д, J=8,35 Гц, 1H), 6,82 (д, J=8,2 Гц, 1H), 4,75 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,79 (с, 3H), 2,61 (с, 6H), ИК v см^-1 2436^, 3382, 3267 (N-H), 1608 (C=N), 1555, 1514, 1474 (C=C), 1265 (N-N=C), 1328 (S-O антисим.), 1141 (S-O сим.), Анализ: C₂₀H₂₂N₆O₄S₂ (474). Рассчит. %: C:50,63, H:4,64, N:17,72. Найдено: C:50,60, H:4,61, N:17,75.

3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(3-аминофенил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.

Выход: 20%. Т.пл. 164-165°C (C₂H₅OH), ¹H-ЯМР (CDCl₃) δ 7,44 (дд, J=8,0, 1,4 Гц, 1H), 7,29 (м, 1H), 7,28 (с, 1H), 7,16 (с, 1H), 6,93 (д, J=8,4 Гц, 1H), 6,71 (с ушир., 2H, NH₂), 6,68 (т, J=7,5 Гц, 1H), 4,81 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,78 (с, 3H), 2,63 (с, 6H), ИК v см^-1, 3450, 3347 (N-H), 1626 (C=N), 1579, 1512, 1473 (C=C), 1272 (N-N=C), 1322 (S-O антисим.), 1129 (S-O сим.), Анализ: C₂₀H₂₆N₆O₄S₂ (474). Рассчит. %: C:50,63, H:4,64, N:17,72. Найдено: C:50,65, H:4,67, N:17,69.

3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(4-аминофенил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.

Выход: 18%. Т.пл. 179-181°C (C₂H₅OH), ¹H-ЯМР (CDCl₃) δ 7,58 (дд, J=8,6, 2,9 Гц, 2H), 7,29 (д, J=3,0 Гц, 1H), 7,19 (д, J=2,8 Гц, 1H), 6,68 (дд, J=8,6, 2,9 Гц, 2H), 6,17 (с, 2H), 4,72 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,78 (с, 3H), 2,61 (с, 6H), ИК v см^-1 3457, 3348, 3237 (N-H), 1603 (C=N), 1577, 1518, 1461 (C=C), 1265 (N-N=C), 1331 (S-O антисим.), 1138 (S-O сим.), Анализ: C₂₀H₂₆N₆O₄S₂ (474). Рассчит. %: C:50,63, H:4,64, N:17,72. Найдено: C:50,60, H:4,59, N:17,70.

3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-бензил-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.

Выход: 18%. Т.пл. 178-179°C (CH₃OH); ¹H-ЯМР (CDCl₃) δ 7,42-7,36 (м, 4H), 7,36-7,30 (м, 1H), 7,28 (с, 1H), 7,13 (с, 1H), 4,69 (с, 2H), 4,44, (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,76 (с, 3H), 2,57 (с, 6H), ИК v см^-1 1601 (C=N), 1565, 1517, 1475 (C=C), 1267 (N-N=C), 1339 (S-O антисим.), 1140 (S-O сим.), Анализ: C₂₁H₂₃N₅O₄S₂ (473). Рассчит. %: C:53,27, H:4,86, N:14,80. Найдено: C:53,23, H:4,89, N:14,83.

3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(3-метоксибензил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.

Выход: 58%. Т.пл. 165-166°C (CH₃OH), ¹H-ЯМР (CDCl₃) δ 7,30 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,29 (с, 1H), 7,13 (с, 1H), 6,97 (с, 1H), 6,94 (д, J=7,7 Гц, 1H), 6,90 (дд, J=8,3, 2,5 Гц, 1H), 4,70 (с, 2H), 4,41 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,77 (с, 3H), 3,75 (с, 3H), 2,57 (с, 6H), ИК v см^-1 1607 (C=N), 1581, 1515, 1491 (C=C), 1266 (N-N=C), 1334 (S-O антисим.), 1139 (S-O сим.), Анализ: C₂₂H₂₅N₅O₅S₂ (503). Рассчит. %: C:52,48, H:4,97, N:13,91. Найдено: C:52,44, H:4,95, N:12,88.

3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(4-метоксибензил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.

Выход: 52%. Т.пл. 184-185°C (CH₃OH), ¹H-ЯМР (CDCl₃) δ 7,30 (д, J=8,6 Гц, 2H), 7,29 (с, 1H), 7,13 (с, 1H), 6,94 (д, J=8,6 Гц, 2H), 4,69 (с, 2H), 4,36 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,77 (с, 3H), 3,75 (с, 3H), 2,57 (с, 6H), ИК v см^-1 1610 (C=N), 1571, 1514, 1476 (C=C), 1267 (N-N=C), 1340 (S-O антисим.), 1140 (S-O сим.), Анализ: C₂₂H₂₅N₅O₅S₂ (503). Рассчит. %: C:52,48, H:4,97, N:13,91. Найдено: C:52,45, H:4,99, N:13,94.

