ШТАММ ESCHERICHIA COLI BL21(DE3)PLYSS/PET15B-HISCPF1 - ПРОДУЦЕНТ РНК-НАПРАВЛЯЕМОЙ ЭНДОНУКЛЕАЗЫ CRISPR/CPF1 Российский патент 2022 года по МПК C12N1/21 C12N15/55 C12N15/70 C12N9/22 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к технологии получения рекомбинантной нуклеазы Cpf1 с помощью штамма бактерий Escherichia coli.

Бактериальный белок Cpf1 является эффекторным белком системы CRISPR, который в комплексе с направляющей (guide) РНК (далее gPHK) генерирует двуцепочечный сайт-специфичный разрыв ДНК с образованием "липких" концов. Нуклеаза CRISPR-Cas Cpf1 (также известная как Casl2a нуклеаза) является аналогом нуклеазы Cas9 и обладает следующими отличительными свойствами: распознавание Т-богатого РАМ-сайта - последовательности, смежной с последовательностью мишени, наличие которой необходимо для нацеливания на мишень; эндонуклеазная активность, при которой в ДНК генерируются липкие 5'-концы ДНК (а не тупые двуцепочечное разрывы, как в случае Cas9); последовательность ДНК расщепляется на дистальном конце от РАМ-сайта (по сравнению с проксимальным расщеплением у Cas9), что уменьшает вероятность нарушения РАМ-сайта и дает возможность проведения нескольких генетических манипуляций в одном месте [1, 2].

Аналоги на получение штаммов-продуцентов эффекторных белков системы CRISPR/Cas, к которым относятся нуклеазы Cpf1 и Cas9, не выявлены. Ближайшими аналогами являются патенты на получение различных эндонуклеаз рестрикции (например, RU 2529362 C1, RU 2475533 C1). Эндонуклеазы рестрикции, так же как и эффекторные белки системы CRISPR/Cas, используются для генно-инженерных манипуляций и вносят в ДНК двуцепочечные разрывы, однако обладают рядом недостатков, таких как распознавание коротких 6-нуклеотидных последовательностей и неизменная специфичность (распознавание определенной единственной последовательности нуклеотидов). Предлагаемое изобретение решает данные проблемы, поскольку нуклеаза Cpf1 узнает 20-25-нуклеотидную последовательность, что важно при редактировании протяженных ДНК, так вероятность встретить несколько идентичных 6-нуклеотидных последовательностей выше примерно в 10⁶-10⁹ раз. Специфичность к мишени у Cpf1 задается через небольшую молекулу РНК, которую легко синтезировать химическим путем, поэтому один и тот же фермент может применяться для редактирования различных мишеней в отличие от эндонуклеаз рестрикции.

Задачей, решаемой авторами, являлось создание технологии высокоэффективной продукции активного рекомбинантного фермента Cpf1.

Технический результат был достигнут созданием штамма E. coli BL21(DE3)pLysS/pET15b-HisCpf1 - продуцента активной рекомбинантной нуклеазы Cpf1, полученного трансформацией культуры клеток E. coli BL21(DE3)pLysS (генотип F-, ompT, hsdSB (rB- mB-), dcm, gal, λ(DE3), pLysS, Cm^r., рекомбинантной плазмидной ДНК pET15b-HisCpf1, сконструированной на основе вектора pET15b, несущего ген рекомбинантной нуклеазы Cpf1 из бактериального штамма Moraxella bovis.

Штамм Е. coli BL21(DE3)pLysS/pET15b-HisCpf1 имеет следующие характеристики:

Культурально-морфологические особенности штамма: грамотрицательные прямые палочки, размером 1,1-1,5×2,0-3,0 мкм, одиночные, спор и капсул не образуют. Каталазоположительные. Оксидазоотрицательные. Факультативные анаэробы.

Клетки хорошо растут на простых питательных средах, содержащих и не содержащих хлорамфеникол и ампициллин, например, на среде LB (питательная среда LisogenyBroth). На агаризованной среде - колонии гладкие, круглые, слабо выпуклые, с ровным краем. В жидких средах образуют равномерную светорассеивающую суспензию, при хранении без перемешивания оседают на дно. Клетки растут в интервале температур от 8°С до 43°С, интервал для наиболее эффективного культивирования - 28-38°С, оптимум роста при 37°С. Оптимальный интервал рН для культивирования рН 5-7.

