4-(3,4-ДИБРОМТИОФЕНКАРБОНИЛ)-10-(2-ЭТОКСИАЦЕТИЛ)-2,6,8,12-ТЕТРААЦЕТИЛ-2,4,6,8,10,12-ГЕКСААЗАТЕТРАЦИКЛО[5,5,0,0 , 0 ]ДОДЕКАН В КАЧЕСТВЕ АНАЛЬГЕТИЧЕСКОГО СРЕДСТВА И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ Российский патент 2022 года по МПК C07D487/22 A61K31/551 A61P29/00 

Изобретение относится к фармацевтической химии и фармакологии, а именно к новому химическому веществу - 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-10-(2-этоксиацетил) -2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11_,0^5,9]додекану, обладающему анальгетической активностью:

Анальгетики, способные купировать боли высокой интенсивности и различной этиологии, включая хронические, представляют собой одну из стратегически важнейших категорий лекарственных средств. В настоящее время для терапии боли различного генеза в стационарных и амбулаторных условиях используются в основном два типа препаратов анальгетиков: нестероидные противовоспалительные вещества (НПВС) и опиаты, а также различные их комбинации в схемах мультимодальной терапии [Машковский М.Д. Лекарственные средства: 15-е изд. М: ОО «Издательство Новая Волна». 2008, 1206; Михайлова А.С. Анальгетический арсенал клинициста. Фарматека. 2018, (3): 50-56; Соснов А.В., Садовников С.В., Семченко Ф.М., Руфанов К.А., Тохмахчи В.Н., Соснова А.А., Тюрин И.А. Сильнодействующие ненаркотические анальгетики как направление развития фармацевтики. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2016, 14 (1): 196-206; Черняков А.В. Проблема боли и обезболивания в амбулаторной хирургии // Русский Медицинский Журнал. 2016, 2 (14); 927-931; Cawich S.O., Deonarine U., Harding H.E., Dan D., Naraynsingh V., Cannabis and Postoperative Analgesia. Handbook of Cannabis and Related Pathologies. Biology, Pharmacology, Diagnosis, and Treatment. 2017, 450-458]. Основными недостатками НПВС по-прежнему остаются побочные и нежелательные эффекты (гастро-, нефро-, гепато-, гематотоксичность, кардиоваскулярные эффекты, тератогенность и др.), фармакологическая активность, проявляющаяся преимущественно на уровне периферии нервной системы [Колоколов О.В., Ситкали И.В., Колоколова A.M. Ноцицептивная боль в практике невролога: алгоритмы диагностики, адекватность и безопасность терапии // Русский Медицинский Журнал. 2015, 23 (12): 664-667. Машковский М.Д. Лекарственные средства: 15-е изд. М.: ОО «Издательство Новая Волна». 2008, 1206; Михайлова А.С. Анальгетический арсенал клинициста. Фарматека. 2018, (3): 50-56; Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. Миронова А.Н., Бунатян Н.Д. и др. М., ЗАО «Гриф и К». 2012.; Соснов А.В., Садовников С.В., Семченко Ф.М., Руфанов К.А., Тохмахчи В.Н., Соснова А.А., Тюрин И.А. Сильнодействующие ненаркотические анальгетики как направление развития фармацевтики. Разработка и регистрация лекарственных средств. 2016, 14 (1): 196-206]. Главными недостатками опиатов, лимитирующими их применение в клинике, является формирование физиологической и психической зависимости, приводящей к инвалидизации трудоспособного населения [Палехов А.В., Введенская Е.С Тактика выбора и применения опиоидных анальгетиков для купирования хронической боли // Паллиативная медицина и реабилитация. 2018, (3): 18-24]. Сходные побочные эффекты, выраженные в меньшей степени, характерны и для анальгетиков из класса каннабиоидов [Cawich S.O., Deonarine U., Harding H.E., Dan D., Naraynsingh V., Cannabis and Postoperative Analgesia. Handbook of Cannabis and Related Pathologies. Biology, Pharmacology, Diagnosis, and Treatment. 2017,450-458; Shiels M.S., Chernyavskiy P., Anderson W.F. et al. Trends in premature mortality in the USA by sex, race, and ethnicity from 1999 to 2014: an analysis of death certificate data // The Lancet. 2017, 389 (10073): 1043-1054]. Все вышесказанное обосновывает необходимость разработки новых высокоэффективных малотоксичных анальгетиков, в первую очередь, на основе принципиально новых классов веществ, инновационных молекулярных структур, отличающихся иными, по сравнению с опиатами и НПВС. механизмами антиноцицептивного действия.

