СВЯЗЫВАЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ, ВЫЗЫВАЮЩИЕ КЛЕТОЧНУЮ АКТИВАЦИЮ Российский патент 2022 года по МПК C07K16/28 C07K16/46 C12N15/63 A61K39/395 A61P35/00 

ДРУГИЕ ЗАЯВКИ, ИМЕЮЩИЕ ОТНОШЕНИЕ К ДАННОЙ ЗАЯВКЕ

[0001] Для настоящей заявки испрашивается приоритет в соответствии c предварительной патентной заявкой США №62/655762, поданной 10 апреля 2018 г.; c предварительной патентной заявкой США №62/719,484, поданной 17 августа 2018 г. Далее, Для настоящей заявки испрашивается приоритет в соответствии c предварительной патентной заявкой США 16/372172, поданной 1 апреля 2019 г., заявкой США № 16/372190, поданной 1 апреля 2019 г., и заявкой США № 16/372196, поданной 1 апреля 2019 г. Каждая из вышеупомянутых заявок полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.

СПИСКИ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

[0002] Это приложение включает в себя полностью посредством ссылки компьютерно-читаемую форму (CRF) перечня последовательностей в текстовом формате ASCII, представленного через EFS-Web. Текстовый файл списка последовательностей, представленный через EFS-Web, под названием 14489-004-228_SEQ_LISTING.txt, создан 2 апреля 2019 г. и имеет размер 140 862 байта.

ОБЛАСТЬ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

[0003] Настоящее описание в целом относится к связывающим молекулам, вызывающим клеточную активацию, способам получения связывающих молекул, композициям, содержащим связывающие молекулы, и применениям таковых.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0004] Антитела и/или агенты на основе антител в настоящее время используются в терапии широкого спектра различных заболеваний и нарушений. В настоящее время в США и/или Евросоюзе уже одобрено не менее 70 антител, причем еще большее количество новых молекул находится на стадии доклинических исследований и клинических испытаний. Однако в исследовательских и клинических сообществах постоянно ведется поиск новых, лучших и более безопасных терапевтических агентов.

[0005] Антитела, встречающееся в природе, являются моноспецифическими и связывается только с одним эпитопом или антигеном. Мультиспецифические антитела сочетают в себе специфичность нескольких антител и обладают способностью связывать разные антигены или эпитопы. Однако многие технические препятствия тормозят разработку мультиспецифических антител; вследствие чего только небольшое количество мультиспецифических антител одобрено в качестве терапевтических средств. Таким образом, до сих пор существует потребность в более совершенных мультиспецифических антителах и способах эффективного получения функциональных стабильных мультиспецифических антител.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0006] В настоящем описании представлены связывающие молекулы, вызывающие клеточную активацию, имеющие множество связывающих доменов, способы получения связывающих молекул и фармацевтические композиции, содержащие связывающие молекулы. В настоящем документе также представлены способы лечения, включающие введение связывающих молекул.

[0007] В одном аспекте в настоящем документе представлены связывающие молекулы, вызывающие клеточную активацию. В некоторых вариантах осуществления предусмотрена связывающая молекула, содержащая:

(а) первый полипептид и второй полипептид, каждый из которых содержит легкую цепь антитела,

(b) третий полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца первую вариабельную область тяжелой цепи (VH), первую константную область тяжелой цепи 1 (CH1) и вторую область VH; и

(c) четвертый полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца третью область VH, вторую область CH1, а также вариабельную область легкой цепи (VL),

где первый полипептид в сочетании с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образуют первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид в сочетании с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образуют вторую антигенсвязывающую область Fab;

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют антигенсвязывающую область Fv; и

где первая область Fab и вторая область Fab связываются с первым антигеном, а область Fv связывается со вторым антигеном, причем первый антиген отличен от второго антигена.

[0008] В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, третий полипептид дополнительно содержит константную область тяжелой цепи 3 (СН3), С-концевую по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, четвертый полипептид дополнительно содержит область СН3, С-концевую к области VL. В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат области CH3, C-концевые по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0009] В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, третий полипептид дополнительно содержит домен или сайт связывания альбумина (ABS), С-концевой по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, четвертый полипептид дополнительно содержит ABS, С-концевой по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат ABS, С-концевой по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0010] В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, третий полипептид дополнительно содержит константную область тяжелой цепи 3 (СН3) и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, четвертый полипептид дополнительно содержит участок CH3 и ABS, С-концевые по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат области CH3 и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0011] В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, третий полипептид и/или четвертый полипептид дополнительно содержат как область CH1, так и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH и/или области VL, соответственно.

[0012] В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS. В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS, С-концевой по отношению к легкой цепи антитела. В конкретных вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS на С-конце легкой цепи антитела.

[0013] В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе представлены связывающие молекулы, в которых первая область Fab и вторая область Fab связаны с областью Fv через гибкую пептидную область. В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab слиты с областью Fv.

[0014] В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область содержит шарнирный участок антитела. В некоторых вариантах осуществления шарнирный участок антитела представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина G (IgG). В некоторых вариантах осуществления шарнирный участок антитела выбран из группы, состоящей из шарнирных участков IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В некоторых вариантах осуществления шарнирный участок антитела содержит межцепочечную дисульфидную связь между третьим полипептидом и четвертым полипептидом. В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область дополнительно содержит линкер. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность GGGGS (G4S). В некоторых вариантах осуществления линкер содержит две тандемные копии аминокислотной последовательности GGGGS (G4S).

[0015] В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связываются с одним и тем же эпитопом первого антигена. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессирован на клетке иммунной системы (далее в тексте упоминается как «иммунная клетка»). В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка выбрана из группы, состоящей из лимфоцитов и моноцитов. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка представляет собой эффекторную клетку. В некоторых вариантах осуществления иммунная клетка выбрана из группы, состоящей из Т-клетки, В-клетки, дендритной клетки, гранулоцита, врожденной лимфоидной клетки (лимфоцит врожденного иммунитета), мегакариоцита, моноцита, клетки-супрессора миелоидного происхождения и естественной клетки-убийцы (NK).

[0016] В некоторых вариантах осуществления первый антиген представляет собой раковый антиген. В некоторых вариантах осуществления раковый антиген представляет собой опухоль-ассоциированный антиген (ТАА) или опухолеспецифический антиген (TSA, tumor specific antigen). В некоторых вариантах осуществления первый антиген выбран из группы, состоящей из CD19, CD20, EGFR, Her2 и PD-L1.

[0017] В некоторых вариантах осуществления второй антиген представляет собой CD3 или TNF-альфа. В некоторых вариантах осуществления первый антиген представляет собой раковый антиген, а второй антиген представляет собой CD3. В некоторых вариантах осуществления раковый антиген выбран из группы, состоящей из CD19, CD20, EGFR, Her2 и PD-L1.

[0018] В другом аспекте в данном документе представлены способы получения связывающей молекулы. В некоторых вариантах осуществления предложен способ получения связывающей молекулы, включающий:

(i) экспрессию связывающей молекулы на основе одного или более векторов в клетке-хозяине, где один или более векторов содержат

(а) первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид, где каждый из первого полипептида и второго полипептида представляет собой легкую цепь антитела,

(b) третью нуклеиновую кислоту, кодирующую третий полипептид, включающий в порядке от N-конца до C-конца первую область VH, первую область CH1 и вторую область VH; и

(c) четвертую нуклеиновую кислоту, кодирующую четвертый полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца третью область VH, вторую область CH1 и область VL,

где первый полипептид в сочетании с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида могут образовывать первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид в сочетании с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида могут образовывать вторую антигенсвязывающую область Fab; и

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют антигенсвязывающую область Fv; и

где первая область Fab и вторая область Fab связываются с первым антигеном, область Fv связывается со вторым антигеном, и где первый антиген отличается от второго антигена, и

(ii) очистку связывающей молекулы.

[0019] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, третий полипептид дополнительно содержит константную область 3 (СН3) тяжелой цепи, С-концевую по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, четвертый полипептид дополнительно содержит область СН3, С-концевую по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат области CH3, C-концевые по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0020] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, третий полипептид дополнительно содержит домен или сайт связывания альбумина (ABS), C-концевой по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления по сравнению с любым из предыдущих способов, четвертый полипептид дополнительно содержит ABS, C-концевой по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат ABS, C-концевой по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0021] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, третий полипептид дополнительно содержит константную область тяжелой цепи 3 (СН3) и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, четвертый полипептид дополнительно содержит область CH3 и ABS, C-концевые по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат области CH3 и ABS, C-концевые по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0022] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, третий полипептид и/или четвертый полипептид дополнительно содержат как область CH1, так и ABS, C-концевые по отношению ко второй области VH и/или области VL, соответственно.

[0023] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS, C-концевой по отношению к легкой цепи антитела. В конкретных вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS на С-конце легкой цепи антитела.

[0024] В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе представлены способы, в которых первая область Fab и вторая область Fab связаны с областью Fv через гибкую пептидную область, содержащую шарнирный участок антитела. В некоторых вариантах осуществления шарнирный участок антитела содержит межцепочечную дисульфидную связь, образованную между третьим полипептидом и четвертым полипептидом. В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область дополнительно содержит линкер. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность GGGGS (G4S).

[0025] В некоторых вариантах осуществления первый антиген представляет собой раковый антиген, а второй антиген представляет собой CD3. В некоторых вариантах осуществления первый антиген выбран из группы, состоящей из CD19, CD20, EGFR, Her2 и PD-L1.

[0026] В еще одном аспекте в настоящем документе представлены фармацевтические композиции, содержащие связывающую молекулу. В некоторых вариантах осуществления предложена фармацевтическая композиция, содержащая связывающую молекулу и фармацевтически приемлемый носитель, где связывающая молекула содержит:

(а) первый полипептид и второй полипептид, каждый из которых содержит легкую цепь антитела,

(b) третий полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца первую область VH, первую область CH1 и вторую область VH; и

(c) четвертый полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца третью область VH, вторую область CH1 и область VL,

где первый полипептид в сочетании с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образуют первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид в сочетании с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образуют второй участок Fab антигена;

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют антигенсвязывающую область Fv; и

где первая область Fab и вторая область Fab связываются с первым антигеном, область Fv связывается со вторым антигеном, и где первый антиген отличен от второго антигена.

[0027] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, третий полипептид дополнительно содержит константную область тяжелой цепи 3 (CH3), расположенную на С-конце второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, четвертый полипептид дополнительно содержит константную область тяжелой цепи 3 (CH3), расположенную на С-конце области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат области CH3, C-концевые по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0028] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, третий полипептид дополнительно содержит домен или сайт связывания альбумина (ABS), С-концевой по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления в отношении любого из предыдущих В фармацевтических композициях четвертый полипептид дополнительно содержит ABS, С-концевой по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат ABS, C-концевые по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0029] [0029] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, третий полипептид дополнительно содержит константную область тяжелой цепи 3 (CH3) и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, четвертый полипептид дополнительно содержит участок CH3 и ABS, С-концевые по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат области CH3 и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0030] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, третий полипептид и/или четвертый полипептид дополнительно содержат как область CH1, так и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH и/или области VL, соответственно.

[0031] В некоторых вариантах осуществления в отношении любой из предыдущих фармацевтических композиций первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS, С-концевой по отношению к легкой цепи антитела. В конкретных вариантах осуществления в отношении любой из предыдущих фармацевтических композиций первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS на С-конце легкой цепи антитела.

[0032] В еще одном аспекте в настоящем документе представлены способы лечения заболевания или состояния, включающие введение связывающей молекулы. В некоторых вариантах осуществления предложен способ лечения заболевания или состояния у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества связывающей молекулы, при этом связывающая молекула включает:

(а) первый полипептид и второй полипептид, каждый из которых содержит легкую цепь антитела,

(b) третий полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца первую область VH, первую область CH1 и вторую область VH; и

(c) четвертый полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца третью область VH, вторую область CH1 и область VL,

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образуют первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образуют второй участок Fab антигена;

где вторая область VH третьего полипептида вместе с областью VL четвертого полипептида образуют антигенсвязывающую область Fv; и

где первая область Fab и вторая область Fab связываются с первым антигеном, область Fv связывается со вторым антигеном, и первый антиген отличается от второго антигена.

[0033] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, третий полипептид дополнительно содержит константную область тяжелой цепи 3 (СН3), С-концевую по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, четвертый полипептид дополнительно содержит область СН3, С-концевую по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат области CH3, C-концевые по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0034] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, третий полипептид дополнительно содержит домен или сайт связывания альбумина (ABS), С-концевой по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления в отношении любого из предыдущих способов четвертый полипептид дополнительно содержит ABS, С-концевой по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат ABS, C-концевой по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0035] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, третий полипептид дополнительно содержит константную область тяжелой цепи 3 (СН3) и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, четвертый полипептид дополнительно содержит участок CH3 и ABS, С-концевые по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат области CH3 и ABS на С-конце по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0036] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, третий полипептид и/или четвертый полипептид дополнительно содержат как область CH1, так и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH и/или области VL, соответственно.

[0037] В некоторых вариантах осуществления по сравнению с любым из предыдущих способов первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS, С-концевой по отношению к легкой цепи антитела. В конкретных вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS на С-конце легкой цепи антитела.

[0038] В одном аспекте в настоящем документе представлены связывающиеся с клеткой связывающие молекулы. В некоторых вариантах осуществления предоставлена связывающая молекула, содержащая:

(а) первый полипептид и второй полипептид, каждый из которых содержит легкую цепь антитела,

(b) третий полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца первую вариабельную область тяжелой цепи (VH), первую константную область тяжелой цепи 1 (CH1) и вторую область VH; и

(c) четвертый полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца третью область VH и вторую область CH1, а также вариабельную область легкой цепи (VL),

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образуют первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образуют вторую антигенсвязывающую область Fab;

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют антигенсвязывающую область Fv; и

где первая область Fab и вторая область Fab связываются с лигандом Programmed Death-Ligand 1 (PD-L1), а область Fv связывается с Cluster of Differentiation 3 (CD3).

[0039] В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, третий полипептид дополнительно содержит константную область тяжелой цепи 3 (CH3), С-концевую по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, четвертый полипептид дополнительно содержит область СН3, С-концевую по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат области CH3, C-концевые по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0040] В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, третий полипептид дополнительно содержит домен или сайт связывания альбумина (ABS), С-концевой по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, четвертый полипептид дополнительно содержит ABS, С-концевой по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержит ABS, С-концевой по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0041] В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, третий полипептид и/или четвертый полипептид дополнительно содержат как область CH1, так и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH и/или области VL. соответственно.

[0042] В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, третий полипептид дополнительно содержит константную область тяжелой цепи 3 (CH3) и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, четвертый полипептид дополнительно содержит участок СН3 и ABS, С-концевые по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат области CH3 и и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0043] В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS. В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS, С-концевой по отношению к легкой цепи антитела. В конкретных вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS на С-конце легкой цепи антитела.

[0044] В некоторых вариантах осуществления представлена связывающая молекула, в которой:

(а) каждая легкая цепь антитела первого и второго полипептида содержит три области, определяющие комплементарность (CDR), и имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 10 и SEQ ID NO.: 11;

(b) в третьем полипептиде первая область VH содержит три CDR, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6 и SEQ ID NO.: 7, а вторая область VH содержит три CDR. с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; и

(c) в четвертом полипептиде третья область VH включает три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6 и SEQ ID NO.: 7, а область VL включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

[0045] В некоторых вариантах осуществления первая Fab-область и вторая Fab-область связаны с Fv-областью через гибкую пептидную область. В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab слиты с областью Fv.

[0046] В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область содержит шарнирный участок антитела. В некоторых вариантах осуществления шарнирный участок антитела представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина G (IgG). В некоторых вариантах осуществления шарнирный участок антитела выбран из группы, состоящей из шарнирных участков IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. В некоторых вариантах осуществления шарнирный участок антитела содержит межцепочечную дисульфидную связь между третьим полипептидом и четвертым полипептидом.

[0047] В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область дополнительно содержит линкер. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность GGGGS (G4S). В некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность GGGGSGGGGS. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность GGSGGGGSG.

[0048] В некоторых вариантах осуществления представлена связывающая молекула, в которой:

(а) каждая легкая цепь антитела первого и второго полипептида содержит область VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 8;

(b) в третьем полипептиде первая область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 4, а вторая область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; и

(c) в четвертом полипептиде третья область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 4, а область VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[0049] В некоторых вариантах осуществления, каждый из первого полипептида и второго полипептида содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 3; третий полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 1; а четвертый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 2.

[0050] В некоторых вариантах осуществления, каждый из первого полипептида и второго полипептида содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 95; третий полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 96; а четвертый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 97.

[0051] В некоторых вариантах осуществления, каждый из первого полипептида и второго полипептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 95; третий полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 98; а четвертый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 99.

[0052] В другом аспекте в данном документе представлены способы получения связывающей молекулы. В некоторых вариантах осуществления предложен способ получения связывающей молекулы, включающий:

(i) экспрессию связывающей молекулы на основе одного или более векторов в клетке-хозяине, где один или более векторов содержат

(а) первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид, причем каждый полипептид содержит легкую цепь антитела,

(b) третью нуклеиновую кислоту, кодирующую третий полипептид, включающий в порядке от N-конца до C-конца первую вариабельную область тяжелой цепи (VH) и первую константную область тяжелой цепи 1 (CH1) и вторую область VH; и

(c) четвертую нуклеиновую кислоту, кодирующую четвертый полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца третью область VH, вторую область CH1 и вариабельную область легкой цепи (VL),

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образуют первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образуют вторую антигенсвязывающую область Fab;

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют антигенсвязывающую область Fv; и

где первая область Fab и вторая область Fab связываются с PD-L1, а область Fv связывается с CD3, и

(ii) очистку связывающей молекулы.

[0053] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, третий полипептид дополнительно содержит константную область тяжелой 3 (CH3), расположенную на С-конце по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, четвертый полипептид дополнительно содержит область СН3, С-концевую по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат области CH3, C-концевые по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0054] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, третий полипептид дополнительно содержит домен или сайт связывания альбумина (ABS), C-концевой по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления в отношении любого из предыдущих способов четвертый полипептид дополнительно содержит ABS, С-концевой по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержит ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0055] В некоторых вариантах осуществления в отношении любого из предыдущих способов s, третий полипептид дополнительно содержит константную область тяжелой цепи 3 (CH3) и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, четвертый полипептид дополнительно содержит участок CH3 и ABS, С-концевые по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат области CH3 и ABS на С-конце по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0056] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, третий полипептид и/или четвертый полипептид дополнительно содержат как область CH1, так и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH и/или области VL, соответственно.

[0057] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS, С-концевой по отношению к легкой цепи антитела. В конкретных вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS на С-конце легкой цепи антитела.

[0058] В некоторых вариантах осуществления предложен способ, в котором:

(а) каждая легкая цепь антитела первого и второго полипептида содержит три области, определяющие комплементарность (CDR), и имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 10 и SEQ ID NO.: 11;

(b) в третьем полипептиде первая область VH содержит три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6 и SEQ ID NO.: 7, а вторая область VH содержит три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; и

(c) в четвертом полипептиде третья область VH включает три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6 и SEQ ID NO.: 7, а область VL включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

[0059] В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связаны с областью Fv через гибкую пептидную область. В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область содержит шарнирный участок антитела. В некоторых вариантах осуществления шарнирный участок антитела представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина G (IgG). В некоторых вариантах осуществления шарнирный участок антитела содержит межцепочечную дисульфидную связь между третьим полипептидом и четвертым полипептидом.

[0060] В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область дополнительно содержит линкер. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность GGGGS (G4S). В некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность GGGGSGGGGS. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность GGSGGGGSG.

[0061] В некоторых вариантах осуществления предложен способ,

где область VH каждой из первой и второй областей Fab содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;

где область VL каждой из первой и второй областей Fab содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 8;

где область VH области Fv содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; и

где область VL области Fv содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[0062] В некоторых вариантах осуществления каждый из первого полипептида и второго полипептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 3; третий полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 1; а четвертый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 2.

[0063] В еще одном аспекте в настоящем документе представлены фармацевтические композиции, содержащие связывающую молекулу. В некоторых вариантах осуществления предложена фармацевтическая композиция, содержащая связывающую молекулу и фармацевтически приемлемый носитель, где связывающая молекула содержит:

(а) первый полипептид и второй полипептид, каждый из которых содержит легкую цепь антитела,

(b) третий полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца первую вариабельную область тяжелой цепи (VH), первую константную область тяжелой цепи 1 (CH1) и вторую область VH; и

(c) четвертый полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца третью область VH и вторую область CH1, а также вариабельную область легкой цепи (VL),

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образуют первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образуют вторую антигенсвязывающую область Fab;

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют антигенсвязывающую область Fv; и

где первая область Fab и вторая область Fab связываются с PD-L1, а область Fv связывается с CD3.

[0064] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, третий полипептид дополнительно содержит константную область тяжелой цепи 3 (CH3), С-концевую по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, четвертый полипептид дополнительно содержит область СН3, С-концевую по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат области CH3, C-концевые по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0065] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, третий полипептид дополнительно содержит домен или сайт связывания альбумина (ABS), С-концевой по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, четвертый полипептид дополнительно содержит ABS, С-концевой по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержит ABS, С-концевой по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0066] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, третий полипептид дополнительно содержит константную область тяжелой цепи 3 (CH3) и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, четвертый полипептид дополнительно содержит участок CH3 и ABS, С-концевые по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат области CH3 и ABS на С-конце по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0067] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, третий полипептид и/или четвертый полипептид дополнительно содержат как область CH1, так и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH и/или области VL, соответственно.

[0068] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS, С-концевой по отношению к легкой цепи антитела. В конкретных вариантах осуществления в отношении любой из предыдущих фармацевтических композиций первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS на С-конце легкой цепи антитела.

[0069] В еще одном аспекте в настоящем документе представлены способы лечения заболевания или состояния, включающие введение связывающей молекулы. В некоторых вариантах осуществления предложен способ лечения заболевания или состояния у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества связывающей молекулы, при этом связывающая молекула включает:

(а) первый полипептид и второй полипептид, каждый из которых содержит легкую цепь антитела,

(b) третий полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца первую вариабельную область тяжелой цепи (VH), первую константную область тяжелой цепи 1 (CH1) и вторую область VH; и

(c) четвертый полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца третью область VH и вторую область CH1, а также вариабельную область легкой цепи (VL),

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образуют первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образуют вторую антигенсвязывающую область Fab;

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют антигенсвязывающую область Fv; и

где первая область Fab и вторая область Fab связываются с PD-L1, а область Fv связывается с CD3.

[0070] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, третий полипептид дополнительно содержит константную область тяжелой цепи 3 (СН3), С-концевую по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, четвертый полипептид дополнительно содержит область СН3, С-концевую по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат области CH3, C-концевые по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0071] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, третий полипептид дополнительно содержит домен или сайт связывания альбумина (ABS), С-концевой по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления в отношении любого из предыдущих способов четвертый полипептид дополнительно содержит ABS, С-концевой по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержит ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0072] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, третий полипептид дополнительно содержит константную область тяжелой цепи 3 (CH3) и ABS, С-концевые ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, четвертый полипептид дополнительно содержит участок CH3 и ABS, С-концевые по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат области CH3 и ABS на С-конце по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0073] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, третий полипептид и/или четвертый полипептид дополнительно содержат как область CH1, так и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH и/или области VL, соответственно.

[0074] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS, С-концевой по отношению к легкой цепи антитела. В конкретных вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS на С-конце легкой цепи антитела.

[0075] В одном аспекте в настоящем документе представлены связывающиеся с клеткой связывающие молекулы. В некоторых вариантах осуществления предусмотрена связывающая молекула, содержащая:

(а) первый полипептид и второй полипептид, каждый из которых содержит легкую цепь антитела,

(b) третий полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца первую вариабельную область тяжелой цепи (VH), первую константную область тяжелой цепи 1 (CH1) и вторую область VH; и

(c) четвертый полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца третью область VH, вторую область CH1, а также вариабельную область легкой цепи (VL),

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образует первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образует вторую антигенсвязывающую область Fab;

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют антигенсвязывающую область Fv; причем первая область Fab и вторая область Fab связываются с CD20 или рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), а область Fv связывается с CD3.

[0076] В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, третий полипептид дополнительно содержит константную область тяжелой цепи 3 (СН3), С-концевую по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, четвертый полипептид дополнительно содержит область СН3, С-концевую по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат области CH3, C-концевые по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0077] В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, третий полипептид дополнительно содержит домен или сайт связывания альбумина (ABS), С-концевой по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, четвертый полипептид дополнительно содержит ABS, С-концевой по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержит ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0078] В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, третий полипептид дополнительно содержит константную область тяжелой цепи 3 (СН3) и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, четвертый полипептид дополнительно содержит участок СН3 и ABS, С-концевые по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат области CH3 и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0079] В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, третий полипептид и/или четвертый полипептид дополнительно содержат как область CH1, так и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH и/или области VL, соответственно.

[0080] В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS. В некоторых вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS, С-концевые по отношению к легкой цепи антитела. В конкретных вариантах осуществления, относительно любой из предыдущих связывающих молекул, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS на С-конце легкой цепи антитела.

[0081] В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связываются с CD20, и

(а) каждая легкая цепь антитела первого и второго полипептида содержит три определяющих комплементарность области (CDR), имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 31, SEQ ID NO.: 32 и SEQ ID NO.: 33;

(b) в третьем полипептиде первая область VH содержит три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 27, SEQ ID NO.: 28 и SEQ ID NO.: 29, а вторая область VH содержит три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; и

(c) в четвертом полипептиде третья область VH включает три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 27, SEQ ID NO.: 28 и SEQ ID NO.: 29, а область VL включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

[0082] В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связаны с областью Fv через гибкую пептидную область. В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область содержит шарнирный участок антитела. В некоторых вариантах осуществления шарнирный участок антитела содержит межцепочечную дисульфидную связь между третьим полипептидом и четвертым полипептидом. В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область дополнительно содержит линкер.

[0083] В некоторых вариантах осуществления предусмотрена связывающая молекула, в которой:

(а) каждая легкая цепь антитела первого и второго полипептида содержит область VL, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 30;

(b) в третьем полипептиде первая область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 26, а вторая область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; и

(c) в четвертом полипептиде третья область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 26, а область VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[0084] В некоторых вариантах осуществления каждый из первого полипептида и второго полипептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 25; третий полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 23; а четвертый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 24.

[0085] В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связываются с EGFR, и

(а) каждая легкая цепь антитела первого и второго полипептида содержит три CDR, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 45, SEQ ID NO.: 46 и SEQ ID NO.: 47;

(b) в третьем полипептиде первая область VH содержит три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 41, SEQ ID NO.: 42 и SEQ ID NO.: 43, а вторая область VH включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; и

(c) в четвертом полипептиде третья область VH включает три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 41, SEQ ID NO.: 42 и SEQ ID NO.: 43, а область VL включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

[0086] В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связаны с областью Fv через гибкую пептидную область. В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область содержит шарнирный участок антитела. В некоторых вариантах осуществления шарнирный участок антитела содержит межцепочечную дисульфидную связь между третьим полипептидом и четвертым полипептидом. В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область дополнительно содержит линкер.

[0087] В некоторых вариантах осуществления предоставлена связывающая молекула, в которой:

(а) каждая легкая цепь антитела первого и второго полипептида содержит область VL, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 44;

(b) в третьем полипептиде первая область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 40, а вторая область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; и

(c) в четвертом полипептиде третья область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 40, а область VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[0088] В некоторых вариантах осуществления, каждый из первого полипептида и второго полипептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 39; третий полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 37; а четвертый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 38.

[0089] В другом аспекте в настоящем документе представлены способы получения связывающей молекулы. В некоторых вариантах осуществления предложен способ получения связывающей молекулы, включающий:

(i) экспрессию связывающей молекулы из одного или более векторов в клетке-хозяине, где один или более векторов содержат

(а) первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид, где каждый из первого полипептида и второго полипептида представляет собой легкую цепь антитела,

(b) третью нуклеиновую кислоту, кодирующую третий полипептид, включающий в порядке от N-конца до C-конца первую область VH, первую область CH1 и вторую область VH; и

(c) четвертую нуклеиновую кислоту, кодирующую четвертый полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца третью область VH, вторую область CH1 и область VL,

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образуют первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образуют вторую антигенсвязывающую область Fab;

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют антигенсвязывающую область Fv; и

где первая область Fab и вторая область Fab связываются с CD20 или EGFR, а область Fv связывается с CD3, и

(ii) очистку связывающей молекулы.

[0090] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, третий полипептид дополнительно содержит константную область тяжелой цепи 3 (CH3), С-концевую по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, четвертый полипептид дополнительно содержит область СН3, С-концевую по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат области CH3, C-концевые по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0091] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, третий полипептид дополнительно содержит домен или сайт связывания альбумина (ABS), С-концевой по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления в отношении любого из предыдущих способов четвертый полипептид дополнительно содержит ABS, С-концевой по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержит ABS, С-концевой по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0092] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, третий полипептид дополнительно содержит константную область тяжелой цепи 3 (CH3) и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, четвертый полипептид дополнительно содержит участок CH3 и ABS, С-концевые по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат области CH3 и ABS на С-конце по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[0093] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, третий полипептид и/или четвертый полипептид дополнительно содержат как область CH1, так и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH и/или области VL, соответственно.

[0094] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS, С-концевые по отношению к легкой цепи антитела. В конкретных вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS на С-конце легкой цепи антитела.

[0095] В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связываются с CD20, и

(а) каждая легкая цепь антитела первого и второго полипептида содержит три области, определяющие комплементарность (CDR), и имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 31, SEQ ID NO.: 32 и SEQ ID NO.: 33;

(b) в третьем полипептиде первая область VH содержит три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 27, SEQ ID NO.: 28 и SEQ ID NO.: 29, а вторая область VH содержит три CDR. имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; и

(c) в четвертом полипептиде третья область VH включает три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 27, SEQ ID NO.: 28 и SEQ ID NO.: 29, а область VL включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

[0096] В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связаны с областью Fv через гибкую пептидную область. В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область содержит шарнирный участок антитела. В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область дополнительно содержит линкер.

[0097] В некоторых вариантах осуществления предложен способ, в котором:

(а) каждая легкая цепь антитела первого и второго полипептида содержит область VL, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 30;

(b) в третьем полипептиде первая область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 26, а вторая область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; и

(c) в четвертом полипептиде третья область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 26, а область VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[0098] В некоторых вариантах осуществления каждый из первого полипептида и второго полипептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 25; третий полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 23; а четвертый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 24.

[0099] В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связываются с CD20 и

(а) каждая легкая цепь антитела первого и второго полипептида содержит три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 45, SEQ ID NO.: 46 и SEQ ID NO.: 47;

(b) в третьем полипептиде первая область VH содержит три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 41, SEQ ID NO.: 42 и SEQ ID NO.: 43, а вторая область VH включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; и

(c) в четвертом полипептиде третья область VH включает три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 41, SEQ ID NO.: 42 и SEQ ID NO.: 43, а область VL включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

[00100] В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связаны с областью Fv через гибкую пептидную область. В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область содержит шарнирный участок антитела. В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область дополнительно содержит линкер.

[00101] В некоторых вариантах осуществления предоставляется способ, в котором:

(а) каждая легкая цепь антитела первого и второго полипептида содержит область VL, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 44;

(b) в третьем полипептиде первая область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 40, а вторая область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; и

(c) в четвертом полипептиде третья область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 40, а область VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[00102] В некоторых вариантах осуществления, каждый из первого полипептида и второго полипептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 39; третий полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 37; а четвертый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 38.

[00103] Еще в одном аспекте в настоящем документе представлены фармацевтические композиции, содержащие связывающую молекулу. В некоторых вариантах осуществления предложена фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество связывающей молекулы и фармацевтически приемлемый носитель, где связывающая молекула включает:

(а) первый полипептид и второй полипептид, каждый из которых содержит легкую цепь антитела,

(b) третий полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца первую вариабельную область тяжелой цепи (VH), первую константную область тяжелой цепи 1 (CH1) и вторую область VH; и

(c) четвертый полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца третью область VH, вторую область CH1, а также вариабельную область легкой цепи (VL),

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образуют первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид и третья область VH и вторая область CH1 четвертого полипептида образуют вторую антигенсвязывающую область Fab;

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют антигенсвязывающую область Fv; и

где первая область Fab и вторая область Fab связываются с CD20 или EGFR, а область Fv связывается с CD3.

[00104] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, третий полипептид дополнительно содержит константную область тяжелой 3 (СН3), С-концевую по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, четвертый полипептид дополнительно содержит область СН3, С-концевую по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат области CH3, C-концевые по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[00105] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, третий полипептид дополнительно содержит домен или сайт связывания альбумина (ABS), С-концевой по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, четвертый полипептид дополнительно содержит ABS, С-концевой по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержит ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[00106] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, третий полипептид дополнительно содержит константную область тяжелой цепи 3 (CH3) и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, четвертый полипептид дополнительно содержит участок CH3 и ABS, С-концевые по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат области CH3 и ABS, C-концевые по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[00107] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, третий полипептид и/или четвертый полипептид дополнительно содержат как область CH1, так и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH и/или области VL, соответственно.

[00108] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любой из предыдущих фармацевтических композиций, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS, С-концевой по отношению к легкой цепи антитела. В конкретных вариантах осуществления в отношении любой из предыдущих фармацевтических композиций первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS на С-конце легкой цепи антитела.

[00109] В еще одном аспекте в настоящем документе представлены способы лечения заболевания или состояния, включающие введение связывающей молекулы. В некоторых вариантах осуществления предложен способ лечения заболевания или состояния у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества связывающей молекулы, при этом связывающая молекула включает:

(а) первый полипептид и второй полипептид, каждый из которых содержит легкую цепь антитела,

(b) третий полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца первую вариабельную область тяжелой цепи (VH), первую константную область тяжелой цепи 1 (CH1) и вторую область VH; и

(c) четвертый полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца третью область VH, вторую область CH1, а также вариабельную область легкой цепи (VL),

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образуют первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образуют вторую антигенсвязывающую область Fab;

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют антигенсвязывающую область Fv; и

где первая область Fab и вторая область Fab связываются с CD20 или EGFR, а область Fv связывается с CD3.

[00110] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, третий полипептид дополнительно содержит константную область тяжелой цепи 3 (СН3), С-концевую по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, четвертый полипептид дополнительно содержит область СН3, С-концевую по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат области CH3, C-концевые по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[00111] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, третий полипептид дополнительно содержит домен или сайт связывания альбумина (ABS), С-концевой по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления в отношении любого из предыдущих способов четвертый полипептид дополнительно содержит ABS, С-концевой по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержит ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[00112] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, третий полипептид дополнительно содержит константную область тяжелой цепи 3 (CH3) и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, четвертый полипептид дополнительно содержит область CH3 и ABS, С-концевые по отношению к области VL. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, как третий, так и четвертый полипептиды дополнительно содержат области CH3 и ABS на С-конце по отношению ко второй области VH и области VL, соответственно.

[00113] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, третий полипептид и/или четвертый полипептид дополнительно содержат как область CH1, так и ABS, С-концевые по отношению ко второй области VH и/или области VL, соответственно.

[00114] В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS. В некоторых вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS, С-концевой по отношению к легкой цепи антитела. В конкретных вариантах осуществления, по сравнению с любым из предыдущих способов, первый и/или второй полипептиды дополнительно содержат ABS на С-конце легкой цепи антитела.

[00115] В настоящем раскрытии частично представлены связывающиеся с клеткой связывающие молекулы, имеющие несколько связывающих доменов. В одном аспекте в настоящем документе предоставлена связывающая молекула, содержащая:

(а) первый антигенсвязывающий домен, содержащий две Fab-области антитела, каждая из которых содержит:

(i) первую часть, содержащую вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH) и область CH1 антитела, при этом первая часть не содержит области CH2 антитела и области CH3 антитела; и

(ii) вторую часть, содержащую легкую цепь (LC) антитела, содержащую вариабельную область легкой цепи (VL) антитела и константную область легкой цепи (CL) антитела,

где каждая из двух Fab-областей антитела связывается с антигеном, и

(b) второй антигенсвязывающий домен, содержащий Fv-область антитела, содержащую VH-область и вариабельную область (VL) легкой цепи антитела,

где второй антигенсвязывающий домен связывается с антигеном, присутствующим на иммунной клетке; и

где первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домены взаимосвязаны.

[00116] В некоторых вариантах осуществления первая часть и вторая часть каждой Fab-области первого антигенсвязывающего домена находятся на одном и том же полипептиде. В некоторых вариантах осуществления по меньшей мере одна Fab-область ориентирована от N-конца к C-концу в следующем порядке: VH-CH1-VL-CL. В других вариантах осуществления по меньшей мере одна область Fab ориентирована от N-конца к C-концу в следующем порядке: VL-CL-VH-CH1.

[00117] В некоторых вариантах осуществления первая часть и вторая часть каждой Fab-области присутствуют на отдельных полипептидах.

[00118] В некоторых вариантах осуществления область VH и область VL области Fv находятся на одном полипептиде. В некоторых вариантах осуществления область Fv ориентирована от N-конца к C-концу в следующем порядке: VH-VL. В других вариантах осуществления область Fv ориентирована от N-конца к C-концу в следующем порядке: VL-VH.

[00119] В некоторых вариантах осуществления область VH и область VL области Fv находятся на разных полипептидах.

[00120] В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен связаны гибкой пептидной областью. В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область содержит шарнирный участок антитела. В некоторых конкретных вариантах осуществления шарнирный участок антитела представляет собой шарнирный участок IgG. В некоторых более конкретных вариантах осуществления шарнирный участок IgG относится к подтипу IgG1. В других более конкретных вариантах осуществления шарнирный участок IgG относится к подтипу IgG2. Еще в других более конкретных вариантах осуществления шарнирный участок IgG относится к подтипу IgG3. В еще других более конкретных вариантах осуществления шарнирный участок IgG относится к подтипу IgG4.

[00121] В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область содержит дополнительные аминокислоты. Например, в некоторых вариантах гибкая пептидная область дополнительно содержит линкер между шарнирной областью антитела и вторым антигенсвязывающим доменом. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность GGGGS (G4S).

[00122] В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен дополнительно содержит первую область CH3, связанную с областью VH области Fv, и вторую область CH3, связанную с областью VL области Fv.

[00123] В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула дополнительно содержит один или более связывающих доменов или сайтов альбумина (ABS). В некоторых вариантах осуществления ABS связан с С-концом области VH области Fv. В других вариантах осуществления ABS связан с С-концом области VL области Fv. В других вариантах осуществления C-конец каждой из областей VL и VH области Fv связан с ABS. В других вариантах осуществления ABS связан с областью CL по меньшей мере одной из областей Fab. Также в других вариантах осуществления связывающая молекула дополнительно содержит один или более доменов альбумина.

[00124] В некоторых вариантах осуществления две области Fab связываются с разными антигенами. В других вариантах осуществления две области Fab связываются с одним и тем же антигеном. В некоторых вариантах осуществления две области Fab связываются с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена. В других вариантах осуществления две области Fab связываются с разными эпитопами одного и того же антигена.

[00125] В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен связываются с одним и тем же антигеном. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен связывается с тем же эпитопом, который представляет собой, по меньшей мере, один из эпитопов, связанных первым антигенсвязывающим доменом.

[00126] В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен связываются с разными антигенами, при этом первый антигенсвязывающий домен связывается с первым антигеном, а второй антигенсвязывающий домен связывается со вторым антигеном.

[00127] В некоторых вариантах осуществления первый антиген представляет собой раковый антиген. В других вариантах осуществления первый антиген не является раковым антигеном.

[00128] В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на иммунных клетках, включая лимфоциты и моноциты. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на В-клетке. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на дендритной клетке. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на гранулоците. Также в других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на врожденной лимфоидной клетке. Также в других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на мегакариоците. Также в других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на моноците. Еще в других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на клетке-супрессоре миелоидного происхождения. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на NK-клетке.

[00129] В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на эффекторной клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на Т-хелперной клетке, регуляторной Т-клетке или цитотоксической Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на Т-хелперной клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на регуляторной Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на цитотоксической Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на CD8+ Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на CD4+ Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген содержит внеклеточный домен.

[00130] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab содержит одинаковые аминокислотные последовательности CDR. В других вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab содержит разные аминокислотные последовательности CDR.

[00131] В некоторых вариантах осуществления VL-область второй части каждой Fab-области содержит одинаковые аминокислотные последовательности CDR. В других вариантах осуществления область VL второй части каждой области Fab содержит различные аминокислотные последовательности CDR. В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab содержит одинаковые аминокислотные последовательности CDR, а область VL второй части каждой Fab-области содержит одинаковые аминокислотные последовательности CDR. В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab включает одинаковые аминокислотные последовательности CDR, а область VL второй части каждой области Fab содержит разные аминокислотные последовательности CDR. В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab включает разные аминокислотные последовательности CDR, а область VL второй части каждой области Fab содержит одинаковые аминокислотные последовательности CDR. В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab включает разные аминокислотные последовательности CDR, а область VL второй части каждой области Fab содержит разные аминокислотные последовательности CDR.

[00132] В некоторых конкретных вариантах осуществления второй антиген представляет собой CD3. В некоторых вариантах осуществления первый антиген представляет собой раковый антиген, а второй антиген представляет собой CD3.

[00133] В некоторых более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой PD-L1, а второй антиген представляет собой CD3.

[00134] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab содержит три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6 и SEQ ID NO.: 7; область VL второй части каждой области Fab включает три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 10 и SEQ ID NO.: 11; область VH области Fv содержит три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14, SEQ ID NO.: 15; и область VL области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

[00135] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 8; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; и область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[00136] В других более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой CD20, а второй антиген представляет собой CD3.

[00137] В некоторых вариантах осуществления, область VH первой части каждой области Fab включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 27, SEQ ID NO.: 28, SEQ ID NO.: 29; область VL второй части каждой области Fab содержит три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 31, SEQ ID NO.: 32 и SEQ ID NO.: 33; область VH области Fv содержит три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14, SEQ ID NO.: 15; а область VL области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

[00138] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 26; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 30; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; и область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[00139] В других более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой EGFR, а второй антиген представляет собой CD3.

[00140] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 41, SEQ ID NO.: 42 и SEQ ID NO.: 43; область VL второй части каждой области Fab содержит три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 45, SEQ ID NO.: 46 и SEQ ID NO.: 47; область VH области Fv включает три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15, а область VL области Fv включает три CDR, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

[00141] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 40; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 44; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; а область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[00142] В других более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой Her2, а второй антиген представляет собой TNF альфа. В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 51; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 52; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 53; а область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 54.

[00143] В другом аспекте в настоящем документе предусмотрена связывающая молекула, содержащая:

(а) первый полипептид и второй полипептид, каждый из которых содержит легкую цепь антитела,

(b) третий полипептид, содержащий первую область VH, первую область CH1 и вторую область VH; и

(c) четвертый полипептид, содержащий третью область VH и вторую область CH1, и область VL,

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образуют первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образуют второй участок Fab антигена; и

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют антигенсвязывающую область Fv.

[00144] В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связаны с областью Fv через гибкую пептидную область. В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область содержит шарнирный участок антитела. В некоторых конкретных вариантах осуществления шарнирный участок антитела представляет собой шарнирный участок IgG. В некоторых более конкретных вариантах осуществления шарнирный участок IgG относится к подтипу IgG1. В других более конкретных вариантах осуществления шарнирный участок IgG относится к подтипу IgG2. Еще в других более конкретных вариантах осуществления шарнирный участок IgG относится к подтипу IgG3. В еще других более конкретных вариантах осуществления шарнирный участок IgG относится к подтипу IgG4. В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область дополнительно содержит линкер между шарнирной областью антитела и вторым антигенсвязывающим доменом. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность GGGGS (G4S).

[00145] В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связываются с разными антигенами. В других вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связываются с одним и тем же антигеном. В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связываются с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена. В других вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связываются с разными эпитопами одного и того же антигена.

[00146] В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab образуют первый антигенсвязывающий домен, а область Fv образует второй антигенсвязывающий домен.

[00147] В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен связываются с одним и тем же антигеном. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен связывается с тем же эпитопом, который, по меньшей мере, является один из эпитопов, связанных первым антигенсвязывающим доменом.

[00148] В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен связываются с разными антигенами, где первый антигенсвязывающий домен связывается с первым антигеном, а второй антигенсвязывающий домен связывается со вторым антигеном.

[00149] В некоторых вариантах осуществления первый антиген представляет собой раковый антиген. В других вариантах осуществления первый антиген не является раковым антигеном.

[00150] В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на иммунных клетках, включая лимфоциты и моноциты. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на В-клетке. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на дендритной клетке. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на гранулоците. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на врожденной лимфоидной клетке. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на мегакариоците. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на моноците. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на клетке-супрессоре миелоидного происхождения. Еще в других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на NK-клетке.

[00151] В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на эффекторной клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на Т-хелперной клетке, регуляторной Т-клетке или цитотоксической Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на Т-хелперной клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на регуляторной Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на цитотоксической Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на CD8+ Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на CD4+ Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген включает внеклеточный домен.

[00152] В некоторых конкретных вариантах осуществления второй антиген представляет собой CD3. В некоторых вариантах осуществления первый антиген представляет собой раковый антиген, а второй антиген представляет собой CD3.

[00153] В некоторых более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой PD-L1, а второй антиген представляет собой CD3.

[00154] В некоторых вариантах осуществления, область VH первой части каждой области Fab включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6 и SEQ ID NO.: 7; область VL второй части каждой области Fab включает три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 10 и SEQ ID NO.: 11; область VH области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; и область VL области Fv содержит три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 16, SEQ ID NO.: 17 и SEQ ID NO.: 19.

[00155] В некоторых вариантах осуществления, область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 4; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 8; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; а область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[00156] В некоторых вариантах осуществления каждый из первого полипептида и второго полипептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 3; третий полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1; а четвертый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.:2.

[00157] В других более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой CD20, а второй антиген представляет собой CD3.

[00158] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 27, SEQ ID NO.: 28 и SEQ ID NO.: 29; область VL второй части каждой области Fab содержит три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 31, SEQ ID NO.: 32 и SEQ ID NO.: 33; область VH области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; и область VL области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

[00159] В некоторых вариантах осуществления изобретения область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 26; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 30; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; а область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[00160] В некоторых вариантах осуществления, каждый из первого полипептида и второго полипептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 25; третий полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 23; а четвертый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 24.

[00161] В других более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой EGFR, а второй антиген представляет собой CD3.

[00162] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 41, SEQ ID NO.: 42, SEQ ID NO.: 43; область VL второй части каждой области Fab включает три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 45, SEQ ID NO.: 46 и SEQ ID NO.: 47; область VH области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; а область VL области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

[00163] В некоторых вариантах осуществления, область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 40; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 44; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; а область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[00164] В некоторых вариантах осуществления, каждый из первого полипептида и второго полипептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 39; третий полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 37; а четвертый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 38.

[00165] В других более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой Her2, а второй антиген представляет собой TNF альфа. В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 51; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 52; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 53; а область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 54.

[00166] В еще одном аспекте в настоящем документе представлены способы получения связывающих молекул, представленные в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе предусмотрен способ получения связывающей молекулы, включающий трансфекцию клетки-хозяина одним или более векторами, при этом один или более векторов содержат:

(а) первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид и второй полипептид, каждый из которых представляет собой легкую цепь антитела,

(b) вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую третий полипептид, содержащий первую область VH, первую область CH1 и вторую область VH; и

(c) третью нуклеиновую кислоту, кодирующую четвертый полипептид, содержащий третью область VH, вторую область CH1 и область VL,

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида могут образовывать первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида могут образовывать вторую антигенсвязывающую область Fab; и

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида могут образовывать антигенсвязывающую область Fv.

[00167] В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связаны с областью Fv через гибкую пептидную область. В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область содержит шарнирный участок антитела. В некоторых конкретных вариантах осуществления шарнирный участок антитела представляет собой шарнирный участок IgG. В некоторых более конкретных вариантах осуществления шарнирный участок IgG относится к подтипу IgG1. В других более конкретных вариантах осуществления шарнирный участок IgG относится к подтипу IgG2. В других более конкретных вариантах осуществления шарнирный участок IgG относится к подтипу IgG3. В других более конкретных вариантах осуществления шарнирный участок IgG относится к подтипу IgG4. В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область дополнительно содержит линкер между шарнирным участком антитела и вторым антигенсвязывающим доменом. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность GGGGS (G4S).