Генетические признаки, устойчивость к антибиотикам: генотип исходного штамма Esherichia coli BL21(DE3)pLysS: F- отрТ hsdSB (rB- mB-) gal dcm (DE3) pLysS(Cam^R). Проявляет устойчивость к хлорамфениколу (34 мкг/мл), обусловленную наличием гена устойчивости в ДНК рекомбинантной плазмиды pLysS.

Характеристики полезного вещества, синтезируемого штаммом: рекомбинантный белок Cpf1, длиной 1281 аминокислотных остатков, состоящий из нуклеазы Cpf1 из бактериального штамма Moraxella bovis (1261 аминокислот) и вспомогательной последовательности длиной 20 аминокислот.

Продуктивность штамма - рекомбинантный Cpf1 составляет не менее 21 масс % по массе белка клеточного лизата при культивировании в жидкой среде ТВ (питательная среда TerrificBroth) при 37°С, 200 об/мин, в условиях индукции 1М ИПТГ (1:100) с добавлением антибиотиков хлорамфеникола (34 мкг/мл), ампициллина (100 мкг/мл) и рифампицина (100 мкг/мл).

Культивирование штамма: культивирование при температуре 37°С в термостате или качалке, в агаризованной (2% агара) LB или жидкой ТВ-среде соответственно.

Селективные условия - в культуральную среду добавлены 100 мкг/мл ампициллина и 34 мкг/мл хлорамфеникола.

На фиг. 1 приведены электрофореграммы лизатов клеток E. coli BL21(DE3)pLysS/pET15b-HisCpf1 при культивировании в условиях индукции синтеза белка при помощи ИПТГ и без индукции, где М - белковый маркер PrecisionPlusProtein™ Unstained Protein Standards (Bio-rad); К - контрольная неиндуцированная культура, 1-8-1-8 ч после индукции 1М ИПТГ (1:100) соответственно.

Сущность изобретения поясняется следующими конкретными примерами получения и использования штамма E. coli BL21(DE3)pLysS/pET15b-HisCpf1.

Пример 1. Создание генетической конструкции, обеспечивающей синтез рекомбинантной нуклеазы Cpf1 в клетках E. coli.

Методом полимеразной цепной реакции с использованием специфических праймеров Cpf1-For (SEQ ID NO 1) и Cpf1-Rev (SEQ ID NO 2) на матрице геномной ДНК штамма Moraxella bovis был амплифицирован ген cpf1 Последовательность нуклеотидов полученного гена совпадает с последовательностью cpf1 Moraxella bovis, имеющейся в GenBank (СР030241.1) Полученный ген был встроен в экспрессирующий вектор pET15b с получением экспрессионной плазмиды pET15b-HisCpf1 (фиг. 2).

Плазмида pET15b-HisCpf1 обеспечивает в клетках Е. coli синтез полноразмерной бактериальной нуклеазы, дополнительно содержащей с N-конца вспомогательную последовательность длиной 20 аминокислот, которая содержит участок, состоящий из 6-ти остатков гистидина (гистидиновая метка), предназначенный для последующей очистки рекомбинантной нуклеазы с помощью металлохелатной хроматографии, а также сайт гидролиза тромбином (протеиназой), позволяющий при необходимости удалить большую часть служебной последовательности при обработке очищенного препарата рекомбинантной нуклеазы тромбином. Нуклеотидная (SEQ ID NO 4) и аминокислотная (SEQ ID NO 5) последовательности рекомбинантной нуклеазы Cpf1 представлены в Приложении 1.

Пример 2. Получение штамма-продуцента рекомбинантной нуклеазы Cpf1 и исследование его продуктивности.

Полученной плазмидой pET15b-HisCpf1 были трансформированы клетки Е. coli штамма BL21(DE3)pLysS, содержащие в своем геноме ген, кодирующий полимеразу фага Т7 под контролем бактериального промотора, индуцируемого лактозой или ИПТГ. Также данный штамм несет плазмиду pLysS, кодирующую ингибитор Т7 полимеразы - лизоцим фага Т7, что существенно снижает базальный уровень экспрессии гена, встроенного под Т7 промотор, что позволяет клонировать даже токсичные для клетки гены. Кроме того, клетки Е. coli BL21(DE3)pLysS дефектны по генам протеаз Ion и ompT. Отсутствие этих двух протеаз уменьшает деградацию гетерологичных белков.