Одним из наиболее часто используемых и наиболее близким по техническому результату к предлагаемому средству является Трамадол - анальгетик смешанного механизма действия, включающего в себя опиоидный и неопиоидный компоненты, который выбран в качестве препарата сравнения [Машковский М.Д. Лекарственные средства: 15-е изд. М.: ОО «Издательство Новая Волна». 2008, 1206; Михайлова А.С. Анальгетический арсенал клинициста. Фарматека. 2018, (3): 50-56].

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала анальгетических средств с помощью создания новых веществ, обладающих анальгетической активностью и малой токсичностью.

Поставленная задача достигается применением впервые синтезированного вещества 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-10-(2-этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11_,0^5,9]додекана (I) в качестве анальгетического средства.

Предлагаемое в качестве изобретения анальгетическое средство впервые синтезировано в Институте проблем химико-энергетических технологий (г.Бийск). Соединение I полностью подтверждено с помощью физико-химических методов анализа (ИК-спектроскопия, элементный анализ, 1Н- и 13С ЯМР-спектроскопия), обладает выраженной анальгетической активностью и относится к 3 классу опасности «малотоксичные средства».

4-(3,4-Дибромтиофенкарбонил)-2,8,10,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазаизовюрцитан обладает анальгетической активностью [Крылова С.Г., Лопатина К.А., Нестерова Ю.В., Поветьева Т.Н., Кульпин П.В., Афанасьева О.Г., Кулагина Д.А., Сафонова Е.А., Зуева Е.П., Суслов Н.И., Сысолятин СВ. Некоторые аспекты исследования центрального механизма антиноцицептивного действия нового анальгетика из класса гексаазаизовюрцитанов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2020 (12): 739-746], введение в его состав этоксиацетильной группировки приводит к повышению растворимости целевого соединения I (в сравнении с исходным продуктом), что делает его еще более привлекательным в плане практического использования.

В НИИ фармакологии и регенеративной медицины имени Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ (г.Томск) в результате проведении экспериментальных исследований выявлена выраженная анальгетическая активность данного вещества.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является новое вещество I, способ его получения, выявление анальгетических свойств вещества I и подтверждение его анальгетического действия. Выявленное свойство вещества I, предлагаемого в качестве анальгетического средства, явным образом не вытекает из уровня техники в данной области и неочевидно для специалиста. Идентичной совокупности признаков не обнаружено при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе [Толстикова Т.Г., Морозова Е.А., Сысолятин С.В., Калашников А.И., Жукова Ю.И., Сурмачев В.Н. Синтез и биологическая активность производных 2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11_,0^5,9]додекана. Химия в интересах устойчивого развития. 2010, 18: 511-516; Sergey V. Sysolyatin, Alexander I. Kalashnikov, Valeriy V. Malykhin, Irina A. Surmacheva, Gennady V. Sakovich. Reductive Debenzelation of 2,4,6,8,10,12-Hexaazaisowurtzitane/ International Journal of Energetic Materials and Chemical Propulsion.2010, 9 (4): 365; Крылова С.Г., Лопатина K.A., Нестерова Ю.В., Поветьева Т.Н., Кульпин П.В., Афанасьева О.Г., Кулагина Д.А., Сафонова Е.А., Зуева Е.П., Суслов Н.И., Сысолятин С.В. Некоторые аспекты исследования центрального механизма антиноцицептивного действия нового анальгетика из класса гексаазаизовюрцитанов // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2020 (12): 739-746; Kulagina, D.A., Sysolyatin, S.V., Kalashnikov, A.I. et al. Synthesis and Analgesic Activity of 4,10-Bis((±)-5-Benzoyl-2,3-Dihydro-l/?pyrrolo[l,2-fl]Pyrrole-l-Carbonyl)-2,6,8,12-Tetraacetyl-2,4,6,8,10,12-Hexaazatetracyclo [5,5,0,0^3,11_,0^5,9]Dodecane. Pharm. Chem. J. 54, 1140-1144 (2021); Tomilova, E., Kurgachev, D., Kulagina, D.. Sergey Sysolyatin, S., Krylova, S., Novikov, D. Development of HPLC-Method for Simultaneous Determination of API and Related Components in Thiowurtzine: A New Non-Narcotic Analgesic. Chromatographia 84, 147-154 (2021)].

Возможность осуществления заявляемого изобретения подтверждается примером конкретного выполнения способа получения заявленного средства.

Пример 1

Получение 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-10-(2-этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11_,0^5,9]додекана 23 г (0,188 моль) хлорангидрида этоксиуксусной кислоты растворяют в 630 мл сухого ацетонитрила. При перемешивании добавляют 56,94 г (0,094 моль) 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11_,0^5,9]додекана. Суспензию кипятят при перемешивании в течение 5,5 часов, фильтруют и охлаждают. Масса технического продукта 53,61 г (82,7% от теоретического). Продукт перекристаллизовывают из 1448 мл диметилформамида. Масса очищенного вещества 43,96 г (82% от теоретического) в виде бесцветных кристаллов с содержанием основного вещества 98,21% (ВЭЖХ) и температурой плавления 298-300°С

Брутто-формула: C₂₃H₂₆Br₂N₆O₇S Найдено (%): С 39,99; Н 3,78; N 12,13. Вычислено (%): С 40,02; Н 3,80; Br 23,15; N 12,17; О 16,22; S 4,64.