[00168] В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связываются с разными антигенами. В других вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связываются с одним и тем же антигеном. В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связываются с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена. В других вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связываются с разными эпитопами одного и того же антигена.

[00169] В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab образуют первый антигенсвязывающий домен, а область Fv образует второй антигенсвязывающий домен.

[00170] В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен связываются с одним и тем же антигеном. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен связывается с тем же эпитопом, который является, по меньшей мере, одним из эпитопов, связанных первым антигенсвязывающим доменом.

[00171] В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен связываются с разными антигенами, причем где первый антигенсвязывающий домен связывается с первым антигеном, а второй антигенсвязывающий домен связывается со вторым антигеном.

[00172] В некоторых вариантах осуществления первый антиген представляет собой раковый антиген. В других вариантах осуществления первый антиген не является раковым антигеном.

[00173] В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на иммунных клетках, включая лимфоциты и моноциты. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на В-клетке. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на дендритной клетке. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на гранулоците. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на врожденной лимфоидной клетке. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на мегакариоците. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на моноците. Еще в других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на клетке-супрессоре миелоидного происхождения. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на NK-клетке.

[00174] В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на эффекторной клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на Т-хелперной клетке, регуляторной Т-клетке или цитотоксической Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на Т-хелперной клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на регуляторной Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на цитотоксической Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на CD8+ Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на CD4+ Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген включает внеклеточный домен.

[00175] В некоторых конкретных вариантах осуществления второй антиген представляет собой CD3. В некоторых вариантах осуществления первый антиген представляет собой раковый антиген, а второй антиген представляет собой CD3.

[00176] В некоторых более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой PD-L1, а второй антиген представляет собой CD3.

[00177] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6 и SEQ ID NO.: 7; область VL второй части каждой области Fab включает три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 10 и SEQ ID NO.: 11; область VH области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; а область VL области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

[00178] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 4; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 8; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; и область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[00179] В некоторых вариантах осуществления каждый из первого полипептида и второго полипептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 3; третий полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 1; а четвертый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 2.

[00180] В некоторых вариантах осуществления первая нуклеиновая кислота имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO.: 22; вторая нуклеиновая кислота имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO.: 20; а третья нуклеиновая кислота имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO.:21.

[00181] В других более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой CD20, а второй антиген представляет собой CD3.

[00182] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab содержит три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 27, SEQ ID NO.: 28, SEQ ID NO.: 29; область VL второй части каждой области Fab содержит три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 31, SEQ ID NO.: 32 и SEQ ID NO.: 33; область VH области Fv содержит три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; а область VL области Fv содержит три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

[00183] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 26; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 30; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; а область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[00184] В некоторых вариантах осуществления, каждый из первого полипептида и второго полипептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 25; третий полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 23; а четвертый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 24.

[00185] В некоторых вариантах осуществления первая нуклеиновая кислота имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO.: 36; вторая нуклеиновая кислота имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO.: 34; а третья нуклеиновая кислота имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO.: 35.

[00186] В других более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой EGFR, а второй антиген представляет собой CD3.

[00187] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 41, SEQ ID NO.: 42 и SEQ ID NO.: 43; область VL второй части каждой области Fab включает три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 45, SEQ ID NO.: 46 и SEQ ID NO.: 47; область VH области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; а область VL области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

[00188] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 40; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 44; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; а область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[00189] В некоторых вариантах осуществления, каждый из первого полипептида и второго полипептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 39; третий полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 37; а четвертый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 38.

[00190] В некоторых вариантах осуществления первая нуклеиновая кислота имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO.: 50; вторая нуклеиновая кислота имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 48; а третья нуклеиновая кислота имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO.: 49.

[00191] В других более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой Her2, а второй антиген представляет собой TNF альфа. В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 51; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 52; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 53; а область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 54.

[00192] В еще одном аспекте в настоящем документе предоставляется фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество связывающей молекулы, представленной в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция предназначена для лечения заболевания или состояния у субъекта. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой рак. В других вариантах осуществления рак представляет собой рак легких. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой немелкоклеточную карциному легкого (NSCLC). В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой диффузную крупноклеточную B-лимфому (DLBCL). В других вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой рак, положительный по PD-L1.

[00193] В еще одном аспекте в настоящем документе предоставляется способ лечения заболевания или состояния у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества связывающей молекулы, представленной в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой рак. В других вариантах осуществления рак представляет собой рак легких. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой немелкоклеточную карциному легкого (NSCLC). В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой диффузную крупноклеточную B-лимфому (DLBCL). В других вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой рак, положительный по PD-L1.

[00194] В тех случаях, когда аспекты или варианты осуществления раскрытия описаны в терминах структуры Маркуша или другой группы альтернативных структур, настоящее раскрытие охватывает не только всю группу, перечисленную в целом, но также каждого члена группы в отдельности и все возможные подгруппы основной группы, а также в основную группу, если в ней отсутствует один или более членов группы. Настоящее раскрытие также предусматривает явное исключение одного или более членов группы в заявленном раскрытии.

[00195] ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ДЛЯ ИЛЛЮСТРАЦИИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Связывающая молекула, содержащая:

(а) первый полипептид и второй полипептид, каждый из которых содержит легкую цепь антитела,

(b) третий полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца первую вариабельную область тяжелой цепи (VH), первую константную область тяжелой цепи 1 (CH1) и вторую область VH; и

(c) четвертый полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца третью область VH, вторую область CH1, вариабельную область легкой цепи (VL),

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образуют первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образуют вторую антигенсвязывающую область Fab;

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют антигенсвязывающую область Fv; и

где первая область Fab и вторая область Fab связываются с первым антигеном, область Fv связывается со вторым антигеном, и первый антиген отличается от второго антигена.

2. Связывающая молекула по варианту осуществления 1, где первая область Fab и вторая область Fab связаны с областью Fv через гибкая пептидная область.

3. Связывающая молекула по варианту осуществления 2, где первая область Fab и вторая область Fab слиты с областью Fv.

4. Связывающая молекула по варианту осуществления 2, где гибкая пептидная область включает шарнирный участок антитела.

5. Связывающая молекула по варианту осуществления 4, где шарнирный участок антитела представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина G (IgG).

6. Связывающая молекула по варианту осуществления 5, где шарнирный участок антитела выбрана из группы, состоящей из шарнирных областей IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.

7. Связывающая молекула по варианту осуществления 4, где шарнирный участок антитела включает межцепочечную дисульфидную связь между третьим полипептидом и четвертым полипептидом.

8. Связывающая молекула по варианту осуществления 4, где гибкая пептидная область дополнительно содержит линкер.

9. Связывающая молекула по варианту осуществления 8, где линкер содержит аминокислотную последовательность GGGGS (G4S).

10. Связывающая молекула по варианту осуществления 9, где линкер содержит две тандемные копии аминокислотной последовательности GGGGS (G4S).

11. Связывающая молекула по варианту осуществления 1, где первая область Fab и вторая область Fab связываются с одним и тем же эпитопом первого антигена.

12. Связывающая молекула по варианту осуществления 1, где второй антиген экспрессируется на иммунной клетке.

13. Связывающая молекула по варианту осуществления 12, где иммунная клетка выбрана из группы, состоящей из лимфоцитов и моноцитов.

14. Связывающая молекула по варианту осуществления 12, где иммунная клетка представляет собой эффекторную клетку.

15. Связывающая молекула по варианту осуществления 12, где иммунная клетка выбрана из группы, состоящей из Т-клетки, В-клетки, дендритной клетки, гранулоцита, врожденной лимфоидной клетки, мегакариоцита, моноцита, супрессорной клетки миелоидного происхождения и естественной клетки-убийцы (NK).

16. Связывающая молекула по варианту осуществления 1, где первый антиген представляет собой раковый антиген.

17. Связывающая молекула по варианту осуществления 16, где раковый антиген представляет собой опухоль-ассоциированный антиген (tumor associated antigen, ТАА) или опухолеспецифический антиген (tumor specific antigen, TSA).

18. Связывающая молекула по варианту осуществления 1, где первый антиген выбран из группы, состоящей из CD19, CD20, EGFR, Her2 и PD-L1.

19. Связывающая молекула по варианту осуществления 12, где второй антиген представляет собой CD3 или TNF-альфа.

20. Связывающая молекула по варианту осуществления 16, где первый антиген представляет собой раковый антиген, а второй антиген представляет собой CD3.

21. Связывающая молекула по варианту осуществления 20, где раковый антиген выбран из группы, состоящей из CD19, CD20, EGFR, Her2 и PD-L1.

22. Способ получения связывающей молекулы, включающий:

(i) экспрессию связывающей молекулы на основе одного или более векторов в клетке-хозяине, где один или более векторов содержат

(а) первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид, где каждый из первого полипептида и второго полипептида представляет собой легкую цепь антитела,

(b) третью нуклеиновую кислоту, кодирующую третий полипептид, включающий в порядке от N-конца до C-конца первую область VH, первую область CH1 и вторую область VH; и

(c) четвертую нуклеиновую кислоту, кодирующую четвертый полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца третью область VH, вторую область CH1 и область VL,

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида могут образовывать первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образуют вторую антигенсвязывающую область Fab; и

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют антигенсвязывающую область Fv; и

где первая область Fab и вторая область Fab связываются с первым антигеном, область Fv связывается со вторым антигеном, и первый антиген отличается от второго антигена.

23. Способ по варианту осуществления 22, где первая область Fab и вторая область Fab связаны с областью Fv через гибкую пептидную область, содержащую шарнирный участок антитела.

24. Способ согласно варианту осуществления изобретения 23, где шарнирный участок антитела включает межцепочечную дисульфидную связь, образованную между третьим полипептидом и четвертым полипептидом.

25. Способ согласно варианту осуществления 23, где гибкая пептидная область дополнительно содержит линкер.

26. Способ согласно варианту осуществления изобретения 25, где линкер содержит аминокислотную последовательность GGGGS (G4S).

27. Способ согласно варианту осуществления 22, где первый антиген представляет собой раковый антиген, а второй антиген представляет собой CD3.

28. Способ согласно варианту осуществления 22, где первый антиген выбран из группы, состоящей из CD19, CD20, EGFR, Her2 и PD-L1.

29. Фармацевтическая композиция, содержащая связывающую молекулу и фармацевтически приемлемый носитель, где связывающая молекула включает:

(а) первый полипептид и второй полипептид, каждый из которых содержит легкую цепь антитела,

(b) третий полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца первую область VH, первую область CH1 и вторую область VH; и

(c) четвертый полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца третью область VH, вторую область CH1 и область VL,

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образуют первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образуют второй участок Fab антигена;

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют антигенсвязывающую область Fv; и

где первая область Fab и вторая область Fab связываются с первым антигеном, область Fv связывается со вторым антигеном, и первый антиген отличается от второго антигена.

30. Способ лечения заболевания или состояния у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества связывающей молекулы, при этом связывающая молекула включает:

(а) первый полипептид и второй полипептид, каждый из которых содержит легкую цепь антитела,

(b) третий полипептид, содержащий в порядке от N-конца к С-концу первую область VH, первую область CH1 и вторую область VH; и

(c) четвертый полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца третью область VH, вторую область CH1 и область VL,

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образуют первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образуют второй участок Fab антигена;

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют антигенсвязывающую область Fv; и

где первая область Fab и вторая область Fab связываются с первым антигеном, область Fv связывается со вторым антигеном, и первый антиген отличен от второго антигена.

31. Связывающая молекула, содержащая:

(а) первый полипептид и второй полипептид, каждый из которых содержит легкую цепь антитела,

(b) третий полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца первую вариабельную область тяжелой цепи (VH), первую константную область тяжелой цепи 1 (CH1) и вторую область VH; и

(c) четвертый полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца третью область VH, вторую область CH1, а также вариабельную область легкой цепи (VL),

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образуют первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образуют вторую антигенсвязывающую область Fab;

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют антигенсвязывающую область Fv; и

где первая область Fab и вторая область Fab связываются с лигандом запрограммированной смерти 1 (Programmed Death-Ligand 1, PD-L1), а область Fv связывается с кластером дифференцировки 3 (Cluster of Differentiation 3, CD3).

32. Связывающая молекула по варианту осуществления 31, где:

(а) каждая легкая цепь антитела первого и второго полипептида содержит три области, определяющие комплементарность (CDR), имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 10 и SEQ ID NO.: 11;

(b) в третьем полипептиде первая область VH содержит три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6 и SEQ ID NO.: 7, а вторая область VH содержит три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; и

(c) в четвертом полипептиде третья область VH включает три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6 и SEQ ID NO.: 7, а область VL включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

33. Связывающая молекула по варианту осуществления 32, где первая область Fab и вторая область Fab связаны с областью Fv через гибкую пептидную область.

34. Связывающая молекула по варианту осуществления 33, где первая область Fab и вторая область Fab связаны слиты с областью Fv.

35. Связывающая молекула по варианту осуществления 33, где гибкая пептидная область содержит шарнирный участок антитела.

36. Связывающая молекула по варианту осуществления 35, где шарнирный участок антитела представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина G (IgG).

37. Связывающая молекула по варианту осуществления 36, где шарнирный участок антитела выбрана из группы, состоящей из шарнирных областей IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.

38. Связывающая молекула по варианту осуществления 35, где шарнирный участок антитела содержит межцепочечную дисульфидную связь между третьим полипептидом и четвертым полипептидом.

39. Связывающая молекула по варианту осуществления 35, где гибкая пептидная область дополнительно содержит линкер.

40. Связывающая молекула по варианту осуществления 39, где линкер содержит аминокислотную последовательность GGGGS (G4S).

41. Связывающая молекула по варианту осуществления 40, где линкер содержит аминокислотную последовательность GGGGSGGGGS.

42. Связывающая молекула по варианту осуществления 40, где линкер содержит аминокислотную последовательность GGSGGGGSG.

43. Связывающая молекула по варианту осуществления 32, где:

(а) каждая легкая цепь антитела первого и второго полипептида содержит область VL, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 8;

(b) в третьем полипептиде первая область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 4, а вторая область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; и

(c) в четвертом полипептиде третья область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 4, а область VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

44. Связывающая молекула по варианту осуществления 32, где каждый из первого полипептида и второго полипептида содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 3; третий полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 1; а четвертый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 2.

45. Связывающая молекула по варианту осуществления 32, где каждый из первого полипептида и второго полипептида содержат аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 95; третий полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 96; а четвертый полипептид содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 97.

46. Связывающая молекула по варианту осуществления 32, где каждый из первого полипептида и второго полипептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 95; третий полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 98; а четвертый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 99.

47. Способ получения связывающей молекулы, включающий:

(i) экспрессию связывающей молекулы на основе одного или более векторов в клетке-хозяине, где один или более векторов содержат

(а) первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид, причем каждый полипептид содержит легкую цепь антитела,

(b) третью нуклеиновую кислоту, кодирующую третий полипептид, включающий в порядке от N-конца до C-конца первую вариабельную область тяжелой цепи (VH), первую константную область тяжелой цепи 1 (CH1) и вторую область VH; и

(c) четвертую нуклеиновую кислоту, кодирующую четвертый полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца третью область VH, вторую область CH1, и вариабельную легкую область (VL),

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образуют первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образуют вторую антигенсвязывающую область Fab;

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют антигенсвязывающую область Fv; и

где первая область Fab и вторая область Fab связываются с PD-L1, а область Fv связывается с CD3, и

(ii) очистку связывающей молекулы.

48. Способ по варианту осуществления, в котором:

(а) каждая легкая цепь антитела первого и второго полипептида содержит три области, определяющие комплементарность (CDR), имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 10 и SEQ ID NO.: 11;

(b) в третьем полипептиде первая область VH содержит три CDR, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6 и SEQ ID NO.: 7, а вторая область VH содержит три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; и

(c) в четвертом полипептиде третья область VH содержит три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6 и SEQ ID NO.: 7, а область VL включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

49. Способ по варианту осуществления 48, где первая область Fab и вторая область Fab связаны с областью Fv через гибкую пептидную область.

50. Способ по варианту осуществления 49, где гибкая пептидная область включает шарнирный участок антитела.

51. Способ в соответствии с вариантом осуществления 50, где шарнирный участок антитела содержит межцепочечную дисульфидную связь между третьим полипептидом и четвертым полипептидом.

52. Способ по варианту осуществления 50, где шарнирный участок антитела представляет собой шарнирный участок иммуноглобулина G (IgG).

53. Способ по варианту осуществления 20, где гибкая пептидная область дополнительно содержит линкер.

54. Способ согласно варианту осуществления 53, где линкер содержит аминокислотную последовательность GGGGS (G4S).

55. Способ согласно варианту осуществления 54, где линкер содержит аминокислотную последовательность GGGGSGGGGS.

56. Способ согласно варианту осуществления 54, где линкер содержит аминокислотную последовательность GGSGGGGSG.

57. Способ по варианту осуществления 48,

где область VH каждой из первой и второй областей Fab содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4;

где область VL каждой из первой и второй областей Fab содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 8;

где область VH области Fv содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; и

где область VL области Fv содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

58. Способ по варианту осуществления 48, где каждый из первого полипептида и второго полипептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 3; третий полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 1; а четвертый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 2.

59. Фармацевтическая композиция, содержащая связывающую молекулу и фармацевтически приемлемый носитель, где связывающая молекула включает:

(а) первый полипептид и второй полипептид, каждый из которых содержит легкую цепь антитела,

(b) третий полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца первую вариабельную область тяжелой цепи (VH) и первую константную область тяжелой цепи 1 (CH1) и вторую область VH; и

(c) четвертый полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца третью область VH, вторую область CH1, вариабельную область легкой цепи (VL),

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образуют первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образуют вторую антигенсвязывающую область Fab;

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют антигенсвязывающую область Fv; и

где первая область Fab и вторая область Fab связываются с PD-L1, а область Fv связывается с CD3.

60. Способ лечения заболевания или состояния у субъекта, включающий введение терапевтически эффективного количества связывающей молекулы субъекту, при этом связывающая молекула включает:

(а) первый полипептид и второй полипептид, каждый из которых содержит легкую цепь антитела,

(b) третий полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца первую вариабельную область тяжелой цепи (VH), первую константную область тяжелой цепи 1 (CH1) и вторую область VH; и

(c) четвертый полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца третью область VH, вторую область CH1, а также вариабельную область легкой цепи (VL),

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образуют первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образуют вторую антигенсвязывающую область Fab;

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют антигенсвязывающую область Fv; и

где первая область Fab и вторая область Fab связываются с PD-L1, а область Fv связывается с CD3.

61. Связывающая молекула, содержащая:

(а) первый полипептид и второй полипептид, каждый из которых содержит легкую цепь антитела,

(b) третий полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца первую вариабельную область тяжелой цепи (VH), первую константную область тяжелой цепи 1 (CH1) и вторую область VH; и

(c) четвертый полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца третью область VH и вторую область CH1, а также вариабельную область легкой цепи (VL),

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образуют первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образуют вторую антигенсвязывающую область Fab;

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют антигенсвязывающую область Fv; и

где первая область Fab и вторая область Fab связываются с CD20 или рецептором эпидермального фактора роста (EGFR), а область Fv связывается с CD3.

62. Связывающая молекула в соответствии с вариантом осуществления 61, где первая область Fab и вторая область Fab связываются с CD20, и

(а) каждая легкая цепь антитела первого и второго полипептида содержит три области, определяющие комплементарность (CDR), и имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 31, SEQ ID NO.: 32 и SEQ ID NO.: 33;

(b) в третьем полипептиде первая область VH содержит три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 27, SEQ ID NO.: 28 и SEQ ID NO.: 29, а вторая область VH содержит три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; и

(c) в четвертом полипептиде третья область VH содержит три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 27, SEQ ID NO.: 28 и SEQ ID NO.: 29, а область VL включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

63. Связывающая молекула по варианту осуществления 62, где первая область Fab и вторая область Fab связаны с областью Fv через гибкую пептидную область.

64. Связывающая молекула по варианту осуществления 63, где гибкая пептидная область содержит шарнирный участок антитела.

65. Связывающая молекула по варианту осуществления 64, где шарнирный участок антитела содержит межцепочечную дисульфидную связь между третьим полипептидом и четвертым полипептидом.

66. Связывающая молекула по варианту осуществления 64, где гибкая пептидная область дополнительно содержит линкер.

67. Связывающая молекула по варианту осуществления 62, где:

(а) каждая легкая цепь антитела первого и второго полипептида содержит область VL, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 30;

(b) в третьем полипептиде первая область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 26, а вторая область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; и

(c) в четвертом полипептиде третья область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 26, а область VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

68. Связывающая молекула по варианту осуществления 62, где каждый из первого полипептида и второго полипептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 25; третий полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 23; а четвертый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 24.

69. Связывающая молекула по варианту осуществления 61, где первая область Fab и вторая область Fab связываются с EGFR, и

(а) каждая легкая цепь антитела первого и второго полипептида содержит три CDR, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 45, SEQ ID NO.: 46 и SEQ ID NO.: 47;

(b) в третьем полипептиде первая область VH содержит три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 41, SEQ ID NO.: 42 и SEQ ID NO.: 43, а вторая область VH включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; и

(c) в четвертом полипептиде третья область VH включает три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 41, SEQ ID NO.: 42 и SEQ ID NO.: 43, а область VL включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

70. Связывающая молекула по варианту осуществления 69, где первая область Fab и вторая область Fab связаны с областью Fv через гибкую пептидную область.

71. Связывающая молекула по варианту осуществления 70, где гибкая пептидная область содержит шарнирный участок антитела.

72. Связывающая молекула по варианту осуществления 71, где шарнирный участок антитела содержит межцепочечную дисульфидную связь между третьим полипептидом и четвертым полипептидом.

73. Связывающая молекула согласно варианту осуществления 70, где гибкая пептидная область дополнительно содержит линкер.

74. Связывающая молекула по варианту осуществления 69, где:

(а) каждая легкая цепь антитела первого и второго полипептида содержит область VL, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 44;

(b) в третьем полипептиде первая область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 40, а вторая область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; и

(c) в четвертом полипептиде третья область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 40, а область VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

75. Связывающая молекула по варианту осуществления 69, где каждый из первого полипептида и второго полипептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 39; третий полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 37; а четвертый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 38.

76. Способ получения связывающей молекулы, включающий:

(i) экспрессию связывающей молекулы на основе одного или более векторов в клетке-хозяине, где один или более векторов содержат

(а) первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид, и вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую второй полипептид, где каждый из первого полипептида и второго полипептида представляет собой легкую цепь антитела,

(b) третью нуклеиновую кислоту, кодирующую третий полипептид, включающий в порядке от N-конца до C-конца первую область VH, первую область CH1 и вторую область VH; и

(c) четвертую нуклеиновую кислоту, кодирующую четвертый полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца третью область VH, вторую область CH1 и область VL,

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образуют первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образуют вторую антигенсвязывающую область Fab;

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют антигенсвязывающую область Fv; и

где первая область Fab и вторая область Fab связываются с CD20 или EGFR, а область Fv связывается с CD3, и

(ii) очистку связывающей молекулы.

77. Способ по варианту осуществления 76, где первая область Fab и вторая область Fab связываются с CD20, и

(а) каждая легкая цепь антитела первого и второго полипептида содержит три области, определяющие комплементарность (CDR), имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 31, SEQ ID NO.: 32 и SEQ ID NO.: 33;

(b) в третьем полипептиде первая область VH содержит три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 27, SEQ ID NO.: 28 и SEQ ID NO.: 29, а вторая область VH содержит три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; и

(c) в четвертом полипептиде третья область VH включает три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 27, SEQ ID NO.: 28 и SEQ ID NO.: 29, а область VL включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

78. Способ согласно варианту осуществления 77, где первая область Fab и вторая область Fab связаны с областью Fv через гибкую пептидную область.

79. Связывающая молекула согласно варианту осуществления 78, где гибкая пептидная область содержит шарнирный участок антитела.

80. Связывающая молекула по варианту осуществления 79, где гибкая пептидная область дополнительно содержит линкер.

81. Способ по п.77, в котором:

(а) легкие цепи антитела первого и второго полипептида содержат, каждая, область VL, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 30;

(b) в третьем полипептиде первая область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 26, а вторая область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; и

(c) в четвертом полипептиде третья область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 26, а область VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

82. Способ согласно варианту осуществления 77, где каждый из первого полипептида и второго полипептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 25; третий полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 23; а четвертый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 24.

83. Способ по варианту осуществления 87, где первая область Fab и вторая область Fab связываются с CD20, и

(а) каждая легкая цепь антитела первого и второго полипептида содержит три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 45, SEQ ID NO.: 46 и SEQ ID NO.: 47;

(b) в третьем полипептиде первая область VH содержит три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 41, SEQ ID NO.: 42 и SEQ ID NO.: 43, а вторая область VH содержит три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; и

(c) в четвертом полипептиде третья область VH включает три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 41, SEQ ID NO.: 42 и SEQ ID NO.: 43, а область VL включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

84. Способ согласно варианту осуществления 83, где первая область Fab и вторая область Fab связаны с областью Fv через гибкую пептидную область.

85. Способ согласно варианту осуществления изобретения 84, где гибкая пептидная область включает шарнирный участок антитела.

86. Способ согласно варианту осуществления изобретения 85, где гибкая пептидная область дополнительно содержит линкер.

87. Способ по п.83, в котором:

(а) каждая легкая цепь антитела первого и второго полипептида содержит область VL, которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 44;

(b) в третьем полипептиде первая область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 40, а вторая область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; и

(c) в четвертом полипептиде третья область VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 40, а область VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

88. Способ согласно варианту осуществления 83, где каждый из первого полипептида и второго полипептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 39; третий полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 37; а четвертый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 38.

89. Фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество связывающей молекулы и фармацевтически приемлемый носитель, где связывающая молекула включает:

(а) первый полипептид и второй полипептид, каждый из которых содержит легкую цепь антитела,

(b) третий полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца первую вариабельную область тяжелой цепи (VH), первую константную область тяжелой цепи 1 (CH1) и вторую область VH; и

(c) четвертый полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца третью область VH, вторую область CH1 и вариабельную область легкой цепи (VL),

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образуют первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образуют вторую антигенсвязывающую область Fab;

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют антигенсвязывающую область Fv; и

где первая область Fab и вторая область Fab связываются с CD20 или EGFR, а область Fv связывается с CD3.

90. Способ лечения заболевания или состояния у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества связывающей молекулы, при этом связывающая молекула включает:

(а) первый полипептид и второй полипептид, каждый из которых содержит легкую цепь антитела,

(b) третий полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца первую вариабельную область тяжелой цепи (VH), первую константную область тяжелой цепи 1 (CH1) и вторую область VH; и

(c) четвертый полипептид, содержащий в порядке от N-конца до C-конца третью область VH, вторую область CH1 и вариабельную область легкой цепи (VL),

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образуют первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образуют вторую антигенсвязывающую область Fab;

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образует антигенсвязывающую область Fv; и

где первая область Fab и вторая область Fab связываются с CD20 или EGFR, а область Fv связывается с CD3.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[00196] Фиг. 1A иллюстрирует связывающую молекулу (ALiCE), представленную в данном документе. Фиг 1B иллюстрирует типичную связывающую молекулу, представленную в данном документе, которая содержит области CH3. ФИГ. 1С иллюстрирует типичную связывающую молекулу, представленную в настоящем документе, которая содержит сайты связывания альбумина (ABS). ФИГ. 1D иллюстрирует типичную связывающую молекулу, представленную в настоящем документе, которая имеет связывающий домен, нацеленный на раковый антиген, а также иллюстрирует примерные варианты гибкой пептидной области, представленной в данном документе. ФИГ. 1E иллюстрирует типичную связывающую молекулу, представленную в настоящем документе, которая имеет связывающий домен, нацеленный на раковый антиген, и связывающий домен, нацеленный на CD3.

[00197] На Фиг. 2А показан образец сборки ACE-00. «BiP» иллюстрирует связывающий белок иммуноглобубин (BiP, binding immunoglobubin protein), связывающий домены CH1 или VH ACE-00, находящиеся на повехности. На ФИГ. 2B показаны результаты SDS-PAGE, выполненного для идентификации паттерна сборки ACE-00. Стрелки указывают полосу ACE-00-VL в образце «ACE-00+легкая цепь» и две полосы ACE-00-VH и ACE-00-VL в образце «ACE-00-VH+ACE-00-VL+ Light chain» в восстанавливающих условиях. На ФИГ. 2C показаны результаты коиммунопреципитации (co-IP) тяжелой цепи дикого типа (HC), тяжелой цепи с усеченной CH1 (ΔCH1) и тяжелой цепи с усеченной VH-CH1 (ΔVH-CH1) адалимумаба. Фиг. 2D иллюстрирует, что BiP может регулировать сборку и секрецию тяжелой цепи путем взаимодействия с доменом VH и/или CH1 тяжелой цепи. «ERAD» представляет собой деградацию белков, связанных с эндоплазматическим ретикулумом. ФИГ. 2E иллюстрирует вклад домена VH антитела в сборку антитела и вклад цепи ACE-00-VH в правильную сборку молекулы ACE-00. «X» обозначает, что сборка не произошла; «О» обозначает сборку. ФИГ. 2F иллюстрирует структуру ACE-00. На ФИГ. 2G показаны результаты аффинной хроматографии для белков ACE-00 и ACE-00-VL2 с использованием Hitrap™ KappaSelect (GE healthcare, USA). На ФИГ. 2H показаны результаты капиллярного электрофореза, проведенного для выявления различия в размере молекул между ACE-00-VL2 и ACE-00. На ФИГ. 2I показаны результаты капиллярного электрофореза, показывающие конформацию молекул ACE-00 и ACE-00-VL2. Сплошные стрелки указывают результаты по ACE-00; пунктирными стрелками показаны результаты по ACE-00-VL2. На ФИГ. 2J показаны результаты капиллярного изоэлектрического фокусирования, проведенного для подтверждения гетеродимеризации между цепью ACE-00-VH и цепью ACE-00-VL. На ФИГ. 2K показаны результаты SDS-PAGE и капиллярного электрофореза, проведенных для определения структуры сборки ACE-00. «R» представляет собой редуцирующие; «NR» означает не-редуцирующие (условия). На ФИГ. 2L показаны результаты эксклюзионной хроматографии ACE-00.

[00198] Фиг. 3 показывает результат SDS-PAGE (в восстанавливающих (слева) и невосстанавливающих (справа) условиях), выполненного для идентификации экспрессии и сборки ACE-02, ACE-02-VL2, ACE-03, ACE-03-VL2 , ACE-00 и ACE-01. ACE-02 содержит второй антиген в виде гуманизированного 12F6 (h12F6, анти-CD3-антитело), а ACE-03 содержит второй антиген в виде гуманизированного OKT3 (hOKT3, анти-CD3-антитело). Стрелки указывают полосы собранных ACE-02, ACE-03 и ACE-03-VL2 соответственно в невосстанавливающих условиях.

[00199] Фиг. 4A иллюстрирует структуру ACE-04. «А» относится к анти-PD-L1. UCHT1 представляет собой анти-CD3 антитело. ФИГ. 4B иллюстрирует структуру ACE-05. «А» относится к анти-PD-L1. OKT3 представляет собой анти-CD3 антитело. На ФИГ. 4C показаны результаты SDS-PAGE, выполненного для идентификации структуры сборки ACE-04, ACE-04-VL2, ACE-05 и ACE-05-VL2. Стрелки указывают полосы ACE-04 и ACE-05 в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. На ФИГ. 4D показаны результаты SDS-PAGE, выполненного для идентификации паттерна сборки ACE-05 (вверху), и показаны потенциальные механизмы регуляции сборки ACE-05 (внизу). На Фиг. 4E-4F показаны результаты SDS-PAGE и капиллярного электрофореза, выполненных для идентификации конформации ACE-05, а также эффективности гетеродимеризации между цепями ACE-05-VH и ACE-05-VL. «М» представляет маркер; «R» означает восстанавливающие (условия); «NR» означает невосстанавливающие (условия); «IN» представляет ввод (input); «FT» представляет сквозной поток (flow through); «W» означает промывку (washing) ; «Elu» представляет собой элюирование. ФИГ. 4G показывает результаты эксклюзионной хроматографии, выполненную для определения чистоты ACE-05. На ФИГ. 4Н показаны результаты эксклюзионной хроматографии для гель-фильтрационного анализа ACE-05. На ФИГ. 4I показаны результаты катионообменной хроматографии (CEX), выполненной для определения конформационных структур ACE-05.

[00200] На ФИГ. 5 показаны результаты SDS-PAGE, выполненного для определения структуры сборки ACE-09 и ACE-05 при 37°C и 32°C (вверху), и обобщены характеристики ACE-09 и ACE-05 (внизу). На рисунках вверху полосы с надписью «ACE-05» показывают результаты ACE-05; остальные дорожки показывают результаты ACE-09; «R» означает восстанавливающие (условия); «N.R» означает невосстанавливающие (условия); «IP» означает ввод; «F.T» представляет сквозной поток; «W» означает промывку; «OP» представляет собой выход.

[00201] Фиг. 6A иллюстрирует структуру ACE-10. ФИГ.6B-6C показывают анализ экспрессии и сборки молекулы ACE-10 (в восстанавливающих (слева) и невосстанавливающих (справа) условиях). На ФИГ. 6B стрелки указывают полосы ACE-10 в восстанавливающих и невосстанавливающих условиях. «ACE-10 dialysis» представляет собой ACE-10, полученный путем трансфекции диализованной ДНК. На ФИГ.6С стрелка в результатах для анти-каппа указывает димер ACE-10-VL/ACE-10-LC и димерный комплекс ACE-10-VH/ACE-10-LC в невосстанавливающих условиях; стрелка в результатах для анти-CH1 указывает собранный ACE-10 в невосстанавливающих условиях.

[00202] На ФИГ. 7A показана структура ACE-11. На ФИГ. 7В показаны результаты SDS-PAGE, выполненного для идентификации экспрессии и структуры сборки ACE-11 и ACE-11-VL2 (проанализированы окрашиванием кумасси синим (слева) и вестерн-блоттингом (справа)). «M» обозначает маркер. Стрелками показаны полосы собранного ACE-11 в невосстанавливающих условиях.

[00203] На ФИГ. 8 показаны результаты SDS-PAGE, выполненного для определения структуры сборки ACE-12, ACE-05 и ACE-09. Стрелками показаны полосы димера ACE-05-VH+LC и димера ACE-05-VL+LC в невосстанавливающих условиях с использованием антител против каппа (слева) и против CH1 (справа) в Вестерн-блоттинге.

[00204] На ФИГ. 9 показаны результаты иммуноферментного анализа (ELISA) для определения сродства ACE-00 и ACE-00-VL2 к TNF-альфа.

[00205] ФИГ. 10A-10C показывают анализ аффинности связывания ACE-05 с PD-L1 (10A) и CD3 (10B-10C) с использованием ELISA.

[00206] ФИГ. 11 показывает анализ аффинности связывания ACE-05 и ACE-09 с CD3 с использованием ELISA.

[00207] ФИГ. 12A-12C показывают анализ кинетики связывания ACE-05 с PD-L1 (12A, 12C) и CD3 (12B, 12C) с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR). На ФИГ. 12D показан кинетический анализ связывания ACE-05 одновременно с PD-L1 и CD3 с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR).

[00208] ФИГ. 13А показаны уровни экспрессии PD-L1 в клетках HEK293E-PD-L1 и родительских клетках HEK293E (правая панель) и уровни экспрессии CD3 в люциферазных репортерных клетках Jurkat, измеренные с помощью различных антител к CD3 (левая панель). ФИГ. 13B-13E показывают результаты анализа перенаправления (активности) Т-клеток для ACE-05 и BiTE-05. ФИГ. 13F показывает активацию Т-клеток в присутствии ACE-05, BiTE-05 или YBL-007 на разных стадиях Т-клеток. На ФИГ. 13G-13H показаны результаты анализа блокады PD-1/PD-L1 для ACE-05. ФИГ. 13I-13J показывают активацию Т-клеток с помощью ACE-05, BiTE-05, UCHT1 (анти-CD3 антитело от BioLegend, США) или OKT3 ( анти-CD3 антитело от BioLegend, США). На ФИГ. 13K показаны результаты анализа цитотоксичности Т-клеток после определения цитотоксичности Т-клеток, опосредованной ACE-05. На ФИГ. 13L показаны результаты цитотоксичности Т-клеток, опосредованной ACE-05, BiTE-05, YBL-007 или UCHT1. «IgG» представляет собой нормальный человеческий IgG, используемый в качестве отрицательного контроля. ФИГ. 13M показывает цитотоксичность Т-клеток в отношении опухолевых клеток при прямом контакте с клетками PBMC в присутствии ACE-05 или YBL-007. Стрелки указывают на раковые клетки-мишени HCC827. ФИГ. 13N показывает уровни IL-2 и INF-γ в присутствии ACE-05, BiTE-05 или YBL-007 в совместно культивируемых клетках PBMC и HCC827. «IgG» представляет собой нормальный человеческий IgG, используемый в качестве отрицательного контроля. На ФИГ. 13O показаны результаты по термодинамической стабильности ACE-05, BiTE-05, YBL-007 и UCHT1.

[00209] На ФИГ. 14A-14B показаны результаты анализа перенаправления Т-клеток, проведенного для определения активации Т-клеток, опосредованной ACE-10. «HIgG» представляет собой нормальный человеческий IgG, используемый в качестве контроля.

[00210] На ФИГ. 15 показаны результаты анализа цитотоксичности Т-клеток после определения цитотоксичности Т-клеток, опосредованной ACE-11.

[00211] На ФИГ. 16A-16B показаны результаты фармакокинетического исследования ACE-05 на крысах Sprague-Dawley (SD).

[00212] На ФИГ. 17А показаны результаты исследования ксенотрансплантата HCC827 (PD-L1-положительная опухоль) на модели гуманизированных мышей. ФИГ. 17B показывает противоопухолевые эффекты ACE-05 и других исследуемых препаратов в PBMC донора A и донора B. На ФИГ. 17C показаны изменения массы тела донора A и донора B. ФИГ. 17D показывает индивидуальные реакции противоопухолевой эффективности. ФИГ. 17E показывает индивидуальную потерю массы тела (%) (побочный эффект). На ФИГ. 17F показаны результаты сравнения противоопухолевой эффективности BiTE и ACE-05 и родительского антитела PD-L1 по сравнению с ACE-05.

[00213] На ФИГ. 18A-18D показаны результаты исследования предела дозы, показывающие противоопухолевые эффекты ACE-05 и других тестируемых препаратов на PBMC донора A и донора B на модели гуманизированной мыши, инокулированной ксенотрансплантатом HCC827 (PD-L1-положительная опухоль). ФИГ. 18A показывает дозовую реакцию противоопухолевой эффективности для ACE-05 и BiTE-05. На ФИГ. 18B и ФИГ. 18C показана противоопухолевая эффективность доз ACE-05 и BiTE-05 соответственно для отдельных мышей в каждой группе. ФИГ. 18D показывает индивидуальную потерю массы тела (%) (побочный эффект) группы, получавшей ACE-05 и BiTE-05.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

[00214] В настоящем описании представлены новые связывающиеся с клеткой связывающие молекулы, имеющие несколько связывающих доменов. Эти связывающие молекулы называются здесь «антителоподобными агентами клетки» (AliCE, antibody like cell engagers). Представленные здесь молекулы ALiCE имеют два антигенсвязывающих домена. Первый антигенсвязывающий домен имеет две Fab-области. Второй антигенсвязывающий домен имеет Fv-область. Типичная молекула ALiCE изображена на ФИГ. 1А. Как правило, в такой молекуле первый антигенсвязывающий домен включает Fab-области, а второй антигенсвязывающий домен присоединен (прямо или косвенно) к первому антигенсвязывающему домену, как правило, в том положении, в котором домены CH2 и CH3 обычно расположены в нативной структуре антитела. Например, в изображенном варианте осуществления C-конец тяжелой цепи включает домен VH, а не домен CH2, а C-конец второй тяжелой цепи содержит домен VL, а не домен.

[00215] Связывающие молекулы, раскрытые в данном документе, обеспечивают множество преимуществ по сравнению с обычными антителами и существующими мультиспецифическими антителами (например, биспецифическими антителами). Благодаря множеству антигенсвязывающих доменов и общей структуре конфигурации связывающие молекулы, представленные в данном документе, могут использоваться в качестве взаимодействующих с клетками для объединения нескольких клеток. Например, первый антигенсвязывающий домен может связываться с антигеном, экспрессируемым на первой клетке, а второй антигенсвязывающий домен может связываться с антигеном, экспрессируемым на второй клетке, и тем самым сводить две клетки вместе.

[00216] В некоторых вариантах осуществления одна из задействованных клеток представляет собой иммунную клетку, например цитотоксическую Т-клетку. В этих вариантах осуществления предлагаемые здесь связывающие молекулы особенно полезны для управления и активации иммунной клетки. Например, в некоторых вариантах осуществления, хотя двухвалентная Fab-часть молекулы ALiCE сохраняет функциональность обычных антител, вторая моновалентная антигенсвязывающая область без Fc (т.е. область Fv) может распознавать, взаимодействовать, перенаправлять и/или активировать эффекторные клетки иммунной системы, такие как Т-клетки. Например, как показано в разделе «Примеры» ниже, ACE-05, молекула ALiCE, состоящая из доменов анти-PD-L1 и анти-CD3, демонстрирует синергетический эффект как при PD-L1-зависимой (опосредованной) активации Т-клеток, так и при эффективности блокады PD-1 и PD-L1.

[00217] В некоторых вариантах осуществления отсутствие полностью функциональной области Fc или отсутствие полноразмерной области CH2 и/или CH3 отменяет или снижает определенную нежелательную Fc-опосредованную эффекторную цитотоксичность. В определенном варианте осуществления естественное взаимодействие между цепями VH и VL области Fv способствует гетеродимеризации молекулы ALiCE без придания нежелательной иммуногенности при искусственной инженерии.

[00218] Фармакокинетические (PK) исследования, представленные в настоящем документе, указывают на более высокую стабильность молекул ALiCE, чем молекул других форматов, таких как BiTE (bispecific T-cell engager) или DART (dual-affinity re-targeting) (Campagne O. et al. Integrated Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Model of a Bispecific CD3xCD123 DART Molecule in Nonhuman Primates: Evaluation of Activity and Impact of Immunogenicity. Clin Cancer Res. 2018 Jun 1;24(11):2631-2641; Moore P. A. et al. Application of dual affinity retargeting molecules to achieve optimal redirected T-cell killing of B-cell lymphoma. Blood. 2011 Apr 28;117(17):4542-51; Moore P. A. et al. Development of MGD007, a gpA33 x CD3-Bispecific DART Protein for T-Cell Immunotherapy of Metastatic Colorectal Cancer. Mol Cancer Ther. 2018 Aug;17(8):1761-1772; Yuraszeck T. et al. Translation and Clinical Development of Bispecific T-cell Engaging Antibodies for Cancer Treatment. Clin Pharmacol Ther. 2017 May;101(5):634-645. Каждая из этих статей включена в настоящий документ посредством ссылки во всей своей полноте). Кроме того, исследование эффективности типичной молекулы ALiCE in vivo показывает значительные противораковые эффекты. Эти результаты демонстрируют, что AliCE, в качестве платформы, представляет собой успешную технологию в инженерии антител, например, для лечения рака.

I. Определения

[00219] Методы и процедуры, описанные или упомянутые в данном документе, включают те, которые в целом хорошо описаны и/или обычно используются специалистами в данной области с использованием традиционной методологии, например, такой как широко используемая методология, описанная в Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3d ed. 2001); Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. eds., 2003); Therapeutic Monoclonal Antibodies: From Bench to Clinic (An ed. 2009); Monoclonal Antibodies: Methods and Protocols (Albitar ed. 2010); and Antibody Engineering Vols 1 and 2 (Kontermann and Dübel eds., 2d ed. 2010).

[00220] Если в данном документе не указано иное, технические и научные термины, используемые в настоящем описании, имеют общепринятые значения, знакомые специалистам в данной области техники. В целях интерпретации данной спецификации будет применяться следующее описание терминов, и, если это уместно, термины, используемые в единственном числе, также будут включать множественное число и наоборот. В случае, если некое описание изложенного термина противоречит любому документу, включенному в данный документ посредством ссылки, описание термина, изложенного ниже, имеет приоритет.

[00221] Термин «связывающая молекула» относится к белку, содержащему часть (например, одна или более связывающих областей, таких как CDR), которая связывается с мишенью или антигеном, и, необязательно, каркасную или структурную часть (например, одну или больше каркасных или структурных областей), которые позволяют связывающей части принимать конформацию, способствующую связыванию связывающего белка с полипептидом, фрагментом или эпитопом. В контексте настоящего раскрытия говорится, что связывающая молекула специфически или выборочно связывается с антигеном, например, если константа диссоциации (KD) составляет ≤10^-7 М. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула способна специфически связываться с антигеном с KD от примерно 10^-7 M до примерно 10^-12 M. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула может специфически связываться с антигеном с высокой аффинностью, и KD составляет ≤10^-8 M или ≤10^-9 М. В одном варианте связывающая молекула может специфически связываться с очищенным человеческим антигеном с KD от 1×10^-9 M до 10×10^-9M, как было измерено с помощью OCTET®. В еще одном варианте связывающая молекула специфически связывается с человеческим антигеном, экспрессируемым на клетках с KD от 0,1×10^-9М до 10×10^-9М. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула специфически связывается с человеческим антигеном, экспрессируемым на клетках с KD около 0,1×10^-9 M, около 0,5×10^-9 M, около 1×10^-9 M, около 5×10^-9 M, около 10×10^-9M или в любом диапазоне или интервале такового. Термин «связывающая молекула» включает антитела и молекулы, полученные на основе антител.

[00222] Термин «антитело», «иммуноглобулин» или «Ig» используется здесь взаимозаменяемо и в самом широком смысле и конкретно охватывает, например, моноклональные антитела (включая агонистов, антагонистов, нейтрализующие антитела, полноразмерные или интактные моноклональные антитела), композиции антител с полиэпитопной или моноэпитопной специфичностью, поликлональные или моновалентные антитела, поливалентные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела, если они проявляют желаемую биологическую активность), образованные по меньшей мере из двух интактных антител, одноцепочечные антитела и фрагменты таковых, как описано ниже. Антитело может быть человеческим, гуманизированным, химерным и/или созревшим по аффинности, а также антителом других видов, например, мыши и кролика и т. д. Термин «антитело» предназначен для включения полипептидного продукта В-клеток в пределах иммуноглобулинового класса полипептидов, который способен связываться с определенным молекулярным антигеном и состоит из двух идентичных пар полипептидных цепей, каждая из которых имеет одну тяжелую цепь (около 50-70 кДа) и одну легкую цепь (около 25 кДа), причем каждая аминоконцевая часть каждой цепи включает вариабельную область из примерно 100-130 или более аминокислот, а каждая карбоксиконцевая часть каждой цепи включает константную область. См., например, Antibody Engineering (Borrebaeck ed., 2d ed. 1995); and Kuby, Immunology (3d ed. 1997). В конкретных вариантах осуществления конкретный молекулярный антиген может быть связан с антителом, представленным в настоящем документе, включая полипептид или эпитоп. Антитела также включают, без ограничения таковыми, синтетические антитела, рекомбинантно полученные антитела, верблюжьи антитела, интратела, антиидиотипические (анти-Id) антитела и функциональные фрагменты (например, антигенсвязывающие фрагменты) любого из вышеперечисленных, которые относится к части полипептида тяжелой или легкой цепи антитела, сохраняющей частично или полностью связывающую активность антитела, из которого был получен фрагмент. Неограничивающие примеры функциональных фрагментов (например, антигенсвязывающих фрагментов) включают одноцепочечные Fv (scFv) фрагменты (например, включая моноспецифические, биспецифические и т.д.), фрагменты Fab, фрагменты F (ab'), F(ab)₂ фрагменты, F(ab')₂ -фрагменты, дисульфидно-связанные Fv (dsFv) фрагменты, Fd-фрагменты, Fv-фрагменты, диатела, три-боди, тетра-боди и мини-тела. В частности, представленные здесь антитела включают молекулы иммуноглобулинов и иммунологически активные части молекул иммуноглобулинов, например, антигенсвязывающие домены или молекулы, содержащие антигенсвязывающий сайт, связывающийся с антигеном (например, один или более CDR областей антитела). Такие фрагменты антител можно найти, например, в: Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1989); Mol. Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference (Myers ed., 1995); Huston et al., 1993, Cell Biophysics 22:189-224; Plückthun and Skerra, 1989, Meth. Enzymol. 178:497-515; Day, Advanced Immunochemistry (2d ed. 1990.). Предоставленные здесь антитела могут относиться к любому классу (например, IgG, IgE, IgM, IgD и IgA) или любому подклассу (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) молекулы иммуноглобулина. Антитела могут быть агонистическими антителами или антагонистическими антителами.

