Способ оценки эффективности конъюгативного переноса в полимикробном сообществе Российский патент 2018 года по МПК C12N1/11 C12Q1/00 

Изобретение относится к области медицины, клинической микробиологии и касается способа оценки конъюгативного переноса в полимикробных сообществах в планктонной и сессильной культуре (биопленках).

Многократно была подтверждена способность бактерий передавать гены резистентности к различным антибиотикам путем горизонтального переноса (Karami N. et al. Transfer of an ampicillin resistance gene between two Escherichia coli strains in the bowel microbiota of an infant treated with antibiotics. J. Antimicrob. Chemother. 2007. 5: 3; Phornphisutthimas S. et al. Conjugation in Escherichia coli. Biochem. Mol. Boil. Educ. 2007. 35(6): 440-445; Молчанова E.B., Агеева Н.П. Изучение возможности конъюгационной передачи плазмиды Rts1-Tn9 от Escherichia coli штаммам Burkholderia thailandensis и Burkholderia cepacia. Вестник ВолгГМУ. 2013. 4: 55-57). Передача плазмид резистентности представляет большую проблему для медицины, что требует создания эффективных способов, позволяющих контролировать этот процесс. Учитывая, что в прикрепленном сообществе клетки функционируют в отличных от планктона условиях, одновременная оценка конъюгативного переноса в двух моделях в присутствии и отсутствие бактерий ассоциантов может дать дополнительную информацию о процессе конъюгации.

Известен количественный метод определения конъюгативного переноса между бактериями в биопленке, сформированной на различных абиотических поверхностях (Guglielmetti Е. et al. Transfer of plasmid-mediated resistance to tetracycline in pathogenic bacteria from fish and aquaculture environments. FEMS Microbiol. Lett. 2009. 293:28-34; Krol J.E. et al. Invasion of E.coli biofilms by antibiotic resistance plasmids. Plasmid. 2013. 70: 110-119), при этом в конъюгационной смеси присутствуют только клетки штаммов донора и реципиента.

Недостатки прототипа: оценка конъюгативного переноса согласно прототипу осуществляется в отношении одного вида микроорганизмов или разных видов, но в бинарной культуре (клетки донора плазмиды и клетки реципиента), тогда как в окружающей среде и биотопах человека бактерии существуют в полимикробных ассоциациях.

Технический результат: повышение объективности оценки эффективности конъюгативного переноса.

Это достигается за счет использования двух моделей, отражающих формы существования бактерий - планктонную и сессильную, при которых учитывается влияние сопутствующей микробиоты (в полимикробных сообществах), то есть приближение условий эксперимента in vitro к ситуации in situ и in vivo.

Сущность метода заключается в том, что эффективность конъюгации оценивают одновременно в жидкой среде и формирующейся микробной биопленке в присутствии бактерий ассоциантов. Для этого бактериальные культуры донора конъюгативной плазмиды и реципиента культивируют в течение 24 часов в лунках полистиролового планшета in vitro в присутствии и в отсутствие клеток другого микроорганизма. После чего из планктона, а затем из отмытой и разрушенной ультразвуком биопленки делают высев на селективные агаризованные среды и оценивают следующие показатели: число клеток реципиента и трансконъюганта, затем рассчитывают и сравнивают с контролем (коньюгативный перенос между донором и реципиентом в отсутствие ассоцианта) частоту конъюгативного переноса, равную отношению числа клеток трансконъюганта к числу клеток реципиента. Если частота конъюгации в опыте увеличивается в 5 раз и более, то считается, что эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий высокая, смешанная культура стимулирует процесс конъюгативного переноса плазмиды. Если частота конъюгации в опыте уменьшается в 5 раз и более, то эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий низкая, смешанная культура ингибирует процесс конъюгативного переноса плазмиды. В случае если частота конъюгации увеличивается/уменьшается менее чем в 5 раз, то эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий не изменяется, смешанная культура не влияет на процесс конъюгативного переноса плазмиды.