ИК-спектр, v/см^-1: 3105, 3038, 3008, 2979, 2886, 1663, 1403, 1312, 1278, 1169, 1112, 1040, 993, 965, 949, 733, 712, 624.

Спектр ЯМР ¹Н (ДМСО-d6, δ, м.д.): 1.10-1.14 (т, 3Н, СН₃), 1.95-2.19 (м, 12Н, СН₃СО), 2.89 (кв, 2Н, СН₂), 3.44-3.49 (с, 2Н, СН₂), 4.45-4.68 (м, 2Н, СН), 6.17-7.04 (м, 4Н, СН), 8.15 (с, Н, тиофен)

Спектр ЯМР ¹³С (ДМСО-d6, δ, м.д.): 15.44 (С, СН₃, EtO), 21.56, 22.34 (С, СН₃, СН₃СО); 62.82, 63.73, 66.08, 71.47, 71.97, 73.67 (С, СН), 66.73 (С, СН₂), 68.91 (С, СН₂, EtO), 112.72, 114.08, 132.57(С, С тиофен), 128.60 (С, СН тиофен), 162.83 (С, СО тиофен), 167.83,168.13,168.62,169.32, 169.73 (С, СО, СН₃СО).

Возможность осуществления заявляемого изобретения подтверждается примером конкретного выполнения исследования анальгетической активности 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-10-(2-этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11_,0^5,9]додекана в сравнении с референс-препаратом Трамадолом, доказывающего, что выявленные признаки решают поставленную задачу.

Пример 2

Эксперименты были выполнены на 194 аутбредных мышах сток CD1 обоих полов, (7-8 недель, масса 22-27 г) первой категории конвенциональных, полученных из отдела экспериментального биомоделирования НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга Томского НИМЦ (сертификат здоровья животных). Содержание животных и дизайн экспериментов были одобрены Биоэтическим комитетом НИИФиРМ им. Е.Д. Гольдберга и соответствовали директиве 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях [Директива 2010/63/EU Европейского парламента и Совета Европейского союза по охране животных, используемых в научных целях (пер. с англ.). СП. 2012, 48]; ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики», 01.08.2015.

Каждому животному внутри группы присваивали индивидуальный номер от 1 до 16, помечаемый с помощью меток фукорцином. Мышей распределяли на группы рандомизированно, используя в качестве критерия массу тела, так, чтобы индивидуальное значение массы не отклонялось от среднего значения в пределах одного пола более чем на ±10%. Данные (вес и номер) отобранных животных ранжировали в порядке убывания веса, используя для этого компьютерную программу Excel, имеющую команду SORT.

Статистическая обработка полученных результатов проведена методами вариационной статистики с использованием программного обеспечения Statistica 6.0. Для всех данных подсчитаны среднее значение (X) и стандартная ошибка среднего (т), которые вместе со значением п (количество вариант в группе) представлены в итоговых таблицах. Различие сравниваемых величин считали достоверным в том случае, если вероятность их тождества была меньше 5% (Р<0,05). Используя выборочные коэффициенты асимметрии и эксцесса, оценивали степень приближения закона распределения исследуемого признака к нормальному. В случаях нормального распределения признаков для статистической оценки применяли параметрический t-критерий Стьюдента. При отклонениях распределений признака от нормального вида для независимых выборок использовали непараметрический критерий U-критерий Уилкоксона-Манна-Уитни. Для выявления достоверности различий качественных показателей использовали критерий углового преобразования Фишера [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. Миронова А.Н., Бунатян Н.Д. и др. М., ЗАО «Гриф и К». 2012].

Определение острой токсичности (I).

При определении острой токсичности 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-10-(2-этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11_,0^5,9] додекана (I) вводили 7 аутбредным мышам-самкам и 7 аутбредным мышам-самцам сток CD1 однократно внутрижелудочно в максимальной дозе 2000 мг/кг (в связи с плохой растворимостью в воде 6,25 г/л) в объеме 0,5 мл водно-твинового раствора. В течение 2 недель наблюдения гибели животных не отмечалось, мыши не имели отклонений в состоянии здоровья и поведении, патологические рефлексы не фиксировались. В связи с невозможностью определения LD50 исследуемое вещество (I) отнесено к 3 классу опасности - «малотоксичные средства» в соответствии с ГОСТ 12.1007-76 «Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности» и «Руководством по проведению доклинических исследований лекарственных средств, 2012» [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. Миронова А.Н., Бунатян Н.Д. и др. М., ЗАО «Гриф и К». 2012].

