АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С GPRC5D Российский патент 2023 года по МПК C07K16/28 A61K39/395 A61P35/00 

Область техники

Настоящее изобретение в целом относится к антителам, которые связываются с GPRC5D, включая биспецифические антигенсвязывающие молекулы, например, для активации Т-клеток. Кроме того, настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим такие антитела, а также к векторам и клеткам-хозяевам, содержащим такие полинуклеотиды. Настоящее изобретение также относится к способам получения антител и к способам их применения при лечении заболеваний.

Предшествующий уровень техники

Множественная миелома (ММ), поражающая около 75000 новых пациентов каждый год в ЕС и США, является одним из наиболее распространенных гематологических злокачественных новообразований, для которого нет эффективного метода лечения. ММ характеризуется терминально дифференцированными плазматическими клетками, которые секретируют нефункциональные моноклональные иммуноглобулины. В краткосрочной перспективе иммуномодулирующие препараты, такие как леналидомид и помалидомид, а также ингибиторы протеасом, такие как карфилзомиб или бортезомиб, могут оставаться основой терапии первой линии при MM (Moreau Р., Rajkumar S.V., Lancet, 388(10040), 2016, 111-113). Однако эти препараты не нацелены непосредственно на пораженные опухолевые клетки, например пораженные плазматические клетки (ПК). Были предприняты попытки избирательного истощения плазматических клеток при ММ,. Отсутствие поверхностных белков - специфических маркеров ПК, препятствует разработке антител или клеточной терапии при ММ. До сих пор существует несколько примеров успешных биопрепаратов, к которым относятся, например, даратумумаб (анти-CD38) и элотузумаб (анти-CD319), с оговоркой, что эти две молекулы экспрессируются не только клетками плазмы. Поэтому новые мишени плазматических клеток при множественной миеломе были идентифицированы с использованием РНК-секвенирования, например, связанный с G-белками рецептор класса С, представитель 5 группы D (GPRC5D). GPRC5D является специфическим поверхностным белком, экспрессируемым плазматическими клетками при множественной миеломе. Сообщалось, что GPRC5D связан с прогнозом и опухолевой нагрузкой у пациентов с множественной миеломой (Atamaniuk, J. с соавт.Eur J Clin Invest, 42(9), 2012, 953-960; Cohen Y. с соавт., Hematology, 18(6), 2013, 348-351).

GPRC5D является орфанным рецептором, лиганд или функция которого неизвестны ни у здорового человека, ни в случаях заболевания раком. Ген, кодирующий GPRC5D, локализован на хромосоме 12р13.3, он содержит три экзона и имеет протяженность примерно 9,6 т.п.н. (Brauner-Osborae Н. с соавт., Biochim. Biophys Acta, 1518(3), 2001, 237-248). Большой первый экзон кодирует трансмембранный домен, пронизывающий мембрану семь раз. Однако биология GPRC5D в значительной степени неизвестна. Показано, что GPRC5D участвует в формировании кератина в фолликулах волос у животных (Gao Y. с соавт., PLoS One, 11(3), 2016, e0151118; Inoue S. с соавт., J Invest Dermatol, 122(3), 2004, 565-573).

В WO 2018/017786 A2 описывают GPRC5D-специфические антитела или антигенсвязывающие фрагменты. Существует потребность в разработке дополнительных лекарственных средств для лечения рака, в частности множественной миеломы. К особенно полезным лекарственным средствам для этой цели относят антитела, которые связывают GPRC5D, в частности биспецифические антитела, которые связывают GPRC5D на клетках-мишенях и активирующий Т-клеточный антиген, например, CD3 на Т-клетках. Одновременное связывание такого антитела с обеими указанными мишенями вызовет временное взаимодействие между клеткой-мишенью и Т-клеткой, вызывая активацию какой-либо цитотоксической Т-клетки и последующий лизис клетки-мишени.

Настоящее изобретение предусматривает новые антитела, включая биспецифические антитела, которые специфически связывают GPRC5D человека. В частности, Т-клеточные биспецифические антитела по настоящему изобретению, нацеленные на GPRC5D, способны лечить множественную миелому.

Краткое описание изобретения

В настоящем изобретении создано новое антитело с неожиданными улучшенными свойствами, которое связывается с GPRC5D. Кроме того, разработаны биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые связываются с GPRC5D и активирующим Т-клеточным антигеном, включая новое антитело к GPRC5D.

В первом объекте настоящего изобретения предусматривают антитело, которое связывается с GPRC5D, причем антитело содержит (i) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 83, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 84, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 87. LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 89; (ii) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 83, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 85, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 87, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 89, (iii) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 91, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97; (iv) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 91, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 96 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97; или (v) и вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 92, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97. В другом варианте антитело может включать (I) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 1, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 2, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 4, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 5 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 6; или (II) вариабельную область тяжелой цепи (VH, включающую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 7, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 8, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 10, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 11 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 12. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения (i) VH содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 13, и содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14; или (ii) VH содержит аминокислотную последовательность, которая, по меньшей мере, примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 15, и VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16; или (iii) VH содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 48, и VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53; или (iv) VH содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 49, и VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52; или (v) VH содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 57, и VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 64; или (vi) VH содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 58, и VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 63. В другом варианте осуществления настоящего изобретения (i) VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; или (ii) VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; или (iii) VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, и VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; или (iv) VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; или (v) VH содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; или (vi) VH содержит аминокислотную последовательность EQ ID NO: 58, и VL содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63. В другом варианте осуществления настоящего изобретения антителом является IgG, особенно антитело IgG₁. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антителом является антитело полной длины. В другом варианте осуществления настоящего изобретения антителом является фрагмент антитела, выбранный из группы, включающей молекулы Fv, молекулы scFv, молекулы Fab и молекулы F(ab')₂. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антителом является мультиспецифическое антитело.

Другой объект настоящего изобретения относится к биспецифической антигенсвязывающей молекуле, содержащей (а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D и первый антигенсвязывающий фрагмент содержит (i) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 83, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 84, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 87, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 89; (ii) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 83, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 85, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 87, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 89; (iii) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 91, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97; (iv) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 91, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 96 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97; или (v) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 92, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97. В другом варианте первый антигенсвязывающий фрагмент может включать (I) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 1, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 2, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 4, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 5 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 6; или (II) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 7, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 8, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 10, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 11 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 12; и (б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается со вторым антигеном. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения (i) VH первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 13, и VL первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14; или (ii) VH первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 15, и VL первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16; или (iii) VH первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 48, и VL первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53; или (iv) VH первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 49, и VL первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52; или (v) VH первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 57, и VL первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 64; или (vi) VH первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 58, и VL первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 63. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения (i) VH первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и VL первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; или (ii) VH первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и VL первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; или (iii) VH первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, и VL первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; или (iv) VH первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и VL первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; или (v) VH первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и VL первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; или (vi) VH первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и VL первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63. В другом варианте осуществления настоящего изобретения вторым антигеном является CD3, особенно CD3e. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, включающий HCDR 1 последовательности SEQ ID NO: 29, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 30, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 31, и VL, включающий LCDR 1 последовательности SEQ ID NO: 32, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 33 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 34. В другом варианте осуществления настоящего изобретения VH второго антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35, и VL второго антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36. В другом варианте осуществления настоящего изобретения VH второго антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35, и VL второго антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый и/или второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab. Это означает, что либо первый антигенсвязывающий фрагмент может быть молекулой Fab, либо второй антигенсвязывающий фрагмент может быть молекулой Fab, либо и первый антигенсвязывающий фрагмент, и второй антигенсвязывающие фрагменты могут быть молекулами Fab. В другом варианте осуществления настоящего изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1, в частности вариабельные домены VL и VH, легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга. В другом варианте осуществления настоящего изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой константной домен в положении аминокислоты 124 заменен независимо лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация по Kabat) и аминокислота в положении 123 заменена независимо лизином (K), аргинином (R) или гистидином (H) (нумерация по Kabat), и в константном домене СН1 аминокислота в положении 147 заменена независимо глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по ЕС индексу по Kabat), и аминокислота в положении 213 заменена независимо глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по ЕС индексу по Kabat). В другом варианте осуществления настоящего изобретения первый и второй антигенсвязывающие фрагменты слиты друг с другом необязательно через пептидный линкер. В другом варианте осуществления настоящего изобретения первый и второй антигенсвязывающие фрагменты оба находятся в молекуле Fab, причем либо (i) второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента, или (ii) первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента. В другом варианте осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит третий антигенсвязывающий фрагмент. В другом варианте осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент идентичен первому антигенсвязывающему фрагменту. В другом варианте осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула включает домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц. В другом варианте осуществления настоящего изобретения каждый из первого, второго и, если присутствует, третьего антигенсвязывающих фрагментов, представляет молекулу Fab; и либо (i) второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента, и первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab к N-концу первой субъединицы домена Fc, или (ii) первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента, и второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой субъединицы домена Fc; и третий антигенсвязывающий фрагмент, если он присутствует, слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом второй субъединицы домена Fc. В другом варианте осуществления настоящего изобретения домен Fc является доменом IgG, в частности, доменом Fc IgG₁. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения домен Fc является доменом Fc человека. В другом варианте осуществления настоящего изобретения аминокислотный остаток в домене CH3 первой субъединицы домена Fc заменен аминокислотным остатком, имеющим больший объем боковой цепи, тем самым создавая выступ в домене CH3 первой субъединицы, который может располагаться во впадине домена CH3 второй субъединицы, и аминокислотный остаток в домене CH3 второй субъединицы домена Fc заменяется аминокислотным остатком, имеющим меньший объем боковой цепи, тем самым образуя впадину в домене CH3 второй субъединицы, внутри которой может расположиться выступ домена CH3 первой субъединицы. В другом варианте осуществления настоящего изобретения домен Fc содержит одно или несколько аминокислотных замещений, которые снижают связывание с рецептором Fc и/или эффекторную функцию. Это означает, что связывание с рецептором Fc может быть уменьшено, или может быть уменьшена эффекторная функция, или могут быть уменьшены связывание с рецептором Fc и эффекторная функция.

В другом объекте настоящего изобретения предусматривают один или несколько выделенных полинуклеотидов, кодирующих антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, согласно описанию в настоящем изобретении. В другом объекте настоящего изобретения предусматривают один или несколько векторов, в частности вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид (полинуклеотиды) по настоящему изобретению. В другом объекте настоящего изобретения предусматривают клетку-хозяина, содержащую полинуклеотид (полинуклеотиды) по настоящему изобретению или вектор (векторы) по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин является эукариотической клеткой, особенно клеткой млекопитающего.

В другом объекте настоящего изобретения предусматривают способ получения антитела, которое связывается с GPRC5D, включающий стадии: а) культивирования клетки-хозяина согласно описанию настоящего изобретения в условиях, подходящих для экспрессии антитела, и б) необязательно выделения антитела. В другом объекте настоящего изобретения предусматривают антитело, которое связывается с GPRC5D, полученное способом, описанным в настоящем изобретении. Другой объект настоящего изобретения относится к фармацевтической композиции, включающей антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, описанную в настоящем изобретении, и фармацевтически приемлемый носитель. Другой объект настоящего изобретения относится к антителу, или биспецифической антигенсвязывающей молекуле, описанной в настоящем изобретении, или фармацевтической композиции, описанной в настоящем изобретении, для применения в качестве лекарственного средства. Другой объект настоящего изобретения относится к антителу, или биспецифической антигенсвязывающей молекуле, описанной в настоящем изобретении, или фармацевтической композиции, описанной в настоящем изобретении, для применения в лечении заболевания. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения заболеванием является рак, особенно множественная миелома. В другом варианте осуществления настоящего изобретения заболевание является аутоиммунным заболеванием, например, системной красной волчанкой и/или ревматоидным артритом.

Другой объект настоящего изобретения относится к способу лечения заболевания, в частности рака, более конкретно множественной миеломы, у индивидуума, включающему введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества композиции, содержащей антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по описанию настоящего изобретения в фармацевтически приемлемой форме. В другом варианте заболевание является аутоиммунным заболеванием, например, системной красной волчанкой и/или ревматоидным артритом. В каком-либо из указанных выше вариантов осуществления настоящего изобретения индивидуум предпочтительно является млекопитающим, в частности человеком.

Краткое описание фигур

Фиг. 1А-Э. Примеры конфигураций биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению. (Фиг. 1А, фиг. 2Г) Строение молекулы «1+1CrossMab». (Фиг. 1Б, фиг. 1Д) Строение молекулы «2+1 IgG Crossfab» с альтернативным расположения компонентов Crossfab и Fab («инвертированное»). (Фиг. 1В, фиг. 1Е) Строение молекулы «2+1 IgG Crossfab». (Фиг. 1Ж, фиг. 1Л) Строение молекулы «1+1 IgG Crossfab» с альтернативным расположения компонентов Crossfab и Fab («инвертированное»). (Фиг. 1З, фиг. 1М) Строение молекулы «1+1 IgG Crossfab». (Фиг. 1И, фиг. 1Н) Строение молекулы «2+1 IgG Crossfab» с двумя CrossFab. (Фиг. 1К, фиг. 10) Строение молекулы «2+1 IgG Crossfab» с двумя CrossFab и альтернативным расположения компонентов Crossfab и Fab («инвертированное»). (Фиг. 1П, фиг. 1У) Строение молекулы «Fab-Crossfab». (Фиг. 1P, фиг. 1Ф) Строение молекулы «Crossfab-Fab». (Фиг. 1C, фиг. 1X) Строение молекулы «(Fab)₂-Crossfab». (Фиг. 1T, фиг. 1Ц) Строение молекулы «Crossfab-Fab₂». (Фиг. 1Ч, фиг. 1Щ) Строение молекулы «Fab-(Crossfab)₂». (Фиг. 1Ш, фиг. 1Э) Строение молекулы «(Crossfab)₂-Fab». Черная точка: необязательная модификация в домене Fc, способствующая гетеродимеризации. ++, --: аминокислоты противоположных зарядов, необязательно интродуцированные в СН1 и CL домены. Молекулы Crossfab показаны включающими обмен областей VH и VL, но в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, когда в домены СН1 и CL не интродуцируют модификации заряда, в другом варианте могут включать обмен доменами СН1 и CL.

Фиг. 2. Анализ генной экспрессии опухолевых мишеней на плазматических клетках и В-клетках методом RNAseq.

Фиг. 3. Примеры конфигураций 5Е11-биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению. Черная точка:

необязательная модификация в домене Fc, способствующая гетеродимеризации. ++, -: аминокислоты противоположных зарядов, необязательно интродуцированные в СН1 и CL домены.

Фиг. 4А-В. Анализ связывания биспецифических антигенсвязывающих молекул 5F11-TCB (фиг. 4А) и 5Е11-ТСВ (фиг. 4Б) и контрольного антитела ЕТ150-5-ТСВ (фиг. 4 В) с линиями клеток множественной миеломы (MM) AMO-1, L636, NCI-H929, RPMI-8226, ОРМ-2 и WSU-DLCL2.

Фиг. 5А-Д. Анализ GPRC5D-TCB опосредованной цитотоксичности Т-клеток на линиях клеток множественной миеломы АМО-1 (фиг. 5А), NCI-H929 (фиг. 5Б), RPMI-8226 (фиг. 5 В) и L363 (фиг. 5Г). Контрольной линией клеток является WSU-DL CL2 (фиг. 5Д). Исследуемые молекулы: 5Е11-ТСВ, 5F11-TCB. Контрольные молекулы: DP47-TCB (ненацеленные) и ЕТ150-5-ТСВ.

Фиг. 6. Анализ GPRC5D-TCB активированного взаимодействия Т-клеток с линиями клеток множественной миеломы NCI-H929 и линией клеток отрицательного контроля WSU-DLCL2, повышающего регуляцию CD25 и CD69.

Фиг. 7А-К. Анализ GPRC5D-TCB активированного взаимодействия Т-клеток с множественной миеломой, повышающего регуляцию CD25 в линиях клеток АМО-1 (фиг. 7А), NCI-H929 (фиг. 7Б), RPMI-8226 (фиг. 7В), L363 (фиг. 7Г) и WSU-DLCL2 (фиг. 7Д), и повышающего регуляцию CD69 повышающего регуляцию АМО-1 (фиг. 7Е), NCI-H929 (Fig. 7Ж), RPMI-8226 (фиг. 73), L363 (фиг. 7И) и WSU-DLCL2 (фиг. 7К).

Фиг. 8А-Б. Визуализация локализации и интернализации антитела методом флуоресцентной конфокальной микроскопии (фиг. 8Б).

Фиг. 9. Связывание различных анти-GPRC5D антител с GPRC5D человека, макака-крабоеда и мыши, установленное методом ELISA с использованием стабильно трансфецированных клонов СНО, экспрессирующих GPRC5D человека (клон 12), GPRC5D макака-крабоеда (клон 13), GPRC5D мыши (клон 4) или GPRC5A человека (клон 30).

Фиг. 10А-Ж. Опосредованный Т-клетками лизис различных линий клеток при множественной миеломе (ММ), индуцированных разными GPRC5D- или ВСМА-нацеленными биспецифическими молекулами Т-клеток на протяжении 20 ч совместного инкубирования (Е:Т=10:1, пан-Т-клетки человека). Показан результат по двум повторам с учетом среднеквадратичного отклонения (SD).

Фиг. 11А-Е. Активация Т-клеток, индуцированная разными GPRC5D- или ВСМА-нацеленными биспецифическими молекулами Т-клеток (5Е11-ТСВ на фиг. 11А; 5F11-TCB на фиг. 11Б; 10В10-ТСВ на фиг. 11В; ВСМА-ТСВ на фиг. 11Г; ВСМА-ТСВ на фиг. 11Д; DP47-TCB на фиг. 11Е) на протяжении 20 ч совместного инкубирования аллогенных пан-Т-клеток человека и необработанных клеток костного мозга от здоровых доноров (Е:Т=10:1, пан-Т-клетки человека). Изображены точечные диаграммы FACS от одного репрезентативного донора, показывающие повышающую регуляцию маркера активации CD69 на CD4 (верхний ряд) или CD8 Т-клетках (нижний ряд) в виде процента положительных клеток среди всех CD4 соответствующих CD8 Т-клеток.

Фиг. 12А-Б. Активация Т-клеток, индуцированная различными GPRC5D-или ВСМА-нацеленными биспецифическими молекулами Т-клеток на протяжении 20 ч совместного инкубирования аллогенных пан-Т-клеток человека и необработанных клеток костного мозга от здоровых доноров (Е:Т=10:1, пан-Т-клетки человека). Изображена сумма данных по всем четырем исследованным донорам, демонстрирующих повышение регуляции маркера активации CD69 на CD8 Т-клетках при выбранных фиксированных дозах или 50 нМ ТСВ (фиг. 12А), или 5 нМ (фиг. 12Б).

Фиг. 13А-Г. Эффективность in vivo, индуцированная различными нацеленными на GPRC5D биспецифическими молекулами Т-клеток (5F11-TCB на фиг. 13А; ВСМА-ТСВ на фиг. 13Б; В72-ТСВ на фиг. 13В; растворитель на фиг. 13Г), которая следует из кинетики роста опухоли на протяжении времени на модели гуманизированных мышей NSG, которым были привиты опухолевые клетки NCI-H929. На графике изображены паутинные диаграммы, каждая линия которых относится к отдельной мыши.

Фиг. 14А-Г. Эффективность in vivo, индуцированная различными нацеленными на GPRC5D биспецифическими молекулами Т-клеток (5F11-TCB на фиг. 14А; 5Е11-ТСВ на фиг. 14Б; В72-ТСВ на фиг. 14В; растворитель на фиг. 14Г), которая следует из кинетики роста опухоли на протяжении времени на модели гуманизированных мышей NSG, которым были привиты опухолевые клетки ОРМ-2. На графике изображены паутинные диаграммы, каждая линия которых относится к отдельной мыши.

Фиг. 15А-Б. PGLALA-CAR-J активация примерно через 16 ч инкубирования, определенная по люминесценции. Люминесценция индуцируется при одновременном связывании GPRC5D IgGs (5F11-IgG на фиг. 15А; 5E11-IgG на фиг. 15Б) с GPRC50-экспрессирующей линией клеток множественной миеломы L-363 и PGLALA-модифицированного домена Fc с репортерными клетками Jurkat-NFAT, которые были генетически сконструированы для экспрессии TCR-направленной против мутации PGLALA в части Fc молекул IgG. Показан результат по двум повторам с учетом среднеквадратичного отклонения (SD).

Подробное описание изобретения

Определения

В настоящем изобретения понятия используются в том смысле, который обычно принят в данной области, если ниже не указано иное.

В контексте настоящего изобретения понятие «антигенсвязывающая молекула» относится в самом широком смысле к молекуле, которая специфически связывает антигенный детерминант. Примерами антигенсвязывающих молекул являются иммуноглобулины и их производные, например, фрагменты.

Термин «биспецифическая» означает, что антигенсвязывающая молекула способна специфически связываться по меньшей мере с двумя различными антигенными детерминантами. Обычно биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит два антигенсвязывающих сайта, каждый из которых специфичен для разных антигенных детерминант. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула способна одновременно связывать два антигенных детерминанта, в частности, два антигенных детерминанта, экспрессируемых в двух разных клетках.

В контексте настоящего изобретения понятие «валентный» означает наличие определенного количества антигенсвязывающих сайтов в антигенсвязывающей молекуле. По существу, понятие «моновалентное связывание с антигеном» означает присутствие одного (и не более одного) сайта связывания антигена, специфичного для антигена, в антигенсвязывающей молекуле.

«Сайт связывания антигена» относится к сайту, т.е. одному или нескольким аминокислотным остаткам антигенсвязывающей молекулы, которые обеспечивают взаимодействие с антигеном. Например, антигенсвязывающий сайт антитела содержит аминокислотные остатки из областей, определяющих комплементарность (CDR). Молекула нативного иммуноглобулина обычно имеет два сайта связывания антигена, молекула Fab обычно имеет один сайт связывания антигена.

В контексте настоящего изобретения понятие «антигенсвязывающий фрагмент» относится к молекуле полипептида, которая специфически связывается с антигенным детерминантом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий фрагмент способен направлять объект, к которому он присоединен (например, второй антигенсвязывающий фрагмент), к целевому сайту, например, к определенному типу опухолевой клетки, несущей антигенный детерминант. В другом варианте осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий фрагмент способен активировать передачу сигналов через свой целевой антиген, например комплексный антиген рецептора Т-клеток. Антигенсвязывающие части включают антитела и их фрагменты, о чем написано ниже. Конкретные антигенсвязывающие фрагменты включают антигенсвязывающий домен антитела, содержащий вариабельную область тяжелой цепи антитела и вариабельную область легкой цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающие фрагменты могут включать константные области антитела, о чем известно в данной области и что описано ниже. Применимые константные области тяжелой цепи относятся к какому-либо из пяти изотипов: α, δ, ε, γ или μ.

Применимые константные области легкой цепи относятся к какому-либо из двух изотипов: κ и λ.

В контексте настоящего изобретения понятие «антигенный детерминант» является синонимом «антигена» и «эпитопа» и относится к сайту (например, непрерывному отрезку аминокислот или конформационной конфигурации, состоящей из разных участков несмежных аминокислот) на макромолекуле полипептида, с которым связывается антигенсвязывающий фрагмент, образуя комплекс антигенсвязывающий фрагмент-антиген. Полезные антигенные детерминанты можно найти, например, на поверхности опухолевых клеток, на поверхности инфицированных вирусом клеток, на поверхностях других больных клеток, на поверхности иммунных клеток, в свободном состоянии в сыворотке крови и/или во внеклеточном матриксе (extracellular matrix, ECM). Белки, называемые в настоящем изобретении антигенами (например, GPRC5D, CD3), могут быть какой-либо нативной формой белков от какого-либо позвоночного животного, в том числе полученные из млекопитающих, таких как приматы (например, люди, или другие приматы помимо людей, например, макаки крабоеды) и грызуны (например, мыши и крысы), если не указано иное. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антигеном является белок человека. Если в настоящем изобретении дана ссылка на определенный белок, данное понятие охватывает неизмененный белок «полной длины», а также какую-либо форму белка, которая является результатом процессинга в клетке. Понятие также включает встречающиеся в природе варианты белка, например варианты сплайсинга или аллельные варианты. Примером белка человека, используемого в качестве антигена, является CD3, особенно эпсилон-субъединица CD3 (см. UniProt no. P07766 (версия 185), NCBI RefSeq no. NP_000724.1, SEQ ID NO: 40 последовательности человека; или UniProt no. Q95LI5 (версия 69), NCBI GenBank no. BAB71849.1, SEQ ID NO: 41 для последовательности макаки крабоеда [Масаса fascicularis]), или GPRC5D (см. UniProt no. Q9NZD1 (версия 115); NCBI RefSeq no. NP_061124.1, SEQ ID NO: 45 для последовательности человека). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело или биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению связывается с эпитопом CD3 или GPRC5D, который консервативен среди антигенов CD3 или GPRC5D различных видов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело или биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению связывается с GPRC5D человека.

Понятие «специфическое связывание» означает, что связывание является селективным для антигена и может отличаться от нежелательных или неспецифических взаимодействий. Способность антигенсвязывающего фрагмента связываться со специфической антигенной детерминантой может быть измерена либо с помощью иммуноферментного анализа (ELISA), либо с помощью других методов, известных специалистам в данной области, например метода поверхностного плазмонного резонанса (surface plasmon resonance, SPR) (например, на приборе BIAcore) (Liljeblad с соавт., Glyco J 17, 2000, 323-329) и традиционных методов связывания (Heeley, Endocr Res 28, 2002, 217-229). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения степень связывания антигенсвязывающего фрагмента с неродственным белком примерно составляет менее 10% от связывания антигенсвязывающего фрагмента с антигеном, например, по результатам измерения методом SPR. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с антигеном, или антигенсвязывающая молекула, содержащая этот антигенсвязывающий фрагмент, имеет константу диссоциации (K_D) ≤ 1 μМ, ≤ 100 нМ, ≤ 10 нМ, ≤ 1 нМ, ≤ 0,1 нМ, ≤ 0,01 нМ или ≤ 0,001 нМ (например, 10^-8 М или менее, например, от 10^-8 М до 10^-13 М, например, от 10^-9 М до 10^-13 М).

Понятие «аффинность (сродство)» относится к силе общей суммы нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, рецептором) и ее партнером по связыванию (например, лигандом). Если не указано иное, в контексте настоящего изобретения понятие «аффинность связывания (связывающее сродство)» относится к внутренней аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между представляющими связывающей пары (например, антигенсвязывающим фрагментом и антигеном или рецептором и его лигандом). Сродство молекулы Х к ее партнеру Y обычно можно выразить константой диссоциации (K_D), которая является отношением констант скорости диссоциации и ассоциации (k_off и k_on, соответственно). Таким образом, эквивалентные аффинности могут включать разные константы скорости, пока соотношение констант скорости остается неизменным. Аффинность можно измерить хорошо зарекомендовавшими себя методами, известными в данной области, включая описанные в настоящем изобретении. Один из методов измерения аффинности - это поверхностный плазмонный резонанс (SPR).

Понятие «пониженное связывание», например, пониженное связывание с рецептором Fc, означает снижение аффинности в отношении соответствующего взаимодействия, измеренного, например, с помощью SPR. Стоит уточнить, что это понятие включает также снижение аффинности до нуля (или ниже предела обнаружения аналитического метода), то есть полное прекращение взаимодействия. Напротив, «повышенное связывание» относится к увеличению аффинности связывания для соответствующего взаимодействия.

В контексте настоящего изобретения понятие «активирующий Т-клеточный антиген» относится к антигенному детерминанту, экспрессируемому на поверхности Т-лимфоцита, в частности цитотоксического Т-лимфоцита, который способен индуцировать активацию Т-клеток при взаимодействии с антигенсвязывающей молекулой. В частности, взаимодействие антигенсвязывающей молекулы с активирующим Т-клеточным антигеном может индуцировать активацию Т-клеток путем индукции сигнального каскада комплекса рецепторов Т-клеток. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения активирующим Т-клеточным антигеном является CD3, в частности субъединица эпсилон CD3 (см. UniProt no. P07766 (версия 144), NCBI RefSeq no. NP_000724.1, SEQ ID NO: 40 для последовательности человека; или UniProt no. Q95LI5 (версия 49), NCBI GenBank no. BAB71849.1, SEQ ID NO: 41 последовательности макака крабоеда [Macaca fascicularis]).

«Активация Т-клеток» в контексте настоящего изобретения относится к одному или нескольким клеточным ответам Т-лимфоцитов, в частности цитотоксических Т-лимфоцитов, выбранным из: пролиферации, дифференцировки, секреции цитокинов, высвобождения цитотоксических эффекторных молекул, цитотоксической активности и экспрессии маркеров активации. Подходящие анализы для измерения активации Т-клеток известны в данной области и описаны в настоящем изобретении.

В контексте настоящего изобретения понятие «антиген клетки-мишени» относится к антигенному детерминанту на поверхности клетки-мишени, например, клетки в опухоли, например, раковой клетки или клетки стромы опухоли. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антигеном клетки-мишени является GPRC5D, в частности GPRC5D человека согласно SEQ ID NO: 45.

В настоящем изобретении понятия «первый», «второй» и «третий» в отношении молекул Fab и др. используют, чтобы было удобно разделить, когда имеется более одного фрагмента каждого типа. Использование этих терминов не предназначено для определения определенного порядка или ориентации биспецифической антигенсвязывающей молекулы, если это явно не указано.

Понятие «слитый» означает, что компоненты (например, молекула Fab и субъединица домена Fc) связаны пептидными связями, либо непосредственно, либо через один или несколько пептидных линкеров.

Понятие «молекула Fab» относится к белку, состоящему из VH и СН1 домена тяжелой цепи («Fab тяжелой цепи») и VL и CL домена легкой цепи («Fab легкой цепи») иммуноглобулина.

Под «кроссоверной» молекулой Fab (также называемой «Crossfab») подразумевают молекулу Fab, в которой вариабельные домены или константные домены тяжелой и легкой цепи Fab обмениваются (т.е. заменяют друг друга), то есть молекула кроссоверного Fab включает пептидную цепь, состоящую из вариабельного домена легкой цепи VL и константного домена тяжелой цепи 1 СН1 (VL-CH1, в направлении от N- к С-концу), и пептидную цепь, состоящую из вариабельного домена тяжелой цепи VH и константного домена легкой цепи CL (VH-CL, в направлении от N- к С-концу). Для уточнения, в молекуле кроссовера Fab, в которой вариабельные домены легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены, пептидную цепь, содержащую константный домен 1 тяжелой цепи СН1, упоминают в данном документе как «тяжелая цепь» (кроссовер) Fab молекулы. Напротив, в молекуле кроссоверного Fab, в которой константные домены легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены, пептидная цепь, содержащая вариабельный домен VH тяжелой цепи, упоминается в настоящем изобретении как «тяжелая цепь» молекулы (кроссоверного) Fab.

Напротив, под «обычной» молекулой Fab подразумевают молекулу Fab в ее естественном формате, т.е. содержащую тяжелую цепь, состоящую из вариабельного и константного доменов тяжелой цепи (VH-CH1, в направлении от N- к С-концу), и легкую цепь, состоящую из вариабельного и константного доменов легкой цепи (VL-CL, в направлении от N- к С-концу).

Понятие «молекула иммуноглобулина» относится к белку, имеющему структуру природного антитела. Например, иммуноглобулины класса IgG представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины размером примерно 150000 дальтон, состоящие из двух легких цепей и двух тяжелых цепей, связанных дисульфидной связью. От N- к С-концу каждая тяжелая цепь имеет вариабельный домен (VH), также называемый вариабельным доменом тяжелой цепи или вариабельной областью тяжелой цепи, за которым следуют три константных домена (СН1, СН2 и CH3), также называемые константной областью тяжелой цепи. Аналогичным образом, от N- к С-концу каждая легкая цепь имеет вариабельный домен (VL), также называемый вариабельным доменом легкой цепи или вариабельной областью легкой цепи, за которыми следует константный домен легкой цепи (CL), также называемый константой областью легкой цепи. Тяжелая цепь иммуноглобулина может быть отнесена к одному из пяти типов, называемых α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG) или μ (IgM), некоторые из которых могут быть дополнительно разделены на подтипы, например, γ₁ (IgG₁), γ₂ (IgG₂), γ₃ (IgG₃), γ₄ (IgG₄), α₁ (IgA₁) и α₂ (IgA₂). Легкая цепь иммуноглобулина может быть отнесена к одному из двух типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основе аминокислотной последовательности ее константного домена. Иммуноглобулин фактически состоит из двух молекул Fab и домена Fc, связанных через шарнирную область иммуноглобулина.

Понятие «антитело» в настоящем изобретении используют в самом широком смысле, и оно охватывает различные структуры антител, включая, но, не ограничиваясь ими, моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, если они проявляют требуемую антигенсвязывающую активность.

Понятие «моноклональное антитело» в контексте настоящего изобретения относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, входящие в популяцию, идентичны и/или связываются с одним и тем же эпитопом, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих природные мутации или возникающих при получении препарата моноклонального антитела, такие варианты обычно присутствуют в незначительных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело в препарате моноклонального антитела направлено против одной детерминанты на антигене. Таким образом, определение «моноклональное» указывает на свойство антитела как полученного из, по существу, гомогенной популяции антител, и его не следует толковать как требующего получения антитела каким-либо конкретным методом. Например, моноклональные антитела, которые могут применяться в соответствии с настоящим изобретением, могут быть получены различными методами, включая, но ими не ограничиваясь, гибридомный метод, методы рекомбинантной ДНК, методы фагового дисплея и методы с использованием трансгенных животных, содержащих все или часть локусов иммуноглобулина человека, такие методы и другие допустимые методы получения моноклональных антител, описаны в настоящем изобретении.

«Выделенное» антитело - это антитело, которое было отделено от компонентов его естественного окружения, то есть антитело, не находящееся в своей естественной среде. Никакого особого уровня очистки не требуется. Например, выделенное антитело можно удалить из его нативной или естественной среды. Рекомбинантно продуцируемые антитела, экспрессируемые в клетках-хозяевах и выделенные для целей настоящего изобретения, являются нативными или рекомбинантными антителами, которые были выделены, фракционированы, частично или в высокой степени очищены каким-либо подходящим методом. Таким образом выделяют антитела и биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело очищают до чистоты более 95% или 99%, что определяют, например, с помощью методов электрофореза (например, SDS-PAGE, изоэлектрического фокусирования (isoelectric focusing, IEF), капиллярного электрофореза) или хроматографии (например, ионного обмена или обращенно-фазовой ВЭЖХ). Для обзора методов оценки чистоты антител см., например, Flatman с соавт., J. Chromatogr. В 848, 2007, 79-87.

Понятия «антитело полной длины», «интактное антитело» и «целое антитело» используют в настоящем изобретении взаимозаменяемо для обозначения антитела, имеющего структуру, по существу, аналогичную структуре нативного антитела.

Понятие «фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая включает часть интактного антитела, связывающую антиген, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают, но ими не ограничиваются, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, диатела, линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител (например, scFv) и однодоменные антитела. Обзор определенных фрагментов антител см. в публикации Hudson с соавт., Nat Med 9, 2003, 129-134. Обзор фрагментов scFv, см., например, Pluckthun в кн.: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, т.113, 1994, под ред. Rosenburg и Moore, изд-во Springer-Verlag, Нью-Йорк, 269-315; WO 93/16185; US 5571894, US 5587458. Обсуждение фрагментов Fab и F(ab')2, содержащих остатки эпитопа связывания рецептора реутилизации и имеющих увеличенный период полужизни in vivo, см. в US 5869046. Диатела являются фрагментами антител с двумя сайтами связывания антигена, которые могут быть бивалентными или биспецифическими. См., например, ЕР 404097; WO 1993/01161; Hudson с соавт., Nat Med 9, 2003, 129-134; Hollinger с соавт., Proc Natl Acad Sci USA 90, 1993, 6444-6448. Триатела и тетратела также описаны в публикации Hudson с соавт., Nat Med 9, 2003, 129-134. Однодоменные антитела являются фрагментами антител, содержащими весь или часть вариабельного домена тяжелой цепи или весь или часть вариабельного домена легкой цепи антитела. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения однодоменное антитело является однодоменным антителом человека (см., например, US 6248516 В1). Фрагменты антител могут быть получены различными методами, включая, но ими не ограничиваясь, протеолитическое расщепление интактного антитела, а также выработку рекомбинантными клетками-хозяевами (например, Е. coli или фаг), согласно описанному в настоящем изобретении.

Понятие «антигенсвязывающий домен» относится к части антитела, которая включает область, специфически связывающуюся и комплементарную части или всему антигену. Антигенсвязывающий домен может быть обеспечен, например, одним или несколькими вариабельными доменами антитела (также называемыми вариабельными областями антитела). В частности, антигенсвязывающий домен содержит вариабельный домен легкой цепи антитела (VL) и вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH).

Понятие «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела обычно имеют сходные структуры, причем каждый домен включает четыре консервативных каркасных области (FR) и три гипервариабельные области (HVR). См., например, Kindt с соавт., Kuby Immunology, 2007, 6^е изд., изд-во W.H. Freeman and Co., с. 91. Одного домена VH или VL может быть достаточно для придания антигенсвязывающей специфичности. В настоящем изобретении применительно к последовательностям вариабельных областей понятие «нумерация по Kabat» относится к системе нумерации, разработанной Kabat с соавт., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991, 5e изд., изд-во Public Health Service, Национальные институты здоровья, Бетезда, Мэриленд.