В результате был получен штамм E. coli BL21(DE3)pLysS/pET15b-HisCpf1- продуцент бактериального белка Cpf1.

Для поддержания полученного штамма-продуцента белка Cpf1 использовали плотную агаризованную LB-среду, содержащую 100 мкг/мл ампициллина и 34 мкг/мл хлорамфеникола.

Продуктивность полученного штамма-продуцента изучали путем культивирования клеток в среде ТВ, в термостатированном шейкере роторного типа при температуре 37°С, скорости вращения платформы 200 об/мин. По достижении культурой оптической плотности 3 о.е. индуцировалась экспрессия целевого гена (добавление 1М ИПТГ (1:100), а затем добавление рифампицина до концентрации 100 мкг/мл через 30 минут после начала индукции). При добавлении рифампицина происходит нарушение экспрессии генов домашнего хозяйства, поскольку рифампицин ингибирует ДНК-зависимую РНК-полимеразу у Е. coli, при этом экспрессия целевого белка не нарушается, так как Т7 РНК-полимераза, под промотором которой находится целевой ген, устойчива к действию рифампицина. В качестве контроля использовали неиндуцированную культуру (без добавления ИПТГ). Образцы собранной центрифугированием биомассы клеток лизировали и анализировали методом электрофореза в полиакриламидном геле в денатурирующих условиях. Результат представлен на фиг. 1.

Как видно из фиг. 1, индукция ИПТГ культуры клеток Е. coli BL21(DE3)pLysS/pET 15b-HisCpf1 приводит к синтезу белка с молекулярным весом примерно 147 кДа, что соответствует ожидаемому молекулярному весу для рекомбинантного Cpf1. Анализ денситограммы полиакриламидного геля, представленного на фиг. 1, выполненный с помощью программы CLIQS, показал, что рекомбинантный Cpf1 составляет 21% общего белка клеточного лизата при начальной оптической плотности 3 о.е. и инкубации с ИПТГ и рифампицином в течение 5 часов.

Пример 3. Очистка рекомбинантного Cpf1 и изучение его биологической активности.

Рекомбинантный Cpf1 очищали из клеточных лизатов методом металлохелатной хроматографии с последующим концентрированием белковой фракции сульфатом аммония и обессоливанием при помощи спин-колонок. Результат очистки клеточного лизата Е. coli BL21(DE3)pLysS/pET15b-HisCpf1 представлен на фиг. 3, где М - белковый маркер PrecisionPlusProtein™ UnstainedProteinStandards (Bio-rad), 1 - очищенный препарат Cpf1.

Как видно из фиг. 3 препарат Cpf1 является практически гомогенным и его чистота составляет не менее 90% по результатам электрофореза в полиакриламидном геле с последующей денситометрией.

Биологическая активность рекомбинантного Cpf1 оценивалась in vitro, матрицей для гидролиза был выбран фрагмент плазмиды pUC19, линеаризованной при помощи ПЦР. Для постановки гидролиза реакционная смесь, состоящая из буферного раствора, ионов магния, очищенного препарата Cpf1 и gPHK (SEQ ID NO 3), инкубировалась в течение 10 минут при комнатной температуре для образования комплексов фермент-РНК. Далее к реакционной смеси добавляли линеаризованный фрагмент pUC19, смесь инкубировали 10 минут при 37°С в твердотельном термостате. Результаты анализировали в 1% агарозном геле. Результаты экспериментов по определению биологической активности рекомбинантного Cpf1 представлены на фиг. 4, где М - ДНК-маркер 1 кб (СибЭнзим), К - контрольная исходная матрица pUC19, 1-3 - препараты ДНК после гидролиза, соотношение ДНК:РНК/Cpf1 = 1:1, 1:2, 1:3 соответственно.

