Способ получения средства, обладающего гепатопротекторным и антигепатотоксическим действием Российский патент 2022 года по МПК A61K36/28 B01D11/02 A61K127/00 A61P1/16 

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к способу получения средства, обладающего гепатопротекторным и антигепатотоксическим действием, из лекарственного растительного сырья.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Патологии гепатобилиарной системы представляют серьезную социально-экономическую и клиническую проблему по причине неуклонного роста заболеваемости. По статистике хронический гепатит встречается у 5% населения [Сакиев К.З., Батырбекова Л.С. Влияние факторов окружающей среды на состояние гепатобилиарной системы населения, проживающего в экологически неблагоприятных регионах // Медицина и экология. - 2015. - № 4 (77)].

Помимо вирусных и аутоиммунных заболеваний одной из основных причин поражения печени считается интоксикация организма, вызванная воздействием алкоголя, тяжелых металлов, пестицидов и других ксенобиотиков. При этом доля факторов окружающей среды в этиологии дисфункции печени может составлять от 14% до 36%. Например, у населения, проживающего на территориях, где содержание промышленных соединений и пестицидов в воде и воздухе выше норм ПДК, вероятность появления дисфункции гепатобилиарной системы в 3-4 раза выше, чем у населения, проживающего в экологически благоприятных районах [Сакиев К.З., Батырбекова Л.С. Влияние факторов окружающей среды на состояние гепатобилиарной системы населения, проживающего в экологически неблагоприятных регионах // Медицина и экология. - 2015. - № 4 (77)]. Также известно, что прием некоторых лекарственных препаратов может приводить к развитию лекарственно-индуцированных гепатотоксических реакций [Бибик Е.Ю. и др. Особенности фармакологических свойств современных гепатопротекторов //Морфологический альманах имени В.Г. Ковешникова. - 2019. - Т. 17. - № 4. - С. 101-110].

Комплексное воздействие на гепатобилиарную систему человека может быть обеспечено за счет использования средств растительного происхождения. Например, было показано, что механизм гепатопротекторной активности некоторых растительных экстрактов, обусловлен антиоксидантным, противовоспалительным, антистеатотическим, антиапоптотическим и антифибротическим действием фенольных соединений и терпеноидов, входящих в их состав [Domitrovic R., Potocnjak I. A comprehensive overview of hepatoprotective natural compounds: mechanism of action and clinical perspectives //Archives of toxicology. - 2016. - Vol. 90. - № 1. - p. 39-79].

Из уровня техники известно, что около 80% гепатопротекторных средств, применяемых в клинической практике, имеют растительное происхождение [Губергриц Н.Б. и др. Фармакотерапевтические эффекты и клинические возможности эталонного препарата силимарина // Фарматека. - 2012. - Т. 2. - С. 24-31.7].

Большинство растительных гепатопротекторных препаратов содержат в качестве действующего вещества силимарин - основной компонент экстракта плодов расторопши пятнистой (Silybum marianum (L.) Gaertn.) [Мусаева Э.М. и др. Возможности фармакологической коррекции патологий гепатобилиарной системы //Вестник Российской Военно-Медицинской Академии. - 2018. - № 2. - С. 221-225]. Биологически активные соединения, содержащиеся в плодах расторопши пятнистой, обладают антиоксидантным действием, препятствуют перекисному окислению липидов, оказывают противовоспалительный и антифиброзный эффект. Однако препараты на основе силимарина не рекомендуют применять для лечения заболеваний печени при холестазе. Кроме того, не была доказана эффективность силимарина при вирусном гепатите [Полунина Т.Е., Маев И.В. Применение гепатопротекторов при лечении болезней печени // Медицинский совет. - 2010. - № 3-4].

