ПРИМЕНЕНИЕ S1P Российский патент 2009 года по МПК A61K31/661 G01N33/50 A61P29/02 

Изобретение относится к применению S1P (сфингозин-1-фосфата). Другие аспекты изобретения относятся к способу скрининга лекарственных средств и к способам лечения боли.

Боль представляет собой сложное субъективное ощущение, отражающее реальное или возможное повреждение тканей и эмоциональный ответ на него. Острая боль представляет собой физиологический сигнал, означающий возможное или реальное повреждение. Хроническая боль может быть либо соматогенной (органической), либо психогенной. Хронической боли часто сопутствуют или за ней следуют вегетативные признаки, которые часто приводят к депрессии.

Соматогенная боль может быть ноцицептивного, воспалительного или невропатического происхождения. Полагают, что ноцицептивная боль связана с непрерывной активацией соматических или висцеральных болевых чувствительных нервных волокон. Невропатическая боль возникает вследствие дисфункции нервной системы; полагают, что ей способствуют аберрантные соматосенсорные процессы периферической нервной системы, ЦНС или их обоих. (Для обзора механизмов боли см., например, Scholz and Woolf, 2002; Julius and Basbaum, 2001, Woolf and Mannion, 1999; Wood, J.D., 2000; Woolf and Salter, 2000.)

Хроническая боль приводит к страданию человека и к огромным социально-экономическим затратам. Существующие способы лечения боли крайне неудовлетворительны как в отношении эффективности, так и в отношении безопасности.

В настоящее время для лечения боли, как правило, применяют два класса анальгетиков: неопиоидные анальгетики, главным образом ацетаминофен и НПВЛС (нестероидные противовоспалительные лекарственные средства), и агонисты опиоидов (наркотики) (где "опиоид" является общим термином для природных или синтетических веществ, связывающихся со специфическими опиоидными рецепторами в ЦНС, оказывая действие в качестве агониста). К сожалению, оба класса анальгетиков, и опиоидные, и неопиоидные, обладают некоторыми нежелательными побочными эффектами. Наиболее серьезными побочными эффектами опиоидов являются возможность угнетения дыхательной системы и возникновение зависимости после длительного их приема (Schaible H.G., Vanegas H., 2000). С другой стороны, НПВЛС, большой класс не являющихся опиоидами анальгетиков, может вызывать множество осложнений желудочно-кишечного тракта, такие как язвы и кровотечение, а также оказывать отрицательное воздействие на почки (Schaible H.G., Vanegas H., 2000). Было установлено, что в США вследствие вызываемых общепринятыми НПВЛС тяжелых желудочно-кишечных осложнений ежегодно умирает приблизительно 16000 пациентов.

Ввиду серьезных недостатков методов лечения боли, известных в данной области, существует необходимость в новых классах модулирующих боль лекарственных средств. Особенно, ввиду огромного разрыва между быстрым продвижением в понимании нейробиологии боли и неудовлетворенной клинической потребностью в эффективных способах лечения без побочных эффектов в данной области, необходимы усилия, направленные на поиск новых объектов исследования для создания новых классов анальгетиков. Таким образом, целью настоящего изобретения является получение новых средств для разработки и получения нового класса модулирующих боль лекарственных средств.

Эта цель достигается благодаря применению S1P или его функциональных фрагментов или производных для получения модулирующих боль фармацевтических соединений.

Изобретение основано на открытиях авторов изобретения, впервые продемонстрировавших, что S1P участвует в ноцицептивных процессах и способен снижать боль. Термин функциональный в отношении S1P или термин функция S1P относится к способности S1P взаимодействовать по меньшей мере с одним из его рецепторов и, предпочтительно, активировать рецептор, или к способности S1P уменьшать внутриклеточные уровни цАМФ, или к способности S1P опосредовать перенос PAM (ассоциированный с Myc белок) из эндоплазматического ретикулума к клеточной мембране; более конкретно, он относится к его способности усиливать активность PAM (т.е. к способности PAM взаимодействовать с AC, и/или уменьшать активность AC, и/или уменьшать боль) и/или к его способности ингибировать активность AC и, еще более предпочтительно, к его способности снижать боль. Термин функциональный в отношении рецепторов S1P или термин функция рецептора S1P относится к способности рецепторов S1P взаимодействовать с S1P, более конкретно, к их способности опосредовать характерный для рецептора сигнал, инициируемый взаимодействием с S1P, и более конкретно, к их способности воздействовать на болевой процесс, инициируемый взаимодействием с S1P.

Фрагмент S1P может быть любым фрагментом, меньшим, чем исходная молекула, в соответствии с фиг.15. Фрагмент PAM может быть любым полипептидным или полинуклеотидным фрагментом, являющимся более коротким, чем соответствующая исходная молекула. Фрагмент рецептора S1P может представлять собой любой полипептидный или полинуклеотидный фрагмент, который короче, чем соответствующая исходная молекула.

Производное S1P или фрагмент S1P может иметь любую модификацию молекулы с функцией S1P или модификацию любого другого типа, такую как химическая или биологическая модификация, например, приводящая к стабилизации молекулы или изменяющая ее специфическую направленность, например, на определенные клетки или облегчающая ее проникновение в клетки или ее захват клеткой; одна из известных модификаций представляет собой гидроксилирование или метилирование S1P. Пригодными являются подходящие модификации или дополнения для обеспечения или облегчения ее направления к необходимому участку и ее вхождения в клетку. С другой стороны, для обеспечения ее направления к спинному мозгу возможно локальное применение, такое как интраспинальное применение с применением подходящих катетеров и тому подобное. Другие пригодные дополнения включают в себя соли (для физиологически переносимых или неорганических солей см., например, Remington's Pharmaceutical Sciences, p. 1418, 1985), буферы или тому подобное для ее стабилизации и тому подобное.

Так как S1P эндоцитируется в клетки посредством специфических рецепторов, то его можно применять наружно, и он затем специфически эндоцитируется. Модулирование направленности S1P можно достичь посредством клонирования и экспрессии рецепторов S1P в желаемых клетках. Клеточную типоспецифическую экспрессию можно обеспечить с применением подходящих промоторов/энхансеров генов, известных в данной области.

Настоящее изобретение основано на исследованиях авторов, впервые продемонстрировавших, что S1P участвует в механизмах повышения чувствительности в спинном мозге и ганглиях задних корешков (DRG).

S1P (сфингозин-1-фосфат) представляет собой фосфорилированное производное сфингозина, структурную основу всех сфинголипидов. Известно, что этот внеклеточный (образующийся в сыворотке) сфинголипид регулирует множество клеточных процессов посредством связывания с одним из пяти специфических сопряженных с G-белками рецепторов (GPCR), обозначенных от S1P₁ до S1P₅, которые по-разному экспрессированы в различных тканях, где каждый регулирует специфические виды клеточной деятельности (для обзора см., например, Payne et al., 2002; и Spiegel and Milstien, 2000). Известные функции внеклеточного S1P включают в себя, например, регуляцию клеточной миграции, продолжительность жизни клеток или ангиогенез. Кроме его внеклеточного действия, также известно, что он действует как внутриклеточный мессенджер (для обзора см., например, Payne et al., 2002; и Spiegel and Milstien, 2000). Однако до сих пор его вовлеченность в ноцицептивные процессы являлась неизвестной.

PAM (ассоциированный с Myc белок) представляет собой гигантский белок с массой 510 кДа. Белковая, геномная и кодирующая полинуклеотидные последовательности PAM известны в данной области и общедоступны, например, в базе данных NCBI (National Centre for Biotechnology Information; National Library of Medicine, Building 38A, Bethesda, MD 20894, USA; www.ncbi.nhm.nih.gov) под инвентарными номерами AAC39928 (кодирующая последовательность; SEQ ID NO:1), AF075587 (белковая последовательность; SEQ ID NO:2). Человеческий PAM расположен на хромосоме 13q22; его геномная последовательность общедоступна под номером NT_024524.11 (Старт: положение 24679861; Стоп: положение 24962245; SEQ ID NO:3). Альтернативно, белковая и кодирующая последовательности общедоступны под инвентарными номерами для белка KIAA0916 NP_055872 (белковая последовательность) и NM_015057 (кодирующая последовательность).

Для крысиного PAM общедоступны следующие кодирующие последовательности из EST-клонов:

AW921303 (соответствует 960-1394 п.н. кДНК человека; SEQ ID NO:4);

AW918711 (соответствует 8188-8632 п.н. кДНК человека; SEQ ID NO:5);

BQ201485 (соответствует 8966-9633 п.н. кДНК человека; SEQ ID NO:6);

BE112881 (соответствует 10311-10830 п.н. кДНК человека; SEQ ID NO:7);

AW441131 (соответствует 13569-14152 п.н. кДНК человека; SEQ ID NO:8);

BF409872 (соответствует 13569-14807 п.н. кДНК человека; SEQ ID NO:9).

Исходно PAM идентифицировали по его способности специфически взаимодействовать с активирующим транскрипцию доменом на N-конце Myc (Guo Q. et al., 1998). Недавно PAM описан как мощный ингибитор активности AC (Scholich K., Pierre S., Patel T.B.: Protein associated with myc (PAM) is a potent inhibitor of adenylyl cyclase. J. Biol. Chem. 2001, Dec 14;276(50):47583-9.), но до настоящего времени доказательств его функционирования в обработке ноцицептивных сигналов и повышения ноцицептивной чувствительности не существовало.