Для оценки антиноцицептивной активности в условиях модели «Уксусные корчи», теста «Механической компрессии здоровой лапы» (Rendal-Selitto), теста «Тепловой иммерсии хвоста» [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. Миронова А.Н., Бунатян Н.Д. и др. М., ЗАО «Гриф и К». 2012; Barrot М. Tests and models of nociception and pain in rodents. Neuroscience. 2012, 211: 39-50] тестируемое вещество (I) вводили мышам внутрижелудочно через зонд в диапазоне доз 25, 50, 100 и 200 мг/кг однократно ежесуточно и в течение 3 дней. Используемая суточная доза референс-препарата Трамадола для мышей (10 мг/кг, растворитель - вода очищенная) соответствовала среднесуточной дозе для человека (согласно инструкции для применения Трамадола). Животные группы негативного контроля получали растворитель (вода очищенная) в аналогичном режиме и пути введения. Значения массы тела животных использовали для расчета доз тестируемых веществ. Отбор определенного количества тестируемого средства производили в рабочей комнате с бактерицидным рециркулятором, который обеспечивает безопасность процедур и чистоту приготовления тестируемых веществ для введения. Необходимое количество веществ для введений готовилось ответственным за провизорскую работу сотрудником лаборатории. Приготовление доз основывалось на значениях доз и указанном объеме введения. Эвтаназию животных по окончании экспериментов осуществляли кранио-цервикальной дислокацией.

Исследование анальгетической активности 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-10-(2-этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11_,0^5,9] додекана (I) в сравнении с референс-препаратом Трамадолом в тесте «Уксусные корчи» (Abdominal constriction test).

Тест «Уксусные корчи» (Abdominal constriction test) направлен на исследование острой висцеральной и соматически глубокой боли [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. Миронова А.Н., Бунатян Н.Д. и др. М., ЗАО «Гриф и К». 2012; Barrot М. Tests and models of nociception and pain in rodents. Neuroscience. 2012, 211: 39-50]. Специфическую болевую реакцию - «корчи» (характерные движения животных, включающие сокращения брюшных мышц, чередующиеся с их расслаблением, вытягиванием задних конечностей и прогибанием спины) - вызывали внутрибрюшинным введением 0,75% раствора уксусной кислоты (ГОСТ 61-75) мышам в дозе 0,1 мл/10 г массы тела. Анальгезирующий эффект оценивали по способности потенциального лекарственного средства (в течение 15 мин после инъекции) уменьшать (в %) количество «корчей» по сравнению с контрольной группой животных (критерий эффективности - снижение болевой реакции не менее чем на 50%) и латентному времени наступления болевой реакции. В данной серии экспериментов использовали следующие группы аутбредных мышей-самцов сток CD1:

1. Негативный контроль - мышам вводили воду очищенную в объеме 0,2 мл/ 20 г мышь однократно ежесуточно внутрижелудочно через зонд в течение 3 сут и последний раз за 1 ч до внутрибрюшинной инъекции 0,75% раствора уксусной кислоты в объеме 0,1 мл/ 10 г (n=11);

2. Позитивный контроль - мышам вводили Трамадол в дозе 10 мг/кг в объеме воды очищенной 0,2 мл/ 20 г мышь однократно внутрижелудочно через зонд в течение 3 сут и последний раз за 1 ч до внутрибрюшинной инъекции 0,75% уксусной кислоты в объеме 0,1 мл/ 10 г(n=9);

3. Анальгетик - мышам вводили (I) в дозе 25 мг/кг в объеме растворителя 0,2 мл/ 20 г мышь однократно внутрижелудочно через зонд в течение 3 сут и последний раз за 1 ч до внутрибрюшинной инъекции 0,75% раствора уксусной кислоты в объеме 0,1 мл/ 10 г (n=10);

4. Анальгетик - мышам вводили (I) в дозе 50 мг/кг в объеме растворителя 0,2 мл/ 20 г мышь однократно внутрижелудочно через зонд в течение 3 сут и последний раз за 1 ч до внутрибрюшинной инъекции 0,75% раствора уксусной кислоты в объеме 0,1 мл/ 10 г (n=10);

5. Анальгетик - мышам вводили (I) в дозе 100 мг/кг в объеме растворителя 0,2 мл/ 20 г мышь однократно внутрижелудочно через зонд в течение 3 сут и последний раз за 1 ч до внутрибрюшинной инъекции 0,75% раствора уксусной кислоты в объеме 0,1 мл/ 10 г (n=10);

6. Анальгетик - мышам вводили (I) в дозе 200 мг/кг в объеме растворителя 0,2 мл/ 20 г мышь однократно внутрижелудочно через зонд в течение 3 сут и последний раз за 1 ч до инъекции 0,75% раствора уксусной кислоты в объеме 0,1 мл/10 г (n=10).