[00223] «Антиген» представляет собой структуру, с которой антитело может избирательно связываться. Антиген-мишень может представлять собой полипептид, углевод, нуклеиновую кислоту, липид, гаптен или другое встречающееся в природе или синтетическое соединение. В некоторых вариантах осуществления антиген-мишень представляет собой полипептид. В некоторых вариантах осуществления антиген связан с клеткой, например, присутствует в клетке например, иммунной клетке) или находится на поверхности таковой.

[00224] Термины «антигенсвязывающий фрагмент», «антигенсвязывающий домен», «антигенсвязывающая область» и аналогичные термины относятся к той части связывающей молекулы, которая включает аминокислотные остатки, взаимодействующие с антигеном и отвечающие за специфичность и сродство к антигену связывающего агента (например, CDR).

[00225] Термины «связывает» или «связывание» относятся к взаимодействию между молекулами, приводящие, например, к формированию комплекса. Взаимодействия могут быть, например, нековалентными взаимодействиями, включающими водородные связи, ионные связи, гидрофобные взаимодействия и/или ван-дер-ваальсовы взаимодействия. Формирование комплекса может также включать связывание двух или более молекул, удерживаемых вместе ковалентными или нековалентными связями, взаимодействиями или силами. Сила общих нековалентных взаимодействий между конкретным антигенсвязывающим сайтом антитела и конкретным эпитопом целевой молекулы, такой как антиген, представляет собой сродство антитела или функционального фрагмента к этому эпитопу. Отношение скорости диссоциации (k_off) к скорости ассоциации (k_on) связывающей молекулы (например, антитела) с моновалентным антигеном (k_off/k_on) представляет собой константу диссоциации KD, которая обратно пропорциональна аффинности. Чем ниже значение KD, тем выше аффинность антитела. Величина KD варьируется для разных комплексов антитела и антигена и зависит как от k_on, так и от k_off. Константа диссоциации KD антитела, представленного в настоящем документе, может быть определена любым методом, предоставленного в настоящем документе, или любым другим методом, хорошо известным специалистам в данной области. Аффинность в одном сайте связывания не всегда отражает истинную силу взаимодействия между антителом и антигеном. Когда сложные антигены, такие как поливалентные антигены, содержащие несколько повторяющихся антигенных детерминант, вступают в контакт с антителами, содержащими несколько сайтов связывания, взаимодействие антитела с антигеном в одном сайте увеличивает вероятность реакции на втором сайте. Сила таких множественных взаимодействий между поливалентным антителом и антигеном называется авидностью.

[00226] В связи с описанными здесь связывающими молекулами термины, такие как «связываются с», «которые специфически связываются с», и аналогичные термины также используются взаимозаменяемо и относятся к связывающим молекулам антигенсвязывающих доменов, специфически связывающихся с антигеном, таким как полипептид. Связывающая молекула или антигенсвязывающий домен, который связывается или специфически связывается с антигеном, может иметь перекрестную реактивность на родственные антигены. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула или антигенсвязывающий домен, связывающийся или специфически связывающийся с антигеном, не вступает в перекрестную реакцию с другими антигенами. Связывающая молекула или антигенсвязывающий домен, связывающийся или специфически связывающийся с антигеном, может быть идентифицирован, например, с помощью иммуноанализов, Octet®, Biacore® или других методов, известных специалистам в данной области. Связывающая молекула или антигенсвязывающий домен «связывается или специфически связывается с антигеном», если он/а связывается с конкретным антигеном с более высоким сродством, чем с любым перекрестно-реактивным антигеном, что определяется с помощью экспериментальных методов, таких как радиоиммуноанализ (РИА) и иммуноферментный анализ (ELISA). Как правило, специфическая или избирательная реакция будет, по крайней мере, вдвое больше фонового сигнала или помех и может быть более чем в 10 раз больше фонового сигнала. См., например, Fundamental Immunology 332-36 (Paul ed., 2d ed. 1989) для обсуждения специфичности связывания. В некоторых вариантах осуществления степень связывания связывающей молекулы или антигенсвязывающего домена с «нецелевым» белком составляет менее примерно 10% степени связывания связывающей молекулы или антигенсвязывающего домена с его конкретным целевым антигеном, например, как определено анализом сортировки активированных флуоресценцией клеток (FACS) или RIA. Что касается таких терминов, как «специфическое связывание», «специфически связывается с» или «специфично для» то они означают связывание, которое заметно отличается от неспецифического взаимодействия. Специфическое связывание можно измерить, например, путем определения связывания молекулы по сравнению со связыванием контрольной молекулы, которая обычно представляет собой молекулу аналогичной структуры, не обладающую связывающей активностью. Например, специфическое связывание может быть определено путем конкуренции с контрольной молекулой, которая похожа на мишень, например, при избытке немеченой мишени. При этих условиях специфическое связывание обнаруживается, если связывание меченой мишени с зондом конкурентно ингибируется избытком немеченой мишени. Связывающая молекула или антигенсвязывающий домен, связывающиеся с антигеном, включают те молекулы, которые способны связывать антиген с достаточным сродством, таким образом, что связывающая молекула может быть полезна, например, в качестве диагностического агента при нацеливании на антиген. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула или антигенсвязывающий домен, которые связывается с антигеном, имеет константу диссоциации (K_D) менее или равную 10 нМ, 5 нМ, 4 нМ, 3 нМ, 2 нМ, 1 нМ, 0,9 нМ, 0,8 нМ, 0,7 нМ, 0,6 нМ, 0,5 нМ, 0,4 нМ, 0,3 нМ, 0,2 нМ или 0,1 нМ. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула или антигенсвязывающий домен связывается с эпитопом антигена, являющимся консервативным среди антигенов разных видов (например, между человекообразными и cyno-видами обезьян).

[00227] «Аффинность связывания» обычно относится к силе общей суммы нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, связывающим белком, таким как антитело) и ее партнером по связыванию (например, антигеном). Если не указано иное, в контексте настоящего описания «аффинность связывания» относится к внутренней аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами пары связывания (например, антитела и антигена). Термин «Bmax» относится к максимальной аффинности связывания, экстраполированной из экспериментальных результатов. Bmax можно рассчитать, используя известные в данной области методы построения кривой, например методы построения кривой, представленные в программном обеспечении GraphPad Prism 7. Аффинность связывающей молекулы X к ее партнеру по связыванию Y обычно можно представить константой диссоциации (K_D). Аффинность можно измерить обычными методами, известными в данной области, включая описанные здесь. Антитела с низким сродством обычно связывают антиген медленно и склонны легко диссоциировать, тогда как антитела с высоким сродством обычно связывают антиген быстрее и имеют тенденцию оставаться связанными дольше. В данной области известны различные методы измерения аффинности связывания, любой из которых можно использовать для целей настоящего раскрытия. Конкретные демонстрируемые варианты осуществления включают следующее. В одном варианте осуществления «K_D» или «значение K_D» можно измерить с помощью анализов, известных в данной области, например, с помощью анализа связывания. K_D можно измерить с помощью RIA, например, проведенного с Fab-версией интересующего антитела и его антигена (Chen et al., 1999, J. Mol Biol 293: 865-81). Значение K_D, или K_D также можно измерить с помощью биослойной интерферометрии (BLI) или анализа поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с помощью Octet®, используя, например, систему Octet® QK384, или Biacore®, например, Biacore® TM-2000 или Biacore® TM-3000. «Скорость», или «скорость ассоциации», или «скорость ассоциации», или «к_оn» также может быть определена с помощью тех же методов биослойной интерферометрии (BLI) или поверхностного плазмонного резонанса (SPR), описанных выше, с использованием, например, Octet ® QK384, Biacore® TM-2000 или Biacore® TM-3000.

[00228] Термин «восстановление/восстанавливающие условия», используемый здесь, относится к состоянию, при котором межцепочечные или внутрицепочечные дисульфидные (SS) мостики в белке денатурируются или восстанавливаются, например, путем добавления 2-меркаптоэтанола (2-ME) или дитиотреитола (DTT), в результате чего образуются несколько полипептидных цепей. Термин «невосстанавливающий», используемый в данном документе, относится к состоянию, при котором межцепочечные или внутрицепочечные дисульфидные (SS) мостики в белке остаются неизменными в отсутствие денатурирующих или восстанавливающих агентов, таких как 2-меркаптоэтанол (2-ME) или дитиотреитол (DTT).

[00229] В некоторых вариантах осуществления связывающие молекулы или антигенсвязывающие домены могут содержать «химерные» последовательности, в которых часть тяжелой и/или легкой цепи идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, происходящих от определенного вида или принадлежащих к конкретному классу или подклассу антител, в то время как остальная часть цепи (цепей) идентична или гомологична соответствующим последовательностям в антителах, происходящих от другого вида или принадлежащих к другому классу или подклассу антител, а также фрагментам таких антител при условии, что они проявляют желаемую биологическую активность (см. патент США № 4816567; и Morrison et al., 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851-55).

[00230] В некоторых вариантах осуществления связывающие молекулы или антигенсвязывающие домены могут содержать части «гуманизированных» форм нечеловеческих (например, мышиных) антител, представляющие собой химерные антитела, включающие человеческие иммуноглобулины (например, реципиентные антитела), в которых нативные остатки CDR заменены остатками из соответствующих CDR нечеловекообразного вида (например, донорского антитела), такого как вид мышей, крыс, кроликов или нечеловекообразных приматов, имеющими желаемую специфичность, аффинность и емкость. В некоторых случаях один или более остатков области FR человеческого иммуноглобулина заменены соответствующими остатками, происходящими из видов, неродственных человеку. Кроме того, гуманизированные антитела могут содержать остатки, которых нет в антителе-реципиенте или в антителе-доноре. Эти модификации сделаны для дальнейшего улучшения характеристик антител. Тяжелая или легкая цепь гуманизированного антитела может включать практически все из, по меньшей мере, одной или более вариабельных областей, в которых все или практически все CDR соответствуют таковым иммуноглобулина «нечеловеческого» происхождения, и все или практически все FR принадлежат последовательности иммуноглобулина человека. В некоторых вариантах реализации гуманизированное антитело будет содержать по меньшей мере часть константной области иммуноглобулина (Fc), обычно часть иммуноглобулина человека. Для получения дополнительной информации см. Jones et al., 1986, Nature 321:522-25; Riechmann et al., 1988, Nature 332:323-29; Presta, 1992, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-96; Carter et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-89; U.S. Pat. Nos: 6800738; 6719971; 6639055; 6407213; and 6054297.

[00231] В некоторых вариантах реализации связывающие молекулы или антигенсвязывающие домены могут содержать части «полностью человеческого антитела» или «человеческого антитела», эти термины используются здесь взаимозаменяемо и относятся к антителу, которое содержит вариабельную область человека и, например, постоянную область человека. В конкретных вариантах осуществления термины относятся к антителу, которое содержит вариабельную область и константную область человеческого происхождения. «Полностью человеческие» антитела в некоторых вариантах реализации могут также включать антитела, связывающие полипептиды, которые кодируются последовательностями нуклеиновых кислот, представляющими собой встречающиеся в природе соматические варианты последовательности нуклеиновой кислоты иммуноглобулина зародышевой линии человека. Термин «полностью человеческое антитело» включает антитела, имеющие вариабельные и константные области, соответствующие последовательностям иммуноглобулина зародышевой линии человека, как описано Kabat et al. (см. Kabat et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). «Человеческое антитело» - это антитело, которое обладает аминокислотной последовательностью, соответствующей таковой антитела, продуцируемого человеком и/или полученного с использованием любого из способов получения человеческих антител. Это определение человеческого антитела специально исключает гуманизированное антитело, содержащее «нечеловеческие» антигенсвязывающие остатки. Человеческие антитела можно получить с помощью различных методов, известных в данной области техники, включая использование библиотек фагового дисплея (Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol. 227: 381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581) и библиотек дрожжевого дисплея (Chao et al., 2006, Nature Protocols 1: 755-68). Для получения человеческих моноклональных антител также доступны способы, описанные в Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy 77 (1985); Boerner et al., 1991, J. Immunol. 147(1):86-95; van Dijk and van de Winkel, 2001, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74. Человеческие антитела могут быть получены путем введения антигена трансгенному животному, модифицированному для продуцирования таких антител в ответ на антигенное воздействие, чьи эндогенные локусы отключены, например, мышам (см., например, Jakobovits, 1995, Curr. Opin. Biotechnol. 6 (5): 561-66; Brüggemann and Taussing, 1997, Curr. Opin. Biotechnol. 8 (4): 455-58; и патенты США №№ 6075181 и 6150584 относительно XENOMOUSE™technology). См. также, например, Li et al., 2006, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 103:3557-62 касательно человеческих антител, полученных с помощью технологии гибридомы B-клеток человека.

[00232] В некоторых вариантах реализации связывающие молекулы или антигенсвязывающие домены могут включать части «рекомбинантного человеческого антитела», где данная фраза обозначает человеческие антитела, которые были получены, экспрессированы, созданы или выделены рекомбинантными способами, такие как антитела, экспрессируемые с использованием рекомбинантного вектора экспрессии, трансфицированного в клетку-хозяина, антитела, выделенные из рекомбинантной комбинаторной библиотеки человеческих антител, антитела, выделенные от животного (например, мыши или коровы), которое является трансгенным и/или трансхромосомным для генов иммуноглобулина человека (см., например, Taylor , LD et al. (1992) Nucl. Acids Res. 20: 6287-6295) или антитела, полученные, экспрессированные, созданные или выделенные любыми другими способами, включающими сплайсинг последовательностей гена иммуноглобулина человека с другими последовательностями ДНК. Такие рекомбинантные человеческие антитела могут иметь вариабельные и константные области, полученные из последовательности иммуноглобулина зародышевой линии человека (см. Kabat, E. A. et al. (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242). Однако, в некоторых вариантах реализации такие рекомбинантные человеческие антитела подвергаются мутагенезу in vitro (или, если используются животные, трансгенные по последовательностям Ig человека, - соматическому мутагенезу in vivo) и, таким образом, аминокислотные последовательности областей VH и VL рекомбинантного антитела представляют собой последовательности, которые, хотя и происходят из последовательностей VH и VL зародышевой линии человека и связаны с ними, могут не существовать в природе в репертуаре человеческих антител зародышевой линии in vivo.

[00233] В некоторых вариантах реализации связывающие молекулы или антигенсвязывающие домены могут включать часть «моноклонального антитела»; используемый здесь данный термин относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, например, популяции, в которой отдельные антитела идентичны, за исключением возможных встречающихся в природе мутаций, которые могут присутствовать в незначительных количествах, и каждое моноклональное антитело, как правило, распознает единственный эпитоп на антигене. В конкретных вариантах реализации термин «моноклональное антитело», используемый здесь, представляет собой антитело, продуцируемое одной гибридомой или одной другой клеткой. Термин «моноклональное» не ограничивается каким-либо конкретным способом получения антитела. Например, моноклональные антитела, используемые в настоящем описании, могут быть получены гибридомной методологией, впервые описанной Kohler et al., 1975, Nature 256: 495, или при помощи методов рекомбинантной ДНК в бактериальных или эукариотических клетках животных или растений ( см., например, патент США № 4816567). «Моноклональные антитела» также могут быть выделены из библиотек фаговых антител с использованием методов, описанных в Clackson et al., 1991, Nature 352: 624-28 и Marks et al., 1991, J. Mol. Биол. 222: 581-97, например. Другие способы получения линий клональных клеток и экспрессируемых ими моноклональных антител также хорошо известны в данной области техники. См., например, Short Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al. Eds., 5th ed. 2002).

[00234] Типичная 4-цепочечная единица антитела представляет собой гетеротетрамерный гликопротеин, состоящий из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. В случае IgG размер четырехцепочечного звена обычно составляет около 150 000 дальтон. Каждая L-цепь связана с H-цепью одной ковалентной дисульфидной связью, тогда как две H-цепи связаны друг с другом одной или более дисульфидными связями в зависимости от изотипа H-цепи. Каждая цепь H или L также имеет регулярно расположенные внутрицепочечные дисульфидные мостики. Каждая H-цепь имеет на N-конце вариабельный домен (VH), за которым следуют три константных домена (CH) для каждой из цепей α и γ и четыре домена CH для изотипов μ и ε. Каждая L-цепь имеет на N-конце вариабельный домен (VL), за которым следует константный домен (CL), расположенный на другом конце. VL выровнен с VH, а CL выровнен с первым константным доменом тяжелой цепи (CH1). Считается, что определенные аминокислотные остатки образуют поверхность раздела между вариабельными доменами легкой цепи и тяжелой цепи. Спаривание VH и VL вместе образует единый антигенсвязывающий сайт. О структуре и свойствах различных классов антител см., например, Basic and Clinical Immunology 71 (Stites et al. Eds., 8th ed. 1994) и Immunobiology (Janeway et al. eds., 5^th ed. 2001).

[00235] Термин «Fab» или «Fab-область» относится к области антитела, которая связывается с антигенами. Типичный IgG обычно включает две Fab-области, каждая из которых находится в одном из двух плеч Y-образной структуры IgG. Каждая Fab-область обычно состоит из одной вариабельной области и одной константной области для тяжелой и легкой цепи. Более конкретно, вариабельная область и константная область тяжелой цепи в области Fab представляют собой области VH и CH1, а вариабельная область и константная область легкой цепи в области Fab представляют собой области VL и CL. VH, CH1, VL и CL в области Fab могут быть расположены различными способами для придания антигенсвязывающей способности согласно настоящему раскрытию. Например, области VH и CH1 могут находиться на одном полипептиде, а области VL и CL могут находиться на другом отдельном полипептиде, аналогично области Fab типичного IgG. Альтернативно, все области VH, CH1, VL и CL могут находиться на одном полипептиде и быть ориентированы в разном порядке, как более подробно описано в разделах ниже.

[00236] Термин «вариабельная область», «вариабельный домен», «V-область» или «V-домен» относится к той части легкой или тяжелой цепи антитела, которая обычно расположена на аминоконце легкой или тяжелой цепи и имеет длину от около 120 до 130 аминокислот в тяжелой цепи и от около 100 до 110 аминокислот в легкой цепи; эта часть используются для связывания и специфичности каждого конкретного антитела в отношении его конкретного антигена. Вариабельная область тяжелой цепи может называться «VH». Вариабельная область легкой цепи может обозначается как «VL». Термин «вариабельный» относится к тому факту, что определенные сегменты вариабельных областей сильно различаются по последовательности среди антител. V-область опосредует связывание антигена и определяет специфичность конкретного антитела в отношении его конкретного антигена. Однако вариабельность неравномерно распределяется по 110-аминокислотному диапазону вариабельных областей. Как правило, V-области состоят из менее вариабельных (например, относительно инвариантных) участков, называемых каркасными областями (FR), примерно из 15-30 аминокислот, разделенных более короткими областями с большей вариабельностью (например, гипер-вариабельностью), называемыми «гипервариабельными областями», каждая длиной около 9-12 аминокислот. Каждая из вариабельных областей тяжелой и легкой цепей содержит четыре FR, в значительной степени принимающих конфигурацию β-листа, соединенных тремя гипервариабельными участками, которые образуют петли, соединяющие структуру β-листа и в некоторых случаях образующие ее часть. Гипервариабельные области в каждой цепи удерживаются вместе в непосредственной близости с помощью FR и вместе с гипервариабельными областями из другой цепи вносят вклад в формирование антигенсвязывающего сайта антител (см., например, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest (5th ed. 1991)). Константные области не участвуют непосредственно в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, например, опосредуют участие антитела в антителозависимой клеточной цитотоксичности (ADCC) и комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC). Вариабельные области значительно различаются по последовательности между разными антителами. В конкретных вариантах реализации вариабельная область представляет собой вариабельную область человека.

[00237] Термин «нумерация остатков вариабельной области по Кабату» или «нумерация аминокислотных положений поКабату» и их варианты относятся к системе нумерации, используемой для вариабельных областей тяжелой цепи или вариабельных областей легкой цепи при компиляции антител. См. Kabat et al., выше. При использовании этой системы нумерации фактическая линейная аминокислотная последовательность может содержать меньшее количество аминокислот или дополнительные аминокислоты, соответствующие делеции или вставке в FR или CDR вариабельного домена. Например, вариабельный домен тяжелой цепи может включать одну аминокислотную инсерцию (остаток 52a по Кабату) после остатка 52 и три встроенных остатка (например, остатки 82a, 82b и 82c и т.д. согласно Кабату) после остатка 82. Нумерация остатков по Кабату может быть определена для данного антитела путем выравнивания областей гомологии последовательности антитела со «стандартной» пронумерованной последовательностью по Кабату. Система нумерации Kabat обычно используется для обозначения остатка в вариабельном домене (приблизительно остатки 1-107 легкой цепи и остатки 1-113 тяжелой цепи) (см., например, Kabat et al., выше). «Система нумерации EU» или «индекс EU» обычно используется для обозначения остатка в константной области тяжелой цепи иммуноглобулина (например, индекс EU, приведенный в Kabat et al., выше). «Индекс EU по Кабату» относится к нумерации остатков человеческого антитела IgG 1 EU. Были описаны другие системы нумерации, например, AbM, Chothia, Contact, IMGT и AHon.

[00238] «Интактное» антитело представляет собой антитело, содержащее антигенсвязывающий сайт, а также CL и, по меньшей мере, константные области тяжелой цепи, CH1, CH2 и CH3. Константные области могут включать константные области аминокислотной последовательности человека или их варианты. В некоторых вариантах реализации интактное антитело выполняет одну или более эффекторных функций.

[00239] «Фрагменты антитела» включают часть интактного антитела, такую как антигенсвязывающая или вариабельная область интактного антитела. Примеры фрагментов антител включают, без ограничения, фрагменты Fab, Fab', F (ab')₂ и Fv; диатела и ди-диатела (см., например, Holliger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. 90: 6444-48; Lu et al., 2005, J. Biol. Chem. 280: 19665-72; Hudson et al., 2003, Nat. Med. 9: 129-34; WO 93/11161; и патенты США №№ 5837242 и 6492123); молекулы одноцепочечных антител (см., например, патенты США №№ 4946778; 5260203; 5482858; и 5476786); антитела с двойным вариабельным доменом (см., например, патент США № 7612181); антитела с одним вариабельным доменом (sdAbs) (см., например, Woolven et al., 1999, Immunogenetics 50: 98-101; и Streltsov et al., 2004, Proc Natl Acad Sci USA. 101: 12444-49); и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

[00240] Термин «тяжелая цепь», используемый по отношению к антителу, относится к полипептидной цепи примерно 50-70 кДа, в которой аминоконцевой участок включает вариабельную область из примерно 120-130 или более аминокислот, а карбоксиконцевая часть включает константную область. Константная область может относиться к одному из пяти различных типов (например, изотипов), называемых альфа (α), дельта (δ), эпсилон (ε), гамма (γ) и мю (μ) в зависимости от аминокислотной последовательности константной области тяжелой цепи. Различные тяжелые цепи различаются по размеру: α, δ и γ содержат примерно 450 аминокислот, а μ и ε содержат примерно 550 аминокислот. В сочетании с легкой цепью эти отдельные типы тяжелых цепей дают пять хорошо известных классов (изотипов) антител, IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, соответственно, включая четыре подкласса IgG, а именно IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4.

[00241] Термин «легкая цепь», используемый по отношению к антителу, относится к полипептидной цепи примерно 25 кДа, где аминоконцевой участок включает вариабельную область из примерно 100-110 или более аминокислот, а карбоксиконцевая часть включает константную область. Примерная длина легкой цепи составляет от 211 до 217 аминокислот. Существует два различных типа, называемых каппа (κ) или лямбда (λ), в зависимости от аминокислотной последовательности константных доменов.

[00242] В контексте настоящего описания термины «гипервариабельная область», «HVR», «область, определяющая комплементарность» и «CDR» используются взаимозаменяемо. «CDR» относится к одной из трех гипервариабельных областей (H1, H2 или H3) в пределах некаркасной области каркаса β-листа VH иммуноглобулина (Ig или антитела) или к одной из трех гипервариабельных областей (L1, L2 или L3 ) в некаркасной области каркасной области β-листа VL антитела. Соответственно, CDR представляют собой последовательности вариабельных участков, вкрапленные в последовательности каркасной области.

[00243] Области CDR хорошо известны специалистам в данной области техники, они определены с помощью хорошо известных систем нумерации. Например, области, определяющие комплементарность (CDR), основаны на вариабельности последовательностей и являются наиболее часто используемыми (см., например, Kabat et al., выше). Напротив, система Chothia относится к расположению структурных петель (см., например, Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-17). Окончание петли Chothia CDR-H1, если промумеровать таковую по Кабату, варьируется от H32 до H34 в зависимости от длины петли (это происходит потому, что схема нумерации по Кабату помещает вставки в H35A и H35B; при этом, если ни 35A, ни 35B не присутствуют, петля заканчивается на 32; если присутствует только 35A, петля заканчивается на 33; если присутствуют и 35A, и 35B, петля заканчивается на 34). Гипервариабельные области системы AbM представляют собой компромисс между CDR по Кабату и структурными петлями Chothia и используются программным обеспечением для моделирования антител программой Oxford Molecular's AbM (см., например, Antibody Engineering Vol. 2 (Kontermann and Dübel eds., 2d ed. 2010)). Расположение «контактных» гипервариабельных областей основано на анализе имеющихся сложных кристаллических структур. Другая универсальная система нумерации, которая была разработана и широко принята, - это ImMunoGeneTics (IMGT) Information System® (Lafranc et al., 2003, Dev. Comp. Immunol. 27 (1): 55-77). IMGT - это интегрированная информационная система, специализирующаяся на иммуноглобулинах (Ig), рецепторах Т-клеток (TCR) и главном комплексе гистосовместимости (MHC) человека и других позвоночных. Здесь CDR упоминаются как с точки зрения аминокислотной последовательности, так и с точки зрения местоположения в легкой или тяжелой цепи. Поскольку «расположение» CDR в структуре вариабельного домена иммуноглобулина является консервативным для разных видов и присутствует в структурах, называемых петлями, с помощью систем нумерации, которые выравнивают последовательности вариабельного домена в соответствии со структурными особенностями, остатки CDR и каркаса легко идентифицируются. Эта информация может быть использована для трансплантации и замены остатков CDR иммуноглобулинов одного вида в акцепторный каркас, как правило, человеческого антитела. Дополнительная система нумерации (AHon) была разработана Honegger and Plückthun, 2001, J. Mol. Biol. 309: 657-70. Соответствие между системами нумерации, включая, например, нумерацию по Кабату и систему уникальной нумерации IMGT, хорошо известно специалисту в данной области техники (см., например, Kabat, выше; Chothia and Lesk, выше; Martin, выше; Lefranc et al., выше). Аминокислотные остатки каждой из этих гипервариабельных областей или CDR указаны ниже.

Таблица 1: Остатки гипервариабельных областей или CDR

Петля Кабат AbM Chothia Когтакт IMGT CDR L1 L24--L34 L24--L34 L24--L34 L30--L36 L27--L38 CDR L2 L50--L56 L50--L56 L50--L56 L46--L55 L56--L65 CDR L3 L89--L97 L89--L97 L89--L97 L89--L96 L105-L117 CDR H1 H31--H35B H26--H35B H26--H32..34 H30--H35B H27--H38 (нумерация по Кабату) CDR H1 H31--H35 H26--H35 H26--H32 H30--H35 (нумерация по Chothia) CDR H2 H50--H65 H50--H58 H52--H56 H47--H58 H56--H65 CDR H3 H95--H102 H95--H102 H95--H102 H93--H101 H105-H117

[00244] Границы конкретного CDR могут варьироваться в зависимости от схемы, используемой для идентификации. Таким образом, если не указано иное, термины «CDR» и «область, определяющая комплементарность» данного антитела или его области, например вариабельная область, а также отдельные CDR (например, «CDR-H1, CDR-H2)» следует понимать в том значении, что антитело или его часть охватывают область, определяющую комплементарность, как определено любой из известных схем, описанных здесь выше. В некоторых случаях указывается схема для идентификации конкретного CDR или более CDR, например «CDR, как определено по Кабату, Chothia или «контактным» методом». В других случаях приводится конкретная аминокислотная последовательность CDR.

[00245] Гипервариабельные области могут включать «расширенные гипервариабельные области» следующим образом: 24-36 или 24-34 (L1), 46-56 или 50-56 (L2) и 89-97 или 89-96 (L3) в VL и 26-35 или 26-35A (H1), 50-65 или 49-65 (H2) и 93-102, 94-102 или 95-102 (H3) в VH.

[00246] Термин «константная область» или «константный домен» относится к карбоксиконцевой части легкой или тяжелой цепи, которая не участвует непосредственно в связывании антитела с антигеном, но проявляет различные эффекторные функции, такие как взаимодействие с Fc рецептором. Термин относится к части молекулы иммуноглобулина, имеющей более консервативную аминокислотную последовательность по сравнению с другой частью иммуноглобулина, вариабельной областью, содержащей сайт связывания антигена. «Константная область» может обозначать области CH1, CH2 и CH3 тяжелой цепи и область CL легкой цепи.

[00247] Термин «каркас» или «FR» относится к тем остаткам вариабельной области, которые фланкируют CDR. Остатки FR присутствуют, например, в химерных, гуманизированных, человеческих доменных антителах, диателах, линейных антителах и биспецифических антителах. Остатки FR представляют собой остатки вариабельного домена, отличные от остатков гипервариабельной области или остатков CDR.

[00248] Термин «Fc-область» в данном документе используется для определения C-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, включая, например, Fc-области с нативной последовательностью, рекомбинантной Fc-области и вариантной Fc-области. Хотя границы Fc-области тяжелой цепи иммуноглобулина могут варьироваться, Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG часто определяется как простирающаяся от аминокислотного остатка в положении Cys226 или от Pro230 до его карбоксильного конца. С-концевой лизин (остаток 447 согласно системе нумерации EU) области Fc может быть удален, например, во время продуцирования или очистки антитела, или путем рекомбинантной инженерии нуклеиновой кислоты, кодирующей тяжелую цепь антитела. Соответственно, композиция интактных антител может включать популяции антител с удаленными остатками K447, популяции антител без удаленных остатков K447 и популяции антител, содержащие смесь антител с остатком K447 и без него. «Функциональная область Fc» обладает «эффекторной функцией» области Fc нативной последовательности. Примеры «эффекторных функций» включают связывание C1q; CDC; связывание с рецептором Fc; ADCC; фагоцитоз; подавление рецепторов клеточной поверхности (например, рецептора В-клеток) и т. д. Такие эффекторные функции обычно требуют, чтобы область Fc была объединена с областью связывания или доменом связывания (например, вариабельной областью или доменом антитела) и эти функции можно оценить с помощью различных методик, известным специалистам в данной области техники. «Вариант Fc-области» включает аминокислотную последовательность, отличающуюся от нативной последовательности Fc-области из-за, по меньшей мере, одной модификации аминокислоты (например, замены, инсерции или делеции). В некоторых вариантах осуществления вариантная область Fc имеет, по меньшей мере, одну аминокислотную замену по сравнению с областью Fc нативной последовательности или с областью Fc исходного полипептида, например, имеет от примерно одной до примерно десяти аминокислотных замен или примерно от одной до около пяти аминокислотных замен в области Fc нативной последовательности или в области Fc родительского полипептида. Вариант Fc-области в данном документе может иметь, по меньшей мере, около 80% гомологии с Fc-областью нативной последовательности и/или с Fc-областью исходного полипептида, или, по меньшей мере, около 90% гомологии с таковыми, например, по меньшей мере около 95% гомологии с таковыми.

[00249] «Внеклеточный домен» полипептида или «ECD, extracellular domain» относится к структуре или части структуры полипептида, которая по существу свободна от трансмембранного и цитоплазматического доменов. Например, ECD может иметь менее 1% таких трансмембранных и/или цитоплазматических доменов, также может иметь менее 0,5% таких доменов.

[00250] В контексте настоящего описания термин «эпитоп» относится к локализованной области антигена, с которой связывающая молекула (например, антитело) может специфически связываться. Эпитоп может быть линейным эпитопом или конформационным, нелинейным или прерывистым эпитопом. В случае полипептидного антигена, например, эпитоп может представлять собой смежные аминокислоты полипептида («линейный» эпитоп), или эпитоп может включать аминокислоты из двух или более несмежных областей полипептида («конформационный», «нелинейный» или «прерывистый» эпитоп). Специалисту в данной области техники будет понятно, что, как правило, линейный эпитоп может зависеть или не зависеть от вторичной, третичной или четвертичной структуры. Например, в некоторых вариантах осуществления связывающая молекула связывается с группой аминокислот независимо от того, свернуты ли они в естественную трехмерную структуру белка. В других вариантах реализации связывающая молекула требует, чтобы аминокислотные остатки, составляющие эпитоп, проявляли конкретную конформацию (например, изгиб, скручивание, поворот или складывание), необходимую для распознавания и связывания эпитопа.

[00251] Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используются здесь взаимозаменяемо и относятся к полимерам аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты и может прерываться не-аминокислотами. Термины также включают аминокислотный полимер, модифицированный естественным путем или путем вмешательства; например, при образовании дисульфидной связи, гликозилировании, липидировании, ацетилировании, фосфорилировании или с помощью любых других манипуляций или модификаций. В определение также включены, например, полипептиды, содержащие один или более аналогов аминокислот, включая, но не ограничиваясь, неприродными аминокислотами, а также содержащие другие модификации, известные в данной области техники. Понятно, что, поскольку полипептиды этого раскрытия могут быть основаны на антителах или других членах суперсемейства иммуноглобулинов, в некоторых вариантах осуществления «полипептид» может существовать в виде одной цепи или двух или более связанных цепей.

[00252] Термин «вектор» относится к системе, которая используется для переноса или включения в нее последовательности нуклеиновой кислоты, включая, например, последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую связывающую молекулу (например, антитело), как описано в данном документе, с целью введения этой последовательности нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина. Векторы, применимые для использования, включают, например, векторы экспрессии, плазмиды, фаговые векторы, вирусные векторы, эписомы и искусственные хромосомы, которые могут включать последовательности для последующего отбора или маркеры, пригодные для стабильной интеграции в хромосомы клетки-хозяина. Кроме того, векторы могут включать один или более селективных маркерных генов и соответствующие последовательности контроля экспрессии. Селективные гены-маркеры, которые могут быть включены, например, обеспечивают устойчивость к антибиотикам или токсинам, дополняют ауксотрофный дефицит или поставляют важные питательные вещества, которых нет в питательной среде. Последовательности контроля экспрессии могут включать конститутивные и индуцибельные промоторы, энхансеры транскрипции, терминаторы транскрипции и т.п., хорошо известные в данной области техники. Когда две или более молекулы нуклеиновой кислоты должны быть совместно экспрессированы (например, тяжелая и легкая цепи антитела или антитела VH и VL), обе молекулы нуклеиновой кислоты могут быть встроены, например, в один и тот же вектор экспрессии или в отдельные векторы экспрессии. Для экспрессии в одном векторе кодирующие нуклеиновые кислоты могут быть функционально связаны с одной общей последовательностью контроля экспрессии или с различными последовательностями контроля экспрессии, такими как один индуцибельный промотор и один конститутивный промотор. Успешное введение молекул нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина можно подтвердить с помощью методов, хорошо известных в данной области техники. Такие методы включают, например, анализ нуклеиновых кислот, такой как Нозерн-блоттинг или амплификация мРНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР), иммуноблоттинг для экспрессии генных продуктов или другие подходящие аналитические методы для проверки экспрессии введенной последовательности нуклеиновой кислоты или ее соответствующего генного продукта. Специалистам в данной области техники понятно, когда молекулы нуклеиновой кислоты экспрессируются в количестве, достаточном для получения желаемого продукта, и, кроме того, понятно, как уровни экспрессии могут быть оптимизированы для получения достаточной экспрессии с использованием способов, хорошо известных в данной области техники.

[00253] Термин «хозяин» в контексте настоящего описания относится к животному, такому как млекопитающее (например, человеку).

[00254] Термин «клетка-хозяин» в контексте настоящего описания относится к конкретной рассматриваемой клетке, которая может быть трансфицирована молекулой нуклеиновой кислоты, и потомству или потенциальному потомству такой клетки. Потомство такой клетки может быть неидентичным родительской клетке, трансфицированной молекулой нуклеиновой кислоты из-за мутаций или влияния окружающей среды, которые могут происходить в последующих поколениях или интеграции молекулы нуклеиновой кислоты в геном клетки-хозяина.

[00255] «Изолированная нуклеиновая кислота» представляет собой нуклеиновую кислоту, например, РНК, ДНК или смешанные нуклеиновые кислоты, которая существенно отделена от других последовательностей ДНК генома, а также от белков или комплексов, таких как рибосомы и полимеразы, наличие которых естественно для нативной последовательности. «Изолированная» молекула нуклеиновой кислоты - это молекула, которая отделена от других молекул нуклеиновой кислоты, присутствующих в природном источнике данной молекулы нуклеиновой кислоты. Более того, «изолированная» молекула нуклеиновой кислоты, такая как молекула кДНК, может практически не содержать другого клеточного материала или культуральной среды при получении рекомбинантными методами или практически не содержать химических предшественников или других химикатов при химическом синтезе. В конкретном варианте осуществления одна или более молекул нуклеиновой кислоты, кодирующих антитело, как описано в данном документе, выделяются или очищаются. Термин охватывает последовательности нуклеиновых кислот, которые были удалены из их естественного окружения, и включает рекомбинантные или клонированные изоляты ДНК, химически синтезированные аналоги или аналоги, биологически синтезированные гетерологичными системами. «Существенно очищенная молекула» может включать изолированные формы молекулы.

[00256] Термины «полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота», используемые здесь взаимозаменяемо, относятся к полимерам нуклеотидов любой длины и включают ДНК и РНК. Нуклеотиды могут быть дезоксирибонуклеотидами, рибонуклеотидами, модифицированными нуклеотидами или основаниями и/или их аналогами или любым субстратом, который может быть включен в полимер с помощью ДНК- или РНК-полимеразы или с помощью синтетической реакции. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. «Олигонуклеотид» в контексте настоящего описания относится к коротким, как правило, одноцепочечным синтетическим полинуклеотидам, которые обычно, но не обязательно, имеют длину менее примерно 200 нуклеотидов. Термины «олигонуклеотид» и «полинуклеотид» не исключают друг друга. Приведенное выше описание полинуклеотидов в равной степени и полностью применимо к олигонуклеотидам. Клетка, которая продуцирует связывающую молекулу по настоящему изобретению, может представлять собой родительскую гибридомную клетку, а также бактериальные и эукариотические клетки-хозяева, в которые были введены нуклеиновые кислоты, кодирующие антитела. Если не указано иное, левый конец любой описанной здесь одноцепочечной полинуклеотидной последовательности является 5'-концом; левостороннее направление двухцепочечных полинуклеотидных последовательностей называется 5'-направлением. Направление от 5' к 3' растущих транскриптов РНК называется направлением транскрипции; участки последовательности на нити ДНК, имеющие ту же последовательность, что и транскрипт РНК, которые находятся в направлении 5' от 5' конца транскрипта РНК, называются «последовательностями, расположенными выше по течению»; области последовательности на нити ДНК, имеющие ту же последовательность, что и транскрипт РНК, которые расположены в направлении 3' от 3' конца транскрипта РНК, называются «последовательностями, расположенными ниже по течению».

[00257] «Носители» в контексте настоящего описания включают фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы, нетоксичные для клетки или млекопитающего, подвергнутых их воздействию, в используемых дозировках и концентрациях. Часто физиологически приемлемый носитель представляет собой водный pH-буферный раствор. Примеры физиологически приемлемых носителей включают буферы, такие как фосфат, цитрат и буфера на основе других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту; полипептиды с низкой молекулярной массой (например, менее примерно 10 аминокислотных остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахарные спирты, такие как маннит или сорбитол; солеобразующие противоионы, такие как натрий; и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как TWEEN™, полиэтиленгликоль (PEG) и PLURONICS ™. Термин «носитель» может также относиться к разбавителю, адъюванту (например, адъюванту Фрейнда (полному или неполному)), или наполнителю. Такие носители, включая фармацевтические носители, могут быть стерильными жидкостями, такими как вода и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и т.п. Вода является примером носителя, когда композицию (например, фармацевтическую композицию) вводят внутривенно. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также можно использовать в качестве жидких носителей, особенно в растворах для инъекций. Подходящие вспомогательные вещества (например, фармацевтические вспомогательные вещества) включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и тому подобное. Композиция, если желательно, также может содержать незначительные количества смачивающих или эмульгирующих агентов или буферных агентов pH. Композиции могут поставляться в форме растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с замедленным высвобождением и т.п. Пероральные композиции, включая составы, могут включать стандартные носители, такие как фармацевтические марки маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, сахарина натрия, целлюлозы, карбоната магния и т.д. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в Remington and Gennaro, Remington's Pharmaceutical Sciences (18-е изд. 1990 г.). Композиции, включая фармацевтические соединения, могут содержать связывающую молекулу (например, антитело), например, в изолированной или очищенной форме вместе с подходящим количеством носителей.

[00258] Термин «фармацевтически приемлемый», используемый в данном документе, означает одобрение к применению регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или внесение в Фармакопею США, Европейскую фармакопею или другую общепризнанную фармакопею для использования на животных, и, более конкретно, на людях.

[00259] Термин «эффективное количество» в контексте настоящего описания относится к количеству связывающей молекулы (например, антитела) или фармацевтической композиции, представленной в настоящем документе, которое является достаточным для получения желаемого результата.

[00260] Термины «субъект» и «пациент» могут использоваться взаимозаменяемо. В контексте настоящего описания в определенных вариантах осуществления субъект представляет собой млекопитающее, не являющееся приматом (как, например, корова, свинья, лошадь, кошка, собака, крыса и т.д.) или являющееся приматом (например, обезьяна и человек). В конкретных вариантах осуществления субъектом является человек. В одном варианте осуществления субъект представляет собой млекопитающее, например человека, у которого диагностировано состояние или расстройство. В другом варианте субъектом является млекопитающее, например человек, подверженное риску развития состояния или расстройства.

[00261] «Администрирование» или «введение» относится к действию инъекции или иной физической доставки вещества в том виде, в котором оно существует вне тела, пациенту, например, путем доставки через слизистые оболочки, внутрикожно, внутривенно, внутримышечно и/или любым другим способом физической доставки, описанным в настоящем документе или известным в данной области техники.

[00262] Используемые в данном документе термины «лечить»» и «лечение» относятся к уменьшению или облегчению прогрессирования, тяжести и/или продолжительности заболевания или состояния, возникающих в результате применения одного или более видов лечения.

[00263] Термины «примерно» и «приблизительно» означают значение в пределах 20%, в пределах 15%, в пределах 10%, в пределах 9%, в пределах 8%, в пределах 7%, в пределах 6%, в пределах 5%, в пределах 4%, в пределах 3%, в пределах 2%, в пределах 1% или меньше заданной величины или диапазона.

[00264] Будучи использованы в настоящем раскрытии и формуле изобретения, формы единственного числа включают формы множественного числа, если контекст явно не обозначает иное.

[00265] Подразумевается, что когда варианты осуществления описаны в данном документе с помощью термина «содержащий», это также предусматривает аналогичные варианты осуществления, описанные в терминах «состоящий из» и/или «состоящий по существу из». Также понятно, что везде, где варианты осуществления описаны в данном документе с помощью фразы «состоящий по существу из», то также предусматриваются аналогичные варианты осуществления, описанные в терминах «состоящий из».

[00266] Термин «и/или», используемый здесь во фразе, такой как «А и/или В», предназначен для включения как А, так и В; А или В; А (отдельно); и B (отдельно). Аналогичным образом, термин «и/или», используемый во фразе, такой как «A, B и/или C», предназначен для охвата каждого из следующих вариантов осуществления: A, B и C; А, В или С; А или С; А или В; B или C; А и С; А и В; B и C; А (отдельно); B (отдельно); и C (отдельно).

Связывающие молекулы

[00267] В настоящем документе предусмотрены связывающие молекулы (ALiCE), содержащие несколько антигенсвязывающих доменов (например, два антигенсвязывающих домена). В некоторых вариантах реализации множественные антигенсвязывающие домены связывающих молекул, представленных в настоящем документе, полезны для активации клетки, переноса клетки к иммунной клетке или перенаправления иммунной клетки.

[00268] В некоторых вариантах реализации связывающие молекулы, представленные в настоящем документе, содержат два антигенсвязывающих домена, при этом первый антигенсвязывающий домен содержит две Fab-области антитела, а второй антигенсвязывающий домен содержит Fv-область антитела. Каждая из двух областей Fab содержит две части: первую часть, имеющую вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH) и область CH1 антитела; и вторую часть, включающую легкую цепь (LC) антитела, содержащую вариабельную область легкой цепи (VL) антитела и константную область легкой цепи (CL) антитела. Каждая из двух областей Fab связывается с антигеном. Область Fv во втором антигенсвязывающем домене включает область VH и область вариабельного легкой цепи (VL) антитела. Обе области Fab связаны с областью Fv.

[00269] Таким образом, в одном аспекте настоящее раскрытие обеспечивает связывающую молекулу, содержащую:

(а) первый антигенсвязывающий домен, содержащий две Fab-области антитела, каждая из которых содержит:

(i) первую часть, содержащую вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH) и область CH1 антитела, причем первая часть не содержит областей CH2 и CH3 антитела; и

(ii) вторую часть, содержащую легкую цепь (LC) антитела, содержащую вариабельную область легкой цепи (VL) антитела и константную область легкой цепи (CL) антитела,

где каждая из двух Fab-областей антитела связывается с антигеном, и

(b) второй антигенсвязывающий домен, содержащий Fv-область антитела, содержащую VH-область и вариабельную (VL) область легкой цепи антитела,

где второй антигенсвязывающий домен связывается с антигеном, присутствующим на иммунной клетке; и где первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен соединены.

[00270] Область Fab (т.е. антигенсвязывающий фрагмент) представляет собой область антитела, которая связывается с антигенами. Обычный IgG обычно включает две Fab-области, каждая из которых находится в одном из двух плеч Y-образной структуры IgG. Каждая Fab-область обычно состоит из одной вариабельной области и одной константной области для тяжелой и легкой цепи. Более конкретно, вариабельная область и константная область тяжелой цепи в области Fab - это области VH и CH1, а вариабельная область и константная область легкой цепи в области Fab - это VL и CL области. VH, CH1, VL и CL в области Fab могут быть скомпонованы различными способами для придания антигенсвязывающей способности согласно настоящему раскрытию. Например, области VH и CH1 могут находиться на одном полипептиде, а области VL и CL могут находиться на другом отдельном полипептиде, аналогично области Fab обычного IgG. Альтернативно, все области VH, CH1, VL и CL могут находиться на одном полипептиде и быть ориентированы в разном порядке, как более подробно описано ниже.

[00271] Область Fv представляет собой область связывания антигена, которая включает область VH и область VL. Области VH и VL в области Fv могут быть расположены различными способами для придания способности связывания антигена в соответствии с настоящим раскрытием. Например, области VH и VL могут находиться на одном или разных полипептидах. Если области VH и VL находятся на одном полипептиде, они могут быть ориентированы в разном порядке, как более подробно описано ниже.

[00272] Как объяснено в Разделе I выше, термин «вариабельная область» относится к той части легкой или тяжелой цепей антитела, которая обычно расположена на аминоконце легкой или тяжелой цепи, имеет длину примерно от 120 до 130 аминокислот в тяжелой цепи и примерно от 100 до 110 аминокислот в легкой цепи и используется для связывания и придания специфичности каждому конкретному антителу по отношению к его конкретному антигену. Вариабельная область тяжелой цепи может называться «VH». Вариабельная область легкой цепи может обозначаться как «VL».

