4-(3,4-ДИБРОМТИОФЕНИЛКАРБОНИЛ)-2,6,8,10,12-ПЕНТААЦЕТИЛ-2,4,6,8,10,12 ГЕКСААЗАИЗОВЮРЦИТАН В КАЧЕСТВЕ АНАЛЬГЕТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2022 года по МПК C07D487/22 A61K31/381 A61P29/00 

Изобретение относится к фармацевтической химии и фармакологии, а именно к новому химическому веществу - 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,10,12-пентаацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазаизовюрцитан, обладающему анальгетической активностью:

По своему биологическому происхождению боль является одним из важнейших сигналов, который информирует организм о повреждении тканей и запускает целый комплекс защитных реакций, направленных на минимизацию и устранение повреждения. Формирование сложного, многокомпонентного болевого ощущения, включающего не только сенсорные и мотивационно-аффективные компоненты, но и вегетативные, двигательные реакции, опосредуется ноцицептивной системой, состоящей из чувствительных нейронов, которые имеют сложную иерархическую организацию и обеспечивают восприятие, кодирование, проведение и анализ повреждающих стимулов. В зависимости от ведущего патогенетического фактора развития все болевые синдромы были разделены на три основные группы: ноцицептивные, неврогенные и психогенные. Болевые синдромы занимают ведущее место среди самых частых проблем, с которыми сталкивается практически каждый человек. Многие острые и хронические заболевания, травмы и медицинские вмешательства сопряжены с болью, требующей применения анальгетических средств. Выбор средств обезболивания, соответствующего анальгетического потенциала, определяется рядом факторов, к которым относятся этиология, интенсивность, тип боли, индивидуальные особенности пациента. По данным различных исследований, потребление этих лекарственных средств неуклонно растет как в России, так и за рубежом [Табеева Г.Р. Непростые простые анальгетики, или о чем надо помнить при выборе анальгетика // Русский Медицинский Журнал. 2013, 21 (10): 470-475]. Существующие в настоящее время анальгетики делят на две основные группы - наркотические (опиоидные) и ненаркотические, используются различные их комбинации в схемах мультимодальной терапии, применяются анальгетики из класса каннабиоидов [Машковский М.Д. Лекарственные средства: 15-е изд. М: 00 «Издательство Новая Волна». 2008, 1206; Михайлова А.С. Анальгетический арсенал клинициста. Фарматека. 2018, (3): 50-56; Соснов А.В., Садовников С.В., Семченко Ф.М., Руфанов К.А., Тохмахчи В.Н., Соснова А.А., Тюрин И.А. Сильнодействующие ненаркотические анальгетики как направление развития фармацевтики. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2016, 14 (1): 196-206; Черняков А.В. Проблема боли и обезболивания в амбулаторной хирургии // Русский Медицинский Журнал. 2016, 2 (14); 927-931; Cawich S.O., Deonarine U., Harding H.E., Dan D., Na-raynsingh V., Cannabis and Postoperative Analgesia. Handbook of Cannabis and Related Pathologies. Biology, Pharmacology, Diagnosis, and Treatment. 2017, 450-458]. Первые обладают мощным эффектом против болей средней и высокой интенсивности, однако, оборот таких средств ограничен в виду развития на фоне их применения физиологической и психической зависимости [Палехов А.В., Введенская Е.С. Тактика выбора и применения опиоидных анальгетиков для купирования хронической боли // Паллиативная медицина и реабилитация. 2018, (3): 18-24]. Неопиодные анальгетики, являющиеся ненаркотическими препаратами и отпускающиеся без рецепта, используются для лечения острой боли и хронических болевых синдромов слабой интенсивности [Михайлова А.С. Анальгетический арсенал клинициста. Фарматека. 2018, (3): 50-56]. Неопиоидные анальгетики включают препараты пяти фармакологических групп: НПВП, селективные ингибиторы циклоокси-геназы-2 (ЦОГ-2), производные пиразолона, производные параацетаминофенола и флу-пиртина. По данным научной литературы более чем за 130 лет, в мире синтезированы сотни субстанций ненаркотических анальгетиков и нестероидных противовоспалительных средств (НПВС), часть из которых в связи с тяжелыми побочными эффектами (гастродуо-денопатия, нефротоксичность, кардиоваскулярные эффекты, гепатотоксичность, терато-генность, гематотоксичность) и недостаточной эффективностью во многих странах запрещено производить и применять [Колоколов О.В., Ситкали И.В., Колоколова A.M. Ноцицептивная боль в практике невролога: алгоритмы диагностики, адекватность и безопасность терапии // Русский Медицинский Журнал. 2015, 23 (12): 664-667. Машковский М.Д. Лекарственные средства: 15-е изд. М.: ОО «Издательство Новая Волна». 2008, 1206; Михайлова А.С. Анальгетический арсенал клинициста. Фарматека. 2018, (3): 50-56; Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. Миронова А.Н., Бунатян Н.Д. и др. М., ЗАО «Гриф и К». 2012.; Соснов А.В., Садовников СВ., Семченко Ф.М., Руфанов К.А., Тохмахчи В.Н., Соснова А.А., Тюрин И.А. Сильнодействующиененаркотические анальгетики как направление развития фармацевтики. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2016, 14 (1): 196-206; Cawich S.O., Deonarine U., Harding Н.Е., Dan D., Naraynsingh V., Cannabis and Postoperative Analgesia. Handbook of Cannabis and Related Pathologies. Biology, Pharmacology, Diagnosis, and Treatment. 2017: 450-458; Shiels M.S., Chernyavskiy P., Anderson W.F. et al. Trends in premature mortality in the USA by sex, race, and ethnicity from 1999 to 2014: an analysis of death certificate data // The Lancet. 2017, 389 (10073): 1043-1054].

