Гепатопротекторное средство Российский патент 2017 года по МПК A61K31/185 A61P1/16 

Изобретение относится к биологически активным соединениям, используемым в медицине и в фармакологии.

Изобретение касается расширения арсенала средств, оказывающих гепатозащитное действие при острых и хронических гепатитах и циррозе печени. Для этой цели предлагается использовать соединение - хлоргидрат N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты. Это структурный аналог таурина ранее описан как ингибитор агрегации тромбоцитов [«Производные таурина, проявляющие способность ингибировать агрегацию тромбоцитов» АС №1540228]. Соединение не токсично, синтез прост и доступен. Проведенные доклинические испытания препарата позволяют рекомендовать его в качестве гепатопротекторного средства для профилактики и лечения острых и хронических гепатитов и цирроза печени.

Проблема профилактики и лечения заболеваний органов гепатобилиарной системы остается одной из актуальных задач медицинской науки. В последнее время отмечается высокий уровень заболеваемости токсическим гепатитом среди людей работоспособного возраста, что определяет важность поисков новых лекарственных средств для лечения данной патологии [Подымова С.Д. Болезни печени /Руководство для врачей. - М.: Медицина. - 1999. - 704 с.; Rizzetto М. Therapy of chronic viral hepatitis. // Ital. J. Gastroenterol. Hepatol. - 1999. - Vol. 31. - P. 781-793; Оковитый С.В. Экспериментально-клиническое обоснование применения препаратов с метаболическим и иммунотропным действием при различной патологии печени. Автореф. дис.… докт. мед. наук. - СПб., 2003. - 41 с. ]. В комплексном лечении заболеваний печени и желчевыводящих путей используются разнообразные медикаментозные средства. Среди них важное место занимают препараты, оказывающие гепатозащитное действие. В основном, они растительного происхождения: фитопрепараты флавоноидной природы из расторопши пятнистой (легалон, силимар, карсил), из пижмы обыкновенной - танацехол и др. [Машковский М.Д. Лекарственные средства. 15 изд-е, 2005. - С. 526-527]. Благодаря своей природе эти средства, как правило, обладают комплексом фармакологической активности [Подымова С.Д. Болезни печени / Руководство для врачей. - М.: Медицина. - 1999. - 704 с. ]. В качестве гепатопротекторного средства часто применяют препарат карсил [Машковский М.Д. Лекарственные средства. 15 изд-е, 2014. - С. 526-527]. Гепатопротекторное действие карсила связывают с антиоксидантными свойствами, нормализацией обмена фосфолипидов, со стимуляцией синтеза белка. Клинический эффект этого соединения начинает проявляться после его длительного применения. Вместе с тем длительное применение карсила может вызывать диспептические явления (изжогу, позывы на рвоту, тяжесть в желудке, послабляющее действие) [Машковский М.Д. Лекарственные средства. 13 изд-е, 1998. - С. 515-516]. Следовательно, при быстром течении болезни такой подход может оказаться малоэффективным и недостаточным [Подымова С.Д. Болезни печени /Руководство для врачей. - М.: Медицина. - 1999. - 704 с. ]. Поэтому проблема поиска новых препаратов для устранения повреждений печени остается актуальной. Перспективным представляется изыскание таких средств среди соединений, обладающих широким спектром фармакологической активности.

По современным представлениям, патогенез гепатита полиэтиологичен и, в конечном счете, сводится к дисбалансу ряда агрессивных и защитных факторов организма. Известно, что токсическое поражение печени сопровождается нарушением проницаемости мембран гепатоцитов и активацией процессов перекисного окисления липидов с последующим нарушением функции печени.

Полученное в результате химической реакции соединение хлоргидрат N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты (C₁₂H₂₀N₂O₂S HCl) нами было апробировано на экспериментальной модели гепатита.

Эффект от его использования превзошел ожидания, после чего препарат подвергли подробному исследованию с использованием комплекса современных методов (биохимических и гистологических) на модели экспериментальной патологии печени, вызванной введением CCl₄ (тетрахлорметана). Гепатопротекторное действие испытуемого средства оценивали в двух сериях экспериментов:

серия 1 - профилактическое применение хлоргидрата N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты в условиях острого эксперимента;

серия 2 - курсовое (в течение 21 дня) применение хлоргидрата N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты в условиях хронического эксперимента.