3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(3,4-диметоксибензил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.

Выход: 50%. Т.пл. 139-140°C (CH₃OH), ¹H-ЯМР (CDCl₃) δ 7,29 (с, 1H), 7,13 (с, 1H), 6,99 (с, 1H), 6,95 (д, J=8,2 Гц, 1H), 6,90 (дд, J=8,3, 2,0 Гц, 1H), 4,70 (с, 2H), 4,35 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,77 (с, 3H), 3,75 (с, 3H), 3,73 (с, 3H), 2,58 (с, 6H), ИК v см^-1 1602 (C=N), 1555, 1516, 1462 (C=C), 1266 (N-N=C), 1336 (S-O антисим.), 1139 (S-O сим.), Анализ: C₂₃H₂₇N₅O₆S₂ (533). Рассчит. %: C:51,78, H:5,06, N:13,13. Найдено %: C:51,81, H:5,10, N:13,15.

3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(3-фенилпропил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.

Выход: 14%. Т.пл. 128-129°C (CH₃OH), ¹H-ЯМР (CDCl₃) δ 7,30-7,26 (м, 3H), 7,23-7,17 (м, 3H), 7,12 (с, 1H), 4,69 (с, 2H), 3,82 (с, 3H), 3,77 (с, 3H), 3,04 (т, J=7,4 Гц, 2H), 2,68 (т, J=7,7 Гц, 2H), 2,59 (с, 6H), 2,03 (p, J=7,6 Гц, 2H), ИК v см^-1 1600 (C=N), 1574, 1516, 1478 (C=C), 1267 (N-N=C), 1334 (S-O антисим.), 1139 (S-O сим.), Анализ: C₂₃H₂₇N₅O₄S₂ (501). Рассчит. %: C:55,09, H:5,38, N:13,97. Найдено %: C:55,11, H:5,41, N:14,01.

3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(2-пиридинил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.

Выход: 32%. Т.пл. 198-199°C (CH₃OH), ¹H-ЯМР (CDCl₃) δ 8,76, (с, 1H), 8,23-8,00 (м, 2H), 7,69 (с, 1H), 7,37-7,15 (м, 2H), 4,79 (с, 2H), 3,83 (с, 3H), 3,78 (с, 3H), 2,62 (с, 6H), ИК v см^-1 1599 (C=N), 1576, 1517, 1456 (C=C), 1270 (N-N=C), 1335 (S-O антисим.), 1137 (S-O сим.), Анализ: C₁₉H₂₀N₆O₄S₂ (460). Рассчит. %: C:49,56, H:4,34, N:18,26. Найдено %: C:49,60, H:4,31, N:18,30.

3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(4-пиридинил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.

Выход: 37%. Т.пл. 231-232°C (C₂H₅OH), ¹H-ЯМР (CDCl₃) δ 8,85 (д, J=5,0 Гц, 2H), 7,91 (д, J=5,0 Гц, 2H), 7,30 (с, 1H), 7,21 (с, 1H), 4,80 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,80 (с, 3H), 2,63 (с, 6H), ИК v см^-1 1600 (C=N), 1561, 1507, 1473, 1411 (C=C), 1274 (N-N=C), 1337 (S-O антисим.), 1138 (S-O сим.), Анализ: C₁₉H₂₀N₆O₄S₂ (460). Рассчит. %: C:49,56, H:4,34, N:18,26. Найдено %: C:49,58, H:4,37, N:18,23.

3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(3-bromo-5-пиридинил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.

Выход: 41%. Т.пл. 227-228°C (C₂H₅OH), ¹H-ЯМР (CDCl₃) δ 9,10 (д, J=2,0 Гц, 1H), 8,98 (д, J=2,2 Гц, 1H), 8,58 (с, 1H), 7,30 (с, 1H), 7,22 (с, 1H), 4,79 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,80 (с, 3H), 2,63 (с, 6H), ИК v см^-1 1600 (C=N), 1573, 1516, 1481, 1440, 1412 (C=C), 1270 (N-N=C), 1338 (S-O антисим.), 1140 (S-O сим.), Анализ: C₁₉H₁₉BrN₆O₄S₂ (539). Рассчит. %: C:42,30, H:3,52, N:15,58. Найдено %: C:42,32, H:3,49, N:15,56.

3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-циннамил-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.