Биологически активные соединения (в том числе глицирризиновая кислота), содержащиеся в солодке голой (Glycyrrhiza glabra L.) проявляют антифибротическую, противовоспалительную и антистеатозную активность [Мехтиев С.Н., Оковитый С.В., Мехтиева О.А. Принципы выбора гепатопротекторов в практике терапевта // Журнал «Лечащий Врач». - 2018. - № 8-2016. - С. 44]. Однако из уровня техники известно, что экстракт солодки голой эффективен для лечения заболеваний печени только в составе комплексных лекарственных препаратов (например, препарат «Фосфоглив®»).

Препараты на основе цветков бессмертника песчаного (Helichrysurn arenarium (L.) Moench.) применяют как желчегонное средство при желчекаменной болезни, хроническом холецистите, гепатите, дискинезии желчевыводящих протоков. Противопоказанием к применению препаратов на основе цветков бессмертника песчаного является повышенная кислотность желудка [Пастушенков А.Л., Беспалова Н.В. Лекарственные средства и лекарственное растительное сырье, содержащие биологически активные вещества, влияющие на клинико-патофизиологические и фитотерапевтические аспекты гепатобилиарной системы // Клиническая патофизиология. - 2019. - Т. 25. - № 2. - С. 65-69].

В связи с этим актуальна разработка новых эффективных средств растительного происхождения, оказывающих комплексное воздействие на гепатобилиарную систему человека за счет различных механизмов гепатопротекторного действия, а также способствующих процессам детоксикации.

Наиболее близким к заявленному способу изобретений является способ получения гепатопротекторного лекарственного препарата «Силимар» (Патент РФ № 2099076 С1 от 16.04.1996; Научно-производственное объединение «Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений»). Лекарственный препарат «Силимар» представляет собой сухой экстракт, получаемый в результате комплексной переработки плодов расторопши пятнистой. Фармакологическое действие препарата «Силимар» обусловлено свойствами входящих в его состав биологически активных компонентов - флаволигнанов. Способ получения препарата «Силимар» включает экстракцию жмыха расторопши пятнистой этиловым спиртом (80%) методом быстротекущей реперколяции (6 перколяторов) при постоянном перемешивании при температуре 50°С в течение 1 ч, упаривание спиртовых извлечений до водного кубового остатка, очистку петролейным эфиром для удаления остатков жирного масла и осаждение флаволигнанов раствором соляной кислоты (0,025%). Полученный сухой остаток содержит до 80% действующих веществ.

Недостатком прототипа является сложная, многостадийная, трудоемкая технология получения экстракта.

Настоящее изобретение решает техническую проблему необходимости расширении ассортимента отечественных высокоэффективных и безопасных лекарственных средств, обладающее гепатопротекторным и антигепатотоксическим действием.

Авторами настоящего изобретения неожиданно было обнаружено, что сухой экстракт цикория обыкновенного (Cichorium intybus L.), проявляет выраженную антигепатотоксическую активность.

Уровень техники содержит сведения об антиоксидантной, антибактериальной, иммуномодулирующей и гепатопротекторной активности компонентов травы цикория обыкновенного. Однако применение экстракта травы цикория обыкновенного для восстановления функций печени при острых интоксикациях тяжелыми металлами, в том числе ртутью, неизвестно.

Техническим результатом заявленного изобретения является снижение уровня билирубина, ферментов печени в крови (ЩФ, АсАТ, АдАТ) и уменьшение дистрофических изменений по типу гиалиново-капельной дистрофии при остром токсическом поражении печени тяжелыми металлами и токсическом гепатите, а также уменьшение проявления симптомов острой интоксикации тяжелыми металлами.

Указанный технический результат достигается осуществлением заявленного способа получения средства, обладающего гепатопротекторным и антигепатотоксическим действием. Способ включает следующие последовательные стадии: измельчение высушенной травы дикорастущего цикория обыкновенного до размера частиц 3-5 мм, трехкратная динамическая мацерация спиртом этиловым 50-70% об. в соотношении 1:10 при температуре 40-60°С в течение 1-1,5 ч, фильтрование, концентрирование объединенного извлечения, очистка органическим растворителем, таким как дихлорметан или хлороформ, и сушка при температуре 40-60°С.