Одним из наиболее часто используемых и наиболее близким по техническому результату к предлагаемому средству является Трамадол - анальгетик смешанного механизма действия, включающего в себя опиоидный и неопиоидный компоненты, который выбран в качестве препарата сравнения [Машковский М.Д. Лекарственные средства: 15-е изд. М.: ОО «Издательство Новая Волна». 2008, 1206; Михайлова А.С. Анальгетический арсенал клинициста. Фарматека. 2018, (3): 50-56].

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала анальгетических средств с помощью создания новых веществ, обладающих анальгетической активностью и малой токсичностью.

Поставленная задача решается созданием нового соединения - 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,10,12-пентаацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазаизовюрцитана (I) и его применением в качестве анальгетического средства.

Предлагаемое анальгетическое средство 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,10,12-пентаацетил-2,4,6,8,10,12 гексаазаизовюрцитан (I) впервые синтезировано в Институте проблем химико-энергетических технологий (г.Бийск). Соединение I полностью подтверждено с помощью физико-химических методов анализа (ИК-спектроскопия, элементный анализ, 1Н- и 13С ЯМР-спектроскопия), обладает выраженной анальгетической активностью и относится к 3 классу опасности «малотоксичные средства».

2,6,8,12-Тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазаизовюцитан является промышленным полупродуктом и легко подвергается ацилированию. Введение пятой ацетильной группы в 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,8,10,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазаизовюрцитана не вызывает затруднений, реакция проходит при умеренных температурах и с высоким выходом целевого продукта I - более 90% (в пересчете на исходный 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазаизовюцитан). Кроме того, введение пятой ацетильной группы в молекулу 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазаизовюцитана способствует повышению растворимости целевого соединения I (в сравнении с исходным продуктом), что делает его еще более привлекательным в плане практического использования.

В НИИ фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ (г. Томск) в результате проведенных экспериментальных исследований выявлена и подтверждена анальгетическая активность и низкая токсичность впервые полученного соединения I.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является новое вещество I, способ его получения, выявление анальгетических свойств вещества I и подтверждение его анальгетического действия. Выявленное свойство вещества I, предлагаемого в качестве анальгетического средства, явным образом не вытекает из уровня техники в данной области и неочевидно для специалиста. Идентичной совокупности признаков не обнаружено при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе [Толстикова Т.Г., Морозова Е.А., Сысолятин С.В., Калашников А.И., Жукова Ю.И., Сурмачев В.Н. Синтез и биологическая активность производных 2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,03,11,05,9]додекана. Химия в интересах устойчивого развития. 2010, 18: 511-516; Sergey V. Sysolyatin, Alexander I. Kalashnikov, Valeriy V. Malykhin, Irina A. Surmacheva, Gennady V. Sakovich. Reductive Debenzelation of 2,4,6,8,10,12 -Hexaazaisowurtzitane/ International Journal of Energetic Materials and Chemical Propulsion.2010, 9 (4): 365; Крылова С.Г., Лопатина К.А., Нестерова Ю.В., Поветьева Т.Н., Кульпин П.В., Афанасьева О.Г., Кулагина Д.А., Сафонова Е.А., Зуева Е.П., Суслов Н.И., Сысолятин С.В. Некоторые аспекты исследования центрального механизма антиноцицептивного действия нового анальгетика из класса гексаазаизовюрцитанов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2020 (12): 739-746; Kulagina, D.A., Sysolyatin, S.V., Kalashnikov, A.I. et al. Synthesis and Analgesic Activity of 4,10-Bis((±)-5-Benzoyl-2,3-Dihydro-1hpyrrolo[1,2-a]Pyrrole-1-Carbonyl)-2,6,8,12-Tetraacetyl-2,4,6,8,10,12-Hexaazatetracyclo [5,5,03,11,05,9]Dodecane. Pharm. Chem. J. 54, 1140-1144 (2021); Tomilova, E., Kurgachev, D., Kulagina, D.. Sergey Sysolyatin, S., Krylova, S., Novikov, D. Development of HPLC-Method for Simultaneous Determination of API and Related Components in Thiowurtzine: A New Non-Narcotic Analgesic. Chromatographia 84, 147-154 (2021)].