Выход: 44%. Т.пл. 191-193°C (CH₃OH-CH₂Cl₂); ¹H-ЯМР (CDCl₃) δ 7,81 (д, J=7,1 Гц, 2H), 7,64 (д, J=16,4 Гц, 1H), 7,60 (д, J=16,3 Гц, 1H), 7,52-7,40 (м, 3H), 7,30 (с, 1H), 7,16 (с, 1H), 4,73 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,80 (с, 3H), 2,62 (с, 6H), ИК v см^-1 1630 (CH=CH), 1600 (C=N), 1575, 1576, 1475 (C=C), 1267 (N-N=C), 1332 (S-O антисим.), 1138 (S-O сим.), Анализ: C₂₂H₂₃N₅O₄S₂ (485). Рассчит. %: C:54,43, H:4,74, N:14,43. Найдено %: C:54,45, H:4,71, N:14,39.

3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(E)-4-фторстирил-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.

Выход: 73%. Т.пл. 210-212 °C. ¹H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) δ 7,89 (дд, J=8,6, 5,6 Гц, 2H), 7,65 (д, J=16,4 Гц, 1H), 7,58 (д, J=16,4 Гц, 1H), 7,36-7,25 (м, 2H), 7,16 (с, 1H), 4,72 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,79 (с, 3H), 2,60 (с, 6H). ИК v см^-1 2926, 2853, 1736, 1631, 1601, 1513, 1494, 1474, 1387, 1337, 1268, 1231, 1139, 1156, 1048.

3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(E)-4-хлорстирил-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол

Выход: 72%. Т.пл. 229-231 °C. ¹H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) δ 7,84 (д, J=8,6 Гц, 2H), 7,64 (с, 2H), 7,53 (д, J=8,6 Гц, 2H), 7,30 (с, 1H), 7,15 (с, 1H), 4,72 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,79 (с, 3H), 2,61 (с, 6H). ¹³C ЯМР (126 МГц, DMSO-d6) δ 165,7, 151,9, 147,2, 146,3, 139,4, 134,8, 133,3, 129,8, 129,0, 127,9, 126,1, 119,0, 115,5, 112,7, 55,9, 36,8, 27,6. ИК v см^-1 2934, 2844, 1726, 1633, 1516, 1488, 1473, 1410, 1381, 1339, 1268, 1224, 1139, 1175, 1087.

3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(E)-3-фторстирил-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.

Выход: 52%. Т.пл. 212-215 °C. ¹H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) δ 7,92-7,73 (м, 2H), 7,68 (td, J=8,1, 5,8 Гц, 1H), 7,55 (td, J=8,6, 2,4 Гц, 1H), 7,30 (с, 1H), 7,21 (с, 1H), 4,78 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,80 (с, 3H), 2,63 (с, 6H). ИК v см^-1 2929, 2844, 1589, 1516, 1474, 1387, 1338, 1270, 1228, 1174, 1155, 1140, 1042

3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-феноксиметил-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.

Выход: 41%. Т.пл. 178-179°C (CH₃OH-CH₂Cl₂), ¹H-ЯМР (CDCl₃) δ 7,37-7,31 (м, 2H), 7,29 (с, 1H), 7,13 (с, 1H), 7,09 (д, J=7,7, 1,0 Гц, 2H), 7,06-7,01 (м, 1H), 5,55 (с, 2H), 4,72 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,78 (с, 3H), 2,58 (с, 6H), ИК v см^-1 1598 (C=N), 1572, 1516, 1479 (C=C), 1267 (N-N=C), 1337 (S-O антисим.), 1139 (S-O сим.), Анализ: C₂₁H₂₃N₅O₅S₂ (489). Рассчит. %: C:51,53, H:4,70, N:14,31. Найдено %: C:51,51, H:4,67, N:14,33.

3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-[2-(2-метоксифенил)этил]-1,2,4-триазоло [3,4-b]-1,3,4-тиазол.

Выход: 37%. Т.пл. 154-155°C (CH₃OH-CH₂Cl₂), ¹H-ЯМР (CDCl₃) δ 7,29 (с, 1H), 7,21 (м, 1H), 7,17 (д, J=7,5 Гц, 1H), 7,10 (с, 1H), 6,95 (д, J=8,2 Гц, 1H), 6,84 (т, J=7,26 Гц, 1H), 4,67 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,77 (с, 3H), 3,75 (с, 3H), 3,29 (м, 2H), 3,01 (т, J=7,5 Гц, 4H), 2,56 (с, 6H), ИК v см^-1 1601 (C=N), 1569, 1519, 1477 (C=C), 1267 (N-N=C), 1336 (S-O антисим.), 1139 (S-O сим.), Анализ: C₂₃H₂₇N₅O₅S₂ (517). Рассчит. %: C:53,38, H:5,22, N:13,53. Найдено %: C:53,41, H:5,19, N:13,56.

