АНТИТЕЛА, СВЯЗЫВАЮЩИЕСЯ С GPRC5D Российский патент 2025 года по МПК C07K16/28 A61K39/395 A61P31/00 

Область техники изобретения

Настоящее изобретение в целом относится к антителам, которые связываются с GPRC5D, включая биспецифические антигенсвязывающие молекулы, например, для активации Т-клеток. Кроме того, настоящее изобретение относится к полинуклеотидам, кодирующим такие антитела, и к векторам и клеткам-хозяевам, содержащим такие полинуклеотиды. Изобретение дополнительно относится к способам получения антител и к способам их применения в лечении заболевания.

Уровень техники

Поражая ~75000 новых пациентов каждый год в ЕС и США, множественная миелома (ММ) является одним из наиболее распространенных гематологических злокачественных образований, что остается острой неудовлетворенной медицинской потребностью. Множественная миелома характеризуется терминально дифференцированными плазматическими клетками, которые секретируют нефункциональные моноклональные иммуноглобулины. В краткосрочной перспективе иммуномодулирующие лекарственные средства, такие как леналидомид и помалидомид, и ингибиторы протеасом, такие как карфилзомиб и бортезомиб, могут оставаться основой терапии 1-ой линии для множественной миеломы (Moreau, P. and S.V. Rajkumar, multiple myeloma-translation of trial results into reality. Lancet, 2016. 388(10040): p. 111-3). Однако эти лекарственные средства специфически не нацелены на патологические опухолевые клетки, например, патологические плазматические клетки (ПК). Были предприняты попытки в направлении избирательного истощения плазматических клеток при множественной миеломе. Отсутствие поверхностных белков, которые бы служили специфическими маркерами плазматических клеток, тормозит разработку антител или клеточной терапии для множественной миеломы. На сегодня существует всего несколько примеров успешных биологических препаратов, включая даратумумаб (анти-CD38) и элотузумаб (анти-CD319), с оговоркой, что эти две молекулы не экспрессируются исключительно плазматическими клетками. Поэтому с помощью РНК-секвенирования были идентифицированы новые мишени из плазматических клеток множественной миеломы, такие как член D группы 5 класса С рецепторов, связанных с G-белками (GPRC5D), который дифференциально экспрессируется плазматическими клетками множественной миеломы по сравнению с плазматическими клетками от здоровых доноров. Сообщалось, что GPRC5D связан с прогнозом и опухолевой нагрузкой у пациентов с множественной миеломой (Atamaniuk, J., et al., Overexpression of G protein-coupled receptor 5D in the bone marrow is associated with poor prognosis in patients with multiple myeloma. Eur J Clin Invest, 2012. 42(9): p. 953-60; и Cohen, Y., et al., GPRC5D is a promising marker for monitoring the tumour load and to target multiple myeloma cells. Hematology, 2013. 18(6): p. 348-51).

GPRC5D представляет собой орфанный рецептор с отсутствием известных лигандов и по большей части неизвестной биологией у человека в целом и при раке в частности. Кодирующий GPRC5D ген, который картирован на хромосоме 12р13.3, содержит три экзона и занимает около 9,6 т.о. (Brauner-Osborne, Н., et al., Cloning and characterization of a human orphan family С G-protein coupled receptor GPRC5D. Biochim Biophys Acta, 2001. 1518(3): p. 237-48). Большой первый экзон кодирует семиспиральный трансмембранный домен. Было показано, что GPRC5D участвует в образовании кератина в волосяных фолликулах у животных (Gao, Y., et al., Comparative Transcriptome Analysis of Fetal Skin Reveals Key Genes Related to Hair Follicle Morphogenesis in Cashmere Goats. PLoS One, 2016. 11(3): p. e0151118; и Inoue, S., T. Nambu, and T. Shimomura, The RAIG family member, GPRC5D, is associated with hard-keratinized structures. J Invest Dermatol, 2004. 122(3): p. 565-73).

В WO 2018/017786 A2 описаны GPRC5D-специфические антитела или антигенсвязывающие фрагменты.

С учетом того, что все стандартные варианты лечения не способны излечивать пациентов со множественной миеломой, существует очевидная потребность в разработке новой активной и специфической терапии. Один из таких подходов включает антитела, которые связывают GPRC5D, в частности биспецифические антитела, которые связывают GPRC5D на клетках-мишенях и активирующий Т-клеточный антиген, такой как CD3, на Т-клетках. После одновременного связывания такого антитела с обеими его мишенями будет образовываться Т-клеточный синапс, приводя к активации (цитотоксической) Т-клетки и последующему лизису клетки-мишени.

В настоящем изобретении предложены новые антитела, в том числе биспецифические антитела, которые специфически связывают GPRC5D человека. В частности, Т-клеточные биспецифические антитела в соответствии с изобретением, нацеленные на GPRC5D, потенциально могут лечить множественную миелому.

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения разработали биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые связываются с GPRC5D и активирующим Т-клеточным антигеном, содержащим новое антитело к GPRC5D.

В первом аспекте в настоящем изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая

(а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент содержит (i) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 83, HCDR 2 с SEQ ID NO: 84 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 87, LCDR 2 с SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 89; (ii) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 83, HCDR 2 с SEQ ID NO: 85 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 87, LCDR 2 с SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 89; (iii) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97; (iv) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 96 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97; или (v) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 92 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97; и (б) а второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент содержит (i) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 29, HCDR 2 с SEQ ID NO: 30 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 31, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 32, LCDR 2 с SEQ ID NO: 33 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 34; (i) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; or (ii) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 106, HCDR 2 с SEQ ID NO: 107 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 108, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 109, LCDR 2 с SEQ ID NO: 110 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 111.

В другом варианте осуществления (i) VH первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 13, a VL первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14; или (ii) VH первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 15, a VL первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16; или (iii) VH первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 48, а VL первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53; или (iv) где VH первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 49, и где VL первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52; или (v) VH первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 57, a VL первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 64; или (vi) VH первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 58, а VL первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 63. В другом варианте осуществления VH второго антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, (i) которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35, VL второго антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36; (ii) которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 104, VL второго антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 105; или (iii) которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 112, VL второго антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 113.

В одном варианте осуществления первый и/или второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab. Это означает, что первый антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой молекулу Fab или второй антигенсвязывающий фрагмент может представлять собой молекулу Fab, или же первый антигенсвязывающий фрагмент и второй антигенсвязывающий фрагмент могут представлять собой молекулы Fab. В другом варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, причем вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1, в частности, вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab, замещены друг другом. В другом варианте осуществления первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, причем в константном домене аминокислота в позиции 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене СН1 аминокислота в позиции 147 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). В другом варианте осуществления первый и второй антигенсвязывающие фрагменты слиты друг с другом, необязательно посредством пептидного линкера. В другом варианте осуществления каждый из первого и второго антигенсвязывающих фрагментов представляет собой молекулу Fab и в которой (i) второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента или (ii) первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента. В другом варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит третий антигенсвязывающий фрагмент. В другом варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент идентичен первому антигенсвязывающему фрагменту. В другом варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц. В другом варианте осуществления каждый из первого, второго и, в случае наличия, третьего антигенсвязывающих фрагментов представляет собой молекулу Fab; и при этом (i) второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента, а первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой субъединицы Fc-домена, или (ii) первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента, а второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой субъединицы Fc-домена; и при этом третий антигенсвязывающий фрагмент, в случае наличия, слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом второй субъединицы Fc-домена. В другом варианте осуществления Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG. В другом варианте осуществления Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG1. В другом варианте осуществления Fc-домен представляет собой Fc-домен человека. В другом варианте осуществления аминокислотный остаток в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена замещен аминокислотным остатком, имеющим больший объем боковой цепи, с созданием, таким образом, выпуклости в СН3-домене первой субъединицы, которая может располагаться в полости в СН3-домене второй субъединицы, а аминокислотный остаток в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена замещен аминокислотным остатком, имеющим меньший объем боковой цепи, с созданием, таким образом, полости в СН3-домене второй субъединицы, в которой может располагаться выпуклость в СН3-домене первой субъединицы. В другом варианте осуществления Fc-домен, содержит одну или более аминокислотных замен, которые уменьшают связывание с Fc-рецептором и/или эффекторную функцию.

В другом аспекте в изобретении предложены один или более выделенных полинуклеотидов, кодирующих биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, описанную в данном документе. В дополнительном аспекте в изобретении предложены один или более векторов, в частности экспрессионных векторов, содержащих полинуклеотид(ы), описанный(е) в данном документе. В другом аспекте в изобретении предложена клетка-хозяин, содержащая полинуклеотид(ы) или вектор(ы), описанные в данном документе.

В другом аспекте в изобретении предложен способ получения биспецифической антигенсвязывающей молекулы, которая связывается с GPRC5D, включающий этапы а) культивирования клетки-хозяина, описанной в данном документе, в условиях, подходящих для экспрессии биспецифической антигенсвязывающей молекулы, и б) необязательно, выделения биспецифической антигенсвязывающей молекулы.

В другом аспекте в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, которая связывается с GPRC5D, полученная способом по п. 21.

В другом аспекте в изобретении предложена фармацевтическая композиция, содержащая биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, описанную в данном документе, и фармацевтически приемлемый носитель.

В другом аспекте в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, описанная в данном документе, или фармацевтическая композиция, описанная в данном документе, для применения в качестве лекарственного средства.

В другом аспекте в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, описанная в данном документе, или фармацевтическая композиция, описанная в данном документе, для применения в лечении заболевания.

В другом аспекте в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула или фармацевтическая композиция, описанная в данном документе, при этом заболевание представляет собой рак или аутоиммунное заболевание.

В другом аспекте в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула или фармацевтическая композиция, описанная в данном документе, при этом заболевание представляет собой множественную миелому.

В дополнительном аспекте в изобретении предложено применение биспецифической антигенсвязывающей молекулы, описанной в данном документе, в производстве лекарственного средства для лечения заболевания.

В другом аспекте изобретение относится к способу лечения заболевания, в частности рака, конкретнее множественной миеломы, у субъекта, включающему введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, описанную в данном документе, в фармацевтически приемлемой форме. В альтернативном варианте заболевание представляет собой аутоиммунное заболевание, такое как системная красная волчанка и/или ревматоидный артрит. В любом из вышеприведенных вариантов осуществления субъект предпочтительно представляет собой млекопитающее, в частности человека.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1А-АА. Типовые конфигурации биспецифических антигенсвязывающих молекул по изобретению. (Фиг. 1А, Фиг. 2Г) Иллюстрация молекулы «1+1 CrossMab». (Фиг. 1Б, Фиг. 1Д) Иллюстрация молекулы «2+1 IgG Crossfab» с альтернативным порядком компонентов Crossfab и Fab («инвертированная молекула»). (Фиг. 1В, Фиг. 1Е) Иллюстрация молекулы «2+1 IgG Crossfab». (Фиг. 1Ж, Фиг. 1М) Иллюстрация молекулы «1+1 IgG Crossfab» с альтернативным порядком компонентов Crossfab и Fab («инвертированная молекула»). (Фиг. 1И, Фиг. 1Н) Иллюстрация молекулы «1+1 IgG Crossfab». (Фиг. 1К, Фиг. 1П) Иллюстрация молекулы «2+1 IgG Crossfab» с двумя CrossFab. (Фиг. 1Л, Фиг. 1Р)

Иллюстрация молекулы «2+1 IgG Crossfab» с двумя CrossFab и альтернативным порядком компонентов Crossfab и Fab («инвертированная молекула»). (Фиг. 1С, Фиг. 1X) Иллюстрация молекулы «Fab-Crossfab». (Фиг. 1Т, Фиг. 1Ц) Иллюстрация молекулы «Crossfab-Fab». (Фиг. 1У, Фиг. 1Ч) Иллюстрация молекулы «(Fab)₂-Crossfab». (Фиг. 1Ф, Фиг. 1Ш) Иллюстрация молекулы «Crossfab-(Fab)₂». (Фиг. 1Щ, Фиг. 1Я) Иллюстрация молекулы «Fab-(Crossfab)₂». (Фиг. 1Ю, Фиг. 1АА) Иллюстрация молекулы «(Crossfab)₂-Fab». Черная точка: необязательная модификация в Fc-домене, способствующая гетеродимеризации. ++, --: аминокислоты с противоположными зарядами, необязательно внесенные в домены СН1 и CL. Молекулы Crossfab на изображении содержат взаимную замену областей VH и VL, но могут - в вариантах осуществления, в которых зарядовые модификации внесены в домены СН1 и CL, в альтернативном случае содержать взаимную замену доменов СН1 и CL.

Фиг. 2. Анализ методом РНК-секвенирования генной экспрессии опухолевых мишеней на плазматических клетках и В-клетках.

Фиг. 3. Типовые конфигурации 5Е11-биспецифических антигенсвязывающих молекул по изобретению. Черная точка: необязательная модификация в Fc-домене, способствующая гетеродимеризации. ++, --: аминокислоты с противоположными зарядами, необязательно внесенные в домены СН1 и CL.

Фиг. 4А-В. Анализ связывания биспецифических антигенсвязывающих молекул 5F11-TCB (Фиг. 4А) и 5Е11-ТСВ (Фиг. 4Б) и контрольного антитела ЕТ150-5-ТСВ (Фиг. 4В) с GPRC5D-экспрессирующими линиями клеток множественной миеломы АМО-1, L636, NCI-H929, RPMI-8226, ОРМ-2 и контрольными клетками WSU-DLCL2.

Фиг. 5А-Д. Анализ опосредованной GPRC5D-TCB Т-клеточной цитотоксичности в линиях клеток множественной миеломы АМО-1 (Фиг. 5А), NCI-H929 (Фиг. 5Б), RPMI-8226 (Фиг. 5В) и L363 (Фиг. 5Г). Контрольной линией клеток является WSU-DL CL2 (Фиг. 5Д). Исследуемые молекулы: 5Е11-ТСВ, 5F11-TCB. Контрольные молекулы: DP47-TCB (не мишень) и ЕТ150-5-ТСВ.

Фиг. 6. Анализ активированного GPRC5D-TCB привлечения Т-клеток с линиями клеток множественной миеломы NCI-H929 и отрицательной контрольной линией клеток WSU-DLCL2 с повышенной регуляцией CD25 и CD69.

Фиг. 7А-Л. Активация Т-клеток, определяемая по повышению регуляции CD25 на CD8+Т-клетках, после инкубации Т-клеток с возрастающими концентрациями GPRC5D-TCB или отрицательного контроля DP47-TCB в присутствии АМО-1 (Фиг. 7A), NCI-H929 (Фиг. 7Б), RPMI-8226 (Фиг. 7В), L363 (Фиг. 7Г) и WSU-DLCL2 (Фиг. 7Д); и определяемая по повышению регуляции CD69 на CD8+ Т-клетках, после инкубации Т-клеток с возрастающими концентрациями GPRC5D-TCB или отрицательного контроля DP47-ТСВ в присутствии АМО-1 (Фиг. 7Е), NCI-H929 (Фиг. 7Ж), RPMI-8226 (Фиг. 7И), L363 (Фиг. 7К) и WSU-DLCL2 (Фиг. 7Л).

Фиг. 8А-Б. Визуализация локализации и интернализации антител с помощью флуоресцентной конфокальной микроскопии (Фиг. 8А) и анализ интенсивности сигналов мембраны и цитоплазмы (Фиг. 8Б).

Фиг. 9. Связывание разных антител к GPRC5D с GPRC5D человека, яванского макака и мыши оценивали методом ELISA, используя стабильно трансфицированные клоны СНО, экспрессирующие GPRC5D человека (клон 12) или GPRC5D яванского макака (клон 13), GPRC5D мыши (клон 4) или GPRC5A человека (клон 30).

Фиг. 10А-Ж. Опосредованный Т-клетками лизис различных линий клеток множественной миеломы (ММ), индуцированный разными нацеленными на GPRC5D или ВСМА Т-клеточными биспецифическими молекулами в течение 20 часов совместной инкубации (Э:М=10:1, пан-Т-клетки человека). Изображены два повтора с СО.

Фиг.11А-Е. Активация Т-клеток, индуцированная разными нацеленными на GPRC5D или ВСМА Т-клеточными биспецифическими молекулами (5Е11-ТСВ на Фиг. 11А; 5F11-TCB на Фиг. 11Б; 10В10-ТСВ на Фиг. 11В; ВСМА-ТСВ на Фиг. 11Г; В72-ТСВ на Фиг. 11Д; DP47-TCB на Фиг. 11Е) в течение ~20 часов совместной инкубации аллогенных пан-Т-клеток человека и необработанных клеток костного мозга от здоровых доноров (Э:М=10:1, пан-Т-клетки человека). Изображены точечные диаграммы FACS от одного репрезентативного донора, демонстрирующие повышение регуляции маркера активации CD69 на CD4 (верхний ряд) или CD8 Т-клетках (нижний ряд) в виде процента положительных клеток среди всех CD4 соответствующих CD8 Т-клеток.

Фиг. 12А-Б. Активация Т-клеток, индуцированная разными нацеленными на GPRC5D или ВСМА Т-клеточными биспецифическими молекулами в течение ~20 часов совместной инкубации аллогенных пан-Т-клеток человека и необработанных клеток костного мозга от здоровых доноров (Э:М=10:1, пан-Т-клетки человека). Приведены обобщенные данные по всем четырем оцененным донорам, демонстрирующие повышение регуляции маркера активации CD69 на CD8 Т-клетках при выбранной фиксированной дозе 50 нМ ТСВ (Фиг. 12А) или 5 нМ (Фиг. 12Б).

Фиг. 13А-Г. In vivo эффективность, индуцированная разными нацеленными на GPRC5D Т-клеточными биспецифическими молекулами (5F11-TCB на Фиг. 13А; ВСМА-ТСВ на Фиг. 13Б; В72-ТСВ на Фиг. 13В; носитель на Фиг. 13Г), проиллюстрированная кинетикой роста опухолей со временем в модели с гуманизированными мышами NSG с привитыми опухолевыми клетками NCI-H929. Изображены паутинные диаграммы, на которых каждая линия относится к отдельной мыши.

Фиг. 14А-Г. In vivo эффективность, индуцированная разными нацеленными на GPRC5D Т-клеточными биспецифическими молекулами (5F11-TCB на Фиг. 14А; 5Е11-ТСВ на Фиг. 14Б; В72-ТСВ на Фиг. 14В; носитель на Фиг. 14Г), проиллюстрированная кинетикой роста опухолей со временем в модели с гуманизированными мышами NSG с привитыми опухолевыми клетками ОРМ-2. Изображены паутинные диаграммы, на которых каждая линия относится к отдельной мыши.

Фиг. 15А-Б. Активация PGLALA-CAR-J примерно через 16 часов инкубации, определенная по люминесценции. Индукция происходила после одновременного связывания GPRC5D IgG (5F11-IgG на Фиг. 15А; 5E11-IgG на Фиг. 15Б) с GPRC5D-экспрессирующей линией клеток множественной миеломы L-363 и PGLALA-модифицированного Fc-домена с репортерными клетками Jurkat-NFAT, которые были генетически сконструированы, чтобы экспрессировать TCR, направленный против мутации PGLALA, в Fc-части этих молекул IgG. Изображены два повтора с СО.

Фиг. 16А-Г. Связывание гуманизированных молекул ТСВ в сравнении с родительскими ТСВ с человеческим GPRC5D на клетках NCI-H929 (Фиг. 16А и 16Б) и человеческим CD3 на клетках Jurkat (Фиг. 16В и 16Г), экспрессируемыми на клетках.

Фиг. 17А-Ж. Анализ активации Jurkat-NFAT в присутствии разных биспецифических молекул ТСВ GPRC5DxCD3 (Фиг. 17А-Ж) в сравнении с ненацеленными контрольными ТСВ, как указано.

Фиг. 18А-Г. Анализ лизиса опухолевых клеток со сравнением представленных в данном документе молекул GPRC5D-TCB и молекул, известных в данной области техники как нацеленные на GPRC5D или ВСМА, с ненацеленной референсной молекулой ТСВ.

Фиг. 19. Активация аутологичных Т-клеток после инкубации образца первичной ММ с разными CD3-привлекающими биспецифическими молекулами. Представленные в данном документе GPRC5D-TCB сравнивали с молекулами, известными в данной области техники как нацеленные на GPRC5D или ВСМА, в сравнении с ненацеленной референсной молекулой ТСВ.

Фиг. 20А-Г. Уменьшение количества В-клеток после инкубации МКПК от здоровых доноров с разными CD3-привлекающими биспецифическими молекулами. Представленные в данном документе GPRC5D-TCB сравнивали с молекулами, известными в данной области техники как нацеленные на GPRC5D или ВСМА, в сравнении с ненацеленной референсной молекулой ТСВ. Антитела использовали в концентрациях 50 нМ (Фиг. 20А), 5 нМ (Фиг. 20Б), 0,5 нМ (Фиг. 20В) и 0,05 нМ (Фиг. 20Г).

Фиг. 21А-Б. Активация Т-клеток после инкубации образцов костного мозга от здоровых доноров с разными CD3-привлекающими биспецифическими молекулами. Представленные в данном документе GPRC5D-TCB сравнивали с молекулами, известными в данной области техники. Активацию определяли путем выявления процента CD69⁺CD8⁺ Т-клеток (Фиг. 21А) и CD69⁺CD4⁺ Т-клеток (Фиг. 21Б) и использовали среди всех CD8⁺ соответствующих CD4⁺ Т-клеток.

Фиг. 22А-Б. Высвобождение цитокинов в человеческой цельной крови от здоровых доноров (данные по TNF на Фиг. 22А; данные по IL6 на Фиг. 22Б). Сравнивали описанные в данном документе GPRC5D-TCB и положительные (Газива, Лемтрада) и отрицательные (Эрбитукс) референсные молекулы.

Фиг. 23А-Ж. In vivo эффективность разных биспецифических молекул ТСВ GPRC5DxCD3 в NCI-H929 (мыши hNSG), включая средний объем опухолей в группе лечения на протяжении курса терапии (Фиг. 23А), объем опухолей на 37 день (Фиг. 23Б) и рост опухолей, для молекул, при этом каждая линия представляет отдельную мышь (носитель: Фиг. 23В; 6623: Фиг. 23Г; 6624: Фиг. 23Д, 6625: Фиг. 23Е, 6626: Фиг. 23Ж).

Фиг. 24. In vivo SDPK у мышей hFcRn Tg и KO и данные по клиренсу указанных молекул ТСВ.

Фиг. 25А-К. Репрезентативные примеры анализа связывания биспецифической антигенсвязывающей молекулы 5Е11(6625)-ТСВ с экспрессирующими GPRC5D человека линиями клеток множественной миеломы ОРМ-2 (Фиг. 25А, Фиг. 25Г, Фиг. 25Ж), NCI-H929 (Фиг. 25Б, Фиг. 25Д, Фиг. 25И) и RPMI-8226 (Фиг. 25В, Фиг. 25Е, Фиг. 25К). Число сайтов связывания антитела (ССА) GPRC5D на линию клеток приведено в скобках и было определено ранее с помощью QSC (Quantum Simply Cellular, BangsLabs). Приведены относительные медианные значения флуоресценции (МИФ) по трем повторам с СО. Значения ЕС50 для связывания были рассчитаны с помощью GraphPadPrism и приведены в таблице 14.2.

Подробное описание сущности изобретения

Определения

В данном документе термины используются так, как это общепринято в данной области техники, если ниже не приведено иное определение.

В контексте данного документа термин «антигенсвязывающая молекула» относится в самом широком смысле к молекуле, которая специфически связывает антигенную детерминанту. Примерами антигенсвязывающих молекул являются иммуноглобулины и их производные, например, фрагменты.

Термин «биспецифический» означает, что антигенсвязывающая молекула способна к специфическому связыванию с по меньшей мере двумя разными антигенными детерминантами. Как правило, биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит два антигенсвязывающих сайта, каждый из которых является специфическим в отношении отличной антигенной детерминанты. В определенных вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула способна одновременно связывать две антигенные детерминанты, в частности, две антигенные детерминанты, экспрессируемые на двух разных клетках.

В контексте данного документа термин «валентный» обозначает наличие определенного числа антигенсвязывающих сайтов в антигенсвязывающей молекуле. Следовательно, термин «одновалентное связывание с антигеном» обозначает наличие одного (и не более одного) антигенсвязывающего сайта, специфического в отношении антигена, в антигенсвязывающей молекуле.

«Антигенсвязывающий сайт» относится к сайту, т.е. одному или более аминокислотным остаткам антигенсвязывающей молекулы, который обеспечивает взаимодействие с антигеном. Например, антигенсвязывающий сайт антитела содержит аминокислотные остатки из определяющих комплементарность областей (CDR). Нативная молекула иммуноглобулина, как правило, имеет два антигенсвязывающих сайта; молекула Fab, как правило, имеет один антигенсвязывающий сайт.

В контексте данного документа термин «антигенсвязывающий фрагмент» относится к молекуле, которая специфически связывается с антигенной детерминантой. В одном варианте осуществления антигенсвязывающий фрагмент способен направлять соединение, к которому он присоединен (например, второй антигенсвязывающий фрагмент) к целевому сайту, например, к конкретному типу опухолевой клетки, несущей антигенную детерминанту. В другом варианте осуществления антигенсвязывающий фрагмент способен активировать сигнализацию через целевой антиген, например, антиген комплекса Т-клеточного рецептора. Антигенсвязывающие фрагменты включают антитела и их фрагменты, которые дополнительно определены в данном документе. Конкретные антигенсвязывающие фрагменты включают антигенсвязывающий домен антитела, содержащий вариабельную область тяжелой цепи антитела и вариабельную область легкой цепи антитела. В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающие фрагменты могут содержать константные области антитела, как дополнительно определено в данном документе и известно в данной области техники. Применимые константные области тяжелой цепи имеют любой из пяти изотипов: α, δ, ε, γ или μ. Применимые константные области легкой цепи имеют любой из двух изотипов: κ и λ.

В контексте данного документа термин «антигенная детерминанта» является синонимом с терминами «антиген» и «эпитоп» и относится к сайту (например, непрерывному участку из аминокислот или конформационной конфигурации, состоящей из разных областей из не являющихся непрерывными аминокислот) на полипептидной макромолекуле, с которым связывается антигенсвязывающий фрагмент с образованием комплекса антигенсвязывающий фрагмент антиген. Применимые антигенные детерминанты можно обнаружить, например, на поверхностях опухолевых клеток, на поверхностях инфицированных вирусом клеток, на поверхностях пораженных заболеванием клеток, на поверхности иммунных клеток, в свободном виде в сыворотке крови и/или во внеклеточном матриксе (ВКМ). Белки, называемые в контексте данного документа антигенами (например, GPRC5D, CD3), могут представлять собой любую нативную форму белков из любого источника, относящегося к позвоночным, включая млекопитающих, таких как приматы (например, люди), отличные от человека приматы (например, яванские макаки) и грызуны (например, мыши и крысы), если не указано иное. В конкретном варианте осуществления антиген представляет собой человеческий белок. Когда в данном документе упоминается конкретный белок, этот термин включает «полноразмерный» непроцессированный белок, а также любую форму белка, которая является результатом процессинга в клетке. Этот термин также охватывает варианты белка природного происхождения, например, сплайс-варианты или аллельные варианты. Примером человеческого белка, применимого в качестве антигена, является CD3, в частности, эпсилон-субъединица CD3 (смотрите UniProt № Р07766 (версия 185), NCBI RefSeq № NP 000724.1, SEQ ID NO: 40 в отношении последовательности человека; или UniProt № Q95LI5 (версия 69), NCBI GenBank № ВАВ71849.1, SEQ ID NO: 41 в отношении последовательности яванского макака [Масаса fascicularis]), или GPRC5D (смотрите UniProt № Q9NZD1 (версия 115); NCBI RefSeq № NP 061124.1, SEQ ID NO: 45 в отношении последовательности человека). В определенных вариантах осуществления антитело или биспецифическая антигенсвязывающая молекула по изобретению связывается с эпитопом CD3 или GPRC5D, который является консервативным среди антигенов CD3 или GPRC5D разных видов. В конкретных вариантах осуществления антитело или биспецифическая антигенсвязывающая молекула по изобретению связывается с человеческим GPRC5D.

Под выражением «специфическое связывание» подразумевается, что связывание является избирательным в отношении антигена и может быть отделено от нежелательных или неспецифических взаимодействий. Способность антигенсвязывающего фрагмента связываться с конкретной антигенной детерминантой можно определить с помощью ферментного иммуносорбентного анализа (ELISA) или других методик, известных специалисту в данной области техники, например, метода поверхностного плазмонного резонанса (ППР) (с анализом на приборе BIAcore) (Liljeblad et al., Glyco J 17, 323-329 (2000)), и традиционных анализов связывания (Heeley, Endocr Res 28, 217-229 (2002)). В одном варианте осуществления степень связывания антигенсвязывающего фрагмента с неродственным белком составляет менее чем около 10% связывания антигенсвязывающего фрагмента с антигеном при измерении, например, методом ППР. В определенных вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с антигеном, или антигенсвязывающая молекула, содержащая антигенсвязывающий фрагмент, имеет константу диссоциации (K_Д) ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например, 10^-8 М или менее, например, от 10^-8 М до 10^-13 М, например, от 10^-9 М до 10^-13 М).

«Аффинность» относится к силе суммарных нековалентных взаимодействий между одним связывающим сайтом молекулы (например, рецептором) и его партнером по связыванию (например, лигандом). Если не указано иное, в контексте данного документа «аффинность связывания» относится к характерной аффинности связывания, которая отображает 1:1 взаимодействие между членами пары связывания (например, антигенсвязывающим фрагментом и антигеном или рецептором и его лигандом). Аффинность молекулы X в отношении ее партнера Y в общем случае можно выразить константой диссоциации (K_Д), которая представляет собой отношение констант диссоциации и ассоциации (k_дисс. и k_асс., соответственно). Таким образом, эквивалентные аффинности могут включать разные константы скорости при условии, что отношение между константами скорости остается одинаковым. Аффинность можно измерять хорошо отработанными методами, известными в данной области техники, включая методы, описанные в данном документе. Конкретным методом для измерения аффинности является поверхностный плазмонный резонанс (ППР).

«Сниженное связывание», например, сниженное связывание с Fc-рецептором, относится к снижению аффинности для соответствующего взаимодействия по определению, например, ППР. Для ясности, этот термин также включает снижение аффинности до нуля (или ниже предела обнаружения аналитического метода), т.е. полное устранение взаимодействия. И наоборот, «повышенное связывание» относится к повышению аффинности связывания для соответствующего взаимодействия.

В контексте данного документа термин «активирующий Т-клеточный антиген» относится к антигенной детерминанте, экспрессируемой на поверхности Т-лимфоцита, в частности цитотоксического Т-лимфоцита, которая способна индуцировать активацию Т-клетки после взаимодействия с антигенсвязывающей молекулой. В частности, взаимодействие антигенсвязывающей молекулы с активирующим Т-клеточным антигеном может индуцировать активацию Т-клетки за счет инициации сигнального каскада комплекса Т-клеточного рецептора. В конкретном варианте осуществления активирующий Т-клеточный антиген представляет собой CD3, в частности, эпсилон-субъединицу CD3 (смотрите UniProt № Р07766 (версия 144), NCBI RefSeq № NP 000724.1, SEQ ID NO: 40 в отношении последовательности человека; или UniProt № Q95LI5 (версия 49), NCBI GenBank № ВАВ71849.1, SEQ ID NO: 41 в отношении последовательности яванского макака [Масаса fascicularis]).

В контексте данного документа «активация Т-клеток» относится к одному или более клеточным ответам Т-лимфоцита, в частности цитотоксического Т-лимфоцита, выбранным из: пролиферации, дифференцировки, секреции цитокинов, высвобождения цитотоксических эффекторных молекул, цитотоксической активности и экспрессии маркеров активации. Подходящие анализы для определения активации Т-клеток известны в данной области техники и описаны в данном документе.

В контексте данного документа «антиген клетки-мишени» относится к антигенной детерминанте, находящейся на поверхности клетки-мишени, например, клетки в опухоли, такой как раковая клетка или клетка опухолевой стромы. В конкретном варианте осуществления антиген клетки-мишени представляет собой GPRC5D, в частности человеческий GPRC5D в соответствии с SEQ ID NO: 45.

В контексте данного документа термины «первый», «второй» или «третий» в отношении молекул Fab и т.д. используются для удобства различения, когда присутствует более одного из каждого типа фрагментов. Использование этих терминов не подразумевает конкретные порядок или ориентацию биспецифической антигенсвязывающей молекулы, если это явно не указано.

Под «слитым» подразумевается, что компоненты (например, молекула Fab и субъединица Fc-домена) связаны пептидными связями, как напрямую, так и посредством одного или более пептидных линкеров.

«Молекула Fab» относится к белку, состоящему из VH и СН1-домена тяжелой цепи («тяжелая цепь Fab») и VL и CL-домена легкой цепи («легкая цепь Fab») иммуноглобулина.

Под «кроссоверной» молекулой Fab (также называемой «Crossfab») подразумевается молекула Fab, в которой обменены (т.е. замещены друг другом) вариабельные домены или константные домены тяжелой и легкой цепи Fab, т.е. кроссоверная молекула Fab содержит пептидную цепь, состоящую из вариабельного домена легкой цепи VL и константного домена тяжелой цепи 1 CH1 (VL-CH1, в направлении от N- к С-концу), и пептидную цепь, состоящую из вариабельного домена тяжелой цепи VH и константного домена легкой цепи CL (VH-CL, в направлении от N- к С-концу). Для ясности, в кроссоверной молекуле Fab, в которой обменены вариабельные домены легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab, пептидная цепь, содержащая константный домен тяжелой цепи 1 СН1, называется в данном документе «тяжелой цепью» (кроссоверной) молекулы Fab. В то же время, в кроссоверной молекуле Fab, в которой обменены константные домены легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab, пептидная цепь, содержащая вариабельный домен тяжелой цепи VH, называется в данном документе «тяжелой цепью» (кроссоверной) молекулы Fab.

В противоположность этому, под «стандартной» молекулой Fab подразумевается, что молекула Fab имеет свой естественный формат, т.е. содержит тяжелую цепь, состоящую из вариабельных и константных доменов тяжелой цепи (VH-CH1, в направлении от N- к С-концу), и легкую цепь, состоящую из вариабельных и константных доменов легкой цепи (VL-CL, в направлении от N- к С-концу).

Термин «молекула иммуноглобулина» относится к белку, имеющему структуру антитела природного происхождения. Например, иммуноглобулины класса IgG представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины массой около 150000 Дальтон, состоящие из двух легких цепей и двух тяжелых цепей, которые связаны дисульфидными связями. В направлении от N-конца к С-концу каждая тяжелая цепь содержит вариабельный домен (VH), также называемый вариабельным доменом тяжелой цепи или вариабельной областью тяжелой цепи, за которым следуют три константных домена (CH1, СН2 и СН3), также называемых константной областью тяжелой цепи. Аналогично, в направлении от N-конца к С-концу каждая легкая цепь содержит вариабельный домен (VL), также называемый вариабельным доменом легкой цепи или вариабельной областью легкой цепи, за которым следует константный домен легкой цепи (CL), также называемый константной областью легкой цепи. Тяжелая цепь иммуноглобулина может быть отнесена к одному из пяти типов, называемых α (IgA), δ (IgD), ε (IgE), γ (IgG) или μ (IgM), некоторые из которых могут быть дополнительно поделены на подтипы, например, γ₁ (IgG₁), γ₂ (IgG₂), γ₃ (IgG₃), γ₄ (IgG₄), α₁ (IgA₁) и α₂ (IgA₂). Легкая цепь иммуноглобулина может быть отнесена к одному из двух типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основании аминокислотной последовательности ее константного домена. Иммуноглобулин состоит главным образом из двух молекул Fab и Fc-домена, связанных посредством шарнирной области иммуноглобулина.

Термин «антитело» в данном документе используется в самом широком смысле и включает различные структуры антител, включая, но не ограничиваясь этим, моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они проявляют необходимую антигенсвязывающую активность.

В контексте данного документа термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, т.е. отдельные антитела, составляющие популяцию, являются идентичными и/или связывают один и тот же эпитоп, за исключением возможных вариантных антител, например, содержащих естественные мутации или возникающих во время получения препарата моноклональных антител, причем такие варианты в общем случае присутствуют в незначительных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно содержат разные антитела, направленные против разных детерминант (эпитопов), каждое моноклональное антитело препарата моноклональных антител направлено против одной детерминанты на антигене. Таким образом, определение «моноклональный» указывает на характеристику антитела, как полученного из, по существу, гомогенной популяции антител, и его не следует интерпретировать как требование получения антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела для применения в соответствии с настоящим изобретением могут быть получены с помощью различных методик, включая, но не ограничиваясь этим, метод гибридомы, методы рекомбинантной ДНК, методы фагового дисплея и методы с использованием трансгенных животных, содержащих все или часть локусов человеческого иммуноглобулина, причем такие методы и другие типичные методы получения моноклональных антител описаны в данном документе.

«Выделенное» антитело представляет собой антитело, которое было отделено от компонента его естественного окружения, т.е. которое не находится в своей естественной среде. Никакого конкретного требования по уровню очистки нет. Например, выделенное антитело может быть удалено из его нативного или естественного окружения. Рекомбинантно полученные антитела, экспрессируемые в клетках-хозяевах, считаются выделенными в контексте данного изобретения, как и нативные или рекомбинантные антитела, которые были отделены, фракционированы или частично или полностью очищены любым подходящим методом. Следовательно, антитела и биспецифические антигенсвязывающие молекулы по настоящему изобретению являются выделенными. В некоторых вариантах осуществления антитело является очищенным до более чем 95% или 99% чистоты, по определению, например, электрофоретическими (например, ДСН-ПААГ, изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ), капиллярный электрофорез) или хроматографическими (например, ионообменная или обращенно-фазовая ВЭЖХ) методами. Обзор методов оценки чистоты антител смотрите, например, в Flatman et al., J. Chromatogr. В 848:79-87 (2007).

В контексте данного документа термины «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «цельное антитело» используются взаимозаменяемо для обозначения антитела, имеющего структуру, по существу, аналогичную структуре нативного антитела.

«Фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, которая связывает антиген, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антител включают, но не ограничиваются этим, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂, диатела, линейные антитела, молекулы одноцепочечных антител (например, scFv) и однодоменные антитела. Обзор некоторых фрагментов антител смотрите в Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Обзор фрагментов scFv смотрите, например, в Pltickthun, в The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994); также смотрите WO 93/16185; и патенты США №№5571894 и 5587458. Обсуждение фрагментов Fab и F(ab')₂, содержащих остатки эпитопа связывания рецептора реутилизации и имеющих увеличенное время полужизни in vivo, смотрите в патенте США №5869046. Диатела представляют собой фрагменты антител с двумя антигенсвязывающими сайтами, которые могут быть двухвалентными или биспецифическими. Смотрите, например, ЕР 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003); и Hollinger et al., Proc Natl Acad Sci USA 90, 6444-6448 (1993). Триатела и тетратела также описаны в Hudson et al., Nat Med 9, 129-134 (2003). Однодоменные антитела представляют собой фрагменты антител, содержащие весь или часть вариабельного домена тяжелой цепи или весь или часть вариабельного домена легкой цепи антитела. В определенных вариантах осуществления однодоменное антитело представляет собой человеческое однодоменное антитело (Domantis, Inc., Waltham, MA; смотрите, например, патент США №6248516 В1). Фрагменты антител можно получать различными способами, включая, но не ограничиваясь этим, протеолитическое расщепление интактного антитела, а также выработку рекомбинантными клетками-хозяевами (например, Е. coli или фага), как описано в данном документе.

Термин «антигенсвязывающий домен» относится к части антитела, которая содержит участок, специфически связывающийся и комплементарный с частью антигена или со всем антигеном. Антигенсвязывающий домен может быть образован, например, одним или более вариабельными доменами антитела (также называемыми вариабельными областями антитела). В частности, антигенсвязывающий домен содержит вариабельный домен легкой цепи антитела (VL) и вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH).

Термин «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепей антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL, соответственно) нативного антитела обычно имеют сходные структуры, причем каждый домен содержит четыре консервативные каркасные области (FR) и три гипервариабельные области (HVR). Смотрите, например, Kindt et al., Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., страница 91 (2007). Одного домена VH или VL может быть достаточно для придания антигенсвязывающей специфичности. В контексте данного документа в связи с последовательностями вариабельных областей «нумерация Kabat» относится к системе нумерации, описанной в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991).

В контексте данного документа аминокислотные позиции всех константных областей и доменов тяжелой и легкой цепи пронумерованы в соответствии с системой нумерации Kabat, описанной в Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991), называемой в данном документе «нумерацией в соответствии с Kabat» или «нумерацией Kabat». В частности, систему нумерации Kabat (смотрите страницы 647-660 в Kabat, et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)) используют для константного домена легкой цепи CL изотипа каппа или лямбда, а систему нумерации по индексу EU по Kabat (смотрите страницы 661-723) используют для константных доменов тяжелой цепи (СН1, шарнирная область, СН2 и СН3), что в таком случае дополнительно подчеркивается в данном документе названием «нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat».

В контексте данного документа термин «гипервариабельная область» или «HVR» относится к каждой из областей вариабельного домена антитела, которые являются гипервариабельными по последовательности («определяющие комплементарность области» или «CDR»; CDR вариабельной области/вариабельного домена тяжелой цепи сокращенно называют, например, HCDR1, HCDR2 и HCDR3; CDR вариабельной области/вариабельного домена легкой цепи сокращенно называют, например, LCDR1, LCDR2 и LCDR3), и/или образуют структурно определенные петли («гипервариабельные петли»), и/или содержат контактирующие с антигеном остатки («антигенные контакты»). В общем случае антитела содержат шесть HVR: три в VH (H1, Н2, Н3) и три в VL (L1, L2, L3). Типовые HVR по данному документу включают:

(а) гипервариабельные петли, находящиеся в аминокислотных остатках 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));

(б) CDR, находящиеся в аминокислотных остатках 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (Н3) (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));

(в) антигенные контакты, находящиеся в аминокислотных остатках 27 с 36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (Н2) и 93-101 (Н3) (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); и

(г) комбинации (а), (б) и/или (в), включая аминокислотные остатки HVR 46-56 (L2), 47-56 (L2), 48-56 (L2), 49-56 (L2), 26-35 (H1), 26-35b (H1), 49-65 (Н2), 93-102 (Н3) и 94-102 (Н3).

Если не указано иное, остатки HVR и другие остатки в вариабельном домене (например, остатки FR) нумеруются в данном документе в соответствии с Kabat et al., выше.

«Каркасная область» или «FR» относится к остаткам вариабельного домена, отличным от остатков гипервариабельной области (HVR). FR вариабельного домена обычно состоит из четырех FR-доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Соответственно, последовательности HVR и FR в общем случае расположены в VH (или VL) в следующем порядке: FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4.

«Гуманизированное» антитело относится к химерному антителу, содержащему аминокислотные остатки из нечеловеческих HVR и аминокислотные остатки из человеческих FR. В определенных вариантах осуществления гуманизированное антитело содержит практически все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все HVR (например, CDR) соответствуют таковым из нечеловеческого антитела, а все или практически все FR соответствуют таковым из человеческого антитела. Такие вариабельные домены называются в данном документе «гуманизированной вариабельной областью». Гуманизированное антитело, необязательно, может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, полученную из человеческого антитела. В некоторых вариантах осуществления некоторые остатки FR в гуманизированном антителе замещены соответствующими остатками нечеловеческого антитела (например, антитела, из которого получены остатки HVR), например, с целью восстановления или улучшения специфичности или аффинности антитела. «Гуманизированная форма» антитела, например, нечеловеческого антитела, относится к антителу, которое было подвергнуто гуманизации. Другие формы «гуманизированных антител», охватываемые настоящим изобретением, представляют собой те, в которых константная область была дополнительно модифицирована или изменена относительно исходного антитела для обеспечения свойств в соответствии с изобретением, в особенности в отношении связывания C1q и/или связывания Fc-рецептора (FcR).

