АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С РАКОВЫМИ КЛЕТКАМИ И ОБЕСПЕЧИВАЮТ НАПРАВЛЕННЫЙ ПЕРЕНОС РАДИОНУКЛИДОВ К УКАЗАННЫМ КЛЕТКАМ Российский патент 2025 года по МПК C07K16/30 C07K16/44 A61K51/04 A61P35/00 

Область техники, к которой относится изобретение

В настоящем изобретении описаны антитела, которые связываются с антигенами на клетках-мишенях и которые обеспечивают направленный перенос (таргетинг) радионуклидов к указанным клеткам, и способы их применения.

Предпосылки создания изобретения

Для направленного переноса лекарственных средств к раковым клеткам созданы моноклональные антитела. Путем конъюгации токсического агента с антителом, которое связывается с опухолеассоциированным антигеном, можно обеспечивать более специфический цитолиз опухолей с меньшей степенью повреждения окружающих тканей.

При осуществлении претаргетной радиоиммунотерапии (PRIT) используют конструкцию антитела, которая обладает высокой аффинностью к опухолеассоциированому антигену, с одной стороны, и к радиоактивномеченному соединению, с другой стороны. На первой стадии вводят антитело, и оно локализуется внутри опухоли. После этого вводят радиоактивномеченное соединение. Поскольку радиоактивномеченное соединение является небольшим, оно может быстро достигать опухоли и быстро выводиться, что снижает радиационную нагрузку вне опухоли (Goldenberg и др., Theranostics 2(5), 2012, сс.523-540). Аналогичную процедуру можно применять также для визуализации. Для предварительного таргетинга можно применять биспецифическое антитело или системы на основе авидина-биотина, хотя последние обладают недостатком, связанным с тем, что система авидин/стрептавдин является иммуногенной.

При осуществлении методов претаргетной радиоиммунотерапии или визуализации, как правило, применяют очищающий или блокирующий агент, который вводят между стадией введения антитела и стадией введения радиоактивномеченного соединения. Целью является клиренс антитела из крови и/или блокада сайта связывания циркулирующего антитела с радиоактивномеченным соединением (см, например, Karacay и др., Bioconj. Chem., 13(5), 2002, сс.1054-1070). Применение очищающего или блокирующего агента позволяет использовать достаточные для эффективного лечения уровни радиоактивности, ограничивая при этом нежелательную токсичность, но при этом необходимо тщательно выбирать время и дозировку. Таким образом, фаза очищения представляет собой усложняющий аспект для методов предварительного таргетинга.

Краткое изложение сущности изобретения

В настоящем изобретении предложены наборы антител, которые можно применять в методах предварительного таргетинга, и способы их применения.

Одним из объектов настоящего изобретения является набор антител, содержащий:

I) первое антитело, которое связывается с антигеном, экспрессируемым на поверхности клетки-мишени, и которое дополнительно содержит V_H-домен антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения, но которое не содержит V_L-домен антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения; и

II) второе антитело, которое связывается с антигеном, экспрессируемым на поверхности клетки-мишени, и которое дополнительно содержит V_L-домен антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения, но которое не содержит V_H-домен антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения,

в котором указанный V_H-домен первого антитела и указанный V_L-домен второго антитела вместе могут образовывать функциональный антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченного соединения.

Ни первое, ни второе антитело не содержит их собственный антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченного соединения. Первое антитело имеет только V_H-домен из функционального сайта связывания для радиоактивномеченного соединения, но в нем отсутствует V_L-домен. Второе антитело имеет только V_L-домен, но в нем отсутствует V_H-домен.

Функциональный антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченного соединения образуется тогда, когда V_H- и V_L-домены первого и второго антител объединяются. Это может происходить, например, когда первое и второе антитела связываются с одной и той же индивидуальной клеткой-мишенью или с соседними клетками.

Первое и второе антитела, указанные в настоящем описании, можно обозначать в контексте настоящего описания как «однодоменные разделенные (сплит) антитела», «сплит-антитела» или «полуантитела». V_H- и V_L-домены, которые вместе образуют антигенсвязывающий центр, обладающий способностью связываться с радиоактивномеченным соединением, разделены между двумя антителами, и не присутствуют в качестве части одного и того же антитела.

Формат сплит-доменов означает, что радиоактивномеченное соединение не может связываться самостоятельно ни с первым антителом, ни связываться самостоятельно со вторым антителом. В крови ассоциация между первым и вторым антителом является слабой или нестабильной и поэтому связывание с радиоактивномеченным соединением является слабым или нестабильным.

Антиген, который экспрессируется на поверхности клетки-мишени, можно обозначать в настоящем описании как «антиген-мишень» или «ТА». Согласно настоящему изобретению первое и второе антитела, описанные выше, имеют сайт связывания для одного и того же антигена-мишени. (Во избежание сомнений при указании на то, что антитела связываются с одним и тем же антигеном-мишенью, подразумевается, что они имеют сайт связывания, который обладает способностью связываться с одним и тем же антигеном-мишенью, и предусматривается возможность того, что антитела могут связываться с двумя индивидуальными молекулами антигенов, которые являются одинаковыми друг с другом). Например, в одном из вариантов осуществления изобретения и первое, и второе антитело, оба связываются с СЕА.

В некоторых вариантах осуществления изобретения первое и второе антитела могут связываться с (имеют связывающий центр для) одним и тем же эпитопом антигена-мишени. В других вариантах осуществления изобретения первое антитело может связываться с (имеет связывающий центр для) с эпитопом антигена-мишени, отличным от эпитопа второго антитела.

В некоторых вариантах осуществления изобретения первое и второе антитела могут содержать одинаковый антигенсвязывающий центр для антигена-мишени. Это означает, что они могут содержать антигенсвязывающий центр, обладающий способностью связываться с антигеном-мишенью, который содержит последовательности V_L и V_H, где последовательности V_L и V_H, образующие указанный антигенсвязывающий центр, являются одинаковыми у первого и второго антител.

В некоторых вариантах осуществления изобретения первое антитело и второе антитело, каждое является двухвалентным в отношении антигена-мишени. В некоторых вариантах осуществления изобретения каждое из них является двухвалентным и моноспецифическим в отношении эпитопа. В других вариантах осуществления изобретения первое антитело и второе антитело каждое является бипаратопным в отношении антигена-мишени, т.е. первое антитело и второе антитело каждое имеет сайты связывания для двух различных эпитопов антигена-мишени.

В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться предпочтительным, чтобы первое и/или второе антитело содержало Fc-область. Присутствие Fc-области обладает преимуществами в контексте радиоиммунотерапии и радиовизуализации, например, пролонгируя время полужизни белка в кровотоке и/или обеспечивая более высокое поглощение опухолью по сравнению с использованием фрагментов меньшего размера.

Указанный в настоящем описании формат «сплит-домена» может являться особенно ценным в данном контексте, поскольку снижает повышенную возможность ассоциации с радиоактивномеченным соединением, которая в противном случае может происходить из-за более длительного присутствия циркулирующего антитела.

В некоторых вариантах осуществления изобретения Fc-домен модифицируют для снижения или элиминации эффекторной функции.

Другим объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая набор антител, указанный в настоящем описании. Следующим объектом настоящего изобретения является набор, содержащий две различные фармацевтические композиции, каждая из которых содержит одно из антител, указанных в настоящем описании (т.е. первое антитело и второе антитело соответственно).

Еще одним объектом настоящего изобретения является полинуклеотид или набор полинуклеотидов, кодирующих любое из антител или наборов антител, указанных в настоящем описании. Другим объектом настоящего изобретения является вектор или набор векторов, содержащих указанный полинуклеотид или указанные полинуклеотиды, необязательно экспрессионный вектор или набор экспрессионных векторов. Следующим объектом настоящего изобретения является прокариотическая или эукариотическая клетка-хозяин или набор клеток-хозяев, содержащих вектор или набор векторов, предлагаемый в настоящем изобретении. Кроме того, предложен способ получения антитела, включающий культивирование клетки(ок)-хозяина(ев) таким образом, чтобы получать антитело.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела, указанные в настоящем описании, находят применение в способе претаргетной радиоиммунотерапии (PRIT) или в способе претаргетной радиовизуализации.

Одним из объектов настоящего изобретения является способ претаргетной радиоиммунотерапии, который включает:

I) введение индивидууму первого антитела и второго антитела, которые описаны выше; и

II) последующее введение указанному индивидууму радиоактивномеченного соединения.

Другим объектом настоящего изобретения являются первое и второе антитела, описанные выше, предназначенные для применения в способе лечения, который включает введение первого антитела и второго антитела индивидууму и последующее введение указанному индивидууму радиоактивномеченного соединения. Другим объектом изобретения является первое антитело, описанное выше, предназначенное для применения в способе лечения, который включает введение первого антитела и второго антитела индивидууму и последующее введение указанному индивидууму радиоактивномеченного соединения. Следующим объектом изобретения является второе антитело, описанное выше, предназначенное для применения в способе лечения, который включает введение первого антитела и второго антитела индивидууму и последующее введение указанному индивидууму радиоактивномеченного соединения.

Другим объектом настоящего изобретения является способ радиовизуализации, который включает:

I) введение индивидууму первого и второго антител, указанных в настоящем описании, в котором антитела связываются с антигеном-мишенью и локализуются на поверхности клетки, экспрессирующей антиген-мишень;

II) последующее введение радиоактивномеченного соединения; и необязательно

III) визуализацию ткани или органа, в которой радионуклид локализован.

Другим объектом настоящего изобретения являются первое и второе антитела, указанные в настоящем описании, предназначенные для применения в способе диагностирования, который осуществляют в организме человека или животного, где способ включает

I) введение индивидууму первого и второго антител, указанных в настоящем описании, в котором антитела связываются с антигеном-мишенью и локализуются на поверхности клетки, экспрессирующей антиген-мишень;

II) последующее введение радиоактивномеченного соединения; и необязательно

III) визуализацию ткани или органа, в которой радионуклид локализован. За стадией визуализации может следовать стадия установления диагноза и необязательно стадия передачи указанного диагноза пациенту. В некоторых вариантах осуществления изобретения способ может включать также определение соответствующего лечения и необязательно осуществление лечения индивидуума.

В каждом из указанных выше способов/вариантов применения связывание первого и второго антител с одной и той же клеткой-мишенью или соседними клетками приводит к объединению V_H- и V_L-доменов антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения и образованию функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения. Таким образом, после введения радиоактивномеченного соединения радиоактивномеченное соединение связывается с функциональным антигенсвязывающим центром, образованным в результате ассоциации V_H и V_L.

В любом из описанных выше способов и вариантов применения первое и второе антитела можно вводить одновременно или последовательно в любом порядке. В данной области часто методы PRIT или радиовизуализации включают стадию очищения. Стадия очищения включает введение агента между введением антитела и введением радиоактивномеченного соединения, где агент увеличивает скорость удаления антитела из крови и/или блокирует связывание радиоактивномеченного соединения с антителом.

В одном из вариантов способов и вариантов применения, указанных в настоящем описании, способ не включает стадию очищения. Это означает, что он не включает стадию введения очищающего агента или блокирующего агента между введением первого и второго антител и введением радиоактивномеченного соединения (т.е. после введения антител, но до введения радиоактивномеченного соединения). В другом варианте осуществления изобретения никакой агент не вводят между введением первого и второго антител и введением радиоактивномеченного соединения, необязательно отличного от радиосенсибилизирующего вещества, иммунотерапевтического и/или химиотерапевтического агента. В другом варианте осуществления изобретения никакой агент не вводят между введением первого и второго антител и введением радиоактивномеченного соединения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела, указанные в настоящем описании, можно вводить в виде части комбинированной терапии. Например, их можно вводить в комбинации с одним или несколькими радиосенсибилизирующими веществами, иммунотерапевтическими и/или химиотерапевтическими агентами: радиосенсибилизирующее вещество, иммунотерапевтический или химиотерапевтический агент и антитела можно вводить одновременно или последовательно в любом порядке.

Способы радиовизуализации и радиоиммунотерапии, указанные в настоящем описании, необязательно можно объединять согласно концепции, обсуждение которой представлено ниже в настоящем описании.

Следующим объектом настоящего изобретения является набор, содержащий:

I) первое и второе антитела, указанные в настоящем описании;

II) радиоактивномеченное соединение, которое связывается с антигенсвязывающим центром, образовавшимся в результате ассоциации первого и второго антител.

Необязательно в наборе может отсутствовать (т.е. набор не содержит) очищающий агент или блокирующий агент, указанный в настоящем описании.

Необязательно набор может содержать также радиосенсибилизирующее вещество, иммунотерапевтический или химиотерапевтический агент.

В некоторых вариантах осуществления изобретения первое и второе антитела могут находиться в одной и той же фармацевтической композиции. В других вариантах осуществления изобретения первое и второе антитела могут находиться в разных фармацевтических композициях. В некоторых вариантах осуществления изобретения радиоактивномеченное соединение находится в фармацевтической композиции, отличной от той, в которой находятся антитела.

Краткое описание чертежей

На чертежах показано:

на фиг. 1 - схематическая структура биспецифического антитела к антигену-мишени (TA)-DOTAM (BsAb TA-DOTAM), которое относится к приведенным для сравнения примерам, и приведенных в качестве примера антител ТА-сплит-DOTAM-VH/VL, предлагаемых в изобретении;

на фиг. 2 - схематическая диаграмма, демонстрирующая сборку связывающего агента сплит-VH/VL DOTAM на опухолевых клетках. Антитела ТА-сплит-DOTAM-VH/VL не связывали существенно ²¹²Pb-DOTAM, если он не был связан с опухолевым антигеном (ТА) на клетках-мишенях, на которых происходила ассоциация двух доменов DOTAM-связывающего агента;

на фиг. 3 схематическое изображение примера концепции трехстадийной TA-PRIT, включающей применение очищающего агента;

на фиг. 4 - схематическое изображение примера концепции двухстадийной TA-PRIT, в которой не применяли очищающий агент;

на фиг. 5 - данные о связывании сплит-антител с MKN45-клетками для демонстрации способности связываться с CEA. Детекцию антител осуществляли с использованием специфических в отношении человеческого IgG вторичных антитела;

на фиг. 6 - данные о связывании сплит-антител с MKN45-клетками для демонстрации способности связываться с DOTAM. Детекцию антител осуществляли с использованием Pb-DOTAM-ФИТЦ;

на фиг. 7А приведенный в качестве примера протокол двухстадийной PRIT с использованием СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL, которую осуществляли на SCID-мышах, несущих введенные подкожно (SC) ВхРС3-опухоли (ч=часы, d=дни, w=недели);

на фиг. 7Б - приведенный в качестве примера протокол трехстадийной контрольной PRIT, которую осуществляли на SCID-мышах, несущих введенные SC ВхРС3-опухоли (ч=часы, d=дни, w=недели);

на фиг. 8 данные о биораспределении предварительно таргетированного ²¹²Pb-DOTAM в SCID-мышах, несущих введенные SC ВхРС3-опухоли, через 6 ч после инъекции ²¹²Pb-DOTAM при применении для предварительного таргетинга либо только СЕА-сплит-DOTAM-VH, только СЕА-сплит-DOTAM-VL, либо смеси двух комплементарных антител, или при применении стандартной трехстадийной PRIT (%ID/г ±SD, n=4);

на фиг. 9 - фармакокинетические характеристики СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL после IV-инъекции SCID-мышам;

на фиг. 10 - план исследования согласно протоколу 158, в котором применяли 2-стадийную (вверху) или 3-стадийную (внизу) CEA-PRIT, которое проводили на SCID-мышах, несущих SC ВхРС3-опухоли. *Дозу BsAb СЕА-сплит DOTAM регулировали для компенсации «hole/hole»-примесей в 2/4 конструкциях;

на фиг. 11 - данные о биораспределении предварительно таргетированного ²¹²Pb-DOTAM в SCID-мышах, несущих SC ВхРС3-опухоли (6 ч p.i.). Оценивали распределение ²¹²Pb в несущих опухоли SCID-мышах через 6 ч после инъекции ²¹²Pb-DOTAM при применении для предварительного таргетинга BsAb СЕА-DOTAM или бспаратопных комбинаций антител СЕА-сплит-DOTAM. Уровень радиоактивности в органах и тканях выражали в виде средней величины % ID/г±SD (n=4);

на фиг. 12 - план исследования согласно протоколу 160, включающему один цикл 3-стадийной CEA-PRIT (вверху), 2-стадийной CEA-PRIT (в середине) или 1-стадийной CEA-RIT, которое проводили на SCID-мышах, несущих SC ВхРС3-опухоли. Мышей из группы, применяемой для оценки биораспределения (BD) (мыши-«разведчики»), умерщвляли через 24 ч после радиоактивной инъекции, в то время как мышей из групп, применямых для оценки эффективности, сохраняли и осуществляли их тщательный мониторинг вплоть до выполнения критериев терминации;

на фиг. 13 - данные о биораспределении предварительно таргетированного ²¹²Pb-DOTAM и ²¹²Pb-DOTAM-CEA-DOTAM в SCID-мышах, несущих SC ВхРС3-опухоли (24 ч p.i.). Оценивали распределение ²¹²Pb в несущих опухоли SCID-мышах через 24 ч после инъекции CEA-DOTAM-претаргетированного ²¹²Pb-DOTAM или предварительно инкубированного ²¹²Pb-DOTAM-CEA-DOTAM. Уровень радиоактивности в органах и тканях выражали в виде среднего % ID/г±SD (n=3);

на фиг. 14 - данные о росте опухолей, выраженные в виде средних значений со стандартной ошибкой, в обработанных PRIT группах и в контрольных группах (группы А-Д), полученные на ВхРС3-модели (n=10). Кривые обрывали при n<5. Пунктирными вертикальными линями обозначено введение ²¹²Pb-DOTAM (20 мкКи) в некоторых или во всех группах в зависимости от схемы опыта;

на фиг. 15 - кривые роста индивидульных опухолей в обработанных PRIT группах и в контрольных группах (группы А-Д), полученные на ВхРС3-модели (n=10). Пунктирными вертикальными линями обозначено введение меченных с помощью ²¹²Pb соединений (20 мкКи);

на фиг. 16 - данные средней потере веса тела у мышей, обработанных CEA-PRIT и CEA-RIT (группы А-Д, n=10), полученные на ВхРС3-модели. Кривые обрывали при n<5. Пунктирными вертикальными линиями обозначено введение меченных с помощью ²¹²Pb соединений в некоторых или всех групп в зависимости от плана эксперимента;

на фиг. 17 - план исследования согласно протоколу 175, включающему двухстадийную CEA-PRIT, которое проводили на SCID-мышах, несущих SC ВхРС3-опухоли, которых умерщвляли и осуществляли аутопсию через 24 ч после инъекции ²¹²Pb-DOTAM. Дозу СЕА-сплит-DOTAM-VH-AST регулировали для компенсации «hole/hole»-примесей;

на фиг. 18 - данные о биораспределении ²¹²Pb в несущих опухоли SCID-мышах через 24 ч после инъекции ²¹²Pb-DOTAM, предварительного таргетированного антителами СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL (протокол 175). Уровень радиоактивности в органах и тканях выражали в виде среднего % ID/г±SD (n=4);

на фиг.19 - план исследования согласно протоколу 185, включающему двухстадийную CEA-PRIT, которое проводили на SCID-мышах, несущих SC ВхРС3-опухоли, которых умерщвляли и осуществляли аутопсию через 6 ч после инъекции ²¹²Pb-DOTAM. Дозу СЕА-сплит-DOTAM-VH-AST (СН1А1А) регулировали для компенсации «hole/hole»-примесей;

на фиг. 20 - данные о биораспределении ²¹²Pb в несущих опухоли SCID-мышах через 6 ч после инъекции ²¹²Pb-DOTAM, предварительного таргетированного антителами СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL (протокол 185). Уровень радиоактивности в органах и тканях выражали в виде средней величины % ID/г±SD (n=5);

на фиг. 21 - данные о биораспределении пар СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL (объединенные содержащие VH и VL антитела) в двух отобранных полученных SC-введением ВхРС3-опухолей через 7 дней после инъекции. На А и Б показаны срезы опухоли из мыши A3, которой инъецировали антитело СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL, таргетирующее Т84.66, при этом на А представлены данные об экспрессии СЕА, а на Б - соответствующее распределение СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL. На В и Д показаны срезы опухоли из мыши С5, которой инъецировали антитело СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL, таргетирующее СН1А1А: на В представлены данные об экспрессии СЕА, а на Г - соответствующее распределение СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL;

на фиг. 22 - план исследования согласно протоколу 189, включающему двухстадийную CEA-PRIT, которое проводили на SCID-мышах, несущих SC ВхРС3-опухоли, которых умерщвляли и осуществляли аутопсию через 6 ч после инъекции ²¹²Pb-DOTAM. Дозу СЕА-сплит-DOTAM-VH-AST (СН1А1А) регулировали для компенсации «hole/hole»-примесей;

на фиг. 23 - данные о распределении ²¹²Pb в несущих опухоли SCID-мышах через 6 ч после инъекции ²¹²Pb-DOTAM при применении для предварительного таргетинга бипаратопных пар антител СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL (мишенью которых являются Т84.66 и СН1А1А), в сравнении с положительным контролем (только СН1А1А). Уровень радиоактивности в органах и тканях выражали в виде средней величины % ID/г±SD;

на фиг. 24 - средние величины интенсивности флуоресценции (MFI), определенные с помощью FACS для сплит-антител. Связывание Pb-DOTA-ФИТЦ удалось обнаружить с помощью FACS только при совместной инкубации обоих сплит-антител с Pb-DOTA-ФИТЦ. Индивидуальные сплит-антитела не генерировали существенный сигнал;

на фиг. 25А-В примеры форматов антител, указанных в настоящем описании;

на фиг. 26 - результаты, полученные в примере 11, эксперимент 1, по оценке связывания индивидуальных антител ТА-сплит-DOTAM-VH и ТА-сплит-DOTAM-VL с биотинилированным DOTAM, иммобилизованном на чипе;

на фиг. 27 результаты, полученные в примере 11, эксперимент 2, по оценке связывания с DOTAM индивидуальных антител ТА-сплит-DOTAM-VH и ТА-сплит-DOTAM-VL, иммобилизованных на чипе;

на фиг. 28 - результаты, полученные в примере 11, эксперимент 3, по оценке связывания DOTAM с антителами ТА-сплит-DOTAM-VH/VL (пары антител), иммобилизованными на чипе.

Подробное описание изобретения

Определения

Для целей настоящего описания «акцепторный человеческий каркасный участок» означает каркасный участок, который содержит аминокислотную последовательность каркасного участка вариабельного домена легкой цепи (VL) или каркасный участок вариабельного домена тяжелой цепи (VH), имеющий происхождение из каркасного участка человеческого иммуноглобулина или человеческого консенсусного каркасного участка, указанного ниже. Акцепторный человеческий каркасный участок, «имеющий происхождение из» каркасного участка человеческого иммуноглобулина или человеческого консенсусного каркасного участка, может иметь такую же аминокислотную последовательность или может содержать изменения в аминокислотной последовательности. В некоторых вариантах осуществления изобретения количество аминокислотных изменений составляет 10 или менее, 9 или менее, 8 или менее, 7 или менее, 6 или менее, 5 или менее, 4 или менее, 3 или менее или 2 или менее. В некоторых объектах изобретения последовательность человеческого акцепторного каркасного участка VL идентична последовательности каркасного участка VL человеческого иммуноглобулина или последовательности человеческого консенсусного каркасного участка.

Понятие «аффинность» относится к суммарной силе всех нековалентных взаимодействий между одним связывающим сайтом молекулы (например, антитела) и ее партнером по связыванию (например, антигеном). В контексте настоящего описания, если не указано иное, «аффинность связывания» относится к присущей молекуле аффинности связывания, отражающей взаимодействие по типу 1:1 между компонентами связывающейся пары (например, антителом и антигеном). Аффинность молекулы X к ее партнеру Y, как правило, можно характеризовать с помощью константы диссоциации (K_D). Аффинность можно оценивать с помощью общепринятых методов, известных в данной области, включая те, которые представлены в настоящем описании. Ниже в описании представлены конкретные иллюстративные и приведенные в качестве примера методы измерения аффинности связывания.

Антитело «с созревшей аффинностью» означает антитело с одним или несколькими изменениями в одном или нескольких гипервариабельных участках (CDR) по сравнению с родительским антителом, которое не содержит указанных изменений, указанные изменения приводят к повышению аффинности антитела к антигену.

Понятие «антитело, которое связывается с антигеном, экспрессируемым на поверхности клетки-мишени» относится к антителу, которое обладает способностью связываться с указанным антигеном с аффинностью, достаточной для того, чтобы антитело можно было применять в качестве диагностического и/или терапевтического агента для таргетинга указанного антигена. В одном из объектов изобретения уровень связывания антитела с неродственным не являющимся антигеном белком составляет менее чем примерно 10% от связывания антитела с антигеном по данным измерений, полученным, например, с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR). В некоторых объектах изобретения антитело, которое связывается с антигеном, экспрессируемым на поверхности клетки-мишени, имеет константу диссоциации (K_D), составляющую ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001нМ (например, 10^-8 М или менее, например, от 10^-8 М до 10^-13 М, например, от 10^-9 М до 10^-13 М). Считается, что антитело «специфически связывается» с антигеном, экспрессируемым на поверхности клетки-мишени, если антитело имеет K_D, составляющую 1 мкМ или менее. В некоторых объектах изобретения антитело связывается с эпитопом указанного антигена, который является консервативными для указанного антигена среди различных видов.

Понятия «антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченного соединения» или «функциональный антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченного соединения» относятся к антигенсвязывающему центру, содержащему VH- и VL-домены, обладающие способностью связываться с радиоактивномеченным соединением с аффинностью, достаточной для того, чтобы антитело можно было применять в качестве диагностического и/или терапевтического агента для объединения радиоактивномеченного соединения с антителом. В одном из объектов изобретения уровень связывания антигенсвязывающего центра с неродственным не являющимся антигеном соединением составляет менее чем примерно 10% от связывания антитела с радиоактивномеченным соединением по данным измерений, полученным, например, с помощью поверхностного плазмонного резонанса (SPR). В некоторых объектах изобретения антигенсвязывающий центр, которые связывается с радиоактивномеченным соединением, имеет константу диссоциации (K_D), составляющую ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например, 10^-8 М или менее, например, от 10^-8 М до 10^-13 М, например, от 10^-9 М до 10^-13 М). Может оказаться предпочтительным, чтобы K_D составляла 100 пМ, 50 пМ, 20 пМ, 10 пМ, 5 пМ, 1 пМ или менее, например, 0,9 пМ или менее, 0,8 пМ или менее, 0,7 пМ или менее, 0,6 пМ или менее, или 0,5 пМ или менее. Например, связывание функционального связывающего сайта с радиоактивномеченным соединением может характеризоваться величиной K_D, составляющей примерно 1 пМ-1 нМ, например, примерно 1-10 пМ, 1-100 пМ, 5-50 пМ, 100-500 пМ или 500 пМ-1 нМ. Считается, что антигенсвязывающий центр «специфически связывается» с радиоактивномеченным соединением, если антигенсвязывающий центр имеет K_D, составляющую 1 мкМ или менее.

В контексте настоящего описания понятие «антитело» используется в его наиболее широком смысле, и оно относится к различным структурам антител, включая (но не ограничиваясь только ими) моноклональные антитела, поликлональные антитела, мультиспецифические антитела (например, биспецифические антитела) и фрагменты антител, при условии, что они обладают требуемой антигенсвязывающей активностью.

Понятие «фрагмент антитела» относится к молекуле, отличной от интактного антитела, которая содержит часть интактного антитела, связывающуюся с антигеном, с которым связывается интактное антитело. Примеры фрагментов антитела включают (но не ограничиваясь только ими) молекулы Fv, Fab, cross-Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')₂; димерные антитела (диабоди); линейные антитела; одноцепочечные антитела (например,, scFv и scFab); однодоменные антитела (dAb); и мультиспецифические антитела, образованные из фрагментов антител.

Обзор некоторых фрагментов антител представлен у Holliger и Hudson, Nature Biotechnology 23, 2005, сс.1126-1136. Так, понятие «Fab-фрагмент» относится к фрагменту антитела, содержащему легкую цепь, которая содержит VL-домен и CL-домен, и фрагменту тяжелой цепи, который содержит VH-домен и CH1-домен. «Fab'-фрагменты» отличаются от Fab-фрагментов добавлением остатков на карбоксильный конец СН1-домена тяжелой цепи, включая один или несколько остатков цистеина из шарнирной области антитела. Обсуждение Fab-и F(ab')₂-фрагментов, содержащих остатки связывающего рецептор спасения эпитопа и обладающих увеличенным временем полужизни in vivo, представлено в патенте США №5869046. Понятие «cross-Fab-фрагмент» или «xFab-фрагмент» или «Кроссовер-Fab-фрагмент» относится к Fab-фрагменту, в котором либо вариабельные области, либо константные области тяжелой и легкой цепей заменены друг на друга. Cross-Fab-фрагмент содержит полипептидную цепь, состоящую из вариабельной области легкой цепи (VL) и первого константного домена (СН1), и полипептидную цепь, состоящую из вариабельной области тяжелой цепи (VH) и константной области легкой цепи (CL). Можно создавать также асимметричные Fab-плечи путем интродукции мутаций заряженных или незаряженных аминокислот в поверхность раздела доменов для обеспечения правильного спаривания Fab (см., например, WO 2016/172485).

«Одноцепочечный вариабельный фрагмент» или «scFv» представляет собой слитый белок, состоящий из вариабельных доменов тяжелой (VH) и легкой (VL) цепей антитела, которые соединены пептидным линкером. В частности, линкер представляет собой короткий полипептид из 10-25 аминокислот и, как правило, содержит большое количество остатков глицина для придания гибкости, а также остатков серина или треонина для растворимости, и он может соединять либо N-конец VH с С-концом VL или наоборот. Указанный белок сохраняет специфичность исходного антитела, несмотря на удаление константных областей и интродукцию линкера. Обзор scFv-фрагментов см, например, у Plückthun, в: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, т.113, под ред. Rosenburg и Moore (изд-во Springer-Verlag, New York), 1994, cc. 269-315; см. также WO 93/16185; и патенты США №№5571894 и 5587458.

Понятие «блокирующий агент» относится к агенту, который блокирует связывание эффекторной молекулы, в частности, радиоактивномеченного соединения, с функциональным сайтом связывания для эффекторной молекулы. Как правило, блокирующий агент связывается с функциональным сайтом связывания для эффекторной молекулы, например, специфически связывается с указанным функциональным сайтом связывания.

Понятие «очищающий агент» относится к агенту, который повышает скорость очищения (клиренса) от антитела кровотока индивидуума. Как правило, очищающий агент связывается с антителом, например, специфически связывается с антителом.

В контексте настоящего описания понятие «стадия очищения» или «фаза очищения» включает применение либо блокирующего агента, либо очищающего агента. Некоторые агенты могут функционировать как в качестве очищающего агента, так и в качестве блокирующего агента.

Понятие «эпитоп» обозначает сайт на антигене, либо белковый, либо небелковый, с которым связывается антитело. Эпитопы могут быть образованы либо сегментами смежных аминокислот (линейный эпитоп), либо могут содержать не являющиеся смежными аминокислоты (конформационный эпитоп), которые, например, становятся пространственно близкими в результате фолдинга антигена, т.е. при образовании третичной структуры в результате фолдинга белкового антигена. Линейные эпитопы после контакта белкового антигена с денатурирующими агентами, как правило, все еще остаются связанными с антителом, в то время как конформационные эпитопы, как правило, разрушаются при обработке денатурирующими агентами. Эпитоп содержит по меньшей мере 3, по меньшей мере 4, по меньшей мере 5, по меньшей мере 6, по меньшей мере 7 или 8-10 аминокислот в уникальной пространственной конформации.

Скрининг в отношении антител, связывающихся с конкретным эпитопом (т.е. антител, связывающихся с одним и тем же эпитопом), можно осуществлять с помощью методов, которые являются стандартными в данной области, такими, например, как (но не ограничиваясь только ими) сканирование аланином, пептидные блоты (см. Meth. Mol. Biol. 248, 2004, сс.443-463), анализ расщепления пептидов, вырезание эпитопа, экстракция эпитопа, химическая модификация антигенов (см. Prot. Sci. 9, 2000, сс.487-496) и перекрестное блокирование (см. Harlow и Lane, «Antibodies», изд-во Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY).

Метод профилирования антител на основе структуры антигена (Antigen Structure-based Antibody Profiling, ASAP), известный также как профилирование с использованием модификации (Modification-Assisted Profiling, MAP), позволяет группировать (распределять по «корзинам») множество моноклональных антител, специфически связывающихся с антигеном, на основе профиля связывания каждого из множества антител с химически или ферментативно модифицированными поверхностями антигена (см., например, US 2004/0101920). Антитела в каждой группе связываются с одним и тем же эпитопом, который может либо представлять собой уникальный эпитоп, четко отличный от эпитопа, соответствующего другой группе, либо частично перекрываться с ним.

Для простого определения того, связывается ли антитело с тем же самым эпитопом, что и референс-антитело, или конкурирует с ним за связывание, можно применять также анализ связывания в условиях конкуренции. Например, выражение «антитело, которое связывается с тем же самым эпитопом», что и референс-антитело, относится к антителу, которое по данным анализа в условиях конкуренции блокирует связывание референс-антитела с его антигеном на 50% или более, и наоборот, референс-антитело по данным анализа в условиях конкуренции блокирует связывание антитела с его антигеном на 50% или более. Также, например, для определения того, связывается ли антитело с тем же самым эпитопом, что и референс-антитело, референс-антителу дают возможность связываться с антигеном в насыщающих условиях. После удаления избытка референс-антитела оценивают способность рассматриваемого антитела к связыванию с антигеном. Если рассматриваемое антитело обладает способностью к связыванию с антигеном после насыщения связывания референс-антитела, то можно сделать вывод о том, что рассматриваемое антитело связывается с эпитопом, отличным от того, с которым связывается референс-антитело. Однако, если рассматриваемое антитело не может связываться с антигеном после связывания референс-антитела в насыщающих условиях, то это означает, что рассматриваемое антитело может связываться с тем же самым эпитопом, с которым связывается референс-антитело. Для подтверждения того, связывается ли рассматриваемое антитело с тем же самым эпитопом или связывание затруднено по стерическим причинам, можно проводить стандартные эксперименты (например, осуществлять пептидные мутации и анализы связывания методами ELISA, РИА, поверхностного плазмонного резонанса, проточной цитометрии или любой количественный или качественный анализ связывания антитела, применяемый в данной области).

Этот анализ следует осуществлять в двух условиях, а именно, когда каждое из обоих антител применяют в качестве насыщающего антитела. Если в обоих условиях только первое (насыщающее) антитело может связываться с антигеном, то это позволяет сделать вывод о том, что рассматриваемое антитело и референс-антитело конкурируют за связывание с антигеном.

В некоторых объектах изобретения считается, что два антитела связываются с одним и тем же или с перекрывающим эпитопом, если 1-, 5-, 10-, 20- или 100-кратный избыток одного антитела ингибирует связывание другого по меньшей мере на 50%, по меньшей мере на 75%, по меньшей мере на 90% или даже на 99% или более по данным анализа связывания в условиях конкуренции (см., например, Junghans и др., Cancer Res. 50, 1990, сс. 1495-1502).

В некоторых объектах изобретения считается, что два антитела связываются с одним и тем же эпитопом, если практически все аминокислотные мутации в антигене, которые снижают или элиминируют связывание одного антитела, приводят также к снижению или элиминированию связывания другого. Считается, что два антитела имеют «перекрывающиеся эпитопы», если только поднабор аминокислотных мутаций, которые снижают или элиминируют связывание одного антитела, приводит к снижению или элиминированию связывания другого.

Понятие «химерное» антитело относится к антителу, в котором часть тяжелой и/или легкой цепи имеет происхождение из конкретного источника или конкретного вида, а остальная часть тяжелой и/или легкой цепи имеет происхождение из другого источника или другого вида.

Понятие «класс» антитела относится к типу константного домена или константной области, входящего/входящей в тяжелую цепь. Существует пять основных классов антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, а некоторые из них можно дополнительно подразделять на подклассы (изотипы), например, IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, IgA₁ и IgA₂. В некоторых объектах изобретения антитело имеет IgG₁-изотип. В некоторых объектах изобретения антитело имеет IgG₁-изотип с мутацией P329G, L234A и L235A S228P для снижения эффекторной функции Fc-области. В других объектах изобретения антитело имеет IgG₂-изотип. В некоторых объектах изобретения антитело имеет IgG₄-изотип с мутацией S228P в шарнирной области для повышения стабильности антитела IgG₄-изотипа. Константные домены тяжелых цепей, соответствующие различным классам иммуноглобулинов, обозначают как α, δ, ε, γ и μ соответственно. Легкая цепь антитела на основе аминокислотной последовательности ее константного домена может относиться к одному из двух типов, обозначенных как каппа (κ) и лямбда (λ).

Понятие «эффекторные функции» относится к видам биологической активности, присущим Fc-области антитела, которые варьируются в зависимости от изотипа антитела. Примеры эффекторных функций антитела включают: связывание с C1q и комплементзависимую цитотоксичность (CDC); связывание с Fc-рецептором; антитело-обусловленную клеточнозависимую цитотоксичность (ADCC); фагоцитоз; понижающую регуляцию рецепторов клеточной поверхности (например, В-клеточного рецептора); и активацию В-клеток.

Понятие «эффективное количество» агента, например, фармацевтической композиции, относится к количеству, эффективному при применении в дозах и в течение периодов времени, необходимых для достижения требуемого терапевтического или профилактического результата.

Понятие «тандемный Fab» относится к антителу, которое содержит два Fab-фрагмента, соединенных через пептидный линкер /привязь. В некоторых вариантах осуществления изобретения тандемный Fab может содержать один Fab-фрагмент и один cross-Fab-фрагмент, которые соединены с помощью пептидного линкера/пептидной связи.

Понятие «Fc-область» в контексте настоящего описания относится к С-концевой области тяжелой цепи иммуноглобулина, которая содержит по меньшей мере часть константной области. Понятие включает имеющие нативную последовательность Fc-области и варианты Fc-областей. В одном из объектов изобретения Fc-область тяжелой цепи человеческого IgG простирается от Cys226 или от Pro230 до карбоксильного конца тяжелой цепи. Однако антитела, продуцируемые клеткой-хозяином, могут подвергаться посттрансляционному отщеплению одной или нескольких, прежде всего одной или двух, аминокислот из С-конца тяжелой цепи. Поэтому антитело, продуцируемое клеткой-хозяином в результате экспрессии специфической молекулы нуклеиновой кислоты, которая кодирует полноразмерную тяжелую цепь, может включать полноразмерную тяжелую цепь или может включать расщепленный вариант полноразмерной тяжелой цепи. Это может приводить к ситуации, когда последние две С-концевые аминокислоты тяжелой цепи представляют собой глицин (G446) и лизин (К447, нумерация согласно EU-индексу Кэбота). Таким образом, С-концевой лизин (Lys447) или С-концевые глицин (Gly446) и лизин (K447) Fc-области могут присутствовать или отсутствовать. В одном из объектов изобретения тяжелая цепь, включающая Fc-область, указанную в настоящем описании, которая содержится в антителе, предлагаемом в изобретении, содержит дополнительный С-концевой дипептид глицин-лизин (G446 и K447, нумерация согласно EU-индексу). В одном из объектов изобретения тяжелая цепь, включающая Fc-область, указанную в настоящем описании, которая содержится в антителе, предлагаемом в изобретении, содержит дополнительный С-концевой остаток глицин (G446, нумерация согласно EU-индексу). Если в настоящем описании не указано иное, то нумерация аминокислотных остатков в Fc-области или в константной области соответствует системе нумерации EU, называемой также EU-индексом, который описан у Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

Понятие «каркасный участок» или «FR» относится к остаткам вариабельного домена, отличным от остатков гипервариабельных участков (CDR). FR вариабельного домена, как правило, состоит из четырех FR-доменов: FR1, FR2, FR3 и FR4. Таким образом, последовательности CDR и FR, как правило, располагаются в VH (или VL) в следующем порядке: FR1-CDR-H1(CDR-L1)-FR2- CDR-H2(CDR-L2)-FR3- CDR-H3(CDR-L3)-FR4.

Понятия «полноразмерное антитело», «интактное антитело» и «цельное антитело» в контексте настоящего описания используют взаимозаменяемо для обозначения антитела, имеющего структуру, практически сходную с нативной структурой антитела, или имеющего тяжелые цепи, которые содержат Fc-область, указанную в настоящем описании.

В контексте настоящего описания понятия «клетка-хозяин», «линия клеток-хозяев» и «культура клеток-хозяев» используются взаимозаменяемо, и они относятся к клеткам, в которые интродуцирована экзогенная нуклеиновая кислота, включая потомство указанных клеток. К клеткам-хозяевам относятся «трансформанты» и «трансформированные клетки», которые включают первичную трансформированную клетку, а также потомство, выведенное из нее, независимо от количества пересевов. Потомство может не быть строго идентичным родительской клетке по составу нуклеиновых кислот, а может нести мутации. Под данное понятие подпадает мутантное потомство, которое обладает такой же функцией или биологической активностью, что и отобранная путем скрининга или селекции исходная трансформированная клетка.

«Человеческое антитело» представляет собой антитело, которое имеет аминокислотную последовательность, соответствующую последовательности антитела, продуцируемого человеком или человеческой клеткой, или полученную из источника, отличного от человека, с использованием спектра человеческих антител или других кодирующих человеческое антитело последовательностей. Из указанного определения человеческого антитела специально исключено гуманизированное антитело, содержащее нечеловеческие антигенсвязывающие остатки.

«Человеческий консенсусный каркасный участок» представляет собой каркасный участок, который содержит наиболее часто встречающиеся аминокислотные остатки в отобранных последовательностях каркасных участков VL или VH человеческого иммуноглобулина. Как правило, отобранные последовательности каркасных участков VL или VH человеческого иммуноглобулина выбраны из подгруппы последовательностей вариабельных доменов. Как правило, подгруппа последовательностей представляет собой подгруппу, описанную у Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд, изд-во NIH Publication, 91-3242, Bethesda MD, 1991, т.т.1-3. В одном из объектов изобретения касательно VL подгруппа представляет собой подгруппу каппа I, описанную у Kabat и др., выше. В одном из объектов изобретения касательно VH подгруппа представляет собой подгруппу III, описанную у Kabat и др., выше.

Понятие «гуманизированное» антитело относится к химерному антителу, которое содержит аминокислотные остатки из нечеловеческих CDR и аминокислотные остатки из человеческих FR. В некоторых вариантах осуществления изобретения гуманизированное антитело может содержать практически все из по меньшей мере одного и, как правило, двух вариабельных доменов, в которых все или практически все CDR соответствуют участкам нечеловеческого антитела, а все или практически все FR соответствуют участкам человеческого антитела. Гуманизированное антитело необязательно может содержать по меньшей мере часть константной области антитела, имеющей происхождение из человеческого антитела. Понятие «гуманизированная форма» антитела, например, нечеловеческого антитела, относится к антителу, которое подвергли гуманизации.

Понятие «гипервариабельный участок» или «HVR» в контексте настоящего описания относится к каждому из участков вариабельного домена антитела, последовательности которых являются гипервариабельными и которые определяют специфичность связывания антигена, например, «определяющие комплементарность участки» «CDR».

Как правило, антитела содержат шесть CDR: три в VH (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) и три в VL (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3). Приведенные в качестве примера в настоящем описании CDR включают:

(а) гипервариабельные петли, включающие аминокислотные остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (Н2) и 96-101 (Н3) (Chothia и Lesk, J. Mol. Biol. 196, 1987, cc. 901-917);

(б) CDR, включающие аминокислотные остатки 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (Н3) (Kabat и др., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5-е изд., изд-во Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD,1991, публикация NIH 91-3242); и

(в) области контакта с антигеном, включающие аминокислотные остатки 27 с-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (Н2) и 93-101 (Н3) (MacCallum и др., J. Mol. Biol. 262, 1996, cc. 732-745).

Если специально не указано иное, то CDR определяют согласно Kabat и др., выше. Специалисту в данной области должно выть очевидно, что определение CDR можно осуществлять также согласно Chothia, см. выше, McCallum, см. выше или любой известной в научных кругах системе номенклатуры. Вместо вышеуказанного, последовательность CDR-H1, указанная в настоящем описании, может простираться от положения по Кэботу 26 до положения по Кэботу 35 (от Kabat26 до Kabat35), например, для связывающего Pb-DOTAM вариабельного домена.

В одном из объектов изобретения остатки CDR включают остатки, указанные в таблицах последовательностей или в ином месте в настоящей заявке.

Если специально не указано иное, то остатки в HVR/CDR и другие остатки в вариабельном домене (например, остатки в FR) нумеруют согласно Kabat и др., выше.

«Иммуноконъюгат» представляет собой антитело, конъюгированное с одной или несколькими гетерологичной(ыми) молекулой(ами), включая (но не ограничиваясь только им) цитотоксический агент.

«Индивидуум» или «субъект» представляет собой млекопитающее. К млекопитающим относятся (но не ограничиваясь только ими) одомашненные животные (например, коровы, овцы, кошки, собаки и лошади), приматы (например, человек и приматы кроме человека, такие как обезьяны), кролики и грызуны (например, мыши и крысы). В некоторых объектах изобретения индивидуум или субъект представляет собой человека.

Указанные в настоящем описании молекулы могут быть «выделены».

«Выделенное» антитело представляет собой антитело, которое отделено от компонента его естественного окружения. В некоторых объектах изобретения антитело очищают до чистоты, превышающей 95% или 99% по данным, например, электрофоретических анализов (таких, например, как ДСН-ПААГ, изоэлектрическое фокусирование (ИЭФ), капиллярный электрофорез) или хроматографических анализов (таких, например, как ионообменная хроматография или ЖХВР с обращенной фазой). Обзор методов оценки чистоты антител см., например, у Flatman и др., J. Chromatogr. В 848, 2007, сс.79-87.

Понятие «молекула нуклеиновой кислоты» или «полинуклеотид» включает любое соединение и/или любую субстанцию, которое/которая содержит полимер нуклеотидов. Каждый нуклеотид состоит из основания, в частности пуринового или пиримидинового основания (т.е. цитозина (С), гуанина (G), аденина (А), тимина (Т) или урацила (U)), сахара (т.е. дезоксирибозы или рибозы) и фосфатной группы. Часто молекула нуклеиновой кислоты описывается последовательностью оснований, при этом указанные основания образуют первичную структуру (линейную структуру) молекулы нуклеиновой кислоты. Последовательность оснований, как правило, представляют в направлении 5'→3'. В настоящем описании под понятие молекула нуклеиновой кислоты подпадают дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК), включая, например, комплементарную ДНК (кДНК) и геномную ДНК, рибонуклеиновая кислота (РНК), в частности, матричная РНК (мРНК), синтетические формы ДНК или РНК и смешанные полимеры, содержащие две или большее количество указанных молекул. Молекула нуклеиновой кислоты может быть линейной или кольцевой. Кроме того, понятие «нуклеиновая кислота» включает как смысловые, так и антисмысловые цепи, а также одноцепоченые и двухцепочечные формы. Кроме того, указанная в настоящем описании молекула нуклеиновой кислоты может содержать встречающиеся в естественных условиях или не встречающиеся в естественных условиях нуклеотиды. Примеры не встречающихся в естественных условиях нуклеотидов включают модифицированные нуклеотидные основания с дериватизированными сахарами или варианты фосфатного каркаса, или химически модифицированные остатки. Молекулы нуклеиновых кислот включают также молекулы ДНК и РНК, пригодные в качестве вектора для непосредственной экспрессии антитела, предлагаемого в изобретении, in vitro и/или in vivo, например, в хозяине или пациенте. Указанные векторы на основе ДНК (например, кДНК) или РНК (например, мРНК) могут представлять собой немодифицированный или модифицированный вектор. Например, мРНК можно химически модифицировать для повышения стабильности РНК-вектора и/или экспрессии кодируемой молекулы таким образом, чтобы мРНК можно было бы инъецировать индивидууму с целью образования антитела in vivo (см., например, Stadler и др., Nature Medicine 2017, публикация онлайн 12 июня 2017 г., doi: 10.1038/nm.4356 или ЕР 2101823 В1).

«Выделенная» нуклеиновая кислота представляет собой молекулу нуклеиновой кислоты, которая отделена от компонента ее естественного окружения. Выделенная нуклеиновая кислота включает молекулу нуклеиновой кислоты, содержащуюся в клетке, которая в норме включает молекулу нуклеиновой кислоты, но в которой молекула нуклеиновой кислоты присутствует вне хромосомы или в которой ее локализация на хромосоме отличается от ее встречающейся в естественных условиях локализации на хромосоме.

Понятие «выделенная нуклеиновая кислота, кодирующая антитело» относится к одной или нескольким молекулам нуклеиновых кислот, кодирующих тяжелые и легкие цепи антитела (или их фрагменты), включая указанную(ые) молекулу(ы) нуклеиновой(ых) кислоты(т) в одном векторе или в различных векторах, и указанную(ые) молекулу(ы) нуклеиновой(ых) кислоты(т), присутствующую(ие) в одном или нескольких положениях в клетке-хозяине.

Понятие «моноклональное антитело» в контексте настоящего описания относится к антителу, полученному из популяции практически гомогенных антител, т.е. индивидуальные антитела, входящие в популяцию, идентичны и/или связываются с одним и тем же эпитопом, за исключением возможных вариантов антител, например, содержащих мутации, встречающиеся в естественных условиях или возникающие в процессе производства препарата моноклонального антитела, указанные варианты, как правило, присутствуют в минорных количествах. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые, как правило, включают различные антитела к различным детерминантам (эпитопам), каждое моноклональное антитело из препарата моноклонального антитела направлено против одной детерминаты на антигене. Таким образом, прилагательное «моноклональный» определяет особенность антитела, характеризуя его как полученное из практически гомогенной популяции антител, а не сконструированное в соответствии с требованиями к получению антитела с помощью какого-либо конкретного метода. Например, моноклональные антитела, которые можно применять согласно настоящему изобретению, можно создавать с помощью различных технологий, включая (но не ограничиваясь только ими) метод гибридом, методы рекомбинантной ДНК, методы фагового дисплея и методы, основанные на использовании трансгенных животных, которые содержат все или часть локусов человеческого иммуноглобулина, указанные методы и другие, приведенные в качестве примера методы получения моноклональных антител, представлены в настоящем описании.

Понятие «голое антитело» относится к антителу, неконъюгированному с гетерологичным фрагментом (например, цитотоксическим фрагментом) или радиоактивной меткой. Голое антитело может присутствовать в фармацевтической композиции.

Понятие «нативные антитела» относится к встречающимся в естественных условиях молекулам иммуноглобулинов с различными структурами. Например, нативные антитела в виде IgG представляют собой гетеротетрамерные гликопротеины с молекулярной массой примерно 150000 Да, состоящие из двух идентичных легких цепей и двух идентичных тяжелых цепей, связанных дисульфидными мостиками. В направлении от N-конца к С-концу, каждая тяжелая цепь имеет вариабельную область (VH), которую называют также вариабельным тяжелым доменом или вариабельным доменом тяжелой цепи, за которой следует три константных домена тяжелой цепи (CH1, СН2 и СН3).

Аналогично этому, в направлении от N-конца к С-концу, каждая легкая цепь имеет вариабельную область (VL), которую называют также вариабельным легким доменом или вариабельным доменом легкой цепи, за которой следует константный домен легкой цепи (CL).

Понятие «листовка-вкладыш в упаковку» относится к инструкциям, которые обычно входят в поступающие в продажу упаковки терапевтических продуктов, содержащим информацию о показаниях, применении, дозе, пути введения, комбинированной терапии, противопоказаниях и/или мерах предосторожности, которые связаны с применением указанных терапевтических продуктов.

«Процент (%) идентичности аминокислотной последовательности» относительно полипептидной референс-последовательности определяют как процент аминокислотных остатков в последовательности-кандидате, которые идентичны аминокислотным остаткам в полипептидной референс-последовательности, после выравнивая последовательностей и при необходимости интродукции брешей для достижения максимального процента идентичности последовательностей, и не рассматривая какие-либо консервативные замены в качестве компонента при оценке идентичности последовательностей. Сравнительный анализ для целей определения процента идентичности аминокислотных последовательностей можно осуществлять различными путями, известными в данной области, используя, например, публично доступные компьютерные программы, такие как программы BLAST, BLAST-2, Clustal W, Megalign (DNASTAR) или пакт программ FASTA. Специалисты в данной области могут определять соответствующие параметры для выравнивания последовательностей, включая любые алгоритмы, необходимые для достижения максимального выравнивания по всей длине сравниваемых последовательностей. Альтернативно этому, величины процента идентичности можно получать с использованием предназначенной для сравнения последовательностей компьютерной программы ALIGN-2. Предназначенная для сравнения последовательностей компьютерная программа ALIGN-2 разработана фирмой Genentech, Inc., и исходный код помещен на хранение вместе с документацией для пользователя в US Copyright Office, Washington D.C., 20559, где он зарегистрирован под регистрационным номером US Copyright Registration, №TXU510087 и описана в WO 2001/007611.

Если специально не указано иное, то для целей настоящего изобретения величины процента идентичности аминокислотных последовательностей получают с использованием программы ggsearch из пакета программ FASTA, версия 36.3.8 с или более поздняя версия, с использованием матрицы для сравнения BLOSUM50. Пакет программ FASTA был разработан W. R. Pearson и D. J. Lipman, «Improved Tools for Biological Sequence Analysis», PNAS 85, 1988, cc. 2444-2448; W. R. Pearson «Effective protein sequence comparison)) Meth. Enzymol. 266, 1996, cc. 227- 258; и Pearson и др. Genomics 46, 1997, cc. 24-36, и публично доступен на сайте www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta www2/fasta_down.shtml or www.ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta. Альтернативно этому, для сравнения последовательностей можно использовать публичный сервер, доступный на сайте fasta.bioch.virginia.edu/fasta www2/index.cgi, с использованием программы ggsearch (global protein:protein) и задаваемых по умолчанию опций (BLOSUM50; open: -10; ext: -2; Ktup=2) для обеспечения осуществления глобального, а не локального выравнивания. Процент идентичности аминокислот выдается в виде заголовка в качестве выходного результата выравнивания.

Понятие «фармацевтическая композиция» или «фармацевтическая препаративная форма» относится к препарату, который находится в такой форме, которая обеспечивает биологическую активность входящего в его состав действующего вещества, которое должно обладать эффективностью, и который не содержит дополнительные компоненты, обладающие неприемлемой токсичностью для индивидуума, которому следует вводить композицию.

Понятие «фармацевтически приемлемый носитель» относится к ингредиенту в фармацевтической композиции или препаративной форме, отличному от действующего вещества, который является нетоксичным для индивидуума. Фармацевтически приемлемый носитель включает (но не ограничиваясь только ими) буфер, эксципиент, стабилизатор или консервант.

В контексте настоящего описания ссылка на антиген-мишень относится к любому нативному антигену-мишени из любого применяемого в качестве источника позвоночного животного, включая, если специально не указано иное, приматов (например, человека) и грызунов (например, мышей и крыс). Под понятие подпадает «полноразмерный» непроцессированный антиген-мишень, а также любая форма антигена-мишени, полученная в результате процессинга в клетке. Под понятие подпадают также встречающиеся в естественных условиях варианты антигена-мишени, например, сплайсинговые варианты или аллельные варианты. Например, антиген-мишень СЕА может иметь аминокислотную последовательность человеческого СЕА, в частности, родственной карциноэмбриональному антигену молекулы адгезии 5 (СЕАСАМ5), которая зарегистрирована в UniProt (www.uniprot.org), регистрационный номер Р06731 (версия 119) или в NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004354.2. Другим примером антигена-мишени является фибробласт-активирующий белок (FAP). Аминокислотная последовательность человеческого FAP представлена в UniProt (www.uniprot.org), регистрационный номер Q12884 (версия 149) или в NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov/) RefSeq NP_004451.2. Еще одним примером антигена-мишени является GPRC5D (для человеческой последовательности см. UniProt №. Q9NZD1 (версия 115); NCBI RefSeq №. NP_061124.1).

