4,10-ДИ(ЭТОКСИАЦЕТИЛ)-2,6,8,12-ТЕТРААЦЕТИЛ-2,4,6,8,10,12-ГЕКСААЗАТЕТРАЦИКЛО [5,5,0,0,0]ДОДЕКАН В КАЧЕСТВЕ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА Российский патент 2023 года по МПК A61K31/4985 A61P29/00 

Изобретение относится к фармацевтической химии и фармакологии, а именно к применению 4,10-ди(этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетра-цикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекана, обладающего противовоспалительной активностью:

Воспаление является универсальным патологическим процессом, развивающимся под влиянием факторов экзогенной или эндогенной природы и характеризующимся стандартным комплексом сосудисто-тканевых изменений независимо от локализации и характера этиологического фактора. Любой повреждающий агент, который по силе и длительности превосходит адаптационные возможности ткани, может вызвать воспаление. Оно лежит в основе многих патологий, различных по клиническим проявлениям, и является одной из центральных проблем в процессе терапии.

Для контроля воспалительного процесса применяют стероидные и нестероидные противовоспалительные средства (НПВС). В группу НПВС объединено более 50 веществ различного химического строения. Необходимо отметить и то, что препараты многих фармацевтических групп, в частности агонисты альфа- и бета-адреноблокаторов, некоторые психотропные, нейротропные, антигистаминные, иммуннотропные, антибактериальные, цитостатические и другие препараты обладают элементами действия нестероидных противовоспалительных средств и могут вызывать торможение острой экссудативной реакции, уменьшать боль, оказывать жаропонижающий эффект. Но все-таки основную роль в подавлении воспаления, боли и лихорадки играют нестероидные противовоспалительные препараты. По данным научной литературы более чем за 140 лет (появление на фармацевтическом рынке биологически активных веществ с противовоспалительной, жаропонижающей и обезболивающей активностью относится к 1876 году), в мире синтезированы сотни субстанций НПВС. Часть из них в связи с тяжелыми побочными эффектами (гастродуоденопатия, нефротоксичность, кардиоваскулярные эффекты, гепатотоксичность, тератогенность, гематотоксичность) и недостаточной эффективностью запрещены к производству. Во многих странах запрещено производить и применять, например, метамизол и его многочисленные комбинации [Малахов В.А., Ромелашвили Е.С., 2011; Son W.S. et al., 2019; Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. Миронова А.Н., Бунатян Н.Д. и др. М., ЗАО «Гриф и К». 2012, Машковский М.Д. Лекарственные средства: 15-е изд. М.: ОО «Издательство Новая Волна». 2008, 1206].

Одним из наиболее часто используемых и наиболее близким по техническому результату к предлагаемому средству является диклофенак, таблетированная форма, которого выбрана в качестве препарата сравнения. Диклофенак натрия (Diclofenac) относится к фармакотерапевтической группе: нестероидные противовоспалительные средства. Фармакологическое действие - противовоспалительное, болеутоляющее, жаропонижающее, противоревматическое, антиагрегационное. Ингибирует циклооксигеназу, в результате чего блокируются реакции арахидонового каскада и нарушается синтез ПГЕ2, ПГЕ альфа, тромбоксана А2, простациклина [Машковский М.Д. Лекарственные средства: 15-е изд. М.: ОО «Издательство Новая Волна». 2008, 1206]. Однако, в результате продолжительного применения диклофенака могут развиться следующие побочные эффекты: нарушение пищеварения, метеоризм, тошнота, рвота, боли в желудке, диарея, запор, головная боль, головокружение, сонливость; зуд, потливость; заложенность носа; повышенное артериальное давление.

Существуют противопоказания и ограничения к назначению большинства остальных противовоспалительных средств.

Нами впервые выявлена выраженная противовоспалительная активность 4,10-ди(этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9] додекана (этовюрцина), относящегося к нетоксичным соединениям (LD₅₀ находится за пределами 2000 мг/кг в силу невозможности введения большей дозы из-за физико-химических свойств соединения и отсутствия летальности).

Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение арсенала малотоксичных противовоспалительных средств применением вещества 4,10-ди(этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9] додекана. Прямых аналогов предлагаемого лекарственного средства на основе производного 2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекана (гексаазаизовюрцитана) для противовоспалительной терапии не существует. Приоритет оригинальности данной молекулы подтвержден патентом №2736936 РФ «4,10-ди(этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекан в качестве анальгетического средства и способ его получения» (23.11.2020).

Поставленная задача достигается применением 4,10-ди(этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекана (этовюрцина) в качестве противовоспалительного средства.