В настоящем изобретении положения аминокислот всех константных областей и доменов тяжелой и легкой цепи пронумерованы в соответствии с системой нумерации Kabat, описанной в работе Kabat с соавт., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991, 5e изд., изд-во Public Health Service, Национальные институты здоровья, Бетезда, Мэриленд, называемой в настоящем изобретении «нумерацией по Kabat» или «нумерацией Kabat». В частности, систему нумерации Kabat (см. страницы 647-660 в работе Kabat с соавт., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991, 5e изд., изд-во Public Health Service, Национальные институты здоровья, Бетезда, Мэриленд) используют для константного домена легкой цепи CL изотипов каппа и лямбда и систему нумерации Kabat индекса EU (см. страницы 661-723) применяют для константных доменов тяжелой цепи (СН1, шарнир, СН2 и СН3), что в настоящем изобретении в данном случае дополнительно поясняют ссылкой на «нумерацию согласно Kabat индексу EU».

Понятие «гипервариабельная область» или «HVR» в контексте настоящего изобретения относится к каждой из областей вариабельного домена антитела, имеющей гипервариабельную последовательность («область, определяющую комплементарность» или «CDR»; CDR область/домен тяжелой цепи обозначают, например, HCDR1, HCDR2 и HCDR3; CDR область/домен легкой цепи обозначают, например, LCDR1, LCDR2 и LCDR3) и/или формируют структурно выраженные петли («гипервариабельные петли») и/или содержат контактирующие с антигеном остатки («антигенные контакты»). Обычно антитела включают шесть HVR: три в VH (H1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3).

Примерами HVR в настоящем изобретении являются:

(а) гипервариабельные петли, возникающие на аминокислотных остатках 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) (Chothia, Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, 901-917);

(б) области CDR, возникающие на аминокислотных остатках 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (Н2) и 95-102 (Н3) (Kabat с соавт., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991, 5e изд., изд-во Public Health Service, Национальные институты здоровья, Бетезда, Мэриленд);

(в) антигенные контакты, возникающие на аминокислотных остатках 27 с-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (Н2), and 93-101 (Н3) (MacCallum с соавт. J. Mol. Biol. 262, 1996, 732-745); и

(г) комбинации (а), (б) и/или (в), включая аминокислотные остатки HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (Н2), 93-102 (Н3) и 94-102 (Н3).

Если не указано иное, остатки HVR и другие остатки в вариабельном домене (например, остатки FR) пронумерованы здесь в соответствии с публикацией Kabat с соавт., ссылка на которую указана выше.

«Каркасная область» или «FR (Framework)» относится к остаткам вариабельного домена, отличным от остатков гипервариабельной области (HVR). FR вариабельного домена обычно состоит из четырех доменов FR: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR обычно появляются в следующем порядке в VH (или VL): FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

Понятие «гуманизированное» антитело относится к химерному антителу, содержащему аминокислотные остатки из HVR, не относящихся к человеку, и аминокислотные остатки из FR от человека. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения гуманизированное антитело может включать практически все из по меньшей мере одного, обычно двух вариабельных доменов, в которых все или практически все HVR (например, CDR) соответствуют тем HVR, которые не относятся к антителу человеку, и все или практически все FR, которые соответствуют FR из антитела человека. В настоящем изобретении такие вариабельные домены называют «гуманизированными вариабельными областями». Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, полученной от антитела человека. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения некоторые остатки FR в гуманизированном антителе заменены соответствующими остатками антитела, не являющегося антителом человека (например, антитела, из которого получены остатки HVR), например, для восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела. «Гуманизированная форма» антитела, например «антитела не от человека», относится к антителу, которое подверглось гуманизации. Другими формами «гуманизированных антител», охватываемых настоящим изобретением, являются те, в которых константная область была дополнительно модифицирована или изменена по сравнению с константной областью исходного антитела для придания свойств согласно настоящему изобретению, особенно в отношении связывания C1q и/или рецептора Fc (FcR).

«Антитело человека» представляет собой антитело, которое обладает аминокислотной последовательностью, которая соответствует аминокислотной последовательности антитела, продуцируемого человеком или клетками человека, или полученного из другого источника, не связанного с человеком, который использует репертуар человеческих антител или другие последовательности, кодирующие антитела человека. Это определение человеческого антитела человека специально исключает гуманизированное антитело, содержащее антигенсвязывающие остатки, не происходящие от человека. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело человека происходит от трансгенного млекопитающего, а не от человека, например, от мыши, крысы или кролика. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело человека происходит от линии клеток гибридомы. Антитела или фрагменты антител, выделенные из библиотек антител человека, также считают в настоящем изобретении антителами человека или фрагментами антител человека.

«Класс» антитела или иммуноглобулина обусловлен типом константного домена или константной области, которой обладает его тяжелая цепь. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. Константные домены тяжелой цепи, которые соответствуют разным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и μ, соответственно.

Понятие «домен Fc» или «область Fc» в настоящем изобретении используют для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Понятие охватывает нативные последовательности областей Fc и вариантов областей Fc. Хотя границы области Fc тяжелой цепи IgG могут незначительно варьировать, область Fc тяжелой цепи IgG человека обычно определяют как простирающуюся от Cys226 или от Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако антитела, вырабатываемые клетками-хозяевами, могут подвергаться посттрансляционному отщеплению одной или нескольких, в частности, одной или двух аминокислот от С-конца тяжелой цепи. Следовательно, антитело, вырабатываемое клеткой-хозяином путем экспрессии определенной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полноразмерную тяжелую цепь, может включать полноразмерную тяжелую цепь или может включать расщепленный вариант полноразмерной тяжелой цепи (также называемый в настоящем изобретении «расщепленный вариант тяжелой цепи»). Возможно, что двумя последними С-концевыми аминокислотами тяжелой цепи являются глицин (G446) и лизин (K447) (нумерация в соответствии с индексом Kabat EU). Таким образом, С-концевой лизин (Lys447) или С-концевой глицин (Gly446) и лизин (K447) области Fc могут присутствовать или отсутствовать.

Аминокислотные последовательности тяжелых цепей, включая домены Fc (или субъединицу домена Fc согласно настоящему изобретению), обозначают в настоящем изобретении без С-концевого дипептида глицин-лизин, если не указано иное. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения тяжелая цепь, включающая субъединицу домена Fc согласно настоящему изобретению, содержащаяся в антителе или биспецифической антигенсвязывающей молекуле по настоящему изобретению, включает дополнительный С-концевой дипептид глицин-лизин (G446 и K447, нумерация по EU индексу Kabat). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения цепь, включающая субъединицу домена Fc согласно настоящему изобретению, содержащаяся в антителе или биспецифической антигенсвязывающей молекуле по настоящему изобретению, включает дополнительный С-концевой остаток глицина (G446, нумерация по EU индексу Kabat). Композиции по настоящему изобретению, например, описанные в настоящем изобретении фармацевтические композиции, содержат популяцию антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению. Популяция антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул может включать молекулы, имеющие полноразмерную тяжелую цепь, и молекулы, имеющие расщепленный вариант тяжелой цепи. Популяция антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул может состоять из смеси молекул, имеющих полноразмерную тяжелую цепь, и молекул, имеющих расщепленный вариант тяжелой цепи, где по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул имеют расщепленный вариант тяжелой цепи. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиция, содержащая популяцию антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, включает антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, содержащую тяжелую цепь, включающую субъединицу домена Fc по настоящему изобретению с дополнительным С-концевым дипептидом глицин-лизин (G446 и K447, нумерация по EU индексу Kabat). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения композиция, содержащая популяцию антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению, включает антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, содержащую тяжелую цепь, включающую субъединицу домена Fc по настоящему изобретению с дополнительным С-концевым остатком глицина (G446, нумерация по EU индексу Kabat). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такая композиция включает популяцию антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул, состоящую из молекул, содержащих тяжелую цепь, включая субъединицу домена Fc согласно настоящему изобретению; молекулы, содержащие тяжелую цепь, включающую субъединицу домена Fc согласно настоящему изобретению с дополнительным С-концевым остатком глицина (G446, нумерация по EU индексу Kabat); и молекулы, содержащие тяжелую цепь, включающую субъединицу домена Fc согласно настоящему изобретению с дополнительным С-концевым дипептидом глицин-лизин (G446 и K447, нумерация по EU индексу Kabat). Если в настоящем изобретении не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в области Fc или константной области соответствует системе нумерации EU, также называемой индексом EU и описанной в Kabat с соавт., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 1991, 5e изд., изд-во Public Health Service, Национальные институты здоровья, Бетезда, Мэриленд (также см. выше). Понятие «субъединица» домена Fc в контексте настоящего изобретения относится к одному из двух полипептидов, образующих димерный домен Fc, т.е. полипептиду, содержащему константные С-концевые области тяжелой цепи иммуноглобулина, способные к стабильной самоассоциации. Например, субъединица домена Fc IgG включает константный домен IgG CH2 и константный домен IgG CH3.

Понятие «модификация, способствующая ассоциации первой и второй субъединиц домена Fc» означает манипуляцию с пептидным каркасом или посттрансляционные модификации субъединицы домена Fc, которые уменьшают или предотвращают ассоциацию полипептида, содержащего субъединицу домена Fc, с идентичным полипептидом с образованием гомодимера. Используемая в настоящем изобретении модификация, способствующая ассоциации, в частности, включает отдельные модификации, произведенные в каждой из двух субъединиц домена Fc, которые желательно ассоциировать (то есть первой и второй субъединиц домена Fc), причем модификации комплементарны друг другу, чтобы способствовать ассоциации двух субъединиц домена Fc. Например, ассоциация, способствующая модификации, может изменять структуру или заряд одной или обеих субъединиц домена Fc таким образом, чтобы сделать их ассоциацию стерически или электростатически благоприятной, соответственно. Таким образом, (гетеро)димеризация происходит между полипептидом, содержащим первую субъединицу домена Fc, и полипептидом, содержащим вторую субъединицу домена Fc, которые могут быть неидентичными в том смысле, что дополнительные компоненты слитые с каждой из субъединиц (например, антигенсвязывающие фрагменты), разные. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения модификация, способствующая ассоциации, включает аминокислотную мутацию в домене Fc, в частности аминокислотное замещение. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения модификация, способствующая ассоциации, включает отдельную аминокислотную мутацию, в частности аминокислотное замещение, в каждой из двух субъединиц домена Fc.

Понятие «эффекторные функции» относится к тем биологическим активностям, которые присущи области Fc антитела, которые варьируют в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: связывание C1q и комплемент-зависимую цитотоксичность (CDC), связывание с рецептором Fc, антитело-зависимую клеточно-опосредованную цитотоксичность (ADCC), антителозависимый клеточный фагоцитоз (ADCP), секрецию цитокинов, опосредованное иммунным комплексом поглощение антигена антиген-презентирующими клетками, пониженную регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, рецептора В-клеток) и активацию В-клеток.

В контексте настоящего описания понятие «сконструированный» означает какие-либо манипуляции с пептидным каркасом или посттрансляционные модификации природного или рекомбинантного полипептида или его фрагмента. Конструирование включает модификации аминокислотной последовательности, паттерна гликозилирования или группы боковой цепи отдельных аминокислот, а также комбинации этих подходов.

Понятие «аминокислотная мутация» в настоящем изобретении означает аминокислотные замещения, делеции, инсерции и модификации. Какая-либо комбинация замещения, делеции, инсерции и модификации может быть сделана для получения конечной конструкции при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми свойствами, например, уменьшенным связыванием с рецептором Fc или усиленной ассоциацией с другим пептидом. Делеции и инсерции в аминокислотных последовательностях включают делеции на амино- и/или карбокси-конце и инсерции аминокислот. Определенные аминокислотные мутации являются аминокислотными замещениями. С целью изменения, например, связывающих свойств области Fc, неконсервативные аминокислотные замещения, т.е. замена одной аминокислоты другой аминокислотой, имеющей другие структурные и/или химические свойства, являются особенно предпочтительными. Аминокислотные замены включают замену не встречающимися в природе аминокислотами или встречающимися в природе аминокислотными производными двадцати стандартных аминокислот (например, такими как 4-гидроксипролин, 3-метилгистидин, орнитин, гомосерин, 5-гидроксилизин). Аминокислотные мутации могут быть получены с использованием генетических или химических методов, хорошо известных в данной области. Генетические методы могут включать сайт-направленный мутагенез, ПЦР, синтез генов и т.п. Авторы предполагают, что методы изменения группы боковой цепи аминокислоты, отличные от генной инженерии, например, такие как химическая модификация, также могут быть полезными. В настоящем изобретении могут использоваться различные обозначения одной и той же аминокислотной мутации. Например, замена пролина в положении 329 домена Fc на глицин может быть обозначена как 329G, G329, G329, P329G или Pro329Gly.

«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» относительно последовательности эталонного полипептида определяют как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидата, которые идентичны аминокислотным остаткам в последовательности эталонного полипептида, после выравнивания последовательностей и введения пробелов, если необходимо, для достижения максимального процента идентичности последовательностей и без учета каких-либо консервативных замен как части идентичности последовательностей. Выравнивание для определения процентной идентичности аминокислотных последовательностей может быть достигнуто различными способами, которые известны специалистам в данной области, например, с использованием общедоступного компьютерного программного обеспечения, такого как BLAST, BLAST-2, Clustal W, Megalign (DNASTAR) программного обеспечения или пакета программ FASTA. Специалисты в данной области могут определить подходящие параметры для выравнивания последовательностей, включая какие-либо алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Однако для целей настоящего изобретения значения процент идентичности аминокислотной последовательности генерируется с использованием программы ggsearch пакета FASTA версии 36.3.8 с или более поздней с матрицей для сравнения BLOSUM50. Пакет программ FASTA, разработанный W.R. Pearson и D.J. Lipman, PNAS 85, 1988, 2444-2448; W.R. Pearson, Meth. Enzymol. 266, 1996, 227-258; Pearson с соавт., Genomics 46, 1997, 24-36, публично доступен на сайте:

http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml. В качестве альтернативы можно использовать общедоступный сервер: http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi, для сравнения последовательностей с помощью программы ggsearch (общий белок:белок; global protein: protein) и параметров по умолчанию (BLOSUM50; open: -10; ext: -2; Ktup=2) для обеспечения глобального, а не локального выравнивания. Степень идентичности аминокислот, выраженную в процентах, указывают в заглавии результатов выравнивания.

Понятие «полинуклеотид» относится к отдельной молекуле или конструкции нуклеиновой кислоты, например матричной РНК (мРНК), вирусной РНК или плазмидной ДНК (пДНК). Полинуклеотид может содержать обычную фосфодиэфирную связь или нетрадиционную связь (например, амидную связь, такую как найденная в пептидных нуклеиновых кислотах (peptide nucleic acid, PNA). Понятие «молекула нуклеиновой кислоты» относится к какому-либо одному или нескольким сегментам нуклеиновой кислоты, например ДНК или фрагментам РНК, присутствующим в полинуклеотиде.

Под «отдельной» молекулой нуклеиновой кислоты или полинуклеотидом подразумевают молекулу нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, которая была выделена из своего природного окружения. Например, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащийся в векторе, считается выделенным для целей настоящего изобретения. Дополнительные примеры выделенного полинуклеотида включают рекомбинантные полинуклеотиды, содержащиеся в гетерологичных клетках-хозяевах, или очищенные полинуклеотиды (частично или существенно) в растворе. Изолированный полинуклеотид включает молекулу полинуклеотида, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат молекулу полинуклеотида, но молекула полинуклеотида присутствует вне хромосомы или в таком месте хромосомы, которое отличается от естественного местоположения. Выделенные молекулы РНК включают транскрипты РНК in vivo или in vitro по настоящему изобретению, а также формы с положительной и отрицательной цепью и двухцепочечные формы. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты, согласно настоящему изобретению, дополнительно включают такие молекулы, полученные синтетически. Кроме того, полинуклеотид или нуклеиновая кислота может быть или может включать регуляторный элемент, например, промотор, сайт связывания рибосомы или терминатор транскрипции.

Понятие «выделенный полинуклеотид (или нуклеиновая кислота), кодирующий [например, антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению]» относится к одной или нескольким молекулам полинуклеотидов, кодирующим тяжелую и легкую цепи антитела (или их фрагменты), включая такую полинуклеотидную молекулу (молекулы) в одном векторе или в отдельных векторах, и такие молекулы (молекула) нуклеиновой кислоты присутствуют в одном или нескольких местах в клетке-хозяине.

Понятие «кассета экспрессии» относится к полинуклеотиду, полученному рекомбинантно или синтетически, с рядом определенных элементов нуклеиновых кислот, которые обеспечивают транскрипцию определенной нуклеиновой кислоты в клетке-мишени. Кассета рекомбинантной экспрессии может быть включена в плазмиду, хромосому, митохондриальную ДНК, пластидную ДНК, вирус или фрагмент нуклеиновой кислоты. Обычно рекомбинантная часть кассеты экспрессии вектора экспрессии включает, наряду с другими последовательностями, последовательность нуклеиновой кислоты, которая должна транскрибироваться, и промотор. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения кассета экспрессии содержит полинуклеотидные последовательности, которые кодируют антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению или их фрагменты.

Понятие «вектор» или «вектор экспрессии» относится к молекуле ДНК, которую используют для интродукции и направления экспрессии определенного гена, с которым она оперативно связана в клетке. Понятие включает вектор как самореплицирующуюся структуру нуклеиновой кислоты, а также вектор, включенный в геном клетки-хозяина, в которую он был интродуцирован. Вектор экспрессии по настоящему изобретению содержит кассету экспрессии. Векторы экспрессии допускают осуществление транскрипции больших количеств стабильной мРНК. Как только вектор экспрессии оказывается внутри клетки, молекула рибонуклеиновой кислоты или белок, кодируемый геном, продуцируется аппаратом клеточной транскрипции и/или трансляции. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вектор экспрессии по настоящему изобретению включает кассету экспрессии, которая содержит полинуклеотидные последовательности, кодирующие антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению или их фрагменты.

Понятия «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используют взаимозаменяемо и относят к клеткам, в которые была введена экзогенная нуклеиновая кислота, а также к потомству таких клеток. К клеткам-хозяевам относятся «трансформанты» и «трансформированные клетки», которые включают первичную трансформированную клетку и полученное от нее потомство, независимо от количества пассажей. Потомство может быть полностью не идентичным по содержанию нуклеиновой кислоты родительской клетке и может содержать мутации. К этому понятию в настоящем изобретении также относят последующие поколения мутантных клеток, которые обладают той же функцией или биологической активностью, что и первоначально выявленные или отобранные трансформированные клетки. Клетка-хозяин представляет собой клеточную систему какого-либо типа, которую можно использовать для выработки антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению. К клеткам-хозяевам относят культивируемые клетки, например культивированные клетки млекопитающих, такие как клетки НЕК, клетки СНО, клетки BHK, клетки NS0, клетки SP2/0, клетки миеломы YO, клетки миеломы мыши Р3Х63, клетки PER, клетки PER.C6 или клетки гибридомы, клетки дрожжей, клетки насекомых и растительные клетки, если называть лишь некоторые из них, но также и клетки, содержащиеся в трансгенных животных, трансгенных растениях или в культивируемых тканях растений или животных.

Понятие «активирующий рецептор Fc» относится к рецептору Fc, который после взаимодействия с доменом Fc антитела вызывает передачу сигналов, которые стимулируют несущую рецептор клетку к выполнению эффекторных функций. Активирующие рецепторы Fc человека включают FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32) и FcαRI (CD89).

Антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность (Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity, ADCC) является иммунным механизмом, ведущим к лизису иммунными эффекторными клетками клеток-мишеней, покрытых антителом. Клетки-мишени являются клетками, с которыми специфически связываются антитела или их производные, содержащие область Fc, обычно через ту часть белка, которая является N-концевой по отношению к области Fc. В контексте настоящего изобретения понятие «пониженная ADCC» означает уменьшение количества клеток-мишеней, которые лизируются в заданное время и при данной концентрации антитела в среде, окружающей клетки-мишени, по описанному выше механизму ADCC, и/или увеличение концентрации антитела в среде, окружающей клетки-мишени, необходимое для достижения лизиса заданного количества клеток-мишеней за заданное время по механизму ADCC. Понижение ADCC происходит относительно ADCC, опосредованной тем же антителом, вырабатываемым клетками-хозяевами того же типа, с использованием тех же стандартных методов получения, очистки, переработки и хранения (которые известны специалистам в данной области), но которые не были разработаны. Например, понижение ADCC, опосредованную антителом, содержащим в домене Fc аминокислотное замещение, которое понижает ADCC, относительно ADCC, опосредованного тем же антителом, без этого аминокислотного замещения в домене Fc. Соответствующие методы измерения ADCC известны в данной области (см., например, WO 2006/082515 или WO 2012/130831).

Понятие «эффективное количество» агента относится к количеству, которое необходимо, чтобы при введении в клетки или ткани вызвать в них физиологические изменения.

Понятие «терапевтически эффективное количество» агента, например, фармацевтической композиции, относится к количеству, эффективному в дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения желаемого терапевтического или профилактического результата. Терапевтически эффективное количество агента, например, устраняет, уменьшает, задерживает, минимизирует или предотвращает вредные эффекты заболевания.

Понятия «индивидуум» или «субъект» относится к млекопитающему. К млекопитающим относят, но ими не ограничиваются, домашних животных (например, коров, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, людей и других приматов, например, обезьян), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс). В частности, индивидуум или субъект - это человек.

Понятие «фармацевтическая композиция» относится к препарату, который находится в форме, обеспечивающей эффективность биологической активности содержащегося в нем активного ингредиента, и который не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому композиция может быть введена.

«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту фармацевтической композиции, отличному от активного ингредиента, который нетоксичен для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но ими не ограничивается, буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.

Используемое в настоящем изобретении понятие «лечение» (и его грамматические вариации, например, «лечить») относится к клиническому вмешательству с попыткой изменить естественное течение заболевания у человека, которого лечат, и может проводиться либо для профилактики, либо в ходе течения клинической патологии. Желательные эффекты лечения включают, но ими не ограничиваются, предотвращение возникновения или рецидива заболевания, облегчение симптомов, уменьшение каких-либо прямых или косвенных патологических последствий заболевания, предотвращение метастазирования, снижение скорости прогрессирования заболевания, улучшение или временное смягчение последствий заболевания или болезненного состояния и ремиссию или улучшенный прогноз. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению используют для задержки развития заболевания или для замедления прогрессирования заболевания.

Понятие «вкладыш в упаковку» означает инструкции, обычно включаемые в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предупреждениях относительно использования таких терапевтических продуктов.

Подробное описание вариантов осуществления настоящего изобретения

Настоящее изобретение предусматривает антитела и биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые связывают GPRC5D, особенно GPRC5D человека. Кроме того, молекулы обладают другими благоприятными свойствами для терапевтического применения, например, относительно эффективности и/или безопасности, а также важно, что может быть налажено их получение.

Антитело против GPRC5D

В первом объекте настоящего изобретения предусматривают антитело, которое связывается с GPRC5D, причем антитело содержит (i) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность, (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 83, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 84, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 87, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 89; (ii) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность, (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 83, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 85, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 86 и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 87, a LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 89; (iii) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность, (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 91, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97; (iv) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность, (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 91, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 96 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97; или (v) вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность, (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 92, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело является гуманизированным. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения VH является гуманизированным VH и/или VL является гуманизированным VL. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело содержит CDR, подобные описанным в каком-либо из вышеперечисленных вариантов осуществления настоящего изобретения, и дополнительно содержит акцепторную каркасную область человека, например каркасную область иммуноглобулина человека или консенсусную каркасную область человека.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения (i) VH содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 13, и VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14; или (ii) VH содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 15, и VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16; или (iii) VH содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 48, и VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53; или (iv) VH содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 49, и VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52; или (v) VH содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 57, и VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 64; or (vi) VH содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 58, и VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 63.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело содержит (i) последовательность VH, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100 идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13, и последовательность VL, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14; или (ii) последовательность VH, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15, и последовательность VL, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16; или (iii) последовательность VH, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 48, и последовательность VL, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53; или (iv) последовательность VH, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 49 и последовательность VL, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52; или (v) последовательность VH, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 57, и последовательность VL, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 64; или (vi) последовательность VH, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 58 и последовательность VL, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 63.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения антителом является IgG, в частности IgG1. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антителом является полноразмерное антитело. В другом варианте осуществления настоящего изобретения антителом является фрагмент антитела, выбранный из группы, включающей молекулу Fv, молекулу scFv, молекулу Fab и молекулу F(ab')₂. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело является мультиспецифичным антителом.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения последовательность VH или VL по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична и содержит замещения (например, консервативные замещения), инсерции или делеции относительно сравниваемой последовательности, но антитело, включающее такую последовательность, сохраняет способность связываться с GPRC5D. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения в общей сложности от 1 до 10 аминокислот замещены, инсертированы и/или делетированы в последовательности SEQ ID NO: 13, и/или в общей сложности от 1 до 10 аминокислот замещены, инсертированы и/или делетированы в последовательности SEQ ID NO: 14, и/или в общей сложности от 1 до 10 аминокислот замещены, инсертированы и/или делетированы в последовательности SEQ ID NO: 15, и/или в общей сложности от 1 до 10 аминокислот замещены, инсертированы и/или делетированы в последовательности SEQ ID NO: 16, и/или в общей сложности от 1 до 10 аминокислот замещены, инсертированы и/или делетированы в последовательности SEQ ID NO: 48, и/или в общей сложности от 1 до 10 аминокислот замещены, инсертированы и/или делетированы в последовательности SEQ ID NO: 53, и/или в общей сложности от 1 до 10 аминокислот замещены, инсертированы и/или делетированы в последовательности SEQ ID NO: 49, и/или в общей сложности от 1 до 10 аминокислот замещены, инсертированы и/или делетированы в последовательности SEQ ID NO: 52, и/или в общей сложности от 1 до 10 аминокислот замещены, инсертированы и/или делетированы в последовательности SEQ ID NO: 57, и/или в общей сложности от 1 до 10 аминокислот замещены, инсертированы и/или делетированы в последовательности SEQ ID NO: 64, и/или в общей сложности от 1 до 10 аминокислот замещены, инсертированы и/или делетированы в последовательности SEQ ID NO: 58, и/или в общей сложности от 1 до 10 аминокислот замещены, инсертированы и/или делетированы в последовательности SEQ ID NO: 63.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения замещения, инсерции или делеции содержатся в областях вне HVR (т.е., в областях FR). Необязательно антитело включает последовательность VH в SEQ ID NO: 13 и/или последовательность VL в SEQ ID NO: 14, включая пост-трансляционные модификации этой последовательности. Необязательно антитело включает последовательность VH в SEQ ID NO: 15 и/или последовательность VL в SEQ ID NO: 16, включая пост-трансляционные модификации этой последовательности. Необязательно антитело включает последовательность VH в SEQ ID NO: 48 и/или последовательность VL в SEQ ID NO: 53, включая пост-трансляционные модификации этой последовательности. Необязательно антитело включает последовательность VH в SEQ ID NO: 49 и/или последовательность VL в SEQ ID NO: 52, включая пост-трансляционные модификации этой последовательности. Необязательно антитело включает последовательность VH в SEQ ID NO: 57 и/или последовательность VL в SEQ ID NO: 64, включая пост-трансляционные модификации этой последовательности. Необязательно антитело включает последовательность VH в SEQ ID NO: 58 и/или последовательность VL в SEQ ID NO: 63, включая пост-трансляционные модификации этой последовательности.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело включает последовательность VH, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы, SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 15, и последовательность VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело включает последовательность VH, выбранную из группы, включающей SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 12, и последовательность VL SEQ ID NO: 16.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело включает последовательность VH SEQ ID NO: 13 и последовательность VL SEQ ID NO: 14.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело включает последовательность VH SEQ ID NO: 15 и последовательность VL SEQ ID NO: 16.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело включает последовательность VH SEQ ID NO: 48, и последовательность VL SEQ ID NO: 53.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело включает область VH, содержащую последовательность SEQ ID NO: 49, и последовательность VL SEQ ID NO: 52.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело включает последовательность VH SEQ ID NO: 57, и последовательность VL SEQ ID NO: 64.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и аминокислотную последовательность VL SEQ ID NO: 63. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело включает последовательность VH SEQ ID NO: 58, и последовательность VL SEQ ID NO: 63.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело содержит константную область человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело является молекулой иммуноглобулина, включающей константную область человека, в частности молекулу иммуноглобулина класса IgG, содержащую CHI, СН2, СН3 и/или CL домен человека. Примеры последовательностей константных доменов человека приведены в последовательностях SEQ ID NO 37 и 38 (домены CL человека каппа и лямбда, соответственно), а также SEQ ID NO: 39 (константные домены СН1-СН2-СН3 тяжелой цепи IgG1 человека). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело содержит константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37 или SEQ ID NO: 39, особенно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 38. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело содержит константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39. В частности, константная область тяжелой цепи может содержать аминокислотные мутации в домене Fc согласно настоящему изобретению.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело является моноклональным антителом.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело является IgG, особенно антителом IgG₁. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело является полноразмерным.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело содержит домен Fc, в частности домен IgG Fc, особенно домен Fc IgG₁. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc является доменом Fc человека. Домен Fc антитела может иметь какие-либо из признаков, по отдельности или в комбинации, описанных в настоящем изобретении в отношении домена Fc биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения антитело является фрагментом антитела, выбранным из группы, включающей молекулы Fv, молекулы scFv, молекулы Fab и молекулы F(ab')₂. В другом варианте осуществления настоящего изобретения антителом является диатело, триатело или тетратело.

В еще одном объекте антитело в соответствии с каким-либо из описанных вариантов осуществления настоящего изобретения может включать какие-либо из признаков, по отдельности или в комбинации, согласно описанному в разделах ниже.

Варианты гликозилирования

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело, которое изменено для увеличения или уменьшения степени гликозилирования антитела. Добавление или удаление сайтов гликозилирования в антителе может быть легко осуществлено путем изменения аминокислотной последовательности таким образом, что создается или удаляется один или несколько сайтов гликозилирования.

Если антитело включает область Fc, присоединенный к ней олигосахарид может быть изменен. Нативные антитела, продуцируемые клетками млекопитающих, обычно содержат разветвленный биантенарный олигосахарид, который обычно присоединен N-связью к Asn297 домена СН2 области Fc. См., например, Wright с соавт. TIBTECH 15, 1997, 26-32. Олигосахариды могут включать различные углеводы, например, маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc в «стволе» структуры биантенарного олигосахарида. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения могут быть сделаны модификации олигосахарида в антителе по настоящему изобретению для создания вариантов антител с определенными улучшенными свойствами.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают варианты антител, имеющие нефукозилированные олигосахариды, т.е. олигосахаридные структуры, которые утратили фукозу, присоединенную (непосредственно или опосредованно) к области Fc. Такой нефукозилированный олигосахарид (также называемый «афукозилированным» олигосахаридом), в частности, представляет собой N-связанный олигосахарид, в котором отсутствует остаток фукозы, присоединенный к первому GlcNAc в основе биантенарной структуры олигосахарида. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают варианты антител, обладающие повышенной долей нефукозилированных олигосахаридов в области Fc по сравнению с нативным или исходным антителом. Например, доля нефукозилированных олигосахаридов может составлять по меньшей мере примерно 20%по меньшей мере примерно 40%по меньшей мере примерно 60%по меньшей мере примерно 80%, или даже примерно 100% (т.е. фукозилированные олигосахариды отсутствуют). Процентом нефукозилированных олигосахаридов является (среднее) количество олигосахаридов, лишенных остатков фукозы, по отношению к сумме всех олигосахаридов, присоединенных к Asn 297 (например, сложных, гибридных и высокоманнозных структур), измеренных с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF, согласно описанию в WO 2006/082515, например, Asn297 относится к остатку аспарагина, расположенному примерно в положении 297 в области Fc (EU нумерация остатков области Fc); однако, Asn297 также может быть расположен примерно на ± 3 аминокислоты выше или ниже по цепи от положения 297, т.е. между положениями 294 и 300, из-за незначительных изменений последовательности в антителах. Такие антитела, имеющие повышенную долю нефукозилированных олигосахаридов в области Fc, могут иметь улучшенное связывание рецептора FcγRIIIa и/или улучшенную эффекторную функцию, в частности улучшенную функцию ADCC. См., например, US 2003/0157108; US 2004/0093621.

К примерам клеточных линий, способных вырабатывать антитела с пониженным фукозилированием, относятся клетки Lec13 СНО, недостаточные по фукозилированию белка (Ripka с соавт. Arch. Biochem. Biophys. 249, 1986, 533-545; US 2003/0157108; and WO 2004/056312, особенно пример 11), линии нокаутных клеток, например, с нокаутом гена альфа-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8, нокаутные клетки СНО (см., например, Yamane-Ohnuki с соавт. Biotech. Bioeng. 87, 2004, 614-622; Kanda Y. с соавт., Biotechnol. Bioeng., 94(4), 2006, 680-688; WO 2003/085107) или клетки с пониженной или ослабленной активностью по синтезу ГДФ-фукозы или транспортного белка (см., например, US 2004259150, US 2005031613, US 2004132140, US 2004110282).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают варианты антител, которые содержат разделенные пополам олигосахариды, в которых, например, биантенарный олигосахарид, присоединенный к области Fc антитела, разделен пополам GlcNAc. Такие варианты антител могут иметь пониженную функцию фукозилирования и/или улучшенную функцию ADCC согласно описанному выше. Примеры таких вариантов антител описаны, например, в публикациях Umana с соавт., Nat Biotechnol 17, 1999, 176-180; Ferrara с соавт., Biotechn Bioeng 93, 2006, 851-861; WO 99/54342; WO 2004/065540, WO 2003/011878.

Также предусматривают варианты антител по меньшей мере с одним остатком галактозы в олигосахариде, присоединенном к области Fc region. Такие варианты антител могут иметь улучшенную функцию CDC. Такие варианты антител описаны, например, в WO 1997/30087; WO 1998/58964; и WO 1999/22764.

Варианты антител, сконструированные с использованием цистеина

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения может быть желательно создать антитела, сконструированные на основе цистеина, «тиоМАb», в которых один или несколько остатков антитела замещены остатками цистеина. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения замещаемые остатки находятся в доступных местах антитела. За счет замены этих остатков цистеином реактивные тиоловые группы оказываются в доступных местах антитела и могут использоваться для конъюгации антитела с другими фрагментами, такими как фрагменты лекарственного средства или фрагменты линкер-лекарственное средство, для создания иммуноконъюгата по настоящему изобретению. Антитела, сконструированные с использованием цистеина, могут быть получены согласно описанному, например, в US 7521541, US 830930, US 7855275, US 9000130 или WO 2016040856.

Производные антител

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антитело может быть дополнительно модифицировано таким образом, чтобы содержать дополнительные небелковые фрагменты, которые известны в данной области и легко доступны. Фрагменты, подходящие для дериватизации антитела, включают, но ими не ограничиваются, водорастворимые полимеры. К примерам водорастворимых полимеров относятся, но ими перечень не ограничивается, полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо случайные сополимеры) и декстран или поли(н-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропропиленгликоля, сополимеры пролипропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Пропиональдегид полиэтиленгликоля может иметь преимущества при производстве из-за его стабильности в воде. Полимер может иметь какую-либо молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Количество полимеров, присоединенных к антителу, может варьировать, и, если присоединено более одного полимера, они могут быть одинаковыми или разными молекулами. В общем, количество и/или тип полимеров, используемых для дериватизации, может быть определен на основании таких факторов, включая, но ими не ограничиваясь, как конкретные свойства или функции улучшаемого антитела, в зависимости от того, если производное антитела будет использоваться в терапии при определенных условиях, и т.д.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают, что конъюгаты антитела и небелкового фрагмента могут быть избирательно нагреты путем облучения. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения небелковый фрагмент является углеродной нанотрубкой (Kam с соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102, 2005, 11600-11605). Облучение может иметь какую-либо длину волны и включает, наряду с другими, длины волн, которые не повреждают обычные клетки, но нагревают небелковый фрагмент до температуры, при которой гибнут клетки, расположенные проксимально к антителу-небелковому фрагменту.

Иммуноконъюганты

В настоящем изобретении также предусматривают иммуноконъюгаты, содержащие анти-GPRC5D антитело по настоящему изобретению, конъюгированное (химически связанное) с одним или несколькими терапевтическими агентами, такими как цитотоксические агенты, химиотерапевтические агенты, лекарственные средства, агенты, ингибирующие рост, токсины (например, белковые токсины, ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или их фрагменты) или радиоактивные изотопы.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения иммуноконъюгат представляет собой конъюгат антитело-лекарственное средство (ADC), в котором антитело конъюгировано с одним или несколькими терапевтическими агентами, упомянутыми выше. Антитело обычно связывается с одним или несколькими терапевтическими агентами с помощью линкеров. Обзор технологии ADC, включая примеры терапевтических агентов, лекарств и линкеров, приведен в Pharmacol Review 68, 2016, 3-19.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения иммуноконъюгат содержит антитело по настоящему изобретению, конъюгированное с ферментативно активным токсином или его фрагментом, включая, но, не ограничиваясь ими, цепь А дифтерийного токсина, экзотоксина, несвязывающие активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь экзотоксина А (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модекцина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, белки диантина, белки Phytolaca americana (PAPI, PAPII и PAP-S), ингибитор Momordica charantia, курцин, кротин, ингибитор сапаонарии лекарственной, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трихотецены.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения иммуноконъюгат включает антитело по настоящему изобретению, конъюгированное с радиоактивным атомом с образованием радиоконъюгата. Для получения радиоконъюгатов доступны различные радиоактивные изотопы.

Примеры включают At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² и радиоактивные изотопы Lu. Если радиоконъюгат используют для обнаружения, он может содержать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например tc99m или I123, или спиновую метку для изображений ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (также известную как магнитно-резонансная томография, МРТ), например йод -123, йод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.