Предпочтительнее полагают, что PAM играет роль в регуляции пресинаптического роста: известно, что мРНК PAM высоко экспрессирована в специфических анатомических областях, включающих в себя гиппокамп, зубчатую извилину и мозжечок. Экспрессия и PAM, и Myc в головном мозге взрослых крыс и мышей ограничена зрелыми клетками Пуркинье в мозжечке и зернистыми и пирамидальными клетками в гиппокампе (Ruppert C., et al., 1986; Yang H. et al., 2002). Однако ни для одного из этих типов клеток не известно, что он вовлечен в обработку болевых ощущений и повышение болевой чувствительности.

Показано, что гомологи PAM у Drosophila (highwire) и C. elegans (rpm-1) играют ключевую роль в организации пресинаптических окончаний (Zhen et al., 2000), регуляции синаптического роста (Wan et al., 2000), формировании синапсов и росте и направлении аксонов (Schaefer et al., 2000). Данные открытия привели к предположению, что highwire, rpm-1 и их гомолог у млекопитающих PAM могут действовать как негативные регуляторы синаптического роста (Chang et al., 2000; Jin Y., 2002). Таким образом, в мозжечке, гиппокампе и зубчатой извилине в течение основного периода формирования синапсов в этих структурах выявили значительное увеличение экспрессии PAM (Yang et al., 2002).

В течение развития головного мозга у грызунов экспрессия PAM запускается вскоре после рождения, повышается в течение первых двух недель, а затем экспрессия PAM остается повышенной в течение взрослого периода (Yang et al., 2002). До настоящего времени об экспрессии и регуляции PAM в спинном мозге и DRG и его функции в механизмах повышения чувствительности и регуляции боли ничего не было известно.

Ранее показано, что человеческий PAM представляет собой мощный регулятор путей передачи сигнала циклического АМФ (цАМФ) и ингибирует ферментативную активность некоторых изоформ аденилатциклазы (AC; E.C.4.6.1.1) при наномолярных концентрациях (Scholich et al., 2001).

Повсеместно присутствующая система вторичного мессенджера циклического АМФ (цАМФ) представляет собой один из различных механизмов передачи сигнала, преобразующих внеклеточные стимулы во внутриклеточные сигналы и ответы. При внеклеточной стимуляции сопряженные с G-белками рецепторы (GPCR) модулируют связанные с плазматической мембраной ферменты или ионные каналы посредством связанных с ГТФ тримерных регуляторных белков (G-белков). Один из ферментов, активность которого регулируют GPCR, представляет собой аденилатциклазу (AC), образующий цАМФ фермент. Таким образом, поступающие внеклеточные стимулы воздействуют на внутриклеточную концентрацию внутриклеточного медиатора, циклического АМФ. Повышение уровней цАМФ воздействует на клетку посредством стимуляции протеинкиназы A (PKA), фосфорилирующей специфические внутриклеточные белки-мишени и, таким образом, изменяющей их активность.

Каждый тип клеток обладает характерным набором GPCR, модулируемых данными GPCR ферментов, специфических подклассов аденилатциклазы (AC) и белков-мишеней, которые, действуя совместно с более неспецифическими или часто встречающимися партнерами (такими как повсеместно присутствующий цАМФ), позволяют каждой клетке производить ее собственный характерный ответ на поступающие внеклеточные сигналы. Например, известно, что вторичный мессенджер циклический АМФ (цАМФ) играет главную роль в синаптической пластичности (Bailey et al., 1996; Xia et al., 1997; Brandon et al., 1997); с другой стороны, он вовлечен в метаболические процессы и клеточную пролиферацию. Таким образом, роль повсеместно распространенной системы мессенджера цАМФ и ее различных компонентов варьируется в зависимости от различных видов специализации различных типов тканей и клеток.

В настоящее время в данной области известны 5 различных действующих на рецепторы S1P GPCR, обозначенных от S1P₁ до S1P₅ (для обзора см., например, Spiegel, S. and Milstien, S., 2000). Белковая и кодирующая полинуклеотидная последовательности различных рецепторов S1P известны в данной области и общедоступны, например, в базе данных NCBI (National Centre for Biotechnology Information; National Library of Medicine, Building 38A, Bethesda, MD 20894, USA; www.ncbi.nhm.nih.gov) под инвентарными номерами: NM_001400 (SEQ ID NO:32; нуклеотидная последовательность мРНК рецептора дифференцировки эндотелия человека, сопряженного с G-белками рецептора сфинголипидов 1 (EDG1/S1P₁); NP_001391 (SEQ ID NO:31, белковая последовательность рецептора дифференцировки эндотелия человека, сопряженного с G-белками рецептора сфинголипидов

1 (EDG1/S1P₁); NM:_004230 (SEQ ID NO:34, нуклеотидная последовательность мРНК рецептора дифференцировки эндотелия человека, сопряженного с G-белками рецептора сфинголипидов 5 (EDG5/S1P₂); NP_004221 (SEQ ID NO:33, белковая последовательность рецептора дифференцировки эндотелия человека, сопряженного с G-белками рецептора сфинголипидов 5 (EDG5/S1P₂); NM_005226 (SEQ ID NO:36, нуклеотидная последовательность мРНК рецептора дифференцировки эндотелия человека, сопряженного с G-белками рецептора сфинголипидов 3 (EDG3/S1P₃); NP:005217 (SEQ ID NO:35, белковая последовательность рецептора дифференцировки эндотелия человека, сопряженного с G-белками рецептора сфинголипидов

3 (EDG3/S1P₃); NM:003775 (SEQ ID NO:38, нуклеотидная последовательность мРНК рецептора дифференцировки эндотелия человека, сопряженного с G-белками рецептора сфинголипидов 6 (EDG6/S1P₄); CAA04118 (SEQ ID NO:37, белковая последовательность рецептора дифференцировки эндотелия человека, сопряженного с G-белками рецептора 6 (EDG6/S1P₄); NM_030760 (SEQ ID NO:40, нуклеотидная последовательность мРНК рецептора дифференцировки эндотелия у человека, сопряженного с G-белками рецептора сфинголипидов 8 (EDG8/S1P₅); NP_110387 (SEQ ID NO:39, белковая последовательность рецептора дифференцировки эндотелия человека, сопряженного с G-белками рецептора сфинголипидов 8 (EDG8/S1P₅).

В другом аспекте изобретение относится к S1P или его функциональному фрагменту или производному для применения в качестве лекарственного средства, предпочтительно в качестве лекарственного средства для профилактики или лечения боли.

В дополнительном аспекте изобретение относится к применению S1P или его функциональных фрагментов или производных для модуляции боли. Данная модуляция предпочтительно представляет собой уменьшение, или профилактику, или полное подавление.

Кроме того, настоящее изобретение относится к применению S1P или его функциональных фрагментов или производных для идентификации соединений, модулирующих боль. Модулирующие соединения предпочтительно представляют собой соединения, обладающие активностью S1P, имитирующие или усиливающие ее. Наиболее предпочтительно, чтобы они обладали способностью предотвращать, уменьшать или прекращать боль.

Например, соединения можно идентифицировать по их способности

a) имитировать, восстанавливать, активировать или усиливать функцию S1P (т.е. его способность взаимодействовать по меньшей мере с одним из его рецепторов или их фрагментов и, предпочтительно, активировать рецептор или его способность уменьшать уровни внутриклеточного цАМФ или опосредовать перемещение PAM из эндоплазматического ретикулума к клеточной мембране; более предпочтительно это относится к его способности усиливать активность PAM и/или ингибировать активность AC, а даже более предпочтительно к его способности уменьшать боль) или функцию PAM (т.е. его способность уменьшать уровни внутриклеточного цАМФ, взаимодействовать с другими факторами, подобными AC, и особенно с AC, ингибировать AC или его способности уменьшать восприятие боли);

b) увеличивать сывороточный уровень S1P (например, посредством активации или усиления продукции S1P или посредством уменьшения его внеклеточного разрушения);

c) усиливать экспрессию, по меньшей мере, одного рецептора S1P (т.е. посредством активации его транскрипции, механизмов стабилизации продукта его транскрипции, трансляции или его посттрансляционного процессинга; посредством модуляции его посттрансляционной модификации или посредством активации механизмов его стабилизации или ингибирования его разрушения и тому подобное);

d) взаимодействовать с ферментами, ответственными за продукцию или разрушение S1P.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу профилактики или уменьшения боли, включающему в себя введение индивидууму достаточного количества S1P или его функционального фрагмента или производного.

Соответственно введение следует проводить способом, обеспечивающим направление S1P к участку действия (DRG или спинной мозг), например, посредством системного введения производных или препаратов S1P в кровоток (например, внутривенное или пероральное применение) или посредством местного (например, интраспинального) применения S1P, или его фрагментов, или производных.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к способу скрининга фармацевтических средств, пригодных для модуляции и/или профилактики боли, включающему в себя стадии:

a) получения образца, содержащего PAM или его функциональный фрагмент или производное и не содержащего S1P,

b) получения второго образца, содержащего PAM или его функциональный фрагмент или производное, а также содержащего S1P,

c) приведения в контакт с соединением, по меньшей мере, одного образца,

d) измерения активности PAM в образцах,

e) определения способности соединения имитировать действие S1P.

Способ может дополнительно включать в себя стадию, где клетки вместо соединения контактируют с S1P и где активность PAM в c) и d) выше сравнивают с активностью PAM в присутствии S1P.