«Человеческое» антитело представляет собой антитело, которое имеет аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности антитела, вырабатываемого человеком или клеткой человека, или полученную из источника, отличного от человека, в котором используются репертуары человеческих антител или другие последовательности, кодирующие человеческие антитела. Это определение человеческого антитела явным образом исключает гуманизированное антитело, содержащее нечеловеческие антигенсвязывающие остатки. В определенных вариантах осуществления человеческое антитело получено от отличного от человека трансгенного млекопитающего, например, мыши, крысы или кролика. В определенных вариантах осуществления человеческое антитело получено из линии клеток гибрид омы. Антитела или фрагменты антител, выделенные из библиотек человеческих антител, также считаются в данном документе человеческими антителами или фрагментами человеческих антител.

«Класс» антитела или иммуноглобулина относится к типу константного домена или константной области, содержащихся в его тяжелой цепи. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, а некоторые из них могут быть дополнительно разделены на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. Константные домены тяжелой цепи, соответствующие разным классам иммуноглобулинов, называются α, δ, ε, γ и μ, соответственно.

В данном документе термин «Fc-домен» или «Fc-область» используют для определения С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Этот термин включает Fc-области с нативной последовательностью и вариантные Fc-области. Хотя границы Fc-области тяжелой цепи IgG могут немного варьироваться, Fc-область тяжелой цепи IgG человека по определению обычно простирается от Cys226 или от Pro230, до его карбокси-конца тяжелой цепи. Однако антитела, вырабатываемые клетками-хозяевами, могут подвергаться посттрансляционному отщеплению одной или более, в частности одной или двух, аминокислот от С-конца тяжелой цепи. Следовательно, антитело, вырабатываемое клеткой хозяином посредством экспрессии конкретной молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей полноразмерную тяжелую цепь, может содержать полноразмерную тяжелую цепь или может содержать расщепленный вариант полноразмерной тяжелой цепи (что также называется в данном документе «тяжелой цепью с расщепленным вариантом»). Такое может происходить, когда двумя последними С-концевыми аминокислотами тяжелой цепи являются глицин (G446) и лизин (K447, нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). Следовательно, С-концевой лизин (Lys447) или С-концевые глицин (Gly446) и лизин (K447) Fc-области могут присутствовать или нет.Аминокислотные последовательности тяжелых цепей, включая Fc-домены (или субъединицу Fc-домена по определению в данном документе), обозначены в данном документе без С-концевого глицин-лизинового дипептида, если не указано иное. В одном варианте осуществления изобретения тяжелая цепь, содержащая субъединицу Fc-домена по определению в данном документе, содержащаяся в антителе или биспецифической антигенсвязывающей молекуле в соответствии с изобретением, содержит дополнительный С-концевой глицин-лизиновый дипептид (G446 и K447, нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). В одном варианте осуществления изобретения тяжелая цепь, содержащая субъединицу Fc-домена по определению в данном документе, содержащаяся в антителе или биспецифической антигенсвязывающей молекуле в соответствии с изобретением, содержит дополнительный С-концевой остаток глицина (G446, нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). Композиции по изобретению, такие как описанные в данном документе фармацевтические композиции, содержат популяцию антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул по изобретению. Популяция антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул может содержать молекулы, имеющие полноразмерную тяжелую цепь, и молекулы, имеющие расщепленный вариант тяжелой цепи. Популяция антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул может состоять из смеси молекул, имеющих полноразмерную тяжелую цепь, и молекул, имеющих расщепленный вариант тяжелой цепи, при этом по меньшей мере 50%, по меньшей мере 60%, по меньшей мере 70%, по меньшей мере 80% или по меньшей мере 90% антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул имеют расщепленный вариант тяжелой цепи. В одном варианте осуществления изобретения композиция, содержащая популяцию антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул по изобретению, содержит антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, содержащие тяжелую цепь, содержащую субъединицу Fc-домена по определению в данном документе с дополнительным С-концевым глицин-лизиновым дипептидом (G446 и K447, нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). В одном варианте осуществления изобретения композиция, содержащая популяцию антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул по изобретению, содержит антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, содержащие тяжелую цепь, содержащую субъединицу Fc-домена по определению в данном документе с дополнительным С-концевым остатком глицина (G446, нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). В одном варианте осуществления изобретения композиция содержит популяцию антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул, состоящую из молекул, содержащих тяжелую цепь, содержащую субъединицу Fc-домена по определению в данном документе; молекул, содержащих тяжелую цепь, содержащую субъединицу Fc-домена по определению в данном документе с дополнительным С-концевым остатком глицина (G446, нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и молекул, содержащих тяжелую цепь, содержащую субъединицу Fc-домена по определению в данном документе с дополнительным С-концевым глицин-лизиновым дипептидом (G446 и K447, нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). Если в данном документе не указано иное, нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или константной области соответствует системе нумерации EU, также называемой индексом EU, описанной в Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991 (смотрите также выше). В контексте данного документа «субъединица» Fc-домена относится к одному из двух полипептидов, образующих димерный Fc-домен, т.е. полипептиду, содержащему С-концевые константные области тяжелой цепи иммуноглобулина, способные к стабильной самоассоциации. Например, субъединица Fc-домена IgG содержит константные домены СН2 IgG и СН3 IgG.

«Модификация, способствующая ассоциации первой и второй субъединиц Fc-домена» представляет собой манипуляцию с пептидным остовом или посттрансляционные модификации субъединицы Fc-домена, которые снижают или предотвращают ассоциацию полипептида, содержащего субъединицу Fc домена, с идентичным полипептидом с образованием гомодимера. В контексте данного документа модификация, способствующая ассоциации, в частности, включает отдельные модификации, проведенные в каждой из субъединиц Fc-домена, ассоциация которых необходима (т.е. в первой и второй субъединицах Fc-домена), причем модификации являются комплементарными по отношению друг к другу так, чтобы способствовать ассоциации двух субъединиц Fc-домена. Например, модификация, способствующая ассоциации, может изменять структуру или заряд одной или обеих субъединиц Fc-домена так, чтобы сделать их ассоциацию стерически или электростатически выгодной, соответственно. Таким образом, (гетеро)димеризация происходит между полипептидом, содержащим первую субъединицу Fc-домена, и полипептидом, содержащим вторую субъединицу Fc-домена, которые могут быть неидентичными в том смысле, что дополнительные компоненты, слитые с каждой из субъединиц (например, антигенсвязывающие фрагменты), не являются идентичными. В некоторых вариантах осуществления модификация, способствующая ассоциации, включает аминокислотную мутацию в Fc-домене, в частности аминокислотную замену. В конкретном варианте осуществления модификация, способствующая ассоциации, включает отдельную аминокислотную мутацию, в частности аминокислотную замену, в каждой из двух субъединиц Fc-домена.

Термин «эффекторные функции» относится видам биологической активности, характерным для Fc-области антитела, которые варьируются в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антител включают: связывание C1q и комплементзависимую цитотоксичность (КЗЦ), связывание Fc-рецептора, антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (АЗКЦ), антителозависимый клеточный фагоцитоз (АЗКФ), секрецию цитокинов, опосредованное иммунным комплексом поглощение антигена антигенпрезентирующими клетками, понижающую регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора) и активацию В-клеток.

В контексте данного документа считается, что термины «конструировать, сконструированный, конструирование» включают любую манипуляцию с пептидным остовом или посттрансляционные модификации встречающегося в природе или рекомбинантного полипептида или его фрагмента. Конструирование включает модификации аминокислотной последовательности, профиля гликозилирования или групп боковых цепей отдельных аминокислот, а также комбинации этих подходов.

В контексте данного документа подразумевается, что термин «аминокислотная мутация» включает аминокислотные замены, делеции, вставки и модификации. Можно осуществлять любую комбинацию из замены, делеции, вставки и модификации, чтобы получить конечную конструкцию, при условии, что конечная конструкция обладает необходимыми характеристиками, например, уменьшенным связыванием с Fc-рецептором или повышенной ассоциацией с другим пептидом. Делеции и вставки в аминокислотной последовательности включают амино- и/или карбокси-концевые делеции и вставки аминокислот.Конкретными аминокислотными мутациями являются аминокислотные замены. В целях изменения, например, характеристик связывания Fc-области, в особенности предпочтительными являются неконсервативные аминокислотные замены, т.е. замещение одной аминокислоты другой аминокислотой, имеющей отличные структурные и/или химические свойства. Аминокислотные замены включают замещение не встречающимися в природе аминокислотами или встречающимися в природе аминокислотными производными двадцати стандартных аминокислот (например, 4-гидроксипролином, 3-метилгистидином, орнитином, гомосерином, 5-гидроксилизином). Аминокислотные мутации можно создавать, используя хорошо известные в данной области техники генетические или химические методы. Генетические методы могут включать сайт-направленный мутагенез, ПЦР, генный синтез и т.п. Подразумевается, что также могут быть применимы методы изменений групп боковых цепей аминокислот методами, отличными от генной инженерии, такими как химическая модификация. Для указания одной и той же аминокислотной мутации в данном документе можно использовать различные обозначения. Например, замена пролина в позиции 329 Fc-домена на глицин может быть обозначена как 329G, G329, G₃₂₉, P329G или Pro329Gly.

«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» относительно референсной полипептидной последовательности определяется как процентная доля аминокислотных остатков в кандидатной последовательности, которые являются идентичными с аминокислотными остатками в референсной полипептидной последовательности, после выравнивания последовательностей и внесения, в случае необходимости, гэпов для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и без учета каких-либо консервативных замен в качестве части идентичности последовательностей. Выравнивание в целях определения процента идентичности аминокислотной последовательности можно осуществлять различными способами, которые известны в данной области техники, например, используя общедоступное компьютерное программное обеспечение, такое как программное обеспечение BLAST, BLAST-2, Clustal W, Megalign (DNASTAR) или программный пакет FASTA. Специалисты в данной области техники могут определить подходящие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. При этом в контексте данного документа значения % идентичности аминокислотных последовательностей получают, используя программу ggsearch из пакета FASTA версии 36.3.8 с или более поздней с матрицей сравнения BLOSUM50. Программный пакет FASTA был создан W.R. Pearson and D.J. Lipman (1988), «Improved Tools for Biological Sequence Analysis», PNAS 85:2444-2448; W.R. Pearson (1996) «Effective protein sequence comparison)) Meth. Enzymol. 266:227-258; и Pearson et. al. (1997) Genomics 46:24-36, и находится в открытом доступе на http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml. В альтернативном варианте для сравнения последовательностей можно использовать общедоступный сервер на http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta www2/index.cgi, используя программу ggsearch (global protein:protein) и параметры по умолчанию (BLOSUM50; open: -10; ext: -2; Ktup=2) для обеспечения проведения глобального, а не местного, выравнивания. Процент идентичности аминокислот указывается в заголовке выходных данных выравнивания.

Термин «полинуклеотид» относится к выделенной молекуле или конструкции нуклеиновой кислоты, например, матричной РНК (мРНК), вирусной РНК или плазмидной ДНК (пДНК). Полинуклеотид может содержать традиционную фосфодиэфирную связь или нетрадиционную связь (например, амидную связь, такую, как встречается в пептидных нуклеиновых кислотах (ПНК)). Термин «молекула нуклеиновой кислоты» относится к любому одному или более сегментам нуклеиновой кислоты, например, фрагментам ДНК или РНК, присутствующим в полинуклеотиде.

Под «выделенными» молекулой нуклеиновой кислоты или полинуклеотидом подразумевается молекула нуклеиновой кислоты, ДНК или РНК, которая была удалена из своего нативного окружения. Например, рекомбинантный полинуклеотид, кодирующий полипептид, содержащийся в векторе, считается выделенным в контексте настоящего изобретения. Дополнительные примеры выделенного полинуклеотида включают рекомбинантные полинуклеотиды, находящиеся в гетерологичных клетках-хозяевах, или очищенные (частично или по существу) полинуклеотиды в растворе. Выделенный полинуклеотид включает молекулу полинуклеотида, содержащуюся в клетках, которые обычно содержат эту молекулу полинуклеотида, но при этом молекула полинуклеотида присутствует внехромосомно или в хромосомном положении, которое отличается от ее природного хромосомного положения. Выделенные молекулы РНК включают in vivo или in vitro РНК-транскрипты по настоящему изобретению, а также положительные и отрицательные формы цепей и двухцепочечные формы. Выделенные полинуклеотиды или нуклеиновые кислоты в соответствии с настоящим изобретением дополнительно включают подобные молекулы, полученные синтетически. Дополнительно полинуклеотид или нуклеиновая кислота могут представлять собой или включать регуляторный элемент, такой как промотор, сайт связывания рибосомы или терминатор транскрипции.

«Выделенный полинуклеотид (или нуклеиновая кислота), кодирующие [например, антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу]» относятся к одной или более полинуклеотидным молекулам, кодирующим тяжелые и легкие цепи антитела (или их фрагменты), включая такую(ие) полинуклеотидную(ые) молекулу(ы) в одном векторе или отдельных векторах и такие молекулы нуклеиновых кислот, присутствующие в одной или более локациях в клетке-хозяине.

Термин «экспрессионная кассета» относится к полинуклеотиду, созданному рекомбинантным или синтетическим способом, с рядом определенных элементов нуклеиновой кислоты, которые обеспечивают возможность транскрипции конкретной нуклеиновой кислоты в клетке-мишени. Рекомбинантная экспрессионная кассета может быть включена в плазмиду, хромосому, митохондриальную ДНК, пластидную ДНК, вирус или фрагмент нуклеиновой кислоты. Как правило, рекомбинантная экспрессионная кассета, как часть экспрессионного вектора, содержит, помимо других последовательностей, последовательность нуклеиновой кислоты, предназначенную для транскрипции, и промотор. В определенных вариантах осуществления экспрессионная кассета содержит полинуклеотидные последовательности, которые кодируют антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по изобретению или их фрагменты.

Термины «вектор» или «экспрессионный вектор» относятся к молекуле ДНК, которую используют для внесения и управления экспрессией конкретного гена, с которым она функционально связана, в клетке. Этот термин включает вектор в виде самореплицирующейся структуры нуклеиновой кислоты, а также вектор, включенный в геном клетки-хозяина, в которую его внесли. Экспрессионный вектор по настоящему изобретению содержит экспрессионную кассету. Экспрессионные векторы делают возможной транскрипцию больших количеств стабильной мРНК. После того, как экспрессионный вектор оказывается в клетке, клеточная транскрипционная и/или трансляционная машинерия вырабатывает молекулу рибонуклеиновой кислоты или белок, кодируемые геном. В одном варианте осуществления экспрессионный вектор по изобретению содержит экспрессионную кассету, которая содержит полинуклеотидные последовательности, которые кодируют антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по изобретению или их фрагменты.

Термины «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используются взаимозаменяемо и относятся к клеткам, в которые была внесена экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство таких клеток. Клетки-хозяева включают «трансформантов» и «трансформированные клетки», которые включают первично трансформированные клетки и полученное от них потомство вне зависимости от числа пассажей. Потомство может не быть полностью идентичным родительской клетке по содержанию нуклеиновой кислоты и может содержать мутации. Сюда включено мутантное потомство, которое имеет такую же функцию или биологическую активность, в отношении которой проводится скрининг или отбор изначально трансформированных клеток. Клетка-хозяин относится к любому типу клеточной системы, который можно использовать для создания антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул по настоящему изобретению. Клетки-хозяева включают культивируемые клетки, например, культивируемые клетки млекопитающих, такие как клетки HEK, клетки СНО, клетки BHK, клетки NS0, клетки SP2/0, клетки миеломы YO, клетки миеломы мышей Р3Х63, клетки PER, клетки PER.C6 или клетки гибридомы, клетки дрожжей, клетки насекомых и клетки растений, если называть только некоторые, но также клетки, присутствующие в организме трансгенного животного, трансгенного растения или культивируемой растительной или животной ткани.

«Активирующий Fc-рецептор» представляет собой Fc-рецептор, который после взаимодействия с Fc-доменом антитела вызывает события сигнализации, которые стимулируют несущую рецептор клетку осуществлять эффекторные функции. Человеческие активирующие Fc-рецепторы включают FcγRIIIa (CD16a), FcγRI (CD64), FcγRIIa (CD32) и FcαRI (CD89).

Антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность (АЗКЦ) представляет собой иммунный механизм, приводящий к лизису покрытых антителами клеток-мишеней иммунными эффекторными клетками. Клетки-мишени (целевые клетки) представляют собой клетки, с которыми специфически связываются антитела или их производные, содержащие Fc-область, обычно посредством белковой части, расположенной N-терминально к Fc-области. В контексте данного документа термин «сниженная АЗКЦ» определяется как снижение числа клеток-мишеней, лизируемых за заданное время при заданной концентрации антитела в среде, окружающей клетки-мишени, за счет механизма АЗКЦ, определенного выше, и/или как повышение концентрации антитела в среде, окружающей клетки-мишени, необходимой для обеспечения лизиса заданного числа клеток-мишеней за заданное время за счет механизма АЗКЦ. Снижение АЗКЦ определяют относительно АЗКЦ, опосредованной тем же антителом, вырабатываемым таким же типом клеток-хозяев, с использованием таких же стандартных методов получения, очистки, составления и хранения (которые известны специалистам в данной области техники), но которое не было сконструировано. Например, снижение АЗКЦ, опосредованной антителом, содержащим в Fc-домене аминокислотную замену, которая снижает АЗКЦ, определяют относительно АЗКЦ, опосредованной таким же антителом без этой аминокислотной замены в Fc-домене. Подходящие анализы для измерения АЗКЦ хорошо известны в данной области техники (смотрите, например, публикацию РСТ № WO 2006/082515 или публикацию РСТ № WO 2012/130831).

«Эффективное количество» агента относится к количеству, необходимому для физиологического изменения в клетке или ткани, в которую его вводят.

«Терапевтически эффективное количество» агента, например, фармацевтической композиции, относится к количеству, эффективному в дозировках и в течение периодов времени, необходимых для достижения необходимого терапевтического или профилактического результата. Терапевтически эффективное количество агента, например, устраняет, снижает, замедляет, минимизирует или предотвращает нежелательные явления заболевания.

«Индивид» или «субъект» представляет собой млекопитающее. Млекопитающие включают, но не ограничиваются этим, одомашненных животных (например, коров, овец, кошек, собак и лошадей), приматов (например, людей и отличных от человека приматов, таких, как обезьяны), кроликов и грызунов (например, мышей и крыс). В частности, индивид или субъект представляет собой человека.

Термин «фармацевтическая композиция» относится к препарату, который находится в форме, обеспечивающей эффективность биологической активности содержащегося в нем активного ингредиента, и который не содержит дополнительные компоненты, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому будет введена композиция.

«Фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтической композиции, отличному от активного ингредиента, который нетоксичен для субъекта. Фармацевтически приемлемый носитель включает, но не ограничивается этим, буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.

В настоящем документе термин «лечение» (и его грамматические варианты, такие как «лечить» или «лечащий») относится к клиническому вмешательству с целью изменения естественного течения заболевания у субъекта, проходящего лечение, и может проводиться как для профилактики, так и при течении клинической патологии. Необходимые эффекты лечения включают, но не ограничиваются этим, предотвращение появления или повторного появления заболевания, смягчение симптомов, уменьшение каких-либо прямых или косвенных патологических последствий заболевания, предотвращение метастазирования, снижение скорости прогрессирования заболевания, уменьшение интенсивности или временное облегчение болезненного состояния и ремиссию или улучшение прогноза. В некоторых вариантах осуществления антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по изобретению применяют для задержки развития заболевания или замедления прогрессирования заболевания.

Термин «вкладыш в упаковку» используется для обозначения инструкций, обычно включаемых в коммерческие упаковки терапевтических продуктов, которые содержат информацию о показаниях, применении, дозировке, введении, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или предостережениях относительно применения таких терапевтических продуктов.

Подробное описание вариантов осуществления

В изобретении предложены антитела и биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые связывают GPRC5D, в частности GPRC5D человека. Кроме того, молекулы имеют другие благоприятные свойства для терапевтического применения, например, в отношении эффективности и/или безопасности, а также легкости производства.

Антитело к GPRC5D

В первом аспекте в настоящем изобретении предложено антитело, которое связывается с GPRC5D, причем антитело содержит (i) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 83, HCDR 2 с SEQ ID NO: 84 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 87, LCDR 2 с SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 89; (ii) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 83, HCDR 2 с SEQ ID NO: 85 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 87, LCDR 2 с SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 89; (iii) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97; (iv) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 96 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97; или (v) вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 92 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97.

В некоторых вариантах осуществления антитело представляет собой гуманизированное антитело. В одном варианте осуществления VH представляет собой гуманизированную VH и/или VL представляет собой гуманизированную VL. В одном варианте осуществления антитело содержит CDR согласно любому из вышеприведенных вариантов осуществления и дополнительно содержит акцепторную человеческую каркасную область, например, каркасную область человеческого иммуноглобулина или человеческую консенсусную каркасную область.

В конкретном варианте осуществления (i) VH содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 13, а VL содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14; или (ii) VH содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 15, a VL содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16; или (iii) VH содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 48, a VL содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53; или (iv) VH содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 49, a VL содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52; или (v) VH содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 57, а VL содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 64; или (vi) VH содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 58, a VL содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 63.

В конкретном варианте осуществления антитело содержит (i) a VH, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 13, и VL, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 14; или (ii) VH, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15, и VL, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 16; или (iii) VH, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 48, и VL, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53; или (iv) VH, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 49, и VL, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 52; или (v) VH, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 57, и VL, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 64; или (vi) VH, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 58, и VL, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 63.

В другом варианте осуществления антитело представляет собой IgG, в частности антитело IgG1. В одном варианте осуществления антитело представляет собой полноразмерное антитело. В другом варианте осуществления антитело представляет собой фрагмент антитела, выбранный из группы из молекулы Fv, молекулы scFv, молекулы Fab и молекулы F(ab')₂. В одном варианте осуществления антитело представляет собой мультиспецифическое антитело.

В определенных вариантах осуществления последовательность VH или VL, имеющая по меньшей мере 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичности, содержит замены (например, консервативные замены), вставки или делеции по сравнению с референсной последовательностью, но антитело, содержащее эту последовательность, сохраняет способность связываться с GPRC5D. В определенных вариантах осуществления была проведена замена, вставка и/или делеция в целом от 1 до 10 аминокислот в SEQ ID NO: 13, и/или была проведена замена, вставка и/или делеция в целом от 1 до 10 аминокислот в SEQ ID NO: 14, и/или была проведена замена, вставка и/или делеция в целом от 1 до 10 аминокислот в SEQ ID NO: 15, и/или была проведена замена, вставка и/или делеция в целом от 1 до 10 аминокислот в SEQ ID NO: 16, и/или была проведена замена, вставка и/или делеция в целом от 1 до 10 аминокислот в SEQ ID NO: 48, и/или была проведена замена, вставка и/или делеция в целом от 1 до 10 аминокислот в SEQ ID NO: 53, и/или была проведена замена, вставка и/или делеция в целом от 1 до 10 аминокислот в SEQ ID NO: 49, и/или была проведена замена, вставка и/или делеция в целом от 1 до 10 аминокислот в SEQ ID NO: 52, и/или была проведена замена, вставка и/или делеция в целом от 1 до 10 аминокислот в SEQ ID NO: 57, и/или была проведена замена, вставка и/или делеция в целом от 1 до 10 аминокислот в SEQ ID NO: 64, и/или была проведена замена, вставка и/или делеция в целом от 1 до 10 аминокислот в SEQ ID NO: 58, и/или была проведена замена, вставка и/или делеция в целом от 1 до 10 аминокислот в SEQ ID NO: 63.

В определенных вариантах осуществления замены, вставки или делеции находятся в областях за пределами HVR (т.е. в FR). Необязательно, антитело содержит последовательность VH в SEQ ID NO: 13 и/или последовательность VL в SEQ ID NO: 14, включая посттрансляционные модификации этой последовательности. Необязательно, антитело содержит последовательность VH в SEQ ID NO: 15 и/или последовательность VL в SEQ ID NO: 16, включая посттрансляционные модификации этой последовательности. Необязательно, антитело содержит последовательность VH в SEQ ID NO: 448 и/или последовательность VL в SEQ ID NO: 53, включая посттрансляционные модификации этой последовательности. Необязательно, антитело содержит последовательность VH в SEQ ID NO: 49 и/или последовательность VL в SEQ ID NO: 52, включая посттрансляционные модификации этой последовательности. Необязательно, антитело содержит последовательность VH в SEQ ID NO: 57 и/или последовательность VL в SEQ ID NO: 64, включая посттрансляционные модификации этой последовательности. Необязательно, антитело содержит последовательность VH в SEQ ID NO: 58 и/или последовательность VL в SEQ ID NO: 63, включая посттрансляционные модификации этой последовательности.

В одном варианте осуществления антитело содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы из SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 15, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14.

В одном варианте осуществления антитело содержит последовательность VH, выбранную из группы из SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 12, и последовательность VL SEQ ID NO: 16.

В конкретном варианте осуществления антитело содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. В конкретном варианте осуществления антитело содержит последовательность VH SEQ ID NO: 13 и последовательность VL SEQ ID NO: 14.

В конкретном варианте осуществления антитело содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16. В конкретном варианте осуществления антитело содержит последовательность VH SEQ ID NO: 15, и последовательность VL SEQ ID NO: 16.

В конкретном варианте осуществления антитело содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53. В конкретном варианте осуществления антитело содержит последовательность VH SEQ ID NO: 48 и последовательность VL SEQ ID NO: 53.

В конкретном варианте осуществления антитело содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52. В конкретном варианте осуществления антитело содержит последовательность VH SEQ ID NO: 49 и последовательность VL SEQ ID NO: 52.

В конкретном варианте осуществления антитело содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64. В конкретном варианте осуществления антитело содержит последовательность VH SEQ ID NO: 57 и последовательность VL SEQ ID NO: 64.

В конкретном варианте осуществления антитело содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63. В конкретном варианте осуществления антитело содержит последовательность VH SEQ ID NO: 58 и последовательность VL SEQ ID NO: 63.

В одном варианте осуществления антитело содержит человеческую константную область. В одном варианте осуществления антитело представляет собой молекулу иммуноглобулина, содержащую человеческую константную область, в частности молекулу иммуноглобулина класса IgG, содержащую человеческий домен CH1, СН2, СН3 и/или CL. Типовые последовательности человеческих константных доменов приведены в SEQ ID NO: 37 и 38 (человеческие домены CL каппа и лямбда, соответственно) и SEQ ID NO: 39 (константные домены СН1-СН2-СН3 тяжелой цепи человеческого IgG1). В некоторых вариантах осуществления антитело содержит константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37 или SEQ ID NO: 39, в частности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 38. В некоторых вариантах осуществления антитело содержит константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39. В частности, константная область тяжелой цепи может содержать аминокислотные мутации в Fc-домене, как описано в данном документе.

В одном варианте осуществления антитело представляет собой моноклональное антитело.

В одном варианте осуществления антитело представляет собой IgG, в частности антитело IgG₁. В одном варианте осуществления антитело представляет собой полноразмерное антитело.

В одном варианте осуществления антитело содержит Fc-домен, в частности Fc-домен IgG, конкретнее Fc-домен IgG₁. В одном варианте осуществления Fc-домен представляет собой Fc-домен человека. Fc-домен антитела может обладать любыми характеристиками, по отдельности или в комбинации, описанными в данном документе в отношении Fc-домена биспецифической антигенсвязывающей молекулы по изобретению.

В другом варианте осуществления антитело представляет собой фрагмент антитела, выбранный из группы из молекулы Fv, молекулы scFv, молекулы Fab и молекулы F(ab')₂; в частности, молекулы Fab. В другом варианте осуществления фрагмент антитела представляет собой диатело, триатело или тетратело.

В дополнительном аспекте антитело по любому из вышеприведенных вариантов осуществления может обладать любыми характеристиками, по отдельности или в комбинации, описанными в разделах ниже.

Варианты по гликозилированию

В определенных вариантах осуществления антитело, предложенное в данном документе, изменяют с целью увеличения или уменьшения степени гликозилирования антитела. Добавление или удаление сайтов гликозилирования к антителу удобно осуществлять путем изменения аминокислотной последовательности так, чтобы создать или удалить один или более сайтов гликозилирования.

Если антитело содержит Fc-область, можно изменять присоединенный к ней олигосахарид. Нативные антитела, вырабатываемые клетками млекопитающих, обычно содержат разветвленный биантеннарный олигосахарид, который обычно присоединен посредством N-связи к Asn297 СН2-домена Fc-области. Смотрите, например, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). Олигосахарид может включать различные углеводы, например, маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc в «стволе» биантеннарной олигосахаридной структуры. В некоторых вариантах осуществления модификации олигосахарида в антителе по данному изобретению можно осуществлять с целью создания вариантов антитела с определенными улучшенными свойствами.

В одном варианте осуществления предложены варианты антител, содержащие нефукозилированный олигосахарид, т.е. олигосахаридную структуру, в которой отсутствует фукоза, присоединенная (прямо или непрямо) к Fc-области. Такой нефукозилированный олигосахарид (также называемый «афукозилированным» олигосахаридом), в частности, представляет собой N-связанный олигосахарид, в котором отсутствует остаток фукозы, присоединенный к первому GlcNAc в стволе биантеннарной олигосахаридной структуры. В одном варианте осуществления предложены варианты антител, имеющие повышенное содержание нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области по сравнению с нативным или родительским антителом. Например, относительное содержание нефукозилированных олигосахаридов может составлять по меньшей мере около 20%, по меньшей мере около 40%, по меньшей мере около 60%, по меньшей мере около 80% или даже около 100% (т.е. отсутствие фукозилированных олигосахаридов). Процент нефукозилированных олигосахаридов представляет (среднее) количество олигосахаридов, в которых отсутствуют остатки фукозы, по отношению к сумме всех олигосахаридов, присоединенных к Asn 297 (например, сложных, гибридных структур и структур с высоким содержанием маннозы), по измерению методом масс-спектрометрии ВП-МАЛДИ, например, как описано в WO 2006/082515. Asn297 относится к остатку аспарагина, расположенному приблизительно в позиции 297 в Fc-области (нумерация EU остатков Fc-области); при этом Asn297 также может быть расположен на около ±3 аминокислоты выше или ниже позиции 297, т.е. между позициями 294 и 300, вследствие незначительных вариаций последовательностей в антителах. Такие антитела, имеющие повышенное содержание нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области, могут обладать улучшенным связыванием с рецептором FcγRIIIa и/или улучшенной эффекторной функцией, в частности, улучшенной функцией АЗКЦ. Смотрите, например, US 2003/0157108; US 2004/0093621.

Примеры линий клеток, способных вырабатывать антитела со сниженным фукозилированием, включают клетки Lec13 СНО с недостаточным фукозилирования белка (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US 2003/0157108 и WO 2004/056312, особенно в примере 11) и линии клеток с нокаутом, таких как клетки СНО с нокаутом гена альфа-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8 (смотрите, например, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87: 614-622 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); и WO 2003/085107), или клетки со сниженной или устраненной активностью синтеза ГДФ-фукозы или белка-переносчика (смотрите, например, US 2004259150, US 2005031613, US 2004132140, US 2004110282).

В дополнительном варианте осуществления предложены варианты антител с раздвоенными олигосахаридами, например, в которых биантеннарный олигосахарид, присоединенный к Fc-области антитела, разделен пополам GlcNAc. Такие варианты антител могут иметь сниженный уровень фукозилирования и/или улучшенную функцию АЗКЦ, как описано выше. Примеры таких вариантов антител описаны, например, в Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006); WO 99/54342; WO 2004/065540, WO 2003/011878.

Также предложены варианты антител с по меньшей мере одним остатком галактозы в олигосахариде, присоединенным к Fc-области. Такие варианты антител могут иметь улучшенную функцию КЗЦ. Такие варианты антител описаны, например, в WO 1997/30087; WO 1998/58964 и WO 1999/22764.

Варианты антител, сконструированные с использованием цистеина

В некоторых вариантах осуществления может быть желательно создать антитела, сконструированные с использованием цистеина, например, «thioMAb,» в которых один или более остатков замещены остатками цистеина. В конкретных вариантах осуществления замещенные остатки находятся в доступных сайтах антитела. При замене этих остатков цистеином реакционноспособные тиоловые группы располагаются в доступных сайтах антитела и могут использоваться для конъюгации антитела с другими фрагментами, такими как лекарственные фрагменты или фрагменты линкер лекарственное средство, для создания иммуноконъюгата, как дополнительно описано в данном документе.-Антитела, сконструированные с использованием цистеина, можно получить, как описано, например, в патентах США №№7521541, 830930, 7855275, 9000130 или в WO 2016040856.

Производные антител

В некоторых вариантах осуществления предложенное в данном документе антитело можно дополнительно модифицировать так, чтобы оно содержало дополнительные небелковые фрагменты, известные в данной области техники и легкодоступные. Фрагменты, подходящие для дериватизации антитела, включают, но не ограничиваются этим, водорастворимые полимеры. Неограничивающие примеры водорастворимых полимеров включают, но не ограничиваются этим, полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (гомополимеры или случайные сополимеры) и декстран или поли(п-винилпирролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропропиленгликоля, сополимеры пропропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Пропиональдегид полиэтиленгликоля может иметь преимущества при производстве из-за его стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Количество полимеров, присоединенных к антителу, может варьироваться, и если присоединено более одного полимера, они могут представлять собой одинаковые или разные молекулы. В общем случае количество и/или тип полимеров, применяемых для дериватизации, можно определить на основании соображений, которые включают, но не ограничиваются этим, конкретные свойства или функции антитела, которые нужно улучшить, то, будут ли производное антитела применять в терапии в определенных условиях и т.д.

В другом варианте осуществления изобретения предложены конъюгаты антитела и небелкового фрагмента, который можно избирательно нагревать путем облучения. В одном варианте осуществления небелковый фрагмент представляет собой углеродную нанотрубку (Kam et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 102: 11600-11605 (2005)). Излучение может иметь любую длину волны и включает, но не ограничивается этим, длины волн, которые не вредят обычным клеткам, но которые нагревают небелковый фрагмент до температуры, при которой погибают клетки, расположенные вблизи конъюгата антитело небелковый фрагмент.

Иммуноконъюгаты

В изобретении также предложены иммуноконъюгаты, содержащие антитело к GPRC5D, описанное в данном документе, конъюгированное (химически связанное) с одним или более терапевтическими агентами, такими как цитотоксические агенты, химиотерапевтические агенты, лекарственные средства, ингибиторы роста, токсины (например, белковые токсины, ферментативно активные токсины бактериального, грибкового, растительного или животного происхождения или их фрагменты) или радиоактивные изотопы.

В одном варианте осуществления иммуноконъюгат представляет собой конъюгат антитело лекарственное средство (ADC), в котором антитело конъюгировано с одним или более терапевтическими агентами, упомянутыми выше. Антитело, как правило, связано с одним или более терапевтическими агентами с помощью линкеров. Обзор технологии ADC, включая примеры терапевтических агентов, лекарственных средств и линкеров, приведен в Pharmacol Review 68:3-19 (2016).

В другом варианте осуществления иммуноконъюгат содержит антитело, описанное в данном документе, конъюгированное с ферментативно активным токсином или его фрагментом, включая, но не ограничиваясь этим, цепь А дифтерийного токсина, несвязывающиеся активные фрагменты дифтерийного токсина, цепь А экзотоксина (из Pseudomonas aeruginosa), цепь А рицина, цепь А абрина, цепь А модецина, альфа-сарцин, белки Aleurites fordii, диантиновые белки, белки Phytolaca americana (PAPI, РАРП и PAP-S), ингибитор из момордики харантской, курцин, кротин, ингибитор из Saponaria officinalis, гелонин, митогеллин, рестриктоцин, феномицин, эномицин и трикотецены.

В другом варианте осуществления иммуноконъюгат содержит антитело, описанное в данном документе, конъюгированное с радиоактивным атомом с образованием радиоконъюгата. Для получения радиоконъюгатов доступен ряд радиоактивных изотопов. Примеры включают At²¹¹, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰, Re¹⁸⁶, Re¹⁸⁸, Sm¹⁵³, Bi²¹², P³², Pb²¹² и радиоактивные изотопы Lu. Если радиоконъюгат используют в целях обнаружения, он может содержать радиоактивный атом для сцинтиграфических исследований, например, tc99m или I123, или спиновую метку для ядерного магнитного резонанса (ЯМР) (также известного как магнито-резонансная томография, МРТ), такую как снова йод-123, йод-131, индий-111, фтор-19, углерод-13, азот-15, кислород-17, гадолиний, марганец или железо.

Конъюгаты антитела и цитотоксического агента можно создавать, используя ряд бифункциональных агентов, связывающих белок, таких как N-сукцинимидил-3-(2-пиридилдитио)пропионат (SPDP), сукцинимидил-4-(N-малеимидометил)циклогексан-1-карбоксилат (SMCC), иминотиолан (IT), бифункциональные производные сложных имидоэфиров (такие как диметиладипимидат HCl), активные сложные эфиры (такие, как дисукцинимидилсуберат), альдегиды (такие, как глутаральдегид), бис-азидо соединения (такие, как бис(п-азидобензоил)-гександиамин), производные бис-диазония (такие, как бис(п-диазоний бензоил)-этилендиамин), диизоцианаты (такие, как толуол 2,6-диизоцианат) и бис-активные соединения фтора (такие, как 1,5-дифтор-2,4-динитробензол). Например, иммунотоксин рицин можно получать, как описано в Vitetta et al., Science 238:1098 (1987). Меченная углеродом-14 1-изотиоцианатобензил-3-метилдиэтилентриаминпентауксусная кислота (MX-DTPA) представляет собой типовой хелатирующий агент для конъюгации радионуклида с антителом. Смотрите WO94/11026. Линкер может представлять собой «расщепляемый линкер», облегчающий высвобождение цитотоксического лекарственного средства в клетке. Например, можно использовать кислотно-лабильный линкер, чувствительный к пептидазам линкер, фотолабильный линкер, диметиловый линкер или дисульфид-содержащий линкер (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); патент США №5208020).

В контексте данного документа под иммуноконъюгатами или ADC прямо подразумевают, без ограничения конъюгатами, полученными с помощью перекрестно-сшивающих реагентов, помимо прочего, BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, МРВН, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, сульфо-EMCS, сульфо-GMBS, сульфо-KMUS, сульфо-MBS, сульфо-SIAB, сульфо-SMCC и сульфо-SMPB, а также SVSB (сукцинимидил-(4-винилсульфон)бензоат), которые являются коммерчески доступными (например, от Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A).

Мультиспецифические антитела

В некоторых вариантах осуществления предложенное в данном документе антитело представляет собой мультиспецифическое антитело, например, биспецифическое антитело. «Мультиспецифические антитела» представляют собой моноклональные антитела, которые обладают специфичностью связывания в отношении по меньшей мере двух разных сайтов, т.е. разных эпитопов на разных антигенах или разных эпитопов на одном антигене. В некоторых вариантах осуществления мультиспецифическое антитело имеет три или более специфичностей связывания. В определенных вариантах осуществления одна специфичность связывания направлена на GPRC5D, а другая (вторая или более) специфичность направлена на любой другой антиген. В определенных вариантах осуществления мультиспецифические антитела могут связываться с двумя (или более) разными эпитопами GPRC5D. Мультиспецифические (например, биспецифические) антитела также можно использовать для локализации цитотоксических агентов или клеток в клетках, которые экспрессируют GPRC5D. Мультиспецифические антитела можно получать в виде полноразмерных антител или фрагментов антител.

Методики для создания мультиспецифических антител включают, но не ограничиваются этим, рекомбинантную коэкспрессию двух пар тяжелая цепь - легкая цепь иммуноглобулина, имеющих разную специфичность (смотрите Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)), и конструирование по типу «выступ-во-впадину» (смотрите, например, патент США №5731168 и Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26 (1997)). Мультиспецифические антитела также можно создавать путем конструирования с использованием эффекта электростатического взаимодействия для создания Fc-гетеродимерных молекул антител (смотрите, например, WO 2009/089004); перекрестного сшивания двух или более антител или фрагментов (смотрите, например, патент США №4676980 и Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); применения лейциновых молний для получения биспецифических антител (смотрите, например, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992) и WO 2011/034605); применения технологии общей легкой цепи для преодоления проблемы неправильного спаривания легкой цепи (смотрите, например, WO 98/50431); применения технологии «диател» для получения биспецифических фрагментов антител (смотрите, например, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); и применения одноцепочечных димеров Fv (sFv) (смотрите, например, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); и получения триспецифических антител, как описано, например, в Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991).

Сконструированные антитела с тремя или более антигенсвязывающими сайтами, включая, например, «антитела-осьминоги» или DVD-Ig, также включены в данный документ (смотрите, например, WO 2001/77342 и WO 2008/024715). Другие примеры мультиспецифических антител с тремя или более антигенсвязывающими сайтами можно найти в WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO 2010/145792 и WO 2013/026831. Биспецифические антитела или их антигенсвязывающие фрагменты также включают «FAb двойного действия» или «DAF», содержащие антигенсвязывающий сайт, который связывается с GPRC5D, а также другим отличным антигеном, или с двумя разными эпитопами GPRC5D (смотрите, например, US 2008/0069820 и WO 2015/095539).

Мультиспецифические антитела могут быть предоставлены в асимметрической форме с кроссовером доменов в одном или более связывающих плечах с одинаковой антигенной специфичностью, т.е. посредством обмена доменов VH/VL (смотрите, например, WO 2009/080252 и WO 2015/150447), доменов CH1/CL (смотрите, например, WO 2009/080253) или полных плеч Fab (смотрите, например, WO 2009/080251, WO 2016/016299, также смотрите Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191 и Klein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20). Асимметрические плечи Fab также можно сконструировать путем внесения заряженных или не заряженных аминокислотных мутаций в контактные поверхности доменов для обеспечения правильного спаривания Fab. Смотрите, например, WO 2016/172485.

Различные дополнительные молекулярные форматы для мультиспецифических антител известны в данной области техники и включены в данный документ (смотрите, например, Spiess et al., Mol Immunol 67 (2015) 95-106).

Конкретным типом мультиспецифических антител, также включенным в данный документ, являются биспецифические антитела, предназначенные для одновременного связывания с поверхностным антигеном на клетке-мишени, например, опухолевой клетке, и с активирующим инвариантным компонентом комплекса Т-клеточного рецептора (ТКР), таким как CD3, для перенацеливания Т-клеток на уничтожение клеток-мишеней. Следовательно, в определенных вариантах осуществления предложенное в данном документе антитело представляет собой мультиспецифическое антитело, в частности биспецифическое антитело, причем одна из специфичностей связывания направлена на GPRC5D, а другая направлена на CD3.

Примеры форматов биспецифических антител, которые можно применять в этих целях, включают, но не ограничиваются этим, так называемые молекулы «BiTE» (привлекающий Т-клетки биспецифический активатор), в которых две молекулы scFv сшиты гибким линкером (смотрите, например, WO 2004/106381, WO 2005/061547, WO 2007/042261 и WO 2008/119567, Nagorsen and Bäuerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)); диатела (Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)) и их производные, такие как тандемные диатела («TandAb»; Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-56 (1999)); молекулы «DART» (перенацеливание с двойной аффинностью), которые основаны на формате диатела, но имеют С-концевой дисульфидный мостик для дополнительной стабилизации (Johnson et al., J Mol Biol 399, 436-449 (2010)), и так называемые triomab, которые представляют собой полностью гибридные молекулы IgG мыши/крысы (обзор в Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)). Конкретные включенные в данный документ форматы Т-клеточных биспецифических антител описаны в WO 2013/026833, WO 2013/026839, WO 2016/020309; Bacac et al., Oncoimmunology 5(8) (2016) е1203498.

Биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые связываются с GPRC5D и вторым антигеном

В изобретении также предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, т.е. антигенсвязывающая молекула, которая содержит по меньшей мере два антигенсвязывающих фрагмента, способных к специфическому связыванию с двумя различными антигенными детерминантами (первым и вторым антигеном).

