АНТИТЕЛО К ANGPTL3 И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2024 года по МПК C07K16/22 C12N15/13 C12N15/63 A61K39/395 G01N33/53 A61P3/00 A61P3/06 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области лекарственных средств на основе антител. В частности, включены лекарственное средство на основе антитела к ANGPTL3 и его применение.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Изложенное в данном документе представляет собой лишь справочную информацию, относящуюся к настоящему изобретению, и не обязательно относится к предшествующему уровню техники.

Ген ангиопоэтин-подобного белка 3 (ANGPTL3, ANGPTL-3) представляет собой новый ген, идентифицированный Конклином и др. из баз данных EST (expressed sequence tag - маркер экспрессируемой последовательности) на основании сигнальных последовательностей и амфипатических спиралей, и они выделили полноразмерную кДНК (комплементарную ДНК) ANGPTL3 человека из библиотеки кДНК печени/селезенки эмбриона человека (Conklin et al., 1999, Genomics 62: 477-482). Белок ANGPTL3 человека (hANGPTL3), состоящий из 460 аминокислот, обладает аминокислотной последовательностью, на 76 % идентичной белку ANGPTL3 мыши, и имеет характерную структуру ангиопоэтинов: сигнальный пептид, расширенный спиральный домен, который предположительно образует димерные или тримерные спиральные катушки, короткий линкерный пептид и глобулярный гомологический домен фибриногена (FD) (Conklin et al., 1999, Genomics 62: 477-482). ANGPTL3 отличается от ангиопоэтинов (ANG) и не связывается с Tie2 (тирозинкиназой TEK). Однако он также может индуцировать ангиогенез путем связывания с интегрином αvβ3 через его C-концевой FD (Camenisch et al., 2002, J Biol Chem 277: 17281-17290).

Кроме того, ANGPTL3 является важным фактором, влияющим на метаболизм жиров. ANGPTL3 может ингибировать активность ЛПЛ (липопротеинлипазы), тем самым снижая клиренс триглицеридов и липопротеинов низкой плотности, тогда как гипертриглицеридемия участвует в патогенезе ряда метаболических заболеваний. Повышенный уровень триглицеридов в плазме может быть вовлечен в патологический процесс атеросклероза путем индуцирования агрегации тромбоцитов и продукции ингибитора активатора плазминогена - 1 (PAI-1), увеличения количества пенных клеток и содействия пролиферации и миграции сосудистых гладкомышечных клеток. Антитело к ANGPTL3 может специфически связываться с ANGPTL3, так что активность ANGPTL3 может быть ингибирована или нарушена, и, таким образом, можно лечить такие заболевания, как атеросклероз и гиперлипидемия. В настоящее время различные антитела к ANGPTL3 были раскрыты в патентных документах, например, WO2012174178A1, WO2008073300A2 и CN107085112A.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предложено антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления данного изобретения предложено антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела, где:

i) вариабельная область тяжелой цепи содержит определяющие комплементарность участки тяжелой цепи (HCDR) HCDR1, HCDR2 и HCDR3, идентичные по последовательностям тем, что имеются в вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 9, и вариабельная область легкой цепи содержит определяющие комплементарность участки легкой цепи (LCDR) LCDR1, LCDR2 и LCDR3, идентичные по последовательностям тем, что имеются в вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 10;

ii) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, идентичные по последовательностям тем, что имеются в вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 11, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, идентичные по последовательностям тем, что имеются в вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 12; или

iii) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, идентичные по последовательностям тем, что имеются в вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 13, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, идентичные по последовательностям тем, что имеются в вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 14.

В некоторых вариантах осуществления предложено описанное выше антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где:

iv) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17, соответственно;

v) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26, соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23, соответственно; или

vi) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 26, соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23, соответственно. В некоторых вариантах осуществления предложено описанное выше антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где:

(A) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, по меньшей мере на 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 % идентичную последовательности, указанной в SEQ ID NO: 9, и/или вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, по меньшей мере на 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 % идентичную последовательности, указанной в SEQ ID NO: 10;

(B) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, по меньшей мере на 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 % идентичную последовательности, указанной в SEQ ID NO: 11, и/или вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, по меньшей мере на 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 % идентичную последовательности, указанной в SEQ ID NO: 12; или

(C) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, по меньшей мере на 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 % идентичную последовательности, указанной в SEQ ID NO: 13, и/или вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, по меньшей мере на 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 % идентичную последовательности, указанной в SEQ ID NO: 14.

В некоторых вариантах осуществления предложено описанное выше антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент, которое содержит вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, как указано ниже:

(D) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 9, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 10;

(E) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 11, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 12; или

(F) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 13, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 14.

В некоторых вариантах осуществления предложено описанное выше антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело к ANGPTL3 дополнительно содержит константную область тяжелой цепи и константную область легкой цепи; в некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи выбрана из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека, и константная область легкой цепи выбрана из группы, состоящей из константных областей κ-цепи и λ-цепи человека; в некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 29 или последовательность, по меньшей мере на 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 % идентичную последовательности, указанной в SEQ ID NO. 29, и/или константная область легкой цепи имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 30, или последовательность, по меньшей мере на 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 % идентичную последовательности, указанной в SEQ ID NO: 30. В некоторых вариантах осуществления предложено описанное выше антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело к ANGPTL3 содержит тяжелую цепь и легкую цепь, где:

(C) тяжелая цепь имеет последовательность, по меньшей мере на 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 % идентичную последовательности, указанной в SEQ ID NO: 31, и/или легкая цепь имеет последовательность, по меньшей мере на 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 % идентичную последовательности, указанной в SEQ ID NO: 32;

(H) тяжелая цепь имеет последовательность, по меньшей мере на 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 % идентичную последовательности, указанной в SEQ ID NO: 33, и/или легкая цепь имеет последовательность, по меньшей мере на 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 % идентичную последовательности, указанной в SEQ ID NO: 34; или

(I) тяжелая цепь имеет последовательность, по меньшей мере на 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 % идентичную последовательности, указанной в SEQ ID NO: 35, и/или легкая цепь имеет последовательность, по меньшей мере на 85 %, 86 %, 87 %, 88 %, 89 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % или 99 % идентичную последовательности, указанной в SEQ ID NO: 36.

В некоторых вариантах осуществления предложено описанное выше антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело к ANGPTL3 содержит тяжелую цепь и легкую цепь, где:

(J) тяжелая цепь имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 31, и легкая цепь имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 32;

(K) тяжелая цепь имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 33, и легкая цепь имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 34; или

(L) тяжелая цепь имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 35, и легкая цепь имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 36.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложено выделенное антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент, где антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент конкурирует с описанным выше антителом к ANGPTL3 или его антигенсвязывающим фрагментом за связывание с антигеном ANGPTL3. В некоторых вариантах осуществления антиген ANGPTL3 представляет собой ANGPTL3 человека, ANGPTL3 мыши, ANGPTL3 обезьяны или ANGPTL3 крысы.

В некоторых вариантах осуществления описанное в настоящем документе антитело представляет собой антитело человека или антитело, полученное от человека. В некоторых вариантах осуществления описанный в настоящем документе антигенсвязывающий фрагмент выбран из группы, состоящей из Fab, F(ab')₂, Fab', Fd, Fv, dsFv, scFv, Fab и диатела. В некоторых вариантах осуществления антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению имеет по меньшей мере одну из следующих характеристик a-d:

a. Специфическое связывание с белком ANGPTL3. В некоторых вариантах осуществления антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с ANGPTL3 человека, ANGPTL3 мыши, ANGPTL3 яванского макака и/или ANGPT3L крысы с EC₅₀ (полумаксимальной эффективной концентрацией) менее 10 нМ (например, менее или равной 5 нМ, менее или равной 3 нМ, менее или равной 1 нМ, менее или равной 0,8 нМ, менее или равной 0,6 нМ, менее или равной 0,4 нМ, менее или равной 0,3 нМ или менее или равной 0,2 нМ); в некоторых вариантах осуществления EC₅₀ определяют способом ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay - иммуноферментный твердофазный анализ), например, как описано в тестовом примере 1 настоящего изобретения; в некоторых вариантах осуществления EC₅₀ определяют способом HTRF (гомогенной флуоресценции с временным разрешением), например, как описано в тестовом примере 2 настоящего изобретения;

b. Связывание с белком ANGPTL3 с высокой аффинностью. В некоторых вариантах осуществления антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с антигеном ANGPTL3 человека, ANGPTL3 мыши, ANGPTL3 яванского макака и/или ANGPTL3 крысы со значением KD (константы диссоциации) менее 10E-10 M (например, менее или равным 9E-10 M, менее или равным 8E-10 M, менее или равным 7E-10 M, менее или равным 6E-10 M, менее или равным 3E-10 M, менее или равным 2E-10 M, менее или равным 1E-10 M, менее или равным 8E-11 M, менее или равным 6E-11 M или менее или равным 5E-11 M); в некоторых вариантах осуществления значение KD определяют с помощью способа Biacore, например, как описано в тестовом примере 4 настоящего изобретения;

c. Блокирование ингибирования ANGPTL3 к ферменту ЛПЛ. В некоторых вариантах осуществления антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент блокирует ингибирование ANGPTL3 человека, ANGPTL3 мыши, ANGPTL3 яванского макака и/или ANGPTL3 крысы к активности фермента ЛПЛ со значением IC₅₀ (концентрации полумаксимального ингибирования) менее 170 нМ (например, менее или равным 80 нМ, менее или равным 135 нМ, или менее или равным 55 нМ). IC₅₀ может быть определена с помощью анализа активности фермента, например, как описано в тестовом примере 3 настоящего изобретения; и/или

d. Демонстрация хорошего гиполипидемического эффекта. В некоторых вариантах осуществления гиполипидемический эффект антитела к ANGPTL3 или его антигенсвязывающего фрагмента по настоящему изобретению показан в тестовых примерах 5, 6 и/или 7. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложена молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая описанной выше антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен вектор, содержащий описанную выше молекулу нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложена клетка-хозяин, содержащая описанную выше молекулу нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложена клетка-хозяин, полученная путем трансформации (или трансдукции или трансфекции) описанным выше вектором; клетка-хозяин выбрана из группы, состоящей из прокариотических клеток и эукариотических клеток, предпочтительно эукариотических клеток, более предпочтительно клеток млекопитающих. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин не содержит каких-либо человеческих клеток, способных развиваться в целостную особь, например, эмбриональных стволовых клеток человека, оплодотворенных яйцеклеток или зародышевых клеток; в некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, более предпочтительно клетку млекопитающего, включая, но не ограничиваясь ими, CHO (яичник китайского хомячка), 293, NSO (миелома мыши), и клетку млекопитающего, в которой редактирование генов (например, нокаутирование генов, таких как FUT8 или GnT-III) может изменить модификацию гликозилирования антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и тем самым изменить функцию ADCC (антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности) антитела или его антигенсвязывающего фрагмента; в некоторых вариантах осуществления клетка млекопитающего не включает клетку человека.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество описанного выше антитела к ANGPTL3 или его антигенсвязывающего фрагмента или описанной выше молекулы нуклеиновой кислоты и один или более фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, буфер или эксципиент. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция в расчете на одну дозу содержит 0,01-99 мас.% описанного выше антитела к ANGPTL3 или его антигенсвязывающего фрагмента или описанной выше молекулы нуклеиновой кислоты. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция в расчете на одну дозу содержит 0,1-2000 мг, более предпочтительно 1-1000 мг описанного выше антитела к ANGPTL3 или его антигенсвязывающего фрагмента или описанной выше молекулы нуклеиновой кислоты.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен способ иммунологического анализа или определения ANGPTL3, который включает описанное выше антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент. В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ обнаружения уровня экспрессии ANGPTL3 в образце субъекта in vitro, и указанный способ включает стадию приведения в контакт описанного в настоящем изобретении антитела к ANGPTL3 или его антигенсвязывающего фрагмента с образцом; в некоторых вариантах осуществления образец представляет собой образец плазмы, сыворотки или цельной крови субъекта. В некоторых вариантах осуществления уровень экспрессии ANGPTL3 может быть обнаружен с помощью любого способа, известного специалистам в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, вестерн-блоттинг, иммуноблоттинг, ELISA и масс-спектрометрию.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен набор, включающий описанное выше антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен способ получения описанного выше антитела к ANGPTL3 или его антигенсвязывающего фрагмента.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложено применение описанного выше антитела к ANGPTL3 или его антигенсвязывающего фрагмента для получения реагента для иммунологического анализа ANGPTL3.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложено описанное выше антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент для применения при иммунологическом анализе или определении ANGPTL3.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен набор, включающий описанное выше антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен набор для обнаружения уровня экспрессии ANGPTL3, который включает описанное выше антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления набор применяют в описанном в настоящем документе способе обнаружения уровня экспрессии ANGPTL3; в некоторых вариантах осуществления способ обнаружения представляет собой любой способ, известный специалистам в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, вестерн-блоттинг, иммуноблоттинг, ELISA и масс-спектрометрию.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложен способ лечения заболевания или расстройства, который включает введение субъекту терапевтически эффективного количества описанного выше антитела к ANGPTL3 или его антигенсвязывающего фрагмента, молекулы нуклеиновой кислоты или фармацевтической композиции; в некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой заболевание или расстройство, связанное с ANGPTL3; в некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой гиперхолестеринемию, гиперлипидемию или атеросклеротическое заболевание.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложено применение описанного выше антитела к ANGPTL3 или его антигенсвязывающего фрагмента, молекулы нуклеиновой кислоты или фармацевтической композиции для получения лекарственного средства для лечения заболевания или расстройства. В некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой заболевание или расстройство, связанное с ANGPTL3; в некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой гиперхолестеринемию, гиперлипидемию или атеросклеротическое заболевание.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предложено описанное выше антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент, молекула нуклеиновой кислоты или фармацевтическая композиция для применения в качестве лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления лекарственное средство применяют для лечения заболевания или расстройства, связанного с ANGPTL3; в некоторых вариантах осуществления заболевание или расстройство представляет собой гиперхолестеринемию, гиперлипидемию или атеросклеротическое заболевание.

Подробное описание изобретения

Термины (определение)

Чтобы облегчить понимание настоящего изобретения, некоторые технические и научные термины точно определены ниже. Если в настоящем документе специально не указано иное, все другие технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют значения, обычно понятные специалистам в области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Трехбуквенные и однобуквенные коды аминокислот, используемые в настоящем изобретении, являются такими, как описано в J. biol. chem, 243, p3558 (1968).