Другой пример относится к способу, включающему в себя стадии:

a) получения двух образцов, содержащих клетки, экспрессирующие рецептор S1P или его функциональный фрагмент или производное,

b) приведения одного образца в контакт с соединением,

c) измерения активности рецептора в обоих образцах.

Способ по другому аспекту изобретения включает в себя стадии:

a) получения двух образцов, содержащих клетки, экспрессирующие рецептор S1P или его функциональный фрагмент или производное,

b) приведения образцов в контакт с S1P,

c) приведения одного образца в контакт с соединением,

d) измерения активности рецептора или взаимодействия S1P и рецептора в обоих образцах.

PAM или рецепторы S1P можно получать из любой доступной последовательности, удовлетворяющей их конкретному назначению по различным аспектам настоящего изобретения. Предпочтительно PAM или рецепторы S1P являются человеческими.

В различных аспектах настоящего изобретения также предпочтительно, если PAM или рецепторы S1P представляют собой выделенные полипептиды, или олиго-, или полинуклеотиды. Выделенные в контексте различных аспектов настоящего изобретения означают, по меньшей мере, частично очищенные из природного источника или рекомбинантные молекулы (которые, конечно, также могут являться очищенными или частично очищенными).

Анализ представляет собой аналитический способ любого типа для слежения за биологическим процессом. Для применения в скрининге лекарственных средств анализ должен являться воспроизводимым, а предпочтительно, также расширяемым и надежным. Анализ предпочтительно пригоден для высокопроизводительного скрининга химических соединений на их способность модулировать (предпочтительно уменьшать) и/или предотвращать боль. Высокопроизводительный скрининг, как правило, включает в себя скрининг приблизительно 500000 различных соединений на определенную способность. Например, тип анализа зависит от типа применяемой молекулы (или полипептид, или полинуклеотид) и "вывода", т.е. способа, которым определяют активность S1P, PAM или рецептора S1P (см. ниже).

Различные типы таких анализов, как правило, известны в данной области и коммерчески доступны у частных поставщиков. Пригодные виды анализа включают в себя радиоизотопный или флуоресцентный виды анализа, например, виды флуоресцентного поляризационного анализа (такие как виды анализа, предоставляемые на коммерческих условиях Panvera, Perkin-Elmer life sciences (например, LANCE) или Packard BioScience (например, HTRF или ALPHAscreen™)) для измерения взаимодействия меченого партнера с немеченым партнером (например, PAM или его фрагменты могут являться мечеными, а измерять можно их взаимодействие с AC).

Простые биохимические анализы пригодны, например, для определения взаимодействия между потенциальным фармацевтическим соединением и рецептором или функциональным фрагментом или производным рецептора. Определить, способно ли соединение активировать данный рецептор и, таким образом, имитировать активность S1P, также можно более сложными анализами.

Более многочисленные примеры включают в себя основанные на применении клеток анализы, где клеточная линия стабильно (индуцируемо или нет; с хромосомы или эписомы) или транзиторно экспрессирует интересующий рекомбинантный белок. Данные виды анализа включают в себя, например, анализ с репортерным геном, где регуляцию определенного промотора или пути передачи сигнала участника каскада передачи сигнала измеряют по активности репортерного фермента, экспрессия которого находится под контролем указанного определенного промотора. Для данного типа анализа конструируют рекомбинантную клеточную линию, содержащую репортерный ген под контролем определенного промотора, который необходимо исследовать самого или который регулируется исследуемым сигнальным каскадом. Пригодные репортерные ферменты, как правило, известны в данной области и включают в себя люциферазу светляка, люциферазу Renilla (например, коммерчески доступная в Packard reagents), β-галактозидазу. Пригодность клеточных линий зависит от цели анализа, но они, как правило, включают в себя клеточные линии, которые легко трансфицировать и легко культивировать, например, такие как HeLA, COS, CHO, NIH-3T3 и тому подобное.

Анализы для измерения внутриклеточного уровня ионов включают в себя, например, анализы с применением FLIPR (планшет-ридера флуориметрического получения изображения, коммерчески доступного в Molecular Devices), где источник свечения аргонового лазера объединяют с охлажденной CCD-камерой, обеспечивая параллельное измерение в 384-луночных планшетах кратковременных сигналов ионов (таких как Ca²⁺ и тому подобное) в клетках (например, в нервных клетках или других клетках (например, в клетках, рекомбинантно или естественным образом экспрессирующих определенные ионные каналы)). Например, анализы с применением FLIPR позволяют с применением определенных флуорохромов, таких как Fluo-3, Fluo-4, производить мониторинг внутриклеточного содержания кальция или, с применением наборов для анализа с применением специфичных для ф./р. BCECF или BCPCF FLIPR, производить мониторинг внутриклеточного pH, или с применением, например, наборов для анализа с применением DiBAC или специфичных FLIPR проводить мониторинг изменений мембранного потенциала, или проводить мониторинг поляризации мембраны. Для мониторинга других внутриклеточных ионов, например цинка или натрия, можно применять другие известные в данной области красители. Как правило, специалистам в данной области известны другие типы анализа и другие типы вывода данных.

Для измерения уровней цАМФ пригодны, например, AlphaScreen, поляризация флуоресценции или технология HTRF.

Для определения активности ионных каналов (контролирующей, например, внутриклеточные концентрации ионов и которую, таким образом, можно применять для измерения внутриклеточной концентрации ионов) можно применять, например, чувствительные к мембранному потенциалу анализы и красители, такие как DiBAC, или технологию с применением набора для анализа мембранного потенциала на FLIPR из Molecular Devices; измеряющий поляризацию митохондриальных мембран краситель JC-1 с применением технологии FLIPR; иончувствительные красители, такие как Fluo-3, Fluo-4 или набор для анализа кальция из Molecular Devices для измерения внутриклеточной концентрации кальция; чувствительные к натрию красители, например, из Molecular Probes для измерения внутриклеточного натрия; основанные на способе фиксации потенциала анализы или основанное на атомно-адсорбционной спектроскопии измерение выхода иона рубидия для определения внутриклеточных концентраций калия и тому подобное. Специалистам в данной области известны дополнительные автоматические устройства и аналитические способы для выявления определенных изменений и состояний в клетках, и они включают в себя, например, детектор Acumen (основанное на флуоресценции лазерное сканирующее считывающее устройство, позволяющее производить трехмерную реконструкцию распределения подходящим образом меченных объектов) из ACUMEN bioscience.

Для измерения активности GPCR пригодны, например, измерение цАМФ, например, посредством системы выявления цАМФ AlphaScreen™ из Packard Bioscience, анализы мобилизации Ca²⁺ или анализы с репортерным геном.

Полипептид PAM предпочтительно представляет собой полипептид, содержащий последовательность в соответствии с SEQ ID NO:2 или состоящий из нее, или кодируемый полинуклеотидом, содержащим последовательность в соответствии с SEQ ID NO:1 или 3 или состоящим из нее. Полипептиды рецепторов S1P предпочтительно представляют собой полипептиды, содержащие одну из соответствующих SEQ ID NO:31, 33, 35, 37 или 39 аминокислотных последовательностей или состоящие из нее или кодируемые полинуклеотидами, содержащими одну из соответствующих SEQ ID NO:32, 34, 36, 38 или 40 последовательностей или состоящими из нее, или кодируемые кодирующими последовательностями в рамках данных последовательностей мРНК.

Полинуклеотид PAM предпочтительно представляет собой полинуклеотид, содержащий последовательность в соответствии с SEQ ID NO:1 или 3 или состоящий из нее, или полинуклеотид, содержащий способную в жестких условиях гибридизоваться с указанными выше полинуклеотидами последовательность или состоящий из нее. Полинуклеотид рецепторов S1P предпочтительно представляют собой полинуклеотиды, содержащие последовательности в соответствии с SEQ ID NO:32, 34, 36, 38 или 40 или состоящие из них, полинуклеотиды, включающие в себя положения с 244 по 1392 SEQ ID NO:32, с 1 по 1137 SEQ ID NO:34, с 1 по 1062 SEQ ID NO:36, с 23 по 1177 SEQ ID NO:38 или с 10 по 1206 SEQ ID NO:40 или соответствующие им, или полинуклеотиды, содержащие способную в жестких условиях гибридизоваться с указанными выше полинуклеотидами последовательность или состоящие из нее.

Жесткие условия являются характерными условиями реакции, влияющими на специфичность гибридизации или отжига двух одноцепочечных молекул нуклеиновой кислоты. Жесткость и, таким образом, специфичность реакции, среди прочего, зависит от температуры и буферных условий, применяемых для реакции. Например, жесткость и, таким образом, специфичность можно увеличить посредством увеличения температуры реакции и/или снижения ионной силы реакционного буфера. Например, условия с низкой жесткостью (и, таким образом, с низкой реакционной или гибридизационной специфичностью) имеют место, если гибридизацию проводят при комнатной температуре в растворе 2×SSC. Условия с высокой жесткостью включают в себя, например, реакцию гибридизации при 68єC в растворе 0,1×SSC и 0,1% SDS.

Под гибридизацией в жестких условиях в пределах различных аспектов настоящего изобретения предпочтительно подразумевают:

1) Гибридизацию меченого зонда с образцом нуклеиновой кислоты для анализа при 65°C или, в случае олигонуклеотидных зондов, при температуре на 5°C ниже температуры отжига или плавления дуплекса, состоящего из олигонуклеотида и образца (температуры отжига и плавления далее подразумевают синонимами), в течение ночи в 50 мМ Tris pH 7,5, 1M NaCl, 1% SDS, 10% декстрансульфате, 0,5 мг/мл денатурированной ДНК спермы лосося или сельди.

