Способ оценки влияния средств, используемых для профилактики катетер-ассоциированных инфекций, на бактериальную колонизацию поверхности катетеров Российский патент 2022 года по МПК G01N33/52 C12N1/11 C12Q1/00 

Изобретение относится к области медицины, а именно клинической микробиологии, хирургии, урологии, и предназначено для оценки влияния средств, используемых для профилактики катетер-ассоциированных инфекций (антимикробных агентов, антисептиков, антимикробного покрытия), на бактериальную колонизацию поверхности катетера.

Патогенез катетер-ассоциированных инфекций мочевыводящих путей (ИМВП) чаще всего обусловлен способностью уропатогенов образовывать биопленки на различных поверхностях (дренажах, катетерах), что является большой проблемой в клинической медицине, так как повышает риск персистенции возбудителя в организме (Перепанова Т.С. Значение инфекций, обусловленных образованием биопленок, в урологической практике. Эффективная фармакотерапия. 2013; 37:18-27; Nicolle L.E. Catheter associated urinary tract infections. Antimicrob. Resist. Inf. Control. 2014; 3(23):l-8.Doi: 10.1186/2047-2994-3-23; Soto S.M. Importance of biofilms in urinary tract infections: new therapeutic approaches. Adv Biol. 2014; 2014:13. DOI: 10.1155/2014/5439794). Процессы колонизации и формирования биопленок бактериями на абиотических поверхностях определяются многими факторами и зависят как от свойств клеток микроорганизмов, так и от характеристик материала медицинских устройств. Известно, что бактерии в составе биопленок демонстрируют большую устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды, воздействию антибактериальных препаратов, значительно превышающих стандартные рекомендуемые дозировки (Mulla S., Kumar A., Rajdev S. Comparison of MIC with MBEC assay for in vitro antimicrobial susceptibility testing in biofilm forming clinical bacterial isolates. Advances in Microbiology. 2016; 6(2):73). Учитывая, что разработка новых средств, обеспечивающих ингибирование бактериальной колонизации, а также модификация материалов катетеров для предотвращения формирования бактериальных биопленок на их поверхности ведутся постоянно (Ahearm D.G., Grade D.T. Effect of hydrogel/silver coating on in vitro adhesion to catheters of bacteria associated with urinary tract infections. Curr Microbiol. 2000; 41:120-125. DOI: 10.1007/s002840010105; Hetrick E.M., Schoenfisch M.H. Reducing implant-related infections:active release strategies. Chem Soc Rev. 2006; 5:780-789. DOI:10.1039/b515219), поиск новых дополнительных подходов к оценке формирования и/или разрушения бактериальных биопленок на различных типах катетеров представляется актуальным.

Известен способ оценки биопленкообразующей способности микроорганизмов, основанный на выращивании бактериальной культуры в 96-луночных полистироловых планшетах, и определении массивности/биомассы биопленки (O'Toole GA, Kolter R. Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signalling pathways: a genetic analysis. Mol Microbiol. 1998; 28(3):449-61. doi: 10.1046/j. 1365-2958.1998.00797.x). Недостатки: используется стандартная гидрофобная поверхность для адгезии (полистирол), а не материал инвазивных устройств - катетеров, кроме того, оценка колонизационной активности проводится только по показателю биомассы сформированной биопленки без учета жизнеспособности клеток в ее составе.

Для характеристики биопленочных культур используют способ на основе световой микроскопии биопленок, выращенных на стеклах в присутствии противомикробных агентов (Сухина М.А., Калашникова И.А., Кашников В.Н., Веселов А.В., Михалевская В.И., Пиядина А.Ю. Влияние антибактериальных веществ на рост биопленки клинических изолятов. Колопроктология. 2018; 2(64):78-84). Недостатки: используется стандартная гидрофильная поверхность для адгезии (стекло), а не материал инвазивных устройств - катетеров, для осуществления способа необходима дополнительная процедура - окрашивание, кроме того, оценка колонизационной активности проводится только по показателю количества окрашенных клеток, без учета их жизнеспособности.

Известен способ выявления жизнеспособности адгезированных бактерий используют простой подсчет колониеобразующих единиц (КОЕ) после ультразвуковой дезинтеграции биопленок (Kobayashi Н., Oethinger М., Tuohy M.J., Procop G.W., Bauer T.W. Improved detection of biofilm-formative bacteria by vortexing and sonication: a pilot study. Clin Orthop Relat Res. 2009; 467(5): 1360-4. doi: 10.1007/s11999-008-0609-5). Недостатки: проведение ультразвуковой обработки биопленок с последующим высевом бактериальной суспензии не исключает гибель клеток при ультразвуковой дезинтеграции, что снижает достоверность оценки, но также увеличивает сроки получения результатов.