В соответствии с конкретными вариантами осуществления изобретения антигенсвязывающие фрагменты, содержащиеся в биспецифической антигенсвязывающей молекуле, представляют собой молекулы Fab (т.е. антигенсвязывающие домены, состоящие из тяжелой и легкой цепи, каждая из которых содержит вариабельный и константный домен). В одном варианте осуществления первый и/или второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab. В одном варианте осуществления указанная молекула Fab является человеческой. В конкретном варианте осуществления указанная молекула Fab является гуманизированной. В другом варианте осуществления указанная молекула Fab содержит константные домены тяжелой и легкой цепи человека.

Предпочтительно по меньшей мере один из антигенсвязывающих фрагментов представляет собой кроссоверную молекулу Fab. Такая модификация снижает неправильное спаривание тяжелых и легких цепей из разных молекул Fab, тем самым улучшая выход и чистоту биспецифической антигенсвязывающей молекулы по изобретению при рекомбинантном получении. В конкретной кроссоверной молекуле Fab, применимой для биспецифической антигенсвязывающей молекулы по изобретению, обменены вариабельные домены легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab (VL и VH, соответственно). Однако даже при таком обмене доменов препарат биспецифической антигенсвязывающей молекулы может содержать некоторые побочные продукты вследствие так называемого взаимодействия Бенс-Джонса между неправильно спаренными тяжелой и легкой цепями (смотрите Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 11187-11191). Чтобы дополнительно уменьшить неправильное спаривание тяжелых и легких цепей из разных молекул Fab и, таким образом, повысить чистоту и выход необходимой биспецифической антигенсвязывающей молекулы, заряженные аминокислоты с противоположными зарядами можно вносить в определенных аминокислотных позициях в доменах СН1 и CL молекулы (молекул) Fab, связывающейся(ихся) с первым антигеном (GPRC5D), или молекулы Fab, связывающейся со вторым антигеном (например, активирующим Т-клеточным антигеном, таким как CD3), как дополнительно описано в данном документе. Зарядовые модификации осуществляют в стандартной(ых) молекуле(ах) Fab, содержащейся в биспецифической антигенсвязывающей молекуле (как показано, например, на Фиг. 1 А-В, Ж-Л), или в VH/VL-кроссоверной(ых) молекуле(ах) Fab, содержащейся в биспецифической антигенсвязывающей молекуле (как показано, например, на Фиг. 1 Г-Е, М-Р) (но не в обеих). В конкретных вариантах осуществления зарядовые модификации осуществляют в стандартной(ых) молекуле(ах) Fab, содержащейся в биспецифической антигенсвязывающей молекуле (которая в конкретных вариантах осуществления связывается с первым антигеном, т.е. GPRC5D).

В конкретном варианте осуществления в соответствии с изобретением биспецифическая антигенсвязывающая молекула способна одновременно связываться с первым антигеном (т.е. GPRC5D) и вторым антигеном (т.е. активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3). В одном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула способна к перекрестному сшиванию Т-клетки и клетки-мишени путем одновременного связывания GPRC5D и активирующего Т-клеточного антигена. В более конкретном варианте осуществления такое одновременное связывание приводит к лизису клетки-мишени, в частности экспрессирующей GPRC5D опухолевой клетки. В одном варианте осуществления такое одновременное связывание приводит к активации Т-клетки. В других вариантах осуществления такое одновременное связывание приводит к клеточному ответу Т-лимфоцита, в частности цитотоксического Т-лимфоцита, выбранному из группы из пролиферации, дифференцировки, секреции цитокинов, высвобождения цитотоксических эффекторных молекул, цитотоксической активности и экспрессии маркеров активации. В одном варианте осуществления связывание биспецифической антигенсвязывающей молекулы с активирующим Т-клеточным антигеном, в частности CD3, без одновременного связывания с GPRC5D не приводит к активации Т-клетки.

В одном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула способна перенаправлять цитотоксическую активность Т-клетки на клетку-мишень. В конкретном варианте осуществления указанное перенаправление не зависит от опосредованной ГКГС презентации пептидного антигена клеткой-мишенью и/или специфичности Т-клетки.

В частности, Т-клетка в соответствии с любым из вариантов осуществления изобретения представляет собой цитотоксическую Т-клетку. В некоторых вариантах осуществления Т-клетка представляет собой CD4⁺ или CD8⁺ Т-клетку, в частности CD8⁺ Т-клетку.

Первый антигенсвязывающий фрагмент

Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по изобретению содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий фрагмент, в частности молекулу Fab, который связывается с GPRC5D (первый антиген). В определенных вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит два антигенсвязывающих фрагмента, в частности молекул Fab, которые связываются с GPRC5D. В таком конкретном варианте осуществления каждый из этих антигенсвязывающих фрагментов связывается с одной и той же антигенной детерминантой. В более конкретном варианте осуществления все из этих антигенсвязывающих фрагментов являются идентичными, т.е. они содержат одинаковые аминокислотные последовательности, содержащие одинаковые аминокислотные замены в доменах СН1 и CL, как описано в данном документе (в случае наличия). В одном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит не более двух антигенсвязывающих фрагментов, в частности молекул Fab, которые связываются с GPRC5D.

В конкретных вариантах осуществления антигенсвязывающий(е) фрагмент(ы), который(е) связывается(ются) с GPRC5D, представляет(ют) собой стандартную молекулу Fab. В таких вариантах осуществления антигенсвязывающий(е) фрагмент(ы), который(е) связывается(ются) со вторым антигеном, представляет(ют) собой кроссоверную молекулу Fab, описанную в данном документе, т.е. молекулу Fab, в которой вариабельные домены VH и VL или константные домены СН1 и CL тяжелой и легкой цепей Fab заменены/замещены друг другом.

В альтернативных вариантах осуществления антигенсвязывающий(е) фрагмент(ы), который(е) связывается(ются) с GPRC5D, представляет(ют) собой кроссоверную молекулу Fab, описанную в данном документе, т.е. молекулу Fab, в которой вариабельные домены VH и VL или константные домены СН1 и CL тяжелой и легкой цепей Fab заменены/замещены друг другом. В таких вариантах осуществления антигенсвязывающий(е) фрагмент(ы), который(е) связывается(ются) со вторым антигеном, представляет(ют) собой стандартную молекулу Fab.

GPRC5D-связывающий фрагмент способен направлять биспецифическую антигенсвязывающую молекулу к сайту-мишени, например, к конкретному типу опухолевой клетки, которая экспрессирует GPRC5D.

Первый антигенсвязывающий фрагмент биспецифической антигенсвязывающей молекулы может обладать любыми характеристиками, по отдельности или в комбинации, описанными в данном документе в отношении антитела, которое связывает GPRC5D, если это явно не является нерациональным или невозможным с научной точки зрения.

Таким образом, в одном аспекте в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая (а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый первый антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 83, HCDR 2 с SEQ ID NO: 84 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 87, LCDR 2 с SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 89, и (б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном. В другом одном аспекте в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая (а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый первый антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 83, HCDR 2 с SEQ ID NO: 85 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 87, LCDR 2 с SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 89, и (б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном. В другом одном аспекте в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая (а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый первый антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97, и (б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном. В другом одном аспекте в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая (а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый первый антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 96 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97, и (б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном. В другом одном аспекте в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая (а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый первый антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 92 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97, и (б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном. В другом одном аспекте в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая (а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый первый антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 1, HCDR 2 с SEQ ID NO: 2 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 4, LCDR 2 с SEQ ID NO: 5 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 6, и (б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном. В другом одном аспекте в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая (а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый первый антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 7, HCDR 2 с SEQ ID NO: 8 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 10, LCDR 2 с SEQ ID NO: 11 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 12, и (б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном.

В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело (получен из него). В одном варианте осуществления VH представляет собой гуманизированную VH и/или VL представляет собой гуманизированную VL. В одном варианте осуществления первый антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR согласно любому из вышеприведенных вариантов осуществления и дополнительно содержит акцепторную человеческую каркасную область, например, каркасную область человеческого иммуноглобулина или человеческую консенсусную каркасную область.

В одном варианте осуществления VH первого антигенсвязывающего домена содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из группы из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58, a VL первого антигенсвязывающего домена содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из группы из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64.

В одном варианте осуществления первый антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из группы из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15. SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58, и последовательность VL, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из группы из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64.

В одном варианте осуществления первый антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64.

В одном варианте осуществления первый антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH, выбранную из группы из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58, и последовательность VL, выбранную из группы из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64.

В конкретном варианте осуществления первый антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. В конкретном варианте осуществления первый антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH SEQ ID NO: 13, и последовательность VL SEQ ID NO: 14.

В конкретном варианте осуществления первый антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16. В конкретном варианте осуществления первый антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH SEQ ID NO: 15, и последовательность VL SEQ ID NO: 16.

В конкретном варианте осуществления первый антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53. В конкретном варианте осуществления первый антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH SEQ ID NO: 48, и последовательность VL SEQ ID NO: 53.

В конкретном варианте осуществления первый антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52. В конкретном варианте осуществления первый антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH SEQ ID NO: 49, и последовательность VL SEQ ID NO: 52.

В конкретном варианте осуществления первый антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64. В конкретном варианте осуществления первый антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH SEQ ID NO: 57, и последовательность VL SEQ ID NO: 64.

В конкретном варианте осуществления первый антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63. В конкретном варианте осуществления первый антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH SEQ ID NO: 58, и последовательность VL SEQ ID NO: 63. В одном варианте осуществления первый антигенсвязывающий фрагмент содержит человеческую константную область. В одном варианте осуществления первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую человеческую константную область, в частности, человеческий домен СН1 и/или CL. Типовые последовательности человеческих константных доменов приведены в SEQ ID NO: 37 и 38 (человеческие домены CL каппа и лямбда, соответственно) и SEQ ID NO: 39 (константные домены СН1-СН2-СН3 тяжелой цепи человеческого IgG₁). В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37 или SEQ ID NO: 38, в частности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37. В частности, константная область легкой цепи может содержать аминокислотные мутации, описанные в данном документе как «зарядовые модификации», и/или может содержать делецию или замены одной или более (в частности двух) N-концевых аминокислот, если она находится в кроссоверной молекуле Fab. В некоторых вариантах осуществления первый антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности домена СН1, содержащейся в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39. В частности, константная область тяжелой цепи (в частности домен СН1) может содержать аминокислотные мутации, описанные в данном документе как «зарядовые модификации».

Второй антигенсвязывающий фрагмент

Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по изобретению содержит по меньшей мере один антигенсвязывающий фрагмент, в частности молекулу Fab, который связывается со вторым антигеном (отличным от GPRC5D).

В конкретных вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, представляет собой кроссоверную молекулу Fab, описанную в данном документе, т.е. молекулу Fab, в которой вариабельные домены VH и VL или константные домены СН1 и CL тяжелой и легкой цепей Fab заменены/замещены друг другом. В таких вариантах осуществления антигенсвязывающий(е) фрагмент(ы), который(е) связывается(ются) с первым антигеном (т.е. GPRC5D), предпочтительно представляет(ют) собой стандартную молекулу Fab. В вариантах осуществления, в которых присутствует более одного антигенсвязывающего фрагмента, в частности молекулы Fab, которые связываются с GPRC5D, содержащихся в биспецифической антигенсвязывающей молекуле, антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, предпочтительно представляет собой кроссоверную молекулу Fab, а антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с GPRC5D, представляют собой стандартные молекулы Fab.

В альтернативных вариантах осуществления антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, представляет собой стандартную молекулу Fab. В таких вариантах осуществления антигенсвязывающий(е) фрагмент(ы), который(е) связывается(ются) с первым антигеном (т.е. GPRC5D), представляет(ют) собой кроссоверную молекулу Fab, описанную в данном документе, т.е. молекулу Fab, в которой вариабельные домены VH и VL или константные домены СН1 и CL тяжелой и легкой цепей Fab заменены/замещены друг другом. В вариантах осуществления, в которых присутствует более одного антигенсвязывающего фрагмента, в частности молекулы Fab, которые связываются со вторым антигеном, содержащихся в биспецифической антигенсвязывающей молекуле, антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с GPRC5D, предпочтительно представляет собой кроссоверную молекулу Fab, а антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются со вторым антигеном, представляют собой стандартные молекулы Fab.

В некоторых вариантах осуществления второй антиген представляет собой активирующий Т-клеточный антиген (также называемый в данном документе «связывающим активирующий Т-клеточный антиген фрагментом или связывающей активирующий Т-клеточный антиген молекулой Fab»). В конкретном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит более одного антигенсвязывающего фрагмента, способного к специфическому связыванию с активирующим Т-клеточным антигеном. В одном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула обеспечивает одновалентное связывание с активирующим Т-клеточным антигеном.

В конкретных вариантах осуществления второй антиген представляет собой CD3, в частности CD3 человека (SEQ ID NO: 40) или CD3 яванского макака (SEQ ID NO: 41), конкретнее CD3 человека. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент является перекрестно-реакционноспособным в отношении CD3 человека и яванского макака (т.е. специфически связывается с ними). В некоторых вариантах осуществления второй антиген представляет собой эпсилон-субъединицу CD3 (CD3-эпсилон).

В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит HCDR 1 с SEQ ID NO: 29, HCDR 2 с SEQ ID NO: 30, HCDR 3 с SEQ ID NO: 31, LCDR 1 с SEQ ID NO: 32, LCDR 2 с SEQ ID NO: 33 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 34. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую HCDR 1 с SEQ ID NO: 29, HCDR 2 с SEQ ID NO: 30 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 31, и VL, содержащую LCDR 1 с SEQ ID NO: 32, LCDR 2 с SEQ ID NO: 33 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело (получен из него). В одном варианте осуществления VH представляет собой гуманизированную VH и/или VL представляет собой гуманизированную VL. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR согласно любому из вышеприведенных вариантов осуществления и дополнительно содержит акцепторную человеческую каркасную область, например, каркасную область человеческого иммуноглобулина или человеческую консенсусную каркасную область. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VL, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35, и последовательность VL, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36. В одном варианте осуществления VH второго антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 35, a VL второго антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 36. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH SEQ ID NO: 35, и последовательность VL SEQ ID NO: 36.

В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит HCDR 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99, HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, LCDR 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую HCDR 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и VL, содержащую LCDR 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело (получен из него). В одном варианте осуществления VH представляет собой гуманизированную VH и/или VL представляет собой гуманизированную VL. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR согласно любому из вышеприведенных вариантов осуществления и дополнительно содержит акцепторную человеческую каркасную область, например, каркасную область человеческого иммуноглобулина или человеческую консенсусную каркасную область. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 104. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VL, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 105. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 104, и последовательность VL, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 105. В одном варианте осуществления VH второго антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 104, a VL второго антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 105. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 105. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH SEQ ID NO: 104, и последовательность VL SEQ ID NO: 105.

В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит HCDR 1 с SEQ ID NO: 106, HCDR 2 с SEQ ID NO: 107, HCDR 3 с SEQ ID NO: 108, LCDR 1 с SEQ ID NO: 109, LCDR 2 с SEQ ID NO: 110 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 111. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую HCDR 1 с SEQ ID NO: 106, HCDR 2 с SEQ ID NO: 107 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 108, и VL, содержащую LCDR 1 с SEQ ID NO: 109, LCDR 2 с SEQ ID NO: 110 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 111.

В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело (получен из него). В одном варианте осуществления VH представляет собой гуманизированную VH и/или VL представляет собой гуманизированную VL. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR согласно любому из вышеприведенных вариантов осуществления и дополнительно содержит акцепторную человеческую каркасную область, например, каркасную область человеческого иммуноглобулина или человеческую консенсусную каркасную область. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 112. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VL, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 113. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 112, и последовательность VL, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 113. В одном варианте осуществления VH второго антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 112, a VL второго антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 113. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 112, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 113. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH SEQ ID NO: 112, и последовательность VL SEQ ID NO: 113.

В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит человеческую константную область. В одном варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую человеческую константную область, в частности, человеческий домен СН1 и/или CL. Типовые последовательности человеческих константных доменов приведены в SEQ ID NO: 37 и 38 (человеческие домены CL каппа и лямбда, соответственно) и SEQ ID NO: 39 (константные домены СН1-СН2-СН3 тяжелой цепи человеческого IgG₁). В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37 или SEQ ID NO: 38, в частности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37. В частности, константная область легкой цепи может содержать аминокислотные мутации, описанные в данном документе как «зарядовые модификации», и/или может содержать делецию или замены одной или более (в частности двух) N-концевых аминокислот, если она находится в кроссоверной молекуле Fab. В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности домена СН1, содержащейся в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39. В частности, константная область тяжелой цепи (в частности домен СН1) может содержать аминокислотные мутации, описанные в данном документе как «зарядовые модификации».

В некоторых вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, причем вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1, в частности вариабельные домены VL и VH, легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом (т.е. в соответствии с таким вариантом осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой кроссоверную молекулу Fab, причем вариабельные или константные домены легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab обменены). В одном таком варианте осуществления первый (и, в случае наличия, третий) антигенсвязывающий фрагмент представляет собой стандартную молекулу Fab.

В одном варианте осуществления в биспецифической антигенсвязывающей молекуле присутствует не более одного антигенсвязывающего фрагмента, который связывается со вторым антигеном (например, активирующим Т-клеточным антигеном, таким как CD3) (т.е. биспецифическая антигенсвязывающая молекула обеспечивает одновалентное связывание со вторым антигеном).

Зарядовые модификации

Биспецифические антигенсвязывающие молекулы по изобретению могут содержать аминокислотные замены в содержащихся в них молекулах Fab, которые являются в особенности эффективными для уменьшения неправильного спаривания легких цепей с несовпадающими тяжелыми цепями (побочные продукты типа Бенс-Джонса), которое может происходить при получении би-/мультиспецифических антигенсвязывающих молекул на основе Fab с обменом VH/VL в одном (или более в случае молекул, содержащих более двух антигенсвязывающих молекул Fab) из их связывающих плеч (также смотрите публикацию РСТ №WO 2015/150447, в полном объеме включенную в данный документ посредством ссылки, в частности, примеры в ней). Соотношение необходимой биспецифической антигенсвязывающей молекулы и нежелательных побочных продуктов, в частности побочных продуктов типа Бенс-Джонса, возникающих в биспецифических антигенсвязывающих молекулах с обменом доменов VH/VL в одном из их связывающих плеч, можно улучшить путем внесения заряженных аминокислот с противоположными зарядами в определенные аминокислотные позиции в доменах СН1 и CL (что иногда называется в данном документе «зарядовыми модификациями»).

Соответственно, в некоторых вариантах осуществления, в которых первый и второй антигенсвязывающие фрагменты биспецифической антигенсвязывающей молекулы оба представляют собой молекулы Fab, а в одном из антигенсвязывающих фрагментов (в частности, во втором антигенсвязывающем фрагменте) вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом,

i) в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 замещена положительно заряженной аминокислотой (нумерация в соответствии с Kabat), и при этом в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 или аминокислота в позиции 213 замещена отрицательно заряженной аминокислотой (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); или

ii) в константном домене CL второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 замещена положительно заряженной аминокислотой (нумерация в соответствии с Kabat), и при этом в константном домене СН1 второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 или аминокислота в позиции 213 замещена отрицательно заряженной аминокислотой (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

Биспецифическая антигенсвязывающая молекула не содержит обе модификации, указанные в i) и ii). Константные домены CL и СН1 антигенсвязывающего фрагмента, содержащего обмен VH/VL, не замещены друг другом (т.е. остаются необмененными).

В более конкретном варианте осуществления

i) в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 или аминокислота в позиции 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); или

ii) в константном домене CL второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене СН1 второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 или аминокислота в позиции 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В одном таком варианте осуществления в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 или аминокислота в позиции 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В дополнительном варианте осуществления в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В конкретном варианте осуществления в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене CH1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В более конкретном варианте осуществления в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В даже более конкретном варианте осуществления в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В конкретных вариантах осуществления, если аминокислотные замены в соответствии с вышеприведенными вариантами осуществления проведены в константном домене CL и константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента, константный домен CL первого антигенсвязывающего фрагмента относится к изотипу каппа.

В альтернативном варианте аминокислотные замены в соответствии с вышеприведенными вариантами осуществления могут быть проведены в константном домене CL и константном домене СН1 второго антигенсвязывающего фрагмента вместо константного домена CL и константного домена CH1 первого антигенсвязывающего фрагмента. В конкретных вариантах осуществления константный домен CL второго антигенсвязывающего фрагмента относится к изотипу каппа.

Соответственно, в одном варианте осуществления в константном домене CL второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене СН1 второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 или аминокислота в позиции 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В дополнительном варианте осуществления в константном домене CL второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене СН1 второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В другом варианте осуществления в константном домене CL второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене СН1 второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В одном варианте осуществления в константном домене CL второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене СН1 второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В другом варианте осуществления в константном домене CL второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене СН1 второго антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В конкретном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула по изобретению содержит

(а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 83, HCDR 2 с SEQ ID NO: 84 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 87, LCDR 2 с SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 89, и

(б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом;

причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat) (в конкретном варианте осуществления - независимо лизином (K) или аргинином (R)) и аминокислота в позиции 123 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat) (в конкретном варианте осуществления - независимо лизином (K) или аргинином (R)), а в константном домене CH1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В конкретном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула по изобретению содержит

(а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 83, HCDR 2 с SEQ ID NO: 85 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 87, LCDR 2 с SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 89, и

(б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом;

причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat) (в конкретном варианте осуществления - независимо лизином (K) или аргинином (R)) и аминокислота в позиции 123 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat) (в конкретном варианте осуществления - независимо лизином (K) или аргинином (R)), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (E) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В конкретном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула по изобретению содержит

(а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97, и

(б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом;

причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat) (в конкретном варианте осуществления - независимо лизином (K) или аргинином (R)) и аминокислота в позиции 123 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat) (в конкретном варианте осуществления - независимо лизином (K) или аргинином (R)), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В конкретном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула по изобретению содержит

(а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 96 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97, и

(б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом;

причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat) (в конкретном варианте осуществления - независимо лизином (K) или аргинином (R)) и аминокислота в позиции 123 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat) (в конкретном варианте осуществления - независимо лизином (K) или аргинином (R)), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В конкретном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула по изобретению содержит

(а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 92 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97, и

(б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом;

причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat) (в конкретном варианте осуществления - независимо лизином (K) или аргинином (R)) и аминокислота в позиции 123 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat) (в конкретном варианте осуществления - независимо лизином (K) или аргинином (R)), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В конкретном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула по изобретению содержит

(а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 1, HCDR 2 с SEQ ID NO: 2 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 4, LCDR 2 с SEQ ID NO: 5 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 6, и

(б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом;

причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat) (в конкретном варианте осуществления - независимо лизином (K) или аргинином (R)) и аминокислота в позиции 123 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat) (в конкретном варианте осуществления - независимо лизином (K) или аргинином (R)), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В конкретном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула по изобретению содержит

(а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 7, HCDR 2 с SEQ ID NO: 8 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 10, LCDR 2 с SEQ ID NO: 11 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 12, и

(б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом;

причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat) (в конкретном варианте осуществления - независимо лизином (K) или аргинином (R)) и аминокислота в позиции 123 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat) (в конкретном варианте осуществления - независимо лизином (K) или аргинином (R)), а в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента аминокислота в позиции 147 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

Форматы биспецифических антигенсвязывающих молекул

Компоненты биспецифической антигенсвязывающей молекулы в соответствии с настоящим изобретением можно сливать друг с другом в ряде конфигураций. Типовые конфигурации проиллюстрированы на Фиг. 1A-АА.

В конкретных вариантах осуществления антигенсвязывающие фрагменты, содержащиеся в биспецифической антигенсвязывающей молекуле, представляют собой молекулы Fab. В таких вариантах осуществления первый, второй, третий и т.д. антигенсвязывающий фрагмент может называться в данном документе первой, второй, третей и т.д. молекулой Fab, соответственно.

В одном варианте осуществления первый и второй антигенсвязывающие фрагменты биспецифической антигенсвязывающей молекулы слиты друг с другом, необязательно посредством пептидного линкера. В конкретных вариантах осуществления каждый из первого и второго антигенсвязывающих фрагментов представляет собой молекулу Fab. В одном таком варианте осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента. В другом таком варианте осуществления первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента. В вариантах осуществления, в которых (i) второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента или (ii) первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента, легкая цепь Fab первого антигенсвязывающего фрагмента и легкая цепь Fab второго антигенсвязывающего фрагмента дополнительно могут быть слиты друг с другом, необязательно, посредством пептидного линкера.

Биспецифическая антигенсвязывающая молекула с одним антигенсвязывающим фрагментом (таким как молекула Fab), способным специфически связываться с антигеном клетки-мишени, таким как GPRC5D (например, как показано на Фиг. 1А, 1Г, 1Ж, 1И, 1М, 1Н), применимо, в частности, в случаях, когда после связывания с высокоаффинным антигенсвязывающим фрагментом можно ожидать интернализации антигена клетки-мишени. В таких случаях наличие более одного антигенсвязывающего фрагмента, специфического в отношении антигена клетки-мишени, может повысить интернализацию антигена клетки-мишени, тем самым снижая его доступность.

При этом в других случаях преимущественной является биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая два или более антигенсвязывающих фрагментов (таких как молекулы Fab), специфических в отношении антигена клетки-мишени (смотрите примеры, проиллюстрированные на Фиг. 1Б, 1В, 1Д, 1Е, 1К, 1Л, 1П или 1P), например, для оптимизации нацеливания на сайт-мишень или для обеспечения возможности перекрестного связывания антигенов клетки-мишени.

Соответственно, в конкретных вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула в соответствии с настоящим изобретением содержит третий антигенсвязывающий фрагмент.

В одном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент связывается с первым антигеном, т.е. GPRC5D. В одном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab.

В одном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент идентичен первому антигенсвязывающему фрагменту.

Третий антигенсвязывающий фрагмент биспецифической антигенсвязывающей молекулы может обладать любыми характеристиками, по отдельности или в комбинации, описанными в данном документе в отношении первого антигенсвязывающего фрагмента и/или антитела, которое связывает GPRC5D, если это явно не является нерациональным или невозможным с научной точки зрения.

В одном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 83, HCDR 2 с SEQ ID NO: 84 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 87, LCDR 2 с SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 89.

В одном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 83, HCDR 2 с SEQ ID NO: 85 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 87, LCDR 2 с SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 89.

В одном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97.

В одном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 96 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97.

В одном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 92 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97.

В одном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 1, HCDR 2 с SEQ ID NO: 2 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 4, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 5, LCDR 2 с SEQ ID NO: 6 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 7.

В одном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 7, HCDR 2 с SEQ ID NO: 8 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 10, LCDR 2 с SEQ ID NO: 11 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 12.

В некоторых вариантах осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент представляет собой гуманизированное антитело (получен из него). В одном варианте осуществления VH представляет собой гуманизированную VH и/или VL представляет собой гуманизированную VL. В одном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR согласно любому из вышеприведенных вариантов осуществления и дополнительно содержит акцепторную человеческую каркасную область, например, каркасную область человеческого иммуноглобулина или человеческую консенсусную каркасную область.

В одном варианте осуществления VH третьего антигенсвязывающего домена содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из группы из SEQ ID NO: 13,SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58, a VL третьего антигенсвязывающего домена содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из группы из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64.

В одном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из группы из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15 SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58, и последовательность VL, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности, выбранной из группы из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64.

В одном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58, и VL, содержащую аминокислотную последовательность, выбранную из группы из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64.

В одном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH, выбранную из группы из SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 57 и SEQ ID NO: 58, и последовательность VL, выбранную из группы из SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 53, SEQ ID NO: 63 и SEQ ID NO: 64.

В конкретном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14. В конкретном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH SEQ ID NO: 13, и последовательность VL SEQ ID NO: 14.

В конкретном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16. В конкретном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH SEQ ID NO: 15, и последовательность VL SEQ ID NO: 16.

В конкретном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53. В конкретном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH SEQ ID NO: 48, и последовательность VL SEQ ID NO: 53.

В конкретном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52. В конкретном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH SEQ ID NO: 49, и последовательность VL SEQ ID NO: 52.

В конкретном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64. В конкретном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH SEQ ID NO: 57, и последовательность VL SEQ ID NO: 64.

В конкретном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63. В конкретном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит последовательность VH SEQ ID NO: 58, и последовательность VL SEQ ID NO: 63.

В одном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит человеческую константную область. В одном варианте осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую человеческую константную область, в частности, человеческий домен СН1 и/или CL. Типовые последовательности человеческих константных доменов приведены в SEQ ID NO: 37 и 38 (человеческие домены CL каппа и лямбда, соответственно) и SEQ ID NO: 39 (константные домены СН1-СН2-СН3 тяжелой цепи человеческого IgG₁). В некоторых вариантах осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37 или SEQ ID NO: 38, в частности аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 37. В частности, константная область легкой цепи может содержать аминокислотные мутации, описанные в данном документе как «зарядовые модификации», и/или может содержать делецию или замены одной или более (в частности двух) N-концевых аминокислот, если она находится в кроссоверной молекуле Fab. В некоторых вариантах осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на около 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности домена СН1, содержащейся в аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 39. В частности, константная область тяжелой цепи (в частности домен СН1) может содержать аминокислотные мутации, описанные в данном документе как «зарядовые модификации».

В конкретных вариантах осуществления каждый из третьего и первого антигенсвязывающих фрагментов представляет собой молекулу Fab, и третий антигенсвязывающий фрагмент идентичен первому антигенсвязывающему фрагменту. Таким образом, в этих вариантах осуществления первый и третий антигенсвязывающие фрагменты содержат одинаковые аминокислотные последовательности тяжелой и легкой цепи и имеют одинаковое расположение доменов (т.е. стандартное или кроссоверное). Кроме того, в этих вариантах осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент содержит такие же аминокислотные замены, в случае их наличия, что и первый антигенсвязывающий фрагмент. Например, аминокислотные замены, описанные в данном документе как «зарядовые модификации» проводят в константном домене CL и константном домене СН1 каждого из первого антигенсвязывающего фрагмента и третьего антигенсвязывающего фрагмента. В альтернативном варианте указанные аминокислотные замены можно проводить в константном домене CL и константном домене СН1 второго антигенсвязывающего фрагмента (который, в конкретных вариантах осуществления также представляет собой молекулу Fab), но не в константном домене CL и константном домене СН1 первого антигенсвязывающего домена и третьего антигенсвязывающего домена.

Как и первый антигенсвязывающий фрагмент, третий антигенсвязывающий фрагмент, в частности, представляет собой стандартную молекулу Fab. При этом также предусмотрены варианты осуществления, в которых первый и третий антигенсвязывающие фрагменты представляют собой кроссоверные молекулы Fab (а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой стандартную молекулу Fab). Таким образом, в конкретных вариантах осуществления каждый из первого и третьего антигенсвязывающих фрагментов представляет собой стандартную молекулу Fab, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой кроссоверную молекулу Fab, описанную в данном документе, т.е. молекулу Fab, в которой вариабельные домены VH и VL или константные домены CL и СН1 тяжелой и легкой цепей Fab заменены/замещены друг другом. В других вариантах осуществления каждый из первого и третьего антигенсвязывающих фрагментов представляет собой кроссоверную молекулу Fab, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой стандартную молекулу Fab.

В случае наличия третьего антигенсвязывающего фрагмента, в конкретном варианте осуществления первый и третий антигенсвязывающие фрагменты связываются с GPRC5D, а второй антигенсвязывающий фрагмент связывается со вторым антигеном, в частности активирующим Т-клеточным антигеном, конкретнее CD3, конкретнее CD3-эпсилон.

В конкретных вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц. Первая и вторая субъединицы Fc-домена способны к стабильной ассоциации.

Биспецифическая антигенсвязывающая молекула в соответствии с изобретением может иметь отличные конфигурации, т.е. первый, второй (и, необязательно, третий) антигенсвязывающие фрагменты могут быть слиты друг с другом и с Fc-доменом разными способами. Компоненты могут быть слиты друг с другом напрямую или, предпочтительно, посредством одного или более подходящих пептидных линкеров. Если молекула Fab слита с N-концом субъединицы Fc-домена, как правило, слияние происходит посредством шарнирной области иммуноглобулина.

В некоторых вариантах осуществления каждый из первого и второго антигенсвязывающих фрагментов представляет собой молекулу Fab, а второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы Fc-домена. В таких вариантах осуществления первый антигенсвязывающий фрагмент может быть слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента или с N-концом другой субъединицы Fc-домена. В таких конкретных вариантах осуществления указанный первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой стандартную молекулу Fab, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой кроссоверную молекулу Fab, описанную в данном документе, т.е. молекулу Fab, в которой вариабельные домены VH и VL или константные домены CL и СН1 тяжелой и легкой цепей Fab заменены/замещены друг другом. В других таких вариантах осуществления указанная первая молекула Fab представляет собой кроссоверную молекулу Fab, а вторая молекула Fab представляет собой стандартную молекулу Fab.

В одном варианте осуществления каждый из первого и второго антигенсвязывающих фрагментов представляет собой молекулу Fab, второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы Fc-домена, а первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента. В конкретном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула состоит преимущественно из первой и второй молекул Fab, Fc-домена, состоящего из первой и второй субъединиц, и, необязательно, одного или более пептидных линкеров, причем первая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab, а вторая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы Fc-домена. Такая конфигурация схематически изображена на Фиг. 1Ж и 1М (в этих примерах второй антигенсвязывающий домен представляет собой VH/VL-кроссоверную молекулу Fab). Необязательно, легкая цепь Fab первой молекулы Fab и легкая цепь Fab второй молекулы Fab могут быть дополнительно слиты друг с другом.

В другом варианте осуществления каждый из первого и второго антигенсвязывающих фрагментов представляет собой молекулу Fab и каждый из первого и второго антигенсвязывающих фрагментов слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена. В конкретном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула состоит преимущественно из первой и второй молекул Fab, Fc-домена, состоящего из первой и второй субъединиц, и, необязательно, одного или более пептидных линкеров, причем каждая из первой и второй молекул Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена. Такая конфигурация схематически изображена на Фиг. 1А и 1Г (в этих примерах второй антигенсвязывающий домен представляет собой VH/VL-кроссоверную молекулу Fab, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой стандартную молекулу Fab). Первая и вторая молекулы Fab могут быть слиты с Fc-доменом напрямую или посредством пептидного линкера. В конкретном варианте осуществления каждая из первой и второй молекул Fab слита с Fc-доменом посредством шарнирной области иммуноглобулина. В конкретном варианте осуществления шарнирная область иммуноглобулина представляет собой шарнирную область IgG₁ человека, в частности, когда Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG₁.

В некоторых вариантах осуществления каждый из первого и второго антигенсвязывающих фрагментов представляет собой молекулу Fab, а первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы Fc-домена. В таких вариантах осуществления второй антигенсвязывающий фрагмент может быть слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента или (как описано выше) с N-концом другой субъединицы Fc-домена. В таких конкретных вариантах осуществления указанный первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой стандартную молекулу Fab, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой кроссоверную молекулу Fab, описанную в данном документе, т.е. молекулу Fab, в которой вариабельные домены VH и VL или константные домены CL и СН1 тяжелой и легкой цепей Fab заменены/замещены друг другом. В других таких вариантах осуществления указанная первая молекула Fab представляет собой кроссоверную молекулу Fab, а вторая молекула Fab представляет собой стандартную молекулу Fab.

В одном варианте осуществления каждый из первого и второго антигенсвязывающих фрагментов представляет собой молекулу Fab, первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы Fc-домена, а второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента. В конкретном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула состоит преимущественно из первой и второй молекул Fab, Fc-домена, состоящего из первой и второй субъединиц, и, необязательно, одного или более пептидных линкеров, причем вторая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первой молекулы Fab, а первая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы Fc-домена. Такая конфигурация схематически изображена на Фиг. 1И и 1H (в этих примерах второй антигенсвязывающий домен представляет собой VH/VL-кроссоверную молекулу Fab, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой стандартную молекулу Fab). Необязательно, легкая цепь Fab первой молекулы Fab и легкая цепь Fab второй молекулы Fab могут быть дополнительно слиты друг с другом.

В некоторых вариантах осуществления третий антигенсвязывающий фрагмент, в частности третья молекула Fab, слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой или второй субъединицы Fc-домена. В таких конкретных вариантах осуществления каждая из указанных первой и третьей молекул Fab представляет собой стандартную молекулу Fab, а вторая молекула Fab представляет собой кроссоверную молекулу Fab, описанную в данном документе, т.е. молекулу Fab, в которой вариабельные домены VH и VL или константные домены CL и СН1 тяжелой и легкой цепей Fab заменены/замещены друг другом. В других таких вариантах осуществления каждая из указанных первой и третьей молекул Fab представляет собой кроссоверную молекулу Fab, а вторая молекула Fab представляет собой стандартную молекулу Fab.

В таком конкретном варианте осуществления каждый из второго и третьего антигенсвязывающих фрагментов слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена, а первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab. В конкретном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула состоит преимущественно из первой, второй и третьей молекул Fab, Fc-домена, состоящего из первой и второй субъединиц, и, необязательно, одного или более пептидных линкеров, причем первая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab, вторая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой субъединицы Fc-домена, а третья молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом второй субъединицы Fc-домена. Такая конфигурация схематически изображена на Фиг. 1Б и 1Д (в этих примерах второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой VH/VL-кроссоверную молекулу Fab, а первый и третий антигенсвязывающие фрагменты представляют собой стандартную молекулу Fab) и Фиг. 1Л и 1Р (в этих примерах второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой стандартную молекулу Fab, а первый и третий антигенсвязывающие фрагменты представляют собой VH/VL-кроссоверную молекулу Fab). Вторая и третья молекулы Fab могут быть слиты с Fc-доменом напрямую или посредством пептидного линкера. В конкретном варианте осуществления каждая из второй и третьей молекул Fab слита с Fc-доменом посредством шарнирной области иммуноглобулина. В конкретном варианте осуществления шарнирная область иммуноглобулина представляет собой шарнирную область IgG₁ человека, в частности, когда Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG₁. Необязательно, легкая цепь Fab первой молекулы Fab и легкая цепь Fab второй молекулы Fab могут быть дополнительно слиты друг с другом.

В другом таком варианте осуществления каждый из первого и третьего антигенсвязывающих фрагментов слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена, а второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента. В конкретном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула состоит преимущественно из первой, второй и третьей молекул Fab, Fc-домена, состоящего из первой и второй субъединиц, и, необязательно, одного или более пептидных линкеров, причем вторая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первой молекулы Fab, первая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой субъединицы Fc-домена, а третья молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом второй субъединицы Fc-домена. Такая конфигурация схематически изображена на Фиг. 1В и 1Е (в этих примерах второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой VH/VL-кроссоверную молекулу Fab, а первый и третий антигенсвязывающие фрагменты представляют собой стандартную молекулу Fab) и на Фиг. 1К и 1П (в этих примерах второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой стандартную молекулу Fab, а первый и третий антигенсвязывающие фрагменты представляют собой VH/VL-кроссоверную молекулу Fab). Первая и третья молекулы Fab могут быть слиты с Fc-доменом напрямую или посредством пептидного линкера. В конкретном варианте осуществления каждая из первой и третьей молекул Fab слита с Fc-доменом посредством шарнирной области иммуноглобулина. В конкретном варианте осуществления шарнирная область иммуноглобулина представляет собой шарнирную область IgG₁ человека, в частности, когда Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG₁. Необязательно, легкая цепь Fab первой молекулы Fab и легкая цепь Fab второй молекулы Fab могут быть дополнительно слиты друг с другом.

В конфигурациях биспецифической антигенсвязывающей молекулы, в которых молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом каждой из субъединиц Fc-домена посредством шарнирных областей иммуноглобулина, две молекулы Fab, шарнирные области и Fc-домен преимущественно образуют молекулу иммуноглобулина. В конкретном варианте осуществления молекула иммуноглобулина представляет собой иммуноглобулин класса IgG. В еще более конкретном варианте осуществления иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин подкласса IgG₁. В другом варианте осуществления иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин подкласса IgG₄. В дополнительном конкретном варианте осуществления иммуноглобулин представляет собой иммуноглобулин человека. В других вариантах осуществления иммуноглобулин представляет собой химерный иммуноглобулин или гуманизированный иммуноглобулин. В одном варианте осуществления иммуноглобулин содержит человеческую константную область, в частности, человеческую Fc-область.

В некоторых из биспецифических антигенсвязывающих молекул по изобретению легкая цепь Fab первой молекулы Fab и легкая цепь Fab второй молекулы Fab слиты друг с другом, необязательно, посредством пептидного линкера. В зависимости от конфигурации первой и второй молекул Fab, легкая цепь Fab первой молекулы Fab может быть слита на С-конце с N-концом легкой цепи Fab второй молекулы Fab или легкая цепь Fab второй молекулы Fab может быть слита на С-конце с N-концом легкой цепи Fab первой молекулы Fab. Слияние легких цепей Fab первой и второй молекул Fab дополнительно уменьшает неправильное спаривание несовпадающих тяжелых и легких цепей Fab и также уменьшает число плазмид, необходимое для экспрессии некоторых из биспецифических антигенсвязывающих молекул по изобретению.

Антигенсвязывающие фрагменты могут быть слиты с Fc-доменом или друг с другом напрямую или посредством пептидного линкера, содержащего одну или более аминокислот, как правило, около 2-20 аминокислот. Пептидные линкеры известны в данной области техники и описаны в данном документе. Подходящие неиммуногенные пептидные линкеры включают, например, пептидные линкеры (G₄S)_n, (SG₄)_n, (G₄S)_n или G₄(SG₄)_n. «n» в общем случае является целым числом от 1 до 10, как правило, от 2 до 4. В одном варианте осуществления указанный пептидный линкер имеет длину по меньшей мере 5 аминокислот, в одном варианте осуществления - длину от 5 до 100, в дополнительном варианте осуществления - от 10 до 50 аминокислот. В одном варианте осуществления указанный пептидный линкер представляет собой (GxS)_n или (GxS)_nG_m, где G = глицин, S = серии, а (х=3, n=3, 4, 5 или 6 и m=0, 1, 2 или 3) или (х=4, n=2, 3, 4 или 5 и m=0, 1, 2 или 3), в одном варианте осуществления x=4 и n=2 или 3, в дополнительном варианте осуществления x=4 и n=2. В одном варианте осуществления указанный пептидный линкер представляет собой (G₄S)₂. В особенности подходящим пептидным линкером для слияния легких цепей Fab первой и второй молекул Fab друг с другом является (G₄S)₂. Типовой пептидный линкер, подходящий для соединения тяжелых цепей Fab первого и второго Fab-фрагментов, содержит последовательность (D)-(G₄S)₂ (SEQ ID NO 43 и 44). Другой такой подходящий линкер содержит последовательность (G₄S)₄. Дополнительно линкеры могут содержать шарнирную область иммуноглобулина (или ее часть). В частности, если молекула Fab слита с N-концом субъединицы Fc-домена, она может быть слита посредством шарнирной области иммуноглобулина или ее части с дополнительным пептидным линкером или без него.

В определенных вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула в соответствии с изобретением содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab содержит кроссоверную тяжелую цепь Fab, в которой вариабельная область тяжелой цепи замещена вариабельной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с субъединицей Fc-домена (VL₍₂₎-СН1₍₂₎-СН2-СН3(-СН4)), и полипептид, в котором тяжелая цепь Fab первой молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с субъединицей Fc-домена (VH₍₁₎-CH1₍₁₎-CH2-CH3(-CH4)). В некоторых вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab (VH₍₂₎-CL₍₂₎), и полипептид легкой цепи Fab первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎). В определенных вариантах осуществления полипептиды ковалентно связаны, например, дисульфидной связью.