Из фиг. 4 следует, что рекомбинантный Cpf1, продуцируемый клетками штамма Е. coli ВЕ21(ОЕ3)pLysS/pET15b1Cpf1, обладает биологической активностью и при мольном соотношении ДНК:РНК:Cpf1=1:3 гидролиз протекает на 100%.

Использованные источники информации

1. Zetsche B. и др. Cpf1 Is a Single RNA-Guided Endonuclease of a Class 2 CRISPR-Cas System // Cell. 2015. T. 163, №3. C. 759-771.

2. Shmakov S. и др. Discovery and Functional Characterization of Diverse Class 2 CRISPR-Cas Systems // Mol. Cell. NIH Public Access, 2015. T. 60, №3. C. 385-397.

--->

ПРИЛОЖЕНИЕ 1

<120> Штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysS/pET15b-HisCpf1 – продуцент

РНК-направляемой эндонуклеазы CRISPR/Cpf1

<160> 5

<210> 1

<211> 40

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 1

Cgcgcggcagccatatgttatttcaagagtttacccattt 40

<210> 2

<211> 35

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 2

Gttagcagccggatcttagcggttttgagcgaagt 35

<210> 3

<211> 43

<212> RNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 3

Aaauuucuacuguuuguagaucucacauguucuuuccugcguu 43

<210> 4

<211> 43

<212> DNA

<213> Искусственная последовательность

<400> 4

atgttatttc aagagtttac ccatttatat cccctatcaa aaaccgtgcg ttttgaatta 60

aagcccattg gcaagacatt agagcatatc catgccaaaa actttttgag ccaagatgag 120

accatggcgg acatgtacca aaaggtgaag gcgatgttgg acgattatca tcgtgatttt 180

atcgctgata tgatgggcga agttaagcta actaagctgg cagaatttta tgatgtgtat 240

ttaaaattta gaaaaaatcc caaagacgat ggattgcaaa aacagctaaa ggacttgcaa 300

gcagttttaa gaaaagagat tgtgaagccc atcggtaatg gcggaaaata caaggcgggt 360

tatgaccgct tgtttggggc aaagctcttt aaggacggca agaagcttgg tgatttggcg 420

aaatttgtca tcgcccaaga gggcgactca tcacccaagc ttgctcacct tgcccatttt 480

gagaagttta gcacttactt tactggcttt catgacaacc gcaaaaacat gtacagcgat 540

gaggataaac acacctccat tgcctatcgt ctgattcatg aaaacttacc acgctttatt 600

gacaacctac aaatactgac aaccatcaaa caaaagcact cggcgttgta tgaccagatt 660

ataaatgagc tgactgcgag tggcttggat gtgtcgctgg caagtcatct ggacggctat 720

cacaagcttt taacccaaga gggtatcacg gcttataata ccctgcttgg cggtatcagt 780

ggcgaggcag gttctcgcaa gataaaaggt atcaatgagc ttatcaatag tcatcacaac 840

caacattgcc acaaatccga acgtatcgcc aaattacgcc ccctgcacaa acaaatccta 900

agcgacggca tgggtgtgtc atttttgcca agcaaatttg ctgatgacag cgaagtttgt 960

caagcggtca atgaatttta ccgccattat gctgatgttt ttgccaaggt gcaaagctta 1020

tttgatgggt ttgatgacta tcaaaaggac ggcatttatg ttgagcataa aaatttaaat 1080

gaactatcca agcaggcatt tggtgatttt gccttgttgg gtcgggtgtt agacggctat 1140

tatgtggatg tggtgagtcc agagtttaat gagagatttg ccaaagccaa aaccgacaat 1200

gccaaagaaa aactaacaaa agaaaaagac aaattcatca aaggcgtgca ttccttggca 1260