Соединение представляет собой каркасный полиамид - производное 2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекана.

Техническим результатом является выявление противовоспалительного действия нового нетоксичного противовоспалительного средства.

Предлагаемое в качестве изобретения противовоспалительное средство 4,10-ди(этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло [5,5,0,0^3,11,0^5,9] додекан (этовюрцин) синтезировано в Институте проблем химико-энергетических технологий (г. Бийск).

В НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ в результате экспериментальных исследований выявлена выраженная противовоспалительная активность данного вещества.

Предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине. Идентичной совокупности признаков не обнаружено при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе [Толстикова Т.Г., Морозова Е.А., Сысолятин С.В., Калашников А.И., Жукова Ю.И., Сурмачев В.Н. Синтез и биологическая активность производных 2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекана. Химия в интересах устойчивого развития. 2010, 18: 511-516; Sergey V. Sysolyatin, Alexander I. Kalashnikov, Valeriy V. Malykhin, Irina A. Surmacheva, Gennady V. Sakovich. Reductive Debenzelation of 2,4,6,8,10,12 - Hexaazaisowurtzitane / International Journal of Energetic Materials and Chemical Propulsion.2010, 9 (4): патент №2565766 «4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекан в качестве анальгетического средства и способ его получения» (20.10.2015); патент №2684107 «4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекан в качестве противосудорожного средства» (04.04.2019)].

Возможность осуществления заявляемого изобретения подтверждается примером конкретного выполнения исследования противовоспалительной активности 4,10-ди(этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекана (этовюрцина) в сравнении с референс препаратом диклофенаком, доказывающего, что новые признаки решают поставленную задачу.

Пример.

Потенциальные противовоспалительные лекарственные средства могут оказывать тормозящее влияние на развитие любого рода воспалительных реакций вне зависимости от характера повреждающего фактора, фазы и стадии процесса. Для оценки противовоспалительного действия необходимо исследовать влияние вещества на моделях острого экссудативного и хронического пролиферативного воспаления. Методические рекомендации по изучению противовоспалительной активности лекарственных средств в «Руководстве по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (2013) послужили основой для выбора метода оценки противовоспалительной активности соединения для последующего моделирования в условиях экспериментов in vitro.

Эксперименты выполнены на половозрелых животных: аутбредных мышах-самцах CD1, аутбредных крысах-самках SD конвенциональных, 1 категории, полученных из отдела экспериментального биомоделирования НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ. Содержание животных и дизайн экспериментов были одобрены комиссией по биоэтике НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга (протокол JACUC №192112021) и соответствовали директиве 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях; ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики, 01.08.2015.

Вывод животных из эксперимента осуществляли: мышей - методом кранио-цервикальной дислокации, крыс - СО₂-наркозом.

В качестве растворителя для этовюрцина использовали воду очищенную с добавлением 20 мкл ТВИН-80 (Полисорбат LAUROPAN Т/80, Италия) / 1 мл воды.

Статистическая обработка полученных результатов проведена с использованием программного обеспечения Statistica 6.0. Для всех данных рассчитаны среднее значение (X) и стандартное отклонение (т), которые вместе со значением п (количество вариант) представлены в итоговых таблицах. Межгрупповые различия проверялись с использованием непараметрического критерия Краскела-Уолисса и Вилкоксона-Манна-Уитни (U), для сравнения частот использовали критерий углового преобразования Фишера (фϕ. Различия считали статистически значимыми при Р≤0,05 [8].

Исследование противовоспалительного действия 4,10-ди(этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекана (этовюрцина) в сравнении с диклофенаком натрия в условиях модели острого экссудативного отека -каррагенинового воспаления у мышей.

Одной из классических моделей острого воспаления, используемой для скрининга новых потенциальных противовоспалительных молекул, является каррагениновый отек лапы у мышей и крыс. Острую воспалительную реакцию (отек) вызывают субплантарным введением 0,1 мл (крысы) или 0,05 мл (мыши) 1% (в 0,9% NaCl) раствора каррагенина (сульфатированный полисахарид из ирландского морского мха) под апоневротическую пластинку задней лапы животного. В другую заднюю лапу вводят эквивалентный объем 0,9% NaCl. При этом кардинальные признаки воспаления - отек, гипералгезия, эритема - развиваются сразу после субплантарной инъекции без повреждения тканей воспаленной лапы. Средний прирост отека лапы животного (%) определяется через 1 ч и на пике воспаления через 3 ч после введения флогогена.