В определенных вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула в соответствии с изобретением содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab содержит кроссоверную тяжелую цепь Fab, в которой константная область тяжелой цепи замещена константной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с субъединицей Fc-домена (VH₍₂₎-CL₍₂₎-CH2-CH3(-CH4)), и полипептид, в котором тяжелая цепь Fab первой молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с субъединицей Fc-домена (VH₍₁₎-CH1₍₁₎-CH2-CH3(-CH4)). В некоторых вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab (VL₍₂₎-CH1₍₂₎), и полипептид легкой цепи Fab первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎). В определенных вариантах осуществления полипептиды ковалентно связаны, например, дисульфидной связью.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab содержит кроссоверную тяжелую цепь Fab, в которой вариабельная область тяжелой цепи замещена вариабельной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью Fab первой молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с субъединицей Fc-домена (VL₍₂₎-CH1₍₂₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎-CH2-CH3(-CH4)). В других вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит полипептид, в котором тяжелая цепь Fab первой молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab содержит кроссоверную тяжелую цепь Fab, в которой вариабельная область тяжелой цепи замещена вариабельной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с субъединицей Fc-домена (VH₍₁₎-CH1₍₁₎-VL₍₂₎-CH1₍₂₎-CH2-СН3(-СН4)).

В некоторых из этих вариантов осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид кроссоверной легкой цепи Fab второй молекулы Fab, в котором вариабельная область тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab (VH₍₂₎-CL₍₂₎), и полипептид легкой цепи Fab первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎). В других вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с полипептидом легкой цепи Fab первой молекулы Fab (VH₍₂₎-CL₍₂₎-VL₍₁₎-CL₍₁₎), или полипептид, в котором полипептид легкой цепи Fab первой молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎-VH₍₂₎-CL₍₂₎), в зависимости от ситуации.

Биспецифическая антигенсвязывающая молекула в соответствии с этими вариантами осуществления может дополнительно содержать (i) полипептид субъединицы Fc-домена (СН2-СН3(-СН4)) или (ii) полипептид, в котором тяжелая цепь Fab третьей молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с субъединицей Fc-домена (VH₍₃₎-CH1₍₃₎-CH2-CH3(-CH4)), и полипептид легкой цепи Fab третьей молекулы Fab (VL₍₃₎-CL₍₃₎). В определенных вариантах осуществления полипептиды ковалентно связаны, например, дисульфидной связью.

В некоторых вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab содержит кроссоверную тяжелую цепь Fab, в которой константная область тяжелой цепи замещена константной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью Fab первой молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с субъединицей Fc-домена (VH₍₂₎-CL₍₂₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎-CH2-CH3(-CH4)). В других вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит полипептид, в котором тяжелая цепь Fab первой молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab содержит кроссоверную тяжелую цепь Fab, в которой константная область тяжелой цепи замещена константной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с субъединицей Fc-домена (VH₍₁₎-CH1₍₁₎-VH₍₂₎-CL₍₂₎-СН2-СН3(-СН4)).

В некоторых из этих вариантов осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид кроссоверной легкой цепи Fab второй молекулы Fab, в котором вариабельная область легкой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab (VL₍₂₎-CH1₍₂₎), и полипептид легкой цепи Fab первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎). В других вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с полипептидом легкой цепи Fab первой молекулы Fab (VL₍₂₎-CH1₍₂₎-VL₍₁₎-CL₍₁₎), или полипептид, в котором полипептид легкой цепи Fab первой молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎-VL₍₂₎-CH1₍₂₎), в зависимости от ситуации.

Биспецифическая антигенсвязывающая молекула в соответствии с этими вариантами осуществления может дополнительно содержать (i) полипептид субъединицы Fc-домена (СН2-СН3(-СН4)) или (ii) полипептид, в котором тяжелая цепь Fab третьей молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с субъединицей Fc-домена (VH₍₃₎-CH1₍₃₎-CH2-CH3(-CH4)), и полипептид легкой цепи Fab третьей молекулы Fab (VL₍₃₎-CL₍₃₎). В определенных вариантах осуществления полипептиды ковалентно связаны, например, дисульфидной связью.

В определенных вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула не содержит Fc-домен. В таких конкретных вариантах осуществления каждая из указанных первой и, в случае наличия, третьей молекул Fab представляет собой стандартную молекулу Fab, а вторая молекула Fab представляет собой кроссоверную молекулу Fab, описанную в данном документе, т.е. молекулу Fab, в которой вариабельные домены VH и VL или константные домены CL и СН1 тяжелой и легкой цепей Fab заменены/замещены друг другом. В других таких вариантах осуществления каждая из указанных первой и, в случае наличия, третьей молекул Fab представляет собой кроссоверную молекулу Fab, а вторая молекула Fab представляет собой стандартную молекулу Fab.

В другом таком варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула преимущественно состоит из первого и второго антигенсвязывающих фрагментов и, необязательно, одного или более пептидных линкеров, причем первый и второй антигенсвязывающие фрагменты, оба, представляют собой молекулы Fab, а первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента. Такая конфигурация схематически изображена на Фиг. 1С и 1X (в этих примерах второй антигенсвязывающий домен представляет собой VH/VL-кроссоверную молекулу Fab, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой стандартную молекулу Fab).

В другом таком варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула преимущественно состоит из первого и второго антигенсвязывающих фрагментов и, необязательно, одного или более пептидных линкеров, причем первый и второй антигенсвязывающие фрагменты, оба, представляют собой молекулы Fab, а второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента. Такая конфигурация схематически изображена на Фиг. 1Т и 1Ц (в этих примерах второй антигенсвязывающий домен представляет собой VH/VL-кроссоверную молекулу Fab, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой стандартную молекулу Fab).

В некоторых вариантах осуществления первая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab, а биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит третий антигенсвязывающий фрагмент, в частности третью молекулу Fab, причем указанная третья молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первой молекулы Fab. В определенных таких вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула состоит преимущественно из первой, второй и третьей молекул Fab и, необязательно, одного или более пептидных линкеров, причем первая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab, а третья молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первой молекулы Fab. Такая конфигурация схематически изображена на Фиг. 1У и 1Ч (в этих примерах второй антигенсвязывающий домен представляет собой VH/VL-кроссоверную молекулу Fab, а каждый из первого и третьего антигенсвязывающих фрагментов представляет собой стандартную молекулу Fab) или Фиг. 1Ю и 1АА (в этих примерах второй антигенсвязывающий домен представляет собой стандартную молекулу Fab, а каждый из первого и третьего антигенсвязывающих фрагментов представляет собой VH/VL-кроссоверную молекулу Fab).

В некоторых вариантах осуществления вторая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первой молекулы Fab, а биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит третий антигенсвязывающий фрагмент, в частности третью молекулу Fab, причем указанная третья молекула Fab слита на N-конце тяжелой цепи Fab с С-концом тяжелой цепи Fab первой молекулы Fab. В определенных таких вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула состоит преимущественно из первой, второй и третьей молекул Fab и, необязательно, одного или более пептидных линкеров, причем вторая молекула Fab слита на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первой молекулы Fab, а третья молекула Fab слита на N-конце тяжелой цепи Fab с С-концом тяжелой цепи Fab первой молекулы Fab. Такая конфигурация схематически изображена на Фиг. 1Ф и 1Ш (в этих примерах второй антигенсвязывающий домен представляет собой VH/VL-кроссоверную молекулу Fab, а каждый из первого и третьего антигенсвязывающих фрагментов представляет собой стандартную молекулу Fab) или Фиг. 1Щ и 1Я (в этих примерах второй антигенсвязывающий домен представляет собой стандартную молекулу Fab, а каждый из первого и третьего антигенсвязывающих фрагментов представляет собой VH/VL-кроссоверную молекулу Fab).

В определенных вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула в соответствии с изобретением содержит полипептид, в котором тяжелая цепь Fab первой молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab содержит кроссоверную тяжелую цепь Fab, в которой вариабельная область тяжелой цепи замещена вариабельной областью легкой цепи) (VH₍₁₎-CH1₍₁₎-VL₍₂₎-CH1₍₂₎). В некоторых вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab (VH₍₂₎-CL₍₂₎), и полипептид легкой цепи Fab первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎).

В определенных вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула в соответствии с изобретением содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab содержит кроссоверную тяжелую цепь Fab, в которой вариабельная область тяжелой цепи замещена вариабельной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью Fab первой молекулы Fab (VL₍₂₎-CH1₍₂₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎). В некоторых вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab (VH₍₂₎-CL₍₂₎), и полипептид легкой цепи Fab первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎).

В определенных вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула в соответствии с изобретением содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab содержит кроссоверную тяжелую цепь Fab, в которой константная область тяжелой цепи замещена константной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью Fab первой молекулы Fab (VH₍₂₎-CL₍₂₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎). В некоторых вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab (VL₍₂₎-CH1₍₂₎), и полипептид легкой цепи Fab первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎).

В определенных вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула в соответствии с изобретением содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab содержит кроссоверную тяжелую цепь Fab, в которой вариабельная область тяжелой цепи замещена вариабельной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью Fab первой молекулы Fab (VL₍₂₎-CH1₍₂₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎). В некоторых вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab (VH₍₂₎-CL₍₂₎), и полипептид легкой цепи Fab первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎).

В определенных вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула в соответствии с изобретением содержит полипептид, в котором тяжелая цепь Fab третьей молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью Fab первой молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab содержит кроссоверную тяжелую цепь Fab, в которой вариабельная область тяжелой цепи замещена вариабельной областью легкой цепи) (VH₍₃₎-CH1₍₃₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎-VL₍₂₎-CH1₍₂₎). В некоторых вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab (VH₍₂₎-CL₍₂₎), и полипептид легкой цепи Fab первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎). В некоторых вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид легкой цепи Fab третьей молекулы Fab (VL₍₃₎-CL₍₃₎).

В определенных вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула в соответствии с изобретением содержит полипептид, в котором тяжелая цепь Fab третьей молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью Fab первой молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab содержит кроссоверную тяжелую цепь Fab, в которой константная область тяжелой цепи замещена константной областью легкой цепи) (VH₍₃₎-CH1₍₃₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎-VH₍₂₎-CL₍₂₎). В некоторых вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab (VL₍₂₎-CH1₍₂₎), и полипептид легкой цепи Fab первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎). В некоторых вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид легкой цепи Fab третьей молекулы Fab (VL₍₃₎-CL₍₃₎).

В определенных вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула в соответствии с изобретением содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab содержит кроссоверную тяжелую цепь Fab, в которой вариабельная область тяжелой цепи замещена вариабельной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью Fab первой молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью Fab третьей молекулы Fab (VL₍₂₎-CH1₍₂₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎-VH₍₃₎-CH1₍₃₎). В некоторых вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab (VH₍₂₎-CL₍₂₎), и полипептид легкой цепи Fab первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎). В некоторых вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид легкой цепи Fab третьей молекулы Fab (VL₍₃₎-CL₍₃₎).

В определенных вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула в соответствии с изобретением содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab второй молекулы Fab (т.е. вторая молекула Fab содержит кроссоверную тяжелую цепь Fab, в которой константная область тяжелой цепи замещена константной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью Fab первой молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью Fab третьей молекулы Fab (VH₍₂₎-CL₍₂₎-VH₍₁₎-CH1₍₁₎-VH₍₃₎-CH1₍₃₎). В некоторых вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab второй молекулы Fab (VL₍₂₎-CH1₍₂₎), и полипептид легкой цепи Fab первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CL₍₁₎). В некоторых вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид легкой цепи Fab третьей молекулы Fab (VL₍₃₎-CL₍₃₎).

В определенных вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула в соответствии с изобретением содержит полипептид, в котором тяжелая цепь Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью легкой цепи Fab первой молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab первой молекулы Fab (т.е. первая молекула Fab содержит кроссоверную тяжелую цепь Fab, в которой вариабельная область тяжелой цепи замещена вариабельной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью легкой цепи Fab третьей молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab третьей молекулы Fab (т.е. третья молекула Fab содержит кроссоверную тяжелую цепь Fab, в которой вариабельная область тяжелой цепи замещена вариабельной областью легкой цепи) (VH₍₂₎-CH1₍₂₎-VL₍₁₎-CH1₍₁₎-VL₍₃₎-CH1₍₃₎). В некоторых вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи Fab первой молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab первой молекулы Fab (VH₍₁₎-CL₍₁₎), и полипептид легкой цепи Fab второй молекулы Fab (VL₍₂₎-CL₍₂₎). В некоторых вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи Fab третьей молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab третьей молекулы Fab (VH₍₃₎-CL₍₃₎).

В определенных вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула в соответствии с изобретением содержит полипептид, в котором тяжелая цепь Fab второй молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью тяжелой цепи Fab первой молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab первой молекулы Fab (т.е. первая молекула Fab содержит кроссоверную тяжелую цепь Fab, в которой константная область тяжелой цепи замещена константной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью тяжелой цепи Fab третьей молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab третьей молекулы Fab (т.е. третья молекула Fab содержит кроссоверную тяжелую цепь Fab, в которой константная область тяжелой цепи замещена константной областью легкой цепи) (VH₍₂₎-CH1₍₂₎-VH₍₁₎-CL₍₁₎-VH₍₃₎-CL₍₃₎). В некоторых вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи Fab первой молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CH1₍₁₎), и полипептид легкой цепи Fab второй молекулы Fab (VL₍₂₎-CL₍₂₎). В некоторых вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи Fab третьей молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab третьей молекулы Fab (VL₍₃₎-CH1₍₃₎).

В определенных вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула в соответствии с изобретением содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи Fab третьей молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab третьей молекулы Fab (т.е. третья молекула Fab содержит кроссоверную тяжелую цепь Fab, в которой вариабельная область тяжелой цепи замещена вариабельной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью легкой цепи Fab первой молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab первой молекулы Fab (т.е. первая молекула Fab содержит кроссоверную тяжелую цепь Fab, в которой вариабельная область тяжелой цепи замещена вариабельной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью Fab второй молекулы Fab (VL₍₃₎-CH1₍₃₎-VL₍₁₎-CH1₍₁₎-VH₍₂₎-CH1₍₂₎). В некоторых вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи Fab первой молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab первой молекулы Fab (VH₍₁₎-CL₍₁₎), и полипептид легкой цепи Fab второй молекулы Fab (VL₍₂₎-CL₍₂₎). В некоторых вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи Fab третьей молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab третьей молекулы Fab (VH₍₃₎-CL₍₃₎).

В определенных вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула в соответствии с изобретением содержит полипептид, в котором вариабельная область тяжелой цепи Fab третьей молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab третьей молекулы Fab (т.е. третья молекула Fab содержит кроссоверную тяжелую цепь Fab, в которой константная область тяжелой цепи замещена константной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с вариабельной областью тяжелой цепи Fab первой молекулы Fab, которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью легкой цепи Fab первой молекулы Fab (т.е. первая молекула Fab содержит кроссоверную тяжелую цепь Fab, в которой константная область тяжелой цепи замещена константной областью легкой цепи), которая в свою очередь имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с тяжелой цепью Fab второй молекулы Fab (VH₍₃₎-CL₍₃₎-VH₍₁₎-CL₍₁₎-VH₍₂₎-CH1₍₂₎). В некоторых вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи Fab первой молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab первой молекулы Fab (VL₍₁₎-CH1₍₁₎), и полипептид легкой цепи Fab второй молекулы Fab (VL₍₂₎-CL₍₂₎). В некоторых вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула дополнительно содержит полипептид, в котором вариабельная область легкой цепи Fab третьей молекулы Fab имеет общую карбокси-концевую пептидную связь с константной областью тяжелой цепи Fab третьей молекулы Fab (VL₍₃₎-CH1₍₃₎).

В конкретном варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 83, HCDR 2 с SEQ ID NO: 84 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 87, LCDR 2 с SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 89; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и является идентичным первому антигенсвязывающему фрагменту; и г) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем (i) первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а каждый из второго антигенсвязывающего фрагмента по б) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г), или (ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по а), а каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г).

В конкретном варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 83, HCDR 2 с SEQ ID NO: 85 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 87, LCDR 2 с SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 89; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и является идентичным первому антигенсвязывающему фрагменту; и г) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем (i) первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а каждый из второго антигенсвязывающего фрагмента по б) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г), или (ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по а), а каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г).

В конкретном варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и является идентичным первому антигенсвязывающему фрагменту; и г) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем (i) первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а каждый из второго антигенсвязывающего фрагмента по б) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г), или (ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по а), а каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г).

В конкретном варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 96 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и является идентичным первому антигенсвязывающему фрагменту; и г) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем (i) первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а каждый из второго антигенсвязывающего фрагмента по б) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г), или (ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по а), а каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г).

В конкретном варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 92 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и является идентичным первому антигенсвязывающему фрагменту; и г) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем (i) первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а каждый из второго антигенсвязывающего фрагмента по б) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г), или (ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по а), а каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г).

В конкретном варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 1, HCDR 2 с SEQ ID NO: 2 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 4, LCDR 2 с SEQ ID NO: 5 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 6; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и является идентичным первому антигенсвязывающему фрагменту; и г) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем (i) первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а каждый из второго антигенсвязывающего фрагмента по б) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г), или (ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по а), а каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г).

В конкретном варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 7, HCDR 2 с SEQ ID NO: 8 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 10, LCDR 2 с SEQ ID NO: 11 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 12; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и является идентичным первому антигенсвязывающему фрагменту; и г) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем (i) первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а каждый из второго антигенсвязывающего фрагмента по б) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г), или (ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по а), а каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г).

В другом варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 83, HCDR 2 с SEQ ID NO: 84 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 87, LCDR 2 с SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 89; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем (i) каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и второго антигенсвязывающего фрагмента по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В другом варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 83, HCDR 2 с SEQ ID NO: 85 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 87, LCDR 2 с SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 89; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем (i) каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и второго антигенсвязывающего фрагмента по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В другом варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем (i) каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и второго антигенсвязывающего фрагмента по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В другом варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 96 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем (i) каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и второго антигенсвязывающего фрагмента по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В другом варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 92 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем (i) каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и второго антигенсвязывающего фрагмента по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В другом варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая

а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 1, HCDR 2 с SEQ ID NO: 2 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 4, LCDR 2 с SEQ ID NO: 5 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 6; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем

(i) каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и второго антигенсвязывающего фрагмента по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В другом варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 7, HCDR 2 с SEQ ID NO: 8 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 10, LCDR 2 с SEQ ID NO: 11 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 12; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем (i) каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и второго антигенсвязывающего фрагмента по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

Во всех из разных конфигураций биспецифической антигенсвязывающей молекулы в соответствии с изобретением описанные в данном документе аминокислотные замены, в случае наличия, могут находиться в доменах СН1 и CL первого и (в случае наличия) третьего антигенсвязывающего фрагмента/молекулы Fab, или в доменах СН1 и CL второго антигенсвязывающего фрагмента/молекулы Fab. Предпочтительно они находятся в доменах СН1 и CL первого и (в случае наличия) третьего антигенсвязывающего фрагмента/молекулы Fab. В соответствии с концепцией изобретения, если описанные в данном документе аминокислотные замены проводят в первом (и, в случае наличия, третьем) антигенсвязывающем фрагменте/молекуле Fab, во втором антигенсвязывающем фрагменте/молекуле Fab такие аминокислотные замены не проводят.И наоборот, если описанные в данном документе аминокислотные замены проводят во втором антигенсвязывающем фрагменте/молекуле Fab, в первом (и, в случае наличия, третьем) антигенсвязывающем фрагменте/молекуле Fab такие аминокислотные замены не проводят.Аминокислотные замены, в частности, проводят в биспецифических антигенсвязывающих молекулах, содержащих молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH1 легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом.

В конкретных вариантах осуществления биспецифической антигенсвязывающей молекулы в соответствии с изобретением, в частности, в которых описанные в данном документе аминокислотные замены проводят в первом (и, в случае наличия, третьем) антигенсвязывающем фрагменте/молекуле Fab, константный домен CL первой (и, в случае наличия, третьей) молекулы Fab принадлежит к изотипу каппа. В других вариантах осуществления биспецифической антигенсвязывающей молекулы в соответствии с изобретением, в частности, в которых описанные в данном документе аминокислотные замены проводят во втором антигенсвязывающем фрагменте/молекуле Fab, константный домен CL второго антигенсвязывающего фрагмента/молекулы Fab принадлежит к изотипу каппа. В некоторых вариантах осуществления константный домен CL первого (и, в случае наличия, третьего) антигенсвязывающего фрагмента/молекулы Fab и константный домен CL второго антигенсвязывающего фрагмента/молекулы Fab принадлежат к изотипу каппа.

В одном варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 83, HCDR 2 с SEQ ID NO: 84 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 86; и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 87, LCDR 2 с SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 89; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и причем (i) первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в), или (ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по а), а первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В одном варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 83, HCDR 2 с SEQ ID NO: 85 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 87, LCDR 2 с SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 89; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и причем (i) первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в), или (ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по а), а первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В одном варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и причем (i) первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в), или (ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по а), а первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В одном варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 96 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и причем (i) первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в), или (ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по а), а первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В одном варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 92 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и причем (i) первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в), или (ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по а), а первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В одном варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 1, HCDR 2 с SEQ ID NO: 2 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 4, LCDR 2 с SEQ ID NO: 5 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 6; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и причем (i) первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в), или (ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по а), а первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В одном варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 7, HCDR 2 с SEQ ID NO: 8 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 10, LCDR 2 с SEQ ID NO: 11 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 12; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и причем (i) первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в), или (ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по а), а первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В конкретном варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 83, HCDR 2 с SEQ ID NO: 84 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 87, LCDR 2 с SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 89; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и является идентичным первому антигенсвязывающему фрагменту; и г) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и причем (i) первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а каждый из второго антигенсвязывающего фрагмента по б) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г), или (ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по а), а каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г).

В конкретном варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 83, HCDR 2 с SEQ ID NO: 85 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 87, LCDR 2 с SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 89; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и является идентичным первому антигенсвязывающему фрагменту; и г) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и причем (i) первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а каждый из второго антигенсвязывающего фрагмента по б) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г), или (ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по а), а каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г).

В конкретном варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и является идентичным первому антигенсвязывающему фрагменту; и г) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и причем (i) первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а каждый из второго антигенсвязывающего фрагмента по б) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г), или (ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по а), а каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г).

В конкретном варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 96 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и является идентичным первому антигенсвязывающему фрагменту; и г) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и причем (i) первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а каждый из второго антигенсвязывающего фрагмента по б) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г), или (ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по а), а каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г).

В конкретном варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 92 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и является идентичным первому антигенсвязывающему фрагменту; и г) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и причем (i) первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а каждый из второго антигенсвязывающего фрагмента по б) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г), или (ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по а), а каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г).

В конкретном варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 1, HCDR 2 с SEQ ID NO: 2 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 4, LCDR 2 с SEQ ID NO: 5 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 6; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и является идентичным первому антигенсвязывающему фрагменту; и г) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и причем (i) первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а каждый из второго антигенсвязывающего фрагмента по б) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г), или (ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по а), а каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г).

В конкретном варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 7, HCDR 2 с SEQ ID NO: 8 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 10, LCDR 2 с SEQ ID NO: 11 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 12; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) третий антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном и является идентичным первому антигенсвязывающему фрагменту; и г) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и причем (i) первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а каждый из второго антигенсвязывающего фрагмента по б) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г), или (ii) второй антигенсвязывающий фрагмент по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента по а), а каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по в) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по г).

В другом варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 83, HCDR 2 с SEQ ID NO: 84 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 87, LCDR 2 с SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 89; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и причем каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и второго антигенсвязывающего фрагмента по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В другом варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 83, HCDR 2 с SEQ ID NO: 85 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 87, LCDR 2 с SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 89; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и причем каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и второго антигенсвязывающего фрагмента по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В другом варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и причем каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и второго антигенсвязывающего фрагмента по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В другом варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 91 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 96 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и причем каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и второго антигенсвязывающего фрагмента по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В другом варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 90, HCDR 2 с SEQ ID NO: 92 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 93, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 94, LCDR 2 с SEQ ID NO: 95 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 97; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и причем каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и второго антигенсвязывающего фрагмента по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В другом варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 1, HCDR 2 с SEQ ID NO: 2 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 3, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 4, LCDR 2 с SEQ ID NO: 5 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 6; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 124 замещена и лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и причем каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и второго антигенсвязывающего фрагмента по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В другом варианте осуществления в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 7, HCDR 2 с SEQ ID NO: 8 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 9, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 10, LCDR 2 с SEQ ID NO: 11 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 12; б) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, и при этом молекула Fab содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и причем каждый из первого антигенсвязывающего фрагмента по а) и второго антигенсвязывающего фрагмента по б) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В соответствии с любым из вышеприведенных вариантов осуществления компоненты биспецифической антигенсвязывающей молекулы (например, молекулы Fab, Fc-домен) могут быть слиты напрямую или посредством различных линкеров, в частности пептидных линкеров, содержащих одну или более аминокислот, как правило, около 2-20 аминокислот, которые описаны в данном документе или известны в данной области техники. Подходящие неиммуногенные пептидные линкеры включают, например, пептидные линкеры (G₄S)_n, (SG₄)_n, (G₄S)_n или G₄(SG₄)_n, где n в общем случае является целым числом от 1 до 10, как правило, от 2 до 4.

В конкретном аспекте в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый и третий антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с первым антигеном; причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а каждый из первого и второго антигенсвязывающих фрагментов представляет собой (стандартную) молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; b) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном; причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого и третьего антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого и третьего антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и при этом дополнительно первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а каждый из второго антигенсвязывающего фрагмента по б) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В конкретном аспекте в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый и третий антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с первым антигеном; причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а каждый из первого и второго антигенсвязывающих фрагментов представляет собой (стандартную) молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16; b) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном; причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого и третьего антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого и третьего антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и при этом дополнительно первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а каждый из второго антигенсвязывающего фрагмента по б) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В конкретном аспекте в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый и третий антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с первым антигеном; причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а каждый из первого и второго антигенсвязывающих фрагментов представляет собой (стандартную) молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 57, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64; b) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном; причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 105; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого и третьего антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого и третьего антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и при этом дополнительно первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а каждый из второго антигенсвязывающего фрагмента по б) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В конкретном аспекте в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый и третий антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с первым антигеном; причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а каждый из первого и второго антигенсвязывающих фрагментов представляет собой (стандартную) молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63; b) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном; причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 105; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого и третьего антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого и третьего антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и при этом дополнительно первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а каждый из второго антигенсвязывающего фрагмента по б) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В конкретном аспекте в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый и третий антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с первым антигеном; причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а каждый из первого и второго антигенсвязывающих фрагментов представляет собой (стандартную) молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 53; b) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном; причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 105; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого и третьего антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого и третьего антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и при этом дополнительно первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а каждый из второго антигенсвязывающего фрагмента по б) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В конкретном аспекте в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый и третий антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с первым антигеном; причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а каждый из первого и второго антигенсвязывающих фрагментов представляет собой (стандартную) молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 49, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 52; b) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном; причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 105; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого и третьего антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого и третьего антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и при этом дополнительно первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а каждый из второго антигенсвязывающего фрагмента по б) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В конкретном аспекте в изобретении предложена биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая а) первый и третий антигенсвязывающие фрагменты, которые связываются с первым антигеном; причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а каждый из первого и второго антигенсвязывающих фрагментов представляет собой (стандартную) молекулу Fab, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 58, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63; b) второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном; причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, в которой вариабельные домены VL и VH легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом, содержащую вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 104, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 105; в) Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц; причем в константном домене CL первого и третьего антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 124 замещена лизином (K) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 замещена лизином (K) или аргинином (R) (нумерация в соответствии с Kabat) (конкретнее, аргинином (R)), и причем в константном домене СН1 первого и третьего антигенсвязывающего фрагмента по а) аминокислота в позиции 147 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 замещена глутаминовой кислотой (Е) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat); и при этом дополнительно первый антигенсвязывающий фрагмент по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента по б), а каждый из второго антигенсвязывающего фрагмента по б) и третьего антигенсвязывающего фрагмента по а) слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом одной из субъединиц Fc-домена по в).

В одном варианте осуществления в соответствии с этим аспектом изобретения в первой субъединице Fc-домена остаток треонина в позиции 366 замещен остатком триптофана (T366W), а во второй субъединице Fc-домена остаток тирозина в позиции 407 замещен остатком валина (Y407V) и, необязательно, остаток треонина в позиции 366 замещен остатком серина (T366S), а остаток лейцина в позиции 368 замещен остатком аланина (L368A) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В дополнительном варианте осуществления в соответствии с этим аспектом изобретения в первой субъединице Fc-домена дополнительно остаток серина в позиции 354 замещен остатком цистеина (S354C) или остаток глутаминовой кислоты в позиции 356 замещен остатком цистеина (Е356С) (в частности остаток серина в позиции 354 замещен остатком цистеина), а во второй субъединице Fc-домена дополнительно остаток тирозина в позиции 349 замещен остатком цистеина (Y349C) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В дополнительном варианте осуществления в соответствии с этим аспектом изобретения в каждой из первой и второй субъединиц Fc-домена остаток лейцина в позиции 234 замещен остатком аланина (L234A), остаток лейцина в позиции 235 замещен остатком аланина (L235A) и остаток пролина в позиции 329 замещен остатком глицина (P329G) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В дополнительном варианте осуществления в соответствии с этим аспектом изобретения Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG₁ человека.

В конкретном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 17, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 18, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 19, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 20. В дополнительном конкретном варианте осуществления биспецифическая антиген связывающая молекула содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 17, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 18, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20.

В другом конкретном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 21, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 22, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 23, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 24. В дополнительном конкретном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.

В другом конкретном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 114, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 115, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 116, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 117. В дополнительном конкретном варианте осуществления биспецифическая антиген связывающая молекула содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 114, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 115, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 116, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 117.

В другом конкретном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 118, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 119, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 120, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 121. В дополнительном конкретном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 118, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 119, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 120, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 121.

В другом конкретном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 122, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 123, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 124, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 125. В дополнительном конкретном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 122, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 123, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125.

В другом конкретном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 126, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 127, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 128, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 129. В дополнительном конкретном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 126, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 129.

В другом конкретном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 130, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 131, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 132, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98% или 99% идентичной последовательности SEQ ID NO: 133. В дополнительном конкретном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 130, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 131, полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 132, и полипептид, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 133.

Fc-домен

В конкретных вариантах осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула по изобретению содержит Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц. Понятно, что характеристики Fc-домена, описанные в данном документе в связи с биспецифической антигенсвязывающей молекулой, можно в равно мере применять в отношении Fc-домена, содержащегося в антителе по изобретению.

Fc-домен биспецифической антигенсвязывающей молекулы состоит из пары полипептидных цепей, содержащих домены тяжелой цепи молекулы иммуноглобулина. Например, Fc-домен молекулы иммуноглобулина G (IgG) представляет собой димер, каждая субъединица которого содержит константные домены СН2 и СН3 тяжелой цепи IgG. Две субъединицы Fc-домена способны к стабильной ассоциации друг с другом. В одном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула по изобретению содержит не более одного Fc-домена.

В одном варианте осуществления Fc-домен биспецифической антигенсвязывающей молекулы представляет собой Fc-домен IgG. В конкретном варианте осуществления Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG₁. В другом варианте осуществления Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG₄. В более конкретном варианте осуществления Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG₄, содержащий аминокислотную замену в позиции S228 (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat), в частности аминокислотную замену S228P. Эта аминокислотная замена уменьшает in vivo обмен плеч Fab антител IgG₄ (смотрите Stubenrauch et al., Drug Metabolism and Disposition 38, 84-91 (2010)). В дополнительном конкретном варианте осуществления Fc-домен представляет собой Fc-домен человека. В более конкретном варианте осуществления Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG₁ человека. Типовая последовательность Fc-области IgG₁ человека приведена в SEQ ID NO: 42.

Модификации Fc-домена. способствующие гетеродимеризации

Биспецифические антигенсвязывающие молекулы в соответствии с изобретением содержат разные антигенсвязывающие фрагменты, которые могут быть слиты с одной или другой из двух субъединиц Fc-домена, таким образом, что две субъединицы Fc-домена, как правило, находятся в двух неидентичных полипептидных цепях. Рекомбинантная коэкспрессия этих полипептидов и последующая димеризация приводит к нескольким возможным комбинациям двух полипептидов. Таким образом, чтобы повысить выход и чистоту биспецифических антигенсвязывающих молекул при рекомбинантном получении, целесообразно внести в Fc-домен биспецифической антигенсвязывающей молекулы модификацию, способствующую ассоциации необходимых полипептидов.

Соответственно, в конкретных вариантах осуществления Fc-домен биспецифической антигенсвязывающей молекулы в соответствии с изобретением содержит модификацию, способствующую ассоциации первой и второй субъединиц Fc-домена. Сайтом наиболее активного белок-белкового взаимодействия между двумя субъединицами Fc-домена IgG человека является СН3-домен Fc-домена. Таким образом, в одном варианте осуществления указанная модификация находится в СН3-домене Fc-домена.

Существует несколько подходов для модификации в СН3-домене Fc-домена с целью стимуляции гетеродимеризации, которые хорошо описаны, например, в WO 96/27011, WO 98/050431, ЕР 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012058768, WO 2013157954, WO 2013096291. Как правило, во всех таких подходах СН3-домен первой субъединицы Fc-домена и СН3-домен второй субъединицы Fc-домена сконструированы комплементарным образом так, чтобы каждый СН3-домен (или содержащая его тяжелая цепь) больше не мог образовывать гомодимер сам с собой, но был бы вынужден образовывать гетеродимер с комплементарно сконструированным другим СН3-доменом (так, чтобы происходила гетеродимеризация первого и второго СН3-доменов и не происходило образование гомодимеров между двумя первыми или двумя вторыми СН3-доменами). Эти разные подходы для улучшения гетеродимеризации тяжелой цепи предусмотрены как разные альтернативные варианты в комбинации с модификациями тяжелой-легкой цепи (например, обмен/замена VH и VL в одном связывающем плече и внесение замен из заряженных аминокислот с противоположными зарядами в поверхность контакта CH1/CL) в биспецифической антигенсвязывающей молекуле, что снижает неправильное спаривание тяжелой/легкой цепи и количество побочных продуктов типа Бенс-Джонса.

В конкретном варианте осуществления указанные модификации, способствующие ассоциации первой и второй субъединиц Fc-домена, представляют собой так называемую модификацию типа «выступ-во-впадину», включающую модификацию «выступа» в одной из двух субъединиц Fc-домена и модификацию «впадины» в другой из двух субъединиц Fc-домена.

Технология «выступ-во-впадину» описана, например, в US 5731168; US 7695936; Ridgway et al., Prot Eng 9, 617-621 (1996) и Carter, J Immunol Meth 248, 7-15 (2001). В общем случае этот способ включает выпуклости («выступа») в контактную поверхность первого полипептида и соответствующей полости («впадины») в контактную поверхность второго полипептида, так что выпуклость может располагаться во полости так, чтобы стимулировать образование гетеродимера и затруднять образование гомодимера. Выпуклости конструируют путем замены небольших аминокислотных боковых цепей в контактной поверхности первого полипептида на более крупные боковые цепи (например тирозин или триптофан). Компенсаторные полости идентичного или сходного размера с выпуклостями создают в контактной поверхности второго полипептида путем замещения крупных аминокислотных боковых цепей меньшими (например, аланином или треонином).

Соответственно, в конкретном варианте осуществления в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена биспецифической антигенсвязывающей молекулы аминокислотный остаток замещен аминокислотным остатком, имеющим больший объем боковой цепи, с созданием, таким образом, выпуклости в СН3-домене первой субъединицы, которая может располагаться в полости в СН3-домене второй субъединицы, а в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена аминокислотный остаток замещен аминокислотным остатком, имеющим меньший объем боковой цепи, с созданием, таким образом, полости в СН3-домене второй субъединицы, в которой может располагаться выпуклость в СН3-домене первой субъединицы.

Предпочтительно указанный аминокислотный остаток, имеющий больший объем боковой цепи, выбран из группы, состоящей из аргинина (R), фенилаланина (F), тирозина (Y) и триптофана (W).

Предпочтительно указанный аминокислотный остаток, имеющий меньший объем боковой цепи, выбран из группы, состоящей из аланина (А), серина (S), треонина (Т) и валина (V).

Выпуклость и полость можно создавать путем изменения нуклеиновой кислоты, кодирующей полипептиды, например, с помощью сайт-специфического мутагенеза, или с помощью пептидного синтеза.

В конкретном варианте осуществления в (СН3-домене) первой субъединице Fc-домена (субъединице «выступа») остаток треонина в позиции 366 замещен остатком триптофана (T366W), а во (СН3-домене) второй субъединице Fc-домена (субъединице «впадины») остаток тирозина в позиции 407 замещен остатком валина (Y407V). В одном варианте осуществления во второй субъединице Fc-домена дополнительно остаток треонина в позиции 366 замещен остатком серина (T366S), а остаток лейцина в позиции 368 замещен остатком аланина (L368A) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В дополнительном варианте осуществления в первой субъединице Fc-домена дополнительно остаток серина в позиции 354 замещен остатком цистеина (S354C) или остаток глутаминовой кислоты в позиции 356 замещен остатком цистеина (Е356С) (в частности остаток серина в позиции 354 замещен остатком цистеина), а во второй субъединице Fc-домена дополнительно остаток тирозина в позиции 349 замещен остатком цистеина (Y349C) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). Внесение двух остатков цистеина приводит к образованию дисульфидного мостика между двумя субъединицами Fc-домена, дополнительно стабилизируя димер (Carter, J Immunol Methods 248, 7-15 (2001)).

В конкретном варианте осуществления первая субъединица Fc-домена содержит аминокислотные замены S354C и T366W, а вторая субъединица Fc домена содержит аминокислотные замены Y349C, T366S, L368A и Y407V (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В конкретном варианте осуществления антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном (например, активирующим Т-клеточным антигеном), слит (необязательно посредством первого антигенсвязывающего фрагмента, который связывается с GPRC5D, и/или пептидного линкера) с первой субъединицей Fc-домена (содержащей модификацию «выступа»). Не ограничиваясь теорией, слияние антигенсвязывающего фрагмента, который связывается со вторым антигеном, таким как активирующий Т-клеточный антиген, с содержащей выступ субъединицей Fc-домена будет (дополнительно) сводить к минимуму создание антигенсвязывающих молекул, содержащих два антигенсвязывающих фрагмента, которые связываются с активирующим Т-клеточным антигеном (вследствие стерического несоответствия двух содержащих выступ полипептидов).

Другие методики СН3-модификации для стимуляции гетеродимеризации предусмотрены как альтернативные варианты в соответствии с изобретением и описаны, например, в WO 96/27011, WO 98/050431, ЕР 1870459, WO 2007/110205, WO 2007/147901, WO 2009/089004, WO 2010/129304, WO 2011/90754, WO 2011/143545, WO 2012/058768, WO 2013/157954, WO 2013/096291.

В одном варианте осуществления в качестве альтернативы используют подход гетеродимеризации, описанный в ЕР 1870459. Этот подход основан на внесении заряженных аминокислот с противоположными зарядами в определенных аминокислотных позициях в поверхности контакта доменов СН3/СН3 между двумя субъединицами Fc-домена. Одним предпочтительным вариантом осуществления для биспецифической антигенсвязывающей молекулы по изобретению являются аминокислотные мутации R409D; K370E в одном из двух СН3-доменов (Fc-домена) и аминокислотные мутации D399K; E357K в другом из двух СН3-доменов Fc-домена (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В другом варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула по изобретению содержит аминокислотную мутацию T366W в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена и аминокислотные мутации T366S, L368A, Y407V в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена, и дополнительно аминокислотные мутации R409D; K370E в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена и аминокислотные мутации D399K; E357K в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В другом варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула по изобретению содержит аминокислотные мутации S354C, T366W в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена и аминокислотные мутации Y349C, T366S, L368A, Y407V в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена, или указанная биспецифическая антигенсвязывающая молекула содержит аминокислотные мутации Y349C, T366W в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена и аминокислотные мутации S354C, T366S, L368A, Y407V в СН3-доменах второй субъединицы Fc-домена и дополнительно аминокислотные мутации R409D; K370E в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена и аминокислотные мутации D399K; E357K в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена (вся нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В одном варианте осуществления в качестве альтернативы используют подход гетеродимеризации, описанный в WO 2013/157953. В одном варианте осуществления первый СН3-домен содержит аминокислотную мутацию T366K, а второй СН3-домен содержит аминокислотную мутацию L351D (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). В дополнительном варианте осуществления первый СН3-домен содержит дополнительную аминокислотную мутацию L351K. В дополнительном варианте осуществления второй СН3-домен содержит дополнительную аминокислотную мутацию, выбранную из Y349E, Y349D и L368E (в частности L368E) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В одном варианте осуществления в качестве альтернативы используют подход гетеродимеризации, описанный в WO 2012/058768. В одном варианте осуществления первый СН3-домен содержит аминокислотные мутации L351Y, Y407A, а второй СН3-домен содержит аминокислотные мутации Т366А, K409F. В дополнительном варианте осуществления второй СН3-домен содержит дополнительную аминокислотную мутацию в позиции Т411, D399, S400, F405, N390 или K392, например, выбранную из a) T411N, T411R, T411Q, T411K, T411D, Т411Е или T411W, б) D399R, D399W, D399Y или D399K, в) S400E, S400D, S400R или S400K, г) F405I, F405M, F405T, F405S, F405V или F405W, д) N390R, N390K или N390D, е) K392V, K392M, K392R, K392L, K392F или K392E (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). В дополнительном варианте осуществления первый СН3-домен содержит аминокислотные мутации L351Y, Y407A, а второй СН3-домен содержит аминокислотные мутации T366V, K409F. В дополнительном варианте осуществления первый СН3-домен содержит аминокислотную мутацию Y407A, а второй СН3-домен содержит аминокислотные мутации Т366А, K409F. В дополнительном варианте осуществления второй СН3-домен дополнительно содержит аминокислотные мутации K392E, Т411Е, D399R и S400R (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В одном варианте осуществления в качестве альтернативы используют подход гетеродимеризации, описанный в WO 2011/143545, например, с аминокислотной модификацией в позиции, выбранной из группы, состоящей из 368 и 409 (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В одном варианте осуществления в качестве альтернативы используют подход гетеродимеризации, описанный в WO 2011/090762, в котором также используется описанная выше технология «выступы-во впадины». В одном варианте осуществления первый СН3-домен содержит аминокислотную мутацию T366W, а второй СН3-домен содержит аминокислотную мутацию Y407A. В одном варианте осуществления первый СН3-домен содержит аминокислотную мутацию T366Y, а второй СН3-домен содержит аминокислотную мутацию Y407T (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В одном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула или ее Fc-домен относится к подклассу IgG₂, а в качестве альтернативы используют подход гетеродимеризации, описанный в WO 2010/129304.