[00273] Термин «константная область» относится к карбоксиконцевой части легкой и тяжелой цепей, которая не участвует непосредственно в связывании антитела с антигеном, но проявляет различные эффекторные функции, такие как взаимодействие с рецептором Fc. Термин относится к части молекулы иммуноглобулина, имеющей более консервативную аминокислотную последовательность по сравнению с другой частью иммуноглобулина, вариабельной областью, которая содержит сайт связывания антигена. Константная область может определять механизм, используемый для разрушения антигена. Антитела делятся на пять основных классов: IgM, IgG, Iga, IgD и IgE, в зависимости от структуры константной области и иммунной функции. IgG - это класс иммуноглобулинов, характеризующийся тяжелыми цепями γ. Это самый распространенный класс иммуноглобулинов, обнаруженных в плазме. Константная область легкой цепи обозначается как «CL». Множественные С-домены тяжелой цепи (СН-домены) пронумерованы от аминоконца до карбокси-конца, например СН1, СН2, СН3 и так далее. Любые области CL и CH1 этих классов антител могут использоваться в настоящем описании. В конкретном варианте осуществления предложенные в настоящем документе области CL и CH1 относятся к типу IgG (например, IgG1). Представленная область CL области Fab, описанная в данном документе, имеет следующую аминокислотную последовательность: TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO.: 59). Представленная область CH1 области Fab, представленная в настоящем документе, имеет следующую аминокислотную последовательность: ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKV (SEQ ID NO.: 60)

[00274] Выражение «первая часть не содержит области CH2 антитела и области CH3 антитела» используется здесь для обозначения, что первая часть не содержит полной области CH2 антитела или полной области CH3. Однако эта фраза не исключает варианты осуществления, в которых часть области CH2 и/или области CH3 включены в первую часть. Кроме того, в некоторых вариантах осуществления могут быть включены варианты или укороченные варианты CH2 и/или CH3, которые не проявляют полной активности CH2 и/или CH3 (например, эффекторной функции). Анализы, такие как анализы связывания рецептора Fc или анализы активности ADCC или другие хорошо известные анализы для определения функций, связанных с областью Fc, могут быть использованы в данном случае для определения того, полностью ли сохраняются активности CH2 и/или CH3 (или активности области Fc).

[00275] В некоторых вариантах осуществления первая часть и вторая часть каждой Fab-области присутствуют на отдельных полипептидах. Каждая из двух областей Fab также может необязательно представлять собой одноцепочечную область Fab. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления первая часть и вторая часть обеих Fab-областей первого антигенсвязывающего домена находятся на одном и том же полипептиде. В других вариантах осуществления первая часть и вторая часть одной из двух Fab-областей находятся на одном полипептиде. В тех вариантах осуществления, где Fab-область представляет собой одноцепочечный Fab (т.е. первая часть и вторая часть Fab-области находятся на одном полипептиде), Fab-область может быть ориентирована от N-конца к C-концу следующим образом: VH-CH1-VL-CL. Альтернативно, одноцепочечный Fab-участок может быть ориентирован от N-конца к C-концу в следующем порядке: VL-CL-VH-CH1.

[00276] Аналогичным образом, в некоторых вариантах осуществления область VH и область VL области Fv находятся на разных полипептидах. В других вариантах осуществления область Fv второго антигенсвязывающего домена представляет собой одноцепочечный Fv (т.е. область VH и область VL области Fv находятся на одном полипептиде). В таких вариантах осуществления одноцепочечного Fv область Fv может быть ориентирована от N-конца к C-концу в следующем порядке: VH-VL или быть ориентирована от N-конца к C-концу в следующем порядке: VL-VH.

[00277] В некоторых конкретных вариантах осуществления две части каждой области Fab находятся на отдельных полипептидах, а области VH и VL области Fv также находятся на отдельных полипептидах.

[00278] В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен связаны гибкой пептидной областью. В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область содержит шарнирный участок антитела. В некоторых конкретных вариантах осуществления шарнирный участок антитела представляет собой шарнирный участок IgG. Шарнирный участок IgG, представленная в настоящем документе, может быть выбран из шарнирных участков антител различных подтипов IgG. В Таблице 2 ниже перечислены типичные подтипы IgG с базовыми шарнирными последовательностями, которые могут быть включены в гибкую пептидную область, представленную в данном документе.

Таблица 2: Типичные подтипы IgG

IgG подтип Базовая последовательность шарнирной области Seq ID NO: IgG1 EPKSCDKTHTCPPCP 55 IgG2 ERKCCVECPPCP 56 IgG3 ELKTPLDTTHTCPRCP (EPKSCDTPPPCPRCP)₃ 57 IgG4 ESKYGPPCPSCP 58

[00279] Таким образом, в некоторых более конкретных вариантах осуществления шарнирный участок IgG относится к подтипу IgG1. В других более конкретных вариантах осуществления шарнирный участок IgG относится к подтипу IgG2. Далее, в других конкретных вариантах осуществления шарнирный участок IgG относится к подтипу IgG3. В других конкретных вариантах осуществления шарнирный участок IgG относится к подтипу IgG4. В некоторых конкретных вариантах осуществления гибкая пептидная область, представленная в настоящем документе, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55. В некоторых конкретных вариантах осуществления гибкая пептидная область, представленная в настоящем документе, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56. В других конкретных вариантах осуществления, гибкая пептидная область, представленная в настоящем документе, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57. В некоторых конкретных вариантах осуществления гибкая пептидная область, представленная в настоящем документе, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58.

[00280] В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область содержит дополнительные аминокислоты. Например, в некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область дополнительно содержит линкер (например, G4S) между шарнирным участком антитела и вторым антигенсвязывающим доменом Fv. Гибкий линкер между шарнирным участком антитела и вторым доменом Fv может влиять на аффинность связывания второго домена Fv. Повышенная аффинность связывания второго домена Fv может привести к увеличению эффективности перенаправления иммунных клеток (например, эффекторных клеток, включая Т-клетки) на клетки-мишени (например, раковые клетки). Второй домен Fv должен обладать изгибом, чтобы иметь возможность взаимодействовать и связываться с поверхностным антигеном, находящимся на иммунных клетках (например, на эффекторных клетках, включая Т-клетки), потому что паратоп второго домена Fv ALiCE структурно маскируется первым Fab-доменом ALiCE. Следовательно, для уменьшения стерических затруднений и оптимизации связывания второго домена Fv с иммунными клетками (например, с эффекторными клетками, включая Т-клетки), гибкий линкер, такой как G4S, может быть введен между шарнирным участком антитела и вторым доменом Fv. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность GGGGS (G4S). В некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность (G4S)_n, где n представляет собой целое число. В некоторых конкретных вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность (G4S)₁. В некоторых более конкретных вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность (G4S)₂. В других более конкретных вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность (G4S)₃. Еще в других более конкретных вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность (G4S)₄. Другие методы конструирования и конструирования линкеров с различной гибкостью описаны более подробно, например, в публикациях Klein et al., Protein Engineering, Design & Selection, 2014, 27 (10): 325-330, и DiGiammarino et al., Landes Bioscience. , 2011, 3 (5): 487-494, каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.

[00281] Предлагаемые здесь связывающие молекулы могут необязательно содержать домен CH3. ФИГ. 1B иллюстрирует такую типичную связывающую молекулу. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен дополнительно содержит первую область CH3, связанную с областью VH области Fv, и вторую область CH3, связанную с областью VL области Fv. В некоторых вариантах осуществления области CH связаны с С-концом областей VH и VL области Fv. Присутствие областей CH3 обеспечивает способность связывающих молекул, представленных в настоящем документе, связывать Fc-рецептор. В некоторых вариантах осуществления области CH3, связанные с областью Fv, сконструированы для облегчения или обеспечения ассоциации между двумя областями CH3 при помощи существующих технологий, таких как технология «ручки в отверстия» (KiH, knobs-into-holes) или электростатическое управление. Например, стратегия «ручки в отверстия» изначально предлагались в качестве модели упаковки боковых цепей аминокислот между соседними α-спиралями, а позже было показано, что она является эффективной стратегией конструирования гомодимеров тяжелых цепей антител для гетеродимеризации. Вкратце, в некоторых вариантах осуществления этого подхода вариант «ручки» может быть сначала получен путем замены небольшой аминокислоты на более крупную в одном домене IgG CH3 (например, замена T на Y). «Ручка» была разработана для вставки в «дырку» в другом домене IgG CH3, созданную заменой большого остатка меньшим (например, заменой Y на T). Технология «ручка в отверстие» подробно описана с несколькими примерами, например, в публикациях WO 96/027011, Ridgway et al., Protein Eng 9 (1996) 617-621 и Merchant et al., Nat Biotechnol 16 (1998) 677 -681, каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки. Другие хорошо известные технологии модификации областей CH3 для облегчения или обеспечения ассоциации между двумя областями CH3 также рассматриваются в настоящем раскрытии.

[00282] Альбумин (например, сывороточный альбумин человека) используется для увеличения периода полужизни (или периода полувыведения) биологических препаратов в сыворотке. См. Dennis et al., The Journal of Biological Cheminstry, 2002, 277 (38): 35035-35043; Adams et al., MABS, 2016, 8(7): 1336-1346. Например, используется человеческий сывороточный альбумин (HSA). HSA является наиболее распространенным белком в крови, широко распределяется в тканях и несет функции стабилизации. Время полу-жизни - 19 дней. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления можно использовать альбумин (например, HSA) для увеличения периода полужизни связывающих молекул, представленных в настоящем документе. Альбумин можно использовать несколькими способами. Для примера, один подход заключается в непосредственном связывании домена альбумина (например, HSA) со связывающей молекулой, представленной в настоящем документе, либо генетически, либо химически. Другой подход заключается в использовании домена или сайта связывания альбумина (ABD или ABS).

[00283] Таким образом, связывающие молекулы, представленные в настоящем документе, могут также необязательно включать один или более связывающих доменов альбумина или сайтов связывания альбумина (ABD или ABS). На ФИГ. 1С показаны такие иллюстративные связывающие молекулы. В некоторых вариантах осуществления ABS связывающих молекул, представленных в настоящем документе, опосредует связывание с эндогенным альбумином, тем самым помогая продлить период полужизни и/или усиливая терапевтические эффекты связывающих молекул, представленных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления ABS связывающих молекул, представленных в настоящем документе, также может способствовать улучшению фармакокинетики за счет нековалентной ассоциации с альбумином. В некоторых вариантах осуществления ABS связан с С-концом области VH области Fv. В других вариантах осуществления ABS связан с С-концом области VL области Fv. В других вариантах осуществления C-конец каждой из областей VL и VH области Fv связан с ABS. В других вариантах осуществления ABS связан с областью CL по меньшей мере одной из областей Fab.

[00284] В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула может дополнительно необязательно содержать один или более доменов альбумина (например, HSA). В некоторых вариантах осуществления домен альбумина связан с С-концом области VH области Fv. В других вариантах осуществления домен альбумина связан с С-концом области VL области Fv. В других вариантах осуществления C-конец каждой из областей VL и VH области Fv связан с доменом альбумина. В других вариантах осуществления домен альбумина связан с областью CL по меньшей мере одной из областей Fab.

[00285] Каждая из двух областей Fab и области Fv связывающих молекул, представленных в настоящем документе, может связываться с антигеном. В некоторых вариантах осуществления обе области Fab связываются с разными антигенами.

[00286] В других вариантах осуществления обе области Fab связываются с одним и тем же антигеном. В некоторых вариантах осуществления обе области Fab связываются с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена. В других вариантах осуществления обе области Fab связываются с разными эпитопами одного и того же антигена.

[00287] Когда две области Fab связываются с одним и тем же антигеном - первым антигеном, первый антиген может быть таким же или отличаться от антигена (второго антигена), связанного с областью Fv. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен связываются с одним и тем же антигеном. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен связывается с эпитопом, который представляет собой один из эпитопов, связанных первым антигенсвязывающим доменом.

[00288] В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен связываются с разными антигенами, при этом первый антигенсвязывающий домен связывается с первым антигеном, а второй антигенсвязывающий домен связывается со вторым антигеном. На ФИГ. 1E представлена иллюстрация такой молекулы ALiCE, в которой первый антигенсвязывающий домен (две области Fab) связывается с раковым антигеном, а второй антигенсвязывающий домен связывается с иммунной клеткой, такой как Т-клетка, через антиген, подобный CD3. Такие молекулы ALiCE могут активировать иммунную клетку (например, Т-клетку) на взаимодействие с раковой клеткой и, таким образом, использоваться в качестве терапевтического средства для лечения рака.

[00289] Таким образом, в некоторых вариантах осуществления связывающие молекулы, представленные в настоящем документе, представляют собой биспецифические связывающие молекулы, содержащие (а) две области Fab (в первом антигенсвязывающем домене), которые обеспечивает аффинность связывания с первым антигеном и (b) область Fv (во втором антигенсвязывающем домене), которая обеспечивает аффинность связывания со вторым антигеном. Первый антигенсвязывающий домен может связываться с внеклеточным доменом поверхностного белка на одной клетке, а второй антигенсвязывающий домен может связываться с внеклеточным доменом поверхностного белка на иммунной клетке и, таким образом, объединять обе клетки.

[00290] Первый антигенсвязывающий домен (с двумя участками Fab) может связываться с раковой клеткой. Он также может связываться с нераковой клеткой. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления первый антиген представляет собой раковый антиген (например, PD-L1). В других вариантах осуществления первый антиген не является раковым антигеном.

[00291] В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на иммунных клетках, включая лимфоциты и моноциты. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на В-клетке. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на дендритной клетке. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на гранулоците. Еще внекоторый вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на врожденной лимфоидной клетке. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на мегакариоците. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на моноците. Далее, в других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на клетке-супрессоре миелоидного происхождения. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на NK-клетке.

[00292] В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на эффекторной клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на Т-хелперной клетке, регуляторной Т-клетке или цитотоксической Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на Т-хелперной клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на регуляторной Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на цитотоксической Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на CD8+ Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на CD4+ Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген содержит внеклеточный домен.

[00293] В некоторых конкретных вариантах осуществления второй антиген представляет собой CD3. В некоторых вариантах осуществления первый антиген представляет собой раковый антиген, а второй антиген представляет собой CD3.

[00294] В некоторых более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой PD-L1, а второй антиген представляет собой CD3.

[00295] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab содержит три CDR, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6 и SEQ ID NO.: 7; область VL второй части каждой области Fab включает три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 10 и SEQ ID NO.: 11; область VH области Fv содержит три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14, SEQ ID NO.: 15; а область VL области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности: SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

[00296] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 4; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 8; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; а область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[00297] В других более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой CD20, а второй антиген представляет собой CD3.

[00298] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab содержит три CDR, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 27, SEQ ID NO.: 28, SEQ ID NO.: 29; область VL второй части каждой области Fab содержит три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 31, SEQ ID NO.: 32 и SEQ ID NO.: 33; область VH области Fv содержит три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14, SEQ ID NO.: 15; а область VL области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

[00299] В некоторых вариантах осуществления VH-область первой части каждой Fab-области имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 26; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 30; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; а область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[00300] В других более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой EGFR, а второй антиген представляет собой CD3.

[00301] В некоторых вариантах осуществления, область VH первой части каждой области Fab включает три CDR, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 41, SEQ ID NO.: 42 и SEQ ID NO.: 43; область VL второй части каждой области Fab включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 45, SEQ ID NO: 46 и SEQ ID NO: 47; область VH области Fv включает три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15, а область VL области Fv включает три CDR, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

[00302] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 40; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 44; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; а область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[00303] В других более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой Her2, а второй антиген представляет собой TNF альфа. В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 51; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 52; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 53; а область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 54.

[00304] В некоторых конкретных вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен находится на N-конце и поддерживает структуру нативного антитела на N-конце, тогда как второй антигенсвязывающий домен находится на C-конце и каждый из C-концевых CH2 и CH3 доменов обеих тяжелых цепей замещены одним доменом VH и VL соответственно. ФИГ. 1A представляет собой иллюстрацию такой молекулы AliCE для примера. Более конкретно, первая часть и вторая часть каждой Fab-области находятся на отдельных полипептидах, первый антигенсвязывающий домен связывается с первым антигеном, VH-область и VL-область Fv-области находятся на разных полипептидах, второй антигенсвязывающий домен связывается со вторым антигеном, присутствующим на иммунной клетке, причем первый антиген и второй антиген являются разными антигенами.

[00305] Таким образом, в одном конкретном варианте осуществления связывающая молекула, представленная в настоящем документе, содержит:

(а) первый антигенсвязывающий домен, содержащий две Fab-области антитела, каждая из которых содержит:

(i) первую часть, содержащую вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH) и область CH1 антитела, причем первая часть не содержит области CH2 антитела и области CH3 антитела; и

(ii) вторую часть, содержащую легкую цепь (LC) антитела, содержащую вариабельную область легкой цепи (VL) антитела и константную область легкой цепи (CL) антитела,

где первая часть и вторая часть находятся на разных полипептидах; и

где первый антигенсвязывающий домен связывается с первым антигеном.

(b) второй антигенсвязывающий домен, содержащий Fv-область антитела, содержащую VH-область и вариабельную легкую (VL) область антитела, где VH-область и VL-область находятся на разных полипептидах; и где второй антигенсвязывающий домен связывается со вторым антигеном, присутствующим на иммунной клетке,

где первый антиген и второй антиген являются разными антигенами.

[00306] В некоторых вариантах осуществления первая часть одной области Fab и область VH области Fv находятся на одном полипептиде, а часть другой области Fab и область VL области Fv находятся на другом отдельном полипептиде. Таким образом, в некоторых конкретных вариантах осуществления связывающая молекула, представленная в настоящем документе, содержит:

(а) первый антигенсвязывающий домен, содержащий первый участок Fab антитела и второй участок Fab антитела, каждый из которых содержит:

(i) первую часть, содержащую вариабельную область тяжелой цепи антитела (VH) и область CH1 антитела, причем первая часть не содержит области CH2 антитела и области CH3 антитела; и

(ii) вторую часть, содержащую легкую цепь (LC) антитела, содержащую вариабельную область легкой цепи (VL) антитела и константную область легкой цепи (CL) антитела,

где первый антигенсвязывающий домен связывается с первым антигеном;

(b) второй антигенсвязывающий домен, содержащий Fv-область антитела, содержащую VH-область и вариабельную легкую (VL) область антитела, где второй антигенсвязывающий домен связывается со вторым антигеном, присутствующим на иммунной клетке,

где первый антиген и второй антиген являются разными антигенами; и

где первая часть первой области Fab и область VH области Fv находятся на одном полипептиде; а первая часть второй области Fab и область VL области Fv находятся на другом отдельном полипептиде.

[00307] В некоторых вариантах осуществления первый антиген представляет собой раковый антиген (например, PD-L1). В других вариантах осуществления первый антиген не является раковым антигеном.

[00308] В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на иммунных клетках, включая лимфоциты и моноциты. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на В-клетке. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на дендритной клетке. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на гранулоците. Далее, в других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на врожденной лимфоидной клетке. Далее, в других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на мегакариоците. Далее, в других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на моноците. Далее, в других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на клетке-супрессоре миелоидного происхождения. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на NK-клетке.

[00309] В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на эффекторной клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на Т-хелперной клетке, регуляторной Т-клетке или цитотоксической Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на Т-хелперной клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на регуляторной Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на цитотоксической Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на CD8+ Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на CD4+ Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген содержит внеклеточный домен.

[00310] В некоторых конкретных вариантах осуществления второй антиген представляет собой CD3. В некоторых вариантах осуществления первый антиген представляет собой раковый антиген, а второй антиген представляет собой CD3.

[00311] В некоторых более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой PD-L1, а второй антиген представляет собой CD3.

[00312] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6 и SEQ ID NO.: 7; область VL второй части каждой области Fab включает три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 10 и SEQ ID NO.: 11; область VH области Fv содержит три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14, SEQ ID NO.: 15; а область VL области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

[00313] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 4; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 8; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; а область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[00314] В других более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой CD20, а второй антиген представляет собой CD3.

[00315] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab включает три CDR, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 27, SEQ ID NO.: 28, SEQ ID NO.: 29; область VL второй части каждой области Fab содержит три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 31, SEQ ID NO.: 32 и SEQ ID NO.: 33; область VH области Fv содержит три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14, SEQ ID NO.: 15; а область VL области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

[00316] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 26; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 30; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; а область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[00317] В других более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой EGFR, а второй антиген представляет собой CD3.

[00318] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab включает три CDR, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 41, SEQ ID NO.: 42 и SEQ ID NO.: 43; область VL второй части каждой области Fab включает три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 45, SEQ ID NO.: 46 и SEQ ID NO.: 47; область VH области Fv включает три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15, а область VL области Fv включает три CDR, содержащие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

[00319] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 40; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 44; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; а область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[00320] В других более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой Her2, а второй антиген представляет собой TNF альфа. В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 51; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислоту последовательность SEQ ID NO.: 52; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 53; а область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 54.

[00321] В другом аспекте связывающие молекулы, представленные в настоящем документе, включают четыре пептида (две легкие цепи антитела и две подобные тяжелой цепи цепи), и их общая структура аналогична традиционному IgG, за исключением того, что Fc-область IgG заменена на Fv регион. Эта структура может быть дополнительно изменена для создания вариаций, придающих различные свойства. Более конкретно, в некоторых вариантах осуществления предлагаемая связывающая молекула содержит:

(а) первый полипептид и второй полипептид, каждый из которых содержит легкую цепь антитела,

(b) третий полипептид, содержащий первую область VH, первую область CH1 и вторую область VH; и

(c) четвертый полипептид, содержащий третью область VH, вторую CH1-область и область VL,

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образуют первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образуют второй участок Fab антигена; и

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют антигенсвязывающую область Fv.

[00322] В некоторых вариантах осуществления первый полипептид и второй полипептид имеют одинаковую аминокислотную последовательность. В этих вариантах осуществления связывающие молекулы, представленные в настоящем документе, содержат две идентичные легкие цепи (первый и второй полипептиды) и две разные цепи, подобные тяжелым цепям (третий и четвертый полипептиды).

[00323] В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связаны с областью Fv через гибкую пептидную область. В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область содержит шарнирный участок антитела. В некоторых конкретных вариантах осуществления шарнирный участок антитела представляет собой шарнирный участок IgG. В некоторых более конкретных вариантах осуществления шарнирный участок IgG относится к подтипу IgG1. В других более конкретных вариантах осуществления шарнирный участок IgG относится к подтипу IgG2. Далее, в других более конкретных вариантах осуществления шарнирный участок IgG относится к подтипу IgG3. В других более конкретных вариантах осуществления шарнирный участок IgG относится к подтипу IgG4. В некоторых конкретных вариантах осуществления гибкая пептидная область, представленная в настоящем документе, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 55. В некоторых конкретных вариантах осуществления гибкая пептидная область, представленная в настоящем документе, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 56. В других конкретных вариантах осуществления , гибкая пептидная область, представленная в настоящем документе, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57. В некоторых конкретных вариантах осуществления гибкая пептидная область, представленная в настоящем документе, содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58.

[00324] В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область содержит дополнительные аминокислоты. Например, в некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область дополнительно содержит линкер (например, G4S) между шарнирной областью антитела и вторым антигенсвязывающим доменом Fv. Гибкий линкер между шарнирной областью антитела и вторым доменом Fv может влиять на аффинность связывания второго домена Fv. Повышенная аффинность связывания второго домена Fv может привести к увеличению эффективности перенаправления иммунных клеток (например, эффекторных клеток, включая Т-клетки) на клетки-мишени (например, раковые клетки). Второй домен Fv должен быть гибким, чтобы иметь возможность взаимодействовать и связываться с поверхностным антигеном, представленным на иммунных клетках (например, на эффекторных клетках, включая Т-клетки), потому что паратоп второго домена Fv ALiCE структурно маскируется первым Fab доменом ALiCE. Следовательно, для уменьшения стерических препятствий и оптимизации связывания второго домена Fv с иммунными клетками (например, эффекторными клетками, включая Т-клетки), между шарнирной областью антитела и вторым доменом Fv может быть введен гибкий линкер, такой как G4S. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность GGGGS (G4S). В некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность (G4S)_n, где n представляет собой целое число. В некоторых конкретных вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность (G4S)₁. В некоторых более конкретных вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность (G4S)₂. В других более конкретных вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность (G4S)₃. Еще в других более конкретных вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность (G4S)₄.

[00325] В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связываются с разными антигенами. В других вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связываются с одним и тем же антигеном. В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связываются с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена. В других вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связываются с разными эпитопами одного и того же антигена.

[00326] В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab образуют первый антигенсвязывающий домен, а Fv-область образует второй антигенсвязывающий домен.

[00327] В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен связываются с одним и тем же антигеном. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен связывается с тем же эпитопом, представляющим, по меньшей мере, один из эпитопов, связанных первым антигенсвязывающим доменом.

[00328] В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен связываются с разными антигенами, при этом первый антигенсвязывающий домен связывается с первым антигеном, а второй антигенсвязывающий домен связывается со вторым антигеном.

[00329] В некоторых вариантах осуществления первый антиген представляет собой раковый антиген. В других вариантах осуществления первый антиген не является раковым антигеном.

[00330] В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на иммунных клетках, включая лимфоциты и моноциты. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на В-клетке. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на дендритной клетке. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на гранулоците. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на врожденной лимфоидной клетке. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на мегакариоците. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на моноците. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на клетке-супрессоре миелоидного происхождения. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на NK-клетке.

[00331] В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на эффекторной клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на Т-хелперной клетке, регуляторной Т-клетке или цитотоксической Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на Т-хелперной клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на регуляторной Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на цитотоксической Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на CD8+ Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на CD4+ Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген содержит внеклеточный домен.

[00332] В некоторых конкретных вариантах осуществления второй антиген представляет собой CD3. В некоторых вариантах осуществления первый антиген представляет собой раковый антиген, а второй антиген представляет собой CD3.

[00333] В некоторых более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой PD-L1, а второй антиген представляет собой CD3.

[00334] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6 и SEQ ID NO.: 7; область VL второй части каждой области Fab включает три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 10 и SEQ ID NO.: 11; область VH области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; а область VL области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 16, SEQ ID NO.: 17 и SEQ ID NO.: 19.

[00335] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 8; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; а область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[00336] В некоторых вариантах осуществления, каждый из первого полипептида и второго полипептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 3; третий полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 1; а четвертый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.:2.

[00337] В других более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой CD20, а второй антиген представляет собой CD3.

[00338] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab включает три CDR, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 27, SEQ ID NO.: 28 и SEQ ID NO.: 29; область VL второй части каждой области Fab содержит три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 31, SEQ ID NO.: 32 и SEQ ID NO.: 33; область VH области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; а область VL области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

[00339] В некоторых вариантах осуществления VH-область первой части каждой Fab-области имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 26; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 30; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; и область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[00340] В некоторых вариантах осуществления первый полипептид и второй каждый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 25; третий полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 23; а четвертый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 24.

[00341] В других более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой EGFR, а второй антиген представляет собой CD3.

[00342] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab включает три CDR, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 41, SEQ ID NO.: 42, SEQ ID NO.: 43; область VL второй части каждой области Fab включает три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 45, SEQ ID NO.: 46 и SEQ ID NO.: 47; область VH области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; а область VL области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

[00343] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 40; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 44; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; а область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[00344] В некоторых вариантах осуществления, каждый из первого полипептида и второго полипептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 39; третий полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 37; а четвертый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 38.

[00345] В других более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой Her2, а второй антиген представляет собой TNF альфа. В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 51; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 52; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 53; а область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 54.

[00346] Как описано выше, в некоторых вариантах осуществления связывающие молекулы, представленные в настоящем документе, содержат две идентичные легкие цепи и две разные цепи, подобные тяжелой цепи. Для создания рекомбинантного белка в клетках млекопитающих, таких как CHO или HEK293, очень важно понимание сборки антител и системы контроля качества, происходящих в ER. Антитело собирается и секретируется в виде тетрамера H2L2, и механизм контроля качества очень жестко регулируется ER с помощью BiP и PDI. Было известно, что развернутый домен CH1 тяжелой цепи играет роль в регуляции сборки антитела BiP-зависимым образом. Как описано ниже в разделе «Примеры», настоящее раскрытие демонстрирует, что домен VH антитела также играет роль в сборке антитела, и показывает, что тяжелая цепь, такая как цепь связывающей молекулы, представленной в настоящем документе, содержащая две области VH (одна в области Fab и один в области Fv) способствует правильной сборке связывающей молекулы.

[00347] C-концевой Fv также играет важную роль в гетеродимеризации двух различных тяжелых цепей, таким как цепи третьего и четвертого полипептидов. Поскольку взаимодействие между областями VH и VL намного сильнее, чем взаимодействие VL-VL, взаимодействие VH-VL было выбрано для осуществления гетеродимеризации между двумя различными цепями, подобными тяжелым цепям (между третьим и четвертым полипептидами). Эффективность гетеродимеризации оказалась очень высокой, и большинство связывающих молекул, экспрессируемых и очищенных в клетках млекопитающих, были гетеродимеризованными (эффективность гетеродимеризации близка к 99%).

[00348] Кроме того, эта структура обеспечивает оптимальное синаптическое расстояние между клетками-мишенями и эффекторными клетками. Расстояние между двумя N-концевыми участками Fab и C-концевыми участками Fv было оценено как 40 Å. Кроме того, связывающая молекула, представленная в настоящем документе, имеет большую сложность укладки (из=за размера молекулы), чем другие известные биспецифические антитела, такие как BiTE, DART и другие форматы биспецифических антител на основе ScFv, и, таким образом, ожидается, что они будут обладать улучшенной термодинамической стабильностью.

[00349] Кроме того, в некоторых вариантах осуществления связывающие молекулы, представленные в настоящем документе, представляют собой биспецифические связывающие молекулы, в которых две области Fab (N-концевые F(ab')₂) связываются с первым антигеном (например, раковым антигеном) и Fv-область связывается с иммунной клеткой (например, Т-клеткой). В некоторых вариантах осуществления связывающие молекулы, представленные в настоящем документе, замыслены и сконструированы в Y-образной форме для обеспечения синергетического эффекта функции антитела и иммунного перенаправления (например, перенаправления Т-клеток), например, для максимальной противоопухолевой активности. Конфигурация молекул ALiCE (преимущественно Y-образная) предназначена для обеспечения оптимального иммунологического синаптического расстояния между двумя антигенсвязывающими доменами (двумя паратопами-мишенями) и максимального функционального перенаправления клетки (например, Т-клетки) на другие клетки (например, на опухолевые клетки). Дополнительно обеспечивается высокое сродство из-за бивалентного N-конца (две Fab-области), в то время как нежелательная, независимая от мишени активация Т-клеток снижается из-за моновалентной низкой аффинности области Fv к антигену иммунных клеток.

[00350] Сообщалось, что связывающая молекула может принимать разные конфигурации, влияющие на расстояние между доменами в связывающей молекуле (Zhang X. et al. 3D Structural Fluctuation of IgG1 Antibody Revealed by IndividualParticle Electron Tomography. Scientific Reports 5, Article number: 9803 (2015); Klein J. S. et al. Examination of the contributions of size and avidity to the neutralization mechanisms of the anti-HIV antibodies b12 and 4E10. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009 May 5;106(18):7385-90; обе публикации включены в настоящий документ в качестве ссылки во всей их полноте). В некоторых вариантах осуществления молекулы ALiCE могут иметь разные конфигурации, например, молекулы ALiCE могут находиться в Y-образной форме или в T-образной форме. В некоторых вариантах осуществления разные конфигурации молекул ALiCE могут влиять на расстояние между двумя N-концевыми участками Fab и C-концевыми участками Fv в молекулах ALiCE. В некоторых вариантах осуществления расстояние между двумя N-концевыми участками Fab и C-концевыми участками Fv в связывающих молекулах, представленных в настоящем документе, можно оценить как находящееся в диапазоне от примерно 40 Å до примерно 70 Å. В некоторых вариантах осуществления расстояние между двумя N-концевыми участками Fab и C-концевыми участками Fv в связывающих молекулах, представленных в настоящем документе, можно оценить как около 42 Å. В некоторых других вариантах осуществления расстояние между двумя N-концевыми участками Fab и C-концевыми участками Fv в связывающих молекулах, представленных в настоящем документе, можно оценить как примерно 60 Å.

[00351] Таким образом, в различных биспецифических связывающих молекулах, представленных в настоящем документе, аффинность связывания первого антигенсвязывающего домена с первым антигеном выше, чем аффинность связывания второго антигенсвязывающего домена со вторым антигеном. Например, как показано в Примере 3 ниже, кинетика связывания ACE-05 с человеческим PD-L1 была сравнима с таковой исходного анти- PD-L1 антитела (т.е. YBL-007 от Y-Biologics, Inc.) (см. Фиг. . 12A-12C). Напротив, аффинность связывания ACE-05 с CD3 была намного ниже, чем у исходного анти-CD3 антитела (UCHT1 от BioLegend, США) (см. Фиг. 12A-12C).

[00352] В общем, взаимодействия антиген-антитело являются нековалентными и обратимыми, они образуются при комбинации водородных связей, гидрофобных взаимодействий, электростатических сил и сил Ван-дер-Ваальса. При описании силы комплекса антиген-антитело обычно упоминается сродство и/или авидность. Как упоминалось выше, связывание антитела с его антигеном является обратимым процессом, и аффинность связывания обычно указывается как константа равновесной диссоциации (K_D). K_D - это отношение скорости диссоциации антитела (k_off или k_d) (как быстро оно диссоциирует от своего антигена) к скорости ассоциации антитела (k_on или k_a) (как быстро оно связывается со своим антигеном). В некоторых вариантах осуществления значения K_D определяют путем измерения скоростей k_on и k_off конкретного взаимодействия антитело/антиген, а затем используют отношение этих значений для расчета значения K_D. Значения K_D можно использовать для оценки и ранжирования силы индивидуальных взаимодействий антитело/антиген. Чем ниже K_D антитела, тем выше сродство антитела к его мишени. Авидность является мерой общей силы комплекса антитело-антиген. Это зависит от трех основных параметров: (i) аффинностью антитела к эпитопу, (ii) валентностью как антитела, так и антигена и (iii) структурным расположением взаимодействующих частей.

[00353] В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, представленная в настоящем документе, связывает одну или более мишеней, антигенов или эпитопов с константой диссоциации (K_D) примерно 1 мкМ или менее, примерно 100 нМ или менее, примерно 40 нМ или менее, примерно 20 нМ или менее, примерно 10 нМ или менее, примерно 1 нМ или менее, примерно 0,1 нМ или менее, 50 пМ или менее, 10 пМ или менее, или 1 пМ или менее. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, представленная в настоящем документе, связывает мишень, антиген или эпитоп с K_D примерно 20 нМ или менее. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула связывает мишень, антиген или эпитоп с K_D примерно 10 нМ или менее. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула связывает мишень, антиген или эпитоп с K_D примерно 1 нМ или менее. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула связывает мишень, антиген или эпитоп с K_D примерно 0,5 нМ или менее. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, представленная в настоящем документе, связывает мишень, антиген или эпитоп с KD примерно 0,1 нМ или менее. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, представленная в настоящем документе, связывает мишень, антиген или эпитоп с KD примерно 50 пМ или менее. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, представленная в настоящем документе, связывает мишень, антиген или эпитоп с KD примерно 25 пМ или менее. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, представленная в настоящем документе, связывает мишень, антиген или эпитоп с KD примерно 10 пМ или менее. В некоторых вариантах Как видно, связывающая молекула, представленная в настоящем документе, связывает мишень, антиген или эпитоп с KD примерно 1 пМ или менее. В некоторых вариантах осуществления константа диссоциации связывающей молекулы, представленной в настоящем документе, с мишенью или антигеном, представляет собой константу диссоциации, определенную с использованием слитого белка, содержащего по менеей мере часть целевого белка, иммобилизованного на чипе Octet®. В некоторых вариантах осуществления константа диссоциации связывающей молекулы, представленной в настоящем документе, с мишенью или антигеном, представляет собой константу диссоциации, определенную с использованием связывающего агента, захваченного анти-IG (человека) антителом на чипе Octet® и растворимого целевого белка.

[00354] В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, представленная в настоящем документе, связывает мишень, антиген или эпитоп при половине максимальной эффективной концентрации (ЕС₅₀) примерно 1 мкМ или менее, примерно 100 нМ или менее, примерно 40 нМ или менее, примерно 20 нМ или менее, примерно 10 нМ или менее, примерно 1 нМ или менее, или примерно 0,1 нМ или менее. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, представленная в настоящем документе, связывает мишень, антиген или эпитоп с ЕС₅₀ примерно 1 мкМ или менее, примерно 100 нМ или менее, примерно 40 нМ или менее, примерно 20 нМ или менее, примерно 10 нМ или менее. , примерно 1 нМ или менее, или примерно 0,1 нМ или менее.

[00355] В некоторых вариантах осуществления, значение K_D для молекулы, связывающей первый антиген, примерно в 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 50 раз или более больше, чем K_D для молекулы, связывающей второй антиген. В некоторых вариантах осуществления значение K_D для молекулы, связывающей первый антиген, примерно в 10, 10², 10³ или 10⁴ раз больше K_D для молекулы, связывающей второй антиген.

[00356] В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, представленная в настоящем документе (например, биспецифическая связывающая молекула), содержит по меньшей мере часть одного или более «родительских» антител. В некоторых вариантах осуществления исходное антитело представляет собой рекомбинантное антитело. В некоторых вариантах осуществления исходное антитело представляет собой моноклональное антитело. В некоторых вариантах осуществления исходное антитело представляет собой поликлональное антитело. В некоторых вариантах осуществления исходное антитело представляет собой химерное антитело. В некоторых вариантах осуществления исходное антитело представляет собой гуманизированное антитело. В некоторых вариантах осуществления исходное антитело представляет собой человеческое антитело или полностью человеческое антитело. В некоторых вариантах осуществления исходное антитело представляет собой антитело IgA, IgD, IgE, IgG или IgM. В некоторых вариантах осуществления исходное антитело представляет собой антитело IgG1. В некоторых вариантах осуществления исходное антитело представляет собой антитело IgG2. В некоторых вариантах осуществления исходное антитело представляет собой антитело IgG3. В некоторых вариантах осуществления исходное антитело представляет собой антитело IgG4.

[00357] В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, представленная в настоящем документе (например, биспецифическая связывающая молекула), является изолированной. В некоторых вариантах осуществления предлагаемая связывающая молекула (например, биспецифическая связывающая молекула) является существенно очищенной.

[00358] В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, представленная в настоящем документе (например, биспецифическая связывающая молекула), или ее часть получена по меньшей мере из одного моноклонального антитела. В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело получают с использованием методов гибридомы, известных специалисту в данной области техники. Например, используя гибридомный метод, мышь, крысу, кролика, хомяка или другое подходящее животное-хозяин иммунизируют, как описано выше, для индукции продукции антител, специфически связывающихся с иммунизирующим антигеном. В некоторых вариантах осуществления лимфоциты иммунизируют in vitro. В некоторых вариантах осуществления иммунизирующий антиген представляет собой белок человека или фрагмент такового. В некоторых вариантах осуществления иммунизирующий антиген представляет собой белок мыши или фрагмент такового.

[00359] После иммунизации лимфоциты выделяют и сливают с подходящей линией миеломных клеток, используя, например, полиэтиленгликоль. Клетки гибридомы отбирают с использованием специализированных сред, известных в данной области, и неслитые лимфоциты и клетки миеломы не выживают в процессе отбора. Гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела, специфически направленные против выбранного антигена, могут быть идентифицированы различными методами, включая, помимо прочего, иммунопреципитацию, иммуноблоттинг и анализы связывания in vitro (например, проточная цитометрия, FACS, ELISA и радиоиммуноанализ). После идентификации гибридомных клеток, продуцирующих антитела с желаемой специфичностью, аффинностью и/или активностью, клоны можно субклонировать с помощью методов ограничивающего разведения. Гибридомы можно размножать либо в культуре in vitro с использованием стандартных методов, либо in vivo как асцитные опухоли у животных. Моноклональные антитела можно очищать из культуральной среды или асцитной жидкости стандартными методами, известными в данной области, включая, но не ограничиваясь таковыми, аффинную хроматографию, ионообменную хроматографию, гель-электрофорез и диализ.

[00360] В некоторых вариантах осуществления моноклональные антитела могут быть получены с использованием методов рекомбинантной ДНК, известных специалистам в данной области техники. Например, в некоторых примерах полинуклеотиды, кодирующие моноклональное антитело, выделяют из зрелых B-клеток или гибридомных клеток, например, с помощью RT-PCR используя олигонуклеотидные праймеры, которые специфически амплифицируют гены, кодирующие тяжелую и легкую цепи антитела, а их последовательность определяют с использованием стандартных методик. Затем выделенные полинуклеотиды, кодирующие тяжелую и легкую цепи, клонируют в подходящие векторы экспрессии, продуцирующие моноклональные антитела при трансфекции в клетки-хозяева, такие как E.coli, клетки обезьяны COS, клетки яичников китайского хомячка (СНО) или клетки миеломы, которые, в противном случае, не продуцируют белки иммуноглобулина.

[00361] В некоторых других вариантах осуществления рекомбинантные моноклональные антитела или фрагменты таковых могут быть выделены из библиотек фагового дисплея, экспрессирующих вариабельные домены или CDR желаемого вида. Скрининг фаговых библиотек можно проводить различными методами, известными в данной области техники.

[00362] В некоторых вариантах осуществления моноклональное антитело модифицируется, например, с использованием технологии рекомбинантной ДНК для создания альтернативных антител. В некоторых вариантах осуществления константные домены легкой цепи и тяжелой цепи, например, моноклонального антитела мыши могут быть заменены на константные области, например, человеческого антитела для образования химерного антитела или полипептида, не являющегося иммуноглобулином, для создания гибридного антитела. В некоторых вариантах осуществления константные области усекаются или удаляются, чтобы получить желаемый фрагмент антитела моноклонального антитела. В некоторых вариантах осуществления сайт-направленный мутагенез или мутагенез высокой плотности вариабельной (ых) области (ей) используется для оптимизации специфичности и/или аффинности моноклонального антитела.

[00363] В некоторых вариантах осуществления предлагаемая в настоящем документе связывающая молекула (например, биспецифическая связывающая молекула) или фрагмент таковой происходят из гуманизированного антитела. В данной области техники известны различные способы получения гуманизированных антител. В некоторых вариантах осуществления гуманизацию проводят путем замены одной или более последовательностей CDR, отличных от человека, на соответствующие последовательности CDR антитела человека. В некоторых вариантах осуществления гуманизированные антитела получают путем замены всех шести CDR родительского антитела, не относящегося к человеку (например, грызуна), на соответствующие последовательности CDR человеческого антитела.

[00364] Выбор вариабельной области тяжелой цепи человека и вариабельной области легкой цепи человека для использования в создании гуманизированных антител может быть сделан на основании множества факторов и различных методов. В некоторых вариантах осуществления используется метод «наилучшего соответствия», когда последовательность вариабельной области антитела «нечеловеческого» происхождения (например, грызуна) подвергают скринингу против всей библиотеки известных последовательностей вариабельной области человека. Человеческая последовательность, которая наиболее похожа на последовательность «нечеловеческой» последовательности, выбирается в качестве основы вариабельной области человека для гуманизированного антитела. В некоторых вариантах осуществления используется способ, в котором выбирается конкретный каркас вариабельной области, полученный из консенсусной последовательности всех человеческих антител конкретной подгруппы легких или тяжелых цепей. В некоторых вариантах осуществления каркас происходит из консенсусных последовательностей наиболее распространенных подклассов человека. В некоторых вариантах осуществления гены зародышевой линии человека используются в качестве источника последовательностей каркасной области вариабельной области.

[00365] Другие методы гуманизации включают в себя, без ограничения таковыми, метод, называемый «сверхгуманизацией», в котором описывается прямой перенос CDR в каркас зародышевой линии человека; метод, называемый HSC (HSC, Human String Content), который основан на метрике «человечности» антитела, методы, основанные на создании больших библиотек гуманизированных вариантов (включая библиотеки фаговых, рибосомных и дрожжевых дисплеев), и методы, основанные на перестановке каркасных областей.

[00366] В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, представленная в настоящем документе (например, биспецифическая связывающая молекула), или фрагмент таковой получены из человеческого антитела. Антитела человека можно получить непосредственно с использованием различных методик, известных в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления человеческие антитела генерируются из иммортализованных В-лимфоцитов человека, иммунизированных in vitro. В некоторых вариантах осуществления человеческие антитела генерируются из лимфоцитов, выделенных от иммунизированного человека. В любом случае клетки, продуцирующие антитела, направленные против антигена-мишени, могут быть созданы и изолированы. В некоторых вариантах осуществления человеческое антитело выбирается из фаговой библиотеки, причем эта фаговая библиотека экспрессирует человеческие антитела. Альтернативно, технология фагового дисплея может быть использована для получения человеческих антител и фрагментов антител in vitro из репертуаров генов вариабельной области иммуноглобулина от неиммунизированных доноров. Методы создания и использования фаговых библиотек антител хорошо известны в данной области техники. После того, как нужные антитела идентифицированы, стратегии созревания аффинности, известные в данной области, включая, без ограничения таковыми, перетасовку цепей и сайт-направленный мутагенез, могут быть использованы для создания человеческих антител с более высокой аффинностью.

[00367] В некоторых вариантах осуществления человеческие антитела продуцируются у трансгенных мышей, содержащих локусы иммуноглобулина человека. После иммунизации эти мыши способны производить полный репертуар антител человека при отсутствии выработки эндогенного иммуноглобулина.

[00368] В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, представленная в настоящем документе (например, биспецифическая связывающая молекула) или фрагмент таковой, описанные в настоящем документе, получены из антител (например, полноразмерных антител или их фрагментов), которые содержат модификации по меньшей мере одной или более постоянных областей. В некоторых вариантах осуществления антитела содержат модификации одной или более из трех константных областей тяжелой цепи (например, CH1) и/или константной области легкой цепи (CL). В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи модифицированных антител содержит по меньшей мере одну константную область человека. В некоторых вариантах осуществления константная область тяжелой цепи модифицированных антител включает более одной константной области человека. В некоторых вариантах осуществления модификации константной области включают инсерции, делеции или замены одной или более аминокислот в одной или более областях. В некоторых вариантах осуществления одна или более областей частично или полностью удалены из соответствующих областей модифицированных антител. В некоторых вариантах осуществления весь домен CH2 удален из антитела (конструкции ΔCH2). В некоторых вариантах осуществления весь домен CH3 удален из антитела (конструкции ΔCH3). В некоторых вариантах осуществления пропущенная константная область заменена коротким аминокислотным спейсером (например, 10 аминокислотных остатков), который обеспечивает некоторую молекулярную гибкость, обычно обеспечиваемую отсутствующей константной областью.

[00369] Модификации константной области антител (например, родительского антитела) и/или связывающей молекулы, представленной в настоящем документе (например, биспецифического антитела), описанной в настоящем документе, можно осуществить с использованием хорошо известных методов биохимической или молекулярной инженерии. В некоторых вариантах осуществления варианты могут быть получены путем внесения соответствующих нуклеотидных изменений в кодирующую ДНК и/или путем прямого синтеза желаемого полипептида или агента. В этом отношении становится возможным нарушение активности или эффекторной функции, обеспечиваемой конкретной последовательностью или областью, и в то же время по существу сохранить структуру, активность связывания и другие желаемые характеристики модифицированного связывающего агента.

[00370] Настоящее раскрытие дополнительно охватывает дополнительные варианты и эквиваленты, которые по существу гомологичны описанным здесь связывающим молекулам. В некоторых вариантах осуществления желательно улучшить аффинность связывания и/или другие биологические свойства связывающих молекул, включая, без ограничения таковыми, специфичность, термостабильность, уровень экспрессии, эффекторные функции, гликозилирование, пониженную иммуногенность или растворимость. Специалисты в данной области техники знают, что замены аминокислот могут изменить посттрансляционные процессы полипептида.

[00371] Вариации могут представлять собой замену, делецию или инсерцию одного или более нуклеотидов, кодирующих мультиспецифический связывающий агент, что приводит к изменению аминокислотной последовательности по сравнению с последовательностью исходного связывающего агента. Аминокислотные замены могут быть результатом замены одной аминокислоты другой аминокислотой, имеющей аналогичные структурные и/или химические свойства, такими как замена лейцина серином, или, например, консервативные замены аминокислот. В некоторых вариантах осуществления инсерции или делеции составляют от примерно 1 до 5 аминокислот. В некоторых вариантах осуществления инсерции, делеции или замены включают менее 25 аминокислотных замен, менее 20 аминокислотных замен, менее 15 аминокислотных замен, менее 10 аминокислотных замен, менее 5 аминокислотных замен, менее 4 аминокислотные замены, менее 3 аминокислотных замен или менее 2 аминокислотных замен относительно исходной молекулы. Вариации в аминокислотной последовательности, которые являются биологически полезными и/или релевантными, могут быть определены путем систематического выполнения инсерций, делеций или замен в последовательности и тестирования полученных вариантных белков на активность по сравнению с исходным белком.

[00372] В некоторых вариантах осуществления варианты могут включать добавление аминокислотных остатков на амино- и/или карбоксильном конце одного или более полипептидов, составляющих связывающие молекулы, представленные в настоящем документе. Длина дополнительных аминокислотных остатков может составлять от одного остатка до ста или более остатков. В некоторых вариантах осуществления вариант содержит N-концевой метионильный остаток. В некоторых вариантах осуществления вариант содержит дополнительный полипептид/белок, т.е. является слитым белком. В некоторых вариантах осуществления вариант разработан так, чтобы его можно было выявлять, и он может содержать детектируемую метку и/или белок (например, фермент).