Способ осуществляется следующим образом. Ночные культуры бактерий донора конъюгативной плазмиды, реципиента и ассоцианта, выращенные на среде Луриа-Бертани (LB-бульоне) с соответствующим селективным антибиотиком, стандартизуют до 2,0 по McFarland и разводят 1:100 в LB-бульоне. В пенициллиновых флакончиках формируют бактериальные суспензии: 1,0 мл донора + 2,0 мл реципиента + 2,0 мл средового компонента (LB-бульон) (контроль) и 1,0 мл донора + 2,0 мл реципиента + 2,0 мл ассоцианта (опыт). Смешанные культуры вносят в лунки плоскодонного полистиролового (без антиадгезивного покрытия) планшета (например, Медполимер, Россия). Закрытые планшеты выдерживают статически в термостате при 37°C в течение 24 часов. Для оценки количества клеток донора, реципиента и трансконъюганта в планктонной культуре после окончания срока экспозиции делают высев из последовательных децимальных разведений бактериальных суспензий на селективные среды. Для оценки количества клеток в биопленках из лунок удаляют планктонную культуру, 3-х кратно отмывают физиологическим раствором/фосфатным буфером, вносят в лунки 100 мкл фосфатно-буферной среды, 5-и кратно обрабатывают ультразвуком в течение 1 мин при 37 кГц, поместив планшеты в ультразвуковую ванну, например, Elma Ultrasonic 30S (Elma, Германия) и делают высевы на селективные агаризованные среды методом децимальных разведений. Количество клеток оценивают через 24 часа по числу колониеобразующих единиц. Затем рассчитывают и сравнивают с контролем (коньюгативный перенос между донором и реципиентом в отсутствие ассоцианта) частоту конъюгативного переноса, равную отношению числа клеток трансконъюганта к числу клеток реципиента согласно Guglielmetti Е. et al. (2009). Если частота конъюгации в опыте увеличивается в 5 раз и более, то считается, что эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий высокая, смешанная культура стимулирует процесс конъюгативного переноса плазмиды. Если частота конъюгации в опыте уменьшается в 5 раз и более, то эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий низкая, смешанная культура ингибирует процесс конъюгативного переноса плазмиды. В случае если частота конъюгации увеличивается/уменьшается менее чем в 5 раз, то эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий не изменяется, смешанная культура не влияет на процесс конъюгативного переноса плазмиды.

Примеры конкретного применения

Пример 1

Влияние клеток Klebsiella pneumonia АТСС 700603 (ассоциант) на конъюгативный перенос плазмиды рОХ38 в уропатогенный штамм Escherichia coli DL82 Amp^r (реципиент). В качестве донора плазмидной ДНК был использован рекомбинантный штамм Escherichia coli N4i рОХ38 Gm^rCm^r (содержит конъюгативную плазмиду рОХ38 - производную F-плазмиды Е. coli К12) (Guyer M.S. et al., 1980). Частота переноса плазмиды в планктоне и биопленке в присутствии клеток бактерий К. pneumonia составила 2,15Е-02±1,26Е-02 и 2,80Е-03±2,61Е-03 соответственно, без ассоцианта - 3,94Е-03±1,84Е-03 и 1,82Е-03±1,57Е-03. Конъюгативный перенос в присутствии клеток ассоцианта в планктоне увеличивается в 5,5 раз, в биопленке не изменяется (увеличение в 1,5 раза). Эффективность конъюгативной передачи в присутствии бактерий K. pneumoniae высокая.