В альтернативном варианте осуществления модификация, способствующая ассоциации первой и второй субъединиц Fc-домена, включает модификацию, которая опосредует эффекты электростатического взаимодействия, например, как описано в публикации РСТ WO 2009/089004. В общем случае этот способ включает замену одного или более аминокислотных остатков на поверхности контакта двух субъединиц Fc-домена заряженными аминокислотными остатками так, чтобы образование гомодимера становилось электростатически невыгодным, но гетеродимеризация была бы электростатический выгодной. В одном таком варианте осуществления первый СН3-домен содержит аминокислотную замену K392 или N392 отрицательно заряженной аминокислотой (например, глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D), предпочтительно K392D или N392D), а второй СН3-домен содержит аминокислотную замену D399, Е356, D356 или Е357 положительно заряженной аминокислотой (например, лизином (K) или аргинином (R), предпочтительно D399K, E356K, D356K или E357K, и более предпочтительно D399K и E356K). В дополнительном варианте осуществления первый СН3-домен дополнительно содержит аминокислотную замену K409 или R409 отрицательно заряженной аминокислотой (например, глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D), предпочтительно K409D или R409D). В дополнительном варианте осуществления первый СН3-домен дополнительно или в качестве альтернативы содержит аминокислотную замену K439 и/или K370 отрицательно заряженной аминокислотой (например, глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D)) (вся нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В дополнительном варианте осуществления в качестве альтернативы используют подход гетеродимеризации, описанный в WO 2007/147901. В одном варианте осуществления первый СН3-домен содержит аминокислотные мутации K253E, D282K и K322D, а второй СН3-домен содержит аминокислотные мутации D239K, E240K и K292D (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В другом варианте осуществления в качестве альтернативы можно использовать подход гетеродимеризации, описанный в WO 2007/110205.

В одном варианте осуществления первая субъединица Fc-домена содержит аминокислотные замены K392D и K409D, а вторая субъединица Fc-домена содержит аминокислотные замены D356K и D399K (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

Модификации Fc-домена, уменьшающие связывание Fc-рецептора и/или эффекторную функцию

Fc-домен придает биспецифической антигенсвязывающей молекуле (или антителу) благоприятные фармакокинетические свойства, включая продолжительное сывороточное время полужизни, которое способствует хорошему накоплению в целевой ткани и благоприятному соотношению распределения в тканях и крови. Однако в то же время он может приводить к нежелательному нацеливанию биспецифической антигенсвязывающей молекулы (или антитела) на клетки, экспрессирующие Fc-рецепторы, вместо предпочтительных несущих антиген клеток. Кроме того, коактивация путей сигнализации Fc-рецептора может приводить к высвобождению цитокинов, что, в комбинации со свойствами активации Т-клеток (например, в вариантах осуществления биспецифической антигенсвязывающей молекулы, в которых второй антигенсвязывающий фрагмент связывается с активирующим Т-клеточным антигеном) и длительным временем полужизни биспецифической антигенсвязывающей молекулы, приводит к избыточной активации цитокиновых рецепторов и тяжелым побочным эффектам при системном введении. Активация (несущих Fc-рецептор) иммунных клеток, отличных от Т-клеток, может даже уменьшить эффективность биспецифической антигенсвязывающей молекулы (в частности, биспецифической антигенсвязывающей молекулы, в которой второй антигенсвязывающий фрагмент связывается с активирующим Т-клеточным антигеном) вследствие потенциального разрушения Т-клеток, например, NK-клетками.

Соответственно, в конкретных вариантах осуществления Fc-домен биспецифической антигенсвязывающей молекулы в соответствии с изобретением демонстрирует уменьшенную аффинность связывания с Fc-рецептором и/или уменьшенную эффекторную функцию по сравнению с нативным Fc-доменом IgG₁. В одном таком варианте осуществления Fc-домен (или биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая указанный Fc-домен) демонстрирует менее 50%, предпочтительно менее 20%, более предпочтительно 10% и наиболее предпочтительно менее 5% аффинности связывания с Fc-рецептором по сравнению с нативным Fc-доменом IgG₁ (или биспецифической антигенсвязывающей молекулой, содержащей нативный Fc-домен IgG₁), и/или менее 50%, предпочтительно менее 20%, более предпочтительно менее 10% и наиболее предпочтительно менее 5% эффекторной функции по сравнению с нативным Fc-доменом IgG₁ (или биспецифической антигенсвязывающей молекулой, содержащей нативный Fc-домен IgG₁). В одном варианте осуществления Fc-домен (или биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая указанный Fc-домен) практически не связывается с Fc-рецептором и/или не индуцирует эффекторную функцию. В конкретном варианте осуществления Fc-рецептор представляет собой Fcγ-рецептор. В одном варианте осуществления Fc-рецептор представляет собой человеческий Fc-рецептор. В одном варианте осуществления Fc-рецептор представляет собой активирующий Fc-рецептор. В конкретном варианте осуществления Fc-рецептор представляет собой активирующий человеческий Fcγ-рецептор, в частности, человеческий FcγRIIIa, FcγRI или FcγRIIa, конкретно - человеческий FcγRIIIa. В одном варианте осуществления эффекторная функция представляет собой одну или более функций, выбранных из группы из КЗЦ, АЗКЦ, АЗКФ и секреции цитокинов. В конкретном варианте осуществления эффекторная функция представляет собой АЗКЦ. В одном варианте осуществления Fc-домен демонстрирует практически аналогичную аффинность связывания с неонатальным Fc-рецептором (FcRn) по сравнению с нативным Fc-доменом IgG₁. Практически аналогичное связывание с FcRn достигается, когда Fc-домен (или биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая указанный Fc-домен) демонстрирует более чем около 70%, в частности более чем около 80%, конкретнее более чем около 90% аффинности связывания нативного Fc-домена IgG₁ (или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, содержащей нативный Fc-домен IgG₁) с FcRn.

В определенных вариантах осуществления Fc-домен конструируют так, чтобы он имел уменьшенную аффинность связывания с Fc-рецептором и/или уменьшенную эффекторную функцию по сравнению с не сконструированным Fc-доменом. В конкретных вариантах осуществления Fc-домен биспецифической антигенсвязывающей молекулы содержит одну или более аминокислотных мутаций, которые уменьшают аффинность связывания Fc-домена с Fc-рецептором и/или эффекторную функцию. Как правило, в каждой из двух субъединиц Fc-домена присутствуют одни и те же одна или более аминокислотных мутаций. В одном варианте осуществления аминокислотная мутация уменьшает аффинность связывания Fc-домена с Fc-рецептором. В одном варианте осуществления аминокислотная мутация уменьшает аффинность связывания Fc-домена с Fc-рецептором по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 5 раз или по меньшей мере в 10 раз. В вариантах осуществления, в которых присутствует более одной аминокислотной мутации, которая уменьшает аффинность связывания Fc-домена с Fc-рецептором, комбинация этих аминокислотных мутаций может уменьшать аффинность связывания Fc-домена с Fc-рецептором по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 20 раз или даже по меньшей мере в 50 раз. В одном варианте осуществления биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая сконструированный Fc-домен, демонстрирует менее 20%, конкретнее, менее 10%, в частности, менее 5% аффинности связывания с Fc-рецептором по сравнению с биспецифической антигенсвязывающей молекулой, содержащей не сконструированный Fc-домен. В конкретном варианте осуществления Fc-рецептор представляет собой Fcγ-рецептор. В некоторых вариантах осуществления Fc-рецептор представляет собой человеческий Fc-рецептор. В некоторых вариантах осуществления Fc-рецептор представляет собой активирующий Fc-рецептор. В конкретном варианте осуществления Fc-рецептор представляет собой активирующий человеческий Fcγ-рецептор, в частности, человеческий FcγRIIIa, FcγRI или FcγRIIa, конкретно - человеческий FcγRIIIa. Предпочтительно связывание с каждым из этих рецепторов уменьшено. В некоторых вариантах осуществления также уменьшена аффинность связывания с компонентом комплемента, в частности аффинность связывания с C1q. В одном варианте осуществления аффинность связывания с неонатальным Fc-рецептором (FcRn) не уменьшена. Практически аналогичное связывание с FcRn, т.е. сохранение аффинности связывания Fc-домена с указанным рецептором, достигается, когда Fc-домен (или биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая указанный Fc-домен) демонстрирует более чем около 70% аффинности связывания не сконструированной формы Fc-домена (или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, содержащей указанную не сконструированную форму Fc-домена) с FcRn. Fc-домен или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по изобретению, содержащие указанный Fc-домен, могут демонстрировать более чем около 80% и даже более чем около 90% такой аффинности. В определенных вариантах осуществления Fc-домен биспецифической антигенсвязывающей молекулы сконструирован так, чтобы иметь уменьшенную эффекторную функцию по сравнению с не сконструированным Fc-доменом. Уменьшенная эффекторная функция может включать, но не ограничивается этим, одно или более из следующего: уменьшенной комплементзависимой цитотоксичности (КЗЦ), уменьшенной антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (АЗКЦ), уменьшенного антителозависимого клеточного фагоцитоза (АЗКФ), уменьшенной секреции цитокинов, уменьшенного опосредованного иммунным комплексом поглощения антигена антигенпрезентирующими клетками, уменьшенного связывания с NK-клетками, уменьшенного связывания с макрофагами, уменьшенного связывания с моноцитами, уменьшенного связывания с полиморфноядерными клетками, уменьшенной прямой сигнализации, индуцирующей апоптоз, уменьшенного перекрестного связывания связанных с мишенью антител, уменьшенного созревания дендритных клеток или уменьшенного примирования Т-клеток. В одном варианте осуществления уменьшенная эффекторная функция представляет собой одну или более функций, выбранных из группы из уменьшенной КЗЦ, уменьшенной АЗКЦ, уменьшенного АЗКФ и уменьшенной секреции цитокинов. В конкретном варианте осуществления уменьшенная эффекторная функция представляет собой уменьшенную АЗКЦ. В одном варианте осуществления уменьшенная АЗКЦ составляет менее 20% АЗКЦ, индуцируемой не сконструированным Fc-доменом (или биспецифической антигенсвязывающей молекулой, содержащей не сконструированный Fc-домен).

В одном варианте осуществления аминокислотная мутация, которая уменьшает аффинность связывания Fc-домена с Fc-рецептором и/или эффекторную функцию, представляет собой аминокислотную замену. В одном варианте осуществления Fc-домен содержит аминокислотную замену в позиции, выбранной из группы из Е233, L234, L235, N297, Р331 и Р329 (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). В более конкретном варианте осуществления Fc-домен содержит аминокислотную замену в позиции, выбранной из группы из L234, L235 и Р329 (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). В некоторых вариантах осуществления Fc-домен содержит аминокислотные мутации L234A и L235A (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). В одном таком варианте осуществления Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG₁, в частности Fc-домен IgG₁ человека. В одном варианте осуществления Fc-домен содержит аминокислотную замену в позиции Р329. В более конкретном варианте осуществления аминокислотная замена представляет собой Р329А или P329G, в частности P329G (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). В одном варианте осуществления Fc-домен содержит аминокислотную замену в позиции Р329 и дополнительную аминокислотную замену в позиции, выбранной из Е233, L234, L235, N297 и Р331 (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). В более конкретном варианте осуществления дополнительная аминокислотная замена представляет собой Е233Р, L234A, L235A, L235E, N297A, N297D или P331S. В конкретных вариантах осуществления Fc-домен содержит аминокислотные замены в позициях Р329, L234 и L235 (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). В более конкретных вариантах осуществления Fc-домен содержит аминокислотные мутации L234A, L235A и P329G («P329G LALA», «PGLALA» или «LALAPG»). В частности, в конкретных вариантах осуществления каждая субъединица Fc-домена содержит аминокислотные замены L234A, L235A и P329G (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat), т.е. в каждой из первой и второй субъединиц Fc-домена остаток лейцина в позиции 234 замещен остатком аланина (L234A), остаток лейцина в позиции 235 замещен остатком аланина (L235A) и остаток пролина в позиции 329 замещен остатком глицина (P329G) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В одном таком варианте осуществления Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG₁, в частности Fc-домен IgG₁ человека. Комбинация аминокислотных замен «P329G LALA» практически полностью устраняет связывание Fcγ-рецептора (а также комплемента) Fc-доменом IgG₁ человека, как описано в публикации РСТ № WO 2012/130831, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки. В WO 2012/130831 также описаны способы получения таких мутантных Fc-доменов и способы определения их свойств, таких как связывание Fc-рецептора или эффекторные функции.

Антитела IgG₄ демонстрируют уменьшенную аффинность связывания с Fc-рецепторами и уменьшенные эффекторные функции по сравнению с антителами IgG₁. Следовательно, в некоторых вариантах осуществления Fc-домен биспецифических антигенсвязывающих молекул по изобретению представляет собой Fc-домен IgG₄, в частности Fc-домен IgG₄ человека. В одном варианте осуществления Fc-домен IgG₄ содержит аминокислотную замену в позиции S228, в частности аминокислотную замену S228P (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). Для дополнительного уменьшения аффинности связывания с Fc-рецептором и/или эффекторной функции в одном варианте осуществления Fc-домен IgG₄ содержит аминокислотную замену в позиции L235, в частности аминокислотную замену L235E (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). В другом варианте осуществления Fc домен IgG₄ содержит аминокислотную замену в позиции Р329, в частности аминокислотную замену P329G (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). В конкретном варианте осуществления Fc-домен IgG₄ содержит аминокислотные замены в позициях S228, L235 и Р329, в частности аминокислотные замены S228P, L235E и P329G (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). Такие мутантные Fc-домены IgG₄ и их свойства связывания с Fcγ-рецептором описаны в публикации РСТ № WO 2012/130831, в полном объеме включенной в данный документ посредством ссылки.

В конкретном варианте осуществления Fc-домен, демонстрирующий уменьшенную аффинность связывания с Fc-рецептором и/или уменьшенную эффекторную функцию по сравнению с нативным Fc-доменом IgG₁, представляет собой Fc-домен IgG₁ человека, содержащий аминокислотные замены L234A, L235A и, необязательно, P329G, или Fc-домен IgG₄ человека, содержащий аминокислотные замены S228P, L235E и, необязательно, P329G (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

В определенных вариантах осуществления было устранено N-гликозилирование Fc-домена. В одном таком варианте осуществления Fc-домен содержит аминокислотную мутацию в позиции N297, в частности аминокислотную замену с замещением аспарагина аланином (N297A) или аспарагиновой кислотой (N297D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

Помимо Fc-доменов, описанных выше в данном документе и в публикации РСТ № WO 2012/130831, Fc-домены с уменьшенными связыванием Fc-рецептора и/или эффекторной функцией также включают домены с заменой одного или более остатков Fc-домена 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 (патент США №6737056) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat). Такие Fc-мутанты включают Fc-мутантов с заменами в двух или более аминокислотных позициях 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемый Fc-мутант «DANA» с заменой остатков 265 и 297 аланином (патент США №7332581).

Мутантные Fc-домены можно получать с помощью аминокислотной делеции, замены, вставки или модификации, используя генетические и химические методы, хорошо известные в данной области техники. Генетические методы могут включать сайт-специфический мутагенез кодирующей последовательности ДНК, ПЦР, генный синтез и т.п. Правильные нуклеотидные изменения можно верифицировать, например, путем секвенирования.

Связывание с Fc-рецепторами можно легко определить, например, методом ELISA или методом поверхностного плазмонного резонанса (ППР), используя стандартное оборудование, такое как инструмент BIAcore (GE Healthcare), и Fc-рецепторы, которые можно получать методом рекомбинантной экспрессии. В альтернативном варианте аффинность связывания Fc-доменов или биспецифических антигенсвязывающих молекул, содержащих Fc-домен, с Fc-рецепторами можно оценить, используя линии клеток, которые экспрессируют конкретные Fc-рецепторы, такие как человеческие NK-клетки, экспрессирующие FcγIIIa-рецептор.

Эффекторную функцию Fc-домена или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, содержащей Fc-домен, можно измерить методами, известными в данной области техники. Примеры in vitro анализов для оценки АЗКЦ-активности представляющей интерес молекулы, описаны в патенте США №5500362; Hellstrom et al. Proc Natl Acad Sci USA 83, 7059-7063 (1986) и Hellstrom et al., Proc Natl Acad Sci USA 82, 1499-1502 (1985); патенте США №5821337; Bruggemann et al., J Exp Med 166, 1351-1361 (1987). В альтернативном варианте можно использовать нерадиоактивные методы анализа (смотрите, например, нерадиоактивный анализ цитотоксичности ACTI™ для проточной цитометрии (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA); и нерадиоактивный анализ цитотоксичности CytoTox 96^® (Promega, Madison, WI)). Эффекторные клетки, подходящие для такого анализа, включают мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) и естественные клетки-киллеры (NK). В альтернативном или дополнительном варианте АЗКЦ-активность представляющей интерес молекулы можно оценивать in vivo, например, в животной модели, такой как описана в Clynes et al., Proc Natl Acad Sci USA 95, 652-656 (1998).

В некоторых вариантах осуществления уменьшено связывание Fc-домена с компонентом комплемента, в частности с C1q. Соответственно, в некоторых вариантах осуществления, в которых Fc-домен сконструирован так, чтобы иметь уменьшенную эффекторную функцию, указанная уменьшенная эффекторная функция включает уменьшенную КЗЦ. Анализы связывания C1q можно проводить, чтобы определить, способны ли Fc-домен или биспецифическая антигенсвязывающая молекула, содержащая Fc-домен, связывать C1q, и, следовательно, обладают ли они активностью КЗЦ. Смотрите, например, ELISA-анализ связывания C1q и С3 с в WO 2006/029879 и WO 2005/100402. Для оценки активации комплемента можно проводить анализ КЗЦ (смотрите, например, Gazzano-Santoro et al., J Immunol Methods 202, 163 (1996); Cragg et al., Blood 101, 1045-1052 (2003); и Cragg and Glennie, Blood 103, 2738-2743 (2004)).

Определение связывания с FcRn и in vivo клиренса/времени полужизни также можно проводить, используя методы, известные в данной области техники (смотрите, например, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006); WO 2013/120929).

Полинуклеотиды

В изобретении дополнительно предложены выделенные полинуклеотиды, кодирующие описанные в данном документе антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу или их фрагмент. В некоторых вариантах осуществления указанный фрагмент представляет собой антигенсвязывающий фрагмент.

Полинуклеотиды, кодирующие антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по изобретению можно экспрессировать в виде одного полинуклеотида, который кодирует всю антитело или всю биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, или в виде нескольких (например, двух или более) коэкспрессируемых полинуклеотидов. Полипептиды, кодируемые коэкспрессируемыми полинуклеотидами, могут ассоциировать посредством, например, дисульфидных связей или других средств, с образованием функционального антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы. Например, часть легкой цепи антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы может кодироваться отдельным полинуклеотидом от части антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, содержащей тяжелую цепь антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы. При совместной экспрессии полипептиды тяжелой цепи будут ассоциировать с полипептидами легкой цепи с образованием антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы. В другом примере часть антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, содержащая одну из двух субъединиц Fc-домена и, необязательно, одну или более молекул Fab (их части), может кодироваться отдельным полинуклеотидом от части антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, содержащей другую из двух субъединиц Fc-домена и, необязательно, молекулу Fab (ее часть). При коэкспрессии субъединицы Fc-домена будут ассоциировать с образованием Fc-домена.

В некоторых вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует все антитело или всю биспецифическую антигенсвязывающую молекулу в соответствии с изобретением, как описано в данном документе. В других вариантах осуществления выделенный полинуклеотид кодирует полипептид, содержащийся в антителе или биспецифической антигенсвязывающей молекуле в соответствии с изобретением, как описано в данном документе.

В определенных вариантах осуществления полинуклеотид или нуклеиновая кислота представляет собой ДНК. В других вариантах осуществления полинуклеотид по настоящему изобретению представляет собой РНК, например, в форме матричной РНК (мРНК). РНК по настоящему изобретению может быть одноцепочечной или двухцепочечной.

Рекомбинантные методы

Антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по изобретению можно получать, например, посредством твердофазного пептидного синтеза (например, твердофазного синтеза по Меррифилду) или рекомбинантного получения. В случае рекомбинантного получения один или более полинуклеотидов, кодирующих антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу (фрагменты), например, описанные выше, выделяют и вставляют в один или более векторов для последующего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Такой полинуклеотид можно легко выделить и секвенировать, используя традиционные процедуры. В одном варианте осуществления предложен вектор, предпочтительно экспрессионный вектор, содержащий один или более полинуклеотидов по изобретению. Для конструирования экспрессионных векторов, содержащих кодирующую последовательность антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы (фрагмента) наряду с соответствующими сигналами управления транскрипцией/трансляцией, можно использовать методы, хорошо известные специалистам в данной области техники. Эти методы включают in vitro технологии рекомбинантных ДНК, технологии синтеза и in vivo рекомбинации/генетической рекомбинации. Смотрите, например, методики, описанные в Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); и Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and Wiley Interscience, N.Y (1989). Экспрессионный вектор может быть частью плазмиды, вируса или может представлять собой фрагмент нуклеиновой кислоты. Экспрессионный вектор содержит экспрессионную кассету, в которую клонирован полинуклеотид, кодирующий антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу (фрагмент) (т.е. кодирующую область), в функциональной ассоциации с промотором и/или другими элементами управления транскрипцией/трансляцией. В контексте данного документа «кодирующая область» представляет собой часть нуклеиновой кислоты, которая состоит из кодонов, транслируемых в аминокислоты. Хотя «стоп-кодон» (TAG, TGA или ТАА) не транслируется в аминокислоту, он может считаться частью кодирующей области, в случае наличия, но любые фланкирующие последовательности, например, промоторы, сайты связывания рибосомы, терминаторы транскрипции, интроны, 5' и 3' нетранслируемые области и т.п., не являются частью кодирующей области. Две или более кодирующих областей могут присутствовать в одной полинуклеотидной конструкции, например, в одном векторе, или в разных полинуклеотидных конструкциях, например в отдельных (разных) векторах. Кроме того, любой вектор может содержать одну кодирующую область или может содержать две или более кодирующих областей, например, вектор по настоящему изобретению может кодировать один или более полипептидов, которые пост- или ко-трансляционно разделяются на конечные белки посредством протеолитического расщепления. Кроме того, вектор, полинуклеотид или нуклеиновая кислота по изобретению могут кодировать гетерологичные кодирующие области, слитые или не слитые с полинуклеотидом, кодирующим антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу (фрагмент) по изобретению или их вариант или производное. Гетерологичные кодирующие области включают, без ограничения, специальные элементы или мотивы, такие как секреторный сигнальный пептид или гетерологичный функциональный домен. Функциональная ассоциация имеет место, когда кодирующая область для генного продукта, например, полипептида, связана с одной или более регуляторными последовательностями таким образом, чтобы экспрессия генного продукта была под управлением или контролем регуляторной(ых) последовательности(ей). Два фрагмента ДНК (такие как кодирующая полипептид область и связанный с ней промотор) «функционально связаны», если индукция функции промотора приводит к транскрипции мРНК, кодирующей необходимый генный продукт, и если природа связи между двумя фрагментами ДНК не препятствует способности экспрессионных регуляторных последовательностей управлять экспрессией генного продукта или не препятствует способности матрицы ДНК к транскрипции. Таким образом, промоторная область функционально связана с нуклеиновой кислотой, кодирующей полипептид, если промотор способен обеспечивать транскрипцию этой нуклеиновой кислоты. Промотор может представлять собой клеточно-специфический промотор, который обеспечивает существенную транскрипцию ДНК только в определенных клетках. Для управления клеточно-специфической транскрипцией с полинуклеотидом могут быть функционально связаны другие элементы управления транскрипцией помимо промотора, например, энхансеры, операторы, репрессоры и сигналы терминации транскрипции. Подходящие промоторы и другие области управления транскрипцией описаны в данном документе. Различные области управления транскрипцией хорошо известны специалистам в данной области техники. Они включают, без ограничения, области управления транскрипцией, функциональные в клетках позвоночных, такие как, без ограничения, сегменты промоторов и энхансеров из цитомегаловирусов (например, немедленно ранний промотор в сочетании с интроном-А), вируса обезьян 40 (например, ранний промотор) и ретровирусов (таких как, например, вирус саркомы Рауса). Другие транскрипционные регуляторные области включают полученные из генов позвоночных, таких как гены актина, белка теплового шока и кроличьего β-глобина, а также другие последовательности, способные регулировать экспрессию генов в эукариотических клетках. Дополнительные области управления транскрипцией включают тканеспецифические промоторы и энхансеры, а также индуцибельные промоторы (например, промоторы, индуцируемые тетрациклинами). Аналогично, различные элементы управления трансляцией хорошо известны специалистам в данной области техники. Они включают, но не ограничиваются этим, сайты связывания рибосом, кодоны инициации и терминации трансляции и элементы, полученные из вирусных систем (в частности, сайт внутренней посадки рибосомы или IRES, также называемый последовательностью CITE). Экспрессионная кассета также может содержать другие элементы, такие как точка начала репликации и/или элементы интеграции хромосомы, такие как ретровирусные длинные концевые повторы (ДКП) или инвертированные концевые повторы (ИКП) аденоассоциированного вируса (AAV).

Кодирующие области полинуклеотидов и нуклеиновых кислот по настоящему изобретению могут быть связаны с дополнительными кодирующими областями, которые кодируют секреторные или сигнальные пептиды, которые управляют секрецией полипептида, кодируемого полинуклеотидом по настоящему изобретению. Например, если необходима секреция антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, ДНК, кодирующую сигнальную последовательность, можно размещать выше нуклеиновой кислоты, кодирующей антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по изобретению или их фрагмент. В соответствии с сигнальной гипотезой, белки, секретируемые клетками млекопитающих, имеют сигнальный пептид или секреторную лидерную последовательность, которые отщепляются от зрелого белка после инициации экспорта растущей белковой цепи через шероховатый эндоплазматический ретикулум. Специалистам в данной области техники известно, что полипептиды, секретируемые клетками позвоночных, в общем случае имеют сигнальный пептид, слитый с N-концом полипептида, который отщепляется от транслируемого полипептида с получением секретируемой или «зрелой» формы полипептида. В определенных вариантах осуществления используют нативный сигнальный пептид, например, сигнальный пептид тяжелой цепи или легкой цепи иммуноглобулина, или функциональное производное этой последовательности, которое сохраняет способность управлять секрецией полипептида, который с ней функционально связан. В альтернативном варианте можно использовать гетерологичный сигнальный пептид млекопитающего или его функциональное производное. Например, лидерную последовательность дикого типа можно заменить лидерной последовательностью человеческого тканевого активатора плазминогена (ТРА) или мышиной β-глюкуронидазы.

ДНК, кодирующая короткую белковую последовательность, которую можно использовать для облегчения последующей очистки (например, гистидиновый тег) или мечения антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, может быть включена внутри или в концах полипептида, кодирующего антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу (фрагмент).

В дополнительном варианте осуществления предложена клетка-хозяин, содержащая один или более полинуклеотидов по изобретению. В определенных вариантах осуществления предложена клетка-хозяин, содержащая один или более векторов по изобретению. Полинуклеотиды и векторы могут содержать любые фрагменты, отдельно или в комбинации, описанные в данном документе в отношение полинуклеотидов и векторов, соответственно. В одном таком варианте осуществления клетка-хозяин содержит (например, была трансформирована или трансфицирована) один или более векторов, содержащих один или более полинуклеотидов, которые кодируют антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу (или их часть) по изобретению. В контексте данного документа термин «клетка-хозяин» относится к любому типу клеточной системы, которую можно сконструировать для генерации антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы по изобретению или их фрагментов. Клетки-хозяева, подходящие для репликации и поддержания экспрессии антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул, хорошо известны в данной области техники. Такие клетки можно трансфицировать или трансдуцировать, в зависимости от ситуации, конкретным экспрессионным вектором, и можно выращивать большие количества содержащих вектор клеток для засевания крупномасштабных ферментеров для получения достаточных количеств антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы для клинических применений. Подходящие клетки включают прокариотические микроорганизмы, такие как Е. coli, или различные эукариотические клетки, такие как клетки яичника китайского хомяка (СНО), клетки насекомых и т.п. Например, полипептиды можно получать в бактериях, в частности, если не требуется гликозилирование. После экспрессии полипептид можно выделять из бактериальной клеточной пасты в растворимую фракцию и дополнительно очищать. Помимо прокариот, эукариотические микробы, такие как нитевидные грибы или дрожжи, являются подходящими хозяевами для клонирования или экспрессии кодирующих полипептиды векторов, включая штаммы грибов и дрожжей, пути гликозилирования которых были «гуманизированы», что приводит к получению полипептида с частично или полностью человеческим профилем гликозилирования. Смотрите Gerngross, Nat Biotech 22, 1409-1414 (2004), и Li et al., Nat Biotech 24, 210-215 (2006). Клетки-хозяев, подходящие для экспрессии (гликозилированных) полипептидов, также получают из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных). Примеры клеток беспозвоночных включают клетки растений и насекомых. Были идентифицированы многочисленные бакуловирусные штаммы, которые можно использовать в сочетании с клетками насекомых, в частности, для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda. Культуры клеток растений также можно использовать в качестве хозяев. Смотрите, например, патенты США №№5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429 (в которых описана технология PLANTIBODIES™ для получения антител в трансгенных растениях). Клетки позвоночных также можно использовать в качестве хозяев. Например, можно использовать линии клеток млекопитающих, которые адаптированы для роста в суспензии. Другими примерами применимых линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия клеток почки обезьяны CV1, трансформированная SV40 (COS-7); линия клеток почки эмбриона человека (клетки 293 или 293Т, описанные, например, в Graham et al., J Gen Virol 36, 59 (1977)), клетки почки новорожденного хомяка (BHK); клетки Сертоли мышей (клетки ТМ4, описанные, например, в Mather, Biol Reprod 23, 243-251 (1980)), клетки почки обезьяны (CV1), клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76), клетки карциномы шейки матки человека (HELA), клетки почки собаки (MDCK), клетки печени серой крысы (BRL 3А), клетки легкого человека (W138), клетки печени человека (Hep G2), клетки опухоли молочной железы мышей (ММТ 060562), клетки TRI (описанные, например, в Mather et al., Annals N.Y. Acad Sci 383, 44-68 (1982)), клетки MRC 5 и клетки FS4. Другие применимые линии клеток-хозяев млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (СНО), включая dhfr^- клетки СНО (Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77, 4216 (1980)); и линии клеток миеломы, такие как YO, NS0, Р3Х63 и Sp2/0. Обзор некоторых линий клеток-хозяев млекопитающих, подходящих для выработки белка, смотрите, например, в Yazaki and Wu, Methods in Molecular Biology, Vol. 248 (B.K.C. Lo, ed., Humana Press, Totowa, NJ), pp. 255-268 (2003). Клетки-хозяева включают культивируемые клетки, например, культивируемые клетки млекопитающих, клетки дрожжей, клетки насекомых, клетки бактерий и клетки растений, если называть лишь некоторые, но также клетки, принадлежащие трансгенному животному, трансгенному растению или культивируемой ткани растения или животного. В одном варианте осуществления клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, предпочтительно клетку млекопитающего, такую как клетка яичника китайского хомяка (СНО), клетка почки эмбриона человека (HEK) или лимфоидная клетка (например, клетка Y0, NS0, Sp20).

Стандартные технологии для экспрессии чужеродных генов в этих системах известны в данной области техники. Клетки, экспрессирующие полипептид, содержащий тяжелую или легкую цепь антигенсвязывающего домена, такого как антитело, можно конструировать так, чтобы они также экспрессировали другую цепь антитела, чтобы экспрессируемый продукт представлял собой антитело, которое имеет как тяжелую, так и легкую цепь.

В одном варианте осуществления предложен способ получения антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы в соответствии с изобретением, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей полинуклеотид, кодирующий предложенные в данном документе антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, в условиях, подходящих для экспрессии антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, и, необязательно, выделение антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы из клетки-хозяина (или культуральной среды клеток-хозяев).

Компоненты биспецифической антигенсвязывающей молекулы (или антитела) по изобретению могут быть генетически слиты друг с другом. Биспецифическую антигенсвязывающую молекулу можно сконструировать так, чтобы ее компоненты были напрямую слиты друг с другом или ненапрямую посредством линкерной последовательности. Композицию и длину линкера можно определять в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники, и можно тестировать в отношении эффективности. Примеры линкерных последовательностей между разными компонентами биспецифических антигенсвязывающих молекул предложены в данном документе. Также при необходимости могут быть включены дополнительные последовательности для внесения сайта расщепления для разделения отдельных компонентов слияния, например, последовательность распознавания эндопептидазой.

Антитело или биспецифическая антигенсвязывающая молекула по изобретению в общем случае содержат по меньшей мере одну вариабельную область антитела, способную связывать антигенную детерминанту. Вариабельные области могут образовывать часть и быть полученными из встречающихся в природе или не встречающихся в природе антител и их фрагментов. Способы получения поликлональных антител и моноклональных антител хорошо известны в данной области техники (смотрите, например, Harlow and Lane, "Antibodies, a laboratory manual", Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). He встречающиеся в природе антитела можно конструировать, используя твердофазный пептидный синтез, можно получать рекомбинантно (например, как описано в патенте США №4186567) или можно получать, например, посредством скрининга комбинаторных библиотек, содержащих вариабельные тяжелые цепи и вариабельные легкие цепи (смотрите, например, патент США №5969108 авторства McCafferty).

Антитело, фрагмент антитела, антигенсвязывающий домен или вариабельную область от животного любого вида можно использовать в антителе или антигенсвязывающей молекуле по изобретению. Неограничивающие примеры антител, фрагментов антител, антигенсвязывающих доменов или вариабельных областей, применимых в настоящем изобретении, могут быть получены от мыши, примата или человека. Если антитело или антигенсвязывающая молекула предназначены для применения человеком, можно использовать химерную форму антитела, в которой константные области антитела получены от человека. Гуманизированные или полностью человеческие формы антител также можно получать в соответствии со способами, хорошо известными в данной области техники (смотрите, например, патент США №5565332 авторства Winter). Гуманизацию можно обеспечивать различными способами, включая, но не ограничиваясь этим, (а) прививание нечеловеческих (например, донорного антитела) CDR в человеческие (например, реципиентного антитела) каркасную область и константные области с сохранением или нет критически важных каркасных остатков (например, тех, которые важны для сохранения хороших антигенсвязывающей аффинности или функций антитела), (б) прививание только нечеловеческих определяющих специфичность областей (SDR или a-CDR; остатки, критически важные для взаимодействия антиген антитело) в человеческие каркасную область и константные области, или (в) трансплантацию всех нечеловеческих вариабельных доменов, но с «маскировкой» их человекоподобным участком путем замещения поверхностных остатков. Гуманизированные антитела и способы их получения рассмотрены, например, в Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008), и дополнительно описаны, например, в Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'I Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); патентах США №№5821337, 7527791, 6982321 и 7087409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (где описано прививание определяющей специфичность области (SDR)); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) (где описано «изменение поверхности»); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) (где описана «перетасовка FR»); и Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) и Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (где описан подход «направленного отбора» при перетасовке FR). Человеческие каркасные области, которые можно использовать для гуманизации, включают, но не ограничиваются этим, каркасные области, выбранные методом «наилучшего соответствия» (смотрите, например, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); каркасные области, полученные из консенсусной последовательности человеческих антител конкретной подгруппы вариабельных областей легких или тяжелых цепей (смотрите, например, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); и Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); человеческие зрелые (соматически мутированные) каркасные области или каркасные области зародышевой линии человека (смотрите, например, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); и каркасные области, полученные при скрининге библиотек FR (смотрите, например, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) и Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).

Человеческие антитела можно получать, используя различные технологии, известные в данной области техники. Человеческие антитела в целом описаны в van Dijk and van de Winkel, Curr Opin Pharmacol 5, 368-74 (2001) и Lonberg, Curr Opin Immunol 20, 450-459 (2008). Человеческие антитела можно получать путем введения иммуногена трансгенному животному, модифицированному для выработки интактных человеческих антител или интактных антител с человеческими вариабельными областями в ответ на антигенную стимуляцию. Такие животные, как правило, содержат все или часть локусов человеческого иммуноглобулина, которые замещают эндогенные локусы иммуноглобулина или которые находятся вне хромосом или случайным образом интегрированы в хромосомы животного. Как правило, у таких трансгенных мышей инактивированы эндогенные локусы иммуноглобулина. Обзор способов получения человеческих антител от трансгенных животных смотрите в Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005). Также смотрите, например, патенты США №№6075181 и 6150584, в которых описана технология XENOMOUSE™; патент США №5770429, в котором описана технология HuMab®; патент №7041870, в котором описана технология K-М MOUSE®, и публикацию заявки на патент США №US 2007/0061900, в которой описана технология VelociMouse®). Человеческие вариабельные области из интактных антител, вырабатываемых такими животными, можно дополнительно модифицировать, например, путем объединения с отличной человеческой константной областью.

Человеческие антитела можно получать методами на основе гибридов. Были описаны линии клеток человеческой миеломы и мышино-человеческой гетеромиеломы для выработки человеческих моноклональных антител. (Смотрите, например, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp.51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); и Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) Человеческие антитела, полученные посредством технологии человеческой В-клеточной гибридомы, также описаны в Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006). Дополнительные методы включают методы, описанные, например, в патенте США №7189826 (где описано получение моноклональных человеческих антител IgM из линий клеток гибридомы) и Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (где описаны человек-человеческие гибридомы). Технология человеческой гибридомы (технология триомы) описана в Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) и Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005).

Человеческие антитела также можно создавать путем выделения из библиотек человеческих антител, как описано в данном документе.

Антитела, применимые в изобретении, можно выделять путем скрининга комбинаторных библиотек антител с необходимой активностью или видами активности. Методы скрининга комбинаторных библиотек рассмотрены, например, в Lerner et al. в Nature Reviews 16:498-508 (2016). Например, в данной области техники известны различные методы получения библиотек фагового дисплея и скрининга таких библиотек в отношении антител, обладающих необходимыми характеристиками связывания. Такие методы рассмотрены, например, в Frenzel et al. mAbs 8:1177-1194 (2016); Bazan et al. Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828 (2012) и Zhao et al. в Critical Reviews in Biotechnology 36.276-289 (2016), а также в Hoogenboom et al. Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) и в Marks and Bradbury Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003).

В некоторых способах на основе фагового дисплея репертуары генов VH и VL по отдельности клонируют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и случайным образом рекомбинируют в фаговых библиотеках, которые затем можно подвергать скринингу в отношении антигенсвязывающего фага, как описано в Winter et al. Annual Review of Immunology 12: 433-455 (1994). Как правило, фаг представляет фрагменты антител в виде одноцепочечных Fv-фрагментов (scFv) или Fab-фрагментов. Библиотеки из иммунизированных источников позволяют получать антитела с высокой аффинностью к иммуногену без необходимости конструирования гибридом. В альтернативном варианте можно клонировать наивный репертуар (например, от человека) для получения единого источника антител к широкому спектру не собственных, а также собственных антигенов без какой-либо иммунизации, как описано в Griffiths et al. EMBO Journal 12: 725-734 (1993). И наконец, наивные библиотеки также можно получать синтетически, клонируя неперестроенные V-генные сегменты из стволовых клеток и используя ПЦР-праймеры, содержащие случайную последовательность, для кодирования высоковариабельных областей CDR3 и осуществления перестройки in vitro, как описано в Hoogenboom and Winter Journal of Molecular Biology 227: 381-388 (1992). Патентные публикации, в которых описаны фаговые библиотеки человеческих антител, включают, например: патенты США №№5750373; 7985840; 7785903 и 8679490, а также публикации патентов США №№2005/0079574, 2007/0117126, 2007/0237764 и 2007/0292936. Дополнительные примеры методов, известных в данной области техники для скрининга комбинаторных библиотек в отношении антител с необходимой активностью или видами активности, включают рибосомный и мРНК дисплей, а также методы для представления и отбора антител на клетках бактерий, клетках млекопитающих, клетках насекомых или клетках дрожжей. Методы дрожжевого поверхностного дисплея рассмотрены, например, в Scholler et al. Methods in Molecular Biology 503:135-56 (2012) и в Cherf et al. Methods in Molecular biology 1319:155-175 (2015), а также в Zhao et al. Methods in Molecular Biology 889:73-84 (2012). Методы рибосомного дисплея описаны, например, в Не et al. Nucleic Acids Research 25:5132-5134 (1997) и в Hanes et al. PNAS 94:4937-4942 (1997).

Антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы, полученные как описано в данном документе, можно очищать известными в данной области техники методами, такими как высокоэффективная жидкостная хроматография, ионообменная хроматография, гель-электрофорез, аффинная хроматография, эксклюзионная хроматография и т.п. Фактические условия, применяемые для очистки конкретного белка, будут зависеть частично от факторов, таких как суммарный заряд, гидрофобность, гидрофильность и т.д., и будут очевидны для специалистов в данной области техники. Для очистки методом аффинной хроматографии можно использовать антитело, лиганд, рецептор или антиген, с которыми связывается антитело или биспецифическая антигенсвязывающая молекула. Например, очистки антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул по изобретению методом аффинной хроматографии можно использовать матрицу с протеином А или протеином G. Последовательные этапы аффинной хроматографии с протеином А или G и эксклюзионной хроматографии можно использовать для выделения антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, по существу, так, как описано в примерах. Чистоту антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы можно определять любым из ряда хорошо известных аналитических методов, включая гель-электрофорез, жидкостную хроматографию высокого давления и т.п.

Методы анализа

Идентификацию, скрининг или изучение характеристик предложенных в данном документе антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул в отношении их физических/химических свойств и/или биологической активности можно проводить с помощью различных методов анализа, известных в данной области техники.

Анализ аффинности

Аффинность) антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы в отношении Fc-рецептора или антигена-мишени можно определить, например, с помощью поверхностного плазмонного резонанса (ППР), используя стандартное оборудование, такое как инструмент BIAcore (GE Healthcare), и рецепторы или белки-мишени, которые можно получить с помощью рекомбинантной экспрессии. В альтернативном варианте связывание антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул с разными рецепторами или антигенами-мишенями можно оценивать, используя линии клеток, экспрессирующие конкретный рецептор или антиген-мишень, например, методом проточной цитометрии (FACS). Конкретный иллюстративный и типовой вариант осуществления для определения аффинности связывания описан ниже.

В соответствии с одним вариантом осуществления K_Д измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса, используя прибор BIACORE® Т100 (GE Healthcare) при 25°С.

Чтобы проанализировать взаимодействие между Fc-частью и Fc-рецепторами, проводят захват His-меченного рекомбинантного Fc-рецептора анти-Penta His антителом (Qiagen) иммобилизованным на чипе СМ5, а биспецифические конструкции используют в качестве аналитов. Вкратце, биосенсорные чипы с карбоксиметилированным декстраном (СМ5, GE Healthcare) активируют гидрохлоридом N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимидом (NHS) в соответствии с инструкциями поставщика. Анти-Penta His антитело разводят в 10 мкМ ацетате натрия, рН 5,0, до 40 мкг/мл перед введением при скорости потока 5 мкл/мин для достижения приблизительно 6500 единиц ответа (ЕО) связанного белка. После введения лиганда вводят 1 М этаноламина, чтобы блокировать не вступившие в реакцию группы. После этого проводят захват Fc-рецептора в течение 60 с при 4 или 10 нМ. Для кинетических измерений четырехкратные серийные разведения антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы (в диапазоне от 500 нМ и 4000 нМ) вводят в HBS-EP (GE Healthcare, 10 мкМ ГЭПЭС, 150 мкМ NaCl, 3 мкМ ЭДТА, 0,05% поверхностно-активного вещества Р20, рН 7,4) при 25°С при скорости потока 30 мкл/мин в течение 120 с.

Для определения аффинности антигена-мишени проводят захват антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул антителом, специфическим к Fab человека (GE Healthcare), которое иммобилизовано на активированном СМ5-сенсорном чипе, как описано для анти-Penta-His антитела. Конечное количество связанного белка составляет приблизительно 12000 ЕО. Захват антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул проводят в течение 90 с при 300 нМ. Антигены-мишени проводят через проточные ячейки в течение 180 с в диапазоне концентраций от 250 до 1000 нМ при скорости потока 30 мкл/мин. Диссоциацию отслеживают в течение 180 с.