[00373] В некоторых вариантах осуществления, остаток цистеина, не участвующий в поддержании надлежащей конформации связывающей молекулы, представленной в настоящем документе, заменяется или удаляется для модуляции характеристики агента, например, для улучшения окислительной стабильности и/или предотвращения аберрантного сшивания дисульфидов. И наоборот, в некоторых вариантах осуществления один или более остатков цистеина добавляется для создания дисульфидной связи(ей) для улучшения стабильности.

[00374] В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула согласно настоящему раскрытию является «деиммунизированной». Деиммунизация агентов, таких как антитела, обычно включает введение специфических мутаций для удаления эпитопов Т-клеток без значительного снижения аффинности связывания или других желаемых активностей агента.

[00375] Варианты связывающих молекул или полипептидов, описанные в настоящем документе, могут быть получены с использованием способов, известных в данной области, включая, без ограничения таковыми, сайт-направленный мутагенез, мутагенез аланинового сканирования и мутагенез посредством ПЦР.

[00376] В некоторых вариантах осуществления описанная здесь связывающая молекула химически модифицирована. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула представляет собой биспецифическое антитело, химически модифицированое гликозилированием, ацетилированием, пегилированием, фосфорилированием, амидированием, дериватизацией известными защитными/блокирующими группами, протеолитическим расщеплением и/или связыванием с клеточным лигандом или другим белком. Любая из многочисленных химических модификаций может быть проведена известными методами.

[00377] Полипептиды, которые составляют описанные здесь мультиспецифические связывающие агенты, могут быть получены любым подходящим способом, известным в данной области техники и более подробно описанным в Разделе III и Разделе IV ниже.

[00378] Настоящее раскрытие также обеспечивает конъюгаты, содержащие любую из связывающих молекул (например, биспецифических антител), описанных в данном документе. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, представленная в настоящем документе, присоединена к дополнительной молекуле. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, представленная в настоящем документе, конъюгирована с цитотоксическим агентом или фрагментом. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, представленная в настоящем документе, конъюгирована с цитотоксическим агентом с образованием ADC (конъюгата «антитело-лекарственное средство»). В некоторых вариантах осуществления цитотоксический фрагмент представляет собой химиотерапевтический агент, включая, без ограничения таковыми, метотрексат, адриамицин/доксорубицин, мелфалан, митомицин C, хлорамбуцил, дуокармицин, даунорубицин, пирролобензодиазепины (PBD) или другие интеркалирующие агенты. В некоторых вариантах осуществления цитотоксический фрагмент представляет собой ингибитор микротрубочек, включая, без ограничения таковыми, ауристатины, майтанзиноиды (например, DMI и DM4) и тубулизины. В некоторых вариантах осуществления цитотоксический фрагмент представляет собой ферментативно активный токсин бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или его фрагменты, включая, помимо прочего, дифтерийную А-цепь, не связывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, А-цепь экзотоксина. , цепь рицина A, цепь абрина A, цепь модекцина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор Sapaonaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, представленная в настоящем документе, конъюгирована с одним или более низкомолекулярными токсинами, такими как калихеамицины, майтанзиноиды, трихотены и CC1065. Производные любого из этих токсинов можно использовать в конъюгате до тех пор, пока производное сохраняет цитотоксическую активность.

[00379] Конъюгаты, содержащие связывающую молекулу, представленную в настоящем документе, могут быть получены с использованием любых подходящих способов, известных в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления конъюгаты получают с использованием различных бифункциональных связывающихся с белками агентов, таких как N-сукцинимидил-3- (2-пиридидитиол) пропионат (SPDP), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис (п-азидобензоил) гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис- (пара-диазонийбензоил) этилендиамин), диизоцианаты (такие как 2,6-диизоцианат толуола) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол).

[00380] В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула (например, биспецифическое антитело), описанная в настоящем документе, конъюгирована с детектируемыми веществами или молекулами, которые позволяют использовать антитела для диагностики и/или обнаружения. Выявляемые вещества могут включать, без ограничения таковыми, ферменты, такие как пероксидаза хрена, щелочная фосфатаза, бета-галактозидаза и ацетилхолинэстераза; простетические группы, такие как биотин и флавин(ы); флуоресцентные материалы, такие как умбеллиферон, флуоресцеин, флуоресцеинизотиоцианат (FITC), родамин, тетраметилродамина изотиоцианат (TRITC), дихлортриазиниламин флуоресцеин, дансилхлорид, цианин (Cy3) и фикоэритрин; биолюминесцентные материалы, такие как люцифераза; радиоактивные материалы, такие как ²¹²Bi, ¹⁴C, ⁵⁷Co, ⁵¹Cr, ⁶⁷Cu, ¹⁸F, ⁶⁸Ga, ⁶⁷Ga, ¹⁵³Gd, ¹⁵⁹Gd, ⁶⁸Ge, ³H, ¹⁶⁶Ho, ¹³¹I, ¹²⁵I, ¹²³I, ¹²¹I, ¹¹⁵In, ¹¹³In, ¹¹²In, ¹¹¹In, ¹⁴⁰La, ¹⁷⁷Lu, ⁵⁴Mn, ⁹⁹Mo, ³²P, ¹⁰³Pd, ¹⁴⁹Pm, ¹⁴²Pr, ¹⁸⁶Re, ¹⁸⁸Re, ¹⁰⁵Rh, ⁹⁷Ru, ³⁵S, ⁴⁷Sc, ⁷⁵Se, ¹⁵³Sm, ¹¹³Sn, ¹¹⁷Sn, ⁸⁵Sr, ^99mTc, ²⁰¹Ti, ¹³³Xe, ⁹⁰Y, ⁶⁹Yb, ¹⁷⁵Yb, ⁶⁵Zn;; позитронно-излучающие металлы; и магнитные ионы металлов.

[00381] В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, представленная и описанная в настоящем документе, прикреплена к твердой подложке, что особенно выгодно для иммуноанализов или очистки целевого антигена(ов). Такие твердые подложки включают, без ограничения таковыми, стекло, целлюлозу, полиакриламид, нейлон, полистирол, поливинилхлорид или полипропилен.

[00382] В некоторых вариантах осуществления связывающие молекулы, представленные в настоящем документе, включены в фармацевтическую композицию. Следовательно, в еще одном аспекте в настоящем документе предоставляется фармацевтическая композиция, содержащая терапевтически эффективное количество связывающей молекулы, представленной в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель. Представленная здесь фармацевтическая композиция описана более подробно в разделе V ниже. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция предназначена для лечения заболевания или состояния у субъекта. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой рак. В других вариантах осуществления рак представляет собой рак, положительный по PD-L1. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак легких. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой немелкоклеточную карциному легкого (NSCLC). В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой диффузную крупноклеточную B-лимфому (DLBCL). В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак прямой кишки. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак груди. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой лимфому. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой меланому. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак яичников.

[00383] В некоторых вариантах осуществления связывающие молекулы, представленные в настоящем документе, используются для лечения заболевания или состояния. Таким образом, в еще одном аспекте в настоящем документе предоставляется способ лечения заболевания или состояния у субъекта, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества связывающей молекулы, представленной в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой рак. В других вариантах осуществления рак представляет собой рак, положительный по PD-L1. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак легких. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой немелкоклеточную карциному легкого (NSCLC). В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой диффузную крупноклеточную B-лимфому (DLBCL). В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак прямой кишки. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак молочной железы. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой лимфому. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой меланому. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак яичников. Более подробное описание способов введения настоящих связывающих молекул находится в Разделе VI ниже.

Полинуклеотиды

[00384] В некоторых вариантах осуществления раскрытие охватывает полинуклеотиды, которые кодируют связывающую молекулу, описанную в данном документе. Термин «полинуклеотиды, кодирующие полипептид» охватывает полинуклеотид, включаеющий только кодирующие последовательности для полипептида, а также полинуклеотид, содержащий дополнительные кодирующие и/или некодирующие последовательности. Полинуклеотиды, раскрытые в настоящем документе, могут находиться в форме РНК или в форме ДНК. ДНК включает кДНК, геномную ДНК и синтетическую ДНК; могут быть двухцепочечными или одноцепочечными, и, если полинуклеотид является одноцепочечным, то он может служить кодирующей цепью или некодирующей (антисмысловой) цепью.

[00385] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид содержит кодирующую последовательность для полипептида, слитого в той же рамке считывания с полинуклеотидом, который принимает участие, например, в экспрессии и секреции полипептида из клетки-хозяина (например, полипептид лидерной последовательности, функционирующей в качестве секреторной последовательности для контроля транспорта полипептида). Полипептид может иметь лидерную последовательность, расщепленную клеткой-хозяином с образованием «зрелой» формы полипептида.

[00386] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид содержит кодирующую последовательность для полипептида, слитого в той же рамке считывания с последовательностью маркера или метки. Например, в некоторых вариантах осуществления маркерная последовательность представляет собой гексагистидиновую метку, поставляемую вектором, который позволяет эффективно очищать полипептид, слитый с маркером, в случае бактериального хозяина. В некоторых вариантах осуществления маркер используется вместе с другими аффинными тегами.

[00387] Настоящее раскрытие дополнительно относится к вариантам полинуклеотидов, описанных в данном документе, где вариант кодирует, например, фрагменты, аналоги и/или производные полипептида. В некоторых вариантах осуществления настоящее раскрытие обеспечивает полинуклеотид, содержащий полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, идентичную по меньшей мере, примерно на 80%, по меньшей мере, примерно на 85% идентичную, по меньшей мере, примерно на 90% идентичную, по меньшей мере, примерно на 95% идентичную, а в некоторых вариантах осуществления, по меньшей мере, примерно на 96%, 97%, 98% или 99% идентичен полинуклеотиду, кодирующему полипептид, содержащий описанную здесь связывающую молекулу.

[00388] Используемая в настоящем документе фраза «полинуклеотид, имеющий нуклеотидную последовательность, по меньшей мере, например, на 95% идентичную эталонной нуклеотидной последовательности» означает, что нуклеотидная последовательность полинуклеотида идентична эталонной последовательности, за исключением того, что полинуклеотидная последовательность может включать до пяти точечных мутаций на каждые 100 нуклеотидов эталонной нуклеотидной последовательности. Другими словами, для получения полинуклеотида, имеющего нуклеотидную последовательность, по крайней мере, на 95% идентичную эталонной нуклеотидной последовательности, до 5% нуклеотидов в эталонной последовательности можно удалить или заменить другим нуклеотидом, или количество нуклеотидов до 5% всех нуклеотидов в эталонной последовательности могут быть вставлены в эталонную последовательность. Эти мутации эталонной последовательности могут происходить в 5'- или 3'-концевых положениях эталонной нуклеотидной последовательности или в любом месте между этими концевыми положениями, вкрапленные как индивидуально среди нуклеотидов в эталонной последовательности, так и с составе одной или более смежных групп.

[00389] Варианты полинуклеотидов могут приводить к изменениям в кодирующих областях, некодирующих областях или в обеих областях. В некоторых вариантах осуществления вариант полинуклеотида содержит модификации, такие как молчащие замены, инсерции или делеции, не изменяющие свойства или активности кодируемого полипептида. В некоторых вариантах осуществления вариант полинуклеотида включает молчащие замены, не приводящие к изменению аминокислотной последовательности полипептида (из-за вырожденности генетического кода). Варианты полинуклеотидов могут быть получены с разными целями, например, для оптимизации экспрессии кодонов для конкретного хозяина (т.е. замены кодонов в мРНК человека на те, которые предпочитает бактериальный хозяин, такой как E. coli). В некоторых вариантах осуществления вариант полинуклеотида содержит по меньшей мере одну молчащую мутацию в некодирующей или кодирующей области последовательности.

[00390] В некоторых вариантах осуществления, вариант полинуклеотида сконструирован для модуляции или изменения экспрессии (или уровней экспрессии) кодируемого полипептида. В некоторых вариантах осуществления вариант полинуклеотида сконструирован для увеличения экспрессии кодируемого полипептида. В некоторых вариантах осуществления получен вариант полинуклеотида для снижения экспрессии кодируемого полипептида. В некоторых вариантах осуществления вариант полинуклеотида демонстрирует повышенную экспрессию кодируемого полипептида по сравнению с исходной полинуклеотидной последовательностью. В некоторых вариантах осуществления вариант полинуклеотида демонстрирует пониженную экспрессию кодируемого полипептида по сравнению с исходной полинуклеотидной последовательностью.

[00391] В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид является изолированным. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид является существенно очищенным.

[00392] Также предоставляются векторы и клетки, содержащие полинуклеотиды, описанные в данном документе. В некоторых вариантах осуществления вектор экспрессии содержит молекулу полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит вектор экспрессии, содержащий молекулу полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит один или более векторов экспрессии, содержащих молекулы полинуклеотидов. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит молекулу полинуклеотида. В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин содержит одну или более полинуклеотидных молекул.

Способы создания связывающих молекул

[00393] В еще одном аспекте в настоящем документе представлены способы получения различных связывающих молекул, представленных в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе предусмотрен способ получения связывающей молекулы, включающий трансфекцию клетки-хозяина одним или более векторами, при этом один или более векторов содержат:

(а) первую нуклеиновую кислоту, кодирующую и первый полипептид и второй полипептид, каждый из которых представляет собой легкую цепь антитела,

(b) вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую третий полипептид, содержащий первую область VH, первую область CH1 и вторую область VH; и

(c) третью нуклеиновую кислоту, кодирующую четвертый полипептид, содержащий третью область VH, вторую область CH1 и VL,

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида могут образовывать первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида могут образовывать вторую антигенсвязывающую область Fab; и

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида могут образовывать антигенсвязывающую область Fv.

[00394] В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связаны с областью Fv через гибкую пептидную область. В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область содержит шарнирный участок антитела. В некоторых конкретных вариантах осуществления шарнирный участок антитела представляет собой шарнирный участок IgG. В некоторых более конкретных вариантах осуществления шарнирный участок IgG относится к подтипу IgG1. В других более конкретных вариантах осуществления шарнирный участок IgG относится к подтипу IgG2. В других более конкретных вариантах осуществления шарнирный участок IgG относится к подтипу IgG3. В других более конкретных вариантах осуществления шарнирный участок IgG относится к подтипу IgG4. В некоторых вариантах осуществления гибкая пептидная область дополнительно содержит линкер между шарнирной областью антитела и вторым антигенсвязывающим доменом. В некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность GGGGS (G4S). В некоторых вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность (G4S)_n, где n - целое число. В некоторых конкретных вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность (G4S)₁. В некоторых более конкретных вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность (G4S)₂. В других более конкретных вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность (G4S)₃. Еще в других более конкретных вариантах осуществления линкер содержит аминокислотную последовательность (G4S)₄.

[00395] В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связываются с разными антигенами. В других вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связываются с одним и тем же антигеном. В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связываются с одним и тем же эпитопом одного и того же антигена. В других вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab связываются с разными эпитопами одного и того же антигена.

[00396] В некоторых вариантах осуществления первая область Fab и вторая область Fab образуют первый антигенсвязывающий домен, а область Fv образует второй антигенсвязывающий домен.

[00397] В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен связываются с одним и тем же антигеном. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий домен связывается с тем же эпитопом, представляющим, по меньшей мере, один из эпитопов, связанных первым антигенсвязывающим доменом.

[00398] В других вариантах осуществления первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен связываются с разными антигенами, где первый антигенсвязывающий домен связывается с первым антигеном, а второй антигенсвязывающий домен связывается со вторым антигеном.

[00399] В некоторых вариантах осуществления первый антиген представляет собой раковый антиген. В других вариантах осуществления первый антиген не является раковым антигеном.

[00400] В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на иммунных клетках, включая лимфоциты и моноциты. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на Т-клетке. В некоторых вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на В-клетке. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на дендритной клетке. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на гранулоците. Дополнительно, в других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на врожденной лимфоидной клетке. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на мегакариоците. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на моноците. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на клетке-супрессоре миелоидного происхождения. В других вариантах осуществления второй антиген экспрессируется на NK-клетке.

[00401] В некоторых конкретных вариантах осуществления второй антиген представляет собой CD3. В некоторых вариантах осуществления первый антиген представляет собой раковый антиген, а второй антиген представляет собой CD3.

[00402] В некоторых более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой PD-L1, а второй антиген представляет собой CD3.

[00403] В некоторых вариантах осуществления, область VH первой части каждой области Fab включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6 и SEQ ID NO.: 7; область VL второй части каждой области Fab включает три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 10 и SEQ ID NO.: 11; область VH области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; и область VL области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

[00404] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 8; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; и область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[00405] В некоторых вариантах осуществления, каждый из первого полипептида и второго полипептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 3; третий полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 1; а четвертый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 2.

[00406] В некоторых вариантах осуществления первая нуклеиновая кислота имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO.: 22; вторая нуклеиновая кислота имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO.: 20; а третья нуклеиновая кислота имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO.: 21.

[00407] В других более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой CD20, а второй антиген представляет собой CD3.

[00408] В некоторых вариантах осуществления, область VH первой части каждой области Fab включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 27, SEQ ID NO.: 28, SEQ ID NO.: 29; область VL второй части каждой области Fab содержит три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 31, SEQ ID NO.: 32 и SEQ ID NO.: 33; область VH области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; и область VL области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности o f SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO: 18 и SEQ ID NO: 19.

[00409] В некоторых вариантах осуществления, область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 26; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 30; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; и область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[00410] В некоторых вариантах осуществления каждый из первого полипептида и второго полипептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 25; третий полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 23; а четвертый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 24.

[00411] В некоторых вариантах осуществления первая нуклеиновая кислота имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO.: 36; вторая нуклеиновая кислота имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO.: 34; а третья нуклеиновая кислота имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO.: 35.

[00412] В других более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой EGFR, а второй антиген представляет собой CD3.

[00413] В некоторых вариантах осуществления, область VH первой части каждой области Fab включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 41, SEQ ID NO.: 42 и SEQ ID NO.: 43; область VL второй части каждой области Fab включает три CDR с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO.: 45, SEQ ID NO.: 46 и SEQ ID NO.: 47; область VH области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; и область VL области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

[00414] В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 40; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 44; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 12; и область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 16.

[00415] В некоторых вариантах осуществления каждый из первого полипептида и второго полипептида имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 39; третий полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 37; а четвертый полипептид имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 38.

[00416] В некоторых вариантах осуществления первая нуклеиновая кислота имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO.: 50; вторая нуклеиновая кислота имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 48; а третья нуклеиновая кислота имеет нуклеотидную последовательность SEQ ID NO.: 49.

[00417] В других более конкретных вариантах осуществления первый антиген представляет собой Her2, а второй антиген представляет собой TNF альфа. В некоторых вариантах осуществления область VH первой части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 51; область VL второй части каждой области Fab имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 52; область VH области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 53; и область VL области Fv имеет аминокислотную последовательность SEQ ID NO.: 54.

[00418] Рекомбинантная экспрессия связывающей молекулы, представленной в настоящем документе, может потребовать конструирования вектора экспрессии, содержащего полинуклеотид, кодирующий связывающую молекулу или ее фрагмент. После получения полинуклеотида, кодирующего связывающую молекулу, тяжелую или легкую цепь антитела или фрагменты таковых (например, содержащий вариабельный домен тяжелой и/или легкой цепи, но необязательно), представленного в настоящем документе, вектор для продукции связывающей молекулы может быть получен с помощью технологии рекомбинантной ДНК при помощи методик, хорошо известных в данной области техники. Таким образом, здесь описаны способы получения белка путем экспрессии полинуклеотида, содержащего кодирующую нуклеотидную последовательность. Способы, хорошо известные специалистам в данной области техники, могут быть использованы для конструирования векторов экспрессии, содержащих кодирующие последовательности и соответствующие сигналы контроля транскрипции и трансляции. Эти методы включают, например, методы рекомбинантной ДНК in vitro, методы синтеза и генетическую рекомбинацию in vivo. Также предусмотрены реплицируемые векторы, содержащие нуклеотидную последовательность, кодирующую связывающую молекулу, представленную в данном документе, или фрагмент таковой, или CDR тяжелой или легкой цепи, функционально связанные с промотором. Такие векторы могут включать нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область молекулы антитела (см., например, международные публикации №№ WO 86/05807 и WO 89/01036; и патент США № 5122464), и, таким образом, вариабельный домен антитела может быть клонирован в такой вектор для экспрессии всей тяжелой цепи, всей легкой цепи или тяжелой и легкой цепей целиком.

[00419] Экспрессионный вектор переносится в клетку-хозяин обычными методами, а затем трансфицированные клетки культивируются обычными методами для получения связывающей молекулы, представленной в настоящем документе. Таким образом, в настоящем документе также представлены клетки-хозяева, содержащие полинуклеотид, кодирующий связывающую молекулу, описанную в данном документе или фрагменты таковой, или тяжелую или легкую цепь таковой, или фрагменты таковых, функционально связанные с гетерологичным промотором. В некоторых вариантах осуществления множество векторов, содержащих полинуклеотиды, кодирующие разные части связывающей молекулы, представленной в настоящем документе, могут совместно экспрессироваться в клетке-хозяине для экспрессии полноразмерной связывающей молекулы, как подробно описано ниже.

[00420] Для экспрессии связывающих молекул, представленных в настоящем документе, можно использовать различные системы вектора экспрессия и клетки-хозяина (см., например, патент США № 5807715). Такие системы экспрессии вектор-хозяин представляют собой системы, с помощью которых могут быть получены и впоследствии очищены представляющие интерес кодирующие последовательности, а также представляют собой клетки, которые могут при трансформации или трансфекции подходящими кодирующими последовательностями нуклеотидов экспрессировать связывающую молекулу, представленную в настоящем документе, in situ. Они включают, без ограничения таковыми, микроорганизмы, такие как бактерии (например, E. coli и B. subtilis), трансформированные векторами экспрессии на основе рекомбинантной ДНК бактериофага, плазмидной ДНК или космидной ДНК, содержащими кодирующие последовательности; дрожжи (например, Saccharomyces Pichia), трансформированные рекомбинантными векторами экспрессии дрожжей, содержащими кодирующие последовательности; системы клеток насекомых, инфицированные векторами экспрессии рекомбинантного вируса (например, бакуловируса), содержащими кодирующие последовательности; системы клеток растений, инфицированные векторами экспрессии на основе рекомбинантного вируса (например, вируса мозаики цветной капусты, CaMV, вируса табачной мозаики, TMV) или трансформированные векторами экспрессии на основе рекомбинантных плазмид (например, плазмидой Ti), содержащими кодирующие последовательности; клеточные системы млекопитающих (например, клетки COS, CHO, BHK, 293, NS0 и 3T3), несущие рекомбинантные экспрессионные конструкции, содержащие промоторы, происходящие из генома клеток млекопитающих (например, промотор металлотионеина) или из вирусов млекопитающих (например, поздний промотор аденовируса; 7,5К промотор вируса вакцинии). Бактериальные клетки, такие как Escherichia coli, или эукариотические клетки, можно использовать для экспрессии рекомбинантной связывающей молекулы, особенно для экспрессии всей молекулы рекомбинантного антитела. Например, клетки млекопитающих, такие как клетки яичников китайского хомячка (СНО), в сочетании с вектором, несущим элемент промотора главного предраннего гена цитомегаловируса человека, представляют собой эффективную систему экспрессии антител или вариантов таковых (Foecking et al., 1986, Gene 45: 101 и Cockett et al., 1990, Bio/Technology 8: 2). В некоторых вариантах осуществления предложенные здесь антитела продуцируются в клетках СНО. В конкретном варианте экспрессия нуклеотидных последовательностей, кодирующих связывающие молекулы, представленные в настоящем документе, регулируется конститутивным промотором, индуцибельным промотором или тканеспецифическим промотором.

[00421] В бактериальных системах ряд векторов экспрессии может быть преимущественно выбран в зависимости от применения, предназначенного для экспрессируемой связывающей молекулы. Например, если должно быть получено большое количество такой связывающей молекулы, для создания фармацевтических композиций связывающей молекулы могут быть желательны векторы, обеспечивающие экспрессию слитых белковых продуктов на высоком уровне, каковые могут быть легко очищены. Такие векторы включают, без ограничения таковыми, вектор экспрессии E. coli pUR278 (Ruther et al., 1983, EMBO 12: 1791), в котором кодирующая последовательность может быть лигирована в вектор индивидуально в рамке считывания с кодирующей lac Z областью для образования слитого белка; векторы pIN (Inouye & Inouye, 1985, Nucleic Acids Res. 13: 3101-3109; Van Heeke & Schuster, 1989, J. Biol. Chem. 24: 5503-5509); и тому подобные. Векторы pGEX также можно использовать для экспрессии чужеродных полипептидов в виде слитых белков с глутатион-5-трансферазой (GST). Как правило, такие слитые белки являются растворимыми и могут быть легко очищены от лизированных клеток путем адсорбции и связывания с матриксными гранулами глутатион-агарозы с последующей элюцией в присутствии свободного глутатиона. Векторы pGEX содержат встроенные сайты расщепления протеазой тромбина или фактора Ха, так что клонированный продукт целевого гена может высвобождаться от фрагмента GST.

[00422] В системе насекомых вирус ядерного полиэдроза Autographa californica (AcNPV) используется в качестве вектора для экспрессии чужеродных генов. Вирус растет в клетках Spodoptera frugiperda. Кодирующая последовательность может быть клонирована индивидуально в несущественные области (например, гена полиэдрина) вируса и помещена под контроль промотора AcNPV (например, промотора полиэдрина).

[00423] В клетках-хозяевах млекопитающих можно использовать ряд вирусных систем экспрессии. В случаях, когда аденовирус используется в качестве вектора экспрессии, интересующая кодирующая последовательность может быть лигирована с комплексом контроля транскрипции/трансляции аденовируса, например, с поздним промотором и трехчастной лидерной последовательностью. Затем этот химерный ген может быть вставлен в геном аденовируса путем рекомбинации in vitro или in vivo. Вставка в несущественную область вирусного генома (например, область E1 или E3) приводит к получению рекомбинантного вируса, жизнеспособного и способного экспрессировать связывающую молекулу в инфицированных хозяевах (например, см. Logan & Shenk, 1984, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 8 1: 355-359). Для эффективной трансляции вставленных кодирующих последовательностей также могут потребоваться специфические сигналы инициации. Эти сигналы включают кодон инициации ATG и прилежащие последовательности. Кроме того, инициирующий кодон должен находиться в фазе с рамкой считывания желаемой кодирующей последовательности для гарантии трансляцию всей вставки. Эти экзогенные контрольные сигналы трансляции и кодоны инициации могут иметь различное происхождение, как природное, так и синтетическое. Эффективность экспрессии может быть повышена путем включения соответствующих элементов энхансера транскрипции, терминаторов транскрипции и т.д. (см., например, Bittner et al., 1987, Methods in Enzymol. 153: 51-544).

[00424] Кроме того, может быть выбран штамм клетки-хозяина, модулирующий экспрессию встроенных последовательностей или модифицирющий и обрабатывающий продукт гена определенным желаемым образом. Такие модификации (например, гликозилирование) и процессинг (например, расщепление) белковых продуктов могут быть важны для обеспечения функции белка. Различные клетки-хозяева обладают характерными и специфическими механизмами посттрансляционной обработки и модификации белков и генных продуктов. Подходящие клеточные линии или системы клетки-хозяина могут быть выбраны для обеспечения правильной модификации и процессинга экспрессируемого чужеродного белка. С этой целью можно использовать эукариотические клетки-хозяева, которые обладают клеточным механизмом для правильного процессинга первичного транскрипта, гликозилирования и фосфорилирования продукта гена. Такие клетки-хозяева млекопитающих включают, без ограничения таковыми, CHO, VERY, BHK, Hela, COS, MDCK, 293, 3T3, W138, BT483, Hs578T, HTB2, BT2O и T47D, NS0 (линия клеток миеломы мыши, которая эндогенно не продуцирует никаких цепей иммуноглобулина), клетки CRL7O3O и HsS78Bst.

[00425] Для долговременного получения рекомбинантных белков с высоким выходом можно использовать стабильную экспрессию. Например, могут быть созданы клеточные линии, которые стабильно экспрессируют связывающую молекулу. Вместо использования векторов экспрессии, содержащих вирусные источники репликации, клетки-хозяева могут быть трансформированы ДНК, контролируемой соответствующими элементами контроля экспрессии (например, промотором, энхансером, другими последовательностями, терминаторами транскрипции, сайтами полиаденилирования и т.д.) и селективным маркером. После введения чужеродной ДНК, сконструированным клеткам надо дать возможность подрасти в течение 1-2 дней в обогащенной среде, а затем перевести на селективную среду. Селектируемый маркер в рекомбинантной плазмиде придает устойчивость, необходимую для отбора, позволяет клеткам стабильно интегрировать плазмиду в свои хромосомы и расти с образованием структур, которые, в свою очередь, могут быть клонированы и размножены в клеточных линиях. Этот метод можно успешно использовать для создания клеточных линий, экспрессирующих связывающую молекулу. Такие сконструированные клеточные линии могут быть особенно полезны при скрининге и оценке композиций, которые прямо или косвенно взаимодействуют со связывающей молекулой.

[00426] Можно использовать ряд систем отбора, включая, не ограничиваясь таковыми, гены тимидинкиназы вируса простого герпеса (Wigler et al., 1977, Cell 11: 223), гипоксантинегуанинфосфорибозилтрансферазы (Szybalska & Szybalski, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48: 202) и гены аденинфосфорибозилтрансферазы (Lowy et al., 1980, Cell 22: 8-17), которые можно использовать в tk-, hgprt- или aprt-клетках соответственно. Кроме того, устойчивость к антиметаболитам может быть использована в качестве основы для отбора следующих генов: dhfr, который придает устойчивость к метотрексату (Wigler et al., 1980, Natl. Acad. Sci. USA 77: 357; O'Hare et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 78: 1527); gpt, который придает устойчивость к микофеноловой кислоте (Mulligan & Berg, 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78: 2072); neo, который придает устойчивость к аминогликозиду G-418 (Wu and Wu, 1991, Biotherapy 3: 87-95; Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32: 573-596; Mulligan, 1993, Science 260: 926-932; и Morgan and Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217; May, 1993, TIB TECH 11(5):l55-2 15); и hygro, который придает устойчивость к гигромицину (Santerre et al., 1984, Gene 30: 147). Способы, широко известные в области технологии рекомбинантных ДНК, могут применяться рутинно для выбора желаемого рекомбинантного клона, и такие методы описаны, например, в Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990); и в Chapters 12 and 13, Dracopoli et al. (eds.), Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons, NY (1994); Colberre-Garapin et al., 1981, J. Mol. Biol. 150:1, которые полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.

[00427] Уровни экспрессии связывающей молекулы можно повысить путем амплификации вектора (для обзора см. Bebbington and Hentschel, The use of vectors based on gene amplification for the expression of cloned genes in mammalian cells in DNA cloning, Vol. 3 (Academic Press, New York, 1987)). Если маркер в векторной системе, экспрессирующий связывающую молекулу, поддается амплификации, то увеличение уровня ингибитора, присутствующего в культуре клетки-хозяина, увеличивает количество копий маркерного гена. Поскольку амплифицированная область связана с геном связывающей молекулы, продукция связывающей молекулы также будет увеличиваться (Crouse et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 257).

[00428] Клетка-хозяин может быть котрансфицирована множеством экспрессионных векторов, представленных в настоящем документе. Векторы могут содержать идентичные селектируемые маркеры, обеспечивающие равную экспрессию соответствующих кодирующих полипептидов. В качестве альтернативы можно использовать один вектор, который кодирует и способен экспрессировать несколько полипептидов. Кодирующие последовательности могут содержать кДНК или геномную ДНК.

[00429] После того, как связывающая молекула, представленная в настоящем документе, получена путем рекомбинантной экспрессии, ее можно очистить любым известным в данной области техники способом очистки молекулы иммуноглобулина, например, хроматографией (например, на основе ионного обмена, аффинности, особенно по аффинности для специфического антигена после протеина А, калибровочной колоночной хроматографии и каппа-селективной аффинной хроматографии), центрифугированием, на основе дифференциальной растворимости или любым другим стандартным методом очистки белков. В конкретном варианте осуществления метод kappa-select (например, KappaSelect, разработанный GE Healthcare Life Science) используется для очистки Fab (каппа) -фрагментов или связывающих молекул, содержащих Fab-фрагменты. Кроме того, связывающие молекулы, представленные здесь, могут быть слиты с гетерологичными полипептидными последовательностями, описанными в данном документе или иным образом известными в данной области техники, для облегчения очистки.

V. Фармацевтические композиции

[00430] В одном аспекте настоящее раскрытие дополнительно предоставляет фармацевтические композиции, содержащие по меньшей мере одну связывающую молекулу настоящего раскрытия. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит терапевтически эффективное количество связывающей молекулы, представленной в настоящем документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

[00431] Фармацевтические композиции, содержащие связывающую молекулу, готовят для хранения путем смешивания связывающей молекулы, имеющей желаемую степень очистки, с необязательными физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (см., например, Remington, Remington's Pharmaceutical Sciences (18th ed. 1980)) в виде водных растворов или лиофилизированных или других сухих форм.

[00432] Связывающая молекула по настоящему раскрытию может быть составлена в любой подходящей лекарственной форме для доставки в клетку/ткань-мишень, например, в виде микрокапсул или макроэмульсий (Remington, выше; Park et al., 2005, Molecules 10: 146-61 ; Malik et al., 2007, Curr. Drug. Deliv. 4: 141-51), в виде композиций с замедленным высвобождением (Putney and Burke, 1998, Nature Biotechnol. 16: 153-57) или в липосомах (Maclean et al. , 1997, Int. J. Oncol. 11: 325-32; Kontermann, 2006, Curr. Opin. Mol. Ther. 8: 39-45).

[00433] Связывающая молекула, представленная в настоящем документе, также может быть заключена в микрокапсулу, полученную, например, методами коацервации или межфазной полимеризацией, например, микрокапсулу на основе гидроксиметилцеллюлозы или желатина, в поли(метилметацилат)-микрокапсулу, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарств (таких как липосомы, микросферы альбумина, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсиях. Такие методы раскрыты, например, в Remington, выше.

[00434] Различные композиции и системы доставки известны и могут использоваться для связывающей молекулу, как описано в данном документе, включая, без ограничения таковыми, инкапсуляцию в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать связывающую молекулу, рецептор-опосредованный эндоцитоз (см., например, Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262: 4429-32), конструирование нуклеиновой кислоты как части ретровирусного или другого вектора и т.д. В другом варианте осуществления композиция может быть представлена в системе контролируемого высвобождения или замедленного высвобождения. В одном варианте осуществления для достижения контролируемого или длительного высвобождения может использоваться насос (см., например, Langer, выше; Sefton, 1987, Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201-40; Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507-16; и Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 569-74). В другом варианте осуществления полимерные материалы могут быть использованы для достижения контролируемого или замедленного высвобождения профилактического или терапевтического агента (например, связывающей молекулы, как описано в данном документе) или композиции, представленной в настоящем документе (см., например, Medical Applications of Controlled Release (Langer and Wise eds., 1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance (Smolen and Ball eds., 1984); Ranger and Peppas, 1983, J. Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61-126; Levy et al., 1985, Science 228:190-92; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351-56; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 71:105-12; U.S. Pat. Nos. 5679377; 5916597; 5912015; 5,989,463;и 5128326; PCT Publication Nos. WO 99/15154 and WO 99/20253)). Примеры полимеров, используемых для замедленного высвобождения составов включают, без ограничения таковыми, поли(2-гидроксиэтилметакрилат), поли(метилметакрилат), поли(акриловая кислота), сополимер этилена и винилацетата, поли(метакриловая кислота), полигликолиды (PLG ), полиангидриды, поли(N-винилпирролидон), поли(виниловый спирт), полиакриламид, поли(этиленгликоль), полилактиды (PLA), сополимеры лактидов и гликолидов (PLGA) и полиортоэфиры. В одном варианте реализации полимер, используемый в составе с замедленным высвобождением, является инертным, не содержит вымываемых примесей, стабилен при хранении, стерилен и поддается биологическому разложению.

[00435] В еще одном варианте осуществления система с контролируемым или замедленным высвобождением может быть размещена рядом с конкретной целевой тканью, например, носовыми ходами или легкими, что требует лишь части системной дозы (см., например, Goodson, Medical Applications of Controlled Release Vol. 2, 115-38 (1984)). Системы с контролируемым высвобождением обсуждаются, например, в Langer, 1990, Science 249: 1527-33. Любой метод, известный специалисту в данной области техники, может быть использован для получения составов с замедленным высвобождением, содержащих одну или более связывающих молекул, как описано в данном документе (см., например, патент США № 4526938, публикации РСТ № WO 91/05548 и WO 96/20698, Ning et al., 1996, Radiotherapy & Oncology 39: 179-89; Song et al., 1995, PDA J. of Pharma. Sci. & Tech. 50: 372-97; Cleek et al., 1997, Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24: 853-54; и Lam et al., 1997, Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24: 759-60).

VI. Способы введения

[00436] В конкретном варианте осуществления в настоящем документе представлена композиция для использования в профилактике, ведении, лечении и/или облегчении заболевания или состояния, содержащая связывающую молекулу, представленную в настоящем документе. В одном варианте осуществления в настоящем документе представлена композиция для применения для предотвращения заболевания или состояния, где композиция содержит связывающую молекулу, предоставленную в настоящем документе. В одном варианте осуществления в настоящем документе предоставляется композиция для использования для контроля заболевания или состояния, где композиция содержит связывающую молекулу, предоставленную в настоящем документе. В одном варианте осуществления в настоящем документе представлена композиция для применения при лечении заболевания или состояния, где композиция содержит связывающую молекулу, предоставленную в настоящем документе. В одном варианте осуществления в настоящем документе предложена композиция для использования при улучшении состояния при заболевании или состоянии, где композиция содержит связывающую молекулу, представленную в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления заболевание или состояние представляет собой рак. В других вариантах осуществления рак представляет собой рак, положительный по PD-L1. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак легких. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой немелкоклеточную карциному легкого (NSCLC). В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой диффузную крупноклеточную B-лимфому (DLBCL). В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак прямой кишки. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак груди. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой лимфому. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой меланому. В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак яичников. В некоторых вариантах осуществления субъект является субъектом, нуждающимся в обработке. В некоторых вариантах осуществления субъект страдает заболеванием или состоянием. В других вариантах осуществления субъект подвержен риску заболевания или состояния. В некоторых вариантах осуществления введение приводит к профилактике, ведению, лечению или облегчению заболевания или состояния.

[00437] В одном варианте осуществления в настоящем документе представлена композиция для применения в профилактике, ведении/контроле, лечении и/или облегчении симптома заболевания или состояния, где композиция содержит связывающую молекулу, представленную в настоящем документе. В одном варианте осуществления в настоящем документе предложена композиция для применения для предотвращения симптома заболевания или состояния, где композиция содержит связывающую молекулу, представленную в настоящем документе. В одном варианте осуществления в настоящем документе предоставляется композиция для применения для ведения/контроля симптома заболевания или состояния, где композиция содержит связывающую молекулу, представленную в настоящем документе. В одном варианте осуществления в настоящем документе представлена композиция для применения при лечении симптома заболевания или состояния, где композиция содержит связывающую молекулу, представленную в настоящем документе. В одном варианте осуществления в настоящем документе предоставляется композиция для применения для облегчения симптома заболевания или состояния, где композиция содержит связывающую молекулу, представленную в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления заболевание представляет собой рак. В некоторых вариантах осуществления субъект является субъектом, который в этом нуждается. В некоторых вариантах осуществления субъект страдает заболеванием или состоянием. В других вариантах осуществления субъект подвержен риску заболевания или состояния. В некоторых вариантах осуществления введение приводит к профилактике, ведению, лечению или облегчению симптома заболевания или состояния.

[00438] В другом варианте осуществления в настоящем документе предоставляется способ предотвращения, ведения, лечения и/или облегчения заболевания или состояния у субъекта, включающий введение эффективного количества связывающей молекулы, представленной в настоящем документе. В одном варианте осуществления в настоящем документе предоставляется способ предотвращения заболевания или состояния у субъекта, включающий введение эффективного количества связывающей молекулы, представленной в настоящем документе. В одном варианте осуществления в настоящем документе предоставляется способ управления/ведения/контроля заболевания или состояния у субъекта, включающий введение эффективного количества связывающей молекулы, представленной в настоящем документе. В одном варианте осуществления в настоящем документе предоставляется способ лечения заболевания или состояния у субъекта, включающий введение эффективного количества связывающей молекулы, представленной в настоящем документе. В одном варианте осуществления в настоящем документе предоставляется способ облегчения заболевания или состояния у субъекта, включающий введение эффективного количества связывающей молекулы, представленной в настоящем документе. В одном из вариантов осуществления заболевание или состояние представляет собой рак. В некоторых вариантах осуществления субъект является субъектом, который в этом нуждается. В некоторых вариантах осуществления субъект страдает заболеванием или состоянием. В других вариантах осуществления субъект подвержен риску заболевания или состояния. В некоторых вариантах осуществления введение приводит к профилактике, ведению, лечению или облегчению заболевания или состояния.

[00439] В другом варианте осуществления в настоящем документе предоставляется способ предотвращения, ведения/контроля, лечения и/или облегчения симптома заболевания или состояния у субъекта, включающий введение эффективного количества связывающей молекулы, представленной в настоящем документе. В одном варианте осуществления в настоящем документе предоставляется способ предотвращения симптома заболевания или состояния у субъекта, включающий введение эффективного количества связывающей молекулы, представленной в настоящем документе. В одном варианте осуществления в настоящем документе предоставляется способ управления и ведения симптома заболевания или состояния у субъекта, включающий введение эффективного количества связывающей молекулы, представленной в настоящем документе. В одном варианте осуществления в настоящем документе предоставляется способ лечения симптома заболевания или состояния у субъекта, включающий введение эффективного количества связывающей молекулы, представленной в настоящем документе. В одном варианте осуществления в настоящем документе предоставляется способ облегчения заболевания или состояния у субъекта, включающий введение эффективного количества связывающей молекулы, представленной в настоящем документе. В одном из воплощений заболевание или состояние представляет собой рак. В некоторых вариантах осуществления субъект является субъектом, который в этом нуждается. В некоторых вариантах осуществления субъект страдает заболеванием или состоянием. В других вариантах осуществления субъект подвержен риску заболевания или состояния. В некоторых вариантах осуществления введение приводит к профилактике, ведению, лечению или облегчению симптома заболевания или состояния.

[00440] В настоящем документе также представлены способы предотвращения, ведения/контроля, лечения и/или облегчения заболевания или состояния путем введения субъекту эффективного количества связывающей молекулы, представленной в настоящем документе, или фармацевтической композиции, содержащей связывающую молекулу, предоставленную в настоящем документе. В одном аспекте связывающая молекула по существенно очищена (т.е. практически не содержит веществ, ограничивающих ее действие или вызывающих нежелательные побочные эффекты). В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула получена из одного или более полностью человеческих моноклональных антител. Субъект, которому вводят терапию, может быть млекопитающим, таким как неприматы (например, коровы, свиньи, лошади, кошки, собаки, крысы и т. Д.) или приматом (например, обезьяна, такая как обезьяна-циномолг, или человек). В одном из вариантов осуществления субъектом является человек. В другом варианте воплощения субъект представляет собой человека, страдающего заболеванием или состоянием, например раком.

[00441] Известны различные системы доставки, которые можно использовать для введения профилактического или терапевтического агента (например, связывающей молекулы, представленной в настоящем документе), включая, без ограничения таковыми, инкапсуляцию в липосомы, микрочастицы, микрокапсулы, рекомбинантные клетки, способные экспрессировать связывающую молекулу, рецептор-опосредованный эндоцитоз (см., например, Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262: 4429-4432 (1987)), конструирование нуклеиновой кислоты как части ретровируса или другого вектора и т. д. Введение профилактического или терапевтического агента (например, связывающей молекулы, представленной в настоящем документе) или фармацевтической композиции включает, без ограничения таковыми, парентеральное введение (например, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное и подкожное), эпидуральное и слизистое (например, интраназальный и пероральный пути). В конкретном варианте осуществления профилактическое или терапевтическое средство (например, связывающая молекула, представленная в настоящем документе) или фармацевтическая композиция вводятся интраназально, внутримышечно, внутривенно или подкожно. Профилактические или терапевтические агенты или композиции можно вводить любым удобным путем, например, путем инфузии или болюсной инъекции, путем абсорбции через эпителиальные или кожно-слизистые оболочки (например, через слизистую оболочку полости рта, слизистую оболочку носа, слизистую оболочку прямой и кишки и т. д.), а также вместе с другими биологически активными веществами. Введение может быть системным или местным. Кроме того, можно также осуществлять легочное введение, например, с использованием ингалятора или распылителя, или состав с аэрозольным агентом. См., например, патенты США №№ 6019968, 5 985 320, 5 985 309, 5 934 272, 5 874 064, 5 855 913, 5 290 540 и 4880 078; и публикации РСТ №№ WO 92/19244, WO 97/32572, WO 97/44013, WO 98/31346 и WO 99/66903, каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.

[00442] В конкретном варианте осуществления может оказаться желательным введение профилактического или терапевтического агента или фармацевтической композиции, представленной в настоящем документе, локально в область, нуждающуюся в лечении. Это может быть достигнуто, например, без ограничения таковыми, местной инфузией, местным введением (например, с помощью интраназального спрея), инъекцией, или с помощью имплантата, причем указанный имплантат может иметь пористую или непористую структуру или гелеобразный материал, включая мембраны, такие как сиалластические мембраны или волокна. В некоторых вариантах осуществления изобретения при введении антитела, представленного в настоящем документе, необходимо соблюдать осторожность при использовании материалов, выбирая те, которые не абсорбирует антитело.

[00443] В другом варианте осуществления профилактическое или терапевтическое средство или композиция, представленные в настоящем документе, могут быть доставлены в везикуле, в частности в липосомах (см. Langer, 1990, Science 249: 1527-1533; Treat et al., В Liposomes in Therapy of Infective Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-327; см. в целом там же). .

[00444] В другом варианте реализации профилактическое или терапевтическое средство или композиция, представленные в настоящем документе, могут быть доставлены в системе с контролируемым высвобождением или замедленным высвобождением. В одном варианте осуществления для достижения контролируемого или замедленного высвобождения может быть использован насос (см. Langer, выше; Sefton, 1987, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20; Buchwald et al., 1980, Surgery 88: 507; Saudek et al., 1989, N. Engl. J. Med. 321: 574). В другом варианте осуществления для достижения контролируемого или длительного высвобождения профилактического или терапевтического агента (например, антитела, представленного в настоящем документе) или композиции, представленной в настоящем документе, могут быть использованы полимерные материалы (см., например, Medical Applications of Controlled Release, Langer and Wise (eds.), CRC Pres., Boca Raton, Florida (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen and Ball (eds.), Wiley, New York (1984); Ranger and Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61; see also Levy et al., 1985, Science 228:190; During et al., 1989, Ann. Neurol. 25:351; Howard et al., 1989, J. Neurosurg. 7 1:105); U.S. Patent No. 5,679,377; U.S. Patent No. 5,916,597; U.S. Patent No. 5,912,015; U.S. Patent No. 5,989,463; U.S. Patent No. 5,128,326; PCT Publication No. WO 99/15154; и PCT Publication No. WO 99/20253. Примеры полимеров, используемых в составах с замедленным высвобождением, включают, без ограничения таковыми, поли(2-гидроксиэтилметакрилат), поли(метилметакрилат), поли(акриловая кислота), сополимер этилена и винилацетата, поли(метакриловая кислота), полигликолиды (PLG), полиангидриды, поли (N-винилпирролидон), поли (виниловый спирт), полиакриламид, поли (этиленгликоль), полилактиды (PLA), сополимеры лактидов с гликолидами (PLGA) и полиортоэфиры. В одном из вариантов реализации полимер, используемый в составе с замедленным высвобождением, инертен, не содержит вымываемых примесей, стабилен при хранении, стерилен и биоразлагаем. В еще одном варианте осуществления система с контролируемым или замедленным высвобождением может быть размещена вблизи терапевтической мишени, то есть носовых ходов или легких, что требует лишь части системной дозы (см., например, Goodson, в Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)). Системы с контролируемым высвобождением обсуждены в обзоре Langer (1990, Science 249: 1527-1533). Любой метод, известный специалисту в данной области техники, может быть использован для получения составов с замедленным высвобождением, содержащих одну или более связывающих молекул, представленных в данном документе. См., например, следующие публикации: U.S. Patent No. 4,526,938, PCT publication WO 91/05548, PCT publication WO 96/20698, Ning et al., 1996, “Intratumoral Radioimmunotherapy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel,” Radiotherapy & Oncology 39:179- 189, Song et al., 1995, “Antibody Mediated Lung Targeting of Long-Circulating Emulsions,” PDA Journal of Pharmaceutical Science & Technology 50:372-397, Cleek et al., 1997, “Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application,” Pro. Int'l. Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854, and Lam et al., 1997, “Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery,” Proc. Int'l. Symp. Control Rel. Bioact. Mater. 24:759-760, каждая из которых полностью включена в настоящий документ посредством ссылки.