Понятия «сплит-антитело», «сплит-антитела», «однодоменные сплит-антитела» или «СПЛИТ-PRIT» в контексте настоящего описания относятся к варианту, когда VH- и VL-домены, которые вместе образуют антигенсвязывающий центр, обладающий способностью связываться с радиоактивномеченным соединением, разделены между двумя антителами, а не присутствуют в качестве части одного и того же антитела (до сборки in vivo). «СЕА-таргетирующее СПЛИТ PRIT» означает сплит-антитело, мишенью которого является СЕА. Понятие «СПЛИТ PRIT» можно применять также взаимозаменяемо с понятием «ТА-сплит-DOTAM-VH/VL» (например, в котором «ТА» или антиген-мишень представляет собой СЕА, FAP или GPRC5D). Понятие «СЕА-таргетирующее СПЛИТ PRIT» можно применять также взаимозаменяемо с понятием «СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL».

В контексте настоящего описания понятие «лечение» (и его грамматические вариации, такие как «лечить» или «процесс лечения») относится к клиническому вмешательству с целью изменения естественного течения болезни у индивидуума, подлежащего лечению, и его можно осуществлять либо для профилактики, либо в процессе развития клинической патологии. Требуемыми действиями лечения являются (но не ограничиваясь только ими) предупреждение возникновения или рецидива болезни, облегчение симптомов, уменьшение любых прямых или косвенных патологических последствий болезни, предупреждение метастазов, снижение скорости развития болезни, облегчение или временное ослабление болезненного состояния и ремиссия или улучшение прогноза. В некоторых объектах изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, применяют для задержки развития болезни или замедления прогрессирования болезни.

Понятие «вариабельная область» или «вариабельный домен» относится к домену тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные домены тяжелой цепи и легкой цепи (VH и VL соответственно) нативного антитела, как правило, имеют сходные структуры, при этом каждый домен содержит четыре консервативных каркасных участка (FR) и три гипервариабельных участка (CDR) (см., например, Kindt и др., Kuby Immunology, 6-ое изд., изд-во W.H. Freeman and Co., 2007, с. 91). Одного VH- или VL-домена может быть достаточно для обеспечения специфичности связывания антигена. Кроме того, антитела, которые связываются с конкретным антигеном, можно выделять, используя VH- или VL-домен из антитела, которое связывается с антигеном, для скрининга библиотеки комплементарных VL- или VH-доменов соответственно (см., например, Portolano и др., J. Immunol. 150, 1993, сс.880-887; Clarkson и др., Nature 352, 1991, сс. 624-628).

Понятие «вектор» в контексте настоящего описания относится к молекуле нуклеиновой кислоты, которая обладает способностью к размножению другой нуклеиновой кислоты, с которой она связана. Понятие включает вектор в виде самореплицирующейся структуры нуклеиновой кислоты, а также вектор, включенный в геном клетки-хозяина, в которую он интродуцирован. Некоторые векторы обладают способностью контролировать экспрессию нуклеиновых кислот, с которыми они функционально связаны. Указанные векторы в контексте настоящего описания обозначают как «экспрессионные векторы».

Понятие «Pb» или «свинец» в контексте настоящего описания включает его ионы, например, Pb(II). Ссылки на другие металлы также включают их ионы. Таким образом, специалисту в данной области должно быть очевидно, что, например, понятия свинец, Pb, ²¹²Pb или ²⁰³Pb включают ионные формы элемента, в частности, Pb(II).

II. Композиции и способы

Одним из объектов изобретения является, в частности, набор антител, содержащий первое и второе антитела, в котором каждое антитело может связываться с антигеном на клетке-мишени, но при этом функциональный антигенсвязывающий центр для эффекторного агента образуется только тогда, когда первое и второе антитела объединяются друг с другом. Антитела, предлагаемые в изобретении, можно применять, например, в способах претаргетной иммунотерапии и/или претаргетной визуализации. В предпочтительных объектах изобретения в способах отсутствует стадия введения очищающего агента или блокирующего агента.

А. Антигены-мишени

Антиген, который экспрессируется на поверхности клетки-мишени, в настоящем описании обозначают как «антиген-мишень».

Поскольку в изобретении предложены способы лечения и продукты, предназначенные для применения в способах лечения, то его можно применять для любого состояния, поддающегося лечению с использованием цитотоксической активности, направленной на клетки пациента, например, на пораженные заболеванием клетки. Таким образом, клетка-мишень представляет собой любую клетку, на которую требуется направлять цитотоксическое действие, например, любую пораженную заболеванием клетку. Лечение предпочтительно относится к лечению опухоли или рака. Однако область применения изобретения не ограничена опухолями и раками. Например, лечение может представлять собой также лечение вирусной инфекции (путем таргетинга инфицированных клеток) или обусловленного Т-клетками аутоммунного заболевания (путем таргетинга Т-клеток). Иммунотоксины против вирусных антигенов, экспрессируемых на поверхности инфицированных клеток, изучены в отношении целого ряда вирусных инфекций, таких как ВИЧ, бешенство и EBV. Cai и Berger (Antiviral Research 90(3), 2011, cc. 143-50) применяли иммунотоксин, содержащий РЕ38, для таргетного цитолиза клеток, инфицированных ассоциированной с вирусом герпеса саркомой Капоши. Кроме того, Resimmune® (A-dmDT390-bisFv(UCHT1)) избирательно уничтожает человеческие злокачественные Т-клетки и кратковременно истощает здоровые Т-клетки и, как считается, обладает потенциалом в отношении лечения обусловленных Т-клетками аутоиммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз и реакция «трансплантат-против-хозяина», а также Т-клеточных раков крови, в отношении которых проводятся клинические испытания.

Аналогично этому, способы, предлагаемые в изобретении, можно применять для любого типа клеток, для которых требуется радиовизуализации, включая (но не ограничиваясь только ими) раковые или опухолевые клетки.

Таким образом, приемлемые антигены-мишени могут включать антигены раковых клеток, вирусные антигены или микробные антигены.

Антигены, как правило, представляют собой поверхностные антигены здоровых клеток, для которых характерна либо сверхэкспрессия, либо экспрессия в аномальное время. В идеальном варианте антиген-мишень экспрессируется только на пораженных заболеванием клетках (таких как опухолевые клетки), хотя это редко встречается на практике. В результате антигены-мишени, как правило, выбирают на основе различной экспрессии в пораженной заболеванием и здоровой ткани.

Маркер клеточной поверхности или антиген-мишень может представлять собой, например, опухолеассоциированный антиген.

В контексте настоящего описания понятие «опухолеассоциированный антиген» или «опухолеспецифический антиген» относится к любой молекуле (например, белку, пептиду, липиду, углеводу и т.д.), которая исключительно или преимущественно экспрессируется или сверхэкспрессируется опухолевыми клетками и/или раковыми клетками или другими клетками стромы опухоли, такими как ассоциированные с раком фибробласты, в результате чего антиген является ассоциированным с опухолью(ями) и/или раком(ами). Опухолеассоциированный антиген может экспрессироваться также здоровыми, неопухолевыми, нераковыми клетками. Однако в этих случаях экспрессия опухолеассоциированного антигена здоровыми, неопухолевыми, нераковыми клетками не является столь же сильной, как экспрессия опухолевыми или раковыми клетками. В этом контексте опухолевые или раковые клетки могут сверхэкспрессировать существенно более высокие уровни антигена по сравнению с экспрессией антигена здоровыми, неопухолевыми, нераковыми клетками. Кроме того, опухолеассоциированный антиген может экспрессироваться также клетками на другой стадии развития или созревания. Например, опухолеассоциированный антиген может экспрессироваться также клетками на эмбриональной или фетальной стадии, т.е. клетками, которые в норме не встречаются у взрослых хозяев. Альтернативно этому, опухолеассоциированный антиген может экспрессироваться также стволовыми клетками или клетками-предшественниками, которые в норме не встречаются у взрослых хозяев.

Опухолеассоциированный антиген может представлять собой антиген, экспрессируемый любой клеткой любого рака или опухоли, включая виды раков и опухолей, которые указаны в настоящем описании. Опухолеассоциированный антиген может представлять собой опухолеассоциированный антиген только одного типа рака или опухоли, такой как опухолеассоциированный антиген, который ассоциирован или характерен только для одного типа рака или опухоли. Альтернативно этому, опухолеассоциированный антиген может представлять собой опухолеассоциированный антиген для нескольких типов раков или опухолей (например, может быть характерным для них). Например, опухолеассоциированный антиген может экспрессироваться раковыми клетками как молочной железы, так и предстательной железы и не экспрессироваться вообще здоровыми, неопухолевыми или нераковыми клетками.

Примеры опухолеассоциированных антигенов, с которыми антитела, предлагаемые в изобретении, могут специфически связываться, включают (но не ограничиваясь только ими) муцин 1 (MUC1; опухолеассоциированный эпителиальный муцин), преимущественно экспрессируемый антиген меланомы (PRAME), карциноэмбриональный антиген (СЕА), простатспецифический мембранный антиген (PSMA), PSCA, ЕрСАМ, Trop2, колониестимулирующий фактор гранулоцитов-макрофагов (GM-CSFR), CD56, рецептор человеческого эпидермального фактора роста 2 (HER2/neu) (который обозначают также как erbB-2), CDS, CD7, родственный тирозиназе белок (TRP) I и TRP2. В другом варианте осуществления изобретения опухолевый антиген можно выбирать из группы, состоящей из кластера дифференцировки (CD) 19, CD20, CD21, CD22, CD25, CD30, CD33 (связывающий сиаловую кислоту Ig-подобный лектин 3, поверхностный антиген миелоидных клеток), CD79b, CD123 (рецептор интерлейкина 3 альфа), рецептора трансферрина, EGF-рецептора, мезотелина, кадхерина, антигена Льюиса Y, глипикана-3, FAP (фибробласт-активирующий белок альфа), PSMA (простатспецифический мембранный антиген), СА9=CAIX (угольная ангидраза IX), L1 САМ (молекула адгезии нервной клетки L1), эндосиалина, HER3 (активированная конформация члена семейства рецепторов эпидермального фактора роста 3), комплекса A1k1/ВМР9 (киназа анапластической лимфомы 1/участвующий в остеогенезе белок 9), TPBG=5Т4 (трофобластический гликопротеин), ROR1 (поверхностный антиген типа рецептороной тирозинкиназы), HER1 (активированная конформация рецептора эпидермального фактора роста) и CLL1 (семейство лектиновых доменов С-типа, семейство 12, член А). Мезотелин экспрессируется, например, при раке яичников, мезотелиоме, немелкоклеточном раке легких, аденокарциноме легких, раке фаллопиевых труб, раке головы и шеи, раке шейки матки и раке поджелудочной железы. CD22 экспрессируется, например, при волосатоклеточном лейкозе, хроническом лимфоцитарном лейкозе (CLL), пролимфоцитарном лейкозе (PLL), неходжкинской лимфоме, лимфоме из малых лимфоцитов (SLL) и остром лимфатическом лейкозе (ALL). CD25 экспрессируется, например, при лейкозах и лимфомах, включая волосатоклеточный лейкоз и лимфому Ходжкина. Антиген Льюиса Y экспрессируется, например, при раке мочевого пузыря, раке молочной железы, раке яичника, колоректальном раке, раке пищевода, раке желудка, раке легких и раке поджелудочной железы. CD33 экспрессируется, например, при остром миелоидном лейкозе (AML), хроническом миеломоноцитарном лейкозе (CML) и миелопролиферативных нарушениях.

Примеры антител, которые специфически связываются с опухолеассоцированными антигенами, включают (но не ограничиваясь только ими) антитела против рецептора трансферрина (например, НВ21 и его варианты), антитела против CD22 (например, RFB4 и его варианты), антитела против CD25 (например, анти-Тас и его варианты), антитела против мезотелина (например, SS 1, MORAb-009, SS, HN1, HN2, MN, MB и их варианты) и антитела против антигена Льюиса Y (например, В3 и его варианты). В этом контексте таргетирующий фрагмент (связывающийся с клетками агент) может представлять собой антитело, выбранное из группы, которая состоит из В3, RFB4, SS, SS1, MN, MB, HN1, HN2, НВ21 и MORAb-009 и их антигенсвязывающих участков. Дополнительные примеры таргетирующих фрагментов, пригодных для применения в заявляемых химерных молекулах, описаны, например, в патентах США №5242824 (антитело к рецептору трансферрина); №5846535 (антитело к CD25); №5889157 (антитело к антигену Льюиса Y); №5981726 (антитело к антигену Льюиса Y); №5990296 (антитело к антигену Льюиса Y); №7081518 (антитело к мезотелину); №7355012 (антитело к CD22 и к CD25); №7368110 (антитело к мезотелину); №7470775 (антитело к CD30); №7521054 (антитело к CD25) и №7541034 (антитело к CD22); в публикации заявки на патент США 2007/0189962 (антитело в CD22); у Frankel и др., Clin. Cancer Res., 6, 2000, сс.326-334 и Kreitman и др., AAPS Journal, 8(3), 2006, Е532-Е551), содержание каждого документа включено в настоящее описание в качестве ссылки.

Известны другие антитела, которые могут образовываться против специфических для опухоли родственных антигенов-мишеней, включая: Cripto, CD30, CD19, CD33, гликопротеин NMB, CanAg, Her2 (ErbB2/Neu), CD56 (NCAM), CD22 (Siglec2), CD33 (Siglec3), CD79, CD138, PSCA, PSMA (простатспецифический мембранный антиген), ВСМА, CD20, CD70, Е-селектин, EphB2, меланотрансферрин, Muc16 и TMEFF2.

Любое из них или любой из их антигенсвязывающий фрагментов можно применять согласно настоящему изобретению, т.е. их можно включать в антитела, указанные в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения может оказаться предпочтительным, если опухолеассоциированный антиген представляет собой карциноэмбриональный антиген (СЕА).

СЕА является предпочтительным в контексте настоящего изобретения, поскольку он относительно медленно интернализуется, и поэтому высокий процент антител должен оставаться доступным на поверхности клетки после начальной обработки, связываясь с радионуклидом. Предпочтительными могут являться также другие отличающиеся низким уровнем интернализации антигены-мишени/опухолеассоциированные антигены. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения опухолеассоциированный антиген может представлять собой CD20 или HER2. В следующих вариантах осуществления изобретения мишень может представлять собой EGP-1 (эпителиальный гликопротеин-1, известный также как трофобласт-2), специфический для ободочной кишки антиген-р (CSAp) или панкреатический муцин MUC1 (см., например, у Goldenberg и др., Theranostics 2(5), 2012, публикация включена в настоящее описание в качестве ссылки). В указанной ссылке описаны также антитела, такие как Mu-9, связывающееся с CSAp (см. также Sharkey и др., Cancer Res. 63, 2003, сс.354-363), hPAM4, связывающееся с MUC1 (см. также Gold и др., Cancer Res. 68, 2008, сс.4819-4826), валтузумаб, связывающийся с CD20 (см. также Sharkey и др., Cancer Res. 68, 2008, сс. 5282-5290), и hRS7, связывающееся с EGP-1 (см. также Cubas и др., Biochim Biophys Acta 1796, 2009, сс.309-314). Любое из этих антител или любой из их антигенсвязывающих участков можно применять согласно настоящему изобретению, т.е. можно включать в антитела, указанные в настоящем описании.

Одним из примеров антитела, образовавшегося против СЕА, является Т84.66 (которое находится в NCBI под регистрационным №: САА36980 для тяжелой цепи и №САА36979 для легкой цепи, см. SEQ ID NO: 317 и 318 в WO 2016/075278) и его гуманизированные и химерные версии, такие как Т84.66-LCHA, описанные в WO 2016/075278 А1 и/или WO 2017/055389. Другим примером является CH1A1a, антитело к СЕА, описанное в WO 2012/117002 и WO 2014/131712, и СЕА hMN-14 (см. также US 6676924 и US 5874540). Другим антителом к СЕА является А5В7, описанное у М.J. Banfield и др., Proteins 29(2), 1997, сс. 161-171. Гуманизированные антитела, полученные из мышиного антитела А5В7, описаны в WO 92/01059 и WO 2007/071422 (см. также совместно рассматриваемую заявку РСТ/ЕР 2020/067582). Примером гуманизированной версии А5В7 является A5H1EL1(G54A). Другим примером антитела против СЕА является MFE23 и его гуманизированные версии, описанные в US 7626011 и/или в совместно рассматриваемой заявке РСТ/ЕР 2020/067582. Еще одним примером антитела против СЕА является 28А9. Любое из них или их антигенсвязывающих фрагментов можно применять для создания СЕА-связывающего плеча, предлагаемого в настоящем изобретении.

FAP (фибробласт-активирующий белок альфа) или GPRC5D (сопряженный с G-белком рецептор, класс С, группа 5, член D) может также быть предпочтительным в вариант осуществления изобретения. FAP является известной мишенью для визуализации и терапии из-за его широкой экспрессии в микроокружении многих типов опухолей, например, при раке поджелудочной железы, молочной железы и легкого (Lindner Т., Loktev A., Giesel F. и др., Targeting of activated fibroblasts for imaging and therapy. EJNMMI radiopharm. chem. 4, 2019, c.16). Таким образом, можно ожидать, что осуществление СПЛИТ-PRIT с использованием антител FAP-сплит-DOTAM-VH/VL приведет к специфическому накапливанию ²¹²Pb-DOTAM на активированных ассоциированных с раком фибробластах. Следовательно, можно ожидать, что испускаемое альфа-излучение будет оказывать отрицательное воздействие на иммунную супрессию экспрессирующих FAP злокачественных опухолей в дополнение к непосредственному уничтожающему опухоль действию на соседние опухолевые клетки. Сверхэкспрессия сопряженного с G-белком рецептора, класс С, группа 5, член D (GPRC5D) имеет место на плазматических клетках при множественной миеломе (Atamaniuk J., Gleiss A., Porpaczy Е., Kainz В., Grunt T.W., Raderer M. и др.. Overexpression of G protein-coupled receptor 5D in the bone marrow is associated with poor prognosis in patients with multiple myeloma. Eur J Clin Invest. 42, 2012, cc. 953-960), что установлено на созданных с использованием SC (подкожного) введения моделей in vivo, имитирующих экспрессию, обнаруженную у пациентов с множественной миеломой, например, ОРМ-2 и NCI-H929 (Kodama Т., Kochi Y., Nakai W., Mizuno H., Baba Т., Habu К. и др., Anti-GPRC5D/CD3 bispecific T-cell-redirecting antibody for the treatment of multiple myeloma. Mol Cancer Ther. 18, 2019, cc. 1555 1564). Таким образом, при создании настоящего изобретения предполагается осуществление СПЛИТ-PRIT с использованием антител GPRC5D-сплит-DOTAM-VH/VL для достижения опухольспецифического накапливания ²¹²Pb-DOTAM с последующей индуцированной излучением гибелью опухолевых клеток.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела, предлагаемые в изобретении, могут специфически связываться с антигеном-мишенью (например, с любым из антигенов-мишеней, обсуждение которых представлено в настоящем описании). В некоторых вариантах осуществления изобретения связывание может характеризоваться константой диссоциации (Kd), составляющей ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например, 10^-7 М или менее, например, от 10^-7 до 10^-13, 10^-8 М или менее, например, от 10^-8 М до 10^-13 М, например, от 10^-9 М до 10^-13 М).

Первое и второе антитело каждое связывается с одним и тем же антигеном-мишенью, который можно обозначать как «антиген А» (т.е. они имеют связывающую специфичность в отношении одного и того же антигена-мишени). Каждое из них имеет связывающую специфичность в отношении одного и того же эпитопа на антигене А. Альтернативно этому, первое антитело может связываться с первым эпитопом на антигене А, а второе антитело может связываться с отличным от него вторым эпитопом на антигене А. Например, в одном из вариантов осуществления изобретения одно из антител может связываться с эпитопом СЕА, распознаваемым Т84.66, а другое может связываться с эпитопом СЕА, распознаваемым А5В7.

В некоторых вариантах осуществления изобретения одно или оба из первого и/или второго антител могут являться бипаратопными в отношении антигена А, т.е. каждое из индивидуальных антител может связываться с двумя различными эпитопами антигена А. Первое антитело может содержать первый и второй сайты связывания, которые связываются с первым и вторым эпитопами антигена А соответственно, при этом, первый и второй эпитопы отличаются друг от друга. В альтернативном или дополнительном варианте второе антитело может содержать первый и второй сайты связывания, которые связываются с первым и вторым эпитопами антигена А, при этом, первый и второй эпитопы отличаются друг от друга. В некоторых вариантах осуществления изобретения один или оба эпитопа, с которыми связывается первое антитело, могут отличаться от одного или обоих эпитопов, с которыми связывается второе антитело. В других вариантах осуществления изобретения два эпитопа, которые связываются первым антителом, могут быть такими же, что и два эпитопа, с которыми связывается второе антитело.

Б. Радиоактивномеченные соединения

Согласно настоящему изобретению объединение первого и второго антител приводит к образованию функционального сайта связывания эффекторной молекулы. Эффекторные молекулы, предлагаемые в настоящем изобретении, представляют собой радиоактивномеченные соединения, которые содержат радиоизотоп, например, представляют собой радиоактивномеченный гаптен.

В некоторых вариантах осуществления изобретения эффекторная молекула может содержать хелатный радиоизотоп.

В некоторых вариантах осуществления изобретения функциональный сайт связывания для эффекторной молекулы может связываться с хелатом, содержащим хелатор и радиоизотоп. В других вариантах осуществления изобретения антитело может связываться с фрагментом, конъюгированным с хелатным радиоизотопом, например, гистамин-сукцинил-глицином (HSG), дигоксигенином, биотином или кофеином.

Хелатор может представлять собой, например, многодентатную молекулу, такую как аминополикарбоновая кислота или аминополитиокарбоновая кислота или ее соль, или функциональный вариант.Хелатор может быть, например, бидентатным или тридентатным, или тетрадентатным. Примеры приемлемых хелаторов металлов включают молекулы, которые содержат EDTA (этилендиаминтетрауксусная кислота или ее соль, такая как CaNa₂EDTA), DTPA (диэтилентриаминпентауксусная кислота), DOTA (1,4,7,10-тетраазациклододекан-1,4,7,10-тетрауксусная кислота), NOTA (2,2',2''-(1,4,7-триазанонан-1,4,7-триил)триуксусная кислота), IDA (иминодиуксусная кислота), MIDA ((метилимино)диуксусная кислота), ТТНА (3,6,9,12-тетракис(карбоксиметил)-3,6,9,12-тетраазатетрадекандионовая кислота), ТЕТА (2,2',2'',2'''-(1,4,8,11-тетраазациклотетрадекан-1,4,8,11-тетраил)тетрауксусная кислота), DOTAM (1,4,7,10-тетракис(карбамоилметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан), НЕНА (1,4,7,10,13,16-гексаазациклогексадекан-1,4,7,10,13,16-гексауксусная кислота, поступающая в продажу от фирмы Macrocyclics, Inc., Плано, шт. Техас), NTA (нитрилотриуксусная кислота), EDDHA (этилендиамин-N,N'-бис(2-гидроксифенилуксусная кислота), BAL (2,3,-димеркаптопропанол), DMSA (2,3-димеркаптоянтарная кислота), DMPS (2,3-димеркапто-1-пропансульфоновая кислота), D-пеницилламин (В-диметилцистеин), MAG₃ (меркаптоацетилтриглицин), Hynic (6-гидразинопридин-3-карбоновая кислота), пара-изотиоцианатобензилдесферриоксамин (например, меченный с помощью циркония для визуализации) и их соли или функциональные варианты/производные, обладающие способностью хелатировать металл. В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться предпочтительным, чтобы хелатор представлял собой DOTA или DOTAM и его соль или функциональный вариант/функциональное производное, обладающий/обладающее способностью хелатировать металл. Таким образом, хелатор может представлять собой или может содержать DOTA или DOTAM с хелатированным радиоизотопом.

Эффекторная молекула может содержать или состоять из функциональных вариантов или производных указанных выше хелаторов в сочетании с радионуклидом. Приемлемые варианты /производные имеют структуру, отличающуюся в некоторой ограниченной степени и сохраняющую способность функционировать в качестве хелатора (т.е. она сохраняет активность, достаточную для применения для одной или нескольких целей, указанных в настоящем описании). Функциональные варианты/производные могут включать также описанный выше хелатор, конъюгированный с одним или несколькими дополнительными фрагментами или заместителями, включая низкомолекулярное соединение, полипептид или углевод. Указанное присоединение можно осуществлять через один из входящих в хелатор углеродов, например, в каркасной области хелатора. Приемлемым заместителем может являться, например, углеводородная группа, такая как алкил, алкенил, арил или алкинил; гидроксильная группа; спиртовая группа; атом галогена; нитрогруппа; цианогруппа; сульфонильная группа; тиольная группа; аминогруппа; оксогруппа; карбоксильная группа; тиокарбоксильная группа; карбонильная группа; амидогруппа; сложноэфирная группа или гетероциклическая группа, включающая гетероарильные группы. Заместитель может, например, представлять собой один из указанных ниже для группа «R¹».Низкомолекулярное соединение может представлять собой, например, краситель (такой как Alexa 647 или Alexa 488), биотин или фрагмент биотина или фенильный, или бензильный фрагмент. Полипептид может представлять собой, например, олигопептид, например, олигопептид из двух или трех аминокислот. Примеры углеводов включают декстран, линейные или разветвленные полимеры или сополимеры (например, полиалкилен, поли(этиленлизин), полиметакрилат, полиаминокислоты, поли- или олигосахариды, дендримеры). Производные могут включать также мультимеры или хелатные соединения, в которых соединения, указанные выше, сцеплены через линкерный фрагмент. Производные могут включать также функциональные фрагменты вышеуказанных соединений, которые сохраняют способность хелатировать ион металла.

Конкретные примеры производных включают бензил-EDTA и гидроксиэтилтиоуридобензил-EDTA, DOTA-бензол (например, (S-2-(4-аминобензил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан тетрауксусная кислота), DOTA-биотин и DOTA-TyrLys-DOTA.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения функциональный сайт связывания, образовавшийся в результате объединения первого и второго антител, связывается с хелатом металла, содержащим DOTAM и металл, например, свинец (Pb). Как указано выше, «DOTAM» имеет химическое название:

1,4,7,10-тетракис(карбамоилметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан, который представляет собой соединение следующей формулы:

Согласно некоторым объектам и вариантам осуществления настоящего изобретения можно применять также функциональные варианты или производные DOTAM, включающие ион металла. Приемлемые варианты/производные DOTAM имеют структуру, которая в некоторой степени отличается от структуры DOTAM, но сохраняет способность функционировать (т.е. сохраняет достаточную активность, позволяющую использовать их для одной или нескольких целей, указанных в настоящем описании). В указанных объектах и вариантах осуществления изобретения DOTAM или функциональный вариант/функциональное производное DOTAM может представлять собой один из активных вариантов, описанных в WO 2010/099536.

Приемлемые функциональные варианты/производные могут представлять собой соединение следующей формулы:

или его фармацевтически приемлемую соль; в которой

R^N обозначает H, C₁-С₆алкил, C₁-С₆галоалкил, С₂-С₆алкенил, С₂-С₆алкинил, С₃-С₇циклоалкил, С₃-С₇циклоалкил-С₁-С₄алкил, С₂-С₇гетероциклоалкил, С₂-С₇гетероциклоалкил-С₁-С₄алкил, фенил, фенил-С₁-С₄алкил, C₁-С₇гетероарил и С₁-С₇гетероарил-С₁-С₄алкил; где С₁-С₆алкил, C₁-С₆галоалкил, С₂-С₆алкенил и С₂-С₆алкинил каждый необязательно замещен 1, 2, 3 или 4 независимо выбранными R^w-группами; и где указанный С₃-С₇циклоалкил, С₃-С₇циклоалкил-С₁-С₄алкил, С₂-С₇гетероциклоалкил, С₂-С₇гетероциклоалкил-С₁-С₄алкил, фенил, фенил-С₁-С₄алкил, C₁-С₇гетероарил и C₁-С₇гетероарил-С₁-С₄алкил каждый необязательно замещен 1, 2, 3 или 4 независимо выбранными R^x-группами;

L¹ независимо обозначает C₁-С₆алкилен, C₁-С₆алкенилен или C₁-С₆алкиниленен, каждый из которых необязательно замещен 1, 2 или 3 группами, независимо выбранными из R¹-групп;

L² обозначает С₂-С₄алкилен с прямой цепью, который необязательно замещен независимо выбранной R¹-группой; и который необязательно замещен 1, 2, 3 или 4 группами, независимо выбранными из С₁-С₄алкила и/или C₁-С₄галоалкила;

R¹ независимо выбран из D¹-D²-D³, галогена, цианогруппы, нитрогруппы, гидроксила, C₁-С₆алкоксигруппы, C₁-С₆галоалкоксигруппы, C₁-С₆алкилтиогруппы, C₁-С₆алкилсульфинила, C₁-С₆алкилсульфонила, аминогруппы, C₁-С₆алкиламиногруппы, ди-С₁-С₆алкиламиногруппы, C₁-С₄алкилкарбонила, карбоксигруппы, C₁-С₆алкоксикарбонила, C₁-С₆алкилкарбониламиногруппы, ди-С₁-С₆алкилкарбониламиногруппы, C₁-С₆алкоксикарбониламиногруппы, С₁-С₆алкоксикарбонил-(С₁-С₆алкил)аминогруппы, карбамила, C₁-С₆алкилкарбамила и ди-C₁-С₆алкилкарбамила;

D¹ каждый независимо друг от друга выбран из С₁-С₆арил-С₁-С₄алкила, C₁-С₉гетероарил-С₁-С₄алкила, С₃-С₁₀циклоалкил-С₁-С₄алкила, С₂-С₉гетероциклоалкил-С₁-С₄алкила, С₁-С₈алкилена, С₁-С₈алкенилена и C₁-С₈алкиниленена; где указанный С₁-С₈алкилен, С₁-С₈алкенилен и C₁-С₈алкиниленен необязательно замещены 1, 2, 3 или 4 независимо выбранными R⁴-группами; и где указанный С₁-С₆арил-С₁-С₄алкил, С₁-С₉гетероарил-С₁-С₄алкил, С₃-С₁₀циклоалкил-С₁-С₄алкил, С₂-С₉гетероциклоалкил-С₁-С₄алкил каждый необязательно замещен 1, 2, 3 или 4 независимо выбранными R⁵-группами;

D² каждый независимо друг от друга отсутствует или обозначает C₁-С₂₀алкилен с прямой цепью, где от 1 до 6 несмежных метиленовых групп в указанном C₁-С₂₀алкилене с прямой цепью каждая необязательно замещена независимо выбранным -D⁴-фрагментом, при условии, что по меньшей мере одно метиленовое звено в указанном С₁-С₂₀алкилене с прямой цепью обязательно замещено -D⁴-фрагментом; где указанный С₁-С₂₀алкилен с прямой цепью необязательно замещен одной или несколькими группами, независимо выбранными из галогена, цианогруппы, гидроксила, С₁-С₄алкила, C₁-С₄галоалкила, С₁-С₄алкоксигруппы, С₁-С₄галоалкоксигруппы, аминогруппы, C₁-С₄алкиламиногруппы, ди-С₁-С₄алкиламиногруппы, С₁-С₄алкилкарбонила, карбоксигруппы, С₁-С₄алкоксикарбонила, С₁-С₄алкилкарбониламиногруппы, ди-С₁-С₄алкилкарбониламиногруппы, С₁-С₄алкоксикарбониламиногруппы, C₁-С₄алкоксикарбонил-(С₁-С₄алкил)аминогруппы, карбамила, С₁-С₄алкилкарбамила и ди-С₁-С₄алкилкарбамила;

D³ каждый независимо друг от друга выбран из Н, галогена, цианогруппы, нитрогруппы, гидроксила, C₁-С₆алкила, C₁-С₆галоалкила, С₂-С₆алкенила, С₂-С₆алкинила, С₃-С₁₄циклоалкила, С₃-С₁₄циклоалкил-С₁-С₄алкила, С₂-С₁₄гетероциклоалкила, С₂-С₁₄гетероциклоалкил-С₁-С₄алкила, С₆-С₁₄арила, C₆-С₁₄арил-С₁-С₄алкила, С₁-С₁₃гетероарила, С₁-С₁₃гетероарил-С₁-С₄алкила; где указанный C₁-С₆алкил, C₁-С₆галоалкил, С₂-С₆алкенил, С₂-С₆алкинил каждый необязательно замещен 1, 2, 3 или 4 независимо выбранными R⁶-группами; и где указанный С₃-С₁₄циклоалкил, С₃-С₁₄циклоалкил-С₁-С₄алкил, С₂-С₁₄гетероциклоалкил, С₂-С₁₄гетероциклоалкил-С₁-С₄алкил, С₆-С₁₄арил, С₆-С₁₄арил-С₁-С₄алкил, С₁-С₁₃гетероарил, С₁-С₁₃гетероарил-С₁-С₄алкил каждый необязательно замещен 1, 2, 3 или 4 независимо выбранными R⁷-группами;

D⁴ каждый независимо друг от друга выбран из -O-, -S-, -NR^aC(=O)-, -NR^aC(=S)-, -NR^bC(=O)NR^c-, -NR^bC(=S)NR^c-, -S(=O)-, -S(=O)₂-, -S(=O)NR^a-, -C(=O)-, -C(=S)-, -C(=O)O-, -OC(=O)NR^a-, -OC(=S)NR^a-, -NR^a-, -NR^bS(=O)NR^c- и NR^bS(=O)₂NR^O-;

R⁴ и R⁶ каждый независимо друг от друга выбран из галогена, цианогруппы, нитрогруппы, гидроксила, С₁-С₄алкоксигруппы, C₁-С₄галоалкоксигруппы, С₁-С₄алкилтиогруппы, С₁-С₄алкилсульфинила, C₁-С₄алкилсульфонила, аминогруппы, С₁-С₄алкиламиногруппы, ди-C₁-С₄алкиламиногруппы, С₁-С₄алкилкарбонила, карбоксигруппы, C₁-С₄алкоксикарбонила, С₁-С₄алкилкарбониламиногруппы, ди-С₁-С₄алкилкарбониламиногруппы, С₁-С₄алкоксикарбониламиногруппы, C₁-С₄алкоксикарбонил-(С₁-С₄алкил)аминогруппы, карбамила, С₁-С₄алкилкарбамила и ди-С₁-С₄алкилкарбамила;

R⁵ каждый независимо друг от друга выбран из галогена, цианогруппы, нитрогруппы, гидроксила, С₁-С₄алкила, С₂-С₄алкенила, С₂-С₄алкинила, C₁-С₄алкоксигруппы, С₁-С₄галоалкоксигруппы, С₁-С₄алкилтиогруппы, C₁-С₄алкилсульфинилв, С₁-С₄алкилсульфонила, аминогруппы, C₁-С₄алкиламиногруппы, ди-С₁-С₄алкиламиногруппы, С₁-С₄алкилкарбонила, карбоксигруппы, С₁-С₄алкоксикарбонила, С₁-С₄алкилкарбониламиногруппы, ди-C₁-С₄алкилкарбониламиногруппы, C₁-С₄алкоксикарбониламиногруппы, C₁-С₄алкоксикарбонил-(С₁-С₄алкил)аминогруппы, карбамила, С₁-С₄алкилкарбамила и ди-С₁-С₄алкилкарбамила;

R⁷ каждый независимо друг от друга выбран из галогена, цианогруппы, нитрогруппы, гидроксила, C₁-С₆алкила, С₂-С₆алкенила, С₂-С₆алкинила, С₃-С₇циклоалкила, С₃-С₇циклоалкил-С₁-С₄алкила, С₂-С₇гетероциклоалкила, С₂-С₇гетероциклоалкил-С₁-С₄алкила, фенила, фенил-С₁-С₄алкила, C₁-С₇гетероарила, С₁-С₇ гетероарил-С₁-С₄алкила, -OR^O, -SR^O, -S(=O)R^P, -S(=O)₂R^P, -S(=O)NR^sR^t, -C(=O)R^P, -C(=O)OR^P, -C(=O)NR^sR^t, -OC(=O)R^P, -OC(=O)NR^sR^t, -NR^sR^t, -NR^qC(=O)R^r, -NR^qC(=O)OR^r, -NR^qC(=O)NR^r, -NR^qS(=O)₂R^r и -NR^PS(=O)₂NR^sR^t; где указанный C₁-С₆алкил, С₂-С₆алкенил, С₂-С₆алкинил каждый необязательно замещен 1, 2, 3 или 4 независимо выбранными R'-группами; и где указанный С₃-С₇циклоалкил, С₃-С₇циклоалкил-С₁-С₄алкил, С₂-С₇гетероциклоалкил, С₂-С₇гетероциклоалкил-С₁-С₄алкил, фенил, фенил-C₁-С₄алкил, С₁-С₇гетероарил, С₁-С₇гетероарил-С₁-С₄алкил каждый необязательно замещен 1, 2, 3 или 4 независимо выбранными R''-группами;

R^a, R^b и R^c каждый независимо друг от друга выбран из Н, C₁-С₆алкила, C₁-С₆галоалкила, С₂-С₆алкенила, С₂-С₆алкинила, С₃-С₇циклоалкила, С₃-С₇циклоалкил-С₁-С₄алкила, С₂-С₇гетероциклоалкила, С₂-С₇гетероциклоалкил-С₁-С₄алкила, фенила, фенил-С₁-С₄алкила, С₁-С₇гетероарила, С₁-С₇гетероарил-С₁-С₄алкила; где указанный C₁-С₆алкил, C₁-С₆галоалкил, С₂-С₆алкенил, С₂-С₆алкинил каждый необязательно замещен 1, 2, 3 или 4 независимо выбранными R^w-группами; и где указанный С₃-С₇циклоалкил-С₁-С₄алкил, С₂-С₇гетероциклоалкил, С₂-С₇гетероциклоалкил-С₁-С₄алкил, фенил, фенил-C₁-С₄алкил, С₁-С₇гетероарил, С₁-С₇гетероарил-С₁-С₄алкил каждый необязательно замещен 1, 2, 3 или 4 независимо выбранными R^x-группами;

R^o, R^p, R^q, R^r, R^s и R^t каждый независимо выбран из H, С₁-С₆алкила, C₁-С₆галоалкила, С₂-С₆алкенила, С₂-С₆алкинила, С₃-С₇циклоалкила, С₃-С₇циклоалкил-С₁-С₄алкила, С₂-С₇гетероциклоалкила, С₂-С₇гетероциклоалкил-С₁-С₄алкила, фенила, фенил-С₁-С₄алкила, С₁-С₇гетероарила, С₁-С₇гетероарил-С₁-С₄алкила; где указанный C₁-С₆алкил, C₁-С₆галоалкил, С₂-С₆алкенил, С₂-С₆алкинил каждый необязательно замещен 1, 2, 3 или 4 независимо выбранными R^y-группами; и где указанный С₃-С₇циклоалкил-С₁-С₄алкил, С₂-С₇гетероциклоалкил, С₂-С₇гетероциклоалкил-С₁-С₄алкил, фенил, фенил-C₁-С₄алкил, С₁-С₇гетероарил, С₁-С₇гетероарил-С₁-С₄алкил каждый необязательно замещен 1, 2, 3 или 4 независимо выбранными R^z-группами;

R', R^w и R^y каждый независимо друг от друга выбран из гидроксила, цианогруппы, нитрогруппы, С₁-С₄алкоксигруппы, С₁-С₄галоалкоксигруппы, аминогруппы, С₁-С₄алкиламиногруппы и ди-С₁-С₄алкиламиногруппы; и

R'', R^x и R^z каждый независимо друг от друга выбран из гидроксила, галогена, цианогруппы, нитрогруппы, С₁-С₄алкила, С₁-С₄галоалкила, C₁-С₄алкоксигруппы, С₁-С₄галоалкоксигруппы, аминогруппы, C₁-С₄алкиламиногруппы и ди-С₁-С₄алкиламиногруппы;

при условии, что валентность каждого атома в необязательно замещенных фрагментах не превышена.

Предпочтительно функциональные варианты/производные указанной выше формулы имеют аффинность в отношении антитела, предлагаемого в настоящем изобретении, сопоставимую или более высокую по сравнению с аффинностью DOTAM, и имеют силу связывания с Pb, сопоставимую или более высокую по сравнению с DOTAM (при измерении «аффинности» по константе диссоциации, как описано выше). Например, константа диссоциации функционального варианта/производного для антитела, предлагаемого в настоящем изобретении, или Pb может быть выше в 1,1 раза или менее, в 1,2 раза или менее, в 1,3 раза или менее, в 1,4 раза или менее, в 1,5 раза или менее или в 2 раза или менее, чем константа диссоциации DOTAM, характеризующая связывание с этим же антителом/Pb.

R^N каждый может обозначать H, С₁-С₆алкил или С₁-С₆галоалкил; предпочтительно Н, С₁-С₄алкил или С₁-С₄галоалкил. Наиболее предпочтительно R^N каждый обозначает Н.

Предпочтительно, если в вариантах DOTAM 1, 2, 3 или наиболее предпочтительно все L² обозначают С₂алкилен. Важно отметить, что содержащие С₂алкилен варианты DOTAM могут обладать наиболее высокой аффинностью к Pb. Необязательными заместителями L² могут быть R¹, C₁-С₄алкил или С₁-С₄галоалкил. Приемлемо, когда необязательными заместителями L² являются С₁-С₄алкил или С₁-С₄галоалкил.

Необязательно L² каждый может быть незамещен С₂алкиленом -СН₂СН₂-.

L¹ каждый предпочтительно обозначает С₁-С₄алкилен, более предпочтительно С₁алкилен, такой как -СН₂-.

Функциональный вариант/функциональное производное DOTAM может представлять собой соединение следующей формулы:

в которой Z каждый независимо обозначает R¹, указанный выше; р, q, r и s обозначают 0, 1 или 2; и сумма p+q+r+s составляет 1 или более. Предпочтительно р, q, r и s обозначают 0 или 1 и/или сумма p+q+r+s составляет 1. Например, в соединении сумма p+q+r+s может быть равна 1, и Z обозначает пара-SCN-бензильный фрагмент - такое соединение поступает в продажу от фирмы Macrocyclics, Inc. (Плано, шт. Техас).

Радионуклиды, которые можно применять согласно изобретению, могут включать радиоизотопы металлов, таких как свинец (Pb), лютеций (Lu) или иттрий (Y).

Радионуклиды, наиболее ценные для применения с целью визуализации, могут представлять собой радионуклиды, испускающие гамма-лучи. Например, их можно выбирать из ²⁰³Pb или ²⁰⁵Bi.

Радионуклиды, наиболее ценные для терапевтических применений, представляют собой радионуклиды, испускающие альфа- или бета-лучи. Например, их можно выбирать из ²¹²Pb, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu, ²²⁵Ac, ²¹¹At, ²²⁷Th, ²²³Ra.

В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться предпочтительным, чтобы DOTAM (или его соли или функциональные варианты) образовывал хелат с Pb или Bi, таким как один из радиоизотопов Pb или Bi, которые указаны выше. В других вариантах осуществления изобретения может оказаться предпочтительным, чтобы DOTAM (или его соли или функциональные варианты) образовывал хелат с Lu или Y, таким как один из радиоизотопов Lu или Y, которые указаны выше.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способы и варианты применения могут включать объединенные способы терапии и визуализации, в которых используют смесь радиоизотопов, например, радиоизотоп, пригодный для терапии, и радиоизотоп, пригодный для визуализации. Например, они могут представлять собой различные радиоизотопы одного и того же металла, хелатированные одним и тем же хелатором. В одном из вариантов осуществления изобретения способ может включать введение ²⁰³Pb-DOTAM и ²¹²Pb-DOTAM в виде смеси. В другом варианте осуществления изобретения способ может включать первый цикл дозиметрии с использованием гамма-излучателя, такого как ²⁰³Pb или ²⁰⁵Bi, с последующим одним или несколькими циклами облучения с использованием альфа- или бета-излучателя, такого как ²¹²Pb, ²¹²Bi, ²¹³Bi, ⁹⁰Y, ¹⁷⁷Lu, ²²⁵Ac, ²¹¹At, ²²⁷Th или ²²³Ra. Указанные способы дополнительно описаны ниже.

В некоторых вариантах осуществления изобретения функциональный сайт связывания, образованный в результате объединения первого и второго антител, может связываться с хелатом Pb-DOTAM.

В некоторых вариантах осуществления изобретения функциональный сайт связывания, образованный в результате объединения первого и второго антител, может связываться с радиоактивномеченным соединением. В некоторых вариантах осуществления изобретения он может связываться с радиоактивномеченным соединением, таким как хелат Pb-DOTAM, при этом константа диссоциации (Kd), характеризующая связывание с Pb-DOTAM и/или с мишенью, составляет ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например, 10^-7 М или менее, например, от 10^-7 до 10^-13, 10^-8 М или менее, например, от 10^-8 М до 10^-13 М, например, от 10^-9 М до 10^-13 М). В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться предпочтительным, если он связывается с величиной Kd, характеризующей аффинность связывания, составляющей 100 пМ, 50 пМ, 20 пМ, 10 пМ, 5 пМ, 1 пМ или менее, например, 0,9 пМ или менее, 0,8 пМ или менее, 0,7 пМ или менее, 0,6 пМ или менее или 0,5 рМ или менее. Например, функциональный сайт связывания может связываться с хелатом металла с величиной Kd, составляющей примерно 1 пМ - 1 нМ, например, примерно 1-10 пМ, 1-100 пМ, 5-50 пМ, 100-500 пМ или 500 пМ - 1 нМ.

В. Примеры антигенсвязывающих центров для DOTA

В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения при объединении первого и второго антител образуется функциональный сайт связывания с DOTA (или с его функциональным производным или вариантом), например хелатом DOTA с Lu или Y (например, ¹⁷⁷Lu или ⁹⁰Y). Например, функциональный сайт связывания может связываться с радиоактивномеченным соединением с величиной Kd, составляющей примерно 1 пМ - 1 нМ, например, примерно 1-10 пМ, 1-100 пМ, 5-50 прМ, 100-500 пМ или 500 пМ - 1 нМ.

С825 представляет собой известный scFv, обладающий высокой аффинностью в отношении DOTA-Bn (S-2-(4-аминобензил)-1,4,7,10-тетраазациклододекантетрауксусная кислота), образующего комплекс с радиоактивномеченными металлами, такими как ¹⁷⁷Lu и ⁹⁰Y (см, например, Cheal и др., Theranostics, 2018 и WO 2010/099536, которые включены в настоящее описание в качестве ссылки). В настоящем описании представлены последовательности CDR и последовательности VL и VH С825. В одном из вариантов осуществления изобретения вариабельная область тяжелой цепи, которая образует часть антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения, может содержать по меньшей мере один, два или все три CDR, выбранные из (a) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35; (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36; (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37. В альтернативном варианте осуществления изобретения CDR-H1 может содержать последовательность GFSLTDYGVH (SEQ ID NO: 148). Вариабельная область тяжелой цепи, которая образует часть антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения, может содержать по меньшей мере один, два или все три CDR, выбранных из (г) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38; (д) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39; и (е) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40.

В другом варианте осуществления изобретения вариабельный домен тяжелой цепи, который образует часть функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения (первого антитела), содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 41 или ее вариант, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична SEQ ID NO: 41. В конкретных вариантах осуществления изобретения VH-последовательность, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции относительно референс-последовательности, но сайт связывания, который содержит указанную последовательность, сохраняет способность связываться с DOTA, образующим комплекс с Lu или Y, предпочтительно с указанной в настоящем описании аффинностью. В конкретных вариантах осуществления изобретения в целом от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены путем инсерции и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 41. В конкретных вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции затрагивают области вне CDR (т.е. FR). Необязательно антитело содержит VH-последовательность SEQ ID NO: 41, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности. В конкретном варианте осуществления изобретения VH содержит один, два или три CDR, которые выбраны из: (a) CDR-H1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 35 или последовательность GFSLTDYGVH (SEQ ID NO: 148), (б) CDR-H2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36, и (в) CDR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37.

Необязательно вариабельный домен легкой цепи, который образует часть функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения (второго антитела), содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42 или ее вариант, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична SEQ ID NO: 42. В конкретных вариантах осуществления изобретения VL-последовательность, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции относительно референс-последовательности, но сайт связывания, который содержит указанную последовательность, сохраняет способность связываться с DOTA, образующим комплекс с Lu или Y, предпочтительно с указанной в настоящем описании аффинностью. В конкретных вариантах осуществления изобретения в целом от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены путем инсерции и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 42. В конкретных вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции затрагивают области вне CDR (т.е. FR). Необязательно антитело содержит VL-последовательность SEQ ID NO: 42, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности. В конкретном варианте осуществления изобретения VL содержит один, два или три CDR, которые выбраны из (a) CDR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 38; (б) CDR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 39; и (в) CDR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 40.

Варианты осуществления изобретения, касающиеся вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, строго должны рассматриваться в комбинации. Таким образом, функциональный антигенсвязывающий центр может быть образован из вариабельной области тяжелой цепи, указанной выше, и вариабельной области легкой цепи, указанной выше, первого и второго антител соответственно.

В любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения вариабельные области легкой и тяжелой цепей, образующие сайт связывания до комплекса DOTA, могут быть гуманизированы. В одном из вариантов осуществления изобретения вариабельные области легкой и тяжелой цепей содержат CDR, указанные в любом из представленных выше вариантов осуществления изобретения, и дополнительно содержат акцепторный человеческий каркасный участок, например, каркасный участок человеческого иммуноглобулина или человеческий консенсусный каркасный участок.

В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельный домен тяжелой цепи может быть удлинен с помощью одного или нескольких С-концевых остатков, таких как один или несколько С-концевых остатков аланина, или одного или нескольких остатков из N-конца CH1-домена, что дополнительно будет обсуждено ниже

Г. Примеры антигенсвязывающих центров для DOTAM

В другом конкретном варианте осуществления изобретения первое и второе антитела объединяются с образованием функционального антигенсвязывающего центра для хелата Pb-DOTAM (Pb-DOTAM).

В конкретных вариантах осуществления изобретения функциональный антигенсвязывающий центр, который связывается с Pb-DOTAM, может обладать одним или несколькими следующими свойствами:

• связывается специфически с Pb-DOTAM и Bi-DOTAM;

• обладает избирательным действием в отношении Pb-DOTAM (и необязательно в отношении Bi-DOTAM) по сравнению с другими хелатами металлов, такими как Cu-DOTAM;

• связывается с Pb-DOTAM с очень высокой аффинностью;

• связывается с тем же эпитопом на Pb-DOTAM, что и антитела, указанные в настоящем описании, например, PRIT-0213 или PRIT-0214, и/или имеет такие же участвующие в контакте остатки, что и указанные антитела.

Радиоизотопы Pb можно применять в методах диагностирования и терапии. Конкретные радиоизотопы свинца, которые можно применять в настоящем изобретении, включают ²¹²Pb и ²⁰³Pb.

Радионуклиды, которые испускают α-частицы, потенциально являются более специфическими в отношении уничтожения опухолевых клеток, повреждая в меньшей степени окружающую ткань, чем β-излучатели, благодаря сочетанию короткой длины пути и высокой линейной передачи энергии. ²¹²Bi является излучателем α-частиц, но его непосредственному применению препятствует его короткий период полураспада. ²¹²Pb является родительским радионуклидом Bi и может служить в качестве генератора in vivo ²¹²Bi, что позволяет эффективно преодолевать недостаток, связанный с коротким периодом полураспада ²¹²Bi (Yong и Brechbiel, Dalton Trans. 40(23), 21 июня 2001 г., cc. 6068-6076).

²⁰³Pb можно применять в качестве визуализирующего изотопа. Таким образом, антитело, связанное с ²⁰³Pb-DOTAM, может найти применение для радиоиммуновизуализации (RII).

Как правило, радиоактивные металлы применяют в форме хелатов. В некоторых объектах настоящего изобретения DOTAM применяют в качестве хелатирующего агента. DOTAM представляет собой стабильный хелатор Pb(П) (Yong и Brechbiel, Dalton Trans. 40(23), 21 июня 2001 г., сс. 6068-6076; Chappell и др., Nuclear Medicine and Biology, т. 27, 2000, cc. 93-100). Таким образом, DOTAM является наиболее ценным для применения в сочетании с изотопами свинца, указанными выше, такими как ²¹²Pb и ²⁰³Pb.

В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться предпочтительным, если аффинность связывания антител с Pb-DOTAM характеризуется величиной Kd, составляющей 100 пМ, 50 пМ, 20 пМ, 10 пМ, 5 пМ, 1 пМ или менее, например, 0,9 пМ или менее, 0,8 пМ или менее, 0,7 пМ или менее, 0,6 пМ или менее или 0,5 пМ или менее. Например, функциональный сайт связывания может связываться с радиоактивномеченным соединением с Kd, составляющей примерно 1 пМ - 1 нМ, например, примерно 1-10 пМ, 1-100 пМ, 5-50 прМ, 100-500 пМ или 500 пМ - 1 нМ.

В конкретном варианте осуществления изобретения антитела связываются также с Bi, хелатированным DOTAM. В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться предпочтительным, если антитела связываются с Bi-DOTAM (т.е. хелатом, содержащим DOTAM в комплексе с висмутом, который обозначают также в настоящем описании как «хелат Bi-DOTAM») и при этом аффинность связывания характеризуется величиной Kd, составляющей 1 нМ, 500 пМ, 200 пМ, 100 пМ, 50 пМ, 10 пМ или менее, например, 9 пМ, 8 пМ, 7 пМ, 6 пМ, 5 пМ или менее. Например, функциональный сайт связывания может связываться с хелатом металла с Kd, составляющей примерно 1 пМ - 1 нМ, например, примерно 1-10 пМ, 1-100 пМ, 5-50 прМ, 100-500 пМ или 500 пМ - 1 нМ.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела могут связываться с Bi-DOTAM и с Pb-DOTAM со сходной аффинностью. Например, может оказаться предпочтительным, если соотношение аффинности, например, соотношение величин Kd для Bi-DOTAM/Pb-DOTAM, находится в диапазоне 0,1-10, например 1-10.

В одном из вариантов осуществления изобретения вариабельная область тяжелой цепи, образующая часть антигенсвязывающего центра для Pb-DOTAM, может содержать по меньшей мере один, два или все три CDR, выбранные из (а) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность GFSLSTYSMS (SEQ ID NO: 1); (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность FIGSRGDTYYASWAKG (SEQ ID NO: 2); (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность ERDPYGGGAYPPHL (SEQ ID NO: 3). Вариабельная область легкой цепи, образующая часть антигенсвязывающего центра для Pb-DOTAM, может содержать по меньшей мере один, два или все три CDR, выбранные из (г) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность QSSHSVYSDNDLA (SEQ ID NO: 4); (д) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность QASKLAS (SEQ ID NO: 5); и (е) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность LGGYDDESDTYG (SEQ ID NO: 6).

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела могут содержать один или несколько CDR-H1, CDR-H2 и/или CDR-H3 или один или несколько CDR-L1, CDR-L2 и/или CDR-L3, которые имеют замены по сравнению с аминокислотными последовательностями SEQ ID NO: 1-6 соответственно, например, 1, 2 или 3 замены.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела могут иметь такие же участвующие в контакте остатки, что и указанные в настоящем описании: например, эти остатки могут быть инвариантными. Указанные остатки могут включать следующие:

а) в CDR2 тяжелой цепи: Phe50, Asp56 и/или Tyr58 и необязательно также Gly52 и/или Arg 54;

б) в CDR3 тяжелой цепи: Glu95, Arg96, Asp97, Pro98, Tyr99, Ala100C и/или Tyr100D и необязательно также Pro100E;

в) в CDR1 легкой цепи: Tyr28 и/или Asp32;

г) в CDR3 легкой цепи: Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c и/или Tyr96;

д) в CDR2 легкой цепи: необязательно Gln50;

во всех случаях нумерация согласно Кэботу.

Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения CDR-H2 может содержать аминокислотную последовательность FIGSRGDTYYASWAKG (SEQ ID NO: 2) или ее вариант, имеющий вплоть до 1, 2 или 3 замен в SEQ ID NO: 2, где эти замены не должны включать Phe50, Asp56 и/или Tyr58 и необязательно также не должны включать Gly52 и/или Arg 54, во всех случаях нумерация согласно Кэботу.

В некоторых вариантах осуществления изобретения CDR-H2 может быть замещен в одном или нескольких положениях, указанных ниже. В настоящем описании и приведенных ниже таблицах замен замены представляют собой замены относительно остатков зародышевой линии (подчеркнуты) или аминокислот, которые теоретически стерически соответствуют или встречаются также в кристаллической структуре в сайте. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные выше остатки могут оставаться фиксированными, а другие остатки можно заменять в соответствии с представленной ниже таблицей; в других вариантах осуществления изобретения замены любого остатка можно осуществлять согласно указанной ниже таблице.

Необязательно CDR-H3 может содержать аминокислотную последовательность ERDPYGGGAYPPHL (SEQ ID NO: 3) или ее вариант, имеющий вплоть до 1, 2 или 3 замен в SEQ ID NO: 3, где указанные замены не включают Glu95, Arg96, Asp97, Pro98 и необязательно не включают также Ala100C, Tyr100D и/или Pro100E, и/или необязательно не включают также Tyr99. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения замены не включают Glu95, Arg96, Asp97, Pro98, Tyr99 Ala100C и Tyr100D.

В некоторых вариантах осуществления изобретения CDR-H3 может быть замещен в одном или нескольких положениях, указанных ниже. В некоторых вариантах осуществления изобретения указанные выше остатки могут оставаться фиксированными, а другие остатки можно заменять в соответствии с представленной ниже таблицей; в других вариантах осуществления изобретения замены любого остатка можно осуществлять согласно указанной ниже таблице.

Необязательно CDR-L1 может содержать аминокислотную последовательность QSSHSVYSDNDLA (SEQ ID NO: 4) или ее вариант, имеющий вплоть до 1, 2 или 3 замен в SEQ ID NO: 4, где указанные замены не включают Tyr28 и/или Asp32 (нумерация по Кэботу).

В конкретных вариантах осуществления изобретения CDR-L1 может иметь замены в одном или нескольких положениях, которые указаны ниже. И в этом случае в некоторых вариантах осуществления изобретения указанные выше остатки могут оставаться фиксированными, а другие остатки можно заменять в соответствии с представленной ниже таблицей; в других вариантах осуществления изобретения замены любого остатка можно осуществлять согласно указанной ниже таблице.

Необязательно CDR-L3 может содержать аминокислотную последовательность LGGYDDESDTYG (SEQ ID NO: 6) или ее вариант, имеющий вплоть до 1, 2 или 3 замен в SEQ ID NO: 6, где указанные замены не включают Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c и/или Tyr96 (по Кэботу).

В конкретных вариантах осуществления изобретения CDR-L3 может иметь замены в следующих положениях, которые указаны ниже. (Поскольку большинство остатков доступны для растворителей и не имеют контактов с антигеном, то возможно наличие целого ряда замен). И в этом случае в некоторых вариантах осуществления изобретения указанные выше остатки могут оставаться фиксированными, а другие остатки можно заменять в соответствии с представленной ниже таблицей; в других вариантах осуществления изобретения замены любого остатка можно осуществлять согласно указанной ниже таблице.

Антитело может содержать также CDR-H1 и CDR-L2, которые необязательно имеют последовательность SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 5 соответственно или ее вариант, имеющий по меньшей мере 1, 2 или 3 замены относительно указанных последовательностей, необязательно консервативные замены.

Таким образом, вариабельный домен тяжелой цепи, образующий часть антигенсвязывающего центра для Pb-DOTAM, может содержать по меньшей мере:

а) CDR2 тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность FIGSRGDTYYASWAKG (SEQ ID NO: 2) или ее вариант, имеющий вплоть до 1, 2 или 3 замен в SEQ ID NO: 2, где эти замены не включают Phe50, Asp56 и/или Tyr58 и необязательно не включают также Gly52 и/или Arg54;

б) CDR3 тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность ERDPYGGGAYPPHL (SEQ ID NO: 3) или ее вариант, имеющий вплоть до 1, 2 или 3 замен в SEQ ID NO: 3, где эти замены не включают Glu95, Arg96, Asp97, Pro98 и необязательно не включают также Ala100C, Tyr100D и/или Pro100E, и/или необязательно не включают также Tyr99.

В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельный домен тяжелой цепи включает дополнительно CDR1 тяжелой цепи, который необязательно представляет собой:

в) CDR1 тяжелой цепи, который содержит аминокислотную последовательность GFSLSTYSMS (SEQ ID NO: 1) или ее вариант, имеющий вплоть до 1, 2 или 3 замен в SEQ ID NO: 1.

В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельный домен тяжелой цепи дополнительно включает С-концевой аланин (например, Ala114 согласно системе нумерации Кэбота) во избежание связывания ранее существующих антител, которые распознают свободную VH-область. Как описано у Holland M.С. и др. J. Clin Immunol, 2013, свободный С-конец, вероятно, является важным для связывания аутоантител HAVH (человеческое антитело к VH-домену) с VH-доменом антител, поскольку аутоантитела HAVH не связываются с интактным IgG или фрагментами IgG (fAb или модифицированные молекулы VH), которые содержат такие же последовательности каркасных участков VH, или с VK-доменом антител. Cordy J.С. и др., Clinical and Experimental Immunology, 2015 установили существование криптического эпитопа на С-концевом эпитопе VH dAb, который в естественных условиях не доступен для HAVH-антител в молекулах полноразмерного IgG.

Таким образом, если антитело содержит свободную VH-область (не слитую с любым другим доменом на ее С-конце), то последовательность можно удлинять с помощью одного или нескольких С-концевых остатков. Удлинение может предупреждать связывание антител, которые распознают свободную VH-область. Например, удлинение может включать 1-10 остатков, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков. В одном из вариантов осуществления изобретения последовательность VH можно удлинять с помощью одного или нескольких С-концевых остатков аланина. Последовательность VH можно удлинять также с помощью N-концевого участка CH1-домена, например, с помощью 1-10 остатков из N-конца CH1-домена, например, из CH1-домена человеческого IgG1. (Первые 10 остатков CH1-домена человеческого IgG1 представляют собой ASTKGPSVFP (SEQ ID NO: 149), и, таким образом в одном из вариантов осуществления изобретения от 1 до 10 остатков можно получать из N-конца указанной последовательности). Например, в одном из вариантов осуществления изобретения пептидную последовательность AST (соответствующую первым 3 остаткам СН1-домена IgG1) добавляют к С-концу VH-области.

В другом варианте осуществления изобретения вариабельный домен легкой цепи, образующий часть антигенсвязывающего центра для Pb-DOTAM, содержит по меньшей мере:

г) CDR2 легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность QSSHSVYSDNDLA (SEQ ID NO: 4) или ее вариант, имеющий вплоть до 1, 2 или 3 замен в SEQ ID NO: 4, где эти замены не включают Tyr28 и Asp32;

д) CDR3 легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность LGGYDDESDTYG (SEQ ID NO: 6) или ее вариант, имеющий вплоть до 1, 2 или 3 замен в SEQ ID NO: 6, где эти замены не включают Gly91, Tyr92, Asp93, Thr95c и Tyr96.

В некоторых вариантах осуществления изобретения вариабельный домен легкой цепи дополнительно включает CDR2 легкой цепи, который необязательно представляет собой:

e) CDR2 легкой цепи, который содержит аминокислотную последовательность QASKLAS (SEQ ID NO: 5) или ее вариант, имеющий вплоть до 1, 2 или 3 замен в SEQ ID NO: 5, необязательно не включающие Gln50.

В любых вариантах осуществления настоящего изобретения, которые относятся к вариантам последовательности, содержащей указанные выше CDR (например, вариабельного домена), белок может быть инвариантным касательно одного или нескольких указанных выше остатков.

Необязательно вариабельный домен тяжелой цепи, образующий часть функционального антигенсвязывающего центра для Pb-DOTAM (первого антитела) содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 9, или ее вариант, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 9. В конкретных вариантах осуществления изобретения VH-последовательность, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции относительно референс-последовательности, но сайт связывания, который содержит указанную последовательность, сохраняет способность связываться с Pb-DOTA, предпочтительно с указанной в настоящем описании аффинностью. В VH-последовательности могут сохраняться указанные выше инвариантные остатки. В конкретных вариантах осуществления изобретения в целом от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены путем инсерции и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 9. В конкретных вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции затрагивают области вне CDR (т.е. FR). Необязательно антитело содержит VH-последовательность SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 9, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности, необязательно с С-концевым Ala. В конкретном варианте осуществления изобретения VH содержит один, два или три CDR, которые выбраны из: (a) CDR-Н1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1, (б) CDR-Н2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2, и (в) CDR-H3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 3.

Как указано выше, согласно некоторым вариантам осуществления изобретения в некоторых вариантах SEQ ID NO: 7 или 9 могут быть удлинены с помощью одного или нескольких дополнительных С-концевых остатков, например, с помощью одного или нескольких остатков аланина, необязательного одного остатка аланина. Таким образом, например, в конкретном варианте осуществления изобретения последовательность SEQ ID NO: 7 в результате удлинения может представлять собой:

В других вариантах осуществления изобретения удлинение может быть за счет N-концевого участка CH1-домена, что описано выше, например, с помощью 1-10 остатков из N-конца CH1-домена, например, из CH1-домена человеческого IgG1. Например, удлинение может быть за счет пептидной последовательности AST.

Необязательно вариабельный домен легкой цепи, образующий часть функционального антигенсвязывающего центра для Pb-DOTAM (второго антитела) содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 или ее вариант, содержащий аминокислотную последовательность, которая по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентична SEQ ID NO: 8. В конкретных вариантах осуществления изобретения VL-последовательность, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции относительно референс-последовательности, но сайт связывания анти-Pb-DOTA, который содержит указанную последовательность, сохраняет способность связываться с Pb-DOTA, предпочтительно с указанной в настоящем описании аффинностью. В VL-последовательности могут сохраняться указанные выше инвариантные остатки. В конкретных вариантах осуществления изобретения в целом от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены путем инсерции и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 8. В конкретных вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции затрагивают области вне CDR (т.е. FR). Необязательно антитело к Pb-DOTA содержит VL-последовательность SEQ ID NO: 8, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности. В конкретном варианте осуществления изобретения VL содержит один, два или три CDR, которые выбраны из: (a) CDR-L1, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4; (6) CDR-L2, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 5; и (в) CDR-L3, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6.

Варианты осуществления изобретения, касающиеся вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи, строго должны рассматриваться в комбинации. Таким образом, функциональный антигенсвязывающий центр для Pb-DOTAM может быть образован из вариабельной области тяжелой цепи, указанной выше, и вариабельной области легкой цепи, указанной выше, первого и второго антитела соответственно.

Необязательно антигенсвязывающий центр, специфический в отношении хелата Pb-DOTAM, может быть образован из вариабельного домена тяжелой цепи, содержащего аминокислотную последовательность, выбранную из группы, которая состоит из SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 9, или ее вариант, указанный выше (включая описанный выше вариант с С-концевым удлинением), и вариабельного домена легкой цепи, содержащего аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, или ее вариант, описанный выше. Например, антигенсвязывающий центр, специфический в отношении хелата Pb-DOTAM, может содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 7, или ее вариант, и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, или ее вариант, включая посттрансляционные модификации этих последовательностей. В другом варианте осуществления изобретения он может содержать вариабельный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 9, или ее вариант (включая описанный выше вариант с С-концевым удлинением), и вариабельный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8, или ее вариант, включая посттрансляционные модификации этих последовательностей.

В любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения вариабельные области легкой и тяжелой цепей, образующие сайт связывания анти-Pb-DOTAM, могут быть гуманизированы. В одном из вариантов осуществления изобретения вариабельные области легкой и тяжелой цепей содержат CDR, применяемые в любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения, и дополнительно содержат человеческий акцепторный каркасный участок, например, каркасный участок человеческого иммуноглобулина или человеческий консенсусный каркасный участок. В другом варианте осуществления изобретения вариабельные области легкой и/или тяжелой цепи содержат CDR, применяемые в любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения, и дополнительно содержат каркасные участки, полученные из vk 1 39 и/или vh 2 26. Согласно некоторым вариантам осуществления изобретения vk 1 39 может не содержать обратные мутации. Касательно vh 2 26, остаток зародышевой линии Ala49 может быть заменен на Gly49 в результате обратной мутации.

Д. Примеры антигенсвязывающих центров для СЕА

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, в котором могут быть объединены обсужденные выше варианты осуществления изобретения, антиген-мишень, который связывается первым и вторым антителами, может представлять собой СЕА (карциноэмбриональный антиген). Антитела, образующиеся против СЕА, включают Т84.66 и его гуманизированные и химерные версии, такие как T84.66-LCHA, описанные в WO 2016/075278 А1 и/или WO 2017/055389, CH1A1a, антитело к СЕА, описанное в WO 2012/117002 и WO 2014/131712, и CEA hMN-14 или лабетузимаб (например, описанные в US 6676924 и US 5874540). Другим примером антитела против СЕА является А5В7 (например, описанное у M.J. Banfield и др., Proteins 29(2), 1997, cc. 161-171) или гуманизированное антитело, полученное из мышиного А5В7, описанное в WO 92/01059 и WO 2007/071422 (см. также совместно рассматриваемую заявку РСТ/ЕР2020/067582). Примером гуманизированной версии А5В7 является A5H1EL1(G54A). Другим примером антитела против СЕА является MFE23 и его гуманизированные версии, описанные в US 7626011 и/или в совместно рассматриваемой заявке РСТ/ЕР2020/067582. Еще одним примером антитела к СЕА является 28А9. Любое из них или их антигенсвязывающих фрагментов можно применять для создания СЕА-связывающего плеча, предлагаемого в настоящем изобретении.

Необязательно связывание антигенсвязывающего центра, который связывается с СЕА, может характеризоваться величиной Kd, составляющей 1 нМ или менее, 500 пМ или менее, 200 пМ или менее или 100 пМ или менее, в случае одновалентного связывания.

В некоторых вариантах осуществления изобретения первое и/или второе антитело может связываться с эпитопом CH1A1a, эпитопом А5В7, эпитопом MFE23, эпитопом Т84.66 или эпитопом 28А9 СЕА.

В некоторых вариантах осуществления изобретения по меньшей мере одно из первого и второго антител связывается с эпитопом СЕА, который не присутствует на растворимом СЕА (sCEA). Растворимый СЕА является частью молекулы СЕА, которая отщепляется GPI-фосфолипазой и высвобождается в кровь. Примером эпитопа, который не встречается на растворимом СЕА, является эпитоп СН1А1А. Необязательно одно из первого и/или второго антитела связывается с эпитопом, который не присутствует на растворимом СЕА, в другое связывается с эпитопом, который присутствует на растворимом СЕА.

Эпитоп для антитела CH1A1a и его родительского мышиного антитела PR1A3 описан в WO 2012/117002 А1 и у Durbin H. и др., Proc. Natl. Scad. Sci. USA, 91, 1994, cc. 4313-4317. Антитело, которое связывается с эпитопом CH1A1a, связывается с конформационным эпитопом внутри В3-домена и GPI-якоря молекулы СЕА. В одном из объектов изобретения антитело связывается с тем же эпитопом, что и антитело CH1A1a, имеющее VH, представленную в SEQ ID NO: 25, и VL, представленную в SEQ ID NO: 26 в настоящем описании. Эпитоп А5В7 описан в совместно рассматриваемой заявке РСТ/ЕР2020/067582. Антитело, которое связывается с эпитопом А5В7, связывается с А2-доменом СЕА, т.е. доменом, содержащим аминокислоты SEQ ID NO: 154:

В одном из объектов изобретения антитело связывается с тем же эпитопом, что и антитело А5В7, имеющее VH, представленную в SEQ ID NO: 49, и VL, представленную в SEQ ID NO: 50 в настоящем описании.

В одном из объектов изобретения антитело связывается с тем же эпитопом, что и антитело Т84.66, описанное в WO 2016/075278. Антитело может связываться с тем же эпитопом, что и антитело, имеющее VH, представленную в SEQ ID NO: 17, и VL, представленную в SEQ ID NO: 18 в настоящем описании.

Эпитоп MFE23 описан в совместно рассматриваемой заявке РСТ/ЕР2020/067582. Антитело, которое связывается с эпитопом MFE23, связывается с A1-доменом СЕА, т.е. с доменом, содержащим аминокислоты SEQ ID NO: 155:

В одном из объектов изобретения антитело может связываться с тем же эпитопом, что и антитело, имеющее VH, представленную в SEQ ID NO: 167, и VL, представленную в SEQ ID NO: 168 в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления изобретения первое и/или второе антитело могут связываться с тем же СЕА-эпитопом, что и антитело, представленное в настоящем описании, например, P1AD8749, P1AD8592, Р1АЕ4956, Р1АЕ4957, P1AF0709, P1AF0298, P1AF0710 или P1AF0711.

В некоторых вариантах осуществления изобретения первое и второе антитело каждое связывается с тем же эпитопом СЕА, что и другое. Таким образом, например, первое и второе антитела оба могут связываться с эпитопом CH1A1a, эпитопом А5В7, эпитопом MFE23, эпитопом Т84.66 или эпитопом 28А9.

В некоторых вариантах осуществления изобретения и первое, и второе антитела могут иметь связывающие СЕА последовательности (т.е., CDR и/или VH/VL-домены) из СН1А1А; или первое и второе антитела оба могут иметь связывающие СЕА последовательности из А5В7 или его гуманизированной версии; или первое и второе антитела оба могут иметь связывающие СЕА последовательности из Т84.66 или его гуманизированной версии; или первое и второе антитела оба могут иметь связывающие СЕА последовательности из MFE23 или его гуманизированной версии; или первое и второе антитела оба могут иметь связывающие СЕА последовательности из 28А9 или его гуманизированной версии. Примеры последовательностей представлены в настоящем описании.

В другом варианте осуществления изобретения первое и второе антитела связываются с различными эпитопами СЕА. Таким образом, например, I) одно антитело может связываться с эпитопом СН1А1А, а другое может связываться с эпитопом А5В7, эпитопом Т84.66, эпитопом MFE23 или эпитопом 28А9; II) одно антитело может связываться с эпитопом А5В7, а другое может связываться с эпитопом СН1А1А, эпитопом Т84.66, эпитопом MFE23 или эпитопом 28А9; III) одно антитело может связываться с эпитопом MFE23, а другое может связываться с эпитопом СН1А1А, эпитопом А5В7, эпитопом Т84.66 или эпитопом 28А9; IV) одно антитело может связываться с эпитопом Т84.66, а другое может связываться с эпитопом СН1А1А, эпитопом А5В7, эпитопом MFE23 или эпитопом 28А9; или V) одно антитело может связываться с эпитопом 28А9, а другое может связываться с эпитопом CH1A1a, эпитопом А5В7, эпитопом MFE23 или эпитопом Т84.66.

В некоторых вариантах осуществления изобретения I) одно антитело может иметь связывающие СЕА последовательности (т.е., CDR или VH/VL-домены) из СН1А1А, а другое может иметь связывающие СЕА последовательности из А5В7 или его гуманизированной версии, из Т84.66 или его гуманизированной версии, из MFE23 или его гуманизированной версии или из 28А9 или его гуманизированной версии; II) одно антитело может иметь связывающие СЕА последовательности из А5В7 или его гуманизированной версии, а другое может иметь связывающие СЕА последовательности из СН1А1А, из Т84.66 или его гуманизированной, из MFE23 или его гуманизированной версии или из 28А9 или его гуманизированной версии; III) одно антитело может иметь связывающие СЕА последовательности из MFE23 или его гуманизированной версии, а другое может иметь связывающие СЕА последовательности из СН1А1А, из А5В7 или его гуманизированной версии, из Т84.66 или его гуманизированной версии или из 28А9 или его гуманизированной версии; IV) одно антитело может иметь связывающие СЕА последовательности из Т84.66 или его гуманизированной версии, а другое может иметь связывающие СЕА последовательности из СН1А1А, из А5В7 или его гуманизированной версии, из MFE23 или его гуманизированной версии или из 28А9 или его гуманизированной версии; V) одно антитело может иметь связывающие СЕА последовательности из 28А9 или его гуманизированной версии, а другое может иметь связывающие СЕА последовательности из СН1А1А, из А5В7 или его гуманизированной версии, из Т84.66 или его гуманизированной версии или из MFE23 или его гуманизированной версии.

В одном конкретном варианте осуществления изобретения одно антитело может связываться с эпитопом СН1А1А, а другое может связываться с эпитопом А5В7. Первое антитело может иметь связывающие СЕА последовательности из антитела СН1А1А, а второе антитело антитело может иметь связывающие СЕА последовательности из А5В7 (включая его гуманизированную версию); или первое антитело может иметь связывающие СЕА последовательности из антитела А5В7 (включая его гуманизированную версию), а второе антитело может иметь связывающие СЕА последовательности из СН1А1А.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения одно антитело может связываться с эпитопом СН1А1А, а другое может связываться с эпитопом Т84.66. Первое антитело может иметь связывающие СЕА последовательности из антитела СН1А1А, а второе антитело может иметь связывающие СЕА последовательности из Т84.66 (включая его гуманизированную версию); или первое антитело может иметь связывающие СЕА последовательности из антитела Т84.66 (включая его гуманизированную версию), а второе антитело может иметь связывающие СЕА последовательности из СН1А1А. В некоторых вариантах осуществления изобретения первое антитело может связываться с эпитопом Т84.66 и/или иметь антигенсвязывающий центр, указанный ниже в подпункте (I), а второе антитело может связываться с эпитопом СН1А1А и/или иметь антигенсвязывающий центр, указанный ниже в подпункте (II).

Примеры СЕА-связывающих последовательностей I)-V), представлены ниже. Они представляют собой примеры СЕА-связывающих последовательностей из I) Т84.66, II) СН1А1А, III) А5В7, IV) 28А9 и V) MFE23(или из их гуманизированных версий).

I). В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, может содержать по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть CDR, выбранных из (а) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; (г) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; (д) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; и (е) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.

Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, может содержать по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR-последовательности VH, выбранные из (a) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; и (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.

Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, может содержать по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR-последовательности VL, выбранные из (a) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; (б) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; и (в) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.

Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит (а) VH-домен, содержащий по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR-последовательности VH, выбранные из (I) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (II) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и (III) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 13; и (б) VL-домен, содержащий по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR-последовательности, выбранные из (I) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (II) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и (в) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.

В другом объекте изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит (a) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; (г) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; (д) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; и (е) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.

В любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения мультиспецифическое антитело может быть гуманизированным. В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий центр антитела к СЕА содержит CDR, указанные в любом из вышеприведенных вариантов осуществления изобретения, и дополнительно содержат акцепторный человеческий каркасный участок, например, каркасный участок человеческого иммуноглобулина или человеческий консенсусный каркасный участок.

В другом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 17. В конкретных вариантах осуществления изобретения VH-последовательность, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции относительно референс-последовательности, но антигенсвязывающий центр, который содержит указанную последовательность, сохраняет способность связываться с СЕА, предпочтительно с указанной выше аффинностью. В конкретных вариантах осуществления изобретения в целом от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены путем инсерции и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 17. В конкретных вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции затрагивают области вне HVR (т.е. в FR). Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит VH-последовательность SEQ ID NO: 17, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности. В конкретном варианте осуществления изобретения VH содержит один, два или три CDR, выбранных из: (a) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, и (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13.

В другом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 18. В конкретных вариантах осуществления изобретения VL-последовательность, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции относительно референс-последовательности, но антигенсвязывающий центр, который содержит указанную последовательность, сохраняет способность связываться с СЕА, предпочтительно с указанной выше аффинностью. В конкретных вариантах осуществления изобретения в целом от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены путем инсерции и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 18. В конкретных вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции затрагивают области вне HVR (т.е. в FR). Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит VL-последовательность SEQ ID NO: 18, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности. В конкретном варианте осуществления изобретения VL содержит один, два или три CDR, выбранных из: (a) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14, (б) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15, и (в) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.

В другом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит VH, представленную выше в любом из вариантов осуществления изобретения, и VL, представленную выше в любом из вариантов осуществления изобретения. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит последовательности VH и VL SEQ ID NO: 17 и SEQ ID NO: 18 соответственно, включая пост-трансляционные модификации этих последовательностей.

II). В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, может содержать по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть CDR, выбранных из (а) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; (г) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; (д) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и (е) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.

Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, может содержать по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR-последовательности VH, выбранные из (a) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; и (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.

Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, может содержать по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR-последовательности VL, выбранные из (a) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; (б) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и (в) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.

Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит (а) VH-домен, содержащий по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR-последовательности VH, выбранные из (I) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, (II) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и (III) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 21; и (б) VL-домен, содержащий по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR-последовательности, выбранные из (I) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (II) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (в) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.

В другом объекте изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит (a) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; (г) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; (д) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и (е) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.

В любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения мультиспецифическое антитело может быть гуманизированным. В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий центр антитела к СЕА содержит CDR, указанные в любом из вышеприведенных вариантов осуществления изобретения, и дополнительно содержат акцепторный человеческий каркасный участок, например, каркасный участок человеческого иммуноглобулина или человеческий консенсусный каркасный участок.

В другом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 25. В конкретных вариантах осуществления изобретения VH-последовательность, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции относительно референс-последовательности, но антигенсвязывающий центр, который содержит указанную последовательность, сохраняет способность связываться с СЕА, предпочтительно с указанной выше аффинностью. В конкретных вариантах осуществления изобретения в целом от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены путем инсерции и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 25. В конкретных вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции затрагивают области вне HVR (т.е. в FR) Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит VH-последовательность SEQ ID NO: 25, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности. В конкретном варианте осуществления изобретения VH содержит один, два или три CDR, выбранных из: (a) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19, (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20, и (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21.

В другом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 26. В конкретных вариантах осуществления изобретения VL-последовательность, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции относительно референс-последовательности, но антигенсвязывающий центр, который содержит указанную последовательность, сохраняет способность связываться с СЕА, предпочтительно с указанной выше аффинностью. В конкретных вариантах осуществления изобретения в целом от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены путем инсерции и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 26. В конкретных вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции затрагивают области вне HVR (т.е. в FR). Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит VH-последовательность SEQ ID NO: 26, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности. В конкретном варианте осуществления изобретения VL содержит один, два или три CDR, выбранных из: (a) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22, (б) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23, и (в) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.

В другом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит VH, представленную выше в любом из вариантов осуществления изобретения, и VL, представленную выше в любом из вариантов осуществления изобретения. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит последовательности VH и VL SEQ ID NO: 25 и SEQ ID NO: 26 соответственно, включая пост-трансляционные модификации этих последовательностей.

III) В другом конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, может содержать по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть CDR, выбранных из (а) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43; (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44; (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45; (г) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46; (д) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47; и (е) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48. В некоторых вариантах осуществления изобретения CDR-H1 может иметь последовательность GFTFTDYYMN (SEQ ID NO: 151).

Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, может содержать по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR-последовательности VH, выбранные из (a) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43; (6) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44; и (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45. В некоторых вариантах осуществления изобретения CDR-H1 может иметь последовательность GFTFTDYYMN (SEQ ID NO: 151).

Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, может содержать по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR-последовательности VL, выбранные из (a) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46; (б) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47; и (в) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48.

Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит (а) VH-домен, содержащий по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR-последовательности VH, выбранные из (I) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43, (II) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44, и (III) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 45; и (б) VL-домен, содержащий по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR-последовательности, выбранные из (I) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, (II) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, и (в) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48. В некоторых вариантах осуществления изобретения CDR-H1 может иметь последовательность GFTFTDYYMN (SEQ ID NO: 151).

В другом объекте изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит (a) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43; (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44; (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45; (г) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46; (д) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47; и (е) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48. В некоторых вариантах осуществления изобретения CDR-H1 может иметь последовательность GFTFTDYYMN (SEQ ID NO: 151).

В любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения мультиспецифическое антитело может быть гуманизированным. В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий центр антитела к СЕА содержит CDR, указанные в любом из вышеприведенных вариантов осуществления изобретения, и дополнительно содержат акцепторный человеческий каркасный участок, например, каркасный участок человеческого иммуноглобулина или человеческий консенсусный каркасный участок.

В другом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 49. В конкретных вариантах осуществления изобретения VH-последовательность, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции относительно референс-последовательности, но антигенсвязывающий центр, который содержит указанную последовательность, сохраняет способность связываться с СЕА, предпочтительно с указанной выше аффинностью. В конкретных вариантах осуществления изобретения в целом от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены путем инсерции и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 49. В конкретных вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции затрагивают области вне HVR (т.е. в FR). Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит VH-последовательность SEQ ID NO: 49, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности. В конкретном варианте осуществления изобретения VH содержит один, два или три CDR, выбранных из: (a) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43 или последовательность GFTFTDYYMN (SEQ ID NO: 151), (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44, и (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45.

В другом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 50. В конкретных вариантах осуществления изобретения VL-последовательность, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции относительно референс-последовательности, но антигенсвязывающий центр, который содержит указанную последовательность, сохраняет способность связываться с СЕА, предпочтительно с указанной выше аффинностью. В конкретных вариантах осуществления изобретения в целом от 1 до 10 аминокислота заменены, встроены путем инсерции и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 50. В конкретных вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции затрагивают области вне HVR (т.е. в FR). Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит VL-последовательность SEQ ID NO: 50, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности. В конкретном варианте осуществления изобретения VL содержит один, два или три CDR, выбранных из: (a) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46, (б) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47, и (в) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48.

В другом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит VH, представленную выше в любом из вариантов осуществления изобретения, и VL, представленную выше в любом из вариантов осуществления изобретения. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит последовательности VH и VL SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 50 соответственно, включая пост-трансляционные модификации этих последовательностей.

IV) В следующем конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, может содержать по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть CDR, выбранных из (а) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59; (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; (г) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; (д) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63; и (e) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64.

Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, может содержать по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR-последовательности VH, выбранные из (a) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59; (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; и (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61.

Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, может содержать по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR-последовательности VL, выбранные из (a) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; (б) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63; и (в) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64.

Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит (а) VH-домен, содержащий по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR-последовательности VH, выбранные из (I) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59, (II) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60, и (III) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 61; и (б) VL-домен, содержащий по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR-последовательности, выбранные из (I) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, (II) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63, и (в) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64.

В другом объекте изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит (a) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59; (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; (г) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; (д) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63; и (е) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64.

В любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения мультиспецифическое антитело может быть гуманизированным. В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий центр антитела к СЕА содержит CDR, указанные в любом из вышеприведенных вариантов осуществления изобретения, и дополнительно содержат акцепторный человеческий каркасный участок, например, каркасный участок человеческого иммуноглобулина или человеческий консенсусный каркасный участок.

В другом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 65. В конкретных вариантах осуществления изобретения VH-последовательность, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции относительно референс-последовательности, но антигенсвязывающий центр, который содержит указанную последовательность, сохраняет способность связываться с СЕА, предпочтительно с указанной выше аффинностью. В конкретных вариантах осуществления изобретения в целом от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены путем инсерции и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 65. В конкретных вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции затрагивают области вне HVR (т.е. в FR). Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит VH-последовательность SEQ ID NO: 65, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности. В конкретном варианте осуществления изобретения VH содержит один, два или три CDR, выбранных из: (a) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59, (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60, и (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61.

В другом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 66. В конкретных вариантах осуществления изобретения VL-последовательность, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции относительно референс-последовательности, но антигенсвязывающий центр, который содержит указанную последовательность, сохраняет способность связываться с СЕА, предпочтительно с указанной выше аффинностью. В конкретных вариантах осуществления изобретения в целом от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены путем инсерции и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 66. В конкретных вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции затрагивают области вне HVR (т.е. в FR). Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит VL-последовательность SEQ ID NO: 66, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности. В конкретном варианте осуществления изобретения VL содержит один, два или три CDR, выбранных из: (a) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62, (б) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63, и (в) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64.

В другом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит VH, представленную выше в любом из вариантов осуществления изобретения, и VL, представленную выше в любом из вариантов осуществления изобретения. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит последовательности VH и VL SEQ ID NO: 65 и SEQ ID NO: 66 соответственно, включая пост-трансляционные модификации этих последовательностей.

V) В следующем конкретном варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, может содержать по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть CDR, выбранных из (а) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 156; (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 157 или 158; (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 159; (г) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 160, 161 или 162; (д) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 163, 164 или 165; и (е) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166.

Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, может содержать:

CDR-последовательности VH: (a) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 156; (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 157 или 158; и (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 159; и/или

CDR-последовательности VL: (a) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 160, 161 или 162; (б) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 163, 164 или 165; и (в) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166.

В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий центр для СЕА содержит вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 167 или (более предпочтительно) выбранную из SEQ ID NO: 169, 170, 171, 172, 173 или 174, и вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 168 или (более предпочтительно) выбранную из SEQ ID NO: 175, 176, 177, 178, 179 или 180.

В любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения мультиспецифическое антитело может быть гуманизированным. В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий центр антитела к СЕА содержит CDR, указанные в любом из вышеприведенных вариантов осуществления изобретения, и дополнительно содержат акцепторный человеческий каркасный участок, например, каркасный участок человеческого иммуноглобулина или человеческий консенсусный каркасный участок.

В конкретном объекте изобретения антигенсвязывающий домен, который обладает способностью связываться с СЕА, содержит:

(а) VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 169, и VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 179, или

(б) VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 173, и VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 179, или

(в) VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 170, и VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 179, или

(г) VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 174, и VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 178, или

(д) VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 173, и VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 178, или

(е) VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 171, и VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 178, или

(ж) VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 169, и VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 178.

В другом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности, указанной выше в подпунктах а)-ж). В конкретных вариантах осуществления изобретения VH-последовательность, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции относительно референс-последовательности, но антигенсвязывающий центр, который содержит указанную последовательность, сохраняет способность связываться с СЕА, предпочтительно с указанной выше аффинностью. В конкретных вариантах осуществления изобретения в целом от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены путем инсерции и/или удалены путем делеции. В конкретных вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции затрагивают области вне HVR (т.е. в FR).

В другом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности, указанной выше в подпунктах а)-ж). В конкретных вариантах осуществления изобретения VL-последовательность, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции относительно референс-последовательности, но антигенсвязывающий центр, который содержит указанную последовательность, сохраняет способность связываться с СЕА, предпочтительно с указанной в выше аффинностью. В конкретных вариантах осуществления изобретения в целом от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены путем инсерции и/или удалены путем делеции. В конкретных вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции затрагивают области вне HVR (т.е. в FR).

В другом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержит VH, представленную выше в любом из вариантов осуществления изобретения, и VL, представленную выше в любом из вариантов осуществления изобретения.

Е. Примеры антигенсвязывающих центров для других мишеней

В другом конкретном варианте осуществления настоящего изобретения, который можно объединять с обсужденными выше вариантами осуществления изобретения (например, сайты связывания для DOTA или DOT AM), антиген-мишень, связывающийся первым и вторым антителами, может представлять собой GPRC5D или FAP.

Необязательно связывание антигенсвязывающего центра, который связывается с GPRC5D или FAP, может характеризоваться величиной Kd, составляющей 1 нМ или менее, 500 пМ или менее, 200 пМ или менее или 100 пМ или менее, в случае одновалентного связывания.

Ниже представлены примеры GPRC5D-связывающих последовательностей.

В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с GPRC5D, может содержать по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть CDR, выбранных из (a) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67; (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; (г) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; (д) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71; и (е) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72.

Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с GPRC5D, может содержать по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR-последовательности VH, выбранные из (a) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67; (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; и (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69.

Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с GPRC5D, может содержать по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR-последовательности VL, выбранные из (a) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; (б) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71; и (в) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72.

Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с GPRC5D, содержит (а) VH-домен, содержащий по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR-последовательности VH, выбранные из (I) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67, (II) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68, и (III) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO:69; и (б) VL-домен, содержащий по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR-последовательности VL, выбранные из (I) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70, (II) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71, и (в) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72.

В другом объекте изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с GPRC5D, содержит (a) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67; (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68; (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69; (г) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70; (д) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71; и (е) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72.

В любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения мультиспецифическое антитело может быть гуманизированным. В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий центр антитела к GPRC5D содержит CDR, указанные в любом из вышеприведенных вариантов осуществления изобретения, и дополнительно содержат акцепторный человеческий каркасный участок, например, каркасный участок человеческого иммуноглобулина или человеческий консенсусный каркасный участок.

В другом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с GPRC5D, содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 73. В конкретных вариантах осуществления изобретения VH-последовательность, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции относительно референс-последовательности, но антигенсвязывающий центр, который содержит указанную последовательность, сохраняет способность связываться с GPRC5D, предпочтительно с указанной выше аффинностью. В конкретных вариантах осуществления изобретения в целом от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены путем инсерции и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 73. В конкретных вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции затрагивают области вне HVR (т.е. в FR). Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с GPRC5D, содержит VH-последовательность SEQ ID NO: 73, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности. В конкретном варианте осуществления изобретения VH содержит один, два или три CDR, выбранных из: (a) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 67, (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 68, и (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 69.

В другом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с GPRC5D, содержит последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 74. В конкретных вариантах осуществления изобретения VL-последовательность, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции относительно референс-последовательности, но антигенсвязывающий центр, который содержит указанную последовательность, сохраняет способность связываться с GPRC5D, предпочтительно с указанной выше аффинностью. В конкретных вариантах осуществления изобретения в целом от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены путем инсерции и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 74. В конкретных вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции затрагивают области вне HVR (т.е. в FR). Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с GPRC5D, содержит VH-последовательность SEQ ID NO: 74, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности. В конкретном варианте осуществления изобретения VL содержит один, два или три CDR, выбранных из: (a) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70, (б) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71, и (в) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 72.

В другом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с GPRC5D, содержит VH, представленную выше в любом из вариантов осуществления изобретения, и VL, представленную выше в любом из вариантов осуществления изобретения. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит последовательности VH и VL SEQ ID NO:73 и SEQ ID NO: 74 соответственно, включая пост-трансляционные модификации этих последовательностей.

Ниже представлены примеры FAP-связывающих последовательностей.

В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с FAP, может содержать по меньшей мере один, два, три, четыре, пять или шесть CDR, выбранных из (a) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; (г) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; (д) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79; и (е) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80.

Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с FAP, может содержать по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR-последовательности VH, выбранные из (a) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; и (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77.

Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с FAP, может содержать по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR-последовательности VL, выбранные из (a) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; (б) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79; и (в) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80.

Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с FAP, содержит (а) VH-домен, содержащий по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR-последовательности VH, выбранные из (I) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75, (II) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, и (III) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 77; и (б) VL-домен, содержащий по меньшей мере один, по меньшей мере два или все три CDR-последовательности VL, выбранные из (I) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78, (II) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79, и (в) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80.

В другом объекте изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с FAP, содержит (a) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75; (6) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76; (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77; (г) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78; (д) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79; и (е) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80.

В любом из указанных выше вариантов осуществления изобретения мультиспецифическое антитело может быть гуманизированным. В одном из вариантов осуществления изобретения антигенсвязывающий центр антитела к FAP содержит CDR, указанные в любом из вышеприведенных вариантов осуществления изобретения, и дополнительно содержат акцепторный человеческий каркасный участок, например, каркасный участок человеческого иммуноглобулина или человеческий консенсусный каркасный участок.

В другом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с FAP, содержит последовательность вариабельного домена тяжелой цепи (VH), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 81. В конкретных вариантах осуществления изобретения VH-последовательность, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции относительно референс-последовательности, но антигенсвязывающий центр, который содержит указанную последовательность, сохраняет способность связываться с FAP, предпочтительно с указанной выше аффинностью. В конкретных вариантах осуществления изобретения в целом от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены путем инсерции и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 81. В конкретных вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции затрагивают области вне HVR (т.е. в FR). Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с FAP, содержит VH-последовательность SEQ ID NO: 81, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности. В конкретном варианте осуществления изобретения VH содержит один, два или три CDR, выбранных из: (a) CDR-H1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 75, (б) CDR-H2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 76, и (в) CDR-H3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 77.

В другом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с FAP, содержит последовательность вариабельного домена легкой цепи (VL), идентичную по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100% аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 82. В конкретных вариантах осуществления изобретения VL-последовательность, идентичная по меньшей мере на 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, содержит замены (например, консервативные замены), инсерции или делеции относительно референс-последовательности, но антигенсвязывающий центр, который содержит указанную последовательность, сохраняет способность связываться с FAP, предпочтительно с указанной выше аффинностью. В конкретных вариантах осуществления изобретения в целом от 1 до 10 аминокислот заменены, встроены путем инсерции и/или удалены путем делеции в SEQ ID NO: 82. В конкретных вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции затрагивают области вне HVR (т.е. в FR). Необязательно антигенсвязывающий центр, который связывается с FAP, содержит VL-последовательность SEQ ID NO: 82, включая пост-трансляционные модификации указанной последовательности. В конкретном варианте осуществления изобретения VL содержит один, два или три CDR, выбранных из: (a) CDR-L1, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 78, (б) CDR-L2, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 79, и (в) CDR-L3, который содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 80.

В другом варианте осуществления изобретения антигенсвязывающий центр, который связывается с FAP, содержит VH, представленную выше в любом из вариантов осуществления изобретения, и VL, представленную выше в любом из вариантов осуществления изобретения. В одном из вариантов осуществления изобретения антитело содержит последовательности VH и VL SEQ ID NO: 81 и SEQ ID NO: 82 соответственно, включая пост-трансляционные модификации этих последовательностей.

Ж. Форматы антител

Как указано выше, настоящее изобретение относится к набору антител, содержащему:

I) первое антитело, которое связывается с антигеном, экспрессируемым на поверхности клетки-мишени и которое содержит также VH-домен антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения, но которое не содержит VL-домен антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения; и

II) второе антитело, которое связывается с антигеном, экспрессируемым на поверхности клетки-мишени и которое содержит также VL-домен антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения, но которое не содержит VH-домен антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения,

где указанный VH-домен первого антитела и указанный VL-домен второго антитела вместе могут образовывать функциональный антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченного соединения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения первое и второе антитело каждое может содержать Fc-домен. Присутствие Fc-области обеспечивает преимущества в контексте радиоиммунотерапии и радиовизуализации, например, пролонгируя время полужизни белка в кровотоке и/или обеспечивая более высокое поглощение опухолью, по сравнению с использованием фрагментов меньшего размера.

В некоторых вариантах осуществления изобретения, в которых присутствует Fc-область, может оказаться предпочтительным создавать Fc-область с пониженной или элиминированной эффекторной функцией. Для этого можно осуществлять замену одного или нескольких остатков Fc-области в положениях 234, 235, 238, 265, 269, 270, 297, 327 и/или 329, например, одного или нескольких остатков в положениях 234, 235 и/или 329. В некоторых вариантах осуществления изобретения Fc-область можно создавать так, чтобы она включала замену Pro 329 на Gly, Leu 234 на Ala и/или Leu 235 на Ala (нумерация согласно EU-индексу).

В некоторых вариантах осуществления изобретения, обсужденных выше, в которых VH-домен антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения является свободным на его С-конце (например, не слитым с другим доменом через его С-конец), то его можно удлинять с помощью одного или нескольких остаток во избежание связывания аутоантител HAVH. Например, удлинение может включать 1-10 остатков, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10 остатков. В одном из вариантов осуществления изобретения последовательность VH можно удлинять с помощью одного или нескольких С-концевых остатков аланина, необязательно одного остатка аланина. Последовательность VH можно удлинять также с помощью N-концевого участка СН1-домена, например, с помощью 1-10 остатков из N-конца CH1-домена, например, из СН1-домена человеческого IgG1. (Первые 10 остатков CH1-домена человеческого IgG1 представляют собой ASTKGPSVFP (SEQ ID NO: 149), и, таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения от 1 до 10 остатков можно получать из N-конца указанной последовательности). Например, в одном из вариантов осуществления изобретения пептидную последовательность AST (соответствующую первым 3 остаткам CH1-домена IgG1) добавляют к С-концу VH-области. В некоторых вариантах осуществления изобретения первое и/или второе антитело каждое может быть многовалентным, например, двухвалентным, в отношении антигена-мишени (например, опухолеассоциированного антигена). Это имеет преимущество с точки зрения повышения авидности.

В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться предпочтительным, чтобы при объединении первого и второго антител они образовывали комплекс антител, который является одновалентным в отношении радиоактивномеченного соединения. Таким образом, первое антитело может содержать только один VH-домен антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения, а второе антитело может содержать только один VL-домен антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения, в результате они вместе образуют только один полный функциональный сайт связывания для радиоактивномеченного соединения.

Каждое из антител может содержать I) по меньшей мере один фрагмент антитела, содержащий антигенсвязывающий центр, специфический для антигена-мишени, II) либо VL-домен, либо VH-домен антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения и III) необязательно Fc-область. Фрагмент антитела может представлять собой, например, по меньшей мере один Fv-, scFv-, Fab- или cross-Fab-фрагмент, содержащий антигенсвязывающий центр, специфический в отношении антигена-мишени. Фрагмент антитела может быть слит с а) либо VL-доменом, либо VH-доменом антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения или б) если антитела содержат Fc-область, то с Fc-областью, слитой либо с VL-доменом, либо с VH-доменом антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения. В некоторых вариантах осуществления изобретения С-конец Fc-области слит с N-концом VL-домена или VH-домена.

Слияние может быть непосредственным или опосредованным. В некоторых вариантах осуществления изобретения слияние можно осуществлять через линкер. Например, Fc-область можно соединять с фрагментом антитела через шарнирную область или другой приемлемый линкер. Аналогично этому, через линкер можно осуществлять связывание VL- или VH- домена антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения с остальной частью структуры антитела. Линкер может представлять собой пептид, состоящий по меньшей мере из 5 аминокислот, предпочтительно 5-100, более предпочтительно 10-50 или 25-50 аминокислот. Линкер может представлять собой жесткий линкер или гибкий линкер. В некоторых вариантах осуществления изобретения он представляет собой гибкий линкер, содержащий или состоящий из остатков Thr, Ser, Gly и/или Ala. Например, он может содержать или состоять из остатков Gly и Ser. В некоторых вариантах осуществления изобретения он может включать повторяющийся мотив, такой как (Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)_n, в котором n обозначает, например, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В другом варианте осуществления изобретения указанный пептидный линкер представляет собой (G×S)_n или (G×S)_nG_m, где G обозначает глицин, S обозначает серии и (х=3, n=3, 4, 5 или 6 и m=0, 1, 2 или 3) или (х=4, n=2, 3, 4 или 5 и m=0, 1, 2 или 3), например, х=4 и n=2 или 3, например, х=4, n=2. В некоторых вариантах осуществления изобретения линкер может представлять собой или может содержать последовательность GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS (SEQ ID NO: 31). Можно применять другие линкеры и их может идентифицировать специалист в данной области.

В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения первое антитело может содержать или состоять из:

а) scFv-фрагмента, где scFv-фрагмент связывается с антигеном-мишенью;

и

б) полипептида, содержащего или состоящего из

I) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH); или

II) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH) и константного домена тяжелой цепи антитела, в котором С-конец VH-домена слит с N-концом константного домена;

где указанный полипептид слит с помощью N-конца VH-домена, предпочтительно через пептидный линкер, с С-концом scFv-фрагмента.

Второе антитело может содержать или состоять из:

в) второго scFv, связывающегося с антигеном-мишенью; и

г) полипептида, содержащего или состоящего из

I) вариабельного домена легкой цепи антитела (VL); или

II) вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) и константного домена легкой цепи антитела, в котором С-конец VL-домена слит с N-концом константного домена;

где указанный полипептид слит с помощью N-конца VL-домена, предпочтительно через пептидный линкер, с С-концом scFv-фрагмента.

Вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH) первого антитела и вариабельный домен легкой цепи антитела (VL) второго антитела вместе образуют функциональный антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченного соединения после объединения двух антител.

Необязательно полипептид, указанный в подпункте 6(1), может содержать дополнительно один или несколько остатков на С-конце VH-домена, необязательно один или несколько остатков аланина, необязательно один остаток аланина. Необязательно дополнительные остатки могут представлять собой N-концевой участок CH1-домена, описанный выше, например, 1-10 остатков из N-конца CH1-домена, например, из CH1-домена человеческого IgG1. Например, дополнительные остатки могут представлять собой AST.

Распознающие антиген-мишень вариабельные домены тяжелой и легкой цепей scFv можно соединять с помощью пептидной связи. Указанная пептидная связь может содержать 1-25 аминокислот, предпочтительно 12-20 аминокислот, предпочтительно 12-16 или 15-20 аминокислот. Указанная выше связьи может содержать один или несколько мотивов (G3S) и/или (G4S), в частности 1, 2, 3, 4, 5 или 6 мотивов (G3S) и/или (G4S), предпочтительно 3 ил 4 мотива (G3S) и/или (G4S), более предпочтительно 3 или 4 мотива (G4S).

Необязательно первое антитело может практически состоять или состоять из указанных выше компонентов (а) и (б), а второе антитело может практически состоять или состоять из указанных выше компонентов (в) и (г). В любом случае первое антитело не содержит вариабельный домен легкой цепи антитела (VL), который может образовывать функциональный антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченного соединения при объединении с компонентом (б) первого антитела; а второе антитело не содержит вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH), который может образовывать функциональный антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченного соединения при объединении с компонентом (г) второго антитела.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения первое антитело может содержать или состоять из:

а) Fab-фрагмента, связывающегося с антигеном-мишенью, и

б) полипептида, содержащего или состоящего из

I) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH) антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения, или

II) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH) антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения и константного домена тяжелой цепи антитела, в котором С-конец VH-домена слит с N-концом константного домен;

где полипептид слит с помощью N-конца VH-домена, предпочтительно через пептидный линкер, с С-концом CL- или CH1-домена Fab-фрагмента. Второе антитело может содержать или состоять из:

в) Fab-фрагмента, связывающегося с антигеном-мишенью, и

г) полипептида, содержащего или состоящего из

III) вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения или

IV) вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения и константного домена легкой цепи антитела, в котором С-конец VL-домена слит с N-концом константного домена;

где полипептид слит с помощью N-конца VL-домена, предпочтительно через пептидный линкер, с С-концом CL- или CH1-домена Fab-фрагмента.

Вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH) полипептида (б) и вариабельный домен легкой цепи антитела (VL) полипептида (г) вместе образуют функциональный антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченного соединения (т.е. после объединения двух антител).

Необязательно полипептид, указанный в подпункте 6(1), может содержать дополнительно один или несколько остатков на С-конце VH-домена, необязательно один или несколько остатков аланина, необязательно один остаток аланина. Необязательно дополнительные остатки могут представлять собой N-концевой участок CH1-домена, описанный выше, например, 1-10 остатков из N-конца CH1-домена, например, из CH1-домена человеческого IgG1. Например, дополнительные остатки могут представлять собой AST.

Необязательно первое антитело может практически состоять или состоять из указанных выше компонентов (а) и (б), а второе антитело может практически состоять или состоять из указанных выше компонентов (в) и (г). В любом случае первое антитело не содержит вариабельный домен легкой цепи антитела (VL), который может образовывать функциональный антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченного соединения при объединении с компонентом (б) первого антитела; а второе антитело не содержит вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH), который может образовывать функциональный антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченного соединения при объединении с компонентом (г) второго антитела.

Цепь Fab-фрагмента, которую сливают с полипептидом, можно выбирать независимо для первого и второго антител. Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения полипептид (б) сливают с С-концом СН1-домена Fab-фрагмента первого антитела, а полипептид (г) сливают с С-концом CH1-домена Fab-фрагмента второго антитела. В другом варианте осуществления изобретения полипептид (б) сливают с С-концом CL-домена Fab-фрагмента первого антитела, а полипептид (г) сливают с С-концом CL-домена Fab-фрагмента второго антитела. В следующем варианте осуществления изобретения полипептид (б) сливают с С-концом СН1-домена Fab-фрагмента первого антитела, а полипептид (г) сливают с С-концом CL-домена Fab-фрагмента второго антитела. В другом варианте осуществления изобретения полипептид (б) сливают с С-концом CL-домена Fab-фрагмента первого антитела, а полипептид (г) сливают с С-концом СН1-домена Fab-фрагмента второго антитела.

Как указано выше, в некоторых вариантах осуществления изобретения первое и/или второе антитело каждое может быть многовалентным, например, двухвалентным в отношении антигена-мишени (например, опухолеассоциированного антигена). Это имеет преимущество с точки зрения повышения авидности. Антитела могут быть многовалентными, например, двухвалентными, и каждое может быть моноспецифическим в отношении конкретного эпитопа (который может представлять собой эпитоп, одинаковый для первого и второго антител, или эпитопы для первого и второго антител могут быть различными). Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения первое антитело может содержать I) два или большее количество фрагментов антител, содержащих антигенсвязывающий центр, специфический в отношении одного и того эпитопа антигена-мишени, II) либо VL-домен, либо VH-домен антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения (но не оба домена) и III) необязательно Fc-область. Второе антитело может содержать I) два или большее количество фрагментов антител, содержащих антигенсвязывающий центр, специфический в отношении одного и того эпитопа антигена-мишени, II) либо VL-домен, либо VH-домен антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения (но не оба домена) и III) необязательно Fc-область. Как указано выше, эпитоп для первого и второго антител может представлять собой один и тот же эпитоп или эпитопы для первого и второго антител могут быть различными.

Например, первое и второе антитело каждое может содержать тандемный Fab, т.е. два Fab-фрагмента, соединенные через пептидную связь (Fab-связь-Fab), в котором первый Fab соединен через его С-конец с N-концом второго Fab.

В одном из вариантов осуществления изобретения первое антитело содержит

а) тандемный Fab, содержащий два Fab-фрагмента, в котором первый и второй Fab-фрагменты связываются с одним и тем же антигеном-мишенью («антиген-мишень А»), и эпитоп, связывающийся первым Fab-фрагментом, представляет собой такой же эпитоп, который связывается вторым Fab-фрагментом, и в котором первый и второй Fab-фрагменты соединены через пептидную связь, при этом первый Fab соединен через его С-конец с N-концом второго Fab; и

б) полипептид, содержащий или состоящий из

I) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH); или

II) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH) и константного домена антитела (СН1), в котором С-конец VH-домена слит с N-концом СН1-домена;

где указанный полипептид слит с помощью N-конца VH-домена, предпочтительно через пептидный линкер, с С-концом CL- или CH1-домена второго Fab-фрагмента;

и второе антитело содержит

в) тандемный Fab, содержащий два Fab-фрагмента, в котором первый и второй Fab-фрагменты связываются с антигеном А, и эпитоп, связывающийся первым Fab-фрагментом, представляет собой такой же эпитоп, который связывается вторым Fab-фрагментом, и в котором первый и второй Fab-фрагменты соединены через пептидную связь, при этом первый Fab соединен через его С-конец с N-концом второго Fab; и

г) полипептид, содержащий или состоящий из

I) вариабельного домена легкой цепи антитела (VL); или

II) вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) и константного домена легкой цепи антитела (CL), в котором С-конец VH-домена слит с N-концом константного домена;

где указанный полипептид слит с помощью N-конца VL-домена, I предпочтительно через пептидный линкер, с С-концом CL- или CH1-домена второго Fab-фрагмента.

Вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH), указанный в подпункте (б) (в первом антителе), и вариабельный домен легкой цепи антитела (VL), указанный в подпункте (г) (во втором антителе), вместе образуют функциональный антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченного соединения, т.е. после объединения двух антител.

Необязательно полипептид, указанный в подпункте 6(1), может содержать дополнительно один или несколько остатков на С-конце VH-домена, необязательно один или несколько остатков аланина, необязательно один I остаток аланина. Необязательно дополнительные остатки могут представлять собой N-концевой участок CH1-домена, описанный выше, например, 1-10 остатков из N-конца CH1-домена, например, из CH1-домена человеческого IgG1. Например, дополнительные остатки могут представлять собой AST.

Цепь тендемного Fab, которую сливают с полипептидом (т.е. когда полипептид сливают с CL- или CH1-доменом второго Fab-фрагмента) можно выбирать независимо для первого и второго антител.

Как указано выше, первый Fab-фрагмент тандемного Fab соединен с N-концом второго Fab-фрагмента. В одном из вариантов осуществления изобретения С-конец фрагмента тяжелой цепи первого Fab-фрагмента соединен с N-концом фрагмента тяжелой цепи или фрагмента легкой цепи второго Fab-фрагмента. В другом варианте осуществления изобретения С-конец фрагмента легкой цепи первого Fab-фрагмента соединен с N-концом фрагмента тяжелой цепи или фрагмента легкой цепи второго Fab-фрагмента. Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения тандемный Fab первого и/или второго антител может содержать указанные ниже три цепи:

1) фрагмент легкой цепи ((VLCL)1) первого Fab-фрагмента, фрагмент тяжелой цепи первого Fab-фрагмента, соединенный с фрагментом тяжелой цепи второго Fab-фрагмента через пептидную связь ((VHCH1)1-связь-(VHCH1)2), и фрагмент легкой цепи второго Fab-фрагмента ((VLCL)2); или

2) фрагмент легкой цепи первого Fab-фрагмента ((VLCL)l), фрагмент тяжелой цепи первого Fab-фрагмента, соединенный с фрагментом легкой цепи второго Fab-фрагмента через пептидную связь ((VHCH1)1-связь-(VLCL)2), и фрагмент тяжелой цепи второго Fab-фрагмента ((VHCH1)2); или

3) фрагмент тяжелой цепи (VHCH1) первого Fab-фрагмента, фрагмент легкой цепи первого Fab-фрагмента, соединенный с фрагментом легкой цепи второго Fab-фрагмента через пептидную связь ((VLCL)1-связь-(VLCL)2), и фрагмент тяжелой цепи второго Fab-фрагмента; или

4) фрагмент тяжелой цепи (VHCH1) перового Fab-фрагмента, фрагмент легкой цепи первого Fab-фрагмента, соединенный с фрагментом легкой цепи второго Fab-фрагмента через пептидную связь ((VLCL)1-связь-(VHCH1)2), и фрагмент легкой цепи второго Fab-фрагмента ((VLCL)2).

В другом варианте осуществления изобретения первое и/или второе антитело каждое может связываться с несколькими, необязательно двумя, различными эпитопами антигена-мишени. Таким образом, одно или оба антитела может(гут) быть бипаратопным(и) в отношении антигена-мишени. В некоторых вариантах осуществления изобретения первое и второе антитело каждое может содержать I) фрагмент антитела, содержащий антигенсвязывающий центр, специфический в отношении первого эпитопа антигена-мишени А; II) фрагмент антитела, содержащий антигенсвязывающий центр, специфический в отношении второго эпитопа антигена-мишени А; III) либо VL-домен, либо VH-домен антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения (но не оба домена) и IV) необязательно Fc-область.

В указанных вариантах осуществления изобретения правильной сборке легких цепей с соответствующей тяжелой цепью может способствовать применение технологии «cross-mab». Например, в одном из вариантов осуществления изобретения каждое антитело может содержать тандемный Fab, который содержит один Fab и один cross-Fab, в котором один фрагмент, выбранный из Fab и cross-Fab, является специфическим в отношении первого эпитопа, а другой является специфическим в отношении второго эпитопа.

В одном из конкретных примеров первое антитело может содержать:

а) тандемный Fab, содержащий первый фрагмент и второй фрагмент, в котором первый фрагмент соединен с помощью его С-конца через пептидную связь с N-концом второго фрагмента, в котором первый фрагмент связывает первый эпитоп антигена-мишени А, а второй фрагмент связывает второй эпитоп антиген-мишени А, и в котором один из фрагментов, выбранных из первого и второго фрагментов, представляет собой Fab, а другой представляет собой cross-Fab,

б) полипептид, который содержит или состоит из

I) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH); или

II) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH) и константного домена тяжелой цепи антитела (СН1), в котором С-конец VH-домена слит с N-концом СН1- домена;

где указанный полипептид слит с помощью N-конца VH-домена, предпочтительно через пептидный линкер, с С-концом одной из цепей второго фрагмента.

Второе антитело может содержать

в) тандемный Fab, содержащий первый фрагмент и второй фрагмент, в котором первый фрагмент соединен с помощью его С-конца с N-концом второго фрагмента, в котором первый фрагмент связывается с первым эпитопом антигена-мишени А, а второй фрагмент связывается со вторым эпитопом антигена-мишени А, и котором один из фрагментов, выбранных из первого и второго фрагментов, представляет собой Fab, а другой представляет собой cross-Fab; и

г) полипептид, который содержит или состоит из

I) вариабельного домена легкой цепи антитела (VL); или

II) вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) и константного домена легкой цепи антитела (CL), в котором С-конец VL-домена слит с N-концом константного домена легкой цепи;

где указанный полипептид слит с помощью N-конца VL-домена, предпочтительно через пептидный линкер, с С-концом одной из цепей второго фрагмента.

Вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH) первого антитела и вариабельный домен легкой цепи антитела (VL) второго антитела вместе образуют функциональный антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченного соединения.

Необязательно полипептид, указанный в подпункте 6(1), может содержать дополнительно один или несколько остатков на С-конце VH-домена, необязательно один или несколько остатков аланина, необязательно один остаток аланина. Необязательно дополнительные остатки могут представлять собой N-концевой участок CH1-домена, описанный выше, например, 1-10 остатков из N-конца CH1-домена, например, из CH1-домена человеческого IgG1. Например, дополнительные остатки могут представлять собой AST.

Либо первый, либо второй фрагмент может представлять собой cross-Fab, если тандемный Fab содержит один канонический Fab и один cross-Fab.

В любом из вариантов тандемного Fab, описанного выше (включая те, которые включают cross-Fab) необязательно первое антитело может практически состоять или состоять из компонентов (а) и (б), а второе антитело может состоять или практически состоять из компонентов (в) и (г). В любом случае первое антитело не содержит вариабельный домен легкой цепи антитела (VL), который может образовывать функциональный антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченного соединения при объединении с компонентом (б) первого антитела; а второе антитело не содержит вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH), который может образовывать функциональный антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченного соединения при объединении с компонентом (г) второго антитела.

В любом из вариантов тандемного Fab, описанного выше (включая те, которые включают cross-Fab), пептидная связь, соединяющая Fab-фрагменты в первом и втором антителе, может представлять собой пептид, состоящий по меньшей мере из 5 аминокислот, предпочтительно 5-100, более предпочтительно 10-50 или 25-50 аминокислот. В одном из вариантов осуществления изобретения указанный пептидный линкер представляет собой (G×S)_n или (G×S)_nG_m, где G обозначает глицин, S обозначает серии и (х=3, n=3, 4, 5 или 6 и m=0, 1, 2 или 3) или (х=4, n=2, 3, 4 или 5 и m=0, 1, 2 или 3), например, х=4 и n=2 или 3, например, х=4, n=2. В одном из вариантов осуществления изобретения указанная пептидная связь представляет собой (G4S)2.

Как указано выше, в некоторых вариантах осуществления изобретения первое и второе антитело каждое может содержать Fc-домен, необязательно сконструированный для снижения или элиминации эффекторной функции.

В одном из вариантов осуществления изобретения первое и второе антитело каждое может содержать I) Fc-домен, II) по меньшей мере один фрагмент антитела, такой как scFv-, Fv-, Fab- или cross-Fab-фрагмент, содержащий антигенсвязывающий центр, специфический в отношении антигена-мишени, и III) либо VL-домен, либо VH- домен антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения (но не оба домена).

Необязательно антитела, содержащие Fc-домен, могут быть одновалентными в отношении связывания с антигеном-мишенью. В других вариантах осуществления изобретения они могут быть многовалентными, например, двухвалентными. Первое и второе антитело каждое может быть многовалентным и моноспецифическим в отношении одного и того же эпитопа антигена-мишени. В следующих вариантах осуществления изобретения первое и второе антитело каждое может иметь сайты связывания для различных эпитопов антигена-мишени например, они могут быть бипаратопными

Фрагмент антитела может представлять собой scFv. Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения первое антитело может содержать или состоять из:

а) scFv-фрагмента, где scFv-фрагмент связывается с антигеном-мишенью;

б) Fc-домена; и

в) полипептида, который содержит или состоит из

I) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH); или

II) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH) и константного домена тяжелой цепи антитела (СН1), в котором С-конец VH-домена слит с N-концом константного домена;

где scFv, указанный в подпункте (а), слит с N-концом Fc-домена и где полипептид, указанный в подпункте (в), слит с помощью N-конца VH-домена с С-концом Fc-домена, предпочтительно через пептидный линкер.

Необязательно полипептид, указанный в подпункте в(1), может содержать дополнительно один или несколько остатков на С-конце VH-домена, необязательно один или несколько остатков аланина, необязательно один остаток аланина. Необязательно дополнительные остатки могут представлять собой N-концевой участок CH1-домена, описанный выше, например, 1-10 остатков из N-конца CH1-домена, например, из CH1-домена человеческого IgG1. Например, дополнительные остатки могут представлять собой AST.

Второе антитело может содержать или состоять из:

г) второго scFv, связывающего антиген-мишень;

д) Fc-домена; и

е) полипептида, который содержит или состоит из

I) вариабельного домена легкой цепи антитела (VL); или

II) вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) и константного домена легкой цепи антитела (CV), в котором С-конец VL-домена слит с N-концом константного домена;

где scFv, указанный в подпункте (г), слит с N-концом Fc-домена и где полипептид, указанный в подпункте (е), слит с помощью N-конца VH-домена с С-концом Fc-домена, предпочтительно через пептидный линкер.

В другом варианте осуществления изобретения первое и второе антитело каждое может представлять собой IgG с одним плечом, содержащим Fab для антигена-мишени (например, один Fab для антигена-мишени) и Fc-домен. Таким образом, первое антитело может содержать или состоять из:

I) фрагмента полной легкой цепи;

II) полной тяжелой цепи;

III) дополнительной Fc-цепи, лишенной Fd; и

IV) полипептида, который содержит или состоит из VH-домена антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения;

в котором легкая цепь (I) и тяжелая цепь (II) вместе образуют антигенсвязывающий центр для антигена-мишени; и в котором полипептид, который содержит или состоит из VH-домена антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения, слит с помощью N-конца, предпочтительно через линкер с С-концом либо (II), либо (III).

Второе антитело может содержать или состоять из

V) фрагмента полной легкой цепи;

VI) полной тяжелой цепи;

VII) дополнительной Fc-цепи, лишенной Fd; и

VIII) полипептида, который содержит или состоит из VL-домена антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения;

в котором легкая цепь (V) и тяжелая цепь (VI) вместе образуют антигенсвязывающий центр для антигена-мишени; и в котором полипептид, который содержит или состоит из VL-домена антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения, слит с помощью N-конца, предпочтительно через линкер с С-концом либо (VI), либо (VII).

Полипептид, который содержит или состоит из VH-домена антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения, может представлять собой полипептид, который содержит или состоит из

I) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH), в этом случае полипептид может содержать дополнительно один или несколько остатков на С-конце VH-домена, необязательно один или несколько остатков аланина, необязательно один остаток аланина, или необязательно N-концевой участок CH1-домена, описанный выше; или

II) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH) и константного домена тяжелой цепи антитела (СН1), в котором С-конец VH-домена слит с N-концом СН1- домена.

Полипептид, который содержит или состоит VL-домена антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения, может представлять собой полипептид, который содержит или состоит из

I) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH); или

II) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VL) и константного домена легкой цепи антитела, в котором С-конец VL-домена слит с N-концом константного домена.

Когда первое и второе антитела представляют собой гетеродимеры, например, как в случае IgG с одним плечом, то их сборке может способствовать применение технологии «knob into hole» («выступ-во-впадину), которая будет описана ниже.

В другом варианте осуществления изобретения каждое из антител может содержать тандемный Fab, описанный выше (например, содержащий два Fab-фрагмента, в котором первый и второй Fab-фрагменты оба связываются с одним и тем же эпитопом антигена-мишени А; или содержащий Fab и cross-Fab, при этом один из них связывается с первым эпитопом антигена-мишени А, а другой связывается со вторым эпитопом антигена-мишени А), в котором тандемный Fab слит (например, через его С-конец) с N-концом Fc-домена и в котором пептид, содержащий или состоящий из VH- или VL-домена антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения, слит (например, через его N-конец) с С-концом Fc-домена.

Таким образом, первое антитело может содержать или состоять из:

а) тандемного Fab, выбранного из

I) тандемного Fab, который содержит два Fab-фрагмента, в котором первый и второй Fab-фрагменты связываются с антигеном-мишенью А, и эпитоп, который связывается первым Fab-фрагментом, является таким же, что и эпитоп, который связывается вторым Fab-фрагментом, и в котором первый и второй Fab-фрагменты соединены через пептидную связь, при этом первый Fab соединен через его С-конец с N-концом второго Fab; и

II) тандемного Fab, который содержит первый фрагмент и второй фрагмент, в котором первый фрагмент соединен с помощью его С-конца через пептидную связь с N-концом второго фрагмента, в котором первый фрагмент связывает первый эпитоп антигена-мишени А, а второй фрагмент связывает второй эпитоп антигена-мишени А, и в котором один из фрагментов, выбранных из первого и второго фрагментов, представляет собой Fab, а другой представляет собой cross-Fab;

б) Fc-домена; и

в) полипептида, который содержит или состоит из:

I) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH); или

II) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH) и константного домена тяжелой цепи антитела (СН1), в котором С-конец VH-домена слит с N-концом СН1- домена,

в котором тандемный Fab слит с N-концом одной из цепей Fc-домена, и полипептид (в) слит с помощью N-конца VH-домена с С-концом одной из цепей Fc-домена, предпочтительно через пептидный линкер.

Необязательно полипептид, указанный в подпункте в(I), может содержать дополнительно один или несколько остатков на С-конце VH-домена, необязательно один или несколько остатков аланина, необязательно один остаток аланина. Необязательно дополнительные остатки могут представлять собой N-концевой участок CH1-домена, описанный выше, например, 1-10 остатков из N-конца CH1-домена, например, из CH1-домена человеческого IgG1. Например, дополнительные остатки могут представлять собой AST.

Второе антитело может содержать или состоять из:

г) тандемного Fab, выбранного из:

I) тандемного Fab, который содержит два Fab-фрагмента, в котором первый и второй Fab-фрагменты связываются с антигеном-мишенью А, и эпитоп, который связывается первым Fab-фрагментом, является таким же, что и эпитоп, который связывается вторым Fab-фрагментом, и в котором первый и второй Fab-фрагменты соединены через пептидную связь, при этом первый Fab соединен через его С-конец с N-концом второго Fab; и

II) тандемного Fab, который содержит первый фрагмент и второй фрагмент, в котором первый фрагмент соединен с помощью его С-конца через пептидную связь с N-концом второго фрагмента, в котором первый фрагмент связывает первый эпитоп антигена-мишени А, а второй фрагмент связывает второй эпитоп антигена-мишени А, и в котором один из фрагментов, выбранных из первого и второго фрагментов, представляет собой Fab, а другой представляет собой cross-Fab;

д) Fc-домена; и

е) полипептида, который содержит или состоит из:

I) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VL); или

II) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VL) и константного домена легкой цепи антитела (CL), в котором С-конец VL-домена слит с N-концом константного домена легкой цепи,

в котором тандемный Fab (г) слит с N-концом одной из цепей Fc-домена, и полипептид (е) слит с помощью N-конца VL-домена с С-концом одной из цепей Fc- домена, предпочтительно через пептидный линкер.

VH-домен первого антитела и VL-домен второго антитела вместе образуют антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченного соединения, т.е. после объединения двух антител.

Если первое антитело содержит тандемный Fab, указанный в подпункте (a)(I), то в этом случае, как правило, второе антитело должно содержать тандемный Fab, указанный в подпункте г(I); если первое антитело содержит тандемный Fab, указанный в подпункте (а)(II), то в этом случае, как правило, второе антитело должно содержать тандемный Fab, указанный в подпункте г(II).

Тандемный Fab может, как правило, представлять собой описанный выше тандемный Fab. Например, связь, соединяющая два фрагмента тандемного Fab, может представлять собой описанную выше связь. Тандемный Fab может состоять из любого набора цепей, описанных выше. Как правило, фрагмент тяжелой цепи второго Fab (который может представлять собой cross-Fab) может быть сцеплен с Fc-доменом.

В другом варианте осуществления изобретения каждое из первого и второго антител может содержать а) Fc-домен, б) по меньшей мере один фрагмент антитела, такой как scFv-, Fv-, Fab- или cross-Fab-фрагмент, содержащий антигенсвязывающий центр для антигена-мишени, и в) полипептид, содержащий либо VL-домен, либо VH-домен антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения (но не оба домена), где С-конец фрагмента антитела (б) слит с N-концом одной цепи Fc-домена, а С-конец полипептида (в) слит с N-концом другой цепи Fc-домена. Слияние фрагмента (в) предпочтительно осуществляют через шарнирную область. Слияние полипептида (в) можно осуществлять через линкер, расположенный между С-концом полипептида и N-концом Fc-области, и/или через часть или всю верхнюю шарнирную область (например, Asp221 и С-концевые по отношению к нему остатки (нумерация согласно EU-индексу). В одном из вариантов осуществления изобретения фрагмент (б) антитела может представлять собой Fab-фрагмент.В одном из вариантов осуществления изобретения в первом антителе полипептид (в) состоит из VH-домена антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения; а во втором антителе полипептид (в) состоит из VL-домена антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения.

Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения первое антитело может содержать или состоять из:

I) полной легкой цепи;

II) полной тяжелой цепи;

III) дополнительной Fc-цепи; и

IV) полипептида, который содержит или состоит из VH-домена антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения;

в котором легкая цепь (I) и тяжелая цепь (II) вместе образуют антигенсвязывающий центр для антигена-мишени; и в котором полипептид, содержащий или состоящий из VH-домена антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения слит с помощью его С-конца, предпочтительно через линкер, с N-концом цепи (III).

Второе антитело может содержать или состоять из:

V) полной легкой цепи;

VI) полной тяжелой цепи;

VII) дополнительной Fc-цепи; и

VIII) полипептида, который содержит или состоит из VL-домена антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения;

в котором легкая цепь (V) и тяжелая цепь (VI) вместе образуют антигенсвязывающий центр для антигена-мишени; и в котором полипептид, содержащий или состоящий из VL-домена антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения слит с помощью его С-конца, предпочтительно через линкер, с N-концом цепи (VII).

Линкер может содержать любой гибкий линкер, известный специалисту в данной области, например, линкер GGGGSGGGGSGGGGSGGSGG (SEQ ID NO: 152). Линкер может также включать часть или всю верхнюю шарнирную область, например, может простираться от Asp221 для начала Fc-цепи (например, Cys226).

В еще одном варианте осуществления изобретения первое и/или второе антитело каждое содержит полноразмерное антитело, имеющее антигенсвязывающий центр для антигена-мишени, и дополнительно содержащее либо VL-домен, либо VH-домен антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения.

В одном конкретном варианте осуществления изобретения первое антитело может содержать:

а) первое полноразмерное антитело, состоящее из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела, в котором по меньшей мере одно плечо полноразмерного антитела связывается с антигеном-мишенью А; и

б) полипептид, который содержит или состоит из

I) дополнительного вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH);

или

II) дополнительного вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH) и дополнительного константного домена антитела (СН1), в котором С-конец VH домена слит с N-концом CH1-домена,

в котором указанный полипептид слит с помощью N-конца VH-домена, предпочтительно через пептидный линкер, с С-концом одной из двух тяжелых цепей указанного первого полноразмерного антитела.

Второе антитело может содержать

в) второе полноразмерное антитело, состоящее из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела, в котором по меньшей мере одно плечо полноразмерного антитела связывается с антигеном-мишенью А; и

г) полипептид, который содержит или состоит из

I) дополнительного вариабельного домена легкой цепи антитела (VL); или

II) дополнительного вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) и дополнительного константного домена легко цепи антитела (CL), в котором С-конец VL-домена слит с N-концом CL-домена,

в котором указанный полипептид слит с помощью N-конца VL-домена, предпочтительно через пептидный линкер, с С-концом одной из двух тяжелых цепей указанного второго полноразмерного антитела.

Вариабельный домен тяжелой цепи (VH) первого антитела и вариабельный домен легкой цепи (VL) второго антитела вместе образуют функциональный антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченного соединения, т.е. после объединения двух антител.

Необязательно полипептид, указанный в подпункте 6(1), может содержать дополнительно один или несколько остатков на С-конце VH-домена, необязательно один или несколько остатков аланина, необязательно один остаток аланина. Необязательно дополнительные остатки могут представлять собой N-концевой участок CH1-домена, описанный выше, например, 1-10 остатков из N-конца CH1-домена, например, из CH1-домена человеческого IgG1. Например, дополнительные остатки могут представлять собой AST.

Необязательно первое антитело может практически состоять или состоять из указанных выше компонентов (а) и (б), а второе антитело может практически состоять или состоять из указанных выше компонентов (в) и (г). В любом случае первое антитело не содержит вариабельный домен легкой цепи антитела (VL), который может образовывать функциональный антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченного соединения при объединении с компонентом (б) первого антитела; а второе антитело не содержит вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH), который может образовывать функциональный антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченного соединения при объединении с компонентом (г) второго антитела.

Может оказаться предпочтительным, чтобы оба плеча полноразмерного антитела обладали связывающей специфичностью в отношении антигена-мишени А. Если антитело является двухвалентным в отношении антигена-мишени, то оба плеча полноразмерного антитела могут связываться с одним и тем же эпитопом антигена-мишени А.

В другом варианте осуществления изобретения антитело может быть паратопным в отношении антигена-мишени; например, одно плечо полноразмерного антитела может связываться с первым эпитопом антигена-мишени А, и одно плечо может связываться со вторым эпитопом антигена-мишени А. В указанных вариантах осуществления изобретения одно плечо антитела может содержать Fab, и одно плечо антитела может содержать cross-Fab, что способствует правильной сборке легких цепей с соответствующей тяжелой цепью. Таким образом, в одном из вариантов осуществления изобретения первая тяжелая цепь полноразмерного антитела может содержать VL-домен вместо VH-домена (например, VL-CH1-шарнир-CH2-CH3), а первая легкая цепь может содержать VH-домен, взамен VL-домена (например, VH-CL), или первая тяжелая цепь может содержать CL-домен вместо НС 1-домена (например, VH-CL-шарнир-CH2-CH3), а первая легкая цепь может содержать CH1-домен вместо CL-домена (например,VL-CH1). В указанном варианте осуществления изобретения вторая тяжелая цепь и вторая легкая цепь имеют каноническую структуру доменов (например, VH-СН1-шарнир-СН2-CH3 и VL-CL соответственно). В альтернативном варианте осуществления изобретения вторая тяжелая цепь полноразмерного антитела может содержать VL-домен вместо VH-домена (например, VL-СН1-шарнир-СН2-CH3), а вторая легкая цепь может содержать VH-домен взамен VL-домена (например, VH-CL) или вторая тяжелая цепь может содержать CL-домен вместо CH1-домена (например, VH-CL-шарнир-СН2-CH3), а вторая легкая цепь может содержать CH1-домен вместо CL-домена (например, VL-CH1). В этом варианте осуществления изобретения первая тяжелая цепь и первая легкая цепь имеют каноническую структуру доменов.

В некоторых вариантах осуществления изобретения правильной сборке легких цепей с соответствующей тяжелой цепью может дополнительно или альтернативно способствовать применение модификации зарядов, что дополнительно будет обсуждаться ниже.

Правильной сборке гетеродимерных тяжелых цепей может способствовать применение технологии «knob into hole».

В контексте настоящего описания понятие «полноразмерное антитело» означает антитело, состоящее из двух «тяжелых цепей полноразмерного антитела» и двух «легких цепей полноразмерного антитела». «Тяжелая цепь полноразмерного антитела» может представлять собой полипептид, состоящий в направлении от N-конца к С-концу из вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH), константного домена 1 тяжелой цепи антитела (СН1), шарнирной области антитела (HR), константного домена 2 тяжелой цепи антитела (СН2) и константного домена 3 тяжелой цепи антитела (CH3), что сокращенно обозначают как VH-CH1-HR-CH2-CH3; и необязательно константного домена 4 тяжелой цепи антитела (СН4) в случае антитела подкласса IgE. Предпочтительно «тяжелая цепь полноразмерного антитела» представляет собой полипептид, состоящий в направлении от N-конца к С-концу из VH, CH1, HR, СН2 и CH3. Не подразумевается, что образование cross-Mab исключено из определения «полноразмерный» - поэтому тяжелая цепь может иметь обмен VH-домена на VL-домен или обмен CH1-домена на CL-домен. «Легкая цепь полноразмерного антитела» может представлять собой полипептид, состоящий в направлении от N-конца к С-концу из вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) и константного домена легкой цепи антитела (CL), что сокращенного обозначают как VL-CL. Альтернативно этому, в случае cross-Mab, может иметь место обмен VL-домена на VH-домен или обмен CL-домена на CH1-домен. Константный домен легкой цепи антитела (CL) может относиться к κ- (каппа) или γ-(лямбда)-типу. Две цепи полноразмерного антитела сцеплены друг с другом с помощью межполипептидных дисульфидных связей между CL-доменом и СН1-доменом и между шарнирными областями тяжелых цепей полноразмерного антитела. Примерами типичных полноразмерных антител являются встречающиеся в естественных условиях антитела типа IgG (например, IgG1 и IgG2), IgM, IgA, IgD и IgE). Полноразмерные антитела, предлагаемые в изобретении, могут иметь происхождение из одного вида, например, человека, или они могут представлять собой химерные или гуманизированные антитела. Полноразмерные антитела, представленные в настоящем описании, содержат два антигенсвязывающих центра, каждый из которых образован парой VH и VL, которые согласно некоторым вариантам осуществления изобретения могут оба специфически связываться с одним и тем же антигеном, или могут связываться с различными антигенами. С-конец тяжелой или легкой цепи указанного полноразмерного антитела означает последнюю аминокислоту на С-конце указанной тяжелой или легкой цепи.

N-конец вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH) в полипептиде, указанном в подпункте б), и вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) в полипептиде, указанном в подпункте г), означает последнюю аминокислоту на N-конце VH- или VL-домена.

Методики, известные в данной области для создания мультиспецифических антител, можно применять также для получения любых гетеродимеров, указанных в настоящем описании. Они включают (но не ограничиваясь только ими) рекомбинантную совместную экспрессию двух пар тяжелых цепей-легких цепей иммуноглобулинов, обладающих различными специфичностями (см. Milstein и Cuello, Nature 305, 1983, сс.537), и технологию конструирования «knob-in-hole» (см., например, патент США №5731168 и Atwell и др., J. Mol. Biol. 270, 1997, с. 26). Другие методики включают создание регулируемых электростатическими силами воздействий для получения молекул антитела с гетеродимерными Fc (см., например, WO 2009/089004); перекрестное связывание двух или большего количества антител или фрагментов (см., например, патент США №4676980 и Brennan и др., Science 229, 1985, сс. 81-83); применение лейциновых молний (см., например, Kostelny и др., J. Immunol. 148(5), 1992, сс. 1547-1553 и WO 2011/034605); и применение технологии общей легкой цепи для преодоления проблемы, связанной с ошибочным спариванием легких цепей (см., например, WO 98/50431).

СН3-домены полноразмерного антитела, указанного выше, можно изменять с использованием технологии «knob-into-holes» (взаимодействие по типу «выступ-во-впадину»), которая описана подробно с помощью нескольких примеров, например, в WO 96/027011, у Ridgway J.В. и др., Protein Eng 9, 1996, сс. 617-621 и Merchant A.M. и др., Nat Biotechnol 16, 1998, сс.677-681. При осуществлении этого метода поверхности раздела двух СН3-доменов изменяют для повышения гетеродимеризации обеих тяжелых цепей, которые содержат два указанных СН3-домена. Каждый из двух СН3-доменов (двух тяжелых цепей) может иметь «выступ», а второй - «впадину». Например, один содержит так называемые «приводящие к образованию выступа мутации» (T366W и необязательно одну из S354C или Y349C), а другой содержит так называемые «приводящие к образованию впадины мутации» (T366S, L368A и Y407V и необязательно Y349C или S354C) (см., например, Carter Р. и др., Immunotechnol. 2, 1996, с. 73) согласно нумерации на основе EU-индекса.

В дополнительном или альтернативном варианте можно использовать интродукцию дисульфидного мостика для стабилизации гетеродимеров (Merchant A.M. и др., Nature Biotech 16, 1998, сс. 677-681; Atwell S. и др., J. Mol. Biol. 270, 1997, сс. 26-35) и повышения выхода.

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения первое и/или второе антитело отличается также тем, что: СН3-домен одной из тяжелых цепей полноразмерного антитела и СН3-домен другой тяжелой цепи полноразмерного антитела оба встречаются на поверхности раздела, которая содержит исходную поверхность раздела между СН3-доменами антитела; при этом указанная поверхность раздела изменена для того, чтобы способствовать образованию антитела, где изменение отличается тем, что:

а) СН3-домен одной тяжелой цепи изменен таким образом, что в исходной поверхности раздела СН3-домен одной тяжелой цепи, который встречается с исходной поверхностью раздела СН3-домена другой тяжелой цепи в антителе, аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, который имеет объем боковой цепи, что приводит к образованию выпуклости на поверхности раздела СН3-домена первой тяжелой цепи, которая может помещаться в полость в поверхности раздела СН3-домена другой тяжелой цепи и

б) СН3-домен другой тяжелой цепи изменен таким образом, что в исходной поверхности раздела второго СН3-домена, который встречается с исходной поверхностью раздела первого СН3-домена в антителе, аминокислотный остаток заменен аминокислотным остатком, который имеет меньший объем боковой цепи, что приводит к образованию полости в поверхности раздела второго СН3-домена, в которую может помещаться выпуклость на поверхности раздела первого СН3-домена.

Указанный аминокислотный остаток, имеющий больший объем боковой цепи, необязательно можно выбирать из группы, состоящей из аргинина (R), фенилаланина (F), тирозина (Y), триптофана (W). Указанный аминокислотный остаток, имеющий меньший объем боковой цепи, можно необязательно выбирать из группы, состоящей из аланина (А), серина (S), треонина (Т), валина (V).

Необязательно в некоторых вариантах осуществления изобретения оба СН3-домена дополнительно изменены путем интродукции цистеина (С) в качестве аминокислоты в соответствующих положениях каждого СН3-домена, так, чтобы мог образоваться дисульфидный мостик между обоими СН3-доменами.

Мультиспецифические (например, бипаратопные) антитела, предлагаемые в изобретении, могут содержать аминокислотные замены в Fab-молекулах (включая молекулы cross-Fab), входящих в их состав, которые являются особенно эффективными в отношении снижения ошибочного спаривания легких цепей с несоответствующими им тяжелыми цепями (побочные продукты бенс-джонсовского типа), что может иметь место при получении на основе Fab би-/мультиспецифических антигенсвязывающих молекул с VH/VL-обменом в одном (или в нескольких, в случае молекул, содержащих более двух антигенсвязывающих Fab-молекул) из их связывающих плечей (см. также публикацию РСТ WO 2015/150447, прежде всего представленные в ней примеры, содержание которой в полном объеме включено в настоящее описание в качестве ссылки). Относительное содержание требуемых мультиспецифических антител по сравнению с нежелательными побочными продуктами, прежде всего побочными продуктами бенс-джонсовского типа, встречающимися в одном из их связывающих плечей, можно повышать путем интродукции заряженных аминокислот с противоположными зарядами в специфические аминокислотные положения в СН1- и CL-доменах Fab-молекулы (иногда в контексте настоящего описания обозначают как «модификации зарядов»).

Таким образом, в некоторых вариантах осуществления изобретения антитела, предлагаемые в настоящем изобретении, которые содержат молекулы Fab, содержат по меньшей мере один Fab с константным доменом тяжелой цепи СН1, который содержит модификации зарядов, указанные в настоящем описании, и константный домен легкой цепи CL, который содержит модификации зарядов, указанные в настоящем описании.

Модификации зарядов можно осуществлять либо в канонической(их) Fab-молекуле(ах), которая(ые) содержится(атся) в антителах, предлагаемых в настоящем изобретении, либо в кроссовер-Fab-молекуле(ах), которая(ые) содержится(атся) в антителах, предлагаемых в настоящем изобретении (но не в обеих молекулах). В конкретных вариантах осуществления изобретения модификации зарядов осуществляют либо в канонической(их) Fab- молекуле(ах), которая(ые) содержится(атся) в антителах, предлагаемых в настоящем изобретении.

В некоторых вариантах осуществления изобретения в Fab- или cross-Fab-молекуле, содержащей константный домен легкой цепи CL, который содержит модификации зарядов, и константный домен тяжелой цепи СН1, который содержит модификации зарядов, модификации зарядов в константном домене легкой цепи CL находятся в положении 124 и необязательно в положении 123 (нумерация согласно Кэботу), а модификации зарядов в константном домене тяжелой цепи СН1 находятся в положении 147 и/или 213 (нумерация согласно Кэботу). В некоторых вариантах осуществления изобретения в константном домене легкой цепи CL аминокислота в положении 124 заменена независимо на лизин (K), аргинин (R) или гистидин (Н) (нумерация согласно Кэботу) (в одном предпочтительном варианте осуществления изобретения независимо на лизин (K)), и в константном домене тяжелой цепи СН1 аминокислота в положении 147 и/или аминокислота в положении 213 заменена независимо на глутаминовую кислоту (Е) или аспарагиновую кислоту (D) (нумерация согласно EU-индексу Кэбота).

3. Примеры антител

Объекты и варианты осуществления изобретения, касающиеся связывания мишеней (например, СЕА-связывание, FAP-связывание или GPRC5D-связывание), и объекты и варианты осуществления изобретения, касающиеся связывания DOT А, в некоторых вариантах осуществления изобретения можно объединять. Это означает, что может оказаться предпочтительным, если первое и второе антитело каждое содержит сайт связывания для СЕА, FAP или GPRC5D, например, содержит любую из описанных выше последовательностей, и если первое и второе антитела объединяются с образованием сайта связывания для хелата DOT А, имеющего любую их указанных выше последовательностей. Кроме того, особенно важно, если можно осуществлять объединение объектов и вариантов осуществления изобретения, которые касаются связывания СЕА, FAP или GPRC5D и/или связывания DOT А, с предпочтительными форматами антитела, которые описаны выше т.е. в любых предпочтительных форматах плечо, которое связывается с антигеном-мишенью, может содержать последовательности CDR или вариабельных областей, указанные выше, и/или плечо, которое связывается с меченным радионуклидом соединением, может представлять собой связывающий DOTA компонент, который имеет последовательности CDR и/или вариабельных областей, указанные выше.

В одном конкретном варианте осуществления изобретения первое антитело может содержать:

а) первое полноразмерное антитело, которое специфически связывается с СЕА и состоит из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела; и

б) полипептид, который содержит или состоит из вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH), в котором вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR, имеющие SEQ ID NO: 35-37 (или в котором CDR-H1 имеет последовательность GFSLTDYGVH (SEQ ID NO: 148)), и/или в котором вариабельный домен тяжелой цепи идентичен по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 41;

в котором указанный полипептид слит с помощью N-конца VH-домена, предпочтительно через пептидный линкер, с С-концом одной из двух тяжелых цепей указанного первого полноразмерного антитела.

Первое антитело не содержит домен легкой цепи, который объединяется с полипептидом (б) с образованием функционального связывающего домена для радиоактивномеченного соединения.

Может оказаться предпочтительным, если полипептид (б) содержит дополнительно один или несколько остатков на С-конце VH-домена, например, 1-10 остатков. Необязательно они могут представлять собой один или несколько остатков аланина, необязательно один остаток аланина. В другом варианте осуществления изобретения дополнительные остатки могут представлять собой N-концевой участок CH1-домена, описанный выше, например, 1-10 остатков из N-конца CH1-домена, например, из CH1-домена человеческого IgG1. Например, дополнительные остатки могут представлять собой AST.

В некоторых вариантах осуществления изобретения две тяжелые цепи антитела, указанные в подпункте (а), имеют идентичные вариабельные домены, необязательно идентичные вариабельные домены, СН1- и/или СН2-домены. Они необязательно могут отличаться только их СН3-доменами, например, в результате создания мутаций «knob into hole» и других мутаций, способствующих правильной ассоциации гетеродимеров.

Второе антитело может содержать:

в) второе полноразмерное антитело, которое специфически связывается с СЕА и состоит из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела; и

б) полипептид, который содержит или состоит из вариабельного домена легкой цепи антитела (VL), в котором вариабельный домен легкой цепи содержит CDR, имеющие SEQ ID NO: 38-40, и/или в котором вариабельный домен тяжелой цепи идентичен по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 42;

в котором указанный полипептид слит с помощью N-конца VL-домена, предпочтительно через пептидный линкер, с С-концом одной из двух тяжелых цепей указанного второго полноразмерного антитела, и второе антитело не содержит домен тяжелой цепи, который объединяется с полипептидом (г) с образованием функционального связывающего домена для радиоактивномеченного соединения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения две тяжелые цепи антитела, указанные в подпункте (в), имеют идентичные вариабельные домены, необязательно идентичные вариабельные домены, СН1- и/или СН2-домены. Они необязательно могут отличаться только их СН3-доменами, например, в результате создания мутаций «knob into hole» и других мутаций, способствующих правильной ассоциации гетеродимеров.

СЕА-связывающие центры/последовательности могут представлять собой любые описанные выше СЕА-связывающие центры/последовательности.

В одном конкретном варианте осуществления изобретения первое антитело может иметь СЕА-связывающие последовательности (т.е., CDR или VH/VL-домены) из антитела СН1А1А.

Например, две легкие цепи, указанные в подпункте (а), могут содержать CDR, имеющие SEQ ID NO: 22-24, и/или могут содержать вариабельные домены легких цепей, идентичные по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления изобретения они могут быть идентичны по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 103. В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться предпочтительным, если две легкие цепи, указанные в подпункте (а), идентичны друг другу.

Две тяжелые цепи антитела, указанные в подпункте (а), могут содержать CDR, имеющие SEQ ID NO: 19-21, и/или две тяжелые цепи антитела, указанные в подпункте (а), содержат вариабельные домены тяжелых цепей, идентичные по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 25. В одном из вариантов осуществления изобретения одна тяжелая цепь, указанная в подпункте (а), имеет последовательность SEQ ID NO: 100, а другая имеет последовательность SEQ ID NO: 102.

В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения первое антитело может содержать первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 100, и вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 101 (при этом С-концевая последовательность AST является необязательной и может отсутствовать или может быть заменена другим С-концевым удлинением, указанным в настоящем описании), и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 103.

Второе антитело может иметь также СЕА-связывающие последовательности (т.е., CDR или VH/VL-домены) из антитела СН1А1А.

Например, две легкие цепи, указанные в подпункте (в), могут содержать CDR, имеющие SEQ ID NO: 22-24, и/или могут содержать вариабельные домены легких цепей, идентичные по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления изобретения они могут быть идентичны по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 103. В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться предпочтительным, если две легкие цепи, указанные в подпункте (в), идентичны друг другу. В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться предпочтительным, если две легкие цепи, указанные в подпункте (в), имеют такую же последовательность, что и легкие цепи указанные в подпункте (а), первого антитела, например, если все эти легкие цепи, указанные в подпунктах (а) и (в), имеют одинаковую последовательность.

В некоторых вариантах осуществления изобретения две тяжелые цепи антитела, указанные в подпункте (в), содержат CDR, имеющие SEQ ID NO: 19-21, и/или две тяжелые цепи, указанные в подпункте (в), содержат вариабельный домен, идентичный по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 25. В одном из вариантов осуществления изобретения одна тяжелая цепь, указанная в подпункте (в), имеет последовательность SEQ ID NO: 97, а другая имеет последовательность SEQ ID NO: 99.

В одном конкретном варианте осуществления изобретения второе антитело может содержать первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 97, и вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 98, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 103.

Аналогично этому, объекты и варианты осуществления изобретения, касающиеся связывания мишеней (например, СЕА-связывание, FAP-связывание или GPRCSD-связывание), и объекты и варианты осуществления изобретения, касающиеся связывания Pb-DOTAM, в некоторых вариантах осуществления изобретения можно объединять. Это означает, что может оказаться предпочтительным, если первое и второе антитело каждое содержит сайт связывания для СЕА, FAP или GPRC5D, например, содержит любую из описанных выше последовательностей, и если первое и второе антитела объединяются с образованием сайта связывания для хелата Pb-DOTAM, имеющего любую из указанных выше последовательностей. Кроме того, особенно важно, если можно осуществлять объединение объектов и вариантов осуществления изобретения, которые касаются связывания СЕА, FAP или GPRC5D и/или связывания Pb-DOTAM, с предпочтительными форматами антитела, которые описаны выше т.е. в любых предпочтительных форматах плечо, которое связывается с антигеном-мишенью, может содержать последовательности CDR или вариабельных областей, указанные выше, и/или плечо, которое связывается с меченным радионуклидом соединением, может представлять собой связывающий Pb-DOTAM компонент, который имеет последовательности CDR и/или вариабельных областей, указанные выше.

В одном конкретном варианте осуществления изобретения первое антитело может содержать:

а) первое полноразмерное антитело, которое специфически связывается с СЕА и состоит из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела; и

б) полипептид, который содержит или состоит из вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH), в котором вариабельный домен тяжелой цепи содержит CDR тяжелой цепи, имеющие SEQ ID NO: 1-3, и/или в котором вариабельный домен тяжелой цепи идентичен по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 7;

в котором указанный полипептид слит с помощью N-конца VH-домена, предпочтительно через пептидный линкер, с С-концом одной из двух тяжелых цепей указанного первого полноразмерного антитела.

Первое антитело не содержит домен легкой цепи, который объединяется с полипептидом (б) с образованием функционального связывающего домена для радиоактивномеченного соединения.

Может оказаться предпочтительным, если полипептид (б) содержит дополнительно один или несколько остатков на С-конце VH-домена, необязательно один или несколько остатков аланина, необязательно один остаток аланина. Например, полипептид (б) может содержать или состоять из SEQ ID NO: 7 с С-концевым удлинением аланином, т.е. последовательность (SEQ ID NO: 150).

В другом варианте осуществления изобретения дополнительные остатки могут представлять собой N-концевой участок CH1-домена, описанный выше, например, 1-10 остатков из N-конца CH1-домена, например, из СН1-домена человеческого IgG1. Например, дополнительные остатки могут представлять собой AST.

В некоторых вариантах осуществления изобретения две тяжелые цепи антитела, указанные в подпункте (а), имеют идентичные вариабельные домены, необязательно идентичные вариабельные домены, СН1- и/или СН2-домены. Они необязательно могут отличаться только их СН3-доменами, например, в результате создания мутаций «knob into hole» и других мутаций, способствующих правильной ассоциации гетеродимеров.

Второе антитело может содержать:

в) второе полноразмерное антитело, которое специфически связывается с СЕА и состоит из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела; и

г) полипептид, который содержит или состоит из вариабельного домена легкой цепи антитела (VL), в котором вариабельный домен легкой цепи содержит CDR, имеющие SEQ ID NO: 4-6, и/или в котором вариабельный домен тяжелой цепи идентичен по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 8;

в котором указанный полипептид слит с помощью N-конца VL-домена, предпочтительно через пептидный линкер, с С-концом одной из двух тяжелых цепей указанного второго полноразмерного антитела, и второе антитело не содержит домен тяжелой цепи, который объединяется с полипептидом (г) с образованием функционального связывающего домена для радиоактивномеченного соединения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения две тяжелые цепи антитела, указанные в подпункте (в), имеют идентичные вариабельные домены, необязательно идентичные вариабельные домены, СН1- и/или СН2-домены. Они необязательно могут отличаться только их СН3-доменами, например, в результате создания мутаций «knob into hole» и других мутаций, способствующих правильной ассоциации гетеродимеров.

В конкретном варианте осуществления изобретения первое антитело может иметь СЕА-связывающие последовательности (т.е., CDR или VH/VL-домены) из антитела СН1А1А.

Например, две легкие цепи, указанные в подпункте (а), могут содержать CDR, имеющие SEQ ID NO: 22-24, и/или могут содержать вариабельные домены легких цепей, идентичные по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%о SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления изобретения они могут быть идентичны по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться предпочтительным, если две легкие цепи, указанные в подпункте (а), идентичны друг другу.

Две тяжелые цепи антитела, указанные в подпункте (а), могут содержать CDR, имеющие SEQ ID NO: 19-21, и/или две тяжелые цепи антитела, указанные в подпункте (а), содержат вариабельный домен, идентичный по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 25. В одном из вариантов осуществления изобретения одна тяжелая цепь, указанная в подпункте (а), имеет последовательность SEQ ID NO: 27, а другая имеет последовательность SEQ ID NO: 28.

В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения первое антитело может содержать первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 28, и вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 32 (или ее вариант, содержащий дополнительный С-концевой аланин или другое С-концевое удлинение, указанное в настоящем описании, такое как удлинение с помощью AST), и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 34. Вариант SEQ ID NO: 32 с С-концевым удлинением аланином представлен ниже:

В другом конкретном варианте осуществления изобретения первое антитело может иметь СЕА-связывающие последовательности (т.е, CDR или VH/VL-домены) из антитела А5В7 (включая его гуманизированные версии).

Например, две легкие цепи, указанные в подпункте (а), могут содержать CDR, имеющие SEQ ID NO: 46-48, и/или могут содержать вариабельные домены легких цепей, идентичные по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100%о SEQ ID NO: 50. В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться предпочтительным, если две легкие цепи, указанные в подпункте (а), идентичны друг другу.

В некоторых вариантах осуществления изобретения две тяжелые цепи антитела, указанные в подпункте (а), могут содержать CDR, имеющие SEQ ID NO: 43-45, и/или две тяжелые цепи антитела, указанные в подпункте (а), содержат вариабельный домен, идентичный по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 49. В одном из вариантов осуществления изобретения одна тяжелая цепь, указанная в подпункте (а), имеет последовательность SEQ ID NO: 51, а другая имеет последовательность SEQ ID NO: 53.

В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения первое антитело может содержать первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 51, и вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 52 (или ее вариант, содержащий дополнительный С-концевой аланин или другое С-концевое удлинение, указанное в настоящем описании, такое как удлинение с помощью AST), и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 54.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения первое антитело может иметь СЕА-связывающие последовательности (т.е, CDR или VH/VL-домены) из антитела Т84.66 (включая его гуманизированные версии).

Например, две легкие цепи, указанные в подпункте (а), могут содержать CDR, имеющие SEQ ID NO: 14-16, и/или могут содержать вариабельные домены легких цепей, идентичные по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления изобретения они могут быть идентичны по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 89. В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться предпочтительным, если две легкие цепи, указанные в подпункте (а), идентичны друг другу.

В некоторых вариантах осуществления изобретения две тяжелые цепи антитела, указанные в подпункте (а), могут содержать CDR, имеющие SEQ ID NO: 11-13, и/или две тяжелые цепи антитела, указанные в подпункте (а), содержат вариабельный домен, идентичный по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 17. В одном из вариантов осуществления изобретения одна тяжелая цепь, указанная в подпункте (а), имеет последовательность SEQ ID NO: 86, а другая имеет последовательность SEQ ID NO: 88.

В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения первое антитело может содержать первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 86, и вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 87 (или ее вариант, в котором С-концевой аланин отсутствует или заменен на другое С-концевое удлинение, указанное в настоящем описании), и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 89.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения первое антитело может иметь СЕА-связывающие последовательности (т.е, CDR или VH/VL-домены) из антитела 28А9 (включая его гуманизированные версии).

Например, две легкие цепи, указанные в подпункте (а), могут содержать CDR, имеющие SEQ ID NO: 62-64, и/или могут содержать вариабельные домены легких цепей, идентичные по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 66. В некоторых вариантах осуществления изобретения они могут быть идентичны по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 96. В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться предпочтительным, если две легкие цепи, указанные в подпункте (а), идентичны друг другу.

В некоторых вариантах осуществления изобретения две тяжелые цепи антитела, указанные в подпункте (а), могут содержать CDR, имеющие SEQ ID NO: 59-61, и/или две тяжелые цепи антитела, указанные в подпункте (а), содержат вариабельный домен, идентичный по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 65. В одном из вариантов осуществления изобретения одна тяжелая цепь, указанная в подпункте (а), имеет последовательность SEQ ID NO: 93, а другая имеет последовательность SEQ ID NO: 95.

В одном из конкретных вариантов осуществления изобретения первое антитело может содержать первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 93, и вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 94 (или ее вариант, в котором С-концевой аланин отсутствует или заменен на другое С-концевое удлинение, указанное в настоящем описании), и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 96.

В некоторых вариантах осуществления изобретения второе антитело может иметь СЕА-связывающие последовательности (т.е, CDR или VH/VL-домены) из антитела СН1А1А.

Например, две легкие цепи, указанные в подпункте (в), могут содержать CDR, имеющие SEQ ID NO: 22-24, и/или могут содержать вариабельные домены легких цепей, идентичные по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 26. В некоторых вариантах осуществления изобретения они могут быть идентичны по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID SEQ ID NO: 34. В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться предпочтительным, если две легкие цепи, указанные в подпункте (в), идентичны друг другу. В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться предпочтительным, если две легкие цепи, указанные в подпункте (в), имеют такую же последовательность, что и легкие цепи первого антитела, указанные в подпункте (а), например, если все легкие цепи, указанные в подпунктах (а) и (в), имеют одинаковую последовательность.

В некоторых вариантах осуществления изобретения две тяжелые цепи антитела, указанные в подпункте (в), содержат CDR, имеющие SEQ ID NO: 19-21, и/или две тяжелые цепи антитела, указанные в подпункте (в), содержат вариабельный домен, идентичный по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 25. В одном из вариантов осуществления изобретения одна тяжелая цепь, указанная в подпункте (в), имеет последовательность SEQ ID NO: 29, а другая имеет последовательность SEQ ID NO: 30.

В одном конкретном варианте осуществления изобретения второе антитело может содержать первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 30, и вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 33, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 34.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения второе антитело может иметь СЕА-связывающие последовательности (т.е, CDR или VH/VL-домены) из А5В7 (включая его гуманизированные версии).

Например, две легкие цепи, указанные в подпункте (в), могут содержать CDR, имеющие SEQ ID NO: 46-48, и/или могут содержать вариабельные домены легких цепей, идентичные по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 50. В некоторых вариантах осуществления изобретения они могут быть идентичны по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID SEQ ID NO: 58. В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться предпочтительным, если две легкие цепи, указанные в подпункте (в), идентичны друг другу. В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться предпочтительным, если две легкие цепи, указанные в подпункте (в), имеют такую же последовательность, что и легкие цепи первого антитела, указанные в подпункте (а), например, если все легкие цепи, указанные в подпунктах (а) и (в), имеют одинаковую последовательность.

В некоторых вариантах осуществления изобретения две тяжелые цепи антитела, указанные в подпункте (в), содержат CDR, имеющие SEQ ID NO: 43-45, и/или две тяжелые цепи антитела, указанные в подпункте (в), содержат вариабельный домен, идентичный по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 49. В одном из вариантов осуществления изобретения одна тяжелая цепь, указанная в подпункте (в), имеет последовательность SEQ ID NO: 55, а другая имеет последовательность SEQ ID NO: 57.

В одном конкретном варианте осуществления изобретения второе антитело может содержать первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 55, и вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 56, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 58.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения второе антитело может иметь СЕА-связывающие последовательности (т.е. CDR или VH/VL-домены) из антитела Т84.66 (включая его гуманизированные версии).

Например, две легкие цепи, указанные в подпункте (в), могут содержать CDR, имеющие SEQ ID NO: 14-16, и/или могут содержать вариабельные домены легких цепей, идентичные по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 18. В некоторых вариантах осуществления изобретения они могут быть идентичны по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID SEQ ID NO: 89. В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться предпочтительным, если две легкие цепи, указанные в подпункте (в), идентичны друг другу.

В некоторых вариантах осуществления изобретения две тяжелые цепи антитела, указанные в подпункте (в), могут содержать CDR, имеющие SEQ ID NO: 11-13, и/или две тяжелые цепи антитела, указанные в подпункте (в), содержат вариабельный домен, идентичный по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 17. В одном из вариантов осуществления изобретения одна тяжелая цепь, указанная в подпункте (в), имеет последовательность SEQ ID NO: 83, а другая имеет последовательность SEQ ID NO: 85.

В одном конкретном варианте осуществления изобретения второе антитело может содержать первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 83, и вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 84, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 89.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения второе антитело может иметь СЕА-связывающие последовательности (т.е. CDR или VH/VL-домены) из антитела 28А9 (включая его гуманизированные версии).

Например, две легкие цепи, указанные в подпункте (в), могут содержать CDR, имеющие SEQ ID NO: 62-64, и/или могут содержать вариабельные домены легких цепей, идентичные по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 66. В некоторых вариантах осуществления изобретения они могут быть идентичны по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID SEQ ID NO: 96. В некоторых вариантах осуществления изобретения может оказаться предпочтительным, если две легкие цепи, указанные в подпункте (в), идентичны друг другу.

В некоторых вариантах осуществления изобретения две тяжелые цепи антитела, указанные в подпункте (в), могут содержать CDR, имеющие SEQ ID NO: 59-61, и/или две тяжелые цепи антитела, указанные в подпункте (в), содержат вариабельный домен, идентичный по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% SEQ ID NO: 65. В одном из вариантов осуществления изобретения одна тяжелая цепь, указанная в подпункте (в), имеет последовательность SEQ ID NO: 90, а другая имеет последовательность SEQ ID NO: 92.

В одном конкретном варианте осуществления изобретения второе антитело может содержать первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 90, и вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 91, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 96.

В некоторых вариантах осуществления изобретения первое и второе антитела связываются с одним и тем же эпитопом СЕА. Так, например, первое и второе антитела оба могут иметь СЕА-связывающие последовательности из антитела СН1А1А; или первое и второе антитела оба могут иметь СЕА-связывающие последовательности из А5В7 (включая его гуманизированные версии); или первое и второе антитела оба могут иметь СЕА-связывающие последовательности из Т84.66 (включая его гуманизированные версии); или первое и второе антитела оба могут иметь СЕА-связывающие последовательности из 28А9 (включая его гуманизированные версии); или первое и второе антитела оба могут иметь СЕА-связывающие последовательности из антитела MFE23 (включая его гуманизированные версии).

Так, например:

I) первое антитело может содержать первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 28, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 32 (необязательно с С-концевым удлинением, указанным в настоящем описании, например, AST), и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 34; а второе антитело может содержать первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 30, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 33, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 34;

II) первое антитело может содержать первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 51, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 52 (необязательно с С-концевым удлинением, указанным в настоящем описании, например, AST), и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 54; а второе антитело может содержать первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 55, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 56, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 58;

III) первое антитело может содержать первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 86, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 87 (в которой С-концевые остатки AST являются необязательными и могут отсутствовать или быть заменены альтернативным С-концевым удлинением), и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 89; а второе антитело может содержать первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 83, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 84, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 89; или

IV) первое антитело может содержать первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 93, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 94 (в которой С-концевые остатки AST являются необязательными и могут отсутствовать или быть заменены альтернативным С-концевым удлинением), и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 96; а второе антитело может содержать первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 90, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 91, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 96.