Возможность осуществления заявляемого изобретения в части вещества и способа его получения подтверждается примером конкретного выполнения способа получения соединения I, обладающего выраженной анальгетической активностью.

Пример 1

Получение 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,10,12-пентаацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазаизовюрцитана.

К 18,12 г (0,03 моль) 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазаизовюрцитана в 220 мл сухого ацетонитрила при перемешиванииприбавили 4,75 г (0,06 моль, 4,4 мл) ацетилхлорида. Реакционную массу кипятили при перемешивании в течение 24 часов, затем охладили до комнатной температуры и отфильтровали. Фильтрат упарили на 3/4 части и разбавили 120 мл изопропилового спирта. Выпавший продукт отфильтровали, промыли 2×20 мл изопропилового спирта. Осадок сушили на воздухе.

Получили 18,8 г (97,0%) 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,10,12-пентаацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазаизовюрцитана в виде бесцветного кристаллического продукта с содержанием основного вещества 99,6% (методом ВЭЖХ) и температурой плавления 255-256°С.

C₂₁H₂₂Br₂N₆O₆S.

Найдено (%): С 39.18; Н 3.39; N 12.97; S 4.96.

Вычислено (%): С 39.03; Н 3.43; Br 24.73; N 13.00; О 14.85; S 4.96.

ИК-спектр, v/cm-1: 3072, 3030, 1666, 1530, 1403, 1360, 1306, 1287, 1256, 1163, 1050, 970, 949, 884, 785, 751, 727, 707, 687, 633.

Спектр ЯМР 1Н (ДМСО-d6, δ, м.д.): 1.98-2.20 (м, 15Н, СН₃СО), 6.47-7.07 (м, 6Н, СН), 8.15(д, 1Н, СН).

Спектр ЯМР 13С (ДМСО-d6, δ, м.д.): 21.27, 21.34, 21.50, 22.32, 22.53, 22.64, 65.62, 67.43, 69.73, 71.37, 72.02, 73.57, 112.58, 113.02, 128.51, 132.49, 167.67, 168.10, 168.27, 168.58, 168.76, 170.21.

Возможность осуществления заявляемого изобретения в части анальгетической активности подтверждается примером конкретного выполнения исследования анальгетической активности 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,10,12-пентаацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазаизовюрцитана (I) в сравнении с референс-препаратом Трамадолом, доказывающего, что выявленные признаки решают поставленную задачу.

Пример 2

Эксперименты были выполнены на 198 аутбредных мышах сток CD1 обоих полов, (7-8 недель, масса 22-27 г) первой категории конвенциональных, полученных из отдела экспериментального биомоделирования НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ (сертификат здоровья животных, ветеринарное удостоверение 270 №0008633). Содержание животных и дизайн экспериментов были одобрены Биоэтическим комитетом НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга и соответствовали директиве 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях [Директива 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях (пер. с англ.). СП. 2012, 48]; Приказу МЗ РФ от 1 августа 2016 N 199н.

Каждому животному внутри группы присваивали индивидуальный номер от 1 до 11, помечаемый с помощью меток фукорцином. Мышей распределяли на группы рандомизированно, используя в качестве критерия массу тела, так, чтобы индивидуальное значение массы не отклонялось от среднего значения в пределах одного пола более чем на ±10%. Данные (вес и номер) отобранных животных ранжировали в порядке убывания веса, используя для этого компьютерную программу Excel, имеющую команду SORT.