Разницу объемного показателя преломления корректируют путем вычитания ответа, полученного на референсной проточной ячейки. Ответ в равновесном состоянии использовали для получения константы диссоциации K_Д путем аппроксимации нелинейной кривой изотермы связывания Ленгмюра. Скорость ассоциации (k_асс.) и скорость диссоциации (k_дисс.) вычисляют, используя простую один-к-одному модель связывания Ленгмюра (оценочное программное обеспечение BIACORE^® Т100 версии 1.1.1) путем одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Равновесную константу диссоциации (K_Д) рассчитывают как отношение k_дисс./k_асс.. Смотрите, например, Chen et al., J Mol Biol 293, 865-881 (1999).

Анализ активности

Биологическую активность биспецифических антигенсвязывающих молекул (или антител) по изобретению можно измерять с помощью различных анализов, как описано в примерах. Биологическая активность может, например, включать индукцию пролиферации Т-клеток, индукцию сигнализации в Т-клетках, индукцию экспрессии маркеров активации в Т-клетках, индукцию секреции цитокинов Т-клетками, индукцию лизиса клеток-мишеней, таких как опухолевые клетки, и индукцию регрессии опухоли и/или улучшения выживаемости.

Композиции, составы и пути введения

В дополнительном аспекте в изобретении предложены фармацевтические композиции, содержащие любые из предложенных в данном документе антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул, например, для применения в любом из нижеприведенных терапевтических способов. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит любые из предложенных в данном документе антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул и фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит любые из предложенных в данном документе антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул и по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент, например, как описано ниже.

Дополнительно предложен способ получения антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы по изобретению в форме, подходящей для введения in vivo, включающий (а) получение антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы в соответствии с изобретением и (б) составление антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы с по меньшей мере одним фармацевтически приемлемым носителем, при этом препарат антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы составляют для введения in vivo.

Фармацевтические композиции по настоящему изобретению содержат терапевтически эффективное количество антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, растворенных или диспергированных в фармацевтически приемлемом носителе. Выражения «фармацевтически или фармакологически приемлемый» относятся к молекулярным веществам и композициям, которые в общем случае являются нетоксичными для реципиентов в применяемых дозировках и концентрациях, т.е. не вызывают нежелательную, аллергическую или другую неблагоприятную реакцию при введении животному, такому как, например, человек, в зависимости от ситуации. Получение фармацевтической композиции, которая содержит антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу и, необязательно, дополнительный активный ингредиент, станет понятно специалистам в данной области техники в свете настоящего изобретения, и как проиллюстрировано в Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, включенной в данный документ посредством ссылки. Кроме того, в случае введения животному (например, человеку) следует понимать, что препараты должны соответствовать стандартам стерильности, апирогенности, общей безопасности и чистоты, согласно требованиям Отдела по биологическим стандартам FDA или соответствующих органов в других странах. Предпочтительные композиции представляют собой лиофилизированные составы или водные растворы. В контексте данного документа «фармацевтически приемлемый носитель» включает любые и все растворители, буферы, дисперсионные среды, покрытия, поверхностно-активные вещества, антиоксиданты, консерванты (например, антибактериальные агенты, противогрибковые агенты), изотонические агенты, агенты, замедляющие всасывание, соли, консерванты, антиоксиданты, белки, лекарственные средства, стабилизаторы лекарственных средств, полимеры, гели, связующие вещества, эксципиенты, разрыхлители, лубриканты, подсластители, ароматизаторы, красители, подобные материалы и их комбинации, как должно быть известно специалисту в данной области техники (смотрите, например, Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289-1329, включенную в данный документ посредством ссылки). За исключением тех случаев, когда любой традиционный носитель является несовместимым с активным ингредиентом, предусмотрено его применение в терапевтических или фармацевтических композициях.

Иммуноконъюгат по изобретению (и любой дополнительный терапевтический агент) можно вводить любым подходящим способом, включая парентеральное, внутрилегочное и интраназальное, и, если необходимо для местного лечения, внутриочаговое введение. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Введение дозы можно проводить любым удобным способом, например путем инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, частично в зависимости от того, является ли введение кратковременным или постоянным.

Парентеральные композиции включают разработанные для введения путем инъекции, например, подкожной, интрадермальной, внутриочаговой, внутривенной, внутриартериальной, внутримышечной, интратекальной или внутрибрюшинной инъекции. Для инъекции антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по изобретению могут быть составлены в виде водных растворов, предпочтительно в физиологически совместимых буферах, таких как раствор Хэнкса, раствор Рингера или физиологический солевой буфер. Раствор может содержать вспомогательные агенты, такие как суспендирующие, стабилизирующие и/или диспергирующие агенты. В альтернативном варианте антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы могут находиться в форме порошка для смешивания с подходящим носителем, например, стерильной апирогенной водой, перед применением. Стерильные инъекционные растворы готовят путем смешивания антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул по изобретению в необходимом количестве в подходящем растворителе с различными перечисленными выше другими ингредиентами, в зависимости от необходимости. Стерильность можно легко обеспечить, например, путем фильтрации через стерильные фильтровальные мембраны. В общем случае дисперсии готовят путем включения различных стерилизованных активных ингредиентов в стерильный носитель, который содержит основную дисперсионную среду и/или другие ингредиенты. В случае стерильных порошков для изготовления стерильных инъекционных растворов, суспензий или эмульсий предпочтительными способами изготовления являются технологии вакуумной сушки или сублимационной сушки, которые позволяют получать порошок активного ингредиента плюс любой дополнительный необходимый активный ингредиент из стерильно профильтрованной перед этим жидкой среды. Жидкую среду, при необходимости, нужно должным образом забуферить, а жидкий разбавитель сначала сделать изотоничным перед инъекцией с помощью достаточного количества солевого раствора или глюкозы. Композиция должна быть стабильной в условиях производства и хранения, и защищенной от загрязняющего действия микроорганизмов, таких как бактерии и грибы. Следует понимать, что загрязнение эндотоксинами следует свести к минимальному безопасному уровню, например, менее 0,5 нг/мг белка. Подходящие фармацевтически приемлемые носители включают, но не ограничиваются этим: буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол; бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол; и м-крезол); низкомолекулярные (содержащие менее 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как ЭДТА; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; металлсодержащие комплексы (например, комплексы Zn-белок) и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ). Водные инъекционные суспензии могут содержать соединения, которые увеличивают вязкость суспензии, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, сорбит, декстран и т.п. Необязательно, суспензия может также содержать подходящие стабилизаторы или вещества, которые повышают растворимость соединений, для обеспечения получения высококонцентрированных растворов. Кроме того, суспензии активных соединений могут быть изготовлены в виде подходящих масляных инъекционных суспензий. Подходящие липофильные растворители или носители включают жирные масла, такие как кунжутное масло, или синтетические сложные эфиры жирных кислот, такие как этилолеаты или триглицериды, или липосомы.

Активные ингредиенты также могут быть заключены в микрокапсулах, полученных, например, с помощью методик коацервации или путем межфазной полимеризации, например, гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и полиметилметакрилатные микрокапсулы, соответственно, в коллоидных системах для доставки лекарственных средств (например, липосомах, альбуминовых микросферах, микроэмульсиях, наночастицах и нанокапсулах) или в макроэмульсиях. Такие методики описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences (18th Ed. Mack Printing Company, 1990). Можно получать препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, содержащие полипептид, причем матрицы находятся в виде формованных изделий, например, пленок или микрокапсул. В конкретных вариантах осуществления длительное всасывание инъекционных композиций может быть достигнуто путем использования в композициях агентов, замедляющих всасывание, таких как, например, моностеарат алюминия, желатин или их комбинации.

Помимо ранее описанных композиций антитела и биспецифические антигенсвязывающие молекулы также можно получать в виде депо-препаратов. Такие составы пролонгированного действия можно вводить путем имплантации (например, подкожной или внутримышечной) или путем внутримышечной инъекции. Таким образом, например, антитела и биспецифические антигенсвязывающие молекулы можно смешивать с подходящими полимерными или гидрофобными материалами (например, в виде эмульсии в приемлемом масле) или ионообменными смолами, или в виде умеренно растворимых производных, например, умеренно растворимой соли.

Фармацевтические композиции, содержащие антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по изобретению, можно получать посредством традиционных процессов смешивания, растворения, эмульсификации, инкапсуляции, захвата или лиофилизации. Фармацевтические композиции можно получать традиционным образом, используя один или более физиологически приемлемых носителей, разбавителей, эксципиентов или вспомогательных агентов, которые облегчают процесс обработки белков в препараты, которые можно использовать фармацевтически. Надлежащий состав зависит от выбранного пути введения.

Антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы можно добавлять в композицию в форме свободной кислоты или свободного основания, в нейтральной или солевой форме. Фармацевтически приемлемые соли представляют собой соли, которые в значительной степени сохраняют биологическую активность свободной кислоты или свободного основания. Они включают соли присоединения кислот, например, образуемые со свободными аминогруппами белковой композиции или образуемые с неорганическими кислотами, такими как, например, хлористоводородная или фосфорная кислоты, или такими органическими кислотами, как уксусная, щавелевая, винная или миндальная кислота. Соли, образуемые со свободными карбоксильными группами, также можно получать из неорганических оснований, таких как, например, гидроксиды натрия, калия, аммония, кальция или железа; или таких органических оснований, как изопропиламин, триметиламин, гистидин или прокаин. Фармацевтические соли, как правило, более растворимы в водных и других протонных растворителях, чем соответствующие формы свободных оснований.

Терапевтические способы и композиции

Любые антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы, предложенные в данном документе, можно применять в терапевтических способах. Антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по изобретению можно использовать в качестве иммунотерапевтических агентов, например, при лечении раков.

Для применения в терапевтических способах антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по изобретению можно составлять, дозировать и вводить способом, соответствующим требованиям надлежащей медицинской практики. Факторы, которые необходимо учитывать в этом контексте, включают конкретное нарушение, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние отдельного пациента, причину нарушения, место доставки агента, способ введения, график введения и другие факторы, известные практикующим врачам.

В одном аспекте предложены антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по изобретению для применения в качестве лекарственного средства. В дополнительных аспектах предложены антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по изобретению для применения в лечении заболевания. В определенных вариантах осуществления предложены антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по изобретению для применения в способе лечения. В одном варианте осуществления в изобретении предложены антитело или биспецифическая антигенсвязывающая молекула, описанные в данном документе, для применения в лечении заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В определенных вариантах осуществления в изобретении предложены антитело или биспецифическая антигенсвязывающая молекула для применения в способе лечения субъекта, имеющего заболевание, включающем введение субъекту терапевтически эффективного количества антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы. В определенных вариантах осуществления подлежащее лечению заболевание представляет собой пролиферативное нарушение. В конкретном варианте осуществления заболевание представляет собой рак. В определенных вариантах осуществления способ дополнительно включает введение субъекту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, например, противоракового агента, если подлежащее лечению заболевание представляет собой рак. В дополнительных вариантах осуществления в изобретении предложены антитело или биспецифическая антигенсвязывающая молекула, описанные в данном документе, для применения в индукции лизиса клетки-мишени, в частности опухолевой клетки. В определенных вариантах осуществления в изобретении предложены антитело или биспецифическая антигенсвязывающая молекула для применения в способе индукции лизиса клетки-мишени, в частности опухолевой клетки, у субъектаа, включающем введение субъекту эффективного количества антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы для индукции лизиса клетки-мишени. «Субъект» в соответствии с любым из вышеуказанных вариантов осуществления представляет собой млекопитающее, предпочтительно человека. В определенных вариантах осуществления заболевание, подлежащее лечению, представляет собой аутоиммунное заболевание, в частности, системную красную волчанку и/или ревматоидный артрит. Выработка патогенных аутоантител аутореактивными плазматическими клетками является отличительным признаком аутоиммунных заболеваний. Следовательно, GPRC5D можно использовать для нацеливания на аутореактивные плазматические клетки при аутоиммунных заболеваниях.

В дополнительном варианте осуществления в изобретении предложено применение антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы по изобретению в производстве или получении лекарственного средства. В одном варианте осуществления лекарственное средство предназначено для лечения заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В дополнительном варианте осуществления лекарственное средство предназначено для применения в способе лечения заболевания, включающем введение субъекту, имеющему заболевание, терапевтически эффективного количества лекарственного средства. В определенных вариантах осуществления подлежащее лечению заболевание представляет собой пролиферативное нарушение. В конкретном варианте осуществления заболевание представляет собой рак. В одном варианте осуществления способ дополнительно включает введение субъекту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, например, противоракового агента, если подлежащее лечению заболевание представляет собой рак. В дополнительном варианте осуществления лекарственное средство предназначено для индукции лизиса клетки-мишени, в частности опухолевой клетки. В дополнительном варианте осуществления лекарственное средство предназначено для применения в способе индукции лизиса клетки-мишени, в частности опухолевой клетки, у субъекта, включающем введение субъекту эффективного количества лекарственного средства для индукции лизиса клетки-мишени. «Субъект» в соответствии с любым из вышеприведенных вариантов осуществления может представлять собой млекопитающее, предпочтительно человека.

В дополнительном аспекте в изобретении предложен способ лечения заболевания. В одном варианте осуществления способ включает введение субъекту, имеющему такое заболевание, терапевтически эффективного количества антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы по изобретению. В одном варианте осуществления указанному субъекту вводят композицию, содержащую антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по изобретению в фармацевтически приемлемой форме. В определенных вариантах осуществления подлежащее лечению заболевание представляет собой пролиферативное нарушение. В конкретном варианте осуществления заболевание представляет собой рак. В определенных вариантах осуществления способ дополнительно включает введение субъекту терапевтически эффективного количества по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, например, противоракового агента, если подлежащее лечению заболевание представляет собой рак. «Субъект» в соответствии с любым из вышеприведенных вариантов осуществления может представлять собой млекопитающее, предпочтительно человека.

В дополнительном аспекте в изобретении предложен способ индукции лизиса клетки-мишени, в частности опухолевой клетки. В одном варианте осуществления способ включает приведение клетки-мишени в контакт с антителом или биспецифической антигенсвязывающей молекулой по изобретению в присутствии Т-клетки, в частности цитотоксической Т-клетки. В дополнительном аспекте предложен способ индукции лизиса клетки-мишени, в частности опухолевой клетки, у индивида. В одном таком варианте осуществления способ включает введение субъекту эффективного количества антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы по изобретению для индукции лизиса клетки-мишени. В одном варианте осуществления «индивид» является человеком.

В определенных вариантах осуществления подлежащее лечению заболевание представляет собой пролиферативное нарушение, в частности рак. Неограничивающие примеры раков включают рак мочевого пузыря, рак головного мозга, рак головы и шеи, рак поджелудочной железы, рак легкого, рак молочной железы, рак яичника, рак матки, рак шейки матки, рак эндометрия, рак пищевода, рак толстой кишки, колоректальный рак, ректальный рак, рак желудка, рак предстательной железы, рак крови, рак кожи, плоскоклеточную карциному, рак кости и рак почки. Другие клеточно-пролиферативные нарушения, которые можно лечить с помощью антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы по настоящему изобретению, включают, но не ограничиваются этим, новообразования, расположенные в: брюшной полости, кости, молочной железе, пищеварительной системе, печени, поджелудочной железе, брюшине, эндокринных железах (надпочечнике, паращитовидной железе, гипофизе, семенниках, яичниках, вилочковой железе, щитовидной железе), глазе, голове и шее, нервной системе (центральной и периферической), лимфатической системе, органах таза, коже, мягкой ткани, селезенке, области грудной клетки и мочеполовой системе. Также включены предраковые состояния или поражения и раковые метастазы. В определенных вариантах осуществления рак выбран из группы, состоящей из рака почки, рака мочевого пузыря, рака кожи, рака легкого, колоректального рака, рака молочной железы, рака головного мозга, рака головы и шеи и рака предстательной железы. В одном варианте осуществления рак представляет собой рак предстательной железы. Специалисту в данной области техники понятно, что во многих случаях антитело или биспецифическая антигенсвязывающая молекула могут не обеспечивать излечение, но могут обеспечивать лишь частичный благоприятный эффект. В некоторых вариантах осуществления физиологическое изменение, характеризующееся некоторой пользой, также считается терапевтически благоприятным. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления количество антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, которое обеспечивает физиологическое изменение, считается «эффективным количеством» или «терапевтически эффективным количеством». Субъект, пациент, индивид, нуждающийся в лечении, как правило, представляет собой млекопитающее, в частности человека.

В некоторых вариантах осуществления в клетку вводят эффективное количество антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы по изобретению. В других вариантах осуществления терапевтически эффективное количество антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы по изобретению вводят субъекту для лечения заболевания.

Для предотвращения или лечения заболевания соответствующая дозировка антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы по изобретению (при применении отдельно или в комбинации с одним или более другими дополнительными терапевтическими агентами) будет зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, пути введения, массы тела пациента, типа антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, тяжести и течения заболевания, того, вводят ли антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу в превентивных или терапевтических целях, предыдущих или одновременных терапевтических вмешательств, анамнеза пациента и ответа на антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, а также решения лечащего врача. Практикующий врач, ответственный за введение, в любом случае определит концентрацию активного(ых) ингредиента(ов) в композиции и соответствующую(ие) дозу(ы) для каждого отдельного субъекта. В данном документе предусмотрены различные схемы дозирования, включая, но не ограничиваясь этим, однократное или многократное введение в различные моменты времени, болюсное введение и импульсную инфузию.

Антитело или биспецифичную антигенсвязывающую молекулу предпочтительно вводят пациенту за один раз или в течение серии процедур. В зависимости от типа и тяжести заболевания, начальная кандидатная дозировка антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы для введения пациенту может составлять от около 1 мкг/кг до 15 мг/кг (например, 0,1 мг/кг - 10 мг/кг), независимо от того, например, осуществляют ли одно или более отдельных введений или непрерывную инфузию. Одна типичная суточная доза может варьироваться от около 1 мкг/кг до 100 мг/кг или более, в зависимости от факторов, упомянутых выше. В случае повторных введений в течение нескольких дней или более, в зависимости от состояния, лечение в общем случае проводят до достижения необходимой степени подавления симптомов заболевания. Одна типовая дозировка антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы находится в диапазоне от около 0,005 мг/кг до около 10 мг/кг. В других неограничивающих примерах доза также может составлять от около 1 микрограмм/кг массы тела, около 5 микрограмм/кг массы тела, около 10 микрограмм/кг массы тела, около 50 микрограмм/кг массы тела, около 100 микрограмм/кг массы тела, около 200 микрограмм/кг массы тела, около 350 микрограмм/кг массы тела, около 500 микрограмм/кг массы тела, около 1 миллиграмм/кг массы тела, около 5 миллиграмм/кг массы тела, около 10 миллиграмм/кг массы тела, около 50 миллиграмм/кг массы тела, около 100 миллиграмм/кг массы тела, около 200 миллиграмм/кг массы тела, около 350 миллиграмм/кг массы тела, около 500 миллиграмм/кг массы тела до около 1000 мг/кг массы тела или более на введение, а также любой получаемый из этих значений диапазон. В неограничивающих примерах получаемого из перечисленных в данном документе значений диапазона можно вводить дозу в диапазоне от около 5 мг/кг массы тела до около 100 мг/кг массы тела, от около 5 микрограмм/кг массы тела до около 500 миллиграмм/кг массы тела и т.д. с учетом вышеприведенных числовых значений. Таким образом, пациенту можно вводить одну или более доз, составляющих около 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 5,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любую их комбинацию). Такие дозы можно вводить с интервалами, например, раз в неделю или раз в три недели (например, чтобы пациент получал от около двух до около двадцати или, например, около шести доз антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы). Можно вводить начальную более высокую нагрузочную дозу, за которой следует одна или более меньших доз. При этом можно применять другие схемы дозирования. Эффективность такой терапии легко контролировать при помощи традиционных методик и анализов.

Антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по изобретению в общем случае применяют в количестве, эффективном для достижения предполагаемой цели. В случае применения для лечения или предотвращения болезненного состояния антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по изобретению или их фармацевтические композиции вводят или применяют в терапевтически эффективном количестве. Определение терапевтически эффективного количества не выходит за рамки квалификации специалистов в данной области техники, особенно в свете подробного описания изобретения, приведенного в данном документе.

В случае системного введения терапевтически эффективную дозу можно оценить изначально из in vitro анализа, такого как анализ клеточной культуры. После этого можно составить дозу для применения в животных моделях для достижения диапазона циркулирующей концентрации, который включает IC₅₀, определенную в клеточной культуре. Такую информацию можно использовать для более точного определения доз, применимых для людей.

Начальные дозировки также можно оценить из in vivo данных, например, животных моделей, используя методики, которые хорошо известны в данной области техники. Специалист в данной области техники легко может оптимизировать введение для людей на основании данных по животным.

Величину дозировки и интервал можно индивидуально корректировать, чтобы обеспечить плазменные уровни антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул, достаточные для поддержания терапевтического эффекта. Обычные дозировки для пациентов при введении путем инъекции находятся в диапазоне от около 0,1 до 50 мг/кг/сутки, как правило, от около 0,5 до 1 мг/кг/сутки. Терапевтически эффективные плазменные уровни можно обеспечить путем введения нескольких доз каждый день. Уровни в плазме можно измерять, например, с помощью ВЭЖХ.

В случаях местного введения или избирательного поглощения эффективная локальная концентрация антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул может не быть связана с плазменной концентрацией. Специалист в данной области техники сможет оптимизировать терапевтически эффективные местные дозировки без проведения необязательных экспериментов.

Терапевтически эффективная доза описанных в данном документе антител или биспецифических антигенсвязывающих молекул в общем случае обеспечивает терапевтическую пользу, не вызывая существенной токсичности. Токсичность и терапевтическую эффективность антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы можно определить с помощью стандартных фармацевтических процедур в клеточной культуре или на экспериментальных животных. Анализы клеточных культур и исследования на животных можно использовать для определения LD₅₀ (дозы, летальной для 50% популяции) и ED₅₀ (дозы, терапевтически эффективной в 50% популяции). Соотношение доз между токсическим и терапевтическим эффектами представляет собой терапевтический индекс, который может быть выражен как соотношение LD₅₀/ED₅₀. Предпочтительными являются антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы, которые демонстрируют высокие терапевтические индексы. В одном варианте осуществления антитело или биспецифическая антигенсвязывающая молекула в соответствии с изобретением демонстрирует высокий терапевтический индекс. Данные, полученные из анализов клеточных культур и исследований на животных, можно использовать при составлении диапазона дозировок, подходящего для применения человеком. Дозировка предпочтительно находится в пределах диапазона циркулирующих концентраций, которые включают ED₅₀ с небольшой или отсутствующей токсичностью. Дозировка может варьироваться в пределах этого диапазона в зависимости от ряда факторов, например, применяемой дозированной формы, используемого пути введения, состояния субъекта и т.п. Точные состав, путь введения и дозировку может выбирать личный лечащий врач с учетом состояния пациента (смотрите, например, Fingl et al., 1975, в: The Pharmacological Basis of Therapeutics, Ch. 1, p. 1, в полном объеме включенной в данный документ посредством ссылки).

Лечащий врач пациентов, которых лечат антителами или биспецифическими антигенсвязывающими молекулами по изобретению, должен знать, как и когда прекращать, прерывать или корректировать введение вследствие токсичности, органной дисфункции и т.п. И наоборот, лечащий врач также должен знать, как скорректировать лечение до более высоких уровней, если клинический ответ был недостаточным (не допуская токсичности). Величина вводимой дозы при лечении представляющего интерес нарушения будет варьироваться в зависимости от тяжести состояния, подлежащего лечению, пути введения и т.п. Тяжесть состояния можно, например, оценить частично с помощью стандартных методов оценки. Кроме того, доза и, возможно, частота введения дозы также будут варьироваться в соответствии с возрастом, массой тела и ответом каждого отдельного пациента.

Другие агенты и варианты лечения

Антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по изобретению можно вводить в комбинации с одним или более агентами в терапии. Например, антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по изобретению можно вводить совместно с по меньшей мере одним дополнительным терапевтическим агентом. Термин «терапевтический агент» включает любой агент, вводимый для лечения симптома заболевания у субъекта, нуждающегося в таком лечении. Такой дополнительный терапевтический агент может содержать любые активные ингредиенты, подходящие для конкретного показания, подлежащего лечению, предпочтительно те, которые обладают дополняющими видами активности и не оказывают отрицательного влияния друг на друга. В определенных вариантах осуществления дополнительный терапевтический агент представляет собой иммуномодулирующий агент, цитостатический агент, ингибитор клеточной адгезии, цитотоксический агент, активатор апоптоза клеток или агент, который повышает чувствительность клеток к индукторам апоптоза. В конкретном варианте осуществления дополнительный терапевтический агент представляет собой противораковый агент, например, разрушитель микротрубочек, антиметаболит, ингибитор топоизомеразы, интеркалятор ДНК, алкилирующий агент, гормональную терапию, ингибитор киназы, антагонист рецептора, активатор апоптоза опухолевых клеток или антиангиогенный агент.

Такие другие агенты приемлемо присутствуют в комбинации в количествах, которые эффективны для предполагаемой цели. Эффективное количество таких других агентов зависит от количества используемых антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы, типа нарушения или лечения и других факторов, обсуждаемых выше. Антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы в общем случае используют в таких же дозировках и вводят путями, которые описаны в данном документе, или в дозировках, составляющих от около 1 до 99% дозировок, описанных в данном документе, или в любой дозировке и любым путем, которые эмпирически/клинически определены как подходящие.

Такие виды комбинированной терапии, отмеченные выше, охватывают комбинированное введение (при котором два или более терапевтических агентов включены в одну или в отдельные композиции) и раздельное введение, в случае которого введение антитела или биспецифической антигенсвязывающей молекулы по изобретению может происходить до, одновременно и/или после введения дополнительного терапевтического агента и/или адъюванта. Антитела или биспецифические антигенсвязывающие молекулы по изобретению также можно использовать в комбинации с лучевой терапией.

Готовые изделия

В другом аспекте данного изобретения предложено готовое изделие, содержащее материалы, применяемые при лечении, предотвращении и/или диагностике вышеописанных нарушений. Готовое изделие содержит контейнер и этикетку или вкладыш в упаковку на нем или связанные с ним. Подходящие контейнеры включают, например, бутылки, флаконы, шприцы, пакеты для в/в раствора и т.д. Контейнеры могут быть выполнены из ряда материалов, таких как стекло или пластик. Контейнер содержит композицию, которая сама по себе или в комбинации с другой композицией эффективна для лечения, предотвращения и/или диагностики патологического состояния, и может иметь стерильное входное отверстие (например, контейнер может представлять собой пакет для внутривенного раствора или флакон с пробкой, прокалываемой гиподермической иглой для инъекции). По меньшей мере один активный агент в композиции представляет собой антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по изобретению. На этикетке или на вкладыше в упаковку указано, что композицию применяют для лечения выбранного патологического состояния. Кроме того, готовое изделие может содержать (а) первый контейнер с содержащейся в нем композицией, причем указанная композиция содержит антитело или биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по изобретению; и (б) второй контейнер с содержащейся в нем композицией, причем указанная композиция содержит дополнительный цитотоксический или иной терапевтический агент. Готовое изделие в этом варианте осуществления может дополнительно содержать вкладыш в упаковку, на котором указано, что композиции можно применять для лечения конкретного патологического состояния. В альтернативном или дополнительном варианте готовое изделие может дополнительно содержать второй (или третий) контейнер, содержащий фармацевтически приемлемый буфер, такой как бактериостатическая вода для инъекций (БВДИ), фосфатно-солевой буферный раствор, раствор Рингера и раствор декстрозы. Оно также может содержать другие материалы, необходимые с коммерческой и пользовательской точки зрения, включая другие буферы, разбавители, фильтры, иглы и шприцы.

Способы и композиции для диагностики и обнаружения

В определенных вариантах осуществления любое из предложенных в данном документе антител к GPRC5D можно использовать для обнаружения наличия GРRС5D в биологическом образце. В контексте данного документа термин «обнаружение» включает количественное или качественное обнаружение. В определенных вариантах осуществления биологический образец включает клетку или ткань, такую как ткань предстательной железы.

В одном варианте осуществления предложено антитело к GPRC5D для применения в способе диагностики или обнаружения. В дополнительном аспекте предложен способ обнаружения наличия GPRC5D в биологическом образце. В определенных вариантах осуществления указанный способ включает приведение биологического образца в контакт с описанным в данном документе антителом к GPRC5D в условиях, обеспечивающих возможность связывания антитела к GPRC5D с GPRC5D, и обнаружение того, образовался ли комплекс между антителом к GPRC5D и GPRC5D. Такой способ может быть in vitro или in vivo способом. В одном варианте осуществления антитело к GPRC5D используют для отбора субъектов, подходящих для терапии антителом к GPRC5D, например в случае, когда GPRC5D является биомаркером для отбора пациентов.

Типовые нарушения, которые можно диагностировать, используя антитело по изобретению, включают рак, в частности множественную миелому.

В некоторых вариантах осуществления изобретения предложены меченые антитела против GPRC5D. Метки включают, но не ограничиваются этим, метки или фрагменты, обнаруживаемые прямым образом (например, флуоресцентные, хромофорные, электронноплотные, хемилюминесцентные и радиоактивные метки), а также фрагменты, такие как ферменты или лиганды, обнаруживаемые непрямым образом, например, посредством ферментативной реакции или молекулярного взаимодействия. Типовые метки включают, но не ограничиваются этим, радиоактивные изотопы ³²Р, ¹⁴С, ¹²⁵I, ³Н и ¹³¹I, флуорофоры, такие как хелаты редкоземельных металлов или флуоресцеин и его производные, родамин и его производные, дансил, умбеллиферон, люциферазы, например, люциферазу светляков и бактериальную люциферазу (патент США №4737456), люциферин, 2,3-дигидрофталазиндионы, пероксидазу хрена (HRP), щелочную фосфатазу, β-галактозидазу, глюкоамилазу, лизозим, сахар идооксидазы, например, глюкозооксидазу, галактоз о оке ид аз у и глюкозо-6-фосфат дегидрогеназу, гетероциклические оксидазы, такие как уриказа и ксантиноксидаза, сопряженные с ферментом, который использует пероксид водорода для окисления предшественника красителя, такой как HRP, лактопероксидазу или микропероксидазу, биотин/авидин, спиновые метки, бактериофаговые метки, стабильные свободные радикалы и т.п.

Дополнительный аспект изобретения относится к антителу (10В10), которое связывает GPRC5D, содержащему вариабельную область тяжелой цепи (VH), причем VH может содержать аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 81. Антитело может содержать вариабельную область легкой цепи (VL), причем VL содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 82. Антитело может содержать VH и VL, причем VL может содержать аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 81, и при этом VL содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 82. Предпочтительно антитело содержит VH, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 81, и VL, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 82.

Дополнительный аспект изобретения относится к антителу (10В10-ТСВ). Антитело может содержать первую легкую цепь, причем первая легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 67. Антитело может содержать вторую легкую цепь, причем вторая легкая цепь содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 68. Антитело может содержать первую тяжелую цепь, причем первая тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 69. Антитело может содержать вторую тяжелую цепь, причем вторая тяжелая цепь содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 70. В предпочтительном варианте осуществления антитело содержит первую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67, вторую легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68, первую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69, и вторую тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70.

Примеры

Ниже приведены примеры способов и композиций по изобретению. Следует понимать, что на практике можно реализовать ряд других вариантов осуществления с учетом общего описания, приведенного выше.

Пример 1

Экспрессия опухолевых мишеней

Чтобы идентифицировать дифференциальные гены, экспрессируемые множественной миеломой, но не нормальными плазматическими клетками, проводили РНК-секвенирование для 10 образцов, полученных от пациентов с множественной миеломой (ММ) и 10 образцов плазматических клеток (ПК), полученных из костного мозга здоровых доноров. РНК экстрагировали, используя набор RNeasy Micro (Qiagen), в соответствии с инструкциями производителя. Геномную ДНК удаляли, используя не содержащий РНКаз набор ДНКаз (Qiagen) во время экстракции РНК. Качество экстрагированной РНК контролировали на пико-чипах для общей РНК эукариот от Agilent (Agilent Technologies). Набор с ультранизким содержанием РНК SMARTer для секвенирования Illumina (Clontech) использовали для получения и амплификации кДНК из 1,6 нг общей РНК в соответствии с инструкциями производителя. Потом 1 нг амплифицированной кДНК использовали для получения библиотеки Nextera XT (Illumina) в соответствии с инструкциями производителя. Библиотеки секвенирования количественно оценивали, используя набор для количественной оценки библиотек Kapa (Kapa Biosystems), и проводили контроль качества посредством капиллярного электрофореза на биоанализаторе, используя чипы с высокой чувствительностью (Agilent Technologies). Библиотеки секвенировали на секвенаторе HiSeq2500 (Illumina) в течение 2×50 циклов, используя наборы для генерации кластеров версии 4 и реагенты для секвенирования версии 4 (Illumina).

Антиген созревания В-клеток (ВСМА) представляет собой белок клеточной поверхности, который экспрессируется на злокачественных плазматических клетках и, следовательно, считается мишенью, относящейся к множественной миеломе (Tai YT & Anderson KC, Targeting B-cell maturation antigen in multiple myeloma, Immunotherapy. 2015 Nov; 7(11): 1187-1199). При применении технологии РНК-секвенирования глубинный анализ показал, что GPRC5D экспрессируется на таком же уровне, что и ВСМА, в плазматических клетках от пациентов с множественной миеломой (Фиг. 2). Что более важно, разница в экспрессии GPRC5D между плазматическими клетками от пациентов с множественной миеломой и здоровыми плазматическими клетками составляет приблизительно 20 раз. В противоположность этому, разница в экспрессии ВСМА между плазматическими клетками от пациентов с множественной миеломой и здоровыми плазматическими клетками составляет всего 2 раза. Общая экспрессия GPRC5D намного превышает экспрессию других связанных с множественной миеломой молекул-мишеней, таких как SLAM7, CD138 и CD38.

Кроме того, GPRC5D практически не экспрессируется здоровыми наивными В-клетками или В-клетками памяти.

Пример 2

Создание GPRC5D-связывающих молекул и получение Т-клеточных биспецифических (ТСВ) антител

GPRC5D-связывающие молекулы создавали путем ДНК-иммунизации крыс с последующим созданием гибридомы, скринингом и секвенированием гибридомы. Скрининг в отношении специфического связывания проводили методом ELISA по связыванию с GPRC5D-экспрессирующим трансфектантом. Были идентифицированы две GPRC5D-связывающие молекулы, называемые далее 5Е11 (SEQ ID NO 13 и 14) и 5F11 (SEQ ID NO 15 и 16). После идентификации специфических связывающих молекул IgG преобразовывали в Т-клеточные биспецифические антитела. Принципы преобразования связывающих молекул в Т-клеточные биспецифические антитела проиллюстрированы и описаны в данной области техники, например, в публикации РСТ № WO 2014/131712 А1, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки. Т-клеточные биспецифические антитела содержат два GPRC5D-связывающих фрагмента и один CD3-связывающий фрагмент (анти-GPRC5D/анти-CD3 Т-клеточные биспецифические антитела), как проиллюстрировано на Фиг. 3. Получали следующие анти-GPRC5D/анти-CD3 Т-клеточные биспецифические антитела: i) 5Е11-ТСВ (SEQ ID NO 17, 18, 19 и 20); ii) 5F11-TCB (SEQ ID NO 21, 22, 23 и 24); iii) ET150-5-TCB (SEQ ID NO 25, 26, 27 и 28); iv) B72-TCB (SEQ ID NO: 73, 74, 75 и 76); и v) BCMA-TCB (SEQ ID NO: 77, 78, 79 и 80). GPRC5D-связывающий фрагмент ET150-5 описан в публикации РСТ № WO 2016/090329 А2. В данном документе термин «ЕТ-150-5» используется как синоним термина «ЕТ150-5» и наоборот. В качестве отрицательного контроля получали ненацеленное DP47-TCB. DP47-TCB представляет собой ненацеленное Т-клеточное биспецифическое антитело, которое связывается только с CD3, но не с GPRC5D. DP47-TCB описано в публикации РСТ № WO 2014/131712 А1, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки. В72-ТСВ получено из антитела GCDB72, приведенного в таблице 23 в WO 2018/0117786 А2, и содержит GPRC5D-связывающий фрагмент GCDB72. В72-ТСВ было создано в формате crossmab 1+1 (SEQ ID NO: 73, 74, 75 и 76). ВСМА-ТСВ получено из WO 2016/166629 А1 и содержит GPRC5D-связывающий фрагмент A02_Rd4_6nM_C01, как описано в данном документе. ВСМА-ТСВ было создано в формате crossmab 2+1 (SEQ ID NO: 77, 78, 79 и 80).

Пример 3

Связывание Т-клеточных биспецифических антител с линиями клеток множественной миеломы

Для измерения связывания с GPRC5D мы поводили анализ связывания на основе FACS на известных линиях клеток множественной миеломы (Lombardi et al., Molecular characterization of human multiple myeloma cell lines by integrative genomics: insights into the biology of the disease; Genes Chromosomes Cancer. 2007 Mar; 46(3):226-38.). Линии клеток AMO-1, L363 и OPM-2 культивировали в среде RPMI 1640 + глутамакс (Gibco), дополненной 20% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (ФБС, Gibco) и 1% пенициллина стрептомицина 100Х (Gibco). Линию клеток WSU-DLCL2 (отрицательный контроль) культивировали с той же средой, дополненной только 10% ФБС. Линии клеток NCI-H929 и RPMI-8226 также культивировали с той же средой, дополненной 50 мкМ меркаптоэтанола (Gibco) и 1 мМ пирувата натрия (Gibco). Линии клеток культивировали в 75 см колбах (ТРР) с двумя пассажами в неделю.

Связывание разных антител ТСВ к GPRC5D человека (5Е11-ТСВ, 5F11-ТСВ и ЕТ150-5 ТСВ) оценивали, используя непрямое окрашивание. Клетки инкубировали с конструкциями ТСВ к GPRC5D человека 5Е11-ТСВ, 5F11-TCB или ЕТ150-5 ТСВ в диапазоне от 10 мкг/мл до 0,00064 мкг/мл, используя серийное разведение с коэффициентом 0,2, или без конструкции в 100 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ; Gibco) в течение 1 часа при 4°С. Клетки окрашивали синим красителем для живых клеток (Life Technologies), разведенным 1:800 в ФСБ, в течение 20 мин при 4°С перед окрашивание РЕ-конъюгированным козьим антителом к IgG человека, специфическим в отношении Fcγ-фрагмента (Jackson Laboratories), разведенным 1/300 в окрашивающем буфере для проточной цитометрии (eBioscience), инкубировали в течение 30 мин при 4°С. Данные по проточной цитометрии получали на специально спроектированном приборе BD Biosciences Fortessa и анализировали, используя программное обеспечение FlowJo (Tree Star, Ashland, OR) и программное обеспечение GraphPad Prism.

На Фиг. 4А-В показано, что как 5Е11-ТСВ, так и 5F11-TCB связывали все исследуемые линии клеток множественной миеломы дозозависимым образом. В противоположность этому, ЕТ150-5-ТСВ намного слабее связывается с исследуемыми линиями клеток. Не наблюдали связывания анти-GPRCSD-TCB с клетками WSU-DLCL2 (GPRC5D^- линии клеток неходжкинской лимфомы).

Пример 4

Опосредованная анти-GPRC5D-TCB Т-клеточная цитотоксичность

Чтобы определить функциональность анти-GPRC5D-TCB антител, проводили in-vitro анализ Т-клеточной цитотоксичности. Вкратце, линии клеток АМО-1, L363 и ОРМ-2 культивировали в среде RPMI 1640 + глутамакс (Gibco), дополненной 20% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (ФБС; Gibco) и 1% пенициллина стрептомицина 100Х (PS; Gibco). Линию клеток WSU-DLCL2 культивировали с той же средой, дополненной только 10% ФБС. Линии клеток NCI-H929 и RPMI-8226 культивировали с той же средой, дополненной 50 мкМ меркаптоэтанола (Gibco) и 1 мМ пирувата натрия (Gibco). Линии клеток культивировали в 75 см² колбе (ТРР) с двумя пассажами в неделю.

Линии клеток совместно культивировали при отношении мишень:эффектор 1:10 с 3,105 аллогенными Т-клетками, выделенными из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) (лейкоцитарная пленка от Blutspende Schlieren), используя набор для выделения человеческих пан-Т-клеток (Miltenyi Biotec) в среде IMDM (Gibco), дополненной 10% ФБС (Gibco) + 1% PS (Gibco). Антитела ТСВ к GPRC5D человека (5Е11-ТСВ, 5F11-TCB, ЕТ150-5 ТСВ или DP47-TCB) добавляли в совместную культуру в разной концентрации в диапазоне от 1 мкг/мл до 0,000001 мкг/мл с серийным разведением с коэффициентом 0,1 или 0 мкг/мл. Через 20 часов инкубации при 37°С с 5% СО₂, 75 мкл супернатанта на лунку переносили в 96-луночный белый планшет (Greiner bio-one) с 25 мкл на лунку реагента для анализа цитотоксичности CytoTox-Glo (Promega). Измерение люминесценции проводили на PerkinElmer EnVision после 15 мин инкубации при комнатной температуре и анализировали, используя программное обеспечение GraphPad Prism и XL fit.

Данные отображали на графике сигнала люминесценции для высвобождения ЛДГ.

На Фиг. 5А-Д показано, что как 5Е11-ТСВ, так и 5F11-TCB опосредовали сильную Т-клеточную цитотоксичность в линиях клеток множественной миеломы, в частности NCI-H929 (Фиг. 5Б), RPMI-8226 (Фиг. 5В), L363 и (Фиг. 5Г) АМО-1 (Фиг. 5А), тогда как для линии отрицательного контроля WSU-DLCL2 уничтожения не наблюдали (Фиг. 5Д). В противоположность этому ЕТ150-5-ТСВ опосредовало слабое или существенно меньшее уничтожение в исследуемых линиях клеток множественной миеломы. В таблице 1 приведены значения ЕС₅₀, полученные по данным, проиллюстрированным на Фиг. 5А-Д. Значение ЕС₅₀ рассчитывали, используя дополнительную функцию XLfit в Excel, путем построения графиков зависимости исходных данных по сигналам от титрованных ТСВ.

Пример 5

Опосредованная анти-GPRC5D-TCB активация Т-клеток

Чтобы механистически описать принцип действия анти-GPRC5D-TCB, измеряли активацию Т-клеток после совместного культивирования с линиями клеток-мишеней множественной миеломы в присутствии анти-GPRC5D-TCB. Аналогично с экспериментом, описанным в примере 4 и на Фиг. 5А-Д, линии клеток совместно культивировали при отношении мишень:эффектор 1:10 с 3,105 аллогенными Т-клетками, выделенными из МКПК (лейкоцитарная пленка от Blutspende Schlieren), используя набор для выделения человеческих пан-Т-клеток (Miltenyi Biotec) в среде IMDM (Gibco), дополненной 10% ФБС (Gibco) + 1% PS (Gibco). Антитела ТСВ к GPRC5D человека (5Е11-ТСВ, 5F11-TCB, ЕТ150-5-ТСВ или DP47-TCB) добавляли в совместную культуру в разной концентрации в диапазоне от 1 мкг/мл до 0,000001 мкг/мл с серийным разведением с коэффициентом 0,1 или 0 мкг/мл. После 20 часов инкубации при 37°С с 5% CO₂ клетки окрашивали, чтобы оценить активацию Т-клеток. Сначала клетки окрашивали синим красителем для живых клеток (Life Technologies), разведенным 1:800 в ФСБ (Gibco), в течение 20 мин при 4°С. После этого клетки окрашивали AF700 к CD4 человека (клон OKT4), BV711 к CD8 человека (клон SKI), BV605 к CD25 человека (клон ВС96), АРС-Су7 к CD69 человека (клон FN50), все от BioLegend, и РЕ-Су5.5 к CD3 человека (клон SK7; eBioscience) в окрашивающем буфере для проточной цитометрии (eBioscience) в течение 30 мин при 4°С. Данные по проточной цитометрии получали на специально спроектированном приборе BD Biosciences Fortessa и анализировали, используя программное обеспечение FlowJo (Tree Star, Ashland, OR) и программное обеспечение GraphPad Prism.