В других вариантах осуществления изобретения первое и второе антитела связываются с различными эпитопами СЕА, обсуждение которых представлено выше. Так, например, первое антитело может иметь СЕА-связывающие последовательности из антитела CH1A1A, а второе антитело может иметь СЕА-связывающие последовательности из антитела А5В7; или первое антитело может иметь СЕА-связывающие последовательности из антитела А5В7, а второе антитело может иметь СЕА-связывающие последовательности из антитела СН1А1А. Пример применения бипаратопных (СН1А1А и А5В7) пар описан в примере 6в.

В других конкретных вариантах осуществления изобретения антиген-мишень может представлять собой GPRC5D или FAP, и формат может соответствовать описанному на фиг. 25Б. Необязательно первое и второе антитела объединяются с образованием функционального антигенсвязывающего центра для хелата Pb-DOTAM (Pb-DOTAM).

Так, в одном из вариантов осуществления изобретения (в котором антиген-мишень представляет собой GPRC5D):

I) первое антитело содержит первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 104, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 106 (в которой С-концевой аланин является необязательным и может отсутствовать или быть заменен альтернативным С-концевым удлинением, указанным в настоящем описании), и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 107; и

II) второе антитело содержит первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 104, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 105, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 107.

В другом варианте осуществления изобретения (в котором антиген-мишень представляет собой FAP):

I) первое антитело содержит первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 108, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 110 (в которой С-концевой аланин является необязательным и может отсутствовать или быть заменен альтернативным С-концевым удлинением, указанным в настоящем описании), и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 111; и

II) второе антитело содержит первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 108, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 109, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 111.

В следующих вариантах осуществления изобретения мишень может представлять собой СЕА, например, антитело может иметь СЕА-связывающие последовательности из антитела CH1A1A, и его формат может соответствовать описанному на фиг. 25В. Необязательно первое и второе антитела объединяются с образованием функционального антигенсвязывающего центра для хелата Pb-DOTAM (Pb-DOTAM). Таким в одном из конкретных вариантов осуществления изобретения:

I) первое антитело содержит первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 112, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 114, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 115; и

II) второе антитело содержит первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 112, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 113, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 115.

И. Варианты антител

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к вариантам аминокислотных последовательностей антител, представленных в настоящем описании. Например, может требоваться повышать аффинность связывания и/или другие биологические свойства антитела. Варианты аминокислотной последовательности антитела можно получать путем интродукции соответствующих модификаций в нуклеотидную последовательность, кодирующую антитело, или путем синтеза пептидов. Указанные модификации включают, например, делеции и/или инсерции, и/или замены остатков в аминокислотных последовательностях антитела. Для получения конечной конструкции можно использовать любую комбинацию делеций, инсерций и замен, при условии, что конечная конструкция обладает требуемыми характеристиками, например, способностью связываться с антигеном.

Полученные путем замены, инсерции и делеции варианты

Некоторыми вариантами осуществления изобретения являются варианты антител, которые имеют одну или несколько аминокислотных замен. Сайты, представляющие интерес для замещающего мутагенеза, включают HVR (CDR) и FR. Консервативные замены представлены ниже в таблице 1 под заголовком «предпочтительные замены». Более значимые замены представлены ниже в таблице 1 под заголовком «приведенные в качестве примера замены», и они описаны ниже со ссылкой на классы боковых цепей аминокислот. Аминокислотные замены можно интродуцировать в представляющее интерес антитело и продукты подвергать скринингу в отношении требуемой активности, например, сохранения/повышения способности к связыванию антигена, пониженной иммуногенности или пониженной или элиминированной ADCC или CDC.

Аминокислоты можно группировать на основе общих свойств боковых цепей следующим образом:

(1) гидрофобные: норлейцин, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) нейтральные гидрофильные: Cys, Ser, Thr, Asn, Gin;

(3) кислотные: Asp, Glu;

(4) основные: His, Lys, Arg;

(5) остатки, которые влияют на ориентацию цепи: Gly, Pro;

(6) ароматические: Trp, Tyr, Phe. Под неконсервативными заменами подразумевают замену представителя одного из указанных классов на представителя из другого класса.

Один из типов полученного в результате замены варианта включает замену одного или нескольких остатков гипервариабельного участка родительского антитела (например, гуманизированного или человеческого антитела). Как правило, полученный(ые) в результате вариант(ы), отобранный(ые) для дополнительного исследования, должен(ы) иметь модификации (например, улучшения) некоторых биологических свойств (например, повышенную аффинность, пониженную иммуногенность) относительно родительского антитела, и/или должен(ы) иметь практически сохраненные определенные биологические свойства родительского антитела. Примером полученного в результате замены варианта является антитело с созревшей аффинностью, которое можно создавать, например, с использованием технологий созревания аффинности на основе фагового дисплея, например, указанных в настоящем описании. В целом, метод состоит в следующем: один или несколько остатков CDR подвергают мутации и варианты антител экспонируют на фаге и подвергают скринингу в отношении конкретной биологической активности (например, аффинности связывания).

Изменения (например, замены) можно осуществлять в CDR, например, для повышения аффинности антитела. Указанные изменения можно делать в «горячих (активных) точках» в CDR, т.е. остатках, кодируемых кодонами, которые с высокой частотой подвергаются мутации в процессе соматического созревания (см., например, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207, 2008, cc. 179-196), и/или в остатках, которые контактируют с антигеном, с последующим тестированием варианта VH или VL в отношении аффинности связывания. Созревание аффинности путем создания и повторной селекции из вторичных библиотек описано, например, у Hoogenboom и др. в: Methods in Molecular Biology 178, 2002, cc. 1-37 (под ред. O'Brien и др., изд-во Human Press, Totowa, NJ, 2001). В некоторых вариантах осуществления процесса созревания аффинности интродуцируют разнообразие в гены вариабельной области, выбранные для созревания, с помощью любого из широкого разнообразия методов (например, ПЦР пониженной точности, перестановка цепи или сайтнаправленный мутагенез с использованием олигонуклеотидов). Затем создают вторичную библиотеку. Далее библиотеку подвергают скринингу для идентификации любых вариантов антител с требуемой аффинностью. Другой метод, применяемый для интродукции разнообразия, включает подходы, мишенью которых является CDR, при которых рандомизируют несколько остатков CDR (например, одновременно 4-6 остатков). Остатки CDR, участвующие в связывании антигена, можно специфически идентифицировать, например, используя аланин-сканирующий мутагенез или моделирование. Часто мишенями являются, прежде всего CDR-H3 и CDR-L3.

В некоторых вариантах осуществления изобретения замены, инсерции или делеции могут затрагивать один или несколько CDR, если указанные изменения не снижают существенно способность антитела связываться с антигеном. Например, в CDR могут быть сделаны консервативные изменения (например, консервативные замены, указанные в настоящем описании), которые не снижают существенно аффинность связывания. Указанные изменения, например, могут находиться вне принимающих участие в контактировании с антигеном остатков в CDR. В некоторых вариантах осуществления изобретения в последовательностях вариантов VH и VL, указанных выше, каждый CDR либо является неизмененным, либо содержит не более одной, двух или трех аминокислотных замен.

Ценным методом идентификации остатков или областей антитела, которые можно подвергать мутагенезу, является так называемый «аланин-сканирующий мутагенез», описанный у Cunningham и Wells, Science 244, 1989, cc. 1081-1085. При осуществлении этого метода остаток или группу остатков-мишеней (например, заряженные остатки, такие как arg, asp, his, lys и glu) идентифицируют и заменяют на нейтральную или отрицательно заряженную аминокислоту (например, аланин или полиаланин) для решения вопроса о том, будет ли это влиять на взаимодействие антитела с антигеном. Дополнительные замены можно интродуцировать в те положения аминокислот, для которых продемонстрирована функциональная чувствительность к начальным заменам. В альтернативном или дополнительном варианте можно анализировать кристаллическую структуру комплекса антиген-антитело для идентификации точек контакта между антителом и антигеном. Указанные контактирующие остатки и соседние остатки можно рассматривать в качестве мишеней или исключать из рассмотрения в качестве кандидатов для замены. Варианты можно подвергать скринингу для решения вопроса о том, обладают ли они требуемыми свойствами.

Инсерции в аминокислотные последовательности включают амино- и/или карбоксиконцевые слияния, варьирующие по длине от одного остатка до полипептидов, содержащих сто или большее количество остатков, а также инсерции одного или нескольких аминокислотных остатков внутрь последовательности. Примером результата осуществления концевых инсерции является антитело с N-концевым метионильным остатком. Другие инсерционные варианты молекул антител включают слияние N- или С-концов антитела с ферментом (например, для ADEPT (антитело-направляемый фермент пролекарственной терапии) или полипептидом, который удлиняет время полужизни антитела в сыворотке.

Варианты гликозилирования

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, представленное в настоящем описании, изменяют с целью повышения или снижения степени гликозилирования антитела. Добавление или делецию сайтов гликозилирования в антителе можно легко осуществлять путем такого изменения аминокислотной последовательности, которое позволяет создавать или удалять один или несколько сайтов гликозилирования.

Если антитело содержит Fc-область, то можно изменять присоединенный к ней углевод. Нативные антитела, которые продуцируются клетками млекопитающих, как правило, содержат разветвленный биантенный олигосахарид, который, как правило, присоединен с помощью N-связи к Asn297 СН2-домена Fc-области (см., например, Wright и др., TIBTECH 15, 1997, сс. 26-32). Олигосахарид может включать различные углеводы, например, маннозу, N-ацетилглюкозамин (GlcNAc), галактозу и сиаловую кислоту, а также фукозу, присоединенную к GlcNAc в «стебле» биантенной олигосахаридной структуры. В некоторых объектах изобретения модификации олигосахарида в антителе, предлагаемом в изобретении, можно осуществлять для создания вариантов антитела с определенными улучшенными свойствами.

Одним из объектов изобретения являются варианты антитела, имеющие нефукозилированный олигосахарид, т.е. имеющие олигосахаридную структуру, в которой отсутствует фукоза, присоединенная (прямо или косвенно) к Fc-области. Указанный нефукозилированный олигосахарид (который обозначают также как «афукозилированный» олигосахарид), прежде всего представляет собой N-сцепленный олигосахарид, в котором отсутствует остаток фукозы, присоединенный к первому GlcNAc в «стебле» биантенной олигосахаридной структуры. Одним из объектов изобретения являются варианты антител, имеющие повышенную долю нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области по сравнению с нативным или родительским антителом. Например, доля нефукозилированных олигосахаридов может составлять по меньшей мере примерно 20%, по меньшей мере примерно 40%, по меньшей мере примерно 60%, по меньшей мере примерно 80% или даже примерно 100% (т.е. отсутствие фукозилированных олигосахаридов). Процент нефукозилированных олисахаридов представляет собой (среднее) количество олигосахаридов, лишенных остатков фукозы, относительно суммы всех олигосахаридов, присоединенных к Asn297 (например, комплексных, гибридных структур и структур с высоким содержанием маннозы), которое измеряют с помощью MALDI-TOF-масс-спектрометрии согласно методу, описанному, например, в WO 2008/077546. Asn297 обозначает остаток аспарагина, локализованный примерно в положении 297 в Fc-области (EU-нумерация остатков Fc-области); однако вследствие минорных вариаций последовательности антитела Asn297 может располагаться также примерно на ±3 аминокислоты в прямом или обратном направлении относительно положения 297, т.е. между положениями 294 и 300. Указанные антитела, имеющие повышенную долю нефукозилированных олигосахаридов в Fc-области, могут обладать повышенной способностью связываться с FcγRIIIa-рецептором и/или повышенной эффекторной функцией, прежде всего повышенной ADCC-функцией (см., например, US 2003/0157108; US 2004/0093621).

Примерами клеточных линий, которые обладают способностью продуцировать антитела с пониженным фукозилированием, являются СНО-клетки Lecl3 с дефицитом белкового фукозилированиея (Ripka и др., Arch. Biochem. Biophys. 249, 1986, сс. 533-545; US 2003/0157108 и WO 2004/056312, см., прежде всего, пример 11), и клеточные линии с «выключенным» геном, например, СНО-клетки с «выключенным» геном альфа-1,6-фукозилтрансферазы, FUT8 (см., например, Yamane-Ohnuki и др., Biotech. Bioeng. 87, 2004, с. 614-622); Kanda Y. и др., Biotechnol. Bioeng., 94(4), 2006, сс. 680-688; и WO 2003/085107), или клетки с пониженной или аннулированной активностью синтеза GDP-фукозы или белка-транспортера (см., например, US 2004/259150, US 2005/031613, US 2004/132140, US 2004/110282).

Следующим объектом изобретения являются варианты антител с бисекционными олигосахаридами, например, в которых биантенный олигосахарид, присоединенный к Fc-области антитела, бисекционнируется с помощью GlcNAc. Указанные варианты антител могут отличаться пониженным фукозилированием и/или повышенной ADCC-функцией, что описано выше. Примеры указанных вариантов антител описаны, например, у Umana и др., Nat Biotechnol 17, 1999, сс. 176-180; Ferrara и др., Biotechn Bioeng 93, 2006, сс. 851-861; WO 99/54342; WO 2004/065540, WO 2003/011878.

Предложены также варианты антител по меньшей мере с одним остатком галактозы в олигосахариде, присоединенном к Fc-области. Указанные варианты антител могут обладать повышенной CDC-функцией. Указанные варианты антител описаны, например, в WO 1997/30087; WO 1998/58964 и WO 1999/22764.

Может оказаться предпочтительным модифицировать антитело для снижения степени гликозилирования. В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело может быть агликозилированным или дегликозилированным. Антитело может иметь замену N297, например, N297D/A.

Варианты Fc-области

Согласно конкретным вариантам осуществления изобретения можно интродуцировать в Fc-область антитела, представленного в настоящем описании, одну или несколько аминокислотных модификаций, создавая тем самым вариант Fc-области. Вариант Fc-области может содержать последовательность человеческой Fc-области (например, Fc-области человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4), включающую аминокислотную модификацию (например, замену) в одном или нескольких аминокислотных положениях.

Некоторые варианты осуществления изобретения относятся к варианту антитела, который обладает пониженный эффекторной функцией, например, пониженной или элиминированной CDC, ADCC и/или FcγR-связывающей активностью. В некоторых объектах изобретения предложен вариант антитела, который обладает некоторыми, но не всеми эффекторными функциями, что делает его перспективным кандидатом для путей применения, для которых является важным время полужизни антитела in vivo, однако некоторые эффекторные функции (такие как комплементзависимая цитотоксичность (CDC) и антитело-обусловленная клеточнозависимая цитотоксичность (ADCC)) не являются необходимыми или являются вредными.

Можно осуществлять анализы цитотоксичности in vitro и/или in vivo для подтверждения снижения/истощения CDC- и/или ADCC-активности. Например, можно осуществлять анализы связывания Fc-рецептора (FcR) для подтверждения того, что у антитела отсутствует способность к связыванию с FcγR (и поэтому, вероятно, отсутствует ADCC-активность), но сохраняется способность связывать FcRn. Первичные клетки, опосредующие ADCC, т.е. NK-клетки, экспрессируют только FcγRIII, в то время как моноциты экспрессируют FcγRI, FcγRII и FcγRIII. Данные об экспрессии FcR на гематопоэтических клетках обобщены в таблице 3 на с. 464 у Ravetch и Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9, 1991, cc. 457-492. Примерами анализов in vitro ADCC-активности представляющей интерес молекулы являются (но не ограничиваясь только ими) анализы, описанные в патенте США №5500362 (см., например, Hellstrom I. и др., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83, 1986, cc. 7059-7063 и Hellstrom I. и др., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82, 1985, cc. 1499-1502); US №5821337 (см. Bruggemann M. и др., J. Exp.Med. 166, 1987, cc. 1351-1361). В альтернативном варианте можно применять нерадиоактивные методы анализа (см., например, нерадиоактивный анализ цитотоксичности АСТ1™ на основе проточной цитометрии (фирма CellTechnology, Inc. Маунтин-Вью, шт. Калифорния); и нерадиоактивный анализ цитотоксичности CytoTox 96^® (фирма Promega, Мэдисон, шт. Висконсин). Пригодными для таких анализов эффекторными клетками являются мононуклеарные клетки периферической крови (РВМС) и естественные клетки-киллеры (NK). В альтернативном или дополнительном варианте ADCC-активность представляющей интерес молекулы можно оценивать in vivo, например, на животной модели, например, как описано у Clynes и др., Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 95, 1998, cc. 652-656. Можно осуществлять также анализы связывания C1q для подтверждения того, что антитело не может связываться с C1q и поэтому не обладает CDC-активностью (см., например, описание ELISA для оценки связывания C1q и С3с в WO 2006/029879 и WO 2005/100402). Для оценки активации комплемента можно осуществлять анализ CDC (см., например, Gazzano-Santoro и др., J. Immunol. Methods 202, 1996, cc. 163-171; Cragg M.S. и M.J. Glennie, Blood 101, 2003, cc. 1045-1052; и Cragg, Blood 103, 2004, cc. 2738-2743). Определение FcRn-связывания и клиренса/времени полужизни in vivo можно осуществлять также с использованием методов, известных в данной области (см., например, Petkova S.B. и др., Int'l. Immunol. 18(12), 2006, cc. 1759-1769); WO 2013/120929 Al).

Антитела с пониженной эффекторной функцией включают антитела с заменой одного или нескольких следующих остатков Fc-области, таких как 238, 265, 269, 270, 297, 327 и 329 (см., например, патент США №6737056), например, P329G. К указанным мутантам Fc относятся мутанты Fc с заменами в двух или большем количестве из следующих аминокислотных положений: 265, 269, 270, 297 и 327, включая так называемый мутант «DANA» Fc-области, несущий замену остатков 265 и 297 на аланин (патент США №7332581).

В некоторых объектах изобретения вариант антитела содержит Fc-область с одной или несколькими аминокислотными заменами, которые уменьшают FcγR-связывание, например, замены в положениях 234 и 235 Fc-области (EU-нумерация остатков). В одном из объектов изобретения замены апредставляют собой L234A и L235A (LALA). В некоторых объектах изобретения вариант антитела дополнительно содержит D265A и/или P329G в Fc-области, имеющей происхождение из Fc-области человеческого IgG1. В одном из объектов изобретения замены представляют собой L234A, L235A и P329G (LALA-PG) в Fc-области, имеющей происхождение из Fc-области человеческого IgG1 (см., например, WO 2012/130831). В другом объекте изобретения замены представляют собой L234A, L235A и D265A (LALA-DA) в Fc-области, имеющей происхождение из Fc-области человеческого IgG1.

В других вариантах осуществления изобретения может оказаться возможным применять подтип IgG с пониженной эффекторной функцией, такой как IgG4 или IgG2.

Описаны некоторые варианты антител с повышенной или пониженной способностью связываться с FcR (см., например, патент США №6737056; WO 2004/056312 и Shields и др., J. Biol. Chem. 276, 2001, сс. 6591-6604).

В некоторых вариантах осуществления изобретения в Fc-области осуществляют изменения, которые приводят к измененной (т.е. либо повышенной, либо пониженной, предпочтительно пониженной) C1q-связывающей активности и/или комплементзависимой цитотоксичности (CDC), например, как описано в патенте США №6194551, WO 99/51642 и у Idusogie и др., J. Immunol. 164, 2000, сс. 4178-4184.

В некоторых объектах изобретения вариант антитела содержит Fc-область с одной или несколькими аминокислотными заменами, которые снижают FcRn-связывание, например, замены в положениях 253 и/или 310, и/или 435 Fc-области (EU-нумерация остатков). В некоторых объектах изобретения вариант антитела содержит Fc-область с аминокислотными заменами в положениях 253, 310 и 435. В одном из объектов изобретения замены представляют собой 1253А, Н310А и Н435А в Fc-области, имеющей происхождение из Fc-области человеческого IgG1 (см., например, Grevys А., и др., J. Immunol. 194, 2015, сс. 5497-5508).

В некоторых объектах изобретения вариант антитела содержит Fc-область с одной или несколькими аминокислотными заменами, которые понижают FcRn-связывание, например, замены в положениях 310 и/или 433, и/или 436 Fc-области (EU-нумерация остатков). В некоторых объектах изобретения вариант антитела содержит Fc-область с аминокислотными заменами в положениях 310, 433 и 436. В одном из объектов изобретения замены представляют собой Н310А, Н433А и Y436A в Fc-области, имеющей происхождение из Fc-области человеческого IgG1 (см., например, WO 2014/177460 А1). Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения можно применять обычное связывание FcRn.

Дополнительные примеры, касающиеся других вариантов Fc-области, описаны также у Duncan и Winter, Nature 322, 1988, сс. 738-740; в патенте США №5648260; патенте США №5624821 и в WO 1994/29351.

С-конец тяжелой цепи полноразмерного антитела, указанного в настоящем описании, может представлять собой полный С-конец, заканчивающийся аминокислотными остатками PGK. С-конец тяжелой цепи может представлять собой укороченный С-конец, из которого удалены один или два С-концевых аминокислотных остатка. В одном из предпочтительных объектов изобретения С-конец тяжелой цепи представляет собой укороченный С-конец, заканчивающийся PG. В одном из варианте всех объектов изобретения, указанных в настоящем описании, антитело, которое содержит тяжелую цепь, включающую С-концевой СН3-домен, указанный в настоящем описании, содержит С-концевой остаток глицина (G446, нумерация аминокислотных положений согласно EU-индексу). Этот вариант все еще строго подпадает под понятие «полноразмерное антитело» или «полноразмерная тяжелая цепь», которое применяют в контексте настоящего описания.

Производные антител

В некоторых объектах изобретения антитело, представленное в настоящем описании, можно дополнительно модифицировать таким образом, чтобы оно содержало известные в данной области и легко доступные дополнительные небелковые фрагменты. Фрагменты, пригодные для дериватизации антитела, включают (но не ограничиваясь только ими) водорастворимые полимеры. Примерами водорастворимых полимеров являются (но не ограничиваясь только ими) полиэтиленгликоль (ПЭГ), сополимеры этиленгликоля/пропиленгликоля, карбоксиметилцеллюлоза, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксан, сополимер этилена/малеинового ангидрида, полиаминокислоты (либо гомополимеры, либо статистические сополимеры) и декстран- или поли(н-винилпиролидон)полиэтиленгликоль, гомополимеры пропиленгликоля, сополимеры пропиленоксида/этиленоксида, полиоксиэтилированные полиолы (например, глицерин), поливиниловый спирт и их смеси. Полиэтиленгликольпропиональдегид может иметь преимущество при производстве благодаря его стабильности в воде. Полимер может иметь любую молекулярную массу и может быть разветвленным или неразветвленным. Количество полимеров, присоединенных к антителу, может варьироваться и, если присоединено более одного полимера, то они могут представлять собой одинаковые или различные молекулы. В целом, количество и/или тип полимеров, применяемых для дериватизации, можно определять с учетом таких особенностей (но не ограничиваясь только ими), как конкретные свойства или функции антитела, подлежащие усовершенствованию, предполагается ли применение производного антитела в терапии в определенных условиях и т.д.

К. Методы рекомбинации и композиции

Антитела можно получать, используя методы рекомбинации и композиции, например, описанные в патенте США №4816567. Одним из вариантов осуществления изобретения является выделенная нуклеиновая кислота или набор выделенных нуклеиновых кислот, кодирующих набор антител, указанных в настоящем описании.

Например, набор нуклеиновых кислот может содержать следующие нуклеиновые кислоты, которые кодируют первое антитело:

I) нуклеиновую кислоту, кодирующую первую тяжелую цепь первого антитела, в котором указанная первая тяжелая цепь содержит тяжелую цепь полноразмерного антитела, специфически связывающего антиген-мишень, слитую через ее С-конец с полипептидом, содержащим VH-домен антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения;

II) нуклеиновую кислоту, кодирующую вторую тяжелую цепь первого антитела, в котором указанная вторая тяжелая цепь содержит тяжелую цепь полноразмерного антитела, специфически связывающего антиген-мишень, и не содержит VL-домен антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения (необязательно вторая тяжелая цепь состоит из тяжелой цепи полноразмерного антитела, специфически связывающего антиген-мишень);

III) нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь первого антитела.

В дополнительном или альтернативном варианте набор нуклеиновых кислот, предлагаемый в изобретении, может содержать следующие нуклеиновые кислоты, которые кодируют второе антитело:

IV) нуклеиновую кислоту, кодирующую первую тяжелую цепь второго антитела, в котором первая тяжелая цепь содержит тяжелую цепь полноразмерного антитела, специфически связывающего антиген-мишень, слитую через ее С-конец с полипептидом, содержащим VL-домен антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения;

V) нуклеиновую кислоту, кодирующую вторую тяжелую цепь второго антитела, в котором вторая тяжелая цепь содержит тяжелую цепь полноразмерного антитела, специфически связывающего антиген-мишень, и не содержит VH-домен антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения (необязательно вторая тяжелая цепь состоит из тяжелой цепи полноразмерного антитела, специфически связывающего антиген-мишень);

VI) нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь второго антитела.

В некоторых вариантах осуществления изобретения некоторые из указанных нуклеиновых кислот могут быть одинаковыми. Например, нуклеиновая кислота, указанная в подпункте (III), может быть такой же, что и указанная в подпункте (VI), в результате чего полный набор содержит только 5 различных нуклеотидных последовательностей.

Нуклеиновые кислоты могут содержаться в одной или нескольких молекулах нуклеиновых кислот или в одном или нескольких экспрессионных векторах. Таким образом, следующим вариантом осуществления изобретения является(ются) один или несколько векторов (например, экспрессионных векторов), содержащий(их) указанную(ые) нуклеиновую(ые) кислоту(ы). В одном из вариантов осуществления изобретения каждая соответствующая тяжелая и легкая цепь экспрессируется в индивидуальной плазмиде.

Другим вариантом осуществления изобретения является клетка-хозяин или набор клеток-хозяев, содержащая(их) указанную(ые) нуклеиновую(ые) кислоту(ы) или вектор(ы). Одном из вариантов осуществления изобретения является первая клетка-хозяин, экспрессирующая первое антитело, и вторая клетка-хозяин, экспрессирующая второе антитело.

В одном из указанных вариантов осуществления изобретения первая клетка-хозяин содержит (например, в результате трансформации указанными векторами): (1) вектор, содержащий нуклеиновые кислоты, указанные выше в подпунктах (I)-(III), или (2) первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, указанную в подпункте (I), второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, указанную в подпункте (II), и третий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, указанную в подпункте (III); или (3) два вектора, которые в совокупности содержат нуклеиновые кислоты, указанные выше в подпунктах (I)-(III). Вторая клетка-хозяин содержит (например, в результате трансформации указанными векторами): (1) вектор, содержащий нуклеиновые кислоты, указанные выше в подпунктах (IV)-(VI), или (2) первый вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, указанную в подпункте (IV), второй вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, указанную в подпункте (V), и третий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, указанную в подпункте (VI) или (3) два вектора, которые в совокупности содержат нуклеиновые кислоты, указанные выше в подпунктах (IV)-(VI). В одном из вариантов осуществления изобретения клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, например, клетку яичника китайского хомячка (СНО) или лимфоидную клетку (например, Y0-, NS0-, Sp20-клетку). Одним из вариантов осуществления изобретения является способ получения антитела, предлагаемого в изобретении, включающий культивирование клетки-хозяина, содержащей нуклеиновую кислоту, которая кодирует антитело, описанное выше, в условиях, пригодных для экспрессии антитела, и необязательно выделение антитела из клетки-хозяина (или среды для культивирования клетки-хозяина).

Для рекомбинантного получения антитела нуклеиновую кислоту, кодирующую антитело, например, описанную выше, выделяют и встраивают в один или несколько векторов для дальнейшего клонирования и/или экспрессии в клетке-хозяине. Указанную нуклеиновую кислоту легко можно выделять и секвенировать с помощью общепринятых процедур (например, путем использования олигонуклеотидных зондов, которые обладают способностью специфически связываться с генами, кодирующими тяжелые и легкие цепи антитела).

Приемлемые клетки-хозяева для клонирования или экспрессии кодирующих антитело векторов включают прокариотические или эукариотические клетки, представленные в настоящем описании. Например, антитела можно получать в бактериях, в частности, когда не требуется гликозилирование и связанная с Fc эффекторная функция. Сведения об экспрессии фрагментов антитела и полипептидов в бактериях см. например, в US №№5648237, 5789199 и 5840523 (см. также у Charlton в: Methods in Molecular Biology, под ред. Lo В.K.С., изд-во Humana Press, Totowa, NJ, т. 248, 2003, cc. 245-254 описание экспрессии фрагментов антител в Е. coli.) После экспрессии антитело можно выделять из пасты бактериальных клеток в виде растворимой фракции и можно дополнительно очищать.

Помимо прокариотических организмов в качестве хозяев, пригодных для клонирования или экспрессии векторов, которые кодируют антитела, можно использовать эукариотические микроорганизмы, такие как нитчатые грибы или дрожжи, включая штаммы грибов и дрожжей, пути гликозилирования которых были «гуманизированы», что позволяет получать антитело с частично или полностью человеческой схемой гликозилирования (см. Gerngross T.U., Nat. Biotech. 22, 2004, сс. 1409-1414 и Li Н. и др., Nat. Biotech. 24, 2006, сс. 210-215).

Клетки-хозяева, которые можно использовать для экспрессии гликозилированного антитела, получают также из многоклеточных организмов (беспозвоночных и позвоночных животных). Примерами клеток беспозвоночных являются клетки насекомых, а также можно применять клетки растений. Были выявлены многочисленные штаммы бакуловирусов и соответствующие пригодные для них в качестве хозяев клетки насекомых, прежде всего для трансфекции клеток Spodoptera frugiperda.

В качестве хозяев можно применять также культуры растительных клеток (см., например, US №№5959177, 6040498, 6420548, 7125978 и 6417429 (описание технологии PLANTIBODIES™ для получения антител в трансгенных растениях).

В качестве хозяев можно применять также клетки позвоночных. Например, можно использовать клеточные линии млекопитающих, которые адаптированы к росту в суспензии. Другими примерами приемлемых линий клеток-хозяев млекопитающих являются линия клеток почки обезьяны CV1, трансформированная с помощью ОВ40 (COS-7); линия клеток почки эмбриона человека (НЕК 293-клетки или 293-клетки, описанные, например, у Graham F. L. и др., J. Gen. Virol., 36, 1977, с. 59); клетки почки детеныша хомяка (ВНК); клетки Сертоли мыши (ТМ4-клетки, описанные, например, у Mather J.P., Biol. Reprod., 23, 1980, сс. 243-251); клетки почки обезьяны (CV1); клетки почки африканской зеленой мартышки (VERO-76,); клетки карциномы шейки матки человека (HELA); клетки почки собаки (MDCK); клетки печени бычьей крысы (BRL 3А); клетки легкого человека (W138); клетки печени человека (Hep G2); клетки опухоли молочной железы мыши (ММТ 060562); клетки TRI, описанные, например, у Mather J.Р. и др., Annals N.Y. Acad. Sci., 383, 1982, сс. 44-68); клетки MRC 5 и клетки FS4. Другими ценными линиями клеток-хозяев млекопитающих являются клетки яичника китайского хомячка (СНО), включая DHFR^--CHO-клетки (Urlaub G. и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 1980, с. 4216); и клеточные линии миеломы, такие как Y0, NS0 и Sp2/0. Обзор конкретных линий клеток-хозяев млекопитающих, которые можно применять для производства антител, см., например, у Yazaki Р. и Wu A.M. в: Methods in Molecular Biology под ред. В.K.С. Lo, изд-во Humana Press, Totowa, NJ, т. 248, 2003, сс. 255-268.

В одном из объектов изобретения клетка-хозяин представляет собой эукариотическую клетку, например, клетку яичника китайского хомячка (СНО) или лимфоидную клетку (например, Y0-, NS0-, 8р20-клетку).

Л. Анализы

Антитела, представленные в настоящем описании, можно идентифицировать, осуществлять их скрининг или характеризовать их физические/химические свойства и/или виды биологической активности с помощью различных анализов, известных в данной области.

В одном из объектов изобретения антитело, предлагаемое в изобретении, тестируют в отношении его антигенсвязывающей активности, например, с помощью известных методов, таких как ELISA, вестерн-блоттинг и т.д.

Аффинность антител

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитело, представленное в настоящем описании, имеет величину константы диссоциации (Kd) в отношении антигена-мишени, составляющую ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например, 10^-8 М или менее, например, от 10^-8 М до 10^-13 М, например, от 10^-9 М до 10^-13 М), или другую величину, указанную в настоящем описании.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченного соединения имеет величину константы диссоциации (Kd) в отношении радиоактивномеченного соединения, составляющую ≤1 мкМ, ≤100 нМ, ≤10 нМ, ≤1 нМ, ≤0,1 нМ, ≤0,01 нМ или ≤0,001 нМ (например, 10^-8 М или менее, например, от 10^-8 М до 10^-13 М, например, от 10^-9 М до 10^-13 М). В некоторых вариантах осуществления изобретения Kd составляет 1 нМ или менее, 500 пМ или менее, 200 пМ или менее, 100 пМ или менее, 50 пМ или менее, 20 пМ или менее, 10 пМ или менее, 5 пМ или менее, или 1 пМ или менее, или другую величину, указанную в настоящем описании. Например связывание функционального сайта связывания с радиоактивномеченным соединением/хелатом металла может характеризоваться величиной Kd, составляющей примерно 1 пМ - 1 нМ, например, примерно 1-10 пМ, 1-100 пМ, 5-50 пМ, 100-500 пМ или 500 пМ - 1 нМ.

В одном из вариантов осуществления величину Kd измеряют с помощью анализа связывания радиоактивномеченного антигена (РИА). В одном из вариантов осуществления изобретения РИА осуществляют с использованием Fab-версии представляющего интерес антитела и его антигена. Например, измеряют в растворе аффинность связывания Fab с антигеном путем уравновешивания Fab минимальной концентрацией ¹²⁵I-меченного антигена в присутствии полученных титрованием разведений немеченого антигена, осуществляя затем «захват» связанного антигена на сенсибилизированном антителом к Fab планшете (см., например, Chen и др., J. Mol Biol 293, 1999, cc. 865-881). Для обеспечения условий, необходимых для проведения анализа, многолуночные планшеты MICROTITER^® (фирма Thermo Scientific) сенсибилизируют в течение ночи захватывающим антителом к Fab (фирма Cappel Labs) в концентрации 5 мкг/мл в 50 мМ карбонате натрия (рН 9,6) и затем блокируют с помощью 2% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина в ЗФР в течение 2-5 ч при комнатной температуре (примерно 23°С). В неадсорбирующем планшете (фирма Nunc, №269620) смешивают взятый в концентрации 100 или 26 пМ меченный с помощью I антиген с серийными разведениями представляющего интерес Fab (например, пригодного для оценки антитела к VEGF, Fab-12, см. Presta и др., Cancer Res. 57, 1997, cc. 4593-4599). Затем представляющий интерес Fab инкубируют в течение ночи; однако инкубацию можно осуществлять в течение более продолжительного периода времени (например, в течение 65 ч) для того, чтобы гарантировать достижение равновесия. После этого смеси переносят в подготовленный для захвата планшет и инкубируют при комнатной температуре (например, в течение 1 ч). Затем раствор удаляют и планшет промывают восемь раз 0,1% полисорбатом 20 (TWEEN-20^®) в ЗФР. После просушки планшетов в них добавляют по 150 мкл/лунку сцинтилляционной жидкости ((MICROSCINT-20™; фирма Packard) и осуществляют считывание планшетов с помощью гамма-счетчика TOPCOUNT™ (фирма Packard) в течение 10 мин. Для осуществления анализа связывания в условиях конкуренции выбирают концентрации каждого Fab, обеспечивающие уровень связывания, составляющий менее или равный 20% от максимального.

В другом варианте осуществления изобретения Kd измеряют методом поверхностного плазмонного резонанса BIACORE®. Например, анализ осуществляют с помощью устройства BIACORE®-2000 или BIACORE®-3000 (фирма BIAcore, Inc., Пискатавей, шт. Нью-Джерси) при 25°С с использованием антигена, иммобилизованного на СМ5-чипах с уровнем иммобилизации, соответствующим ~10 единицам ответа (RU). В одном из вариантов осуществления изобретения биосенсорные чипы из карбоксиметилированного декстрана (СМ5, фирма BIACORE, Inc.) активируют с помощью гидрохлорида N-этил-N'-(3-диметиламинопропил)карбодиимида (EDC) и N-гидроксисукцинимида (NHS) согласно инструкциям поставщика. Антиген разводят 10 мМ ацетатом натрия, рН 4,8 до концентрации 5 мкг/мл (~0,2 мкМ) перед инъекцией со скоростью потока 5 мкл/мин для достижения уровня иммобилизации, соответствующего примерно 10 единицам ответа (RU) сшитого белка. После инъекции антигена инъецируют 1М этаноламин для блокады непрореагировавших групп. Для кинетических измерений инъецируют двукратные серийные разведения Fab (от 0,78 до 500 нМ) в ЗФР, дополненном 0,05% полисорбата 20 (TWEEN-20™) в качестве поверхностно-активного вещества (ЗФРТ), при 25°С со скоростью потока примерно 25 мкл/мин. Скорость реакции ассоциации (k_on) и реакции диссоциации (k_off) рассчитывают с использованием простой модели связывания Ленгмюра 1:1 (программное обеспечение Evaluation версия 3.2, BIACORE®) путем одновременной аппроксимации сенсограмм ассоциации и диссоциации. Константу равновесия реакции диссоциации (Kd) рассчитывают как соотношение k_off/k_on (см., например, Chen и др., J Mol Biol 293, 1999, cc. 865-881). Если скорость реакции ассоциации превышает 10⁶ М^-1 с^-1 при оценке с помощью описанного выше метода поверхностного плазмонного резонанса, то скорость реакции ассоциации можно определять с помощью метода гашения флуоресценции, который позволяет измерять повышение или снижение интенсивности излучения флуоресценции (длина волны возбуждения 295 нм; длина волны испускания 340 нм, полоса пропускания 16 нм) при 25°С применяемого в концентрации 20 нМ антитела к антигену (Fab-формат) в ЗФР, рН 7,2, в присутствии возрастающих концентраций антигена, осуществляя измерения с помощью спектрометра, такого как спектрофотометр, снабженный блоком для остановки потока (фирма Aviv Instruments), или спектрофотометр SLM-AMINCO™ серии 8000 (фирма ThermoSpectronic), при перемешивании содержимого кюветы.

В другом варианте осуществления изобретения Kd измеряют с помощью SET-анализа (титрование при равновесии в растворе). При осуществлении указанного анализа тестируемые антитела, как правило, вносят в постоянной концентрации и смешивают с серийными разведениями тестируемого антигена. После инкубации для создания равновесия часть свободных антител «захватывают» на сенсибилизированной антигеном поверхности и оценивают с помощью меченного антивидового антитела, как правило, с использованием электрохемилюминесценции (например, согласно методу, описанному у Haenel и др., Analytical Biochemistry 339, 2005, сс. 182-184).

Например, в одном варианте осуществления изобретения 384-луночные стрептавидиновые планшеты (фирма Nunc, Microcoat №11974998001) инкубируют в течение ночи при 4°С с использованием 25 мкл/лунку смеси антиген-биотин-изомер в ЗФР-буфере в концентрации 20 нг/мл. Для уравновешивания образцов антитела свободным антигеном: 0,01-1 нМ антитело титруют с использованием релевантного антигена в серийных разведениях 1:3, 1:2 или 1:1,7, начиная с концентрации антигена 2500 нМ, 500 нМ или 100 нМ. Образцы инкубируют при 4°С в течение ночи в запечатанных полипропиленовых микропланшетах для хранения REMP (фирма Brooks). После инкубации в течение ночи стрептавидиновые планшеты промывают трижды (3×), используя 90 мкл ЗФРТ на лунку. По 15 мкл каждого образца из планшета для уравновешивания переносят в планшет для анализа и инкубируют в течение 15 мин при КТ, с последующими тремя стадиями промывки (по 90 мкл) ЗФРТ-буфером. Детекцию осуществляют, добавляя 25 мкл конъюгата козье антитело к человеческому IgG-POD (фирма Jackson, 109-036-088, 1:4000 в среде OSEP), с последующими шестью стадиями промывки (по 90 мкл) ЗФРТ-буфером. Добавляют в каждую лунку по 25 мкл ТМВ-субстрата (фирма Roche Diagnostics GmbH, каталожный №11835033001). Измерения осуществляют при длинах волн 370/492 нм с использованием ридера Safire2 (фирма Tecan).

В следующем варианте осуществления изобретения Kd измеряют с помощью KinExA-анализа (кинетический анализ исключения). Согласно этому анализу антиген, как правило, титруют в присутствии постоянной концентрации связывающих сайтов антитела, образцам дают уравновеситься и затем быстро пропускают через проточную ячейку, на которой свободные связывающие сайты антитела «захватываются» на покрытых антигеном гранулах, в то время как насыщенный антигеном комплекс антитела отмывается. Гранулы с «захваченным» антителом затем оценивают с помощью меченого антивидового антитела, например, флуоресцентномеченного антитела (Bee и др., PloS One, 7(4), 2012, е36261). Например, в одном из вариантов осуществления изобретения эксперименты с использованием KinExA осуществляют при комнатной температуре (КТ), применяя ЗФР, рН 7,4 в качестве подвижного буфера. Образцы приготавливают в подвижном буфере, дополненном 1 мг/мл БСА («буфер для образца»). Используют скорость потока 0,25 мл/мин. Постоянное количество антитела с концентрацией сайтов связывания 5 пМ титруют с использованием двукратных серийных разведений антигена, начиная с концентрации 100 пМ (диапазон концентраций 0,049-100 пМ). Один образец антитела без антигена служит в качестве 100% сигнала (т.е. без ингибирования). Комплексы антиген антитело инкубируют при КТ в течение по меньшей мере 24 ч, обеспечивая достижение равновесия. Уравновешенные смеси затем пропускают через колонку, содержащую сшитые с антигеном гранулы, в KinExA-системе в объеме 5 мл, что позволяет несвязанному антителу «захватываться» гранулами без нарушения состояния равновесия раствора. Для детекции «захваченного» антитела используют 250 нг/мл конъюгированного с Dylight 650© специфического для человеческого Fc-фрагмента вторичного антитела в буфере для образца. Во всех экспериментах по уравновешиванию каждый образец оценивают с дублированием. Величины KD определяют с помощью нелинейного регрессионного анализа данных с использованием модели односайтового гомогенного связывания, входящей в пакет программ KinExA (версия 4.0.11), используя метод «стандартного анализа».

М. Терапевтические способы и композиции

Указанный в настоящем описании набор антител можно применять в терапевтических способах. Одним из объектов изобретения является набор антител, указанный в настоящем описании, предназначенный для применения в качестве лекарственного средства. В некоторых объектах изобретения предложен набор антител для применения в способе лечения.

Как обсуждалось выше, в некоторых объектах изобретения наборы антител, предлагаемые в настоящем изобретении, можно применять для любого лечения, для которого требуется доставка радионуклида к клетки-мишени индивидуума. Например, предложен набор антител, указанный в настоящем описании, для применения в способе претаргетной радиоиммунотерапии, например, для лечения рака.

В некоторых объектах изобретения предложен набор антител для применения в способе претаргетной радиоиммунотерапии индивидуума, включающем введение индивидууму в эффективном количестве набора антител. «Индивидуум» согласно любому из указанных выше объектов изобретения предпочтительно представляет собой человека.

Как указано выше, лечение может быть направлено на любое состояние, которое можно лечить с использованием цитотоксической активности, мишенью которой являются пораженные заболеванием клетки пациента. Лечение предпочтительно представляет собой лечение опухоли или рака. Однако применимость изобретения не ограничена опухолями и раками. Например, лечение может также представлять собой лечение вирусной инфекции или инфекции, вызываемой другим патогенным организмом, например, прокариотическим организмом. Необязательно таргетинг можно применять в отношении Т-клеток для лечения обусловленного Т-клетками аутоиммунного заболевания или Т-клеточных раков крови. Таким образом, состояние, подлежащее лечению, может включать вирусные инфекции, такие как ВИЧ, бешенство, EBV и ассоциированная с вирусом герпеса саркома Капоши, и аутоиммунные заболевания, такие как рассеянный склероз, и в качестве лекарственных средств при реакция «трансплантат-против-хозяина».

В контексте настоящего описания понятие «рак» относится как к солидным опухолям, так и к гематологическим видам рака, таким как лимфомы, лимфолейкозы, рак легкого, немелкоклеточный рак легкого (NSCL), альвеолярно-клеточный рак легкого, рак кости, рак поджелудочной железы, включая аденокарциному протоков поджелудочной железы (PDAC), рак кожи, рак головы или шеи, кожная или внутриглазная меланома, рак матки, рак яичника, рак анальной области, рак желудка, гастральный рак, колоректальный рак, который может представлять собой рак ободочной кишки и/или ректальный рак, рак молочной железы, карцинома фаллопиевых труб, карцинома эндометрия, карцинома шейки матки, карцинома влагалища, карцинома вульвы, болезнь Ходжкина, рак пищевода, рак тонкого кишечника, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечников, саркома мягких тканей, рак мочеиспускательного канала, рак пениса, рак предстательной железы, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, почечно-клеточная карцинома, карцинома почечной лоханки, мезотелиома, печеночно-клеточный рак, билиарный рак, неоплазмы центральной нервной системы (ЦНС), опухоли позвоночника, глиома ствола головного мозга, мультиформная глиобластома, астроцитомы, шванномы, эпендимомы, медуллобластомы, менингиомы, плоскоклеточные карциномы, аденома гипофиза и саркома Юинга, включая рефрактерные варианты любого из указанных выше видов рака, подвергнутые воздействию ингибиторов контрольных точек версии любого из указанных выше видов рака или комбинации одного или нескольких из указанных выше видов рака.

Способ направленного переноса (таргетинга) радиоизотопа в ткань или орган для терапии может включать:

I) введение индивидууму первого и второго антител, указанных в настоящем описании (одновременное или последовательное в любом порядке), в котором антитела связываются с антигеном-мишенью и локализуются на поверхности клетки, экспрессирующей антиген-мишень; и в котором при объединении первого и второго антител образуется функциональный сайт связывания для радиоактивномеченного соединения;

II) последующее введение индивидууму радиоактивномеченного соединения, при этом радиоактивномеченное соединение связывается с функциональным сайтом связывания для радиоактивномеченного соединения.

Радиоактивномеченное соединение метят с помощью радиоизотопа, обладающего цитотоксичностью в отношении клеток. Приемлемые радиоизотопы включают альфа- и бета-излучатели, обсуждение которых представлено выше.

В способах претаргетной радиоиммунотерапии, которую осуществляют с использованием биспецифического антитела (т.е. не «сплит»-антитела, предлагаемого в настоящем изобретении), общепринятой практикой является введение очищающего агента или блокирующего агента между введением антитела и введением радиоактивномеченного соединения. Очищающие агенты связываются с антителами и повышают скорость их клиренса из организма. Они включают антиидиотипические антитела. Блокирующие агенты, как правило, представляют собой агенты, которые связываются с антигенсвязывающим центром для радиоактивномеченного соединения, но которые сами не являются радиоактивномеченными. Например, когда радиоактивномеченное соединение содержит хелатор, нагруженный радиоизотопом определенного химического элемента (например, металла), то блокирующий агент может содержать такой же хелатор, нагруженный нерадиоактивным изотопом этого же элемента (например, металла), или может содержать ненагруженный хелатор или хелатор, нагруженный другим нерадиоактивным фрагментом (например, нерадиоактивным изотопом другого элемента), при условии, что все еще может связываться антигенсвязывающим центром. В некоторых случаях блокирующий агент может дополнительно содержать фрагмент, который увеличивает размер и/или гидродинамический радиус молекулы. Это препятствует способности молекулы достигать опухоли, без воздействия на способность молекулы связываться с антителом в кровотоке. Примеры фрагментов включают гидрофильные полимеры. Фрагмент может представлять собой полимер или сополимер, например, декстран, декстрин, ПЭГ, полисиаловые кислоты (PSA), гиалуроновую кислоту, гидроксиэтилкрахмал (HES) или поли(2-этил-2-оксазолин) (PEOZ). В других вариантах осуществления изобретения фрагмент может представлять собой неструктурный пептид или белок, такой как XTEN-полипептиды (неструктурные гидрофильные белковые полимеры), гомополимер аминокислот (НАР), полимер пролина-аланина-серина (PAS), эластинподобный пептид (ELP) или желатиноподобный белок (GLK). Другие примеры фрагментов включают белки, такие как альбумин, например, бычий сывороточный альбумин, или IgG. Приемлемая молекулярная масса фрагментов/полимеров может находиться в диапазоне, например, по меньшей мере 50 кДа, например, между 50 и 2000 кДа. Например, молекулярная масса может составлять 200-800 кДа, необязательно может быть выше 300, 350, 400 или 450 кДа и необязательно может быть ниже 700, 650, 600 или 550 кДа, необязательно может составлять примерно 500 кДа.

Согласно некоторым объектам настоящего изобретения стадия введения индивидууму очищающего агента или блокирующего агента отсутствует.В некоторых объектах изобретения отсутствует стадия введения любого агента, который связывается с первым или вторым антителом, между введением антител и введением радиоактивномеченного соединения. В некоторых объектах изобретения отсутствует стадия введения любого агента между введением антител и радиоактивномеченного соединения, необязательно за исключением соединения, выбранного из химиотерапевтического агента, иммунотерапевтического средства и радиосенсибилизирующего вещества. В некоторых вариантах осуществления изобретения никакой агент не вводят между введением антител и введением радиоактивномеченного соединения. В некоторых вариантах осуществления изобретения может отсутствовать введение индивидууму путем инъекции или инфузии любого другого агента между введением антитела и введением радиоактивномеченного соединения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способ может представлять собой двухстадийный метод претаргентной радиоиммунотерапии, который состоит или практически состоит из стадий, на которых I) вводят набор антител (при этом первое и второе антитела можно вводить одновременно или последовательно в любом порядке) и II) затем вводят радиоактивномеченное соединение. Лечение может включать несколько циклов указанной терапии, т.е. несколько циклов указанных двух стадий. Пример продолжительности цикла лечения составляет 28 дней, при этом набор антител вводят только в день 1 цикла, а радиоактивномеченное соединение необязательно вводят в день 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 или 8 цикла, например, в день 7. Количество терапевтических циклов можно варьировать. В одном из вариантов осуществления изобретения можно применять 4, 5 или 6 циклов лечения.

При создании настоящего изобретения неожиданного было установлено, что при применении антител, предлагаемых в изобретении, можно достигать терапевтически эффективного поглощения радиоактивномеченного соединения опухолью, избегая при этом избыточного накопления радиоактивности в здоровых тканях. Так, согласно данным, приведенным в примерах, уровень накопления радиоактивности в нецелевых тканях был ниже, чем при осуществлении метода трехстадийной PRIT, в котором использовали биспецифические антитела и стадию очищения, осуществляя при этом также более простую процедуру.

В некоторых вариантах осуществления изобретения радиоактивномеченное соединение можно вводить индивидууму через приемлемый промежуток времени, давая возможность первому и второму антителам локализоваться в клетках-мишенях. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения радиоактивномеченное соединение можно вводить индивидууму сразу после первого и второго антител или по меньшей мере через 4 ч, 8 ч, 1 день или 2 дня после первого и второго антител. Необязательно его можно вводить не более чем через 3, 5 или 7 дней после введения первого и второго антител. В одном конкретном варианте осуществления изобретения радиоактивномеченное соединение можно вводить индивидууму через 2-7 дней после первого и второго антител.

В некоторых вариантах осуществления изобретения антитела, указанные в настоящем описании, можно вводить в качестве компонента комбинированной терапии. Например, их можно вводить в комбинации с одним или несколькими химиотерапевтическими агентами: химиотерапевтический агент и антитело можно вводить одновременно или последовательно в любом порядке. В дополнительном или альтернативном варианте их можно вводить в комбинации с одним или несколькими иммунотерапевтическими средствами: иммунотерапевтическое средство и антитело можно вводить одновременно или последовательно в любом порядке.

В некоторых вариантах осуществления изобретения в дополнительном или альтернативном варианте антитела, указанные в настоящем описании, можно вводить в комбинации с радиосенсибилизирующими веществами. Радиосенсибилизирующее вещество и антитело можно вводить одновременно или последовательно в любом порядке.

Антитела, предлагаемые в изобретении (и любой дополнительный терапевтический агент, например, радиоактивномеченное соединение) можно вводить с помощью любых приемлемых путей, включая парентеральное, внутрилегочное и интраназальное введение и при необходимости местную обработку, введение внутрь повреждения. Парентеральные инфузии включают внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшинное или подкожное введение. Дозирование можно осуществлять с помощью любого приемлемого пути, например, с помощью инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции.

В некоторых вариантах осуществления изобретения перед одним или несколькими циклами лечения, описанными выше, можно осуществлять один или несколько циклов дозиметрии. Цикл дозиметрии может включать стадии, на которых I) вводят набор антител (при этом первое и второе антитела можно вводить одновременно или последовательно в любом порядке) и II) затем вводят соединение, пригодное для визуализации радиоактивномеченного с помощью гамма-излучателя (если радиоактивномеченное соединение связывается с функциональным сайтом связывания для радиоактивномеченного соединения). Соединение может представлять собой такое же соединение, которое применяют в последующих циклах лечения, за исключением того, что его метят предпочтительно с помощью гамма-излучателя, а не альфа- или бета-излучателя. Например, в одном из вариантов осуществления изобретения радиоактивномеченное соединение, применяемое в цикле дозиметрии, может представлять собой ²⁰³Pb-DOTAM, а радиоактивномеченное соединение, применяемое в цикле лечения, может представлять собой ²¹²Pb-DOTAM. Можно осуществлять визуализацию пациента для определения поглощения соединения опухолью и/или для оценки абсорбированной дозы соединения. Эту информацию можно использовать для оценки ожидаемого радиационного облучения в последующих стадиях лечения и для доведения дозы радиоактивномеченного соединения, которое применяют на стадиях лечения, до безопасного уровня.

Н. Фармацевтические композиции

Первое и второе антитела, указанные в настоящем описании, можно включать в состав одной фармацевтической композиции или отдельных фармацевтических композиций. Так, дополнительным объектом настоящего изобретения является фармацевтическая композиция, содержащая первое и второе антитела, предлагаемые в изобретении, или первая фармацевтическая композиция, содержащая первое антитело, предлагаемое в изобретении, и вторая фармацевтическая композиция, содержащая второе антитело, предлагаемое в изобретении, например, для применения в любом из терапевтических или диагностических способов, указанных в настоящем описании. В одном из вариантов осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит также фармацевтически приемлемый носитель. В другом варианте осуществления изобретения фармацевтическая композиция содержит также по меньшей мере один дополнительный терапевтический агент, например, описанный ниже.

Фармацевтические препаративные формы антител, указанных в настоящем описании, получают путем смешения указанного антитела, имеющего необходимую степень чистоты, с одним или несколькими необязательными фармацевтически приемлемыми носителями (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16-е изд. под ред. Osol А., 1980) в форме лиофилизированных композиций или водных растворов.