agccttgagc aggcgataga gcattatact gctaggcatg atgatgagtc tgtgcaggcg 1320

ggcaaacttg gacagtattt caaacacggt ctggcaggcg tggacaatcc aatccaaaaa 1380

atacacaaca accacagcac cattaagggt tttttggagc gtgaacgtcc agcaggcgag 1440

cgagcattgc ccaaaattca gttaggcaaa aaccctgaaa tcaggcaact aaaagagctg 1500

ctagacaaca ccctaaacgt ggtgcatttt gccaagttat taacgaccaa aaccacgcta 1560

gacaaccaag acggcaattt ttatggtgag tttggggcgt tgtatgatga gcttgccaag 1620

attcccacgc tttataacaa agtgcgtgat tatctgtcgc aaaagccatt tagcaccgaa 1680

aaatataaat taaactttgg caatccgaca ttattaaacg ggtgggattt gaataaagaa 1740

aaagataatt ttggggttat cttacaaaaa gacggttgtt attatttggc gttattagat 1800

aaagctcata aaaaagtatt tgataatgct ccaaatacag gcaaaaatat ttatcaaaaa 1860

atgatttata aattattgcc cggacctaat aaaatgctac ccaaagtatt ttttgccaag 1920

agtaatttgg attattataa cccttctgct gaactactgg ataaatatgc aaaaggcacg 1980

cacaaaaaag gcgataattt taatctaaaa gactgccatg cgttgattga tttttttaag 2040

gcgggtatta ataaacatcc agaatggcaa cattttggtt ttaaattttc gccaaccagt 2100

agctatcagg atttgagtga tttttataga gaagtcgaac cacaaggtta tcaagtaaaa 2160

tttgtggata tcaacgccga ttatattgac gagttggttg aacaaggtca gttgtattta 2220

ttccagattt ataataaaga tttctcgccc aaggctcacg gtaagcccaa tttgcatact 2280

ctgtatttta aggcgttgtt tagcgaagat aaccttgccg atccaattta taaattaaat 2340

ggcgaggcac agatatttta tcgtaaggca tctttggata tgaatgaaac caccattcat 2400

cgtgcaggcg aggtattaga aaataaaaat cctgataatc caaaaaagcg tcaatttgtc 2460

tatgacatca tcaaagataa acgctatacc caagataagt ttatgctaca tgtacctatt 2520

accatgaatt ttggtgtgca gggcatgacg attaaagaat ttaataaaaa agttaatgaa 2580

agcatacagc aatatgatga ggtgaatgtc ataggcatag accgtggaga gcgacatttg 2640

ctatatctga ccgtgattaa tagcaaaggc gaaatcttag aacagcgtag tctcaatgac 2700

atcatcacca catcggcaaa tggtacacaa atgaccacgc attatcataa aatactagac 2760

aagagagaaa tagaacgcct aaatgctcgt gtcggttggg gtgagattga gaccataaaa 2820

gagctaaaat cgggctatct aagccatgtg gtacatcaaa tcagccagct tatgcttaaa 2880

tataatgcca ttgtggtgtt agaggattta aattttgggt ttaaacgtgg tcgctttaag 2940

gtggaaaaac aaatttacca aaactttgaa aacgccttaa tcaaaaagct aaaccatttg 3000

gtattaaaag ataaggcaga tgatgagatt ggctcataca aaaatgccct gcaactgacc 3060

aataatttta ctgatctaaa aagcattggc aaacaaacag gctttttatt ctatgtgcct 3120

gcatggaata ccagtaaaat agaccctgaa acgggctttg tggatttgtt aaaaccacgt 3180

tatgaaaata tcgctcagtc gcaagcgttt tttggtaaat ttgataagat ttgttataac 3240

gcagataagg gttattttga atttcatatt gattatgcca aatttactga caaagccaaa 3300

aactctcgcc aaaaatggac gatttgctcg catggcgata aacgttatgt gtatgacaaa 3360

accgccaata aaaataaagg aacgacaaag ggtattaatg tcaatgatga attaaaatcg 3420

ctatttgctc gtcatcacat caatgaaaaa cagccaaatc tggtcatgga tatttgccaa 3480

aataacgata aagaatttca taaatcgctg atgtatctat taaagacatt gcttgcatta 3540