Материалы и методы

Сравнительную гепатопротекторную активность хлоргидрата N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты изучали на крысах-самцах массой 180-200 г на модели токсического повреждения печени CCl₄.

Препарат сравнения - карсил. Он является суммарным препаратом, содержащим силимарин, силибинин и экстракт плодов расторопши пятнистой [Машковский М.Д. Лекарственные средства. 15 изд-е, 2005. - С. 526-527].

Серия 1. Профилактическое применение хлоргидрата N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты Моделирование токсического повреждения печени CCl4

Эксперименты проведены на 40 белых крысах-самцах массой 180-200 г, которых делили на 4 группы. Группу 1 составили интактные животные. Крысам группы 2 ежедневно перорально в течение 7 дней вводили физиологический раствор, группы 3 - заявляемое соединение хлоргидрата N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты (25 мг/кг), группы 4 - препарат сравнения карсил (20 мг/кг). Начиная с 8-го дня у животных групп 2, 3 и 4 вызывали повреждение печени введением CCl₄ (50% раствор на вазелиновом масле) в дозе 0,4 мл/кг. CCl₄ вводили подкожно (1 раз в сутки) в течение четырех дней.

На 7-е сутки от начала введения тетрахлорметана, когда, по данным литературы [Стречень С.Б., Стресюн В.Н. Механизмы гепатопротекторного действия новых производных никотиновой кислоты при экспериментальном поражении печени CCl₄ // Бюл. эксп. биол. и мед. - 1972. - №7. - С. 58-60], в печени развиваются гистологические и функциональные изменения, соответствующие токсическому гепатиту, крыс декапитировали. После вскрытия брюшной полости быстро извлекали печень, отсекали от нее кусочек (массой 1 г) и замораживали в жидком азоте. Забор ткани в каждом опыте осуществляли от одной и той же доли печени. В гомогенатах печени определяли содержание гликогена [Kemp A., Heijningen V. Van // Biochem. J. - 1954. - Vol. 56. - P. 646-648], в сыворотке крови трансаминазы - аланинаминотрансферазу (АлАТ), аспартатаминотрансферазу (АсАТ) и общий билирубин с использованием наборов реактивов по инструкции производителя [Комаров Ф.И., Коровин Б.Ф., Меньшиков В.В. Биохимические исследования в клинике. Элиста: АПП «Джангар», 1998. - 250 с]. Для гистологического исследования кусочки печени фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и заливали в парафин. Серийные срезы окрашивали гематоксилином и эозином.

Влияние препарата хлоргидрата N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты на изменение биохимических показателей при профилактическом применении.

Результаты исследований представлены в таблице 1. Видно, что при токсическом повреждении печени на 7-е сутки от начала введения CCl₄ у крыс, получавших физиологический раствор, в ткани печени значительно снижалось содержание гликогена (с 4,80±0,25 до 1,4±0,3 г %). В сыворотке крови, при этом, увеличивались концентрация АлАТ (от 65,5±4,0 до 85,3±3,2 Е/л.), АсАТ (от 165,3±4,0 до 199,4±4,7 Е/л.) и уровень общего билирубина (с 27,8±2,4 до 52,7±4,5 мкмоль/л).

У крыс, которым вводили заявляемое соединение - хлоргидрат N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты (группа 3) или препарат сравнения карсил (группа 4), содержание гликогена в ткани печени было достоверно выше, уровень общего билирубина - ниже, чем у животных, не получавших лечения (группа 2), а концентрация трансаминаз (АлАТ и АсАТ) не отличалась от таковой у интактных животных.

Из полученных результатов можно сделать вывод: предварительное, до токсического воздействия, введение заявляемого соединения хлоргидрата N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты, как и эталонного препарата карсила, предупреждало истощение запасов гликогена в гепатоцитах и увеличение содержания АлАТ, АсАТ, общего билирубина в сыворотке крови.

Влияние хлоргидрата N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты на гистологическую картину печени при профилактическом применении.