Как видно из таблицы 1, у животных группы негативного контроля фиксировали выраженную болевая реакция в течение 15 мин наблюдения, которая заключалась в развитии уксусных «корчей» (22,6±2,1) при латентном времени их наступления 222,2±17,9 с.

Введение мышам Трамадола однократно в терапевтической дозе 10 мг/кг купировало болевой ответ (22,1%) за счет снижения количества «корчей» в 1,3 раза и статистически значимого повышения латентного времени развития болевой реакции относительно такового показателя группы негативного контроля (таблица 1).

Доза 25 мг/кг оказалась эффективной (33,6%), поскольку выявлено статистически значимое снижение количества «корчей» в 1,5 раза и увеличение латентного времени наступления болевого ответа в 1,4 раза (Р<0,05) (таблица 1).

В случае введения (I) в дозе 50 мг/кг отмечалось его обезболивающее действие (35,8%), которое выражалось в снижении количества «корчей» в 1,6 раза (Р<0,05), увеличении латентного времени наступления болевого ответа в 1,6 раза (Р<0,05) по сравнению с соответствующим значением негативного контроля (таблица 1).

Последующее увеличение дозы потенциального анальгетика до 100 мг/кг приводило к увеличению антиноцицептивного действия до 57,5%, поскольку все изучаемые показатели оказались статистически значимы по сравнению с соответствующими значениями негативного контроля (таблица 1). Следует отметить преимущественную активность анальгетика по сравнению с Трамадолом по снижению количества «корчей», которое оказалось ниже в 1,8 раза (Р<0,01) соответствующего значения референс-препарата. Повышение дозы анальгетика до 200 мг/кг не способствовало увеличению эффективности, поскольку анальгетическая активность оказалась 53,1% (Р<0,01) при статистически достоверном повышении латентного времени болевого ответа относительно соответствующего значения негативного контроля. Необходимо подчеркнуть, что анальгетик превышал активность Трамадола в 1,7 раза (Р<0,01) по выраженности болевого ответа.

Таким образом, исследуемое вещество 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-10-(2-этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11_,0^5,9] додекан (I) в тесте «Уксусные корчи» (Abdominal constriction test) проявляет выраженную анальгетическую активность в диапазоне доз 25-200 мг/кг, сравнимую с Трамадолом в дозах 25 и 50 мг/кг, превышающую эффективность референс-препарата в дозах 100 и 200 мг/кг. Снижение болевой реакции более чем на 50% в условиях модели «Уксусных корчей», коррелирующей с клинической ситуацией острого перитонита, свидетельствует о высокой потенциальной возможности новой молекулы в качестве анальгетического средства.

Исследование анальгетической активности 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-10-(2-этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11_,0^5,9] додекана (I) в сравнении с референс-препаратом Трамадолом в тесте «Механической компрессии лапы» (Randall-Selitto test).

Изучение анальгетической активности молекулы 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-10-(2-этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло-[5,5,0,0^3,11_,0^5,9]додекан (I) в тесте «Механической компрессии лапы» проводили с помощью анальгезиметра («Ugo Basile», Италия), разработанного для выполнения точного тестирования анальгетиков на нормальной и воспаленной лапе крыс и мышей по методу Рэндалл-Селитто [Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. Миронова А.Н., Бунатян Н.Д. и др. М., ЗАО «Гриф и К». 2012; Barrot М. Tests and models of nociception and pain in rodents. Neuroscience. 2012, 211: 39-50]. При увеличении давления на конечность последовательно наблюдали: спинальный рефлекс отдергивания конечности, комплекс супраспинальных двигательных реакций животного, направленных на освобождение конечности, и вокализацию. Регистрировали порог возникновения вокализации (вес в граммах), латентное время наступления болевой реакции, число животных без болевой реакции. Критерием анальгетического эффекта считали достоверное уменьшение интенсивности болевых реакций, оцененной в граммах по силе воздействия на здоровую лапу, латентному времени болевой реакции, числу животных без болевой реакции в динамике (через 1 после введения препаратов) после однократного и курсового ежесуточного трехдневного введения.