Описанное в настоящем документе «антитело» относится к иммуноглобулину, и природное интактное антитело представляет собой структуру тетрапептидной цепи, образованную соединением двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей посредством межцепочечных дисульфидных связей. По отличиям в аминокислотном составе и порядку расположения константных областей тяжелой цепи иммуноглобулины могут быть класифицированы на пять классов, иначе называемых изотипами иммуноглобулинов, а именно IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, при этом их соответствующими тяжелыми цепями являются μ-цепь, δ-цепь, γ-цепь, α-цепь и ε-цепь, соответственно. Ig одного класса может быть классифицирован на разные подклассы согласно различиям в аминокислотном составе шарнирных областей и количестве и положениях дисульфидных связей тяжелых цепей; например, IgG может быть классифицирован на IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Легкие цепи классифицируют по различиям в константных областях на κ- или λ-цепи. Каждый из пяти классов Ig может иметь κ-цепь или λ-цепь.

В тяжелых и легких цепях антител последовательности примерно 110 аминокислот вблизи N-конца значительно варьируют и, таким образом, они относятся к вариабельным областям (Fv-области); остальные аминокислотные последовательности вблизи С-конца относительно стабильны и, таким образом, они относятся к константным областям. Вариабельные области содержат 3 гипервариабельные области (HVR) и 4 каркасные области (FR) с относительно консервативными последовательностями. Указанные 3 гипервариабельные области определяют специфичность антитела и, таким образом, они также известны как определяющие комплементарность области (CDR). Каждая вариабельная область легкой цепи (VL) или вариабельная область тяжелой цепи (VH) состоит из 3 CDR и 4 FR, расположенных от амино-конца к карбокси-концу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. 3 CDR легкой цепи относятся к LCDR1, LCDR2 и LCDR3, а 3 CDR тяжелой цепи относятся к HCDR1, HCDR2 и HCDR3.

Помимо полноразмерных антител, описанные в настоящем документе «антитела» также включают антигенсвязывающие фрагменты, способные связываться с антигеном.

Антитела, описанные в настоящем документе, включают антитела человека.

Описанное в настоящем документе «мышиное антитело» представляет собой моноклональное антитело к ANGPTL3 человека, полученное в соответствии со знаниями и навыками в данной области техники. Во время получения тестируемым субъектам вводят с помощью инъекции антиген ANGPTL3, а затем выделяют гибридомы, экспрессирующие антитело с желаемой последовательностью или функциональными свойствами. В одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения мышиное антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент может дополнительно содержать константную область легкой цепи κ- или λ-цепи мыши или ее вариант, или дополнительно содержать константную область тяжелой цепи мышиного IgG1, IgG2 или IgG3 или ее вариант.

Описанный в настоящем документе термин «химерное антитело» относится к антителу, полученному путем слияния вариабельной области гетерологичного (например, мышиного) антитела и константной области родительского антитела (например, антитела человека), которое может облегчать иммунный ответ, индуцированный гетерологичным антителом. Например, химерное антитело человека-мыши получают, сначала создавая гибридому, секретирующую мышиное специфическое моноклональное антитело, затем клонируя ген вариабельной области из клеток гибридомы мыши, клонируя ген константной области антитела человека по мере необходимости, соединяя ген вариабельной области мыши и ген константной области человека в химерный ген, внедряя химерный ген в вектор экспрессии и, наконец, экспрессируя молекулы химерного антитела в эукариотической системе или прокариотической системе. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения легкая цепь антитела химерного антитела к ANGPTL3 дополнительно содержит константную область легкой цепи κ- или λ-цепи человека или ее вариант. Тяжелая цепь антитела химерного антитела ANGPTL3 дополнительно содержит константную область тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека или ее вариант, предпочтительно константную область тяжелой цепи IgG1, IgG2 или IgG4 человека или вариант IgG1, IgG2 или IgG4 с применением аминокислотной мутации (например, мутации L234A и/или L235A и/или мутации S228P).

Термин «гуманизированное антитело», также называемое CDR-привитым антителом, относится к антителу, продуцируемому путем прививки последовательностей CDR мыши в каркас вариабельной области антитела человека, т. е. к антителу, продуцируемому в другом типе каркасной последовательности антитела зародышевой линии человека. Следовательно, гетерогенная реакция, индуцированная присутствием большого количества компонентов мышиного белка в химерном антителе, может быть преодолена. Такие каркасные последовательности могут быть получены из общедоступных баз данных ДНК или раскрытых ссылок, которые включают генные последовательности зародышевых антител. Например, последовательности ДНК зародышевой линии генов вариабельных областей тяжелой и легкой цепи человека могут быть найдены в базе данных последовательностей зародышевой линии человека «VBase», а также в Kabat, E.A. et al., 1991, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th edition. Чтобы избежать снижения активности, вызванного снижением иммуногенности, каркасная последовательность вариабельной области антитела человека может быть подвергнута минимальной обратимой мутации или обратной мутации для сохранения активности. Гуманизированное антитело по настоящему изобретению также включает гуманизированные антитела, которые дополнительно подвергали мутации созревания аффиности CDR с помощью дрожжевого дисплея.

Термины «антитело человека» и «антитело, полученное от человека» применяются взаимозаменяемо и означают, что одна или более вариабельных и константных областей получены из последовательностей иммуноглобулина человека. Один предпочтительный способ заключается в том, что все вариабельные и константные области получены из последовательностей иммуноглобулина человека, т. е. «антитела, полностью полученные от человека» или «полностью человеческие антитела». Эти антитела могут быть получены различными способами, включая антитела, полученные путем выделения В-клеток из МКПК (мононуклеарных клеток периферической крови) человека, ткани селезенки и лимфатического узла и конструирования природной одноцепочечной фаговой библиотеки антител человека с помощью технологии фагового дисплея или путем иммунизации трансгенных мышей, способных экспрессировать легкие и тяжелые цепи антител человека, и скрининга. Антитела человека по настоящему изобретению также включают антитела, которые по-прежнему связываются с антигеном, представляющим интерес, и получены путем мутации одной или более аминокислот на основе антител человека.

Описанный в настоящем документе «обычный вариант» константной области тяжелой цепи антитела человека и константной области легкой цепи антитела человека относится к варианту константной области тяжелой цепи или константной области легкой цепи, полученному от человека, который был раскрыт в предшествующем уровне техники и не изменяет структуру и функцию вариабельной области антитела. Иллюстративные варианты включают варианты константной области тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 с сайт-направленными модификациями и аминокислотными заменами в константной области тяжелой цепи. Конкретные замены представляют собой, например, мутацию YTE, мутацию L234A и/или L235A или мутацию S228P, или мутации с получением структуры выступ-во-впадину (так что тяжелая цепь антитела имеет комбинацию выступ-Fc и впадина-Fc), известную в данной области техники. Было подтверждено, что эти мутации придают антителу новые свойства, но не изменяют функцию вариабельной области антитела.

Термины «полноразмерное антитело», «интактное антитело», «полное антитело» и «цельное антитело» применяются в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения антитела в его практически интактной форме, в отличие от антигенсвязывающего фрагмента, определенного ниже. Указанный термин, в частности, относится к антителам, в которых легкая и тяжелая цепи содержат константные области. «Антитело» по настоящему изобретению включает «полноразмерные антитела» и их антигенсвязывающие фрагменты.

В некоторых вариантах осуществления полноразмерные антитела по настоящему изобретению включают полноразмерные антитела, образованные путем связывания вариабельной области легкой цепи с константной областью легкой цепи и связывания вариабельной области тяжелой цепи с константной областью тяжелой цепи. Специалисты в данной области техники могут выбрать различные константные области легкой цепи и константные области тяжелой цепи, полученные из антител, в соответствии с фактическими потребностями, например, константные области легкой цепи и константные области тяжелой цепи, полученные из антител человека.

Термин «антигенсвязывающий фрагмент» или «функциональный фрагмент» относится к одному или более фрагментам антитела, которые сохраняют способность специфически связываться с антигеном (например, ANGPTL3). Было показано, что фрагмент полноразмерного антитела может применяться для осуществления антигенсвязывающей функции антитела. Примеры связывающего фрагмента, входящие в термин «антигенсвязывающий фрагмент», включают (i) Fab-фрагмент, моновалентный фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) F(ab')₂-фрагмент, бивалентный фрагмент, содержащий два Fab-фрагмента, связанных дисульфидным мостиком в шарнирной области; (iii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (iv) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VH и VL одного плеча антитела; (v) dsFv, стабильный антигенсвязывающий фрагмент, образованный VH и VL посредством межцепочечных дисульфидных связей между ними; (vi) диатело, биспецифическое антитело и мультиспецифическое антитело, содержащее такие фрагменты, как scFv, dsFv и Fab. Кроме того, хотя два домена Fv-фрагмента, VL и VH, кодируются отдельными генами, они могут быть связаны синтетическим линкером путем рекомбинации, так что он способен продуцировать одну белковую цепь, в которой области VL и VH спариваются с образованием моновалентной молекулы (называется одноцепочечным Fv (scFv); см., например, Bird et al. (1988) Science 242:423-426; и Huston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:5879-5883). Такие одноцепочечные антитела также входят в термин «антигенсвязывающий фрагмент» антитела. Такие фрагменты антител получают с помощью общепринятых способов, известных специалистам в данной области техники, и подвергают скринингу на пригодность таким же образом, как и интактные антитела. Антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены с помощью технологии рекомбинантной ДНК или путем ферментативного или химического расщепления интактных иммуноглобулинов. Антитела могут быть различных изотипов, например, антитело IgG (например, подтип IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), IgA1, IgA2, IgD, IgE или IgM.

Fab представляет собой фрагмент антитела, который имеет молекулярную массу примерно 50 000, обладает антигенсвязывающей активностью и может быть получен обработкой молекул антител IgG протеазой папаином (который расщепляет аминокислотный остаток в положении 224 H-цепи), в котором около половины H-цепи N-концевой стороны и вся L-цепь соединены дисульфидными связями.

F(ab')₂ представляет собой фрагмент антитела, который имеет молекулярную массу около 100 000, обладает антигенсвязывающей активностью, содержит две области Fab, соединенные в шарнирном положении, и может быть получен путем расщепления нижней части двух дисульфидных связей в шарнирной области IgG ферментом пепсином.

Fab' представляет собой фрагмент антитела, который имеет молекулярную массу около 50 000, обладает антигенсвязывающей активностью и может быть получен путем расщепления дисульфидной связи в шарнирной области описанного выше F(ab')₂. Fab' по настоящему изобретению может быть получен с помощью восстановителей, например дитиотреитола, для обработки F(ab')₂ по настоящему изобретению, который специфически распознает ANGPTL3 и связывается с аминокислотной последовательностью внеклеточной области или ее трехмерной структурой.

Кроме того, Fab' может быть получен путем внедрения ДНК, кодирующей Fab'-фрагмент антитела, в прокариотический или эукариотический вектор экспрессии и введения вектора в прокариот или эукариот для экспрессии Fab'.

Термин «одноцепочечное антитело», «одноцепочечный Fv» или «scFv» относится к молекуле, содержащей вариабельный домен тяжелой цепи антитела (или область; VH) и вариабельный домен легкой цепи антитела (или область; VL), связанные линкером. Такие молекулы scFv могут иметь общую структуру: NH₂-VL-линкер-VH-COOH или NH₂-VH-линкер-VL-COOH. Подходящие линкеры в предшествующем уровне техники состоят из повторяющихся аминокислотных последовательностей GGGGS или их вариантов, например, повторяющихся вариантов 1-4 (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6444-6448). Другие линкеры, которые могут применяться в настоящем изобретении, описаны в Alfthan et al. (1995), Protein Eng. 8:725-731; Choi et al. (2001), Eur. J. Immunol. 31:94-106; Hu et al. (1996), Cancer Res. 56:3055-3061, Kipriyanov et al. (1999) J. Mol. Biol. 293:41-56; и Roovers et al. (2001), Cancer Immunol.

Диатело представляет собой фрагмент антитела, в котором scFv или Fab димеризован, и представляет собой фрагмент антитела с бивалентной антигенсвязывающей активностью. В бивалентной антигенсвязывающей активности два антигена могут быть идентичными или различными.

Биспецифические антитела и мультиспецифические антитела относятся к антителам, которые могут одновременно связываться с двумя или более антигенами или антигенными детерминантами, и содержат scFv или Fab-фрагменты, которые могут связываться с ANGPTL3.

Диатело по настоящему изобретению может быть получено с помощью следующих стадий: получение кодирующей кДНК VH и VL моноклонального антитела по настоящему изобретению, которое специфически распознает ANGPTL3 человека и связывается с аминокислотной последовательностью внеклеточной области или ее трехмерной структурой, конструирование ДНК, кодирующей scFv, таким образом, чтобы длина аминокислотной последовательности пептидного линкера составляла 8 остатков или менее, внедрение ДНК в прокариотический вектор экспрессии или эукариотический вектор экспрессии, а затем введение вектора экспрессии в прокариот или эукариот для экспрессии диатела.

dsFv получают путем связывания полипептидов, в которых один аминокислотный остаток в каждом VH и VL замещен остатком цистеина посредством дисульфидных связей между остатками цистеина. Аминокислотные остатки, замещенные остатками цистеина, могут быть выбраны в соответствии с известными способами (Protein Engineering, 7, 697 (1994)) на основании прогнозирования трехмерной структуры антитела.

Полноразмерное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению может быть получено с помощью следующих стадий: получение кодирующей кДНК антитела по настоящему изобретению, которое специфически распознает ANGPTL3 человека и связывается с аминокислотной последовательностью внеклеточной области или ее трехмерной структурой, конструирование ДНК, кодирующей dsFv, внедрение ДНК в прокариотический вектор экспрессии или эукариотический вектор экспрессии, а затем введение вектора экспрессии в прокариот или эукариот для экспрессии dsFv.

Термин «аминокислотная разница» или «аминокислотная мутация» относится к наличию аминокислотных изменений или мутаций в варианте белка или полипептида по сравнению с исходным белком или полипептидом, включая возникновение 1, 2, 3 или более аминокислотных вставок, делеций или замен на основании исходного белка или полипептида.

Термин «каркасный участок антитела» или «FR» относится к фрагменту вариабельного домена VL или VH, который служит каркасом для антигенсвязывающих петель (CDR) вариабельного домена. Это, по существу, вариабельный домен без CDR.

Термин «определяющая комплементарность область», «CDR» или «гипервариабельная область» относится к одной из 6 гипервариабельных областей в пределах вариабельного домена антитела, которая в основном способствует связыванию антигена. В целом, существует три CDR (HCDR1, HCDR2 и HCDR3) в каждой вариабельной области тяжелой цепи и три CDR (LCDR1, LCDR2 и LCDR3) в каждой вариабельной области легкой цепи. Любая из множества хорошо известных схем может быть использована для определения границ аминокислотных последовательностей CDR, включая нумерацию по «Кабату» (см. Kabat et al., (1991), «Sequences of Proteins of Immunological Interest», 5th edition, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD), нумерацию по «Чотиа» (см. Al-Lazikani et al., (1997) JMB 273: 927-948) и нумерацию по ImMunoGenTics (IMGT) (Lefranc M. P., Immunologist, 7, 132-136 (1999); Lefranc, M. P., et al., Dev. Comp. Immunol., 27, 55-77 (2003)) и др.