Контроль

Результаты исследований показали, что гистологическая картина ткани печени животных, которым до инъекций CCl₄ вводили физиологический раствор (Рис. 1, фото Б), по сравнению с наблюдаемой в печени интактных крыс (Рис. 1, фото А), характеризовалась мелкокапельной жировой дистрофией, нерегулярными ступенчатыми некрозами, склеротическими изменениями и лимфомакрофагальной инфильтрацией, локализованными в портальных трактах; адаптационные изменения отсутствовали.

Эталонный препарат карсил

Профилактическое введение карсила не предупреждало развития мелкокапельной жировой дистрофии, но снижало интенсивность лимфомакрофагальной инфильтрации и способствовало появлению адаптационных изменений в виде ядерного полиморфизма гепатоцитов (Рис. 1, фото Г).

Заявляемое соединение хлоргидрат N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты

Микроструктура ткани печени крыс соответствовала хроническому гепатиту средней степени активности (Рис. 1, фото В). Гистологическое исследование показало, что ступенчатые некрозы в паренхиме печени малочисленны, жировая мелкокапельная дистрофия непостоянна в пределах одного наблюдения с преобладанием гидропической дистрофии, отмечались адаптационно-компенсаторные изменения в виде ядерного полиморфизма гепатоцитов.

Из полученных данных можно сделать вывод: предварительное введение заявляемого соединения хлоргидрата N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты оказывает положительное влияние на гистологическую картину печени при ее токсическом повреждении CCl₄. Об этом свидетельствует снижение степени активности патологического процесса, уменьшение интенсивности инфильтративно-склеротических повреждений и жировой дистрофии, частоты некроза, усиление адаптационных изменений в виде ядерного полиморфизма гепатоцитов.

Серия 2. Исследование гепатопротекторного действия хлоргидрата N-изопропиламида - 2-бензиламиноэтансульфокислоты при курсовом (в течение 21 дня) введении в условиях хронического эксперимента

Моделирование токсического повреждения печени CCl₄

Эксперименты проведены на 100 белых крысах-самцах массой 180-200 г. Заявляемое соединение хлоргидрат N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты и препарат сравнения карсил начинали вводить животным с уже сформированным токсическим гепатитом, который моделировали подкожным введением CCl₄ (50% раствор на вазелиновом масле) в дозе 0,4 мл/кг. На 7-е сутки от начала введения CCl₄ животных делили на 3 группы. Крысам группы 1 вводили физиологический раствор, группы 2 - заявляемое соединение хлоргидрат N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты (25 мг/кг). Животным группы 3 - препарат сравнения карсил (20 мг/кг). Заявляемое соединение хлоргидрат N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты и эталонный препарат карсил вводили ежедневно перорально (через зонд). Терапевтический эффект оценивали в динамике. Для этого на 7-е, 14-е и 21-е сутки от начала лечения из каждой экспериментальной группы декапитировали по 10 крыс. В сыворотке крови определяли общий билирубин, в гомогенатах ткани печени - содержание гликогена. При гистологическом исследовании серийные срезы окрашивали гематоксилином и эозином.

Влияние препарата хлоргидрата N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты на изменение биохимических показателей в условиях хронического эксперимента при курсовом (в течение 21 дня) введении

Результаты исследований представлены в таблице 2. Они показали, что у животных при токсическом повреждении, обусловленном тетрахлорметаном, по сравнению с интактными крысами снижался уровень гликогена в печени на 71% и увеличилась концентрация общего билирубина в сыворотке крови на 134%. Установленные факты указывают на нарушение углеводного обмена и пигментообразовательной функции печени. Дальнейшие наблюдения за динамикой развития токсического повреждения показали, что у животных, не получающих лечения, содержание гликогена в печени увеличивалось с 14-го дня наблюдения, а уровень общего билирубина в сыворотке крови снижался начиная с 7-го дня (табл. 2). Вместе с тем, следует отметить, что и на 21-е сутки указанные показатели не возвращались к величинам, наблюдаемым у интактных крыс.

В группе крыс с токсическим повреждением печени, которые получали препарат сравнения карсил, содержание общего билирубина снижалось до значений, наблюдаемых у интактных крыс на 14-е сутки, а запасы гликогена практически восстанавливались - к 21-м суткам терапии.