В двух сериях экспериментов (1 серия - однократное введение; 2 серия - курсовое введение в течение 3 сут) использовали следующие группы аутбредных мышей-самцов сток CD1:

1. Негативный контроль - мышам вводили воду очищенную в объеме 0,2 мл/ 20 г мышь внутрижелудочно через зонд однократно и ежесуточно в течение трех дней, в первый и последний день эксперимента введение осуществляли за 1 ч до фиксации вокализации, латентного времени болевой реакции, числа животных без болевой реакции (n=11);

2. Позитивный контроль - мышам вводили Трамадол в дозе 10 мг/кг в объеме воды очищенной 0,2 мл/ 20 г мышь внутрижелудочно через зонд однократно и ежесуточно в течение трех дней, в первый и последний день эксперимента введение осуществляли за 1 ч до фиксации вокализации, латентного времени болевой реакции, числа животных без болевой реакции (n=11);

3. Анальгетик - мышам вводили (I) в дозе 25 мг/кг в объеме растворителя 0,2 мл/ 20 г мышь внутрижелудочно через зонд однократно и в течение трех дней, в первый и последний день эксперимента введение осуществляли за 1 ч до фиксации вокализации, латентного времени болевой реакции, числа животных без болевой реакции (n=11);

4. Анальгетик - мышам вводили (I) в дозе 50 мг/кг в объеме растворителя 0,2 мл/ 20 г мышь внутрижелудочно через зонд однократно и в течение трех дней, в первый и последний день эксперимента введение осуществляли за 1 ч до фиксации вокализации, латентного времени болевой реакции, числа животных без болевой реакции (n=10);

5. Анальгетик - мышам вводили (I) в дозе 100 мг/кг в объеме растворителя 0,2 мл/ 20 г мышь внутрижелудочно через зонд однократно и в течение трех дней, в первый и последний день эксперимента введение осуществляли за 1 ч до фиксации вокализации, латентного времени болевой реакции, числа животных без болевой реакции (n=10);

6. Анальгетик - мышам вводили (I) в дозе 200 мг/кг в объеме растворителя 0,2 мл/ 20 г мышь внутрижелудочно через зонд однократно и в течение трех дней, в первый и последний день эксперимента введение осуществляли за 1 ч до фиксации вокализации, латентного времени болевой реакции, числа животных без болевой реакции (n=10).

На модели «механической гиперальгезии» по Рэндалл-Селитто величина болевого порога (г) составляла в первые (160,2±27,8) и (284,0±65,7) третьи сутки наблюдения у животных группы негативного контроля (таблица 2). Отмечалось повышение латентного времени наступления болевой реакции от 3,0±0,6 с (1 сут) до 5,6±1,4 с (3 сут) и числа животных с максимальной экспозицией от 0 до 9,1%. Изменение исследуемых показателей негативного контроля характерно для этой экспериментальной модели при повторном тестировании животных.

Порог болевой чувствительности референс-препарата Трамадола оказался сопоставим как при однократном, так и при трехкратном введении и статистически значимым относительно соответствующих показателей негативного контроля (таблица 2). Следует отметить увеличение в 1 сут наблюдения показателя времени болевого ответа в 4,1 раза (Р<0,01), числа мышей без болевой реакции - до 70% (Р<0,01) относительно аналогичных значений негативного контроля. Сходная картина фиксировалась в последующем периоде наблюдения в группе Трамадола: латентное время болевого ответа увеличилось в 1,9 раза (Р<0,05) относительно соответствующего значения негативного контроля, а число мышей с максимальной экспозицией оказалось 50% (Р<0,01) против 0% контроля (таблица 2).

Статистически значимое повышение порога болевого ответа в первый срок наблюдения отмечалось во всех группах применения соединения (I): 25 мг/кг - в 2,9 раза (Р<0,05), 50 мг/кг - в 3,4 раза, 100 мг/кг - 3,1 раза. 200 мг/кг - 3,9 раза по сравнению с аналогичным значением негативного контроля. Кроме того фиксировалось увеличение латентного времени развития болевой реакции во всех исследуемых группах (I): 25 мг/кг -в 3,3 раза (Р<0,01), 50 мг/кг - в 3,8 раза (Р<0,01), 100 мг/кг - в 3,6 раза (Р<0,01), 200 мг/кг -в 4,5 раза (Р<0,01) относительно соответствующего значения группы негативного контроля. При этом число мышей без проявления болевой реакции составило 60% (25 мг/кг, Р<0,01), 50% (50 мг/кг, Р<0,01), 60% (100 мг/кг, Р<0,01), 90% (25 мг/кг, Р<0,01) против 0% негативного контроля (таблица 2). Следует отметить отсутствие статистически значимых различий с аналогичными значениями группы Трамадола, что свидетельствует о сопоставимости обезболивающей активности соединения (I) и анальгетика с опиодным компонентом механизма действия.