На Фиг. 6 показано, что 5F11-TCB индуцирует активацию Т-клеток в совместных культурах с клетками NCI-H929 путем повышения регуляции маркеров активации CD25 и CD69, тогда как контроли, например, ненацеленное DP47-TCB и образец без какого-либо ТСВ, не индуцировали активацию Т-клеток. В качестве другого отрицательного контроля обработанные 5F11-TCB Т-клетки совместно культивировали с клетками WSU-DLCL2, при этом также не происходила активация Т-клеток. Эти профили активации были сопоставимы для нескольких линий клеток, которые мы исследовали, например, АМО-1, NCI-Н929, RPMI-8226, L363 (Фиг. 7А-Л). В соответствии со слабой активностью уничтожения, ЕТ150-5-ТСВ не индуцировало активацию Т-клеток за исключением наибольшей исследуемой концентрации 1 мг/кг.

Пример 6

Локализация и интернализация анти-GPRC5D-TCB

Клетки NCI-H929 окрашивали CMFDA (Invitrogen) и высевали на покрытые поли-L-лизином (Sigma) круглые покровные стекла в 24-луночные планшеты. Антитела (5E11-IgG, 5Е11-ТСВ, 5F11-IgG, 5F11-TCB) метили сукцинимидиловым сложным эфиром Alexa Fluor 647 (InVitrogen, кат. № А201106) в молярном отношении 2,5. Клетки оставляли на ночь для прикрепления при 37°С перед добавлением флуоресцентно меченных антител (меченных Alexa Fluor 647 5E11-IgG, 5E11-TCB, 5F11-IgG, 5F11-TCB) непосредственно в среду для роста в течение разного времени и при разных температурах (30 мин на льду, 1 час при 37°С и 3 часа при 37°С). Холодный ФСБ (Lonza) использовали для гашения реакции и для промывки несвязанных антител после каждого временного отрезка. Клетки фиксировали Cytofix (BD) в течение 20 мин при 4°С и дважды промывали ФСБ. Затем покровные стекла переносили и крепили на стеклянные слайды с Fluoromount G (eBioscience) и держали в темноте при 4°С в течение ночи перед визуализацией. Использовали флуоресцентную конфокальную микроскопию с инвертированным LSM 700 от Zeiss с 60х объективом для масляной иммерсии. Изображения получали, используя программное обеспечение Zen (Zeiss), сопряженное с микроскопом, и визуализировали с помощью программного обеспечения IMARIS (Bitplane). На Фиг. 8А показано, что все антитела окрашивали поверхность (плазматическую мембрану) линии клеток множественной миеломы при 4°С или 37°С. Если антитела интернализуются клетками, то флуоресцентное окрашивание будет происходить в цитоплазме при культивировании при 37°С. Не наблюдали интернализацию GPRC5D-связывающих IgG или GPRCSD-связывающих ТСВ GPRC5D⁺ линиями клеток. Это было дополнительно подтверждено по сумме интенсивности от определенных представляющих интерес областей мембраны и цитоплазмы клеток (через три часа). Программное обеспечение IMARIS использовали для анализа и количественной оценки отношения сигнала мембраны и цитоплазмы. На Фиг. 8Б показано, что через 3 часа после инкубации с разными антителами отношение мембранной и цитоплазматической интенсивности не изменилось и составляло ~4, что означает, что флуоресцентные сигналы сконцентрированы на поверхности, а не в цитоплазме.

Пример 7

Характеристики GPRC5D-связывающих молекул: связывание рекомбинантных клеток по ELISA

Использовали стабильно трансфицированные клоны СНО, экспрессирующие GPRC5D человека, или GPRC5D яванского макака, или GPRC5D мыши, или GPRC5A человека, чтобы проанализировать связывание потенциальных лучших антител-кандидатов в виде IgG. Подробнее, 104 клеток (жизнеспособность ≥98%) высевали в 384-луночные микротитровальные планшеты (BD поли-D-лизин, №356662, объем: 25 мкл/лунка), используя свежую культуральную среду. После инкубации в течение ночи при 37°С, к клеткам добавляли по 25 мкл/лунка разведений антител (15×1:3 разведения в 1хФСБ, аналитическая конц. начинается на 30 мкг/мл) в течение 2 часов при 4°С. После одного этапа промывки с использованием 90 мкл/лунка ФСБТ (10х ФСБ, Roche, №11666789001 + 0,1% Твин 20) клетки фиксировали добавлением 50 мкл/лунка 0,05% глутаральдегида (Sigma, кат. № G5882 в 1хФСБ) в течение 10 мин при комнатной температуре (КТ). После трех дополнительных этапов промывки с использованием 90 мкл/лунка ФСБТ добавляли вторичные антитела для обнаружения: для человеческих антител использовали HRP-конъюгат козьего антитела к человеческому Ig на основе κ-цепи (Millipore, № АР502Р), разведенный 1:2000 в блокирующем буфере (1х ФСБ (Roche, №11666789001) + 2% БСА (фракция V бычьего сывороточного альбумина, без жирных кислот, Roche, №10735086001) + 0,05% Твин 20) (25 мкл/лунка). Для крысиных антител использовали смесь козьего HRP-конъюгированного антитела к крысиному IgG1 (Bethyl № А110-106Р), козьего HRP-конъюгированного антитела к крысиному IgG2a (Bethyl № А110-109Р) и козьего HRP-конъюгированного антитела к крысиному IgG2b (Bethyl № A110-111P) в разведении каждого антитела 1:10000 в блокирующем буфере (25 мкл/лунка). После инкубации в течение 1 ч при КТ и трех дополнительных этапов промывки с использованием 90 мкл/лунка ФСБТ добавляли 25 мкл/лунка субстрата ТМБ (заказ Roche №11835033001) в течение 10 мин, а проявление цвета до конечной ОП определяли по измерению на 370 нм/492 нм.

Все исследуемые антитела продемонстрировали положительное связывание с GPRC5D человека со значениями ЕС₅₀ (отображающими авидность) в диапазоне пМ. Только крысиные IgG 10В10 и 07А04 продемонстрировали перекрестную реактивность на клетках СНО, экспрессирующих GPRC5D яванского макака со значениями ЕС₅₀, сравнимыми с человеческой версией этого рецептора (Фиг. 9). Перекрестную реактивность с яванским макаком также обнаружили для всех других антител, но на более низких уровнях по сравнению с 10В10 и 07А04 (Фиг. 9). Не было обнаружено какого-либо существенного связывания с клетками СНО, экспрессирующими мышиный GPRC5D, и связывания с клетками СНО, экспрессирующими человеческую версию GPRC5A (Фиг. 9). Значения ЕС₅₀ связывания приведены в таблице 2.

Пример 8

GPRCSD-связывающие молекулы: рекомбинантное GPRC5D-TCB опосредует Т-клеточную цитотоксичность в линиях клеток ММ

Чтобы сравнить функциональность GPRC5D-TCB или других нацеленных ТСВ, мы провели анализ in vitro Т-клеточной цитотоксичности с несколькими линиями клеток MM: MOLP-2 (Фиг. 10Б), АМО-1 (Фиг. 10 В), EJM (Фиг. 10Г) и NCI-H929 (Фиг. 10Ж). Вкратце, линии клеток культивировали в среде RPMI 1640 + глутамакс (Gibco), дополненной 20% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (ФБС; Gibco) и 1% пенициллина - стрептомицина 100Х (PS; Gibco). MOLP-2 культивировали с этой средой, дополненной глутамаксом IX (Gibco). Линии клеток ОРМ-2 (Фиг. 10А), RPMI-8226 (Фиг. 10Д) и L-363 (Фиг. 10Е) культивировали с этой средой, дополненной только 10% ФБС. NCI-H929 культивировали с этой средой, дополненной 50 мкМ меркаптоэтанола (Gibco), 1 мМ пирувата натрия (Gibco) и глутамаксом IX (Gibco). EJM культивировали в IMDM (Gibco) + 10% ФБС (Gibco) и 1% PS (Gibco). Все линии клеток культивировали в 75 см колбе (ТРР) с двумя пассажами в неделю.

Линии клеток совместно культивировали при отношении эффекторов к мишеням 10 к 1, используя 0,3 миллиона аллогенных Т-клеток, выделенных из МКПК (лейкоцитарная пленка от Blutspende Schlieren), используя набор для выделения человеческих пан-Т-клеток (Miltenyi Biotec) в среде RPMI (Gibco), дополненной 10% ФБС (Gibco) + 1% PS (Gibco). ТСВ-конструкции против GPRC5D человека (5Е11-ТСВ, 5F11-TCB, 10В10-ТСВ, В72-ТСВ, ВСМА-ТСВ и DP47-TCB) добавляли в совместную культуру в разной концентрации от 12,5 нМ до 0,0000125 нМ с серийным разведением 1/10 и сравнивали с необработанными образцами. Через 20 часов инкубации при 37°С с 5% CO₂, 75 мкл супернатанта на лунку переносили в 96-луночный белый планшет (Greiner bio-one) с 25 мкл на лунку реагента для анализа цитотоксичности CytoTox-Glo (Promega). Измерение люминесценции проводили на PerkinElmer En Vision после 15 мин инкубации при комнатной температуре и анализировали, используя программное обеспечение GraphPad Prism и XL fit. Данные отображали на графике сигнала люминесценции для высвобождения ЛДГ (Фиг. 10). На Фиг. 10А-Ж приведены данные, демонстрирующие, что как 5Е11-ТСВ, так и 5F11-TCB опосредовали более сильную Т-клеточную цитотоксичность в линиях клеток ММ, чем ВСМА-ТСВ, 10В10-ТСВ и В72-ТСВ. ЕС₅₀ опосредованного ТСВ уничтожения приведена в таблице 3 и рассчитана как среднее по разным экспериментам с Т-клетками от разных доноров (n=2 или n=3).

Пример 9

In vitro активация Т-клеток в здоровых клетках костного мозга человека

Свежий необработанный костный мозг от четырех доноров (Lonza № 1М-105, партия 0000739254; 0000739255; 0000739256 и 0000734008) обрабатывали в течение 1 или 2 дней после получения образцов. После быстрого лизиса красных кровяных клеток с использованием лизисного буфера BD Pharm (BD №555899; IX в стерильной воде) в течение 5 минут при комнатной температуре клетки 2 раза промывали путем центрифугирования и замены буфера при 126 г и 443 г, соответственно. Клетки подсчитывали и ресуспендировали при 300000 клеток/мл в RPMI 1640 с глутамаксом + 20% ТИ фетальная бычья сыворотка + 2% человеческая сыворотка + 1% пенициллин/стрептомицин (все от Gibco) и высевали 100 мкл клеточной суспензии на лунку в 96-луночный круглодонный планшет (ТРР). Добавляли по 50 мкл среды или среды с добавлением В72-ТСВ, 5F11-TCB, 5Е11-ТСВ, ВСМА-ТСВ, 10В10-ТСВ или DP47-TCB от 200 нМ (4Х) до 20 пМ с серийным разведением 1/10 на лунку. В конце добавляли 50 мкл аллогенных Т-клеток, выделенных с использованием пан-Т-клеток (Miltenyi Biotec, №130-096-535) из МКПК здоровых доноров, при 6 млн/мл (отношение эффекторных Т-клеток к здоровым клеткам-мишеням костного мозга 10:1). После инкубации в течение ночи при 37°С в увлажненном инкубаторе клетки один раз промывали ФСБ и окрашивали в течение 20 минут при 4°С 50 мкл синего красителя для живых клеток (Invitrogen, № L23105), разведенного 1/800 в ФСБ. После промывки клетки инкубировали в течение 30 минут при 4°С со следующей смесью антител, разведенных в буфере FACS (ФСБ IX, 2% фетальная бычья сыворотка; 1% 0,5 М ЭДТА, РН 8; 0,25% NaN₃ азид натрия (20%)): CD25 BV605, CD69 АРС-Су7, ВСМА BV421, CD38 BV510, CD138 FITC, FcRH5 РЕ, разведенные 1/100, и CD8 BV711, CD3 РЕ-Су5 и CD4 AlexaFluor 700, разведенные 1/300 (все от BioLegend), и GPRC5D AlexaFluor 647 (внутрилабораторный клон 5Е11 IgG). После промывки клетки ресуспендировали в 100 мкл буфера FACS и анализировали на приборе Fortessa (BD Biosciences).

Данные, представленные на Фиг. 11А-Е, иллюстрируют, что В72-ТСВ индуцировало неспецифическую активацию Т-клеток (по измерению повышенной регуляции CD69) в здоровом костном мозге, но ни одно из других исследуемых ТСВ этого не делало. Как показано, неспецифическая активация, индуцированная В72-ТСВ, представляла собой зависимый от концентрации эффект и была более выражена при 50 нМ, чем при 5 нМ (Фиг. 12А и 12Б).

Пример 10 In vivo эффективность ТСВ

В исследовании эффективности сравнивали разные конструкции ТСВ (GPRC5D 5F110-TCB, 5Е11-ТСВ, ВСМА-ТСВ и В72-ТСВ) в терминах регрессии опухолей у имеющих множественную миелому полностью гуманизированных мышей линии NSG. Клетки NCI-H929 были изначально получены от АТСС, а клетки ОРМ-2 - от DSMZ. Обе линии клеток были размножены. Клетки культивировали в RPMI, содержащей 10% ФТС и 2 мМ L-глутамина, 10 мМ ГЭПЭС, 1 мМ пирувата натрия. Клетки культивировали при 37°С в насыщенной влагой атмосфере при 5% CO₂. 2,5×10⁶ клеток NCI-H929 и 5×10⁶ клеток ОРМ-2 на животное подкожно вводили в правый бок животных в среде для клеточного культивирования RPMI (Gibco) и матригеле GFR (1:1, общий объем 100 мкл) при жизнеспособности > 95,0%.

Самок мышей NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ) возрастом 4-5 недель на момент начала эксперимента (разводимых в Charles River, Lyon, France) содержали в специальных беспатогенных условиях с суточными циклами 12 ч день/12 ч ночь в соответствии с принятыми руководствами (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол экспериментального исследования был рассмотрен и одобрен местным органом управления (ROB-55.2-2532.Vet_03-16-10). После поступления животных держали в течение одной недели для привыкания к новой среде и для наблюдения. Постоянное наблюдение за состоянием здоровья осуществляли на регулярной основе.

В соответствии с протоколом самок мышей линии NSG в/б (внутрибрюшинно) инъецировали 15 мг/кг бусульфана, за чем через день следовала в/в инъекция 1×10⁵ человеческих гемопоэтических клеток, выделенных из пуповинной крови. Через 16 20 недель после инъекции стволовых клеток у мышей брали кровь и анализировали ее методом проточной цитометрии в отношении успешной гуманизации. Мышей с эффективным прививанием рандомизировали в соответствии с частотой человеческих Т-клеток в разные группы обработки (n = 10/группа). В это время мышам подкожно инъецировали опухолевые клетки, как описано выше, и раз в неделю обрабатывали соединениями или ФСБ (носитель), когда размер опухолей достигал приблизительно 200 мм³. Всем мышам внутривенно инъецировали разные дозы молекул ТСВ (смотрите Фиг. 13А-Г и 14А-Г).

Чтобы получить соответствующее количество исходного раствора, соединения разводили гистидиновым буфером (20 мМ гистидин, 140 мМ NaCl, рН 6,0). Рост опухоли измеряли дважды в неделю, используя штангенциркуль, а объем опухолей рассчитывали следующим образом:

Исследование заканчивали и умерщвляли всех мышей после четырех инъекций соединений, а опухоли вырезали и взвешивали.

На Фиг. 13А-Г показана кинетика роста опухолей у всех животных, которые получали инъекции NCl-H929, после обработки. 5F11-TCB индуцировало полную ремиссию опухолей у всех животных при 1 мг/кг или 0,1 мг/кг (Фиг. 13А), тогда как В72-ТСВ индуцировало только частичную ремиссию опухолей при применении при 1 мг/кг и отсутствие эффекта при 0,1 мг/кг (Фиг. 13В). ВСМА-ТСВ также индуцировало частичную ремиссию опухолей при 1 мг/кг (Фиг. 13Б).

На Фиг. 14А-Г показана кинетика роста опухолей у всех животных, которые получали инъекции ОРМ-2, после обработки. 5F11-TCB (Фиг. 14А, верхняя панель) и 5Е11-ТСВ (Фиг. 14Б, верхняя панель) индуцировали полную ремиссию опухолей у большинства животных при 0,1 мг/кг, тогда как В72-ТСВ (Фиг. 14В, верхняя панель) при 0,1 мг/кг было менее эффективным в отношении контроля роста опухолей. При 0,01 мг/кг 5F11-TCB (Фиг. 14А, нижняя панель) и 5Е11-ТСВ (Фиг. 14Б, нижняя панель) были более эффективными в отношении ингибирования роста опухолей по сравнению с В72-ТСВ (Фиг. 14В, нижняя панель).

Пример 11

Гуманизация антител к GPRC5D

Подходящие человеческие акцепторные каркасные области идентифицировали, проводя запрос по базе данных BLASTp относительно человеческих последовательностей V- и J-области для мышиных вставочных последовательностей (обрезанных до вариабельной части). Критериями отбора для выбора человеческой акцепторной области были гомология последовательности, одинаковая или сходная длина CDR и оценочная частота зародышевой линии человека, но также консервативность определенных аминокислот на поверхности контакта доменов VH-VL. После этапа идентификации зародышевой линии CDR мышиных вставочных последовательностей прививали в человеческие акцепторные каркасные области. Каждое аминокислотное отличие между этими исходными привитыми CDR и родительскими антителами оценивали в отношении возможного влияния на целостность структуры соответствующей вариабельной области и в случае необходимости вносили «обратные мутации» в направлении родительской последовательности. Структурная оценка основывалась на моделях гомологии Fv-области родительского антитела и гуманизированных вариантов, созданных по внутрилабораторному протоколу моделирования гомологии структуры антител, реализуемому с применением BIOVIA Discovery Studio Environment версии 17R2. В некоторые гуманизированные варианты были внесены «прямые мутации», т.е. аминокислотные замены, которые изменяют оригинальную аминокислоту, находящуюся в заданной позиции CDR родительской связывающей молекулы, на аминокислоту, находящуюся в эквивалентной позиции акцепторной зародышевой линии человека. Целью этого было увеличение общего «человеческого» характера гуманизированных вариантов (помимо каркасных областей), чтобы дополнительно снизить риск иммуногенности.

In silico инструмент, разработанный в лаборатории, использовали для предсказания ориентации домена VH-VL гуманизированных вариантов со спаренными доменами VH и VL (как в WO 2016/062734 А1, которая в полном объеме включена посредством ссылки). Результаты сравнивали с предсказанной ориентацией доменов VH-VL родительских связывающих молекул, чтобы выбрать комбинации каркасных областей, которые близки по геометрии к оригинальным антителам. Обоснованием является выявление возможных аминокислотных замен в области контакта VH-VL, которые могут приводить к разрушительным изменениям в спаривании двух доменов, которые в свою очередь могут иметь негативный эффект на свойства связывания.

Выбор акцепторной каркасной области и ее адаптация для GPRC5D-связывающей молекулы 5Е11

Акцепторные каркасные области выбирали в соответствии со следующей таблицей 4.

Пост-CDR3 каркасные области адаптировали из IGHJ3*02 (DAFDIWGQGTMVTVSS) человеческой зародышевой линии IGHJ и IGKJ5*01 (ITFGQGTRLEIK) человеческой зародышевой линии IGKJ. Часть, относящаяся к акцепторной каркасной области, выделена жирным шрифтом.

На основании структурных соображений в определенных позициях гуманизированных вариантов 5Е11 были внесены обратные мутации с человеческой акцепторной каркасной области на аминокислоту в родительской связывающей молекуле (таблицы 5 и 6). Кроме того, некоторые позиции были идентифицированы как перспективные кандидаты для прямых мутаций, в которых аминокислота в CDR родительской связывающей молекулы замещена аминокислотой из человеческой акцепторной зародышевой линии. Эти изменения подробно описаны в таблице ниже.

Примечание: Обратные мутации обозначены префиксом Ь, прямые мутации - f, например, bS49A относится к обратной мутации (аминокислоты человеческой зародышевой линии на аминокислоту родительского антитела) с серина на аланин в позиции 49. Все индексы остатков приведены по нумерации Kabat.

Выбор акцепторной каркасной области и ее адаптация для GPRC5D-связывающей молекулы 5F11

Акцепторные каркасные области выбирали в соответствии со следующей таблицей 7.

Пост-CDR3 каркасные области адаптировали из IGHJ3*02 (DAFDIWGQGTMVTVSS) человеческой зародышевой линии IGHJ и IGKJ2*01 (YTFGQGTKLEIK) человеческой зародышевой линии IGKJ. Часть, относящаяся к акцепторной каркасной области, выделена жирным шрифтом.

На основании структурных соображений в определенных позициях гуманизированных вариантов 5F11 были внесены обратные мутации с человеческой акцепторной каркасной области на аминокислоту в родительской связывающей молекуле (таблицы 8 и 9). Кроме того, некоторые позиции были идентифицированы как перспективные кандидаты для прямых мутаций, в которых аминокислота в CDR родительской связывающей молекулы замещена аминокислотой из человеческой акцепторной зародышевой линии. Эти изменения подробно описаны в таблице ниже.

Примечание: Обратные мутации обозначены префиксом b, прямые мутации - f, например, bA93T относится к обратной мутации (аминокислоты человеческой зародышевой линии на аминокислоту родительского антитела) с аланина на треонин в позиции 93. Все индексы остатков приведены по нумерации Kabat.

Характеристики гуманизированных вариантов по данным ELISA

Для получения характеристик гуманизированных вариантов доменов VH и VL GPRCSD-связывающих молекул использовали протокол ELISA, описанный выше (смотрите 7). Данные приведены в таблице 10 для гуманизированных вариантов 5Е11 и в таблице 11 для гуманизированных вариантов 5F11. В таблице 12 приведены последовательности CDR родительского 5Е11 и родительского 5Е11 и выбранных гуманизированных вариантов.

Пример 12

In vitro активация клеток CAR-J в присутствии разных гуманизированных вариантов, выбранных анти-GPRC5D IgG

Способность разных гуманизированных анти-GPRC5D IgG активировать эффекторные клетки PGLALA-CAR-J оценивали, как описано далее. GPRC5D-экспрессирующие клетки-мишени множественной миеломы L363 (Diehl et al., Blut 36: 331-338 (1978)) совместно культивировали с анти-PGLALA-CAR-J эффекторными клетками (репортерная линия клеток острого лимфатического лейкоза человека Jurkat-NFAT, экспрессирующая TCR, направленный против мутации PGLALA (P329G L234A L235A) в Fc-части молекул IgG, и содержащая промотор NFAT, как описано в заявке РСТ № РСТ/ЕР 2018/086038 и заявке РСТ № РСТ/ЕР 2018/086067. После одновременного связывания молекулы IgG с GPRC5D на клетках L363 и клеток PGLALA-CAR-J происходит активация промотора NFAT, которая приводит к экспрессии активной люциферазы светляков.

Для анализа гуманизированные варианты IgG разводили в среде RPMI 1640 (содержащей глутамакс, 15% ТИ фетальную бычью сыворотку, 1% пенициллин - стрептомицин; все от GIBCO) и трансфицировали в круглодонные 96-луночные планшеты (диапазон конечных концентраций от 0,2 пг/мл до 10 мкг/мл). Добавляли 20000 клеток L363 на лунку и анти-PGLALA-CAR-J эффекторные клетки для получения конечного соотношения эффекторных клеток (анти-PGLALA-CAR-J) и клеток-мишеней (L363) 5:1 и конечного объема 200 мкл на лунку. Клетки инкубировали приблизительно в течение 16 ч при 37°С в увлажненном инкубаторе. По истечению времени инкубации 100 мкл/лунка супернатанта переносили в белый плоскодонный 96-луночный планшет (Costar) и инкубировали с другими 100 мкл/лунка субстрата люциферазы ONE-Glo (Promega) в течение 5 мин перед считыванием люминесценции с помощью PerkinElmer Envision. По исходным данным строили график зависимости относительного сигнала люминесценции (ОЕЛ) от концентрации IgG, используя GraphPad Prism, а ЕС50 рассчитывали, используя программное обеспечение XL-fit.

Как показано на Фиг. 15А-Б и в таблице 13, все оцениваемые IgG к GPRC5D индуцировали активацию CAR-J после одновременного связывания с GPRC5D-экспрессирующими клетками-мишенями и анти-PGLALA-CAR-J клетками. Для обеих анти-GPRC5D связывающих молекул 5F11 и 5Е11 можно было идентифицировать гуманизированные варианты со сходными или даже улучшенными значениями ЕС₅₀ по сравнению с родительскими антителами до гуманизации. В случае связывающей молекулы 5F11 наибольшая активация могла быть индуцирована молекулой Р1АЕ5741 (Фиг. 15А). В случае связывающей молекулы 5Е11 наибольшая активация могла быть индуцирована молекулами Р1АЕ5730 и Р1АЕ5723 (Фиг. 15Б).

Пример 13

Получение дополнительных Т-клеточных биспецифических антител

Принципы преобразования связывающих молекул в Т-клеточные биспецифические антитела проиллюстрированы и описаны в данной области техники, например, в публикации РСТ № WO 2014/131712 А1, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки. Т-клеточные биспецифические антитела содержат два GPRC5D-связывающих фрагмента и один CD3-связывающий фрагмент (анти-GPRC5D/анти-CD3 Т-клеточные биспецифические антитела), как проиллюстрировано на Фиг. 3. Получали следующие анти-GPRC5D/анти-CD3 Т-клеточные биспецифические антитела: i) 6623 (SEQ ID NO 114, 115, 116 и 117); ii) 6624 (SEQ ID NO 118, 119, 120 и 121); iii) 6625 (SEQ ID NO 122, 123, 124 и 125); iv) 6626 (SEQ ID NO: 126, 127, 128 и 129). DP47-TCB («ненацеленное ТСВ») описано в публикации РСТ № WO 2014/131712 А1, которая в полном объеме включена в данный документ посредством ссылки. В72 ТСВ получено из антитела GCDB72, приведенного в таблице 23 в WO 2018/0117786 А2, и содержит GPRC5D-связывающий фрагмент GCDB72 (пример 7). В данном документе термин «В72 ТСВ» также относится к термину «В72». ВСМА-ТСВ получено из WO 2016/166629 А1 и содержит GPRC5D-связующий фрагмент A02_Rd4_6nM_C01, как описано в данном документе. СМА-ТСВ было создано в формате crossmab 2+1 (SEQ ID NO: 77, 78, 79, 80), как описано для примера 2. В данном документе термины «5F11-TCB» и «5F11p-СН2527» используются взаимозаменяемо. В данном документе термины «5Е11-ТСВ» и «5Е11р-СН2527» используются взаимозаменяемо.

Пример 14.1

Связывание Т-клеточных биспецифических антител с линиями клеток множественной миеломы и клетками Jurkat-NFAT

Для измерения связывания с GPRC5D мы поводили анализ связывания на основе проточной цитометрии на известных линиях клеток множественной миеломы (Lombardi et al., Molecular characterization of human multiple myeloma cell lines by integrative genomics: insights into the biology of the disease; Genes Chromosomes Cancer. 2007 Mar;46(3):226-38.). Линию клеток NCI-H929 (АТСС® CRL-9068) культивировали в среде RPMI 1640 с глутамаксом (Gibco), дополненной 10% ФБС, 1х пенициллина/стрептомицина (Gibco), 1х пирувата натрия (Gibco) и 50 мкМ бета-меркаптоэтанола (Gibco). Репортерные клетки Jurkat-NFAT (CD3-экспрессирующая линия клеток острого лимфатического лейкоза человека с промотором NFAT, GloResponse Jurkat NFAT-RE-luc2P, Promega, № CS176501) культивировали в RPMI 1640, содержащей 2 г/л глюкозы, 2 г/л NaHCO3, 10% ФТС, 25 мМ ГЭПЭС, 2 мМ L-глутамина, 1 х NEAA, 1 х пирувата натрия и 200 мкг/мл гигромицина В.

0,1 млн клеток на лунку 96-луночного круглодонного планшета инкубировали с 100 нМ - 1,3 пМ (серийные разведения 1:5) указанных конструкций GPRC5D-TCB 5Е11р-СН2527, 6625, 6626, 5F11p-СН2527, 6623 или 6624 или без конструкций в течение 30 мин при 4°С. Клетки дважды промывали буфером FACS (ФСБ, 2% фетальная бычья сыворотка; 1% 0,5 М ЭДТА, рН 8; 0,25% NaN₃ азид натрия (20%)) и окрашивали РЕ-конъюгированным козьим антителом к человеческому IgG, специфическим к Fcγ-фрагменту (Jackson Laboratories, 109-606-008), разведенным 1/100 в буфере FACS, еще в течение 30 мин при 4°С.

Анализ методом проточной цитометрии проводили на специально спроектированном приборе BD Biosciences Fortessa и анализировали, используя BD Diva. Значения ЕС50 рассчитывали, используя программное обеспечение GraphPad Prism.

На Фиг. 16 показано, что все молекулы ТСВ способны связываться как с GPRC5D человека, так и с CD3 человека зависимым от концентрации образом. Вкратце, обе гуманизированные версии 5Е11р-СН2527, а именно 6625 и 6626, демонстрируют повышенное связывание с GPRC5D человека по сравнению с родительским ТСВ, что также приводит к более низким значениям ЕС50 связывания (Фиг. 16А и таблица 14.1). Кроме того, 6624 демонстрирует немного повышенное связывание с GPRC5D человека по сравнению с 5F11p-CH2527 и 6623 (Фиг. 16Б). В целом, все молекулы на основе 5F11 демонстрируют лучшее связывание с GPRC5D человека, чем молекулы на основе 5Е11. Все молекулы ТСВ на основе 5Е11 демонстрируют сравнимое зависимое от концентрации связывание с CD3 человека (Фиг. 16В), тогда как оба гуманизированных варианта 5F11p-СН2527, а именно 6623 и 6624, демонстрируют более сильные общие сигналы связывания при наибольших концентрациях антител по сравнению с родительским при инкубации с человеческими CD3-экспрессирующими клетками Jurkat-NFAT (Фиг. 16Г).

Пример 14.2

Связывание Т-клеточных биспецифических антител с линиями клеток множественной миеломы

Поскольку данные, представленные в примере 14.1, были неправильно рассчитаны с коэффициентом 10, значения ЕС50 являются слишком низкими. Поэтому для повторной оценки связывания с GPRC5D мы поводили серию анализов связывания на основе FACS на известных линиях клеток множественной миеломы (Lombardi et al., Molecular characterization of human multiple myeloma cell lines by integrative genomics: insights into the biology of the diseas; Genes Chromosomes Cancer. 2007 Mar; 46(3):226-38.). Линию клеток ОРМ-2 культивировали в среде RPMI 1640 + 1% глутамакса (Gibco), дополненной 20% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (ФБС, Gibco). Линию клеток NCI-H929 культивировали в среде RPMI 1640 + 1% глутамакса (Gibco), дополненной 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (ФБС, Gibco), 50 мкМ меркаптоэтанола (Gibco) и 1 мМ пирувата натрия (Gibco), a RPMI-8226 культивировали в среде RPMI 1640 + 1% глутамакса (Gibco), дополненной 10% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки (ФБС, Gibco). Линии клеток культивировали в 75 см² колбах (ТРР) с двумя пассажами в неделю.

Вкратце, суспензионные клетки собирали, подсчитывали и оценивали в отношении жизнеспособности. Все последующие этапы проводили при 4°С.

Клетки ресуспендировали в ФСБ при 0,5 млн клеток на мл. Затем высевали по 0,05 млн клеток на лунку круглодонного 96-луночного планшета, центрифугировали и сливали супернатанты. Клетки окрашивали красителем для оценки жизнеспособности zombie aqua (BioLegend, №423102, предварительно разведенным 1:400), содержащим Fc-блок (BioLegend, №422302, предварительно разведенный 1:400), в течение 20 минут в общем объеме 50 мкл на лунку. Клетки промывали буфером FACS и инкубировали с возрастающими концентрациями 5Е11(6625)-ТСВ, также называемого в данном документе 6625 (0,7 нМ - 500 нМ, общий объем 25 мкл на лунку), в течение 30 минут при 4°С. Аналитические планшеты центрифугировали и сливали супернатанты.

После этого клетки ресуспендировали путем аккуратного смешивания еще в течение 30 минут при 4°С в общем объеме 25 мкл на лунку, содержащем 500 нМ вторичного антитела (aPGLALA mulG2b Alexa 647, полученного в лаборатории) в буфере FACS. Клетки один раз промывали и анализировали на проточном цитометре BD, оснащенном FACS Diva. Кривые связывания и значения ЕС50 получали, используя GraphPadPrism6. Значения ЕС50 аналитического повтора 1 соответствуют графикам на Фиг. 25А, Фиг. 25Б и Фиг. 25В. Значения ЕС50 аналитического повтора 2 соответствуют графикам на Фиг. 25Г, Фиг. 25Д и Фиг. 25Е. Значения ЕС50 аналитического повтора 3 соответствуют графикам на Фиг. 25Ж, Фиг. 25И и Фиг. 25К.

На Фиг. 25 показано зависимое от концентрации связывание 5Е11(6625)-ТСВ с линиями клеток ММ, экспрессирующими различные уровни человеческого GPRC5D. ЕС50 связывания находится в диапазоне от 20 нМ до 158 нМ и демонстрирует некоторую аналитическую вариабельность в уровнях экспрессии мишеней на клетках.

Пример 15

Способность GPRC5D-TCB индуцировать CD3-опосредованную активацию эффекторных клеток Jurkat-NFAT после одновременного связывания с CD3 человека и GPRC5D человека оценивали, используя совместные культуры клеток RPMI-8226 (АТСС® CCL-155) и репортерных клеток Jurkat-NFAT (Promega, № CS176501). После одновременного связывания молекулы ТСВ с GPRC5D человека на клетках RPMI-8226 и антигеном CD3 человека на репортерных клетках Jurkat-NFAT происходит активация промотора NFAT, которая приводит к экспрессии активной люциферазы светляков. Интенсивность сигнала люминесценции (получаемая после добавления субстрата люциферазы) пропорциональна интенсивности активации и сигнализации CD3.

Для анализа высевали 20000 клеток RPMI8226 на лунку 96-луночного планшета и добавляли указанные молекулы ТСВ для получения конечного диапазона концентраций от 50 нМ до 5 фМ, используя этапы серийного разведения 1:10 в RPMI, содержащей 20% ФБС и 1% пенициллина/стрептомицина. Добавляли 50000 клеток Jurkat-NFAT на лунку для получения конечного соотношения Э:М 2,5:1. После инкубации в течение ночи при 37°С, 5% CO₂, добавляли 100 мкл реагента ONE-Glo (Promega) в эквивалентные объемы аналитического супернатанта и инкубировали в течение 5 минут при комнатной температуре с защитой от света. Люминесценцию анализировали, используя планшет-ридер Perkin Elmer.

Как изображено на Фиг. 17А, все оцениваемые молекулы GPRC5D ТСВ индуцировали активацию Jurkat-NFAT дозозависимым образом, тогда как в присутствии любой из двух ненацеленных контрольных молекул DP47 ТСВ не было получено существенного сигнала. Ненацеленное DP47 ТСВ 1 содержит CD3-связывающую молекулу, содержащую VH с SEQ ID NO: 104 и VL с SEQ ID NO: 105. Ненацеленное DP47 ТСВ 2 содержит CD3-связывающую молекулу, содержащую VH с SEQ ID NO: 35 и VL с SEQ ID NO: 36. Соответствующие значения ЕС50 для активации Jurkat рассчитывали, используя GraphPadPrism6, и они приведены в таблице 15. С учетом обеих ЕС50, а также ППК (смотрите таблицу 15) ранжирование молекул выглядит следующим образом: 6624 > 6623 > 5F11p-CH2527 > 6626 ~6625 > 5Е11р-СН2527.

Аналогичные анализы проводили в присутствии дополнительных линий клеток (множественной миеломы), экспрессирующих различные уровни человеческого GPRC5D, определенные проточным методом (Quantum Simply Cellular, Bangslabs) и указанные в виде числа сайтов связывания GPRC5D в скобках рядом с названием линии клеток.

ЕС50 и ППК рассчитывали, используя GraphPadPrism, и строили график зависимости х от у (Фиг. 17Б-Ж).

Как изображено на Фиг. 17Б-Ж, все молекулы демонстрируют зависимую от концентрации активацию Jurkat в присутствии линий клеток с широким диапазоном относительной экспрессии GPRC5D; ранжирование молекул является аналогичным независимо от линии клеток-мишеней.

Пример 16

Опосредованная GPRC5D-TCB Т-клеточная цитотоксичность

Чтобы дополнительно определить функциональность анти-GPRC5D-TCB антител, проводили in-vitro анализ лизиса опухолевых клеток. Вкратце, линии клеток АМО-1 (DSMZ АСС 538), NCI-H929 АТСС® CRL-9068, LP-1 (DSMZ АСС 41) и IM-9 (АТСС® CCL-159) культивировали совместно с человеческими пан-Т-клетками в качестве эффекторных клеток при конечном соотношении эффекторов к мишеням 10:1. Человеческие пан-Т-клетки выделяли из мононуклеарных клеток периферической крови (МКПК) от здоровых доноров, используя набор для выделения человеческих пан-Т-клеток (Miltenyi Biotec). Указанные нацеленные на GPRC5D (6625 и В72) или ВСМА привлекающие Т-клетки биспецифические молекулы добавляли в возрастающих концентрациях (в диапазоне от 50 нМ до 5 пМ с этапами разведения 1:10). В качестве отрицательного контроля было включено ненацеленное ТСВ.

Через 20 часов инкубации при 37°С с 5% СО₂ определяли клеточную гибель путем количественной оценки сигнала люминесценции (анализ цитотоксичности CytoTox-Glo, Promega), придерживаясь руководства производителя. Проиллюстрированы значения относительного сигнала люминесценции (ОЕЛ) как прямое измерение определяемой клеточной гибели. ЕС50 и ППК были рассчитаны с помощью GraphPadPrism и приведены в таблице 16.

На Фиг. 18А-Г показано, что все молекулы ТСВ способны индуцировать зависимый от концентрации лизис широкого диапазона линий опухолевых клеток с различными относительными уровнями экспрессии человеческого GPRC5D и ВСМА, соответственно. Прямое сравнение 6625 и В72 позволяет предположить, что 6625 имеет повышенную эффективность и активность. Сравнение 6625 и ВСМА-ТСВ демонстрирует лучшую in vitro эффективность и активность 6625 в присутствии АМО-1 (Фиг. 18А), NCI-H929 (Фиг. 18Б) и LP-1 (Фиг. 18В), тогда как ВСМА-ТСВ индуцирует более сильный лизис опухолевых клеток IM-9 (Фиг. 18Г), которые экспрессируют довольно низкие уровни GPRC5D. Разное ранжирование 6625 и ВСМА-ТСВ для исследуемых линий клеток, вероятно, можно объяснить разными уровнями относительной экспрессии GPRC5D и ВСМА на этих линиях клеток.

Пример 17

Опосредованная анти-GPRC5D-TCB активация Т-клеток в присутствии образца первичной ММ

Чтобы оценить активность молекул GPRC5D ТСВ в образцах первичной множественной миеломы, замороженный необработанный образец костного мозга (Proteogenex) размораживали и проводили быстрый лизис красных кровяных клеток, используя лизисный буфер BD Pharm (№555899). После этого клетки промывали, ресуспендировали в RPMI 1640 с глутамаксом, содержащей 20% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки, 2% человеческой сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина (все от Gibco), и высевали 100 мкл клеточной суспензии (30000 клеток) на лунку в 96-луночный круглодонный планшет (ТРР). Добавляли аутологичные Т-клетки до получения конечного соотношения 10 Т-клеток на клетки смешанного образца КМ. Указанные молекулы добавляли до получения конечного диапазона концентраций от 50 нМ до 0,05 нМ (этапы разведения 1:10) в общем объеме 200 мкл на лунку 96-луночного планшета.

После инкубации в течение ночи при 37°С в увлажненном инкубаторе клетки один раз промывали ФСБ и окрашивали в течение 20 минут при 4°С 50 мкл синего красителя для живых клеток (Invitrogen, №L23105), чтобы отделить живые и мертвые клетки. Поверхностное окрашивание проводили, используя смесь следующих антител, с учетом рекомендаций производителя: CD25 BV605, CD69 АРС-Су7, CD38 BV510, CD138 FITC, CD8 BV711, CD3 РЕ-Су5 и CD4 AlexaFluor700 (все от BioLegend). Для конечного анализа клетки ресуспендировали в 100 мкл буфера FACS и анализировали, используя прибор Fortessa (BD Biosciences). На Фиг. 19 показан процент активации Т-клеток, определенный по проценту живых CD8 Т-клеток, положительных в отношении раннего маркера активации CD69. ЕС50 активации Т-клеток была рассчитана с помощью Graph Pad Prism и приведена в таблице 18. Обе репрезентативные нацеленные на GPRC5D биспецифические молекулы, а именно 6624 и 6625, способны индуцировать зависимую от концентрации активацию Т-клеток с ЕС50 1,06 пМ и 14,8 пМ, соответственно, тогда как в присутствии ненацеленного контрольного ТСВ индукцию активации Т-клеток не наблюдали. В проиллюстрированном случае ВСМА-ТСВ активировало Т-клетки в меньшей степени, чем обе оцениваемые молекулы GPRC5D ТСВ. Потенциальной причиной может быть разница в уровнях относительной экспрессии GPRC5D и ВСМА (не оценено). Молекула В72 индуцировала существенную активацию Т-клеток только при намного большей концентрации, чем в случае 6624 и 6625, при этом В72 приводила к более высокой общей активации при двух оцениваемых концентрациях. Поскольку мы наблюдали активацию Т-клеток при сходных концентрациях В72 в образцах костного мозга от здоровых доноров, непонятно, зависит ли наблюдаемый эффект В72 в присутствии образцов первичной ММ исключительно от мишени (смотрите Фиг. 21).

Пример 18

Истощение В-клеток после инкубации МКПК от здоровых доноров

Человеческие МКПК выделяли из крови здоровых доноров посредством классического центрифугирования в градиенте плотности. 200000 МКПК на лунку 96-луночного планшета высевали в среду RPMI 1640, содержащую 10% ФБС и 1% пенициллина/стрептомицина. Указанные биспецифические молекулы добавляли до конечной концентрации 50 нМ, 5 нМ, 0,5 нМ или 0,05 нМ в общем объеме 200 мкл на лунку. После инкубации в течение 48 ч при 37°С в увлажненном инкубаторе клетки промывали буфером FACS, а Fc-рецепторы блокировали путем инкубации клеток с Human TruStain FcX™ (Fc-блок, BioLegend) в соответствии с протоколами производителя. Синий краситель для живых клеток (Invitrogen, №L23105) использовали для отделения живых и мертвых клеток (смотрите пример 17). Поверхностную экспрессию следующих маркеров оценивали в течение 30 мин при 4°С: CD19, CD45, CD4, CD38, CD8, CD138 (все от BioLegend). Для абсолютной количественной оценки В-клеток на лунку добавляли 10 мкл на лунку гранул для абсолютного подсчета CountBright (Invitrogen, № С36950) перед анализом методом проточной цитометрии на BD FACS Fortessa. На Фиг. 20А-Г приведены данные по 5 разным здоровым донорам, которых оценивали с указанными биспецифическими молекулами при разных концентрациях антитела, а именно 50 нМ (Фиг. 20А), 5 нМ (Фиг. 20Б), 0,05 нМ (Фиг. 20В) и 0,05 нМ (Фиг. 20Г). Приведено количество В-клеток, нормализованное относительно необработанного контроля, по двум повторам с СО (на донора). Существенное истощение здоровых В-клеток наблюдали как для ВСМА-ТСВ, так и для GPRC5D-TCB 6626, тогда как ни одно из других нацеленных на GPRC5D ТСВ, включая В72, не приводило к существенному истощению В-клеток в случае большинства доноров. Эффект истощения В-клеток, наблюдаемый с 6626, был ограничен концентрациями выше ~ 5 нМ, тогда как ВСМА-ТСВ приводило к истощению здоровых В-клеток уже при концентрациях 0,05 нМ. В целом, это позволяет предположить, что нацеленные на GPRC5D молекулы вероятно имеют намного меньший риск в отношении истощения здоровых В-клеток, что может быть преимуществом в плане безопасности.