Пример 2

Влияние клеток Enterococcus faecalis АТСС 23212 (ассоциант) на конъюгативный перенос плазмиды рОХ38 в уропатогенный штамм Е. coli DL82 Ampr (реципиент). Частота переноса плазмиды в планктоне и биопленке в присутствии клеток бактерий Е. faecalis составила 3,32Е-03±2,82Е-03 и 4,01Е-03±3,77Е-03 соответственно, без ассоцианта - 3,94Е-03±1,84Е-03 и 1,82Е-03±1,57Е-03. Конъюгативный перенос в присутствии клеток ассоцианта в планктоне (снижение в 1,2 раза) и в биопленке (увеличение в 2,2 раза) не изменяется. Эффективность конъюгативной передачи в присутствии бактерий Е. faecalis не изменяется. Смешанная культура не влияет на процесс конъюгативного переноса плазмиды.

Пример 3

Влияние клеток К. pneumonia АТСС 700603 (ассоциант) на конъюгативный перенос плазмиды рОХ38 в клинический штамм Е. coli Amp^r (реципиент), выделенный от пациента с инфекцией области хирургического вмешательства. Частота конъюгативного переноса в планктонной культуре и биопленке в присутствии клеток бактерий К. pneumoniae составила 4,75Е-02±2,39Е-02 и 3,44Е-02±3,41Е-02 соответственно, без ассоцианта - 1,83Е-01±1,10Е-01 и 2,31Е-02±2,23Е-02. Конъюгативный перенос в присутствии клеток ассоцианта в планктоне (снижение в 3,9 раза) и в биопленке (увеличение в 1,5 раза) не изменяется. Эффективность конъюгативной передачи в присутствии бактерий Е. faecalis не изменяется.

Пример 4

Влияние клеток Е. faecalis АТСС 23212 (ассоциант) на конъюгативный перенос плазмиды рОХ38 в клинический штамм Е. coli (реципиент), выделенный от пациента с инфекцией области хирургического вмешательства. В планктоне и биопленке эффективность переноса плазмиды в присутствии клеток бактерий Е. faecalis составила 3,21Е-02±2,82Е-02 и 2,97Е-02±2,71Е-02 соответственно, без ассоцианта - 1,83Е-01±1,10Е-01 и 2,31Е-02±2,23Е-02. Конъюгативный перенос в присутствии клеток ассоцианта в планктоне снижается в 5,7 раз, в биопленке не изменяется (увеличение в 1,3 раза). Эффективность конъюгативной передачи в присутствии бактерий Е. faecalis низкая.

Способ отличается простотой и высокой производительностью за счет унификации обеих моделей эксперимента - в планктоне и в биопленке.

Изобретение относится к клинической микробиологии. Предложен способ оценки эффективности конъюгативного переноса в полимикробных сообществах. Способ включает оценку конъюгации плазмиды одновременно параллельно в планктоне и в формирующейся микробной биопленке в присутствии бактерий ассоциантов (опыт) и в отсутствии их (контроль). Затем рассчитывают частоту конъюгации и сравнивают. Если частота конъюгации в опыте увеличивается в 5 раз и более, то эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий считают высокой, если частота конъюгации в опыте уменьшается в 5 раз и более, то эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий оценивают как низкую, если частота конъюгации увеличивается/уменьшается менее чем в 5 раз, то эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий не изменяется. Способ обеспечивает объективность оценки эффективности конъюгативного переноса. 1 табл., 4 пр.

Способ оценки эффективности конъюгативного переноса путем проведения конъюгации между донором плазмиды и реципиентом в течение 24 часов в лунках полистиролового планшета, отличающийся тем, что конъюгацию осуществляют одновременно параллельно в планктоне и формирующейся биопленке в присутствии (опыт) и в отсутствие (контроль) клеток другого вида микроорганизмов, затем производят высевы бактериальных суспензий на селективные агаризованные среды из планктона и из отмытой разрушенной ультразвуком биопленки, рассчитывают частоту конъюгации и сравнивают с контролем, и если частота конъюгации в опыте увеличивается в 5 раз и более, то эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий считают высокой, если частота конъюгации в опыте уменьшается в 5 раз и более, то эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий оценивают как низкую, если частота конъюгации увеличивается/уменьшается менее чем в 5 раз, эффективность конъюгативной передачи в присутствии других бактерий не изменяется.