Курсовое в течение 3 дней ежесуточно введение соединения (I) во всех дозах 25-200 мг/кг per os приводило к статистически значимому проявлению его антиноцицептивного действия, о чем свидетельствуют изученные показатели. Отмечалось увеличение порога болевой чувствительности: 25 мг/кг - в 2,0 раза (Р<0,01), 50 мг/кг - в 2,1 раза (Р<0,01), 100 мг/кг - в 2,4 раза (Р<0,01), 200 мг/кг - в 2,2 раза (Р<0,01) по сравнению с аналогичным значением негативного контроля.

Анализ латентного времени развития болевого ответа позволил выявить сходную направленность эффекта, так как показано увеличении этих показателей относительно соответствующего значения негативного контроля во второй период наблюдения: 25 мг/кг - в 1,9 раза (Р<0,01), 50 мг/кг - в 2,1 раза (Р<0,01), 100 мг/кг - в 2,7 раза (Р<0,01), 200 мг/кг - в 2,5 раза (Р<0,01). Фиксировалось число мышей без проявления болевой реакции, которое составило 70% (25 мг/кг, Р<0,01), 80% (50 мг/кг, Р<0,01), 90% (100 мг/кг, Р<0,01), 80% (200 мг/кг, Р<0,01) против 9,1% животных группы негативного контроля. Отсутствовала статистически значимая разница между всеми показателями групп применения соединения (I) в дозах 25, 50 и 200 мг/кг и таковыми значениями группы Трамадола в этот срок наблюдения, за исключением группы введения (I) в дозе 100 мг/кг (таблица 2). Выявлена статистически значимая преимущественная активность соединения (I) в дозе 100 мг/кг по сравнению с Трамадолом, заключающаяся в повышении латентного времени наступления болевой реакции в 1,4 раза (Р<0,05) и увеличении числа мышей с максимальной экспозицией на 40% (Р<0,01).

Таким образом, в результате исследования анальгетической активности вещества (I) в тесте «Механической компрессии здоровой лапы» {Randall-Selitto test) у аутбредных мышей-самцов сток CD1 при однократном и трехдневном применении продемонстрирована выраженная в разной степени антиноцицептивная активность в диапазоне доз 25-200 мг/кг, сравнимая с эффективностью референс-препарата Трамадола. Выявлена статистически значимая преимущественная активность соединения (I) при курсовом введении в дозе 100 мг/кг по сравнению с Трамадолом.

Исследование анальгетической активности 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-10-(2-этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11_,0^5,9]додекана (I) в сравнении с референс-препаратом Трамадолом в тесте исследования антиноцицептивного действия на модели боли центрального генеза «Тепловой иммерсии хвоста» у аутбредных мышей-самцов CD1.

Тест тепловой иммерсии хвоста (tail immersion) основан на спинальном флексорном рефлексе в ответ на погружение хвоста в горячую воду [[Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Под ред. Миронова А.Н., Бунатян Н.Д. и др. М., ЗАО «Гриф и К». 2012; Barrot М. Tests and models of nociception and pain in rodents. Neuroscience. 2012, 211: 39-50]. В условиях этого метода площадь теплового раздражения большая и нагревание кожной поверхности происходит быстрее. В этой связи не происходит активации терморецепторов, а сразу активируются С-волокна полимодальных ноцицепторов, Ad-волокна полимодальных ноцицепторов, полимодальные ноцицепторы и высокопороговые механорецепторы. Болевое раздражение моделировали погружением хвоста в горячую воду температурой 52°С (от 45 до 54°С). Регистрировали латентный период отдергивания хвоста. Как правило, величина латентного периода реакции в контрольной группе находится в диапазоне от 5 до 30 с (чаще всего от 7 до 12 с). Удлинение времени реакции интерпретируется как обезболивающее действие. Во избежание повреждения тканей не нагревали хвост более 30 с. Критерием анальгетического эффекта считали достоверное увеличение латентного периода реакции после введения вещества. При обработке полученных результатов рассчитывали величину максимально возможного эффекта (МВЭ). % МВЭ=ЛП₀ - ЛП_к/(30 - ЛП_к) × 100, где ЛП₀ - латентный период ноцицептивной реакции в опытной группе; ЛП_к - латентный период ноцицептивной реакции в контрольной группе; 30 с - максимальное время экспозиции для мышей. Одним из критериев, характеризующих анальгетическую активность исследуемого вещества, является количество животных с максимальным проявлением обезболивающего эффекта -экспозицией хвоста в течение 30 с в горячей воде.