Термин «эпитоп» или «антигенная детерминанта» относится к сайту на антигене (например, специфическому сайту на молекуле ANGPTL3), с которым специфически связывается иммуноглобулин или антитело. Эпитопы обычно содержат по меньшей мере 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 заменимых или незаменимых аминокислот в уникальной пространственной конформации. См, например, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, vol. 66, G.E. Morris, Ed. (1996).

Термины «специфическое связывание», «селективное связывание», «селективное связывание с», «специфическое связывание с» и «способный специфически связываться с» относятся к связыванию антитела с эпитопом на заранее определенном антигене. Как правило, антитело связывается с аффинностью (KD) менее чем примерно 10^-8 M, например, менее чем примерно 10^-9 M, 10^-10 M или 10^-11 M, 10^-12 M или менее.

Термин «KD» относится к константе диссоциации для специфического взаимодействия антитело-антиген. Как правило, антитело по настоящему изобретению связывается с ANGPTL3 с константой диссоциации (KD) менее чем примерно 10^-7 M, например, менее чем примерно 10^-8 M или 10^-9 M. Например, в настоящем изобретении значение KD аффинности антитела для антигена клеточной поверхности определяют с помощью способа FACS (fluorescent activated cell sorting - сортировка флуоресцентно-активированных клеток); в других вариантах осуществления значение KD аффинности антитела для антигена определяют с помощью способа Biacore; в других вариантах осуществления связывание антитела с антигеном определяют с помощью способа ELISA.

Термин «конкурировать» при использовании в случае, когда антигенсвязывающие белки (например, нейтрализуя антигенсвязывающие белки или нейтрализуя антитела) конкурируют за один и тот же эпитоп, относится к конкуренции между антигенсвязывающими белками, которая определяется с помощью следующих анализов, в которых тестируемый антигенсвязывающий белок (например, антитело или его иммунологически функциональный фрагмент) предотвращает или ингибирует (например, снижает) специфическое связывание эталонного антигенсвязывающего белка (например, лиганда или эталонного антитела) с общим антигеном (например, антигеном ANGPTL3 или его фрагментом). Доступны многочисленные виды анализов конкурентного связывания для определения того, конкурирует ли антигенсвязывающий белок с другим, например: твердофазный прямой или непрямой радиоиммуноанализ (РИА), твердофазный прямой или непрямой иммуноферментный анализ (ИФА) и конкурентный-сэндвич анализ (см., например, Stahli et al., 1983, Methods in Enzymology 9:242-253); твердофазный прямой биотин-авидин ИФА (см., например, Kirkland et al., 1986, J. Immunol. 137:3614-3619), твердофазный анализ с прямым мечением и твердофазный сэндвич-анализ с прямым мечением (см., например, Harlow and Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press); твердофазный РИА с прямым мечением меткой I-125 (см., например, Morel et al., 1988, Molec. Immunol. 25:7-15); твердофазный прямой ИФА С биотином-авидином (см., например, Cheung, et al., 1990, Virology 176:546-552) и РИА с прямым мечением (Moldenhauer et al., 1990, Scand. J. Immunol. 32:77-82). В целом, анализ относится к применению очищенного антигена, связывающегося с твердой поверхностью или клеткой, несущей любой немеченый анализируемый антигенсвязывающий белок и меченый эталонный антигенсвязывающий белок. Конкурентное ингибирование измеряют путем измерения количества метки, связанной с твердой поверхностью или клеткой в присутствии анализируемого антигенсвязывающего белка. Как правило, анализируемый антигенсвязывающий белок присутствует в избыточном количестве. Антигенсвязывающие белки, идентифицированные с помощью конкурентного анализа (конкурентные антигенсвязывающие белки), включают: антигенсвязывающий белок, связывающийся с тем же эпитопом, что и эталонный антигенсвязывающий белок, и антигенсвязывающий белок, связывающийся с соседним эпитопом, достаточно близким к связывающему эпитопу эталонного антигенсвязывающего белка, и два эпитопа, пространственно мешающие друг другу, для предотвращения связывания. Другая подробная информация о способе анализа конкурентного связывания представлена в настоящем документе в примерах. Как правило, когда конкурентный антигенсвязывающий белок находится в избыточном количестве, специфическое связывание эталонного антигенсвязывающего белка с общим антигеном будет ингибироваться (например, снижаться) по меньшей мере на 40-45 %, 45-50 %, 50-55 %, 55-60 %, 60-65 %, 65-70 %, 70-75 % или 75 % или более. В некоторых случаях связывание ингибируется по меньшей мере на 80-85 %, 85-90 %, 90-95 %, 95-97 % или 97 % или более.

В контексте настоящего документа термин «молекула нуклеиновой кислоты» относится к молекуле ДНК и молекуле РНК. Молекула нуклеиновой кислоты может быть одноцепочечной или двухцепочечной, и она предпочтительно представляет собой двухцепочечную ДНК, одноцепочечную мРНК (матричная РНК) или модифицированную мРНК. Нуклеиновая кислота является «функционально связанной», когда она находится в функциональной связи с другой последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, промотор или энхансер функционально связан с кодирующей последовательностью, если он влияет на транскрипцию кодирующей последовательности.

«Идентичность» аминокислотной последовательности относится к проценту аминокислотных остатков, общих для первой последовательности и второй последовательности, при этом при выравнивании аминокислотных последовательностей, при необходимости, вводятся гэпы для достижения максимального процента идентичности последовательности, и любая консервативная замена не рассматривается как часть идентичности последовательности. С целью определения процента идентичности аминокислотных последовательностей, выравнивания могут быть достигнуты различными способами, хорошо известными в данной области техники, например, с применением общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 или Megalign (DNASTAR). Специалисты в данной области техники могут определить параметры, подходящие для измерения выравнивания, включая любые алгоритмы, требуемые для достижения максимального выравнивания всей длины выровненных последовательностей.

Термин «вектор экспрессии» относится к молекуле нуклеиновой кислоты, способной транспортировать другую нуклеиновую кислоту, с которой она связана. В одном варианте осуществления вектор представляет собой «плазмиду», которая относится к круговой двухцепочечной петле ДНК, в которую могут быть лигированы дополнительные сегменты ДНК. В другом варианте осуществления вектор представляет собой вирусный вектор, в котором дополнительные сегменты ДНК могут быть лигированы в вирусный геном. Векторы, раскрытые в настоящем документе, способны автономно реплицироваться в клетке-хозяине, в которую они введены (например, бактериальные векторы, имеющие бактериальное происхождение репликации, и эписомальные векторы млекопитающих), или способны интегрироваться в геном клетки-хозяина после введения в клетку-хозяина и, таким образом, реплицироваться геномом хозяина (например, неэписомальные векторы млекопитающих).

Способы получения и очистки антител и антигенсвязывающих фрагментов хорошо известны в данной области техники, например, те, что описаны в главах 5-8 и 15 книги Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press. Например, мыши могут быть иммунизированы ANGPTL3 человека или его фрагментом, и полученные антитела могут быть ренатурированы и очищены, а аминокислотное секвенирование может быть выполнено с помощью обычных способов. Антигенсвязывающие фрагменты также могут быть получены с применением обычных способов. Описанное в настоящем изобретении антитело или антигенсвязывающий фрагмент генетически сконструированы, чтобы содержать одну или более дополнительных FR человека в нечеловеческих CDR. Последовательности зародышевой линии FR человека могут быть получены на веб-сайте ImMunoGeneTics (IMGT) путем сравнения базы данных генов зародышевой линии вариабельной области антител человека IMGT с программным обеспечением MOE или получены из журнала по иммуноглобулинам 2001ISBN012441351.

Термин «клетка-хозяин» относится к клетке, в которую был введен вектор экспрессии. Клетки-хозяева могут включать бактериальные, микробные, растительные или животные клетки. Бактерии, чувствительные к трансформации, включают членов семейства Enterobacteriaceae, например, штаммы Escherichia coli или Salmonella; членов семейства Bacillaceae, например, Bacillus subtilis; Pneumococcus; Streptococcus и Haemophilus influenzae. Подходящие микроорганизмы включают Saccharomyces cerevisiae и Pichia pastoris. Подходящие животные линии клеток-хозяев включают CHO, клетки 293 и клетки NS0.

Сконструированное антитело или антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению может быть получено и очищено с помощью обычных способов. Например, последовательности кДНК, кодирующие тяжелую и легкую цепи, могут быть клонированы и рекомбинированы в вектор экспрессии GS. Рекомбинантные векторы экспрессии иммуноглобулина могут быть стабильно трансфицированы в клетки СНО. В соответствии с более рекомендуемым уровнем техники, системы экспрессии млекопитающих приводят к гликозилированию антитела, в частности, в высококонсервативном N-концевом сайте Fc-области. Стабильные клоны получают путем экспрессии антитела, которое специфически связывается с ANGPTL3 человека. Положительные клоны размножаются в бессывороточной среде в биореакторе с получением антитела. Культуральный раствор с секретируемым антителом может быть очищен с помощью обычных способов. Например, очистку проводят на колонке Sepharose FF A или G, содержащей отрегулированный буфер. Неспецифически связанные фракции смывают. Связанное антитело элюируют с помощью градиентного способа рН, а фрагменты антител обнаруживают с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза (электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия) и собирают. Антитело может быть отфильтровано и сконцентрировано с помощью обычных способов. Растворимые смеси и полимеры также могут быть удалены с помощью обычных способов, таких как молекулярные сита и ионный обмен. Полученный продукт требует немедленной заморозки, например, при минус 70°C, или лиофилизации.

Термины «введение», «назначение» и «лечение», при применении к животным, людям, экспериментальным субъектам, клеткам, тканям, органам или биологической жидкости, относятся к контакту экзогенного лекарственного средства, терапевтического агента, диагностического агента или композиции с животными, людьми, субъектами, клетками, тканями, органами или биологической жидкостью. «Введение», «назначение» и «лечение» может относиться, например, к терапевтическим, фармакокинетическим, диагностическим, исследовательским и экспериментальным способам. Обработка клеток включает приведение реагента в контакт с клетками и приведение реагента в контакт с жидкостью, при этом указанная жидкость находится в контакте с клетками. «Введение», «назначение» и «лечение» также относятся к обработке, например, клеток реагентами, диагностикой, связывающими композициями или другой клеткой in vitro и ex vivo. «Лечение» применительно к людям, ветеринарным или исследовательским субъектам относится к терапевтическому лечению, предупреждающим или профилактическим мерам, а также к исследовательскому и диагностическому применению.

«Лечение» или «обработка» относится к введению терапевтического агента, такого как композиция, содержащего любое из соединений конъюгации по настоящему изобретению, либо внутрь, либо снаружи пациенту с одним или более симптомами заболевания, в отношении которого известно, что терапевтический агент имеет терапевтический эффект. Как правило, терапевтический агент вводят в количестве, эффективном для облегчения одного или более симптомов заболевания у пациента или популяции, получающей лечение, чтобы индуцировать регрессию таких симптомов или ингибировать развитие таких симптомов в любой клинически измеримой степени. Количество терапевтического агента, эффективного для облегчения симптомов любого конкретного заболевания (также называемое «терапевтически эффективным количеством»), может варьировать в зависимости от множества факторов, таких как болезненное состояние, возраст и вес пациента, и способности лекарственного средства продуцировать желаемый терапевтический эффект у пациента. Облегчение симптома заболевания может быть оценено с помощью любых способов клинического тестирования, обычно применяемых врачами или другими специалистами в области здравоохранения для оценки тяжести или прогрессирования симптома. Хотя варианты осуществления настоящего изобретения (например, способы лечения или продукты) могут быть неэффективны в облегчении всех целевых симптомов заболевания у каждого пациента, как определено в соответствии с любыми статистическими способами тестирования, известными в данной области техники, такими как t-критерий Стьюдента, критерий хи-квадрат, U-критерий Манна и Уитни, критерий Крускала-Уоллиса (H-критерий), критерий Джонкхира-Терпстры и критерий Уилкоксона, они должны уменьшать целевые симптомы заболевания у статистически значимого числа пациентов.

«Консервативная модификация» или «консервативная замена или замещение» относится к замене аминокислот в белке другими аминокислотами, имеющими сходные характеристики (например, заряд, размер боковой цепи, гидрофобность/гидрофильность или конформацию и жесткость каркаса), так что изменения часто могут быть сделаны без изменения биологической активности белка. Специалистам в данной области техники известно, что, как правило, замена одной аминокислоты в несущественной области полипептида существенно не изменяет биологическую активность (см., например, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., p224, (4^th edition)). Кроме того, замена аминокислот с аналогичной структурой или функцией вряд ли нарушит биологическую активность. Иллюстративные консервативные замещения приведены ниже в таблице «Иллюстративные аминокислотные консервативные замещения».

Таблица 1. Иллюстративные аминокислотные консервативные замещения

Исходный остаток Консервативное замещение Ala(A) Gly; Ser Arg(R) Lys; His Asn(N) Gln; His; Asp Asp(D) Glu; Asn Cys(C) Ser; Ala; Val Gln(Q) Asn; Glu Glu(E) Asp; Gln Gly(G) Ala His(H) Asn; Gln Ile(I) Leu; Val Leu(L) Ile; Val Lys(K) Arg; His Met(M) Leu; Ile; Tyr Phe(F) Tyr; Met; Leu Pro(P) Ala Ser(S) Thr Thr(T) Ser Trp(W) Tyr; Phe Tyr(Y) Trp; Phe Val(V) Ile; Leu

«Эффективное количество» или «эффективная дозировка» относится к количеству лекарственного средства, соединения или фармацевтической композиции, необходимому для получения любого одного или более полезных или желательных терапевтических результатов. Для профилактического применения полезные или желательные результаты включают устранение или снижение риска, снижение тяжести или замедление начала расстройства, включая биохимию, гистологию и/или поведенческие симптомы расстройства, их осложнения и промежуточные патологические фенотипы, которые появляются во время прогрессирования расстройства. Для терапевтических применений полезные или желательные результаты включают клинические результаты, такие как снижение частоты возникновения различных расстройств, связанных с целевым антигеном по настоящему изобретению, или облегчение одного или более симптомов расстройства, снижение дозировки других агентов, требуемых для лечения расстройства, усиление терапевтического эффекта другого агента и/или замедление прогрессирования расстройств у пациента, связанных с целевым антигеном по настоящему изобретению.