Фармацевтически приемлемые носители, как правило, являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозах и концентрациях, они включают (но не ограничиваясь только ими): буферы, такие как фосфатный, цитратный, ацетатный буферы, а также буферы на основе других органических кислот; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как хлорид октадецилдиметилбензиламмония; хлорид гексаметония; хлорид бензалкония; хлорид бензетония; фенол; бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метил- или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол и.мета-крезол); полипептиды с низкой молекулярной массой (содержащие менее приблизительно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поли(винилпирролидон); аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; содержащие металл комплексы (например, комплексы Zn-белок); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (ПЭГ). В контексте настоящего описания примеры фармацевтически приемлемых носителей включают также диспергирующие агенты интерстициальных лекарственных средств, такие как растворимые активные в нейтральной среде гликопротеины гиалуронидаз (sHASEGP), например, человеческие растворимые гликопротеины гиалуронидазы РН-20, такие как rHuPH20 (HYLENEX^®, фирма Baxter International, Inc.). Некоторые примеры sHASEGP и методы их применения, в том числе rHuPH20, описаны в публикациях патентов США №№2005/0260186 и 2006/0104968. Согласно одному из объектов изобретения sHASEGP объединяют с одним или несколькими дополнительными гликозаминогликаназами, такими как хондроитиназы.

Примеры лиофилизированных композиций антител описаны в патенте США №6267958. Водные композиции антител включают композиции, описанные в патенте США №6171586 и WO 2006/044908, последние композиции включают гистидин-ацетатный буфер.

Препаративная форма, указанная в настоящем описании, может содержать также более одного действующего вещества, если это необходимо для конкретного подлежащего лечению показания, предпочтительно вещества с дополнительными видами активности, которые не оказывают отрицательного воздействия друг на друга. Например, может требоваться применение дополнительных химиотерапевтических агентов, иммунотерапевтических агентов и/или радиосенсибилизирующих веществ, указанных выше. Такие действующие вещества должны присутствовать в комбинации в количествах, эффективных для достижения поставленной цели.

Действующие вещества можно включать также в микрокапсулы, например, полученные с помощью методов коацервации или межфазной полимеризации, например в гидроксиметилцеллюлозные или желатиновые микрокапсулы и поли(метилметакрилатные) микрокапсулы соответственно, в коллоидные системы введения лекарственного средства (например в липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методы описаны в Remington's Pharmaceutical Sciences, 16-е изд., под ред. Osol А., 1980.

Можно приготавливать препараты с замедленным высвобождением. Приемлемыми примерами препаратов с замедленным высвобождением являются полупроницаемые матрицы из твердых гидрофобных полимеров, включающие антитело, такие матрицы представляют собой изделия определенной формы, например, пленки или микрокапсулы.

Композиции, предназначенные для применения in vivo, как правило, должны быть стерильными. Стерильность можно легко обеспечивать, например, путем фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны.

О. Способы и композиции для диагностирования и детекции

Набор антител, указанный в настоящем описании, можно применять также в способах диагностирования или визуализации, предпочтительно в способах претаргетной радиоиммуновизуализации или включающих претаргетную радиоиммуновизуализацию. Таким образом, в настоящем изобретении предложены способы диагностирования и визуализации. Предложено также применение набора антител в способе визуализации, указанном в настоящем описании, и предложен набор антител, указанных в настоящем описании (т.е. включающий первое и второе антитела, указанные в настоящем описании), для применения в способе диагностирования индивидуума, например, путем исследования организма человека или животного.

Способы визуализации можно применять для визуализации присутствия и/или распределения антигена-мишени в организме. Например, способ может представлять собой способ визуализации клеток, экспрессирующих антиген, ассоциированный с заболеванием, таким как любое из болезненных состояний, описанных выше. Необязательно способ предназначен для визуализации опухолей или рака. Способ может предназначаться для диагностирования индивидуума, у которого предполагается наличие пролиферативного нарушения, такого как рак, или инфекционного заболевания.

В некоторых вариантах осуществления изобретения может быть предпочтительно, чтобы индивидуум представлял собой человека.

Способ направленного переноса радиоизотопа в ткань или орган для визуализации может включать:

I) введение индивидууму первого и второго антител, указанных в настоящем описании (одновременное или последовательное в любом порядке), в котором антитела связываются с антигеном-мишенью и локализуются на поверхности клетки, экспрессирующей антиген-мишень; и в котором при объединении первого и второго антител образуется функциональный сайт связывания для радиоактивномеченного соединения; и

II) последующее введение радиоактивномеченного соединения, при этом радиоактивномеченное соединение связывается с функциональным сайтом связывания для радиоактивномеченного соединения.

Необязательно способ может включать также:

III) визуализацию ткани или органа, в которой/котором радиоактивномеченное соединение локализовано или ожидается, что может быть локализовано.

Необязательно способ может включать также одну или несколько стадий, на которых осуществляют установление диагноза, передачу диагноза индивидууму и/или определяют и/или осуществляют приемлемое лечение на основе диагноза.

В другом варианте осуществления изобретения способ, предлагаемый в изобретении, может включать визуализацию ткани или органа индивидуума, в котором индивидуума ранее лечили с помощью:

I) первого и второго антител, указанных в настоящем описании (одновременно или последовательно в любом порядке), где антитела связываются с антигеном-мишенью и локализуются на поверхности клетки, экспрессирующей антиген-мишень; и где при объединении первого и второго антител образуется функциональный сайт связывания для радиоактивномеченного соединения; и

II) радиоактивномеченного соединения, где радиоактивномеченное соединение связывается с антигенсвязывающим центром для указанного радиоактивномеченного соединения, образовавшимся в результате объединения первого и второго антител.

В способах визуализации и/или диагностирования, указанных в настоящем описании, радиоактивномеченное соединение представляет собой соединение, меченное радиоизотопом, который можно применять для визуализации. Приемлемые радиоизотопы включают гамма-излучатели, обсуждение которых представлено выше.

При осуществлении общепринятых методов претаргетной радиовизуализации обычной практикой является введение очищающего агента или блокирующего агента между введением антитела и введением радиоактивномеченного соединения, например, очищающего или блокирующего агента, описанного выше.

В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения стадия введения очищающего агента или блокирующего агента отсутствует. В некоторых объектах изобретения отсутствует стадия введения любого агента, который связывается с первым или вторым антителом, между введением антител и введением радиоактивномеченного соединения. В некоторых объектах изобретения отсутствует стадия введения любого агента между введением антител и радиоактивномеченного соединения, за исключением необязательного соединения, выбранного из химиотерапевтического агента, иммунотерапевтического агента и радиосенсибилизирующего вещества. В некоторых вариантах осуществления изобретения никакой агент не вводят между введением антител и введением радиоактивномеченного соединения. В некоторых вариантах осуществления изобретения может отсутствовать введение индивидууму путем инъекции или инфузии любого другого агента между введением антитела и введением радиоактивномеченного соединения.

В некоторых вариантах осуществления изобретения радиоактивномеченное соединение можно вводить индивидууму через приемлемый промежуток времени, давая возможность первому и второму антителам локализоваться в клетках-мишенях. Например, в некоторых вариантах осуществления изобретения радиоактивномеченное соединение можно вводить индивидууму сразу после первого и второго антител или по меньшей мере через 4 ч, 8 ч, 1 день или 2 дня после первого и второго антител. Необязательно его можно вводить не более чем через 3, 5 или 7 дней после введения первого и второго антител. В одном конкретном варианте осуществления изобретения радиоактивномеченное соединение можно вводить индивидууму через 2-7 дней после первого и второго антител.

В некоторых вариантах осуществления изобретения способ визуализации может представлять собой способ претаргентной радиовизуализации, который состоит или практически состоит из стадий, на которых I) вводят набор антител (в котором первое и второе антитела можно вводить одновременно или последовательно в любом порядке), II) затем вводят радиоактивномеченное соединение и III) осуществляют визуализацию представляющей интерес ткани или представляющего интерес органа. Способ диагностирования может состоять или практически состоять из указанных стадий, за которыми следуют стадии установления диагноза, который затем можно передавать пациенту и можно применять в качестве основы для выбора и/или осуществления режима лечения.

Антиген-мишень может представлять собой любой из антигенов-мишеней, обсуждение которыхо представлено выше. В некоторых вариантах осуществления изобретения антиген-мишень может представлять собой опухолеспецифический антиген, обсуждение которого представлено выше, а способ визуализации может представлять собой способ визуализации опухоли или опухолей. Может быть известно, что индивидуум имеет опухоль или у него предполагается наличие опухоли.

Например, способ может представлять собой способ визуализации опухолей у индивидуума, который имеет или у него предполагается наличие рака легкого, немелкоклеточного рака легкого (NSCL), альвеолярно-клеточного рака легкого, рака кости, рака поджелудочной железы, включая PDAC, рака кожи, рака головы или шеи, кожной или внутриглазной меланомы, рака матки, рака яичника, колоректального рака, который может представлять собой ректальный рак и/или рак ободочной кишки, рака анальной области, рака желудка, гастрального рака, рака молочной железы, карциномы фаллопиевых труб, карциномы эндометрия, карциномы шейки матки, карциномы влагалища, карциномы вульвы, болезни Ходжкина, рака пищевода, рака тонкого кишечника, рака эндокринной системы, рака щитовидной железы, рака паращитовидной железы, рака надпочечников, саркомы мягких тканей, рака мочеиспускательного канала, рака пениса, рака предстательной железы, рака мочевого пузыря, рака почки или мочеточника, почечно-клеточной карциномы, карциномы почечной лоханки, мезотелиомы, печеночно-клеточного рака, билиарного рака, неоплазм центральной нервной системы (ЦНС), опухолей позвоночника, глиомы ствола головного мозга, мультиформной глиобластомы, астроцитом, шванном, эпендимом, медуллобластом, менингиом, плоскоклеточных карцином, аденомы гипофиза и саркомы Юинга, включая рефрактерные варианты любого из указанных выше видов рака, подвергнутые воздействию ингибиторов контрольных точек версии любого из указанных выше видов рака или комбинации одного или нескольких из указанных выше видов рака.

III. Последовательности

IV. Примеры

Ниже представлены примеры способов и композиций, предлагаемых в изобретении. Следует понимать, что на основе представленного выше общего описания можно воплощать на практике различные другие варианты осуществления изобретения.

Глоссарий сокращений

ADA - антитело к лекарственному средству

AST - аланин, серии, треонин

BsAb - биспецифическое антитело

СА - очищающий агент

СБА - карциноэмбриональный антиген

DOTAM - 1,4,7,10-тетракис(карбамоилметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан

ID - инъецируемая доза

ELISA - твердофазный иммуноферментный анализ

FAP - фибробласт-активирующий белок

GPRC5D - сопряженный с G-белком рецептор, класс С, группа 5, член D

IV - внутривенно

ММ - молекулярная масса

ЗФР - забуференный фосфатом физиологический раствор

p.i. - после инъекции

ФК - фармакокинетический

PRIT - претаргетная радиоиммунотерапия

RIT - радиоиммунотерапия

КТ - комнатная температура

SC - подкожно

SCID - серьезный комбинированный иммунодефицит

SD - стандартное отклонение

SOPF - свободный от специфических и условно-патогенных организмов

ТА - антиген-мишень

TGI - ингибирование роста опухоли

TR - регресс опухоли.

Пример 1: Создание кроличьих антител, связывающихся с РОТАМ

Пример 1А: Иммунизация кроликов

Смесь 1:1 2-х энантиомерных фракций Pb-DOTAM-алкил-PEG₄-KLH (фракция 1 MS2-DOTAM KLH и фракция 2 MS2-DOTAM KLH) применяли для иммунизации белых новозеландских кроликов или трансгенных кроликов, несущих локус человеческого иммуноглобулина, как описано в WO 2000/46251, WO 2002/12437, WO 2005/007696, WO 2006/047367, US 2007/0033661 и WO 2008/027986. Каждого кролика иммунизировали 500 мкг иммуногенной смеси, эмульгированной в полном адъюванте Фрейнда, в день 0 путем внутрикожного введения и 500 мкг в каждый из дней 7, 14, 28, 56 путем чередующихся внутримышечных и подкожных введений. После этого кроликов подвергали подкожным иммунизациям, вводя ежемесячно по 500 мкг, и через 7 дней после иммунизации брали небольшие образцы крови для определения титров в сыворотке. В течение третьего и в течение девятого месяца иммунизации (в период с 5 по 7 день после иммунизации) брали более крупный образец крови (10% от предполагаемого общего объема крови), и выделяли мононуклеарные клетки периферической крови, которые использовали в качестве источника антигенспецифических В-клеток в процессе клонирования В-клеток.

Определение титров в сыворотке (ELISA)

Каждую из 2 энантиомерных фракций Pb-DOTAM (PJRD05.133F1 или PJRD05.133F2) иммобилизовали на 96-луночном планшете NUNC Maxisorp в концентрации 1 мкг/мл из расчета 100 мкл/лунку, в ЗФР, после чего осуществляли: блокирование планшета с помощью 2% Crotein С в ЗФР, 200 мкл/лунку; внесение с дублированием серийных разведений антисыворотки в 0,5% Crotein С в ЗФР, 100 мкл/лунку; детекцию с использованием конъюгированного с HRP ослиного антикроличьего антитела IgG-типа (фирма Jackson Immunoresearch/Dianova 711-036-152; 1/16 000) и стрептавидина-HRP; каждый из которых разводили в 0,5% Crotein С в ЗФР, 100 мкл/лунку. При осуществлении всех стадий планшеты инкубировали в течение 1 ч при 37°С. Между всеми стадиями планшеты промывали 3 раза 0,05% Твин 20 в ЗФР. Сигнал генерировали путем добавления растворимого субстрата ВМ Blue POD (фирма Roche), 100 мкл/лунку; и реакцию прекращали путем добавления 1М HCl, 100 мкл/лунку. Абсорбцию считывали при 450 нм, принимая за длину референс-волны 690 нм. Титр определяли как разведение антисыворотки, при котором уровень сигнала составлял половину от максимального.

Пример 1Б: Клонирование В-клеток кролика

Выделение кроличьих мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС)

Образцы крови получали из иммунизированных кроликов. Цельную кровь, содержащую EDTA, разводили двукратно 1× ЗФР (фирма РАА, Пашинг, Австрия) перед осуществлением центрифугирования в градиенте плотности с использованием лимфолита для клеток млекопитающих (фирма Cedarlane Laboratories, Берлингтон, провинция Онтарио, Канада) согласно спецификациям производителя. РВМС промывали дважды 1× ЗФР.

Среда EL-4 В5

Применяли среду RPMI 1640 (фирма Pan Biotech, Айденбах, Германия), дополненную 10% FCS (фирма Hyclone, Логан, шт. Юта, США), 2 мМ глутамином, 1% раствора пенициллина/стрептомицина (фирма РАА, Пашинг, Австрия), 2 мМ пируватом натрия, ЮмМ HEPES (фирма Pan Biotech, Айденбах, Германия) и 0,05 мМ β-меркаптоэтанолом (фирма Gibco, Пейсли, Шотландия).

Сенсибилизация планшетов

Стерильные 6-луночные планшеты для культур клеток сенсибилизировали 2 мкг/мл KLH в карбонатном буфере (0,1М бикарбонат натрия, 34 мМ вторичный кислый карбонат натрия, рН 9,55) в течение ночи при 4°С. Перед использованием планшеты промывали трижды стерильным ЗФР. Стерильные покрытые стрептавидином 6-луночные планшеты (фирма Microcoat, Бернрид, Германия) сенсибилизировали энантиомерной смесью 1+1 изомеров А (1 мкг/мл) и Б (1 мкг/мл) биотинилированного ТСМС-Pb-dPEC3-биотина в ЗФР в течение 3 ч при комнатной температуре. Перед стадией пэннинга указанные 6-луночные планшеты промывали трижды стерильным ЗФР.

Истощение макрофагов/моноцитов

РВМС высевали на стерильные сенсибилизированные KLH 6-луночные планшеты для истощения макрофагов и моноцитов посредством неспецифической адгезии и для удаления клеток, связывающихся с KLH. Каждую лунку заполняли максимально 4 мл среды и вплоть до 6×10⁶ РВМС из иммунизированного кролика и давали связываться в течение 1 ч при 37°С и 5% CO₂. Клетки, находящиеся в супернатанте (лимфоциты периферической крови (PBL)), применяли на стадии пэннинга антигенов.

Обогащение В-клеток на содержащем Pb энантиомере ТСМС

На 6-луночные планшеты, сенсибилизированные энантиомерной смесью изомеров А и Б ТСМС-РЬ-dPEC3-биотина, высевали вплоть до 6×10⁶ PBL на 4 мл среды и выдерживали для связывания в течение 1 ч при 37 С и 5% СО₂. Непрекрепившиеся клетки удаляли путем 1-3-кратной осторожной промывки лунок 1× ЗФР. Оставшиеся прикрепившиеся клетки отделяли путем обработки трипсином в течение 10 мин при 37 С и 5% СО₂. Трипсинизацию прекращали с помощью среды EL-4 В5. Клетки хранили на льду до осуществления иммунофлуоресцентного окрашивания.

Иммунофлуоресцентное окрашивание и проточная цитометрия

Для сортировки индивидуальных клеток применяли антитело к IgG, конъюгированное с ФИТЦ (фирма AbD Serotec, Дюссельдорф, Германия). Для окрашивания поверхности клетки после стадии истощения и обогащения инкубировали с антителом к IgG-ФИТЦ, в ЗФР и инкубировали в течение 45 мин в темноте при 4°С. После окрашивания РВМС промывали дважды охлажденным на льду ЗФР. И, наконец, РВМС ресуспендировали в охлажденном на льду ЗФР и сразу подвергали FACS-анализам. Перед проведением FACS-анализов добавляли йодид пропидия в концентрации 5 мкг/мл (фирма BD Pharmingen, Сан-Диего, шт. Калифорния, США) для различения мертвых и живых клеток.

Для сортировки единичных клеток применяли устройство Becton Dickinson FACSAria, снабженное компьютером и программным обеспечением FACSDiva (фирма BD Biosciences, США).

Культивирование В-клеток

Культивирование кроличьих В-клеток осуществляли согласно методу, описанному у Lightwood и др., J Immunol Methods, 316, 2006, сс. 133-143. В целом, метод состоял в следующем: полученные в результате сортировки единичных клеток кроличьи В-клетки инкубировали в 96-луночных планшетах с 200 мкл/лунку среды EL-4 В5, содержащей клетки Pansorbin (1:100000) (фирма Calbiochem (Merck), Дармштадт, Германия), 5% супернатанта кроличьих тимоцитов (фирма MicroCoat, Бернрид, Германия) и обработанные гамма-излучением клетки мышиной тимомы EL-4 В5 (5×10⁵ клеток/лунку), в течение 7 дней при 37°С в инкубаторе. Супернатанты культивированных В-клеток удаляли для скрининга и оставшиеся клетки сразу же собирали и помещали на хранение при -80°С в 100 мкл RLT-буфера (фирма Qiagen, Гильден, Германия).

Пример 1В: Экспрессия кроличьего антитела

ПЦР-амплификация V-доменов

Общую РНК получали из лизата В-клеток (ресуспедированного в RLT-буфере (фирма Qiagen, каталожный номер N 79216) с использованием набора для РНК NucleoSpin 8/96 (фирма Macherey&Nagel; 740709.4, 740698) согласно протоколу производителя. РНК элюировали с помощью 60 мкл свободной от РНКазы воды. 6 мкл РНК использовали для получения кДНК с помощью реакции с обратной транскриптазой с использованием смеси для синтеза первой цепи Superscript III First-Strand Synthesis SuperMix (фирма Invitrogen 18080-400) и олиго-с1Т-праймера согласно инструкциям производителя. Все стадии осуществляли с использованием системы Hamilton ML Star. 4 мкл кДНК использовали для амплификации вариабельных областей тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина (VH и VL) с применением смеси AccuPrime Supermix (фирма Invitrogen 12344-040) в конечном объеме 50 мкл с использованием праймеров rbHC.up и rbHC.do для тяжелой цепи и rbLC.up и rbLC.do для легкой цепи (см. приведенную ниже таблицу). Все прямые праймеры представляли собой специфические для сигнального пептида праймеры (соответственно VH и VL), а «обратные» праймеры представляли собой специфические для константных областей праймеры (соответственно VH и VL). Условия ПЦР для RbVH+RbVL были следующими: горячий старт при 94°С в течение 5 мин; 35 циклов по 20 с при 94°С, 20 с при 70°С, 45 с при 68°С и окончательное удлинение при 68°С в течение 7 мин.

8 мкл из 50 мкл раствора для ПЦР вносили на 2% гель 48 Е (фирма Invitrogen G8008-02). Продукты положительных ПЦР-реакций очищали с использованием набора NucleoSpin Extract II (фирма Macherey&Nagel; 740609250) согласно протоколу производителя и элюировали с использованием 50 мкл буфера для элюирования. Все стадии очистки осуществляли с использованием системы Hamilton ML Starlet.

Рекомбинантная экспрессия кроличьих моноклональных двухвалентных антител

Для рекомбинантной экспрессии кроличьих моноклональных двухвалентных антител ПЦР-продукты, кодирующие VH или VL, клонировали в виде кДНК в экспрессионных векторах с помощью метода клонирования по выступающим концам (R.S. Haun и др., Biotechniques 13, 1992, сс. 515-518; M.Z. Li и др., Nature Methods 4, 2007, сс. 251-256). Экспрессионные векторы содержали кассету экспрессии, состоящую из 5'-промотора из CMV, включая интрон А, и последовательность полиаденилирования 3'-BGH. Помимо кассеты экспрессии плазмиды содержали полученный из pUC18 сайт инициации репликации и ген бета-лактамазы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, для амплификации плазмид в E.coli. Применяли три варианта исходной плазмиды: одна плазмид а содержала константную область кроличьего IgG для включения VH-областей, в то время как две дополнительные плазмиды содержали константную область кроличьей или человеческой легкой каппа-цепи (LC-каппа) для включения VL-областей. Линеаризованные экспрессионные плазмиды, кодирующие константные области каппа- или гамма-цепи и VL/VH-вставки, амплифицировали с помощью ПЦР с использованием перекрывающихся праймеров. Очищенные ПЦР-продукты инкубировали с ДНК-полимеразой Т4, в результате чего создавали одноцепочечные выступающие концы. Реакцию прекращали путем добавления дЦТФ. На следующей стадии объединяли плазмиду и вставку и инкубировали с recA, индуцируя сайтспецифическую рекомбинацию. Полученными в результате рекомбинации плазмидами трансформировали E.coli. На следующий день отбирали выросшие колонии и тестировали в отношении правильно рекомбинированных плазмид после получения плазмид путем рестрикционного анализа и ДНК-секвенирования. Для экспрессии антител выделенными содержащими НС и LC плазмидами кратковременно совместно трансфектировали 2 мл клеток FreeStyle HEK293-F (фирма Invitrogen R790-07) (в 96-луночном планшете) с использованием реагента для трансфекции 239-Free (фирма Novagen) согласно процедуре, предложенной поставщиком реагента. Через 1 неделю собирали супернатанты и передавали для очистки.

Пример 1Г: Селекция кроличьих моноклональных антител

SET-анализ (титрование при равновесии в растворе) осуществляли согласно описанному ниже методу.

SET-анализ

Материалы:

1. Смесь изомеров DOTAM-биотина:

Смесь следующих компонентов, концентрация 20 нг/мл

- Pb-Dotam-Bn-биотин/ТСМС-Pb-dPEG3-биотин, изомер А

- Pb-Dotam-Bn-биотин/TCMC-Pb-dPEG3-биотин, изомер Б

- Pb-Dotam-алкил-биотин, изомер А

- Pb-Dotam-алкил-биотин, изомер Б

2. ЗФР: DЗФР, фирма PAN, Р04-36500

3. БСА: фирма Roche, 10735086001

4. Твин 20: полисорбат 20 (фирма usb, №20605, 500 мл)

5. ЗФРТ: 10×, фирма Roche, №11666789001/0,1% Твин 20

6. среда OSEP: ЗФР (10×, фирма Roche, №11666789001)/0,5% БСА (фракция V бычьего сывороточного альбумина, свободная от жирных кислот, фирма Roche, №10735086001)/0,05% Твин 20

Подготовка планшета для анализа: 384-луночные стрептавидиновые планшеты (фирма Nunc, Microcoat №11974998001) инкубировали в течение ночи при 4°С с 25 мкл/лунку смеси изомеров DOTAM-биотина в ЗФР-буфере в концентрации 20 нг/мл.

Уравновешивание образцов, содержащих антитело к DOTAM, свободными хелатами DOTAM-металл (Pb, Bi, Са, Cu, Zn, Mg, Fe): 0,01нМ -1нМ антитело титровали с использованием серийных разведений релевантных хелатов DOTAM-металл в соотношении 1:3, 1:2 или 1:1,7, начиная с концентрации хелата DOTAM-металл 2500нМ, 500нМ или 100нМ. Образцы инкубировали при 4°С в течение ночи в запечатанных полипропиленовых микропланшетах REMP Storage (фирма Brooks).

После инкубации в течение ночи стрептавидиновые планшеты промывали трижды, используя по 90 мкл ЗФРТ на лунку. 15 мкл каждого образца из планшета для уравновешивания переносили на планшет для анализа и инкубировали в течение 15 мин при КТ, после чего осуществляли стадии промывки, используя 3×90 мкл ЗФРТ-буфера. Детекцию осуществляли путем добавления 25 мкл конъюгата козье антитело к человеческому IgG-POD (фирма Jackson, 109-036-088, 1:4000 в OSEP), после чего осуществляли стадии промывки, используя 6×90 мкл ЗФРТ-буфера. В каждую лунку добавляли по 25 мкл субстрата ТМВ (фирма Roche Diagnostics GmbH, каталожный номер: 11835033001). Измерения осуществляли при 370/492 нм с использованием ридера Safire2 (фирма Тесап).

В приведенной ниже таблице представлены характеристики различных моноклональных двухвалентных кроличьих антител, полученные с помощью указанного анализа. В качестве наиболее перспективного кандидата выбирали антитело PRIT-0128, поскольку оно обладало сопоставимой способностью к связыванию с хелатированными Pb и Bi, пониженной способностью к связыванию с другими хелатированными металлами и высокой аффинностью (<100пММ).

WTRa: кролики дикого типа; TgRa: трансгенные кролики

Пример 2: Гуманизация

Гуманизация

На следующем этапе осуществляли гуманизацию наиболее перспективного кандидата PRIT-0128.

Для идентификации пригодного человеческого акцепторного каркасного участка для гуманизации связывающего DOT AM агента PRIT-0128 применяли комбинацию двух методологий. С одной стороны, использовали классический подход, заключающийся в поиске акцепторного каркасного участка, обладающего высокой гомологией последовательности с родительским антителом, и последующей трансплантации CDR-участков в указанный акцепторный каркасный участок. Производили оценку влияния каждого аминокислотного различия в идентифицированных каркасных участках с родительским антителом на структурную целостность связывающего агента и при необходимости интродуцировали обратные относительно родительской последовательности мутации.

С другой стороны, применяли разработанный в лаборатории заявителя основанный на компьютерном моделировании (in silico) метод («инструмент» для предсказания ориентации VH- и VL-доменов гуманизированных версий относительно друг друга (см. WO 2016/062734). Этот подход применяли для виртуальных трансплантатов CDR на всех возможных комбинациях человеческих зародышевых линий. Результаты сравнивали с ориентацией VH-VL-домена родительского связывающего агента для отбора комбинаций каркасных участков, близких по геометрии к исходному антителу.

В каждом случае в акцепторный каркасный участок трансплантировали следующие CDR-участки родительского антитела (нумерация согласно Кэботу):

VH_CDR1: 31-35

VH_CDR2: 50-65

VH_CDR3: 95-102

VL_CDR1: 24-34

VL_CDR2: 50-56

VL_CDR3: 89-97

Гуманизированные варианты получали в формате, содержащем полноразмерное антитело к СБА, в котором С-конец одной из тяжелых цепей слит с N-концом VH-домена связывающего Dotam агента, а С-конец другой тяжелой цепи слит с N-концом VL-домена связывающего DOT AM агента, формируя биспецифическое антитело с двумя сайтами связывания для СБА и одним функциональным сайтом связывания для DOTAM. Таким образом, связывающий DOTAM агент сливали с С-концом Fc таргетирующего опухоль IgG, получая слияние VH/VL Fv (без СН1 и Ck соответственно). Молекулу, полученную на основе родительского связывающего DOTAM агента PRIT-0128 в указанном биспецифическом формате обозначали как PRIT-0156.

Включали также каркасный участок герцептина из-за его пригодности с точки зрения предсказания VH/VL и повышенной стабильности каркасного участка. Для всех гуманизированных вариантов VH использовали человеческий J-элемент hJH2. Для всех гуманизированных вариантов VK использовали человеческий J-элемент hJK4.

НС4 получали путем трансплантации PRIT-128 в человеческую зародышевую линию IGHV3-30-02 с одной обратной мутацией A49G (нумерация Кэбота).

Для получения вариабельной тяжелой цепи НС5 CDR трансплантировали в человеческую зародышевую линию hVH_2_26 с осуществлением обратной мутации A49G и делеции первой аминокислоты для соответствия исходному кроличьему N-концу.

После трансплантации в V-область герцептина (полученную из человеческой зародышевой линии hVH3_66) вариант НС7 имел несколько модификаций в акцепторном каркасном участке: делецию из N-конца Е, A49G, A71R и S93A.

Для создания НС 10 трансплантировали CDR PRIT-128 в человеческую зародышевую линию IGHV4_34_01.

В данном случае модифицировали N-конец, начиная с V2, для соответствия участку исходного кроличьего антитела, начиная с Q2. Кроме того, вносили в качестве обратных мутаций G29F и F31L (нумерация согласно номенклатуре Кэбота), а также V71R и F78V, в каркасный участок 3.

Для создания легкой цепи LCI CDR трансплантировали в человеческую зародышевую линию IGKV1_39_01 без какой-либо обратной мутации. В качестве начального остатка выбирали 12 для соответствия исходному кроличьему Ат, начиная с А2.

Вариант легкой цепи LC3 создавали путем трансплантации CDR в человеческую зародышевую линию hVK1_5. D1 удаляли путем делеции, а обратную мутацию I2A рассматривали в качестве нового N-конца. В качестве дополнительных обратных мутаций рассматривали K42Q и А43Р.

Создавали не все возможные комбинации матрицы гуманизации, а осуществляли отбор определенных комбинаций на основе таких факторов, как обусловленные рассматриваемой комбинацией риски, связанные с получением предсказанных VH/VL и последовательности.

Отбор кандидатов

Цель гуманизации заключалась в получении гуманизированных связывающих агентов, аффинность которых к DOT AM не снижается более чем в 10 раз. Эта цель была достигнута для нескольких связывающих агентов, которые обладали сопоставимой или даже более высокой аффинностью к DOTAM.

Как указано выше, PRIT-0156 представляет собой антитело в формате 2:1, которое содержит кроличий связывающий DOTAM агент PRIT-0128, объединенный со связывающим СЕА агентом СН1А1А. Антитела с PRIT-0178 по PRIT-0204 представляют собой гуманизированные варианты того же формата, содержащие тот же самый связывающий СЕА агент.Антитела с PRIT-0205 вплоть до PRIT-0221 соответствуют гуманизированным вариантам с PRIT-0178 по PRIT-0204 касательно связывающегося с DOTAM компонента, но СЕА-связывающий агент заменен на Т84.66.

Определение kd в условиях равновесия в растворе

Для осуществления скрининга большого количества гуманизированных кандидатов в отношении их аффинности к Pb-DOTAM, применяли метод титрования при равновесии в растворе (SET). В приведенной ниже таблице представлены подробные данные об определенных с помощью SET аффинностей отобранных гуманизированных DOTAM-связывающих агентов к Pb-DOTAM. Все антитела в указанной таблице представляют собой биспецифические антитела, которые характеризуются двухвалентным связыванием с СЕА и одновалентным связыванием с Pb-Dotam (формат 2:1):

Определение kd методом Kinexa

Для более подробного анализа и определения аффинности ортогональным методом применяли метод Kinexa.

Оборудование и материалы

Применяли устройство KinExA 3200 фирмы Sapidyne Instruments (Бойсе, шт. Айдахо), снабженное автосэмплером. Полиметилметакрилатные (РММА) гранулы покупали у фирмы Sapidyne, а ЗФР (забуференный фосфатом физиологический раствор), БСА (бычий сывороточный альбумин, фракция V) и антитела к DOT AM получали в лаборатории заявителя (фирма Roche). Конъюгированное с Dylight650® очищенное на основе аффинности козье антитело к человеческому IgG, перекрестно адсорбированное с Fc-фрагментом, покупали у фирмы Bethyl Laboratories (Монтгомери, шт. Техас). Биотинилированные антигены Pb-DOTAM (изомеры А и Б Pb-DOTAM-алкил-биотина, изомеры А и Б Pb-DOTAM-Bn-биотина/TCMC-Pb-dPEG3-биотина) и небиотинилированный Pb-DOTAM получали от фирмы AREVA Med (Бетезда, шт. Мэриленд).

Получение покрытых антигеном гранул

На РММА-гранулы наносили покрытие согласно протоколу, указанному в справочнике KinExA для биотинилированных молекул (фирма Sapidyne). В целом метод состоял в следующем. Во-первых, для нанесения адсорбирующего покрытия добавляли по 10 мкг биотин-БСА (фирма Thermo Scientific) в 1 мл ЗФР (рН 7,4) на флакон гранул (200 мг). После вращения в течение 2 ч при комнатной температуре супернатант удаляли и гранулы промывали 5 раз 1 мл ЗФР. Во-вторых, к гранулам добавляли 1 мл 100 мкг нейтравидина, биотин-связывающего белка (фирма Thermo Scientific) в ЗФР, содержащем 10 мг/мл БСА, и инкубировали при комнатной температуре еще в течение 2 ч для связывания нейтравидина с гранулами и для создания дополнительных связывающих биотин сайтов для последующего связывания биотинилированных белков.Затем покрытые нейтравидином гранулы промывали 5 раз 1 мл ЗФР. И, в завершение, на гранулы наносили покрытие с использованием 200 нг/мл смеси изомеров Pb-DOTAM (по 50 нг каждого изомера) в ЗФР и инкубировали еще в течение 2 ч при комнатной температуре. После этого гранулы ресуспендировали в 30 мл ЗФР и сразу же использовали.

Анализы методом KinExA в условиях равновесия Все эксперименты методом KinExA проводили при комнатной температуре (КТ) с использованием ЗФР рН 7,4 в качестве подвижного буфера. Образцы приготавливали в подвижном буфере, дополненном 1 мг/мл БСА («буфер для образца»). Скорость потока составляла 0,25 мл/мин. Постоянное количество антитела к DOTAM с концентрацией сайтов связывания 5 пМ титровали с использованием двукратных серийных разведений антигена Pb-DOTAM, начиная с концентрации ЮОпМ (диапазон концентраций 0,049-100пМ). Один образец антитела без антигена служил в качестве образца, сигнал от которого принимали за 100% (т.е. без ингибирования). Комплексы антиген-антитело инкубировали при КТ в течение по меньшей мере 24 ч для достижения равновесия. Затем уравновешенные смеси пропускали через колонку, содержащую сшитые с Pb-DOTAM гранулы, в системе KinExA в объеме 5 мл, давая возможность гранулам захватывать несвязанное антитело без нарушения состояния равновесия раствора. Детекцию захваченного антитела осуществляли с использованием 250 нг/мл конъюгированного с Dylight 650© вторичного антитела, специфического для человеческого Fc-фрагмента, в буфере для образца. Измерения для каждого образца проводили в двух повторностях во всех экспериментах по уравновешиванию.

Величины KD определяли с помощью нелинейного регрессионного анализа данных с использованием модели односайтового гомогенного связывания, входящей в пакет программ KinExA (версия 4.0.11), используя метод «стандартного анализа». Программное обеспечение позволяло рассчитывать величины KD и определять 95%-ный доверительный интервал на основе аппроксимации экспериментальных точек теоретической кривой KD. 95%-ный доверительный интервал (Sapidyne TechNote TN207R0) представлен в виде величин KD_low и KD_high.

Оценка термостабильности гуманизированных молекул PRIT

Метод и анализ данных

Различные варианты гуманизированных PRIT-молекул в окончательном формате (в 20 мМ гистидине, 140 мМ NaCl, рН 6,0) разводили в одном и том же буфере до концентрации 1 мг/мл. По 30 мкл каждого образца переносили в 384-луночный планшет фильтровального устройства (наряду с антителом к HER3 в качестве референс-антитела). После центрифугирования при 1000 × g в течение 1 мин в лунки наслаивали по 10 мкл парафинового масла. Планшет снова центрифугировали (1000 × g в течение 1 мин) и переносили в планшет-ридер для DLS (Dyna Pro PlateReader-II, фирма Wyatt). Температуру повышали, начиная с 25°С, до 79,9°С со скоростью 0,05°С/мин. Рассеянный свет регистрировали использованием программы Dynamics Software (V7.0).

Данные переносили в базу Excel (фирма Microsoft), сортировали в зависимости от образца и температуры и применяли пакет программ надстройки для создания кривых плавления. Температуру, при которой наблюдалось выраженное отклонение от исходного уровня, определяли как «начало агрегации», а точку излома на кривой плавления как «температуру плавления».

Результаты

Характеристики кандидатов

В приведенных ниже таблицах обобщены данные, характеризующие различные PRIT-молекулы, и дано сравнение их характеристик. Предпочтительными соединениями являлись PRIT-0213 и PRIT-0214.

Обобщение данных о кандидатах

Ниже представлены дополнительные данные о величинах аффинности, полученные с помощью системы Kinexa, для PRIT-0213. (PRIT-0213 представляет собой ту же самую молекулу, что и PRIT-0186, за исключением наличия других связывающих CEA VH/VL.) PRIT-0213

Аффинности BsAb CEA-DOTAM к хелату металл-РОТАМ

Дополнительные данные представлены ниже:

Последовательности

Ниже представлены последовательности антител для данного примера. Оба антитела PRIT-0213 и -0214 имеют сайт связывания для Pb-DOTAM, содержащий CDR, которые имеют представленные ниже последовательности SEQ ID NO: 116-121. Последовательности вариабельных областей тяжелых и легких цепей сайта связывания для Pb-DOTAM антитела PRIT-0213 представлены в SEQ ID NO: 122-123, а соответствующие последовательности PRIT-0214 представлены в SEQ ID NO: 124-125.

PRIT-0214 состоит из: I) первой тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 126;

II) второй тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 127 и

III) двух легких цепей антитела, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128.

PRIT-0213 состоит из:

I) первой тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность:

129;

II) второй тяжелой цепи, имеющей аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 130 и

III) двух легких цепей антитела, имеющих аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 128.

Пример 3: Кристаллизация, сбор данных и определение структуры комплекса Fab Р1АА1227 Pb-DOTAM

Для формирования комплекса смешивали Fab, полученный из гуманизированных VH/VL PRIT-0213, который обозначали как Р1АА1227, в концентрации 26 мг/мл с порошкообразным Pb-DOTAM в молярном соотношении 1:4,2. После инкубации в течение 2 ч при 4°С осуществляли начальные опыты по кристаллизации методом «сидящей капли» в устройстве для диффузии паров при 21°С с использованием экрана JCSG+ (фирма Qiagen, Гильден). Кристаллы формировались в течение 5 дней в присутствии 0,2М (NH₄)₂SO₄, 0,1Μ бис-Трис, рН 5,5, 25% (мас./об.) PEG3350. Кристаллы собирали непосредственно с планшета для скрининга без дополнительной стадии оптимизации.

Сбор данных и определение структуры. Для сбора данных кристаллы мгновенно замораживали при 100K в растворе для осаждения, содержащем 10% этиленгликоля. Данные о дифракции собирали при длине волны 1,0000 с использованием детектора PILATUS 6М, помещенного на оси пучка X10SA источника синхротронного излучения (Виллиген, Швейцария). Данные обрабатывали с помощью программного обеспечения XDS (Kabsch W., Acta Cryst. D66, 2010, сс. 133-144) и масштабировали с помощью SADABS (фирма BRUKER). Кристаллы комплекса относились к пространственной группе С2 с осями элементарной ячейки а=135,63 b=56,42 с=64,52и β=108,36, картину дифракции получали с разрешением 1,40 Структуру определяли методом молекулярного замещения с помощью программы PHASER (McCoy A.J, Grosse-Kunstleve R.W., Adams P.D., Storoni L.C. и Read R.J., J. Appl. Cryst. 40, 2007, cc. 58-674), используя координаты разработанной в лаборатории заявителей структуры Fab в качестве поисковой модели. Различия в электронной плотности использовали для определения положения Pb-DOTAM и изменения аминокислот в соответствии с различиями в последовательностях при уточнении реальной пространственной структуры. Структуры уточняли с помощью программ из пакета ССР4 (Collaborative Computational Project, Number 4 Acta Cryst. D50, 1994, cc. 760-763) и BUSTER (Bricogne G., Blanc E., Brandl M., Flensburg C, Keller P., Paciorek W., Roversi P., Sharff Α., Smart O.S., Vonrhein C, Womack Т.О., версия Buster 2.9.5 Cambridge, United Kingdom:Global Phasing Ltd., 2011). Перестроение вручную осуществляли с помощью COOT (Emsley P., Lohkamp В., Scott W.G. и Cowtan K. Acta Cryst D66, 2010, cc. 486-501).

Собранные данные и уточненные статистические данные обобщены ниже. Все графические презентации получали с помощью программы PYMOL (The Pymol Molecular Graphics System, версия 1.7.4. Schrodinger, LLC).

Собранные данные и уточненные статистические данные для комплекса Fab P1AA1227-Pb-DOTAM

Структура Fab Р1АА1227 в комплексе с Pb-DOTAM Для подробной характеризации взаимодействия Pb-DOTAM с Fab Р1АА1227 при создании изобретения определяли кристаллическую структуру комплекса с разрешением 1,40 Анализ структуры выявил, что основной вклад в связывание Fab Р1АА1227 с Pb-DOTAM вносят CDR1 и CDR3 легкой цепи и CDR2 и CDR3 тяжелой цепи.

Анализ связывающихся поверхностей раздела с помощью программы PISA выявил схему взаимодействия Fab Р1АА1227 с Pb-DOTAM, которая включает 3 гидрофобные связи, полярные взаимодействия и контакты, обусловленные Ван-дер-Ваальсовыми силами. Pb-DOTAM связывается в кармане, образованном тяжелой и легкой цепью. Этот карман имеет форму коробки, открытой с одной стороны. Боковые стенки и дно кармана участвуют в неполярных взаимодействиях, в то время как на кромках стенок доминируют полярные взаимодействия. Водородные связи боковой цепи формируются между остатками Glu95 и Asp97 CDR3 тяжелой цепи и карбамоильными атомами азота N7 и N8 DOT AM. Дополнительная водородная связь формируется между карбонильным атомом Arg96 основной цепи (mc) и атомом N7 DOTAM. Комплекс дополнительно стабилизируется посредством неполярных взаимодействий Phe50 и Tyr58 CDR2 тяжелой цепи, боковые цепи которых ориентированы по типу «ребро-к грани» относительно азациклододеканового кольца. Легкая цепь в основном формирует «дно» кармана с помощью остатков Gly91-Tyr96 CDR3, обеспечивающих неполярные контакты с тетрациклододекановым кольцом. Asp32 обеспечивает водородную связь с карбамоильным атомом азота N6 DOTAM (нумерация согласно Кэботу).

В приведенной ниже таблице указаны остатки паратопа тяжелой цепи, выявленные путем анализа с помощью программы PISA.

В приведенной ниже таблице указаны остатки паратопа легкой цепи, идентифицированные на основе анализа с использованием программы PISA.

В представленных ниже последовательностях остатки паратопа также подчеркнуты:

Пример 4: Создание антител СЕА-сплит-DOTAM VH/VL В методах PRIT (претаргетная радиоиммунная терапия) с использованием биспецифических антител, имеющих сайт связывания для антигена-мишени и сайт связывания для радиоактивномеченого соединения, как правило, применяют очищающий агент (СА) между введениями антитела и радиолиганда для обеспечения эффективного таргетинга и высоких соотношений между дозами, адсорбированными опухолью и здоровой тканью (см. фиг. 3). В одном из примеров такого метода инъецированному BsAb дают возможность проникать в опухоли в течение достаточного периода времени, как правило, в течение 4-10 дней, после чего циркулирующее BsAb нейтрализуют с использованием СА Pb-DOTAM-декстран-500. СА блокирует связывание ²¹²Pb-DOTAM с нетаргетированным BsAb без проникновения в опухоль, что должно было блокировать претаргетированные сайты. Такой режим предварительного таргетирования позволяет обеспечивать эффективное накопление вводимого после этого радиоактивномеченого ²¹²Pb-DOTAM.

Однако в методах с использованием очищающего агента применение СА означает включение в метод дополнительной стадии, что является неэффективным. Кроме того, может оказаться важным тщательно выбирать временной график введения и дозирование СА, что является усложняющим фактором.

Для решения проблем, ассоциированных с применением очищающего агента, при создании настоящего изобретения была предложена стратегия разделения доменов VL и VH антитела к DOTAM таким образом, чтобы они находились в отдельных антителах.

Создание представленных в качестве примеров сплит-антител DOTAM VH/VL дополнительно описано ниже.

Создание плазмид для рекомбинантной экспрессии тяжелых и легких цепей антитела

Требуемые белки экспрессировали путем кратковременной трансфекции клетках почки эмбриона человека (HEK 293). Для экспрессии требуемого гена/белка (например, тяжелой цепи полноразмерного антитела, легкой цепи полноразмерного антитела или тяжелой цепи полноразмерного антитела, содержащей дополнительный домен (например, вариабельный домен тяжелой или легкой цепи иммуноглобулина на ее С-конце) применяли транскрипционную единицу, содержащую следующие функциональные элементы:

- немедленно-ранний энхансер и промотор из человеческого цитомегаловируса (P-CMV), включая интрон А,

5’-нетранслируемую область (5’UTR) тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина,

- сигнальную последовательность (SS) тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина,

- подлежащий экспрессии ген/белок и

- последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH рА).

Помимо единицы/кассеты экспрессии, включающей подлежащий экспрессии требуемый ген, основная/стандартная экспрессионная плазмида содержала

- сайт инициации репликации из вектора pUC18, обеспечивающий репликацию этой плазмиды в Е. coli, и

- ген бета-лактамазы, придающий устойчивость к ампициллину в Е. coli.

а) Экспрессионная плазмида для тяжелых цепей

Гены, включая гены С-концевого слияния, кодирующие тяжелую цепь которая содержит полную и функциональную тяжелую цепь антитела, за которой следует дополнительный V-домен тяжелой или V-домен легкой цепи антитела, собирали путем слияния ДНК-фрагмента, кодирующего соответствующие элементы последовательности (V-домен тяжелой или V-домен легкой цепи), каждый из которых отделен линкером G4Sx4, с С-концом СН3-домена молекулы человеческого IgG (VH-СН1-шарнир-СН2-СН3-линкер-VH или VH-CH1-шарнир-CH2-CH3-линкер-VL). Рекомбинантные молекулы антитела, несущие один VH- и один VL-домен на С-концах двух СН3-доменов соответственно экспрессировали с использованием технологии «knob-into-hole».

Экспрессионные плазмиды для кратковременной экспрессии тяжелой цепи антитела с С-концевым VH- или VL-доменом в HEK293-клетках содержали помимо кассеты экспрессии фрагмента, представляющего собой тяжелую цепь антитела с С-концевым VH- или VL-доменом, сайт инициации репликации из вектора pUC18, обеспечивающего репликацию указанной плазмиды в Е. coli, и ген бета-лактамазы, придающего устойчивость к ампициллину в Е. coli. Транскрипционная единица фрагмента, представляющего собой тяжелую цепь антитела с геном С-концевого слияния VH- или VL-домена, содержала следующие функциональные элементы:

- немедленно-ранний энхансер и промотор из человеческого цитомегаловируса (P-CMV), включая интрон А,

- 5'-нетранслируемую область (5'UTR) тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина,

- сигнальную последовательность тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина,

- нуклеиновую кислоту, кодирующую тяжелую цепь антитела (VH-CH1-шарнир-СН2-СН3-линкер-VH или УН-СШ-шарнир-СН2-СН3-линкер-VL), и

- последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH рА).

Ниже представлена аминокислотная последовательность белка фрагмента тяжелой цепи зрелого антитела, слитой на С-конце с VH- или VL-доменом:

PRIT сплит-антитело с DOTAM-VH - P1AD8749

PRIT сплит-антитело с DOTAM-VL-P1AD8592

б) Экспрессионная плазмида для легких цепей антитела Гены, кодирующие легкую цепь антитела, которая содержала полную и функциональную легкую цепь антитела, собирали путем слияния ДНК-фрагментов, кодирующих соответствующие элементы последовательности. Экспрессионная плазмида для кратковременной экспрессии легкой цепи антитела содержала помимо фрагмента легкой цепи антитела, сайт инициации репликации из вектора pUC18, который обеспечивает репликацию этой плазмиды в Е. coli, и ген бета-лактамазы, придающий устойчивость к ампициллину в Е. coli. Транскрипционная единица для фрагмента, представляющего собой легкую цепь антитела, содержала следующие функциональные элементы:

- немедленно-ранний энхансер и промотор из человеческого цитомегаловируса (P-CMV), включая интрон А,

- 5’-нетранслируемую область (5’UTR) тяжелой цепи человеческого иммуноглобулина,

- сигнальную последовательность тяжелой цепи мышиного иммуноглобулина,

- нуклеиновую кислоту, кодирующую легкую цепь антитела (VL-CL), и

- последовательность полиаденилирования бычьего гормона роста (BGH рА).

Аминокислотная последовательность фрагмента легкой цепи зрелого антитела была одинаковой для P1AD8592 и P1AD8749.

Кратковременная экспрессия молекул антитела Молекулы антител получали в кратковременно трансфектированных HEK293-клетках (полученных из линии клеток почки эмбриона человека 293), которые культивировали в среде F17 (фирма Invitrogen Corp.). Для трансфекции применяли реагент для трансфекции «293-Free» (фирма Novagen). Для экспрессии соответствующих молекул тяжелой и легкой цепи антитела, описанных выше, использовали индивидуальные экспрессионные плазмиды. Трансфекции осуществляли согласно инструкциям производителя. Содержащие иммуноглобулин супернатанты клеточной культуры собирали через три-семь (3-7) дней после трансфекции. Супернатанты хранили при пониженной температуре (например, при -80°С) до осуществления очистки.

Общая информация касательно рекомбинантной экспрессии человеческих иммуноглобулинов, например, в HEK293-клетках, приведена у: Meissner Р. и др., Biotechnol. Bioeng. 75, 2001, сс.197-203.

PRIT-полуантитела (сплит-антитела) очищали с использованием MabSelect Sure (аффинная хроматография) и затем Superdex 200 (гель-фильтрация). PRIT сплит-антитело с DOTAM-VL-P1AD8592 получали в количестве 5 мг с концентрацией 1,372 мг/мл и чистотой >96% по данным аналитической SEC и капиллярного электрофореза в присутствии додецилсуцльфата наттрия (КЭ-ДСН). PRIT сплит-антитело с DOTAM-VH-P1AD8749 получали в количестве 14 мг с концентрацией 2,03 мг/мл и чистотой >91% по данным аналитической SEC и КЭ-ДСН.

Создавали также антитела Р1АЕ4956 и Р1АЕ4957, последовательности которых представлены в настоящем описании. (Р1АЕ4956 содержало тяжелые цепи, имеющие SEQ ID NO: 51 и 52, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 54; Р1АЕ4957 содержало тяжелые цепи, имеющие SEQ ID NO: 55 и 56, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 58). PRIT сплит-антитело с DOTAM-VL-Р1АЕ4957 получали в количестве 19 мг с концентрацией 2,6 мг/мл и чистотой >81,6% по данным аналитической SEC и CE-SDS. PRIT сплит-антитело с DOTAM-VH-Р1АЕ4956 получали в количестве 6,9 мг с концентрацией 1,5 мг/мл и чистотой >90% по данным аналитической SEC и CE-SDS. Для подтверждения идентичности PRIT-полуантител применяли также ESI-MC.

Пример 5: FACS-анализ функциональности сплит-антител

Для оценки функциональности сплит-антител или полуантител MKN-45-клетки отделяли от культурального сосуда с помощью аккутазы при 37°С в течение 10 мин. Затем клетки промывали дважды в ЗФР и высевали в 96-луночные планшеты с V-образным дном до достижения конечной плотности 4×10⁶ клеток/лунку.

Полуантитела P1AD8749 и P1AD8592 и человеческое контрольное антитело, соответсвующее смеждународному стандарту ISO, смешивали в соотношении 1:1 и добавляли к клеткам в концентрациях, указанных на фиг. 5. Затем клетки инкубировали в течение 1 ч на льду и промывали дважды в ЗФР. Клеточный дебрис ресуспендировали и добавляли из расчета по 40 мкл/лунку реагент для детекции, представляющий собой либо < человеческий IgG(H+L)>OHTL(, (10 мкг/мл), либо Pb_Dotam_ФИТЦ 1:100=>(10 мкг/мл) в ЗФР/5% FCS. После инкубации в течение 60 мин на льду клетки промывали дважды в ЗФР и ресуспендировали в 200 мкл ЗФР/5% FCS для измерения ФИТЦ-флуоресценции с помощью устройства FACS Canto.

Для оценки способности полуантител связываться с СБА на MKN-45-клетках, проводили их обнаружение с помощью антител с использованием вторичных антител, специфических в отношении человеческого IgG (фиг. 5). Как и ожидалось, на этих клетках не было выявлено значимого связывания человеческого контрольного ISO-антитела. Для обоих полуантител, а также комбинации обоих антител при доведении их концентрации до концентрации IgG выявлено зависящее от дозы связывание с MKN-45-клетками, при этом, как и ожидалось, имел место выраженный «хук-эффект» при очень высокой концентрации. Этот эксперимент продемонстрировал, что полуантитела обладают функциональным связыванием с СБА.

Для оценки способности полуантител связываться с DOTAM осуществляли их связывание с клетками либо в присутствии человеческого контрольного ISO-антитела, либо их соответствующего полуантитела-партнера (сплит-антитела) в соотношении 1:1. После их связывания с MKN-45-клетками клетки промывали для удаления несвязанного антитела. Затем добавляли Pb-DOTAM-ФИТЦ (флуоресцентномеченый Pb-DOTAM) для определения антител, связанных с компетентными в отношении связывания с DOTAM клетками (фиг. 6). Как и ожидалось, не было выявлено значимого ФИТЦ-сигнала на этих клетках, когда одно из полуантител-партнеров (сплит-антител) применяли в комбинации с человеческим контрольным ISO-антителом. Только в случае применения комбинации обоих полуантител в соотношении 1:1 выявляли зависящий от дозы ФИТЦ-сигнал. Этот эксперимент продемонстрировал, что сайт связывания DOTAM становится функциональным, когда оба полуантитела объединяются на одной клетке.

Пример 6: Исследования in vivo

Пример 6а: Материалы и методы общие сведения

Все экспериментальные протоколы были рассмотрены и одобрены местными регулирующими органами ( d’Ethique de Animale du Limousin [CREEAL], Laboratoire d’Analyses et de Recherches de la Haute-Vienne). Самок мышей с серьезным комбинированным иммунодефицитом (SCID) (фирма Charles River) содержали в условиях, свободных от специфических и условно-патогенных организмов (SOPF), при суточных циклах свет/темнота (12 ч/12 ч) в соответствии с руководствами по этике. В течение первых 5 дней после доставки не осуществляли никаких манипуляций для того, чтобы дать возможность животным акклиматизироваться к новым условиям. Ежедневно осуществляли контроль животных в отношении клинических симптомов и для обнаружения нежелательных явлений.

Ксенотрансплантаты солидных опухолей создавали путем подкожной (SC) инъекции экспрессирующих СЕА опухолевых клеток в среде для клеток, смешанной в соотношении 1:1 с матриксом базальной мембраны Corning® Matrigel® (с пониженным содержанием фактора роста; каталожный номер 354230). Объемы опухоли оценивали путем измерения кронциркулем вручную 3 раза в неделю и рассчитывали по формуле: объем = 0,5 × длина × ширина². Дополнительные измерения опухоли осуществляли по мере необходимости в зависимости от скорости роста опухоли.