3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-[2-(4-метоксифенил)этил]-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.

Выход: 41%. Т.пл. 151-152°C (CH₃OH-CH₂Cl₂), ¹H-ЯМР (CDCl₃) δ 7,29 (с, 1H), 7,18 (д, J=8,3 Гц, 2H), 7,11 (с, 1H), 6,83 (д, J=8,1 Гц, 2H), 4,67 (с, 2H), 3,83 (с, 3H), 3,77 (с, 3H), 3,71 (с, 3H), 2,99 (т, J=7,6 Гц, 2H), 2,55 (с, 6H), ИК v см^-1 1601 (C=N), 1569, 1519, 1477 (C=C), 1267 (N-N=C), 1336 (S-O антисим.), 1139 (S-O сим.), Анализ: C₂₃H₂₇N₅O₅S₂ (517). Рассчит. %: C:53,38, H:5,22, N:13,53. Найдено %: C: 53,35, H:5,24, N:13,50.

3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(3-хлорфенил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.

Выход: 45%. Т.пл. 237-239 °C, ¹H ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 7,86 (с, 1H), 7,74 (д, J=7,7 Гц, 1H), 7,56 (д, J=8,0 Гц, 1H), 7,53-7,39 (м, 2H), 6,99 (с, 1H), 4,90 (с, 2H), 3,93 (с, 3H), 3,87 (с, 3H), 2,72 (с, 6H). ¹³C ЯМР (126 МГц, CDCl₃) δ 164,9, 153,1, 152,5, 147,7, 146,8, 135,7, 132,7, 130,9, 130,8, 127,9, 127,03, 127,0 125,3, 114,4, 113,4, 56,4, 56,2, 36,9, 27,9. ИК v см^-1 3088, 3056, 2955, 2927, 2852, 2616, 1598, 1573, 1518, 1482, 1470, 1439, 1405, 187, 1339, 1270, 1228, 1175, 1139, 1101, 1078, 1043.

3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(4-нитрофенил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.

Выход: 53%. Т.пл. 223-225 °C, ¹H ЯМР (500 МГц, CDCl₃) δ 8,39 (д, J=8,7 Гц, 2H), 8,08 (д, J=8,7 Гц, 2H), 7,45 (с, 1H), 7,00 (с, 1H), 4,94 (с, 2H), 3,93 (с, 3H), 3,88 (с, 3H), 2,73 (с, 6H), ¹³C ЯМР (126 МГц, CDCl₃) δ 163,9, 153,1, 152,5, 150,1, 147,9, 147,1, 134,8, 128,2, 127,5, 126,9, 124,7, 114,5, 113,1, 113,1, 56,4, 37,1, 28,0, ИК v см^-1 3108, 3004, 2931, 2837, 1600, 1534, 1571, 1518, 1471, 1351, 1337, 1270, 1227, 1138, 1049

3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(4-фторфенил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.

Выход: 66%. Т.пл. 220-223 °C, ¹H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) δ 8,02 (дд, J=8,8, 5,2 Гц, 2H), 7,48 (т, J=8,8 Гц, 2H), 7,30 (с, 1H), 7,20 (с, 1H), 4,78 (с, 2H), 3,84 (с, 3H), 3,79 (с, 3H), 2,62 (с, 6H), ИК v см^-1 2933, 2842,1602, 1517, 1475, 187, 1337, 1268, 1241, 1225, 1139, 1042

3-[2-(N,N-диметилсульфамоил)-4,5-диметоксибензил]-6-(2,4-динитрофенил)-1,2,4-триазоло[3,4-b]-1,3,4-тиазол.

Выход: 29%. Т.пл. 162-164 °C, ¹H ЯМР (500 МГц, DMSO-d6) δ 8,74 (с, 1H), 8,69 (д, J=8,4 Гц, 1H), 8,50 (д, J=8,6 Гц, 1H), 7,29 (с, 1H), 7,13 (с, 1H), 4,74 (с, 2H), 3,83 (с, 3H), 3,79 (с, 3H), 2,58 (с, 6H), ¹³C ЯМР (126 МГц, DMSO-d6) δ 161,2, 153,8, 151,9, 150,5, 149,3, 147,3, 146,3, 128,2, 127,7, 127,6, 126,9, 126,1, 124,3, 115,4, 112,8, 55,9, 55,8, 36,7, 27,6, ИК v см^-1 2917, 2850, 1729, 1555, 1514, 1457, 1346, 1308, 1270, 1223, 1137, 1042

Пример 3

In vitro исследование цитостатическо-цитотоксической активности в отношении человеческих линий клеток рака и лейкоза