«Экзогенный» относится к веществам, производимым вне организмов, клеток или человеческих тел в зависимости от обстоятельств. «Эндогенный» относится к веществам, производимым внутри клеток, организмов или человеческих тел в зависимости от обстоятельств.

В контексте настоящего документа выражения «клетка», «клеточная линия» и «клеточная культура» применяются взаимозаменяемо, и все такие обозначения включают их потомство. Таким образом, слова «трансформант» и «трансформированная клетка» включают первичные тестовые клетки и культуры, полученные из них, независимо от количества переносов. Также следует понимать, что все потомство может не быть точно идентичными по содержанию ДНК из-за преднамеренных или непреднамеренных мутаций. Включено потомство мутантов с той же функцией или биологической активностью, что и при скрининге в исходных трансформированных клетках. Различные обозначения, при ссылке на них, станут понятными через контекст.

В контексте настоящего документа «полимеразная цепная реакция» или «ПЦР» относится к процедуре или способу, в которой следовое количество специфического фрагмента нуклеиновой кислоты, РНК и/или ДНК амплифицируется, как описано, например, в патенте США № 4683195. В целом, необходимо получить информацию о последовательности с конца или снаружи целевой области, чтобы можно было сконструировать олигонуклеотидные праймеры; эти праймеры идентичны или схожи с точки зрения последовательности с соответствующей цепью матрицы, подлежащей амплификации. 5'-концевой нуклеотид 2-х праймеров может совпадать с концом материала, подлежащего амплификации. ПЦР может быть применена для амплификации специфических последовательностей РНК, специфических последовательностей ДНК из общих геномных последовательностей ДНК и кДНК, транскрибируемых из последовательностей тотальной клеточной РНК, фага, плазмиды или т. п. См., в целом, Mullis, et al., (1987) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51: 263; Ed. Erlich (1989) PCR TECHNOLOGY (Stockton Press, N.Y.). ПЦР в контексте настоящего документа считается примером, но не единственным, способа полимеразной реакции нуклеиновых кислот для амплификации исследуемого образца нуклеиновой кислоты, и указанный способ включает применение известных нуклеиновых кислот в качестве праймеров и полимераз нуклеиновых кислот для амплификации или получения специфического фрагмента нуклеиновой кислоты.

«Выделенный» относится к очищенному состоянию, и в этом случае означает, что обозначенная молекула по существу не содержит других биомолекул, таких как нуклеиновые кислоты, белки, липиды, углеводы или другие материалы (такие как клеточный детрит и среда для роста). Как правило, термин «выделенный» не означает полного отсутствия таких веществ или отсутствия воды, буферов или солей, если они не присутствуют в количествах, которые будут значительно препятствовать экспериментальному или терапевтическому применению соединений, описанных в настоящем документе.

Термин «необязательный» или «необязательно» означает, что событие или обстоятельство, описанное впоследствии, может, но не обязательно, иметь место, и что описание включает случаи, когда событие или обстоятельство происходит или не происходит.

Термин «фармацевтическая композиция» относится к смеси, содержащей одно или более соединений, описанных в настоящем документе, или их физиологически/фармацевтически приемлемых солей или пролекарств и других химических компонентов, а другие указанные компоненты представляют собой, например, физиологически/фармацевтически приемлемые носители и эксципиенты. Назначение фармацевтической композиции заключается в том, чтобы способствовать введению в организм, что облегчает абсорбцию активного ингредиента, тем самым проявляя биологическую активность.

Термин «фармацевтически приемлемый носитель» относится к любому неактивному веществу, подходящему для применения в составах для доставки антитела или антигенсвязывающего фрагмента. Носитель может представлять собой антиадгезивный агент, связующее вещество, покрытие, разрыхлитель, наполнитель или разбавитель, консервант (такой как антиоксидант, антибактериальный или противогрибковый агент), подсластитель, замедляющий абсорбцию агент, смачивающий агент, эмульгатор, буфер и т.д. Примеры подходящих фармацевтически приемлемых носителей включают воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропандиол и полиэтиленгликоль), декстрозу, растительное масло (например, оливковое масло), физиологический раствор, буфер, забуференный физиологический раствор и изотонический агент, такой как сахар, полиол, сорбит и хлорид натрия.

Кроме того, настоящее изобретение включает агенты для лечения заболеваний, связанных с положительными клетками целевого антигена (например, ANGPTL3), и указанные агенты содержат антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента.

В настоящем изобретении нет ограничений для заболеваний, связанных с ANGPTL3, при условии, что это заболевание связано с ANGPTL3. Например, терапевтический ответ, индуцированный молекулой по настоящему изобретению, может быть достигнут путем связывания с ANGPTL3 человека, а затем блокирования связывания ANGPTL3 с его рецепторами. Таким образом, молекулы по настоящему изобретению, при нахождении в препаратах и составах, подходящих для терапевтического применения, очень полезны для тех, кто страдает от гиперхолестеринемии, гиперлипидемии, атеросклеротического заболевания или т.п.

Кроме того, настоящее изобретение относится к способам иммунологического анализа или определения целевого антигена (например, ANGPTL3), реагентам для иммунологического анализа или определения целевого антигена (например, ANGPTL3), способам иммунологического анализа или определения клеток, экспрессирующих целевой антиген (например, ANGPTL3), и диагностическим агентам для диагностики заболеваний, связанных с положительными клетками целевого антигена (например, ANGPTL3), который включает антитело или фрагмент антитела по настоящему изобретению в качестве активного ингредиента, который специфически распознает целевой антиген (например, ANGPTL3 человека) и связывается с аминокислотной последовательностью внеклеточной области или ее трехмерной структурой.

В настоящем описании способ, применяемый для обнаружения или определения количества целевого антигена (например, ANGPTL3), может представлять собой любой известный способ. Например, он включает способы иммунологического анализа или определения.

Способы иммунологического анализа или определения представляют собой способы обнаружения или определения количества антитела или антигена с помощью меченых антигенов или антител. Примеры способов иммунологического анализа или определения включают радиоиммуноанализ (РИА), иммуноферментный анализ (ИФА или ELISA), флуоресцентный иммунологический анализ (ФИА), люминесцентный иммуноанализ, вестерн-блоттинг, физико-химические способы и т.д.

Вышеупомянутые заболевания, связанные с положительными клетками ANGPTL3, могут быть диагностированы путем обнаружения или определения клеток, экспрессирующих ANGPTL3, с помощью антитела или фрагмента антитела по настоящему изобретению.

Для обнаружения клеток, экспрессирующих полипептид, могут быть применены известные способы иммунологического анализа, предпочтительно иммунопреципитация, флуоресцентное окрашивание клеток, иммуногистохимическое окрашивание и т.д. Кроме того, может быть применен способ окрашивания флуоресцирующими антителами с применением системы FMAT8100HTS (Applied Biosystem).

В настоящем изобретении не существует конкретного ограничения для образца, применяемого для обнаружения или определения целевого антигена (например, ANGPTL3), при условии, что он имеет возможность содержать клетки, экспрессирующие целевой антиген (например, ANGPTL3), такие как гистоцит, кровь, плазма, сыворотка, поджелудочный сок, моча, фекалии, тканевая жидкость или культуральный раствор.

Согласно требуемому способу диагностики, диагностический агент, содержащий моноклональное антитело или его фрагмент антитела по настоящему изобретению, может также содержать реагенты для осуществления реакции антиген-антитело или реагенты для обнаружения реакции. Реагенты для осуществления реакции антиген-антитело включают буферы, соли и т.д. Реагенты для обнаружения включают реагенты, обычно применяемые в способах иммунологического анализа или определения, например, меченые вторичные антитела, которые распознают моноклональное антитело, его фрагмент антитела или его конъюгат, и субстраты, соответствующие метке, и т.д.

Один или более вариантов осуществления настоящего изобретения подробно описаны выше в описании. Хотя любые способы и материалы, подобные или идентичные описанным в настоящем документе, могут быть использованы для реализации или тестирования настоящего изобретения, предпочтительные способы и материалы описаны ниже. Другие признаки, объекты и преимущества настоящего изобретения станут очевидны из описания и формулы изобретения. В описании и формуле изобретения формы единственного числа включают множественное число, если иное четко не указано в контексте. Если специально не указано иное, все технические и научные термины, используемые в настоящем документе, имеют значения, обычно понятные специалистам в области техники, к которой относится настоящее изобретение. Все патенты и публикации, приведенные в описании, включены в него посредством ссылки. Следующие примеры приведены для того, чтобы более полно проиллюстрировать предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Эти примеры не следует никоим образом толковать как ограничивающие объем настоящего изобретения, который определен формулой изобретения.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг. 1 показано влияние антитела P8BG на триглицерид в сыворотке крыс Спрэг-Доули (SD);

на фиг. 2 показано влияние антитела P3G на триглицерид в сыворотке крыс SD;

на фиг. 3 показано влияние антител к ANGPTL3 на триглицерид в плазме мышей с высоким содержанием жиров в рационе (HFD);

на фиг. 4 показано влияние антител к ANGPTL3 на холестерин липопротеинов низкой плотности (Х-ЛПНП) в плазме мышей HFD;

на фиг. 5 показано влияние антител к ANGPTL3 на общий холестерин в плазме мышей HFD;

на фиг. 6 показано влияние антител к ANGPTL3 на триглицерид в плазме мышей APOE (мыши с нокаутом гена аполипопротеина E (ApoE));

на фиг. 7 показано влияние антител к ANGPTL3 на холестерин липопротеинов высокой плотности (ЛПВП-Х) в плазме мышей APOE;

на фиг. 8 показаны результаты фармакокинетического эксперимента с антителами к ANGPTL3 у мышей in vivo; и

на фиг. 9 показаны результаты фармакокинетического эксперимента с антителами к ANGPTL3 у яванских макак in vivo.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Следующие примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение, но настоящее изобретение не ограничивается этим.

Экспериментальные способы без условий, указанных в примерах или тестовых примерах по настоящему изобретению, как правило, проводят в соответствии с обычными условиями или в соответствии с условиями, рекомендованными производителем исходных материалов или коммерческих продуктов. См. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, NY. Реагенты без указания конкретного происхождения представляют собой коммерчески доступные обычные реагенты.

Примеры

Пример 1: Конструкция и экспрессия антигенов ANGPTL3

Белок ANGPTL3 человека (Uniprot No.: Q9Y5C1), белок ANGPTL3 мыши (Uniprot No.: Q9R182), белок ANGPTL3 яванского макака (Uniprot No.: A0A2K5UDC5) и белок ANGPTL3 крысы (Uniprot No.: F7FHP0) применяли в качестве матриц ANGPTL3 по настоящему изобретению для конструирования антигенов и белков для обнаружения, связанного с настоящим изобретением. Различные метки были слиты с белками ANGPTL3, и каждый из полученных белков подвергали клонированию в вектор pTT5 (Biovector, кат. №: 102762), временной экспрессии трансфекции в клетках 293 и очистке, таким образом, получая антигены и белки для обнаружения по настоящему изобретению.

1. Полноразмерный ANGPTL3 человека: человек-ANGPTL3(17-460)-His, применяемый для иммунизации и обнаружения и имеющий следующую аминокислотную последовательность:

MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRIDQDNSSFDSLSPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKELRRTTYKLQVKNEEVKNMSLELNSKLESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTNLIQNQPETPEHPEVTSLKTFVEKQDNSIKDLLQTVEDQYKQLNQQHSQIKEIENQLRRTSIQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPAECTTIYNRGEHTSGMYAIRPSNSQVFHVYCDVISGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHLVAITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFNCPEGYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFEHHHHHHHHHH

SEQ ID NO: 1

Примечание: подчеркнутая часть представляет собой сигнальную пептидную последовательность, курсивная часть (пунктирная линия) представляет собой последовательность His, а выделенная жирным часть (неподчеркнутое) представляет собой аминокислоты положений 17-460 полноразмерного белка ANGPTL3 человека.

2. Внеклеточная область ANGPTL3 человека: ANGPTL3(17-170)-Flag-His человека, применяемая для иммунизации и обнаружения и имеющая следующую аминокислотную последовательность:

MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRIDQDNSSFDSLSPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKELRRTTYKLQVKNEEVKNMSLELNSKLESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTNLIQNQPETPEHPEVTSLKTFVEKGSSDYKDDDDKHHHHHH

SEQ ID NO: 2

Примечание: подчеркнутая часть представляет собой сигнальный пептид, дважды подчеркнутая часть представляет собой линкерный пептид, курсивная часть (пунктирная линия) представляет собой Flag и His, а выделенная жирным часть (неподчеркнутое) представляет собой аминокислоты положений 17-170 полноразмерного белка ANGPTL3 человека.

3. Слитый белок внеклеточной области ANGPTL3 человека (ANGPTL3(17-170) человека) и фрагмент IgG2aFc мыши (сокращенно mFc): ANGPTL3(17-170)-mFc человека, применяемый для обнаружения и имеющий следующую аминокислотную последовательность:

MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRIDQDNSSFDSLSPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKELRRTTYKLQVKNEEVKNMSLELNSKLESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTNLIQNQPETPEHPEVTSLKTFVEKEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK

SEQ ID NO: 3

Примечание: подчеркнутая часть представляет собой сигнальный пептид, курсивная часть (пунктирная линия) представляет собой IgG2aFc мыши, а выделенная жирным часть (неподчеркнутое) представляет собой аминокислоты положений 17-170 полноразмерного белка ANGPTL3 человека.

4. Слитый белок внеклеточной области ANGPTL3 человека (ANGPTL3(17-220) человека) и фрагмент IgG2aFc мыши: ANGPTL3(17-220)-mFc человека, который может быть применен для иммунизации и обнаружения и имеет следующую аминокислотную последовательность:

MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRIDQDNSSFDSLSPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKELRRTTYKLQVKNEEVKNMSLELNSKLESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTNLIQNQPETPEHPEVTSLKTFVEKQDNSIKDLLQTVEDQYKQLNQQHSQIKEIENQLRRTSIQEPTEISLSSKPEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK

SEQ ID NO: 4

Примечание: подчеркнутая часть представляет собой сигнальный пептид, курсивная часть (пунктирная линия) представляет собой IgG2aFc мыши, а выделенная жирным часть (неподчеркнутое) представляет собой аминокислоты положений 17-220 полноразмерного белка ANGPTL3 человека.