Конъюгаты антитела и цитотоксического агента могут быть получены с использованием различных бифункциональных белковых связывающих агентов, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио) пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил) циклогексан-1-карбоксилат.(SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие как дисукцинимидил суберат), альдегиды (такие как глутаральдегид), бис-азидосоединения (такие как бис (п-азидобензоил) гександиамин), производные бис-диазония (такие как бис-(п-диазонийбензоил) этилендиамин), диизоцианаты (такие как толуол 2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие как 1,5-дифтор-2, 4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицин может быть получен, как описано у Vitetta с соавт., Science 238, 1987, 1098. Меченная углеродом-14 1-изотиоцианатобензил-3 -метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (МХ-DTPA) является типичным хелатирующим агентом для конъюгации радионуклеотида с антителом. См. WO 94/11026. Линкер может быть «расщепляемым линкером», способствующим высвобождению цитотоксического лекарственного средства в клетке. Например, можно применять кислотолабильный линкер, чувствительный к пептидазе линкер, фотолабильный линкер, диметиловый линкер или дисульфидсодержащий линкер (Chari с соавт., Cancer Res. 52, 1992, 127-131; US 5208020).

Иммуноконъюгатами или ADC по настоящему изобретению являются, но ими перечень неограничивается, такие конъюгаты, полученные с помощью перекрестно-линкерных реагентов, включая, помимо прочего, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, МРВН, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB, а также SVSB (сукцинимидил- (4-винилсульфон) бензоат), которые являются коммерческими доступны (например, от Pierce Biotechnology, Inc., Рокфорд, Иллинойс, США).

Мультиспецифические антитела

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматриваемое антитело является мультиспецифическим антителом, например, биспецифическим антителом. Мультиспецифические антитела являются моноклональными антителами, которые обладают специфичностью связывания по меньшей мере с двумя разными сайтами, то есть с разными эпитопами на разных антигенах или разными эпитопами на одном и том же антигене. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения мультиспецифическое антитело обладает тремя или более связывающими специфичностями. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения одна из связывающих специфичностей обусловливает связывание с GPRC5D, а две другие (две или более) специфичности обусловливают связывание с каким-либо другим антигеном. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифические антитела могут связываться с двумя (или более) разными эпитопами GPRC5D. Мультиспецифические антитела (например, биспецифические) также могут быть применены для локализации цитотоксических агентов или клеток к клеткам, которые экспрессируют GPRC5D. Мультиспецифические антитела могут быть получены в виде антител полной длины или фрагментов антител.

К методикам получения мультиспецифических антител относятся, но ими перечень не ограничивается, рекомбинантная ко-экспрессия двух пар тяжелой цепи-легкой цепи иммуноглобулина, обладающих разными специфичностями (см. Milstein и Cuello, Nature 305, 1983, 537), а также конструирование «выступ-во-впадину» (см., например, US 5731168; Atwell с соавт., J. Mol. Biol. 270, 1997, 26). Мультиспецифические антитела также могут быть получены путем конструирования электростатических управляемых эффектов для создания Fc-гетеродимерных молекул антитела (см., например, WO 2009/089004); перекрестное связывание двух или более антител или фрагментов (см., например, US 4676980, Brennan с соавт., Science, 229, 1985, 81); применение лейциновых молний для получения биспецифичных антител (см., например, Kostelny с соавт., J. Immunol., 148(5), 1992, 1547-1553, и WO 2011/034605); применение технологии общей легкой цепи для обхода проблемы неправильного спаривания легкой цепи (см., например, WO 98/50431); применение «метода диатела» для получения биспецифических фрагментов антител (см., например, Hollinger с соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90, 1993, 6444-6448); применение димеров одноцепочечных Fv (single-chain, sFv) (см., например, Gruber с соавт., J. Immunol., 152, 1994, 5368); аи получение триспецифичных антител согласно описанию, например, в публикации Tutt с соавт.J. Immunol. 147, 1991, 60.

К настоящему изобретению также относятся сконструированные антитела с тремя или более сайтами связывания антигена, включая, например, «антитела-осьминоги» или DVD-Ig (см., например, WO 2001/77342 и WO 2008/024715). С другими мультиспецифическими антителами с тремя или более сайтами связывания антигена можно ознакомиться в WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO 2010/145792 и WO 2013/026831. К биспецифическому антителу или его связывающему фрагменту относится «Fab двойного действия» или «DAF», включающий сайт связывания антигена, который связывается с GPRC5D, а также другой отличающийся антиген, или два разных эпитопа GPRC5D (см., например, US 2008/0069820 и WO 2015/095539).

Мультиспецифические антитела также могут быть получены в асимметричной форме с доменом кроссовера в одном или более связывающих ветвях одной и той же антигенной специфичности, т.е. путем обмена доменов VH/VL (см., например, WO 2009/080252 и WO 2015/150447), доменов CH1/CL (см., например, WO 2009/080253) или полных ветвей Fab (см., например, WO 2009/080251, WO 2016/016299, а также см. Schaefer с соавт., PNAS, 108, 2011, 1187-1191; Klein с соавт., MAbs 8, 2016, 1010-1020). Асимметричные ветви Fab также можно сконструировать путем интродукции мутаций заряженных или незаряженных аминокислот в интерфейсы доменов для направленной коррекции правильным спариванием Fab. См., например, WO 2016/172485.

Различные другие молекулярные форматы мультиспецифических антител известны в данной области и включены в рамки охвата настоящего изобретения (см., например, Spiess с соавт., Mol Immunol 67, 2015, 95-106).

Определенный тип мультиспецифических антител, также включенных в настоящее изобретение, представляет собой биспецифические антитела, разработанные для одновременного связывания с поверхностным антигеном на клетке-мишени, например, опухолевой клетке, и с активирующим инвариантным компонентом комплекса рецепторов Т-клеток (TCR), например, CD3, для перенацеливания Т-клеток на уничтожение клеток-мишеней. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматриваемое антитело является мультиспецифическим антителом, в частности биспецифическим антителом, причем одной из связывающих специфичностей является специфичность в отношении GPRC5D, и другая - в отношении CD3.

Примеры биспецифических форматов антител, которые могут быть применимы для данной цели, включают, но ими не ограничиваются, так называемые молекулы «BiTE» (биспецифический активатор Т-клеток - bispecific Т cell engager), в которых две молекулы scFv слиты с помощью гибкого линкера (см., например, WO 2004/106381, WO 2005/061547, WO 2007/042261 и WO 2008/119567, Nagorsen и Exp Cell Res 317, 201 1, 1255-1260); диатела (Holliger с соавт., Prot Eng 9, 1996, 299-305) и их производные, например, тандемные антитела («TandAb»; Kipriyanov с соавт., JMol Biol 293, 1999, 41-56); молекулы «DART» (перенацеливание двойной афинностью - dual affinity retargeting), которые основаны на формате диатела, но характерной особенностью которых является С-концевой дисульфидный мост для дополнительной стабилизации (Johnson с соавт., J Mol Biol 399, 2010, 436-449), и так называемые триомабсы, являющиеся полным гибридом молекул мышиного/крысиного IgG (обзор в публикации Seimetz с соавт., Cancer Treat Rev 36, 2010, 458-467). В частности, Т-клеточные биспецифические форматы антител описаны в WO 2013/026833, WO 2013/026839, WO 2016/020309; Васас с соавт., Oncoimmunology 5(8), 2016, е1203498.

Биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые связываются с GPRC5D и со вторым антигеном

Настоящее изобретение также относится к биспецифической антигенсвязывающей молекуле, то есть антигенсвязывающей молекуле, которая содержит по меньшей мере два антигенсвязывающих фрагмента, способных специфически связываться с двумя различными антигенными детерминантами (первым и вторым антигеном).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающие фрагменты, содержащиеся в биспецифической антигенсвязывающей молекуле, являются молекулами Fab (т.е. антигенсвязывающими доменами, состоящими из тяжелой и легкой цепей, каждая из которых содержит вариабельный и константный домен). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый и/или второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанный Fab является молекулой человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанная молекула Fab является гуманизированной. В еще одном другом варианте осуществления настоящего изобретения указанная молекула Fab включает константные домены тяжелой и легкой цепей человека.

Предпочтительно по меньшей мере один из антигенсвязывающих фрагментов является кроссоверной молекулой Fab. Такая модификация понижает неправильное спаривание тяжелых и легких цепей разных молекул Fab, тем самым улучшая выход и чистоту биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению при получении рекомбинантов. В определенной кроссоверной молекуле Fab, пригодной для биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению, происходит обмен вариабельных доменов легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab (VL и VH, соответственно). Однако даже при таком обмене доменов препарат биспецифической антигенсвязывающей молекулы может включать определенные побочные продукты из-за так называемого взаимодействия типа Бенс-Джонса между ошибочно спаренными тяжелыми и легкими цепями (см., Schaefer с соавт., PNAS, 108, 2011, 11187-11191). Для дополнительного уменьшения ошибочного спаривания тяжелых и легких цепей из разных молекул Fab и, таким образом, повышения чистоты и выхода требуемой биспецифической антигенсвязывающей молекулы, заряженные аминокислоты с противоположными зарядами могут быть введены в определенные аминокислотные положения в доменах СН1 и CL либо молекулы (молекул) Fab, связывающейся с первым антигеном (GPRC5D), либо молекулы Fab, связывающейся со вторым антигеном (например, активирующего Т-клеточного антигена, такого как CD3), как дополнительно описано в настоящем изобретении. Модификации заряда производят либо в обычных молекулах (молекуле) Fab, содержащихся в биспецифической антигенсвязывающей молекуле (такой, как показано, например, на фиг.1 А-В, Ж-К), либо в молекуле (молекулах) VH/VL кроссовера Fab, содержащихся в биспецифической антигенсвязывающей молекуле (например, показанной на рисунке 1 Г-Е, Л-О) (но не в обеих). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения модификации заряда производят в обычной молекуле (молекулах) Fab, содержащихся в биспецифической антигенсвязывающей молекуле (которая в определенных вариантах осуществления настоящего изобретения связывается с первым антигеном, т.е. GPRC5D).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула способна одновременно связываться с первым антигеном (т.е. GPRC5D) и вторым антигеном (например, активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула способна к перекрестному скрещиванию Т-клеток и клеток-мишеней путем одновременного связывания GPRC5D и активирующего Т-клеточного антигена. В еще одном предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения такое одновременное связывание приводит к лизису клеток-мишеней, в частности опухолевых клеток, экспрессирующих GPRC5D. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения такое одновременное связывание приводит к активации Т-клеток. В другом варианте осуществления настоящего изобретения такое одновременное связывание приводит к клеточному ответу Т-лимфоцитов, особенно цитотоксических Т-лимфоцитов, выбранных из группы, в которую входят: пролиферация, дифференциация, секреция цитокинов, высвобождение цитотоксических эффекторных молекул, цитотоксическая активность и экспрессия маркеров активации. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения связывание биспецифической антигенсвязывающей молекулы с активирующим Т-клеточным антигеном, особенно CD3, без одновременного связывания с GPRC5D не приводит к активации Т-клеток.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула способна к перенацеливанию цитотоксической активности Т-клеток на клетки-мишени. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанное перенацеливание не зависит от презентации ГКГ-опосредованного пептидного антигена клетками-мишенями и/или от специфичности Т-клеток.

В частности, Т-клетки по какому-либо из вариантов осуществления настоящего изобретения являются цитотоксическими Т-клетками. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения Т-клетками являются Т-клетки CD4⁺ или CD8⁺, особенно Т-клетки CD8⁺.

Первый антигенсвязывающий фрагмент

Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий фрагмент, в частности молекула Fab, которая связывается с GPRC5D (первым антигеном). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула включает два антигенсвязывающих фрагмента, в частности молекулы Fab, которые связываются с GPRC5D. В одном из подобных вариантов осуществления настоящего изобретения каждый из таких антигенсвязывающих фрагментов связывается с одним и тем же антигенным детерминантом. В еще более предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения все эти антигенсвязывающие фрагменты идентичны, т.е. они содержат одинаковые аминокислотные последовательности, включая одинаковые аминокислотные замещения в доменах СН1 и CL согласно описанию настоящего изобретения (если они имеются). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению содержит не более двух антигенсвязывающих фрагментов, в частности молекул Fab, которые связываются с GPRC5D.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий фрагмент (фрагменты), которые связываются с GPRC5D, является обычной молекулой Fab. В таких вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий фрагмент (фрагменты), которые связываются со вторым антигеном, являются кроссоверной Fab молекулой, описанной в настоящем изобретении, т.е. молекулой Fab, в которой вариабельные домены VH и VL или конценсусные домены СН1 и CL тяжелых и легких цепей Fab обменены/замещены друг на друга.

В других альтернативных вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий фрагмент (фрагменты), которые связываются с GPRC5D, является кроссоверной Fab молекулой, описанной в настоящем изобретении, т.е. молекулой Fab, в которой вариабельные домены VH и VL или конценсусные домены СН1 и CL тяжелых и легких цепей Fab обменены/замещены друг на друга. В других подобных вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий фрагмент (фрагменты), которые связывают второй антиген, является обычной молекулой Fab.

GPRC5D-связывающий фрагмент способен направлять биспецифическую антигенсвязывающую молекулу к целевому сайту, например, к опухолевой клетке определенного типа, которая экспрессирует GPRC5D.

Первый антигенсвязывающий фрагмент биспецифической антигенсвязывающей молекулы может обладать какими-либо специфическими характеристиками, отдельно или в комбинации, описанными в настоящем изобретении в связи с антителом, которое связывает GPRC5D, за исключением тех случаев, когда с научной точки зрения очевидно, что это явно необоснованно или невозможно.

Таким образом, в одном объекте настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую (а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первым антигеном является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 83, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 84, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 87, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 89, и (б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном. Во втором объекте настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую (а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первым антигеном является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 83, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 85, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 87, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 89, и (б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном. В другом объекте настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую (а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первым антигеном является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97, и (б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном. В другом объекте настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую (а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первым антигеном является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 96 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97, и (б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном. В другом объекте настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую (а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первым антигеном является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 92 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97, и (б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном. В другом объекте настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую (а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первым антигеном является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 1, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 2 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 4, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 5 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 6, и (б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном. В другом объекте настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую (а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первым антигеном является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), включающую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 7, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 8 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи (VL), включающую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 10, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 11 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 12, и (б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент представлен (происходит от) гуманизированного антитела. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения VH является гуманизированным VH и/или VL является гуманизированным VL. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR как в каком-либо из указанных выше вариантов осуществления настоящего изобретения, и дополнительно включает акцепторную область человека, например, каркасную область иммуноглобулина человека или конценсусную каркасную область человека.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения VH первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58, и VL первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент включает последовательность VH, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15. SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58, и последовательность VL, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент включает последовательность VH, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58, и последовательность VL, включающую аминокислотную последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент включает последовательность VH, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58, и последовательность VL, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент включает последовательность VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13 и последовательность VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент включает последовательность VH SEQ ID NO: 13 и последовательность VL SEQ ID NO: 14.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент включает последовательность VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15 и последовательность VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент включает последовательность VH SEQ ID NO: 15 и последовательность VL SEQ ID NO: 16.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент включает последовательность VH, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48 и последовательность VL, включающую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент включает последовательность VH SEQ ID NO: 48 и последовательность VL SEQ ID NO: 53.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент включает последовательность VH SEQ ID NO: 49 и последовательность VL SEQ ID NO: 52.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент включает последовательность VH SEQ ID NO: 57 и последовательность SEQ ID NO: 64.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и область VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент включает последовательность VH SEQ ID NO: 58 и последовательность SEQ ID NO: 63. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент включает константную область человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первым антигенсвязывающим фрагментом является молекула Fab, включающая константную область человека, особенно СН1 и/или CL домен человека. Примерами последовательностей константных доменов человека являются последовательности SEQ ID NO 37 и 38 (домены CL человека каппа и лямбда) и SEQ ID NO: 39 (константные домены СН1-СН2-СН3 тяжелой цепи IgG1 человека). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент включает константную область первый антигенсвязывающий фрагмент включает константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37 или SEQ ID NO: 38, particularly the amino acid sequence of SEQ ID NO: 37. В частности, константная область легкой цепи может содержать аминокислотные мутации, описанные в настоящем изобретении в разделе «модификации заряда», и/или может включать делецию или замещения одной или нескольких (особенно двух) N-концевых аминокислот в случае кроссоверной молекулы Fab. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент включает константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности домена СН1, содержащейся в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39. В частности, константная область тяжелой цепи (особенно домен СН1) может включать аминокислотные мутации, описанные в настоящем изобретении в разделе «модификации заряда».

Второй антигенсвязывающий фрагмент

Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий фрагмент, в частности молекулу Fab, которая связывается со вторым антигеном (отличным от GPRC5D).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий фрагмент, который связывает второй антиген, является кроссоверной молекулой Fab по настоящему изобретению, т.е. молекулой Fab, в которой вариабельные домены VH и VL или константные домены СН1 и CL тяжелой и легкой цепей Fab обменены/заменены друг на друга. В таких вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий фрагмент (фрагменты), которые связывается с первым антигеном (т.е. GPRC5D), предпочтительно является обычной молекулой Fab. В вариантах осуществления настоящего изобретения имеется более одного антигенсвязывающего фрагмента, в частности молекулы Fab, которая связывается с GPRC5D, входящим в состав биспецифической антигенсвязывающей молекулы, антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, предпочтительно является кроссоверной молекулой Fab, и антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с GPRC5D, представляют собой обычные молекулы Fab.

В других альтернативных вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, является обычной молекулой Fab. В таких вариантах осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий фрагмент (фрагменты), которые связываются с первым антигеном (то есть с GPRC5D), являются кроссоверной молекулой Fab, описанной в настоящем изобретении, т.е. молекулой Fab, в которой вариабельные домены VH и VL или константные домены СН1 и CL тяжелой и легкой цепи Fab обмениваются/заменяются друг другом. В вариантах осуществления настоящего изобретения при наличии более одного антигенсвязывающего фрагмента, в частности молекулы Fab, которая связывается со вторым антигеном, содержащимся в биспецифической антигенсвязывающей молекуле, антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с GPRC5D, предпочтительно является кроссоверной молекулой Fab, и антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются со вторым антигеном, являются обычными молекулами Fab.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения второй антиген представляет собой активирующий Т-клеточный антиген (также называемый здесь «активирующий Т-клеточный антигенсвязывающий фрагмент или активирующая Т-клеточный антигенсвязывающая молекула Fab»). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит не более одного антигенсвязывающего фрагмента, способного специфически связываться с активирующим Т-клеточным антигеном. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула обеспечивает моновалентное связывание с активирующим Т-клеточным антигеном.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вторым антигеном является CD3, в частности CD3 человека (SEQ ID NO: 40) или макаки крабоеда CD3 (SEQ ID NO: 41), наиболее предпочтительно CD3 человека. В одном варианте осуществления настоящего изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент проявляет перекрестную реактивность (т.е. специфическое связывание) в отношении CD3 человека и макаки крабоеда. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вторым антигеном является субъединица эпсилон CD3 (CD3 эпсилон).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент включает HCDR 1 последовательности SEQ ID NO: 29, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO:30, HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 31, LCDR 1 последовательности SEQ ID NO: 32, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 33 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 34.

В одном варианте осуществления настоящего изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент включает VH, содержащую HCDR 1 последовательности SEQ ID NO: 29, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 30 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 31, и VL, содержащую LCDR 1 последовательности SEQ ID NO: 32, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 33 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 34.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент является (производным от) гуманизированного антитела. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения область VH является гуманизированной VH и/или VL является гуманизированной VL. В одном варианте осуществления настоящего изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент включает области CDR как в каком-либо из приведенных выше вариантов осуществления настоящего изобретения и дополнительно включает акцепторный каркасный участок человека, например, каркасный участок иммуноглобулина человека или конценсусный каркасный участок человека.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент включает последовательность VH, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент включает последовательность VL, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент включает последовательность VH, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35, и последовательность VL, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения VH второго антигенсвязывающего фрагмента включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35, и VL второго антигенсвязывающего фрагмента включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент включает последовательность VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент включает последовательность VH SEQ ID NO: 35, и последовательность VL SEQ ID NO: 36.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент включает константную область человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вторым антигенсвязывающим фрагментом является молекула Fab, молекула, содержащая константный участок человека, в частности домен человека СН1 и/или CL. Типичные последовательности константных доменов человека приведены в SEQ ID NO 37, SEQ ID NO 38 (домены CL человека каппа и лямбда, соответственно) и SEQ ID NO: 39 (chain константные домены СН1-СН2-СН3 тяжелой цепи IgG1 человека). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент включает константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37 или SEQ ID NO: 38, особенно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37. В частности, константная область легкой цепи может содержать аминокислотные мутации, согласно описанному в настоящем изобретении в разделе «модификации заряда», и/или может включать делецию или замещение одной или нескольких (особенно двух) N-концевых аминокислот, если они находятся в кроссоверной молекуле Fab. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент включает константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности домена СН1, содержащейся в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39. В частности, константная область тяжелой цепи (в частности, домен СН1) может содержать аминокислотные мутации, как описано в разделе «модификации заряда» настоящего описания.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вторым антигенсвязывающим фрагментом является молекула Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1, особенно вариабельные домены VL и VH, легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга (т.е. в соответствии с таким вариантом осуществления настоящего изобретения, вторым антигенсвязывающим фрагментом является кроссоверная молекула Fab, в которой вариабельные или константные домены легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга). В одном таком варианте осуществления настоящего изобретения первый (и третий, если таковой имеется) антигенсвязывающий фрагмент является обычной молекулой Fab.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в биспецифической антигенсвязывающей молекуле присутствует не более одного антигенсвязывающего фрагмента, который связывается со вторым антигеном (например, активирующим Т-клеточным антигеном, таким как CD3), т.е. биспецифическая антигенсвязывающая молекула обеспечивает моновалентное связывание со вторым антигеном.

Модификации заряда

Биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению могут содержать аминокислотные замещения в молекулах Fab, которые особенно эффективны для уменьшения неправильного спаривания легких цепей с некомплементарными тяжелыми цепями (побочные продукты типа Бенс-Джонса), которые могут возникать при получении би-/мультиспецифических антигенсвязывающих молекул с обменом VH/VL в одном (или нескольких, в случае молекул, содержащих более двух антигенсвязывающих молекул Fab) из связывающих ветвей (см. также WO 2015/150447, особенно приведенные в нем примеры, сущность которых приведена в настоящем изобретении в виде ссылок). Долю требуемой биспецифической антигенсвязывающей молекулы по сравнению с нежелательными побочными продуктами, в частности побочными продуктами типа Бенс-Джонса, встречающимися среди биспецифических антигенсвязывающих молекулах с обменом доменов VH/VL в одном из их связывающих ветвей, можно улучшить путем введения заряженных аминокислот с противоположными зарядами в определенных положениях аминокислот в доменах CHI и CL (иногда в настоящем изобретении применяют понятие «модификации заряда»).

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, где первый и второй антигенсвязывающий фрагмент биспецифической антигенсвязывающей молекулы оба являются молекулами Fab, а в одном из антигенсвязывающих фрагментов (в частности, во втором антигенсвязывающем фрагменте) вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга,

i) в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 124 заменена положительно заряженной аминокислотой (нумерация по Kabat), и где в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 заменена отрицательно заряженной аминокислотой (нумерация по Kabat EU индексу); или

ii) в константном домене CL второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 124 заменена положительно заряженной аминокислотой (нумерация по Kabat), и где в константном домене СН1 второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 заменена отрицательно заряженной аминокислотой (нумерация по Kabat EU индексу).

Биспецифическая антигенсвязывающая молекула не содержит обеих модификаций, упомянутых в пунктах i) и ii). Константные домены CL и СН1 антигенсвязывающего фрагмента, в котором VH/VL не заменяются друг другом (т.е. остаются неизменными).

В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения

i) в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация по Kabat), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающий фрагмент аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 независимо замещены глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по Kabat EU индексу); или

ii) в константном домене CL второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация по Kabat), а в константном домене СН1 второго антигенсвязывающий фрагмента аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 независимо замещены глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по Kabat EU индексу).

В одном таком варианте осуществления настоящего изобретения в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация по Kabat), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 независимо замещены глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по Kabat EU индексу).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация по Kabat), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 147 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по Kabat EU индексу).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 124 независимо замещается лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация по Kabat), а аминокислота в положении 123 заменяется независимо лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация по Kabat EU индексу), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 147 независимо замещается глутаминовой кислотой (Е), или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по Kabat EU индексу) и аминокислота в положении 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по Kabat EU индексу).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 124 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat EU индексу) и аминокислота в положении 123 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat EU индексу), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 147 независимо заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу) и аминокислота в положении 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу).

В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 124 заменена лизином (К) (нумерация по Kabat EU индексу) и аминокислота в положении 123 заменена аргинином (R) (нумерация по Kabat), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 147 независимо заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу) и аминокислота в положении 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения если аминокислотные замены в соответствии с приведенными выше вариантами осуществления настоящего изобретения произведены в константном домене CL и константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента, константный домен CL первого антигенсвязывающего фрагмента имеет изотип каппа.

В другом альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения аминокислотные замены в соответствии с приведенными выше вариантами осуществления могут быть произведены в константном домене CL и константном домене СН1 второго антигенсвязывающего фрагмента вместо константного домена CL и константного домена СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента. В некоторых подобных вариантах осуществления настоящего изобретения константный домен CL второго антигенсвязывающего фрагмента имеет изотип каппа.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в константном домене CL второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 124 заменена независимо лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация по Kabat), а в константном домене СН1 второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 147 или аминокислота в положении 213 независимо заменена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по Kabat EU индексу).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения в константном домене CL второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 124 заменена независимо лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация по Kabat), а в константном домене СН1 второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 147 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по Kabat EU индексу).

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения в константном домене CL второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 124 заменена независимо лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация по Kabat) и аминокислота в положении 123 независимо заменена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация по Kabat), а в константном домене СН1 второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 147 независимо заменена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по Kabat EU индексу) и аминокислота в положении 213 независимо заменена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по Kabat EU индексу).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в константном домене CL второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 124 заменена независимо лизином (K) (нумерация по Kabat) и аминокислота в положении 123 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat), а в константном домене СН1 второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 147 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения в константном домене CL второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 124 заменена лизином (К) (нумерация по Kabat EU индексу) и аминокислота в положении заменена аргинином (R) (нумерация по Kabat), а в константном домене СН1 второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 147 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу) заменена глутаминовой кислотой 213 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению включает

(а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, где первым антигеном является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 83, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 84 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 87, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 89, и

(б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, где второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 124 независимо заменена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация по Kabat) (в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения независимо заменена лизином (K) или аргинином (R)) и аминокислота в положении 123 независимо заменена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация по Kabat) (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения независимо заменена лизином (K) или аргинином (R)), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 147 независимо заменена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по Kabat EU индексу) и аминокислота в положении 213 независимо заменена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по Kabat EU индексу).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению включает

(а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, где первым антигеном является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 83, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 85, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 87, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 89, и

(б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, где второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 124 независимо заменена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация по Kabat) (в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения независимо заменена лизином (K) или аргинином (R)) и аминокислота в положении 123 независимо заменена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация по Kabat) (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения независимо заменена лизином (K) или аргинином (R)), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 147 независимо заменена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по Kabat EU индексу) и аминокислота в положении 213 независимо заменена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по Kabat EU индексу).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению включает

(а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, где первым антигеном является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 91, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97, и

(б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, где второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 124 независимо заменена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация по Kabat EU индексу) (в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения независимо заменена лизином (K) или аргинином (R)) и аминокислота в положении 123 независимо заменена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация по Kabat EU индексу) (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения независимо заменена лизином (K) или аргинином (R)), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 147 независимо заменена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по Kabat EU индексу) и аминокислота в положении 213 независимо заменена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по Kabat EU индексу).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению включает

(а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, где первым антигеном является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 91, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 96 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97, и

(б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, где второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 124 независимо заменена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация по Kabat EU индексу) (в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения независимо заменена лизином (K) или аргинином (R)) и аминокислота в положении 123 независимо заменена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация по Kabat EU индексу) (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения независимо заменена лизином (К) или аргинином (R)), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 147 независимо заменена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по Kabat EU индексу) и аминокислота в положении 213 независимо заменена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по Kabat EU индексу).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению включает

(а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, где первым антигеном является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область тяжелой цепи, определяющую комплементарность (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 92, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область легкой цепи, определяющую комплементарность (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97, и

(б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, где второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 124 независимо заменена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация по Kabat EU индексу) (в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения независимо заменена лизином (K) или аргинином (R)) и аминокислота в положении 123 независимо заменена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация по Kabat) (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения независимо заменена лизином (K) или аргинином (R)), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 147 независимо заменена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по Kabat EU индексу) и аминокислота в положении 213 независимо заменена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по Kabat EU индексу).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению включает

(а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, где первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1, последовательности SEQ ID NO: 1, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 2, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1, последовательности SEQ ID NO: 4, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 5 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 6, и

(б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, где второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация по Kabat) (в определенном варианте осуществления настоящего изобретения независимо лизином (K) или аргинином (R)), и аминокислота в положении 123 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация по Kabat) (в определенном варианте осуществления настоящего изобретения независимо лизином (K) или аргинином (R)), и в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 147 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по Kabat EU индексу) и аминокислота в положении 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по Kabat EU индексу).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению включает

(а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первым антигеном является GPRC5D и первым антигенсвязывающим фрагментом является молекула Fab, содержащая вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 7, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 8, HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 10, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 11 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 12, и

(б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем вторым антигенсвязывающим фрагментом является молекула Fab, причем вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга; где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 124 замещена независимо лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация по Kabat) (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения независимо лизином (K) или аргинином (R)) и аминокислота в положении 123 замещена независимо лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация по Kabat) (в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения независимо лизином (K) или аргинином (R)), и в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в положении 147 замещена независимо глютаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по Kabat EU индексу) и аминокислота в положении 213 замещена независимо глютаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация по Kabat EU индексу).

Форматы биспецифических антигенсвязывающих молекул

Компоненты биспецифической антигенсвязывающей молекулы, согласно настоящему изобретению, могут быть слиты друг с другом в различных конфигурациях. Примеры конфигураций изображены на фиг. 1А-Э.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения фрагменты антигенсвязывающих молекул, включенные в биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, являются молекулами Fab. В таких вариантах осуществления настоящего изобретения первый, второй, третий и др. антигенсвязывающие фрагменты могут быть обозначены как первая, вторая, третья и др. молекулы Fab, соответственно.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый и второй антигенсвязывающие фрагменты биспецифической антигенсвязывающей молекулы сливаются друг с другом, необязательно через пептидный линкер. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения первый и второй антигенсвязывающие фрагменты каждый является молекулой Fab. В одном подобном варианте осуществления настоящего изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента. В другом таком варианте осуществления настоящего изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента. В вариантах осуществления настоящего изобретения, где либо (i) второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента, либо (ii) первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой слитый на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента, дополнительно легкая цепь Fab первого антигенсвязывающего фрагмента и легкая цепь Fab второго антигенсвязывающего фрагмента могут сливаться друг с другом, причем необязательно через пептидный линкер.

Биспецифическая антигенсвязывающая молекула с одним антигенсвязывающим фрагментом (например, такая как молекула Fab) способна специфически связываться с антигеном клетки-мишени, таким как GPRC5D (например, показанная на фиг. 1А, 1Г, 1Ж, 1З, 1Л, 1М), применима особенно в тех случаях, когда следует ожидать интернализации антигена клетки-мишени после связывания высокоаффинного антигенсвязывающего фрагмента. В таких случаях присутствие более чем одного антигенсвязывающего фрагмента, специфичного для антигена клетки-мишени, может усиливать интернализацию антигена клетки-мишени, тем самым снижая его доступность.

Однако в других случаях может быть полезно иметь биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, содержащую два или несколько антигенсвязывающих фрагментов (например, молекул Fab), специфичных в отношении антигена клеток-мишеней (см. примеры, представленные на фиг. 1Б, 1В, 1Д, 1Е, 1И, IK, 1Н или 1O), например, для оптимизации нацеливания на сайт мишени или допуская перекрестное связывание антигенов клеток-мишеней.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению содержит третий антигенсвязывающий фрагмент.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент связывается с первым антигеном, т.е. GPRC5D. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третьим антигенсвязывающим фрагментом является молекула Fab.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент идентичен первому антигенсвязывающему фрагменту.

Третий антигенсвязывающий фрагмент биспецифической антигенсвязывающей молекулы может включать какой-либо из признаков, по отдельности или в комбинации, описанных в настоящем изобретении в отношении первого антигенсвязывающего фрагмента и/или антитела, которое связывает GPRC5D, за исключением случаев, когда это явно необоснованно или невозможно с научной точки зрения.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 83, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 84, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 87, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 89.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 83, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 85, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 87, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 89.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 91, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 91, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 92, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 1, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 2, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 4, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 5, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 6 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 7.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент включает вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 7, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 8, и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 10, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 11 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 12.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент является гуманизированным антителом (происходит из него). В одном варианте осуществления настоящего изобретения VH является гуманизированной VH и/или VL является гуманизированной VL. В одном варианте осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент содержит области CDR, как в каком-либо из вышеперечисленных вариантов осуществления настоящего изобретения, и дополнительно включает акцепторную каркасную область человека, например каркасную область иммуноглобулина человека или консенсусную каркасную область человека.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения VH третьего антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58, и VL третьего антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент включает последовательность VH, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58, и последовательность VL которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности, выбранной из группы последовательностей SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент включает последовательность VH, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58, и последовательность VL, выбранную из группы последовательностей SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент включает последовательность VH SEQ ID NO: 13 и последовательность VL SEQ ID NO: 14.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент включает последовательность VH SEQ ID NO: 15 и последовательность VL SEQ ID NO: 16.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент включает последовательность SEQ ID NO: 48 и последовательность VL SEQ ID NO: 53.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент включает последовательность SEQ ID NO: 49 и последовательность VL SEQ ID NO: 52.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент включает последовательность SEQ ID NO: 57 и последовательность VL SEQ ID NO: 64.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент включает область VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент включает последовательность SEQ ID NO: 58 и последовательность VL SEQ ID NO: 63.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент включает константную область человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей константную область человека, особенно домен человека СН1 и/или CL. Примерами последовательностей константных доменов человека являются последовательности SEQ ID NO: 37 и 38 (домены каппа и лямбда CL человека, соответственно) и SEQ ID NO: 39 (константные домены СН1-СН2-СН3 тяжелой цепи IgG₁ человека). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент включает константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37 или SEQ ID NO: 38, особенно аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37. В частности, константная область легкой цепи может включать мутации аминокислот, согласно описанному в настоящем изобретении под термином «модификации заряда», и/или может включать делецию или замещения одной или нескольких (в частности двух) N-концевых аминокислот в случае молекулы кроссоверного Fab. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент включает константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична домену СН1, содержащемся в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39. В частности, константная область тяжелой цепи (в частности домен СН1) может включать мутации аминокислот, согласно описанному в настоящем изобретении под термином «модификации заряда».

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения каждый третий и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, и третий антигенсвязывающий фрагмент идентичен первому антигенсвязывающему фрагменту. Таким образом, в этих вариантах осуществления настоящего изобретения первый и третий антигенсвязывающий фрагмент имеют одинаковые аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепей, а также одинаковое расположение доменов (т.е. обычное или кроссоверное). Кроме того, в этих вариантах осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент содержит те же аминокислотные замещения, если таковые имеются, что и первый антигенсвязывающий фрагмент. Например, аминокислотные замещения, описанные в настоящем изобретении под термином «модификации заряда», могут быть произведены в константном домене CL и константном домене СН1 каждого как первого антигенсвязывающего фрагмента, так и третьего антигенсвязывающего фрагмента. В другом варианте указанные аминокислотные замещения могут быть произведены в константном домене CL и в константном домене СН1 второго антигенсвязывающего фрагмента (который в конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения также является молекулой Fab), но не в константном домене CL и константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента и третьего антигенсвязывающего фрагмента.

Подобно первому антигенсвязывающему фрагменту, третий антигенсвязывающий фрагмент, в частности, является обычной молекулой Fab. Однако в настоящем изобретении также рассматривают такие варианты осуществления, в которых первый и третий антигенсвязывающие фрагменты являются кроссоверными молекулами Fab (и второй антигенсвязывающий фрагмент является обычной молекулой Fab). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения первый и третий антигенсвязывающие фрагменты являются обычной молекулой Fab, а второй антигенсвязывающий фрагмент является кроссоверной молекулой Fab, согласно описанию настоящего изобретения, то есть молекулой Fab, в которой вариабельные домены VH и VL или константные домены CL и СН1 тяжелой и легкой цепей Fab обмениваются/заменяются друг на друга. В других вариантах осуществления настоящего изобретения первый и третий антигенсвязывающие фрагменты являются кроссоверной молекулой Fab, а второй антигенсвязывающий фрагмент является обычной молекулой Fab.

Если имеется третий антигенсвязывающий фрагмент, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый и третий антигенсвязывающие фрагменты связываются с GPRC51), а второй антигенсвязывающий фрагмент связывается со вторым антигеном, в частности активирующим Т-клеточным антигеном, особенно CD3, наиболее предпочтительно CD3 эпсилон.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц. Первая и вторая субъединицы домена Fc способны стабильно ассоциировать.

Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению может иметь разные конфигурации, т.е. первый, второй (и необязательно третий) антигенсвязывающие фрагменты могут быть слиты друг с другом и с доменом Fc различными методами. Компоненты могут быть слиты друг с другом напрямую или предпочтительно через один или несколько подходящих пептидных линкеров. Слияние молекулы Fab происходит с N концом субъединицы домена Fc, это обычно происходит через шарнирную область иммуноглобулина.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения первый и второй антигенсвязывающие фрагменты являются молекулами Fab, а второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы домена Fc. В таких вариантах осуществления настоящего изобретения первый антигенсвязывающий фрагмент может быть слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента или с N-концом другой субъединицы домена Fc. В конкретных таких вариантах осуществления настоящего изобретения указанный первый антигенсвязывающий фрагмент является обычной молекулой Fab, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой кроссоверную молекулу Fab по настоящему изобретению, т.е. молекулу Fab, в которой вариабельные домены VH и VL или константные домены CL и СН1 тяжелой и легкой цепей Fab обмениваются/заменяются друг на друга. В других подобных вариантах осуществления настоящего изобретения указанная первая молекула Fab является кроссоверной молекулой Fab, а вторая молекула Fab является обычной молекулой Fab.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый и второй антигенсвязывающие фрагменты являются молекулами Fab, а второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по существу состоит из первой и второй молекулы Fab, домена Fc, состоящего из первой и второй субъединицы, и, необязательно, одного или нескольких пептидных линкеров, где первая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab, а вторая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы домена Fc. Такая конфигурация схематически изображена на фиг. 1Ж и 1Л (со вторым антигенсвязывающим доменом в этих примерах, являющимся VH/VL кроссоверной молекулой Fab). Необязательно легкая цепь Fab первой молекулы Fab и легкая цепь Fab второй молекулы Fab могут быть дополнительно слиты друг с другом.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения и первый, и второй антигенсвязывающий фрагмент являются молекулой Fab, а также и первый, и второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по существу состоит из первой и второй молекулы Fab, домена Fc, состоящего из первой и второй субъединиц, и, необязательно, одного или нескольких пептидных линкеров, причем и первая, и вторая молекула Fab слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc. Такая конфигурация схематически изображена на фиг. 1А и 1Г (в этих примерах второй антигенсвязывающий домен является VH/VL кроссоверной молекулой Fab, а первый антигенсвязывающий фрагмент является обычной молекулой Fab). Первая и вторая молекула Fab могут быть слиты с доменом Fc напрямую или через пептидный линкер. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения и первая, и вторая молекула Fab слита с доменом Fc через шарнирную область иммуноглобулина. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения шарнирная область иммуноглобулина является шарнирной областью IgG₁ человека, в частности, если домен Fc является доменом Fc IgG₁.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения и первый, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, и первый антигенсвязывающий фрагмент слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы домена Fc. В таких вариантах осуществления настоящего изобретения второй антигенсвязывающий фрагмент может быть слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента или (согласно описанному выше) с N-концом другой субъединицы домена Fc. В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения указанный первый антигенсвязывающий фрагмент является обычной молекулой Fab, а второй антигенсвязывающий фрагмент является кроссоверной молекулой Fab согласно описанному в настоящем изобретении, т.е. молекулой Fab, в которой вариабельные домены VH и VL или константные домены CL и СН1 тяжелой и легкой цепей Fab обмениваются/заменяются друг на друга. В других таких вариантах осуществления настоящего изобретения указанная первая молекула Fab является кроссоверной молекулой Fab, а вторая молекула Fab является обычной молекулой Fab.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения и первый, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, и первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы домена Fc, и второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента. В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по существу состоит из первой и второй молекулы Fab, домена Fc, состоящего из первой и второй субъединиц, и, необязательно, одного или нескольких пептидных линкеров, причем вторая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первой молекулы Fab, и первая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы домена Fc. Такая конфигурация схематически изображена на фиг. 1З и 1М (в этих примерах второй антигенсвязывающий домен представляет собой VH/VL кроссоверную молекулу Fab, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой обычную молекулу Fab). Необязательно легкая цепь Fab первой молекулы Fab и легкая цепь Fab второй молекулы Fab могут быть дополнительно слиты друг с другом.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения третий антигенсвязывающий фрагмент, в частности третья молекула Fab, слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы домена Fc. В конкретных таких вариантах осуществления настоящего изобретения и первая, и третья указанные молекулы Fab являются обычной молекулой Fab, а вторая молекула Fab является кроссоверной молекулой Fab согласно описанию настоящего изобретения, то есть молекулой Fab, в которой вариабельные домены VH и VL или константные домены CL и СН1 тяжелой и легкой цепей Fab обмениваются/заменяются друг на друга. В других таких вариантах осуществления настоящего изобретения указанные и первая, и третья молекулы Fab являются кроссоверными молекулами Fab, а вторая молекула Fab является обычной молекулой Fab.

В одном подобных варианте осуществления настоящего изобретения каждый второй и третий антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc, и первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по существу состоит из первой, второй и третьей молекулы Fab, домена Fc, состоящего из первой и второй субъединиц, и, необязательно, одного или нескольких пептидных линкеров, где первая молекула Fab слита на С- конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab, а вторая молекула Fab слита на С- конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой субъединицы домен Fc, и третья молекула Fab слита на С- конце тяжелой цепи Fab с N-концом второй субъединицы Fc-домена. Такая конфигурация схематично изображена на фиг. 1Б и 1Д (в этих примерах второй антигенсвязывающий фрагмент является VH/VL кроссоверной молекулы Fab, а первый и третий антигенсвязывающие фрагменты являются обычной молекулой Fab), а также на фиг. 1К и 1О (в этих примерах второй антигенсвязывающий фрагмент является обычной молекулой Fab, а первый и третий антигенсвязывающий фрагмент являются VH/VL кроссоверной молекулы Fab). Вторая и третья молекулы Fab могут быть слиты с доменом Fc напрямую или через пептидный линкер. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения вторая и третья молекула Fab обе слиты с доменом Fc через шарнирную область иммуноглобулина. В другом варианте осуществления настоящего изобретения шарнирная область иммуноглобулина является шарнирной областью IgG₁ человека, особенно если домен Fc является доменом Fc IgG₁. Необязательно легкая цепь Fab первой молекулы Fab и легкая цепь Fab второй молекулы Fab могут быть дополнительно слиты с друг с другом.

В другом подобном варианте осуществления настоящего изобретения первый и третий антигенсвязывающий фрагмент слиты на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc, а второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула состоит из первой, второй и третьей молекулы Fab, домена Fc, состоящего из первой и второй субъединиц, и необязательно одного или нескольких пептидных линкеров, причем вторая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первой молекулы Fab, и первая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой субъединицы домена Fc, и где третья молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом второй субъединицы домена Fc. Такая конфигурация схематично изображена на фиг. 1В и 1Е (в этих примерах второй антигенсвязывающий фрагмент является VH/VL кроссоверной молекулы Fab, а первый и третий антигенсвязывающий фрагмент являются обычной молекулой Fab) и на фиг. 1И и 1Н (в этих примерах второй антигенсвязывающий фрагмент является обычной молекулойу Fab, а первый и третий антигенсвязывающий фрагмент является VH/VL кроссоверной молекулы Fab). Первая и третья молекулы Fab могут быть слиты с доменом Fc напрямую или через пептидный линкер. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первая и третья молекулы Fab могут быть слиты с доменом Fc через шарнирную область иммуноглобулина. В определенном варианте осуществления настоящего изобретения шарнирная область иммуноглобулина является шарнирно областью IgG₁ человека, особенно если домен Fc является доменом Fc IgG₁. Необязательно легкая цепь Fab первой молекулы Fab и легкая цепь Fab второй молекулы Fab могут быть дополнительно слиты друг с другом.

В конфигурациях биспецифической антигенсвязывающей молекулы, в которых молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом каждой из субъединиц домена Fc через шарнирные области иммуноглобулина, две молекулы Fab, шарнирные области и домен Fc, по существу, образуют молекулу иммуноглобулина. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения молекула иммуноглобулина относится к классу иммуноглобулина IgG. В еще одном более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения иммуноглобулином является иммуноглобулин подкласса IgG₁. В другом варианте осуществления настоящего изобретения иммуноглобулином является иммуноглобулин подкласса IgG₄. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуноглобулином является иммуноглобулин человека. В других вариантах осуществления настоящего изобретения иммуноглобулином является химерный иммуноглобулин или гуманизированный иммуноглобулин. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения иммуноглобулин содержит константную область человека, особенно область Fc человека.

В некоторых биспецифических антигенсвязывающих молекулах по настоящему изобретению легкая цепь Fab первой молекулы Fab и легкая цепь Fab второй молекулы Fab слиты друг с другом, необязательно через пептидный линкер. В зависимости от конфигурации первой и второй молекулы Fab, легкая цепь Fab первой молекулы Fab может быть слита на С-конце с N-концом легкой цепи Fab второй молекулы Fab, или легкая цепь Fab второй молекулы Fab может быть слита на С-конце с N-концом легкой цепи Fab первой молекулы Fab. Слияние легких цепей Fab первой и второй молекулы Fab дополнительно снижает неправильное спаривание несоответствующих тяжелой и легкой цепей Fab, а также уменьшает количество плазмид, необходимых для экспрессии некоторых биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению.

Антигенсвязывающие фрагменты могут быть слиты с доменом Fc или друг с другом непосредственно или через пептидный линкер, включающий одну или несколько аминокислот, обычно примерно 2-20 аминокислот. Пептидные линкеры известны в данной области и описаны в настоящем изобретении. Применимые неиммуногенные линкеры включают, например, пептидные линкеры (G₄S)_n, (SG₄)_n, (G₄S)_n или G₄(SG₄)_n. Обычно «n» является целым числом от 1 до 10, обычно от 2 до 4. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанный пептидный линкер имеет в длину по меньшей мере 5 аминокислот, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения от 5 до 100, и в другом варианте осуществления настоящего изобретения от 10 до 50 аминокислот. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанным пептидным линкером является (GxS)_n или (GxS)_nG_m, где G=глицину, S=серину, и (х=3, n=3, 4, 5 или 6, и m=0, 1, 2 или 3) или (х=4, n=2, 3, 4 или 5 и m=0, 1, 2 or 3), в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения х=4 и n=2 или 3, в другом варианте осуществления настоящего изобретения х=4 и n=2. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанным пептидным линкером является (G₄S)₂. Особенно подходящим пептидным линкером для слияния легких цепей Fab первой и второй молекулы Fab друг с другом является (G₄S)₂. Типичный пептидный линкер, подходящий для соединения тяжелых цепей Fab первого и второго фрагментов Fab, включает последовательность (D)-(G₄S)₂ (SEQ ID NO 43 и 44). Другой подобный применимый линкер содержит последовательность (G₄S)₄. Дополнительно линкеры могут включать (часть) шарнирной области иммуноглобулина. В частности, если молекула Fab слита с N-концом субъединицы домена Fc, она может быть слита с помощью шарнирной области иммуноглобулина или ее части с дополнительным пептидным линкером или без него.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab включает тяжелую цепь кроссоверного Fab, где тяжелая вариабельная область цепи заменена вариабельной областью легкой цепи), которая, в свою очередь, имеет карбокси-концевую пептидную связь с субъединицей домена Fc (VL₍₂₎-СН1₍₂₎-СН2-СН3(-СН4)), и полипептид, в котором тяжелая цепь Fab первой молекулы Fab имеет карбоксиконцевую пептидную связь с субъединицей домена Fc (VH₍₁₎-CH1₍₁₎-CH2-CH3(-CH4)). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно включает полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab имеет карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab (VH₍₂₎-CL₍₂₎) и полипептидом легкой цепи Fab первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎). В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения полипептиды ковалентно связаны, например, дисульфид ной связью.

В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab содержит тяжелую цепь кроссоверного Fab, где тяжелая константная область цепи заменена константной областью легкой цепи), которая, в свою очередь, имеет карбокси-концевую пептидную связь с субъединицей домена Fc (VH₍₂₎-CL₍₂₎-CH2-CH3(-CH4)), и полипептид, в котором тяжелая цепь Fab первой молекулы Fab имеет карбокси-концевую пептидную связь с субъединицей домена Fc (VH₍₁₎-CH1₍₁₎-CH2-CH3(-CH4)). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно включает полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab (VL₍₂₎-CH1₍₂₎) и полипептид легкой цепи Fab первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎). В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения полипептиды ковалентно связаны, например, дисульфидной связью.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула включает полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab включает тяжелую цепь кроссовера Fab, в которой вариабельная область тяжелой цепи заменена вариабельной областью легкой цепи), которая, в свою очередь, имеет карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью Fab первой молекулы Fab, которая в свою очередь разделяет карбоксиконцевую пептидную связь с субъединицей домена Fc (VL₍₂₎-CH1₍₂₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎-CH2-CH3(-CH4)). В других вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула включает полипептид, в котором тяжелая цепь Fab первой молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab, которая, в свою очередь, имеет общую пептидную связь на карбокси-конце с константной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab включает тяжелую цепь кроссовера Fab, где вариабельная область тяжелой цепи заменена вариабельной областью легкой цепи), которая, в свою очередь, имеет карбокси-концевую пептидную связь с субъединицей домена Fc (VH₍₁₎-CH1₍₁₎-VL₍₂₎-CH1₍₂₎-CH2-СН3(-СН4)).

В некоторых из этих вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула включает полипептид легкой цепи кроссовера Fab второй молекулы Fab, где вариабельная область тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab (VH₍₂₎-CL₍₂₎), и полипептид легкой цепи Fab первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎). В других подобных вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно включает полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab, которая, в свою очередь, имеет общую пептидную связь на карбокси-конце с полипептидом легкой цепи Fab первой молекулы Fab (VH₍₂₎-CL₍₂₎-VL₍₁₎-CL₍₁₎), или полипептид, в котором полипептид легкой цепи Fab первой молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab, которая, в свою очередь, разделяет карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎-VH₍₂₎-CL₍₂₎), в зависимости от ситуации.

Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по таким вариантам осуществления настоящего изобретения может дополнительно включать (i) полипептид субъединицы домена Fc (СН2-СН3(-СН4)), или (ii) полипептид, в котором тяжелая цепь Fab третьей молекулы Fab имеет карбокси-концевую пептидную связь с субъединицей домена Fc (VH₍₃₎-CH1₍₃₎-CH2-CH3(-CH4)) и полипептид легкой цепи Fab третьей молекулы Fab (VL₍₃₎-CL₍₃₎). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полипептиды ковалентно связаны, например, дисульфидной связью.

В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула включает полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab содержит тяжелую цепь кроссовера Fab, где константная область тяжелой цепи заменена константной областью легкой цепи), который, в свою очередь, имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью Fab первой молекулы Fab, которая, в свою очередь, имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с субъединицей домена Fc (VH₍₂₎-CL₍₂₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎-CH2-CH3(-CH4)). В других вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит полипептид, в котором тяжелая цепь Fab первой молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab, которая, в свою очередь, имеет общую пептидную связь на карбокси-конце с константной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab (то есть вторая молекула Fab включает тяжелую цепь кросссовера Fab, где константная область тяжелой цепи заменена константной областью легкой цепи), которая, в свою очередь, имеет карбокси-концевую общую пептидную связь с субъединицей домена Fc (VH₍₁₎-CH1₍₁₎-VH₍₂₎-CL₍₂₎-CH2-CH3(-CH4)).

В некоторых подобных вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид легкой цепи кроссоверного Fab второй молекулы Fab, где вариабельная область легкой цепи Fab второй молекулы Fab имеет карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab (VL₍₂₎-CH1₍₂₎), и полипептид легкой цепи Fab первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎). В других подобных вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab, которая, в свою очередь, имеет общую пептидную связь на карбокси-конце с полипептидом легкой цепи Fab первой молекулы Fab (VL₍₂₎-CH1₍₂₎-VL₍₁₎-CL₍₁₎), или полипептид, в котором полипептид легкой цепи Fab первой молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab, которая, в свою очередь, имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎-VL₍₂₎-CH1₍₂₎), по мере необходимости.

Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по таким вариантам осуществления настоящего изобретения может дополнительно включать (i) полипептид субъединицы домена Fc (СН2-СН3(-СН4)), или (ii) полипептид, в котором тяжелая цепь Fab третьей молекулы Fab имеет карбоксиконцевую пептидную связь с субъединицей домена Fc (VH₍₃₎-CH1₍₃₎-CH2-CH3(-CH4)) и полипептид легкой цепи Fab третьей молекулы Fab (VL₍₃₎-CL₍₃₎). В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения полипептиды ковалентно связаны, например, дисульфидной связью.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула не содержит домена Fc. В определенных подобных вариантах осуществления настоящего изобретения каждая из указанных первой и, если присутствует, третьей молекул Fab, являются обычной молекулой Fab, а вторая молекула Fab является кроссоверной молекулой Fab согласно описанию настоящего изобретения, т.е. молекулой Fab, в которой вариабельные домены VH и VL или константные домены CL и СН1 тяжелой и легкой цепей Fab обмениваются/заменяются друг другом. В других подобных вариантах осуществления настоящего изобретения, каждая из указанных первой и, если присутствует, третьей молекулы Fab, представляют собой кроссоверную молекулу Fab, а вторая молекула Fab является обычной молекулой Fab.

В определенных подобных вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по существу состоит из первого и второго антигенсвязывающего фрагмента и, необязательно, одного или нескольких пептидных линкеров, где первый и второй антигенсвязывающий фрагмент являются молекулами Fab, а первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента. Такая конфигурация схематически изображена на фиг. 1П и 1У (в этих примерах со вторым антигенсвязывающим домен, являющимся VH/VL кроссоверной молекулой Fab, и первым антигенсвязывающим фрагментом, являющимся обычной молекулой Fab).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения первая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab, а биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит третий антигенсвязывающий фрагмент, в частности, третью молекулу Fab, в которой указанная третья молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первой молекулы Fab. В некоторых подобных вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по существу состоит из первой, второй и третьей молекулы Fab и, необязательно, одного или нескольких пептидных линкеров, причем первая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab, и третья молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первой молекулы Fab. Такая конфигурация схематически изображена на фигурах 1С и 1X (в этих примерах второй антигенсвязывающий домен является VH/VL кроссоверной молекулой Fab, а первый и антигенсвязывающий фрагмент, являются обычными молекулами Fab) или на фигурах 1Ш и 1Э (в этих примерах второй антигенсвязывающий домен является обычной молекулой Fab, а каждая первый и третий антигенсвязывающие фрагменты являются VH/VL кроссоверной молекулой Fab).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения вторая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи с N-концом тяжелой цепи первой молекулы Fab, а биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно включает третий антигенсвязывающий фрагмент, в частности третью молекулу Fab, причем третья молекула Fab слита на N-конце тяжелой цепи с С-концом тяжелой цепи первой молекулы Fab. В некоторых подобных вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по существу состоит из первой, второй и третьей молекулы Fab и, необязательно, одного или нескольких пептидных линкеров, причем вторая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи с N-концом тяжелой цепи первой молекулы Fab, а третья молекула Fab слита на N-конце тяжелой цепи с С-концом тяжелой цепи первой молекулы Fab. Такая конфигурация схематически изображена на фигурах 1Т и Щ (в этих примерах второй антигенсвязывающий домен является VH/VL_кроссоверной молекулой Fab, а первый домен и антигенсвязывающий фрагмент являются обычными молекулами Fab) или на фигурах 1Ч и 1Щ (в этих примерах второй антигенсвязывающий домен является обычной молекулой Fab, а первый домен и третий антигенсвязывающий фрагмент являются VH/VL_кроссоверными молекулами Fab).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению содержит полипептид, в котором тяжелая цепь первой молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью легкой цепи второй молекулы Fab, которая, в свою очередь, имеет общую пептидную связь на карбокси-конце с константной областью тяжелой цепи второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab включает тяжелую цепь кроссоверной молекулы Fab, где вариабельная область тяжелой цепи заменена вариабельной областью легкой цепи) (VH₍₁₎-CH1₍₁₎-VL₍₂₎-CH1₍₂₎). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи второй молекулы Fab (VH₍₂₎-CL₍₂₎) и полипептид легкой цепи первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab включает тяжелую цепь кроссоверной молекулы Fab, где вариабельная область тяжелой цепи заменена вариабельной областью легкой цепи), которая, в свою очередь, имеет карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью первой молекулы Fab (VL₍₂₎-CH1₍₂₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи второй молекулы Fab (VH₍₂₎-CL₍₂₎) и полипептид легкой цепи первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab содержит тяжелую цепь кроссоверной молекулы Fab, в которой константная область тяжелой цепи заменена константной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью первой молекулы Fab (VH₍₂₎-CL₍₂₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи второй молекулы Fab (VL₍₂₎-CH1₍₂₎) и полипептид легкой цепи первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab содержит тяжелую цепь кроссоверной молекулы Fab, в которой вариабельная область тяжелой цепи заменена вариабельной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью первой молекулы Fab (VL₍₂₎-CH1₍₂₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи второй молекулы Fab (VH₍₂₎-CL₍₂₎) и полипептид легкой цепи первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению содержит полипептид, в котором тяжелая цепь третьей молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью первой молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью легкой цепи второй молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab содержит тяжелую цепь кроссоверной молекулы Fab, в которой вариабельная область тяжелой цепи заменена вариабельной областью легкой цепи) (VH₍₃₎-CH1₍₃₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎-VL₍₂₎-CH1₍₂₎). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи второй молекулы Fab (VH₍₂₎-CL₍₂₎) и полипептид легкой цепи первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид легкой цепи третьей молекулы Fab (VL₍₃₎-CL₍₃₎).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению содержит полипептид, в котором тяжелая цепь третьей молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью первой молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью тяжелой цепи второй молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab содержит тяжелую цепь кроссоверной молекулы Fab, в которой константная область тяжелой цепи заменена константной областью легкой цепи) (VH₍₃₎-CH1₍₃₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎-VH₍₂₎-CL₍₂₎). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи второй молекулы Fab (VL₍₂₎-CH1₍₂₎) и полипептид легкой цепи Fab первой молекулы (VL₍₁₎-CL₍₁₎). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид легкой цепи третьей молекулы Fab (VL₍₃₎-CL₍₃₎).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab содержит тяжелую цепь кроссоверной молекулы Fab, в которой вариабельная область тяжелой цепи заменена вариабельной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью первой молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью третьей молекулы Fab (VL₍₂₎-CH1₍₂₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎-VH₍₃₎-CH1₍₃₎). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи второй молекулы Fab (VH₍₂₎-CL₍₂₎) и полипептид легкой цепи первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид легкой цепи третьей молекулы Fab (VL₍₃₎-CL₍₃₎).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab содержит тяжелую цепь кроссоверной молекулы Fab, в которой вариабельная область тяжелой цепи заменена вариабельной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью первой молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью третьей молекулы Fab (VH₍₂₎-CL₍₂₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎-VH₍₃₎-CH1₍₃₎). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи второй молекулы Fab (VL₍₂₎-CH1₍₂₎) и полипептид легкой цепи первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид легкой цепи третьей молекулы Fab (VL₍₃₎-CL₍₃₎).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению содержит полипептид, в котором тяжелая цепь второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью легкой цепи первой молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab (т.е. первая молекула Fab содержит тяжелую цепь кроссоверной молекулы Fab, в которой вариабельная область тяжелой цепи заменена вариабельной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью легкой цепи третьей молекулы Fab которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи третьей молекулы Fab (т.е. третья молекула Fab содержит тяжелую цепь кроссоверной молекулы Fab, в которой вариабельная область тяжелой цепи заменена вариабельной областью легкой цепи) (VH₍₂₎-CH1₍₂₎-VL₍₁₎-CH1₍₁₎-VL₍₃₎-CH1₍₃₎). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи первой молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи первой молекулы Fab (VH₍₁₎-CL₍₁₎) и полипептид легкой цепи второй молекулы Fab (VL₍₂₎-CL₍₂₎). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи третьей молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи третьей молекулы Fab (VH₍₃₎-CL₍₃₎).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению содержит полипептид, в котором тяжелая цепь второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью тяжелой цепи второй молекулы Fab первой молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи первой молекулы Fab (т.е. первая молекула Fab содержит тяжелую цепь кроссоверной молекулы Fab, в которой константная область тяжелой цепи заменена константной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью тяжелой цепи третьей молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи третьей молекулы Fab (т.е. третья молекула Fab содержит тяжелую цепь кроссоверной молекулы Fab, в которой константная область тяжелой цепи заменена константной областью легкой цепи) (VH₍₂₎-CH1₍₂₎-VH₍₁₎-CL₍₁₎-VH₍₃₎-CL₍₃₎). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи первой молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CH1₍₁₎) и полипептид легкой цепи второй молекулы Fab (VL₍₂₎-CL₍₂₎). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи третьей молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи третьей молекулы Fab (VL₍₃₎-CH1₍₃₎).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи третьей молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи третьей молекулы Fab (т.е. третья молекула Fab содержит тяжелую цепь кроссоверной молекулы Fab, в которой вариабельная область тяжелой цепи заменена вариабельной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью легкой цепи первой молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи первой молекулы Fab (т.е. первая молекула Fab содержит тяжелую цепь кроссоверной молекулы Fab, в которой вариабельная область тяжелой цепи заменена вариабельной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью второй молекулы Fab (VL₍₃₎-CH1₍₃₎-VL₍₁₎-CH1₍₁₎-VH₍₂₎-CH1₍₂₎). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи первой молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи первой молекулы Fab (VH₍₁₎-CL₍₁₎) и полипептид легкой цепи второй молекулы Fab (VL₍₂₎-CL₍₂₎). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи третьей молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи третьей молекулы Fab (VH₍₃₎-CL₍₃₎).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи третьей молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи третьей молекулы Fab (т.е. третья молекула Fab содержит тяжелую цепь кроссоверной молекулы Fab, в которой константная область тяжелой цепи заменена константной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью тяжелой цепи первой молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи первой молекулы Fab (т.е. первая молекула Fab содержит тяжелую цепь кроссоверной молекулы Fab, в которой константная область тяжелой цепи заменена константной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью второй молекулы Fab (VH₍₃₎-CL₍₃₎-VH₍₁₎-CL₍₁₎-VH₍₂₎-CH1₍₂₎). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи первой молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CH1₍₁₎) и полипептид легкой цепи второй молекулы Fab (VL₍₂₎-CL₍₂₎). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи третьей молекулы Fab имеет общую карбокси концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи третьей молекулы Fab (VL₍₃₎-CH1₍₃₎).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 83, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 84 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 87, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 89;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и идентичен первому антигенсвязывающему фрагменту; и

г) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц; где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по п. б), и третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) все слиты на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом субъединиц домена Fc по п. г), или

(ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) и первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) каждый слиты на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 83, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 85 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 87, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 89;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и идентичен первому антигенсвязывающему фрагменту; и

г) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц; где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по п. б), второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) и третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) все слиты на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г), или

(ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а), а первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) все слиты на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и идентичен первому антигенсвязывающему фрагменту; и

г) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц; где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по п. б), и второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б), а также третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) все слиты на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г), или

(ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а), первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) каждый слиты на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 96 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и идентичен первому антигенсвязывающему фрагменту; и

г) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц; где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по п. б), и второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б), а также третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) все слиты на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г), или

(ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а), первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) каждый слиты на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 92 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и идентичен первому антигенсвязывающему фрагменту; и

г) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц; где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по п. б), и второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б), а также третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) все слиты на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г), или

(ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а), первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) каждый слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 1, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 2 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 4, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 5 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 6;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и идентичен первому антигенсвязывающему фрагменту; и

г) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц; где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по п. б), и второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б), а также третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) все слиты на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г), или

(ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а), первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) каждый слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 7, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 8 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 10, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 11 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 12;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и идентичен первому антигенсвязывающему фрагменту; и

г) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц; где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по п. б), и второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б), а также третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) все слиты на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г), или

(ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а), первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) каждый слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 83, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 84 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 87, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 89;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц; где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) каждый слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 83, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 85 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 87, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 89;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц; где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) каждый слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц;

где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) каждый слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 96 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц; где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) каждый слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 92 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц; где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) каждый слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 1, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 2 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 4, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 5 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 6;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц; где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) каждый слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 7, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 8 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 10, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 11 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 12;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц;

где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) каждый слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в).

Во всех различных конфигурациях биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению описанные в настоящем изобретении аминокислотные замещения, если они имеются, могут находиться либо в доменах СН1 и CL первого и (если имеется) третьего антигенсвязывающего фрагмента/молекулы Fab, либо в доменах СН1 и CL второго антигенсвязывающего фрагмента/молекулы Fab. Предпочтительно они находятся в доменах СН1 и CL первого и (если имеется) третьего антигенсвязывающего фрагмента/молекулы Fab. В соответствии с целью настоящего изобретения, если аминокислотные замещения по настоящему изобретению произведены в первом (и, если имеется, третьем) антигенсвязывающем фрагменте/молекуле Fab, такие аминокислотные замещения не производятся во втором антигенсвязывающем фрагменте/молекуле Fab. Наоборот, если аминокислотные замещения по настоящему изобретению произведены во втором антигенсвязывающем фрагменте/молекуле Fab, такие аминокислотные замещения не производят в первом (и, если имеется, третьем) антигенсвязывающем фрагменте/молекуле Fab. Аминокислотные замещения, в частности, производятся в биспецифических антигенсвязывающих молекулах, содержащих молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга.

В определенных вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула, в частности, когда аминокислотные замещения по настоящему изобретению производят в первом (и, если имеется, третьем) антигенсвязывающем фрагменте/молекуле Fab, константный домен CL первой (и, если имеется, третьей) молекулы Fab относится к изотипу каппа. В других вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению, в частности, где аминокислотные замещения по настоящему изобретению производят во втором антигенсвязывающем фрагменте/молекуле Fab, константный домен CL второго антигенсвязывающего фрагмента/молекулы Fab относится к изотипу каппа. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения константный домен CL первой (и, если имеется, третьей) молекулы Fab/антигенсвязывающего фрагмента относятся к изотипу каппа.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 83, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 84 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 87, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 89;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц;

где в константной области CL первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 124 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat) и аминокислота в положении 123 заменена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация по Kabat) (обычно аргинином (R)), и где в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 147 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу) и аминокислота в пложении 213 заменена глутаминовой кислотой (E) (нумерация ро Kabat EU индексу; и

где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по п. б), а второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в), или

(ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а), и первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 83, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 85 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 87, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 89;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 124 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat) и аминокислота в положении 123 заменена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация по Kabat) (обычно аргинином (R)), и где в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 147 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу) и аминокислота в положении 213 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу); и

где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по п. б), а второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в), или

(ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а), и первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 124 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat), а аминокислота в положении 123 заменена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация по Kabat) (обычно аргинином (R)), и где в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 147 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу), и аминокислота в положении 213 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу); и

где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по п. б), а второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в), или

(ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а), и первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 96 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 124 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat), а аминокислота в положении 123 заменена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация по Kabat) (обычно аргинином (R)), и где в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 147 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу), и аминокислота в положении 213 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу); и

где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по п. б), а второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в), или

(ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а), и первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 92 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 124 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat), а аминокислота в положении 123 заменена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация по Kabat) (обычно аргинином (R)), и где в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 147 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу), и аминокислота в положении 213 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу); и

где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по п. б), а второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в), или

(ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а), и первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 1, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 2 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 4, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 5 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 6;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 124 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat), а аминокислота в положении 123 заменена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация по Kabat) (обычно аргинином (R)), и где в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 147 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу), и

аминокислота в пложении 213 заменена глутаминовой кислотой (E) (нумерация ро Kabat EU индексу); и

где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по п. б), а второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в), или

(ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а), и первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 7, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 8 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 10, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 11 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 12;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 124 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat), а аминокислота в положении 123 заменена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация по Kabat) (обычно аргинином (R)), и где в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 147 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу), и аминокислота в положении 213 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу); и

где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по п. б), а второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в), или

(ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а), и первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 83, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 84 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 87, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 89;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и идентичен первому антигенсвязывающему фрагменту; и

г) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по п. в) аминокислота в положении 124 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat), а аминокислота в положении 123 заменена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация по Kabat) (обычно аргинином (R)), и где в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по п. в) аминокислота в положении 147 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу), и аминокислота в положении 213 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу); и

где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по п. б), а второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) и третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) гибридизированы по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г), или

(ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а), первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) каждый гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 83, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 85 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 87, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 89;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и идентичен первому антигенсвязывающему фрагменту; и

г) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по п. в) аминокислота в положении 124 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat), а аминокислота в положении 123 заменена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация по Kabat) (обычно аргинином (R)), и где в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по п. в) аминокислота в положении 147 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу), и аминокислота в положении 213 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу); и

где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по п. б), а второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) и третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) каждый гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в), или

(ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а), первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) каждый гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и идентичен первому антигенсвязывающему фрагменту; и

г) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по п. в) аминокислота в положении 124 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat), а аминокислота в положении 123 заменена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация по Kabat) (обычно аргинином (R)), и где в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по п. в) аминокислота в положении 147 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу), и аминокислота в положении 213 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу); и

где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по п. б), а второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) и третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) каждый гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г), или

(ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а), первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) каждый гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область,

определяющую комплементарность легкой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 96 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и идентичен первому антигенсвязывающему фрагменту; и

г) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по п. в) аминокислота в положении 124 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat), а аминокислота в положении 123 заменена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация по Kabat) (обычно аргинином (R)), и где в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по п. в) аминокислота в положении 147 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу), и аминокислота в положении 213 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу); и

где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по п. б), а второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) и третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) каждый гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г), или

(ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а), первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) каждый гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 92 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и идентичен первому антигенсвязывающему фрагменту; и

г) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по п. в) аминокислота в положении 124 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat), а аминокислота в положении 123 заменена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация по Kabat) (обычно аргинином (R)), и где в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по п. в) аминокислота в положении 147 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу), и аминокислота в положении 213 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу); и

где:

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по п. б), а второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) и третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) каждый гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г), или

(ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а), первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) каждый гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 1, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 2 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 4, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 5 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 6;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и идентичен первому антигенсвязывающему фрагменту; и

г) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по п. в) аминокислота в положении 124 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat), а аминокислота в положении 123 заменена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация по Kabat) (обычно аргинином (R)), и где в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по п. в) аминокислота в положении 147 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу), и аминокислота в положении 213 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу); и

где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по п. б), а второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) и третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) каждый гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г), или

(ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а), первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) каждый гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 7, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 8 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 10, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 11 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 12;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и идентичен первому антигенсвязывающему фрагменту; и

г) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по п. в) аминокислота в положении 124 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat), а аминокислота в положении 123 заменена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация по Kabat) (обычно аргинином (R)), и где в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по п. в) аминокислота в положении 147 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу), и аминокислота в положении 213 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу); и

где

(i) первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по п. б), а второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) и третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) каждый гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г), или

(ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а), первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и третий антигенсвязывающий фрагмент по п. в) каждый гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. г).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 83, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 84 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 87, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 89;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по п. в) аминокислота в положении 124 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat), а аминокислота в положении 123 заменена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация по Kabat) (обычно аргинином (R)), и где в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 147 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу), и аминокислота в положении 213 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу); и

где первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и второй антигенсвязыывющий фрагмент по п. б) каждый слит на С-конце тяжелой цепи Fab c N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 83, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 85 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 87, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 89;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 124 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat), а аминокислота в положении 123 заменена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация по Kabat) (обычно аргинином (R)), и где в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 147 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу), и аминокислота в положении 213 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу); и

где первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и второй антигенсвязыывющий фрагмент по п. б) каждый слит на С-конце тяжелой цепи Fab c N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 124 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat), а аминокислота в положении 123 заменена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация по Kabat) (обычно аргинином (R)), и где в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 147 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу), и аминокислота в положении 213 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу); и

где первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и второй антигенсвязыывющий фрагмент по п. б) каждый слит на С-конце тяжелой цепи Fab c N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 96 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 124 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat), а аминокислота в положении 123 заменена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация по Kabat) (обычно аргинином (R)), и где в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 147 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу), и аминокислота в положении 213 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу); и

где первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и второй антигенсвязыывющий фрагмент по п. б) каждый слит на С-конце тяжелой цепи Fab c N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 90, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 92 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 94, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 97;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 124 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat), а аминокислота в положении 123 заменена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация по Kabat) (обычно аргинином (R)), и где в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 147 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу), и аминокислота в положении 213 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу); и

где первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и второй антигенсвязыывющий фрагмент по п. б) каждый слит на С-конце тяжелой цепи Fab c N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 1, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 2 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 4, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 5 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 6;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 124 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat), а аминокислота в положении 123 заменена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация по Kabat) (обычно аргинином (R)), и где в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 147 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу), и аминокислота в положении 213 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу); и

где первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и второй антигенсвязыывющий фрагмент по п. б) каждый слит на С-конце тяжелой цепи Fab c N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 7, HCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 8 и HCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 последовательности SEQ ID NO: 10, LCDR 2 последовательности SEQ ID NO: 11 и LCDR 3 последовательности SEQ ID NO: 12;

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, точнее CD3 эпсилон, и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab заменены друг на друга;

в) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц;

где в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 124 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat), а аминокислота в положении 123 заменена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация по Kabat) (обычно аргинином (R)), и где в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 147 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу), и аминокислота в положении 213 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу); и

где первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) и второй антигенсвязыывющий фрагмент по п. б) каждый слит на С-конце тяжелой цепи Fab c N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в).