Этапы получения сухого экстракта цикория обыкновенного были разработаны и подобраны с учетом требований современного типового оборудования, а также потребности пациентов и рынка в новых эффективных средствах с гепатопротекторным и антигепатотоксическим действием.

Сухой экстракт цикория обыкновенного, получаемый согласно предлагаемому способу, содержит преимущественно фенолкарбоновые кислоты (хлорогеновую, цикориевую) и их производные; флавоноиды (гликозиды кверцетина и кемпферола); кумарины (эскулетин, цикориин) и углеводы.

Средство, полученное в результате реализации заявленного способа, может быть использовано для получения лекарственных препаратов для профилактики и лечения заболеваний печени. Предлагаемое средство отличается высокой эффективностью в снятии симптомов острого отравления токсикантами, малой токсичностью и связанной с этим возможностью длительного применения без риска развития побочных реакций. Также к преимуществам предлагаемого однокомпонентного растительного средства можно отнести возможность его применения в комплексной терапии заболеваний гепатобилиарной системы.

РАСКРЫТИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Сущность изобретения раскрывается в следующих примерах реализации заявленного способа, которые служат для иллюстрации, но не ограничивают объема притязаний.

Пример 1

Высушенную траву дикорастущего цикория обыкновенного измельчали до размера частиц 5 мм. Измельченное сырье заливали спиртом этиловым 50% об. в соотношении 1:10 и экстрагировали в экстракторе при температуре 40°С в течение 1 ч. Извлечение фильтровали, после чего в сборник добавляли экстрагент в объеме, равном слитому. Экстракцию повторяли трижды. Объединенное извлечение концентрировали до водного кубового остатка и очищали органическим растворителем (хлороформ). Очищенное водное извлечение сушили при температуре 40°С.

Полученный продукт представляет собой сухой экстракт (влажность не более 5% масс.) с содержанием суммы фенольных соединений в пересчете на цикориевую кислоту 8±0,38% масс.

Пример 2

Высушенную траву дикорастущего цикория обыкновенного измельчали до размера частиц 4 мм. Измельченное сырье заливали спиртом этиловым 60% об. в соотношении 1:10 и экстрагировали в экстракторе при температуре 50°С в течение 1 ч. Извлечение фильтровали, после чего в сборник добавляли экстрагент в объеме, равном слитому. Экстракцию повторяли трижды. Объединенное извлечение концентрировали до водного кубового остатка и очищали органическим растворителем (дихлорметан). Очищенное водное извлечение сушили при температуре 50°С.

Полученный продукт представляет собой сухой экстракт (влажность не более 5% масс.) с содержанием суммы фенольных соединений в пересчете на цикориевую кислоту 9±0,39% масс.

Пример 3

Высушенную траву дикорастущего цикория обыкновенного измельчали до размера частиц 3 мм. Измельченное сырье заливали спиртом этиловым 70% об. в соотношении 1:10 и экстрагировали в экстракторе при температуре 60°С в течение 1,5 ч. Извлечение фильтровали, после чего в сборник добавляли экстрагент в объеме, равном слитому. Экстракцию повторяли трижды. Объединенное извлечение концентрировали до водного кубового остатка и очищали органическим растворителем (дихлорэтан). Очищенное водное извлечение сушили при температуре 60°С.

Полученный продукт представляет собой сухой экстракт (влажность не более 5% масс.) с содержанием суммы фенольных соединений в пересчете на цикориевую кислоту 10±0,47% масс.

Таким образом, было показано, что измельчение растительного сырья до размера частиц 3-5 мм, трехкратная динамическая экстракция спиртом этиловым 50-70% об. в соотношении 1:10 при температуре 40-60°С в течение 1-1,5 ч, фильтрование, концентрирование, очистка подходящим органическим растворителем и сушка при температуре 40-60°С обеспечивает получение сухого экстракта (влажность не более 5% масс.) с содержанием суммы фенольных соединений в пересчете на цикориевую кислоту 8-10% (масс).