5. Полноразмерный ANGPTL3 мыши: ANGPTL3(17-455)-His мыши, применяемый для иммунизации и обнаружения и имеющий следующую аминокислотную последовательность:

MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRVDPDLSSFDSAPSEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLRTNEIKEEEKELRRTTSTLQVKNEEVKNMSVELNSKLESLLEEKTALQHKVRALEEQLTNLILSPAGAQEHPEVTSLKSFVEQQDNSIRELLQSVEEQYKQLSQQHMQIKEIEKQLRKTGIQEPSENSLSSKSRAPRTTPPLQLNETENTEQDDLPADCSAVYNRGEHTSGVYTIKPRNSQGFNVYCDTQSGSPWTLIQHRKDGSQDFNETWENYEKGFGRLDGEFWLGLEKIYAIVQQSNYILRLELQDWKDSKHYVEYSFHLGSHETNYTLHVAEIAGNIPGALPEHTDLMFSTWNHRAKGQLYCPESYSGGWWWNDICGENNLNGKYNKPRTKSRPERRRGIYWRPQSRKLYAIKSSKMMLQPTTHHHHHHHHHH

SEQ ID NO: 5

Примечание: подчеркнутая часть представляет собой сигнальный пептид, курсивная часть (пунктирная линия) представляет собой последовательность His, а выделенная жирным часть (неподчеркнутое) представляет собой аминокислоты положений 17-455 полноразмерного белка ANGPTL3 мыши.

6. Слитый белок внеклеточной области ANGPTL3 мыши (мышь-ANGPTL3(17-220)) и сегмента IgG2aFc мыши: ANGPTL3(17-220)-mFc мыши, применяемый для иммунизации и имеющий следующую аминокислотную последовательность:

MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRVDPDLSSFDSAPSEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLRTNEIKEEEKELRRTTSTLQVKNEEVKNMSVELNSKLESLLEEKTALQHKVRALEEQLTNLILSPAGAQEHPEVTSLKSFVEQQDNSIRELLQSVEEQYKQLSQQHMQIKEIEKQLRKTGIQEPSENSLSSKSEPRGPTIKPCPPCKCPAPNLLGGPSVFIFPPKIKDVLMISLSPIVTCVVVDVSEDDPDVQISWFVNNVEVHTAQTQTHREDYNSTLRVVSALPIQHQDWMSGKEFKCKVNNKDLPAPIERTISKPKGSVRAPQVYVLPPPEEEMTKKQVTLTCMVTDFMPEDIYVEWTNNGKTELNYKNTEPVLDSDGSYFMYSKLRVEKKNWVERNSYSCSVVHEGLHNHHTTKSFSRTPGK

SEQ ID NO: 6

Примечание: подчеркнутая часть представляет собой сигнальный пептид, курсивная часть (пунктирная линия) представляет собой IgG2aFc мыши, а выделенная жирным часть (неподчеркнутое) представляет собой аминокислоты положений 17-220 полноразмерного белка ANGPTL3 мыши.

7. Полноразмерный ANGPTL3 яванского макака: ANGPTL3(17-460)-His яванского макака, применяемый для обнаружения и имеющий следующую аминокислотную последовательность:

MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRIDQDNSSFDSVSPEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQSFYDLSLQTSEIKEEEKELRRTTYKLQVKNEEVKNMSLELNSKLESLLEEKILLQQKVKYLEEQLTNLIQNQPATPEHPEVTSLKSFVEKQDNSIKDLLQTVEEQYKQLNQQHSQIKEIENQLRMTNIQEPTEISLSSKPRAPRTTPFLQLNEIRNVKHDGIPADCTTIYNRGEHISGTYAIRPSNSQVFHVYCDVVSGSPWTLIQHRIDGSQNFNETWENYKYGFGRLDGEFWLGLEKIYSIVKQSNYVLRIELEDWKDNKHYIEYSFYLGNHETNYTLHVVKITGNVPNAIPENKDLVFSTWDHKAKGHFSCPESYSGGWWWHDECGENNLNGKYNKPRTKSKPERRRGLSWKSQNGRLYSIKSTKMLIHPTDSESFEHHHHHHHHHH

SEQ ID NO: 7

Примечание: подчеркнутая часть представляет собой сигнальный пептид, курсивная часть (пунктирная линия) представляет собой последовательность His, а выделенная жирным часть (неподчеркнутое) представляет собой аминокислоты положений 17-460 полноразмерного белка ANGPTL3 яванского макака.

8. Полноразмерный ANGPTL3 крысы: ANGPTL3(17-455)-His крысы, применяемый для обнаружения и имеющий следующую аминокислотную последовательность:

MEFGLSWLFLVAILKGVQCSRVDPDLSPFDSVPSEPKSRFAMLDDVKILANGLLQLGHGLKDFVHKTKGQINDIFQKLNIFDQCFYDLSLQTNEIKEEEKELRRTTSKLQVKNEEVKNMSLELNSKLESLLEEKMALQHRVRALEEQLTSLVQNPPGAREHPEVTSLKSFVEQQDNSIRELLQSVEEQYKQLSQQHIQIKEIENQLRKTGIQEPTENSLYSKPRAPRTTPPLHLKEAKNIEQDDLPADCSAIYNRGEHTSGVYTIRPSSSQVFNVYCDTQSGTPRTLIQHRKDGSQNFNQTWENYEKGFGRLDGEFWLGLEKIYAIVKQSNYILRLELQDWKDSKHYAEYSFHLGNHETNYTLHVAEIAANIPEALPEHRDLMFSTWDHRAKGQLYCPESYSGGWWFSDMCGENNLNGKYNKPRAKSKPERRRGISWRPRGGKLYSIKSSKMMLQPTTHHHHHHHHHH

SEQ ID NO: 8

Примечание: подчеркнутая часть представляет собой сигнальный пептид, курсивная часть (пунктирная линия) представляет собой последовательность His, а выделенная жирным часть (неподчеркнутое) представляет собой аминокислоты положений 17-455 полноразмерного белка ANGPTL3 крысы.

Пример 2: Очистка антигенных белков ANGPTL3, гибридомных антител и рекомбинантных антител

1. Очистка рекомбинантных белков с His-меткой или рекомбинантных белков с Flag-His-меткой

Образец экспрессии клеток центрифугировали при высокой скорости для удаления клеток и нерастворимых примесей, собирали супернатант и добавляли имидазол для достижения конечной концентрации 5 мМ. Никелевую колонку уравновешивали раствором PBS (Phosphate buffered saline - фосфатно-солевой буфер), содержащим 5 мМ имидазол, и промывали 2-5 объемами колонки. Затем в колонку загружали клеточный супернатант. Колонку промывали раствором PBS, содержащим 5 мМ имидазол, до тех пор, пока показания A₂₈₀ не упали до исходного уровня. Затем хроматографическую колонку промывали смесью PBS и 10 мМ имидазола для удаления неспецифически связанных примесных белков и собирали элюат. Целевой белок элюировали раствором PBS, содержащим 300 мМ имидазол, и получали пик элюирования.

Собранный элюат дополнительно очищали с помощью гель-фильтрационной колонки Superdex, а затем собирали пробирками. Полученный образец идентифицировали с помощью ДСН-ПААГ-электрофореза, пептидной карты и ЖХ-МС (жидкостной хроматографии с тандемной масс-спектрометрией), а затем отбирали аликвоты для последующего применения, если было установлено, что он правильный. Таким образом, были получены рекомбинантные белки с меткой His или рекомбинантные белки с меткой Flag-His.

2. Очистка гибридомных антител или рекомбинантных белков с меткой mFc

Образец центрифугировали при высокой скорости для удаления клеток и нерастворимых примесей, и супернатант сохраняли. Аффинную колонку с белком А уравновешивали 1 × PBS и промывали 2-5 объемами колонки. Центрифугированный образец супернатанта экспрессии клеток загружали в колонку. Колонку промывали 1 × PBS до тех пор, пока показания A₂₈₀ не упали до исходного уровня. Затем колонку промывали 1 × PBS. Целевой белок элюировали 0,1 М уксусной кислотой (рН 3,5-4,0) и собирали, а затем рН элюированного белка немедленно доводили до нейтрального значения с помощью 1 М Трис-HCl (рН 7,0), и, наконец, элюированный белок подвергали диализу или буферному обмену на буфер 1 × PBS. Образец собирали, идентифицировали с помощью электрофореза, пептидной карты и ЖХ-МС, а затем отбирали аликвоты для последующего применения, если было установлено, что он правильный. Таким образом, были получены рекомбинантные белки с меткой mFc или гибридомные антитела.

3. Очистка антител и рекомбинантных белков с Fc-меткой

Образец центрифугировали при высокой скорости для удаления клеток и нерастворимых примесей, а супернатант сохраняли. Аффинную колонку с белком G уравновешивали 1 × PBS и промывали 2-5 объемами колонки. Центрифугированный образец супернатанта экспрессии клеток загружали в колонку. Колонку промывали 1 × PBS до тех пор, пока показания A₂₈₀ не упали до исходного уровня. Затем колонку промывали 1 × PBS. Целевой белок элюировали уксусной кислотой (рН 3,0) и собирали, а затем рН элюированного белка немедленно доводили до нейтрального значения с помощью 1 М Трис-HCl (рН 7,0), и, наконец, элюированный белок подвергали диализу или буферному обмену на буфер 1 × PBS. Образец собирали, идентифицировали с помощью электрофореза, пептидной карты и ЖХ-МС, а затем отбирали аликвоты для последующего применения, если было установлено, что он правильный. Таким образом, было получено антитело или рекомбинантный белок с меткой hFc.

Пример 3: Получение антител к ANGPTL3

1. Скрининг антител к ANGPTL3, полученных от человека, с помощью фаговой библиотеки

Фаговую одноцепочечную библиотеку антител человека упаковывали и концентрировали, а затем указанную фаговую библиотеку (10¹²-10¹³/БОЕ (бляшкообразующая единица)) суспендировали в 1 мл 2 % MPBS (PBS, содержащий 2 % сухого обезжиренного молока), а затем добавляли 100 мкл стрептавидина Dynabeads® M-280 (Invitrogen, кат. № 11206D). Пробирку помещали на вращающийся планшет и неоднократно переворачивали, а затем блокировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем пробирку помещали на магнитный штатив на 2 мин, удаляли парамагнитные микрочастицы Dynabeads, а затем фаговую библиотеку переносили в новую пробирку. 2 мкг/мл меченного биотином ANGPTL3(17-460)-His человека добавляли в заблокированную фаговую библиотеку, а затем пробирку помещали на вращающийся планшет и неоднократно переворачивали в течение 1 ч. При этом 100 мкл Dynabeads суспендировали в 1 мл 2 % MPBS, а затем пробирку помещали на вращающийся планшет и неоднократно переворачивали, а затем блокировали при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем пробирку помещали на магнитный штатив на 2 мин и отбирали пипеткой блокирующий раствор. Заблокированные Dynabeads добавляли к смеси фаговой библиотеки и ANGPTL3(17-460)-His человека, и пробирку, содержащую полученную смесь, помещали на вращающийся планшет и переворачивали неоднократно в течение 15 мин. Затем пробирку помещали на магнитный штатив на 2 мин и отбирали пипеткой смешанный раствор. Промывали Dynabeads 10 раз 1 мл PBST (PBS, содержащий 0,1 % Твин-20) и добавляли 0,5 мл 1 мг/мл трипсина (Sigma, кат. № T1426-250MG). Затем пробирку помещали на вращающийся планшет и инкубировали в течение 15 мин путем неоднократного вращения, а затем проводили элюирование. Затем элюированный фаг применяли для инфицирования TG1 E. coli, который затем применяли для посева. Отдельные клоны были случайным образом отобраны для фагового ELISA.

Клоны высевали в 96-луночный планшет с глубокими лунками (Nunc кат. № 260251) и инкубировали при 37 °C в течение 16-18 ч. Небольшое количество инкубированных клонов инокулировали в другой 96-луночный планшет с глубокими лунками до достижения OD₆₀₀ примерно 0,5, а затем добавляли для упаковки фаг-помощник M13K07 (NEB, кат. № N0315S). Смесь центрифугировали при 4000 g в течение 10 мин для удаления бактерий и отбирали пипеткой культуральный раствор для обнаружения с помощью ELISA связывания ANGPTL3. Положительные штаммы клонов были криоконсервированы и отправлены в компанию по секвенированию для секвенирования. Аминокислотные последовательности, соответствующие положительным клонам P3 и P8, являются следующими:

> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи P3:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKSSGYTFTDYYLHWLRQAPGQGPEWMGWISPNSGGTSYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSDDTAVYYCARDIATLGNFFTYGMDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO: 9

> Последовательность вариабельной области легкой цепи P3:

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSSWTFGQGTKVEIK

SEQ ID NO: 10

> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи P8:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWVGLINPRDDSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTMYMELSSLRSEDTAVYFCARDLGSIREVLYYGMDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO: 11

> Последовательность вариабельной области легкой цепи P8:

DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYTYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGQGTRLEIK

SEQ ID NO: 12

Примечание: подчеркнутые части в последовательностях представляют собой последовательности CDR, определенные в соответствии с системой нумерации по Кабату, а выделенные курсивом части (неподчеркнутое) представляют собой последовательности FR.

2. Мутация антитела к ANGPTL3

На основании трехмерной структуры антитела P8, аминокислотный остаток в положении 55 (естественная последовательная нумерация) в вариабельной области тяжелой цепи P8 мутировали из D в E, а аминокислотный остаток в положении 34 (естественная последовательная нумерация) в вариабельной области легкой цепи P8 мутировали из G в V, таким образом, получая новую молекулу антитела P8B, где аминокислотная последовательность P8B выглядит следующим образом:

> Последовательность вариабельной области тяжелой цепи P8B:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWVGLINPREDSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTMYMELSSLRSEDTAVYFCARDLGSIREVLYYGMDVWGQGTTVTVSS

SEQ ID NO: 13

> Последовательность вариабельной области легкой цепи P8B:

DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNVYTYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGQGTRLEIK

SEQ ID NO: 14

Примечание: подчеркнутые части в последовательностях представляют собой последовательности CDR, определенные в соответствии с системой нумерации по Кабату, а выделенные курсивом части (неподчеркнутое) представляют собой последовательности FR.