Согласно какому-либо из вышеуказанных вариантов осуществления настоящего изобретения компоненты биспецифической антигенсвязывающей молекулы (например, молекул Fab, домена Fc) могут быть гибридизированы напрямую или через различные линкеры, в частности пептидные линкеры, содержащие одну или несколько аминокислот, обычно примерно 2-20 аминокислот, которые описаны в настоящем изобретении или известны в данной области. К применимым неиммуногенным пептидным линкерам относятся, например, пептидные линкеры (G₄S)_n, (SG₄)_n, (G₄S)_n или G₄(SG₄)_n, где n обычно является целым числом от 1 до 10, обычно от 2 до 4.

В одном из объектов по настоящему изобретению предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый ивторой антигенсвязывающие фрагменты являются (обычной) молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательности SEQ ID NO: 13, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательности SEQ ID NO: 14.

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является CD3, второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab, замененные друг на друга, содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36;

в) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц;

где

в константном домене CL первого и третьего антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 124 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat), а аминокислота в положении 123 заменена лизином (K) или аргинин (R) (нумерация по Kabat) (обычно аргинином (R)), и где в константном домене CH1 первого и третьего антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 147 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу) и аминокислота в положении 213 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу);

и при этом дополнительно

первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по п. б), причем второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) и третий антигенсвязывающий фрагмент по п. а) гибридизированы по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в).

В одном из объектов по настоящему изобретению предусматривают биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, включающую

а) первый и третий антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с первым антигеном, причем первый антиген является GPRC5D, и первый и второй антигенсвязывающие фрагменты являются (обычной) молекулой Fab, содержащей вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательности SEQ ID NO: 15, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательности SEQ ID NO: 16.

б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген является CD3, второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab, замененные друг на друга, содержат вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36;

в) домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц; где

в константном домене CL первого и третьего антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 124 заменена лизином (K) (нумерация по Kabat), а аминокислота в положении 123 заменена лизином (K) или аргинин (R) (нумерация по Kabat) (обычно аргинином (R)), и где в константном домене СН1 первого и третьего антигенсвязывающего фрагмента по п. а) аминокислота в положении 147 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу) и аминокислота в положении 213 заменена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация по Kabat EU индексу);

и при этом дополнительно

первый антигенсвязывающий фрагмент по п. а) гибридизирован по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по п. б), причем второй антигенсвязывающий фрагмент по п. б) и третий антигенсвязывающий фрагмент по п. а) гибридизированы по С-концу тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц домена Fc по п. в).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения относительно одного из объектов, в первой субъединице домена Fc остаток треонина в положении 366 заменен на остаток триптофана (T366W), а во второй субъединице Fc-домена остаток тирозина в положении 407 заменен на остаток валина (Y407V) и, необязательно, остаток треонина в положении 366 заменен на остаток серина (T366S), а остаток лейцина в положении 368 заменен остатком аланина (L368A) (нумерация по Kabat EU индексу).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения относительно одного из объектов, в первой субъединице домена Fc дополнительно остаток серина в положении 354 заменен на остаток цистеина (S354C) или остаток глутаминовой кислоты в положении 356 замещен остатком цистеина (Е356С) (в частности, остаток серина в положении 354 заменен остатком цистеина), а во второй субъединице домена Fc дополнительно остаток тирозина в положении 349 заменен остатком цистеина (Y349C) (нумерация по Kabat EU индексу).

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения по одному из объектов настоящего изобретения в каждой из первой и второй субъединиц домена Fc остаток лейцина в положении 234 заменен остатком аланина (L234A), остаток лейцина в положении 235 заменен остатком аланина (L235A), а остаток пролина в положении 329 заменен остатком глицина (P329G) (нумерация по Kabat EU индексу).

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения относительно одного из объектов, Fc представляет собой домен Fc IgGi человека.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 17, полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% %, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 18, полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 19, и полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 20.

В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 21, полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95% %, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 22, полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 23, и полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентична последовательности SEQ ID NO: 24. В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.

Домен Fc

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит домен Fc, состоящий из первой и второй субъединиц. Очевидно, что признаки домена Fc, описанные в настоящем изобретении в отношении биспецифической антигенсвязывающей молекулы, могут в равной степени применяться к домену Fc, входящему в состав антитела по настоящему изобретению.

Домен Fc биспецифической антигенсвязывающей молекулы состоит из пары полипептидных цепей, содержащих домены тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина. Например, домен Fc молекулы иммуноглобулина G (IgG) является димером, каждая субъединица которого содержит константные домены СН2 и СН3 тяжелой цепи IgG. Две субъединицы домена Fc способны к стабильной ассоциации друг с другом. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула по изобретению содержит не более одного домена Fc.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc биспецифической антигенсвязывающей молекулы является доменом Fc IgG. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc является доменом Fc IgG₁. В другом варианте осуществления настоящего изобретения домен Fc является доменом Fc IgG₄. В одном из конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc является доменом Fc L3G4, содержащим аминокислотную замену в положении S228 (индексная нумерация Kabat EU), в частности аминокислотная замена S228P. Эта аминокислотная замена снижает in vivo обмен плеча Fab антител IgG₄ (см. Stubenrauch с соавт., Drug Metabolism and Disposition 38, 2010, 84-91). В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения домен Fc является доменом Fc человека. В еще одном, более конкретном, варианте осуществления настоящего изобретения домен Fc является доменом Fc IgG₁ человека. В качестве примера приведена последовательности области Fc IgG₁ человека SEQ ID NO: 42.

Модификации домена Fc, активирующие гетеродимеризацию

Биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению содержат различные антигенсвязывающие фрагменты, которые могут быть гибридизированы с одной или другой из двух субъединиц домена Fc таким образом, что две субъединицы домена Fc обычно содержатся в двух неидентичных полипептидных цепях. Совместная рекомбинантная экспрессия этих полипептидов и последующая димеризация приводят к нескольким возможным комбинациям двух полипептидов. Таким образом, для повышения выхода и чистоты биспецифических антигенсвязывающих молекул целесообразно интродуцировать в домен Fc биспецифической антигенсвязывающей молекулы модификацию, способствующую ассоциации соответствующих полипептидов.

Соответственно, в определенных вариантах осуществления настоящего изобретения, домен Fc биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению содержат модификацию, активирующую ассоциацию первой и второй субъединиц домена Fc. Место большинство интенсивных взаимодействий белок-белок между двумя субъединицами домена Fc IgG человека содержится в домене СН3 домена Fc. Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанная модификация содержится в домене СН3 домена Fc.

Существует несколько подходов к методам модификации домена СН3 домена Fc с целью усиления гетеродимеризации, которые описаны, например, в WO 96/27011, WO 98/050431, ЕР 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291. Обычно, во всех подобных методах домен СН3 первой субъединицы домена Fc и домен СН3 второй субъединицы домена Fc сконструированы комплементарно, в результате чего каждый домен СН3 (или содержащая его тяжелая цепь) больше не может гомодимеризоваться с самим собой, но вынужден формировать гетеродимер с комплементарно сконструированным другим доменом СН3 (в результате чего первый и второй домены СН3 гетеродимеризуются, а не образуются гомодимеры между двумя первыми или двумя вторыми доменами СН3). Эти разные подходы по улучшению гетеродимеризации тяжелой цепи рассматривают в качестве разных альтернатив в сочетании с модификациями тяжелой-легкой цепи (например, обмен/замена между VH и VL в одном связующем плече и интродукция замен заряженных аминокислот с противоположными зарядами в месте соприкосновения CH1/CL) в биспецифической антигенсвязывающей молекуле, которые снижают неправильное спаривание тяжелой/легкой цепей и образование побочных продуктов типа Бенс-Джонса.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанная модификация, способствующая ассоциации первой и второй субъединиц домена Fc, представляет собой так называемую модификацию «выступа во впадину», включающую модификацию «выступ» в одной из двух субъединиц домена Fc и модификацию «впадина» в другой из двух субъединиц домена Fc.

Метод «выступа во впадину» описан, например, в US 5731168; US 7695936; Ridgway с соавт., Prot Eng 9, 1996, 617-621; Carter, J Immunol Meth 248, 2001, 7-15). Метод обычно включает внедрение выпуклости («выступа») на границе соприкосновения в первом полипептиде и соответствующей полости («впадины») на границе соприкосновения во втором полипептиде, таким образом, что выступ может располагаться во впадине, что способствует образованию гетеродимера и препятствуют образованию гомодимера. Выступы образуются путем замены небольших боковых цепей аминокислот на границе раздела в первом полипептиде на более крупные боковые цепи (например, тирозина или триптофана). Компенсаторные впадины, соответствующие или подобные по размеру выступам, создаются на границе раздела второго полипептида путем замены больших боковых цепей аминокислот на более мелкие цепи (например, аланина или треонина).

Таким образом, в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в домене СН3 первой субъединицы домена Fc биспецифической антигенсвязывающей молекулы аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, имеющим больший объем боковой цепи, тем самым создавая выступ в домене СН3 первой субъединицы, которая располагается в полости внутри домена СН3 второй субъединицы, и в домене СН3 второй субъединицы домена Fc аминокислотный остаток заменяют аминокислотным остатком, имеющим меньший объем боковой цепи, тем самым создавая впадину в домене СН3 второй субъединицы, в которой может разместиться выступ домена СН3 первой субъединицы.

Предпочтительно указанный аминокислотный остаток, имеющий больший объем боковой цепи, выбран из группы, состоящей из аргинина (R), фенилаланина (F), тирозина (Y) и триптофана (W).

Предпочтительно указанный аминокислотный остаток, имеющий меньший объем боковой цепи, выбран из группы, состоящей из аланина (А), серина (S), треонина (Т) и валина (V).

Выступ и впадина могут быть получены путем изменения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды, например, методом сайт-специфического мутагенеза, или синтезом пептидов.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в (домене СН3) первой субъединицы домена Fc (субъединица «выступа») остаток треонина в положении 366 заменен остатком триптофана (T366W), а во второй субъединицы (в домене СН3) домена Fc (субъединица «впадины») остаток тирозина в положении 407 заменен остатком валина (Y407V). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения во второй субъединице домена Fc дополнительно остаток треонина в положении 366 заменяют остатком серина (T366S), а остаток лейцина в положении 368 заменяют остатком аланина (L368A) (нумерация по Kabat EU индексу).

В еще одном другом варианте осуществления настоящего изобретения в первой субъединице домена Fc дополнительно остаток серина в положении 354 заменяют остатком цистеина (S354C) или остаток глутаминовой кислоты в положении 356 заменяют остатком цистеина (Е356С) (в частности, остаток серина в положении 354 заменяют на остаток цистеина), а во второй субъединице домена Fc дополнительно остаток тирозина в положении 349 заменяют остатком цистеина (Y349C) (нумерация по Kabat EU индексу). Введение этих двух остатков цистеина приводит к образованию дисульфидного мостика между двумя субъединицами домена Fc, дополнительно стабилизируя димер (Carter, J Immunol Methods 248, 2001, 7-15).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первая субъединица домена Fc содержит аминокислотные замены S354C и T366W, а вторая субъединица домена Fc содержит аминокислотные замены Y349C, T366S, L368A и Y407V (нумерация по Kabat EU индексу).

В конкретном варианте осуществления настоящего изобретения антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном (например, активирующим Т-клеточным антигеном), гибридизирован (необязательно через первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с GPRC5D и/или пептидным линкером) с первой субъединицей домена Fc (содержащей модификацию «выступ»). Не ограничиваясь какой-либо теорией, отмечают, что слияние антигенсвязывающего фрагмента, который связывает второй антиген, например, активирующий Т-клеточный антиген, с субъединицей домена Fc, содержащей выступ, будет (дополнительно) минимизировать образование антигенсвязывающих молекул, содержащих две антигенсвязывающие группы, которые связываются с активирующим Т-клеточным антигеном (стерическое столкновение двух полипептидов, содержащих выступы).

В настоящем изобретении в качестве альтернативы рассматривают другие методы СН3-модификации для усиления гетеродимеризации, описанные, например, в WO 96/27011, WO 98/050431, ЕР 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в качестве альтернативы используют метод гетеродимеризации, описанный в ЕР 1870459. Этот метод основан на интродукции заряженных аминокислот с противоположными зарядами в определенные положения аминокислот на границе соприкосновения доменов СН3/СН3 между двумя субъединицами домена Fc. В одном из предпочтительных вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифической антигенсвязывающей молекулой по настоящему изобретению являются аминокислотные мутации R409D, K370E в одном из двух доменов СН3 (домена Fc) и аминокислотная мутация D399K, E357K в другом домене СН3 домена Fc (нумерация по Kabat EU индексу).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит аминокислотную мутацию T366W в домене СН3 первой субъединицы домена Fc и аминокислотные мутации T366S, L368A, Y407V в домене СН3 второй субъединицы домена Fc и дополнительно аминокислотные мутации R409D, K370E в домене СН3 первой субъединицы домена Fc и аминокислотной мутации D399K, E357K в домене СН3 второй субъединицы домена Fc (нумерация по Kabat EU индексу).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит аминокислотные мутации S354C, T366W в домене СН3 первой субъединицы домена Fc и аминокислотные мутации Y349C, T366S, L368A, Y407V в домене СН3 второй субъединицы домена Fc, или указанная биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит аминокислотные мутации Y349C, T366W в домене СН3 первой субъединицы домена Fc и аминокислотные мутации S354C, T366S, L368A, Y407V в доменах СН3 второй субъединицы домена Fc и дополнительно аминокислотные мутации R409D, K370Е в домене СН3 первой субъединицы домена Fc и аминокислотные мутации D399K, Е357К в домене СН3 второй субъединицы домена Fc (нумерация по Kabat EU индексу).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в качестве альтернативы применяют метод, описанный в WO 2013/157953. В другом варианте осуществления настоящего изобретения первый домен СН3 содержит аминокислотную мутацию T366K и второй домен содержит аминокислотную мутацию L351D (нумерация по Kabat EU индексу). В другом варианте осуществления настоящего изобретения первый домен СН3 дополнительно содержит аминокислотную мутацию L351K. В другом варианте осуществления настоящего изобретения второй домен дополнительно содержит аминокислотную мутацию, выбранную из Y349E, Y349D и L368E (предпочтительно L368E) (нумерация по Kabat EU индексу).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения описанный в WO 2012/058768 подход к гетеродимеризации применяют альтернативно. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый домен СН3 содержит аминокислотные мутации L351Y, Y407A, и второй домен СН3 содержит аминокислотные мутации Т366А, K409F. В другом варианте осуществления настоящего изобретения второй домен СН3 содержит дополнительную аминокислотную мутацию в положении Т411, D399, S400, F405, N390 или К392, например, выбранную из а) Т41 IN, T411R, T411Q, T411K, T411D, Т411Е или T411W, б) D399R, D399W, D399Y или D399K, в) S400E, S400D, S400R или S400K, г) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V или F405W, д) N390R, N390K или N390D, е) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F или К392Е (нумерация по Kabat EU индексу). В другом варианте осуществления настоящего изобретения первый домен СН3 содержит аминокислотные мутации L351Y, Y407A, и второй домен СН3 содержит аминокислотные мутации T366V, K409F. В другом варианте осуществления настоящего изобретения первый домен СН3 содержит аминокислотную мутацию Y407A, и второй домен СН3 содержит аминокислотные мутации Т366А, K409F. В другом варианте осуществления настоящего изобретения второй домен СН3 дополнительно содержит аминокислотные мутации К392Е, Т411Е, D399R и S400R (нумерация по Kabat EU индекс).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения описанный в WO 2011/143545 подход к гетеродимеризации применяют альтернативно, например, с модификацией аминокислоты в положении, выбранном из группы, состоящей из положений амнокислот 368 и 409 (нумерация по Kabat EU индексу).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения в качестве альтернативы применяют метод гетеромеризации, описанный в WO 2011/090762, в котором также используют описанный выше подход «выступ во впадину». В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый домен СН3 содержит аминокислотную мутацию T366W, а второй домен СН3 содержит аминокислотную мутацию Y407A. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый домен СН3 содержит аминокислотную мутацию T366Y и второй домен СН3 содержит аминокислотную мутацию Y407T (нумерация по Kabat EU индексу).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула или ее домен Fc принадлежит к подклассу IgG₂, а подход к гетеродимеризации описан в WO 2010/129304 и применяется в качестве альтернативы.

В альтернативном варианте осуществления настоящего изобретения ассоциация, способствующая модификации первой и второй субъединиц домена Fc, включает модификацию, опосредующую эффекты электростатического наведения, например, согласно описанию в РСТ публикации WO 2009/089004. Обычно этот способ включает замену одного или нескольких аминокислотных остатков на границе раздела двух субъединиц домена Fc заряженными аминокислотными остатками, так что образование гомодимера становится электростатически неблагоприятным, но электростатически благоприятным для гетеродимеризации. В одном из подобных вариантов осуществления настоящего изобретения первый домен СН3 включает замену аминокислоты K392 или N392 на отрицательно заряженную аминокислоту (например, глутаминовую кислоту (Е) или аспарагиновую кислоту (D), предпочтительно K392D или N392D), а второй домен СН3 содержит аминокислотное замещение D399, Е356, D356 или Е357 на положительно заряженную аминокислоту (например, лизин (K) или аргинин (R), предпочтительно D399K, E356K, D356K или E357K, более предпочтительно D399K и E356K). В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения первый домен СН3 дополнительно содержит замену аминокислоты K409 или R409 на отрицательно заряженную аминокислоту (например, глутаминовую кислоту (Е) или аспарагиновую кислоту (D), предпочтительно K409D или R409D). В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения первый домен СН3 дополнительно или альтернативно включает замену аминокислоты K439 и/или K370 на отрицательно заряженную аминокислоту (например, глутаминовую кислоту (Е) или аспарагиновую кислоту (D)) (нумерация по Kabat EU индексу).

В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения альтернативно используют метод гетеродимеризации, описанный в WO 2007/147901. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первый домен СН3 содержит аминокислотные мутации K253E, D282K и K322D, а второй домен СН3 содержит аминокислотные мутации D239K, E240K и K292D (нумерация по Kabat EU индексу).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения метод гетеродимеризации, описанный в WO 2007/110205, может быть использован альтернативно.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения первая субъединица домена Fc включает замены аминокислот K392D и K409D, а вторая субъединица домена Fc содержит замены аминокислот D356K и D399K (нумерация по Kabat EU индексу).

Модификации домена Fc, понижающие связывание рецептора Fc и/или эффекторную функцию

Домен Fc придает биспецифической антигенсвязывающей молекуле (или антителу) благоприятные фармакокинетические свойства, включая длительный период полужизни в сыворотке, что способствует хорошему накоплению в ткани-мишени и благоприятному соотношению распределения в ткани и крови. Однако в то же время это может привести к нежелательному нацеливанию биспецифической антигенсвязывающей молекулы (или антитела) на клетки, экспрессирующие рецепторы Fc, а не на предпочтительные антиген-несущие клетки. Более того, совместная активация сигнальных метаболических путей рецептора Fc может привести к высвобождению цитокинов, которые в сочетании со свойствами Т-клеточного активирования (например, в вариантах осуществления биспецифической антигенсвязывающей молекулы, в которой второй антигенсвязывающий фрагмент связывается с активирующим Т-клеточным антигеном) и длительным периодом полужизни биспецифической антигенсвязывающей молекулы приводит к чрезмерной активации рецепторов цитокинов и серьезным побочным эффектам при системном введении. Активация иммунных клеток (несущих рецептор Fc), отличных от Т-клеток, может даже снизить эффективность биспецифической антигенсвязывающей молекулы (в частности биспецифической антигенсвязывающей молекулы, в которой второй антигенсвязывающий фрагмент связывается с активирующим Т-клеточным антигеном) из-за возможного разрушения Т-клеток, например, NK-клетками.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения домен Fc биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению проявляет пониженную аффинность связывания с рецептором Fc и/или пониженную эффекторную функцию по сравнению с нативным доменом Fc IgG₁. В одном из подобных вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc (или биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая указанный домен Fc) проявляет связывающее сродство с рецептором Fc, которое менее чем на 50%, предпочтительно менее чем на 20%, более предпочтительно менее чем на 10% и наиболее предпочтительно менее чем на 5% по сравнению с нативным доменом Fc IgG₁ (или биспецифической антигенсвязывающей молекулой, содержащей нативный домен Fc IgG₁), и/или менее чем на 50%, предпочтительно менее чем на 20%, более предпочтительно менее чем на 10% и наиболее предпочтительно менее чем на 5% по сравнению с нативным доменом Fc IgG₁ (или биспецифическая антигенсвязывающая молекула, включающая домен Fc нативного IgG₁). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc (или биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая указанный домен Fc) существенным образом не связывается с рецептором Fc и/или не индуцирует эффекторной функции. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения рецептор Fc является рецептором Fcγ. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения рецептор Fc является рецептором Fc человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения рецептор Fc является активирующим рецептором Fc. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения рецептор Fc является активирующим рецептором Fcγ человека, точнее рецептором человека FcγRIIIa, FcγRI или FcγRIIa, особенно рецептором FcγRIIIa человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения эффекторная функция представлена одной или несколькими из группы, включающей CDC, ADCC, ADCP и секрецию цитокина. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения эффекторной функцией является ADCC. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc проявляет практически равное связывающее сродство с неонатальным рецептором Fc (FcRn) по сравнению с нативным доменом Fc IgG1. По существу, равное связывание с FcRn достигается, когда домен Fc (или биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая указанный домен Fc) проявляет связывающее сродство, большее примерно на 70%, особенно примерно на 80%, особенно примерно на 90% относительно связывающего сродства нативного домена Fc IgG₁ (или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, включающей нативный домен Fc IgG₁) с FcRn.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения домен Fc сконструирован так, чтобы иметь пониженное связывающее сродство с рецептором Fc и/или пониженную эффекторную функцию по сравнению с доменом Fc, не подвергшимся конструированию. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения домен Fc биспецифической антигенсвязывающей молекулы содержит одну или несколько аминокислотных мутаций, которые снижают связывающее сродство домена Fc с рецептором Fc и/или эффекторную функцию. Обычно одна и та же одна или несколько мутаций аминокислот присутствует в каждой из двух субъединиц домена Fc. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения аминокислотная мутация снижает связывающее сродство домена Fc с рецептором Fc. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения мутация аминокислоты снижает связывающее сродство домена Fc с рецептором Fc по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз. В вариантах осуществления настоящего изобретения если имеется более одной аминокислотной мутации, которая снижает связывающее сродство домена Fc с рецептором Fc, комбинация этих аминокислотных мутаций может снизить связывающее сродство домена Fc с рецептором Fc по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 20 раз или даже по меньшей мере в 50 раз. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая сконструированный домен Fc, демонстрирует связывающее сродство с рецептором Fc, которое менее чем на 20%, особенно менее чем на 10%, более предпочтительно менее чем на 5% по сравнению с биспецифической антигенсвязывающей молекулой, содержащей домен Fc, не подвергавшийся конструированию. В определенном варианте осуществления настоящего изобретения рецептор Fc является рецептором Fcγ. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рецептор Fc является рецептором Fc человека. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рецептор Fc является активирующим рецептором Fc. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения рецептор Fc является активирующим рецептором Fey человека, точнее рецептором человека FcγRIIIa, FcγRI или FcγRIIa, особенно рецептором FcγRIIIa человека. Предпочтительно связывание с каждым из этих рецепторов понижено. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения связывающее сродство с компонентом комплемента, специфически связывающимся с C1q, также понижено. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения связывающее сродство с неонатальным рецептором Fc (FcRn) не понижено. По существу, аналогичное связывание с FcRn, т.е. сохранение связывающего сродства домена Fc с указанным рецептором, достигается, если домен Fc (или биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая указанный домен Fc) проявляет связывающее сродство, которое примерно на 70% выше, чем у формы домена Fc, не подвергавшегося конструированию (или чем у биспецифической антигенсвязывающей молекулы, включающей указанную форму домена Fc, не подвергавшуюся конструированию) с FcRn. Домен Fc или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, включающие указанный домен Fc, могут проявлять указанное связывающее сродство, которое может быть больше, примерно на 80% и еще больше, примерно на 90%. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения домен Fc биспецифической антигенсвязывающей молекулы сконструирован таким образом, чтобы иметь пониженную эффекторную функцию по сравнению с доменом Fc, не подвергавшимся конструированию. Пониженная эффекторная функция может включать, но ими перечень не ограничивается, одну или несколько из следующих функций: пониженной комплемент-зависимой цитотоксичности (CDC), пониженной антителозависимой клеточно-опосредованной цитотоксичности (ADCC), пониженного антителозависимого клеточного фагоцитоза (ADCP), пониженной секреции цитокинов, пониженного опосредованного иммунным комплексом захвата антигена антигенпрезентирующими клетками, пониженного связывания с NK-клетками, пониженного связывания с макрофагами, пониженного связывания с моноцитами, пониженного связывания с полиморфно-ядерными клетками, пониженной прямой передачи сигналов, вызывающих апоптоз, пониженного перекрестного связывания антител, связанных с мишенью, пониженного созревания дендритных клеток или пониженного примирования Т-клеток. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пониженная эффекторная функция является одной или несколькими эффекторными функциями, выбранными из группы, включающей пониженную CDC, пониженную ADCC, пониженный ADCP и пониженную секрецию цитокинов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пониженная эффекторная функция является пониженной ADCC. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения пониженная ADCC составляет менее 20% ADCC, индуцированной доменом Fc, не подвергавшимся конструированию (или биспецифической антигенсвязывающей молекулой, включающей домен Fc, не подвергавшийся конструированию).

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения аминокислотная мутация, которая снижает связывающее сродство домена Fc с рецептором Fc и/или эффекторную функцию, является аминокислотной заменой. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc домен содержит аминокислотную замену в положении, выбранном из группы Е233, L234, L235, N297, Р331 и Р329 (нумерация по Kabat EU индексу). В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения домен Fc содержит аминокислотную замену в положении, выбранном из группы, включающей L234, L235 и Р329 (нумерация по Kabat EU индексу). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения домен Fc содержит аминокислотные замены в положениях L234A и L235A (нумерация по Kabat EU индексу). В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения домен Fc является доменом Fc IgG₁, особенно доменом Fc IgG₁ человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc содержит аминокислотную замену в положении Р329. В более конкретном варианте осуществления настоящего изобретения аминокислотная замена является Р329А или P329G, особенно P329G (нумерация по Kabat EU индексу). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc содержит аминокислотную замену в положении Р329 и дополнительная аминокислотная замена в положении, выбранном из Е233, L234, L235, N297 и Р331 (нумерация по Kabat EU индексу). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения дополнительная аминокислотная замена является Е233Р, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D или P331S. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения домен Fc содержит аминокислотные замены в положениях Р329, L234 и L235 (нумерация по Kabat EU индексу). В более предпочтительных вариантах осуществления настоящего изобретения домен Fc содержит аминокислотные мутации L234A, L235A и P329G («P329G LALA», «PGLALA» или «LALAPG»). Особенно, в определенных вариантах осуществления настоящего изобретения, каждая субъединица домена Fc содержит аминокислотные замены в положениях L234A, L235A и P329G (нумерация по Kabat EU индексу), т.е. в каждой из первой и второй субъединиц домена Fc остаток лейцина в положении 234 заменен остатком аланина (L234A), остаток лейцина в положении 235 заменен остатком аланина (L235A), а остаток пролина в положении 329 заменен остатком глицина (P329G) (нумерация по Kabat EU индексу).

В одном подобном варианте осуществления настоящего изобретения домен Fc является доменом Fc IgG₁, особенно доменом Fc IgG₁ человека. Комбинация аминокислотных замен «P329G LALA» почти полностью устраняет связывание рецептора Fcγ (а также комплемента) с доменом Fc IgG₁ человека, как описано в РСТ публикации WO 2012/130831, сущность которой включена в настоящее изобретение в виде ссылки. В WO 2012/130831 также описывают способы получения таких мутантных доменов Fc и способы определения их свойств, таких как связывание с рецептором Fc или эффекторные функции.

Антитела IgG₄ проявляют пониженное связывающее сродство с рецепторами Fc и пониженные эффекторные функции по сравнению с антителами IgG₁. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения домен Fc биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению является доменом Fc IgG₄, в частности доменом Fc IgG₄ человека. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc IgG₄ включает аминокислотные замещения в положении S228, особенно аминокислотное замещение S228P (нумерация по Kabat EU индексу). Для дальнейшего понижения его связывающего сродства с рецептором Fc и/или его эффекторной функции в одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc IgG₄ включает аминокислотную замену в положении L235, в частности аминокислотную замену L235E (нумерация по Kabat EU индексу). В другом варианте осуществления настоящего изобретения домен Fc IgG₄ содержит замещение аминокислоты в положении Р329, особенно замещение аминокислоты в положении P329G (нумерация по Kabat EU индексу). В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения домен Fc IgG₄ включает аминокислотные замены в положениях S228, L235 и Р329, в частности аминокислотные замены S228P, L235E и P329G (нумерация по Kabat EU индексу). Такие мутанты домена Fc IgG₄ и их способность связываться с рецептором Fcγ описаны в публикации РСТ WO 2012/130831, сущность которой включена в настоящее изобретение в виде ссылки.

В определенном варианте осуществления настоящего изобретения домен Fc, демонстрирующий пониженное связывающее сродство с рецептором Fc и/или пониженную эффекторную функцию по сравнению с нативным доменом Fc IgG1, представляет собой домен Fc IgG₁ человека, содержащий аминокислотные замены L234A, L235A и необязательно P329G, или домен Fc IgG₄ человека, содержащий аминокислотные замены S228P, L235E и необязательно P329G (нумерация по Kabat EU индексу).

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения N-гликозилирование домена Fc было элиминировано. В одном подобном варианте осуществления настоящего изобретения домен Fc содержит аминокислотную мутацию в положении N297, в частности аминокислотную замену, меняющую аспарагин на аланин (N297A) или аспарагиновую кислоту (N297D) (нумерация по Kabat EU индексу).

В дополнение к доменам Fc, описанным в настоящем описании выше, а также в публикации РСТ WO 2012/130831, домены Fc с пониженным связыванием рецептора Fc и/или пониженной эффекторной функцией также включают те домены Fc, у которых один или несколько остатков заменены на 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 (US 6737056) (нумерация по Kabat EU индексу). К таким мутантам Fc относят мутанты Fc с заменами в двух или более положениях аминокислот 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемый мутант Fc «DANA» с заменой остатков 265 и 297 на аланин (US 7332581).

Мутантные домены Fc можно получить путем делеции, замены, вставки или модификации аминокислот с использованием генетических или химических методов, хорошо известных в данной области. Генетические методы могут включать сайт-специфический мутагенез кодирующей последовательности ДНК, ПЦР, синтез гена и т.п. Правильность изменения нуклеотидов можно проверить, например, путем секвенирования.

Связывание с рецепторами Fc можно легко определить, например, с помощью ELISA или поверхностного плазмонного резонанса (Surface Plasmon Resonance, SPR) с использованием стандартных инструментов, таких как прибор BIAcore (фирма GE Healthcare), и рецепторов Fc, которые могут быть получены путем рекомбинантной экспрессии. В другом варианте, связывающее сродство доменов Fc или биспецифических антигенсвязывающих молекул, содержащих домен Fc, для рецепторов Fc может быть оценена с использованием клеточных линий, о которых известно, что они экспрессируют определенные рецепторы Fc, например, NK-клетки человека, экспрессирующие рецептор FcγIIIa.

Эффекторная функция Fc-домена или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, содержащей Fc-домен, может быть измерена способами, известными в данной области. Примеры анализов in vitro для оценки активности ADCC интересующей молекулы описаны в US 5500362; Hellstrom с соавт. Proc Natl Acad Sci USA 83, 1986, 7059-7063; Hellstrom с соавт., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1985, 1499-1502; US 5821337; Bruggemann с соавт., J Exp Med 166, 1987, 1351-1361. В качестве альтернативы можно использовать нерадиоактивные методы анализа (см., например, ACTI™ нерадиоактивный анализ цитотоксичности для проточной цитометрии (фирма CellTechnology, Inc. Mountain View, Калифорния); CytoTox 96^® нерадиоактивный анализ цитотоксичности (фирма Promega, Мэдисон, Висконсин)). Подходящие эффекторные клетки для таких анализов включают мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и природные клетки-киллеры (NK). Альтернативно или дополнительно, активность ADCC исследуемой молекулы может быть оценена in vivo, например, на животной модели, такой как описанная в публикации Clynes с соавт., Proc Natl Acad Sci USA 95, 1998, 652-656.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения связывание домена Fc с компонентом комплемента, особенно с C1q, снижается. Альтернативно в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения, где домен Fc сконструирован таким образом, чтобы иметь пониженную эффекторную функцию, указанная пониженная эффекторная функция включает пониженную CDC. Анализы связывания C1q могут выполняться для определения того, может ли домен Fc или биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая домен Fc, способный связываться с C1q и, следовательно, обладать активностью CDC. См., например, C1q и С3с связывание ELISA в WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Для оценки активации комплемента может быть использован анализ CDC (см., например, Gazzano-Santoro с соавт., J Immunol Methods 202, 1996, 163; Cragg с соавт., Blood 101, 2003, 1045-1052; Cragg и Glennie, Blood 103, 2004, 2738-2743).

Связывание FcRn и определения in vivo клиренса/периода полужизни также могут быть осуществлены, используя методы, описанные в данной области (см., например, Petkova SB. с соавт., Int'l. Immunol. 18(12), 2006, 1759-1769; WO 2013/120929).

Полинуклеотиды

Настоящее изобретение также направлено на выделенные полинуклеотиды, кодирующие антитело, или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению, или ее фрагмент.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения указанный фрагмент является антигенсвязывающим фрагментом. Полинуклеотиды, кодирующие антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, экспрессируются в виде одного полинуклеотида, кодирующего целое антитело или антигенсвязывающую молекулу, или нескольких (например, двух или более) экспрессирующих полинуклеотидов. Полипептиды, кодируемые полинуклеотидами, которые совместно экспрессируются, могут связываться, например, посредством дисульфидных связей или другим образом с образованием функционального антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы. Например, часть легкой цепи антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы может кодироваться отдельным полинуклеотидом от части антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, содержащей тяжелую цепь антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы. При совместной экспрессии полипептиды тяжелой цепи будут связываться с полипептидами легкой цепи с образованием антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы. В другом примере часть антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, включающая одну из двух субъединиц Fc-домена и необязательно (часть) одну или несколько молекул Fab, может кодироваться отдельным полинуклеотидом от части антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, содержащих другую из двух субъединиц домена Fc и необязательно (часть) молекулу Fab. При совместной экспрессии субъединицы домена Fc будут связываться с образованием домена Fc.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения выделенный полинуклеотид кодирует целое антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению. В других вариантах осуществления настоящего изобретения выделенный полинуклеотид кодирует полипептид в составе антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения полинуклеотидом или нуклеиновой кислотой является ДНК. В других вариантах осуществления настоящего изобретения полинуклеотидом по настоящему изобретению является РНК, например, в форме матричной РНК (мРНК). РНК по настоящему изобретению может быть одноцепочечной или двухцепочечной.

Методы рекомбинации

Антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению могут быть получены, например, путем твердофазного пептидного синтеза (например, твердофазный синтез Меррифилда) или методом рекомбинации. Для получения путем рекомбинации, один или несколько полинуклеотидов, кодирующих антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу (фрагмент), например, подобных описанным выше, выделяют и инсертируют в один или несколько векторов для последующего клонирования и/или экспрессии в клетках-хозяевах. Такой полинуклеотид можно легко выделить и секвенировать с использованием обычных методов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают вектор, предпочтительно вектор экспрессии, содержащий один или несколько полинуклеотидов по настоящему изобретению. Методы, которые хорошо известны специалистам в данной области, можно использовать для конструирования векторов экспрессии, содержащих кодирующую последовательность антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы (фрагмент) наряду с соответствующими сигналами контроля транскрипции/трансляции. Эти методы включают методы рекомбинантной ДНК in vitro, методы синтеза и рекомбинации in vivo/генетической рекомбинации. См., например, методы, описанные Maniatis с соавт., Molecular Cloning: А Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); Ausubel с соавт., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989). Вектор экспрессии может быть частью плазмиды, вируса или может быть фрагментом нуклеиновой кислоты. Вектор экспрессии включает кассету экспрессии, в которой полинуклеотид, кодирующий антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу (фрагмент) (т.е. область кодирования), клонируют в оперативной ассоциации с промотором и/или другие элементы контроля транскрипции или трансляции. В контексте настоящего изобретения понятие «кодирующая область» означает часть нуклеиновой кислоты, которая состоит из кодонов, транслируемых в аминокислоты. Хотя «стоп-кодон» (TAG, TGA или ТАА) не транслируется в аминокислоту, его можно рассматривать как часть кодирующей области, если она присутствует, но какие-либо фланкирующие последовательности, например, промоторы, сайты связывания рибосом, терминаторы транскрипции, интроны, 5'- и 3'-нетранслируемые области и т.п., не являются частью кодирующей области. Две или несколько кодирующих областей могут присутствовать в одной полинуклеотидной конструкции, например, в одном векторе или в отдельных полинуклеотидных конструкциях, например, в отдельных (разных) векторах. Кроме того, какой-либо вектор может содержать одну кодирующую область или может содержать две или несколько кодирующих областей, например, вектор по настоящему изобретению может кодировать один или несколько полипептидов, которые пост- или ко-трансляционно разделяются на конечные белки посредством протеолитического расщепления. Кроме того, вектор, полинуклеотид или нуклеиновая кислота по настоящему изобретению может кодировать гетерологичные кодирующие области, либо гибридизированные, либо не гибридизированные с полинуклеотидом, кодирующим антитело, или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу (фрагмент) по настоящему изобретению, или его вариант или производное. Гетерологичные кодирующие области включают, но ими не ограничиваются, специализированные элементы или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологичный функциональный домен. Понятие «функциональная ассоциация» означает, что кодирующая область генного продукта, например полипептида, связана с одной или несколькими регуляторными последовательностями таким образом, чтобы поместить экспрессию генного продукта под влияние или контроль регуляторной последовательности (последовательностей). Два фрагмента ДНК (например, кодирующая область полипептида и связанный с ней промотор) являются «функционально ассоциированными», если индукция функции промотора приводит к транскрипции мРНК, кодирующей желаемый генный продукт, и если природа связи между двумя фрагментами ДНК не препятствует способности последовательностей регуляторной экспрессии управлять экспрессией продукта гена или препятствовать способности матрицы ДНК транскрибироваться. Таким образом, промоторная область будет функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, если промотор способен влиять на транскрипцию этой нуклеиновой кислоты. Промотор может быть клеточно-специфическим промотором, который направляет конкретную транскрипцию ДНК только в предопределенных клетках. Другие элементы контроля транскрипции, помимо промотора, например, энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции, могут быть функционально связаны с полинуклеотидом для управления клеточно-специфической транскрипцией. В настоящем изобретении описывают применимые промоторы и другие области контроля транскрипции. Специалистам в данной области известно множество областей контроля транскрипции. К ним относят, но ими перечень не ограничивают, области контроля транскрипции, которые функционируют в клетках позвоночных, например, помимо прочего, сегменты промотора и энхансера из цитомегаловирусов (например, немедленно-ранний промотор в сочетании с интроном-А), вируса обезьян 40 (например, ранний промотор) и ретровирусов (например, вируса саркомы Рауса). Другие области контроля транскрипции включают те, которые происходят из генов позвоночных, таких как актин, белок теплового шока, гормон роста крупного рогатого скота и β-глобин кролика, а также другие последовательности, способные контролировать экспрессию генов в эукариотических клетках. Дополнительные применимые области контроля транскрипции включают тканеспецифичные промоторы и энхансеры, а также индуцибельные промоторы (например, промоторы, индуцируемые тетрациклинами). Аналогичным образом специалистам в данной области известны различные элементы управления трансляцией. Они включают, но ими не ограничиваются, сайты связывания рибосом, кодоны инициации и терминации трансляции и элементы, происходящие из вирусных систем (в частности, внутренний сайт входа в рибосомы или IRES, также называемый последовательностью CITE). Кассета экспрессии также может включать другие функции, такие как начало репликации и/или элементы хромосомной интеграции, такие как длинные концевые повторы ретровирусов (long terminal repeat, LTR) или инвертированные концевые повторы (inverted terminal repeat, ITR) аденоассоциированного вируса (adeno-associated viral, AAV).