В ряде случаев, для выявления жизнеспособности адгезированных на различных поверхностях бактерий, в том числе в биопленках, используют детекцию концентрации внутриклеточной аденозинтрифосфорной кислоты (АТФ) после ее экстракции из клеток, или методы, основанные на восстановлении тетразолия (Jin Y., Samaranayake L.P., Samaranayake Y., Yip H.K. Biofilm formation of Candida albicans is variably affected by saliva and dietary sugars. Arch. Oral Biol. 2004; 49(10): 789-98. doi:10.1016/j.archoralbio.2004.04.011). Недостатки: для выполнения способа необходимо проведение дополнительных процедур, таких как разрушение клеток, экстракция АТФ и ее детекция, использование коммерческих китов.

Разработана экспериментальная модель образования биопленок на абиотических поверхностях (Патент на изобретение РФ № 2718910 от 15.04.2020), в том числе на мочевых катетерах (Рыбальченко О.В., Эрман М.В., Орлова О.Г. и др. Подавление биопленок условно патогенных бактерий на мочевых катетерах. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2017; 3: 3-11), бактерии в которых контролируются с помощью сканирующей электронной микроскопии. Недостатки: требуется специальное дорогостоящее микроскопическое оборудование - сканирующий электронный микроскоп.

Учитывая, что большая часть прототипов предполагает использование либо только стандартных поверхностей для адгезии (стекло, полистирол), либо одного показателя, представляется важным проводить оценку колонизационной активности микроорганизмов на поверхности катетеров - собственно нативных инвазивных устройств, в том числе со сложной конфигурацией, а также с использованием двух показателей - массивности биопленки и жизнеспособности входящих в нее клеток бактерий по биолюминесценции.

Технический результат: повышение точности и объективности способа за счет приближения условий эксперимента in vitro к ситуации in vivo; повышение информативности способа за счет проведения оценки жизнеспособности адгезированных клеток в составе биопленки по биолюминесценции; доступность способа; при частых замерах биолюминесценции способ позволяет мониторировать все процессы, связанные с персистенцией бактерий в присутствии различных средств, а именно адгезию клеток (ускорение/ингибирование), скорость колонизации и формирования биопленки (замедление/усиление).

Указанный результат достигается путем формирования биопленки люминесцентных бактерий на фрагменте катетера 0,5 см в 4-луночных полистироловых культуральных планшетах in vitro в течение 6 и 24 часов в присутствии средства с последующей оценкой биолюминесценции и массивности биопленки в сравнении с контролем, то есть с показателями в биопленке без средства.

Способ осуществляется следующим образом: суточные культуры бактерий люминесцентных бактерий, например, Е. coli TG1 (pF1 lux⁺ Ap^r) (Данилов B.C., Зарубина А.П., Ерошников Г.Е., Соловьева Л.Н., Карташев Ф.В., Завильгельский Г.Б. Сенсорные биолюминесценцтные системы на основе LUX-оперонов разных видов люминесцентных бактерий. Вестник МГУ. Серия 16. Биология; 2002; 3:20-4), выращенные на бульоне Луриа Бертани (LB-бульоне) с ампициллином (BioChemica, USA) стандартизуют LB-бульоном до 2,0 по McFarland и разводят 1:100 в LB-бульоне. В лунки 4-луночного полистиролового плоскодонного планшета (например, ТРР, Techno Plastic Products AG, Швейцария) вносят 1 мл бульонной культуры, средство (в контроль - бульонная культура без средства), фрагменты (0,5 см) катетера, например Нелатона (поливинилхлорид (ПВХ), силикон, «Apexmed International BV», Нидерланды), предназначенного для однократной катетеризации мочевого пузыря, затем закрытые планшеты выдерживают статически в термостате при 37°С в течение 6 часов для оценки адгезии; 24 часа - для формирования биопленки. После контроля роста планктонной культуры (в 200 мкл, ОП₆₀₀) на мультипланшетном ридере (например, Synergy Н1ТМ, BioTek, США) катетеры 3-кратно отмывают в 5 мл 0,89% раствора NaCl, далее отмытый катетер помещают в белый планшет со 150 мкл 0,89% NaCl и проводят оценку биолюминесценции на мультипланшетном ридере в течение 0-20 мин. Затем катетер окрашивают 0,1% водным раствором генцианвиолета в течение 30 мин. Биомассу биопленки оценивают по уровню экстракции этанолом (150 мкл) красителя на катетере по ОП₅₈₀. После этого сравнивают усредненные показатели биолюминесценции катетера (I, усл. ед.) и массивности биопленки катетера (ОП₅₈₀, ед.) для варианта со средством и аналогичным в контроле. При снижении от контроля показателя биолюминесценции на 99% и показателя массивности биопленки на 70% и выше, судят о высокой эффективности средства; снижение от контроля показателя биолюминесценции от 98% до 70% и показателя массивности биопленки от 69% до 30% свидетельствует о средней эффективности средства; снижение от контроля показателя биолюминесценции менее 70% и показателя массивности биопленки менее 30% свидетельствует о низкой эффективности средства или ее отсутствии; при ином сочетании показателей снижения биолюминесценции и массивности биопленки влияние средства определяют по показателю, имеющему по оценке меньшую эффективность.