2) Отмывку в течение 10 минут в 2×SSC при комнатной температуре.

3) Отмывку в течение 30 минут в 1×SSC/0,1% SDS при 65°C (или в случае олигонуклеотидов при температуре на 5°C ниже температуры отжига).

4) Отмывку в течение 30 минут в 0,1×SSC/0,1% SDS при 65°C (или в случае олигонуклеотидов при температуре на 5°C ниже температуры отжига).

Олигонуклеотиды для применения в качестве зондов для гибридизации представляют собой полинуклеотиды, а предпочтительно фрагменты ДНК, с длиной от 15 до 30, а предпочтительно 20, нуклеотидов. Температуру отжига определяют по формуле T_m=2 × (число A+T) + 4 × (число G+C)°C.

Для получения 2×SSC или 0,1×SSC (или любой другой степени разведения SSC) раствор, например, 20×SSC разбавляют соответствующим образом. 20×SSC состоит из 3 М NaCl/0,3 М цитрата Na×2H₂O.

Перед проведением реакции гибридизации полинуклеотиды, если желательно, после проведения электрофоретического разделения (в таком случае: "саузерн"-блот (ДНК) или "нозерн"-блот (РНК)) или без проведения электрофоретического разделения (в таком случае: слот- или дот-блот) переносят на подходящую мембрану, например нейлоновую или нитроцеллюлозную мембрану. Гибридизацию проводят с применением подходящим образом меченного зонда. Пригодные способы мечения представляют собой, например, радиоактивное мечение или мечение с применением флуоресцентных красителей. Зонд представляет собой одноцепочечный полирибо- или полидезоксирибонуклеотид, являющийся по природе одноцепочечным или, как правило, являющийся двухцепочечным, но сделанный одноцепочечным посредством денатурации. Данный зонд связывается с образцов ДНК или РНК (который также находится в одноцепочечном состоянии) посредством спаривания оснований.

Фрагменты PAM предпочтительно представляют собой фрагменты, содержащиеся в указанных выше последовательностях с ID NO:1, 2 или 3, а производные предпочтительно получают из указанных выше последовательностей с ID NO:1, 2 или 3 или из их фрагментов. Фрагменты рецепторов S1P предпочтительно представляют собой фрагменты, содержащиеся в указанных выше последовательностях с ID NO: от 31 до 40, более предпочтительно, фрагменты, содержащиеся в положениях с 244 по 1392 SEQ ID NO:32, с 1 по 1137 SEQ ID NO:34, с 1 по 1062 SEQ ID NO:36, с 23 по 1177 SEQ ID NO:38 или с 10 по 1206 SEQ ID NO:40 или состоящие из них, а производные предпочтительно получают из данных последовательностей.

Функциональные фрагменты или их производные предпочтительно способны ингибировать активность аденилатциклазы (AC), более предпочтительно, активность AC типа I, V или VI (в отношении рецепторов S1P, более предпочтительно, способную ингибировать активность AC при активации посредством связывания S1P или связывания имитирующей S1P молекулы).

В предпочтительном варианте осуществления различных аспектов настоящего изобретения функциональные фрагменты или производные PAM содержат или включают аминокислоты 400-1400, предпочтительно, 446-1062, 499-1065 или 1028-1231 и, более предпочтительно, 1000-1300, и еще более предпочтительно, 1000-1100, и наиболее предпочтительно, 1028-1065 последовательности человеческого PAM, предпочтительно, последовательности человеческого PAM, соответствующей SEQ ID NO:2, в том случае, если их кодируют соответствующие нуклеотидные фрагменты, особенно, если они входят в состав последовательностей SEQ ID NO:2 или 3.

Если функциональные фрагменты или их производные представляют собой полинуклеотиды, предпочтительно, если они содержат кодирующие указанные выше полипептидные фрагменты полинуклеотиды или состоят из них. Более конкретно, предпочтительно, если они содержат положения с 1482 по 3332 (кодирующие аминокислоты 446-1062), или с 1641 по 3341 (кодирующие аминокислоты 498-1066), или с 3228 по 3839 (кодирующие аминокислоты 1038-1231) cds человеческого PAM или состоят из них. Даже более предпочтительно, если cds человеческого PAM, из которой получены фрагменты, обладает последовательностью, соответствующей SEQ ID NO:2.

По одному из предпочтительных вариантов осуществления настоящего способа идентификации модулирующих боль соединений применяют клетки, экспрессирующие рецептор S1P и/или PAM, предпочтительно рекомбинантные рецептор S1P и/или PAM.

Клетки могут представлять собой клетки любого типа, например эукариотические или прокариотические одноклеточные организмы (такие как бактерии, например, E. coli или дрожжи, например, S. pombe или S. cerevisiae) или клеточные линии, полученные из многоклеточных организмов (такие как HeLa, COS, NIH-3T3, CHO и тому подобное), где предпочтительны клеточные линии млекопитающих.

По другому предпочтительному варианту осуществления применяют модифицированные клетки с уменьшенной по сравнению с ее немодифицированным состоянием активностью рецепторов S1P. Таким образом, можно тестировать способность химических соединений, тестируемых на способность модулировать (предпочтительно уменьшать) и/или предотвращать боль, увеличивать или восстанавливать сниженную или полностью нарушенную активность рецепторов S1P.

Модификация может представлять собой модификацию любого типа (стабильную или транзиторную, предпочтительно стабильную), ведущую к уменьшению активности рецептора S1P и/или активности PAM (т.е. их способности уменьшать уровни внеклеточного цАМФ, перемещение PAM, ингибировать AC или их способность снижать восприятие боли), стабильному уровню рецептора S1P или транскрипта PAM (т.е. посредством ингибирования транскрипции рецептора S1P или PAM или стабилизации транскрипта) или стабильному уровню белка рецептора S1P или PAM (т.е. посредством инактивации трансляции рецептора S1P или PAM или его посттрансляционного процессинга; посредством модуляции его посттрансляционной модификации или посредством инактивации его стабилизации или посредством увеличения его разрушения). Этого можно достигнуть, например, с применением доминантных негативных мутантов рецепторов S1P или PAM, антисмысловых нуклеотидов, конструкций RNAi, посредством образования функциональных или геномных нокаутов рецепторов S1P или PAM (которые, например, можно индуцировать) или посредством других пригодных способов, известных в данной области. Для обзора указанных выше способов см., например: Current protocols in Molecular biology (2000) J.G. Seidman, Chapter 23, Supplement 52, John Wiley and Sons, Inc.; Gene Targeting: a practical approach (1995), Editor: A.L. Joyner, IRL Press; Genetic Manipulation of Receptor Expression and Function, 2000; Antisense Therapeutics, 1996; Scherr et al., 2003.

По предпочтительному варианту осуществления применяют клетки с нокаутом PAM. Пригодные клеточные линии для получения нокаутов хорошо известны в данной области и описаны, например, в Current protocols in Molecular Biology (2000) J.G. Seidman, Chapter 23, Supplement 52, John Wiley and Sons, Inc., или Gene Targeting a practical approach. (1995) Ed. A.L. Joyner, IRL Press.

Активность S1P можно определять или непосредственно, например, по его способности (или способности его фрагментов или производных) взаимодействовать, по меньшей мере, с одним из его рецепторов или их функциональными фрагментами или инициировать перемещение PAM к клеточной мембране, или ее можно определять косвенно, например, по его способности (или способности его функциональных фрагментов или производных) уменьшать уровни внутриклеточного цАМФ, модулировать концентрации ионов в нейронах, ингибировать функционирование AC или его способности модулировать, особенно уменьшать, восприятие боли. Пригодные способы уменьшения указанных выше параметров хорошо известны в данной области (см. также выше): например, уровни цАМФ можно измерять посредством HTRF или ALPHAscreen™, концентрации ионов, например, можно рассчитывать посредством фиксации потенциала или пригодных красителей, восприятие боли можно измерять, например, посредством формалинового теста или тестов механической или термической гипералгезии или посредством теста горячей пластинки и тому подобное. Взаимодействие с его рецепторами можно определить, например, посредством измерения цАМФ, мобилизации Ca²⁺ или анализов с репортерным геном.

В другом аспекте изобретение относится к способу идентификации модулирующего боль соединения, включающему в себя

a) выбор соединения, модулирующего или имитирующего активность S1P, в качестве тестируемого соединения; и

b) введение указанного тестируемого соединения индивидууму для определения того, модулирует ли оно боль.

Индивидуум может представлять собой любого индивидуума, способного ощущать боль, предпочтительно млекопитающего, или не являющегося человеком, млекопитающего или человека (т.е. при изучении на пациентах).

Модуляция предпочтительно представляет собой профилактику, уменьшение или устранение боли. По одному из предпочтительных вариантов изобретения соединение представляет собой агонист рецептора S1P (для обзора см., например, Mandala et al., Science 2002), а более предпочтительно, FTY 720 (2-амино-2-(4-октилфенил)этил)пропан-1,3-диол, см. фиг. 17) или его функциональное производное или аналог (аналоги известны в данной области, см., например, Brinkmann et al., JBC, 2002) (т.е. производное или аналог с указанной выше способностью к модуляции боли), предпочтительно, фосфорилированное производное (см., Mandala et al., Science 2002). Также пригодны физиологически приемлемые соли соединения или их производные или аналоги.