Настоящий пример иллюстрирует цитостатическо-цитотоксические эффекты следующих соединений согласно настоящему изобретению в отношении человеческих клеточных линий рака яичника UWB1,289 (с мутантом BRCA1), UWB1,289+BRCA1, OVCAR-3, SCOV-3, человеческих клеточных линий рака молочной железы MCF-7 [экспрессирующих рецепторы эстрогена, белков, связывающих инсулиноподобный фактор роста (IGFBP) BP-2, BP-4; BP-5), онкоген WNT7B], T-47D (положительной в отношении экспрессии всех стероидных рецепторов и онкогена WNT7B), человеческой линии раковых клеток гормон-резистентного рака предстательной железы PC-3, человеческой линии острого T-клеточного лейкоза MOLT-4 (не демонстрирующей экспрессию мутанта онкогена P53) и человеческой клеточной линии рака легкого A549, имеющий мутацию в онкогене KRAS (p. G12S c, 34G>A).

Заместитель R3 изученных соединений определен в Таблице 1:

Ένωση R₃ Ένωση R₃ TS167 C₆H₅- TS50 4-CH₃O-C₆H₄CH₂- TS63 4-Cl-C₆H₄- TS51 3,4-CH₃O-C₆H₃CH₂- TS57 2-NH₂-C₆H₄- TS56 C₆H₅-OCH₂- TS70 3-NH₂-C₆H₄- TS53 C₆H₅-CH=CH- TS71 4-NH₂-C₆H₄- TS54 2-CH₃O-C₆H₄CH₂CH₂- TS61 2-Cl-4-NO₂-C₆H₃- TS55 4-CH₃O-C₆H₄CH₂CH₂- TS60 2-CH₃-4-NO₂-C₆H₃- TS52 C₆H₅CH₂CH₂CH₂- TS59 3,4,5-CH₃O-C₆H₂- TS66 TS62 C₆H₅CH₂- TS65 TS58 3-CH₃O-C₆H₄CH₂- TS67 TS22 3-Cl-C₆H₄- TS25 4-F-C₆H₄-CH=CH- TS29 3-F-C₆H₄- TS26 4-Cl-C₆H₄-CH=CH-

Таблица 1

Специфические характеристики линий клеток рака яичника

SKOV-3 (SKOV-3) (ATCC HTB 77) и OVCAR-3 (ATCC® HTB-161™)

Человеческие клетки аденокарциномы яичника, выращенные легко в однослойной культуре с эпителиоподобной морфологией. SKOV-3 резистентны к фактору некроза опухоли (TNF) и к другим цитотоксическим лекарственным средствам, таким как цисплатин и адриамицин, в то время как OVCAR-3 резистентны к адриамицину, цисплатину и мелфалану. Эти клеточные линии экспрессируют рецепторы андрогенов, эстрогенов и прогестерона. Когда клетки SKOV-3 или OVCAR-3 внедряют подкожно голым мышам, мышам SCID, развивается умеренно дифференцированная опухоль, и полученная модель напоминает первичную овариальную аденокарциному у человека.

UWB1.289 (ATCC CRL-2945)

Человеческие овариальные клетки аденокарциномы, выращенные легко в однослойной культуре, имеют морфологию эпителиальных раковых клеток и не экспрессируют эстрогеновые и прогестероновые рецепторы. Кроме того, клетки UWB1.289 имеют мутированный ген-супрессор опухоли p53 и положительную экспрессию белка опухоли Вилмса (WT), не имеют функционального гена BRCA1 и являются положительными в отношении экспрессии цитокератина 7 (CK-7), калретинина и белка опухоли Вилмса (WT). Наконец, они чувствительны к ионизирующему излучению.

UBWB1.289+BRCA1 (ATCC CRL-2946)

Человеческие овариальные клетки аденокарциномы, полученные из UBWB1.289, в которых было восстановлено присутствие гена BRCA1. Они легко растут в культуре, создавая монослои, имеют морфологию эпителиальных раковых клеток и не экспрессируют эстрогеновые и прогестероновые рецепторы. Они не чувствительны к ионизирующему излучению и радиоиммунным химическим веществам (например, алкилирующим агентам). Кроме того, клетки UWB1.289 имеют мутированный ген-супрессор опухоли p53 и являются положительными в отношении экспрессии цитокератина 7 (CK-7), калретинина и белка опухоли Вилмса (WT).