Мышей умерщвляли до достижения предусмотренной графиком конечной точки, если у них проявлялись признаки невыносимого дистресса или боли из-за опухолевой нагрузки, побочных действий инъекций или других причин. Свидетельствами боли, дистресса или дискомфорта являлись (но не ограничиваясь только ими) резкая потеря веса тела (BW), неряшливая шерсть, диарея, сгорбленная поза и вялость. BW обработанных животных измеряли 3 раза в неделю, при необходимости осуществляли дополнительные измерения в зависимости от состояния здоровья. Влажный корм давали всем животным, начиная со следующего дня после радиоактивной инъекции, в течение 7 дней или до тех пор, пока все особи не восстанавливались в достаточной степени после какой-либо резкой потери BW. Мышей, у которых потеря BW превышала 20% от их начального BW или у которых объем опухоли достигал 3000 мм³, сразу же умерщвляли. Другими факторами, которые учитывали при умерщвлении по этическим причинам, являлись состояние опухоли (например, наличие некротических областей, просачивание крови/жидкости, признаки членовредительства) и общий внешний вид животного (например, состояние шерсти, поза, подвижность).

Для минимизации повторного поглощения радиоактивной мочи/экскрементов всех мышей, на которых проводили исследования эффективности, помещали в клетки с решетчатыми полами на 4 ч после введения Pb-DOTAM перед переносом в новые клетки со стандартной подстилкой. Затем через 24 ч после инъекции (p.i.) все клетки заменяли. Эту процедуру не осуществляли для мышей, которых умерщвляли для целей исследования биораспределения в период до 24 ч после радиоактивной инъекции.

Кровь собирали при умерщвлении анестезированных мышей из венозного синуса посредством ретро-орбитального кровопускания перед умерщвлением путем смещения шейных позвонков, после чего дополнительно собирали ткань для измерений радиоактивности и/или гистологического анализа согласно требованиям протокола. Регистрировали неожиданные или аномальные состояния. Ткани, собранные для фиксации в формалине, сразу помещали в 10%-ный нейтральный забуференный формалин (4°С) и затем через 5 дней переносили в забуференный фосфатом физиологический раствор (ЗФР; 4°С). Органы и ткани, собранные для целей исследования биораспределения, взвешивали и измеряли радиоактивность с использованием автоматического гамма-счетчика 2470 WIZARD (фирма PerkinElmer), после чего рассчитывали процент инъецированной дозы на грамм ткани (% ID/г) с учетом поправок на распад и фоновый уровень.

Статистический анализ проводили с использованием программного обеспечения GraphPad Prism 7 (фирма GraphPad Software, Inc.) и JMP 12 (фирма SAS Institute Inc.). Анализ кривых ингибирования роста опухоли (TGI) осуществляли на основе средних объемов опухолей с использованием формулы:

где d обозначает день опыта, а 0 - исходный уровень. В качестве референс-группы принимали группу, обработанную наполнителем. Регресс опухоли (TR) рассчитывали по формуле:

в которой положительные величины свидетельствуют о регрессе опухоли, а величины ниже -1 соответствуют росту, выходящему за пределы удвоенного исходного уровня.

Тестируемые соединения

В приведенных ниже таблицах представлены соединения, которые использовали в описанных исследованиях, а именно, биспецифические антитела, очищающие агенты и радиоактивномеченые хелаты соответственно.

CEA-DOTAM (RO7198427, PRIT-0213) представляло собой полностью гуманизированное BsAb, таргетирующее эпитоп Т84.66 СЕА, в то время как DIG-DOTAM (RO7204012) представляло собой не связывающееся с СЕА BsAb, которое применяли в качестве отрицательного контроля. P1AD8749, P1AD8592, Р1АЕ4956 и Р1АЕ4957 представляли собой антитела СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL, таргетирующие эпитопы СН1А1А или А5В7 СЕА. Все конструкции антител хранили при 80°С до дня инъекции, когда их подвергали оттаиванию и разводили в стандартном буфере, представляющем собой носитель (20 мМ гистидин, 140 мМ NaCl; рН 6,0), или 0,9% NaCl до соответствующих концентраций для внутривенного (IV) или внутрибрюшинного (IP) введения.

СА Pb-DOTAM-декстран-500 (RO7201869) хранили при -20°С до дня инъекции, когда их подвергали оттаиванию и разводили в ЗФР для IV- или IP-введения.

Хелат DOTAM для радиоактивного мечения получали от фирмы Macrocyclics и хранили при 20°С до осуществления радиоактивного мечения, которое проводили на фирме Orano Med ( France). Pb-DOTAM (RO7205834) создавали путем элюирования DOTAM из ториевого генератора и последующего гашения с помощью Са после мечения. Раствор ²¹²Pb-DOTAM разводили 0,9% NaCl до достижения требуемой активной концентрации ²¹²Pb для IV-инъекции.

Мышам в обрабатываемых наполнителем контрольных группах вводили путем нескольких инъекций используемый в качестве наполнителя буфер вместо BsAb, СА и ²¹²Pb-DOTAM.

Биспецифические антитела

Очищающие агенты

Радиоактивномеченые хелаты

Модели опухоли

Применяемая линия опухолевых клеток и инъецируемое количество для инокуляции мышам, представлены в приведенной ниже таблице. ВхРС3 представляет собой клеточную линию человеческой первичной аденокарциномы поджелудочной железы, которая в естественных условиях экспрессирует СЕА. Клетки ВхРС3 культивировали в среде RPMI-1640, содержащей добавку GlutaMAX™, HEPES (фирма Gibco, каталожный номер 72400-021), обогащенной 10% фетальной бычьей сыворотки (фирма GE Healthcare, Hyclone SH30088.03). Ксенотрансплантаты солидных опухолей создавали в каждой из SCID-мышей в день опыта 0 путем подкожной инъекции клеток в среде RPMI, смешанной в соотношении 1:1 с матриксом базальной мембраны Corning® Matrigel® (уменьшенный уровень фактора роста; каталожный №354230), в правую боковую область.

Линии опухолевых клеток

Пример 66: протокол 144

Протокол 144 предназначен для получения ФК и данных о распределении in vivo претаргетированного ²¹²Pb-DOTAM в организме SCID-мышей, несущих SC ВхРС3-опухоли, после осуществления 2-стадийной PRIT с использованием BsAb СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL.

Двухстадийную PRIT осуществляли путем инъекции СЕА-сплит-DOTAM-VH и СЕА-сплит-DOTAM-VL (P1AD8749 и P1AD8592) индивидуально или в сочетании друг с другом и последующего введения спустя 7 дней ²¹²Pb-DOTAM. Мышей умерщвляли через 6 ч после радиоактивной инъекции и собирали кровь и органы для измерений радиоактивности. 2-стадийную схему сравнивали с 3-стадийной PRIT, в которой применяли стандартное биспецифическое антитело к CEA-DOTAM с последующим введением спустя 7 дней СА, представляющего собой Са-ООТАМ-декстран-500, и затем ²¹²Pb-DOTAM через 24 ч после введения СА.

ФК-данные о клиренсе СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL получали путем повторного взятия образцов крови в период с 1 ч до 7 дней после инъекции антитела и затем анализировали с помощью ELISA.

Схема опыта проиллюстрирована на фиг. 7. На фиг. а представлена схема 2-стадийного режима PRIT, включающего взятие образцов крови для изучения ФК СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL у SCID-мышей, несущих SC ВхРС3-опухоли. На фиг. 7б представлена схема 3-стадийного режима PRIT, которую осуществляли на SCID-мышах, несущих SC ВхРС3-опухоли (ч = часы, d = дни).

План опыта

Временной график и план протокола 144 приведен в представленной ниже таблице.

Временной график протокола 144

Подопытные группы согласно протоколу 144

Ксенотрансплантаты солидных опухолей создавали в каждой SCID-мыши в день опыта 0 путем SC-инъекции 5×10⁶ клеток (пассаж 26) в RPMI/Matrigel в правую боковую область. Через 14 дней после инъекции опухолевых клеток мышей разделяли на экспериментальные группы со средним объемом опухоли 116 мм³. ²¹²Pb-DOTAM инъецировали в день 22 после инокуляции; в день 21 средний объем опухоли составлял 140 мм.

Кровь у мышей в группах Аа, Ба и Ва собирали посредством ретро-орбитального кровопускания под анестезией через 1 ч (правый глаз), 24 ч (левый глаз) и 168 ч (правый глаз, при умерщвлении) после инъекции СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL. Аналогичным образом, у мышей в группах Аб, Бб и Вб образцы брали через 4 ч (правый глаз), 72 ч (левый глаз) и 168 ч (правый глаз, при умерщвлении) после инъекции СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL.

Мышей в группах Аа, Ба, Ва и Г умерщвляли и подвергали аутопсии через 6 ч после инъекции ²¹²Pb-DOTAM, и собирали перечисленные ниже органы и ткани для измерения уровня радиоактивности: кровь, кожу, мочевой пузырь, желудок, тонкий кишечник, ободочную кишку, селезенку, поджелудочную железу, почки, печень, легкое, сердце, бедренную кость, мышцу, головной мозг, хвост, уши и опухоль.

Результаты

Данные о среднем накоплении ²¹²Pb и клиренсе во всех собранных тканях через 6 ч после инъекции представлены на фиг. 8. Претаргетинг с использованием либо СЕА-сплит-DOTAM-VH, либо СЕА-сплит-DOTAM-VL, индивидуально приводил к отсутствию накопления радиоактивности в опухолях. При применении в комбинации два комплементарных антитела приводили к уровню поглощения после осуществления 2-стадийной PRIT, составлявшему 65±12% ID/г, по сравнению с 87±15% ID/г после стандартного 3-стадийного режима PRIT. Двухсторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с использованием критерия Тьюки для множественных сравнений показал, что различие в уровнях поглощения в опухоли между двумя PRIT-обработками было значимым, также как и различие в мочевом пузыре (1±2% ID/г и 38±17% ID/г для 2- и 3-стадийной PRIT соответственно); других статистически значимых различий в накоплении в ткани не было выявлено с использованием указанного критерия (р=0,05).

Данные о клиренсе IV-инъецированных конструкций СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL, полученные с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), представлены на фиг. 9.

Нежелательные явления и токсичность

Не было обнаружено нежелательных явлений или токсичности, связанных с рассматриваемым опытом.

Выводы

Результаты рассматриваемого опыта продемонстрировали правильность концепции СА-независимого 2-стадийного претаргетинга с использованием комплементарных антител СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL. При применении 2-стадийной PRIT и стандартной 3-стадийной PRIT с использованием комплементарных антител СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL обеспечивалось высокое и специфические поглощение Pb-DOTAM опухолью при очень малом накоплении радиоактивности в здоровых тканях.

Пример 6в: протокол 158

Протокол 158 предназначен для оценки ассоциации ²¹²Pb-DOTAM с подкожными ВхРС3-опухолями у мышей, претаргетированных би-паратопными (СН1А1А и А5 В7) парами антител СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL для осуществления не зависящей от очищающего агента 2-стадийной CEA-PRIT. Поглощение опухолью сравнивали с поглощением при осуществлении стандартной 3-стадийной CEA-PRIT.

Мышам, несущим подкожные ВхРС3-опухоли вводили путем инъекции либо антитела СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL с последующим введением спустя 7 дней радиоактивномеченого ²¹²Pb-DOTAM (2-стадийная PRIT), либо

BsAb CEA-DOTAM с последующим введением спустя 7 дней СА и, в завершение, через 24 ч радиоактивномеченого ²¹²Pb-DOTAM (3-стадийная PRIT).

Распределение in vivo ²¹²Pb-DOTAM оценивали через 6 ч после радиоактивной инъекции. Схема опыта представлена на фиг. 10.

План опыта

Временной график и план согласно протоколу 158 представлен в приведенной ниже таблице.

Временной график протокола 158

Подопытные группы согласно протоколу 158

Ксенотрансплантаты солидных опухолей создавали в каждой SCID-мыши в день опыта 0 путем SC-инъекции 5×10⁶ клеток (пассаж 27) в RPMI/Matrigel в правую боковую область. Через 14 дней после инъекции опухолевых клеток мышей разделяли на экспериментальные группы со средним объемом опухоли 177 мм³. ²¹²Pb-DOTAM инъецировали в день 20 после инокуляции; в день 21 средний объем опухоли составлял 243 мм³.

Мышей во всех группах умерщвляли и подвергали аутопсии через 6 ч после инъекции ²¹²Pb-DOTAM, и собирали перечисленные ниже органы и ткани для измерения уровня радиоактивности: кровь, кожу, мочевой пузырь, желудок, тонкий кишечник, ободочную кишку, селезенку, поджелудочную железу, почки, печень, легкое, сердце, бедренную кость, мышцу, головной мозг, хвост и опухоль.

Результаты

Средние уровни распределения ²¹²Pb во всех собранных тканях через 6 ч после инъекции представлены на фиг. 11. Двусторонний дисперсионный анализ с использованием критерия Тьюки для множественных сравнений показал отсутствие статистически значимого различия в поглощении ²¹²Pb здоровыми тканями между тремя видами обработки, за исключением мочевого пузыря, в указанном органе при использовании обеих бипаратопных пар СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL происходило меньшее накопление, чем при применении стандартной 3-стадийной PRIT. Поглощение в печени составляло 3-4% ID/г для всех трех видов обработки. Любая из бипаратопных комбинаций приводила к накоплению в опухоли, составляющему примерно 56% ID/г, по сравнению с 67% ID/г в случае 3-стадийной PRIT; различие между 2- и 3-стадийной PRIT было статистически значимым (р<0,0001).

Нежелательные явления и токсичность

Не выявлено нежелательных явлений или токсичности, связанных с рассматриваемым опытом.

Выводы

В рассматриваемом опыте оценивали ассоциацию ²¹²Pb-DOTAM с SC ВхРС3-опухолями у мышей, претаргетированных бипаратопными парами антител СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL при осуществлении не зависящей от СА 2-стадийной CEA-PRIT, в сравнении со стандартной 3-стадийной PRIT.

Распределения ²¹²Pb через 6 ч после инъекции в случае 2- и 3-стадийных PRIT оказались сопоставимыми, они характеризовались высоким уровнем накопления в опухоли и очень низким уровнем радиоактивности в здоровых тканях. Это демонстрирует правильность концепции бипаратопного 2-стадийного претаргетинга СЕА-экспрессирующих опухолей для 2-стадийной CEA-PRIT с использованием антител СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL.

Пример 6г: Протокол 160

Протокол 160 предназначен для сравнения терапевтической эффективности после 3-циклов не зависящей от СА 2-стадийной CEA-PRIT с использованием комплементарных антител СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL с эффективностью стандартной 3-стадийной CEA-PRIT на мышах, несущих SC ВхРС3-опухоли. Проводили также сравнение с 1-стадийной CEA-RIT с использованием BsAb, которые перед осуществлением инъекции предварительно инкубировали с ²¹²Pb-DOTAM.

Мышам, несущим SC ВхРС3-опухоли, вводили путем инъекции либо BsAb CEA-DOTAM, после чего вводили спустя 7 дней СА и, в завершение, через 24 ч радиоактивномеченый ²¹²Pb-DOTAM (3-стадийная PRIT),

либо антитела СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL, после чего вводили спустя 7 дней радиоактивномеченый ²¹²Pb-DOTAM (2-стадийная PRIT),

либо BsAb ²¹²Pb-DOTAM-CEA-DOTAM (предварительно инкубированный; 1-стадийная RIT).

Терапия включала осуществление 3 повторных циклов введения 20 мкКи ²¹²Pb-DOTAM, при этом проводили также сравнение с не связывающим СЕА контрольным антителом (DIG-DOTAM) и вариантом без (терапевтической) обработки (обработка наполнителем). Предназначенных для этой цели мышей умерщвляли для исследования биораспределения с целью подтверждения таргетинга и клиренса ²¹²Pb-DOTAM при каждом цикле обработки. Эффективность обработки оценивали в понятиях TGI и TR, и в процессе опыта осуществляли тщательный мониторинг мышей для оценки переносимости обработки. Схема опыта представлена на фиг. 12.

Временной график и план протокола 160 представлены в приведенной ниже таблице.

Временной график протокола 160

Подопытные группы согласно протоколу 160

Ксенотрансплантаты солидной опухоли создавали у SCID-мышей в день опыта 0 путем SC-инъекции 5×10⁶ клеток (пассаж 24) в RPMI/Matrigel в правую боковую область. Через 15 дней после инъекции опухолевых клеток мышей разделяли на экспериментальные группы со средним объемом опухоли 122 мм³. ²¹²Pb-DOTAM инъецировали в день 23 после инокуляции; в день 22 средний объем опухоли составлял 155 мм³.

Антитела CEA-DOTAM и DIG-DOTAM разводили в буфере, представляющем собой наполнитель, до конечной концентрации 100 мкг на 200 мкл для IP-введения согласно приведенной выше таблице (Подопытные группы в протоколе 160). Для осуществления IP-введения антитела СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL смешивали друг с другом в растворе для однократной инъекции, содержащем 100 мкг каждой конструкции на 200 мкл. В случае PI AD8749 дозу доводили до 154 мкг для компенсации 35%-ной «hole/hole»-примеси в маточном растворе (плечо молекулы, которое не несет VH/VL). СА, представляющий собой Са-ООТАМ-декстран-500, вводили IP (25 мкг на 200 мкл ЗФР) через 7 дней после инъекции BsAb, после чего спустя 24 ч вводили ²¹²Pb-DOTAM (RO7205834) согласно схеме эксперимента, представленной на фиг. 12. Мышам, обработанным согласно PRIT (2- и 3-стадийной) инъецировали IV 100 мкл раствора ²¹²Pb-DOTAM (20 мкКи в 100 мкл 0,9% NaCl), погашенного Са.

Мышам, обработанным согласно 1-стадийной RIT, осуществляли только одну инъекцию: вводили антитело, предварительно связанное ²¹²Pb-DOTAM-CEA-DOTAM (20 мкКи/20 мкг BsAb в 100 мкл 0,9% NaCl для IV-инъекции). Непосредственно меченое антитело получали путем инкубации ²¹²Pb-DOTAM с BsAb CEA-DOTAM в течение 10 мин при 37°С.

При умерщвлении у мышей из групп А-Д брали следующие органы и ткани: сыворотку, печень, селезенку, почки, поджелудочную железу и опухоль. Перед умерщвлением живую мышь анестезировали для сбора крови путем ретро-орбитального кровопускания. Собранные образцы крови центрифугировали при 10000 g в течение 5 мин и полученные фракции сыворотки выделяли, замораживали и помещали на хранение при -20°С. Вырезанные ткани немедленно погружали в 10%-ный нейтральный забуференный формалин (4°С) и затем через 24 ч переносили в 1×ЗФР (4°С). Зафиксированные в формалине образцы передавали на фирму Roche Pharma Research and Early Development, Roche Innovation Center Basel для дальнейшей обработки и анализа.

Мышей в группах Е, Ж, К и Η умерщвляли и подвергали аутопсии через 24 ч после первой и единственной инъекции ²¹²Pb-DOTAM или ²¹²Pb-DOTAM-BsAb; мышей в группах З и Л умерщвляли и подвергали аутопсии через 24 ч после второй инъекции ²¹²Pb-DOTAM; мышей в группах И и Μ умерщвляли и подвергали аутопсии через 24 ч после третьей инъекции ²¹²Pb-DOTAM. Кровь собирали у анестезированных мышей при умерщвлении из венозного синуса посредством ретро-орбитального кровопускания перед осуществлением умерщвления посредством смещения шейных позвонков. Для целей изучения биораспределения собирали также следующие органы и ткани: мочевой пузырь, селезенку, почки, печень, легкое, мышцу, хвост, кожу и опухоль

Результаты

Данные о среднем накоплении и клиренсе ²¹²Pb во всех собранных тканях через 24 ч после инъекции для каждого варианта терапии и цикла обработки представлены на фиг. 13. В отрицательном контроле поглощение в опухоли отсутствовало (0,4% ID/г). Двухсторонний дисперсионный анализ с использованием критерия Тьюки для множественных сравнений показал, что различия в распределении в любом цикле 2-стадийной и 3-стадийной PRIT не были статистически значимыми; однако различия во всех циклах были статистически значимыми по сравнению с отрицательным контролем и 1-стадийной RIT (р<0,05). Поглощение в опухоли составляло 25-45% ID/г в случае 3-стадийной PRIT и 25 30% ID/г в случае 2-стадийной PRIT, при этом не имелось статистически значимого различия между режимами или циклами обработки. В случае 1-стадийной RIT при осуществлении одного и единственного цикла обработки поглощение в опухоли составляло 99%. Поглощение в здоровых тканях было очень низким при осуществлении обоих режимов, но оно было значимо более высоким во всех органах и тканях после 1-стадийной RIT вследствие намного более продолжительного времени нахождения в кровотоке предварительно инкубированного антитела по сравнению с малым временем нахождения в кровотоке радиоактивномеченого хелата DOTAM.

Кривые, характеризующие среднее развитие опухоли и рост индивидуальных опухолей представлены на фиг. 14 и фиг. 15 соответственно. Опухоли в необработанной группе, которой вводили наполнитель, и в группе, обработанной DIG-DOTAM, характеризовались постоянным ростом, однако в последнем случае после третьей обработки наблюдалась немного меньшая скорость удвоения. В отличие от этого, размер опухолей в группах, подвергнутых PRIT и RIT, уменьшались после первого цикла обработки, и контроль опухоли поддерживался в течение периода времени вплоть до примерно 10 недель после инокуляции, после чего размеры опухолей начинали увеличиваться. Обработки согласно режимам 2-стадийной и 3-стадийной PRIT обеспечивали почти идентичный контроль опухолей. Ни для одной опухоли не был выявлен полный регресс.

В день опыта 83, последний день, в который можно было анализировать все группы обработки на основе средних значений, величина TGI составляла 91,7% и 88,4% в случае PRIT с использованием CEA-DOTAM (3-стадии) и СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL (2-стадии) соответственно, по сравнению с контролем, обработанным наполнителем. Соответствующая величина в случае 1-стадийной RIT составляла 72,6%, в то время как для неспецифического контроля, обработанного DIG-DOTAM величина TGI составляла -59,7%. В этот же самый день величина TR, полученная на основе средних значений, составляла -1,9 в случае 3-стадийной CEA-DOTAM PRIT, -2,9 в случае 2-стадийной СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL PRIT, -4,7 в случае 1-стадийной RIT, -28,8 в случае DIG-DOTAM PRIT и -39,3 в случае контроля, обработанного наполнителем. Вследствие описанных ниже нежелательных явлений анализ выживаемости не может рассматриваться как статистически релевантный.

Нежелательные явления и токсичность

Изменение BW во всех подвергнутых терапии группах представлено на фиг. 16. Несколько циклов 2- и 3-стадийной PRIT с использованием 20 мкКи ²¹²Pb-DOTAM переносились хорошо, а у мышей, подвергавшихся 1-стадийной RIT, происходила резкая потеря BW, при этом 8/10 мышей в группе Д были умерщвлены после первого цикла RIT (через 6-11 дней после облучения ²¹²Pb) вследствие падения BW на 20% или более. Оставшимся двум мышам, подвергавшимся RIT, не осуществляли дополнительных инъекций ²¹²Pb-DOTAM-CEA-DOTAM, но их непрерывно контролировали для оценки роста опухоли.

Кроме того, несколько мышей были умерщвлены по этическим соображениям вследствие ухудшения состояния опухоли, а именно, из-за открытия или просачивания опухоли. В группе, обработанной DIG-DOTAM, 9/10 мышей были умерщвлены по указанной причине до достижения объема опухоли 3000 мм; в не обработанной контрольной группе, которой вводили наполнитель, соответствующее количество составляло 5/10. Проблема была менее выраженной в группах, которых подвергали PRIT и RIT, в этом случае по указанной причине были умерщвлены 1/10, 2/10 и 2/10 мышей в группах, подвергавшихся 3-стадийной PRIT, 2-стадийной PRIT и 1-стадийной RIT соответственно. Это отражено на кривых роста индивидуальных опухолей, представленных на фиг. 15.

И, наконец, 1 мышь в группе В была умерщвлена из-за ухудшения состояния раны под анусом.

Все нежелательные явления перечислены в приведенной ниже таблице.

Нежелательные явления, выявленные при осуществлении протокола 160

²¹²Pb-облучение осуществляли в день опыта 23 (цикл 1), 37 (цикл 2) и 51 (цикл 3).

Выводы

Не было выявлено различия между CEA-PRTT с использованием 3-стадийной схемы (BsAb CEA-DOTAM, СА и ²¹²Pb-DOTAM) и 2-стадийной схемы (антитела СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL и ²¹²Pb-DOTAM); величины TGI были значимыми и почти идентичными для двух режимов обработки и в обоих случаях оказалось безопасным осуществлять 3 цикла обработки 20 мкКи. В отличие от этого, подавляющее большинство обработанных мышей не переносили обработку 20 мкКи ²¹²Pb-DOTAM, предварительно связанным с CEA-DOTAM перед осуществлением инъекции (1-стадийная RTT).

Опыт продемонстрировал переносимость и терапевтическую эффективность СА-независимой 2-стадийной PRIT с использованием разработанных конструкций СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL.

Пример 7: Протокол 175

Протокол 175 предназначен для оценки воздействия увеличенного количества инъецированного претаргетирующего антитела на последующее накопление ²¹²Pb в опухоли и здоровых тканях. Сравнивали две различные дозы антител СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL: стандартное количество (100 мкг) и в 2,5 раза более высокую дозу (250 мкг). Кроме того, осуществляли модификацию конструкции СЕА-сплит-DOTAM-VH с целью удлинения VH для того, чтобы избежать формирования антитела к лекарственному средству (ADA) (ее применяли вместе с протестированной ранее конструкцией СЕА-сплит-DOTAM-VL). VH удлиняли так, чтобы она содержала первые три аминокислоты из СН1-домена антитела: аланин, серии и треонин (AST), и после этого ее обозначали как СЕА-сплит-DOTAM-VH-AST.

Антитело P1AD8592 уже было описано выше в примере 4. P1AF0171 было таким же, что и P1AD8749, за исключением того, что слитая НС была удлинена на остатки AST таким образом, антитело Ρ1AD0171 состояло из легкой цепи D1AA3384, описанной выше (SEQ ID NO: 34), первой тяжелой цепи D1AC4022, описанной выше (SEQ ID NO: 28), и второй тяжелой цепи D1AE3669, описанной ниже:

D1AE3669 (НСвыступ<СЕА>СН1А1А Dotam-VH-AST)

Мышам, несущим SC ВхРС3-опухоли, инъецировали либо

1-кратную стандартную дозу BsAb СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL, после чего спустя 7 дней вводили радиоактивномеченый ²¹²Pb-DOTAM, либо

2,5-кратную стандартную дозу BsAb СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL, после чего спустя 7 дней вводили радиоактивномеченый ²¹²Pb-DOTAM.

Распределение in vivo ²¹²Pb-DOTAM оценивали через 24 ч после радиоактивной инъекции. Схема опыта представлена на фиг. 17.

План опыта

Временной график и план протокола 175 представлены ниже. Временной график протокола 175

Подопытные группы согласно протоколу 175

Ксентрансплантаты солидных опухолей создавали в каждой SCID-мыши в день 0 путем SC-инъекции 5×10⁶ клеток (пассаж 24) в RPMI/Matrigel в правую боковую область. Через 21 день после инъекции опухолевых клеток мышей разделяли на группы со средним объемом опухоли 310 мм³. ²¹²Pb-DOTAM инъецировали в день 29 после инокуляции; в день 30 средний объем опухолей составлял 462 мм.

Всех мышей умерщвляли, подвергали аутопсии через 24 ч после инъекции ²¹²Pb-DOTAM, и собирали следующие органы и ткани для измерения уровня радиации: кровь, кожу, селезенку, поджелудочную железу, почки, печень, мышцу, хвост и опухоль.

Результаты

Данные о среднем распределении ²¹²Pb во всех собранных тканях через 24 ч после инъекции представлены на фиг. 18. Не выявлено значимого различия в поглощении ²¹²Pb в опухоли или здоровых тканях для двух уровней доз. Накопление в опухоли составляло 30-31% ID/г в обеих группах обработки, при этом поглощение в почках составляло <2% ID/г в рассматриваемый момент времени. У одной мыши поглощение в хвосте составляло ~1% ID/г после инъекции ²¹²Pb-DOTAM, но ни в одной из других собранных здоровых тканей не выявлено значительного накопления ²¹²Pb.

Нежелательные явления и токсичность

Не было выявлено нежелательных явлений или токсичности, связанных с рассматриваемым опытом.

Выводы

Увеличение дозы претаргетирующих антител СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL в 2,5 раза не приводило к повышению накопления в опухоли вводимого после них ²¹²Pb-DOTAM на рассматриваемой модели in vivo. Однако, оно не приводило также к повышению накопления радиоактивности в здоровых тканях, что указывает на выраженную специфичность, которая достигалась при использовании указанного 2-стадийного режима претаргетирования. И, наконец, результаты позволили верифицировать функцию конструкции с удлинением VH СЕА-сплит-DOTAM-VH-AST.

Пример 8: Протокол 185

Протокол 185 предназначен для оценки СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL, таргетирующих эпитоп Т84.66. Последовательности P1AF0709 и P1AF0298 представлены в настоящем описании. P1AF0709 имеет первую тяжелую цепь D1AE4688 (SEQ ID NO: 83) и вторую тяжелую цепь D1AA4920 (SEQ ID NO: 84). P1AF0298 имеет первую тяжелую цепь D1AE4687 (SEQ ID NO: 86) и вторую тяжелую цепь D1AE3668 (SEQ ID NO: 87). Оба антитела имеют легкую цепь D1AA4120 (SEQ ID NO: 89).

Мышам, несущим SC ВхРС3-опухоли, вводили путем инъекции стандартную дозу BsAb СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL (100 мкг каждого антитела), затем спустя 6 дней вводили радиоактивномеченый ²¹²Pb-DOTAM. Распределение in vivo ²¹²Pb-DOTAM оценивали через 6 ч после радиоактивной инъекции. Схема опыта представлена на фиг. 19.

План опыта

Временной график и план протокола 185 представлены ниже.

Ксенотрансплантаты солидных опухолей создавали в каждой SCID-мыши в день опыта 0 путем SC-инъекции 5×10⁶ клеток (пассаж 27) в RPMI/Matrigel в правую боковую область. Через 22 дня после инъекции опухолевых клеток мышей разделяли на экспериментальные группы со средним объемом опухоли 224 мм³. ²¹²Pb-DOTAM инъецировали в день 28 после инокуляции, в указанный момент времени средний объем опухоли достигал 385 мм³.

Всех мышей умерщвляли, подвергали аутопсии через 6 ч после инъекции ²¹²Pb-DOTAM и собирали следующие органы и ткани для измерений уровня радиоактивности: кровь, кожу, селезенку, поджелудочную железу, почки, печень, мышцу, хвост и опухоль. Собранные опухоли разделяли на два куска: один использовали для измерений уровня радиоактивности, а другой помещали в криоблок, содержащий заливочную среду Tissue-Tek® с оптимальной для приготовления криосрезов температурой (ОСТ), и помещали на сухой лед для быстрого замораживания. Замороженные при ОСТ образцы поддерживали при -80°С до приготовления срезов, иммунофлуоресцентного окрашивания и анализа с использованием модульного микроскопа Zeiss Axio Scope.A1.

Результаты

Данные о среднем распределении ²¹²Pb во всех собранных тканях через 6 ч после инъекции представлены на фиг. 20. Накопление в опухоли составляло 40% ID/г (СН1А1А) или 44% ID/г (Т84.66). Помимо опухоли заметное накопление радиоактивности для двух групп было обнаружено только в почках: 3-5% ID/г через 6 ч p.i.

Примеры распределения внутри опухоли пар СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL, таргетирующих либо Т84.66 (группа А), либо СН1А1А (группа Б), представлены на фиг. 21. На панелях А и В продемонстрировано, что экспрессия CEA является высокой и гомогенной в ВхРС3-опухолях, а на панелях Б и Г продемонстрировано, что через 7 дней после инъекции распределение антитела остается сходным. Однако для образцов из группы А сигнал в целом является более сильным по сравнению с образцами опухоли из группы Б, это свидетельствует о том, что Т84.66 является более сильным связывающим агентом, чем СН1А1А.

Нежелательные явления и токсичность

Не было выявлено нежелательных явлений или токсичности, связанных с рассматриваемым опытом.

Выводы

Результаты позволили верифицировать функцию конструкций СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL, таргетирующих эпитоп Т84.66 СБА. Обусловленное ими накопление ²¹²Pb в претаргетированных экспрессирующих СБА опухолях было высоким и специфическим, а пары СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL, таргетирующие эпитоп либо СН1А1А, либо Т84.66, были гомогенно распределены внутри экспрессирующих СЕА опухолей.

Пример 9: Протокол 189

Протокол 189 предназначен для оценки бипаратопных пар антител СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL, таргетирующих антитела VH-AST/CH1A1A VL Т84.66 и VL/CH1A1 VH-AST Т84.66 в сравнении со служащей в качестве положительного контроля пары, таргетирующей VH-AST/VL СН1А1А. Указанная бипаратопная комбинация предотвращает формирование полного связывающего агента Pb-DOTAM на растворимом СЕА, который экспрессирует только один из двух эпитопов (например, Т84.66), ослабляя тем самым его потенциальные нежелательные воздействия, такие как повышенный уровень радиоактивности в кровотоке и ассоциированная с ним индуцированная излучением токсичность, и эффективность, сниженная вследствие конкуренции с находящимися вне опухоли мишенями.

Мышам, несущим SC ВхРС3-опухоли, вводили путем инъекции стандартную дозу BsAb СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL (100 мкг каждого антитела), после чего спустя 7 дней вводили радиоактивномеченый ²¹²Pb-DOTAM. Распределение in vivo ²¹²Pb-DOTAM оценивали через 6 ч после осуществления радиоактивной инъекции. Схема опыта представлена на фиг. 22.

План опыта

Временной график и план протокола 189 представлен ниже.

Ксенотрансплантаты солидных опухолей создавали в каждой SCID-мыши в день опыта 0 путем SC-инъекции 5×10⁶ клеток (пассаж 31) в RPMI/Matrigel в правую боковую область. Через 14 дней после инъекции опухолевых клеток мышей разделяли на экспериментальные группы со средним объемом опухоли 343 мм³. ²¹²Pb-DOTAM инъецировали в день 22 после инокуляции; при этом средний объем опухолей достигал 557 мм³ в день 21.

Всех мышей умерщвляли, подвергали аутопсии через 6 ч после инъекции ²¹²Pb-DOTAM и собирали для измерения уровня радиоактивности следующие органы и ткани: кровь, кожу, селезенку, поджелудочную железу, почки, печень, мышцу, хвост и опухоль.

Результаты

Данные о среднем распределении ²¹²Pb во всех собранных тканях через 6 ч после инъекции представлены на фиг. 23. Накопление в опухоли би-паратопных вариантов составляло 71% ID/г и 46% ID/г в случае Т84.66 VH-AST+СН1А1А VL и Т84.66 VL+СН1А1А VH-AST соответственно. В случае применяемого в качестве положительного контроля СН1А1А оно составляло 37% ID/г. Двусторонний дисперсионный анализ с использованием критерия Тьюки для множественных сравнений показал, что между всеми тремя группами имело место значимое различие в поглощении в опухоли (р<0,0001 для Т84.66 VH-AST+СН1А1А VL при сравнении с двумя другими группами; р=0,0020 для Т84.66 VL+СН1А1А VH-AST при сравнении только с СН1А1А). Ни для одного другого органа не было выявлено статистически значимого различия в поглощении между группами, хотя для комбинации Т84.66 VH-AST+СН1А1А VL был обнаружен немного более высокий уровень удерживания в крови по сравнению с двумя другими группами: 2% ID/г по сравнению с <1% ID/г. Поглощение в почках также было несколько более высоким, хотя это различие не было статистически значимым: 4,5% ID/г для Т84.66 VH-AST+СН1А1А по сравнению с 3% ID/г для двух других групп.

Нежелательные явления и токсичность Не было обнаружено нежелательных явлений или токсичности, связанных с рассматриваемым опытом. Однако в рассматриваемом опыте имел место значимо более быстрый рост ВхРС3-опухоли, который характеризовался большей вариабельностью, по сравнению со стандартной скоростью роста. При аутопсии было обнаружено, что большие опухоли (большинство) были заполнены жидкостью, которая вытекала, когда опухоли рассекали пополам перед осуществлением измерений радиоактивности; указанная жидкость, по-видимому, являлась причиной ускоренного роста, но не влияла на % IA/г в сколько-нибудь значительной степени, поскольку опухоли взвешивали и измеряли после их вскрытия.

Выводы

Результаты позволили верифицировать функцию бипаратопного таргетинга СЕА-эпитопов Т84.66 и СН1А1А с использованием протестированных конструкций СЕА-сплит-DOTAM-VH/VL и продемонстрировали неожиданно высокую эффективность указанной комбинации по сравнению со служащим в качестве положительного контроля СН1А1А. Достигнутое в результате накопление ²¹²Pb в претаргетированных экспрессирующих СЕА опухолях оказалось высоким и специфическим, что свидетельствует о заметном преимуществе пары Т84.66 VH-AST+СН1А1А VL.

Пример 10

В рассматриваемых примерах исследовали рекрутинг Pb-DOTA к клеткам с помощью антител, представленных в настоящем описании.

Антитело P1AF0712 содержало первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 97, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 98 и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 103. P1AF0713 содержало первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 100, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 101 и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 103.

MKN-45-клетки отделяли от культурального сосуда с использованием трипсина и подсчитывали с помощью цитометра Casy. После пеллетирования при 4°С, 300×g клетки ресуспендировали в буфере для FACS (2,5% FCS в ЗФР), доводили концентрацию до 2,0Е+06 клеток/мл и вносили в 96-луночный полипропиленовый (РР) планшет с V-образным дном (25 мкл/лунку = 5,0Е+04 клеток/лунку).

FACS-окрашивание с использованием DOTA-ФИТЦ Концентрацию СЕА-специфических сплит-антител (P1AF0712 или P1AF0713 соответственно) доводили до 40 мкг/мл в FACS-буфере с получением конечной концентрации 10 мкг/мл. Оба антитела добавляли к клеткам либо в сочетании друг с другом, либо по отдельности, и затем добавляли буфер и инкубировали при 4°С в течение 1 ч. Затем к клеткам добавляли Pb-DOTA, меченный ФИТЦ, в эквимолярном с антителами соотношении и инкубировали в течение 1 ч при 4°С. После этого клетки промывали дважды FACS-буфером и ресуспендировали в 70 мкл/лунку буфера для FACS для измерений с помощью устройства FACS Canto (фирма BD, Pharmingen). Было установлено (фиг. 24), что ни одно из сплит-полуантител не приводило к увеличению флуоресцентного сигнала, что свидетельствовало об отсутствии способности связываться с Pb-DOTA. Только комбинация обоих SPLIT-полуантител обладала способностью обеспечивать рекрутинг Pb-DOTAM-FITC к клеткам-мишеням (фиг. 24).

FACS-окрашивание с использованием <huIgG(H+L)A488>

Концентрацию СЕА-специфических сплит-антител (P1AF0712 или P1AF0713 соответственно) доводили до 40 мкг/мл в FACS-буфере с получением конечной концентрации 10 мкг/мл. Оба антитела добавляли к клеткам либо по отдельности, после чего добавляли буфер, либо в сочетании друг с другом, и инкубировали при 4°С в течение 1 ч. Затем клетки промывали дважды FACS-буфером. После промывки клетки ресуспендировали в 50 мкл FACS-буфера, содержащего вторичное антитело (<huIgG(H+L)>-Alexa488, с=10 мкг/мл) и инкубировали в течение 1 ч при 4°С. После этого клетки промывали дважды FACS-буфером и ресуспендировали в 70 мкл/лунку FACS-буфера для измерений с помощью устройства FACS Canto (фирма BD, Pharmingen). Величины ЕС₅₀ для обоих SPLIT-антител были сопоставимыми, что свидетельствовало о СЕА-специфическом связывании клеток обоими сплит-антителами. Вследствие более высокого содержания антитела в смеси в указанных условиях были получены более низкие величины ЕС₅₀, что представлено в приведенной ниже таблице.

Пример 11: Эксперименты по оценке связывания методом Biacore В рассматриваемом примере анализировали связывание ТА-сплит-DOTAM-VH и ТА-сплит-DOTAM-VL с DOTAM при их применении индивидуально по сравнению с референс-антителом CEA-DOTAM (R07198427, PRIT-0213). В других тестах анализировали связывание DOTAM с парами ТА-сплит-DOTAM-VH/VL по сравнению с референс-антителом.

Ниже представлено соотношение между обозначениями, используемыми в рассматриваемых примерах, и номерами белков, используемыми в различных местах в настоящей заявке. Представлены также последовательности. В рассматриваемом примере референс-антитело обозначено как «PRIT_RS».

При осуществлении указанных экспериментов PRIT сплит-антитела очищали на первой стадии с использованием MabSelect Sure (аффинная хроматография) и на второй стадии с помощью ионообменной хроматографии (например, POROS XS), а после этого подвергали дополнительной очистке с использованием Superdex 200 (гель-фильтрация).

Эксперименты осуществляли с использованием устройства Biacore Т200, проводя измерения при температуре 25°С. Все эксперименты с использованием Biacore Т200 проводили в подвижном буфере HBS-P+ (фирма GE Healthcare, Br-1008-27) при рН 7,4. Для каждого тестируемого антитела/тестируемой пары антител проводили по два эксперимента с использованием различных фракций DOTAM.

1. В первом эксперименте оценивали связывание индивидуальных антител ТА-сплит-DOTAM-VH и ТА-сплит-DOTAM-VL с биотинилированным DOTAM, иммобилизованном на чипе, в сравнении с референс-антителом.

DOTAM (120нМ раствор в HBS-P+) иммобилизовали до достижения высокой плотности на поверхности чипа САР (10 мкл/мин, 60 с). Затем на покрытую DOTAM поверхность инъецировали 600нМ растворы пролекарства_А или пролекарства_Б в HBS-P+ (10 мкл/мин, 90 с). Мониторинг диссоциации осуществляли в течение 240 с при скорости потока 10 мкл/мин. Определение относительного максимального ответа осуществляли с использованием программного обеспечения Т200.

Результаты представлены на фиг. 26. Ни для одного из применяемых индивидуально антител не было выявлено связывания с иммобилизованным DOTAM.

2. Во втором эксперименте индивидуальные антитела ТА-сплит-DOTAM-VH и ТА-сплит-DOTAM-VL сначала захватывали на чипе с использованием иммобилизованного антитела к hFab, а затем оценивали связывание комплекса DOTAM-монострептавидин (слияние DOTAM + монострептавидин, 600 нМ, молярное соотношение 1:1, 1 ч при КТ).

600 нМ раствор пролекарства_А или пролекарства_Б в HBS-P+ инъецировали на сенсибилизированную антителом к hFab (фирма GE Healthcare, BR-1008-27) поверхность чипа СМ5 (10 мкл/мл, 120 с). После захвата пролекарства А или Б до достижения высокой плотности инъецировали раствор комплекса DOTAM-монострептавидин (20 мкл/мин, 90 с). Мониторинг диссоциации осуществляли в течение 180 с при скорости потока 20 мкл/мин. Для нового цикла поверхность регенерировали с использованием глицина, рН 2,1, осуществляя регенерацию в течение 75 с при скорости 10 мкл/мин. Определение относительного максимального ответа осуществляли с использованием программного обеспечения Т200.

Результаты представлены на фиг. 27. Низкий процент максимальных ответов (отмечены на чертеже символом *), по-видимому, обусловлены «следами» или неспецифическими взаимодействиями с DOTAM-SA, они свидетельствуют о необходимости оптимизация анализа.

3. В третьем эксперименте оценивали связывание пар ТА-сплит-DOTAM-VH/VL с DOTAM в сравнении с референс-антителом. Антитела сначала захватывали на чипе с использованием иммобилизованного антитела к hFab, а затем оценивали связывание комплекса DOTAM-монострептавидин (слияние DOTAM + монострептавидин, 600нМ, молярное соотношение 1:1, 1 ч при КТ).

300нМ раствор пролекарства_А и пролекарства_Б в HBS-P+ инъецировали на сенсибилизированную антителом к hFab (фирма GE Healthcare, BR-1008-27) поверхность чипа СМ5 (10 мкл/мин, 120 с). После захвата пролекарства А или Б до достижения высокой плотности инъецировали раствор комплекса DOTAM-монострептавидин (20 мкл/мин, 90 с). Мониторинг диссоциации осуществляли в течение 180 с при скорости потока 20 мкл/мин. Для нового цикла поверхность регенерировали с использованием глицина, рН 2,1, осуществляя регенерацию в течение 75 с при скорости 10 мкл/мин. Определение относительного максимального ответа осуществляли с использованием программного обеспечения Т200.

Результаты представлены на фиг. 28. Для всех пар ТА-сплит-DOTAM-VH/VL выявлен высокий уровень связывания DOTAM, за исключением пары Р6_АВ (P1AF0712/P1AF0713), которые представляли собой агенты, связывающие DOTA.

Сходные результаты, демонстрирующие значимый уровень связывания DOTAM парами ТА-сплит-DOTAM-VH/VL, но не индивидуальными компонентами пары, получены также для связывающих FAP агентов P1AF8286 и P1AF8287. P1AF8286 состояло из первой тяжелой цепи, имеющей SEQ ID NO: 108, второй тяжелой цепи, имеющей SEQ ID NO: 109, и легкой цепи, имеющей SEQ ID NO: 111, a P1AF8287 состояло из первой тяжелой цепи, имеющей SEQ ID NO: 108, второй тяжелой цепи, имеющей SEQ ID NO: 110, и легкой цепи, имеющей SEQ ID NO: 111. Однако, данный анализ все еще необходимо оптимизировать.

Хотя вышеизложенное изобретение подробно описано с помощью иллюстраций и примеров для целей более ясного понимания, описание и примеры не следует рассматривать как ограничивающие объем изобретения. Описание всех патентов и научной литературы, процитированных в настоящем описании, специально включено в полном объеме в качестве ссылки.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> Ф. ХОФФМАНН-ЛЯ РОШ АГ

<120> АНТИТЕЛА, КОТОРЫЕ СВЯЗЫВАЮТСЯ С РАКОВЫМИ КЛЕТКАМИ И

ОБЕСПЕЧИВАЮТ НАПРАВЛЕННЫЙ ПЕРЕНОС РАДИОНУКЛИДОВ К УКАЗАННЫМ

КЛЕТКАМ

<130> 007681943

<150> EP19186135

<151> 2019-07-12

<160> 180

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR1, <Pb-Dotam>

<400> 1

Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser

1 5 10

<210> 2

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR2 <Pb-Dotam>

<400> 2

Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 3

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR3 <Pb-Dotam>

<400> 3

Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu

1 5 10

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR1, <Pb-Dotam>

<400> 4

Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala

1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR2 <Pb-Dotam>

<400> 5

Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser

1 5

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR3 <Pb-Dotam>

<400> 6

Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly

1 5 10

<210> 7

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain variable domain <Pb-Dotam> PRIT-0213

<400> 7

Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu Thr

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser

20 25 30

Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly

35 40 45

Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu Thr

65 70 75 80

Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg

85 90 95

Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly

100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 8

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain variable domain <Pb-Dotam> PRIT-0213

<400> 8

Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn

20 25 30

Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu

85 90 95

Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 9

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain variable domain <Pb-Dotam> PRIT-0214

<400> 9

Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr

1 5 10 15

Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser

20 25 30

Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys

65 70 75 80

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

85 90 95

Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly

100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 10

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain variable domain <Pb-Dotam> PRIT-0214

<400> 10

Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn

20 25 30

Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu

85 90 95

Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 11

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR1 <CEA> T84.66

<400> 11

Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr Tyr Met His

1 5 10

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR2 <CEA> T84.66

<400> 12

Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 13

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR3 <CEA> T84.66

<400> 13

Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr

1 5 10

<210> 14

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR1 <CEA> T84.66

<400> 14

Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe Gly Val Gly Phe Leu His

1 5 10 15

<210> 15

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR2 <CEA> T84.66

<400> 15

Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR3 <CEA> T84.66

<400> 16

Gln Gln Thr Asn Glu Asp Pro Tyr Thr

1 5

<210> 17

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain variable domain <CEA> T84.66

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 18

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain variable domain <CEA> T84.66

<400> 18

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe

20 25 30

Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR1 <CEA> CH1A1A

<400> 19

Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe Gly Met Asn

1 5 10

<210> 20

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR2 <CEA> CH1A1A

<400> 20

Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 21

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR3 <CEA> CH1A1A

<400> 21

Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 22

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR1 <CEA> CH1A1A

<400> 22

Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr Val Ala

1 5 10

<210> 23

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR2 <CEA> CH1A1A

<400> 23

Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg

1 5

<210> 24

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR3 <CEA> CH1A1A

<400> 24

His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu Phe Thr

1 5 10

<210> 25

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain variable domain <CEA> CH1A1A

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 26

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain variable domain <CEA> CH1A1A

<400> 26

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 27

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Heavy chain <CEA> of P1AD8749 without linker and <DOTAM-VH>' Same

Plasmid as SeqID32, lacking linker and <DOTAM>

<400> 27

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly

450

<210> 28

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AD8749 Heavy chain hole <CEA> CH1A1A

<400> 28

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly

450

<210> 29

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Heavy chain <CEA> of P1AD8592 without linker and <DOTAM-VL>' Same

Plasmid as SeqID33, lacking linker and <DOTAM>

<400> 29

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly

450

<210> 30

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AD8592 Heavy chain Knob <CEA>CH1A1A

<400> 30

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly

450

<210> 31

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Linker

<400> 31

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Gly Gly Ser

20

<210> 32

<211> 591

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AD8749 heavy chain knob <CEA>CH1A1A<Dotam-VH>

<400> 32

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu

465 470 475 480

Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe

485 490 495

Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys

500 505 510

Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr

515 520 525

Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys

530 535 540

Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala

545 550 555 560

Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr

565 570 575

Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

580 585 590

<210> 33

<211> 581

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AD8592 heavy chain hole <CEA>CH1A1A<Dotam-VL>

<400> 33

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

465 470 475 480

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His

485 490 495

Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

500 505 510

Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly

515 520 525

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

530 535 540

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu

545 550 555 560

Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr

565 570 575

Lys Val Glu Ile Lys

580

<210> 34

<211> 215

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AD8749 and P1AD8592 light chain <CEA> CH1A1A

<400> 34

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 35

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Heavy chain CDR 1, <C825>

<400> 35

Asp Tyr Gly Val His

1 5

<210> 36

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Heavy chain CDR 2, <C825>

<400> 36

Val Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Thr Ala Leu Ile Ser

1 5 10 15

<210> 37

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Heavy chain CDR 3, <C825>

<400> 37

Arg Gly Ser Tyr Pro Tyr Asn Tyr Phe Asp Ala

1 5 10

<210> 38

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Light chain CDR 1, <C825>

<400> 38

Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ala Ser Asn Tyr Ala Asn

1 5 10

<210> 39

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Light chain CDR 2, <C825>

<400> 39

Gly His Asn Asn Arg Pro Pro

1 5

<210> 40

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Light chain CDR 3, <C825>

<400> 40

Ala Leu Trp Tyr Ser Asp His Trp Val

1 5

<210> 41

<211> 119

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Heavy chain variable domain <C825>

<400> 41

His Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Gln Pro Ser Gln

1 5 10 15

Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr

20 25 30

Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Ala Tyr Asn Thr Ala Leu Ile

50 55 60

Ser Arg Leu Asn Ile Tyr Arg Asp Asn Ser Lys Asn Gln Val Phe Leu

65 70 75 80

Glu Met Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Arg Gly Ser Tyr Pro Tyr Asn Tyr Phe Asp Ala Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 42

<211> 109

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Light chain variable domain, <C825>

<400> 42

Gln Ala Val Val Ile Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Pro Pro Gly Glu

1 5 10 15

Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ala Ser

20 25 30

Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly

35 40 45

Leu Ile Gly Gly His Asn Asn Arg Pro Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Ala Gly Thr

65 70 75 80

Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Ser Asp

85 90 95

His Trp Val Ile Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu

100 105

<210> 43

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR1 <CEA> A5B7

<400> 43

Asp Tyr Tyr Met Asn

1 5

<210> 44

<211> 19

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR2 <CEA> A5B7

<400> 44

Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala Ser

1 5 10 15

Val Lys Gly

<210> 45

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR3 <CEA> A5B7

<400> 45

Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 46

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR1 <CEA> A5B7

<400> 46

Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile His

1 5 10

<210> 47

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR2 <CEA> A5B7

<400> 47

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 48

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR3 <CEA> A5B7

<400> 48

Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr

1 5

<210> 49

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain variable domain <CEA> A5B7

<400> 49

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 50

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain variable domain <CEA> A5B7

<400> 50

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ser Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 51

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AE4956 heavy chain hole <CEA> A5B7

<400> 51

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly

450

<210> 52

<211> 591

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AE4956 heavy chain knob <CEA> A5B7 <Dotam-VH>

<400> 52

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu

465 470 475 480

Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe

485 490 495

Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys

500 505 510

Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr

515 520 525

Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys

530 535 540

Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala

545 550 555 560

Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr

565 570 575

Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

580 585 590

<210> 53

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Heavy chain <CEA> of P1AE4956 without linker and DOTAM-VH

<400> 53

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro

<210> 54

<211> 213

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AE4956 light chain <CEA> A5B7

<400> 54

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ser Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 55

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AE4957 heavy chain knob <CEA> A5B7

<400> 55

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly

450

<210> 56

<211> 581

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AE4957 heavy chain hole <CEA> A5B7 <Dotam-VL>

<400> 56

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

465 470 475 480

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His

485 490 495

Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

500 505 510

Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly

515 520 525

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

530 535 540

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu

545 550 555 560

Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr

565 570 575

Lys Val Glu Ile Lys

580

<210> 57

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Heavy chain <CEA> of P1AE4957 without linker and DOTAM-VL

<400> 57

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Phe Ile Gly Asn Lys Ala Asn Ala Tyr Thr Thr Glu Tyr Ser Ala

50 55 60

Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Lys Ser Lys Asn Thr

65 70 75 80

Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Thr Tyr

85 90 95

Tyr Cys Thr Arg Asp Arg Gly Leu Arg Phe Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro

<210> 58

<211> 213

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AE4957 light chain <CEA> A5B7

<400> 58

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Thr Tyr Ile

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Ser Trp Ile Tyr

35 40 45

Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Trp Ser Ser Lys Pro Pro Thr

85 90 95

Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro

100 105 110

Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr

115 120 125

Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys

130 135 140

Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu

145 150 155 160

Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser

165 170 175

Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala

180 185 190

Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe

195 200 205

Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 59

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR1 <CEA> 28A9

<400> 59

Gly Gly Thr Phe Ser Tyr Tyr Ala Ile Ser

1 5 10

<210> 60

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR2 <CEA> 28A9

<400> 60

Gly Ile Leu Pro Ala Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 61

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR3 <CEA> 28A9

<400> 61

Leu Pro Pro Leu Pro Gly Ala Gly Leu Asp Tyr

1 5 10

<210> 62

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR1 <CEA> 28A9

<400> 62

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp Leu Ala

1 5 10

<210> 63

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR2 <CEA> 28A9

<400> 63

Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser

1 5

<210> 64

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR3 <CEA> 28A9

<400> 64

Gln Gln Asn Thr Gln Tyr Pro Met Thr

1 5

<210> 65

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain variable domain <CEA> 28A9

<400> 65

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Tyr Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Leu Pro Ala Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Pro Pro Leu Pro Gly Ala Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 66

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain variable domain <CEA> 28A9