Статистическая обработка полученных результатов проведена методами вариационной статистики с использованием программного обеспечения Statistica 6.0. Для всех данных подсчитаны среднее значение (X) и стандартная ошибка среднего (m), которые вместе со значением n (количество вариант в группе) представлены в итоговых таблицах. Различие сравниваемых величин считали достоверным в том случае, если вероятность их тождества была меньше 5% (Р<0,05). Используя выборочные коэффициенты асимметрии и эксцесса, оценивали степень приближения закона распределения исследуемого признака к нормальному. В случаях нормального распределения признаков для статистической оценки применяли параметрический t-критерий Стьюдента. При отклонениях распределений признака от нормального вида для независимых выборок использовали непараметрический критерий U-критерий Уилкоксона-Манна-Уитни. Для выявления достоверности различий качественных показателей использовали критерий углового преобразования Фишера [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. Миронова А.Н., Бунатян Н.Д. и др. М., ЗАО «Гриф и К». 2012].

Определение острой токсичности 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,10,12-пентаацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазаизовюрцитана (I).

При определении острой токсичности 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,10,12-пентаацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазаизовюрцитан (I) вводили 7 аутбредным мышам-самкам и 7 аутбредным мышам-самцам сток CD1 однократно внутрижелудочно в максимальной дозе 2000 мг/кг (в связи с плохой растворимостью в воде 6,25 г/л) в объеме 0,5 мл водно-твинового раствора. В течение 2 недель наблюдения гибели животных не отмечалось, мыши не имели отклонений в состоянии здоровья и поведении, патологические рефлексы не фиксировались. В связи с невозможностью определения LD50 исследуемое вещество (I) отнесено к 3 классу опасности - «малотоксичные средства» в соответствии с ГОСТ 12.1007-76 «Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности» и «Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств, 2012» [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. Миронова А.Н., Бунатян Н.Д. и др. М., ЗАО «Гриф и К». 2012].

Для оценки антиноцицептивной активности в условиях модели «Уксусные корчи», тесте «Механической компрессии лапы» (Rendal-Selitto), в тесте термического раздражения центрального генеза «Горячая пластина» [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. Миронова А.Н., Бунатян Н.Д. и др. М., ЗАО «Гриф и К». 2012; Barrot М. Tests and models of nociception and pain in rodents. Neuro-science. 2012, 211: 39-50] тестируемое вещество (I) вводили мышам внутрижелудочно через зонд в диапазоне доз 25, 50, 100 и 200 мг/кг однократно ежесуточно и в течение 3 дней. Используемая суточная доза референс-препарата Трамадола для мышей (10 мг/кг, растворитель - вода очищенная) соответствовала среднесуточной дозе для человека (согласно инструкции для применения Трамадола). Животные группы негативного контроля получали растворитель (вода очищенная) в аналогичном режиме и пути введения. Значения массы тела животных использовали для расчета доз тестируемых веществ. Отбор определенного количества тестируемого средства производили в рабочей комнате с бактерицидным рециркулятором, который обеспечивает безопасность процедур и чистоту приготовления тестируемых веществ для введения. Необходимое количество веществ для введений готовилось ответственным за провизорскую работу сотрудником лаборатории. Приготовление доз основывалось на значениях доз и указанном объеме введения. Эвтаназию животных по окончании экспериментов осуществляли кранио-цервикальной дислокацией.

Исследование анальгетической активности 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,10,12-пентаацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазаизовюрцитана (I) в сравнении с референс-препаратом Трамадолом в тесте «Уксусные корчи» (Abdominal constriction test).

Тест «Уксусные корчи» (Abdominal constriction test) направлен на исследование острой висцеральной и соматически глубокой боли [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. Миронова А.Н., Бунатян Н.Д. и др. М., ЗАО «Гриф и К». 2012; Barrot М. Tests and models of nociception and pain in rodents. Neuroscience. 2012, 211: 39-50]. Специфическую болевую реакцию - «корчи» (характерные движения животных, включающие сокращения брюшных мышц, чередующиеся с их расслаблением, вытягиванием задних конечностей и прогибанием спины) - вызывали внутри-брюшинным введением 0,75% раствора уксусной кислоты (ГОСТ 61-75) мышам в дозе 0,1 мл/10 г массы тела. Анальгезирующий эффект оценивали по способности потенциального лекарственного средства (в течение 15 мин после инъекции) уменьшать (в %) количество «корчей» по сравнению с контрольной группой животных (критерий эффективности -снижение болевой реакции не менее чем на 50%) и латентному времени наступления болевой реакции. В данной серии экспериментов использовали следующие группы аутбред-ных мышей-самцов сток CD1:

1. Негативный контроль - мышам вводили воду очищенную в объеме 0,2 мл/ 20 г мышь однократно внутрижелудочно через зонд за 1 ч до внутрибрюшинной инъекции 0,75% раствора уксусной кислоты в объеме 0,1 мл/10 г (n=11).