Полинуклеотиды и кодирующие области нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут быть связаны с дополнительными кодирующими областями, которые кодируют секреторные или сигнальные пептиды, направляющие секрецию полипептида, кодируемого полинуклеотидом по настоящему изобретению. Например, если требуется секреция антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, ДНК, кодирующая сигнальную последовательность, может быть размещена выше по цепи нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению или ее фрагмент. Согласно сигнальной гипотезе, белки, секретируемые клетками млекопитающих, имеют сигнальный пептид или секреторную лидерную последовательность, которая отщепляется от зрелого белка, как только начинается экспорт растущей белковой цепи через гранулярную эндоплазматическую сеть. Специалистам в данной области известно, что полипептиды, секретируемые клетками позвоночных, обычно содержат сигнальный пептид, гибридизированный с N-концом полипептида, который отщепляется от транслированного полипептида с образованием секретируемой или «зрелой» формы полипептида. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения нативный сигнальный пептид, например, применяют сигнальный пептид тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина, или функциональное производное этой последовательности, которое сохраняет способность управлять секрецией полипептида, который функционально связан с ним. В качестве альтернативы можно использовать гетерологичный сигнальный пептид млекопитающего или его функциональное производное. Например, лидерная последовательность дикого типа может быть заменена лидерной последовательностью активатора тканевого плазминогена человека (tissue plasminogen activator, TP А) или β-глюкуронидазы мыши.

ДНК, кодирующая короткую белковую последовательность, которую можно использовать для облегчения последующей очистки (например, гистидиновой метки) или для помощи в маркировке антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, может быть включена внутрь или на концах полинуклеотида, кодирующего антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу (фрагмент молекулы).

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают клетку-хозяин, содержащую один или несколько полинуклеотидов по настоящему изобретению. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают клетку-хозяин, содержащую один или несколько векторов по настоящему изобретению. Полинуклеотиды и векторы могут включать в себя по отдельности или в комбинации какие-либо признаки, описанные в настоящем изобретении в отношении полинуклеотидов и векторов, соответственно. В одном подобном варианте осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин содержит (например, трансформирована или трансфецирована) один или несколько векторов, содержащих один или несколько полинуклеотидов, которые кодируют (часть) антитела или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению. В контексте настоящего изобретения понятие «клетка-хозяин» относится к какому-либо типу клеточной системы, которая может быть сконструирована для выработки антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению или ее фрагментов. Клетки-хозяева, подходящие для репликации и поддержки экспрессии антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул, хорошо известны в данной области. Такие клетки могут быть трансфецированы или трансдуцированы, в зависимости от ситуации, конкретным вектором экспрессии, и большие количества клеток, содержащих вектор, могут быть выращены для засева крупномасштабных ферментеров для получения достаточных количеств антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы для клинических применений. К применимым клеткам-хозяевам относятся прокариотические микроорганизмы, такие как Е. coli, или различные эукариотические клетки, такие как клетки яичников китайского хомячка (Chinese hamster ovary cell, CHO), клетки насекомых и другие. Например, полипептиды могут вырабатываться в бактериях, в частности, когда гликозилирование не требуется. После экспрессии полипептид может быть выделен из пасты бактериальных клеток в растворимую фракцию и может быть дополнительно очищен. Помимо прокариот, применимыми хозяевами для клонирования или экспрессии полипептид-кодирующих векторов являются эукариотические микробы, такие как мицелиальные грибы или дрожжи, включая штаммы грибов и дрожжей, пути гликозилирования которых были «гуманизированы», что приводит к продукции полипептида с частично или полностью гуманизированным гликозилированием. См. Gerngross, Nat Biotech 22, 2004, 1409-1414, Li с соавт., Nat Biotech 24, 2006, 210-215. Клетки-хозяева, которые могут быть применены для экспрессии (гликозилированных) полипептидов, также происходят из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Было идентифицировано множество штаммов бакуловирусов, которые можно использовать в сочетании с клетками насекомых, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda. Культуры растительных клеток также могут быть использованы в качестве хозяев. См., например, US 5959177, US 6040498, US 6420548, US 7125978, US 6417429 (где описывают технологию PLANTIBODIES™ для получения антител в трансгенных животных). Клетки позвоночных также можно использовать в качестве хозяев. Например, могут быть полезны клеточные линии млекопитающих, адаптированные для роста в виде суспензии. Другими примерами полезных линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия клеток почек обезьяны CV1, трансформированных вирусом SV40 (COS-7), линия клеток почки эмбриона человека (293 или 293Т согласно описанию, например, Graham с соавт., J Gen Virol 36, 1977, 59), клетки почек детеныша хомяка (baby hamster kidney cells, BHK), клетки сертоли у мышей (клетки ТМ4 согласно описанию, например, Mather, Biol Reprod 23, 1980, 243-251), клетки почки обезьяны (CV1), клетки почки африканской зеленой обезьяны (VERO-76), клетки карциномы шейки матки человека (HELA), клетки почки собаки (MDCK), клетки печени серой крысы (BRL 3А), клетки легкого человека (W138), клетки печени человека (Hep G2), опухолевые клетки молочной железы мыши (ММТ 060562), клетки TRI (согласно описанию, например, Mather с соавт., Annals N.Y. Acad Sci 383, 1982, 44-68), клетки MRC 5 и клетки FS4. К другим полезным линиям клеток-хозяев млекопитающих относят клетки яичника китайского хомячка (СНО), включая клетки dhfr^- СНО (Urlaub с соавт., Proc Natl Acad Sci USA 77, 1980, 4216); линии клеток миеломы, такие как YO, NS0, Р3Х63 и Sp2/0. Для обзора некоторых линий клеток-хозяев млекопитающих, применимых для выработки белка, см., например, Yazaki и Wu, в кн.: Methods in Molecular Biology, том 248 (под ред. В.K.С. Lo, изд-во Humana Press, Тотова, Нью-Джерси), 2003, 255-268. Клетки-хозяева включают культивируемые клетки, например, культивируемые клетки млекопитающих, дрожжевые клетки, клетки насекомых, бактериальные клетки и растительные клетки, а также клетки, содержащиеся в трансгенном животном, трансгенном растении или клетки культивируемой ткани растения или животного. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения клетка-хозяин является эукариотической клеткой, предпочтительно клеткой млекопитающего, например, клеткой яичника китайского хомячка (СНО), эмбриональной клеткой почки человека (НЕК) или лимфоидной клеткой (например, клетки Y0, NS0, Sp20).

В данной области известны стандартные технологии экспрессии чужеродных генов в подобных системах. Клетки, экспрессирующие полипептид, содержащий либо тяжелую, либо легкую цепь антигенсвязывающего домена, такого как антитело, можно сконструировать таким образом, чтобы также экспрессировать другую из цепей антитела, так что экспрессируемый продукт представляет собой антитело, которое имеет как тяжелую, так и легкую цепь. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают метод получения антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению, который включает культивирование клеток-хозяев, содержащих полинуклеотид, кодирующий антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, как предусмотрено в настоящем изобретении, в условиях, пригодных для экспрессии антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, и необязательно выделение антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы из клетки-хозяин (или из среды для культивирования клеток-хозяев).

Компоненты биспецифической антигенсвязывающей молекулы (или антитела) по настоящему изобретению могут быть генетически гибридизированы друг с другом. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула может быть сконструирована таким образом, что ее компоненты могут быть слиты непосредственно друг с другом или опосредованно через линкерную последовательность. Состав и длина линкера могут быть определены в соответствии с методами, известными в данной области, и могут быть проверены на эффективность. Примеры последовательностей линкеров между разными компонентами биспецифических антигенсвязывающих молекул предусмотрены в настоящем изобретении. Также могут быть упомянуты дополнительные последовательности для включения сайта расщепления для разделения отдельных компонентов слияния, если существует такая потребность, например, последовательности распознавания эндопептидазы.

Антитело или биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению обычно содержат по крайней мере вариабельную область антитела, способную связывать антигенную детерминанту. Вариабельные области могут формировать часть и происходить из природных или неприродных антител и их фрагментов. Способы получения поликлональных антител и моноклональных антител хорошо известны в данной области (см., например Harlow и Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Неприродные антитела могут быть сконструированы методами твердофазного пептидного синтеза, могут быть получены путем рекомбинации (например, согласно описанию в US 4186567), или могут быть получены, например, методом скрининга комбинаторных библиотек, содержащих вариабельные тяжелые цепи и вариабельные легкие цепи (см., например, US 5969108).

Какой-либо вид происходящих от животных антител, фрагментов антител, антигенсвязывающих доменов или вариабельных областей может быть использован в антителе или биспецифической антигенсвязывающей молекуле по настоящему изобретению. Антитела, фрагменты антител, антигенсвязывающие домены или вариабельные области, применимые в настоящем изобретении, могут происходить от мышей, приматов, людей, но ими перечень не ограничивается. Если антитело или биспецифическая антигенсвязывающая молекула предназначены для использования людьми, может быть использована химерная форма антитела, в которой константные области антитела получены от человека. Гуманизированную форму антитела или полностью антитело человека также можно получить в соответствии со способами, известными в данной области (см., например, US 5565332). Гуманизация может быть достигнута различными методами, включая, но ими не ограничиваясь, (а) трансплантацию области CDR, происходящей не от человека (например, от антитела донора), в каркасную область человека (например, антитело реципиента), и константные области с сохранением или без сохранения критических остатков каркасной области (например тех, которые важны для сохранения хорошего связывающего сродства антигена или функций антитела), (б) трансплантацию только областей, происходящих не от человека, которые определяют специфичность (SDR или а-CDR; остатки, критические для взаимодействия антитело-антиген) на каркасную область и константные области человека или (в) трансплантацию целых нечеловеческих вариабельных доменов, происходящих не от человека, но их «маскировка» участком, подобным участку от человека, путем замены поверхностных остатков. Рассмотрены гуманизированные антитела и способы их получения, например, в публикации Almagro и Fransson, Front. Biosci. 13, 2008, 1619-1633, а также описанные, например, в публикации Riechmann с соавт., Nature 332, 1988, 323-329; Queen с соавт., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86, 1989, 10029-10033; US 5821337, US 7527791, US 6982321, US 7087409; Kashmiri с соавт., Methods 36, 2005, 25-34 (описание области, определяющей специфичность (SDR) трансплантации); Padlan, Mol. Immunol. 28, 1991, 489-498 (описание «перекладки» доменов); Dall'Acqua с соавт., Methods 36, 2005, 43-60 (описание «перекладки» доменов); Osbourn с соавт., Methods 36, 2005, 61-68; Klimka с соавт., Br. J. Cancer, 83, 2000, 252-260 (описание подхода «направленной селекции» к перекладке доменов). Каркасные области человека, которые можно использовать для гуманизации, включают, но ими не ограничиваются: каркасные области, выбранные с использованием метода «наиболее подходящего» (см., например, Sims с соавт. J. Immunol. 151, 1993, 2296); каркасные области, полученные из консенсусной последовательности антител человека определенной подгруппы вариабельных областей легкой или тяжелой цепей (см., например, Carter с соавт. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 1992, 4285; Presta с соавт. J. Immunol., 151, 1993, 2623); зрелые (соматически мутировавшие) каркасные области человека или каркасные области зародышевой линии человека (см., например, Almagro и Fransson, Front. Biosci. 13, 2008, 1619-1633); каркасные области, полученные из скрининговых библиотек FR (см., например, Васа с соавт., J. Biol. Chem. 272, 1997, 10678-10684; Rosok с соавт., J. Biol. Chem. 271, 1996, 22611-22618).

Антитела человека можно получить различными методами, известными в данной области. Антитела человека подробно описаны в работах van Dijk и van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 2001, 368-374, и Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 2008, 450-459. Антитела человека могут быть получены путем введения иммуногена трансгенному животному, которое было модифицировано для продуцирования интактных антител человека или интактных антител с вариабельными областями антител человека в ответ на антигенную пробу. Такие животные обычно содержат все или часть локусов иммуноглобулина человека, которые замещают эндогенные локусы иммуноглобулина, или которые присутствуют вне хромосом или случайным образом интегрированы в хромосомы животного. У таких трансгенных мышей локусы эндогенного иммуноглобулина обычно инактивированы. Для обзора методов получения антител человека от трансгенных животных см. публикацию Lonberg, Nat. Biotech. 23, 2005, 1117-1125. См. также, например, US 6075181 и US 6150584, в которых описывают технологию XENOMOUSE™; US 5770429, в котором описывают технологию HuMab®; US 7041870, в котором описывают технологию K-М MOUSE®; и патентную заявку US 2007/0061900, в которой описывают технологию VelociMouse®). Вариабельные области человека из интактных антител, вырабатываемых такими животными, можно дополнительно модифицировать, например, путем комбинирования с другой константной областью человека.

Антитела человека также можно получить методами на основе гибридом. Описаны линии клеток миеломы человека и гетеромиеломы мыши-человека для получения моноклональных антител человека. (См., например, Kozbor J. Immunol., 133, 1984, 3001; Brodeur с соавт. в кн.: Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 1987, 51-63, изд-во Marcel Dekker, Inc., Нью-Йорк; Boerner с соавт., J. Immunol., 147, 1991, 86.) Антитела человека, полученные с помощью технологии гибридом В-клеток человека, также описаны в публикации Li с соавт., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103, 2006, 3557-3562. Дополнительные методы также описаны, например, в US 7189826 (описание выработки моноклональных антител человека IgM из линий гибридомных клеток) и в публикации Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4), 2006, 265-268 (описание гибридом человека-человека). Технологию гибридом человека (технология Trioma) также описывают в работах Vollmers и Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3), 2005, 927-937 и Vollmers и Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3), 2005, 185-191.

Антитела человека также могут быть получены путем выделения из библиотек антител человека согласно описанию настоящего изобретения.

Антитела, применимые в настоящем изобретении, можно выделить путем скрининга комбинаторных библиотек на антитела с желаемой активностью или активностями. Методы скрининга комбинаторных библиотек рассмотрены, например, в работе Lerner с соавт. Nature Reviews 16, 2016, 498-508. Например, в данной области известно множество методов создания библиотек фагового дисплея и скрининга таких библиотек на антитела, обладающие требуемыми параметрами связывания. Такие методы рассмотрены, например, в работах Frenzel с соавт. in mAbs 8, 2016, 1177-1194; Bazan с соавт. Human Vaccines and Immunotherapeutics 8, 2012, 1817-1828; Zhao с соавт. Critical Reviews in Biotechnology 36, 2016, 276-289; Hoogenboom с соавт. в кн.: Methods in Molecular Biology 178, 2001, 1-37 (под ред. O'Brien с соавт., изд-во Human Press, Тотова, Нью-Джерси); Marks и Bradbury в кн.: Methods in Molecular Biology 248, 2003, 161-175 (под ред. Lo, изд-во Human Press, Тотова, Нью-Джерси).

В некоторых методах фагового дисплея репертуары генов VH и VL по отдельности клонируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и случайным образом рекомбинируют в фаговых библиотеках, которые затем могут быть проверены на антигенсвязывающий фаг, как описано в публикации Winter с соавт. in Annual Review of Immunology 12, 1994, 433-455. Фаг обычно отображает фрагменты антител, либо как одноцепочечных фрагменты Fv (scFv), либо как фрагменты Fab. Библиотеки из иммунизированных источников предоставляют антитела с высоким сродством к иммуногену без необходимости конструирования гибридом. В качестве альтернативы, наивный репертуар можно клонировать (например, от человека) для обеспечения единого источника антител к широкому спектру чужеродных, а также аутоантигенов без какой-либо иммунизации, как описано Griffiths с соавт., EMBO Journal 12, 1993, 725-734. В итоге, наивные библиотеки также могут быть созданы синтетически путем клонирования нереаранжированных сегментов V-гена из стволовых клеток и использования праймеров для ПЦР, содержащих случайную последовательность, для кодирования высоко вариабельных областей CDR3 и для выполнения реаранжировки in vitro, как описано Hoogenboom и Winter в Journal of Molecular Biology 227, 1992, 381-388). К патентам, в которых описывают фаговые библиотеки антител человека, относятся, например, US 5750373, US 7985840, US 7785903, US 8679490, а также патентные публикации US 2005/0079574, US 2007/0117126, US 2007/0237764 и US 2007/0292936. Дополнительные примеры известных в данной области методов скрининга комбинаторных библиотек антител с требуемой активностью или активностями включают дисплей рибосом и мРНК, а также методы дисплея и отбора антител на бактериях, клетках млекопитающих, клетках насекомых или дрожжевых клетках. Рассмотрены методы дисплея на поверхности дрожжей, например, в работах Scholler с соавт., Methods in Molecular Biology 503, 2012, 135-156, Cherf с соавт., Methods in Molecular biology 1319, 2015, 155-175, Zhao с соавт., Methods in Molecular Biology 889, 2012, 73-84. Методы рибосомного дисплея описаны, например, Не с соавт., Nucleic Acids Research 25, 1997, 5132-5134, и Hanes с соавт. PNAS 94, 1997, 4937-4942.

Антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы, полученные согласно описанию настоящего изобретения, могут быть очищены известными в данной области методами, такими как высокоэффективная жидкостная хроматография, ионообменная хроматография, гель-электрофорез, аффинная хроматография, эксклюзионная хроматография и т.п. Фактические условия, используемые для очистки конкретного белка, будут частично зависеть от таких факторов, как общий заряд, гидрофобность, гидрофильность и т.д., и будут очевидны для специалистов в данной области. Для очистки аффинной хроматографией можно использовать антитело, лиганд, рецептор или антиген, с которыми связываются антитело или биспецифическая антигенсвязывающая молекула. Например, для очистки антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению с помощью аффинной хроматографии можно использовать матрицу с белком А или белком G. Последовательная аффинная хроматография с белком А или G и эксклюзионная хроматография могут использоваться для выделения антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, по существу по описанию в примерах. Чистота антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы может быть определена любым из множества хорошо известных аналитических методов, включая гель-электрофорез, жидкостную хроматографию высокого давления и тому подобное.

Анализы

Антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы, предусмотренные в настоящем изобретении, могут быть идентифицированы, проверены или охарактеризованы на предмет их физических/химических свойств и/или биологической активности с помощью различных анализов, известных в данной области.

Анализы сродства (аффинности)

Сродство антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы к рецептору Fc или целевому антигену может быть определено, например, с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR) с использованием стандартных инструментов, таких как инструмент BIAcore (фирма GE Healthcare), и рецепторов или целевых белков, например, полученных рекомбинантной экспрессией. Альтернативно, связывание антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул с различными рецепторами или целевыми антигенами можно оценивать с использованием клеточных линий, экспрессирующих конкретный рецептор или целевой антиген, например, с помощью жидкостной цитометрии (FACS). Конкретный иллюстративный вариант осуществления для измерения сродства связывания описывается ниже.

Согласно одному варианту осуществления настоящего изобретения, Ко измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса с использованием аппарата BIACORE® Т100 (фирма GE Healthcare) при 25°С.

Для анализа взаимодействия между частью Fc и рецепторами Fc, His-меченный рекомбинантный рецептор Fc захватывают анти-Penta His антителом (фирма Qiagen), иммобилизованным на чипах СМ5, и биспецифические конструкции используют в качестве аналитов. Вкратце, биосенсорные чипы из карбоксиметилированного декстрана (СМ5, фирма GE Healthcare) активируют гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)-карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями поставщика. Анти-Penta-His антитело разводят 10 мМ ацетатом натрия, рН 5.0, до 40 мкг/мл перед инъекцией со скоростью 5 мкл/мин для достижения примерно 6500 единиц ответа (response unit, RU) присоединенного белка. После инъекции лиганда впрыскивают 1 М этаноламина для блокирования непрореагировавших групп. Впоследствии рецептор Fc захватывается в течение 60 сек при 4 или 10 нМ. Для кинетических измерений четырехкратные серийные разведения антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы (диапазон от 500 нМ до 4000 нМ) вводят в HBS-EP (фирма GE Healthcare, 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 3 мМ EDTA, 0,05%). Сурфактант Р20, рН 7,4) при 25°С со скоростью потока 30 мкл/мин в течение 120 сек.

Для определения сродства с целевым антигеном антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы захватываются специфическим антителом против Fab человека (фирма GE Healthcare), которое иммобилизуют на поверхности активированного сенсорного чипа СМ5, как описано для анти-Penta-His антитела. Конечное количество связанного белка составляет примерно 12000 RU. Антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы захватываются в течение 90 сек при 300 нМ. Антигены-мишени пропускают через проточные кюветы в течение 180 сек в диапазоне концентраций от 250 до 1000 нМ со скоростью потока 30 мкл/мин. Диссоциацию подвергают мониторингу в течение 180 сек.

Различия в совокупном показателе преломления корректируются путем вычитания отклика, полученного на эталонной проточной кювете. Реакцию в установившемся состоянии использовали для получения константы диссоциации KD путем аппроксимации нелинейной кривой изотермы связывания Ленгмюра.. Скорости ассоциации (k_on) и скорости диссоциации (k_off) рассчитывают, используя простуюмодель связывания Лэнгмюра один-к-одному (BIACORE® Т100 Evaluation Software версия 1.1.1) путем одновременной подгонки сенсограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесной диссоциации (KD) рассчитывают как отношение k_off/k_on. См., например, Chen с соавт., J Mol Biol 293, 1999, 865-881.

Анализ активности

Биологическая активность биспецифических антигенсвязывающих молекул (или антител) по настоящему изобретению может быть измерена с помощью различных анализов, описанных в примерах. Биологические активности могут, например, включать индукцию пролиферации Т-клеток, индукцию передачи сигналов в Т-клетках, индукцию экспрессии маркеров активации в Т-клетках, индукцию секреции цитокинов Т-клетками, индукцию лизиса клеток-мишеней, таких как опухолевые клетки, и индукцию регрессии опухоли и/или улучшение выживаемости.

Композиции, составы и способы введения

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтическим композициям, содержащим какие-либо из антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул, представленных в настоящем описании, например, для использования в каком-либо из следующих терапевтических методов. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция включает какое-либо из антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул, представленных в настоящем изобретении, и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления настоящего изобретения фармацевтическая композиция содержит какое-либо из антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул, представленных в настоящем документе, и по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент, например, согласно описанному ниже.

Также предусматривают метод получения антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению в форме, подходящей для введения in vivo, метод, включающий (а) получение антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы в соответствии с настоящим изобретением и (б) составление препарата антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы по меньшей мере с одним фармацевтически приемлемым носителем, посредством чего готовится препарат антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы для введения in vivo.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат терапевтически эффективное количество антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, растворенных или диспергированных в фармацевтически приемлемом носителе. Понятие «фармацевтически или фармакологически приемлемые» относится к молекулярным объектам и композициям, которые обычно нетоксичны для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях, т.е. не вызывают неблагоприятных, аллергических или других нежелательных реакций при введении животному, например, человеку, в зависимости от обстоятельств. Приготовление фармацевтической композиции, которая содержит антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу и, возможно, дополнительный активный ингредиент, известно специалистам в данной области в свете настоящего изобретения, что проиллюстрировано на примерах в кн.: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18е изд., изд-во Mack Printing Company, 1990, включенной в настоящее описание в виде ссылки. Более того, для введения животным (например, человеку) следует понимать, что препараты должны соответствовать стандартам стерильности, пирогенности, общей безопасности и чистоты, как того требует Управление биологических стандартов FDA или соответствующие органы в других странах. Предпочтительные композиции представляют собой лиофилизированные составы или водные растворы. В контексте настоящего изобретения понятие «фармацевтически приемлемый носитель» включает какие-либо и все растворители, буферы, дисперсионные среды, покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные агенты, противогрибковые агенты), изотонические агенты, агенты, замедляющие абсорбцию, соли, консерванты, антиоксиданты, белки, лекарственные препараты, стабилизаторы лекарственных средств, полимеры, гели, связующие, эксципиенты, дезинтегрирующие агенты, лубриканты, подслащивающие агенты, ароматизаторы, красители, подобные материалы и их комбинации, которые известны специалистам в данной области (см., например, в кн.: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18е изд., изд-во Mack Printing Company, 1990, 1289-1329, включенную в настоящее описание в виде ссылки). За исключением тех случаев, когда любой обычный носитель несовместим с активным ингредиентом, предполагают его использование в терапевтических или фармацевтических композициях.

Иммуноконъюгат по настоящему изобретению (и какой-либо дополнительный терапевтический агент) можно вводить какими-либо подходящими способами, включая парентеральный, внутрилегочный и интраназальный, и, если необходимо, для местного лечения, путем внутриочагового введения. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Дозирование может осуществляться каким-либо подходящим путем, например, инъекциями, такими как внутривенные или подкожные инъекции, частично в зависимости от того, является ли введение кратковременным или хроническим.

Парентеральные композиции включают композиции, предназначенные для введения путем инъекции, например подкожной, внутрикожной, внутриочаговой, внутривенной, внутриартериальной, внутримышечной, интратекальной или внутрибрюшинной инъекции. Для инъекции антитела или биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению могут быть приготовлены их водные растворы, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнкса, раствор Рингера или физиологический солевой буферный раствор. Раствор может содержать составные агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. Альтернативно, антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы могут быть в форме порошка для смешивания с подходящим носителем, например, стерильной апирогенной водой, непосредственно перед применением. Стерильные растворы для инъекций готовят путем включения антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению в необходимом количестве в соответствующий растворитель с различными другими ингредиентами, перечисленными ниже, по мере необходимости. Стерильность может быть легко достигнута, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны. Обычно дисперсии готовят путем включения различных стерилизованных активных ингредиентов в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и/или другие ингредиенты. В случае стерильных порошков для приготовления стерильных растворов, суспензий или эмульсий для инъекций предпочтительными методами приготовления являются методы вакуумной сушки или сублимационной сушки, которые дают порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный желаемый ингредиент из жидкой среды, ранее стерилизованной фильтрацией. Жидкая среда должна быть соответствующим образом забуферена, если необходимо, и жидкий разбавитель сначала должен стать изотоническим перед инъекцией с помощью достаточного количества физиологического раствора или раствора глюкозы. Композиция должна быть стабильной в условиях производства и хранения и защищена от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибки. Следует принимать во внимание, что загрязнение эндотоксинами должно поддерживаться минимально на безопасном уровне, например, менее 0,5 нг/мг белка. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, но ими не ограничиваются: буферы, такие как фосфатный, цитратный и на основе других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; гексаметония хлорид; хлорид бензалкония; бензетония хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (содержащие примерно менее 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбитол; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (PEG). Водные суспензии для инъекций могут содержать соединения, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как натрийкарбоксиметилцеллюлоза, сорбит, декстран и т.п. Необязательно, суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или агенты, которые увеличивают растворимость соединений, что позволяет получать высококонцентрированные растворы. Кроме того, суспензии активных соединений могут быть приготовлены в виде подходящих масляных суспензий для инъекций. Подходящие липофильные растворители или носители включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этиловые эфиры или триглицериды, или липосомы.

Активные ингредиенты могут быть заключены в микрокапсулы, приготовленные, например, методами коацервации или межфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозы, или желатиновые микрокапсулы и поли-(метилметацилатные) микрокапсулы, соответственно, в коллоидных системах доставки лекарств (например, в липосомах, микросферах альбумина, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Такие методы раскрыты в кн.: Remington's Pharmaceutical Sciences, 18е изд., изд-во Mack Printing Company, 1990). Могут быть приготовлены препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащих полипептид, причем матрицы имеют форму изделий определенной формы, например пленок или микрокапсул. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения пролонгированное поступление композиции для инъекций может быть достигнуто путем использования в композициях агентов, замедляющих абсорбцию, таких как, например, моностеарат алюминия, желатин или их комбинация.

Дополнительно к ранее описанным композициям, антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы также могут быть получены в виде препарата-депо. Такие составы длительного действия можно вводить путем имплантации (подкожно или внутримышечно) или путем внутримышечной инъекции. Таким образом, например, антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы могут быть составлены с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменными смолами, или в виде труднорастворимых производных, например, в виде умеренно растворимой соли.

Фармацевтические композиции, содержащие антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, могут быть получены посредством обычных процессов смешивания, растворения, эмульгирования, инкапсулирования, захвата или лиофилизации. Фармацевтические композиции могут быть составлены обычным способом с использованием одного или нескольких физиологически приемлемых носителей, разбавителей, эксципиентов или вспомогательных веществ, которые облегчают переработку белков в препараты, которые можно использовать в фармацевтике. Правильный состав зависит от выбранного пути введения.

Антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы могут быть включены в композицию в форме свободной кислоты или основания, нейтральной или солевой форме. Фармацевтически приемлемые соли являются солями, которые по существу сохраняют биологическую активность свободной кислоты или основания. К ним относятся кислотно-аддитивные соли, например, те, которые образованы со свободными аминогруппами белковой композиции или которые образованы с неорганическими кислотами, например, соляная или фосфорная кислоты, или такие органические кислоты, как уксусная, щавелевая, винная или миндальная кислота. Соли, образованные со свободными карбоксильными группами, также могут быть получены из неорганических оснований, например, гидроксидов натрия, калия, аммония, кальция или железа; или такие органические основания, как изопропиламин, триметиламин, гистидин или прокаин. Фармацевтические соли имеют тенденцию к большей растворимости в водных и других протонных растворителях, чем соответствующие формы свободного основания.

Терапевтические методы и составы

Какой-либо из антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул, предусмотренных в настоящем изобретении, можно использовать в терапевтических методах. Антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению можно применять в качестве иммунотерапевтических агентов, например, при лечении рака.

Для использования в терапевтических методах антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению должны быть разработаны, дозированы и введены способом, совместимым с надлежащей медицинской практикой. Факторы, которые следует учитывать в этом контексте, включают конкретное подвергаемое лечению заболевание, конкретного пациента из класса млекопитающих, клиническое состояние отдельного пациента, причину расстройства, место доставки агента, метод введения, схему введения и другие факторы, известные практикующим врачам.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению для применения в качестве лекарственного средства. В других вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению для лечения заболевания. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению для применения в методах лечения заболевания. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению для применения в лечении заболевания индивидуума, нуждающегося в таком лечении. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению для применения в методе лечения индивидуума с заболеванием, включающим введение индивидууму терапевтически эффективного количества антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения подвергаемое лечению заболевание является пролиферативным заболеванием. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения заболевание является раком. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения метод дополнительно включает введение индивидууму терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, например, противоракового агента, если подвергаемое лечению заболевание является раком. В дополнительных вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению для применения с целью индукции лизиса клеток-мишеней, особенно раковых клеток. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу для применения в методе индукции лизиса клеток-мишеней, в частности опухолевых клеток, у индивидуума, включающем введение индивидууму эффективного количества антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы для индукции лизиса клеток-мишеней. «Индивидуум» по какому-либо из указанных выше вариантов осуществления настоящего изобретения может быть млекопитающим, предпочтительно человеком. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения подвергаемое лечению заболевание является аутоиммунным заболеванием, в частности системной красной волчанкой и/или ревматоидным артритом. Выработка болезнетворных аутоантител аутореактивными клетками плазмы является признаком аутоиммунных заболеваний. Следовательно, GPRC5D можно использовать для нацеливания на аутореактивные плазматические клетки при аутоиммунных заболеваниях.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения предусматривают применение антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению для получения или прготовления лекарственного средства. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения лекарственное средство предназначают для лечения заболевания у индивидуума, нуждающегося в таком лечении. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения лекарственное средство предназначено для применения в методе лечения заболевания, предусматривающем введение больному индивидууму терапевтически эффективного количества лекарственного средства. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения подвергаемое лечению заболевание является пролиферативным расстройством. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения заболевание является раком. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения метод дополнительно включает введение индивидууму терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, например, противоракового агента, если подвергаемое лечению заболевание является раком. В еще одном варианте осуществления настоящего изобретения лекарственное средство предназначено для индукции лизиса клеток-мишеней, в частности раковых клеток. В другом варианте осуществления настоящего изобретения лекарственное средство предназначено для применения в методе индукции лизиса клеток-мишеней у индивидуума, в частности раковых клеток, предусматривающем введение индивидууму эффективного количества лекарственного средства для индукции лизиса клеток-мишеней. «Индивидуум» по какому-либо из указанных выше вариантов осуществления настоящего изобретения может быть млекопитающим, предпочтительно человеком.

В другом объекте настоящего изобретения предусматривают метод лечения заболевания. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения метод заключается во введении индивидууму с таким заболеванием терапевтически эффективного количества антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения указанному индивидууму вводят состав, содержащий антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению в фармацевтически приемлемой форме. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения подвергаемое лечению заболевание является пролиферативным расстройством. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения заболевание является раком. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения метод дополнительно включает введение индивидууму терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, например, противоракового агента, если подвергаемое лечению заболевание является раком. «Индивидуум» по какому-либо из указанных выше вариантов осуществления настоящего изобретения может быть млекопитающим, предпочтительно человеком.

В другом объекте настоящего изобретения предусматривают метод индукции лизиса клетки-мишени, в частности опухолевой клетки. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения метод предусматривает контакт клетки-мишени с антителом или биспецифической антигенсвязывающей молекулой по настоящему изобретению в присутствии Т-клеток, особенно цитотоксических Т-клеток. В другом объекте настоящего изобретения предусматривают метод индукции лизиса клетки-мишени, в частности опухолевой клетки, у индивидуума. В еще одном из вариантов осуществления настоящего изобретения метод включает введение индивидууму эффективного количества антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы для индукции лизиса клетки-мишени. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения «индивидуумом» является человек.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения заболевание, подлежащее лечению, представляет собой пролиферативное нарушение, в частности рак. Примеры рака, которыми перечень не ограничивается, включают рак мочевого пузыря, рак мозга, рак головы и шеи, рак поджелудочной железы, рак легких, рак груди, рак яичников, рак матки, рак шейки матки, рак эндометрия, рак пищевода, рак толстой кишки, колоректальный рак, рак прямой кишки, рак желудка, рак простаты, рак крови, рак кожи, плоскоклеточный рак, рак костей и рак почек. Другие нарушения пролиферации клеток, которые можно лечить с использованием антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются ими, новообразования, расположенные в брюшной полости, костях, груди, пищеварительной системе, печени, поджелудочной железе, брюшине, эндокринных железах (надпочечниках, паращитовидных железах, гипофизе, яичках, яичниках, тимусе, щитовидной железе), глазах, голове и шее, нервной системе (центральной и периферической), лимфатической системе, тазу, коже, мягких тканях, селезенке, грудной области и мочеполовой системе. Также включены предраковые состояния или поражения и метастазы рака. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения рак выбран из группы, состоящей из рака почки, рака мочевого пузыря, рака кожи, рака легких, колоректального рака, рака груди, рака мозга, рака головы и шеи и рака простаты. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения рак является раком простаты. Специалисту в данной области очевидно, что во многих случаях антитело или биспецифическая антигенсвязывающая молекула не может обеспечить излечение, а может принести лишь частичную пользу. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения физиологическое изменение, имеющее некоторую пользу, также считается терапевтически полезным. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения количество антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, которое обеспечивает физиологическое изменение, рассматривают как «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество». Субъектом, пациентом или индивидуумом, нуждающемся в лечении, обычно является млекопитающее, точнее человек.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения эффективное количество антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению вводят в клетку. В других вариантах осуществления настоящего изобретения эффективное количество антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению вводят в клетку. В других вариантах осуществления настоящего изобретения терапевтически эффективное количество антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению вводят индивидууму для лечения заболевания.