В еще одном аспекте изобретения в объеме настоящей заявки рассматривают способ уменьшения или профилактики боли, включающий в себя введение достаточного количества фармацевтического соединения со способностью связываться и активировать, по меньшей мере, один из рецепторов S1P и/или способностью активировать функцию PAM у индивидуума. Один подходящий пример такого соединения представляет собой агонист рецептора S1P (для обзора см., например, Mandala et al., Science 2002), а более предпочтительно, FTY 720 или его функциональное производное или аналог, как определено выше, предпочтительно, фосфорилированное производное или фармацевтическую соль соединения или его функционального производного или аналога.

Далее изобретение проиллюстрировано более подробно посредством примеров и чертежей. Однако примеры не являются средством ограничения объема изобретения.

Примеры: исследование профиля экспрессии PAM и функции PAM и S1P

1. Материалы

S1P приобретали в Tocris (Ellisville, MO), антитело к Hsp70 и антитело к калнексину - в BD TransductionLabs (Bedford, MA). Антитело к активному ERK1/2 получали из Promega (Madison, WI). Токсин коклюша, U0126, U73122 и вортманнин - из Tocris (Ellisville, MO), RO31-223, BAPTA-AM и GF109203X - из Sigma (St. Louis, MO).

2. Получение животных срезов

Крыс Sprague Dawley дикого типа приобретали в Charles River Wiga GmbH (Sulzfeld, Германия). Животным до экспериментов предоставляли свободный доступ к пище и воде. Их содержали в помещениях с контролируемым климатом и светом (24±0,5°C). Каждое животное использовали только для одного эксперимента. Во всех экспериментах соблюдались этические рекомендации для исследователей в отношении находящихся в сознании животных, а процедуры одобрялись местным этическим комитетом. После умерщвления взрослых крыс фиксировали посредством перфузии 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатно-солевом буфере (PBS, pH 7,2) в течение одного часа. Ткани нарезали с применением криостата в горизонтальной плоскости с толщиной 14-16 мкм. Срезы закрепляли на Superfrost Plus Slides (Fisher Scientific Co., Pittsburgh, PA) и до применения хранили при -80°C.

3. Получение рибонуклеотидных зондов

Рибонуклеотидные зонды получали, как описано ранее (Yang et al., 2002). Антисмысловые и смысловые рибонуклеотидные зонды PAM крыс получали с применением полимераз T7 и T3, после линеаризации плазмиды Hind III (антисмысловой) и BamHI (смысловой) соответственно (см. Yang et al., 2002). В присутствии [³⁵S] УТФ-αS (ICN, Irvine CA), линеаризованной кДНК PAM, NTP, при 37°C в течение 1 часа проводили транскрипцию in vitro по рекомендациям производителя (Promega, Madison, WI). Транскрипты РНК очищали с применением набора RNA Probe Purification (Pequlab, Erlangen, Германия).

4. Гибридизация in situ

Гибридизацию in situ проводили, как описано ранее (Yang et al., 2002): срезы фиксировали в 4% параформальдегиде в 0,1 М фосфатно-солевом буфере (pH 7,2), предварительно обрабатывали 0,25% уксусным ангидридом и 0,1 M триэтаноламином, промывали 0,2×SSC и денатурировали последовательно увеличивающимися концентрациями этилового спирта. Срезы в течение 2 часов при комнатной температуре предгибридизовали в растворе для предгибридизации (50% деионизированный формамид, 0,6 М хлорид натрия, 10 мМ Tris-HCl (pH 7,6), 50 мМ ЭДТА, 0,025% пирофосфат натрия, 0,02% фиколл, 0,02% БСА, 0,02% поливинилпирролидон, 10 мМ DTT и денатурированные нагреванием гетерологичные нуклеиновые кислоты (0,005% дрожжевая тРНК, типа X, 0,05% тотальная дрожжевая РНК, типа I, 0,05% ДНК семенников лосося, типа III)); гибридизовали с рибонуклеотидными зондами в растворе для гибридизации (2,5×10⁶ имп./мин/срез), 50% деионизированном формамиде и 50% буфере для гибридизации, содержащем 0,6 М хлорид натрия, 10 мМ Tris-HCl (pH 7,6), 50 мМ ЭДТА, 0,025% пирофосфат натрия, 0,02% фиколл, 0,02% БСА, 0,02% поливинилпирролидон, денатурированные нагреванием гетерологичные нуклеиновые кислоты (0,005% дрожжевая тРНК, типа X, 0,005% тотальная дрожжевая РНК, типа I, 0,05% ДНК семенников лосося, типа III), 100 мМ DTT, 0,0005% полиадениловая кислота, 10% декстрансульфат) при 50°C в течение ночи. Срезы промывали 2×, 1×, 0,5×SSC при RT (комнатная температура). После расщепления в 20 мкг/мл РНКазы A (Sigma, St. Louis, MO) срезы отмывали в 1× буфере РНКазы, 2×, 1×, 0,5×SSC при комнатной температуре и в 0,1×SSC в течение ночи при 45°C. Срезы обезвоживали последовательно увеличивающимися концентрациями этилового спирта, экспонируя на пленку Kodak Biomax MR (Kodak, Rochester, NY) в течение 3-7 суток при -80°C.

5. Получение антител и иммунофлуоресцентное окрашивание

Антисыворотку коммерческим способом индуцировали у кроликов с применением пептидов, состоящих из аминокислотных остатков 135-153 и 4601-4614 человеческого PAM, в соответствии с SEQ ID NO:1 соответственно (BioTrend, Cologne, Германия). Антисыворотку коммерческим способом получали в BioTrend, Cologne, Германия, по стандартным процедурам. Для слежения за распределением PAM в срезах спинного мозга и DRG, срезы пропитывали 0,1% Triton X-100 в течение 5 минут. Срезы в течение 1 часа блокировали в 3% БСА в PBS, а затем инкубировали в течение 1 часа с антисывороткой к PAM (разведение 1:50). После этого в PBS, содержащем 3% БСА, проводили инкубацию с меченными FITC антителами козы к антителам кролика. Затем срезы отмывали PBS и размещали с применением fluoromount™.

6. ОТ-ПЦР

Тотальную РНК из спинного мозга и DRG крыс выделяли с применением экстракции с гуанидинизотиоцианатом/фенолом/хлороформом (Chomczynski and Sacchi 1987). 2 мкг тотальной РНК отжигали с 0,6 мМ каждого олиго-(dT)-праймера и в течение 30 минут при 37°C проводили обратную транскрипцию с применением обратной транскриптазы (Promega, Madison, WI). Затем кДНК сразу же применяли для амплификации. Олигонуклеотидные праймеры, применяемые для амплификации крысиного GADPH, представляли собой 5'-GAAGGGTGGGGCCAAAAG-3' (смысловой; SEQ ID NO:10) и 5'-GGATGCAGGGATGATGTTCT-3' (антисмысловой; SEQ ID NO:11; Trajkovic et al., 2000). Олигонуклеотидные праймеры для амплификации изоформ AC выбирали, как опубликовано у Xu et al. (Xu et al., 2001). Праймеры для крысиного PAM представляли собой 5'-GGTGGTGAAGCTCGCTGTGATGCT-3' (смысловой; SEQ ID NO:12) и 5'-CGTGTGAGCATTTCTGCACAC TCC-3' (антисмысловой; SEQ ID NO:13). Продукт ПЦР соответствует нуклеотидам 13692-14064 кДНК человеческого PAM. Соответствующие крысиные последовательности получали из EST-клона AW441131 (SEQ ID NO:8). Для полуколичественной ПЦР применяли ДНК-полимеразу SAWDAY DNA Polymerase (Peqlab, Erlangen, Германия). После начальной стадии денатурации при 95°C в течение 5 минут проводили 30 циклов по 1 минуте при 95°C, 30 секунд при 55°C и 10 секунд при 72°C с последующей конечной стадией удлинения при 72°C в течение 10 минут. Количественную ПЦР проводили с применением системы и реагентов TaqMan™ (Applied Biosystems, Weiterstadt, Германия) по инструкциям производителя.

7. Очистка полноразмерного PAM

Очистку PAM проводили, как описано ранее (Scholich et al., 2001), с некоторыми модификациями. В кратком изложении, клетки HeLa растили в среде DMEM с 10% эмбриональной телячьей сыворотки и 1% пенициллина/стрептомицина. Конфлюэнтные клетки из сорока 150-мм чашек собирали в 1×PBS, 1 мМ ЭДТА и в течение 5 минут осаждали при 400×g. Клетки ресуспендировали в буфере TED (50 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT), содержащем 125 мМ NaCl, 20 мкг/мл апротинина, 20 мкг/мл лейпептина, 1 мМ бензамидина, 5 мкг/мл соевого ингибитора трипсина, и лизировали 2×5 секунд обработки ультразвуком. Гомогенат центрифугировали при 27000×g в течение 30 мин при 4°C, а супернатант помещали в колонку XK16 с Q-Sepharose (Amersham, Pharmacia, Piscataway, NJ) и элюировали в TED в градиенте NaCl 150-350 мМ по инструкциям производителя. Фракции анализировали посредством "вестерн"-блоттинга по стандартным процедурам; положительные фракции объединяли, а концентрацию NaCl доводили до 1 М. Затем белок помещали в колонку XK16 с Phenyl-Sepharose (Amersham, Pharmacia, Piscataway, NJ) и отмывали в 300 мМ NaCl в TED по инструкциям производителя. Проточные и отмытые фракции содержали PAM. Их объединяли и буфер заменяли на указанный выше буфер TED, содержащий 100 мМ NaCl, с применением Centricon 50 (Amicon, Beverly, MA) по инструкциям производителя. Затем белок помещали на колонку FPLC Mono S 5/5 (Amersham, Pharmacia, Piscataway, NJ) и отмывали буфером для нанесения (100 мМ NaCl в TED) по инструкциям производителя. Проходящую фракцию собирали и наносили на колонку FPLC Mono Q 5/5 (Amersham, Pharmacia, Piscataway, NJ). Белок элюировали в градиента NaCl от 150 до 400 мМ в TED. Положительные фракции объединяли и заменяли буфер на 50 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 1 мМ DTT с применением Centricon 50 (Amicon, Beverly, MA) и хранили при -80°C. Хранящийся PAM использовали в течение 3 недель.