2. Позитивный контроль - мышам вводили Трамадол в дозе 10 мг/кг в объеме воды очищенной 0,2 мл/ 20 г мышь однократно внутрижелудочно через зонд за 1 ч до внутрибрюшинной инъекции 0,75% уксусной кислоты в объеме 0,1 мл/10 г (n=9).

3. Анальгетик - мышам вводили (I) в дозе 25 мг/кг в объеме растворителя 0,2 мл/ 20 г мышь однократно внутрижелудочно через зонд за 1 ч до внутрибрюшинной инъекции 0,75% раствора уксусной кислоты в объеме 0,1 мл/ 10 г (n=10).

4. Анальгетик - мышам вводили (I) в дозе 50 мг/кг в объеме растворителя 0,2 мл/ 20 г мышь однократно внутрижелудочно через зонд за 1 ч до внутрибрюшинной инъекции 0,75% раствора уксусной кислоты в объеме ОД мл/10 г (n=10).

5. Анальгетик - мышам вводили (I) в дозе 100 мг/кг в объеме растворителя 0,2 мл/ 20 г мышь однократно внутрижелудочно через зонд за 1 ч до внутрибрюшинной инъекции 0,75% раствора уксусной кислоты в объеме 0,1 мл/10 г (n=10).

6. Анальгетик - мышам вводили (I) в дозе 200 мг/кг в объеме растворителя 0,2 мл/ 20 г мышь однократно внутрижелудочно через зонд за 1 ч до инъекции 0,75% раствора уксусной кислоты в объеме 0,1 мл/10 г (n=10).

Среднее количество уксусных «корчей» 22,8±2,0 за 15-минутный период наблюдения, латентное время их наступления 191,7±23,2 с свидетельствует о развитии выраженной висцеральной болевой реакции у животных группы негативного контроля после введения химического раздражителя (таблица 1).

Однократное введение мышам Трамадола в терапевтической дозе 10 мг/кг купировало болевой ответ до 57,5%, поскольку количество «корчей» уменьшилось в 2,4 (Р<0,01) раза по сравнению с соответствующим показателем группы негативного контроля (таблица 1). Латентное время развития болевой реакции статистически значимо увеличилось в 1,7 раза относительно такового показателя группы негативного контроля. Полученные результаты референс-контроля соответствуют данным литературы.

Доза 25 мг/кг оказалась неэффективной (3,5%) при однократном использовании (I) через 1 ч после введения на данной модели (таблица 1).

В случае введения (I) в дозе 50 мг/кг отмечалось его обезболивающее действие (30,5%), которое выражалось в снижении количества «корчей» в 1,4 раза, увеличении латентного времени наступления болевого ответа в 2,0 раза (Р<0,05) по сравнению с соответствующим значением негативного контроля (таблица 1). Следует отметить преимущественное значение этого показателя относительно аналогичного значения группы Трамадола (Р<0,05).

Дальнейшее увеличение дозы потенциального анальгетика до 100 мг/кг приводило к увеличению антиноцицептивного действия. Но, если в результате введения (I) в дозе 100 мг/кг обезболивающая активность составила 58,8% (Р<0,01), то увеличение дозы до 200 мг/кг не способствовало повышению эффективности, поскольку анальгетическая активность оказалась 50,9% (Р<0,01).

Таким образом, исследуемое вещество 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,10,12-пентаацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазаизовюрцитана (I) в тесте «Уксусные корчи» (Abdominal constriction test) проявляет выраженную анальгетическую активность в дозах 100 и 200 мг/кг, сравнимую с Трамадолом. Снижение болевой реакции более чем на 50% в условиях модели «Уксусных корчей», коррелирующей с клинической ситуацией острого перитонита, свидетельствует о высокой потенциальной возможности новой молекулы в качестве анальгетического средства.

Исследование анальгетической активности 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,10,12-пентаацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазаизовюрцитана (I) в сравнении с референс-препаратом Трамадолом в тесте «Механической компрессии лапы» (Randall-Selitto test).