Пример 4

Определение гепатопротекторного действия на модели токсического гепатита, вызванного введением однократно подкожно крысам тетрахлорметана.

Исследования проводили согласно Правилам лабораторной практики в Российской Федерации (Приказ Министерства здравоохранения Российской Федерации № 199н от 01.04.2016, Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ 33044-2014 «Принципы надлежащей лабораторной практики», «Руководству по проведению доклинических исследований лекарственных средств» (2012 г.) и в соответствии с Федеральными законами от 12.04.2010 г. № 61-ФЗ (ред. от 28.11.2018 г.) «Об обращении лекарственных средств»). Животные содержались в виварии ФГБНУ ВИЛАР на стандартном рационе.

Эксперимент проводили на белых нелинейных крыс массой 200-250 г в количестве 50 особей. Подопытные животные были разделены на пять групп по 10 особей:

I группа - интактные животные,

II группа - контрольные животные, которым перед введением тетрахлорметана пять дней вводили эквивалентное количество очищенной воды в аналогичном с опытными группами в режиме внутрижелудочно,

III и IV группы - опытные, которые получали исследуемое вещество - цикория обыкновенного экстракт сухой пять дней в дозах 500 мг/кг и 100 мг/кг соответственно,

V группа животных, получавшая препарат сравнения «Силимар» в дозе 100 мг/кг, суспендированный в 1% крахмальной взвеси в течение пяти дней.

Экспериментальный гепатит у животных вызывали однократным введением 50% масляного раствора тетрахлорметана подкожно в дозе 0,4 мл на 100 г через час после последнего введения исследуемых веществ.

Через 48 часов после введения тетрахлорметана брали кровь из хвостовой вены крыс, получали сыворотку и проводили биохимический анализ. Затем изучали влияние экстракта травы цикория обыкновенного (полученного по примеру 1-3) и препарата сравнения «Силимар» на активность ферментов-маркеров морфофункционального состояния гепатоцитов в сыворотке крови крыс.

Крыс подвергали эвтаназии в СО₂ камере и извлекали печень для патогистологической оценки (Таблица 1).

На основании полученных результатов (таблица 1) можно сделать вывод, что сухой экстракт травы цикория обыкновенного дикорастущего в дозах 100 и 500 мг/кг проявляет выраженное гепатопротекторное действие. Морфологическая картина органов в обеих группах (III и IV) стереотипна. Выявлен дозозависимый эффект. Действие сухого экстракта травы цикория обыкновенного дикорастущего сопоставимо с действием препарата «Силимар».

Пример 5

Влияние экстракта и препарата сравнения на активность ферментов-маркеров в сыворотке крови крыс и морфофункционального состояния гепатоцитов.

Для установления гепатопротекторной эффективности и механизма действия экстракта травы цикория обыкновенного была изучена активность индикаторных ферментов цитолитического синдрома - аланин- и аспартатаминотрансфераз (АлАт, АсАт), экскреционного фермента маркера холестаза - щелочной фосфатазы (ЩФ), а также содержание общего билирубина в условиях экспериментального тетрахлорметанового гепатита (таблица 2).

Введение подопытным животным тетрахлорметана вызвало выраженные изменения активности индикаторных ферментов цитолитического синдрома, экскреционного фермента маркера холестаза - щелочной фосфатазы, общего билирубина. Наблюдали существенное увеличение активности этих ферментов-маркеров функционального состояния печени.

Введение крысам цикория обыкновенного экстракта сухого в дозах 100 мг/кг и 500 мг/кг, а также препарата «Силимар» в дозе 100 мг/кг на фоне токсического гепатита, вызванного тетрахлорметаном, существенно снижало активность АлАТ, АсАТ, общего билирубина, щелочной фосфатазы. Действие препарата «Силимар» в дозе 100 мг/кг было сопоставимо с действием цикория обыкновенного экстракта сухого в дозе 100 мг/кг.