Для профилактики или лечения заболевания соответствующая дозировка антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению (при использовании отдельно или в комбинации с одним или несколькими другими дополнительными терапевтическими агентами) зависит от типа заболевания, которое подлежит лечению, способа введения, массы тела пациента, типа антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, тяжести и течения заболевания, вводится ли антитело или биспецифическая антигенсвязывающая молекула в профилактических или терапевтических целях, предшествующие или сопутствующие терапевтические вмешательства, истории болезни пациента и реакции на антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, а также от решения лечащего врача. Практикующий врач, ответственный за введение, в любом случае определит концентрацию активного ингредиента (ингредиентов) в композиции и соответствующую дозу (дозы) для индивидуума. В настоящем изобретении рассматриваются различные схемы дозирования, включая, но, не ограничиваясь ими, однократное или многократное введение в различные моменты времени, болюсное введение и пульсовую инфузию.

Антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу подходящим образом вводят пациенту однократно или в виде серии введений. В зависимости от типа и степени тяжести заболевания, примерно от 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,1 мг/кг - 10 мг/кг) антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы могут быть начальной дозой кандидата для введения пациенту, например, путем одного или нескольких отдельных введений или путем непрерывной инфузии. Одна типичная суточная доза может варьировать примерно от 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от упомянутых выше факторов. При повторных введениях в течение нескольких суток или дольше, в зависимости от состояния, лечение, как правило, будет продолжаться до тех пор, пока не произойдет требуемое подавление симптомов заболевания. Одна примерная дозировка антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы может быть в диапазоне примерно от 0,005 мг/кг до примерно 10 мг/кг. В других примерах, которыми настоящее изобретение не ограничивается, доза также может составлять примерно от 1 мкг/кг массы тела, примерно 5 мкг/кг массы тела, примерно 10 мкг/кг массы тела, примерно 50 мкг/кг массы тела, примерно 100 мкг/кг массы тела, примерно 200 мкг/кг массы тела, примерно 350 мкг/кг массы тела, примерно 500 мкг/кг массы тела, примерно 1 мг/кг массы тела, примерно 5 мг/кг массы тела, примерно 10 мг/кг массы тела, примерно 50 мг/кг массы тела, примерно 100 мг/кг массы тела, примерно 200 мг/кг массы тела, примерно 350 мг/кг массы тела, примерно 500 мг/кг массы тела, до примерно 1000 мг/кг массы тела или более за одно введение и какой-либо производный диапазон. В примерах, не ограничивающих рамки охвата настоящего изобретения, получаемый диапазон от чисел, перечисленных в настоящем изобретении, диапазон примерно от 5 мг/кг массы тела до примерно 100 мг/кг массы тела, примерно от 5 мкг/кг массы тела до примерно 500 мг/кг массы тела, и т.д. может вводиться, основываясь на описанных выше числах. Таким образом, пациенту может быть введена одна или несколько доз примерно равных 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 5,0 мг/кг или 10 мг/кг (или какой-либо их комбинации). Такие дозы можно вводить с перерывами, например, каждую неделю или каждые три недели (например, таким образом, что пациент получает примерно от двух до примерно двадцати, или например, примерно шесть доз антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы). Может быть введена начальная более высокая ударная доза, за которой следует одна или несколько более низких доз. Однако могут быть полезны другие режимы дозирования. Прогресс такого лечения легко подвергать мониторингу с помощью обычных методов и тестов.

Антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению обычно можно использовать в количестве, эффективном для достижения намеченной цели. Для применения в лечении или предотвращении болезненного состояния антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению или их фармацевтические композиции вводят или применяют в терапевтически эффективном количестве. Определение терапевтически эффективного количества находится в пределах возможностей специалистов в данной области, особенно в свете подробного описания настоящего изобретения.

Для системного введения терапевтически эффективная доза может быть первоначально оценена с помощью анализов in vitro, например, путем анализа в культуре клеток. Затем на животных моделях может быть составлена доза для достижения диапазона циркулирующих концентраций, который включает IC₅₀, установленную в культуре клеток. Такую информацию можно использовать для более точного определения полезных доз для людей.

Начальные дозировки также можно оценить на основании данных in vivo, например, на животных моделях, с использованием методов, известных в данной области. Специалист в данной области может легко оптимизировать введение людям, основываясь на данных о животных.

Количество дозы и интервалы дозирования можно регулировать индивидуально, чтобы обеспечить уровни антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул в плазме, достаточные для поддержания терапевтического эффекта. Обычные дозы пациента для введения инъекцией находятся в диапазоне примерно от 0,1 до 50 мг/кг/ сутки, обычно примерно от 0,5 до 1 мг/кг/сутки. Терапевтически эффективные уровни в плазме могут быть достигнуты путем ежедневного введения нескольких доз. Уровни в плазме можно измерить, например, с помощью ВЭЖХ.

В случаях местного введения или селективного потребления эффективная локальная концентрация антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул может не быть связана с концентрацией в плазме. Специалист в данной области сможет оптимизировать терапевтически эффективные местные дозы без лишних экспериментов.

Терапевтически эффективная доза антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул, описанных в настоящем изобретении, обычно обеспечивает терапевтический эффект, не вызывая существенной токсичности. Токсичность и терапевтическая эффективность антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы можно определить стандартными фармацевтическими процедурами на культуре клеток или с помощью экспериментальных животных. Анализы на культурах клеток и исследования на животных можно использовать для определения LD₅₀ (летальная доза для 50% популяции) и ED₅₀ (терапевтически эффективная доза для 50% популяции). Соотношение доз, связанных с токсическим и терапевтическим эффектами, представляет собой терапевтический индекс, который может быть выражен как отношение LD₅₀/ED₅₀. Антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые демонстрируют большие терапевтические индексы, являются придпочтительными. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения антитело или биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению демонстрирует высокий терапевтический индекс. Данные, полученные из анализа культур клеток и исследований на животных, могут быть применимы для определения диапазона доз, подходящих для введения людям. Дозировка предпочтительно находится в диапазоне циркулирующих концентраций, который включает ED₅₀ с небольшой токсичностью или при ее отсутствии. Дозировка может варьироваться в этом диапазоне в зависимости от множества факторов, например, от используемой лекарственной формы, способа введения, состояния субъекта и т.п. Точный состав, способ введения и дозировка могут быть выбраны лечащим врачом с учетом состояния пациента, (см., например, публикацию Fingl с соавт., 1975, в кн.: «The Pharmacological Basis of Therapeutics)), глава 1, стр. 1, включенную в настоящее изобретение в виде ссылки).

Лечащему врачу, применяющему для лечения пациента антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению, должно быть известно, как и когда закончить, прервать или скорректировать введение из-за токсичности, дисфункции органов и т.п. И наоборот, лечащий врач также должен знать, что нужно корректировать лечение до более высоких уровней, если клинический ответ не был адекватным (исключая токсичность). Величина вводимой дозы при лечении конкретного будет варьировать в зависимости от тяжести состояния, подлежащего лечению, от способа введения и т.п. Тяжесть состояния может частично оцениваться, например, стандартными прогностическими методами оценки. Кроме того, доза и, возможно, частота введения также можно варьировать в зависимости от возраста, массы тела и реакции отдельного пациента.

Другие агенты и методы лечения

Антитела и биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению при лечении можно вводить в комбинации с одним или несколькими другими агентами. Например, антитело или биспецифическая антигенсвязывающая молекула по настоящему изобретению можно вводить совместно по меньшей мере с одним дополнительным терапевтическим агентом. Понятие «терапевтический агент» относится к какому-либо агенту, вводимому для лечения симптома или заболевания у индивидуума, нуждающегося в таком лечении. Такой дополнительный терапевтический агент может включать какие-либо активные ингредиенты, применимые в случае конкретного показания, подлежащего лечению, предпочтительно ингредиенты с дополнительными активностями, которые не оказывают негативного воздействия друг на друга. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения дополнительным терапевтическим агентом является иммуномодулирующий агент, цитостатический агент, ингибитор клеточной адгезии, цитотоксический агент, активатор апоптоза клеток или агент, повышающий чувствительность клеток к индукторам апоптоза. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения дополнительным терапевтическим агентом является противораковый агент, например, разрушающий микротрубочки, антиметаболит, ингибитор топоизомеразы, интеркалятор ДНК, алкилирующий агент, гормональная терапия, ингибитор киназы, антагонист рецептора, активатор апоптоза опухолевых клеток или антиангиогенный агент. Такие дополнительные агенты обычно присутствуют в комбинации в количествах, эффективных для обозначенной цели. Эффективное количество таких дополнительных агентов зависит от количества используемого антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, типа нарушения или лечения и других факторов, обсуждаемых выше. Антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы обычно используют в тех же дозировках и теми же путями введения, которые описаны в настоящем изобретении, или примерно от 1 до 99% от дозировок, описанных в настоящем изобретении, или в какой-либо дозе и каким-либо путем, которые рекомендованы эмпирически/клинически.

Такие комбинированные методы лечения, указанные выше, включают комбинированное введение (когда два или более терапевтических агента включены в одну или отдельные композиции) и раздельное введение, и в этом случае введение антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению может происходить до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического агента и/или адъюванта. Антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению также можно использовать в сочетании с лучевой терапией.

Получаемые продукты

В другом объекте настоящего изобретения предусматривают получаемый продукт, содержащий материалы, полезные для лечения, профилактики и/или диагностики нарушений, описанных выше. Продукт включает контейнер и этикетку или листок-вкладыш на контейнере или в контейнере. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы, пакеты с раствором для внутривенного введения и т.д. Контейнеры могут быть изготовлены из различных материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая сама по себе или в сочетании с другой композицией, эффективной для лечения, профилактики и/или диагностики состояния, может иметь стерильный порт доступа (например, контейнер может представлять собой пакет с раствором для внутривенного введения или флакон, имеющий пробку, которую можно проткнуть посредством игла для подкожных инъекций). По крайней мере, один активный агент в композиции представляет собой антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению. Этикетка или вкладыш в упаковку указывает на то, что композицию используют для лечения выбранного состояния. Кроме того, изделие может включать (а) первый контейнер с содержащейся в нем композицией, которая содержит антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по настоящему изобретению; и (б) второй контейнер с содержащейся в нем композицией, которая содержит дополнительный цитотоксический или иной терапевтический агент. Продукт в этом варианте осуществления настоящего изобретения может дополнительно содержать вкладыш в упаковку, указывающий на то, что композиции можно использовать для лечения определенного состояния. В другом варианте или дополнительно, продукт может дополнительно включать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, например, бактериостатическую воду для инъекций (bacteriostatic water for injection, BWFI), фосфатно-солевой буфер, раствор Рингера и раствор декстрозы. Он может дополнительно включать другие материалы, желательные с коммерческой точки зрения и с точки зрения пользователя, в том числе другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

Методы и составы для диагностики и обнаружения

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения какое-либо из антител против GPRC5D, описанных в настоящем изобретении, полезно для обнаружения наличия GPRC5D в биологическом образце. Используемое в настоящем изобретении понятие «обнаружение» относится к количественному или качественному обнаружению. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения биологический образец включает клетки или ткань, например, ткань простатита.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения предусматривают анти-GPRC5D антитело для использования в методе диагностики или обнаружения. В дополнительном объекте предусматривают метод обнаружения GPRC5D в биологическом образце. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения метод включает контакт биологического образца с анти-GPRC5D антителом согласно описанному в настоящем изобретении в условиях, допустимых для связывания анти-GPRC5D антитела с GPRC5D, и обнаружение того, образуется ли комплекс между анти-GPRC5D антителом и GPRC5D. Такой метод может быть методом in vitro или in vivo. В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения анти-GPRC5D антитело применяют для отбора субъектов, подходящих для терапии анти-GPRC5D антителом, например, где GPRC5D является биомаркером для отбора пациентов.

Типичные нарушения, которые можно диагностировать с использованием антитела по настоящему изобретению, включают рак, в частности множественную миелому.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения предусматривают меченые анти-GPRC5D антитела. К меткам относятся, но ими перечень не ограничивается, метки или фрагменты, которые выявляют непосредственно (например, флуоресцентные, хромофорные, электронно-плотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки), а также фрагменты, например, ферменты или лиганды, которые выявляют непосредственно, например, по ферментативной реакции или по молекулярному взаимодействию. К примерам меток относят, но ими перечень не ограничивают, радиоизотопы ³²Р, ¹⁴С, ¹²⁵I, ³Н и ¹³¹I, флуорофоры, например, хелаты редкоземельных элементов или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люцериферазы, например, люцифераза светлячка и бактериальная люцифераза (US 4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидаза хрена (horseradish peroxidase, HRP), щелочная фосфатаза, β-галактозидаза, глюкоамилаза, лизоцим, сахаридоксидазы, например, глюкозооксидаза, галактозоксидаза, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа, гетероциклические оксидазы, такие как уриказа и ксантиноксидаза, в сочетании с ферментом, который использует перекись водорода для окисления предшественника красителя, такого как HRP, лактопероксидаза или микропероксидаза, биотин/авидин, спиновые метки, метки бактериофага, стабильные свободные радикалы и т.п.

Другой объект настоящего изобретения связан с антителом (10В10), которое связывает GPRC5D, содержащим вариабельную область тяжелой цепи (VL), где VL может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 81. Антитело может содержать вариабельную область легкой цепи (VL), где VL содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 82. Антитело может включать VH и VL, причем VL может включать аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 81, и где VL включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 82. Предпочтительно антитело содержит область VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82.

Другой объект настоящего изобретения относится к антителу (10В10-ТСВ). Антитело может включать первую легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 67. Антитело может включать вторую легкую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 68. Антитело может включать первую тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 69. Антитело может включать вторую тяжелую цепь, которая содержит аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 70. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения антитело включает первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67, вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68, первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69, и вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70.

Примеры

Ниже представлены примеры методов и композиций по настоящему изобретению. Следует учитывать, что могут быть применены другие варианты осуществления настоящего изобретения, приведенные выше в общем описании.

Пример 1. Экспрессия мишеней опухолей.

Чтобы идентифицировать дифференциальные гены, экспрессируемые клетками множественной миеломой по сравнению с нормальными клетками плазмы, проводят RNAseq 10 образцов, полученных от пациентов с множественной миеломой (ММ), и 10 клеток плазмы (plasma cell, PC), полученных из костного мозга здоровых доноров. РНК экстрагируют с помощью набора RNeasy Micro kit (фирма Qiagen) по инструкциям производителя. Геномную ДНК удаляют, используя набор ДНКаз, не содержащих РНКаз (фирма Qiagen), при экстракции РНК. Качество экстрагированной РНК контролируют на пикочипах Agilent Eukaryote Total RNA (фирма Agilent Technologies). Набор SMARTer со сверхнизким содержанием РНК для секвенирования Illumina (фирма Clontech) применяют для получения и амплификации кДНК из 1,6 нг суммарной РНК по инструкциям производителя. Затем 1 нг амплифицированной кДНК подвергают обработке Nextera XT library (фирма Illumina) в соответствии с инструкциями производителя. Библиотеки секвенирования оценивают количественно, используя набор для количественной оценки библиотеки Kapa (фирма Kapa Biosystems), а качество контролируют капиллярным электрофорезом на биоанализаторе с использованием чипов высокой чувствительности High Sensitivity (фирма Agilent Technologies). Библиотеки секвенируют на секвенаторе HiSeq2500 (фирма Illumina) на протяжении 2×50 циклов, используя наборы для создания кластеров версии 4 и реактивы для секвенирования версии 4 (фирма Illumina).

Антиген созревания В-клеток (B-cell maturation antigen, BCMA) является белком клеточной поверхности, который экспрессируется на злокачественных плазматических клетках и, таким образом, распознается как мишень множественной миеломы (Tai Y.T., Anderson K.С., Immunotherapy, 7(11), 2015, 1187-1199). Глубокий анализ с использованием технологии RNAseq показал, что GPRC5D экспрессируется на таком же высоком уровне, что и BCMA, в плазматических клетках пациентов с множественной миеломой (фиг. 2). Более важно, что экспрессия GPRC5D в плазматических клетках пациентов с множественной миеломой и в здоровых плазматических клетках отличается примерно в 20 раз. Напротив, дифференциальная экспрессия BCMA между плазматическими клетками пациентов с множественной миеломой и здоровыми плазматическими клетками отличается только в 2 раза. В целом экспрессия GPRC5D намного выше, чем экспрессия других известных молекул-мишеней множественной миеломы, таких как SLAM7, CD138 и CD38. Кроме того, экспрессия GPRC5D затруднена наивными В-клетками или В-клетками памяти.

Пример 2. Выработка связующих GPRC5D и получение Т-клеточных биспецифических (ТСВ) антител.

Связующие GPRC5D вырабатываются в результате иммунизации крыс ДНК с последующим получением гибридомы, скринингом и секвенированием гибридомы. Скрининг на специфическое связывание измеряют с помощью ELISA по связыванию с трансфектантом, экспрессирующим GPRC5D. Два связующих агента GPRC5D идентифицируют как 5Е11 (SEQ ID NO: 13 и 14) и 5F11 (SEQ ID NO: 15 и 16), приведенные ниже. Как только специфические связующие были идентифицированы, IgG конвертируют в Т-клеточные биспецифические антитела. Принципы конвертирования связующих в Т-клеточные биспецифические антитела исследованы и описаны в данной области, например, в публикации WO 2014/131712 А1, сущность которой включена в настоящий документ в виде ссылки. Биспецифические антитела к Т-клеткам содержат два GRKC5D-связующих фрагмента и один CD3-связующий фрагмент (анти-GPRC5D/анти-CD3 Т-клеточные биспецифические антитела), показанные на фиг. 3. Получают следующие анти-GRKC5D/анти-CD3 Т-клеточные биспецифические антитела: i) 5E11-TCB (SEQ ID NO: 17, 18, 19 и 20); ii) 5F11-TCB (SEQ ID NO: 21, 22, 23 и 24); iii) ET150-5-TCB (SEQ ID NO: 25, 26, 27 и 28);

iv) B72-TCB (SEQ ID NO: 73, 74, 75 и 76); и v) BCMA-TCB (SEQ ID NO: 77, 78, 79 и 80). ЕТ150-5 GPRC5D связующий фрагмент описан в WO 2016/090329 A2. Понятие «ЕТ-150-5» равноценно применяемому в настоящем изобретении понятию «ЕТ150-5» и наоборот. В качестве отрицательного контроля получают ненацеленный DP47-TCB. DP47-TCB является ненацеленным Т-клеточным биспецифическим антителом, которое связывается только с CD3, но не связывается с GPRC5D. DP47-TCB описывают в публикации WO 2014/131712 А1, сущность которой включена в настоящий документ в виде ссылки. B72-TCB является производным антитела GCDB72, описанным в табл. 23 в WO 2018/0117786 А2, и содержит GPRC5D-связывающий фрагмент GCDB72. B72-TCB вырабатывают в формате crossmab 1+1 (SEQ ID NO: 73, 74, 75 и 76). BCMA-TCB является производным от описанного в WO 2016/166629 А1 и содержит GPRC5D-связывающий фрагмент A02_Rd4_6nM_C01 согласно описанному в указанном патенте. BCMA-TCB вырабатывают в формате crossmab 2+1 (SEQ ID NO: 77, 78, 79 и 80).

Пример 3. Связывание Т-клеточных биспецифических антител к с линиями клеток множественной миеломы.

Для измерения связывания с GPRC5D, исследуют связывание на основе метода флуоресцентной сортировки клеток (FACS) (Lombardi с соавт., Genes Chromosomes Cancer. Mar; 46(3), 2007, 226-238.). Линии клеток АМО-1, L363 и ОРМ-2 культивируют в среде RPMI 1640 + среда Glutamax (фирма Gibco), обогащенной 20% инактивированной нагреванием фетальной сывороткой теленка (Fetal Bovine Serum, FBS; фирма Gibco) и 1% пенициллин - стрептомицин 100Х (фирма Gibco). Линию клеток WSU-DLCL2 (отрицательный контроль) культивируют в той же среде, но обогащенной только 10% FBS. Линии клеток NCI-H929 и RPMI-8226 также культивируют в той же среде, обогащенной 50 мкМ меркаптоэтанола (фирма Gibco) и 1 мМ пирувата натрия (фирма Gibco). Линии клеток культивируют во флаконах объемом 75 см (фирма ТРР) при двух пассажах в неделю.

Связывание различных анти-GPRC5D человека-ТСВ антител (5Е11-ТСВ, 5F11-TCB и ЕТ 150-5 ТСВ) оценивают, используя непрямое окрашивание.

Клетки инкубируют с конструкциями GPRC5D-TCB (5Е11-ТСВ, 5F11-TCB или ЕТ150-5 ТСВ) в диапазоне от 10 мкг/мл до 0,00064 мкг/мл, используя серийное разведение с коэффициентом 0,2, или без конструкции в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ; фирма Gibco) в течение 1 ч при 4°С. Клетки окрашивают красителем Live blue (фирма Life Technologies), разведенным в ФСБ 1:800 в течение 20 мин при 4°С перед окрашиванием РЕ конъюгированным козьим анти-IgG человека, Fcy-фрагмент специфическим (фирма Jackson Laboratories) разведенным 1/300 в буфере для окрашивания для жидкостной цитометрии (фирма eBioscience), инкубируют в течение 30 мин при 4°С. Жидкостную цитометрию выполняют на специально разработанном цитофлуориметре BD Biosciences Fortessa и анализируют с использованием программного обеспечения FlowJo (фирма Tree Star, Ашленд, штат Орегон) и программного обеспечения GraphPad Prism.

Фиг. 4А-В показывают, что и 5Е11-ТСВ, и 5F11-TCB связывают все исследованные линии клеток множественной миеломы дозозависимым образом. Напротив, ЕТ150-5-ТСВ гораздо слабее связывается с тестируемыми линиями клеток. Не наблюдают связывание с клетками WSU-DLCL2 (линия GPRC5D-клеток неходжкинской лимфомы) анти-GPRC5D-TCB.

Пример 4. Анти-GPRC5D-ТСВ опосредованная Т-клеточная цитотоксичность.

Для измерения функциональности анти-GPRC5D-TCB антител проводят анализ цитотоксичности Т-клеток in-vitro. Вкратце, линии клеток АМО-1, L363 и ОРМ-2 культивируют в среде RPMI 1640 + Glutamax (фирма Gibco), обогащенной 20% инактивированной нагреванием фетальной сывороткой теленка (Fetal Bovine Serum, FBS; фирма Gibco) и 1% пенициллин - стрептомицин 100Х (фирма Gibco). Линии клеток NCI-H929 и RPMI-8226 культивируют в той же среде, обогащенной 50 мкМ меркаптоэтанола (фирма Gibco) и 1 мМ пирувата натрия (фирма Gibco). Линии клеток культивируют во флаконах объемом 75 см² (фирма ТРР) при двух пассажах в неделю.

Линии клеток совместно культивируют при соотношении мишень: эффектор 1:10 с 3,105 аллогенными Т-клетками, выделенными из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) (лейкоцитарная пленка от фирмы Blutspende Schlieren) с использованием набора для выделения Pan Т-клеток человека (фирма Miltenyi Biotec) в среде IMDM (фирма Gibco) с добавлением 10% ФСБ (фирма Gibco) + 1% PS (фирма Gibco). Антитела анти-GPRC5D-TCB человека (5Е11-ТСВ, 5F11-TCB, ЕТ150-5 ТСВ или DP47-TCB) добавляют в совместную культуру в разных концентрациях, в диапазоне от 1 мкг/мл до 0,000001 мкг/мл при серийном разведении с коэффициентом 0,1 или 0 мкг/мл. Через 20 ч инкубирования при 37°С с 5% CO₂, по 75 мкл супернатанта переносили в лунки 96-луночного планшета (фирма Greiner bio-one) с 25 мкл/лунку CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay (фирма Promega). Возникающую люминесценцию фиксируют с помощью самописца PerkinElmer En Vision после 15 мин инкубирования при комнатной температуре и анализируют, используя GraphPad Prism и XL fit программное обеспечение. Данные представляют в виде сигнала люминесценции для высвобождения LDH.

Фиг. 5А-Д показывают, что как 5Е11-ТСВ, так и 5F11-TCB опосредуют сильную цитотоксичность Т-клеток в отношении линий множественных миеломных клеток, особенно NCI-H929 (фиг. 5Б), RPMI-8226 (фиг. 5В), L363 и (фиг. 5Г) АМО-1 (фиг. 5А), в то время как гибель не наблюдают в линии клеток отрицательного контроля WSU-DLCL2 (фиг. 5Д). Напротив, ЕТ150-5-ТСВ опосредует незначительное или существенно меньшее уничтожение тестируемых линий клеток множественной миеломы. В табл. 1 суммируют значения ЕС₅₀, полученные на основе данных, представленных на фиг. 5А-Д. Значение ЕС₅₀ рассчитывают с использованием дополнительной функции XLfit в Excel путем нанесения необработанных данных по сигналам против оттитрованных ТСВ.

Пример 5. Анти-GPRC5D-TCB опосредованная активация Т-клеток

Чтобы механически воздействовать на способы действия анти-GPRC5D-TCB, была измерена активация Т-клеток после совместного культивирования с линиями клеток-мишеней множественной миеломы в присутствии анти-GPRC5D-TCB. Схожий эксперимент описывают в примере 4 и на фиг. 5А-Д, линии клеток совместно культивируют при соотношении мишень: эффектор 1:10 с 3,105 аллогенными Т-клетками, выделенными из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) (лейкоцитарная пленка от фирмы Blutspende Schlieren) с использованием набора для выделения Pan Т-клеток человека (фирма Miltenyi Biotec) в среде IMDM Medium (фирма Gibco), обогащенной 10% ФСТ (фирма Gibco) + 1% PS (фирма Gibco). Антитела анти-GPRC5D-TCB человека (5Е11-ТСВ, 5F11-TCB, ЕТ150-5-ТСВ или DP47-TCB) добавляют в совместную культуру в разных концентрациях в диапазоне от 1 мкг/мл до 0,000001 мкг/мл с коэффициентом серийных разведении 0,1 или 0 мкг/мл. Через 20 ч инкубирования при 37°С с 5% CO₂, клетки окрашивают для оценки активации Т-клеток. Клетки сначала окрашивают красителем Live blue (фирма Life Technologies), разведенным 1:800 в ФСБ (фирма Gibco) в течение 20 мин при 4°С. Затем клетки окрашивают AF700 анти-CD4 человека (клон ОКТ4), BV711 анти-CD8 человека (клон SKI), BV605 анти-CD25 человека (клон ВС96), АРС-Су7 анти-CD69 человека (клон FN50), все от фирмы BioLegend, и РЕ-Су5.5 анти-CD3 человека (клон SK7; фирма eBioscience) в окрашивающем буфере для жидкостной цитометрии (фирма eBioscience) в течение 30 мин при 4°С. Проточную цитометрию осуществляют на специально разработанном цитометре BD Biosciences Fortessa и анализируют с использованием программного обеспечения FlowJo (фирма Tree Star, Ashland, OR) и GraphPad Prism.

На фиг. 6 показано, что 5F11-TCB индуцирует активацию Т-клеток в совместных культурах с клетками NCI-H929 путем усиления регуляции маркера активации CD25 и CD69, тогда как контрольные элементы, например, ненацеленный DP47-TCB без какого-либо ТСВ, не индуцируют активацию Т-клеток. В качестве другого отрицательного контроля Т-клетки, обработанные 5F11-TCB, культивируют совместно с клетками WSU-DLCL2, при этом Т-клетки также не были активируют. Эти профили активации совпадают во многих изученных клеточных линиях, например АМО-1, NCI-H929, RPMI-8226, L363 (фиг. 7А-К). В соответствии с низкой эффективностью уничтожения, ЕТ150-5-ТСВ не индуцирует активацию Т-клеток, за исключением самой высокой испытанной концентрации 1 мг/кг.

Пример 6. Локализация и интернализация анти-GRKC5D-ТСВ

Клетки NCI-H929 окрашивают CMFDA (фирма Invitrogen) и высевают на круглые покровные стекла, покрытые поли-Е-лизином (фирма Sigma), в 24-луночные планшеты. Антитела (5E11-IgG, 5E11-TCB, 5F11-IgG, 5F11-TCB) метят сукцинимидиловым эфиром Alexa Fluor 647 (фирма InVitrogen, номер по каталогу А201106) в молярном соотношении 2,5. Клеткам дают возможность прикрепиться в течение ночи при 37°С перед добавлением флуоресцентно-меченых антител (Alexa Fluor 647, меченный-5Е11-IgG, -5E11-TCB, -5F11-IgG, -5F11-TCB) непосредственно в питательную среду на разное время и температуры (30 мин на льду, 1 час при 37°С и 3 ч при 37°С). Холодный ФСБ (фирма Lonza) используют для гашения реакции и отмывания несвязавшихся антител после каждой контрольной точки. Затем клетки фиксируют Cytofix (фирма BD) в течение 20 мин при 4°С и дважды промывают ФСБ. Затем покровные стекла переносят на предметные стекла с Fluoromount G (фирма eBioscience) и хранят в темноте при 4°С в течение ночи перед визуализацией. Флуоресцентную конфокальную микроскопию выполняют на инвертированном микроскопе LSM 700 от фирмы Zeiss с иммерсионным объективом 60×. Изображения собирают с использованием программного обеспечения Zen (фирма Zeiss), встроенного в микроскоп, и визуализируют с помощью программного обеспечения IMARIS (фирма Bitplane). На фиг. 8А показано, что все антитела окрашивают поверхность (плазматическую мембрану) линии клеток множественной миеломы при 4°С или 37°С. Если антитела интернализуются клетками, то при культивировании при 37°С в цитоплазме появляется флуоресцентное окрашивание. Не наблюдают интернализации GPRC5D-связывающих IgG или GRKC5D-связывающих ТСВ линиями клеток GPRC5D. Это было дополнительно подтверждено оценкой суммарной интенсивности для определенных областей клеток, определяемых мембраной и цитоплазмой (через три часа). Программное обеспечение IMARIS используют для анализа и количественной оценки отношения сигналов от мембраны к цитоплазме. Фиг. 8Б показывает, что через 3 ч после инкубации с различными антителами отношение интенсивности мембраны к цитоплазме не изменилось и составило ~ 4, что означает, что флуоресцентные сигналы концентрируются на поверхности, а не в цитоплазме.

Пример 7. Описание связующих GPRC5D: связывание рекомбинантных клеток, определяемое методом ELISA

Стабильно трансфецированные клоны СНО, экспрессирующие GPRC5D человека, или GPRC5D макаки крабоеда, или GPRC5D грызуна, или GPRC5A человека, применяют для анализа связывания потенциальных лидерных антител-кандидатов, относящихся к IgG. Подробнее, 10⁴ клеток (выживаемость ≥98%) высевают в 384-луночные планшеты для микротитрования (поли D-лизин, фирма BD, номер в каталоге 356662; объем: 25 мкл/лунку), используя свежую культуральную среду. После инкубирования в течение ночи при 37°С, разведения антител по 25 мкл/лунку (15 × 1:3 разведения в 1×фСБ, исследование концентраций начинают с концентрации 30 мкг/мл) добавляют к клеткам в течение 2 ч при 4°С. После стадии промывания с использованием 90 мкл/лунку PBST (10× PBS, фирма Roche, #11666789001 + 0,1% Tween 20), клетки последовательно фиксируют добавлением 50 мкл/лунку 0,05% глутаральдегида (фирма Sigma, номер в каталоге G5882; в 1×фСБ) в течение 10 мин при комнатной температуре (КТ). После трех дополнительных промывок с использованием 90 мкл/лунку PBST, для обнаружения вносят вторичные антитела: для антител человека применяют (25 мкл/лунку) козье анти-Ig к цепи человека антитело, конъюгированное с HPR (фирма Millipore, номер в каталоге АР502Р) применяют разведенным 1:2000 в блокирующем буфере (1×фСБ (фирма Roche, номер в каталоге 11666789001) + 2% БСА (фирма Bovine Serum Albumin Fraction V, без жирных кислот; фирма Roche, номер в каталоге 10735086001) + 0,05% Tween 20). Для антител крысы применяют смесь козьего анти-IgG2a крысы антитела, конъюгированного с HPR (фирма Bethyl, номер в каталоге А110-106Р), козьего анти-IgG2a крысы антитела, конъюгированного с HPR (фирма Bethyl, номер в каталоге А110-109Р), и козьего анти-IgG2b крысы антитела, конъюгированного с HPR (фирма Bethyl, номер в каталоге А110-111P), в разведении 1:10000 каждого антитела в блокирующем буфере (25 мкл/лунку). После инкубирования в течение 1 ч при КТ и трех дополнительных стадий промывки с использованием 90 мкл/лунку PBST, добавляют 25 мкл/лунку ТМВ субстрат (фирма Roche, номер в каталоге 11835033001) в течение 10 мин и формирование цвета до итоговой оптической плотности (ОП) определяют измерением при 370 нм/492 нм.

Все протестированные антитела показывают положительное связывание с GPRC5D человека со значениями ЕС₅₀ (отражающими авидность) в диапазоне пМ. Только IgG крысы 10В10 и 07А04 показывают перекрестную реактивность на клетках СНО, экспрессирующих GPRC5D макака крабоеда, со значениями ЕС₅₀, сравнимыми с версией рецептора человека (фиг. 9). Перекрестная реактивность макака крабоеда также обнаружена для всех других антител, но на более низких уровнях по сравнению с 10В10 и 07А04 (фиг. 9). Не было обнаружено существенного связывания с клетками СНО, экспрессирующими GPRC5D мыши, и не было обнаружено связывания с клетками СНО, экспрессирующими версию GPRC5A человека (фиг. 9). Значения связывания ЕС₅₀ суммированы в табл. 2.

Пример 8. Связующие GPRC5D: рекомбинант GPRC5D-TCB опосредует цитотоксичность Т-клеток на линии клеток ММ.

Для сравнения функциональности GPRC5D-TCB или других нацеленных ТСВ проводят анализ in vitro Т-клеточной цитотоксичности на линии клеток множественной миеломы (MM): MOLP-2 (фиг. 10Б), АМО-1 (фиг. 10В), EJM (фиг. 10Г) и NCI-H929 (фиг. 10Ж). Вкратце, линии клеток культивируют в среде RPMI 1640 + GlutaMax (фирма Gibco), обогащенной 20% инактивированной нагреванием фетальной сыворотки теленка (фирма FBS; Gibco) и 1% пенициллина - стрептомицина 100Х (фирма PS; Gibco). MOLP-2 культивируют в этой среде, обогащенной GlutaMax IX (фирма Gibco). ОРМ-2 (фиг. 10А), RPMI-8226 (фиг. 10Д) и L-363 (фиг. 10Е), линию клеток культивируют в той же среде, обогащенной только 10% ФСБ. NCI-H929 культивируют в этой среде, обогащенной 50 мкМ меркаптоэтанола (фирма Gibco), 1 мМ пируватом натрия (фирма Gibco) и GlutaMax 1X (фирма Gibco). EJM культивируют в IMDM (фирма Gibco) + 10% ФСБ (фирма Gibco) и 1% PS (фирма Gibco). Все линии клеток культивируют во флаконах объемом 75 см² (фирма ТРР) при двух пассажах в неделю.

Клеточные линии совместно культивируют при соотношении эффектор/мишень 10:1 с использованием 0,3 миллиона аллогенных Т-клеток, выделенных из МКПК (лейкоцитарная пленка от фирмы Blutspende Schlieren), с использованием набора для выделения Pan Т-клеток человека (фирма Miltenyi Biotec) в среде RPMI (фирма Gibco) с добавлением 10% ФСВ (фирма Gibco) + 1% PS (фирма Gibco). Конструкцию анти-GRKC5D человека ТСВ (5Е11-ТСВ, 5F11-TCB, 10 В10-ТСВ, В72-ТСВ, ВСМА-ТСВ и DP47-TCB) добавляют к совместной культуре в различных концентрациях, от 12,5 нМ до 0,0000125 нМ с серийным разведение 1/10 и сравнивают с необработанными образцами. После 20 ч инкубации при 37°С с 5% CO₂ по 75 мкл супернатанта на лунку переносили в 96-луночный белый планшет (фирма Greiner bio-one) с 25 мкл на лунку CytoTox-Glo Cytotoxicity Assay (фирма Promega). Получение люминесценции осуществляют на PerkinElmer En Vision после 15 мин инкубации при комнатной температуре и анализируют с использованием программного обеспечения GraphPad Prism и XL fit. Данные наносят на график как сигнал люминесценции для высвобождения LDH (фиг. 10). На фиг. 10А-Ж суммируют данные, показывающие, что как 5Е11-ТСВ, так и 5F11-TCB опосредуют более сильную цитотоксичность Т-клеток в отношении линий клеток ММ, чем ВСМА-ТСВ, 10В10-ТСВ и В72-ТСВ. ЕС₅₀ опосредованного ТСВ уничтожения показано в табл. 3 и рассчитано как среднее значение из разных экспериментов с разными Т-клетками доноров (n=2 или n=3).

Пример 9. Активация in vitro Т-клеток в здоровых клетках костного мозга еловека.