Для исследования анальгетической активности молекулы 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,10,12-пентаацетил-2,4,6,8,10,12 гексаазаизовюрцитан (I) в тесте «Механической компрессии лапы» использовали анальгезиметр («Ugo Basile», Италия), который разработан для выполнения точного тестирования анальгетиков на нормальной и воспаленной лапе крыс и мышей по методу Рэндалл-Селитто [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. Миронова А.Н., Бунатян Н.Д. и др. М., ЗАО «Гриф и К». 2012; Barrot М. Tests and models of nociception and pain in rodents. Neuroscience. 2012, 211: 39-50]. При увеличении давления на конечность последовательно наблюдали: спинальный рефлекс отдергивания конечности, комплекс супраспинальных двигательных реакций животного, направленных на освобождение конечности, и вокализацию. Регистрировали порог возникновения вокализации (вес в граммах), латентное время болевой реакции, число животных без болевой реакции. Критерием анальгетического эффекта считали достоверное уменьшение интенсивности болевых реакций, оцененной в граммах по силе воздействия на здоровую лапу, латентному времени болевой реакции, числу животных без болевой реакции в динамике (через 1 после введения препаратов) после однократного и курсового ежесуточного трехдневного введения.

В двух сериях экспериментов (1 серия - однократное введение; 2 серия - курсовое введение в течение 3 сут) использовали следующие группы аутбредных мышей-самцов сток CD1:

1. Негативный контроль - мышам вводили воду очищенную в объеме 0,2 мл/ 20 г мышь внутрижелудочно через зонд однократно и ежесуточно в течение трех дней, в первый и последний день эксперимента введение осуществляли за 1 ч до фиксации вокализации, латентного времени болевой реакции, числа животных без болевой реакции (n=11);

2. Позитивный контроль - мышам вводили Трамадол в дозе 10 мг/кг в объеме воды очищенной 0,2 мл/ 20 г мышь внутрижелудочно через зонд однократно и ежесуточно в течение трех дней, в первый и последний день эксперимента введение осуществляли за 1 ч до фиксации вокализации, латентного времени болевой реакции, числа животных без болевой реакции (n=l 1);

3. Анальгетик - мышам вводили (I) в дозе 25 мг/кг в объеме растворителя 0,2 мл/ 20 г мышь внутрижелудочно через зонд однократно и в течение трех дней, в первый и последний день эксперимента введение осуществляли за 1 ч до фиксации вокализации, латентного времени болевой реакции, числа животных без болевой реакции (n=11);

4. Анальгетик - мышам вводили (I) в дозе 50 мг/кг в объеме растворителя 0,2 мл/ 20 г мышь внутрижелудочно через зонд однократно и в течение трех дней, в первый и последний день эксперимента введение осуществляли за 1 ч до фиксации вокализации, латентного времени болевой реакции, числа животных без болевой реакции (n=10);

5. Анальгетик - мышам вводили (I) в дозе 100 мг/кг в объеме растворителя 0,2 мл/ 20 г мышь внутрижелудочно через зонд однократно и в течение трех дней, в первый и последний день эксперимента введение осуществляли за 1 ч до фиксации вокализации, латентного времени болевой реакции, числа животных без болевой реакции (n=10);

6. Анальгетик - мышам вводили (I) в дозе 200 мг/кг в объеме растворителя 0,2 мл/ 20 г мышь внутрижелудочно через зонд однократно и в течение трех дней, в первый и последний день эксперимента введение осуществляли за 1 ч до фиксации вокализации, латентного времени болевой реакции, числа животных без болевой реакции (n=10).

На модели «механической гиперальгезии» по Рэндалл-Селитто величина болевого порога (г) составляла в первые (258,5±57,9) и (184,9±59,8) третьи сутки наблюдения у животных группы негативного контроля (таблица 2, 3). Отмечалось снижение латентного времени наступления болевой реакции от 5,0±1,4 с (1 сут) до 3,2±1,4 с (3 сут) при одинаковом числе животных с максимальной экспозицией (9,1%). Снижение исследуемых показателей контроля характерно для этой экспериментальной модели при повторном применении животных.