agatatagta acgccagtag cgatgaagat tttattttat cgcctgtggc aaatgatgag 3600

ggtgtgtttt ttaattcggc attggcggat gatacacagc cacaaaatgc ggacgccaat 3660

ggggcgtatc atatcgcatt aaagggctta tggctattaa atgaactaaa agacagcgat 3720

gatttgaata aagtcaaact tgccattgac aatcaaacat ggctaaactt cgctcaaaac 3780

cgctaa 3786

<210> 5

<211> 43

<212> PRT

<213> Искусственная последовательность

<400> 5

Met Leu Phe Gln Glu Phe Thr His Leu Tyr Pro Leu Ser Lys Thr Val

1 5 10 15

Arg Phe Glu Leu Lys Pro Ile Gly Lys Thr Leu Glu His Ile His Ala

20 25 30

Lys Asn Phe Leu Ser Gln Asp Glu Thr Met Ala Asp Met Tyr Gln Lys

35 40 45

Val Lys Ala Met Leu Asp Asp Tyr His Arg Asp Phe Ile Ala Asp Met

50 55 60

Met Gly Glu Val Lys Leu Thr Lys Leu Ala Glu Phe Tyr Asp Val Tyr

65 70 75 80

Leu Lys Phe Arg Lys Asn Pro Lys Asp Asp Gly Leu Gln Lys Gln Leu

85 90 95

Lys Asp Leu Gln Ala Val Leu Arg Lys Glu Ile Val Lys Pro Ile Gly

100 105 110

Asn Gly Gly Lys Tyr Lys Ala Gly Tyr Asp Arg Leu Phe Gly Ala Lys

115 120 125

Leu Phe Lys Asp Gly Lys Lys Leu Gly Asp Leu Ala Lys Phe Val Ile

130 135 140

Ala Gln Glu Gly Asp Ser Ser Pro Lys Leu Ala His Leu Ala His Phe

145 150 155 160

Glu Lys Phe Ser Thr Tyr Phe Thr Gly Phe His Asp Asn Arg Lys Asn

165 170 175

Met Tyr Ser Asp Glu Asp Lys His Thr Ser Ile Ala Tyr Arg Leu Ile

180 185 190

His Glu Asn Leu Pro Arg Phe Ile Asp Asn Leu Gln Ile Leu Thr Thr

195 200 205

Ile Lys Gln Lys His Ser Ala Leu Tyr Asp Gln Ile Ile Asn Glu Leu

210 215 220

Thr Ala Ser Gly Leu Asp Val Ser Leu Ala Ser His Leu Asp Gly Tyr

225 230 235 240

His Lys Leu Leu Thr Gln Glu Gly Ile Thr Ala Tyr Asn Thr Leu Leu

245 250 255

Gly Gly Ile Ser Gly Glu Ala Gly Ser Arg Lys Ile Lys Gly Ile Asn

260 265 270

Glu Leu Ile Asn Ser His His Asn Gln His Cys His Lys Ser Glu Arg

275 280 285

Ile Ala Lys Leu Arg Pro Leu His Lys Gln Ile Leu Ser Asp Gly Met

290 295 300

Gly Val Ser Phe Leu Pro Ser Lys Phe Ala Asp Asp Ser Glu Val Cys

305 310 315 320

Gln Ala Val Asn Glu Phe Tyr Arg His Tyr Ala Asp Val Phe Ala Lys

325 330 335

Val Gln Ser Leu Phe Asp Gly Phe Asp Asp Tyr Gln Lys Asp Gly Ile

340 345 350

Tyr Val Glu His Lys Asn Leu Asn Glu Leu Ser Lys Gln Ala Phe Gly

355 360 365

Asp Phe Ala Leu Leu Gly Arg Val Leu Asp Gly Tyr Tyr Val Asp Val

370 375 380

Val Ser Pro Glu Phe Asn Glu Arg Phe Ala Lys Ala Lys Thr Asp Asn

385 390 395 400

Ala Lys Glu Lys Leu Thr Lys Glu Lys Asp Lys Phe Ile Lys Gly Val

405 410 415

His Ser Leu Ala Ser Leu Glu Gln Ala Ile Glu His Tyr Thr Ala Arg

420 425 430

His Asp Asp Glu Ser Val Gln Ala Gly Lys Leu Gly Gln Tyr Phe Lys

435 440 445

His Gly Leu Ala Gly Val Asp Asn Pro Ile Gln Lys Ile His Asn Asn

450 455 460