<400> 66

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Thr Gln Tyr Pro Met

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 67

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR1 <GPRC5D>

<400> 67

Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr Ala Met Ala

1 5 10

<210> 68

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR2 <GPRC5D>

<400> 68

Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 69

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR3 <GPRC5D>

<400> 69

His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 70

<211> 15

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR1 <GPRC5D>

<400> 70

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser Gly Ile Asn Leu Met Asn

1 5 10 15

<210> 71

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR2 <GPRC5D>

<400> 71

His Ala Ser Ile Leu Ala Ser

1 5

<210> 72

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR3 <GPRC5D>

<400> 72

Gln Gln Thr Arg Glu Ser Pro Leu Thr

1 5

<210> 73

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Heavy chain variable domain <GPRC5D>

<400> 73

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 74

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Light chain variable domain <GPRC5D>

<400> 74

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser

20 25 30

Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 75

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR1 <FAP> 4B9

<400> 75

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser

1 5 10

<210> 76

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR2 <FAP> 4B9

<400> 76

Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 77

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR3 <FAP> 4B9

<400> 77

Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr

1 5

<210> 78

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR1 <FAP> 4B9

<400> 78

Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser Tyr Leu Ala

1 5 10

<210> 79

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR2 <FAP> 4B9

<400> 79

Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr

1 5

<210> 80

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR3 <FAP> 4B9

<400> 80

Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro Pro Thr

1 5

<210> 81

<211> 117

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Heavy chain variable domain <FAP> 4B9

<400> 81

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 82

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Light chain variable domain <FAP> 4B9

<400> 82

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 83

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF0709 HCknob <CEA> T84.66 (D1AE4688)

<400> 83

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly

450

<210> 84

<211> 581

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF0709 HChole <CEA> T84.66 Dotam-VL (D1AA4920)

<400> 84

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

465 470 475 480

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His

485 490 495

Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

500 505 510

Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly

515 520 525

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

530 535 540

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu

545 550 555 560

Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr

565 570 575

Lys Val Glu Ile Lys

580

<210> 85

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF0709 HChole <CEA> T84.66 without linker and DOTAM

<400> 85

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly

450

<210> 86

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PIAF0298 HCHole <CEA> T84.66 (D1AE4687)

<400> 86

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly

450

<210> 87

<211> 594

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PIAF0298 HCknob <CEA> T84.66 Dotam-VH-AST (D1AE3668)

<400> 87

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu

465 470 475 480

Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe

485 490 495

Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys

500 505 510

Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr

515 520 525

Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys

530 535 540

Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala

545 550 555 560

Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr

565 570 575

Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

580 585 590

Ser Thr

<210> 88

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> PIAF0298 HCknob <CEA> T84.66 without linker and DOTAM

<400> 88

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly

450

<210> 89

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF0709 and PIAF0298 light chain (D1AA4120)

<400> 89

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe

20 25 30

Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 90

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF710 HCknob <CEA> 28A9 (D1AE4690)

<400> 90

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Tyr Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Leu Pro Ala Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Pro Pro Leu Pro Gly Ala Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 91

<211> 580

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF710 HChole <CEA> 28A9 Dotam-VL (D1AC3172)

<400> 91

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Tyr Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Leu Pro Ala Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Pro Pro Leu Pro Gly Ala Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

450 455 460

Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser

465 470 475 480

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser

485 490 495

Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

500 505 510

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val

515 520 525

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

530 535 540

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly

545 550 555 560

Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys

565 570 575

Val Glu Ile Lys

580

<210> 92

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF710 HChole <CEA> 28A9 without linker or DOTAM

<400> 92

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Tyr Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Leu Pro Ala Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Pro Pro Leu Pro Gly Ala Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 93

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF711 HChole <CEA> 28A9 (D1AE4689)

<400> 93

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Tyr Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Leu Pro Ala Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Pro Pro Leu Pro Gly Ala Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 94

<211> 593

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF711 1 HCknob <CEA> 28A9 Dotam-VH-AST (D1AE3671)

<400> 94

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Tyr Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Leu Pro Ala Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Pro Pro Leu Pro Gly Ala Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

450 455 460

Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val

465 470 475 480

Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser

485 490 495

Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala

500 505 510

Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala

515 520 525

Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser

530 535 540

Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr

545 550 555 560

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro

565 570 575

Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

580 585 590

Thr

<210> 95

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF711 HCknob <CEA> 28A9 without linker and DOTAM

<400> 95

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Tyr Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Leu Pro Ala Phe Gly Ala Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Leu Pro Pro Leu Pro Gly Ala Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

115 120 125

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

130 135 140

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

145 150 155 160

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

165 170 175

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

180 185 190

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

195 200 205

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

210 215 220

Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly

225 230 235 240

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

245 250 255

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu

260 265 270

Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

275 280 285

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg

290 295 300

Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys

305 310 315 320

Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu

325 330 335

Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr

340 345 350

Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu

355 360 365

Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp

370 375 380

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val

385 390 395 400

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp

405 410 415

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His

420 425 430

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro

435 440 445

Gly

<210> 96

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF710 and P1AF711 light chain (D1AA2299)

<400> 96

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Trp

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Ser Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Thr Gln Tyr Pro Met

85 90 95

Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 97

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF0712 HCknob <CEA> CH1A1A (D1AC4023)

<400> 97

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly

450

<210> 98

<211> 579

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF0712 HChole <CEA> CH1A1A DOTA-VL (D1AE4684)

<400> 98

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ala Val Val Ile Gln Glu Ser Ala Leu

465 470 475 480

Thr Thr Pro Pro Gly Glu Thr Val Thr Leu Thr Cys Gly Ser Ser Thr

485 490 495

Gly Ala Val Thr Ala Ser Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro

500 505 510

Asp His Leu Phe Thr Gly Leu Ile Gly Gly His Asn Asn Arg Pro Pro

515 520 525

Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala

530 535 540

Leu Thr Ile Ala Gly Thr Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys

545 550 555 560

Ala Leu Trp Tyr Ser Asp His Trp Val Ile Gly Gly Gly Thr Lys Leu

565 570 575

Thr Val Leu

<210> 99

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF0712 HChole <CEA> without linker or DOTA

<400> 99

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly

450

<210> 100

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF0713 HCHole <CEA> CH1A1A (D1AC4022)

<400> 100

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly

450

<210> 101

<211> 592

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF0713 HCknob <CEA> CH1A1A DOTA-VH-AST (D1AE3670)

<400> 101

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser His Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly

465 470 475 480

Leu Val Gln Pro Ser Gln Ser Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly

485 490 495

Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Gly Val His Trp Val Arg Gln Ser Pro Gly

500 505 510

Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile Trp Ser Gly Gly Gly Thr Ala

515 520 525

Tyr Asn Thr Ala Leu Ile Ser Arg Leu Asn Ile Tyr Arg Asp Asn Ser

530 535 540

Lys Asn Gln Val Phe Leu Glu Met Asn Ser Leu Gln Ala Glu Asp Thr

545 550 555 560

Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Arg Gly Ser Tyr Pro Tyr Asn Tyr Phe

565 570 575

Asp Ala Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr

580 585 590

<210> 102

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF0713 HCknob <CEA> CH1A1A without linker and DOTA

<400> 102

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly

450

<210> 103

<211> 215

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF0712 and P1AF0713 light chain (D1AA3384)

<400> 103

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 104

<211> 447

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF8284 and P1AF8285 HCknob <GPRC5D> (D1AF6517)

<400> 104

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr

20 25 30

Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ala Ser Ile Ser Thr Gly Gly Val Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Thr His Thr Gly Asp Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 105

<211> 359

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF8284 HChole Dotam-VL (D1AG3592)

<400> 105

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

225 230 235 240

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser

245 250 255

Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser

260 265 270

Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys

275 280 285

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala

290 295 300

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

305 310 315 320

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr

325 330 335

Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly

340 345 350

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

355

<210> 106

<211> 369

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF8285 Hhole Dotam-VHA (D1AG3591)

<400> 106

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

225 230 235 240

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val

245 250 255

Leu Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly

260 265 270

Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly

275 280 285

Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr

290 295 300

Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser

305 310 315 320

Lys Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr

325 330 335

Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala

340 345 350

Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

355 360 365

Ala

<210> 107

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF8284 and P1AF8285 light chain (D1AF6469)

<400> 107

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ile Ser

20 25 30

Gly Ile Asn Leu Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Gln Pro

35 40 45

Lys Leu Leu Ile Tyr His Ala Ser Ile Leu Ala Ser Gly Ile Pro Asp

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg

85 90 95

Glu Ser Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 108

<211> 447

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF8286 and P1AF8287 HCknob <FAP> 4B9 (D1AF6515)

<400> 108

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ile Gly Ser Gly Ala Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Gly Trp Phe Gly Gly Phe Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

100 105 110

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

115 120 125

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

130 135 140

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

145 150 155 160

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

165 170 175

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

180 185 190

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

195 200 205

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

210 215 220

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val

225 230 235 240

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

245 250 255

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

260 265 270

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

275 280 285

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

290 295 300

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

305 310 315 320

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

325 330 335

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

340 345 350

Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Trp Cys Leu

355 360 365

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

370 375 380

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

385 390 395 400

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

405 410 415

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

420 425 430

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 109

<211> 359

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF8286 HChole Dotam-VL (D1AG3592)

<400> 109

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

225 230 235 240

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser

245 250 255

Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser

260 265 270

Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys

275 280 285

Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala

290 295 300

Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

305 310 315 320

Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr

325 330 335

Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly

340 345 350

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

355

<210> 110

<211> 369

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF8287 HChole Dotam-VHA (D1AG3591)

<400> 110

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

1 5 10 15

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

20 25 30

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

35 40 45

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

50 55 60

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

65 70 75 80

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

85 90 95

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

100 105 110

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

115 120 125

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

130 135 140

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

145 150 155 160

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

165 170 175

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

180 185 190

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

195 200 205

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

210 215 220

Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

225 230 235 240

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val

245 250 255

Leu Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly

260 265 270

Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly

275 280 285

Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr

290 295 300

Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser

305 310 315 320

Lys Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr

325 330 335

Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala

340 345 350

Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

355 360 365

Ala

<210> 111

<211> 215

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF8286 and P1AF8287 light chain (D1AB9974)

<400> 111

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Asn Val Gly Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ile Met Leu Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 112

<211> 451

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF7782 and P1AF7784 HCknob <CEA> CH1A1A (D1AD3419)

<400> 112

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Lys

450

<210> 113

<211> 359

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF7782 HChole Dotam-VL (D1AG2237)

<400> 113

Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp

20 25 30

Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp

85 90 95

Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Ser Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

130 135 140

Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

145 150 155 160

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

165 170 175

Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp

180 185 190

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr

195 200 205

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

210 215 220

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu

225 230 235 240

Gly Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

245 250 255

Glu Pro Gln Val Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys

260 265 270

Asn Gln Val Ser Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

275 280 285

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

290 295 300

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser

305 310 315 320

Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser

325 330 335

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

340 345 350

Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

355

<210> 114

<211> 369

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF7784 HChole Dotam-VH (D1AG2236)

<400> 114

Gly Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu

1 5 10 15

Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr

20 25 30

Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu

35 40 45

Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys

50 55 60

Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu

65 70 75 80

Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu Trp

100 105 110

Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

115 120 125

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gly Gly Asp Lys

130 135 140

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro

145 150 155 160

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

165 170 175

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

180 185 190

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

195 200 205

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

210 215 220

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

225 230 235 240

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile Glu Lys

245 250 255

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Cys Thr

260 265 270

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Ser

275 280 285

Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

290 295 300

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

305 310 315 320

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

325 330 335

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

340 345 350

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

355 360 365

Lys

<210> 115

<211> 215

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AF7782 and P1AF7784 light chain (D1AD3421)

<400> 115

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 116

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR1 <Pb-Dotam> PRIT-0213

<400> 116

Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser

1 5 10

<210> 117

<211> 16

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR2 <Pb-Dotam> PRIT-0213

<400> 117

Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

1 5 10 15

<210> 118

<211> 14

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR3 <Pb-Dotam> PRIT-0213

<400> 118

Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu

1 5 10

<210> 119

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR1 <Pb-Dotam> PRIT-0213

<400> 119

Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala

1 5 10

<210> 120

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR2 <Pb-Dotam> PRIT-0213

<400> 120

Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser

1 5

<210> 121

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR3 <Pb-Dotam> PRIT-0213

<400> 121

Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly

1 5 10

<210> 122

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain variable domain 1 of <Pb-Dotam> PRIT-0213

<400> 122

Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu Thr

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser

20 25 30

Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly

35 40 45

Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu Thr

65 70 75 80

Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg

85 90 95

Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly

100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 123

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain variable domain <Pb-Dotam> PRIT-0213

<400> 123

Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn

20 25 30

Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu

85 90 95

Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 124

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain variable domain <Pb-Dotam> PRIT-0214

<400> 124

Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr

1 5 10 15

Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser

20 25 30

Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys

65 70 75 80

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

85 90 95

Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly

100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 125

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain variable domain <Pb-Dotam> PRIT-0214

<400> 125

Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn

20 25 30

Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu

85 90 95

Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 126

<211> 591

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain 1 of bispecific, trivalent <CEA/Pb-Dotam> PRIT-0214

VH_84.66

<400> 126

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu

465 470 475 480

Leu Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Phe

485 490 495

Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys

500 505 510

Gly Leu Glu Trp Ile Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr

515 520 525

Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys

530 535 540

Asn Gln Val Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala

545 550 555 560

Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr

565 570 575

Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

580 585 590

<210> 127

<211> 581

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain 2 of bispecific, trivalent<CEA/Pb-Dotam> PRIT-0214

VL_84.66

<400> 127

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

465 470 475 480

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His

485 490 495

Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

500 505 510

Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly

515 520 525

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

530 535 540

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu

545 550 555 560

Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr

565 570 575

Lys Val Glu Ile Lys

580

<210> 128

<211> 218

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain <CEA> 84.66

<400> 128

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe

20 25 30

Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg

100 105 110

Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln

115 120 125

Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr

130 135 140

Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser

145 150 155 160

Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr

165 170 175

Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys

180 185 190

His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro

195 200 205

Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 129

<211> 591

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain 1 of bispecific, trivalent <CEA/Pb-Dotam> PRIT-0213

VH_84.66 --> knob

<400> 129

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu

465 470 475 480

Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe

485 490 495

Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys

500 505 510

Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr

515 520 525

Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys

530 535 540

Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala

545 550 555 560

Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr

565 570 575

Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

580 585 590

<210> 130

<211> 581

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain 2 of bispecific, trivalent <CEA/Pb-Dotam> PRIT-0213

VL_84.66 -->hole

<400> 130

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu

465 470 475 480

Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His

485 490 495

Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly

500 505 510

Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly

515 520 525

Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu

530 535 540

Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu

545 550 555 560

Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr

565 570 575

Lys Val Glu Ile Lys

580

<210> 131

<211> 581

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain 1 of bispecific, <CEA/Pb-Dotam> Rabbit Dotam _84.66

<400> 131

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Ser Cys Ala Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Pro Val

465 470 475 480

Ser Pro Ala Val Gly Gly Thr Val Thr Ile Ser Cys Gln Ser Ser His

485 490 495

Ser Val Tyr Ser Asp Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly

500 505 510

Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly

515 520 525

Val Ser Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu

530 535 540

Thr Ile Ser Gly Val Gln Ser Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu

545 550 555 560

Gly Gly Tyr Asp Asp Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr

565 570 575

Glu Val Val Val Lys

580

<210> 132

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HC5

<400> 132

Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu Thr

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser

20 25 30

Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly

35 40 45

Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu Thr

65 70 75 80

Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg

85 90 95

Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly

100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 133

<211> 112

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LC1

<400> 133

Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp

20 25 30

Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp

85 90 95

Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 134

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> LC3

<400> 134

Ala Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Thr Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp

1 5 10 15

Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp Asn

20 25 30

Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln

65 70 75 80

Pro Asp Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp Glu

85 90 95

Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 135

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HC7

<400> 135

Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser

1 5 10 15

Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser

20 25 30

Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly

35 40 45

Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Thr Ala Tyr Leu Gln

65 70 75 80

Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

85 90 95

Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly

100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 136

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> HC10

<400> 136

Val Gln Leu Gln Gln Trp Gly Ala Gly Leu Leu Lys Pro Ser Glu Thr

1 5 10 15

Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Tyr Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser

20 25 30

Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

35 40 45

Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Val Ser Leu Lys

65 70 75 80

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg

85 90 95

Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly

100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 137

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> T84.66 VH 1

<400> 137

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Thr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Arg Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asn Ser Lys Tyr Val Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Pro Phe Gly Tyr Tyr Val Ser Asp Tyr Ala Met Ala Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 138

<211> 111

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> T84.66 VL

<400> 138

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Gly Glu Ser Val Asp Ile Phe

20 25 30

Gly Val Gly Phe Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

35 40 45

Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala

50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

65 70 75 80

Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Asn

85 90 95

Glu Asp Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 139

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH1A1A VH

<400> 139

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 140

<211> 108

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CH1A1A VL

<400> 140

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Ala Ala Val Gly Thr Tyr

20 25 30

Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Ala Ser Tyr Arg Lys Arg Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Tyr Tyr Thr Tyr Pro Leu

85 90 95

Phe Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 141

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> rbHC.up primer sequence

<400> 141

aagcttgcca ccatggagac tgggctgcgc tggcttc 37

<210> 142

<211> 21

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> https://protect-eu.mimecast.com/s/jhrhC2RNxFYMPVS2Ygk4?domain=rbhcf.do primer sequence

<400> 142

ccattggtga gggtgcccga g 21

<210> 143

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> rbLC.up Primer sequence

<400> 143

aagcttgcca ccatggacay gagggccccc actc 34

<210> 144

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> https://protect-eu.mimecast.com/s/2MppC3lXQckn6XCQnhR8?domain=rblc.do Primer sequence

<400> 144

cagagtrctg ctgaggttgt aggtac 26

<210> 145

<211> 224

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AA1227_HC

<400> 145

Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu Thr

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser

20 25 30

Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly

35 40 45

Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu Thr

65 70 75 80

Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg

85 90 95

Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly

100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

<210> 146

<211> 219

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> P1AA1227_LC

<400> 146

Ser Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ser Ser His Ser Val Tyr Ser Asp

20 25 30

Asn Asp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu

35 40 45

Leu Ile Tyr Gln Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu

65 70 75 80

Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gly Gly Tyr Asp Asp

85 90 95

Glu Ser Asp Thr Tyr Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 147

<211> 594

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> D1AE3669 (HCknob <CEA> CH1A1A Dotam-VH-AST)

<400> 147

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu

465 470 475 480

Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe

485 490 495

Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys

500 505 510

Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr

515 520 525

Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys

530 535 540

Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala

545 550 555 560

Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr

565 570 575

Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

580 585 590

Ser Thr

<210> 148

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR H1

<400> 148

Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Gly Val His

1 5 10

<210> 149

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> human IgG1 CH1 domain

<400> 149

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro

1 5 10

<210> 150

<211> 122

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain variable domain with c terminus extension

<400> 150

Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro Thr Glu Thr

1 5 10 15

Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Thr Tyr Ser

20 25 30

Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Ala Leu Glu Trp Leu Gly

35 40 45

Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys Gly

50 55 60

Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Ser Gln Val Val Leu Thr

65 70 75 80

Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg

85 90 95

Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr Pro Pro His Leu Trp Gly

100 105 110

Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

115 120

<210> 151

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> CDR H1

<400> 151

Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn

1 5 10

<210> 152

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> flexible linker

<400> 152

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

1 5 10 15

Gly Ser Gly Gly

20

<210> 153

<211> 592

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> a variant with c-terminal alanine extension

<400> 153

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu Phe

20 25 30

Gly Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Thr Lys Thr Gly Glu Ala Thr Tyr Val Glu Glu Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Trp Asp Phe Ala Tyr Tyr Val Glu Ala Met Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

115 120 125

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

130 135 140

Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

145 150 155 160

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

165 170 175

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

180 185 190

Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

195 200 205

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

210 215 220

Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly

225 230 235 240

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

245 250 255

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His

260 265 270

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

275 280 285

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr

290 295 300

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

305 310 315 320

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Gly Ala Pro Ile

325 330 335

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

340 345 350

Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

355 360 365

Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

370 375 380

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

385 390 395 400

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

405 410 415

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

420 425 430

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

435 440 445

Pro Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

450 455 460

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Val Thr Leu Lys Glu Ser Gly Pro Val Leu

465 470 475 480

Val Lys Pro Thr Glu Thr Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe

485 490 495

Ser Leu Ser Thr Tyr Ser Met Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys

500 505 510

Ala Leu Glu Trp Leu Gly Phe Ile Gly Ser Arg Gly Asp Thr Tyr Tyr

515 520 525

Ala Ser Trp Ala Lys Gly Arg Leu Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys

530 535 540

Ser Gln Val Val Leu Thr Met Thr Asn Met Asp Pro Val Asp Thr Ala

545 550 555 560

Thr Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Arg Asp Pro Tyr Gly Gly Gly Ala Tyr

565 570 575

Pro Pro His Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala

580 585 590

<210> 154

<211> 88

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> A5B7 epitope

<400> 154

Pro Lys Pro Phe Ile Thr Ser Asn Asn Ser Asn Pro Val Glu Asp Glu

1 5 10 15

Asp Ala Val Ala Leu Thr Cys Glu Pro Glu Ile Gln Asn Thr Thr Tyr

20 25 30

Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln

35 40 45

Leu Ser Asn Asp Asn Arg Thr Leu Thr Leu Leu Ser Val Thr Arg Asn

50 55 60

Asp Val Gly Pro Tyr Glu Cys Gly Ile Gln Asn Lys Leu Ser Val Asp

65 70 75 80

His Ser Asp Pro Val Ile Leu Asn

85

<210> 155

<211> 88

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MFE23 epitope

<400> 155

Pro Lys Pro Ser Ile Ser Ser Asn Asn Ser Lys Pro Val Glu Asp Lys

1 5 10 15

Asp Ala Val Ala Phe Thr Cys Glu Pro Glu Thr Gln Asp Ala Thr Tyr

20 25 30

Leu Trp Trp Val Asn Asn Gln Ser Leu Pro Val Ser Pro Arg Leu Gln

35 40 45

Leu Ser Asn Gly Asn Arg Thr Leu Thr Leu Phe Asn Val Thr Arg Asn

50 55 60

Asp Thr Ala Ser Tyr Lys Cys Glu Thr Gln Asn Pro Val Ser Ala Arg

65 70 75 80

Arg Ser Asp Ser Val Ile Leu Asn

85

<210> 156

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR1 <CEA> MFE23

<400> 156

Asp Ser Tyr Met His

1 5

<210> 157

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR2 <CEA> MFE23

<400> 157

Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 158

<211> 17

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR2 <CEA> MFE23-H26

<400> 158

Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 159

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> heavy chain CDR3 <CEA> MFE23

<400> 159

Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 160

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR1 <CEA> MFE23

<400> 160

Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

1 5 10

<210> 161

<211> 10

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR1 <CEA> MFE23-L24, L25

<400> 161

Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His

1 5 10

<210> 162

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR1 <CEA> MFE23-L26

<400> 162

Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Met Arg Ala Ser Gln Ser Ile

1 5 10 15

Ser Ser Tyr Met

20

<210> 163

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR2 <CEA> MFE23

<400> 163

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 164

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Light chain CDR2 <CEA> MFE23-L26

<400> 164

Tyr Thr Ser Asn Leu Ala Ser

1 5

<210> 165

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Light chain CDR2 <CEA> MFE23-L29

<400> 165

Ser Thr Ser Ser Leu Gln Ser

1 5

<210> 166

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> light chain CDR3 <CEA> MFE23

<400> 166

Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

1 5

<210> 167

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Heavy chain variable domain <CEA> MFE23

<400> 167

Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser

20 25 30

Tyr Met His Trp Leu Arg Gln Gly Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 168

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> Light chain variable domain <CEA> MFE23

<400> 168

Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr

35 40 45

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu

65 70 75 80

Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys

100 105

<210> 169

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MFE-H24

<400> 169

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 170

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MFE-H25

<400> 170

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Lys Asp Ser

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 171

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MFE-H26

<400> 171

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 172

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MFE-H27

<400> 172

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 173

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MFE-H28

<400> 173

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 174

<211> 120

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MFE-H29

<400> 174

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Thr Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln

100 105 110

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 175

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MFE-L24

<400> 175

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 176

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MFE-L25

<400> 176

Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 177

<211> 107

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MFE-L26

<400> 177

Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr

20 25 30

Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 178

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MFE-L27

<400> 178

Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met

20 25 30

His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 179

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MFE-L28

<400> 179

Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met

20 25 30

His Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 180

<211> 106

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> MFE-L29

<400> 180

Glu Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Pro Tyr Met

20 25 30

His Trp Leu Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr

35 40 45

Ser Thr Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Val Gln Pro Glu

65 70 75 80

Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr

85 90 95

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к набору антител для направления радиоактивномеченого соединения при радиоиммунотерапии рака. Также раскрыт набор нуклеиновых кислот, набор экспрессионных векторов и клеток-хозяев для получения набора антител. Изобретение также относится к способу направленной радиоиммунотерапии и применению набора антител в способе направленной радиоиммунотерапии, а также к способу направленного переноса радиоизотопа в ткань или орган для радиовизуализации. Изобретение обеспечивает таргетинг радионуклидов к необходимым клеткам-мишеням. 9 н. и 88 з.п. ф-лы, 28 ил., 35 табл., 11 пр.

1. Набор антител для направления радиоактивномеченого соединения при направленной радиоиммунотерапии рака, содержащий:

i) первое антитело, которое связывается с антигеном, экспрессируемым на поверхности клетки-мишени, и которое также содержит VH-домен из функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения, но которое не содержит VL-домен из функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения; и

ii) второе антитело, которое связывается с указанным антигеном, экспрессируемым на поверхности клетки-мишени, и которое также содержит VL-домен из функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения, но которое не содержит VH-домен из функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения,

в котором указанный VH-домен первого антитела и указанный VL-домен второго антитела вместе могут образовывать функциональный антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченого соединения, включающего радиоактивномеченый препарат Pb-DOTAM (1,4,7,10-Тетракис(карбамоилметил)-1,4,7,10-тетраазациклододекан;

и где VH-домен из функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения содержит:

(а) CDR1 тяжелой цепи;

(б) CDR2 тяжелой цепи, включающей аминокислотную последовательность FIGSRGDTYYASWAKG (SEQ ID NO: 2);

(в) CDR3 тяжелой цепи, включающего аминокислотную последовательность ERDPYGGGAYPPHL (SEQ ID NO: 3);

и где VL-домен из функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения содержит в себе:

(г) CDR1 легкой цепи, включающего аминокислотную последовательность QSSHSVYSDNDLA (SEQ ID NO: 4);

(д) CDR2 легкой цепи;

(e) CDR3 легкой цепи, включающей аминокислотную последовательность LGGYDDESDTYG (SEQ ID NO: 6).

2. Набор антител по п. 1, в котором VH-домен функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения содержит:

CDR1 тяжелой цепи, включающий аминокислотную последовательность GFSLSTYSMS (SEQ ID NO: 1) или его вариант, содержащий 1, 2 или 3 замены в последовательности (SEQ ID NO: 1).

3. Набор антител по п. 2, в котором VH-домен функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения содержит (a) CDR-H1, включающий аминокислотную последовательность GFSLSTYSMS (SEQ ID NO: 1); (б) CDR-H2, включающий аминокислотную последовательность FIGSRGDTYYASWAKG (SEQ ID NO: 2); (в) CDR-H3, включающий аминокислотную последовательность ERDPYGGGAYPPHL (SEQ ID NO: 3).

4. Набор антител по любому из пп. 1-3, в котором VL-домен антитела функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения содержит:

CDR2 легкой цепи, включающий аминокислотную последовательность QASKLAS (SEQ ID NO: 5) или его вариант, содержащий 1, 2 или 3 замены в последовательности SEQ ID NO: 5, и необязательно не включающий Gln 50.

5. Набор антител по п. 4, в котором VL-домен функционального антигенсвязывающего центра радиоактивномеченого соединения содержит (г) CDR-L1, включающий аминокислотную последовательность QSSHSVYSDNDLA (SEQ ID NO: 4); (д) CDR-L2, включающий аминокислотную последовательность QASKLAS (SEQ ID NO: 5); (e) CDR-L3, включающий аминокислотную последовательность LGGYDDESDTYG (SEQ ID NO: 6).

6. Набор антител по любому из пп. 1-5, в котором: VH-домен функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения содержит (a) CDR-H1, включающий аминокислотную последовательность GFSLSTYSMS (SEQ ID NO: 1); (б) CDR-H2, включающий аминокислотную последовательность FIGSRGDTYYASWAKG (SEQ ID NO: 2); (в) CDR-H3, включающий аминокислотную последовательность ERDPYGGGAYPPHL (SEQ ID NO: 3); и

VL-домен функционального антигенсвязывающего центра радиоактивномеченого соединения содержит (г) CDR-L1, включающий аминокислотную последовательность QSSHSVYSDNDLA (SEQ ID NO: 4); (д) CDR-L2, включающий аминокислотную последовательность QASKLAS (SEQ ID NO: 5); (e) CDR-L3, включающий аминокислотную последовательность LGGYDDESDTYG (SEQ ID NO: 6).

7. Набор антител по любому из предыдущих пунктов, в котором каждое антитело, как первое, так и второе, содержит:

(i) фрагмент антитела, включающий антигенсвязывающий центр, специфический для связывания с указанным антигеном, экспрессируемым на поверхности клетки-мишени и

(ii) либо VL-, либо VH-доменов функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения.

8. Набор антител по п. 7, в котором фрагмент антитела выбран из по меньшей мере одного из Fv, scFv, Fab, пересекающихся Fab фрагментов.

9. Набор антител по п. 8, в котором первое антитело содержит или состоит из:

а) Fab-фрагмент, который связывается с указанным антигеном, и

б) полипептид, который содержит или состоит из:

i) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH) функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения или

ii) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH) функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения и константного домена тяжелой цепи антитела, в котором С-конец VH-домена слит с N-концом константного домена;

где полипептид слит с помощью N-конца VH-домена с С-концом CL- или СН1-домена Fab-фрагмента;

и в котором второе антитело содержит или состоит из:

в) Fab-фрагмент, который связывается с указанным антигеном, и

г) полипептид, который содержит или состоит из

iii) вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения или

iv) вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения и константного домена легкой цепи антитела, в котором С-конец VL-домена слит с N-концом константного домена;

где полипептид слит с помощью N-конца VL-домена с С-концом CL- или СН1-домена Fab-фрагмента;

и в котором вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH) полипептида, указанного в подпункте (б), и вариабельный домен легкой цепи антитела (VL) полипептида, указанного в подпункте (г), вместе могут образовывать функциональный антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченого соединения.

10. Набор антител по п. 9, в котором полипептид, указанный в подпункте (б), слит с помощью N-конца VH-домена с С-концом CL- или СН1-домена Fab-фрагмента, указанного в подпункте (а), через пептидный линкер; и в котором полипептид, указанный в подпункте (г), слит с помощью N-конца VL-домена с С-концом CL- или СН1-домена Fab-фрагмента, указанного в подпункте (в), через пептидный линкер.

11. Набор антител по п. 8, в котором первое антитело содержит

а) тандемный Fab, содержащий два Fab-фрагмента, в котором первый и второй Fab-фрагмент каждый связывается с одним и тем же эпитопом указанного антигена, и в котором первый и второй Fab-фрагменты соединены через пептидную связь, при этом первый Fab соединен через его С-конец с N-концом второго Fab; и

б) полипептид, который содержит или состоит из

i) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH); или

ii) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH) и константного домена тяжелой цепи антитела (СН1), в котором С-конец VH-домена слит с N-концом СН1-домена;

где указанный полипептид слит с помощью N-конца VH-домена с С-концом CL-или CH1-домена второго Fab-фрагмента;

и второе антитело содержит

в) тандемный Fab, содержащий два Fab-фрагмента, в котором первый и второй Fab-фрагмент каждый связывается с одним и тем же эпитопом указанного антигена, и в котором первый и второй Fab-фрагменты соединены через пептидную связь, при этом первый Fab соединен через его С-конец с N-концом второго Fab; и

г) полипептид, который содержит или состоит из

i) вариабельного домена легкой цепи антитела (VL); или

ii) вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) и константного домена легкой цепи антитела (CL), в котором С-конец VH-домена слит с N-концом константного домена;

где указанный полипептид слит с помощью N-конца VL-домена с С-концом CL-или CHI-домена второго Fab-фрагмента;

и в котором вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH) полипептида, указанного в подпункте (б), и вариабельный домен легкой цепи антитела (VL) полипептида, указанного в подпункте (г), вместе могут образовывать функциональный антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченого соединения.

12. Набор антител по п. 11, в котором полипептид подпункта (б) слит с помощью N-конца VH-домена с С-концом CL- или CH1-домена второго Fab-фрагмента, указанного в подпункте (а), через пептидный линкер; и в котором полипептид, указанный в подпункте (г), слит с помощью N-конца VL-домена с С-концом CL- или СН1-домена второго Fab-фрагмента, указанного в подпункте (в), через пептидный линкер.

13. Набор антител по п. 8, в котором первое антитело содержит:

а) тандемный Fab, содержащий первый фрагмент и второй фрагмент, в котором первый фрагмент соединен с помощью его С-конца через пептидную связь с N-концом второго фрагмента, при этом первый фрагмент связывается с первым эпитопом указанного антигена, а второй фрагмент связывается со вторым эпитопом указанного антигена, и в котором один из фрагментов, выбранных из первого и второго фрагментов представляет собой Fab, а другой представляет собой cross-Fab,

б) полипептид, который содержит или состоит из

i) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH); или

ii) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH) и константного домена тяжелой цепи антитела (СН1), в котором С-конец VH-домена слит с N-концом СН1- домена;

где указанный полипептид слит с помощью N-конца VH-домена с С-концом одной из цепей второго фрагмента; и

и в котором второе антитело содержит

в) тандемный Fab, содержащий первый фрагмент и второй фрагмент, в котором первый фрагмент соединен с помощью его С-конца с N-концом второго фрагмента, при этом первый фрагмент связывается с первым эпитопом указанного антигена, а второй фрагмент связывается со вторым эпитопом указанного антигена, и в котором один из фрагментов, выбранных из первого и второго фрагментов, представляет собой Fab, а другой представляет собой cross-Fab, и

г) полипептид, который содержит или состоит из

i) вариабельного домена легкой цепи антитела (VL); или

ii) вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) и константного домена легкой цепи антитела (CL), в котором С-конец VL-домена слит с N-концом константного домена легкой цепи,

где указанный полипептид слит с помощью N-конца VL-домена с С-концом одной из цепей второго фрагмента;

и в котором вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH) полипептида, указанного в подпункте (б), и вариабельный домен легкой цепи антитела (VL) полипептида, указанного в подпункте (г), вместе могут образовывать функциональный антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченного соединения.

14. Набор антител по п. 13, в котором полипептид, указанный в подпункте (б), слит с помощью N-конца VL-домена с С-концом одной из цепей второго фрагмента, указанного в подпункте (а), через пептидный линкер; и в котором полипептид, указанный в подпункте (г), слит с помощью N-конца VL-домена с С-концом одной из цепей второго фрагмента, указанного в подпункте (в), через пептидный линкер.

15. Набор антител по одному из пп. 1-8, в котором первое и второе антитело каждое содержит Fc-домен.

16. Набор антител по п. 15, в котором первое и второе антитело каждое содержит i) фрагмент антитела, содержащий функциональный антигенсвязывающий центр, специфический для указанного антигена, который экспрессируется на поверхности клетки-мишени, ii) и Fc-область, и iii) либо VL-домен, либо VH-домен функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения, слитый с Fc-областью.

17. Набор антител по п. 15 или 16, в котором Fc-домен модифицирован с целью снижения или элиминации эффекторной функции.

18. Набор антител по любому из пп. 15-17, в котором первое антитело содержит или состоит из:

i) фрагмента полной легкой цепи;

ii) полной тяжелой цепи;

iii) дополнительной Fc-цепи, лишенной Fd; и

iv) полипептида, который содержит или состоит из VH-домена функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения;

в котором легкая цепь (i) и тяжелая цепь (ii) вместе образуют антигенсвязывающий центр для указанного антигена, и в котором полипептид, который содержит или состоит из VH-домена функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения, слит с помощью его N-конца с С-концом либо (ii), либо (iii); и

в котором второе антитело содержит или состоит из

v) фрагмента полной легкой цепи;

vi) полной тяжелой цепи;

vii) дополнительной Fc-цепи, лишенной Fd; и

viii) полипептида, который содержит или состоит из VL-домена функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения;

в котором легкая цепь (v) и тяжелая цепь (vi) вместе образуют антигенсвязывающий центр для указанного антигена, и в котором полипептид, который содержит или состоит из VL-домена функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения, слит с помощью его N-конца с С-концом либо (vi), либо (vii);

в котором вариабельный домен тяжелой цепи антитела (VH) полипептида (IV) и вариабельный домен легкой цепи антитела (VL) полипептида (viii) вместе могут образовывать функциональный антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченого соединения.

19. Набор антител по п. 18, в котором полипептид (iv) слит с помощью его N-конца с С-концом либо (ii), либо (iii) через линкер; а полипептид (viii) слит с помощью его N-конца с С-концом либо (vi), либо (vii) через линкер.

20. Набор антител по любому из пп. 15-17, в котором первое и второе антитело каждое содержит а) Fc-домен, б) по меньшей мере один фрагмент антитела, такой как scFv-, Fv-, Fab- или cross-Fab-фрагмент, содержащий антигенсвязывающий центр для антигена-мишени, и в) полипептид, который содержит либо VL-домен, либо VH-домен антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения, в котором С-конец фрагмента антитела, указанного в подпункте (б), слит с N-концом одной из цепей Fc-домена, и С-конец полипептида, указанного в подпункте (в), слит с N-концом другой цепи Fc-домена.

21. Набор антител по п. 20, в котором первое антитело содержит:

i) полную легкую цепь;

ii) полную тяжелую цепь;

iii) дополнительную Fc-цепь; и

iv) полипептид, который содержит или состоит из VH-домена функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения, в котором легкая цепь (i) и тяжелая цепь (ii) вместе образуют антигенсвязывающий центр для антигена-мишени; и в котором полипептид, содержащий или состоящий из VH-домена функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения, слит с помощью его С-конца через линкер с N-концом (iii); и

второе антитело содержит:

v) полную легкую цепь;

vi) полную тяжелую цепь;

vii) дополнительную Fc-цепь; и

viii) полипептид, который содержит или состоит из VL-домена функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения;

в котором легкая цепь (v) и тяжелая цепь (vi) вместе образуют антигенсвязывающий центр для антигена-мишени, и в котором полипептид, содержащий или состоящий из VL-домена функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченного соединения, слит с помощью его С-конца через линкер с N-концом (vii).

22. Набор антител по п. 21, в котором:

i) первое антитело содержит первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 112, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 114, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 115; и

ii) второе антитело содержит первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 112, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 113, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 115.

23. Набор антител по любому из пп. 15-17, в котором первое антитело содержит

а) первое полноразмерное антитело и состоит из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела, где по меньшей мере одно плечо полноразмерного антитела связывается с указанным антигеном; и

б) полипептид, состоящий из

i) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH); или

ii) вариабельного домена тяжелой цепи антитела (VH) и константного домена антитела (СН1),

в котором указанный полипептид слит с помощью N-конца VH-домена с С-концом одной из двух тяжелых цепей указанного первого полноразмерного антитела, и

в котором второе антитело содержит:

в) второе полноразмерное антитело и состоит из двух тяжелых цепей антитела и двух легких цепей антитела, где по меньшей мере одно плечо антитела связывается с указанным антигеном; и

г) полипептид, состоящий из

i) вариабельного домена легкой цепи антитела (VL); или

ii) вариабельного домена легкой цепи антитела (VL) и константного домена легкой цепи антитела (CL),

в котором указанный полипептид слит с помощью N-конца VL-домена с С-концом одной из двух тяжелых цепей указанного второго полноразмерного антитела,

где полипептид, указанный в подпункте (б), и полипептид, указанный в подпункте (г), вместе могут образовывать функциональный антигенсвязывающий центр для радиоактивномеченного соединения.

24. Набор антител по п. 23, в котором полипептид, указанный в подпункте (б), слит с помощью N-конца VH-домена с С-концом одной из двух тяжелых цепей указанного первого полноразмерного антитела через пептидный линкер; и полипептид, указанный в подпункте (г), слит с помощью N-конца VL-домена с С-концом одной из двух тяжелых цепей указанного второго полноразмерного антитела через пептидный линкер.

25. Набор антител по п. 23 или 24, в которой первое и второе антитело каждое является двухвалентным в отношении указанного антигена.

26. Набор антител по п. 25, в котором оба плеча полноразмерного антитела связываются с одним и тем же эпитопом указанного антигена.

27. Набор антител по п. 23 или 24, в котором первое и второе антитело каждое является бипаратопным в отношении указанного антигена.

28. Набор антител по п. 27, в котором каждое из двух плечей первого антитела связывается с эпитопом указанного антигена, и эпитопы, с которыми они связываются, отличны друг от друга; и в котором каждое из двух плечей второго антитела связывается с эпитопом указанного антигена, и эпитопы, с которыми они связываются, отличны друг от друга.

29. Набор антител по любому из предыдущих пунктов, в котором связывание функционального сайта связывания для Pb-DOTAM характеризуется величиной аффинности связывания Kd, составляющей 100 пМ, 50 пМ, 20п М, 10 пМ, 5 пМ, 1 пМ или менее, например, 0,9 пМ или менее, 0,8 пМ или менее, 0,7 пМ или менее, 0,6 пМ или менее или 0,5 пМ или менее.

30. Набор антител по любому из предыдущих пунктов, в котором функциональный сайт связывания для Pb-DOTAM связывается с Pb-DOTAM и Bi-DOTAM.

31. Набор антител по любому из предыдущих пунктов, в котором VH домен функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 9, или ее варианта, содержащего аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 9.

32. Набор антител по п. 31, в котором один или несколько остатков аланина добавлены к С-концу VH-домена функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения, или в котором один или несколько остатков из N-конца CH1-домена добавлены к С-концу VH-домена функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения.

33. Набор антител по п. 32, в котором остатки AST добавлены к С-концу VH-домена функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения.

34. Набор антител по любому из предыдущих пунктов, в котором VL-домен функционального антигенсвязывающего центра для радиоактивномеченого соединения содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8 или вариант, содержащий аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% SEQ ID NO: 8.

35. Набор антител по одному из предыдущих пунктов, в котором первое и второе антитела связываются с одним и тем же эпитопом антигена, экспрессируемого на поверхности клетки-мишени.

36. Набор антител по любому из пп. 1-34, в котором первое антитело связывается с эпитопом, отличным от эпитопа, с которым связывается второе антитело.

37. Набор антител по одному из предыдущих пунктов, где антиген, экспрессируемый на поверхности клетки-мишени, представляет собой опухолеассоциированный антиген.

38. Набор антител по одному из предыдущих пунктов, где антиген, экспрессируемый на поверхности клетки-мишени, выбирают из группы, состоящей из карциноэмбрионального антигена (CEA), CD20, HER2, EGP-1 (эпителиальный гликопротеин-1, известный также как трофобласт-2), специфического для ободочной кишки антигена-р (CSAp), панкреатического муцина MUC1, GPRC5D и FAP.

39. Набор антител по одному из предыдущих пунктов, где антиген, экспрессируемый на поверхности клетки-мишени, выбирают из группы, состоящей из СЕА, GPRC5D и FAP.

40. Набор антител по п. 39, в котором:

i) первое антитело содержит первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 104, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 106, в которой С-концевой аланин является необязательным и может отсутствовать или быть заменен альтернативным С-концевым удлинением, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 107; и

ii) второе антитело содержит первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 104, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 105, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 107.

41. Набор антител по п. 39, в котором

i) первое антитело содержит первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 108, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 110, в которой С-концевой аланин в SEQ ID NO: 110 является необязательным и может отсутствовать или быть заменен альтернативным С-концевым удлинением, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 111; и

ii) второе антитело содержит первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 108, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 109, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 111.

42. Набор антител по одному из пп. 1-39, где антиген, экспрессируемый на поверхности клетки-мишени, представляет собой СЕА.

43. Набор антител по п. 42, в котором первое антитело содержит антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержащий вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит

(а) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19;

(б) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20;

(в) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; и

вариабельную область легкой цепи, которая содержит

(г) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22;

(д) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и

(е) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.

44. Набор антител по одному из пп. 42-43, в котором первое антитело содержит антигенсвязывающий центр для СЕА, содержащий VH-последовательность, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25 или ее варианта, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% SEQ ID NO: 25.

45. Набор антител по одному из пп. 42-44, в котором первое антитело содержит антигенсвязывающий центр для СЕА, содержащий VL-последовательность, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26 или ее варианта, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% SEQ ID NO: 26.

46. Набор антител по п. 42, в котором первое антитело содержит антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43; (б) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44; и (в) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45; и вариабельную область легкой цепи, которая содержит (г) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46; (д) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47; и (e) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48.

47. Набор антител по одному из пп. 42 или 46, в котором первое антитело содержит антигенсвязывающий центр для СЕА, содержащий VH-последовательность, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 49 или ее варианта, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% SEQ ID NO: 49.

48. Набор антител по одному из пп. 42, 46 или 47, в котором первое антитело содержит антигенсвязывающий центр для СЕА, содержащий VL-последовательность, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50 или ее варианта, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% SEQ ID NO: 50.

49. Набор антител по п. 42, в котором первое антитело содержит антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержащий

вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; (б) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (в) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и

вариабельную область легкой цепи, которая содержит (г) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; (д) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; и (е) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.

50. Набор антител по одному из пп. 42 или 49, в котором первое антитело содержит антигенсвязывающий центр для СЕА, содержащий VH-последовательность, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17 или ее варианта, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% SEQ ID NO: 17.

51. Набор антител по пп. 42, 49 или 50, в котором первое антитело содержит антигенсвязывающий центр для СЕА, содержащий VL-последовательность, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18 или ее варианта, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% SEQ ID NO: 18.

52. Набор антител по п. 42, в котором первое антитело содержит антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержащий

вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59; (б) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; (в) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; и

вариабельную область легкой цепи, которая содержит (г) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; (д) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63; и (е) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64.

53. Набор антител по п. 42 или 52, в котором первое антитело содержит антигенсвязывающий центр для СЕА, содержащий VH-последовательность, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 65 или ее варианта, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% SEQ ID NO: 65.

54. Набор антител по пп. 42, 52 или 53, в котором первое антитело содержит антигенсвязывающий центр для СЕА, содержащий VL-последовательность, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 66 или ее варианта, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% SEQ ID NO: 66.

55. Набор антител по п. 42, в котором первое антитело содержит антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержащий

вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 156; (б) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 157 или 158; (в) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 159; и

вариабельную область легкой цепи, которая содержит (г) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 160, 161 или 162; (д) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 163, 164 или 165; и (е) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166.

56. Набор антител по п. 42 или 55, в котором первое антитело содержит антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержащий вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 169, 170, 171, 172, 173 или 174, или последовательность, идентичную им на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%; и вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 175, 176, 177, 178, 179 или 180, или последовательность, идентичную им на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%.

57. Набор антител по пп. 42, 55 или 56, в котором первое антитело содержит антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, который содержит:

(а) VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 169, и VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 179, или

(б) VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 173, и VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 179, или

(в) VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 170, и VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 179, или

(г) VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 174, и VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 178, или

(д) VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 173, и VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 178, или

(е) VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 171, и VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 178, или

(ж) VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 169, и VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 178.

58. Набор антител по одному из пп. 42-57, в котором второе антитело содержит антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержащий

вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 19; (б) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 20; (в) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21; и

вариабельную область легкой цепи, которая содержит (г) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22; (д) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 23; и (е) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 24.

59. Набор антител по одному из пп. 42-58, в котором второе антитело содержит антигенсвязывающий центр для СЕА, содержащий VH-последовательность, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 25 или ее варианта, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% SEQ ID NO: 25.

60. Набор антител по одному из пп. 42-59, в котором второе антитело содержит антигенсвязывающий центр для СЕА, содержащий VL-последовательность, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 26 или ее варианта, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% SEQ ID NO: 26.

61. Набор антител по одному из пп. 42-57, в котором второе антитело содержит антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержащий

вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 43; (б) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 44; (в) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 45; и

вариабельную область легкой цепи, которая содержит (г) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 46; (д) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 47; и (е) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 48.

62. Набор антител по одному из пп. 42-57 или 61, в котором второе антитело содержит антигенсвязывающий центр для СЕА, содержащий VH-последовательность, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 49 или ее варианта, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% SEQ ID NO: 49.

63. Набор антител по одному из пп. 42-57, 61 или 62, в котором второе антитело содержит антигенсвязывающий центр для СЕА, содержащий VL-последовательность, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 50 или ее варианта, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% SEQ ID NO: 50.

64. Набор антител по одному из пп. 42-57, в котором второе антитело содержит антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержащий

вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11; (б) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12; (в) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 13; и

вариабельную область легкой цепи, которая содержит (г) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 14; (д) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 15; и (е) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16.

65. Набор антител по одному из пп. 42-57 или 64, в котором второе антитело содержит антигенсвязывающий центр для СЕА, содержащий VH-последовательность, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 17 или ее варианта, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% SEQ ID NO: 17.

66. Набор антител по одному из пп. 42-57, 64 или 65, в котором второе антитело содержит антигенсвязывающий центр для СЕА, содержащий VL-последовательность, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 18 или ее варианта, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% SEQ ID NO: 18.

67. Набор антител по одному из пп. 42-57, в котором второе антитело содержит антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержащий

вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 59; (б) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 60; (в) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 61; и

вариабельную область легкой цепи, которая содержит (г) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 62; (д) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 63; и (е) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 64.

68. Набор антител по одному из пп. 42-57 или 67, в котором второе антитело содержит антигенсвязывающий центр для СЕА, содержащий VH-последовательность, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 65 или ее варианта, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% SEQ ID NO: 65.

69. Набор антител по одному из п.п. 42-57, 67 или 68, в котором второе антитело содержит антигенсвязывающий центр для СЕА, содержащий VL-последовательность, которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 66 или ее варианта, который содержит аминокислотную последовательность, идентичную по меньшей мере на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% SEQ ID NO: 66.

70. Набор антител по одному из пп. 42-57, в котором второе антитело содержит антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержащий

вариабельную область тяжелой цепи, которая содержит (a) CDR-H1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 156; (б) CDR-H2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 157 или 158; (в) CDR-H3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 159; и

вариабельную область легкой цепи, которая содержит (г) CDR-L1, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 160, 161 или 162; (д) CDR-L2, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 163, 164 или 165; и (е) CDR-L3, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 166.

71. Набор антител по пп. 42-57 или 70, в котором второе антитело содержит антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, содержащий вариабельную область тяжелой цепи (VH), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 169, 170, 171, 172, 173 или 174, или последовательность, идентичную им на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%; и вариабельную область легкой цепи (VL), которая содержит аминокислотную последовательность, выбранную из SEQ ID NO: 175, 176, 177, 178, 179 или 180, или последовательность, идентичную им на 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99%.

72. Набор антител по пп. 42-57, 70 или 71, в котором второе антитело содержит антигенсвязывающий центр, который связывается с СЕА, который содержит:

(а) VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 169, и VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 179, или

(б) VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 173, и VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 179, или

(в) VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 170, и VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 179, или

(г) VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 174, и VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 178, или

(д) VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 173, и VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 178, или

(е) VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 171, и VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 178, или

(ж) VH-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 169, и VL-домен, содержащий аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 178.

73. Набор антител по п. 42, в котором первое антитело представляет собой антитело, как определено в любом из пп. 49-51, а второе антитело представляет собой антитело, как определено в любом из пп. 58-60.

74. Набор антител по п. 1, в котором первое антитело содержит первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 28, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 32, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 34.

75. Набор антител по п. 74, в котором один или несколько остатков аланина добавлены к С-концу SEQ ID NO: 32, или в котором последовательность AST добавлена к С-концу SEQ ID NO: 32.

76. Набор антител по п. 1, в котором первое антитело содержит первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 51, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 52, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 54.

77. Набор антител по п. 76, в котором один или несколько остатков аланина добавлены к С-концу SEQ ID NO: 52, или в котором последовательность AST добавлена к С-концу SEQ ID NO: 32.

78. Набор антител по п. 1, в котором первое антитело содержит первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 86, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 87, в которой С-концевые остатки AST являются необязательными и могут отсутствовать или быть заменены другим С-концевым удлинением, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 89.

79. Набор антител по п. 1, в котором первое антитело содержит первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 93, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 94, в которой С-концевые остатки AST являются необязательными и могут отсутствовать или быть заменены другим С-концевым удлинением, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 96.

80. Набор антител по п. 1 или пп. 74-79, в котором второе антитело содержит первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 30, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 33, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 34.

81. Набор антител по п. 1 или пп. 74-79, в котором второе антитело содержит первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 55, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 56, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 58.

82. Набор антител по п. 1 или пп. 74-79, в котором второе антитело содержит первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 83, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 84, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 89.

83. Набор антител по п. 1 или п.п. 74-79, в котором второе антитело содержит первую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 90, вторую тяжелую цепь, имеющую SEQ ID NO: 91, и легкую цепь, имеющую SEQ ID NO: 96.

84. Набор нуклеиновых кислот, для получения набора антител по любому из п.п. 1-83, где набор нуклеиновых кислот включает нуклеиновую кислоту, кодирующую первое антитело, и нуклеиновую кислоту, кодирующую второе антитело, где VH-домен из функционального антигенсвязывающего центра первого антитела и VL-домен функционального антигенсвязывающего центра второго антитела образуют функциональный антигенсвязывающий центр радиоактивномеченого соединения.

85. Экспрессионный вектор, содержащий набор нуклеиновых кислот по п. 84.

86. Набор экспрессионных векторов для получения набора антител по любому из пп. 1-83, где набор экспрессионных векторов содержит набор нуклеиновых кислот по п. 84.

87. Клетка-хозяин для получения набора антител по любому из пп. 1-83, содержащая экспрессионный вектор по п. 85 или набор экспрессионных векторов по п. 86.

88. Набор клеток-хозяев для получения набора антител по любому из пп. 1-83, содержащих экспрессионный вектор по п. 85 или набор экспрессионных векторов по п. 86.

89. Способ направленной радиоиммунотерапии, включающий

i) введение индивидууму набора антител по любому из пп. 1-83, в котором первое и второе антитела вводят одновременное или последовательно в любом порядке, в котором антитела связываются с антигеном-мишенью и локализуются на поверхности клетки, экспрессирующей антиген-мишень, при этом при объединении первого и второго антител образуется функциональный центр связывания для радиоактивномеченого соединения;

ii) последующее введение индивидууму радиоактивномеченого соединения, где радиоактивномеченое соединение связывается с функциональным сайтом связывания для радиоактивномеченого соединения.

90. Способ по п. 89, где способ не включает стадию введения очищающего или блокирующего агента.

91. Способ по п. 89 или 90, в котором индивидуум представляет собой человека.

92. Способ по любому из пп. 89-91, в котором антиген-мишень представляет собой ассоциированный с раком или опухолью антиген, и способ представляет собой способ радиоиммунотерапии опухоли или рака.

93. Применение набора антител по любому из пп. 1-83, в способе направленной радиоиммунотерапии по любому из пп. 89-92.

94. Способ направленного переноса радиоизотопа в ткань или орган для радиовизуализации, включающий:

i) введение индивидууму набора антител по одному из пп. 1-83, в котором первое и второе антитела вводят одновременное или последовательно в любом порядке, в котором антитела связываются с антигеном-мишенью и локализуются на поверхности клетки, экспрессирующей антиген-мишень, где при объединении первого и второго антител образуется функциональный центр связывания для радиоактивномеченого соединения;

ii) последующее введение индивидууму радиоактивномеченого соединения, где радиоактивномеченое соединение связывается с функциональным центром связывания для радиоактивномеченого соединения.

95. Способ по п. 94, где способ не включает стадию введения очищающего или блокирующего агента.

96. Способ по п. 94 или 95, где способ дополнительно включает стадию визуализации.

97. Способ по п. 96, в котором антиген-мишень представляет собой ассоциированный с раком или опухолью антиген, и способ представляет собой способ визуализации опухолей или рака.