Оценку противовоспалительной активности этовюрцина в дозах 25, 50 и 100 мг/кг в сравнении с диклофенаком (10 мг/кг) проводили с использованием стандартной методики острого каррагенинового отека на 96 аутбредных мышах-самцах CD1 (массой 29,2±1,1 г). Тестируемые вещества вводили профилактическим курсом в желудок через атравматичный зонд ежедневно в течение 3 сут, последнее введение осуществляли за 1 ч до инъекции флогогена. В день индукции острого экссудативного отека лапы, тестируемые вещества вводили за 1 ч до субплантарной инъекции 1% раствора (в 0,9% NaCl) каррагенина. В 1 серии экспериментов животных подвергали эвтаназии через 1 ч после введения флогогена, во 2 серии - через 3 ч после введения флогогена, после чего обе задние лапки (воспаленная и здоровая) выделяли по выступу кости ниже сочленения мало- и болыпеберцовой кости и выше пяточного сустава, определяли их массу на весах лабораторных электронных Adventurer фирмы «OHAUS Europe» (Швейцария).

Антиэкссудативный эффект, оцениваемый по изменению массы отека, был выражен в процентах к контролю и посчитан по формулам:

Субплантарное введение флогогена (50 мкл 1% раствора каррагенина) в заднюю правую лапу мышей контрольной группы приводило к формированию экссудативного отека, масса которого в раннюю фазу развития экссудации (через 1 ч) составила 30,4±3,8 мг на фоне прироста отека до 16,6±2,0% (таблица 1). В этот период наблюдения, который характеризуется нарастанием экссудативного отека лапы, выявлено статистически значимое противовоспалительное действие диклофенака (10 мг/кг) и этовюрцина (25 мг/кг), которое заключалось в снижении массы отека в 1,7 (Р<0,05) и 1,5 раза (Р<0,05), уменьшении прироста отека в 1,7 раза (Р<0,01) и 1,5 раза (Р<0,05) соответственно относительно значений контроля. Показатели противовоспалительной активности сравниваемых групп не имели статистически значимых отличий, что свидетельствует о сопоставимости полученных результатов (31,3% этовюрцина против 42,8% диклофенака).

Через 3 ч после субплантарного введения каррагенина масса отека у мышей контрольной группы увеличилась до 43,2±4,4 мг, а прирост отека составил 23,1±2,3% (таблица 1). У животных, получавших диклофенак, масса отека статистически значимо уменьшилась и составила 32,3±2,5 мг на фоне прироста отека до 17,8±1,5% (Р<0,05), что обусловило антиэкссудативную активность НПВС (22,9%).

На пике каррагенинового воспаления в группах животных, получавших этовюрцин в диапазоне доз 25-100 мг/кг, отмечалась дозозависимая «куполообразная» антиэкссудативная активность с максимальным эффектом в дозе 50 мг/кг. В этот период развития воспаления у животных, получавших вещество в дозе 50 мг/кг, масса отека оказалась в 1,6 раза Р<0,05 меньше контрольного уровня, причем фиксировался минимальный прирост отека - 14,5±1,98 мг (Р<0,05), вследствие чего угнетение отека составило 37,2%. В группе применения этовюрцина в дозе 25 мг/кг выявлено снижение прироста отека лапы у мышей в 1,4 раза (Р<0,05) и массы отека в 1,4 раза (Р<0,05), что выразилось в угнетении воспалительной реакции до 29%. Эффективность соединения в дозе 100 мг/кг на пике воспалительной реакции (17,7%) осталась на уровне 1 ч наблюдения (16,3%).

Таким образом, этовюрцин при трехсуточном профилактическом введении в желудок оказывает «куполообразную» дозозависимую антиэкссудативную активность, сравнимую с эффектом диклофенака, как через 1 ч (25 мг/кг), так и через 3 ч (25 мг/кг, 50 мг/кг) после инъекции флогогена.

Исследование противовоспалительного действия 4,10-ди(этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекана в сравнении с диклофенаком натрия на модели хронического пролиферативного воспаления у крыс.

Для оценки противовоспалительного действия новых веществ используется модель хронического пролиферативного воспаления, которая характеризует антиэкссудативный и антипролиферативный компоненты фармакологической активности. Хроническое грануляционно-фиброзное воспаление моделируется в эксперименте на крысах, которым под кожу спины имплантируют стерильный ватный тампон массой 13 мг с помощью иглы (А1-20x40-117И25). Введение тестируемых веществ начинается за 1 ч до имплантации ватного тампона и продолжается в течение 7 сут. На 8-е сутки животных умерщвляют CO₂-наркозом, ватные тампоны с образовавшейся вокруг них грануляционной тканью извлекают, взвешивают на электронных весах «Adventurer» (США) и высушивают в термостате до постоянной массы при 60°С. Пролиферативную реакцию оценивают по разнице между массой высушенной гранулемы и исходной массой ватного тампона. Экссудативную реакцию оценивают по разнице между массами сырой и высушенной гранулемы (экссудату).