His Ser Thr Ile Lys Gly Phe Leu Glu Arg Glu Arg Pro Ala Gly Glu

465 470 475 480

Arg Ala Leu Pro Lys Ile Gln Leu Gly Lys Asn Pro Glu Ile Arg Gln

485 490 495

Leu Lys Glu Leu Leu Asp Asn Thr Leu Asn Val Val His Phe Ala Lys

500 505 510

Leu Leu Thr Thr Lys Thr Thr Leu Asp Asn Gln Asp Gly Asn Phe Tyr

515 520 525

Gly Glu Phe Gly Ala Leu Tyr Asp Glu Leu Ala Lys Ile Pro Thr Leu

530 535 540

Tyr Asn Lys Val Arg Asp Tyr Leu Ser Gln Lys Pro Phe Ser Thr Glu

545 550 555 560

Lys Tyr Lys Leu Asn Phe Gly Asn Pro Thr Leu Leu Asn Gly Trp Asp

565 570 575

Leu Asn Lys Glu Lys Asp Asn Phe Gly Val Ile Leu Gln Lys Asp Gly

580 585 590

Cys Tyr Tyr Leu Ala Leu Leu Asp Lys Ala His Lys Lys Val Phe Asp

595 600 605

Asn Ala Pro Asn Thr Gly Lys Asn Ile Tyr Gln Lys Met Ile Tyr Lys

610 615 620

Leu Leu Pro Gly Pro Asn Lys Met Leu Pro Lys Val Phe Phe Ala Lys

625 630 635 640

Ser Asn Leu Asp Tyr Tyr Asn Pro Ser Ala Glu Leu Leu Asp Lys Tyr

645 650 655

Ala Lys Gly Thr His Lys Lys Gly Asp Asn Phe Asn Leu Lys Asp Cys

660 665 670

His Ala Leu Ile Asp Phe Phe Lys Ala Gly Ile Asn Lys His Pro Glu

675 680 685

Trp Gln His Phe Gly Phe Lys Phe Ser Pro Thr Ser Ser Tyr Gln Asp

690 695 700

Leu Ser Asp Phe Tyr Arg Glu Val Glu Pro Gln Gly Tyr Gln Val Lys

705 710 715 720

Phe Val Asp Ile Asn Ala Asp Tyr Ile Asp Glu Leu Val Glu Gln Gly

725 730 735

Gln Leu Tyr Leu Phe Gln Ile Tyr Asn Lys Asp Phe Ser Pro Lys Ala

740 745 750

His Gly Lys Pro Asn Leu His Thr Leu Tyr Phe Lys Ala Leu Phe Ser

755 760 765

Glu Asp Asn Leu Ala Asp Pro Ile Tyr Lys Leu Asn Gly Glu Ala Gln

770 775 780

Ile Phe Tyr Arg Lys Ala Ser Leu Asp Met Asn Glu Thr Thr Ile His

785 790 795 800

Arg Ala Gly Glu Val Leu Glu Asn Lys Asn Pro Asp Asn Pro Lys Lys

805 810 815

Arg Gln Phe Val Tyr Asp Ile Ile Lys Asp Lys Arg Tyr Thr Gln Asp

820 825 830

Lys Phe Met Leu His Val Pro Ile Thr Met Asn Phe Gly Val Gln Gly

835 840 845

Met Thr Ile Lys Glu Phe Asn Lys Lys Val Asn Glu Ser Ile Gln Gln

850 855 860

Tyr Asp Glu Val Asn Val Ile Gly Ile Asp Arg Gly Glu Arg His Leu

865 870 875 880

Leu Tyr Leu Thr Val Ile Asn Ser Lys Gly Glu Ile Leu Glu Gln Arg

885 890 895

Ser Leu Asn Asp Ile Ile Thr Thr Ser Ala Asn Gly Thr Gln Met Thr

900 905 910

Thr His Tyr His Lys Ile Leu Asp Lys Arg Glu Ile Glu Arg Leu Asn

915 920 925

Ala Arg Val Gly Trp Gly Glu Ile Glu Thr Ile Lys Glu Leu Lys Ser

930 935 940

Gly Tyr Leu Ser His Val Val His Gln Ile Ser Gln Leu Met Leu Lys

945 950 955 960

Tyr Asn Ala Ile Val Val Leu Glu Asp Leu Asn Phe Gly Phe Lys Arg

965 970 975

Gly Arg Phe Lys Val Glu Lys Gln Ile Tyr Gln Asn Phe Glu Asn Ala

980 985 990

Leu Ile Lys Lys Leu Asn His Leu Val Leu Lys Asp Lys Ala Asp Asp

995 1000 1005