Свежий непроцессированный костный мозг от четырех разных здоровых доноров (фирма Lonza, номер в каталоге 1М-105, лоты 0000739254; 0000739255; 0000739256 и 0000734008) обрабатывают после 1 или 2 суток после отбора образцов. After a quick red blood cell lysis using BD Pharm Lysis buffer (фирма BD, номер в каталоге 555899; 1X в стерильной воде) в течение 5 мин при КТ; клетки промывают дважды, центрифугируют и заменяют буфер в режимах 126g и 443g, соответственно. Клетки подсчитывают и ресуспендируют до 300000 клеток/мл в среде RPMI 1640 Glutamax + 20% HI фетальной сыворотки теленка + 2% сыворотки человека + 1% пенициллин /стрептомицин (все реактивы от фирмы Gibco), и по 100 мкл клеточной суспензии высевают в лунки в 96-луночный круглодонный планшет (фирма ТРР). По 50 мкл среды или среды, обогащенной В72-ТСВ, 5F11-TCB, 5Е11-ТСВ, ВСМА-ТСВ, 10В10-ТСВ или DP47-TCB, от 200 нМ (4Х) до 20 пМ в стерильном разведении 1/10 вносят в лунки. В итоге, 50 мкл аллогенных Т-клеток, выделенных с использованием Pan Т-клеток (фирма Miltenyi Biotec, номер в каталоге 130-096-535) из МКПК здоровых доноров вносят в количестве 6 млн./мл (соотношение эффекторных Т-клеток и здоровых клеток-мишеней костного мозга 10:1). После ночи инкубирования при 37°С во влажном инкубаторе клетки однократно промывают ФСБ и окрашивают в течение 20 мин при 4° с 50 мкл красителя Live blue (фирма Invitrogen, номер в каталоге L23105), разведенного 1/800 в ФСБ. После промывки клетки инкубируют в течение 30 мин при 4° со следующей смесью антител, разведенных в буфере РАС (ФСБ 1X, 2% фетальной сыворотки теленка; 1% 0,5 м EDTA РН 8; 0,25% NaNs азида натрия (20%)): CD25 BV605, CD69 АРС-Су7, ВСМА BV421, CD38 BV510, CD138 FITC, FcRH5 РЕ, разведенный 1/100, и CD8 BV711, CD3 РЕ-Су5 и CD4 AlexaFluor 700, разведенный 1/300 (все реактивы от фирмы BioLegend), и GPRC5D AlexaFluor 647 (внутрифирменный, клон 5Е11 IgG). После промывки клетки ресуспендируют в 100 мкл буфера РАС и собирают с помощью флуориметра Fortessa (фирма BD Biosciences).

Данные, представленные на фиг. 11А-Е, показывают, что В72-ТСВ индуцирует неспецифическую активацию Т-клеток (измеренную по активации CD69) в здоровом костном мозге, но не какие-либо другие исследованные ТСВ. Показано, что неспецифическая активация, индуцированная В72-ТСВ, зависит от концентрации и более выражена при 50 нм, чем при 5 нм (фиг. 12А и 12Б).

Пример 10. Эффективность in vivo TCB

В исследовании эффективности различные конструкции ТСВ (GPRC5D 5F110-TCB, 5Е11-ТСВ, ВСМА-ТСВ и В72-ТСВ) сопоставляют по оценке регрессии опухоли у полностью гуманизированных мышей NSG с множественной миеломой. Клетки NCI-H929 изначально получают из коллекции АТСС, а клетки ОРМ-2 - из коллекции DSMZ. Клетки обеих линий размножались. Клетки культивируют в среде RPMI, содержащей 10% ФСТ и 2 мМ L-глутамина, 10 мМ HEPES, 1 мМ пирувата натрия. Клетки культивируют при 37°С во влажной атмосфере при 5% CO₂. 2,5×10⁶ NCI-H929 и 5×10⁶ ОРМ-2 клеток на животное вводят инъекцией подкожно в правый бок в среде для культур клеток RPMI (фирма Gibco) и GFR матригеле (1:1, общий объем 100 мкл) при жизнеспособности >95,0%.

Самок мышей NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtmlWjl/SzJ) в возрасте 4-5 недель от начала эксперимента (разведение на фирме Charles River, Лион, Франция) поддерживают в условиях, свободных от патогенов, с суточным циклом 12 ч света/ 12 ч темноты в соответствии с установленными рекомендациями (фирмы GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол экспериментального исследования рассмотрен и одобрен местными властями (ROB-55.2-2532. Vet_03-16-10). После прибытия животных содержат в течение одной недели для привыкания к новой среде и для наблюдения. Постоянный мониторинг здоровья проводят на регулярной основе.

В соответствии с протоколом самкам мышей NSG внутрибрюшинной инъекцией вводят из расчета 15 мг/кг бусульфана и затем через сутки внутривенной инъекцией вводят 1×10⁵ кроветворные стволовые клетки человека, выделенные из пуповинной крови. На 16-20 неделе после инъекции стволовых клеток у мышей берут и анализируют кровь с помощью жидкостной цитометрии для успешной гуманизации. Эффективно привитых мышей рандомизируют в соответствии с частотой встречаемости Т-лимфоцитов человека по разным группам лечения (n=10/ группу). В это время мышам подкожно вводят опухолевые клетки согласно описанному выше и обрабатывают один раз в неделю соединениями или ФСБ (растворитель), когда размер опухоли достигал приблизительно 200 мм³. Всем мышам внутривенно вводят различные дозы молекул ТСВ (см. фиг. 13А-Г и 14А-Г).

Для получения необходимого количества соединений исходные растворы разбавляют гистидиновым буфером (20 мМ гистидин, 140 мМ NaCl, pH 6,0). Рост опухоли измеряют дважды в неделю с помощью штангенциркуля и рассчитывают объем опухоли следующим образом:

Объем опухоли = (Ш²/2)×Д

(Ш: ширина, Д: длина)

Исследование прекращают и всех мышей умерщвляют после четырех инъекций соединений, опухоли эксплантируют и взвешивают.

Фиг. 13А-Г показывает кинетику роста опухоли у всех животных, которые получили инъекции NC1-H929, после лечения. 5F11-ТСВ-индуцированная полная ремиссия опухоли у всех животных при дозе 1 мг/кг или 0,1 мг/кг (фиг. 13А), хотя В72-ТСВ индуцирует только частичную ремиссию опухоли при применении в дозе 1 мг/кг, при отсутствии эффекта в дозе 0,1 мг/кг (фиг. 13В). ВСМА-ТСВ также индуцирует частичную ремиссию опухоли в дозе 1 мг/кг (фиг. 13Б).

Фиг. 14А-Г показывает кинетику роста опухоли у всех животных, которые получили инъекции ОРМ-2, после лечения. 5F11-TCB (фиг. 14А, верхняя панель) и 5Е11-ТСВ (фиг. 14Б, верхняя панель) индуцирует полную ремиссию опухоли у большинства животных в дозе 0,1 мг/кг, тогда как В72-ТСВ (фиг. 14В, верхняя панель) в дозе 0,1 мг/кг проявляет меньшую активность по остановке роста опухоли. В дозе 0,01 мг/кг 5F11-TCB (фиг. 14А, нижняя панель) и 5Е11-ТСВ (фиг. 14Б, верхняя панель) сильнее подавляют рост опухоли по сравнению с В72-ТСВ (фиг. 14 В, нижняя панель).

Пример 11. Гуманизация анти-GRKC5D антител

Подходящие акцепторные каркасные области человека идентифицируют путем запроса в базе данных BLASTp последовательностей V- и J-областей человека для ввода последовательностей грызунов (от усеченной до вариабельной части). Селективными критериями для отбора акцепторной каркасной области человека была гомология последовательности, близость или идентичность по длине CDR, и предполагаемая частота зародышевой линии человека, а также сохранение определенных аминокислот на интерфейсе домена VH-VL. После стадии идентификации зародышевой линии, CDR вводимых последовательностей грызунов переносят в акцепторные каркасные области человека. Каждое отличие аминокислот между данными исходными трансплантатами CDR и исходными антителами оценивают на предмет возможного воздействия на структурную целостность соответствующей вариабельной области, и «обратные мутации» по отношению к исходной последовательности вводят при возникновении целесообразности. Структурную оценку основывают на моделях гомологии области Fv как родительского антитела, так и гуманизированных вариантов, разработанных по протоколу моделирования гомологии структуры антител, разработанного авторами настоящего изобретения, осуществленного с помощью программы BIOVIA Discovery Studio Environment, версия 17R2. В некоторые гуманизированные варианты включают «прямые мутации», то есть замещения аминокислот, которые изменяют первоначальную аминокислоту, имеющуюся в данном положении CDR исходного связующего, на аминокислоту, обнаруженную в равном положении акцепторной зародышевой линии человека. Цель заключается в повышении в целом свойств, свойственных человеку, которые касаются гуманизированных вариантов (за пределами каркасных областей) для дальнейшего снижения риска иммуногенности.

Разработанный авторами настоящего изобретения in silico инструмент применяют для прогнозирования ориентации домена VH-VL спаренных VH и VL гуманизированных вариантов (подобно изложенному в патенте WO 2016/062734 А1, сущность которого включена в настоящее изобретение в виде ссылке). Результаты сравнивают с прогнозом по ориентации домена VH-VL исходных связующих для отбора комбинаций каркасных областей, которые по геометрии близки к исходным антителам. Рациональным является обнаружение возможных обменов аминокислот в области интерфейса VH-VL, которые могут привести к разрушительным изменениям в спаривании двух доменов, что, в свою очередь, может иметь вредные воздействия на свойства связывания.

Выбор акцепторной каркасной области и ее адаптации для GPRC5D связующего 5F11

Акцепторные каркасные области выбирают из представленных в табл. 4.

Пост-CDR3 каркасные области адаптируют из зародышевой линии IGHJ человека IGHJ3*02 (DAFDIWGQGTMVTVSS) и зародышевой линии IGKJ человека IGKJ5*01 (ITFGQGTRLEIK). Часть, релевантная по отношению к акцепторной каркасной области, выделена жирным шрифтом.

Исходя из анализа структуры, обратные мутации из акцепторной каркасной области человека в отношении аминокислоты в исходном связующем внедряют в определенные положения гуманизированных вариантов 5Е11 (табл. 5 и 6). Кроме того, некоторые позиции идентифицируют в качестве перспективных кандидатов для прямых мутаций, где аминокислота в CDR исходного связывающего заменена аминокислотой, обнаруженной в акцепторной зародышевой линии человека. Изменения подробно описаны ниже в таблице.

Примечание. Обратные мутации имеют префикс b, прямые мутации - f, например, bS49A означает обратную мутацию (аминокислота зародышевой линии человека относительно аминокислоты исходного антитела) от серина к аланину в положении 49. Нумерация всех остатков приводится по системе Kabat.

Выбор акцепторной каркасной области и ее адаптация для GPRC5D связующего 5F11

Акцепторные каркасные области выбирают из представленных в табл. 7.

Идентичность зародышевой линии V-области человека

Пост-CDR3 каркасные области адаптируют из зародышевой линии IGHJ человека IGHJ3*02 (DAFDIWGQGTMVTVSS) и зародышевой линии IGKJ человека IGKJ5*01 (YTFGQGTKLEIK). Часть, релевантная по отношению к акцепторной каркасной области, выделена жирным шрифтом.

Исходя из анализа структуры, обратные мутации из акцепторной каркасной области человека в отношении аминокислоты в исходном связующем внедряют в определенные положения гуманизированных вариантов 5Е11 (табл. 8 и 9). Кроме того, некоторые позиции идентифицируют как перспективные кандидаты для прямых мутаций, где аминокислота в CDR исходного связывающего заменена аминокислотой, обнаруженной в акцепторной зародышевой линии человека. Изменения подробно описаны в таблице ниже.

Примечание. Обратные мутации имеют префикс b, прямые мутации - f, например, bA93T означает обратную мутацию (аминокислота зародышевой линии человека относительно аминокислоты исходного антитела) от аланина к треонину в положении 93. Нумерацию всех остатков приводят по системе Kabat.

Описание гуманизированных вариантов методом ELISA Для описания гуманизированных вариантов доменов VH и VL GPRC5D связующих применяют описанный выше протокол метода ELISA (см. пример 7). Данные суммированы в табл. 10 для гуманизированных вариантов 5Е11 и в табл. 11 для гуманизированных вариантов 5F11. В табл. 12 показаны последовательности CDR родительского 5Е11 и родительского 5Е11 и отобранных вариантов гуманизации.

Пример 12. Активация in vitro клеток CAR-J в присутствии различных гуманизированных вариантов отобранных анти-GRKC5D IgG

Способность различных гуманизированных анти-GPRC5D IgG активировать эффекторные клетки PGLALA-CAR-J оценивают согласно описанию, приведенному ниже. GRKC5D-экспрессирующие клетки-мишени множественной миеломы L363 (Diehl с соавт., Blut 36, 1978, 331-338) культивируют совместно с анти-PGLALA-CAR-J эффекторными клетками (репортерная линия клеток острого лимфатического лейкоза человека Jurkat-NFAT, экспрессирующих TCR-направленную против PGLALA (P329G L234A L235A) мутацию в части Fc молекул IgG и содержащих промотор NFAT, согласно описанному в РСТ/ЕР2018/086038 и РСТ/ЕР2018/086067. При одновременном связывании молекулы IgG с GPRC5D на клетках L363 и клетках PGLALA-CAR-J, промотор NFAT активируется и приводит к экспрессии активной люциферазы светлячков.

Для проведения анализа варианты гуманизированного IgG разводят в среде RPMI 1640 (содержащей Glutamax, 15% HI фетальной сыворотки теленка, 1% пенициллин-стрептомицин; все реактивы от фирмы GIBCO) и переносят в круглодонные 96-луночные планшеты (итоговая концентрация в диапазоне от 0,2 пг/мл до 10 мкг/мл). По 20000 клеток L363 на лунку и анти-PGLALA-CAR-J эффекторные клетки вносят для итогового получения соотношения эффектора (анти-PGLALA-CAR-J) к мишени (L363), равного 5:1, и итогового объема 200 мкг/лунку. Клетки инкубируют в течение примерно 16 ч при 37°С в инкубаторе с увлажнением. К концу инкубации переносят по 100 мкл супернатанта в лунки белого плоскодонного 96-луночного планшета (фирма Costar) и инкубируют с другим 100 мкл/лунку субстратом люциферазы ONE-Glo (фирма Promega) в течение 5 мин перед прочтением показателей люминесценции, используя ридер PerkinElmer Envision. Данные строк наносят на график в виде относительных сигналов люминесценции (relative luminescence signals, RLU) против концентрации IgG с использованием программы GraphPad Prism, a EC₅₀ рассчитывают с использованием программного обеспечения XL-fit.

Как показано на фиг. 15А-Б и в табл. 13, все оцениваемые IgG к GPRC5D индуцируют активацию CAR-J при одновременном связывании с клетками-мишенями, экспрессирующими GPRC5D, и анти-PGLALA-CAR-J клетками. Для обоих анти-GPRC5D связующих, 5F11 и 5Е11, гуманизированные варианты могут быть идентифицированы с аналогичными или даже улучшенными значениями ЕС₅₀ по сравнению с исходными антителами, не подвергшимися гуманизированию. Для связующего 5F11 самая сильная активация могла быть вызвана молекулой Р1АЕ5741 (фиг. 15А). Для связующего 5Е11 самая сильная активация могла быть вызвана молекулами Р1АЕ5730 и Р1АЕ5723 (фиг. 15Б).

Хотя вышеизложенное изобретение было описано подробно с помощью иллюстраций и примеров для ясности понимания, описания и примеры не следует истолковывать как ограничивающие объем настоящего изобретения. Сущность всей цитируемой патентной и научной литературы полностью включена в настоящее изобретение в виде ссылок.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Ф. ХОФФМАНН-ЛЯ РОШ АГ

<120> АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С GPRC5D

<130> P34553

<160> 97

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr Ala Met Ala

1 5 10

<210> 2

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 2

Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys Ala

1 5 10 15

<210> 3

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 3

His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 4

Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Gly Ile Asn Leu Met Asn

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 5

His Ala Ser Ile Leu Ala Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 6

Gln Gln Thr Arg Glu Ser Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 7

Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ala

1 5 10

<210> 8

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 8

Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 9

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 9

His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr

1 5

<210> 10

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 10

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr

1 5 10 15

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 11

Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 12

Gly Gln Leu Leu Glu Asn Pro Tyr Thr

1 5

<210> 13

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 13

Glu Leu Gln Leu Glu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 110

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 14

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Gly

20 25 30

Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Thr Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro

65 70 75 80

Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg Glu

85 90 95

Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 15

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Ala Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 16

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Pro Leu Ser Val Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Phe Gln Lys Pro Gly Lys Ser

35 40 45

Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr His Cys Gly Gln Leu

85 90 95

Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Glu Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 17

<211> 217

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 17

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Gly

20 25 30

Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Thr Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro

65 70 75 80

Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg Glu

85 90 95

Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu

115 120 125

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

130 135 140

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

145 150 155 160

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

180 185 190

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

195 200 205

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 18

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 18

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val

115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

195 200 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 19

<211> 447

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 19

Glu Leu Gln Leu Glu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 20

<211> 672

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 20

Glu Leu Gln Leu Glu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly

210 215 220

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser

225 230 235 240

Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser

245 250 255

Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys

260 265 270

Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala

275 280 285

Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala

290 295 300

Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr

305 310 315 320

Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys

325 330 335

Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

340 345 350

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

355 360 365

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

370 375 380

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

385 390 395 400

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

405 410 415

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

420 425 430

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

435 440 445

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

450 455 460

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

465 470 475 480

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

485 490 495

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

500 505 510

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

515 520 525

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

530 535 540

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr

545 550 555 560

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

565 570 575

Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys

580 585 590

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

595 600 605

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

610 615 620

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

625 630 635 640

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

645 650 655

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

660 665 670

<210> 21

<211> 219

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 21

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Pro Leu Ser Val Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Phe Gln Lys Pro Gly Lys Ser

35 40 45

Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr His Cys Gly Gln Leu

85 90 95

Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Glu Leu Glu Leu Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg

115 120 125

Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 22

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 22

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val

115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

195 200 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 23

<211> 446

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 23

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Ala Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 24

<211> 671

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 24

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Ala Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu

225 230 235 240

Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr

245 250 255

Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro

260 265 270

Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro

275 280 285

Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala

290 295 300

Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys

305 310 315 320

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

325 330 335

Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

340 345 350

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

355 360 365

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

370 375 380

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

385 390 395 400

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

405 410 415

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

420 425 430

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

435 440 445

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

450 455 460

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

465 470 475 480

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

485 490 495

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

500 505 510

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

515 520 525

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

530 535 540

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

545 550 555 560

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

565 570 575

Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

580 585 590

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

595 600 605

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

610 615 620

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

625 630 635 640

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

645 650 655

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

660 665 670

<210> 25

<211> 216

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 25

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Val Gly Gly Asn

20 25 30

Tyr Val Phe Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Ala Thr Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Arg Ser Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ala

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Phe Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Lys Lys

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 26

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 26

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val

115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

195 200 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 27

<211> 447

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 27

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Gly Lys Ala Tyr Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 28

<211> 672

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 28

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Gly Lys Ala Tyr Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly

210 215 220

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser

225 230 235 240

Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser

245 250 255

Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys

260 265 270

Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala

275 280 285

Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala

290 295 300

Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr

305 310 315 320

Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys

325 330 335

Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

340 345 350

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

355 360 365

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

370 375 380

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

385 390 395 400

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

405 410 415

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

420 425 430

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

435 440 445

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

450 455 460

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

465 470 475 480

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

485 490 495

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

500 505 510

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

515 520 525

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

530 535 540

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr

545 550 555 560

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

565 570 575

Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys

580 585 590

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

595 600 605

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

610 615 620

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

625 630 635 640

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

645 650 655

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

660 665 670

<210> 29

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 29

Thr Tyr Ala Met Asn

1 5

<210> 30

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 30

Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 31

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 31

His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 32

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 32

Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

1 5 10

<210> 33

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 33

Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro

1 5

<210> 34

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 34

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val

1 5

<210> 35

<211> 125

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 35

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 36

<211> 109

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 36

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 37

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 37

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 38

<211> 105

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 38

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

20 25 30

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

35 40 45

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

65 70 75 80

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

85 90 95

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 39

<211> 328

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 39

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 40

<211> 207

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 40

Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser

1 5 10 15

Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr

20 25 30

Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr

35 40 45

Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys

50 55 60

Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp

65 70 75 80

His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr

85 90 95

Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu

100 105 110

Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met

115 120 125

Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu

130 135 140

Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys

145 150 155 160

Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn

165 170 175

Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg

180 185 190

Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile

195 200 205

<210> 41

<211> 198

<212> PRT

<213> Macaca fascicularis

<400> 41

Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser

1 5 10 15

Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr

20 25 30

Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr

35 40 45

Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys

50 55 60

Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu

65 70 75 80

Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro

85 90 95

Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn

100 105 110

Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp

115 120 125

Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys

130 135 140

Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly

145 150 155 160

Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn

165 170 175

Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly

180 185 190

Leu Asn Gln Arg Arg Ile

195

<210> 42

<211> 225

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 42

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro

225

<210> 43

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 43

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 44

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 44

Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 45

<211> 345

<212> PRT

<213> Homo sapiens

<400> 45

Met Tyr Lys Asp Cys Ile Glu Ser Thr Gly Asp Tyr Phe Leu Leu Cys

1 5 10 15

Asp Ala Glu Gly Pro Trp Gly Ile Ile Leu Glu Ser Leu Ala Ile Leu

20 25 30

Gly Ile Val Val Thr Ile Leu Leu Leu Leu Ala Phe Leu Phe Leu Met

35 40 45

Arg Lys Ile Gln Asp Cys Ser Gln Trp Asn Val Leu Pro Thr Gln Leu

50 55 60

Leu Phe Leu Leu Ser Val Leu Gly Leu Phe Gly Leu Ala Phe Ala Phe

65 70 75 80

Ile Ile Glu Leu Asn Gln Gln Thr Ala Pro Val Arg Tyr Phe Leu Phe

85 90 95

Gly Val Leu Phe Ala Leu Cys Phe Ser Cys Leu Leu Ala His Ala Ser

100 105 110

Asn Leu Val Lys Leu Val Arg Gly Cys Val Ser Phe Ser Trp Thr Thr

115 120 125

Ile Leu Cys Ile Ala Ile Gly Cys Ser Leu Leu Gln Ile Ile Ile Ala

130 135 140

Thr Glu Tyr Val Thr Leu Ile Met Thr Arg Gly Met Met Phe Val Asn

145 150 155 160

Met Thr Pro Cys Gln Leu Asn Val Asp Phe Val Val Leu Leu Val Tyr

165 170 175

Val Leu Phe Leu Met Ala Leu Thr Phe Phe Val Ser Lys Ala Thr Phe

180 185 190

Cys Gly Pro Cys Glu Asn Trp Lys Gln His Gly Arg Leu Ile Phe Ile

195 200 205

Thr Val Leu Phe Ser Ile Ile Ile Trp Val Val Trp Ile Ser Met Leu

210 215 220

Leu Arg Gly Asn Pro Gln Phe Gln Arg Gln Pro Gln Trp Asp Asp Pro

225 230 235 240

Val Val Cys Ile Ala Leu Val Thr Asn Ala Trp Val Phe Leu Leu Leu

245 250 255

Tyr Ile Val Pro Glu Leu Cys Ile Leu Tyr Arg Ser Cys Arg Gln Glu

260 265 270

Cys Pro Leu Gln Gly Asn Ala Cys Pro Val Thr Ala Tyr Gln His Ser

275 280 285

Phe Gln Val Glu Asn Gln Glu Leu Ser Arg Ala Arg Asp Ser Asp Gly

290 295 300

Ala Glu Glu Asp Val Ala Leu Thr Ser Tyr Gly Thr Pro Ile Gln Pro

305 310 315 320

Gln Thr Val Asp Pro Thr Gln Glu Cys Phe Ile Pro Gln Ala Lys Leu

325 330 335

Ser Pro Gln Gln Asp Ala Gly Gly Val

340 345

<210> 46

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 46

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 47

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 47

Glu Leu Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 48

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 48

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 49

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 49

Glu Leu Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 50

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 50

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser

20 25 30

Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 51

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 51

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser

20 25 30

Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 52

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 52

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser

20 25 30

Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 53

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 53

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser

20 25 30

Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 54

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 54

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser

20 25 30

Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gln Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 55

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 55

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser

20 25 30

Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 56

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 56

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 57

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 57

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 58

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 58

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 59

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 59

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 60

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 60

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 61

<211> 116

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 61

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 62

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 62

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr His Cys Gly Gln Leu

85 90 95

Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 63

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 63

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ser

35 40 45

Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr His Cys Gly Gln Leu

85 90 95

Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 64

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 64

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr His Cys Gly Gln Leu

85 90 95

Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 65

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 65

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr His Cys Gly Gln Leu

85 90 95

Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 66

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 66

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr His Cys Gly Gln Leu

85 90 95

Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 67

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 67

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro His Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Asn Met Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Glu Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Lys Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 68

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 68

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val

115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

195 200 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 69

<211> 452

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 69

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Phe

20 25 30

Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Asn Thr Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Thr Arg Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Glu Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Leu Thr Tyr Tyr Gly Arg Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 70

<211> 677

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 70

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Phe

20 25 30

Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Asn Thr Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Thr Arg Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Glu Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Leu Thr Tyr Tyr Gly Arg Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val

225 230 235 240

Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu

245 250 255

Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

260 265 270

Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly

275 280 285

Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu

290 295 300

Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp

305 310 315 320

Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe

325 330 335

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

340 345 350

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

355 360 365

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

370 375 380

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

385 390 395 400

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

405 410 415

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

420 425 430

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

435 440 445

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

450 455 460

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

465 470 475 480

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

485 490 495

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

500 505 510

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

515 520 525

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

530 535 540

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala

545 550 555 560

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

565 570 575

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

580 585 590

Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

595 600 605

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

610 615 620

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

625 630 635 640

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

645 650 655

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

660 665 670

Leu Ser Pro Gly Lys

675

<210> 71

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 71

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Tyr Asn Leu Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Asn Cys Lys Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Asn Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 72

<211> 454

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 72

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser His

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr

20 25 30

Gly Met Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala Ser Ile Trp Trp Asn Gly Asn Thr Tyr Asn Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Val Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Ala

65 70 75 80

Phe Leu Lys Val Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Val His Thr Arg Gly Ile Ile Arg Gly Arg Gly Leu Phe Phe Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly

325 330 335

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 73

<211> 441

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 73

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala

100 105 110

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

115 120 125

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

130 135 140

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

145 150 155 160

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

180 185 190

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

195 200 205

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

210 215 220

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

225 230 235 240

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

245 250 255

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

260 265 270

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

275 280 285

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

290 295 300

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

305 310 315 320

Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

325 330 335

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu

340 345 350

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

355 360 365

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

370 375 380

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

385 390 395 400

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

405 410 415

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

420 425 430

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 74

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 74

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val

115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

195 200 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 75

<211> 448

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 75

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Ser Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Ala Leu Arg Val Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys

355 360 365

Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 76

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 76

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Ala Thr His

20 25 30

Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 77

<211> 445

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 77

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Ala Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Trp Pro Met Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 78

<211> 215

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 78

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ala Tyr

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Arg Trp Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 79

<211> 670

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 79

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Ala Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Trp Pro Met Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser

210 215 220

Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr

225 230 235 240

Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly

245 250 255

Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly

260 265 270

Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly

275 280 285

Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu

290 295 300

Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala

305 310 315 320

Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

325 330 335

Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

340 345 350

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

355 360 365

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

370 375 380

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

385 390 395 400

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

405 410 415

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

420 425 430

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

435 440 445

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe

450 455 460

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

465 470 475 480

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

485 490 495

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

500 505 510

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

515 520 525

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

530 535 540

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

545 550 555 560

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

565 570 575

Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val

580 585 590

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

595 600 605

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

610 615 620

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

625 630 635 640

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

645 650 655

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

660 665 670

<210> 80

<211> 232

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 80

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val

115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

195 200 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 81

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 81

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro His Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Asn Met Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Glu Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Lys Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 82

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 82

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Phe

20 25 30

Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Asn Thr Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Thr Arg Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Glu Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Leu Thr Tyr Tyr Gly Arg Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 83

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 83

Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr Ala Met Ala

1 5 10

<210> 84

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 84

Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Ala

<210> 85

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 85

Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 86

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 86

His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 87

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 87

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Gly Ile Asn Leu Met Asn

1 5 10 15

<210> 88

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 88

His Ala Ser Ile Leu Ala Ser

1 5

<210> 89

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 89

Gln Gln Thr Arg Glu Ser Pro Leu Thr

1 5

<210> 90

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 90

Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ala

1 5 10

<210> 91

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 91

Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 92

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 92

Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 93

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 93

His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr

1 5

<210> 94

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 94

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr

1 5 10 15

<210> 95

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 95

Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 96

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 96

Arg Met Ser Asn Arg Ala Ser

1 5

<210> 97

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Synthetic Construct

<400> 97

Gly Gln Leu Leu Glu Asn Pro Tyr Thr

1 5

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к антителу или его антигенсвязывающему фрагменту, которые связываются с GPRC5D, содержащей его композиции и способу получения, а также к кодирующему его выделенному полинуклеотиду, вектору и клетке, содержащим вышеуказанный полинуклеотид. Также раскрыты биспецифическая антигенсвязывающая молекула, которая специфически связывается с GPRC5D и CD3, содержащая его композиция и способ получения, а также кодирующий ее выделенный полинуклеотид, вектор и клетка, содержащие вышеуказанный полинуклеотид. Изобретение эффективно для лечения множественной миеломы. 15 н. и 22 з.п. ф-лы, 15 ил., 13 табл., 12 пр.

1. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые связываются с G-белковым рецептором класса С представителем 5 группы D (GPRC5D) и включают:

(i) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 с последовательностью SEQ ID NO: 83, HCDR 2 с последовательностью SEQ ID NO: 84 и HCDR 3 с последовательностью SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 с последовательностью SEQ ID NO: 87, LCDR 2 с последовательностью SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 с последовательностью SEQ ID NO: 89,

(ii) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 с последовательностью SEQ ID NO: 83, HCDR 2 с последовательностью SEQ ID NO: 85 и HCDR 3 с последовательностью SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 с последовательностью SEQ ID NO: 87, LCDR 2 с последовательностью SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 с последовательностью SEQ ID NO: 89,

(iii) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 с последовательностью SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с последовательностью SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 с последовательностью SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 с последовательностью SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с последовательностью SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 с последовательностью SEQ ID NO: 97,

(iv) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 с последовательностью SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с последовательностью SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 с последовательностью SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 с последовательностью SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с последовательностью SEQ ID NO: 96 и LCDR 3 с последовательностью SEQ ID NO: 97, или

(v) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 с последовательностью SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с последовательностью SEQ ID NO: 92 и HCDR 3 с последовательностью SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 с последовательностью SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с последовательностью SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 с последовательностью SEQ ID NO: 97.

2. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1,

(i) в котором VH включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 13, и VL включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14; или

(ii) в котором VH включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 15, и VL включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16; или

(iii) в котором VH включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 48, и VL включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53; или

(iv) в котором VH включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 49, и VL включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52; или

(v) в котором VH включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 57, и VL включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 64; или

(vi) в котором VH включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 58, и VL включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 63.

3. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 1 или 2, где антитело является антителом IgG.

4. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по п. 3, где антитело является антителом IgG₁.

5. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-4, где антитело является полноразмерным антителом.

6. Антитело или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп. 1-4, где антигенсвязывающий фрагмент выбирают из группы, включающей молекулу Fv, молекулу scFv, молекулу Fab и молекулу F(ab')₂.

7. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула, которая специфически связывается с G-белковым рецептором класса С представителем 5 группы D (GPRC5D) и CD3, включающая:

(а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первым антигеном является GPRC5D и первый антигенсвязывающий фрагмент содержит:

(i) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 с последовательностью SEQ ID NO: 83, HCDR 2 с последовательностью SEQ ID NO: 84, HCDR 3 с последовательностью SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 с последовательностью SEQ ID NO: 87, LCDR 2 с последовательностью SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 с последовательностью SEQ ID NO: 89,

(ii) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 с последовательностью SEQ ID NO: 83, HCDR 2 с последовательностью SEQ ID NO: 85, HCDR 3 с последовательностью SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 с последовательностью SEQ ID NO: 87, LCDR 2 с последовательностью SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 с последовательностью SEQ ID NO: 89,

(iii) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 с последовательностью SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с последовательностью SEQ ID NO: 91, HCDR 3 с последовательностью SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 с последовательностью SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с последовательностью SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 с последовательностью SEQ ID NO: 97,

(iv) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 с последовательностью SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с последовательностью SEQ ID NO: 91, HCDR 3 с последовательностью SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 с последовательностью SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с последовательностью SEQ ID NO: 96 и LCDR 3 с последовательностью SEQ ID NO: 97, или

(v) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую область, определяющую комплементарность тяжелой цепи (HCDR) 1 с последовательностью SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с последовательностью SEQ ID NO: 92, HCDR 3 с последовательностью SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую область, определяющую комплементарность легкой цепи (LCDR) 1 с последовательностью SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с последовательностью SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 с последовательностью SEQ ID NO: 97, и

(б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается со вторым антигеном.

8. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по п. 7,

(i) в которой VH первого антигенсвязывающего фрагмента включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 13, и в которой VL первого антигенсвязывающего фрагмента включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14; или

(ii) в которой VH первого антигенсвязывающего фрагмента включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 15, и в которой VL первого антигенсвязывающего фрагмента включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16; или

(iii) в которой VH первого антигенсвязывающего фрагмента включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 48, и в которой VL первого антигенсвязывающего фрагмента включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53; или

(iv) в которой VH первого антигенсвязывающего фрагмента включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 49, и в которой VL первого антигенсвязывающего фрагмента включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52; или

(v) в которой VH первого антигенсвязывающего фрагмента включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 57, и в которой VL первого антигенсвязывающего фрагмента включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 64; или

(vi) в которой VH первого антигенсвязывающего фрагмента включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 58, и в которой VL первого антигенсвязывающего фрагмента включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 63.

9. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по п. 7 или 8, в которой вторым антигеном является CD3.

10. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по п. 9, в которой вторым антигеном является CD3ε.

11. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по п. 9 или 10, в которой второй антигенсвязывающий фрагмент включает область VH, содержащую HCDR 1 с последовательностью SEQ ID NO: 29, HCDR 2 с последовательностью SEQ ID NO: 30, HCDR 3 с последовательностью SEQ ID NO: 31, а также область VL, содержащую LCDR 1 с последовательностью SEQ ID NO: 32, LCDR 2 с последовательностью SEQ ID NO: 33 и LCDR 3 с последовательностью SEQ ID NO: 34.

12. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по п. 11, в которой VH второго антигенсвязывающего фрагмента включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35, и в которой VL второго антигенсвязывающего фрагмента включает аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере примерно на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентична последовательности SEQ ID NO: 36.

13. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 7-12, в которой первым и/или вторым антигенсвязывающим фрагментом является молекула Fab.

14. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 7-13, в которой вторым антигенсвязывающим фрагментом является молекула Fab, причем вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1, в частности вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab, заменены друг на друга.

15. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 7-14, в которой первым антигенсвязывающим фрагментом является молекула Fab, причем в константном домене аминокислота в положении 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) - нумерация по Kabat и аминокислота в положении 123 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) - нумерация по Kabat и в константном домене СН1 аминокислота в положении 147 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) - нумерация по Kabat EU индексу и аминокислота в положении 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) - нумерация по Kabat EU индексу.

16. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 7-15, в которой первый и второй антигенсвязывающие фрагменты слиты друг с другом, необязательно через пептидный линкер.

17. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 7-16, в которой каждый первый и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab и в которой или (i) второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента или (ii) первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента.

18. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 7-17, содержащая домен Fc, состоящий из первой и второй субъединицы.

19. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по п. 18, в которой каждый первый и второй антигенсвязывающий фрагмент является молекулой Fab и в которой или (i) второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента и первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой субъединицы домена Fc или (ii) первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента и второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой субъединицы домена Fc.

20. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по п. 18 или 19, в которой домен Fc является доменом Fc IgG.

21. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по п. 20, в которой домен Fc является доменом Fc IgG₁.

22. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 18-21, в которой домен Fc является доменом Fc человека.

23. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 18-22, в которой аминокислотный остаток в домене СН3 первой субъединицы домена Fc замещен аминокислотным остатком, имеющим больший объем боковой цепи, тем самым образуя выступ в домене СН3 первой субъединицы, которая может располагаться во впадине в домене СН3 второй субъединицы, и аминокислотный остаток в домене СН3 второй субъединицы домена Fc замещен аминокислотным остатком, имеющим меньший объем боковой цепи, тем самым образуя впадину в домене СН3 второй субъединицы, внутри которой может расположиться выступ домена СН3 первой субъединицы.

24. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 18-23, в которой домен Fc содержит одну или несколько аминокислотных замен, которые снижают связывание с рецептором Fc и/или эффекторную функцию.

25. Выделенный полинуклеотид, кодирующий антитело по любому из пп. 1-6.

26. Выделенный полинуклеотид, кодирующий биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по любому из пп. 7-24.

27. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п. 25.

28. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п. 26.

29. Клетка-хозяин, предназначенная для получения антитела по любому из пп. 1-6, содержащая вектор по п. 27.

30. Клетка-хозяин, предназначенная для получения биспецифической антигенсвязывающей молекулы по любому из пп. 7-24, содержащая вектор по п. 28.

31. Способ получения антитела, которое связывается с GPRC5D по любому из пп. 1-6, включающий стадии а) культивирования клеток-хозяев по п. 29 в условиях, обеспечивающих экспрессию антитела, и б) выделение антитела.

32. Фармацевтическая композиция для лечения аутоиммунного заболевания, включающая антитело по любому из пп. 1-6 или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по любому из пп. 7-24 и фармацевтически приемлемый носитель.

33. Применение антитела по любому из пп. 1-6 для лечения множественной миеломы.

34. Применение биспецифической антигенсвязывающей молекулы по любому из пп. 7-24 для лечения множественной миеломы.

35. Применение антитела по любому из пп. 1-6 для получения лекарственного средства для лечения множественной миеломы.

36. Применение биспецифической антигенсвязывающей молекулы по любому из пп. 7-24 для получения лекарственного средства для лечения множественной миеломы.

37. Способ лечения множественной миеломы у индивидуума, включающий введение указанному индивидууму терапевтически эффективного количества фармацевтической композиции по п. 32.