Таким образом, было показано, что цикория обыкновенного дикорастущего травы экстракт сухой проявляет дозозависимое гепатопротекторное действие.

Пример 6

Исследование антигепатотоксического действия на модели острого токсического поражения печени, вызванного однократным подкожным введением сулемы.

Исследования выполнены на 70 крысах Wistar (самцы), масса тела 180-200 г. Эксперименты проведены в соответствии с «Правилами лабораторной практики». Содержание, кормление и уход за животными проводили в соответствии с Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных целей (Европейская конвенция, Страсбург, 1986).

Модель острого токсического поражения печени крыс вызывали однократным подкожным введением сулемы в дозе 3 мг/кг (≈ ЛД50 при подкожном введении сулемы белым крысам). Животные были разделены на 5 групп по 14 крыс в каждой:

I группа - интактный контроль, используемый для оценки токсического действия сулемы;

- II группа (модель) - животным однократно вводили подкожно (п/к) сулему в дозе 3 мг/кг;

III и IV группы - животным за 1 час до введения сулемы и в последующие 20 дней вводили в желудок цикория обыкновенного сухой экстракт в дозах 100 и 500 мг/кг соответственно;

V группа - животным за 1 час до введения сулемы и в последующие 20 дней вводили в желудок «Силимар» в дозе 100 мг/кг.

На протяжении эксперимента регистрировали основные интегральные показатели экспериментальных животных: общее состояние, поведение, динамику массы тела, гибель. На 21-е сутки опыта определяли показатели клинической биохимии сыворотки крови: общий белок, общий холестерин, триглицериды, глюкоза, общий билирубин активность ЩФ, АлАТ, АсАт, гамма-глутамилтрансферазы (ГГТ) на автоматическом биохимическом анализаторе крови URIT-8030 фирмы Urit Medical Electronic (Китай), при помощи наборов фирмы «Human», Германия. В конце эксперимента животных подвергали эвтаназии в СО₂-камере, определяли коэффициенты массы печени, проводили патогистологическую оценку печени при окрашивании срезов гематоксилином и эозином и исследовании световой микроскопией при увеличении ×100.

Под влиянием сулемы отмечали развитие токсического повреждения печени (II группа) у животных, характерное для острого отравления крыс этим гепатотропным ядом, резкое нарушение ее функционального состояния, снижение основных видов межуточного обмена, повреждение мембран гепатоцитов и их гибель. Указанные эффекты гепатотоксического действия сулемы сопровождались нарушением общего состояния животных (снижение динамики массы тела на 40%, вялость, гиподинамия, размягчение кала), гибелью 5 животных, что составляло 35,7%. Интоксикация сулемой приводила к статистически достоверному увеличению в сыворотке крови крыс уровня общего белка, глюкозы, общего холестерина и триглицеридов, активности ферментов АсАТ и АлАТ, ЩФ, ГГТ. У животных II группы отмечено повышение коэффициента массы печени.

Гистологическая картина печени показала наличие дистрофии гепатоцитов, характеризующаяся гиалиново-капельной дистрофией (фиг. 9).

Введение сухого экстракта цикория обыкновенного в дозах 100 (III группа) и 500 мг/кг (IV группа) улучшало общее состояние животных, предотвращало резкое снижение массы тела и двигательной активности. На 21-й день опыта снижение массы тела крыс, получавших экстракт в обеих испытанных дозах, не превышало 14-16%, по сравнению с моделью патологии.

В III группе животных была зарегистрирована гибель 4 животных, что составляло 26,8%, а IV группу - гибель 3 животных (21.4%); в V группе животных, получавших препарат сравнения «Силимар» - гибель 4 животных (26,8%). Крысы этих групп (III-V) имели опрятный внешний вид, оформленный кал, охотно поедали корм.