Glu Ile Gly Ser Tyr Lys Asn Ala Leu Gln Leu Thr Asn Asn Phe Thr

1010 1015 1020

Asp Leu Lys Ser Ile Gly Lys Gln Thr Gly Phe Leu Phe Tyr Val Pro

1025 1030 1035 1040

Ala Trp Asn Thr Ser Lys Ile Asp Pro Glu Thr Gly Phe Val Asp Leu

1045 1050 1055

Leu Lys Pro Arg Tyr Glu Asn Ile Ala Gln Ser Gln Ala Phe Phe Gly

1060 1065 1070

Lys Phe Asp Lys Ile Cys Tyr Asn Ala Asp Lys Gly Tyr Phe Glu Phe

1075 1080 1085

His Ile Asp Tyr Ala Lys Phe Thr Asp Lys Ala Lys Asn Ser Arg Gln

1090 1095 1100

Lys Trp Thr Ile Cys Ser His Gly Asp Lys Arg Tyr Val Tyr Asp Lys

1105 1110 1115 1120

Thr Ala Asn Lys Asn Lys Gly Thr Thr Lys Gly Ile Asn Val Asn Asp

1125 1130 1135

Glu Leu Lys Ser Leu Phe Ala Arg His His Ile Asn Glu Lys Gln Pro

1140 1145 1150

Asn Leu Val Met Asp Ile Cys Gln Asn Asn Asp Lys Glu Phe His Lys

1155 1160 1165

Ser Leu Met Tyr Leu Leu Lys Thr Leu Leu Ala Leu Arg Tyr Ser Asn

1170 1175 1180

Ala Ser Ser Asp Glu Asp Phe Ile Leu Ser Pro Val Ala Asn Asp Glu

1185 1190 1195 1200

Gly Val Phe Phe Asn Ser Ala Leu Ala Asp Asp Thr Gln Pro Gln Asn

1205 1210 1215

Ala Asp Ala Asn Gly Ala Tyr His Ile Ala Leu Lys Gly Leu Trp Leu

1220 1225 1230

Leu Asn Glu Leu Lys Asp Ser Asp Asp Leu Asn Lys Val Lys Leu Ala

1235 1240 1245

Ile Asp Asn Gln Thr Trp Leu Asn Phe Ala Gln Asn Arg

1250 1255 1260

<---

Изобретение относится к штамму Escherichia coli, продуцирующему рнк-направляемую эндонуклеазу CRISPR/CPF1. Предложен штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysS/pET15b-HisCpf1, продуцирующий рнк-направляемую эндонуклеазу CRISPR/CPF1 и полученный путем трансформации клеток Escherichia coli штамма BL21(DE3)pLysS рекомбинантной плазмидной ДНК рЕТ15b-HisCpf1, сконструированной на основе вектора pET15b, несущего ген рекомбинантного белка Cpf1 длиной 1281 аминокислотных остатков, состоящего из нуклеазы из бактериального штамма Moraxella bovis (1261 аминокислота) и вспомогательной последовательности длиной в 20 аминокислот, включающей в себя гистидиновую метку и сайт гидролиза для тромбина. Изобретение обеспечивает высокоэффективную продукцию активного рекомбинатного фермента Cpf1. 4 ил., 3 пр.

Штамм Escherichia coli BL21(DE3)pLysS/pET15b-HisCpf1 - продуцент рнк-направляемой эндонуклеазы CRISPR/CPF1, полученный путем трансформации клеток Escherichia coli штамма BL21(DE3)pLysS рекомбинантной плазмидной ДНК рЕТ15b-HisCpf1, сконструированной на основе вектора pET15b, несущего ген рекомбинантного белка Cpf1 длиной 1281 аминокислотных остатков, состоящего из нуклеазы из бактериального штамма Moraxella bovis (1261 аминокислота) и вспомогательной последовательности длиной в 20 аминокислот, включающей в себя гистидиновую метку и сайт гидролиза для тромбина.