У животных с моделированным токсическим гепатитом, на фоне введения заявляемого средства - хлоргидрата N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты содержание гликогена в печени увеличивалось к 21-м суткам, а уровень общего билирубина уменьшался до значений, наблюдаемых у интактных животных к 7-м суткам лечения, свидетельствующее о восстановлении гликогенеза и пигментообразовательной функции гепатоцитов.

Таким образом, результаты сравнительного изучения терапевтического влияния заявляемого соединения хлоргидрата N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты при повреждении печени, вызванном тетрахлорметаном, свидетельствуют о том, что тестируемое соединение (хлоргидрат N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты) восстанавливает содержание общего билирубина в крови в более короткие сроки, чем препарат сравнения карсил.

Влияние хлоргидрата N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты на гистологическую картину печени в условиях хронического эксперимента при курсовом (в течение 21 дня) введении

Контроль

В печени животных контрольной группы, получавших CCl₄ и физиологический раствор, на 7-е и 14-е сутки наблюдения были выявлены грубая зернистость, а также ступенчатые некрозы в центральных и промежуточных зонах (Рис. 2, фото Б и В) по сравнению с печенью интактных крыс (Рис. 2, фото А). На 21-е сутки наблюдения появлялись двухъядерные клетки, свидетельствующие о слабо выраженной адаптации (Рис. 2, фото Г). Токсический гепатит на этом сроке наблюдения характеризовался средней степенью активности.

Заявляемое соединение хлоргидрат N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты

Гистологическая картина при терапии хлоргидратом N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты соответствовала хроническому гепатиту средней активности на 7-е и на 14-е сутки лечения (Рис. 3, фото А и Б), а на 21-е сутки - характеризовалась низкой степенью активности (Рис. 3, фото В). Процессы повреждения коррелировали с отчетливыми адаптационными изменениями гепатоцитов, в виде ядерного полиморфизма. В портальных трактах отмечалась умеренная макрофагальная инфильтрация.

Эталонный препарат карсил

По результатам гистологического анализа препарат сравнения несколько уступал хлоргидрату N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты. Так, на 7-е и 14-е сутки терапии карсилом структурные нарушения в печени животных соответствовали хроническому гепатиту средней степени активности (Рис. 4, фото А и Б). На серийных срезах печени отмечались ступенчатые некрозы, в большинстве долек преобладала эозинофильная дегенерация и гидропическая дистрофия гепатоцитов. На 21-е сутки лечения карсилом на фоне адаптационных изменений в виде полиморфизма ядер, встречались ступенчатые некрозы (Рис. 4, фото В).

Из проведенных гистологических исследований можно сделать вывод, что при повреждении печени CCl₄, сравнительная оценка терапевтического действия заявленного соединения - хлоргидрата N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты - и эталонного препарата карсила выявила положительную динамику. Так, на 14-е сутки терапии заявляемым соединением отмечалась отчетливая тенденция к снижению интенсивности процессов повреждения, низкая степень клеточной инфильтрации, значительная выраженность компенсаторных изменений (адаптационные и регенераторные процессы), наклонность соединительной ткани к созреванию. К 21-м суткам лечения эти процессы усиливались. Результаты гистологического исследования печени при отравлении тетрахлорметаном, свидетельствуют, что в условиях хронического эксперимента при курсовом (в течение 21 дня) введении гепатопротекторное действие хлоргидрата N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты сопоставимо с эффектом эталонного препарата карсила.

Таким образом, биохимические и гистологические исследования показали, что заявляемое вещество превосходит по гепатопротекторной активности препарат сравнения карсил.

Изобретение относится к биологически активным соединениям, используемым в медицине и в фармакологии, в частности к гепатопротектору. Предложено применение производного таурина, хлоргидрата N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты в качестве гепатопротекторного средства для профилактики острых или хронических гепатитов, цирроза печени. Проведенные доклинические испытания препарата показали снижение интенсивности инфильтративно-склеротических повреждений и жировой дистрофии, частоты некроза гепатоцитов. Показано, что хлоргидрат N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты не уступает по гепатопротекторной активности карсилу и может найти применение в медицинской практике. 4 ил., 2 табл.

Применение хлоргидрата N-изопропиламида-2-бензиламиноэтансульфокислоты в качестве гепатопротекторного средства для профилактики острых или хронических гепатитов, цирроза печени.