Примеры практического применения

Пример 1. Оценено влияние препарата «Хлоргексидин биглюконат», (0,05% водный раствор, Кемеровская ФФ, Россия) в конечной концентрации 0,0002% на формирование штаммом Е. coli TG1 lux⁺ биопленки на катетере Нелатона (имплантационнонетоксичный медицинский поливинилхлорид, «Apexmed International BV», Нидерланды) с помощью предлагаемого способа. Для этого на катетере в присутствии средства и без средства в качестве контроля формировали 6- и 24-часовую биопленку в 4-луночном планшете. Катетеры с биопленками 3-кратно отмывали, оценивали биолюминесценцию в течение 20 мин и определяли массивность биопленки на катетерах. Результаты представлены в таблице. Биолюминесценция через 6 и 24 ч в опытном варианте (при экспозиции со средством) снизилась на 97,0 и 99,7% от контроля (при экспозиции без средства), показатель биомассы биопленки - на 95,3 и 97,3%, соответственно. Исследованный препарат «Хлоргексидин биглюконат» в концентрации 0,0002% является умеренно эффективным через 6 ч на этапе адгезии бактерий к катетеру и высокоэффективным через 24 ч на этапе формирования биопленки на катетере из ПВХ.

Пример 2. Оценено влияние препарата «Секстафаг» (НПО Микроген, Россия) на формирование штаммом Е. coli TG1 lux⁺ биопленки на катетере Нелатона (имплантационнонетоксичный медицинский поливинилхлорид, «Apexmed International BV», Нидерланды) с помощью предлагаемого способа. Для этого на катетере в присутствии средства и без средства в качестве контроля формировали 6- и 24-часовую биопленку в 4-луночном планшете. Катетеры с биопленками 3-кратно отмывали, оценивали биолюминесценцию в течение 20 мин и определяли массивность биопленки на катетерах. Результаты представлены в таблице. Биолюминесценция через 6 и 24 ч в опытном варианте (при экспозиции со средством) снизилась на 99,5 и 99,5% от контроля (при экспозиции без средства), показатель биомассы биопленки - на 100 и 100%), соответственно. Исследованный препарат «Секстафаг» является высокоэффективным, то есть предотвращает адгезию бактерий и формирование биопленки на катетере из ПВХ.

Пример 3. Оценено влияние препарата «Ампициллина натриевой соли» (50 мкг/мл, BioChemica, USA) на формирование штаммом Е. coli TG1 lux⁺ биопленки на катетере Нелатона (имплантационнонетоксичный медицинский силикон, «Apexmed International BV», Нидерланды) с помощью предлагаемого способа. Для этого на катетере в присутствии средства и без средства в качестве контроля формировали 6- и 24-часовую биопленку в 4-луночном планшете. Катетеры с биопленками 3-кратно отмывали, оценивали биолюминесценцию в течение 20 мин и определяли массивность биопленки на катетерах. Результаты представлены в таблице. Биолюминесценция через 6 и 24 ч в опытном варианте (при экспозиции со средством) изменилась на - 15,1 и 17% от контроля (при экспозиции без средства), показатель биомассы биопленки - на 7,4 и - 35,1%, соответственно.

Исследованный препарат «Ампициллина натриевой соли» является низкоэффективным, то есть не предотвращает адгезию бактерий и формирование биопленки на катетере из ПВХ.