[00445] В конкретном варианте осуществления, когда композиция, представленная в настоящем документе, представляет собой нуклеиновую кислоту, кодирующую профилактическое или терапевтическое средство (например, связывающую молекулу, представленную в настоящем документе), нуклеиновую кислоту можно вводить in vivo для стимулирования экспрессии кодируемых ею профилактических или терапевтических агентов, посредством конструирования таковой как части подходящего вектора экспрессии нуклеиновой кислоты и вводя его таким образом, чтобы вектор стал внутриклеточным, например, при использовании ретровирусного вектора (см. патент США № 4980286), или путем прямой инъекции, или с помощью бомбардировки микрочастицами (например, методом генной пушки; Biolistic, Dupont), или с помощью покрытия липидами, рецепторами клеточной поверхности или трансфицирующими агентами, или введением его связанным с гомеобоксоподобным пептидом, который, как известно, проникает в ядро (см., например, Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 1864-1868) и т.д. Альтернативно, нуклеиновая кислота может быть введена внутриклеточно и включена в ДНК клетки-хозяина для экспрессии путем гомологичной рекомбинации.

[00446] В конкретном варианте осуществления композиция, представленная в настоящем документе, включает одну, две или более связывающих молекул, представленных в настоящем документе. В другом варианте осуществления композиция, представленная в настоящем документе, содержит одну, две или более связывающих молекул, представленных в настоящем документе, и профилактическое или терапевтическое средство, отличное от связывающей молекулы, представленной в настоящем документе. В одном варианте осуществления известно, что агенты выгодны и полезны для применения и уже использовались или используются в настоящее время для профилактики, ведения, лечения и/или облегчения заболевания или состояния. В дополнение к профилактическим или терапевтическим средствам представленные здесь композиции могут также содержать носитель.

[00447] Композиции, представленные в настоящем документе, включают нерасфасованные лекарственные композиции, пригодные для производства фармацевтических композиций (например, композиций, подходящих для введения субъекту или пациенту), которые можно использовать при приготовлении стандартных дозированных форм. В одном варианте осуществления предлагаемая здесь композиция представляет собой фармацевтическую композицию. Такие композиции содержат профилактически или терапевтически эффективное количество одного или более профилактических или терапевтических агентов (например, связывающую молекулу, представленную в данном документе, или другое профилактическое или терапевтическое средство) и фармацевтически приемлемый носитель. Фармацевтические композиции могут быть составлены таким образом, чтобы они подходили для соответствующего пути введения субъекту.

[00448] В конкретном варианте осуществления термин «носитель» относится к разбавителю, адъюванту (например, адъюванту Фрейнда (полному или неполному)), наполнителю или носителю, вместе с которым вводят терапевтическое средство. Такие фармацевтические носители могут быть стерильными жидкостями, такими как вода и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, такие как арахисовое масло, соевое масло, минеральное масло, кунжутное масло и тому подобное. Вода является типичным носителем при внутривенном введении фармацевтической композиции. Солевые растворы и водные растворы декстрозы и глицерина также можно использовать в качестве жидких носителей, особенно в растворах для инъекций. Подходящие фармацевтические наполнители включают крахмал, глюкозу, лактозу, сахарозу, желатин, солод, рис, муку, мел, силикагель, стеарат натрия, моностеарат глицерина, тальк, хлорид натрия, сухое обезжиренное молоко, глицерин, пропилен, гликоль, воду, этанол и тому подобное. Композиция, если желательно, также может содержать незначительные количества смачивающих или эмульгирующих агентов или буферных агентов pH. Эти композиции могут принимать форму растворов, суспензий, эмульсий, таблеток, пилюль, капсул, порошков, составов с замедленным высвобождением и т.п. Пероральный состав может включать стандартные носители, такие как фармацевтические сорта маннита, лактозы, крахмала, стеарата магния, сахарина натрия, целлюлозы, карбоната магния и т.д. Примеры подходящих фармацевтических носителей описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences (1990) Mack Publishing Co., Easton, PA.. Такие композиции будут содержать профилактически или терапевтически эффективное количество связывающей молекулы, представленной в настоящем документе, например, в очищенной форме, вместе с подходящим количеством носителя для обеспечения формы для правильного введения пациенту. Состав должен соответствовать способу введения.

[00449] В одном из вариантов реализации композицию составляют в соответствии с обычными процедурами в виде фармацевтической композиции, адаптированной для внутривенного введения человеку. Обычно композиции для внутривенного введения представляют собой растворы в стерильном изотоническом водном буфере. При необходимости композиция может также включать солюбилизирующий агент и местный анестетик, такой как лигнокам, для облегчения боли в месте инъекции. Также такие композиции можно вводить другим путем, кроме внутривенного.

[00450] Обычно ингредиенты представленных здесь композиций поставляются либо по отдельности, либо в смеси в стандартной лекарственной форме, например, в виде сухого лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытом контейнере, таком как ампула или саше, с указанием количества активного агента. Если композицию следует вводить путем инфузии, то она может быть введена с помощью бутылочки/емкости для инфузии, содержащей стерильную воду или физиологический раствор фармацевтического качества. Если композиция вводится путем инъекции, то может предоставляться ампула со стерильной водой для инъекций или физиологическим растворам для смешивания ингредиентов перед введением.

[00451] Связывающая молекула, представленная в настоящем документе, может быть упакована в герметично закрытый контейнер, такой как ампула или пакетик с указанием количества антитела. В одном варианте связывающая молекула поставляется в виде сухого стерилизованного лиофилизированного порошка или безводного концентрата в герметично закрытом контейнере и может быть восстановлена, например, водой или физиологическим раствором до подходящей концентрации для введения субъекту. Лиофилизированная связывающая молекула может храниться при температуре от 2 до 8°C в ее исходном контейнере, и связывающая молекула может быть введена в течение 12 часов, например, в течение 6 часов, в течение 5 часов, в течение 3 часов или в течение 1 часа после восстановления. В альтернативном варианте осуществления связывающая молекула, представленная в настоящем документе, поставляется в жидкой форме в герметично закрытом контейнере с указанием количества и концентрации антитела.

[00452] Композиции, представленные в настоящем документе, могут быть приготовлены в нейтральной или солевой формах. Фармацевтически приемлемые соли включают соли, образованные с анионами, например, полученными из соляной, фосфорной, уксусной, щавелевой, винной кислот и т. д., и соли, образованные с катионами, например, полученными из гидроксидов натрия, калия, аммония, кальция, железа, изопропиламина, триэтиламина, 2-этиламиноэтанола, гистидина, прокаина и др.

[00453] Количество профилактического или терапевтического агента (например, связывающей молекулы, представленной в настоящем документе) или композиции, представленной в настоящем документе, которая будет эффективна для предотвращения, ведения, лечения и/или облегчения заболевания или состояния, может быть определено с помощью стандартных клинических методов. Кроме того, необязательно, можно использовать анализы in vitro для определения оптимальных диапазонов доз. Точная доза, которую следует использовать в составе, также будет зависеть от пути введения и серьезности заболевания или состояния и должна определяться в соответствии с мнением практикующего врача и состояния каждого пациента.

[00454] Эффективные дозы можно экстраполировать из кривых доза-ответ, полученных из тест-систем in vitro или на моделях животных.

[00455] В некоторых вариантах осуществления путь введения пациенту дозы связывающей молекулы, представленной в настоящем документе, является интраназальным, внутримышечным, внутривенным или их комбинацией, но другие пути, описанные в настоящем документе, также могут быть приемлемы. Каждая доза может вводиться как идентичным способом введения, так и различным. В некоторых вариантах осуществления связывающая молекула, представленная в настоящем документе, может вводиться несколькими путями введения одновременно или последовательно с другими дозами той же или другой связывающей молекулы, представленной в настоящем документе.

[00456] В некоторых вариантах осуществления связывающие молекулы, представленные в настоящем документе, вводятся субъекту профилактически или терапевтически. Предоставленные здесь антитела можно вводить субъекту профилактически или терапевтически, чтобы предотвратить, уменьшить или облегчить заболевание или его симптом.

[00457] Для краткости в данном документе используются определенные сокращения. Одним из примеров является сокращение обозначения аминокислотных остатков до одной буквы. Аминокислоты и соответствующие им трехбуквенные и однобуквенные сокращения следующие:

Аланин Ала (А)

Аргинин Арг (R)

Аспарагин Asn (N)

аспарагиновая кислота Asp (D)

цистеин Cys (C)

глутаминовая кислота Glu (E)

глутамин Gln (Q)

глицин Gly (G)

гистидин His (H)

изолейцин Ile (I)

лейцин Leu (L)

лизин Lys (K)

метионин Met (M)

фенилаланин Phe (F)

пролин Pro (P)

серин Ser (S)

треонин Thr (T)

триптофан Trp (W)

тирозин Tyr (Y)

валин Val (V)

[00458] Изобретение в целом раскрывается согласно описанию многочисленных вариантов осуществления. Для этой цели, изобретение также включает варианты осуществления, в которых некоторая информация пропущена, полностью или частично, например, характеризующая вещества или материалы, этапы и условия способа, протоколы, процедуры, техники или анализ. Таким образом, даже несмотря на то, что изобретение обычно не выражается здесь в терминах того, что изобретение не включает, аспекты, которые явным образом не включены в изобретение, тем не менее, здесь раскрыты.

[00459] Был описан ряд вариантов осуществления изобретения. Тем не менее, должно быть понято, что различные модификации могут быть выполнены без отклонения от сущности и объема изобретения. Соответственно, следующие примеры предназначены для иллюстрации, но не для ограничения объема изобретения, описанного в формуле изобретения.

ПРИМЕРЫ

Пример 1: Конструирование и экспрессия типичных связывающих молекул

[00460] Этот пример иллюстрирует конструирование и экспрессию иллюстративных связывающих молекул, представленных в данном документе (проиллюстрированных на Фиг. 1A-1E), в частности, связывающих молекул ACE-00, ACE-02, ACE-03, ACE-04, ACE- 05, ACE-09, ACE-10, ACE-11 и ACE-12. Компоненты, нацеленные на первый и второй антигены в каждой из примерных связывающих молекул, суммированы в таблице ниже.

Таблица 3: Компоненты, нацеленные на первый и второй антигены типичных связывающих молекул

Связывающая молекула Нацеливаемый сомпонент Первый Антиген Второй антиген ACE-00 Трастузумаб Адалимумаб ACE-02 Анти-CD19 Ab Анти-CD3 гуманизированный 12F6 ACE-03 Анти-CD19 Ab Анти-CD3 гуманизированный OKT3 ACE-04 Анти-PD-L1 Ab Анти-CD3 химерный (xi) OKT3 Fab ACE-05 Анти-PD-L1 Ab Анти-CD3 UCHT1 ACE-09 Анти-PD-L1 Ab Анти-CD3 UCHT1 ACE-10 Анти-CD20 Анти-CD3 ACE-11 Анти-EGFR Анти-CD3 ACE-12 Анти-PD-L1 Ab Анти-CD3 UCHT1

[00461] Форматы, используемые в аминокислотных последовательностях:

ЖИРНЫЙ ШРИФТ: VH или VL;

ЖИРНЫМ ШРИФТ С ПОДЧЕРКИВАНИЕМ : CDR;

ВЫДЕЛЕН КУРСИВОМ: шарнирный участок антитела;

нижний регистр: гибкий линкер;

[В СКОБКАХ]: CH1;

[В СКОБКАХ и ПОДЧЕРКНУТО]: CL.

1.1.Конструирование и экспрессия ACE-00

[00462] Система временной экспрессии HEK-293 (Invitrogen, США) была использована для экспрессии ACE 00, вторая антигенсвязывающая область Fv которого связывается с TNF-альфа, а первый антигенсвязывающий домен (Fab-области) связывается с антигеном Her2 (см. ФИГ. 2F). ACE-00 имеет ту же общую структуру, что и примерная связывающая молекула, показанная на ФИГ. 1А. Вкратце, ACE-00 содержит две разные цепи, подобные тяжелой цепи (ACE-00-VH и ACE-00-VL), и две идентичные легкие цепи (ACE-00-LC). Родительским антителом, используемым для конструирования домена анти-Her2 ACE-00, является трастузумаб, а родительским антителом, используемым для конструирования домена анти-TNF альфа ACE-00, является адалимумаб. Аминокислотные последовательности этих трех типов полипептидов следующие:

Аминокислотная последовательность ACE-00-VH:

Аминокислотная последовательность ACE-00-VL:

Аминокислотная последовательность ACE-00-LC (легкая цепь анти-CD19 антитела):

[00463] Аминокислотные последовательности VH и VL для бивалентной области Fab, нацеленной на Her2, и моновалентной области Fv, нацеленной на TNF-альфа, перечислены в таблице ниже:

Таблица 4: VH и VL ACE-00

Fab область
(Анти-Her2) VH: EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFNIKDTYIHWVRQAPGKGLEWVARIYPTNGYTRYADSVKGRFTISADTSKNTAYLQMNSLRAEDTAVYYCSRWGGDGFYAMDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 51) VL:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVNTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSRSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQHYTTPPTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 52) CDR H1: GFNIKDTY (SEQ ID NO: 118) CDR L1: QDVNTA (SEQ ID NO: 121) CDR H2: IYPTNGYT (SEQ ID NO: 119) CDR L2: SAS (SEQ ID NO: 122) CDR H3: SRWGGDGFYAMDY (SEQ ID NO: 120) CDR L3: QQHYTTPPT (SEQ ID NO: 123) Fv область
(Анти-TNF альфа) VH:
EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 53) VL:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 54) CDR H1: GFTFDDYA (SEQ ID NO: 124) CDR L1: QGIRNY (SEQ ID NO: 127) CDR H2: ITWNSGHI (SEQ ID NO: 125) CDR L2: AAS (SEQ ID NO: 128) CDR H3: AKVSYLSTASSLDY (SEQ ID NO: 126) CDR L3: QRYNRAPYT (SEQ ID NO: 129)

[00464] Тройную трансфекцию ДНК, кодирующих ACE-00-VH, ACE-00-VL и ACE-00-LC, выполняли, как кратко описано ниже. Полиэтиленимин (PEI) использовали в качестве реагента для трансфекции (использовали при соотношении ДНК: PEI=1: 4 (мас./мас.)). Через шесть-семь дней после трансфекции, когда уровень выживаемости клеток составлял примерно 60-70%, культивирование прекращали, а среду для экспрессии собирали и центрифугировали (4800 об/мин, 30 мин, 4℃) для удаления клеточных фрагментов. Затем супернатант фильтровали с использованием 0,22 TOP-фильтра (Millipore, США). Затем отфильтрованный супернатант, содержащий молекулы ACE-00, подвергали процессу очистки с помощью аффинной хроматографии с использованием Hitrap™ KappaSelect (GE healthcare, США) с последующим диализом с pH 7,4 PBS с использованием кассеты для диализа Slide-A Lyzer (Thermo, США) для смены элюирующего буфера. Очищенные белки анализировали с помощью SDS-PAGE, капиллярного электрофореза и эксклюзионной хроматографии (SEC). Очищенные молекулы ACE-00 также анализировали на чистоту с использованием биоанализатора Agilent 2100 (Agilent Technologies, Германия) и SEC-HPLC (ThermoFisher, США). Анализ чистоты проводился с использованием протоколов, предоставленных производителями.

[00465] В качестве контроля выполняли би-трансфекцию ДНК, кодирующих ACE-00-VL и ACE-00-LC, в клетки HEK-293. SDS-PAGE выполняли для выявления разницы в структуре сборки ACE-00 (содержащего две разные цепи, подобные тяжелой цепи, ACE-00-VH и ACE-00-VL) и ACE-00-VL2 (содержащего две идентичные цепи, подобные тяжелой цепи ACE-00-VL) (ФИГ. 2A-2B).

[00466] Антитело подвергается сборке и секретируется в виде тетрамера H₂L₂, а механизм контроля качества очень жестко регулируется в эндоплазматическом ретикулуме (ER) шаперонами ER, такими как люминал-связывающий белок (BiP) и протеин-дисульфид-изомераза (PDI). Известно, что развернутый домен CH1 тяжелой цепи играет роль в регуляции сборки антитела BiP-зависимым образом. BiP может играть роль в образовании гетеродимеров CH1 и CL, а также участвовать в механизмах контроля качества сборки антител путем регуляции деградации белков, ассоциированных с эндоплазматическим ретикулумом (ERAD) (Lee Y. K. et al. BiP and immunoglobulin light chain cooperate to control the folding of heavy chain and ensure the fidelity of immunoglobulin assembly. Mol Biol Cell. 1999 Jul;10(7):2209-19; Feige M. J. et al. An unfolded CH1 domain controls the assembly and secretion of IgG antibodies. Mol Cell. 2009 Jun 12;34(5):569-79; Feige M. J. et al. How antibodies fold. Trends Biochem Sci. 2010 Apr;35(4):189-98. Каждая из этих публикаций полностью включена в настоящий документ посредством ссылки) . Возможное взаимодействие между доменом VH и BiP было исследовано, для изучения того, могут ли две разные тяжелые цепи ALiCE образовывать гетеродимер за счет специфического взаимодействия VH-VL. Усеченные тяжелые цепи CH1 или VH-CH1, или ΔCH1 или ΔVH-CH1, клонировали и доставляли в клетки HEK293. HC дикого типа или укороченные конструкции HC доставляли в клетки HEK293. Клеточные лизаты, полученные от каждого трансфектанта, обрабатывали с помощью гранул протеина А для идентификации доменов антител, способных связываться с BiP, при помощи анти-Fc-HRP (Thermo Fisher) и анти-BiP-HRP (системы R&D).

[00467] Без привязки к какому-либо конкретному механизмом или теории, были получены следующие результаты. Соосажденный BiP был обнаружен вестерн-блоттингом в лизате, трансфицированном клоном ΔCH1 и WT-HC, что указывает на взаимодействие VH и BiP (ФИГ. 2C). Кроме того, секретируемый полипептид был обнаружен в экспрессионной среде, трансфицированной ΔVH-CH1, что указывает на то, что BiP может регулировать сборку и секрецию тяжелой цепи посредством взаимодействия с доменом VH и/или CH1 тяжелой цепи (ФИГ. 2C-2E). Предположительно, в этом исследовании также было обнаружено, что домен VH антитела играет роль сборки антитела зависимым от BiP образом (см. ФИГ. 2C-2E). Как показано на ФИГ. 2F, подобная тяжелой цепи цепь связывающей молекулы, представленной в настоящем документе, содержащая две области VH (одна в области Fab и одна в области Fv), то есть обозначенная ACE-00-VH в этом исследовании, способствует правильной сборке связывающей молекулы, представленной в настоящем документе, в системе экспрессии млекопитающих. При отсутствии этой системы контроля качества в среде для экспрессии обнаруживается множество различных нежелательных комбинаций полипептидных цепей.

[00468] KappaSelect использовали для аффинной хроматографии белков ACE-00 и ACE-00-VL2. Как показано на ФИГ. 2G, не было обнаружено несвязанного ACE в «проточных» (F.T., “flow through”) дорожках.

[00469] Затем выполняли капиллярный электрофорез для выявления различия в размере молекул ACE-00-VL2 и ACE-00. На ФИГ. 2H размер каждого пика на рисунке (слева) показан в таблице (справа). Пик 7 представляет собой димерный комплекс ACE-00-VL/ACE-00-LC, а пик 8 представляет собой димерный комплекс ACE-00-VH/ACE-00-LC. Молекулярная масса ACE-00 на 4 кДа выше, чем ACE-00-VL2 (пик 12).

[00470] Результаты капиллярного электрофореза также показали конформацию молекул ACE-00 и ACE-00-VL2. Как показано на ФИГ. 2I, большинство (почти 99%) молекул ACE-00 существует в гетеродимеризованной форме. Затем была проведена капиллярная изоэлектрическая фокусировка, которая подтвердила гетеродимеризацию между цепью ACE-00-VH и цепью ACE-00-VL. Значение pI измеряли с помощью cIEF для каждого из ACE-00 и ACE-00-VL2. Результат показан на ФИГ. 2J. Высокая эффективность гетеродимеризации между цепями ACE-00-VH и ACE-00-VL была подтверждена результатами SDS-PAGE и капиллярного электрофореза, показанными на ФИГ. 2К. Как показано на ФИГ. 2L, небольшая часть белковых агрегатов была обнаружена при эксклюзионной хроматографии ACE-00, и большая часть ACE-00 имела растворимую однородную структуру, что дополнительно подтверждает высокую эффективность гетеродимеризации.

[00471] Эти результаты показывают, что ACE-00 был правильно экспрессирован и собран. Эти результаты также показывают, что подобная тяжелой цепи цепь связывающей молекулы, представленной в настоящем документе, содержащая две области VH (одну в области Fab и одну в области Fv), способствует правильной сборке связывающей молекулы, представленной в настоящем документе, в системе экспрессии млекопитающих, и что взаимодействие VH-VL в области Fv является основной движущей силой, способствующей гетеродимеризации двух цепей, подобных тяжелой цепи. Аналогичные тесты были проведены для других примерных связывающих молекул (например, ACE-05, ACE-10 и ACE-11), описанных ниже, и были сделаны такие же выводы для этих молекул.

1.2. Конструкция и проявление ACE-02

[00472] Система временной (транзиентной) экспрессии HEK-293 (Invitrogen, США) была использована для экспрессии молекулы ALiCE ACE-02, представленной в настоящем документе. ACE-02 состоит из доменов анти-CD19 и гуманизированных анти-CD3 12F6. ACE-02 содержит две разные цепи, подобные тяжелой цепи (ACE-02-VH и ACE-02-VL), и две идентичные легкие цепи (ACE-02-LC). Аминокислотные последовательности этих трех типов полипептидов следующие:

Аминокислотная последовательность ACE-02-VH:

Аминокислотная последовательность ACE-02-VL:

Аминокислотная последовательность ACE-02-LC (легкая цепь антитела к CD19):

[00473] Аминокислотные последовательности VH и VL и последовательности CDR в таковых для бивалентной области Fab первого антигенсвязывающего домена, нацеленного на CD19, и моновалентной области Fv второго антигенсвязывающего домена гуманизированного 12F6 представлены в таблице ниже:

Таблица 5: VH, VL и CDR ACE-02

Fab область
(анти-CD19) VH: QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 61) VL:
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 65) CDR H1: SYWMN (SEQ ID NO: 62) CDR L1: QSVDYDGDSY (SEQ ID NO: 66) CDR H2: QIWPGDGDTNYNGKFKG (SEQ ID NO: 63) CDR L2: DAS (SEQ ID NO: 67) CDR H3: RETTTVGRYYYAMDY (SEQ ID NO: 64) CDR L3: QQSTEDPWT (SEQ ID NO: 68) Fv область
(анти-CD3) VH:
QVQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTSYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSSGYTKYNQKFKDRFTISADKSKSTAFLQMDSLRPEDTGVYFCARWQDYDVYFDYWGQGTPVTVSS (SEQ ID NO: 69) VL:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTMTCRASSSVSYMHWYQQTPGKAPKPWIYATSNLASGVPSRFSGSGSGTDYTLTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPPTFGQGTKLQITR (SEQ ID NO: 73) CDR H1: GYTFTSYT (SEQ ID NO: 70) CDR L1: SSSVSY (SEQ ID NO: 74) CDR H2: INPSSGYT (SEQ ID NO: 71) CDR L2: ATS (SEQ ID NO: 75) CDR H3: ARWQDYDVYFDY (SEQ ID NO: 72) CDR L3: QQWSSNPPT (SEQ ID NO: 76)

[00474] Последовательности ДНК, кодирующие ACE-02-VH, ACE-02-VL и ACE-02-LC, следующие:

ACE-02-VH нуклеотидная последовательность:

CAGGTTCAATTGCAGCAAAGCGGGGCTGAGTTGGTACGGCCTGGGTCCAGCGTGAAGATATCATGTAAGGCTtctGGATATGCCTTCTCCTCTTACTGGATGAACTGGGTCAAGCAACGGCCAGGACAAGGCCTGGAGTGGATTGGGCAAATATGGCCCGGGGACGGAGATACTAATTATAATGGCAAGTTTAAGGGGAAAGCTACACTGACCGCAGACGAAAGCTCCTCTACGGCCTATATGCAGCTCTCATCTCTTGCGTCCGAAGATAGTGCAGTATATTTTTGTGCGCGCCGCGAGACCACCACGGTTGGGAGGTACTATTACGCGATGGATTACTGGGGCCAGGGGACTACAGTTACGGTTTCATCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAccGCAGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACACCATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCAGCGGCTACACCAAGTACAACCAGAAGTTCAAGGACCGCTTCACCATCAGCGCCGACAAGAGCAAGAGCACCGCCTTCCTGCAGATGGACAGCCTGCGCCCCGAGGACACCGGCGTGTACTTCTGCGCCCGCTGGCAGGACTACGACGTGTACTTCGACTACTGGGGCCAGGGCACCCCCGTGACCGTGAGCAGCTAA (SEQ ID NO: 100)

ACE-02-VL нуклеотидная последовательность: CAGGTTCAATTGCAGCAAAGCGGGGCTGAGTTGGTACGGCCTGGGTCCAGCGTGAAGATATCATGTAAGGCTTCTGGATATGCCTTCTCCTCTTACTGGATGAACTGGGTCAAGCAACGGCCAGGACAAGGCCTGGAGTGGATTGGGCAAATATGGCCCGGGGACGGAGATACTAATTATAATGGCAAGTTTAAGGGGAAAGCTACACTGACCGCAGACGAAAGCTCCTCTACGGCCTATATGCAGCTCTCATCTCTTGCGTCCGAAGATAGTGCAGTATATTTTTGTGCGCGCCGCGAGACCACCACGGTTGGGAGGTACTATTACGCGATGGATTACTGGGGCCAGGGGACTACAGTTACGGTTTCATCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACCGCGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGCACTGGTACCAGCAGACCCCCGGCAAGGCCCCCAAGCCCTGGATCTACGCCACCAGCAACCTGGCCAGCGGCGTGCCCAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACACCCTGACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCCCCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGCAGATCACCCGCTAA (SEQ ID NO: 101)

Нуклеотидная последовательность ACE-02-LC (нуклеотидная последовательность легкой цепи анти-CD19 антитела):

GATATTCAACTCACGCAATCTCCAGCAAGTCTCGCAGTTAGTTTGGGGCAGCGAGCTACAATAAGTTGCAAGGCGAGCCAATCCGTGGATTATGATGGAGACAGCTATCTTAACTGGTATCAGCAAATTCCAGGCCAGCCACCCAAGTTGCTGATCTACGACGCGTCAAACCTGGTCTCAGGGATCCCTCCAAGATTTAGCGGCTCAGGTTCAGGTACGGATTTTACGCTCAATATCCATCCTGTAGAGAAGGTTGATGCAGCTACATACCACTGTCAACAGAGTACCGAGGATCCTTGGACCTTCGGAGGCGGTACAAAGCTGGAGATCAAGAGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA (SEQ ID NO: 102)

[00475] На ФИГ. 3 результаты SDS-PAGE показывают экспрессию ACE-02, ACE-03, ACE-00 и ACE-01. ФИГ.3 также показывает разницу в паттернах сборки ACE-02 и ACE-02-VL2 и разницу в паттернах сборки ACE-03 и ACE-03-VL2. Для ACE-01 родительскими антителами являются анти-CD19 Ab, нацеленный на первый антиген, и мышиный OKT3, нацеленный на второй антиген. Эти результаты предполагают, что ACE-02 был правильно экспрессирован и собран.

1.3. Конструирование и экспрессия ACE-03

[00476] Система временной экспрессии HEK-293 (Invitrogen, США) была использована для экспрессии молекулы ALiCE ACE-03, представленной в настоящем документе. ACE-03 состоит из анти-CD19 доменов и гуманизированных анти-CD3 OKT3 доменов. ACE-03 содержит две разные цепи, подобные тяжелым цепям (ACE-03-VH и ACE-03-VL), и две идентичные легкие цепи (ACE-03-LC). Аминокислотные последовательности этих трех типов полипептидов следующие:

Аминокислотная последовательность ACE-03-VH:

Аминокислотная последовательность ACE-03-VL:

Аминокислотная последовательность ACE-03-LC (легкая цепь анти-CD19-антитела):

[00477] Аминокислотные последовательности VH и VL и последовательности CDR в таковых для бивалентной области Fab первого антигенсвязывающего домена, нацеленного на CD19, и моновалентной области Fv второго антигенсвязывающего домена гуманизированного OKT3 представлены в таблице ниже:

Таблица 6: VH, VL и CDR ACE-03

Fab область
(анти-CD19) VH: QVQLQQSGAELVRPGSSVKISCKASGYAFSSYWMNWVKQRPGQGLEWIGQIWPGDGDTNYNGKFKGKATLTADESSSTAYMQLSSLASEDSAVYFCARRETTTVGRYYYAMDYWGQGTTVTVSS (SEQ ID NO: 61) VL:
DIQLTQSPASLAVSLGQRATISCKASQSVDYDGDSYLNWYQQIPGQPPKLLIYDASNLVSGIPPRFSGSGSGTDFTLNIHPVEKVDAATYHCQQSTEDPWTFGGGTKLEIK (SEQ ID NO: 65) CDR H1: SYWMN (SEQ ID NO: 62) CDR L1: QSVDYDGDSY (SEQ ID NO: 66) CDR H2: QIWPGDGDTNYNGKFKG (SEQ ID NO: 63) CDR L2: DAS (SEQ ID NO: 67) CDR H3: RETTTVGRYYYAMDY (SEQ ID NO: 64) CDR L3: QQSTEDPWT (SEQ ID NO: 68) Fv область
(анти-CD3) VH:
VQLVQSGGGVVQPGRSLRLSCKASGYTFTRYTMHWVRQAPGKGLEWIGYINPSRGYTNYNQKVKDRFTISTDKSKSTAFLQMDSLRPEDTAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTPVTVSS (SEQ ID NO: 77) VL:
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASSSVSYMNWYQQTPGKAPKRWIYDTSKLASGVPSRFSGSGSGTDYTFTISSLQPEDIATYYCQQWSSNPFTFGQGTKLQITR (SEQ ID NO: 81) CDR H1: GYTFTRYT (SEQ ID NO: 78) CDR L1: SSVSY (SEQ ID NO: 82) CDR H2: INPSRGYT (SEQ ID NO: 79) CDR L2: DTS (SEQ ID NO: 83) CDR H3: ARYYDDHYCLDY (SEQ ID NO: 80) CDR L3: QQWSSNPFT (SEQ ID NO: 84)

[00478] Последовательности ДНК, кодирующие ACE-03-VH, ACE-03-VL и ACE-03-LC, следующие:

ACE-03-VH нуклеотидная последовательность: CAGGTTCAATTGCAGCAAAGCGGGGCTGAGTTGGTACGGCCTGGGTCCAGCGTGAAGATATCATGTAAGGCTtctGGATATGCCTTCTCCTCTTACTGGATGAACTGGGTCAAGCAACGGCCAGGACAAGGCCTGGAGTGGATTGGGCAAATATGGCCCGGGGACGGAGATACTAATTATAATGGCAAGTTTAAGGGGAAAGCTACACTGACCGCAGACGAAAGCTCCTCTACGGCCTATATGCAGCTCTCATCTCTTGCGTCCGAAGATAGTGCAGTATATTTTTGTGCGCGCCGCGAGACCACCACGGTTGGGAGGTACTATTACGCGATGGATTACTGGGGCCAGGGGACTACAGTTACGGTTTCATCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACcGGTGCAGCTGGTGCAGAGCGGCGGCGGCGTGGTGCAGCCCGGCCGCAGCCTGCGCCTGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCCGCTACACCATGCACTGGGTGCGCCAGGCCCCCGGCAAGGGCCTGGAGTGGATCGGCTACATCAACCCCAGCCGCGGCTACACCAACTACAACCAGAAGGTGAAGGACCGCTTCACCATCAGCACCGACAAGAGCAAGAGCACCGCCTTCCTGCAGATGGACAGCCTGCGCCCCGAGGACACCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCTACTACGACGACCACTACTGCCTGGACTACTGGGGCCAGGGCACCCCCGTGACCGTGAGCAGCTAA (SEQ ID NO: 103)

ACE-03-VL нуклеотидная последовательность: CAGGTTCAATTGCAGCAAAGCGGGGCTGAGTTGGTACGGCCTGGGTCCAGCGTGAAGATATCATGTAAGGCTtctGGATATGCCTTCTCCTCTTACTGGATGAACTGGGTCAAGCAACGGCCAGGACAAGGCCTGGAGTGGATTGGGCAAATATGGCCCGGGGACGGAGATACTAATTATAATGGCAAGTTTAAGGGGAAAGCTACACTGACCGCAGACGAAAGCTCCTCTACGGCCTATATGCAGCTCTCATCTCTTGCGTCCGAAGATAGTGCAGTATATTTTTGTGCGCGCCGCGAGACCACCACGGTTGGGAGGTACTATTACGCGATGGATTACTGGGGCCAGGGGACTACAGTTACGGTTTCATCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAccgGACATCCAGATGACCCAGAGCCCCAGCAGCCTGAGCGCCAGCGTGGGCGACCGCGTGACCATCACCTGCAGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATGAACTGGTACCAGCAGACCCCCGGCAAGGCCCCCAAGCGCTGGATCTACGACACCAGCAAGCTGGCCAGCGGCGTGCCCAGCCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCGACTACACCTTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCCGAGGACATCGCCACCTACTACTGCCAGCAGTGGAGCAGCAACCCCTTCACCTTCGGCCAGGGCACCAAGCTGCAGATCACCCGCTAA (SEQ ID NO: 104)

Нуклеотидная последовательность ACE-03-LC (нуклеотидная последовательность легкой цепи анти-CD19 антитела):

GATATTCAACTCACGCAATCTCCAGCAAGTCTCGCAGTTAGTTTGGGGCAGCGAGCTACAATAAGTTGCAAGGCGAGCCAATCCGTGGATTATGATGGAGACAGCTATCTTAACTGGTATCAGCAAATTCCAGGCCAGCCACCCAAGTTGCTGATCTACGACGCGTCAAACCTGGTCTCAGGGATCCCTCCAAGATTTAGCGGCTCAGGTTCAGGTACGGATTTTACGCTCAATATCCATCCTGTAGAGAAGGTTGATGCAGCTACATACCACTGTCAACAGAGTACCGAGGATCCTTGGACCTTCGGAGGCGGTACAAAGCTGGAGATCAAGAGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA (SEQ ID NO: 102)

[00479] На ФИГ. 3 результаты SDS-PAGE показывают экспрессию ACE-02, ACE-03, ACE-00 и ACE-01. ФИГ.3 также показывает разницу в паттернах сборки ACE-02 и ACE-02-VL2 и разницу в паттернах сборки ACE-03 и ACE-03-VL2. Эти результаты предполагают, что ACE-03 был правильно экспрессирован и собран.

1.4. Конструкция и проявление ACE-04

[00480] Система транзиентной экспрессии HEK-293 (Invitrogen, США) была использована для экспрессии молекулы ALiCE ACE-04, представленной в данном документе. ACE-04 состоит из анти-PD-L1 доменов и химерных OKT3 Fab-доменов (см. ФИГ. 4A). ACE-04 содержит две разные цепи, подобные тяжелым цепям, ACE-04-VH (VL-CL-VH-CH1) и ACE-04-VL (VH-CH1-VL-CL), и две идентичные легкие цепи (ACE-04-LC). Аминокислотные последовательности этих трех типов полипептидов следующие:

Аминокислотная последовательность ACE-04-VH:

Аминокислотная последовательность ACE-04-VL:

Аминокислотная последовательность ACE-04-LC (легкая цепь анти-PD-L1 антитела):

[00481] Аминокислотные последовательности VH и VL и последовательности CDR таковых для бивалентной области Fab первого антигенсвязывающего домена, нацеленной на PD-L1, и моновалентной области Fv второго антигенсвязывающего домена химерного OKT-3 Fab-области перечислены в таблице ниже:

Таблица 7: VH, VL и CDR ACE-04

Fab область
(анти-PD-L1) VH: QMQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGIANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAKPRDGYNLVAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 4) VL:
QLVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGAAPKLLIYGDINRPSGVPDRFSGSKSGISASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGGVFGGGTKLTVLR (SEQ ID NO: 8) CDR H1: GGTFSSYA (SEQ ID NO: 5) CDR L1: SSNIGAGYD (SEQ ID NO: 9) CDR H2: IIPILGIA (SEQ ID NO: 6) CDR L2: GDI (SEQ ID NO: 10) CDR H3: AKPRDGYNLVAFDI (SEQ ID NO: 7) CDR L3: QSYDSSLSGGV (SEQ ID NO: 11) Fv область
(анти-CD3) VH:
QVQLQQSGAELARPGASVKMSCKASGYTFTRYTMHWVKQRPGQGLEWIGYINPSRGYTNYNQKFKDKATLTTDKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARYYDDHYCLDYWGQGTTVTVSA (SEQ ID NO: 85) VL:
QIVLTQSPAIMSASPGEKVTMTCSASSSVSYMNWYQQKSGTSPKRWIYDTSKLASGVPAHFRGSGSGTSYSLTISGMEAEDAATYYCQQWSSNPFTFGSGTKLEINR (SEQ ID NO: 86) CDR H1: GYTFTRYT (SEQ ID NO: 78) CDR L1: SSVSY (SEQ ID NO: 82) CDR H2: INPSRGYT (SEQ ID NO: 79) CDR L2: DTS (SEQ ID NO: 83) CDR H3: ARYYDDHYCLDY (SEQ ID NO: 80) CDR L3: QQWSSNPF (SEQ ID NO: 87)

[00482] Последовательности ДНК, кодирующие ACE-04-VH, ACE-04-VL и ACE-04-LC, следующие:

ACE-04-VH нуклеотидная последовательность: CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTCAGGTCCAGTTGCAACAGTCTGGAGCCGAGCTCGCCAGGCCAGGAGCCTCCGTCAAAATGTCATGCAAGGCCTCAGGGTACACATTTACGCGATATACCATGCACTGGGTGAAACAAAGACCAGGTCAGGGACTTGAATGGATCGGTTACATTAACCCCTCTAGAGGCTATACGAATTACAACCAGAAATTCAAAGACAAAGCAACACTTACGACTGACAAATCCAGTAGTACGGCTTACATGCAGCTCTCATCTTTGACTTCAGAAGACTCTGCTGTATATTATTGTGCCCGCTATTACGATGACCATTACTGCCTTGATTACTGGGGCCAGGGCACTACTGTTACCGTAAGTGCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAGAGTTGAGCCCAAATCTTGTTGA (SEQ ID NO: 105)

ACE-04-VL нуклеотидная последовательность: CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTCAGATCGTCCTCACTCAAAGTCCTGCTATTATGTCCGCAAGCCCTGGTGAAAAGGTTACCATGACTTGCTCCGCATCTAGTTCTGTCTCTTACATGAACTGGTACCAGCAAAAGTCTGGAACGTCCCCGAAAAGGTGGATATATGATACGAGCAAATTGGCAAGCGGAGTACCCGCGCATTTTAGGGGTTCAGGCAGCGGTACGTCATATAGCCTGACTATTAGCGGAATGGAGGCGGAGGATGCTGCAACATATTATTGCCAACAATGGTCATCAAATCCTTTTACTTTCGGCTCAGGCACAAAACTTGAAATAAATAGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGcTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA (SEQ ID NO: 106)

ACE-04-LC (нуклеотидная последовательность легкой цепи анти-PD-L1 антитела):

CAGCTCGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTATCAGCAACTTCCAGGAGCAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGCGACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCATCTCAGCCTCCCTGGCTATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGGGGGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAAGATCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 107)

[00483] На ФИГ. 4C результаты SDS-PAGE показывают экспрессию ACE-04 и ACE-05, разницу в паттернах сборки ACE-04 и ACE-04-VL2 и разницу в паттернах сборки ACE-05 и ACE-05-VL2. Результаты показывают, что ACE-04 был правильно экспрессирован и собран.

1.5.Конструирование и экспрессия ACE-05

[00484] Система транзиентной экспрессии HEK-293 (Invitrogen, США) была использована для экспрессии другой молекулы ALiCE, представленной в данном документе ACE-05 (связывающая молекула, состоящая из анти-PD-L1 и анти-CD3 доменов; см. ФИГ. 4Б). ACE-05 содержит две разные цепи, подобные тяжелым цепям (ACE-05-VH и ACE-05-VL), и две идентичные легкие цепи (ACE-05-LC). ACE-05 содержит линкер G4S (аминокислотная последовательность GGGGS, SEQ ID NO: 112) в гибкой пептидной области. Аминокислотные последовательности этих трех типов полипептидов следующие:

ACE-05-VH аминокислотная последовательность:

ACE-05-VL аминокислотная последовательность:

ACE-05-LC аминокислотная последовательность:

[00485] Аминокислотные последовательности VH и VL и последовательности CDR в таковых для бивалентной области Fab первого антигенсвязывающего домена, нацеленной на PD-L1, и моновалентной области Fv второго антигенсвязывающего домена, нацеленной на CD3, перечислены в таблице ниже:

Таблица 8: VH, VL и CDR ACE-05

Fab область
(анти-PD-L1) VH: QMQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGIANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAKPRDGYNLVAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 4) VL:
QLVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGAAPKLLIYGDINRPSGVPDRFSGSKSGISASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGGVFGGGTKLTVLR (SEQ ID NO: 8) CDR H1: GGTFSSYA (SEQ ID NO: 5) CDR L1: SSNIGAGYD (SEQ ID NO: 9) CDR H2: IIPILGIA (SEQ ID NO: 6) CDR L2: GDI (SEQ ID NO: 10) CDR H3: AKPRDGYNLVAFDI (SEQ ID NO: 7) CDR L3: QSYDSSLSGGV (SEQ ID NO: 11) Fv область
(анти-CD3) VH:
EVQLQQSGPELVKPGPSMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTTLTVFS (SEQ ID NO: 12) VL:
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLEIKR (SEQ ID NO: 16) CDR H1: GYSFTGYTMN (SEQ ID NO: 13) CDR L1: RASQDIRNYLN (SEQ ID NO: 17) CDR H2: LINPYKGVST (SEQ ID NO: 14) CDR L2: YTSRLHS (SEQ ID NO: 18) CDR H3: SGYYGDSDWYFDV (SEQ ID NO: 15) CDR L3: QQGNTLPWT (SEQ ID NO: 19)

[00486] Тройную трансфекцию клеток-хозяев выполняли, используя ДНК ACE-05-VH, ACE-05-VL и ACE-05-LC (при соотношении 0,5: 0,5: 1 мас./мас.). Последовательности ДНК, кодирующие ACE-05-VH, ACE-05-VL и ACE-05-LC, следующие:

ACE-05-VH нуклеотидная последовательность: CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGACCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGGACCACGCTGACCGTCTTCTCATAA (SEQ ID NO: 20)

ACE-05-VL нуклеотидная последовательность: CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGTCTGCCTCCCTGGGCGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA (SEQ ID NO: 21)

ACE-05-LC нуклеотидная последовательность:

CAGCTCGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTATCAGCAACTTCCAGGAGCAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGCGACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCATCTCAGCCTCCCTGGCTATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGGGGGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAAGAaccGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA (SEQ ID NO: 22)

[00487] Трансфекцию проводили, как описано выше в Разделе 1.1. Более конкретно, полиэтиленимин (PEI) использовали в качестве реагента для трансфекции (при соотношении ДНК: PEI=1: 4 (мас./мас.)). Через шесть-семь дней после трансфекции, когда уровень выживаемости клеток составлял примерно 60-70%, культивирование прекращали, а среду для экспрессии собирали и центрифугировали (4800 об/мин, 30 мин, 4 ℃) для удаления клеток. Затем супернатант фильтровали с использованием 0.22 мкм TOP-фильтра (Millipore, США). Затем отфильтрованный супернатант, содержащий молекулы ACE-05, очищали с помощью аффинной хроматографии с использованием Hitrap™ KappaSelect (GE healthcare, США) с последующим диализом PBS pH 7,4 с использованием кассеты для диализа Slide-A Lyzer (Thermo, США) для замены элюирующего буфера. Очищенные белки анализировали с помощью SDS-PAGE, капиллярного электрофореза и эксклюзионной хроматографии (SEC). Уровень экспрессии с использованием системы транзиентной экспрессии HEK-293F в этом эксперименте составлял около 50 мг/л. Анализ очистки с использованием Hitrap ™ KappaSelect показал, что большинство молекул, экспрессируемых в среде, было восстановлено. Очищенные молекулы ACE-05 также анализировали на их чистоту препарата (отсутствие примесей) с использованием Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Германия) и SEC-HPLC (ThermoFisher, США). Анализ чистоты проводился с использованием протоколов, предоставленных производителями.

[00488] На ФИГ. 4C результаты SDS-PAGE показывают экспрессию ACE-05 и ACE-04, разницу в паттернах сборки ACE-05 и ACE-05-VL2 и разницу в паттернах сборки ACE-04 и ACE- 04-VL2. На ФИГ. 4D показаны результаты SDS-PAGE, выполненного для идентификации паттерна сборки ACE-05 (вверху), и показан потенциальный регуляторный механизм сборки ACE-05.

[00489] ФИГ. 4E-4F показывают SDS-PAGE и капиллярный электрофорез, выполненные для идентификации конформации ACE-05, а также эффективности гетеродимеризации между цепями ACE-05-VH и ACE-05-VL. На левой панели ФИГ. 4E-4F показаны результаты SDS-PAGE очищенного ACE-05. На левой панели ФИГ. 4E также показаны результаты аффинной хроматографии для белков ACE-05 и ACE-05-VL2 с использованием KappaSelect. Правые четыре панели на ФИГ. 4E-4F показывают почти одинаковое количество цепей ACE-05-VH и ACE-05-VL, количество ACE-05-LC и высокую эффективность гетеродимиеризации между цепями ACE-05-VH и ACE-05-VL. Результат капиллярного электрофореза также свидетельствует о том, что ACE-05 был правильно экспрессирован и собран. ФИГ. 4G показывает результаты эксклюзионной хроматографии, выполненной для определения чистоты ACE-05. Как показано, очищенный образец KappaSelect содержит свободные легкие цепи. Затем была применена вторая стадия гель-фильтрационной хроматографии (GFC) для удаления свободных легких цепей, что привело к образованию чистых и правильно собранных молекул ACE-05. Как и ожидалось, димеры ACE-05-VH и ACE-05-LC и димеры ACE-05-VL и ACE-05-LC наблюдались в полосе NR изображения SDS-PAGE. Гидрофобное взаимодействие между ACE-05-VH и ACE-05-VL нарушалось детергентом SDS.

[00490] На ФИГ. 4Н показаны результаты эксклюзионной хроматографии для гель-фильтрационного анализа ACE-05. Анализ гель-фильтрации выполняли для определения конформации ACE-05 после аффинной очистки kappa-select. Около 19% агрегации ACE-05 было обнаружено с помощью колоночной хроматографии Superdex 200A. На ФИГ. 4I показаны результаты катионообменной хроматографии (CEX), выполненной для определения структурных конформаций ACE-05. Главный пик, выделенный после гель-фильтрации, анализировали и разделяли на 2 пика с помощью колонки CEX. Более высокий пик (67,87%) - представляет собой собранный ACE-05, а нижний пик (32%) - представляет собой цепь ACE-05-VH, имеющую свободные тиоловые группы в шарнирной области.