Пример 19

Влияние на активацию Т-клеток после инкубации образцов костного мозга от здоровых доноров

Необработанный костный мозг от здоровых доноров (Lonza) оценивали через 1 день после получения образцов. После быстрого лизиса красных кровяных клеток с использованием лизисного буфера от BD Pharm №555899 клетки промывали, ресуспендировали в RPMI 1640 с глутамаксом, содержащей 20% термоинактивированной фетальной бычьей сыворотки, 2% человеческой сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина (все от Gibco), и высевали 100 мкл клеточной суспензии (30000 клеток) на лунку в 96-луночный круглодонный планшет (ТРР). Указанные молекулы добавляли до получения конечного диапазона концентраций от 5 нМ до 0,05 нМ (этапы разведения 1:10) в общем объеме 200 мкл на лунку 96-луночного планшета.

После инкубации в течение ночи при 37°С в увлажненном инкубаторе клетки один раз промывали ФСБ и окрашивали в течение 20 минут при 4°С 50 мкл синего красителя для живых клеток (Invitrogen, № L23105), чтобы отделить живые и мертвые клетки. Поверхностное окрашивание проводили, используя смесь следующих антител, с учетом рекомендаций производителя: CD25 BV605, CD69 APC-Cy7, CD38 BV510, CD138 FITC, CD8 BV711, CD3 РЕ-Су5 и CD4 AlexaFluor700 (все от BioLegend). Для конечного анализа клетки ресуспендировали в 100 мкл буфера FACS и анализировали, используя прибор Fortessa (BD Biosciences). На Фиг. 21 показана активация Т-клеток, определяемая как процент СВ69-положительных CD8⁺ (А) или CD4⁺ Т-клеток (Б) после указанной обработки.

Явная зависимая от концентрации активация Т-клеток в образце костного мозга была выявлена с ВСМА-ТСВ или В72, но не с 6624 или 6625. Это иллюстрирует потенциальное преимущество в плане безопасности таких молекул, как 6624 и 6625, по сравнению с ВСМА-ТСВ или В72 при применении в более высоких дозах.

Пример 20

Высвобождение цитокинов в цельной крови человека от здоровых доноров

Цельную кровь от 6 здоровых доноров собирали в литий-гепариновые пробирки BD Vacutainer и анализировали в течение 3 часов. GPRC5D-TCB 6624 и 6625, а также ненацеленную контрольную молекулу ТСВ разводили в ФСБ (Gibco, №14190) и добавляли 5 мкл в 195 мкл цельной крови в круглодонный 96-луночный планшет (Corning, №Costar 3799) для достижения конечных концентраций 50, 0,5 и 0,005 нМ. Моноклональные антитела Газива (обинутузумаб) и Лемтрада (алемтузумаб) анализировали при аналогичных концентрациях 50, 0,5 и 0,005 нМ, тогда как Эрбитукс (цетуксимаб) исследовали при 50 нМ. Один ФСБ служил контрольным носителем. Через 24 ч инкубации при 37°С планшеты центрифугировали при 1800 g (3000 об/мин) в течение 5 мин. Супернатанты плазмы (~ 70 мкл) собирали и хранили при -80°С перед мультиплексным обнаружением цитокинов, проводимым с использованием набора Millipore (HCYTOMAG-60K) и ридера Luminex LX 200 в соответствии с рекомендациями производителя. Как показано на Фиг. 22А (TNFa человека) и Фиг. 22Б (IL-6 человека), 6624 индуцировало секрецию низких уровней TNFa и IL-6 в сходном диапазоне с Газивой, тогда как 6625 индуцировало даже более низкие уровни оцениваемых цитокинов, что позволяет предположить, что 6624 может иметь благоприятный профиль безопасности в терминах высвобождения цитокинов.

Пример 21

In vivo эффективность разных СРКС5 ВхСВ\3-биспецифических молекул ТСВ

в NCI-H929 (мыши hNSG)

Чтобы дополнительно оценить эффективность молекул GPRC5D ТСВ 6623, 6624, 6625 и 6626, оценивали их потенциал индуцировать регрессию опухолей у имеющих множественную миелому полностью гуманизированных мышей линии NSG. 2,5×10⁶ клеток NCI-H929 с жизнеспособностью > 95,0% ресуспендировали в клеточной культуральной среде RPMI (Gibco) и матригеле GFR (1:1, общий объем 100 мкл) и подкожно инъецировали в правый бок гуманизированных самок мышей NSG (NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ).

Гуманизацию мышей проводили следующим образом: мышей возрастом 4-5 недель на момент начала эксперимента (разводимых в Charles River, Lyon, France) содержали в специальных беспатогенных условиях с суточными циклами 12 ч день/12 ч ночь в соответствии с принятыми руководствами (GV-Solas; Felasa; TierschG). Протокол экспериментального исследования был рассмотрен и одобрен местным органом управления (ROB-55.2-2532.Vet_03-16-10). После поступления животных держали в течение одной недели для привыкания к новой среде и для наблюдения. Постоянное наблюдение за состоянием здоровья осуществляли на регулярной основе. В соответствии с протоколом самок мышей линии NSG в/б (внутрибрюшинно) инъецировали 15 мг/кг бусульфана, за чем через день следовала в/в инъекция 1×10⁵ человеческих гемопоэтических клеток, выделенных из пуповинной крови. Через 16 20 недель после инъекции стволовых клеток у мышей брали кровь и анализировали ее методом проточной цитометрии в отношении успешной гуманизации. Мышей с эффективным прививанием рандомизировали в соответствии с частотой человеческих Т-клеток в разные группы обработки (n = 10/группа).

В это время мышам подкожно инъецировали опухолевые клетки, как описано выше, и раз в неделю обрабатывали соединениями или ФСБ (носитель), когда размер опухолей достигал медианного размера 308 мм³ (диапазон 92-841 мм³). Всем мышам внутривенно инъецировали 0,05 мг/кг и 0,005 мг/кг указанных молекул ТСВ (смотрите Фиг. 23А и 23Б).

Чтобы получить соответствующее количество исходного раствора, соединения разводили гистидиновым буфером (20 мМ гистидин, 140 мМ NaCl, рН 6,0). Рост опухоли измеряли дважды в неделю, используя штангенциркуль, а объем опухолей рассчитывали следующим образом:

Исследование заканчивали на 41 день после инокуляции опухолевых клеток и умерщвляли всех мышей после трех инъекций соединений, а опухоли вырезали и взвешивали. Статистику проводили в соответствии с дисперсионным анализом anova с критерием Тьюки.

Как проиллюстрировано на Фиг. 23А и 23Б, при низкой дозе 0,005 мг/кг ни одна из оцениваемых молекул GPRC5D-TCB не демонстрировала эффективное ингибирование роста опухолей. В противоположность этому, при 0,05 мг/кг мы наблюдали существенные ответы, направленные против роста опухолей, для всех четырех оцениваемых молекул GPRC5D ТСВ по сравнению с группой носителя. На Фиг. 23В-Ж дополнительно продемонстрировано ингибирование роста опухолей для одной мыши на группу обработки. При этом отсутствовала существенная разница между четырьмя оцениваемыми молекулами, подтверждая высокую доклиническую эффективность всех четырех молекул GPRC5D ТСВ.

Пример 22

In vivo SDPK у мышей hFcRn Tg и KO

Чтобы оценить ФК свойства молекул GPRC5D ТСВ 6623, 6624, 6625 и 6626, соответствующие молекулы внутривенно вводили (болюс) через хвостовую вену в дозе 1 мг/кг мышам -/- huFcRn Tg линии 32 (B6.Cg-Fcgrt<tm1Dcr>Tg(FCGRT)32Dcr) или -/- muFcRn (B6.129X1 -FcgrttmlDcr/DcrJ) (JAX laboratories, Bar harbor, USA). Все исследования проводили с одобрения местного ветеринарного регуляторного органа, строго придерживаясь Швейцарских федеральных норм по защите животных и правил Международной ассоциации оценки и аккредитации лабораторных исследований на животных (AAALAC). Кровь брали путем пункции вены (хвостовой вены) в разные моменты времени для получения сыворотки для анализа в указанные моменты времени после введения дозы: 0,083, 7, 24, 48, 72, 168, 336, 504 и 672 часов после введения дозы для -/- huFcRn Tg линии 32 и 0,083, 2, 7, 24, 31, 48, 72 и 96 часов после введения дозы для -/- muFcRn линии. Кровь хранили в течение 20 минут при комнатной температуре для сворачивания, а сыворотку получали путем центрифугирования при 15000 об/мин в течение 5 мин при 4°С и незамедлительно замораживали. Все образцы сыворотки хранили при -20°С до проведения электро-иммунохемилюминесцентного анализа (ECLIA), метода, специфического в отношении человеческого Fab-фрагмента вводимого антитела и его вариантов.

Вкратце, образцы, предварительно разведенные аналитическим буфером, инкубировали с молекулами для захвата и обнаружения в течение 9 мин при 37°С. Биотинилированное mAb<H-Fab(kappa)>M-IgG-Bi использовали в качестве молекулы для захвата, а меченное рутений(II)трис(бипиридилом)32+ мышиное моноклональное антитело mAb<H-Fab(CH1)>M-1.19.31-IgG-S-Ru использовали для обнаружения. Добавляли покрытые стрептавидином магнитные микрочастицы и инкубировали еще в течение 9 мин при 37°С, чтобы обеспечить возможность образования комплекса вследствие взаимодействий биотин стрептавидин. Проводили магнитный захват комплексов на электроде, а хемилюминесцентный сигнал, генерируемый сореагентом трипропиламином (ТПА), измеряли с помощью фотоумножителя. Все образцы сыворотки и образцы положительного или отрицательного контроля анализировали в четырех повторах и калибровали относительно соответствующего вводимого антитела.

Как проиллюстрировано на Фиг. 24 и в таблице 19, все четыре молекулы GPRC5D ТСВ демонстрировали приемлемый ФК профиль у мышей hFcRn tg32 в диапазоне профиля классического IgG. Данные, полученные для мышей FcRn ко, считаются релевантными для оценки неспецифического клеточного поглощения, которое может быть связано с иммуногенностью. Как показано на Фиг. 10Б, 6625 и 6626 демонстрируют сравнимые скорости клиренса, тогда как для 6623 и 6624 они повышены, что позволяет предположить наличие немного большего потенциала в отношении неспецифического клеточного поглощения.

Хотя вышеизложенное изобретение было подробно описано посредством иллюстрации и примеров в целях ясности понимания, описания и примеры не следует воспринимать как ограничивающие объем данного изобретения. Раскрытие всех патентов и научной литературы, цитируемых в данном документе, в полном объеме и явным образом включено посредством ссылки.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Ф. ХОФФМАНН-ЛЯ РОШ АГ

<120> Антитела, связывающиеся с GPRC5D

<130> P35639

<160> 133

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 1

Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr Ala Met Ala

1 5 10

<210> 2

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 2

Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys Ala

1 5 10 15

<210> 3

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 3

His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 4

<211> 14

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 4

Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Gly Ile Asn Leu Met Asn

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 5

His Ala Ser Ile Leu Ala Ser

1 5

<210> 6

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 6

Gln Gln Thr Arg Glu Ser Pro Leu Thr

1 5

<210> 7

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 7

Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ala

1 5 10

<210> 8

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 8

Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 9

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 9

His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr

1 5

<210> 10

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 10

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr

1 5 10 15

<210> 11

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 11

Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 12

Gly Gln Leu Leu Glu Asn Pro Tyr Thr

1 5

<210> 13

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 13

Glu Leu Gln Leu Glu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 14

<211> 110

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 14

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Gly

20 25 30

Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Thr Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro

65 70 75 80

Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg Glu

85 90 95

Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 15

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 15

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Ala Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 16

<211> 112

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 16

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Pro Leu Ser Val Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Phe Gln Lys Pro Gly Lys Ser

35 40 45

Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr His Cys Gly Gln Leu

85 90 95

Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Glu Leu Glu Leu Lys

100 105 110

<210> 17

<211> 217

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 17

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val Ser Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Gly

20 25 30

Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro Lys

35 40 45

Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Thr Arg

50 55 60

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp Pro

65 70 75 80

Val Gln Ala Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg Glu

85 90 95

Ser Pro Leu Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Ile Lys Arg Thr

100 105 110

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu

115 120 125

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

130 135 140

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

145 150 155 160

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

165 170 175

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

180 185 190

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

195 200 205

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 18

<211> 232

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 18

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val

115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

195 200 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 19

<211> 447

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 19

Glu Leu Gln Leu Glu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 20

<211> 672

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 20

Glu Leu Gln Leu Glu Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Thr Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly

210 215 220

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser

225 230 235 240

Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser

245 250 255

Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys

260 265 270

Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala

275 280 285

Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala

290 295 300

Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr

305 310 315 320

Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys

325 330 335

Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

340 345 350

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

355 360 365

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

370 375 380

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

385 390 395 400

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

405 410 415

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

420 425 430

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

435 440 445

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

450 455 460

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

465 470 475 480

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

485 490 495

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

500 505 510

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

515 520 525

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

530 535 540

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr

545 550 555 560

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

565 570 575

Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys

580 585 590

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

595 600 605

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

610 615 620

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

625 630 635 640

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

645 650 655

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

660 665 670

<210> 21

<211> 219

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 21

Asp Ile Val Met Thr Gln Ala Pro Leu Ser Val Ser Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Phe Gln Lys Pro Gly Lys Ser

35 40 45

Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Glu Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr His Cys Gly Gln Leu

85 90 95

Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Glu Leu Glu Leu Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg

115 120 125

Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 22

<211> 232

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 22

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val

115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

195 200 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 23

<211> 446

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 23

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Ala Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 24

<211> 671

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 24

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Ala Thr Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Ile Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Gln Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu

225 230 235 240

Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr

245 250 255

Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro

260 265 270

Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro

275 280 285

Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala

290 295 300

Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys

305 310 315 320

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

325 330 335

Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

340 345 350

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

355 360 365

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

370 375 380

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

385 390 395 400

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

405 410 415

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

420 425 430

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

435 440 445

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

450 455 460

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

465 470 475 480

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

485 490 495

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

500 505 510

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

515 520 525

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

530 535 540

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

545 550 555 560

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

565 570 575

Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

580 585 590

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

595 600 605

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

610 615 620

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

625 630 635 640

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

645 650 655

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

660 665 670

<210> 25

<211> 216

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 25

Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Val Gly Gly Asn

20 25 30

Tyr Val Phe Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Ala Thr Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Arg Ser Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ala

50 55 60

Gly Ser Lys Ser Gly Ser Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg

65 70 75 80

Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Asp Ser Leu

85 90 95

Ser Gly Phe Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gln

100 105 110

Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Lys Lys

115 120 125

Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe Tyr

130 135 140

Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val Lys

145 150 155 160

Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys Tyr

165 170 175

Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser His

180 185 190

Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu Lys

195 200 205

Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

210 215

<210> 26

<211> 232

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 26

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val

115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

195 200 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 27

<211> 447

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 27

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Gly Lys Ala Tyr Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 28

<211> 672

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 28

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Ser Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Tyr Ile Ser Ser Ser Gly Ser Thr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Tyr Gly Lys Ala Tyr Asp Gln Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly

210 215 220

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser

225 230 235 240

Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser

245 250 255

Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys

260 265 270

Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala

275 280 285

Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala

290 295 300

Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr

305 310 315 320

Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys

325 330 335

Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

340 345 350

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

355 360 365

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

370 375 380

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

385 390 395 400

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

405 410 415

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

420 425 430

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

435 440 445

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

450 455 460

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

465 470 475 480

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

485 490 495

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

500 505 510

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

515 520 525

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

530 535 540

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr

545 550 555 560

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

565 570 575

Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys

580 585 590

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

595 600 605

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

610 615 620

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

625 630 635 640

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

645 650 655

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

660 665 670

<210> 29

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 29

Thr Tyr Ala Met Asn

1 5

<210> 30

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 30

Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 31

<211> 14

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 31

His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe Ala Tyr

1 5 10

<210> 32

<211> 14

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 32

Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

1 5 10

<210> 33

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 33

Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro

1 5

<210> 34

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 34

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val

1 5

<210> 35

<211> 125

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 35

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 36

<211> 109

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 36

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 37

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 37

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 38

<211> 105

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 38

Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu

1 5 10 15

Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe

20 25 30

Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val

35 40 45

Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys

50 55 60

Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser

65 70 75 80

His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu

85 90 95

Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

100 105

<210> 39

<211> 328

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 39

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

325

<210> 40

<211> 207

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 40

Met Gln Ser Gly Thr His Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser

1 5 10 15

Val Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Gly Ile Thr

20 25 30

Gln Thr Pro Tyr Lys Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr

35 40 45

Cys Pro Gln Tyr Pro Gly Ser Glu Ile Leu Trp Gln His Asn Asp Lys

50 55 60

Asn Ile Gly Gly Asp Glu Asp Asp Lys Asn Ile Gly Ser Asp Glu Asp

65 70 75 80

His Leu Ser Leu Lys Glu Phe Ser Glu Leu Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr

85 90 95

Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Lys Pro Glu Asp Ala Asn Phe Tyr Leu

100 105 110

Tyr Leu Arg Ala Arg Val Cys Glu Asn Cys Met Glu Met Asp Val Met

115 120 125

Ser Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp Ile Cys Ile Thr Gly Gly Leu

130 135 140

Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys

145 150 155 160

Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn

165 170 175

Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg

180 185 190

Lys Gly Gln Arg Asp Leu Tyr Ser Gly Leu Asn Gln Arg Arg Ile

195 200 205

<210> 41

<211> 198

<212> Белок

<213> Macaca fascicularis

<400> 41

Met Gln Ser Gly Thr Arg Trp Arg Val Leu Gly Leu Cys Leu Leu Ser

1 5 10 15

Ile Gly Val Trp Gly Gln Asp Gly Asn Glu Glu Met Gly Ser Ile Thr

20 25 30

Gln Thr Pro Tyr Gln Val Ser Ile Ser Gly Thr Thr Val Ile Leu Thr

35 40 45

Cys Ser Gln His Leu Gly Ser Glu Ala Gln Trp Gln His Asn Gly Lys

50 55 60

Asn Lys Glu Asp Ser Gly Asp Arg Leu Phe Leu Pro Glu Phe Ser Glu

65 70 75 80

Met Glu Gln Ser Gly Tyr Tyr Val Cys Tyr Pro Arg Gly Ser Asn Pro

85 90 95

Glu Asp Ala Ser His His Leu Tyr Leu Lys Ala Arg Val Cys Glu Asn

100 105 110

Cys Met Glu Met Asp Val Met Ala Val Ala Thr Ile Val Ile Val Asp

115 120 125

Ile Cys Ile Thr Leu Gly Leu Leu Leu Leu Val Tyr Tyr Trp Ser Lys

130 135 140

Asn Arg Lys Ala Lys Ala Lys Pro Val Thr Arg Gly Ala Gly Ala Gly

145 150 155 160

Gly Arg Gln Arg Gly Gln Asn Lys Glu Arg Pro Pro Pro Val Pro Asn

165 170 175

Pro Asp Tyr Glu Pro Ile Arg Lys Gly Gln Gln Asp Leu Tyr Ser Gly

180 185 190

Leu Asn Gln Arg Arg Ile

195

<210> 42

<211> 225

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 42

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro

225

<210> 43

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 43

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 44

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 44

Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

1 5 10

<210> 45

<211> 345

<212> Белок

<213> Homo sapiens

<400> 45

Met Tyr Lys Asp Cys Ile Glu Ser Thr Gly Asp Tyr Phe Leu Leu Cys

1 5 10 15

Asp Ala Glu Gly Pro Trp Gly Ile Ile Leu Glu Ser Leu Ala Ile Leu

20 25 30

Gly Ile Val Val Thr Ile Leu Leu Leu Leu Ala Phe Leu Phe Leu Met

35 40 45

Arg Lys Ile Gln Asp Cys Ser Gln Trp Asn Val Leu Pro Thr Gln Leu

50 55 60

Leu Phe Leu Leu Ser Val Leu Gly Leu Phe Gly Leu Ala Phe Ala Phe

65 70 75 80

Ile Ile Glu Leu Asn Gln Gln Thr Ala Pro Val Arg Tyr Phe Leu Phe

85 90 95

Gly Val Leu Phe Ala Leu Cys Phe Ser Cys Leu Leu Ala His Ala Ser

100 105 110

Asn Leu Val Lys Leu Val Arg Gly Cys Val Ser Phe Ser Trp Thr Thr

115 120 125

Ile Leu Cys Ile Ala Ile Gly Cys Ser Leu Leu Gln Ile Ile Ile Ala

130 135 140

Thr Glu Tyr Val Thr Leu Ile Met Thr Arg Gly Met Met Phe Val Asn

145 150 155 160

Met Thr Pro Cys Gln Leu Asn Val Asp Phe Val Val Leu Leu Val Tyr

165 170 175

Val Leu Phe Leu Met Ala Leu Thr Phe Phe Val Ser Lys Ala Thr Phe

180 185 190

Cys Gly Pro Cys Glu Asn Trp Lys Gln His Gly Arg Leu Ile Phe Ile

195 200 205

Thr Val Leu Phe Ser Ile Ile Ile Trp Val Val Trp Ile Ser Met Leu

210 215 220

Leu Arg Gly Asn Pro Gln Phe Gln Arg Gln Pro Gln Trp Asp Asp Pro

225 230 235 240

Val Val Cys Ile Ala Leu Val Thr Asn Ala Trp Val Phe Leu Leu Leu

245 250 255

Tyr Ile Val Pro Glu Leu Cys Ile Leu Tyr Arg Ser Cys Arg Gln Glu

260 265 270

Cys Pro Leu Gln Gly Asn Ala Cys Pro Val Thr Ala Tyr Gln His Ser

275 280 285

Phe Gln Val Glu Asn Gln Glu Leu Ser Arg Ala Arg Asp Ser Asp Gly

290 295 300

Ala Glu Glu Asp Val Ala Leu Thr Ser Tyr Gly Thr Pro Ile Gln Pro

305 310 315 320

Gln Thr Val Asp Pro Thr Gln Glu Cys Phe Ile Pro Gln Ala Lys Leu

325 330 335

Ser Pro Gln Gln Asp Ala Gly Gly Val

340 345

<210> 46

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 46

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 47

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 47

Glu Leu Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Ala Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 48

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 48

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 49

<211> 117

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 49

Glu Leu Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 50

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 50

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser

20 25 30

Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 51

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 51

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser

20 25 30

Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 52

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 52

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser

20 25 30

Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 53

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 53

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser

20 25 30

Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 54

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 54

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser

20 25 30

Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Gln Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 55

<211> 111

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 55

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser

20 25 30

Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 56

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 56

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 57

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 57

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 58

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 58

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 59

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 59

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 60

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 60

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 61

<211> 116

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 61

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 62

<211> 112

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 62

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr His Cys Gly Gln Leu

85 90 95

Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 63

<211> 112

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 63

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ser

35 40 45

Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr His Cys Gly Gln Leu

85 90 95

Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 64

<211> 112

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 64

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr His Cys Gly Gln Leu

85 90 95

Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 65

<211> 112

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 65

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr His Cys Gly Gln Leu

85 90 95

Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 66

<211> 112

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 66

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

35 40 45

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

65 70 75 80

Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr His Cys Gly Gln Leu

85 90 95

Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 67

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 67

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro His Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Asn Met Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Glu Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Lys Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 68

<211> 232

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 68

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val

115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

195 200 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 69

<211> 452

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 69

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Phe

20 25 30

Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Asn Thr Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Thr Arg Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Glu Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Leu Thr Tyr Tyr Gly Arg Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

225 230 235 240

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

245 250 255

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

260 265 270

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

275 280 285

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

290 295 300

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

305 310 315 320

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro

325 330 335

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

340 345 350

Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

355 360 365

Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

370 375 380

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

385 390 395 400

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr

405 410 415

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

420 425 430

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

435 440 445

Ser Pro Gly Lys

450

<210> 70

<211> 677

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 70

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Phe

20 25 30

Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Asn Thr Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Thr Arg Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Glu Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Leu Thr Tyr Tyr Gly Arg Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

115 120 125

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

130 135 140

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145 150 155 160

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

165 170 175

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

180 185 190

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

195 200 205

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser

210 215 220

Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val

225 230 235 240

Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu

245 250 255

Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

260 265 270

Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly

275 280 285

Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu

290 295 300

Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp

305 310 315 320

Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe

325 330 335

Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly

340 345 350

Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly

355 360 365

Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val

370 375 380

Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe

385 390 395 400

Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val

405 410 415

Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val

420 425 430

Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys

435 440 445

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala

450 455 460

Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr

465 470 475 480

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val

485 490 495

Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val

500 505 510

Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser

515 520 525

Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu

530 535 540

Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala

545 550 555 560

Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro

565 570 575

Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln

580 585 590

Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala

595 600 605

Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr

610 615 620

Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu

625 630 635 640

Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser

645 650 655

Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser

660 665 670

Leu Ser Pro Gly Lys

675

<210> 71

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 71

Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Tyr Asn Leu Ala Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Ser Val Ser Ile Asn Cys Lys Ala Ser Lys Ser Ile Ser Lys Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Asn Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Gly Ser Thr Leu Gln Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Ser Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Gly Leu Tyr Tyr Cys Gln Gln His Asn Glu Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 72

<211> 454

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 72

Gln Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser His

1 5 10 15

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ser Phe Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr

20 25 30

Gly Met Gly Val Asn Trp Ile Arg Gln Pro Ser Gly Lys Gly Leu Glu

35 40 45

Trp Leu Ala Ser Ile Trp Trp Asn Gly Asn Thr Tyr Asn Asn Pro Ser

50 55 60

Leu Lys Ser Arg Leu Thr Val Ser Lys Asp Thr Ser Asn Asn Gln Ala

65 70 75 80

Phe Leu Lys Val Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr

85 90 95

Cys Val His Thr Arg Gly Ile Ile Arg Gly Arg Gly Leu Phe Phe Asp

100 105 110

Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys

115 120 125

Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly

130 135 140

Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro

145 150 155 160

Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr

165 170 175

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val

180 185 190

Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn

195 200 205

Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro

210 215 220

Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu

225 230 235 240

Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp

245 250 255

Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp

260 265 270

Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly

275 280 285

Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn

290 295 300

Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp

305 310 315 320

Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly

325 330 335

Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu

340 345 350

Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn

355 360 365

Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile

370 375 380

Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr

385 390 395 400

Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys

405 410 415

Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys

420 425 430

Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu

435 440 445

Ser Leu Ser Pro Gly Lys

450

<210> 73

<211> 441

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 73

Gln Thr Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Val

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala

100 105 110

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

115 120 125

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

130 135 140

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

145 150 155 160

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

180 185 190

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

195 200 205

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

210 215 220

Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

225 230 235 240

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

245 250 255

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

260 265 270

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

275 280 285

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

290 295 300

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

305 310 315 320

Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

325 330 335

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu

340 345 350

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

355 360 365

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

370 375 380

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

385 390 395 400

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

405 410 415

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

420 425 430

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 74

<211> 232

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 74

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Ser

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Ala Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val

115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

195 200 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 75

<211> 448

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 75

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Leu Ile Asn Pro Tyr Asn Ser Asp Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Leu

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Val Ala Leu Arg Val Ala Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

115 120 125

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

130 135 140

Cys Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

145 150 155 160

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

165 170 175

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

180 185 190

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

195 200 205

Asn Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

210 215 220

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

225 230 235 240

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

245 250 255

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

260 265 270

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

275 280 285

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

290 295 300

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

305 310 315 320

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr

325 330 335

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu

340 345 350

Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys

355 360 365

Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

370 375 380

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

385 390 395 400

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

405 410 415

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

420 425 430

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 76

<211> 214

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 76

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asn Val Ala Thr His

20 25 30

Val Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Tyr Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Arg Tyr Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 77

<211> 445

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 77

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Ala Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Trp Pro Met Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

210 215 220

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

225 230 235 240

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

245 250 255

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

260 265 270

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

275 280 285

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

290 295 300

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

305 310 315 320

Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

325 330 335

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser

340 345 350

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys

355 360 365

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

370 375 380

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

385 390 395 400

Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

405 410 415

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

420 425 430

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 78

<211> 215

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 78

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ala Tyr

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Met Tyr Asp Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Glu Arg Trp Pro

85 90 95

Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 79

<211> 670

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 79

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Ala Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Tyr Trp Pro Met Ser Leu Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr

100 105 110

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

115 120 125

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

130 135 140

Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

145 150 155 160

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

165 170 175

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

180 185 190

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

195 200 205

Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly Ser

210 215 220

Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr

225 230 235 240

Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly

245 250 255

Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly

260 265 270

Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly

275 280 285

Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu

290 295 300

Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala

305 310 315 320

Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

325 330 335

Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

340 345 350

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

355 360 365

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

370 375 380

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

385 390 395 400

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

405 410 415

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

420 425 430

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

435 440 445

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe

450 455 460

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

465 470 475 480

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

485 490 495

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

500 505 510

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

515 520 525

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

530 535 540

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

545 550 555 560

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

565 570 575

Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val

580 585 590

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

595 600 605

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

610 615 620

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

625 630 635 640

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

645 650 655

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

660 665 670

<210> 80

<211> 232

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 80

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Thr Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Gly Asn Phe Gly Asn Ser Tyr Val Ser Trp Phe

100 105 110

Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val

115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

195 200 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 81

<211> 107

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 81

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro His Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Ser Ile Glu Cys Leu Ala Ser Glu Gly Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Ala Trp Phe His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ala Ser Ser Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Asn Met Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Glu Gly Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Tyr Lys Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 82

<211> 122

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 82

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Met Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Phe

20 25 30

Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Thr Lys Ala Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Asn Thr Gly Gly Gly Tyr Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Val Ser Arg Asp Asn Thr Arg Ser Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Glu Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg His Leu Thr Tyr Tyr Gly Arg Tyr Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 83

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 83

Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr Ala Met Ala

1 5 10

<210> 84

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 84

Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Ala

<210> 85

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 85

Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 86

<211> 8

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 86

His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 87

<211> 15

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 87

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Gly Ile Asn Leu Met Asn

1 5 10 15

<210> 88

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 88

His Ala Ser Ile Leu Ala Ser

1 5

<210> 89

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 89

Gln Gln Thr Arg Glu Ser Pro Leu Thr

1 5

<210> 90

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 90

Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr Gly Met Ala

1 5 10

<210> 91

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 91

Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 92

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 92

Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 93

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 93

His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr

1 5

<210> 94

<211> 16

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 94

Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr

1 5 10 15

<210> 95

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 95

Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 96

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 96

Arg Met Ser Asn Arg Ala Ser

1 5

<210> 97

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 97

Gly Gln Leu Leu Glu Asn Pro Tyr Thr

1 5

<210> 98

<211> 5

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 98

Ser Tyr Ala Met Asn

1 5

<210> 99

<211> 19

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 99

Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 100

<211> 14

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 100

His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr Gly Tyr

1 5 10

<210> 101

<211> 14

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 101

Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn

1 5 10

<210> 102

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 102

Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro

1 5

<210> 103

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 103

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val

1 5

<210> 104

<211> 125

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 104

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr

100 105 110

Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120 125

<210> 105

<211> 109

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 105

Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn

85 90 95

Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 106

<211> 10

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 106

Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr Thr Met Asn

1 5 10

<210> 107

<211> 17

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 107

Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 108

<211> 13

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 108

Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val

1 5 10

<210> 109

<211> 11

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 109

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 110

<211> 7

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 110

Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser

1 5

<210> 111

<211> 9

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 111

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr

1 5

<210> 112

<211> 122

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 112

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 113

<211> 106

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 113

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105

<210> 114

<211> 219

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 114

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr His Cys Gly Gln Leu

85 90 95

Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg

115 120 125

Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 115

<211> 232

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 115

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr

100 105 110

Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val

115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

195 200 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 116

<211> 446

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 116

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 117

<211> 671

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 117

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu

225 230 235 240

Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr

245 250 255

Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro

260 265 270

Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro

275 280 285

Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala

290 295 300

Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys

305 310 315 320

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

325 330 335

Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

340 345 350

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

355 360 365

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

370 375 380

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

385 390 395 400

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

405 410 415

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

420 425 430

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

435 440 445

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

450 455 460

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

465 470 475 480

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

485 490 495

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

500 505 510

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

515 520 525

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

530 535 540

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

545 550 555 560

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

565 570 575

Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

580 585 590

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

595 600 605

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

610 615 620

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

625 630 635 640

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

645 650 655

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

660 665 670

<210> 118

<211> 219

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 118

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ser

35 40 45

Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr His Cys Gly Gln Leu

85 90 95

Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg

115 120 125

Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 119

<211> 232

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 119

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr

100 105 110

Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val

115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

195 200 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 120

<211> 446

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 120

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 121

<211> 671

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 121

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser Leu

225 230 235 240

Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr

245 250 255

Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro

260 265 270

Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala Pro

275 280 285

Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala Ala

290 295 300

Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr Cys

305 310 315 320

Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu

325 330 335

Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

340 345 350

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

355 360 365

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

370 375 380

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

385 390 395 400

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

405 410 415

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

420 425 430

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

435 440 445

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

450 455 460

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

465 470 475 480

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

485 490 495

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

500 505 510

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

515 520 525

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

530 535 540

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

545 550 555 560

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

565 570 575

Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

580 585 590

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

595 600 605

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

610 615 620

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

625 630 635 640

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

645 650 655

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

660 665 670

<210> 122

<211> 218

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 122

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser

20 25 30

Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 123

<211> 232

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 123

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr

100 105 110

Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val

115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

195 200 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 124

<211> 447

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 124

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 125

<211> 672

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 125

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly

210 215 220

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser

225 230 235 240

Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser

245 250 255

Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys

260 265 270

Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala

275 280 285

Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala

290 295 300

Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr

305 310 315 320

Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys

325 330 335

Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

340 345 350

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

355 360 365

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

370 375 380

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

385 390 395 400

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

405 410 415

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

420 425 430

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

435 440 445

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

450 455 460

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

465 470 475 480

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

485 490 495

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

500 505 510

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

515 520 525

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

530 535 540

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr

545 550 555 560

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

565 570 575

Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys

580 585 590

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

595 600 605

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

610 615 620

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

625 630 635 640

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

645 650 655

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

660 665 670

<210> 126

<211> 218

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 126

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser

20 25 30

Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg Lys

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 127

<211> 232

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 127

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Gln Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Arg Ile Arg Ser Lys Tyr Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr

85 90 95

Tyr Cys Val Arg His Thr Thr Phe Pro Ser Ser Tyr Val Ser Tyr Tyr

100 105 110

Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val

115 120 125

Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys

130 135 140

Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg

145 150 155 160

Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn

165 170 175

Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser

180 185 190

Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys

195 200 205

Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr

210 215 220

Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 128

<211> 447

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 128

Glu Leu Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 129

<211> 672

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 129

Glu Leu Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly

210 215 220

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Pro Ser

225 230 235 240

Leu Thr Val Ser Pro Gly Gly Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser

245 250 255

Thr Gly Ala Val Thr Thr Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys

260 265 270

Pro Gly Gln Ala Phe Arg Gly Leu Ile Gly Gly Thr Asn Lys Arg Ala

275 280 285

Pro Gly Thr Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Leu Gly Gly Lys Ala

290 295 300

Ala Leu Thr Leu Ser Gly Ala Gln Pro Glu Asp Glu Ala Glu Tyr Tyr

305 310 315 320

Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asn Leu Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys

325 330 335

Leu Thr Val Leu Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

340 345 350

Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly

355 360 365

Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn

370 375 380

Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln

385 390 395 400

Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser

405 410 415

Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser

420 425 430

Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr

435 440 445

His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser

450 455 460

Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg

465 470 475 480

Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro

485 490 495

Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

500 505 510

Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

515 520 525

Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

530 535 540

Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr

545 550 555 560

Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu

565 570 575

Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys

580 585 590

Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser

595 600 605

Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp

610 615 620

Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser

625 630 635 640

Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala

645 650 655

Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

660 665 670

<210> 130

<211> 219

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 130

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Ile Thr Tyr Val Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Lys Ser

35 40 45

Pro Gln Val Leu Ile Tyr Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr His Cys Gly Gln Leu

85 90 95

Leu Glu Asn Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Arg

115 120 125

Lys Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 131

<211> 229

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 131

Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Thr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Leu Ile Asn Pro Tyr Lys Gly Val Ser Thr Tyr Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Ser Gly Tyr Tyr Gly Asp Ser Asp Trp Tyr Phe Asp Val Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Val Ala Ala Pro

115 120 125

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

130 135 140

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

145 150 155 160

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

165 170 175

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

180 185 190

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

195 200 205

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

210 215 220

Asn Arg Gly Glu Cys

225

<210> 132

<211> 446

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 132

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 133

<211> 669

<212> Белок

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Синтетическая конструкция

<400> 133

Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Asn Tyr

20 25 30

Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg His Asp Arg Gly Gly Leu Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Glu Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Glu Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Gly Gly Gly Gly

210 215 220

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

225 230 235 240

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser

245 250 255

Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

260 265 270

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu Glu Ser Gly Val

275 280 285

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr

290 295 300

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln

305 310 315 320

Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

325 330 335

Lys Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

340 345 350

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

355 360 365

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

370 375 380

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

385 390 395 400

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

405 410 415

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

420 425 430

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys

435 440 445

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

450 455 460

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

465 470 475 480

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys

485 490 495

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

500 505 510

Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

515 520 525

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

530 535 540

Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

545 550 555 560

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Cys

565 570 575

Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu Val Lys

580 585 590

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

595 600 605

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

610 615 620

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

625 630 635 640

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

645 650 655

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

660 665

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к биспецифической антигенсвязывающей молекуле, специфически связывающейся с GPRC5D и CD3. Указанная молекула содержит HCDR1-3 с SEQ ID NO: 83, 85 и 86, LCDR1-3 с SEQ ID NO: 87, 88 и 89, HCDR1-3 с SEQ ID NO: 98, 99, 100 и LCDR1-3 с SEQ ID NO: 101, 102, 103. Кроме того, настоящее изобретение также относится к полинуклеотиду, кодирующему указанную молекулу, вектору экспрессии, клетке-хозяину, способу получения такой молекулы, а также к фармацевтической композиции, ее содержащей. Настоящее изобретение обеспечивает биспецифические антигенсвязывающие молекулы со специфичностью как к GPRC5D, так и CD3. 6 н. и 20 з.п. ф-лы, 25 ил., 19 табл., 22 пр.

1. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула, специфически связывающаяся с GPRC5D и CD3, содержащая

первый антигенсвязывающий фрагмент, который связывается с первым антигеном, причем первый антиген представляет собой GPRC5D, а первый антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 83, HCDR 2 с SEQ ID NO: 85 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 86, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 87, LCDR 2 с SEQ ID NO: 88 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 89, и второй антигенсвязывающий фрагмент, который связывается со вторым антигеном, причем второй антиген представляет собой CD3, а второй антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), содержащую определяющую комплементарность область тяжелой цепи (HCDR) 1 с SEQ ID NO: 98, HCDR 2 с SEQ ID NO: 99 и HCDR 3 с SEQ ID NO: 100, и вариабельную область легкой цепи (VL), содержащую определяющую комплементарность область легкой цепи (LCDR) 1 с SEQ ID NO: 101, LCDR 2 с SEQ ID NO: 102 и LCDR 3 с SEQ ID NO: 103.

2. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по п. 1, в которой VH первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной последовательности SEQ ID NO: 48, и в которой VL первого антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 53.

3. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по п. 1 или 2, в которой VH второго антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 104, a VL второго антигенсвязывающего фрагмента содержит аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 105.

4. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 1-3, в которой первый и/или второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab.

5. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 1-4, в которой второй антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, причем вариабельные домены VL и VH или константные домены CL и СН1, в частности вариабельные домены VL и VH, легкой цепи Fab и тяжелой цепи Fab замещены друг другом.

6. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 1-5, в которой первый антигенсвязывающий фрагмент представляет собой молекулу Fab, причем в константном домене аминокислота в позиции 124 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat) и аминокислота в позиции 123 независимо замещена лизином (K), аргинином (R) или гистидином (Н) (нумерация в соответствии с Kabat), а в константном домене СН1 аминокислота в позиции 147 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat) и аминокислота в позиции 213 независимо замещена глутаминовой кислотой (Е) или аспарагиновой кислотой (D) (нумерация в соответствии с индексом EU по Kabat).

7. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 1-6, в которой первый и второй антигенсвязывающие фрагменты слиты друг с другом необязательно посредством пептидного линкера.

8. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 1-7, в которой каждый из первого и второго антигенсвязывающих фрагментов представляет собой молекулу Fab и в которой (i) второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента или (ii) первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента.

9. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 1-8, содержащая Fc-домен, состоящий из первой и второй субъединиц.

10. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по п. 9, в которой каждый из первого, второго и, в случае наличия, третьего антигенсвязывающего фрагмента представляет собой молекулу Fab, и в которой (i) второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab первого антигенсвязывающего фрагмента, а первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой субъединицы Fc-домена или (ii) первый антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом тяжелой цепи Fab второго антигенсвязывающего фрагмента, а второй антигенсвязывающий фрагмент слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом первой субъединицы Fc-домена, и в которой третий антигенсвязывающий фрагмент, в случае наличия, слит на С-конце тяжелой цепи Fab с N-концом второй субъединицы Fc-домена.

11. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по п. 9 или 10, в которой Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG.

12. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по п. 11, в которой Fc-домен представляет собой Fc-домен IgG₁.

13. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 9-12, в которой Fc-домен представляет собой Fc-домен человека.

14. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 9-13, в которой аминокислотный остаток в СН3-домене первой субъединицы Fc-домена замещен аминокислотным остатком, имеющим больший объем боковой цепи, с созданием, таким образом, выпуклости в СН3-домене первой субъединицы, которая может располагаться в полости в СН3-домене второй субъединицы, а аминокислотный остаток в СН3-домене второй субъединицы Fc-домена замещен аминокислотным остатком, имеющим меньший объем боковой цепи, с созданием, таким образом, полости в СН3-домене второй субъединицы, в которой может располагаться выпуклость в СН3-домене первой субъединицы.

15. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 9-14, в которой Fc-домен содержит одну или более аминокислотных замен, которые уменьшают связывание с Fc-рецептором и/или эффекторную функцию.

16. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из предыдущих пунктов, содержащая полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 122, полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 123, полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 124, полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая является по меньшей мере на 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% идентичной аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 125.

17. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из предыдущих пунктов, содержащая полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 122, полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 123, полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 124, полипептид, включающий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 125.

18. Полинуклеотид, кодирующий биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, специфически связывающуюся с GPRC5D и CD3, по любому из пп. 1-17.

19. Вектор экспрессии, содержащий полинуклеотид по п. 18, кодирующий биспецифическую антигенсвязывающую молекулу, специфически связывающуюся с GPRC5D и CD3, по любому из пп. 1-17.

20. Клетка-хозяин для получения биспецифической антигенсвязывающей молекулы по любому из пп. 1-17, содержащая полинуклеотид по п. 18 или вектор экспрессии по п. 19.

21. Способ получения биспецифической антигенсвязывающей молекулы, специфически связывающейся с GPRC5D и CD3, включающий этапы а) культивирования клетки-хозяина по п. 20 в условиях, подходящих для экспрессии биспецифической антигенсвязывающей молекулы, и б) выделения биспецифической антигенсвязывающей молекулы.

22. Фармацевтическая композиция для лечения заболеваний, ассоциированных с экспрессией GPRC5D, содержащая биспецифическую антигенсвязывающую молекулу по любому из пп. 1-17 и фармацевтически приемлемый носитель.

23. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 1-17 или фармацевтическая композиция по п. 22 для применения в качестве лекарственного средства для лечения заболеваний, ассоциированных с экспрессией GPRC5D.

24. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула по любому из пп. 1-17 или фармацевтическая композиция по п. 22 для применения в лечении заболеваний, ассоциированных с экспрессией GPRC5D.

25. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула или фармацевтическая композиция по п. 24, причем заболевание представляет собой рак или аутоиммунное заболевание.

26. Биспецифическая антигенсвязывающая молекула или фармацевтическая композиция по п. 25, причем заболевание представляет собой множественную миелому.