Референс-препарат Трамадол повышал порог болевой чувствительности при однократном применении в 2,1 раза (Р<0,05), в 2,5 раза (Р<0,05) - при трехкратном введении относительно соответствующих показателей негативного контроля (таблица 2, 3). Следует отметить увеличение в 1 сут наблюдения показателя времени болевого ответа в 2,1 раза (Р<0,05) и числа мышей без болевой реакции до 54,5% (Р<0,01) относительно аналогичных значений негативного контроля. Сходная картина фиксировалась в последующий период наблюдения в группе Трамадола: болевой порог увеличился в 2,5 раза (Р<0,01), латентное время болевого ответа в - в 2,9 раза (Р<0,01), тогда как число мышей с 15 с экспозицией оказалось прежним (таблица 2, 3).

Максимальная обезболивающая активность (I) в первый срок наблюдения отмечалась в группе применения дозы 25 мг/кг: повышение болевого порога - в 1,9 раза (Р<0,05), увеличение латентного времени - в 2 раза (Р<0,05) относительно соответствующих значений группы негативного контроля, при этом число мышей с максимальной экспозицией составило 54,5% (Р<0,01) против 9,1% негативного контроля (таблица 2, 3). Трехкратное применение соединения в дозе 25 мг/кг приводило к статистически значимому повышению его антиноцицептивного действия, о чем свидетельствуют все изученные показатели. Отмечалось увеличение порога болевой чувствительности в 2,9 раза (Р<0,01), латентного времени - в 3,7 раза при прежнем числе мышей с 15 с экспозицией 54,5% (Р<0,01). Отсутствовала статистически значимая разница между всеми показателями группы 25 мг/кг и таковыми значениями группы Трамадола в оба срока наблюдения.

У животных, получавших вещество (I) в дозах 50 и 100 мг/кг при однократном применении, отмечалась тенденция к увеличению порога болевой чувствительности в 1,7 раза, времени наступления болевой реакции – в 1,8 раза относительно соответствующих значений негативного контроля соответственно. Однако выявлено статистически значимое увеличение числа животных без болевой реакции в данных группах, сопоставимое с данным показателем группы Трамадола. Трехкратное ежесуточное применение (I) в дозах 50 и 100 мг/кг приводило к статистически значимому антиноцицептивному эффекту. Выявлено статистически значимое повышение болевого порога в 2,3 и 2,6 раза, латентного времени болевого ответа - в 2,7 (Р<0,05) и 3,1 раза (Р<0,05). Следует отметить статистически достоверное число мышей без болевой реакции (50%) только в группе животных, получавших 100 мг/кг. Отсутствовала статистически значимая разница между всеми показателями групп 50, 100 мг/кг и таковыми значениями группы Трамадола после трехкратного применения.

При использовании дозы 200 мг/кг (I) не проявило анальгетическое действие.

По совокупности полученных результатов исследования порога болевой чувствительности можно сделать вывод о сходной с Трамадолом активности соединения (I), которое продемонстрировало статистически значимую активность во все сроки наблюдения, в дозе 25 мг/кг - во все сроки наблюдения, в дозах 50 и 100 мг/кг - после ежесуточного трехкратного введения.

Таким образом, в результате исследования анальгетической активности вещества (I) в тесте «Механической компрессии лапы» (Randall-Selitto test) у аутбредных мышей-самцов сток CD1 при однократном и трехдневном применении продемонстрирована выраженная антиноцицептивная активность в диапазоне доз 25-100 мг/кг, сравнимая с эффективностью референс-препарата Трамадола.

Исследование анальгетической активности 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,10,12-пентаацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазаизовюрцитана (I) в сравнении с референс-препаратом Трамадолом в тесте исследования антиноцицептивного действия на модели боли центрального генеза «Горячая пластина».

Основной стандартной операционной процедурой для измерения порога болевой чувствительности и потенциального анальгезирующего эффекта изучаемых фармакологических препаратов в ответ на термическое раздражение является тест «Горячая пластина». Тест «Горячая пластина» (Hot plate) является базисным для исследования анальгетической активности и основан на поведенческих реакциях, контролируемых супраспинальными структурами, в ответ на термическое болевое воздействие. В исследованиях для быстрой и эффективной проверки уровня обезболивания на мелких лабораторных животных использовали HOTPLATE ANALGESIA METER (Columbus Instruments, USA). Мышей помещали на пластину, нагретую до 54,00±0,5°С. Эта температура создает ощущение дискомфорта, не вызывая серьезных повреждений. К конечным точкам данного эксперимента относятся: облизывание задних лап (голова обращена в сторону задней лапы, и вентральная поверхность под углом направлена вверх). При этом остальные поведенческие реакции игнорируют. Если животное не проявляет активности в течение 30-секундного интервала, то его убирают с горячей поверхности, а за латентное время подпрыгивания принимают 30 с.