Таблица 2. Последовательности CDR молекул антител к ANGPTL3

Молекула антитела CDR легкой цепи CDR тяжелой цепи P3 LCDR1 RASQGIRNDLG (SEQ ID NO: 15) HCDR1 DYYLH (SEQ ID NO: 18) LCDR2 AASSLQS (SEQ ID NO: 16) HCDR2 WISPNSGGTSYAQKFQG (SEQ ID NO: 19) LCDR3 QQSYSSWT (SEQ ID NO: 17) HCDR3 DIATLGNFFTYGMDV (SEQ ID NO: 20) Р8 LCDR1 RSSQSLLHSNGYTYLD (SEQ ID NO: 21) HCDR1 SYDIN (SEQ ID NO: 24) LCDR2 LGSNRAS (SEQ ID NO: 22) HCDR2 LINPRDDSTSYAQKFQG (SEQ ID NO: 25) LCDR3 MQALQTPLT (SEQ ID NO: 23) HCDR3 DLGSIREVLYYGMDV (SEQ ID NO: 26) P8B LCDR1 RSSQSLLHSNVYTYLD (SEQ ID NO: 27) HCDR1 SYDIN (SEQ ID NO: 24) LCDR2 LGSNRAS (SEQ ID NO: 22) HCDR2 LINPREDSTSYAQKFQG (SEQ ID NO: 28) LCDR3 MQALQTPLT (SEQ ID NO: 23) HCDR3 DLGSIREVLYYGMDV (SEQ ID NO: 26)

3. Конструирование и экспрессия антител к ANGPTL3

Был сконструирован праймер, а затем с помощью ПЦР сконструировали фрагмент гена VH/VK антитела и подвергли его гомологичной рекомбинации с вектором экспрессии pHr (с сигнальным пептидом и фрагментом гена константной области (CH1-FC/CL)), таким образом, конструируя вектор экспрессии VH-CH1-FC-pHr/VK-CL-pHr для полноразмерного антитела. Константная область тяжелой цепи антитела может быть выбрана из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2, IgG4 человека и их вариантов, а константная область легкой цепи может быть выбрана из группы, состоящей из константных областей легкой цепи κ- и λ-цепей человека или их вариантов. В качестве примера, выбрана константная область тяжелой цепи антитела из варианта IgG4-YTE человека, имеющая последовательность, указанную в SEQ ID NO: 29, и выбрана константная область легкой цепи из константной области κ-цепи человека, имеющая последовательность, указанную в SEQ ID NO: 30.

Последовательность константной области тяжелой цепи варианта IgG4-YTE человека:

ASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQ ID NO: 29

Последовательность константной области легкой цепи κ-цепи человека:

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 30

В качестве примера, константные области легкой/тяжелой цепи, описанные выше, вместе с вариабельными областями P3, P8 и P8B, описанными выше, образуют полные антитела к ANGPTL3: P3G, P8G и P8BG, и последовательности легкой/тяжелой цепи антител являются следующими:

> Последовательность тяжелой цепи P3G:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKSSGYTFTDYYLHWLRQAPGQGPEWMGWISPNSGGTSYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSSLRSDDTAVYYCARDIATLGNFFTYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQ ID NO: 31

> Последовательность легкой цепи P3G:

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNDLGWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSSWTFGQGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 32

> Последовательность тяжелой цепи P8G:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWVGLINPRDDSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTMYMELSSLRSEDTAVYFCARDLGSIREVLYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQ ID NO: 33

> Последовательность легкой цепи P8G:

DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYTYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 34

> Последовательность тяжелой цепи P8BG:

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYDINWVRQAPGQGLEWVGLINPREDSTSYAQKFQGRVTMTRDTSTSTMYMELSSLRSEDTAVYFCARDLGSIREVLYYGMDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLYITREPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK

SEQ ID NO: 35

> Последовательность легкой цепи P8BG:

DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNVYTYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTPLTFGQGTRLEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC

SEQ ID NO: 36

Верификация активности антител по настоящему изобретению с помощью тестовых биохимических способов

Тестовый пример 1: Анализ ELISA на связывание антител к ANGPTL3 с белками ANGPTL3

Антитело к ANGPTL3 ингибировало или препятствовало по меньшей мере одной активности белка ANGPTL3 путем связывания с белком ANGPTL3. Активность связывания антитела к ANGPTL3 с антигеном ANGPTL3 тестировали с помощью анализа ELISA. Белок ANGPTL3 (ANGPTL3(17-170)-mFc человека) иммобилизовали на 96-луночном микропланшете путем связывания с козьим антителом к IgG мыши, нанесенным на микропланшет, и активность связывания антитела с ANGPTL3 определяли в соответствии с интенсивностью сигнала после добавления антитела. Между тем, белки ANGPTL3 с меткой HIS (ANGPTL3(17-455)-His мыши, ANGPTL3(17-460)-His яванского макака и ANGPTL3(17-455)-His крысы), меченные набором для мечения биотином (Dojindo China, LK03), иммобилизовали на 96-луночном микропланшете путем связывания со стрептавидином, нанесенным на микропланшет, и определяли активность связывания антитела с ANGPTL3 в соответствии с интенсивностью сигнала после добавления антитела.

Козьи антитела к IgG мыши (Sigma, M3534-1ML) разбавляли до концентрации 2 мкг/мл буфером PBS (Shanghai BasalMedia, B320, pH 7,4), добавляли в 96-луночный микропланшет (Corning, CLS3590-100EA) при 50 мкл/лунку, а затем инкубировали в инкубаторе при 37 °C в течение 3 ч или инкубировали при 4 °C в течение ночи (16-18 ч). После того, как жидкость отбрасывали, добавляли блокирующий раствор 5 % обезжиренного молока, разбавленного PBS (BD, 232100), при 250 мкл/лунку, и инкубировали смесь в инкубаторе при 37 °C в течение 3 ч или инкубировали при 4 °C в течение ночи (16-18 ч) для блокирования. После завершения блокирования блокирующий раствор отбрасывали, а планшет промывали 3 раза буфером PBST (pH 7,4 PBS, содержащий 0,05 % Твин-20), а затем добавляли ANGPTL3(17-170)-mFc человека (с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 3), разбавленный до 0,5 мкг/мл разбавителем образца (pH 7,4 PBS, содержащим 1 % BSA (Bovine Serum Albumin - бычий сывороточный альбумин)), при 50 мкл/лунку. Смесь инкубировали в инкубаторе при 37 °C в течение 2 ч. После завершения инкубации реакционный раствор в микропланшете отбрасывали. Планшет промывали 3 раза PBST, а затем добавляли тестируемое антитело, которое разбавляли разбавителем образца до различных концентраций, при 50 мкл/лунку. Смесь инкубировали в инкубаторе при 37 °C в течение 2 ч. После завершения инкубации планшет промывали 3 раза PBST и добавляли вторичное козье антитело к человеку (Jackson Immuno Research, 109-035-003), которое разбавляли разбавителем образца, при 50 мкл/лунку. Смесь инкубировали при 37 °C в течение 1 ч. Планшет промывали 3 раза PBST, а затем добавляли хромогенный субстрат TMB (KPL, 52-00-03) при 50 мкл/лунку. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 2-5 мин, и реакцию останавливали добавлением 1 M H₂SO₄ при 50 мкл/лунку. Поглощение при 450 нм считывали с помощью считывающего устройства для микропланшетов VersaMax, и рассчитывали значение EC₅₀ связывания антитела к ANGPTL3 с антигенным белком ANGPTL3. Экспериментальные результаты приведены в таблице 3.

Стрептавидин (Sigma, S4762-5MG) разбавляли до концентрации 3 мкг/мл буфером PBS (Shanghai BasalMedia, B320, pH 7,4), добавляли в 96-луночный микропланшет (Corning, CLS3590-100EA) при 50 мкл/лунку, а затем инкубировали в инкубаторе при 37 °C в течение 3 ч или инкубировали при 4 °C в течение ночи (16-18 ч). После того, как жидкость отбрасывали, добавляли блокирующий раствор 5% обезжиренного молока, разбавленного PBS (BD, 232100), при 250 мкл/лунку, и инкубировали смесь в инкубаторе при 37 °C в течение 3 ч или инкубировали при 4 °C в течение ночи (16-18 ч) для блокирования. После завершения блокирования блокирующий раствор отбрасывали, а планшет промывали 3 раза буфером PBST (pH 7,4 PBS, содержащим 0,05 % Твин-20), и добавляли при 50 мкл/лунку меченные биотином ANGPTL3(17-455)-His мыши (с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 5), ANGPTL3(17-460)-His яванского макака (с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 7) и ANGPTL3(17-455)-His крысы (с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 8), причем каждое разбавляли до 0,5 мкг/мл разбавителем образца (pH 7,4 PBS, содержащим 1 % BSA). Смесь инкубировали в инкубаторе при 37 °C в течение 2 ч. После завершения инкубации реакционный раствор в микропланшете отбрасывали. Планшет промывали 3 раза PBST, а затем добавляли тестируемое антитело, которое разбавляли разбавителем образца до различных концентраций, при 50 мкл/лунку. Смесь инкубировали в инкубаторе при 37 °C в течение 2 ч. После завершения инкубации планшет промывали 3 раза PBST, и добавляли при 50 мкл/лунку разбавленное разбавителем образца меченное HRP (хреносодержащей пероксидазой) вторичное козье антитело к мыши, (Jackson Immuno Research, 115-035-003), вторичное козье антитело к человеку (Jackson Immuno Research, 109-035-003) или вторичное мышиное антитело к конъюгату HRP/M13 (Sino Biological, кат. № 11973-MM05-100, используемое для скрининга фагов). Смесь инкубировали при 37 °C в течение 1 ч. Планшет промывали 3 раза PBST, а затем добавляли хромогенный субстрат TMB (KPL, 52-00-03) при 50 мкл/лунку. Смесь инкубировали при комнатной температуре в течение 2-5 мин, и реакцию останавливали добавлением 1 M H₂SO₄ при 50 мкл/лунку. Поглощение при 450 нм считывали с помощью считывающего устройства для микропланшетов VersaMax, и рассчитывали значение EC₅₀ связывания антитела к ANGPTL3 с антигенным белком ANGPTL3. Экспериментальные результаты приведены в таблице 3. Результаты показывают, что антитела к ANGPTL3 по настоящему изобретению способны связываться с белками ANGPTL3 различных видов.

Таблица 3. Анализ ELISA на связывание антител к ANGPTL3 с белками ANGPTL3 разных видов

Антитела Связывание с ANGPTL3 человека EC₅₀ (нМ) Связывание с ANGPTL3 мыши EC₅₀ (нМ) Связывание с ANGPTL3 яванского макака EC₅₀ (нМ) Связывание с ANGPTL3 крысы EC₅₀ (нМ) P3G 2,480 1,631 4,555 1,441 P8G 0,361 1,732 2,528 2,115 P8BG 0,172 0,105 0,200 0,528

Тестовый пример 2: Анализ HTRF на связывание антител к ANGPTL3 с антигенными белками ANGPTL3

Анализ HTRF также применяли для обнаружения активности связывания антитела к ANGPTL3 с антигеном. ANGPTL3 с меткой HIS (ANGPTL3(17-460)-His человека, ANGPTL3(17-455)-His мыши, ANGPTL3(17-460)-His яванского макака и ANGPTL3(17-455)-His крысы), меченый набором для мечения биотином (Dojindo China, LK03), связывали с реагентом для HTRF криптатом стрептавидина-Tb (Cisbio, 610SATLA), а после добавления антитела, антитело связывали с реагентом для HTRF Pab к IgG-XL665 мыши (Cisbio, 61PAMXLA) и ангиопоэтиноподобным белком 3. Интенсивность сигнала применяли для определения активности связывания антитела с ангиопоэтин-подобным белком 3.

По 4 мкг/мл каждого меченного биотином ANGPTL3(17-460)-His человека (с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 1), ANGPTL3(17-455)-His мыши (с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 5), ANGPTL3(17-460)-His яванского макака (с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 7) и ANGPTL3(17-455)-His крысы (с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 8) получали с помощью разбавителя (рН 7,4 PBS, содержащего 1 % BSA) и добавляли в 384-луночный планшет (PerkinElmer, optiplatte-384) при 5 мкл/лунку, затем добавляли смешанный раствор реагента для HTRF криптата стрептавидина-Tb и Pab к IgG-XL665 мыши при 5 мкл/лунку, и, наконец, добавляли тестируемое антитело, которое разбавляли разбавителем образца до различных концентраций, при 10 мкл/лунку. Смесь инкубировали при 25 °C в течение 1 ч. Значения считывали с помощью PHERAstar FS (BMG LabTECH) в модуле HTRF, и рассчитывали значение EC₅₀ для связывания антитела к ANGPTL3 с ангиопоэтин-подобным белком 3. Экспериментальные результаты приведены в таблице 4. Результаты показывают, что все антитела по настоящему изобретению обладают хорошей активностью связывания в отношении антигенов ANGPTL3 человека, мыши, яванского макака, крысы и других видов.

Таблица 4. Анализ HTRF на связывание антител к ANGPTL3 с белками ANGPTL3

Антитела EC₅₀ (нМ) для связывания с белками ANGPTL3 ANGPTL3 человека ANGPTL3 мыши ANGPTL3 яванского макака ANGPTL3 крысы P3G 0,929 0,638 0,502 0,597 P8G 0,784 0,450 0,303 0,484 P8BG 0,277 0,321 0,360 0,362

Тестовый пример 3: Анализ активности для блокирования ингибирования ЛПЛ антителами к ANGPTL3

Эксперимент по обнаружению активности ферментов ЛПЛ применялся для обнаружения активности антитела к ANGPTL3 в блокировании ингибирования фермента ЛПЛ белком ANGPTL3.

ЛПЛ крупного рогатого скота (Sigma, L2254-5KU) разбавляли буфером для разведения (pH 7,4 PBS плюс 2 мг/мл BSA) до 12,5 единиц и добавляли в 96-луночный планшет (Corning, 3603) при 25 мкл/лунку, затем добавляли тестируемое антитело, которое разбавляли разбавителем образца до различных концентраций, при 25 мкл/лунку, а затем добавляли 27,6 мкг/мл белка ANGPTL3 (ANGPTL3(17-170)-Flag-His человека (с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 2), ANGPTL3(17-455)-His мыши (с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 5), ANGPTL3(17-460)-His яванского мака (с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 7) и ANGPTL3(17-455)-His крысы (с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 8) при 25 мкл/лунку. 96-луночный планшет встряхивали на шейкере для хорошего перемешивания смеси, которую затем инкубировали в инкубаторе при 37 °С в течение 30 мин. Наконец, добавляли 20 мкМ субстрата (Sigma, 30058-10MG-F), разбавленного буфером для разведения, при 25 мкл/лунку, и встряхивали на шейкере 96-луночный планшет для хорошего перемешивания смеси, которую затем инкубировали в инкубаторе при 37 °С в течение 30 мин. С помощью считывателя микропланшетов Flexstation3 считывали Ex535/Em612. Концентрации и соответствующие данные флуоресценции обрабатывали с помощью программного обеспечения Graphpad Prism 5 и рассчитывали IC₅₀. Экспериментальные результаты приведены в таблице 5. Результаты показывают, что антитела по настоящему изобретению демонстрируют хороший блокирующий эффект ингибирования в отношении фермента ЛПЛ.