Оценку антиэкссудативного и антипролиферативного действия этовюрцина в дозах 12,5; 25; 50 и 100 мг/кг в сравнении с диклофенаком (5 мг/кг) проводили на 71 аутбредной самке крыс SD, которые получали тестируемые вещества внутрь курсом через атравматичный зонд ежедневно в течение 7 сут. Первое введение осуществляли за 1 ч до имплантации стерильного ватного тампона под кожу спины. Животные контрольной группы получали растворитель в аналогичном режиме и пути введения. Показатели массы сырой гранулемы (280,0±43,2 мг) и экссудата (154,5±14,7 мг) свидетельствовали о выраженном воспалительном процессе у животных группы контроля (таблица 2).

На фоне индуцированного хронического патологического процесса этовюрцин способствовал снижению выраженности экссудативного отека и гранулематозной инфильтрации при введении в диапазоне доз 12,5-100 мг/кг.

Противовоспалительная активность диклофенака реализовалась главным образом за счет статистически значимого антипролиферативного эффекта (44,3%), который выражался в снижении массы сырой гранулемы в 1,3 раза (Р<0,01), массы сухой гранулемы в 4,2 раза (Р<0,05), массы гранулематозно-фиброзной ткани в 1,8 раза (Р<0,05) в сравнении с соответствующими значениями контроля.

Максимальный эффект по всем изучаемым параметрам отмечался при введении исследуемого вещества в дозе 12,5 мг/кг: выявлена статистически значимая антиэкссудативная активность (44,5%, Р<0,05) относительно эффекта диклофенака (8,7%), антипролиферативное действие составило 62,9%) против 44,3% НПВС. Введение этовюрцина в дозе 25 мг/кг приводило к статистически значимому уменьшению массы сырой гранулемы в 1,9 раза, массы сухой гранулемы - в 2,2 раза (Р<0,01), массы гранулематозно-фиброзной ткани - в 2,6 раза (Р<0,01), массы экссудата - в 1,7 раза (Р<0,01), в результате чего угнетение экссудации составило 39,6% (Р<0,05), статистически значимое снижение процессов пролиферации - 61,4% относительно контроля. Следует отметить, что антиэкссудативное действие этовюрцина (25 мг/кг) статистически значимо превосходила активность диклофенака при сопоставимости параметров антипролиферативного эффекта. Похожая картина наблюдалась при использовании вещества в дозах 50 и 100 мг/кг. Выявлено снижение массы сырой гранулемы - в 1,8 раза (50 мг/кг, Р<0,01) и 1,8 раза (100 мг/кг, Р<0,01), массы сухой гранулемы - в 2,1 раза (50 мг/кг, Р<0,01) и 2 раза (100 мг/кг, Р<0,01), массы гранулематозно-фиброзной ткани - в 2,5 раза (50 мг/кг, Р<0,01) и 2,2 раза (100 мг/кг, Р<0,01), массы экссудата - в 1,6 раза (50 мг/кг, Р<0,01) и 1,6 раза (100 мг/кг, Р<0,01) относительно аналогичных значений контроля. Противовоспалительный эффект этовюрцина реализовался за счет угнетения экссудации до 36,2% (50 мг/кг, Р<0,05) и 38,1 (100 мг/кг, Р<0,05), снижения выраженности процессов пролиферации - до 60,6% (50 мг/кг) и 55,3 (100 мг/кг, Р<0,05).

Резюмируя вышесказанное, можно сделать вывод о выраженном дозозависимом противовоспалительном эффекте 4,10-ди(этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекана (этовюрцина) со значительным снижением гранулематозной инфильтрации и экссудации на модели хронического пролиферативного воспаления. Исследуемое соединение в диапазоне доз 12,5-100 мг/кг статистически значимо превосходило антиэкссудативный эффект референс-препарата диклофенака. Кроме того, на двух моделях воспаления различной этиологии на мышах и крысах (самцах и самках) доказано наличие антиэкссудативного действия этовюрцина, как при его профилактическом, так и лечебном применении.

Изобретение относится к фармацевтической химии и фармакологии, а именно к применению 4,10-ди(этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекана формулы:

в качестве противовоспалительного средства. Технический результат: расширение арсенала малотоксичных противовоспалительных средств. 2 табл., 1 пр.

Применение 4,10-ди(этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекана в качестве противовоспалительного средства.