При обработке полученных результатов рассчитывали величину максимально возможного эффекта (МВЭ). % МВЭ=ЛП₀ - ЛП_к/(30-ЛП_к) × 100, где ЛП₀ - латентный период ноцицептивной реакции в опытной группе; ЛПК - латентный период ноцицептивной реакции в контрольной группе; 30 с - максимальное время экспозиции для мышей. Одним из критериев, характеризующих анальгетическую активность исследуемого вещества, является количество животных с максимальным проявлением обезболивающего эффекта -экспозицией в течение 30 с на горячей пластине прибора.

Показатели латентного периода болевого ответа группы негативного контроля и число животных с максимальной экспозицией через 1 ч (21,6±2,4 с; 36,4%) и 2 ч (22,6±2,1 с; 36,4%) наблюдения свидетельствуют о высокопороговой болевой чувствительности данной партии аутбредных мышей-самцов сток CD1 (таблица 4).

Анализ значений латентного периода и числа животных с 30 с экспозицией позволил выявить тенденцию к увеличению через 1 ч после введения Трамадола, (I) - в дозах 25, 50, 200 мг/кг. В данный период наблюдения исследуемое соединение (I) в дозе 100 мг/кг проявило выраженное антиноцицептивное действие, заключающееся в статистически достоверном увеличении латентного времени развития болевой реакции, повышении числа мышей с 30 с экспозицией (Р<0,05) относительно соответствующих значений негативного контроля, в результате чего максимально выраженный эффект составил 81% и статистически достоверно превышал этот показатель Трамадола (40,5%).

Таким образом, 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,10,12-пентаацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазаизовюрцитан в дозе 100 мг/кг через 1 ч после введения продемонстрировал эффективность, превосходящую активность Трамадола.

Через 2 ч после введения в группе животных, получавших Трамадол, выявлено статистически достоверное повышение латентного времени, увеличение числа животных с 30 с экспозицией (Р<0,05), в результате чего максимально выраженный эффект составил 58%о. Полученный результат соответствует данным литературы (таблица 4).

Во второй период наблюдения соединение (I) проявило максимально выраженный эффект (67,6%) в минимальной использованной дозе 25 мг/кг. При этом отмечалось статистически значимое увеличение латентного времени, числа животных без проявления боли - до 80%) (2 ч, Р<0,05) против 40% (1 ч). Следует отметить сопоставимые результаты группы 25 мг/кг и группы животных, получавших референс-препарат.

Анализ полученных результатов исследования анальгетической активности 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8Д0,12-пентаацетил-2,4,6,8,10,12 гексаазаизовюрцита- на (I) в сравнении с референс-препаратом Трамадолом в тестах соматогенной боли различного генеза «Уксусные корчи» (Abdominal constriction test), «Механической компрессии лапы» (Randall-Selitto test), термического болевого раздражения «Горячая пластина» позволяет заключить, что вновь полученное соединение (I) обладает выраженным антиноцицептивным действием даже после однократного применения в зависимости от экспериментальной ситуации в диапазоне доз 25-200 мг/кг, сопоставимым и/или превосходящим по ряду показателей активность референс-препарата Трамадола.

Полученные данные о выраженном антиноцицептивном действии малотоксичного 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,10,12-пентаацетил-2,4,6,8,10,12 гексаазаизовюрцитана (I) позволяют сделать вывод о перспективности разработки анальгетического средства на основе инновационного соединения для купирования средней и высокой интенсивности болей различного генеза и, в определенной мере, прогнозировать характер его обезболивающего действия у человека.

Изобретение относится к новому химическому веществу - 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,10,12-пентаацетил-2,4,6,8,10,12 гексаазаизовюрцитану (I), а также к способу его получения, который заключается в ацилировании 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазаизовюрцитана ацетилхлоридом. Технический результат: получено новое соединение 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,10,12-пентаацетил-2,4,6,8,10,12 гексаазаизовюрцитан, обладающий анальгетической активностью, сравнимой и/или превосходящей эффективность Трамадола. 2 н.п. ф-лы, 4 табл., 2 пр.

1. 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,10,12-пентаацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазаизовюрцитан (I), обладающий анальгетической активностью.

2. Способ получения 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,10,12-пентаацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазаизовюрцитана по п. 1, заключающийся в ацилировании 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазаизовюрцитана ацетилхлоридом.