Таблица 5. Результаты анализа активности антител к ANGPTL3 в блокировании ингибирования ЛПЛ с помощью различных видов ANGPTL3

Антитела IC₅₀ (нМ) ANGPTL3 человека ANGPTL3 мыши ANGPTL3 яванского макака ANGPTL3 крысы P3G 68,9 167,5 42,4 66,5 P8BG 75,3 41,5 53,6 132,2

Тестовый пример 4: Анализ Biacore антител к ANGPTL3 и белков ANGPTL3

Biacore применяли для определения аффинности тестируемых антител к ANGPTL3 для ANGPTL3 человека, обезьяны, крысы и мыши, и способ выглядит следующим образом:

Определенное количество тестируемого антитела подвергали аффинному захвату с помощью биосенсорного чипа Protein A (кат. № 29127556, GE), а затем каждый из антигенов ANGPTL3 человека, обезьяны, крысы и мыши (человек-ANGPTL3 (R&D, 3829-AN), ANGPTL3(17-455)-His мыши (с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 5), ANGPTL3(17-460)-His яванского макака (с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 7) и ANGPTL3(17-455)-His крысы (с последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 8)) в определенной концентрации пропускали через поверхность чипа. Сигналы реакции были обнаружены в реальном времени с помощью прибора Biacore T200 для получения кривых ассоциации и диссоциации. После завершения каждого цикла диссоциации биочип промывали и регенерировали с помощью раствора глицин-соляной кислоты для регенерации (кат. № BR-1003-54, GE, pH 1,5). Рабочий буфер для эксперимента представлял собой буфер 1 × HBS-EP (кат. № BR-1001-88, GE). Данные, полученные в ходе эксперименте, были сопоставлены с моделью Ленгмюра (1:1) с помощью оценочного программного обеспечения GE Biacore T200 (версия 3.0) для получения значений аффинности. Экспериментальные результаты приведены в таблице 6. Результаты показывают, что антитела к ANGPTL3 по настоящему изобретению способны связываться с антигенами ANGPTL3 человека, яванского макака, крысы и мыши с высокой аффинностью.

Таблица 6. Результаты анализа Biacore антител к ANGPTL3 и белков ANGPTL3

Антитела Анитигены Константа ассоциации (1/Мс) Константа диссоциации (1/с) Аффинность (М) P3G ANGPTL3 человека 2,56E+06 7,31E-04 2,85E-10 ANGPTL3 яванского макака 4,15E+06 8,47E-04 2,04E-10 ANGPTL3 мыши 9,81E+05 8,27E-04 8,43E-10 ANGPTL3 крысы 1,28E+06 8,20E-04 6,39E-10 P8G ANGPTL3 человека 2,20E+06 3,33E-04 1,51E-10 ANGPTL3 яванского макака 8,37E+06 4,97E-04 5,93E-11 ANGPTL3 мыши 9,70E+05 3,45E-04 3,55E-10 ANGPTL3 крысы 1,34E+06 3,35E-04 2,50E-10 P8BG ANGPTL3 человека 6,14E+06 2,76E-04 4,50E-11 ANGPTL3 яванского макака 5,18E+06 3,98E-04 7,69E-11 ANGPTL3 мыши 1,46E+06 4,20E-04 2,88E-10 ANGPTL3 крысы 1,21E+06 3,11E-04 2,57E-10

Тестовый пример 5: Оценка эффективности in vivo антител к ANGPTL3 у крыс

1. Эксперимент по снижению липидов in vivo с помощью антитела P8BG у крыс

Крысы SD для экспериментов (в возрасте 4 недель, СПФ (Свободные от патогенной микрофлоры), примерно по 100 г, самцы, приобретенные у Shanghai Slac Laboratory Animal Co., Ltd.; сертификат №: 20170005013017, SCXK (Shanghai) 2017-0005) подвергались 1 неделе адаптивного кормления в лабораторной среде (в 12/12-часовом цикле день/ночь, при температуре 23 ± 1 °С и влажности 40-50 %), и животные получали стандартный стерильный мышиный корм и имели свободный доступ к еде и воде. За 7 дней до начала эксперимента животных подвергали голоданию в течение 4 ч, а затем собирали кровь с глазной орбиты и центрифугировали при 3500 об/мин в течение 15 мин и собирали сыворотку. Концентрацию липидов в сыворотке (триглицерид) определяли с помощью химической системы ADVIA 2400 (Siemens). Крыс делили на 6 групп по уровню триглицеридов (нерелевантный изотипический белок IgG человека (hIgG, такой же ниже): группа отрицательного контроля, группа эвинакумаб 3,5 мг/кг (для структуры последовательности, см. последовательность эвинакумаба в документе WHO Drug Information, Vol. 29, No. 3, 2015), группа эвинакумаб 7 мг/кг, группа P8BG 3,5 мг/кг, группа P8BG 1,75 мг/кг и группа P8BG 7 мг/кг, по 6 крыс в каждой группе. Каждую крысу во всех группах подвергали однократному введению подкожной инъекции, а затем забору крови через 4 ч натощак на 1, 5, 9, 13 и 16 день после инъекции. Сыворотку отделяли и определяли концентрацию липидов в сыворотке (триглицеридов) с помощью химической системы ADVIA 2400 (Siemens). Экспериментальные данные были выражены как среднее ± стандартное отклонение (среднее ± SEM) и нанесены на график с применением программного обеспечения Graphpad Prism5, а для статистического анализа применяли TTEST.

Экспериментальные результаты показаны на фиг. 1 и в таблице 7. По сравнению с группой отрицательного контроля, через 1 день после введения триглицерид в каждой лечебной группе снижался, и в группах, за исключением группы эвинакумаб 3,5 мг/кг, наблюдались статистические различия. В ходе эксперимента триглицерид в группе P8BG 7 мг/кг снижался на 83,7 % максимум, триглицерид в группе P8BG 3,5 мг/кг снижался на 81,8 % максимум, а триглицерид в группе P8BG 1,75 мг/кг снижался на 68,7 % максимум; через 5 дней после введения снижение триглицерида в группе P8BG 3,5 мг/кг, группе P8BG 1,75 мг/кг и группе P8BG 7 мг/кг по-прежнему имело статистическое различие, в то время как в группе эвинакумаб 3,5 мг/кг и группе эвинакумаб 7 мг/кг статистического различия не наблюдалось; через 9 дней после введения снижение триглицерида в группе P8BG 7 мг/кг и группе P8BG 3,5 мг/кг все еще имело статистическое различие. Это указывает на то, что P8BG обладает более эффективным и пролонгированным влиянием на снижение триглицеридов, чем эвинакумаб, в той же дозе. Кроме того, во время эксперимента животные в каждой группе имели нормальную массу тела.

Таблица 7. Влияние антитела P8BG на триглицерид в сыворотке крыс

Антитела Эвинакумаб P8BG Дозировка для подкожного введения 7 мг/кг 3,5 мг/кг 7 мг/кг 3,5 мг/кг 1,75 мг/кг Начальная концентрация ТГ (триглициридов) (мг/дл) 121,5 ± 17,0 122,2 ± 17,1 120,1 ± 14,3 122,6 ± 15,6 120,9 ± 16,1 Минимальный уровень ТГ 131,1 ± 12,5 109,7 ± 16,7 27,6 ± 3,1 34,2 ± 4,7 72,6 ± 10,9 Макс. Inh % 40,7 % 13,1 % 83,7 % 81,8 % 68,7 % Примечание: Макс. Inh % относится к максимальному проценту снижения липидов относительно ТГ группы отрицательного контроля.

2. Эксперимент по снижению липидов in vivo с помощью антитела P3G у крыс

Крысы SD для экспериментов (в возрасте 4 недель, СПФ, самцы, приобретенные у Shanghai Slac Laboratory Animal Co., Ltd.; сертификат №: 20170005013017, SCXK (Shanghai) 2017-0005) подвергались 1 неделе адаптивного кормления в лабораторной среде (в 12/12-часовом цикле день/ночь, при температуре 23 ± 1 °С и влажности 40-50 %), и животные получали стандартный стерильный мышиный корм и имели свободный доступ к еде и воде. За 7 дней до начала эксперимента животных подвергали голоданию в течение 4 ч, а затем собирали кровь с глазной орбиты и центрифугировали при 3500 об/мин в течение 15 мин и собирали сыворотку. Концентрацию липидов в сыворотке (триглицеридов) определяли с помощью химической системы ADVIA 2400 (Siemens). Крыс делили на 4 группы по уровню триглицеридов (группа отрицательного контроля hIgG, группа эвинакумаб 3,5 мг/кг, группа P3G 3,5 мг/кг и группа P3G 7 мг/кг), по 6 крыс в каждой группе. Каждую крысу во всех группах подвергали однократному введению подкожной инъекции, а затем забору крови через 4 ч натощак на 1, 5 и 9, 13 день после инъекции. Сыворотку отделяли и определяли концентрацию липидов в сыворотке (триглицеридов) с помощью химической системы ADVIA 2400 (Siemens). Экспериментальные данные были выражены как среднее ± стандартное отклонение (среднее ± SEM) и нанесены на график с применением программного обеспечения Graphpad Prism5, а для статистического анализа применяли TTEST.

Экспериментальные результаты показаны на фиг. 2. По сравнению с группой отрицательного контроля hIgG, через 1 день после введения триглицерид каждой лечебной группы снижался, а степень снижения в группе P3G 3,5 мг/кг и группе P3G 7 мг/кг была выше, чем в группе эвинакумаб 3,5 мг/кг; через 9 дней после введения концентрация липидов в сыворотке в группе P3G 3,5 мг/кг и группе P3G 7 мг/кг оставалась ниже, чем в группе положительного контроля.

Тестовый пример 6: Определение влияния антител к ANGPTL3 in vivo на концентрацию липидов в плазме у мышей c57bl/6, получавших питание с высоким содержанием жиров и высоким содержанием холестерина

Мышей c57bl/6 (в возрасте 4 недель, СПФ, примерно по 16-18 г, самцов, приобретенных у Shanghai Cavens Laboratory Animal Co., Ltd.; сертификат №: 201913812, SCXK (Jiangsu) 2016-0010) подвергали 4 неделям адаптивного кормления (по 5 мышей в каждой клетке) в лабораторной среде (в 12/12-часовом цикле день/ночь, при температуре 23 ± 1 °C и влажности 40-50 %), и животных кормили нормальным кормом, и они имели свободный доступ к еде и воде. Через 5 дней после предварительного забора крови обычный корм заменяли на корм с высоким содержанием жира и высоким содержанием холестерина (D12079B, приобретенный у Jiangsu Xietong Pharmaceutical Bio-engineering Co., Ltd.) для кормления мышей до конца эксперимента. За 8 дней до начала эксперимента животных подвергали голоданию в течение 4 ч, а затем собирали кровь с глазной орбиты и центрифугировали при 8000 об/мин в течение 2 мин и собирали плазму. Концентрацию липидов в плазме определяли с помощью химической системы ADVIA 2400 (Siemens). Мышей делили на 4 группы по уровню триглицеридов (группа отрицательного контроля hIgG, группа эвинакумаб 25 мг/кг, группа P8BG 25 мг/кг и группа P8BG 5 мг/кг), по 11 мышей в каждой группе, и мышей подвергали подкожной инъекции один раз в неделю, всего 8 раз. На 2, 3, 5, 7, 9, 10 и 11 неделе после начала эксперимента мышей в каждой группе подвергали голоданию в течение 4 ч, а затем собирали кровь с глазной орбиты и собирали плазму. Концентрацию липидов в плазме (триглицерид (ТГ), общий холестерин (ОХ) и холестерин ЛПНП (Х-ЛПНП)) определяли с помощью химической системы ADVIA 2400 (Siemens). Экспериментальные данные были выражены как среднее ± стандартное отклонение (среднее ± SEM) и нанесены на график с применением программного обеспечения Graphpad Prism5, а для статистического анализа применяли TTEST.

Результаты приведены в таблицах 8-10 и на фиг. 3-5. По сравнению с группой отрицательного контроля hIgG, ТГ, ОХ и Х-ЛПНП были значительно снижены в группе P8BG 25 мг/л через 2, 3, 5 и 7 недель после начала эксперимента; группа эвинакумаб 25 мг/кг и группа P8BG 5 мг/кг показали снижение ТГ, ОХ и Х-ЛПНП через 3, 5 и 7 недель после начала эксперимента. Через 9 недель после начала эксперимента только в двух группах, группа P8BG 25 мг/кг и группа P8BG 5 мг/кг, наблюдалось значительное снижение триглицеридов по сравнению с группой отрицательного контроля hIgG. По сравнению с группой эвинакумаб 25 мг/кг, группа P8BG 25 мг/кг показала значительное снижение триглицерида и общего холестерина на 2, 3 и 9 неделе эксперимента; по сравнению с группой эвинакумаб 25 мг/кг, группа P8BG 25 мг/кг показала значительное снижение Х-ЛПНП на 2 и 9 неделе эксперимента. На протяжении всего экспериментального цикла с 1 по 11 неделю ТГ в группе эвинакумаб 25 мг/кг был снижен до минимума 40,5 ± 2,3, что на 32,60 % ниже по сравнению с начальным ТГ; и ТГ в группе P8BG 25 мг/кг был снижен до 21,1 ± 1,3, что на 64,90 % ниже по сравнению с начальным ТГ. Это указывает на то, что антитело P8BG обладает более эффективным и пролонгированным влиянием на снижение липидов, чем эвинакумаб.

Таблица 8. Влияние антитела к ANGPTL3 на ТГ в плазме у мышей c57bl/6

Антитела Эвинакумаб P8BG hIgG Дозировка для еженедельного подкожного введения 25 мг/кг 25 мг/кг 5 мг/кг 25 мг/кг Начальная ТГ (мг/дл) 60,1 ± 3,2 60,1 ± 4,1 60,1 ± 3,8 60,0 ± 6,2 Минимальный уровень ТГ 40,5 ± 2,3 21,1 ± 1,3 35,5 ± 1,7 45,1 ± 7,1 Макс. Inh % 32,6 % 64,9 % 40,9 % 24,8 % Примечание: Макс. Inh% относится к максимальному проценту снижения липидов относительно начальной ТГ.

Таблица 9. Влияние антител к ANGPTL3 на ЛПНП в плазме у мышей c57bl/6

Антитела Эвинакумаб P8BG Дозировка для еженедельного подкожного введения 25 мг/кг 25 мг/кг 5 мг/кг Макс. Inh % 28,10 % 52,10 % 42,80 % Примечание: Макс. Inh% относится к максимальному проценту снижения липидов относительно ЛПНП группы отрицательного контроля.

Таблица 10. Влияние антитела к ANGPTL3 на ТГ в плазме у мышей c57bl/6

Антитела Эвинакумаб P8BG Дозировка для еженедельного подкожного введения 25 мг/кг 25 мг/кг 5 мг/кг Макс. Inh % 27,50 % 47,90 % 36,20 % Примечание: Макс. Inh% относится к максимальному проценту снижения липидов относительно ОХ группы отрицательного контроля.

