Штамм грибов ASpeRGILLUS FLaVIpeS - продуцент тирозиназы Советский патент 1988 года по МПК C12N9/88 C12N9/88 C12R1/16 

00

со qD ел

10

20

t1437395

Изобретение относится к микробиологической промьппленности и представляет собой новый шта.мм гриба, обладающий свойством продуцировать тиро- зиназу, фермент, применяющийся при трансформации-фенольных соединений, в частности при ферментативном сии- Тезе Ь-длоксифенилаланина (L-ДОФА) из Ь тирозина.

Цель изобретения - выявление штамма грибов, продуцирующего тирозиназу с более высокой активностью. Штамгч Aspergillus flavipes BKIM

F-351 выделен из образцов почвы, ото- 15 бранньсс на юге УССР, и следующие характеристики.

Морфологические и культуральные признаки. Штамм быстрорастуа(иЙ5 характеризуется хорошим споропошением при вьфавд-шании на синтетических средах (сусло агар,, среде Чапека, картофельно-декстрозной среде, среде Сабуро, Ролена-Тома). На сусло-агаре колонии быстрорастущие, пушистые, белые, с возрастом светло-желтого цвета. Эксудат обильньй, формируется в большие капли, частично внедренные внутрь мицелиальных масс, светлые, затем янтарного цветаз запах практичесв:и отсутствует, конидиаль- ные головки колончатые, короткие, ко- нгздиеносцы варьирзтот 500-800 х 5,5™ 8,0II), едва заметно окрашенные в свет- ло-коричневьш цвет, гладкие. Вздутия

эллиптические., почти шаровидные, 10,5-30 гм в диаметре. Наблюдается редукция конидиеносцев , Стеригмы в 2 раза в больпшх голоЕках густо пок- рьшают. везикл, в маленьких образуются только на верхупше вздутия. Линейный рост колонии составляет на сусло- агаре: день 75 мм, 10-й день 9,5 г-м; на среде Чапека: 5-й день 80 мм, 10-й день 110 мм; на мясо- пептонном агаре: 5-й день 7 , 10-й день 12 1чм«

Гифы воздушного мицелия двух типов; тонкие, нитевидные, с удлиненными клетками и более широкие, густо мелкогранулированные. Покровных клеток не образует.

с.

Физиологические и биокимические признаки, Усв;швает следующие источники углерода:: глюкозу, галактозу;, сахарозу, мальтозу фруктозу, арабино- зу, ксилозу, крахмал, инулин, сорбит, манит и органические кислоты. Хорошо растет на нитритном, нитратном и ш-гвп с в 25 н в ж

30

35

40

45

50

55

ко че до ми ти ро до пи 0 ка ля LПона

фе gi ют

0

0

5

миачном азоте. Из органических источников азота ассимилируют аминокислоты. Растет в широких пределах кислотности среды (рН 2,0-9,0), Штамм не токсичен.

Исследование субстратной специфичности выделенной из штамма Aspergillus flavipes ВКШ F-351 тирозиназы показало, что фермент окисляет следующий ряд фенолов: тирозин, п-кре- зол, фенол, пирокатехин, 3,4-диокси- толуол, 3,4-диоксифенялаланин, резорцин.

Изобретение поясняется следлощими примерами,

Пример 1 о Посевную культуру Aspergillus fiavipes ВКПМ F-351 выращивают в пробирках на скошенной среде 2% сусло-агара, содержащего пивное сусло 2-2,5 Баллинга. Среду стерршизуют при 0,8 атм в течение 20 мин. Культуру на косяках выращивают 4-5 сут при 28 с. Культивирова- 5 ние ведут на качалках (120 об/мин) в колбах Эрленмейера. Используют жидкую среду следующего состава,г/л:

0

5

0

5

0

5

Сахароза

MgS04

KCl

FeSOa

7Н,

5,0

1,0

0,93

0,5

0,5

0,01

0,01

0,01

J ,0

Сиso 4 .

П,1,-Тирозин

Гидролизный лигнин

Дистиллированная

вода . До 1 л

125 мл среды в 500-миллилитровых колбах стерилизуют при 0,8 атм в течение 20 мин. Посев в колбы со средой проводят вводом петлей кусочка мицелия с агаровой поверхности. Куль тивируют при 28 Cj на качалках. После 3 сут роста биомассу собирают и хорошо промьшают дистиллированной водой. Биомассу, полученную из 500 мл питательной среды, инкубируют в 2 л 0,3%-ного раствора L-тирозина в 0,1 М КС1-НС1 буфере, рН 2,0. Через каждые 30 мин берут пробу и определяют количество образовавшегося LДОФА колориметрическим методом. После 2 ч инкубации достигается 85%- ная трансформация L-тирозина вL-ДОФА.

Пример 2, С целью получения ферментного раствора культуру Aspergillus flavipes ВКПМ F-351 выращивают, как в примере 1. После 4 сут культивирования биомассу собирают и несколько раз промьшают дистиллированно водой. 10 г биомассы гомогенизируют в 100 мл дистиллированной воды. Гомогенат центрифугируют при 6000 об/мин в течение 30 мин. Полученный супернатант представляет собой ферментный раствор с активностью 50 МЕ/мл или в расчете на биомассу 500 ед./г сырой биомассы. Активность определяют по окислению Ъ-тирозина. Реакционная смесь содержит: 1 мл 10 -М раствора L-тирозина в дистиллированной , 1 мл 0,5 М Na-фос- фатиого буфера, рН 6,5, 0,1 мл раствора фермента и 0,9 мл дистиллированной НдО (объем 3 мл). Реакцию про

водят при 25°С, за единицу активности принимают количество фермента, который приводит к увеличению оптической плотности реакционной смеси при 280 им на 0,001 ед./мин.

Таким образом, использование нового штамма позволяет осуществлять 85%-ную г трансформацию L-тирозина в 1Q L-ДОФА за 2 ч вместо 5, как в извест- ном способе, что свидетельствует о более высокой тирозиназной активности культуры.

15 Формула изобретения

Штамм грибов Aspergillus flavipes

ВКШ 1 F-351 - продуцент тирозиназы.

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а imeHно к новому штамму плесневого гриба рода Aspergillus flavipes - продуцента тирозиназы, находящей применение при трансформации L-тироэина в L-ди- гидрооксифенилаланин. Цель изобретения - выявление штамма грибов, продуцирующего тирозиназу с более высокой активностью. Изобретение заключается в том, что выделен новый штамм ВКПМ F-351. Культуру выращивают на питательной среде следующего состава, г/л: сахароза 5,0; 1,0; , 0,93; MgS04 0,5; KCl 0,5; FeS04-7H,jO 0,01; CuS04-5H20 0,01, П,Ь-тирозин 0,01; гидролизный лигнин 5,0; дистиллированная вода - до 1 л, активность ферментного раствора полученного су- пернатанта 50 МЕ/мл или в расчете на биомассу 500 ед/г сырой биомассы. i (Л

Редактор Н.Киштулинец

Составитель Г.Мелентьева

Техред М.Ходанич Корректор Э.Лончакова

Заказ 5855/25

Тираж 520

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, д. 4/5

Подписное