Клеточная культура

Все линии раковых клеток хранят в резервуаре с жидким азотом в криоампулах на 2,5 мл (Corning-Costar, Кембридж, Массачусетс). DMSO (диметилсульфоксид) действует как криопротектор и добавляется для предотвращения формирования ледяных кристаллов, которые могут привести к лизису клеток. Клетки выращивали как однослойные культуры в колбах T-75 (Corning-Costar, Кембридж, Массачусетс) и сохраняли при 37^oC в инкубаторе с 5% CO₂ и при относительной влажности 100%. Используемой культуральной средой является McCoy's 5a Medium, дополненная 10%-й эмбриональной бычьей сывороткой (FBS, Gibco) и 1% антибиотиков (100 МЕ/мл пенициллина/100 мкг/мл стрептомицина), стерилизованная фильтрацией (Фильтр Corning-Costar, диаметр 0,2 мкм, RPMI-1640 и 50% RPMI-1640 (Каталог No 30-2001) плюс 50%-я среда для выращивания эпителия млекопитающих (MEGM), дополненная 10%-й эмбриональной бычьей сывороткой (FBS, Gibco) и 1% антибиотиков (100 МЕ/мл пенициллина/100 мкг/мл стрептомицина). Пассаж осуществляли каждые 3-4 дня следующим образом: Клетки промывали стерильным PBS (Фосфатный буферный солевой раствор): 8 г/л NaCl, 0,2 г/л KCl, 1,15 г/л Na₂HPO₄, 0,2 г/л KH₂PO₄. pH:7,4), добавляли 2-3 мл 0,05% трипсина (Gibco 1:250) и 0,02% EDTA, чтобы покрыть монослой, и инкубировали колбу при 37°C в течение 5-10 минут. Трипсин-EDTA используется в основном, чтобы отделить клетки от колбы и получить суспензию отдельных клеток. Наконец, число клеток может быть определено прямым подсчетом с помощью камеры Neubauer, и жизнеспособность клеток определяют путем окрашивания клеток трипановым синим.

In vitro исследование

В экспериментальном исследовании in vitro эффект соединения типа (I) был оценен в отношении клеточных линий рака яичника UWB1.289, UWB1.289+BRCA1 и SKOV-3. Клетки высевали на планшет с 96 лунками (MTP) при плотности 1×10⁴ клеток/мл на лунку и сохраняли в течение 72 ч при 37°C в инкубаторе с 5% CO₂, и выращивали как монослои. Выбор начального числа клеток был сделан согласно скорости пролиферации клеточной линии с тем, чтобы клетки в течение эксперимента находились в фазе экспоненциального (log) роста. Через 24 часа клетки обрабатывали 1-100 мкмоль/л тестируемых соединений в течение 48 ч. Эксперименты проводили с использованием тройных лунок. Жизнеспособность культивируемых клеток оценивали с помощью метаболического теста с (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолий бромидом (MTT), как описано ранее (Finlay GJ, Wilson WR and Baguley BC: Comparison of in vitro activity of cytotoxic drugs towards human carcinoma and leukaemia cell lines. Eur J Cancer Clin Oncol 22: 655-662, 1986; Alley MC, Scudiero DA, Monks A, Hursey ML, Czerwinski MJ, Fine DL, et al. Feasibility of drug screening with panels of human tumor cell lines using a microculture tetrazolium assay. Cancer Res 1988; 48:589-601). MTT (Sigma, Сент-Луис, Миссури, США) растворяли в PBS в концентрации 5 мг/мл, стерилизовали фильтрацией и сохраняли при 4°C. MTT (50 мкл стокового раствора) добавляли к каждой культуре и инкубировали в течение 3 ч при 37°C для обеспечения метаболизации. Кристаллы формазана растворяли с помощью DMSO (100 мкл). Поглощение конвертированного красителя измеряли при длине волны 540 нм на ридере ELISA (BioTek, Винооски, Вермонт, США).

Средние концентрации каждого соединения, генерирующие 50% или полное (100%) ингибирование роста (GI₅₀ и TGI, соответственно), а также концентрации соединения, демонстрирующие цитотоксичность в отношении 50% культивируемых клеток [(половина максимальной ингибирующей концентрации (IC₅₀)] вычисляли с помощью способа линейной регрессии. Используя семь измерений поглощения [время 24 ч (Ct24), контрольный рост 72 ч (Ct72) и исследование роста в присутствии лекарственного средства при пяти уровнях концентрации (Tt72x)], процент роста вычисляли при каждом уровне концентраций лекарственного средства. Процент ингибирования роста вычисляли согласно Национальному институту онкологии (NCI) как:

[(Tt72x)-(Ct24)/(Ct72)-(Ct24)]×100 для концентраций, для которых Tt72x>Ct24 и

[(Tt72x)-(Ct24)/Ct24]×100 для концентраций, для которых Tt72x<Ct24

GI₅₀: средняя концентрация, вызывающая 50%-е ингибирование роста клеток (Ингибирование роста 50%). Вычисление значения основывается на формуле:

(Tt72x)-(Ct24)/(Ct72)-(Ct24)×100=50

TGI: средняя концентрация, вызывающая 100%-е ингибирование роста клеток (Полное ингибирование роста). Значение вычисляется согласно формуле:

(Tt72x)-(Ct24)/(Ct72)-(Ct24)×100=0

IC₅₀: средняя концентрация, убивающая 50% клеток (Ингибирующая концентрация 50%). Значение вычисляется согласно формуле:

(Tt72x)-(Ct24)/(Ct24)×100=50

Результаты

Результаты анализировали с использованием t-теста Стъюдента. P<0,05 считали статистически значимым.

Результаты in vitro исследования представлены в Таблице 2.

Соед. GI50 (мкМ) TGI (мкМ) IC50 (мкМ) GI50 (мкМ) TGI (мкМ) IC50 (мкМ) GI50 (мкМ) TGI (мкМ) IC50 (мкМ) UWB1.289+BRCA1 TS53 12 28 42 OVCAR-3 5 12 25 SKOV-3 8 16 32 TS63 8 64 >100 3 32 >100 8 38 >100 TS62 8 64 >100 8 68 >100 12 56 >100 TS50 16 >100 >100 5 86 >100 6 >100 >100 TS66 >100 >100 >100 24 >100 >100 20 >100 >100 TS167 76 >100 >100 65 >100 >100 80 >100 >100 TS71 90 >100 >100 97 >100 >100 >100 >100 >100 TS57 85 >100 >100 95 >100 >100 >100 >100 >100 TS22 16 >100 >100 90 >100 >100 60 100 >100 TS25 5 12 36 24 68 94 18 52 80 TS29 10 64 >100 74 >100 >100 45 84 >100 TS26 11 37 54 41 87 >100 38 72 >100 UWB1.289 TS53 12 56 >100 MCF-7 15 45 >100 T-47D 8 37 >100 TS63 30 50 >100 22 50 >100 27 55 >100 TS62 13 >100 >100 18 >100 >100 24 >100 >100 TS50 30 >100 >100 40 >100 >100 28 >100 >100 TS66 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 TS167 56 >100 >100 65 >100 >100 52 >100 >100 TS71 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 TS57 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 TS22 88 >100 >100 24 90 >100 48 97 >100 TS22 16 >100 >100 90 >100 >100 60 100 >100 TS25 2 4 60 16 51 86 12 34 76 TS29 10 67 >100 66 >100 >100 48 86 >100 TS26 8 21 72 25 67 >100 78 >100 >100 PC-3 TS53 12 31 85 MOLT-4 4 21 36 A-549 9 24 58 TS63 20 45 >100 6 45 78 14 36 92 TS62 27 >100 >100 7 55 >100 15 71 >100 TS50 44 >100 >100 10 >100 >100 35 >100 >100 TS66 >100 >100 >100 85 >100 >100 >100 >100 >100 TS167 62 >100 >100 42 >100 >100 74 >100 >100 TS71 >100 >100 >100 55 >100 >100 >100 >100 >100 TS57 >100 >100 >100 94 >100 >100 >100 >100 >100 TS22 >100 >100 >100 72 >100 >100 45 95 >100 TS25 8 24 69 16 29 78 11 56 87 TS29 85 >100 >100 61 >100 >100 30 71 >100 TS26 19 47 86 32 81 >100 20 90 >100

Таблица 2

12 производных 1,2,4-триазоло-[3,4-b]-1,3,4-тиадиазола TS167, TS70, TS61, TS60, TS59, TS58, TS51, TS56, TS54, TS55, TS52, TS65 показывают более мощную цитостатическую (IG50 < 100 мкм), чем цитотоксическую противораковую активность при протестированной концентрации с IC50 > 100 мкМ во всех 9 человеческих линиях раковых клеток.

Пример 4

Исследование токсичности у мышей C57Bl/6 in vivo

Острая токсичность in vivo

Острую токсичность соединений оценивали по летальности путем тестирования различных концентраций, начиная с 100 мг/кг. Терапевтическая доза тестируемого соединения определяется как LD10 (летальная доза для 10% животных). Для внутрибрюшинного (i.p.) лечения стоковые растворы тестируемых соединений готовили непосредственно перед использованием. Их суспендировали в кукурузном масле при желаемой концентрации после начального растворения в 10%-м диметилсульфоксиде (DMSO). Самцов и самок C57Bl/6 использовали для исследований токсичности. Мышей держали в условиях постоянной температуры и влажности в стерильных клетках с водой и пищей.

