СПОСОБ ОЦЕНКИ ХАРАКТЕРА МЕЖМИКРОБНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ Российский патент 2012 года по МПК C12Q1/00 C12N1/20 

Изобретение относится к области медицины, а именно клинической микробиологии.

Известен способ оценки взаимного влияния микроорганизмов методом совместного культивирования с контрольным высевом и определением численности тест-культуры и изучаемого штамма по количеству выросших колоний на плотной питательной среде (Семенов А.В. Характеристика антагонистической активности бактерий при межмикробных взаимодействиях. Дисс. к.м.н. Оренбург, 2009).

Недостатки прототипа: низкая производительность способа при высокой стоимости, связанная с трудоемкостью, продолжительностью во времени, необходимостью подбора оптимальных условий совместного культивирования для микроорганизмов различных таксономических групп.

Технический результат: повышение производительности за счет унификации пробоподготовки, использования 96-луночных полистироловых планшетов и автоматизированного учета результатов, снижение затратности.

Сущность метода заключается в оценке межмикробных взаимоотношений двух микробных штаммов путем сравнительного анализа массивности сформированных ими биопленок. Для этого в стандартных условиях in vitro формируют биопленки каждого штамма по отдельности и после их смешивания затем оценивают результат пленкообразования моно- и смешанными культурами на основе регистрации интенсивности поглощения ими красителя.

Способ осуществляется следующим образом: для формирования биопленок в лунки полистиролового планшета микропипеткой-дозатором вносят по 100 мкл 18-часовых бульонных культур микроорганизмов, выращенных на бульоне Луриа Бертани (LB-бульон), стандартизованных до 0,5 по стандарту МакФарланда, затем добавляют 100 мкл LB-бульона для формирования монопленок или 100 мкл другой тестируемой бульонной культуры для формирования смешанной биопленки. Контролем служат лунки с 200 мкл стерильного LB-бульона. Все эксперименты проводят не менее чем в трех повторностях.

Закрытые планшеты выдерживают в термостате при 37°С в течение 48 часов. Затем сформированные биопленки промывают дистиллированной водой и окрашивают 200 мкл 0,1%-ного водного раствора генцианвиолета в течение 45 минут в темноте. После тщательного трехкратного отмывания биопленок аналогичным образом и высушивания планшета определяют состояние биопленок по интенсивности их окрашивания. Для этого краситель элюируют 96%-ным спиртом и определяют показатель оптической плотности (ОП) элюата, который соответствует уровню пленкообразования (Шагинян, 2007). Количественным выражением степени образования биопленок служат значения ОП₅₈₀, измеряемые на планшетном спектрофотометре, например планшетном спектрофотометре Benchmark Plus (Bio-Rad, США), с интервалом измерения оптической плотности от 0,0 до 4,0.

Затем сравнивают усредненные показатели оптической плотности элюата из смешанных биопленок с суммой показателей оптической плотности элюата из биопленок монокультур. Если наблюдается аддитивный (суммарный) эффект, т.е. показатель смешанной биопленки (ОП_mix) достоверно не отличается от суммы показателей каждого тестируемого штамма (ОП₁+ОП₂) - регистрируют нейтральный характер в межмикробном взаимодействии; если показатель ОП_mix>ОП₁+ОП₂- - регистрируют синергический характер взаимодействия; если показатель ОП_mix<ОП₁+ОП₂ - регистрируют антагонистический характер взаимодействия. При этом сумма показателей оптической плотности элюата из биопленок монокультур не должна превышать 4. В противном случае, готовят разведение элюата 1:10 и вновь измеряют оптическую плотность.

Пример практического применения.

Пример 1. Оценено взаимное влияние микробных культур Pseudomonas aeruginosa и Candida albicans, изолированных из мокроты больного К. 72 лет, находящегося на ИВЛ, с использованием предлагаемого способа. Для этого изоляты культивировали на LB-бульоне в лунках полистиролового планшета в виде смешанной и монокультур, после чего удаляли планктонные клетки и питательную среду, отмывали. Сформированные биопленки окрашивали 0,1%-ным раствором генцианвиолета, промывали, высушивали и краситель элюировали спиртом. Оптическую плотность определяли на спектрофотометре, при этом показатель оптический плотности смешанной биопленки 2,209±0,669 превышал большее значение оптической плотности монокультур: 0,864±0,144 для Р.aeruginosa, что указывает на синергидный характер взаимоотношений тестируемых культур.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно клинической микробиологии, и может быть использовано для уточнения этиологии заболевания. Способ предусматривает следующее. Культуры микроорганизмов выращивают на LB-бульоне с последующей стандартизацией до 0,5 по стандарту МакФарланда. Выращенные культуры микроорганизмов вносят в лунки полистиролового планшета и добавляют LB-бульон для формирования монопленок или вносят другую бульонную культуру для формирования смешанной биопленки. Планшеты выдерживают в термостате при 37°С в течение 48 часов до формирования биопленок. Сформированные биопленки промывают дистиллированной водой и окрашивают 200 мкл 0,1%-ного водного раствора генцианвиолета в течение 45 мин в темноте и тщательно трехкратно отмывают биопленки дистиллированной водой с последующим высушиванием планшета и определением состояния биопленок по их интенсивности окрашивания. Для этого краситель элюируют 96%-ным спиртом и определяют показатель оптической плотности элюата на спектрофотометре, соответствующий уровню пленкообразования, с последующим сравнением усредненных показателей оптической плотности элюата из смешанных биопленок с суммой показателей оптической плотности элюата из биопленок монокультур, и при отсутствии достоверных отличий делают вывод о нейтральном характере взаимодействия, если показатель для смешанной биопленки меньше суммы показателей монопленок, делают вывод об антагонистическом характере взаимодействия, если показатель для смешанной биопленки больше суммы показателей монопленок, делают вывод о синергическом характере в межмикробном взаимодействии. При этом сумма показателей оптической плотности элюата из биопленок монокультур не должна превышать 4. Изобретение позволяет оценить характер межмикробного взаимодействия и прогнозировать развитие микст-инфекции.

Способ оценки характера межмикробных взаимодействий путем совместного культивирования, отличающийся тем, что тестируемые моно- и смешанные культуры микроорганизмов культивируют в лунках полистиролового планшета на LB-бульоне до формирования биопленки, осуществляют промывание сформированных биопленок, окрашивание в течение 45 мин в темноте красителем, в качестве которого используют 0,1%-ный раствор генцианвиолета, трехкратное промывание биопленок с последующим высушиванием планшета, краситель элюируют спиртом и определяют оптическую плотность элюатов на спектрофотометре, усредненные показатели оптической плотности элюата из смешанных биопленок сравнивают с суммой показателей оптической плотности элюата из биопленок монокультур, и при отсутствии достоверных отличий делают вывод о нейтральном характере взаимодействия, если показатель для смешанной биопленки меньше суммы показателей монопленок, делают вывод об антагонистическом характере взаимодействия, если показатель для смешанной биопленки больше суммы показателей монопленок, делают вывод о синергическом характере в межмикробном взаимодействии.