8. Экспрессия и очистка рекомбинантного Gsα

Помеченный гексагистидиновой меткой, конститутивно активный мутант Gsα (Gsα*) Q213L экспрессировали и очищали, как описано у Graziano et al., 1991. Для обеспечения максимальной активации Gsα* G-белок до применения в анализах активности AC в течение 30 минут инкубировали с 1 мкМ GTPγS в присутствии MgCl₂ (25 мМ).

9. Анализы активности аденилатциклазы (анализы активности AC)

Образцы спинного мозга лизировали в 25 мМ Hepes, pH 7,4, 1 мМ ЭДТА, а клеточные мембраны получали, как описано у Kassis и Fishman. Аликвоты хранили при -80°C до использования. Анализы активности AC проводили в объеме 100 мкл в течение 15 мин при комнатной температуре в присутствии 100 мкМ MgCl₂, как описано ранее (Patel et al., 2002). Для стимуляции ферментативной активности AC в мембранах (10 мкг белка) применяли Gsα* (80 нМ) или форсколин (100 мкМ).

10. Спинальная доставка смысловых или антисмысловых олигонуклеотидов PAM

Крыс анестезировали кетамином (60 мг/кг в./б.) и мидазоламом (0,5-1 мг/кг в./б.). Над позвоночником от позвонка Th13 до L3 рассекали кожу. Мышечную ткань вокруг L2-3 удаляли. Остистый отросток L3 удаляли, а у L2 проводили ламинэктомию. Затем в перидуральное пространство вводили полиэтиленовые катетеры (ID 0,28 мм, OD 0,61 мм) так, чтобы наконечник катетера достигал Th9-10. Катетер фиксировали цианакрилатным клеем, выводили наружу в области шеи и зашивали кожу.

11. Инфузия олигонуклеотидов PAM

Последовательности олигодезоксинуклеотидов (ODN) выбирали из последовательности крысиного PAM, как изложено ниже. Смысловой: 5'-GACTGGTTTAGCAATGGC-3'(SEQ ID NO:14), антисмысловой: 5'-GCCATTGCTAAACCAGTC-3' (SEQ ID NO:15) и антисмысловой ODN, несущий три мутации (3M-as; мутации подчеркнуты): 5'-GCAATTGCTAAATCAGTA-3' (SEQ ID NO:16). Через трое суток после хирургического вмешательства крыс помещали в "свободно перемещающуюся систему" (CMA, Stockholm, Sweden) и в течение 100 часов с применением микроинфузионной помпы (CMA, Stockholm, Sweden) через катетер при скорости потока 0,05-0,1 мкл/мин проводили инфузию антисмысловых (n=5) или смысловых (n=5) олигонуклеотидов (2,5 мг/мл в искусственной цереброспинальной жидкости).

12. Формалиновый тест

В пределах 15 минут после прекращения инфузии проводили формалиновый тест. 50 мкл 5% раствора формальдегида подкожно (п/к) инъецировали на дорзальную поверхность одной задней лапы. В течение одноминутных интервалов, до 60 минуты, начиная сразу после инъекции формалина, подсчитывали подергивания. Подергивания 5 мин интервалов суммировали как среднее количество подергиваний в минуту. Для сравнения болевого поведения между группами сумму подергиваний в течение двух фаз периода одночасового наблюдения подвергали обработке посредством t-теста Стьюдента. Величину α принимали за 0,05.

В конце формалинового теста крыс умерщвляли, вырезали поясничную область спинного мозга и ганглии задних корешков (DRG), образец замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C до дальнейшего анализа. Для определения экспрессии PAM иммуногистохимически анализировали срезы спинного мозга с применением указанных выше антител к PAM.

13. Вызванное зимозаном воспаление

Для индукции воспаления 2,5 мг зимозана A (Sigma, St. Louis, MO), суспендированного в 30 мкл 0,03 М фосфатно-солевого буфера (PBS, pH 7,5), подкожно инъецировали в среднюю подошвенную область правой задней лапы. Известно, что такая внутриподошвенная инъекция зимозана является достоверной моделью термической и механической гипералгезии у крыс (Meller and Gebhart, 1997). Крыс через 24-96 часов после инъекции зимозана умерщвляли посредством сердечной пункции в условиях глубокой изофлурановой анестезии. Поясничную область спинного мозга и ганглии задних корешков (DRG) вырезали, образец замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C до дальнейшего анализа.

14. Иммунофлуоресцентное окрашивание

Для наблюдения за распределением PAM в клетках HeLa клетки растили на стеклянных покровных стеклах в DMEM c 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина (Gibco, Karlsruhe, Германия). Для визуализации перемещения PAM в HeLa клетки в течение ночи держали с недостатком сыворотки, а потом в течение 2 часов обрабатывали 10% сывороткой. Везде, где указано, клетки в течение 30 минут предварительно инкубировали с различными концентрациями ингибиторов. Клетки в течение 10 минут фиксировали в 4% параформальдегиде (Sigma, Taufkirchen, Германия) в PBS, а затем пропитывали в 0,1% Triton X-100 еще 5 минут. Покровные стекла в течение 1 часа блокировали в 3% БСА в PBS, а затем в течение часа инкубировали с антителами к PAM (разведение 1:50). Затем в содержащем 3% БСА PBS проводили инкубацию с меченными FITC антителами козы к антителам кролика. Далее клетки отмывали PBS и закрепляли. Для анализа применяли конфокальный (BioRad, Hercules, CA) и обычный флуоресцентные микроскопы (Nikon, Duesseldorf, Германия).

15. Накопление цАМФ

Образцы спинного мозга разрушали ультразвуком и центрифугировали при 18000×g в течение 20 мин при 4°C. Для измерений цАМФ применяли супернатант. Накопление цАМФ в клетках определяли с применением набора cAMP Detection (Assay Design Inc, Ann Arbor, MI) по инструкциями производителя.

16. Антисмысловые олигодезоксинуклеотиды

Последовательности олигодезоксинуклеотидов (ODN) выбирали, как опубликовано ранее (Scholich et al., 2001). Смысловой: 5'-CTGTTCATGCCGGTT-3', антисмысловой: 5'-AACCGGCATGAACAG-3' и антисмысловой ODN, несущий четыре мутации (3M-as; мутации подчеркнуты): 5'-AATCCGTATGAACAC-3'. Клетки HeLa помещали в 35-мм чашки (300000 клеток) и в течение 24 часов растили в среде DMEM (Gibco, Karlsruhe, Германия), содержащей 10% FBS и 1% пенициллина/стрептомицина. ODN (3 мкМ каждый) вводили в клетки посредством трансфекций с применением Tfx20 (Promega, Madison, WI) в 1 мл не содержащей сыворотки среде по инструкциям производителя. Двумя часами позже добавляли 1 мл DMEM (Gibco, Karlsruhe, Германия), содержащей 10% FBS. Затем клетки инкубировали 6 часов. Затем среду снова заменяли на среду DMEM без сыворотки (Gibco, Karlsruhe, Германия), с последующей инкубацией в течение 16 часов в среде DMEM без сыворотки (Gibco, Karlsruhe, Германия) перед обработкой 10% сывороткой или 500 М S1P. Затем клетки применяли для "вестерн"-блотов посредством добавления кипящего 1×буфера Лэммли или их собирали для анализа активности AC, как описано выше.

17. Очистка активирующего PAM сывороточного фактора

188 мл эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, Karlsruhe, Германия) доводили до конечной концентрации 0,3 М NaCl. Затем сыворотку помещали на колонку Phenyl-Sepharose 15/10 (Amersham, Pharmacia, Piscataway, NJ). После элюции с данной колонки, а также после элюции со всех следующих колонок проходящую фракцию и все элюированные фракции собирали и анализировали на их способность индуцировать перемещение PAM в клетках HeLa. Затем проходящую фракцию помещали на колонку Q-Sepharose 15/10 (Amersham, Pharmacia, Piscataway, NJ). Колонку отмывали 400 мМ NaCl в TE (50 мМ Tris/Cl pH 7,4, 0,5 мМ ЭДТА) и элюировали 1 М NaCl в TE. Элюат помещали на колонку для гель-фильтрации Superdex 200pg (Amersham, Pharmacia, Piscataway, NJ). Белок элюировали TE по инструкциями производителя, а фракции анализировали на их способность индуцировать перемещение PAM в клетках HeLa. Положительные фракции объединяли, помещали на колонку FPLC MonoQ 5/5 (Amersham, Pharmacia, Piscataway, NJ) и отмывали 400 мМ NaCl в TE. Белок отмывали в градиенте NaCl 400-1000 мМ в TED. Положительные фракции объединяли и помещали в колонку для гель-фильтрации Superdex 50pg (Amersham, Pharmacia, Piscataway, NJ) по инструкциям производителя. Белок элюировали TE по инструкциям производителя, а фракции анализировали на их способность индуцировать перемещение PAM в клетках HeLa. Положительные фракции объединяли и хранили при -80°C и использовали в течение срока в пределах 2 недель для масс-спектрометрии или биохимических анализов. S1P выявляли, применяя мечение фталевым диальдегидом, с последующим разделением ВЭЖХ, как описано у Caligan et al.