Результаты исследования острой токсичности представлены в Таблице 3.

Соединение LD50 (мг/кг) LD10 (мг/кг) TS53 375 >500 TS63 430 >500 TS62 480 >500 TS25 345 >500 TS26 365 >500 TS50 >500 >500 TS66 >500 >500 TS167 >500 >500 TS71 >500 >500 TS57 >500 >500

Таблица 3

Известно, что все соединения производили относительно очень низкую острую токсичность на мышах C57Bl/6. Все LD10 от i.p. введения тестируемых производных 1,2,4-триазоло-[3,4-b]-1,3,4-тиадиазола составляли более 350 мг/кг, тогда как LD50 не были достигнуты в любом случае. Для производных TS50, TS66, TS167, TS71, TS57, TS167, TS70, TS61, TS60, TS59, TS58, TS51, TS56, TS54, TS55, TS52 и TS65, острая токсичность не была продемонстрирована при i.p. введении в более высоких дозах, и LD10 и LD50 не были достигнуты (>500 мг/кг).

Группа изобретений относится к области фармацевтической химии и включает производное 1,2,4-триазоло-[3,4-b]-1,3,4-тиадиазола формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтическую композицию на их основе. В формуле (I) R₁ и R₂ являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из C₁-C₅ алкила; R₃ выбран из группы, состоящей из CH₂R₈, CH₂CH₂R₈, CH=CHR₈, CH₂CH₂CH₂R₈, CH₂-OR₈, замещенного или незамещенного фенила, бензила, пиридила, причем заместитель или заместители выбраны из группы, состоящей из метила, F, Cl, Br, I, ΝΟ₂; R₄, R₅, R₆, R₇ являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из H и OCH₃; R₈ представляет собой замещенный или незамещенный фенил, причем заместитель или заместители выбраны из группы, состоящей из метила, F, Cl, Br, I, NO₂. Соединение формулы (I) обладает цитостатическим и цитотоксическим действием в отношении рака яичника, молочной железы, предстательной железы, легких и лимфом и показывает низкую острую и системную токсичность. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 3 табл., 4 пр.

.

1. Соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль

в которой

R₁ и R₂ являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из C₁-C₅ алкила,

R₃ выбран из группы, состоящей из CH₂R₈, CH₂CH₂R₈, CH=CHR₈, CH₂CH₂CH₂R₈, CH₂-OR₈, замещенного или незамещенного фенила, бензила, пиридила, причем заместитель или заместители выбраны из группы, состоящей из метила, F, Cl, Br, I, ΝΟ₂,

R₄, R₅, R₆, R₇ являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из H, OCH₃,

R₈ представляет собой замещенный или незамещенный фенил, причем заместитель или заместители выбраны из группы, состоящей из метила, F, Cl, Br, I, NO₂.

2. Соединение по п. 1, в котором R₁ и R₂ являются одинаковыми или разными и выбраны из группы, состоящей из C₁-C₃ алкила.

3. Соединение по п. 1 или 2, в котором R₁ и R₂ обозначают метил.

4. Соединение по любому из пп. 1-3, в котором R₃ выбран из группы, состоящей из CH₂CH₂R₈, CH=CHR_8, CH₂CH₂CH₂R₈, замещенного или незамещенного фенила, бензила, пиридила, причем заместитель или заместители выбраны из группы, состоящей из метила, F, Cl, Br, ΝΟ₂.

5. Соединение по любому из пп. 1-4, в котором R₃ выбран из группы, состоящей из CH=CHR₈, CH₂CH₂CH₂R₈, замещенного или незамещенного фенила, пиридила, причем заместитель или заместители выбраны из группы, состоящей из F, Cl, ΝΟ₂.

6. Соединение по любому из пп. 1-5, в котором R₄ и R₇ обозначают Η, R₅ и R₆ обозначают OCH₃.

7. Соединение по любому из пп. 1-6, в котором R₈ представляет собой замещенный или незамещенный фенил, причем заместитель или заместители выбраны из группы, состоящей из метила, F, Cl, Br, ΝΟ₂.

8. Соединение по любому из пп. 1-7, в котором R₈ представляет собой замещенный или незамещенный фенил, причем заместитель или заместители выбраны из группы, состоящей из F, Cl, ΝΟ₂.

9. Фармацевтическая композиция, обладающая противораковой активностью в отношении рака яичника, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака легких и лимфом и содержащая соединение формулы (Ι) по любому из пп. 1-8 или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель.

10. Соединение по любому из пп. 1-8 или его фармацевтически приемлемая соль для применения в лечении рака яичника, рака молочной железы, рака предстательной железы, рака легких или лимфом.