Пример 4. Оценено влияние серебряного антибактериального покрытия катетера Нелатона (имплантационнонетоксичный медицинский силикон, «Apexmed International BV», Нидерланды) на колонизацию катетера штаммом Е. coli TG1 lux⁺ с помощью предлагаемого способа. Для этого на катетере с покрытием и без покрытия формировали 6- и 24-часовую биопленку в 4-луночном планшете как описано выше. Результаты представлены в таблице. Биолюминесценция через 6 и 24 часа в опытном варианте (катетер с покрытием) снизилась соответственно на 96,1% и 99,3% от контроля, показатель биомассы биопленки оценить не представлялось невозможным, так как поверхность нативного катетера имеет высокую способность к адсорбции красителя. Серебряное покрытие является средством с умеренной эффективностью, на катетере из силикона в указанные сроки сохраняются жизнеспособные клетки.

Таким образом, использование предлагаемого способа позволяет с помощью биолюминесценции и массивности биопленки оценить способность бактерий колонизировать поверхность катетера, а также определить эффективность применения средства (антисептика, антибактериального препарата, антимикробного покрытия) для подавления адгезии и формирования биопленки на различных типах катетеров.

Изобретение относится к области медицины, а именно клинической микробиологии, хирургии, урологии, и предназначено для оценки влияния средств, используемых для профилактики катетер-ассоциированных инфекций на бактериальную колонизацию поверхности катетера. Биопленки люминесцентных бактерий формируют на фрагменте катетера 0,5 см в 4-луночных полистироловых культуральных планшетах in vitro в течение 6 и 24 часов в присутствии и отсутствие средства, промывают в 0,89% растворе NaCl, после чего оценивают биолюминесценцию (I, усл. ед.), окрашивают 0,1% генцианвиолетом, определяют массивность биопленки (ОП₅₈₀, ед.) и сравнивают с контролем. Вывод об эффективности действия средства на бактериальную колонизацию поверхности катетера делается следующим образом: при снижении от контроля показателя биолюминесценции на 99% и показателя массивности биопленки на 70% и выше судят о высокой эффективности средства; снижение от контроля показателя биолюминесценции от 98% до 70% и показателя массивности биопленки от 69% до 30% свидетельствует о средней эффективности средства; снижение от контроля показателя биолюминесценции менее 70% и показателя массивности биопленки менее 30% свидетельствует о низкой эффективности средства или ее отсутствии; при ином сочетании показателей биолюминесценции и массивности биопленки эффективность средства оценивают по показателю, имеющему наименьшее влияние на микробную колонизацию. Способ позволяет обеспечить повышение точности и объективности способа за счет приближения условий эксперимента in vitro к ситуации in vivo; повышение информативности способа за счет проведения оценки жизнеспособности адгезированных клеток в составе биопленки по биолюминесценции; доступность способа; при частых замерах биолюминесценции способ позволяет мониторировать все процессы, связанные с персистенцией бактерий в присутствии различных средств, а именно адгезию клеток (ускорение/ингибирование), скорость колонизации и формирования биопленки (замедление/усиление). 1 табл., 4 пр.

Способ оценки влияния средств, используемых для профилактики катетер-ассоциированных инфекций, на бактериальную колонизацию поверхности катетеров, отличающийся тем, что биопленки люминесцентных бактерий формируют на фрагменте катетера 0,5 см в 4-луночных полистироловых культуральных планшетах in vitro в течение 6 часов для оценки адгезии; а в течение 24 часов - для оценки формирования биопленки в присутствии средства, катетеры 3-кратно отмывают в 5 мл 0,89% раствора NaCl, отмытый катетер помещают в белый планшет со 150 мкл 0,89% NaCl и проводят оценку биолюминесценции на мультипланшетном ридере в течение 0-20 мин; затем катетер окрашивают 0,1% водным раствором генцианвиолета в течение 30 мин, биомассу биопленки оценивают по уровню экстракции этанолом 150 мкл красителя на катетере по оптической плотности, ОП₅₈₀, после этого сравнивают усредненные показатели биолюминесценции катетера в условных единицах - I, усл. ед, и массивности биопленки катетера по ОП₅₈₀ для варианта со средством и аналогичным в контроле, то есть показателями в биопленке без средства; при снижении от контроля показателя биолюминесценции на 99% и показателя массивности биопленки на 70% и выше судят о высокой эффективности средства; снижение от контроля показателя биолюминесценции от 98% до 70% и показателя массивности биопленки от 69% до 30% свидетельствует о средней эффективности средства; снижение от контроля показателя биолюминесценции менее 70% и показателя массивности биопленки менее 30% свидетельствует о низкой эффективности средства или ее отсутствии; при ином сочетании показателей снижения биолюминесценции и массивности биопленки влияние средства определяют по показателю, имеющему по оценке меньшую эффективность.