18. Результаты, демонстрирующие вовлеченность PAM в преобразование ноцицептивных сигналов

Указанные выше эксперименты авторов изобретения с применением ОТ-ПЦР, иммуногистохимии и гибридизации in situ впервые демонстрируют, что PAM экспрессируется в сенсорных нейронах спинного мозга, а также ганглиях задних корешков (DRG) взрослых крыс. Посредством ОТ-ПЦР мРНК PAM на тех же уровнях выявляли в спинном мозге и ганглиях задних корешков в течение развития (E14-взрослый). Как показано посредством "вестерн"-блота и ОТ-ПЦР, экспрессия PAM повышается через 24-48 часов после обработки крыс зимозаном.

Главные изоформы аденилатциклазы, экспрессируемые в спинном мозге и DRG, представляют собой AC типа 5 и 6 и AC типа 4 и 6 соответственно. Больших изменений в экспрессии изоформ AC в спинном мозге после обработки зимозаном не выявили. Следовательно, стимулированная Gαs активность AC в мембранах препаратов из спинного мозга и DRG ингибировалась PAM. Следовательно, выявлено, что обработка антисмысловыми, но не смысловыми, олигонуклеотидами к PAM увеличивает индуцированное формалином подергивание задних лап у взрослых крыс. Таким образом, накопление цАМФ в спинном мозге крыс, обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами к PAM, увеличено по сравнению с контрольными крысами.

Добавление к лизатам спинного мозга очищенного PAM приводило к ингибированию стимулированной Gαs активности AC в лизатах спинного мозга контрольных и обработанных зимозаном животных (фиг. 5b). Активность AC, стимулированная 30 нМ Gαs, снижалась на 50% в лизатах спинного мозга контрольных животных и на 70% в лизатах, полученных от обработанных зимозаном крыс, в течение 96 часов.

Для определения того, экспрессирован ли PAM в спинном мозге, вначале проводили гибридизацию in situ. Это приводило к выявлению четкого сигнала для мРНК PAM во всем объеме серого вещества, но не в белом веществе спинного мозга взрослых крыс (фиг. 1). Для более точного определения клеточной популяции экспрессирующей PAM в спинном мозге, а также в DRG, с применением пептидов, соответствующих аминокислотным остаткам 135-153 и 4601-4614 человеческого PAM, получали антитела против PAM. Иммуногистохимический анализ выявил, что PAM совместно локализуется с иммунореактивностью против NeuN, но не с иммунореактивностью против GFAP (фиг. 2a). Более конкретно, экспрессию PAM преимущественно выявляли в нейронах рога спинного мозга (фиг. 2a), тогда как не относящаяся к нейронам клеточная популяция демонстрировала очень слабую экспрессию PAM. Особенно высокую экспрессию PAM можно выявить в нейронах DRG (фиг. 2b). Здесь иммунореактивность против PAM располагалась в аксонах, а также в телах нейрональных клеток большого и малого диаметров (фиг. 2b). Вызывает интерес то, что PAM не выявили в ядрах клеток, что показано совместным окрашиванием антителом к гистонам (фиг. 2b). Как можно видеть в спинном мозге, экспрессию PAM не выявили в экспрессирующих GFAP клетках.

Так как экспрессия PAM в головном мозге в течение развития мышей и крыс регулируется различным образом (Yang et al., 2002), авторы настоящего изобретения также исследовали, изменяется ли в течение развития экспрессия мРНК PAM в спинном мозге и DRG крыс. С этой целью с применением количественного ОТ-ПЦР определяли экспрессию мРНК PAM. Выявили, что мРНК PAM высокоэкспрессирована в спинном мозге и DRG на поздних эмбриональных стадиях (E16) до момента вскоре после рождения (P0,5; фиг. 3). Представляет интерес то, что вскоре после рождения экспрессия уменьшалась до 30-40% от уровня эмбриональной экспрессии и затем оставалась постоянной на всем протяжении взрослого состояния (фиг. 3).

Затем проверяли, регулируется ли экспрессия PAM в спинном мозге ноцецептивной стимуляцией. Для этого проводили мониторинг экспрессии PAM в спинном мозге после инъекции зимозана и формалина в задние лапы взрослых крыс. Экспрессия мРНК PAM после обработки зимозаном после 24 и 48 часов повышалась приблизительно в два раза (фиг. 4a). Таким образом, через 24 часа после инъекции зимозана экспрессия PAM на уровне белка являлась повышенной и оставалась повышенной в течение 96 часов (фиг. 4b). Через 96 часов после инъекции зимозана экспрессия мРНК PAM снижалась. Данное уменьшение экспрессии мРНК PAM не отражалось на уровне белка (сравн. фиг. 4a и b). Особенно интересно то, что экспрессия мРНК PAM в спинном мозге крыс также повышалась через 1 час после инъекции формалина (фиг. 4c).

Так как известно, что PAM представляет собой мощный ингибитор аденилатциклаз типов 1, 5 и 6 (Scholich et al., 2001), исследовали способность PAM ингибировать активность AC в лизатах спинного мозга и DRG. В спинном мозге полуколичественным ОТ-ПЦР выявили две главных изоформы AC. Данные изоформы AC являлись изоформами типов 5 и 6 (фиг. 5a). Примечательно, что PAM ингибирует обе изоформы при наномолекулярных концентрациях (Scholich et al., 2001). Профиль экспрессии изоформ AC в спинном мозге через 24-96 часов после инъекции зимозана существенно не изменялся. Представляет интерес, что через 1 час после инъекции формалина выявляли сдвиг в экспрессии изоформ AC (фиг. 5a). Снижалась экспрессия мРНК AC типа 5 и повышалась экспрессия мРНК AC типов 3 и 9.

Как может быть показано указанными выше экспериментами, добавление очищенного PAM к лизатам спинного мозга приводило к ингибированию стимулированной Gαs активности AC в препаратах спинного мозга. Добавление 30 нМ PAM снижало стимулированную Gαs активность AC в лизатах спинного мозга контрольных животных на 49% (фиг. 5b). Стимулированная Gαs активность AC в полученных у крыс через 96 часов после инъекции зимозана лизатах спинного мозга демонстрировала большую чувствительность к ингибированию PAM по сравнению с необработанными животными (70% ингибирования при 30 нМ; фиг. 5b). Напротив, ингибирование активности AC посредством PAM в лизатах спинного мозга животных, обработанных в течение 1 часа формалином, снижалось в меньшей степени (25% ингибирования при 30 нМ; фиг. 5b).

В DRG преимущественно экспрессируемыми изоформами AC являются AC типов 4 и 6 (фиг. 5a). Стимулированная Gαs активность AC в лизатах DRG по сравнению с лизатами спинного мозга в присутствии 30 нМ PAM снижалась на 32% (фиг. 5b).

Для проверки возможной роли PAM в ноцицептивной передаче в спинном мозге животным перед проведением анализа с формалином посредством поясничных интратекальных катетеров проводили инфузию смысловых и антисмысловых олигонуклеотидов. Как выявляли с применением иммуногистохимии, экспрессия PAM в нейронах спинного мозга снижалась (фиг. 6a). Инфузия антисмысловых олигонуклеотидов PAM вызывала значительное увеличение ноцицептивного ответа после инъекции формалина по сравнению с обработкой смысловым олигонуклеотидом PAM (p=0,007; фиг. 6b и c). Гипералгезия у обработанных антисмысловым олигонуклеотидом PAM крыс сопровождалась увеличенной лизательной и кусательной деятельностью. Так как PAM представляет собой ингибитор активности AC (Scholich et al., 2001), у обработанных смысловыми и антисмысловыми ODN крыс определяли базальную, стимулированную Gαs и форсколином активность AC в лизатах спинного мозга. Эксперименты показали значительное увеличение (20,7%) базальной активности AC у обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами крыс (таблица 1). Напротив, значительных изменений в стимулированной Gαs и форсколином активности AC не выявили, что указывает на то, что общее количество AC при обработке посредством ODN не изменяется (таблица 1).

Указанные выше эксперименты показали, что PAM локализуется в телах и аксонах клеток нейронов спинного мозга и DRG (фиг. 2a,b). Только очень небольшое количество иммунореактивности выявляли в ядрах, позволяя предположить различные функции PAM в нейронах и линиях злокачественных клеток.

Повышение центральной чувствительности после длительной ноцицептивной стимуляции основывается на изменениях нейронов и синапсов в спинном мозге (Woolf and Costigan, 1999; Woolf and Salter, 2000; Ji and Woolf, 2001). Открытие авторов настоящего изобретения того, что PAM экспрессирован в чувствительных нейронах спинного мозга и DRG, привело к вновь сформированной гипотезе, что PAM может быть вовлечен в изменения синапсов в течение обработки ноцицептивных сигналов в спинном мозге. Указанные выше открытия того, что после ноцицептивных стимулов повышается экспрессия PAM (фиг. 4a), поддерживают данную гипотезу о том, что PAM может играть роль в изменениях синапсов в течение обработки ноцицептивных сигналов в спинном мозге.