В данной серии экспериментов использовали следующие группы аутбредных мышей-самцов CD1:

1. Негативный контроль - мышам вводили воду очищенную в объеме 0,2 мл/ 20 г мышь однократно внутрижелудочно через зонд за 1 ч до теплового раздражения хвоста (n=12);

2. Позитивный контроль - мышам вводили Трамадол в дозе 10 мг/кг в объеме воды очищенной 0,2 мл/ 20 г мышь однократно внутрижелудочно через зонд за 1 ч до теплового раздражения хвоста (n=10);

3. Анальгетик - мышам вводили (I) в дозе 25 мг/кг в объеме 0,2 мл/ 20 г мышь водно-твинового раствора однократно внутрижелудочно через зонд за 1 ч до теплового раздражения хвоста (n=10);

4. Анальгетик - мышам вводили (I) в дозе 50 мг/кг в объеме 0,2 мл/ 20 г мышь водно-твинового раствора однократно внутрижелудочно через зонд за 1 ч до теплового раздражения хвоста (n=10);

5. Анальгетик - мышам вводили (I) в дозе 100 мг/кг в объеме 0,2 мл/ 20 г мышь водно-твинового раствора однократно внутрижелудочно через зонд за 1 ч до теплового раздражения хвоста (n=10);

6. Анальгетик - мышам вводили (I) в дозе 200 мг/кг в объеме 0,2/ 20 г мышь водно-твинового раствора однократно внутрижелудочно через зонд за 1 ч до теплового раздражения хвоста (n=10).

Как представлено в таблице 3, латентное время болевого ответа (9,1±1,2 с) у животных группы негативного контроля свидетельствует о воспроизведении данной модели, что позволяет корректно оценить результаты исследования нового анальгетика.

Антиноцицептивное действие Трамадола заключалось в статистически достоверном увеличении латентного времени болевого ответа в 2,1 раза относительно соответствующего значения контроля, при этом максимально выраженный эффект составил 49,8% (таблица 3).

Исследуемое лекарственное средство продемонстрировало выраженное обезболивающее действие при введении во всех дозах (таблица 3). В случае применения дозы 25 мг/кг выявлена максимальная активность (75,6%), превышающая таковой показатель негативного контроля в 2,7 раза (Р<0,01) и Трамадола в 1,3 раза (Р<0,05). Тогда как в результате применения доз 50, 100 и 200 мг/кг значения болевого ответа имели статистически значимую разницу только с результатом негативного контроля, а показатели максимально выраженного эффекта оказались сравнимы и составили 60,8%, 70,3%, 69,9% соответственно против 49,8% группы Трамадола. Кроме того выявлены животные с максимальным проявлением обезболивающего эффекта - экспозицией хвоста в течение 30 с в горячей воде: 25 мг/кг - 30% (Р<0,01), 50 мг/кг - 30% (Р<0,01), 100 мг/кг - 40% (Р<0,01). Следует отметить, что при введении (I) в дозе 100 мг/кг данный показатель оказался статистически достоверно больше по сравнению с аналогичным значением Трамадола (40% против 10%).

Полученные данные свидетельствуют о выраженном антиноцицептивном действии соединения (I) при однократном введении в диапазоне доз 25-200 мг/кг per os в условиях теста термического болевого раздражения «Тепловая иммерсия хвоста». Максимально выраженный эффект во всех дозах превышал пороговый уровень 50%, оказался сравнимым/или превосходил по ряду показателей активность Трамадола.

Анализ полученных результатов исследования анальгетической активности 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-10-(2-этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11_,0^5,9]додекана (I) в сравнении с референс-препаратом Трамадолом в тестах соматогенной боли различного генеза «Уксусные корчи» (Abdominal constriction test), «Механической компрессии лапы» (Randall-Selitto test), термического болевого раздражения «Тепловая иммерсия хвоста» (tail immersion) позволяет заключить, что вновь полученное соединение (I) обладает выраженным антиноцицептивным действием даже после однократного применения в диапазоне доз 25-200 мг/кг, сопоставимым и/или превосходящим по ряду показателей активность референс-препарата Трамадола.

Полученные данные о выраженном обезболивающем действии малотоксичного 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-10-(2-этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11_,0^5,9]додекана (I) позволяют сделать вывод о перспективности разработки анальгетического средства на основе инновационного соединения для купирования средней и высокой интенсивности болей различного генеза и, с определенной долей вероятности, прогнозировать характер его обезболивающего действия у человека.

Группа изобретений относится к фармацевтической химии и фармакологии, а именно к 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-10-(2-этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекану формулы (I) и способу его получения путем ацилирования 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекана хлорангидридом этоксиуксусной кислоты. Технический результат - 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-10-(2-этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекан, обладающий анальгетической активностью. 2 н.п. ф-лы, 3 табл., 2 пр.

1. 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-10-(2-этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекан (I)

,

обладающий анальгетической активностью.

2. Способ получения 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-10-(2-этоксиацетил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекана по п. 1, заключающийся в ацилировании 4-(3,4-дибромтиофенкарбонил)-2,6,8,12-тетраацетил-2,4,6,8,10,12-гексаазатетрацикло[5,5,0,0^3,11,0^5,9]додекана хлорангидридом этоксиуксусной кислоты.