1.6. Конструкция и экспрессия ACE-09

[00491] Система транзиентной экспрессии HEK-293 (Invitrogen, США) также использовалась для подтверждения правильной экспрессии и сборки ACE-09 (связывающей молекулы, состоящей из анти-PD-L1 и UCHT1 доменов) с использованием аналогичного метода, описанного в Разделах выше. ACE-09 содержит две разные цепи, подобные тяжелым цепям (ACE-09-VH и ACE-09-VL), и две идентичные легкие цепи (ACE-09-LC) (ФИГ.5 внизу). По сравнению с ACE-05, ACE-09 не содержит линкер G4S (аминокислотная последовательность GGGGS), содержащийся в гибкой пептидной области ACE-05 (ФИГ.5 внизу). Аминокислотные последовательности этих трех типов полипептидов следующие:

ACE-09-VH аминокислотная последовательность (без линкера G4S):

ACE-09-VL аминокислотная последовательность (без линкера G4S):

ACE-09-LC аминокислотная последовательность (без линкера G4S):

[00492] Аминокислотные последовательности VH и VL и последовательности CDR таковых для бивалентной области Fab, нацеленной на PD-L1 и UCHT1, перечислены в таблице ниже:

Таблица 9: VH, VL и CDR ACE-09

Fab область (анти-PD-L1) VH: QMQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGIANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAKPRDGYNLVAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 4) VL:
QLVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGAAPKLLIYGDINRPSGVPDRFSGSKSGISASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGGVFGGGTKLTVLR (SEQ ID NO: 8) CDR H1: GGTFSSYA (SEQ ID NO: 5) CDR L1: SSNIGAGYD (SEQ ID NO: 9) CDR H2: IIPILGIA (SEQ ID NO: 6) CDR L2: GDI (SEQ ID NO: 10) CDR H3: AKPRDGYNLVAFDI (SEQ ID NO: 7) CDR L3: QSYDSSLSGGV (SEQ ID NO: 11) Fv область
(анти-CD3) VH:
EVQLQQSGPELVKPGPSMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTTLTVFS (SEQ ID NO: 12) VL:
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLEIKR (SEQ ID NO: 16) CDR H1: GYSFTGYTMN (SEQ ID NO: 13) CDR L1: RASQDIRNYLN (SEQ ID NO: 17) CDR H2: LINPYKGVST (SEQ ID NO: 14) CDR L2: YTSRLHS (SEQ ID NO: 18) CDR H3: SGYYGDSDWYFDV (SEQ ID NO: 15) CDR L3: QQGNTLPWT (SEQ ID NO: 19)

[00493] Последовательности ДНК, кодирующие ACE-09-VH, ACE-09-VL и ACE-09-LC, следующие:

ACE-09-VH нуклеотидная последовательность (без линкера G4S):

CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACcGGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGACCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGGACCACGCTGACCGTCTTCTCATAA (SEQ ID NO: 108)

ACE-09-VL нуклеотидная последовательность (без линкера G4S):

CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGAccgGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGTCTGCCTCCCTGGGCGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA (SEQ ID NO: 109)

ACE-09-LC нуклеотидная последовательность (нуклеотидная последовательность легкой цепи анти-PD-L1 антитела):

CAGCTCGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTATCAGCAACTTCCAGGAGCAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGCGACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCATCTCAGCCTCCCTGGCTATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGGGGGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAAGATCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 107)

[00494] На ФИГ. 5 показаны результаты SDS-PAGE аффинной хроматографии для ACE-09 с использованием KappaSelect и результат SDS-PAGE для ACE-09 и ACE-05 при 37° C и 32° C. Результаты показывают, что ACE-09 был правильно экспрессирован и собран. Более того, ACE-09 имеет такие же VH и VL в областях Fab и Fv, что и ACE-05 (показано в Таблицах 8 и 9), но ACE-09 не содержит линкер G4S (аминокислотная последовательность GGGGS), расположенный в ACE- 05 между шарнирной областью антитела и вторым доменом Fv (ФИГ. 5 внизу). Гибкие линкеры G4S способны уменьшать стерические препятствия и оптимизировать связывание второго домена Fv с иммунными клетками (например, эффекторными клетками, включая Т-клетки), и, таким образом, приводить к повышению эффективности перенаправления иммунных клеток на клетки-мишени (например, раковые клетки). Было неожиданно, что ACE-05 и ACE-09 показали одинаковый уровень экспрессии, что позволяет предположить, что линкер G4S может обладать гибкостью, способствующей активности молекул ALiCE, не влияя на их экспрессию и сборку.

1.7. Конструиование и экспрессия ACE-10

[00495] Система транзиентной экспрессии HEK-293 (Invitrogen, США) использовалась для подтверждения правильной экспрессии и сборки ACE-10 (связывающей молекулы, состоящей из анти-CD20 и анти-CD3 доменов; см. ФИГ. 6A) с использованием аналогичного метода, описанного в Разделах 1.1 и 1.2 выше. ACE-10 содержит две разные цепи, подобные тяжелые цепям (ACE-10-VH и ACE-10-VL), и две идентичные легкие цепи (ACE-10-LC). Аминокислотные последовательности этих трех типов полипептидов следующие:

ACE-10-VH аминокислотная последовательность:

ACE-10-VL аминокислотная последовательность:

ACE-10-LC аминокислотная последовательность:

[00496] Аминокислотные последовательности VH и VL и последовательности CDR таковых для бивалентной области Fab, нацеленной на CD20, и моновалентной области Fv, нацеленной на CD3, представлены в таблице ниже:

Таблица 10: VH, VL и CDR ACE-10

Fab область
(анти-CD20) VH: QVQLQQPGAELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYNMHWVKQTPGRGLEWIGAIYPGNGDTSYNQKFKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYYCARSTYYGGDWYFNVWGAGTTVTVSA (SEQ ID NO: 26) VL:
QIVLSQSPAILSASPGEKVTMTCRASSSVSYIHWFQQKPGSSPKPWIYATSNLASGVPVRFSGSGSGTSYSLTISRVEAEDAATYYCQQWTSNPPTFGGGTKLEIKR (SEQ ID NO: 30) CDR H1: GYTFTSYN (SEQ ID NO: 27) CDR L1: SSVSY (SEQ ID NO: 31) CDR H2: IYPGNGDT (SEQ ID NO: 28) CDR L2: ATS (SEQ ID NO: 32) CDR H3: ARSTYYGGDWYFNV (SEQ ID NO: 29) CDR L3: QQWTSNPPT (SEQ ID NO: 33) Fv область
(анти-CD3) VH:
EVQLQQSGPELVKPGPSMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTTLTVFS (SEQ ID NO: 12) VL:
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLEIKR (SEQ ID NO: 16) CDR H1: GYSFTGYTMN (SEQ ID NO: 13) CDR L1: RASQDIRNYLN (SEQ ID NO: 17) CDR H2: LINPYKGVST (SEQ ID NO: 14) CDR L2: YTSRLHS (SEQ ID NO: 18) CDR H3: SGYYGDSDWYFDV (SEQ ID NO: 15) CDR L3: QQGNTLPWT (SEQ ID NO: 19)

[00497] Последовательности ДНК, кодирующие ACE-10-VH, ACE-10-VL и ACE-10-LC, следующие:

ACE-10-VH нуклеотидная последовательность: CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGAGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCTGGAAGAGGACTGGAGTGGATCGGCGCCATCTACCCCGGCAACGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCAGCACCTACTACGGCGGCGACTGGTACTTCAACGTGTGGGGAGCTGGAACCACCGTGACCGTGAGCGCCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGACCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGGACCACGCTGACCGTCTTCTCATAA (SEQ ID NO: 34)

ACE-10-VL нуклеотидная последовательность: CAGGTGCAGCTGCAGCAGCCTGGAGCCGAGCTGGTGAAGCCCGGCGCCAGCGTGAAGATGAGCTGCAAGGCCAGCGGCTACACCTTCACCAGCTACAACATGCACTGGGTGAAGCAGACCCCTGGAAGAGGACTGGAGTGGATCGGCGCCATCTACCCCGGCAACGGCGACACCAGCTACAACCAGAAGTTCAAGGGCAAGGCCACCCTGACCGCCGACAAGAGCAGCAGCACCGCCTACATGCAGCTGAGCAGCCTGACCAGCGAGGACAGCGCCGTGTACTACTGCGCCCGCAGCACCTACTACGGCGGCGACTGGTACTTCAACGTGTGGGGAGCTGGAACCACCGTGACCGTGAGCGCCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGTCTGCCTCCCTGGGCGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA (SEQ ID NO: 35)

ACE-10-LC нуклеотидная последовательность:

CAGATCGTGCTGAGCCAGAGCCCtGCtATCCTGAGCGCCAGCCCtGGCGAGAAGGTGACCATGACCTGCCGCGCCAGCAGCAGCGTGAGCTACATCCACTGGTTCCAGCAGAAGCCCGGCAGCAGCCCCAAGCCCTGGATCTACGCCACCAGCAACCTGGCCAGCGGAGTGCCTGTGCGCTTCAGCGGCAGCGGCAGCGGCACCAGCTACAGCCTGACCATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGACGCCGCTACCTACTACTGCCAGCAGTGGACCAGCAACCCCCCCACCTTCGGCGGCGGCACCAAGCTGGAGATCAAGAGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 36)

[00498] На ФИГ. 6B-6C показан анализ экспрессии молекулы ACE-10. Как показано, ACE-10 была правильно экспрессирована и собрана. Кроме того, результаты показывают, что сборка ACE-10 регулируется VH-BiP-зависимым образом.

1.8. Конструирование и экспрессия ACE-11

[00499] Система транзиентной экспрессии HEK-293 (Invitrogen, США) также использовалась для подтверждения правильной экспрессии и сборки ACE-11 (связывающей молекулы, состоящей из анти-EGFR и анти-CD3 доменов; см. ФИГ. 7A) с использованием аналогичного метода, описанного в Разделах 1.1 и 1.2 выше. ACE-11 имеет ту же общую структуру, что и ACE-05 и ACE-10, и содержит две разные цепи, подобные тяжелым цепям (ACE-11-VH и ACE-11-VL), и две идентичные легкие цепи (ACE-11-LC).. Аминокислотные последовательности этих трех типов полипептидов следующие:

ACE-11-VH аминокислотная последовательность:

ACE-11-VL аминокислотная последовательность:

ACE-11-LC аминокислотная последовательность:

[00500] Аминокислотные последовательности VH и VL и последовательности CDR таковых для бивалентной области Fab первого антигенсвязывающего домена, нацеленной на EGFR, и моновалентной области Fv второго антигенсвязывающего домена, нацеленной на CD3, представлены в таблице ниже:

Таблица 11: VH, VL и CDR ACE-11

Fab область
(анти-CD20) VH: QVQLKQSGPGLVQPSQSLSITCTVSGFSLTNYGVHWVRQSPGKGLEWLGVIWSGGNTDYNTPFTSRLSINKDNSKSQVFFKMNSLQSNDTAIYYCARALTYYDYEFAYWGQGTLVTVSA (SEQ ID NO: 40) VL:
DILLTQSPVILSVSPGERVSFSCRASQSIGTNIHWYQQRTNGSPRLLIKYASESISGIPSRFSGSGSGTDFTLSINSVESEDIADYYCQQNNNWPTTFGAGTKLELKR (SEQ ID NO: 44) CDR H1: GFSLTNYG (SEQ ID NO: 41) CDR L1: QSIGTN (SEQ ID NO: 45) CDR H2: IWSGGNT (SEQ ID NO: 42) CDR L2: YAS (SEQ ID NO: 46) CDR H3: ARALTYYDYEFAY (SEQ ID NO: 43) CDR L3: QQNNNWPTT (SEQ ID NO: 47) Fv область
(анти-CD3) VH:
EVQLQQSGPELVKPGPSMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTTLTVFS (SEQ ID NO: 12) VL:
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLEIKR (SEQ ID NO: 16) CDR H1: GYSFTGYTMN (SEQ ID NO: 13) CDR L1: RASQDIRNYLN (SEQ ID NO: 17) CDR H2: LINPYKGVST (SEQ ID NO: 14) CDR L2: YTSRLHS (SEQ ID NO: 18) CDR H3: SGYYGDSDWYFDV (SEQ ID NO: 15) CDR L3: QQGNTLPWT (SEQ ID NO: 19)

[00501] Последовательности ДНК, кодирующие ACE-11-VH, ACE-11-VL и ACE-11-LC, следующие:

АСЕ-11-VH нуклеотидная последовательность: CAAGTCCAACTGAAACAATCGGGTCCGGGTCTGGTCCAACCGTCCCAATCACTGAGCATCACCTGTACCGTGTCGGGCTTCTCGCTGACCAATTATGGTGTGCATTGGGTTCGTCAGAGTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGCTGGGCGTTATTTGGTCCGGCGGTAATACCGATTACAACACCCCGTTTACGAGTCGCCTGTCCATCAATAAAGACAACTCGAAAAGCCAGGTGTTTTTCAAAATGAATTCACTGCAATCGAACGATACCGCGATTTATTACTGCGCACGTGCTCTGACGTATTACGACTATGAATTTGCCTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTGACGGTTAGCGCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGACCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGGACCACGCTGACCGTCTTCTCATAA (SEQ ID NO: 48)

ACE-11-VL нуклеотидная последовательность: CAAGTCCAACTGAAACAATCGGGTCCGGGTCTGGTCCAACCGTCCCAATCACTGAGCATCACCTGTACCGTGTCGGGCTTCTCGCTGACCAATTATGGTGTGCATTGGGTTCGTCAGAGTCCGGGCAAAGGTCTGGAATGGCTGGGCGTTATTTGGTCCGGCGGTAATACCGATTACAACACCCCGTTTACGAGTCGCCTGTCCATCAATAAAGACAACTCGAAAAGCCAGGTGTTTTTCAAAATGAATTCACTGCAATCGAACGATACCGCGATTTATTACTGCGCACGTGCTCTGACGTATTACGACTATGAATTTGCCTACTGGGGCCAGGGTACCCTGGTGACGGTTAGCGCGGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAGGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGTCTGCCTCCCTGGGCGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA (SEQ ID NO: 49)

ACE-11-LC нуклеотидная последовательность:

GATATTCTGCTGACCCAGAGCCCGGTGATCCTGAGTGTTTCCCCGGGCGAACGTGTGTCATTTTCGTGTCGCGCGAGCCAGTCTATTGGTACCAATATCCACTGGTATCAGCAACGTACGAACGGCTCTCCGCGCCTGCTGATTAAATACGCCAGTGAATCCATTTCAGGCATCCCGAGCCGCTTTTCGGGCAGCGGTTCTGGCACCGATTTCACGCTGAGTATTAACTCCGTGGAATCAGAAGATATCGCAGACTATTACTGCCAGCAAAACAATAACTGGCCGACCACGTTTGGTGCTGGCACCAAACTGGAACTGAAAAGAACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAA (SEQ ID NO: 50).

[00502] ФИГ. 7B показывает экспрессию и сборку ACE-11 и ACE-11-VL2. Стрелками указаны полосы собранного АСЕ-11. Результаты показывают, что ACE-11 был правильно экспрессирован и собран.

1.9. Конструкция и выражение ACE-12

[00503] Система транзиентной экспрессии HEK-293 (Invitrogen, США) также использовалась для подтверждения правильной экспрессии и сборки ACE-12 (связывающей молекулы, состоящей из анти-PD-L1 и UCHT1 доменов) с использованием аналогичного метода, описанного в разделах выше. ACE-12 содержит две разные цепи, подобные тяжелые цепям (ACE-12-VH и ACE-12-VL), и две идентичные легкие цепи (ACE-12-LC). ACE-12 содержит линкер G4S, имеющий аминокислотные последовательности GGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 113) и GGSGGGGSG (SEQ ID NO: 114), тогда как ACE-05 содержит линкер G4S, имеющий аминокислотную последовательность GGGGS в гибкой пептидной области. Аминокислотные последовательности этих трех типов полипептидов следующие:

ACE-12-VH аминокислотная последовательность (включающая 10 остатков GGGGSGGGGS):

ACE-12-VL аминокислотная последовательность (включающая 9 остатков GGSGGGGSG):

ACE-12-LC аминокислотная последовательность (анти-PD-L1 легкая цепь антитела):

[00504] Аминокислотные последовательности VH и VL и последовательности CDR таковых для бивалентной области Fab первого антигенсвязывающего домена, нацеленного на PD-L1, и моновалентной области Fv второго антигенсвязывающего домена UCHT1 представлены в Таблице ниже:

Таблица 12: VH, VL и CDR ACE-12

Fab область
(анти-PD-L1) VH: QMQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGRIIPILGIANYAQKFQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAKPRDGYNLVAFDIWGQGTMVTVSS (SEQ ID NO: 4) VL:
QLVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTGSSSNIGAGYDVHWYQQLPGAAPKLLIYGDINRPSGVPDRFSGSKSGISASLAITGLQAEDEADYYCQSYDSSLSGGVFGGGTKLTVLR (SEQ ID NO: 8) CDR H1: GGTFSSYA (SEQ ID NO: 5) CDR L1: SSNIGAGYD (SEQ ID NO: 9) CDR H2: IIPILGIA (SEQ ID NO: 6) CDR L2: GDI (SEQ ID NO: 10) CDR H3: AKPRDGYNLVAFDI (SEQ ID NO: 7) CDR L3: QSYDSSLSGGV (SEQ ID NO: 11) Fv область
(анти-CD3) VH:
EVQLQQSGPELVKPGPSMKISCKASGYSFTGYTMNWVKQSHGKNLEWMGLINPYKGVSTYNQKFKDKATLTVDKSSSTAYMELLSLTSEDSAVYYCARSGYYGDSDWYFDVWGQGTTLTVFS (SEQ ID NO: 12) VL:
DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDIRNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSRLHSGVPSKFSGSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFAGGTKLEIKR (SEQ ID NO: 16) CDR H1: GYSFTGYTMN (SEQ ID NO: 13) CDR L1: RASQDIRNYLN (SEQ ID NO: 17) CDR H2: LINPYKGVST (SEQ ID NO: 14) CDR L2: YTSRLHS (SEQ ID NO: 18) CDR H3: SGYYGDSDWYFDV (SEQ ID NO: 15) CDR L3: QQGNTLPWT (SEQ ID NO: 19)

[00505] Последовательности ДНК, кодирующие ACE-12-VH, ACE-12-VL и ACE-12-LC, следующие:

АСЕ-12-VH нуклеотидная последовательность (включающая 10 остатков GGGGSGGGGS): CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGAGGTGGGAGTGGAGGCGGAGGATCTGAGGTGCAGCTCCAGCAGTCTGGACCTGAGCTGGTGAAGCCTGGACCTTCAATGAAGATATCCTGCAAGGCTTCTGGTTACTCATTCACTGGCTACACCATGAACTGGGTGAAGCAGAGTCATGGAAAGAACCTTGAGTGGATGGGACTTATTAATCCTTACAAAGGTGTTAGTACCTACAACCAGAAGTTCAAGGACAAGGCCACACTGACTGTAGACAAGTCATCCAGCACAGCCTACATGGAACTCCTCAGTCTGACATCTGAGGACTCTGCAGTCTATTACTGTGCAAGATCGGGGTACTACGGTGATAGTGACTGGTACTTCGATGTCTGGGGCCAGGGGACCACGCTGACCGTCTTCTCATAA (SEQ ID NO: 110)

ACE-12-VL нуклеотидная последовательность (включающая 9 остатков GGSGGGGSG): CAGATGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGGTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACAAATCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAAACCGAGAGATGGCTACAATTTGGTTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACGATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCCTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGGGCGGATCCGGCGGAGGCGGCAGCGGAGACATCCAGATGACCCAGACCACCTCCTCCCTGTCTGCCTCCCTGGGCGACAGAGTCACCATCAGTTGCAGGGCAAGTCAGGACATTAGAAATTATTTAAACTGGTATCAACAGAAACCAGATGGAACTGTTAAACTCCTGATCTACTACACATCAAGATTACACTCAGGAGTCCCATCAAAGTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGAACAGATTATTCTCTCACCATTAGCAACCTGGAGCAAGAGGATATTGCCACTTACTTTTGCCAACAGGGTAATACGCTTCCGTGGACGTTCGCTGGAGGCACCAAGCTGGAAATCAAACGGTAA (SEQ ID NO: 111)

ACE-12-LC нуклеотидная последовательность (нуклеотидная последовательность анти-PD-L1 легкой цепи антитела):

CAGCTCGTGCTGACTCAGCCGCCCTCAGTGTCTGGGGCCCCAGGGCAGAGGGTCACCATCTCCTGCACTGGGAGCAGCTCCAACATCGGGGCAGGTTATGATGTACACTGGTATCAGCAACTTCCAGGAGCAGCCCCCAAACTCCTCATCTATGGCGACATCAATCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTCTGGCTCCAAGTCTGGCATCTCAGCCTCCCTGGCTATCACTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTATTACTGCCAGTCCTATGACAGCAGCCTGAGTGGGGGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCTAAGATCTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAG (SEQ ID NO: 107)

[00506] На ФИГ. 8 показаны результаты SDS-PAGE, выполненного для определения сборки ACE-12, ACE-05 и ACE-09. Результаты показывают, что ACE-12 был правильно экспрессирован и собран. Кроме того, ACE-12, ACE-05 и ACE-09 имеют одинаковые VH и VL в областях Fab и Fv (показаны в Таблицах 8, 9 и 12), и их структуры отличаются длиной линкеров G4S между шарнирным участком антитела и вторым доменом Fv (ФИГ.8, внизу). Гибкие линкеры G4S способны уменьшать стерические препятствия и оптимизировать связывание второго домена Fv с иммунными клетками (например, с эффекторными клетками, включая Т-клетки), и, таким образом, приводить к повышению эффективности перенаправления иммунных клеток на клетки-мишени (например, раковые клетки). Неожиданно, ACE-12, ACE-05 и ACE-09 показали одинаковый уровень экспрессии. Линкеры разной длины могут предлагать разный уровень гибкости, способствующий активности молекул ALiCE, не влияя на их экспрессию и сборку.

[00507] В целом, вышеупомянутые эксперименты иллюстрируют успешное конструирование и экспрессию типичных связывающих молекул, представленных в данном документе, и показывают, что эти молекулы ALiCE могут быть правильно экспрессированы и собраны.

Пример 2: Анализ аффинности связывания типичных связывающих молекул с использованием иммуноферментного анализа (ELISA)

[00508] Сродство ACE-00 и ACE-00-VL2 к TNF-альфа измеряли с помощью иммуноферментного анализа (ELISA). Bmax обозначает максимальную аффинность связывания, экстраполированную на основе экспериментальных результатов (рассчитанную с использованием методов аппроксимации кривой, предоставленных программой GraphPad Prism 7). Как показано на ФИГ. 9, K_D исходного антитела адалимумаба к TNF-альфа составляет 1,125 нМ; K_D ACE-00, который имеет только моновалентный связывающий с TNF-альфа домен, была определена как 30,03 нМ; а ACE-00-VL2, состоящий из гомодимера ACE-00-VL, как было установлено, не имеет сродства к TNF-альфа.

[00509] Аффинность ACE-05 и контрольных антител к каждому антигену (например, PD-L1 и CD3 для ACE-05) измеряли с помощью ELISA. Более конкретно, антигены, такие как PD-L1 человека (YBL-007 производства Y-Biologics, Inc.) и CD3 (Sino Biological), были иммобилизованы на иммунном планшете (Thermo Scientific, США) в концентрации от 1 до 10 мкг/мл (от 100 до 1000 нг/на лунку) с использованием PBS pH 7,4 в качестве буфера при 4℃ в течение ночи. На следующий день планшет промывали один раз 200 мкл PBST, а затем проводили блокировку поверхности при комнатной температуре с использованием 5% обезжиренного молока в течение 1-2 часов. Затем после промывки каждой лунки дважды 200 мкл PBST, ACE-05 и контрольные антитела разбавляли в соотношении от 1/2 до 1/5 и позволяли реагировать при комнатной температуре в течение 1-2 часов. Затем каждую лунку трижды промывали 200 мкл PBST для удаления несвязавшихся антител. Конъюгированные с пероксидазой хрена (HRP) антитела против человеческого IgG (Fab-специфические) (Sigma, США) добавляли в лунки в соотношении 1: 1000 для реакции при комнатной температуре. После трехкратной отмывки 200 мкл PBST окрашенная реакция HRP вызывалась с использованием раствора TMB (GEhealthcare, США), добавленном в объеме 100 мкл/на лунку. Реакцию останавливали, используя стоп-раствор (2,5 М H2SO4, 100 мкл/на лунку). Спектрофотометр использовали для измерения оптической плотности при длине волны A450 для расчета аффинности связывания. Программное обеспечение GraphPad Prism 7 использовали для анализа аффинности ACE-05 и других контрольных антител к соответствующим мишеням таковых. Результаты показаны на ФИГ. 10A, 10B и 10C.

[00510] Сродство ACE-09, ACE-05 и контрольного антитела к CD3 измеряли с использованием аналогичных методов, описанных выше. Как показано на ФИГ. 11, ACE-09 показал такой же уровень аффинности связывания, как ACE-05.

Пример 3: Анализ кинетики связывания ACE-05 с использованием поверхностного плазмонного резонанса (SPR)

[00511] Кинетику связывания ACE-05 с PD-L1 и CD3 человека измеряли с использованием анализа поверхностного плазмонного резонанса (SPR). Измерение безметочной кинетики (белок-белковое взаимодействие) с использованием системы OCTET® QKe (ForteBio, USA) проводили с использованием биосенсора захвата человеческого IgG (AHC) (ForteBio, USA) для человеческого PD-L1 и амино-реактивного ( ARG2) биосенсора для цепей CD3εδ. PD-L1 и CD3εδ были зафиксированы на соответствующих поверхностях биосенсоров и последовательно реагировали с ACE-05, разбавленным кинетическими буферами различных концентраций. Сенсограммы собирались на протяжении определенного времени. Родительские антитела, которые были использованы для получения ACE-05 (т.е. анти- hPD-L1 антитело (YBL-007, полученное в нашей лаборатории с использованием обычных методов, известных в данной области техники) и анти-CD3 антитело (UCHT1 от BioLegend, США)), также были протестировали и сравнены с ACE-05 в этом эксперименте. Как показано на ФИГ. 12A-12C, кинетика связывания ACE-05 с PD-L1 человека была сопоставима с исходным анти-PD-L1 антителом (т.е. YBL-007 от Y-Biologics, Inc.), а K_D составила менее 1,09 × 10 ^-11 (см. ФИГ. 12A-12C). Напротив, как и ожидалось, аффинность связывания ACE-05 с CD3 была намного ниже, чем у исходного анти-CD3 антитела (UCHT1 от BioLegend, США), и K_D была определена как 6,82 × 10^-9 (см. ФИГ. 5C). Как показано на ФИГ. 12A-12C, кинетику связывания ACE-05 также сравнивали с биспецифическим вовлечением Т-клеток (BiTE), то есть BiTE-05. BiTE - это существующая технология биспецифических антител, генерирующая слитые белки, состоящие из двух одноцепочечных вариабельных фрагментов (scFv) различных антител, или аминокислотных последовательностей от четырех разных генов на одной пептидной цепи размером около 55 килодальтон. Более подробное описание технологии BiTE можно найти, например, в Huehls et al., Immunol Cell Biol., 2015, 93 (3): 290-296; Baeuerle et al., Drug Discovery Today, 2005, 10: 1237-1244; и Kufer et al., Trends in Biotechnology, 2004, 22 (5): 238-244. Было продемонстрировано, что ACE-05 имеет более высокую аффинность к PD-L1 человека, чем BiTE-05. С другой стороны, было продемонстрировано, что ACE-05 имеет более низкую аффинность к CD3, чем BiTE-05, и поэтому ожидается, что он будет иметь меньшую цитотоксичность, чем BiTE-05.

[00512] ФИГ. 12D показывает результаты одновременного связывания ACE-05 с hPD-L1 и hCD3 при использовании системы безметочной кинетики OCTET® (ForteBio, USA). В качестве лигандов получали меченные гистидином рекомбинантные белки-лиганды (например, hPD-L1-his, hCD3εδ -his) и Fc-меченные рекомбинантные белки-лиганды (например, hPD-L1-Fc, hCD3εδ -Fc). Для захвата (иммобилизации) первого антигена на чипе биосенсора использовался захватывающий гистидин NTA-чип (ForteBio, USA). После полного захвата первого лиганда на чипе NTA анализировали ACE-05, разбавленный кинетическим буфером. Далее, второй лиганд, также разведенный в кинетическом буфере, анализировали для оценки одновременного связывания ACE-05 со вторым лигандом.

Пример 4: Перенаправление (активности) Т-клеток и проверка цитотоксичности Т-клеток

[00513] ACE-05 был протестирован на его активность в отношении перенаправления и активации Т-клеток. В анализе перенаправления (активности) Т-клеток была создана клеточная линия HEK293E-PD-L1, стабильно экспрессирующая PD-L1, которую использовали в качестве донора антигена. CD3-положительная линия клеток Jurkat, сконструированная таким образом, чтобы содержать репортерную систему люциферазы NFAT, была использована в качестве эффекторной линии клеток (репортерная (люциферазная) линия клеток Jurkat, полученная собственными силами с использованием обычных способов, известных в данной области техники).

[00514] Далее использовали FACS-анализ для определения уровней экспрессии PD-L1 и CD3 в вышеупомянутых клеточных линиях. Уровни экспрессии PD-L1 в клетках HEK293E-PD-L1 и родительских клетках HEK293E показаны на ФИГ. 13А (правая панель). Уровень экспрессии CD3 в репортерных (люцифераза) клетках Jurkat, измеренный с помощью различных анти-CD3 антител, также показан на ФИГ. 13А (левая панель).

[00515] Анализ перенаправления (активности) Т-клеток выполняли следующим образом: клетки HEK293E и клетки HEK293E-PD-L1 (7 × 10⁴ клеток/лунку) высевали на планшеты с белым дном, покрытые поли-L-лизином (Sigma), и инкубировали. в течение 24 часов. На следующий день репортерные клетки (люцифераза) Jurkat (1,4 × 10⁵ клеток/лунка) обрабатывали серийными разведениями ACE-05, UCHT1 (родительское анти-CD3-антитело от BioLegend, USA) и контрольных молекул, а затем инкубировали при 37℃ в течение 7 часов. Анализ люциферазы Bio-Glo (Promega, USA) проводили для определения степени активации Jurkat. В случае ACE-05, чтобы определить синергетический эффект как блокирования взаимодействия PD-1/PD-L1, так и перенаправления нацеленных на PD-L1 Т-клеток, был проведен анализ блокады PD-1/PD-L1 с использованием PD-1/PD- набор для анализа Blockade Bioassay kit (Promega, USA). Данные обрабатывали и анализировали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 7.

[00516] Как показано на ФИГ. 13B, при использовании клеток-мишеней, экспрессирующих PD-L1 (клетки HEK293E-PD-L1), ACE-05 способен активировать эффекторные Т-клетки (репортерные клетки люциферазы Jurkat); тогда как при использовании клеток-мишеней, не экспрессирующих PD-L1 (HEK293E), эффекторные Т-клетки не могли быть эффективно активированы ACE-05. Эти результаты показывают, что ACE-05 демонстрирует зависимую от клеток-мишеней активацию Т-клеток. В этом исследовании ACE-05 также сравнивали с BiTE-05. Как показано на ФИГ. 13B, ACE-05 продемонстрировал более эффективную активацию Т-клеток, чем BiTE-05, в присутствии PD-L1. Однако в отсутствие PD-L1 активация Т-клеток в присутствии BiTE-05 была выше, чем в присутствии ACE-05. Следовательно, BiTE-05 демонстрирует более высокую клеточно-независимую активацию Т-клеток, чем ACE-05.

[00517] На ФИГ. 13C - те же данные, что и на ФИГ. 13B представленные отдельно для ACE-05 (левая панель) и BiTE-05 (правая панель), каждый с PD-L1 или без него, показывая, что динамический диапазон активации Т-клеток, опосредованной ACE-05, намного выше, чем активация Т-клеток, опосредованная BiTE-05 (обозначена вертикальными пунктирными стрелками), в соответствии с наблюдениями, изображенными на ФИГ. 13B. ФИГ. 13D-13E демонстрируют опосредованную только мишенью (мишень HEK, экспрессирующая PD-L1) активацию ACE-05 и BiTE-05 Т-клетками, на основе тех же данных, что и на ФИГ. 13C.

[00518] Т-клеточный ответ против рака варьирует в иммунном цикле рака. HCC827 PD-L1-положительная немелкоклеточная карцинома легкого (NSCLC) и репортерные клетки люциферазы Jurkat с экспрессией PD-1 или без нее были использованы для измерения Т-клеточного противоопухолевого ответа. Стадия праймирования и активации Т-клетки была представлена как Jurkat-PD-1[-], а стадия покоя и толерантности Т-клетки была представлена как Jurkat-PD-1[+] на ФИГ. 13F. Как показано, результаты демонстрируют, что ожидается, что противоопухолевая эффективность ACE-05 будет намного выше, чем BiTE-05 на обеих стадиях развития Т-клеток.

[00519] Для определения синергетического эффекта как от блокирования взаимодействия PD-1/PD-L1, так и от направленного перенаправления Т-клеток PD-L1, был использован набор для анализа биологической блокады PD-1/PD-L1 (Promega, США) для измерения биологической способности ACE-05. Анализ блокады PD-1/PD-L1 проводили в соответствии с протоколом, предоставленным производителем. Результат анализа блокирования PD-1/PD-L1 показан на ФИГ. 13G, который демонстрирует, что ACE-05 может блокировать взаимодействие PD-1/PD-L1, а также перенаправление Т-клеток. ФИГ. 13H дополнительно указывает, что при сравнении с BiTE-05, ACE-05 показывает самый высокий сигнал активации Т-клеток вследствие синергетического эффекта от одновременной блокады PD-L1 и перенаправления Т-клеток. YBL-007 представляет собой анти-PD-L1 антитело, а UCHT1 представляет собой анти-CD3 антитело.

[00520] Кроме того, как показано на ФИГ. 13I, ACE-05 демонстрирует меньшую мишень-независимую активацию Т-клеток, чем анти-CD3 антитело. Этот результат согласуется с наблюдаемым более низким сродством ACE-05 к CD3 по сравнению с исходным анти-CD3-антителом. Таким образом, эти результаты показывают, что ACE-05 будет проявлять меньшую цитотоксичность, чем анти-CD3-антитело, поскольку один моновалентный анти-CD3-домен неэффективен для активации Т-клеток. На ФИГ. 13J показаны данные того же анализа, сравнивающие ACE-05 и BiTE-05, что указывает на то, что BiTE-05 показывает самый высокий сигнал активации Т-клеток в отсутствие мишени PD-L1, поскольку сродство BiTE-05 к CD3 намного выше, чем сродство ACE-05, что свидетельствует о более высоком уровне цитотоксичности.

[00521] Опосредованная ACE-05 цитотоксичность Т-клеток определялась с использованием анализа LDH (лактатдегидрогеназы). PBMC от здоровых доноров использовали в качестве эффекторных клеток, а клетки немелкоклеточного рака легкого (ATCC) HCC827, имеющие сверхэкспрессию PD-L1, использовали в качестве клеток-мишеней. Высвобождение LDH из мертвых опухолевых клеток измеряли с помощью системы анализа LDH, и различные соотношения Т (target): Е (effector) (мишень: эффектор) тестировали в присутствии АСЕ-05 (ФИГ. 13K). Кроме того, ACE-05 продемонстрировал дозозависимую способность уничтожать опухоли в отношении клеток HCC827 (положительных по PD-L1), которые инкубировали совместно с PBMC, выделенными от здорового донора (ФИГ. 13L). ФИГ. 13M показывает цитотоксичность Т-клеток в отношении опухолевых клеток при прямом контакте с PBMC в присутствии ACE-05 или YBL-007. В течение 24 часов раковые клетки-мишени HCC827 были уничтожены в присутствии ACE-05, тогда как клетки-мишени HCC827 росли без обработки или в присутствии YBL-007.

[00522] Уровни иммунных цитокинов, высвобождаемых активированными лейкоцитами, могут отражать неблагоприятные события, связанные с активацией нецелевых Т-клеток. Таким образом, уровни IL-2 и INF-γ в присутствии ACE-05 или BiTE-05 контролировали в совместно культивированных PBMC от здоровых доноров и клетках HCC827 при помощи набора для анализа IL-2 или IFN-γ (BioLegend, США). Нижняя граница уровеня IL-2 наблюдалась в присутствии ACE-05, по сравнению с BiTE-5, что позволяет предположить, что вовлечение ACE-05 в активацию CD3+ T-клеток, которые являются основными источниками секреции IL-2, менее вероятно. Таким образом, ACE-05 может вызывать меньшую нецелевую активацию Т-клеток, чем BiTE-05. Кроме того, присутствие ACE-05 и BiTE-05 приводило к аналогичным уровням INF-γ, высвобождаемому NKT или NK-клетками (ФИГ. 13N).

[00523] Термодинамическую стабильность ACE-05 оценивали с использованием термоциклера C1000 с системой CFX 96TM ORM (BioRad, США). 3 мкМ связывающих молекул смешивали с 10 мкл разбавленного 1/25 оранжевого белкового красителя CYPRO (CYPRO orange protein stain (Invitrogen, USA), и 50 мкл смесей инкубировали в течение 30 мин при 25°C. Образцы денатурировали нагреванием со скоростью 1℃ /мин от комнатной температуры до 99℃ . Количество денатурированных белков, окрашенных CYPRO, регистрировали и рассчитывали температуру плавления (TM) с помощью программного обеспечения CFX. Как показано на ФИГ. 13O, ACE-05 имел более высокую термодинамическую стабильность, чем BiTE-05.

[00524] Анализ перенаправления Т-клеток выполняли для определения активации Т-клеток, опосредованной ACE-10, посредством нацеливания на CD20. CD20-положительные клетки Raji использовали в качестве донорных клеток-мишеней антигена, а клетки Karpas-299 использовали в качестве отрицательного контроля CD20. ACE-10 показывает более эффективную активацию Т-клеток, чем BiTE-10. Сравнение результатов для CD20-положительных клеток Raji и результатов для CD20-отрицательных клеток Karpas-299 предполагает, что активация Т-клеток зависит от экспрессии CD20 в клетках-мишенях (см. ФИГ. 14A-14B).

[00525] Опосредованная ACE-11 цитотоксичность Т-клеток также определялась с помощью анализа LDH. PBMC от здоровых доноров использовали в качестве эффекторных клеток, а EGFR-положительные клетки рака толстой кишки SW48, HT29 и HCT116 использовали в качестве клеток-мишеней. Высвобождение LDH из мертвых опухолевых клеток измеряли с помощью системы анализа LDH. Раковые клетки HT29 и HCT116 имеют мутации Ras и Raf, которые могут приводить к непрерывной активации сигнала роста. ACE-11 показал цитотоксичность для всех трех линий раковых клеток. Результаты показаны на ФИГ. 15.

Пример 5: Фармакокинетическое исследование на крысах Sprague-Dawley (SD).

[00526] Фармакокинетическое исследование ACE-05 и контрольных антител проводили на крысах SD. Исследование было одобрено институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (номер разрешения: QBSIACUC-A17099).

[00527] Крысы SD получали однократную внутривенную дозу 10 мг/кг ACE-05 или контрольных антител (YBL 007 или авелумаб) через хвостовую вену (n=3 крысы-самцы/группа). 500 мкл сыворотки было забрано у каждого животного в данных временных точках: 10 минут, 30 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа, 8 часов, 24 часа, 3 дня, 5 дней и 9 дней после введения ACE-05 или контрольных антител. Образцы центрифугировали при 10 000 ~ 13 000 об/мин в течение 2 минут, и 70 мкл плазмы от каждого образца отделяли и хранили при -80℃ до дальнейшего анализа. Концентрация каждого образца определялась с помощью ELISA. 96-луночный иммуннологический планшет (Thermo Scientific, США) был покрыт PD-L1 (произведенным Y-Biologics, Inc.). В лунки добавляли образцы плазмы крыс, разведенные в соотношении 1:1000, 1:4000 или 1:8000. Связанные образцы выявляли с помощью конъюгированного с HRP антитела к человеческому IgG (Fab-специфический) (Sigma, США). Лунки были обработаны субстратом TMB (Sigma, США) согласно протоколу производителя в соотношении 1:500. Затем измеряли A450. Концентрацию ACE-05 и контрольных антител определяли путем сравнения со стандартными кривыми с использованием образцов белков известных концентраций. Данные наблюдений анализировали с помощью программы BA Calc 2007. Результаты фармакокинетического исследования показаны на ФИГ. 16А. Как показано, измеренный период полураспада ACE-05 составил 10,113 часов. Однако наиболее вероятно, что фактический период полураспада ACE-05 намного больше, чем 10 часов, поскольку в этом эксперименте период полураспада родительских антител был определен как 98 и 73 часа, что было намного короче, чем обычный период полураспада таких антител (7 или 10 дней). Как показано на ФИГ. 16B, ACE-05 показал более длительный период полураспада, чем BiTE-05, что позволяет предположить, что ACE-05 имеет более высокую стабильность в плазме, чем BiTE.

Пример 6: Оценка эффективности ACE-05 при лечении немелкоклеточного рака легкого человека

[00528] Эффективность ACE-05 при лечении немелкоклеточного рака легкого человека оценивалась и сравнивалась с другими антителами с использованием линии клеток HCC827 мышей NCG (CrownBio, США). Исследование было разработано, как показано в таблице ниже:

Таблица 13: Дизайн исследования

Группа №* HCC827
(День 0) PMBC
(День -3) обработка Доза (мг/кг) Путь введения Схема 1 10 День 0, s.c. HCC827 (5×10⁶/100 мкл/мышь) День -3, i.v. PBMC (5×10⁶/100 мкл/мышь) IgG 5 i.v. Q3d (дни 4, 7, 10) 2 10 YBL-007 5 i.v. Q3d (дни 4, 7, 10) 3 10 Bite-05 0,5 i.v. Q2d (дни 4, 6, 8) 4 10 ACE-05 0,5 i.v. Q2d (дни 4, 6, 8)

Заметки: N-номер животного; *используются 2 донора, n=5/на группу

Объем дозы: рассчитать объем дозы в соответствии с массой тела

Схема обработки может быть изменена всвязи с потерей массы тела или другого побочного эффекта в соответствии с утвержденными правилами или по запросу клиента.

[00529] На ФИГ. 17A-17F показаны результаты исследования ксенотрансплантата HCC827 (PD-L1-положительная опухоль) на модели гуманизированных мышей. Для реконструирования РВМС были выбраны самки мышей NCG в возрасте 6-8 недель. Как показано в Таблице 13, было 4 группы исследования (10 мышей/группа) и 2 донора PBMC (5 мышей/донор). Испытуемых животных обрабатывали ACE-05, BiTE-05, IgG и YBL-007 через 4 дня после инокуляции опухоли (размер TV=50 мм3), и PBMC, выделенные от каждого донора, реконструировали за несколько дней до инокуляции опухоли. АСЕ-05 и BiTE-05 вводили на 4, 6, и 8 день (всего 3 раза). IgG и YBL-007 вводили в дни 4, 7 и 10 (всего 3 раза). На 12-й день этого исследования опухоли у 9 из 10 мышей полностью исчезли после лечения ACE-05. Потеря массы тела (BWL, Body weight loss) (%) в группе, получавшей BiTE, была намного выше, чем в группе, получавшей ACE-05. Три мыши из 10 из группы, получавшей BiTE, были исключены из исследования вследствие более чем 20% BWL во время этого исследования. Результаты показывают, что ACE-05 эффективен при лечении наблюдаемого рака легких, а также указывает на то, что ACE-05 демонстрирует большую безопасность, чем BiTE-05, биспецифическое антитело, созданное с использованием технологии BiTE.

Пример 7: Исследование предельной дозы противораковой эффективности ACE-05 и BiTE-05

[00530] Для определения эффективной дозы ACE-05, было проведено исследование пределов дозы на модели гуманизированного ксенотрансплантата HCC827 (ФИГ. 18A-18D). Самок мышей NCG (CrownBio, США) в возрасте 6-8 недель отбирали для реконструированной гуманизации PBMC и делили на 14 исследовательских групп (6 мышей/группу). Перед разбивкой на группы и обработкой всех животных взвешивали и измеряли объемы опухолей с помощью штангенциркуля. Поскольку объем опухоли может влиять на эффективность любого лечения, объем опухоли использовался в качестве числового параметра для рандомизации выбранных животных в определенные группы. Группирование производили с помощью программного обеспечения StudyDirector ™ (Studylog Systems, США). Для группового распределения был выбран метод «согласованного распределения», который показал минимальные межгрупповые различия в объеме опухоли.

[00531] Человеческие PBMC от 2 доноров имплантировали путем внутривенной инъекции за 3 дня до инокуляции опухолевых клеток. Каждой мыши подкожно инокулировали в область правого фланга опухолевые клетки HCC827 (5 × 10⁶) в 0,1 мл PBS для развития опухоли. Пять различных концентраций ACE-05 и BiTE-05 от 0,5 мг/кг до 0,0005 мг/кг (также обозначено как mpk, milligrams per kilogram) (0,5, 0,1, 0,05, 0,005 и 0,0005 mpk) обрабатывали на 4-й день после инокуляции HCC827. Введение испытуемых препаратов осуществлялось каждые 3 дня, то есть на 4-й, 7-й, 10-й и 13-й день (Q3d, всего 4 дозы), как показано 4 вертикальными стрелками над осью x на ФИГ. 18А.

[00532] Размер опухоли (ФИГ. 18A-18C) и вес тела (ФИГ. 18D) оценивали каждые 2 или 3 дня после первоначального введения экспериментальных молекул. Стандартная ошибка среднего (SEM) объема опухоли и изменений массы тела для каждой группы была нанесена на график зависимости от времени на ФИГ. 18А соответственно. ФИГ. 18B-18C демонстрируют противоопухолевую эффективность отдельных мышей в каждой дозовой группе, обработанной ACE-05 и BiTE-05, соответственно. Четыре мыши были удалены на 15 день в группе, обработанной BiTE-05, но только 1 мышь была удалена в группе, обработанной ACE-05. У большинства животных, получавших 0,5 мг/кг, 0,1 мг/кг и 0,05 мг/кг ACE-05, опухоли полностью исчезли (ФИГ. 18B), в отличие от группы, получавшей BiTE-05 (ФИГ. 18C).

[00533] Таблица 14 суммирует противоопухолевую активность ACE-05 и BiTe-05. Средний объем опухоли (TV) на 15-й день показан со стандартной ошибкой среднего. Процент ингибирования роста опухоли (TGI%) представляет собой разницу между средним объемом опухоли в тестовой группе и контрольной группе, рассчитанную по следующей формуле: TGI (%) = (Среднее TV контроля - Среднее TV обработанных)/Среднее TV контрольных × 100. T/C (в %) рассчитывали по следующей формуле: T/C(%) = среднее TV обработанных/среднее TV контрольных ×100. Результаты показывают, что ACE-05 более эффективен, чем BiTE-05 при лечении наблюдаемого рака легких в данном диапазоне концентраций.

Таблица 14: Противоопухолевая активность ACE-05 и BiTE-05

Группа Объект тестирования Доза/Схема TV (мм³) в День 15, среднее TGI (%) T/C (%) Смертность на День 15 1a IgG 5mpk/Q3d 79.99 ± 10.56 - - - 1b 69.21 ± 5.15 - - - 5a BiTE-05 0.5mpk/Q3d 0.00 ± 0 100.00% 0.00% Смерть(I), TS(2) 5b 0.00 ± 0 100.00% 0.00% Смерть(I) 6a 0.1mpk/Q3d 9.70 ± 4.88 87.87% 12.13% - 6b 5.71 ± 5.71 91.75% 8.25% - 7a 0.05mpk/Q3d 22.22 ± 3.66 72.23% 27.77% - 7b 4.51 ± 4.51 93.48% 6.52% - 8a 0.005mpk/Q3d 28.52 ± 4.81 64.34% 35.66% - 8b 12.08 ± 8.55 82.55% 17.45% - 9a 0.0005mpk/Q3d 64.69 ± 15.97 19.12% 80.88% - 9b 39.42 ± 2.62 43.04% 56.96% - 10a ACE-05 0.5mpk/Q3d 7.00 ± 7.00 91.24% 8.76% - 10b 0.00 ± 0 100.00% 0.00% Смерть(1) 11a 0.1mpk/Q3d 0.00 ± 0 100.00% 0.00% - 11b 0.00 ± 0 100.00% 0.00% - 12a 0.05mpk/Q3d 17.56 ± 8.85 78.04% 21.96% - 12b 0.00 ± 0 100.00% 0.00% - 13a 0.005mpk/Q3d 62.60 ± 1.55 21.74% 78.26% - 13b 42.17 ± 6.57 39.07% 60.93% - 14a 0.0005mpk/Q3d 40.96 ± 0.92 20.86% 79.14% - 14b 30.27 ± 2.41 56.27% 43.73% -

(Mpk обозначает миллиграм/килограм, принятое в фармацевтике)

[00534] Из вышеизложенного следует понимать, что, хотя конкретные варианты осуществления были описаны здесь с целью иллюстрации, различные модификации могут быть выполнены без отклонения от сущности и объема изобретения, предоставленного в настоящем документе. Все публикации, упомянутые выше, полностью включены в настоящий документ посредством ссылки.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Y-БИОЛОДЖИКС, ИНК.