Тестовый пример 7: Определение влияния антител к ANGPTL3 in vivo на концентрацию липидов в плазме у мышей APOE

Мышей APOE (в возрасте 8 недель, СПФ, примерно по 22 г, самцы, приобретенные у Shanghai Cavens Laboratory Animal Co., Ltd.; сертификат №: 201917260, SCXK (Jiangsu) 2016-0010) подвергали 4 неделям адаптивного кормления (по 2 мыши в каждой клетке) в лабораторной среде (в 12/12-часовом цикле день/ночь, при температуре 23 ± 1 °С и влажности 40-50%), и животных кормили кормом с высоким содержанием жиров (D12108C), и они имели свободный доступ к еде и воде. За 7 дней до начала эксперимента животных подвергали голоданию в течение 4 ч, а затем собирали кровь с глазной орбиты и центрифугировали при 8000 об/мин в течение 2 мин и собирали плазму. Концентрацию липидов в плазме определяли с помощью химической системы ADVIA 2400 (Siemens). Мышей делили на 5 групп по уровню триглицеридов (группа отрицательного контроля hIgG, группа эвинакумаб 10 мг/кг, группа эвинакумаб 5 мг/кг, группа P8BG 10 мг/кг и группа P8BG 5 мг/кг), по 8 мышей в каждой группе. Каждую мышь во всех группах подвергали однократной подкожной инъекции (см. таблицу 11 для введения дозы для каждой группы), а затем подвергали сбору крови с глазной орбиты после 4 ч голодания на 1, 7 и 11 день после введения. Собирали плазму и определяли концентрации липидов (триглицеридов и холестерина ЛПВП) с помощью химической системы ADVIA 2400 (Siemens). Экспериментальные данные были выражены как среднее ± стандартное отклонение (среднее ± SEM) и нанесены на график с применением программного обеспечения Graphpad Prism5, а для статистического анализа применяли TTEST.

Экспериментальные результаты показаны на фиг. 6-7 и в таблице 11. По сравнению с группой отрицательного контроля hIgG через 1 день после введения триглицерид в каждой лечебной группе снижался. В группе эвинакумаб (10 мг/кг) триглицерид был снижен до 65,6 ± 5,4 мг/дл, что на 46,2 % ниже начального значения ТГ; в группе эвинакумаб (5 мг/кг) триглицерид был снижен до 71,8 ± 3,3 мг/дл, что на 42,1 % ниже начального значения ТГ; в группе P8BG (10 мг/кг) триглицерид был снижен до 33,3 ± 2,2 мг/дл, что на 72,9 % ниже начального значения ТГ; в группе P8BG (5 мг/кг) триглицерид был снижен до 37,0 ± 1,7 мг/дл, что на 70,2 % ниже начального значения ТГ. Кроме того, экспериментальные результаты показывают, что через 1 день после введения Х-ЛПВП в плазме в группе P8BG 10 мг/кг увеличивался, а Х-ЛПВП в плазме в группе эвинакумаб 10 мг/кг уменьшался. Однако в эксперименте по снижению липидов обычно снижение Х-ЛПВП не желательно во время снижения липидов.

Таблица 11. Влияние антител к ANGPTL3 на триглицерид в плазме у мышей APOE

Антитела Эвинакумаб P8BG hIgG Дозировка для подкожного введения 10 мг/кг 5 мг/кг 10 мг/кг 5 мг/кг 10 мг/кг Начальная ТГ (мг/дл) 122,0 ± 8,8 123,9 ± 17,1 122,8 ± 10,7 124,0 ± 20,8 120,5 ± 14,9 Минимальный уровень ТГ 65,6 ± 5,4 71,8 ± 3,3 33,3 ± 2,2 37,0 ± 1,7 146,7 ± 21,6 макс. Inh % 46,20 % 42,10 % 72,90 % 70,20 % 21,70 % Примечание: макс. Inh% относится к максимальному проценту снижения липидов по отношению к начальной ТГ.

Тестовый пример 8: Оценка фармакокинетики антител к ANGPTL3

1. Фармакокинетический эксперимент in vivo с антителами к ANGPTL3 у мышей

Мышей C57BL/6 (по 18-24 г, приобретенных у Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd.) подвергали адаптивному кормлению (не менее 3 дней) в лабораторных условиях (в 12/12-часовом цикле день/ночь, при температуре 16-26 °С и влажности 40-70 %), и они имели свободный доступ к еде и воде во время кормления. За день до начала эксперимента мышей C57BL/6 пронумеровали и случайным образом сгруппировали по 3 мыши в каждой группе. В день эксперимента мышам в группах внутривенно вводили тестируемые лекарственные средства P8BG и эвинакумаб, соответственно, вводимая доза составляла 10 мг/кг, а объем инъекции составлял 5 мл/кг.

Каждую мышь в группах для введения подвергали сбору 0,1 мл цельной крови перед введением и через 5 мин, 8 ч, 1 д, 2 д, 4 д, 7 д, 10 д, 14 д, 21 д и 28 д после введения, и помещали кровь при 4 °С в течение 30 мин без антикоагуляции, а затем центрифугировали при 1000 g в течение 15 мин. Супернатант (сыворотку) собирали, помещали в пробирку EP (эппендорф) и хранили при минус 80 °C.

Концентрацию антител в сыворотке определяли с помощью ELISA, а фармакокинетические параметры для тестируемых лекарственных средств рассчитывали с помощью программного обеспечения Winnolin. Основные полученные фармакокинетические результаты приведены в таблице 12 и на фиг. 8. Экспериментальные результаты показывают, что антитело P8BG по настоящему изобретению имеет более высокий период полувыведения у мышей, чем эвинакумаб положительного контроля.

Таблица 12. Фармакокинетика антител к ANGPTL3 у мышей

Антитела P8BG Эвинакумаб Способ введения в/в в/в Дозировка при введении (мг/кг) 10 10 t1/2 ч 131,4 ± 18,8 71,1 ± 6,1 t1/2 д 5,47 ± 0,78 2,96 ± 0,25 AUC0-∞(ч×мкг/мл) 23272 ± 2887 16904 ± 4481 Примечание: AUC0-∞: площадь под кривой зависимости концентрации лекарственного средства в плазме от времени; t1/2 (ч): период полувыведения (в часах); t1/2 (д): период полувыведения (в днях); в/в: внутривенная инъекция.

2. Оценка фармакокинетики антитела к ANGPTL3 у яванской макаки

Использовали яванских макак (по 3-4 кг, приобретенных у Guangdong Qianyan Biological Science and Technology Co., Ltd.), и перед использованием в эксперименте животных подвергали 14- дневному карантину и адаптивному кормлению. Они содержались в клетках из нержавеющей стали с не более чем 2 животными на клетку. Комнатная температура в помещении для животных контролировалась на уровне 18-26 °C, относительная влажность составляла 40-70 %, а освещение осуществлялось по циклу 12/12 день/ночь. Во время эксперимента животные имели свободный доступ к воде. 6 яванских макак были рандомизированы на 2 группы по 3 животных в группе в соответствии с биохимическими критериями. Яванским макакам в группах подкожно вводили тестируемые лекарственные средства P8BG и эвинакумаб, соответственно, вводимая доза составляла 10 мг/кг, а объем инъекции составлял 2 мл/кг.

После группирования животных подвергали голоданию в течение ночи, и каждое животное подвергали забору примерно 2 мл крови из вен нижней конечности перед введением и через 1 ч, 2 ч, 4 ч, 8 ч, 12 ч, 1 д, 3 д, 5 д, 7 д, 10 д, 14 д, 21 д, 28 д, 35 д, 42 д, 49 д и 56 д после введения. Кровь помещали в пробирку для сбора крови, содержащую сепарирующий гель, оставляли стоять при комнатной температуре в течение 30 мин, а затем центрифугировали при 1000 g в течение 15 мин. Супернатант собирали, отбирали аликвотами по 2 чистым пробиркам EP и временно хранили при минус 70 °C (завершали в течение 2 ч после сбора крови). Концентрацию антител в сыворотке определяли с помощью ELISA, а фармакокинетические параметры для тестируемых лекарственных средств рассчитывали с помощью программного обеспечения Winnolin. Основные полученные фармакокинетические результаты приведены в таблице 14 и на фиг. 9. Экспериментальные результаты показывают, что антитело P8BG по настоящему изобретению имеет более высокий период полувыведения у яванских макак, чем эвинакумаб положительного контроля.

Таблица 13. Фармакокинетика антител к ANGPTL3 у яванских макак

P8BG Эвинакумаб Дозировка при введении (мг/кг) 10 10 Способ введения п/к п/к t1/2 ч 324,7 ± 115,3 157,7 ± 28,6 t1/2 д 13,5 ± 4,8 6,6 ± 1,2 AUC0-∞ (мкг/мл×ч) 44243 ± 7404 38027 ± 252 Примечание: AUC0-∞: площадь под кривой зависимости концентрации лекарственного средства в плазме от времени; t1/2 (ч): период полувыведения (в часах); t1/2 (д): период полувыведения (в днях); п/к: подкожная инъекция.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложены антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент. Также предложены нуклеиновая кислота, кодирующая антитело к ANGPTL3 или его фрагмент, и содержащая указанную нуклеиновую кислоту клетка-хозяин для экспрессии антитела к ANGPTL3 или его антигенсвязывающего фрагмента. Кроме того, изобретение относится к применению антитела к ANGPTL3 или его антигенсвязывающего фрагмента в способе иммунологического анализа для определения ANGPTL3 и в способе лечения заболевания или расстройства, представляющего собой гиперхолестеринемию, гиперлипидемию или атеросклеротическое заболевание. Изобретение может найти дальнейшее применение в терапии. 7 н. и 8 з.п. ф-лы, 9 ил., 13 табл., 11 пр.

1. Антитело к ANGPTL3 (ангиопоэтин-подобному белку 3) или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащее вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи антитела, где:

i) вариабельная область тяжелой цепи имеет определяющие комплементарность участки тяжелой цепи (HCDR) HCDR1, HCDR2 и HCDR3, идентичные по последовательностям тем, что имеются в вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 13, и вариабельная область легкой цепи имеет определяющие комплементарность участки легкой цепи (LCDR) LCDR1, LCDR2 и LCDR3, идентичные по последовательностям тем, что имеются в вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 14;

ii) вариабельная область тяжелой цепи имеет HCDR1, HCDR2 и HCDR3, идентичные по последовательностям тем, что имеются в вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 11, и вариабельная область легкой цепи имеет LCDR1, LCDR2 и LCDR3, идентичные по последовательностям тем, что имеются в вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 12; или

iii) вариабельная область тяжелой цепи имеет HCDR1, HCDR2 и HCDR3, идентичные по последовательностям тем, что имеются в вариабельной области тяжелой цепи, указанной в SEQ ID NO: 9, и вариабельная область легкой цепи имеет LCDR1, LCDR2 и LCDR3, идентичные по последовательностям тем, что имеются в вариабельной области легкой цепи, указанной в SEQ ID NO: 10.

2. Антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где:

iv) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 28 и SEQ ID NO: 26, соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23, соответственно;

v) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26, соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и

LCDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22 и SEQ ID NO: 23, соответственно; или

vi) вариабельная область тяжелой цепи содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19 и SEQ ID NO: 20, соответственно, и вариабельная область легкой цепи содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательности, указанные в SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16 и SEQ ID NO: 17, соответственно.

3. Антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, содержащее вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, где:

(A) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, по меньшей мере на 90 % идентичную SEQ ID NO: 13, и/или вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, по меньшей мере на 90 % идентичную SEQ ID NO: 14;

(B) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, по меньшей мере на 90 % идентичную SEQ ID NO: 11, и/или вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, по меньшей мере на 90 % идентичную SEQ ID NO: 12; или

(С) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, по меньшей мере на 90 % идентичную SEQ ID NO: 9, и/или вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, по меньшей мере на 90 % идентичную SEQ ID NO: 10.

4. Антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 3, содержащее вариабельную область тяжелой цепи и вариабельную область легкой цепи, как указано ниже:

(D) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 13, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 14;

(E) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 11, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 12; или

(F) вариабельная область тяжелой цепи имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 9, и вариабельная область легкой цепи имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 10.

5. Антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где антитело к ANGPTL3 дополнительно содержит константную область тяжелой цепи и константную область легкой цепи.

6. Антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 5, где константная область тяжелой цепи выбрана из группы, состоящей из константных областей IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4 человека, и константная область легкой цепи выбрана из группы, состоящей из константных областей κ-цепи и λ-цепи человека.

7. Антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 6, где константная область тяжелой цепи имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 29, или последовательность, по меньшей мере на 85 % идентичную SEQ ID NO: 29, и/или константная область легкой цепи имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 30, или последовательность, по меньшей мере на 85 % идентичную SEQ ID NO: 30.

8. Антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где антитело к ANGPTL3 содержит тяжелую цепь и легкую цепь, где:

(G) тяжелая цепь имеет последовательность, по меньшей мере на 85 % идентичную SEQ ID NO: 35, и/или легкая цепь имеет последовательность, по меньшей мере на 85 % идентичную SEQ ID NO: 36;

(H) тяжелая цепь имеет последовательность, по меньшей мере на 85 % идентичную SEQ ID NO: 33, и/или легкая цепь имеет последовательность, по меньшей мере на 85 % идентичную SEQ ID NO: 34; или

(I) тяжелая цепь имеет последовательность, по меньшей мере на 85 % идентичную SEQ ID NO: 31, и/или легкая цепь имеет последовательность, по меньшей мере на 85 % идентичную SEQ ID NO: 32.

9. Антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1, где антитело к ANGPTL3 содержит тяжелую цепь и легкую цепь, где:

(J) тяжелая цепь указана в SEQ ID NO: 35, и легкая цепь указана в SEQ ID NO: 36;

(K) тяжелая цепь указана в SEQ ID NO: 33, и легкая цепь указана в SEQ ID NO: 34; или

(L) тяжелая цепь указана в SEQ ID NO: 31, и легкая цепь указана в SEQ ID NO: 32.

10. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9.

11. Клетка-хозяин для экспрессии антитела к ANGPTL3 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-9, содержащая молекулу нуклеиновой кислоты по п. 10.

12. Фармацевтическая композиция для лечения заболевания или расстройства, представляющего собой гиперхолестеринемию, гиперлипидемию или атеросклеротическое заболевание, содержащая:

(A) терапевтически эффективное количество антитела к ANGPTL3 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-9, и

(B) один или более фармацевтически приемлемый носитель, разбавитель, буфер или эксципиент.

13. Способ иммунологического анализа для определения ANGPTL3, включающий стадию применения антитела к ANGPTL3 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-9.

14. Набор для обнаружения уровня экспрессии ANGPTL3, включающий антитело к ANGPTL3 или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-9 и другие реагенты, применяемые для вестерн-блоттинга, иммуноблоттинга, ELISA и масс-спектрометрии.

15. Способ лечения заболевания или расстройства, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела к ANGPTL3 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп. 1-9 или фармацевтической композиции по п. 12, причем заболевание или расстройство представляет собой гиперхолестеринемию, гиперлипидемию или атеросклеротическое заболевание.