Введение сухого экстракта цикория обыкновенного предотвращало резкое повышение активности ряда ферментов сыворотки крови, характеризующих функциональное состояние печени, и способствовало их более быстрой нормализации, причем несколько более выраженными эти изменения были у животных, получавших максимальную дозу 500 мг/кг (табл. 3 и 4).

Выраженные антигепатотоксические свойства сухого экстракта цикория, полученного по примеру 1-3, в дозе 100 и 500 мг/кг подтверждены результатами патогистологического исследования печени экспериментальных животных. Введение сухого экстракта цикория обыкновенного в дозе 100 и 500 мг/кг на фоне интоксикации сулемой показало отсутствие дистрофических изменений в гепатоцитах (фиг. 10, 11)

Введение сухого экстракта цикория обыкновенного в обеих дозах способствовало сохранению относительной массы печени на уровне показателей интактного контроля (табл. 5).

Таким образом, было установлено выраженное антигепатотоксическое действие сухого экстракта цикория обыкновенного на модели острой интоксикации сулемой у крыс в дозах 100 и 500 мг/кг.

Результаты проведенных исследований свидетельствуют о том, что по эффективности антигепатотоксического действия на указанной модели патологии печени сухой экстракт цикория обыкновенного в дозах 100 и 500 мг/кг соответствует препарату «Силимар».

Сулема, используемая в экспериментальной модели, обладает в целом общетоксическим действием, в отличие от тетрахлорметана, который влияет только на гепатоциты, вызывая их цитолиз.

Из результатов, приведенных в примерах, следует, что указанная техническая проблема решена - создано растительное средство на основе сухого экстракта цикория обыкновенного, способствующего снижению уровня билирубина и ферментов печени (ЩФ, АсАТ, АлАТ, ГЛТ) в крови, уменьшению дистрофических изменений по типу гиалиново-капельной дистрофии печени, а также улучшению общего самочувствия при острой интоксикации тяжелыми металлами, в том числе ртутью.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, а именно к средству, обладающему гепатопротекторным и антигепатотоксическим действием, и способу его получения. Способ получения средства, обладающего гепатопротекторным и антигепатотоксическим действием, включающий экстракцию растительного сырья, очистку и сушку, причем в качестве растительного сырья используют измельченную высушенную траву дикорастущего цикория обыкновенного (Cichorium intybus L.) с размером частиц 3-5 мм, трехкратную динамическую экстракцию спиртом этиловым 50-70% об. в соотношении 1:10 при температуре 40-60°С в течение 1-1,5 ч, фильтрование, концентрирование объединенного извлечения, очистку органическим растворителем, выбранным из группы, включающей дихлорметан, дихлорэтан, хлороформ, и сушку при температуре 40-60°С. Средство, обладающее гепатопротекторным и антигепатотоксическим действием. Вышеуказанное средство обеспечивает снижение уровня билирубина, активности ферментов сыворотки крови – маркеров заболеваний печени (ЩФ, АсАТ, АлАТ) и уменьшение дистрофических изменений по типу гиалиново-капельной дистрофии при остром токсическом поражении печени тяжелыми металлами и токсическом гепатите, а также уменьшает проявления симптомов острой интоксикации тяжелыми металлами. 2 н.п. ф-лы, 11 ил., 5 табл., 6 пр.

1. Способ получения средства, обладающего гепатопротекторным и антигепатотоксическим действием, включающий экстракцию растительного сырья, очистку и сушку, отличающийся тем, что в качестве растительного сырья используют измельченную высушенную траву дикорастущего цикория обыкновенного (Cichorium intybus L.) с размером частиц 3-5 мм, трехкратную динамическую экстракцию спиртом этиловым 50-70% об. в соотношении 1:10 при температуре 40-60°С в течение 1-1,5 ч, фильтрование, концентрирование объединенного извлечения, очистку органическим растворителем, выбранным из группы, включающей дихлорметан, дихлорэтан, хлороформ, и сушку при температуре 40-60°С.

2. Средство, обладающее гепатопротекторным и антигепатотоксическим действием, полученное способом по п. 1.