<120> СВЯЗЫВАЮЩИЕ МОЛЕКУЛЫ, ВЫЗЫВАЮЩИЕ КЛЕТОЧНУЮ АКТИВАЦИЮ

<130> 14489-004-228

<140>

<141>

<150> США 16/372,196

<151> 2019-04-01

<150> США 16/372,190

<151> 2019-04-01

<150> США 16/372,172

<151> 2019-04-01

<150> США 62/719,484

<151> 2018-08-17

<150> США 62/655,762

<151> 2018-04-10

<160> 129

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 369

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-05-VH аминокислотная последовательность

<400> 1

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro

245 250 255

Glu Leu Val Lys Pro Gly Pro Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser

260 265 270

Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His

275 280 285

Gly Lys Asn Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val

290 295 300

Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp

305 310 315 320

Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu

325 330 335

Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser

340 345 350

Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Phe

355 360 365

Ser

<210> 2

<211> 355

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-05-VL аминокислотная последовательность

<400> 2

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser

245 250 255

Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala

260 265 270

Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp

275 280 285

Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly

290 295 300

Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu

305 310 315 320

Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln

325 330 335

Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu

340 345 350

Ile Lys Arg

355

<210> 3

<211> 218

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-05-LC аминокислотная последовательность

<400> 3

Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asp Ile Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser

85 90 95

Leu Ser Gly Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 4

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (PD-L1), расположенная в VH молекул ACE-04, ACE-05,

ACE-09 и ACE-12

<400> 4

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 5

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (PD-L1), расположенная в CDR H1 молекул ACE-04, ACE-05,

ACE-09 и ACE-12

<400> 5

Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala

1 5

<210> 6

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (PD-L1), расположенная в CDR H2 молекул ACE-04, ACE-05,

ACE-09 и ACE-12

<400> 6

Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala

1 5

<210> 7

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (PD-L1) CDR H3 молекул ACE-04, ACE-05, ACE-09 и ACE-12

<400> 7

Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile

1 5 10

<210> 8

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (PD-L1), расположенная в VL молекул ACE-04, ACE-05,

ACE-09 и ACE-12

<400> 8

Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asp Ile Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser

85 90 95

Leu Ser Gly Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg

100 105 110

<210> 9

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (PD-L1), расположенная в CDR L1 молекул ACE-04,

ACE-05, ACE-09 и ACE-12

<400> 9

Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp

1 5

<210> 10

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (PD-L1), расположенная в CDR L2 молекул ACE-04,

ACE-05, ACE-09 и ACE-12

<400> 10

Gly Asp Ile

1

<210> 11

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (PD-L1), расположенная в CDR L3 молекул ACE-04,

ACE-05, ACE-09 и ACE-12

<400> 11

Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Gly Val

1 5 10

<210> 12

<211> 122

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в VH молекул ACE-05, ACE-09,

ACE-10, ACE-11 и ACE-12

<400> 12

Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Pro

1 5 10 15

Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Phe Ser

115 120

<210> 13

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в CDR H1 молекул ACE-05, ACE-09,

ACE-10, ACE-11 и ACE-12

<400> 13

Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn

1 5 10

<210> 14

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в CDR H2 молекул ACE-05, ACE-09,

ACE-10, ACE-11 и ACE-12

<400> 14

Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr

1 5 10

<210> 15

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в CDR H3 молекул ACE-05, ACE-09,

ACE-10, ACE-11 и ACE-12

<400> 15

Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 16

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в VL молекул ACE-05, ACE-09,

ACE-10, ACE-11 и ACE-12

<400> 16

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 17

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в CDR L1 молекул ACE-05, ACE-09,

ACE-10, ACE-11 и ACE-12

<400> 17

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 18

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в CDR L2 молекул ACE-05, ACE-09,

ACE-10, ACE-11 и ACE-12

<400> 18

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

<210> 19

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в CDR L3 молекул ACE-05, ACE-09,

ACE-10, ACE-11 и ACE-12

<400> 19

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr

1 5

<210> 20

<211> 1110

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-05-VH нуклеотидная последовательность

<400> 20

cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaccgaga 300

gatggctaca atttggttgc ttttgatatc tggggccaag ggacgatggt caccgtctcc 360

tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccgggcg gaggtgggag tgaggtgcag ctccagcagt ctggacctga gctggtgaag 780

cctggacctt caatgaagat atcctgcaag gcttctggtt actcattcac tggctacacc 840

atgaactggg tgaagcagag tcatggaaag aaccttgagt ggatgggact tattaatcct 900

tacaaaggtg ttagtaccta caaccagaag ttcaaggaca aggccacact gactgtagac 960

aagtcatcca gcacagccta catggaactc ctcagtctga catctgagga ctctgcagtc 1020

tattactgtg caagatcggg gtactacggt gatagtgact ggtacttcga tgtctggggc 1080

caggggacca cgctgaccgt cttctcataa 1110

<210> 21

<211> 1068

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-05-VL нуклеотидная последовательность

<400> 21

cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaccgaga 300

gatggctaca atttggttgc ttttgatatc tggggccaag ggacgatggt caccgtctcc 360

tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccgggcg gaggtgggag tgacatccag atgacccaga ccacctcctc cctgtctgcc 780

tccctgggcg acagagtcac catcagttgc agggcaagtc aggacattag aaattattta 840

aactggtatc aacagaaacc agatggaact gttaaactcc tgatctacta cacatcaaga 900

ttacactcag gagtcccatc aaagttcagt ggcagtgggt ctggaacaga ttattctctc 960

accattagca acctggagca agaggatatt gccacttact tttgccaaca gggtaatacg 1020

cttccgtgga cgttcgctgg aggcaccaag ctggaaatca aacggtaa 1068

<210> 22

<211> 657

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-05-LC нуклеотидная последовательность

<400> 22

cagctcgtgc tgactcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60

tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtatcagcaa 120

cttccaggag cagcccccaa actcctcatc tatggcgaca tcaatcggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctggctc caagtctggc atctcagcct ccctggctat cactgggctc 240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtgggggg 300

gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaagaaccg tggctgcacc atctgtcttc 360

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540

agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttaa 657

<210> 23

<211> 369

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-10-VH аминокислотная последовательность

<400> 23

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro

245 250 255

Glu Leu Val Lys Pro Gly Pro Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser

260 265 270

Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His

275 280 285

Gly Lys Asn Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val

290 295 300

Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp

305 310 315 320

Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu

325 330 335

Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser

340 345 350

Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Phe

355 360 365

Ser

<210> 24

<211> 355

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-10-VL аминокислотная последовательность

<400> 24

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser

245 250 255

Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala

260 265 270

Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp

275 280 285

Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly

290 295 300

Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu

305 310 315 320

Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln

325 330 335

Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu

340 345 350

Ile Lys Arg

355

<210> 25

<211> 213

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-10-LC аминокислотная последовательность

<400> 25

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 26

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (CD20), расположенная в VH молекул ACE-10

<400> 26

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Asn Met His Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val Trp Gly

100 105 110

Ala Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala

115 120

<210> 27

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (CD20), расположенная в CDR H1 молекул ACE-10

<400> 27

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Asn

1 5

<210> 28

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (CD20), расположенная в CDR H2 молекул ACE-10

<400> 28

Ile Tyr Pro Gly Asn Gly Asp Thr

1 5

<210> 29

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (CD20), расположенная в CDR H3 молекул ACE-10

<400> 29

Ala Arg Ser Thr Tyr Tyr Gly Gly Asp Trp Tyr Phe Asn Val

1 5 10

<210> 30

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (CD20), расположенная в VL молекул ACE-10

<400> 30

Gln Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Val Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 31

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (CD20), расположенная в CDR L1 молекул ACE-10

<400> 31

Ser Ser Val Ser Tyr

1 5

<210> 32

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (CD20), расположенная в CDR L2 молекул ACE-10

<400> 32

Ala Thr Ser

1

<210> 33

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (CD20), расположенная в CDR L3 молекул ACE-10

<400> 33

Gln Gln Trp Thr Ser Asn Pro Pro Thr

1 5

<210> 34

<211> 1110

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-10-VH нуклеотидная последовательность

<400> 34

caggtgcagc tgcagcagcc tggagccgag ctggtgaagc ccggcgccag cgtgaagatg 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctacaaca tgcactgggt gaagcagacc 120

cctggaagag gactggagtg gatcggcgcc atctaccccg gcaacggcga caccagctac 180

aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgccgaca agagcagcag caccgcctac 240

atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc ccgcagcacc 300

tactacggcg gcgactggta cttcaacgtg tggggagctg gaaccaccgt gaccgtgagc 360

gccgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccgggcg gaggtgggag tgaggtgcag ctccagcagt ctggacctga gctggtgaag 780

cctggacctt caatgaagat atcctgcaag gcttctggtt actcattcac tggctacacc 840

atgaactggg tgaagcagag tcatggaaag aaccttgagt ggatgggact tattaatcct 900

tacaaaggtg ttagtaccta caaccagaag ttcaaggaca aggccacact gactgtagac 960

aagtcatcca gcacagccta catggaactc ctcagtctga catctgagga ctctgcagtc 1020

tattactgtg caagatcggg gtactacggt gatagtgact ggtacttcga tgtctggggc 1080

caggggacca cgctgaccgt cttctcataa 1110

<210> 35

<211> 1068

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-10-VL нуклеотидная последовательность

<400> 35

caggtgcagc tgcagcagcc tggagccgag ctggtgaagc ccggcgccag cgtgaagatg 60

agctgcaagg ccagcggcta caccttcacc agctacaaca tgcactgggt gaagcagacc 120

cctggaagag gactggagtg gatcggcgcc atctaccccg gcaacggcga caccagctac 180

aaccagaagt tcaagggcaa ggccaccctg accgccgaca agagcagcag caccgcctac 240

atgcagctga gcagcctgac cagcgaggac agcgccgtgt actactgcgc ccgcagcacc 300

tactacggcg gcgactggta cttcaacgtg tggggagctg gaaccaccgt gaccgtgagc 360

gccgctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaggttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccgggcg gaggtgggag tgacatccag atgacccaga ccacctcctc cctgtctgcc 780

tccctgggcg acagagtcac catcagttgc agggcaagtc aggacattag aaattattta 840

aactggtatc aacagaaacc agatggaact gttaaactcc tgatctacta cacatcaaga 900

ttacactcag gagtcccatc aaagttcagt ggcagtgggt ctggaacaga ttattctctc 960

accattagca acctggagca agaggatatt gccacttact tttgccaaca gggtaatacg 1020

cttccgtgga cgttcgctgg aggcaccaag ctggaaatca aacggtaa 1068

<210> 36

<211> 642

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-10-LC нуклеотидная последовательность

<400> 36

cagatcgtgc tgagccagag ccctgctatc ctgagcgcca gccctggcga gaaggtgacc 60

atgacctgcc gcgccagcag cagcgtgagc tacatccact ggttccagca gaagcccggc 120

agcagcccca agccctggat ctacgccacc agcaacctgg ccagcggagt gcctgtgcgc 180

ttcagcggca gcggcagcgg caccagctac agcctgacca tcagcagagt ggaggctgag 240

gacgccgcta cctactactg ccagcagtgg accagcaacc cccccacctt cggcggcggc 300

accaagctgg agatcaagag aaccgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 360

gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 420

agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 480

agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 540

agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 600

agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ag 642

<210> 37

<211> 367

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-11-VH аминокислотная последовательность

<400> 37

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu

245 250 255

Val Lys Pro Gly Pro Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

260 265 270

Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys

275 280 285

Asn Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr

290 295 300

Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser

305 310 315 320

Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser

325 330 335

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp

340 345 350

Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Phe Ser

355 360 365

<210> 38

<211> 353

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-11-VL аминокислотная последовательность

<400> 38

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu

245 250 255

Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln

260 265 270

Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr

275 280 285

Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro

290 295 300

Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile

305 310 315 320

Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly

325 330 335

Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

340 345 350

Arg

<210> 39

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-11-LC аминокислотная последовательность

<400> 39

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 40

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (CD20), расположенная в VH молекул ACE-11

<400> 40

Gln Val Gln Leu Lys Gln Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Thr Pro Phe Thr

50 55 60

Ser Arg Leu Ser Ile Asn Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Phe

65 70 75 80

Lys Met Asn Ser Leu Gln Ser Asn Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 41

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (CD20), расположенная в CDR H1 молекул ACE-11

<400> 41

Gly Phe Ser Leu Thr Asn Tyr Gly

1 5

<210> 42

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (CD20), расположенная в CDR H2 молекул ACE-11

<400> 42

Ile Trp Ser Gly Gly Asn Thr

1 5

<210> 43

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (CD20), расположенная в CDR H3 молекул ACE-11

<400> 43

Ala Arg Ala Leu Thr Tyr Tyr Asp Tyr Glu Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 44

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (CD20), расположенная в VL молекул ACE-11

<400> 44

Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Val Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn

20 25 30

Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile

35 40 45

Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg

100 105

<210> 45

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (CD20), расположенная в CDR L1 молекул ACE-11

<400> 45

Gln Ser Ile Gly Thr Asn

1 5

<210> 46

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (CD20), расположенная в CDR L2 молекул ACE-11

<400> 46

Tyr Ala Ser

1

<210> 47

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (CD20), расположенная в CDR L3 молекул ACE-11

<400> 47

Gln Gln Asn Asn Asn Trp Pro Thr Thr

1 5

<210> 48

<211> 1104

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-11-VH нуклеотидная последовательность

<400> 48

caagtccaac tgaaacaatc gggtccgggt ctggtccaac cgtcccaatc actgagcatc 60

acctgtaccg tgtcgggctt ctcgctgacc aattatggtg tgcattgggt tcgtcagagt 120

ccgggcaaag gtctggaatg gctgggcgtt atttggtccg gcggtaatac cgattacaac 180

accccgttta cgagtcgcct gtccatcaat aaagacaact cgaaaagcca ggtgtttttc 240

aaaatgaatt cactgcaatc gaacgatacc gcgatttatt actgcgcacg tgctctgacg 300

tattacgact atgaatttgc ctactggggc cagggtaccc tggtgacggt tagcgcggct 360

agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcctgggcac ccagacctac 600

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaggt tgagcccaaa 660

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720

ggcggaggtg ggagtgaggt gcagctccag cagtctggac ctgagctggt gaagcctgga 780

ccttcaatga agatatcctg caaggcttct ggttactcat tcactggcta caccatgaac 840

tgggtgaagc agagtcatgg aaagaacctt gagtggatgg gacttattaa tccttacaaa 900

ggtgttagta cctacaacca gaagttcaag gacaaggcca cactgactgt agacaagtca 960

tccagcacag cctacatgga actcctcagt ctgacatctg aggactctgc agtctattac 1020

tgtgcaagat cggggtacta cggtgatagt gactggtact tcgatgtctg gggccagggg 1080

accacgctga ccgtcttctc ataa 1104

<210> 49

<211> 1062

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-11-VL нуклеотидная последовательность

<400> 49

caagtccaac tgaaacaatc gggtccgggt ctggtccaac cgtcccaatc actgagcatc 60

acctgtaccg tgtcgggctt ctcgctgacc aattatggtg tgcattgggt tcgtcagagt 120

ccgggcaaag gtctggaatg gctgggcgtt atttggtccg gcggtaatac cgattacaac 180

accccgttta cgagtcgcct gtccatcaat aaagacaact cgaaaagcca ggtgtttttc 240

aaaatgaatt cactgcaatc gaacgatacc gcgatttatt actgcgcacg tgctctgacg 300

tattacgact atgaatttgc ctactggggc cagggtaccc tggtgacggt tagcgcggct 360

agcaccaagg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 420

acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac ggtgtcgtgg 480

aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg ctgtcctaca gtcctcagga 540

ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca gcctgggcac ccagacctac 600

atctgcaacg tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg acaagaaggt tgagcccaaa 660

tcttgtgaca aaactcacac atgcccaccg tgcccagcac ctgaactcct ggggggaccg 720

ggcggaggtg ggagtgacat ccagatgacc cagaccacct cctccctgtc tgcctccctg 780

ggcgacagag tcaccatcag ttgcagggca agtcaggaca ttagaaatta tttaaactgg 840

tatcaacaga aaccagatgg aactgttaaa ctcctgatct actacacatc aagattacac 900

tcaggagtcc catcaaagtt cagtggcagt gggtctggaa cagattattc tctcaccatt 960

agcaacctgg agcaagagga tattgccact tacttttgcc aacagggtaa tacgcttccg 1020

tggacgttcg ctggaggcac caagctggaa atcaaacggt aa 1062

<210> 50

<211> 645

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-11-LC нуклеотидная последовательность

<400> 50

gatattctgc tgacccagag cccggtgatc ctgagtgttt ccccgggcga acgtgtgtca 60

ttttcgtgtc gcgcgagcca gtctattggt accaatatcc actggtatca gcaacgtacg 120

aacggctctc cgcgcctgct gattaaatac gccagtgaat ccatttcagg catcccgagc 180

cgcttttcgg gcagcggttc tggcaccgat ttcacgctga gtattaactc cgtggaatca 240

gaagatatcg cagactatta ctgccagcaa aacaataact ggccgaccac gtttggtgct 300

ggcaccaaac tggaactgaa aagaaccgtg gctgcaccat ctgtcttcat cttcccgcca 360

tctgatgagc agttgaaatc tggaactgcc tctgttgtgt gcctgctgaa taacttctat 420

cccagagagg ccaaagtaca gtggaaggtg gataacgccc tccaatcggg taactcccag 480

gagagtgtca cagagcagga cagcaaggac agcacctaca gcctcagcag caccctgacg 540

ctgagcaaag cagactacga gaaacacaaa gtctacgcct gcgaagtcac ccatcagggc 600

ctgagctcgc ccgtcacaaa gagcttcaac aggggagagt gttaa 645

<210> 51

<211> 120

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (Her2), расположенная в VH молекул ACE-00

<400> 51

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 52

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (Her2), расположенная в VL молекул ACE-00

<400> 52

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 53

<211> 121

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (TNF alpha), расположенная в VH молекул ACE-00

<400> 53

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 54

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (TNF alpha), расположенная в VL молекул ACE-00

<400> 54

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

100 105

<210> 55

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Базовая последовательность шарнирного участка молекул IgG1

<400> 55

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10 15

<210> 56

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Базовая последовательность шарнирного участка молекул IgG2

<400> 56

Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

1 5 10

<210> 57

<211> 61

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Базовая последовательность шарнирного участка молекул IgG3

<400> 57

Glu Leu Lys Thr Pro Leu Asp Thr Thr His Thr Cys Pro Arg Cys Pro

1 5 10 15

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu

20 25 30

Pro Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro Glu Pro

35 40 45

Lys Ser Cys Asp Thr Pro Pro Pro Cys Pro Arg Cys Pro

50 55 60

<210> 58

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Базовая последовательность шарнирного участка молекул IgG4

<400> 58

Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro

1 5 10

<210> 59

<211> 106

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Репрезентативная CL область Fab-области

<400> 59

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

1 5 10 15

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

20 25 30

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

35 40 45

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

50 55 60

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

65 70 75 80

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

85 90 95

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 60

<211> 98

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Репрезентативная CH1 область Fab-области

<400> 60

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val

<210> 61

<211> 124

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (CD19), расположенная в VH молекул ACE-02 и ACE-03

<400> 61

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 62

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (CD19), расположенная в CDR H1 молекул ACE-02 и ACE-03

<400> 62

Ser Tyr Trp Met Asn

1 5

<210> 63

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (CD19), расположенная в CDR H2 молекул ACE-02 и ACE-03

<400> 63

Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 64

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (CD19), расположенная в CDR H3 молекул ACE-02 и ACE-03

<400> 64

Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10 15

<210> 65

<211> 111

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (CD19), расположенная в VL молекул ACE-02 и ACE-03

<400> 65

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 66

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (CD19), расположенная в CDR L1 молекул ACE-02 и ACE-03

<400> 66

Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr

1 5 10

<210> 67

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (CD19), расположенная в CDR L2 молекул ACE-02 и ACE-03

<400> 67

Asp Ala Ser

1

<210> 68

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (CD19), расположенная в CDR L3 молекул ACE-02 и ACE-03

<400> 68

Gln Gln Ser Thr Glu Asp Pro Trp Thr

1 5

<210> 69

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в VH молекул ACE-02

<400> 69

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Phe

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Gly Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Gln Asp Tyr Asp Val Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Pro Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 70

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в CDR H1 молекул ACE-02

<400> 70

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Thr

1 5

<210> 71

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в CDR H2 молекул ACE-02

<400> 71

Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr

1 5

<210> 72

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в CDR H3 молекул ACE-02

<400> 72

Ala Arg Trp Gln Asp Tyr Asp Val Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 73

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в VL молекул ACE-02

<400> 73

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Pro Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg

100 105

<210> 74

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в CDR L1 молекул ACE-02

<400> 74

Ser Ser Ser Val Ser Tyr

1 5

<210> 75

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в CDR L2 молекул ACE-02

<400> 75

Ala Thr Ser

1

<210> 76

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в CDR L3 молекул ACE-02

<400> 76

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Pro Thr

1 5

<210> 77

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в VH молекул ACE-03

<400> 77

Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr

20 25 30

Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Val Lys

50 55 60

Asp Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Lys Ser Lys Ser Thr Ala Phe Leu

65 70 75 80

Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Pro Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 78

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в CDR H1 молекул ACE-03 и ACE-04

<400> 78

Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr

1 5

<210> 79

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в CDR H2 молекул ACE-03 и ACE-04

<400> 79

Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr

1 5

<210> 80

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в CDR H3 молекул ACE-03 и ACE-04

<400> 80

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 81

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в VL молекул ACE-03

<400> 81

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg

100 105

<210> 82

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в CDR L1 молекул ACE-03 и ACE-04

<400> 82

Ser Ser Val Ser Tyr

1 5

<210> 83

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в CDR L2 молекул ACE-03 и ACE-04

<400> 83

Asp Thr Ser

1

<210> 84

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в CDR L3 молекул ACE-03

<400> 84

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

1 5

<210> 85

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в VH молекул ACE-04

<400> 85

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr

20 25 30

Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ala

115

<210> 86

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в VL молекул ACE-04

<400> 86

Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr

35 40 45

Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala His Phe Arg Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr

85 90 95

Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg

100 105

<210> 87

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (CD3), расположенная в CDR L3 молекул ACE-04

<400> 87

Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Phe

1 5

<210> 88

<211> 364

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-02-VH аминокислотная последовательность

<400> 88

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val

245 250 255

Val Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr

260 265 270

Thr Phe Thr Ser Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys

275 280 285

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Ser Gly Tyr Thr Lys

290 295 300

Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser

305 310 315 320

Lys Ser Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr

325 330 335

Gly Val Tyr Phe Cys Ala Arg Trp Gln Asp Tyr Asp Val Tyr Phe Asp

340 345 350

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser

355 360

<210> 89

<211> 352

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-02-VL аминокислотная последовательность

<400> 89

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

245 250 255

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser

260 265 270

Ser Val Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro

275 280 285

Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

290 295 300

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser

305 310 315 320

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser

325 330 335

Ser Asn Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg

340 345 350

<210> 90

<211> 218

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-02-LC, ACE-03-LC (анти-CD19 антитело, легкая цепь)

<400> 90

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Asp

20 25 30

Gly Asp Ser Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Gln Pro Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Val Ser Gly Ile Pro Pro

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His

65 70 75 80

Pro Val Glu Lys Val Asp Ala Ala Thr Tyr His Cys Gln Gln Ser Thr

85 90 95

Glu Asp Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 91

<211> 363

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-03-VH аминокислотная последовательность

<400> 91

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Val Val

245 250 255

Gln Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr

260 265 270

Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

275 280 285

Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr

290 295 300

Asn Gln Lys Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Thr Asp Lys Ser Lys

305 310 315 320

Ser Thr Ala Phe Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Pro Glu Asp Thr Ala

325 330 335

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr

340 345 350

Trp Gly Gln Gly Thr Pro Val Thr Val Ser Ser

355 360

<210> 92

<211> 352

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-03-VL аминокислотная последовательность

<400> 92

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Gln Ile Trp Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asn Tyr Asn Gly Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Ala Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Glu Thr Thr Thr Val Gly Arg Tyr Tyr Tyr Ala Met Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Leu Leu Gly Gly Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

245 250 255

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser

260 265 270

Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Lys Ala Pro

275 280 285

Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

290 295 300

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Phe Thr Ile Ser

305 310 315 320

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser

325 330 335

Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Gln Ile Thr Arg

340 345 350

<210> 93

<211> 469

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-04-VH аминокислотная послеедовательность

<400> 93

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala

245 250 255

Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser

260 265 270

Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro

275 280 285

Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr

290 295 300

Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp

305 310 315 320

Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu

325 330 335

Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys

340 345 350

Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ala Ala Ser

355 360 365

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

370 375 380

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

385 390 395 400

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

405 410 415

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

420 425 430

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

435 440 445

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val

450 455 460

Glu Pro Lys Ser Cys

465

<210> 94

<211> 460

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-04-VL аминокислотная последовательность

<400> 94

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala

245 250 255

Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala

260 265 270

Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr

275 280 285

Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val

290 295 300

Pro Ala His Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr

305 310 315 320

Ile Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

325 330 335

Trp Ser Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile

340 345 350

Asn Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp

355 360 365

Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn

370 375 380

Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu

385 390 395 400

Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp

405 410 415

Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr

420 425 430

Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser

435 440 445

Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

450 455 460

<210> 95

<211> 218

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-04-LC, ACE-09-LC, и ACE-12-LC (анти-PD-L1 антитело, легкая

цепь)

<400> 95

Gln Leu Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ala Gly

20 25 30

Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gly Asp Ile Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Lys Ser Gly Ile Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu

65 70 75 80

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser

85 90 95

Leu Ser Gly Gly Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Arg

100 105 110

Ser Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 96

<211> 364

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-09-VH аминокислотная последовательность (без G4S линкера)

<400> 96

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro

245 250 255

Gly Pro Ser Met Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr

260 265 270

Gly Tyr Thr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu

275 280 285

Trp Met Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln

290 295 300

Lys Phe Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr

305 310 315 320

Ala Tyr Met Glu Leu Leu Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr

325 330 335

Tyr Cys Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp

340 345 350

Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Phe Ser

355 360

<210> 97

<211> 350

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-09-VL аминокислотная последовательность (без G4S линкера)

<400> 97

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser

245 250 255

Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg

260 265 270

Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu

275 280 285

Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe

290 295 300

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu

305 310 315 320

Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu

325 330 335

Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

340 345 350

<210> 98

<211> 374

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-12-VH аминокислотная последовательность (с 10 остатками)

<400> 98

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu

245 250 255

Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Pro Ser Met Lys Ile

260 265 270

Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn Trp

275 280 285

Val Lys Gln Ser His Gly Lys Asn Leu Glu Trp Met Gly Leu Ile Asn

290 295 300

Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Asp Lys Ala

305 310 315 320

Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Leu

325 330 335

Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Gly

340 345 350

Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr

355 360 365

Thr Leu Thr Val Phe Ser

370

<210> 99

<211> 359

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-12-VL аминокислотная последовательность (с 9 остатками)

<400> 99

Gln Met Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Ile Pro Ile Leu Gly Ile Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Arg Asp Gly Tyr Asn Leu Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

225 230 235 240

Gly Pro Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Asp Ile Gln Met Thr

245 250 255

Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile

260 265 270

Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln

275 280 285

Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg

290 295 300

Leu His Ser Gly Val Pro Ser Lys Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr

305 310 315 320

Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr

325 330 335

Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Ala Gly Gly

340 345 350

Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

355

<210> 100

<211> 1095

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-02-VH нуклеотидная последовательность

<400> 100

caggttcaat tgcagcaaag cggggctgag ttggtacggc ctgggtccag cgtgaagata 60

tcatgtaagg cttctggata tgccttctcc tcttactgga tgaactgggt caagcaacgg 120

ccaggacaag gcctggagtg gattgggcaa atatggcccg gggacggaga tactaattat 180

aatggcaagt ttaaggggaa agctacactg accgcagacg aaagctcctc tacggcctat 240

atgcagctct catctcttgc gtccgaagat agtgcagtat atttttgtgc gcgccgcgag 300

accaccacgg ttgggaggta ctattacgcg atggattact ggggccaggg gactacagtt 360

acggtttcat cagctagcac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 420

agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480

gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 540

ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcctg 600

ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660

agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 720

ctcctggggg gaccgcaggt gcagctggtg cagagcggcg gcggcgtggt gcagcccggc 780

cgcagcctgc gcctgagctg caaggccagc ggctacacct tcaccagcta caccatgcac 840

tgggtgcgcc aggcccccgg caagggcctg gagtggatcg gctacatcaa ccccagcagc 900

ggctacacca agtacaacca gaagttcaag gaccgcttca ccatcagcgc cgacaagagc 960

aagagcaccg ccttcctgca gatggacagc ctgcgccccg aggacaccgg cgtgtacttc 1020

tgcgcccgct ggcaggacta cgacgtgtac ttcgactact ggggccaggg cacccccgtg 1080

accgtgagca gctaa 1095

<210> 101

<211> 1059

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-02-VL нуклеотидная последовательность

<400> 101

caggttcaat tgcagcaaag cggggctgag ttggtacggc ctgggtccag cgtgaagata 60

tcatgtaagg cttctggata tgccttctcc tcttactgga tgaactgggt caagcaacgg 120

ccaggacaag gcctggagtg gattgggcaa atatggcccg gggacggaga tactaattat 180

aatggcaagt ttaaggggaa agctacactg accgcagacg aaagctcctc tacggcctat 240

atgcagctct catctcttgc gtccgaagat agtgcagtat atttttgtgc gcgccgcgag 300

accaccacgg ttgggaggta ctattacgcg atggattact ggggccaggg gactacagtt 360

acggtttcat cagctagcac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 420

agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480

gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 540

ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcctg 600

ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660

agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 720

ctcctggggg gaccggacat ccagatgacc cagagcccca gcagcctgag cgccagcgtg 780

ggcgaccgcg tgaccatgac ctgccgcgcc agcagcagcg tgagctacat gcactggtac 840

cagcagaccc ccggcaaggc ccccaagccc tggatctacg ccaccagcaa cctggccagc 900

ggcgtgccca gccgcttcag cggcagcggc agcggcaccg actacaccct gaccatcagc 960

agcctgcagc ccgaggacat cgccacctac tactgccagc agtggagcag caaccccccc 1020

accttcggcc agggcaccaa gctgcagatc acccgctaa 1059

<210> 102

<211> 657

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-02-LC, и ACE-03-LC (анти-CD19 антитело, легкая цепь,

нуклеотидная последовательность)

<400> 102

gatattcaac tcacgcaatc tccagcaagt ctcgcagtta gtttggggca gcgagctaca 60

ataagttgca aggcgagcca atccgtggat tatgatggag acagctatct taactggtat 120

cagcaaattc caggccagcc acccaagttg ctgatctacg acgcgtcaaa cctggtctca 180

gggatccctc caagatttag cggctcaggt tcaggtacgg attttacgct caatatccat 240

cctgtagaga aggttgatgc agctacatac cactgtcaac agagtaccga ggatccttgg 300

accttcggag gcggtacaaa gctggagatc aagagaaccg tggctgcacc atctgtcttc 360

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540

agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttaa 657

<210> 103

<211> 1092

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-03-VH нуклеотидная последовательность

<400> 103

caggttcaat tgcagcaaag cggggctgag ttggtacggc ctgggtccag cgtgaagata 60

tcatgtaagg cttctggata tgccttctcc tcttactgga tgaactgggt caagcaacgg 120

ccaggacaag gcctggagtg gattgggcaa atatggcccg gggacggaga tactaattat 180

aatggcaagt ttaaggggaa agctacactg accgcagacg aaagctcctc tacggcctat 240

atgcagctct catctcttgc gtccgaagat agtgcagtat atttttgtgc gcgccgcgag 300

accaccacgg ttgggaggta ctattacgcg atggattact ggggccaggg gactacagtt 360

acggtttcat cagctagcac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 420

agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480

gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 540

ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcctg 600

ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660

agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 720

ctcctggggg gaccggtgca gctggtgcag agcggcggcg gcgtggtgca gcccggccgc 780

agcctgcgcc tgagctgcaa ggccagcggc tacaccttca cccgctacac catgcactgg 840

gtgcgccagg cccccggcaa gggcctggag tggatcggct acatcaaccc cagccgcggc 900

tacaccaact acaaccagaa ggtgaaggac cgcttcacca tcagcaccga caagagcaag 960

agcaccgcct tcctgcagat ggacagcctg cgccccgagg acaccgccgt gtactactgc 1020

gcccgctact acgacgacca ctactgcctg gactactggg gccagggcac ccccgtgacc 1080

gtgagcagct aa 1092

<210> 104

<211> 1059

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-03-VL нуклеотидная последовательность

<400> 104

caggttcaat tgcagcaaag cggggctgag ttggtacggc ctgggtccag cgtgaagata 60

tcatgtaagg cttctggata tgccttctcc tcttactgga tgaactgggt caagcaacgg 120

ccaggacaag gcctggagtg gattgggcaa atatggcccg gggacggaga tactaattat 180

aatggcaagt ttaaggggaa agctacactg accgcagacg aaagctcctc tacggcctat 240

atgcagctct catctcttgc gtccgaagat agtgcagtat atttttgtgc gcgccgcgag 300

accaccacgg ttgggaggta ctattacgcg atggattact ggggccaggg gactacagtt 360

acggtttcat cagctagcac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 420

agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccg 480

gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 540

ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcctg 600

ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660

agagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 720

ctcctggggg gaccggacat ccagatgacc cagagcccca gcagcctgag cgccagcgtg 780

ggcgaccgcg tgaccatcac ctgcagcgcc agcagcagcg tgagctacat gaactggtac 840

cagcagaccc ccggcaaggc ccccaagcgc tggatctacg acaccagcaa gctggccagc 900

ggcgtgccca gccgcttcag cggcagcggc agcggcaccg actacacctt caccatcagc 960

agcctgcagc ccgaggacat cgccacctac tactgccagc agtggagcag caaccccttc 1020

accttcggcc agggcaccaa gctgcagatc acccgctaa 1059

<210> 105

<211> 1410

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-04-VH нуклеотидная последовательность

<400> 105

cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaccgaga 300

gatggctaca atttggttgc ttttgatatc tggggccaag ggacgatggt caccgtctcc 360

tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccgggcg gaggtgggag tcaggtccag ttgcaacagt ctggagccga gctcgccagg 780

ccaggagcct ccgtcaaaat gtcatgcaag gcctcagggt acacatttac gcgatatacc 840

atgcactggg tgaaacaaag accaggtcag ggacttgaat ggatcggtta cattaacccc 900

tctagaggct atacgaatta caaccagaaa ttcaaagaca aagcaacact tacgactgac 960

aaatccagta gtacggctta catgcagctc tcatctttga cttcagaaga ctctgctgta 1020

tattattgtg cccgctatta cgatgaccat tactgccttg attactgggg ccagggcact 1080

actgttaccg taagtgcggc tagcaccaag ggcccatcgg tcttccccct ggcaccctcc 1140

tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 1200

gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg 1260

gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc 1320

agcctgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg 1380

gacaagagag ttgagcccaa atcttgttga 1410

<210> 106

<211> 1383

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-04-VL нуклеотидная последовательность

<400> 106

cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaccgaga 300

gatggctaca atttggttgc ttttgatatc tggggccaag ggacgatggt caccgtctcc 360

tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccgggcg gaggtgggag tcagatcgtc ctcactcaaa gtcctgctat tatgtccgca 780

agccctggtg aaaaggttac catgacttgc tccgcatcta gttctgtctc ttacatgaac 840

tggtaccagc aaaagtctgg aacgtccccg aaaaggtgga tatatgatac gagcaaattg 900

gcaagcggag tacccgcgca ttttaggggt tcaggcagcg gtacgtcata tagcctgact 960

attagcggaa tggaggcgga ggatgctgca acatattatt gccaacaatg gtcatcaaat 1020

ccttttactt tcggctcagg cacaaaactt gaaataaata gaaccgtggc tgcaccatct 1080

gtcttcatct tcccgccatc tgatgagcag ttgaaatctg gaactgcctc tgttgtgtgc 1140

ctgctgaata acttctatcc cagagaggcc aaagtacagt ggaaggtgga taacgccctc 1200

caatcgggta actcccagga gagtgtcaca gagcaggaca gcaaggacag cacctacagc 1260

ctcagcagca ccctgacgct gagcaaagca gactacgaga aacacaaagt ctacgcctgc 1320

gaagtcaccc atcagggcct gagctcgccc gtcacaaaga gcttcaacag gggagagtgt 1380

taa 1383

<210> 107

<211> 657

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-04-LC, ACE-09-LC, ACE-12-LC (анти-PD-L1 антитело,

нуклеотидная последовательность легкой цепи )

<400> 107

cagctcgtgc tgactcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60

tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtatcagcaa 120

cttccaggag cagcccccaa actcctcatc tatggcgaca tcaatcggcc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctggctc caagtctggc atctcagcct ccctggctat cactgggctc 240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtgggggg 300

gtgttcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaagatctg tggctgcacc atctgtcttc 360

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 420

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 480

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 540

agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 600

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttag 657

<210> 108

<211> 1095

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-09-VH нуклеотидная последовательность (без G4S линкера)

<400> 108

cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaccgaga 300

gatggctaca atttggttgc ttttgatatc tggggccaag ggacgatggt caccgtctcc 360

tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccggagg tgcagctcca gcagtctgga cctgagctgg tgaagcctgg accttcaatg 780

aagatatcct gcaaggcttc tggttactca ttcactggct acaccatgaa ctgggtgaag 840

cagagtcatg gaaagaacct tgagtggatg ggacttatta atccttacaa aggtgttagt 900

acctacaacc agaagttcaa ggacaaggcc acactgactg tagacaagtc atccagcaca 960

gcctacatgg aactcctcag tctgacatct gaggactctg cagtctatta ctgtgcaaga 1020

tcggggtact acggtgatag tgactggtac ttcgatgtct ggggccaggg gaccacgctg 1080

accgtcttct cataa 1095

<210> 109

<211> 1053

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-09-VL нуклеотидная последовательность (без G4S линкера)

<400> 109

cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaccgaga 300

gatggctaca atttggttgc ttttgatatc tggggccaag ggacgatggt caccgtctcc 360

tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccggaca tccagatgac ccagaccacc tcctccctgt ctgcctccct gggcgacaga 780

gtcaccatca gttgcagggc aagtcaggac attagaaatt atttaaactg gtatcaacag 840

aaaccagatg gaactgttaa actcctgatc tactacacat caagattaca ctcaggagtc 900

ccatcaaagt tcagtggcag tgggtctgga acagattatt ctctcaccat tagcaacctg 960

gagcaagagg atattgccac ttacttttgc caacagggta atacgcttcc gtggacgttc 1020

gctggaggca ccaagctgga aatcaaacgg taa 1053

<210> 110

<211> 1125

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-12-VH нуклеотидная последовательность (с 10 остатками)

<400> 110

cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaccgaga 300

gatggctaca atttggttgc ttttgatatc tggggccaag ggacgatggt caccgtctcc 360

tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccgggcg gaggtgggag tggaggcgga ggatctgagg tgcagctcca gcagtctgga 780

cctgagctgg tgaagcctgg accttcaatg aagatatcct gcaaggcttc tggttactca 840

ttcactggct acaccatgaa ctgggtgaag cagagtcatg gaaagaacct tgagtggatg 900

ggacttatta atccttacaa aggtgttagt acctacaacc agaagttcaa ggacaaggcc 960

acactgactg tagacaagtc atccagcaca gcctacatgg aactcctcag tctgacatct 1020

gaggactctg cagtctatta ctgtgcaaga tcggggtact acggtgatag tgactggtac 1080

ttcgatgtct ggggccaggg gaccacgctg accgtcttct cataa 1125

<210> 111

<211> 1080

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-12-VL нуклеотидная последовательность (с 9 остатками)

<400> 111

cagatgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120

cctggacaag ggcttgagtg gatgggaagg atcatcccta tccttggtat agcaaactac 180

gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240

atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gaaaccgaga 300

gatggctaca atttggttgc ttttgatatc tggggccaag ggacgatggt caccgtctcc 360

tcagctagca ccaagggccc atcggtcttc cccctggcac cctcctccaa gagcacctct 420

gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg 480

tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc 540

tcaggactct actccctcag cagcgtggtg accgtgccct ccagcagcct gggcacccag 600

acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag 660

cccaaatctt gtgacaaaac tcacacatgc ccaccgtgcc cagcacctga actcctgggg 720

ggaccgggcg gatccggcgg aggcggcagc ggagacatcc agatgaccca gaccacctcc 780

tccctgtctg cctccctggg cgacagagtc accatcagtt gcagggcaag tcaggacatt 840

agaaattatt taaactggta tcaacagaaa ccagatggaa ctgttaaact cctgatctac 900

tacacatcaa gattacactc aggagtccca tcaaagttca gtggcagtgg gtctggaaca 960

gattattctc tcaccattag caacctggag caagaggata ttgccactta cttttgccaa 1020

cagggtaata cgcttccgtg gacgttcgct ggaggcacca agctggaaat caaacggtaa 1080

<210> 112

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер, расположенный в ACE-05-VH и ACE-05-VL

<400> 112

Gly Gly Gly Gly Ser

1 5

<210> 113

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер, расположенный в ACE-12-VH

<400> 113

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 114

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Линкер, расположенный в ACE-12-VL

<400> 114

Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5

<210> 115

<211> 362

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-00-VH аминокислотная последовательность

<400> 115

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

245 250 255

Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp

260 265 270

Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

275 280 285

Val Ser Ala Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser

290 295 300

Val Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu

305 310 315 320

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

325 330 335

Cys Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp

340 345 350

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

355 360

<210> 116

<211> 349

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-00-VL аминокислотная последовательность

<400> 116

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Ala Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly

225 230 235 240

Pro Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val

245 250 255

Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn

260 265 270

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

275 280 285

Ile Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

290 295 300

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

305 310 315 320

Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro

325 330 335

Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg

340 345

<210> 117

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> ACE-00-LC аминокислотная последовательность (анти-CD19 антитело,

легкая цепь)

<400> 117

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Phe Leu Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Ser Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 118

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (Анти-Her2), расположенная в CDR H1 молекул ACE-00

<400> 118

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr

1 5

<210> 119

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (Анти-Her2), расположенная в CDR H2 молекул ACE-00

<400> 119

Ile Tyr Pro Thr Asn Gly Tyr Thr

1 5

<210> 120

<211> 13

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (Анти-Her2), расположенная в CDR H3 молекул ACE-00

<400> 120

Ser Arg Trp Gly Gly Asp Gly Phe Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 121

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (Анти-Her2), расположенная в CDR L1 молекул ACE-00

<400> 121

Gln Asp Val Asn Thr Ala

1 5

<210> 122

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (Анти-Her2), расположенная в CDR L2 молекул ACE-00

<400> 122

Ser Ala Ser

1

<210> 123

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fab область (Анти-Her2), расположенная в CDR L3 молекул ACE-00

<400> 123

Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Pro Thr

1 5

<210> 124

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (Анти-TNF alpha), расположенная в CDR H1 молекул ACE-00

<400> 124

Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr Ala

1 5

<210> 125

<211> 8

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (Анти-TNF alpha), расположенная в CDR H2 молекул ACE-00

<400> 125

Ile Thr Trp Asn Ser Gly His Ile

1 5

<210> 126

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (Анти-TNF alpha), расположенная в CDR H3 молекул ACE-00

<400> 126

Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 127

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (Анти-TNF alpha), расположенная в CDR L1 молекул ACE-00

<400> 127

Gln Gly Ile Arg Asn Tyr

1 5

<210> 128

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (Анти-TNF alpha), расположенная в CDR L2 молекул ACE-00

<400> 128

Ala Ala Ser

1

<210> 129

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Fv область (Анти-TNF alpha), расположенная в CDR L3 молекул ACE-00

<400> 129

Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr

1 5

<---

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложена связывающая молекула, содержащая первый, второй, третий и четвертый полипептиды. Первый полипептид и второй полипептид содержат легкую цепь антитела. Третий полипептид содержит первую вариабельную область (VH) тяжелой цепи, первую константную область (CH1) тяжелой цепи и вторую область VH. Четвертый полипептид содержит третью область VH, вторую область CH1 и вариабельную область легкой цепи (VL). Первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образуют первую антигенсвязывающую область Fab. Второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образуют вторую антигенсвязывающую Fab область. Вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют область Fv, которая связывается с CD3. Первая и вторая области Fab связаны с Fv гибкой пептидной областью, содержащей шарнирный участок антитела. Первая и вторая области Fab связываются с одним и тем же антигеном. Также изобретение относится к способу производства указанной молекулы и к содержащей указанную молекулу фармацевтической композиции. Изобретение может быть использовано в иммунотерапии рака. 3 н. и 15 з.п. ф-лы, 73 ил., 14 табл., 7 пр.

1. Связывающая молекула, содержащая:

(а) первый полипептид и второй полипептид, каждый из которых содержит легкую цепь антитела,

(b) третий полипептид, содержащий первую вариабельную область (VH) тяжелой цепи, первую константную область (CH1) тяжелой цепи и вторую область VH; и

(c) четвертый полипептид, содержащий третью область VH, вторую область CH1 и вариабельную область легкой цепи (VL),

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида образуют первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида образуют вторую антигенсвязывающую Fab область;

где первая область Fab и вторая область Fab связаны с антигенсвязывающей областью Fv гибкой пептидной областью, содержащей шарнирный участок антитела;

где первая область Fab и вторая область Fab связываются с тем же самым антигеном;

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида образуют указанную область Fv; и

где указанная область Fv связывается с CD3 (кластером дифференцировки 3).

2. Связывающая молекула по п.1, в которой гибкая пептидная область дополнительно содержит линкер.

3. Связывающая молекула по п.2, в которой линкер содержит аминокислотную последовательность GGGGS (G4S).

4. Связывающая молекула по п.1, которая не содержит домена CH2 или домена CH3.

5. Связывающая молекула по п.1, которая дополнительно содержит первую область CH3, связанную с областью VH области Fv, и вторую область CH3, связанную с областью VL области Fv.

6. Связывающая молекула по п.1, где первая область Fab и вторая область Fab образуют первый антигенсвязывающий домен, а область Fv является вторым антигенсвязывающим доменом, связывающимся с CD3.

7. Связывающая молекула по п.6, где первый антигенсвязывающий домен и второй антигенсвязывающий домен связываются с разными антигенами и где первый антигенсвязывающий домен связывается с первым антигеном, а второй антигенсвязывающий домен связывается со вторым антигеном, где второй антиген представляет собой CD3.

8. Связывающая молекула по п.7, где первый антиген представляет собой раковый антиген.

9. Связывающая молекула по п.7, где первый антиген представляет собой PD-L1.

10. Связывающая молекула по п. 9,

где область VH каждой области Fab включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 5, SEQ ID NO.: 6 и SEQ ID NO.: 7;

где область VL каждой области Fab включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 9, SEQ ID NO.: 10 и SEQ ID NO.: 11;

где область VH области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; и

где область VL области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

11. Связывающая молекула по п.7, где первый антиген представляет собой CD20.

12. Связывающая молекула по п.11,

где область VH каждой области Fab включает три CDR, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 27, SEQ ID NO.: 28 и SEQ ID NO.: 29;

где область VL каждой области Fab включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 31, SEQ ID NO.: 32 и SEQ ID NO.: 33;

где область VH области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; и

где область VL области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

13. Связывающая молекула по п.7, где первый антиген представляет собой EGFR.

14. Связывающая молекула по п.13,

где область VH каждой области Fab включает три CDR, имеющих аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 41, SEQ ID NO.: 42, SEQ ID NO.: 43;

где область VL каждой области Fab включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 45, SEQ ID NO.: 46 и SEQ ID NO.: 47;

где область VH области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 13, SEQ ID NO.: 14 и SEQ ID NO.: 15; и

где область VL области Fv включает три CDR, имеющие аминокислотные последовательности SEQ ID NO.: 17, SEQ ID NO.: 18 и SEQ ID NO.: 19.

15. Способ производства связывающей молекулы по п.1, включающий трансфекцию клетки-хозяина одним или более векторами, где один или более векторов содержат:

(а) первую нуклеиновую кислоту, кодирующую первый полипептид и второй полипептид, каждый из которых содержит легкую цепь антитела,

(b) вторую нуклеиновую кислоту, кодирующую третий полипептид, содержащий первую область VH, первую область CH1 и вторую область VH; и

(c) третью нуклеиновую кислоту, кодирующую четвертый полипептид, содержащий третью область VH, вторую область CH1 и область VL,

где первый полипептид вместе с первой областью VH и первой областью CH1 третьего полипептида могут образовывать первую антигенсвязывающую область Fab;

где второй полипептид вместе с третьей областью VH и второй областью CH1 четвертого полипептида могут образовывать вторую антигенсвязывающую область Fab;

где первая область Fab и вторая область Fab связаны с антигенсвязывающей областью Fv гибкой пептидной областью, содержащей шарнирный участок антитела;

где первая область Fab и вторая область Fab связываются с тем же самым антигеном;

где вторая область VH третьего полипептида и область VL четвертого полипептида могут образовывать указанную область Fv; и

где указанная область Fv связывается с CD3 (кластером дифференцировки 3).

16. Фармацевтическая композиция для применения в лечении рака у субъекта, содержащая терапевтически эффективное количество связывающей молекулы по любому из пп. 1-14 и фармацевтически приемлемый носитель.

17. Фармацевтическая композиция по п. 16, где рак представляет собой рак легкого или диффузную крупноклеточную В-клеточную лимфому (DLBCL).

18. Фармацевтическая композиция по п. 16, где заболевание или состояние представляет собой рак, положительный по PD-L1.