Кроме того, неожиданное открытие авторов настоящего изобретения того, что PAM экспрессирован в чувствительных нейронах спинного мозга и DRG, привело к вопросу о том, способен ли PAM также ингибировать активность AC в спинном мозге и DRG.

Указанные выше эксперименты впервые показали, что PAM представляет собой мощный ингибитор стимулированной Gαs активности AC в препаратах спинного мозга (фиг. 5b). После добавления 30 нМ PAM активность AC уменьшалась на 50%. Для достижения сравнимого ингибирования с применением α-субъединицы ингибиторного G-белка, Gαi, необходимо применять 200-800 нМ Gαi (Wittpoth et al. 1999). Ингибирующее действие PAM являлось даже более строгим в препаратах спинного мозга животных, обработанных за 96 часов зимозаном (фиг. 5b), и его можно объяснить увеличенными количествами эндогенного PAM в спинном мозге после инъекции зимозана (фиг. 4a, b). Ингибирование стимулированной Gαs активности AC в препаратах спинного мозга обработанных формалином животных (25% ингибирования) являлось менее резко выраженным по сравнению с контролем или обработанными зимозаном животными (50% и 75% соответственно).

Примечательно, что у обработанных в течение 1 часа формалином животных наблюдали сдвиг экспрессии изоформ AC (фиг. 5a). Экспрессия AC типов 3 и 9 повышается, тогда как экспрессия AC типа 5 снижается. До настоящего времени неизвестно, является ли PAM ингибитором AC типов 3 и 9. Следовательно, данные изоформы могут не ингибироваться PAM, или тестируемые концентрации PAM являлись слишком низкими для достижения ингибирующего действия. Так как PAM представляет собой гигантский белок массой 510 кДа, технически невозможно тестировать концентрации PAM, большие, чем 30 нМ. Однако по кривой доза-ответ, показанной на фигуре 5b, более высокие концентрации PAM могут приводить к более сильному ингибированию стимулированной Gαs активности AC в тестируемых препаратах спинного мозга.

Представляет интерес, что PAM являлся менее эффективным ингибитором ферментативной активности AC в препаратах DRG, чем в препаратах спинного мозга. Различные эффективности ингибирования PAM в препаратах спинного мозга и DRG, вероятнее всего, являются следствием наблюдаемого различия экспрессии изоформ AC. Основные изоформы AC, экспрессируемые в спинном мозге, представляют собой типы 5 и 6, которых оба сильно ингибирует PAM (фиг. 5a; (Scholich et al., 2001)). В DRG доминантными изоформами AC являются AC типа 4 и 6 (фиг. 5a). Неизвестно, ингибирует ли PAM AC типа 4, то ли данная изоформа не ингибируется PAM, то ли, опять, тестируемые концентрации PAM являлись слишком низкими для достижения ингибирующего действия. Однако по кривой доза-эффект, показанной на фигуре 5b, кажется вероятным, что более высокие концентрации PAM могут приводить к более сильному ингибированию стимулированной Gαs активности AC в препаратах DRG.

Однако наиболее неожиданным явилось обнаружение факта, что активность PAM оказывает влияние на болевое поведение тестируемых животных. Это впервые было показано в экспериментах авторов настоящего изобретения, продемонстрировавших значительное увеличение базальной активности AC (таблица 1) и, что более важно, значительное увеличение ноцицептивного ответа после инъекции формалина при сравнении с обработкой смысловыми олигонуклеотидами PAM (фиг. 6b и c), когда экспрессия эндогенного PAM в спинном мозге уменьшалась введением животным антисмысловых олигонуклеотидов PAM (фиг. 6a).

19. Определение обезболивающего действия PAM

Приведенные выше доказательства обезболивающего действия PAM можно, например, подкрепить следующим гипотетическим экспериментом: обезболивающее действие PAM, например, формалиновой модели острой боли непосредственно может быть определено с помощью интратекального применения, например, пептида, соответствующего аминокислотным остаткам с 1028 по 1065. Данный пептид соответствует минимальной области, выявленной как способная опосредовать взаимодействия PAM-аденилатциклаза, что определено посредством дрожжевой двухгибридной системы и анализов активности AC. Пептид можно применять в сочетании с bioporter lipofection reagent (коммерчески доступный в Peqlab, Германия). Данный подход мог бы позволить пептиду проникать в ткань и имитировать действия физиологического PAM в отношении AC.

20. Результаты, демонстрирующие влияние S1P на передачу сигнала PAM

Для исследования экспрессии и локализации PAM в клетках HeLa применяли два антитела к PAM, направленные к пептидам, соответствующие аминокислотным остаткам 135-153 и 4601-4614 человеческого PAM. Сравнение иммуногистохимического окрашивания головного мозга крыс показало, что оба антитела распознают одинаковые области головного мозга, которые также демонстрируют экспрессию мРНК PAM (Yang et al., 2002). В клетках HeLa с недостатком сыворотки оба антитела показали совместную локализацию PAM с калнексином, маркером эндоплазматического ретикулума (фиг. 18a). После добавления к клеткам сыворотки наблюдали частичное перемещение PAM к плазматической мембране (фиг. 18b). PAM появлялся у мембраны через 20-30 минут после обработки сывороткой и начинал исчезать от мембраны через 1 час после инкубации с сывороткой. Наблюдаемое с применением антител клеточное распределение PAM в HeLa отличается от клеточного распределения, описанного Guo et al. Так как Guo et al. для получения антител применяли часть PAM, включающую в себя общие мотивы для ядерных белков, возможны перекрестные реакции данных антител с ядерными белками.

Так как PAM представляет собой мощный ингибитор ферментативной активности AC, далее исследовали, может ли перемещение PAM из ЭР к плазматической мембране приводить к ингибированию активности AC. Обработка сывороткой клеток HeLa уменьшала накопление цАМФ внутри клеток (фиг. 19a). Кроме того, обработка сывороткой уменьшала стимулированную Gαs и форсколином активность AC по сравнению с необработанными клетками (фиг. 19b) до 56,7% и 64,7% соответственно. Наблюдаемое снижение активности AC не происходило вследствие изменения экспрессии изоформ AC или вследствие увеличения экспрессии AC, так как изменений экспрессии мРНК изоформ AC не выявили (фиг. 19c). Для определения того, было ли снижение стимулированной активности AC опосредовано PAM, количество эндогенного PAM уменьшали, применяя антисмысловые олигонуклеотиды к PAM, как ранее описано у Scholich et al., 2001. Как показано на фиг. 19d, в клетках HeLa, обработанных антисмысловыми ODN, количество PAM, определенное посредством анализа "вестерн"-блот, по сравнению с клетками, обработанными смысловыми или мутантными антисмысловыми ODN, являлось уменьшенным. Повторное мечение тех же блотов антителами к Hsp70 показало, что загрузка белками являлась одинаковой (фиг. 19d). Однако обработка клеток HeLa антисмысловым ODN значимо уменьшала индуцированное сывороткой ингибирование стимулированной Gαs и форсколином активности AC (фиг. 19e). Существенно, что трансфекция клеток HeLa смысловыми или мутантными ODN не оказывала влияние на индуцированное сывороткой ингибирование стимулированной Gαs и форсколином активности AC (фиг. 19e). Эти данные позволяют предположить, что эндогенный PAM оказывает ингибирующее влияние на активность AC после стимуляции клеток HeLa сывороткой.

Для идентификации сывороточного фактора, индуцирующего перемещение PAM к клеточной мембране, фактор очищали с применением анионообменных гель-фильтрационных колонок с обратной фазой. После каждой стадии очистки фракции тестировали на их способность индуцировать перемещение PAM и ингибировать AC. Исходя из свойств очистки, сывороточный фактор можно идентифицировать как незначительно гидрофобный (элюция с колонки с фенил-сефарозой 0,3 М NaCl), обладающий сильным отрицательным зарядом (элюция с колонок MonoQ и Q-Sepharose 0,7 M NaCl) и обладающий расчетной молекулярной массой приблизительно 500, исходя из времени удерживания на гель-фильтрационной колонке superdex 30. Исходя из физических свойств, тестировали несколько соединений-кандидатов, из которых только сфингозин-1-фосфат индуцировал перемещение PAM.

S1P может связываться с семейством из пяти сопряженных с G-белками рецепторов. Следовательно, посредством ОТ-ПЦР HeLa исследовали возможность экспрессии в клетках HeLa рецепторов S1P. В клетках HeLa выявили мРНК четырех из пяти изоформ рецептора S1P (S1P_1-4) (фиг. 20a). Далее тестировали, проявляет ли очищенный S1P в отношении активации/перемещения PAM те же свойства, что и в сыворотке. Вначале клетки HeLa обрабатывали увеличивающимися концентрациями очищенного S1P. Перемещение PAM к плазматической мембране происходило в 70-90% клеток, обработанных 0,1-5 мкМ S1P. PAM появлялся у плазматической мембраны через 10 минут инкубации с 500 нМ S1P и начинал исчезать через 1 час инкубации (фиг. 3b, c). Наиболее важно, что обработка клеток HeLa 0,5 мкМ S1P уменьшала внутриклеточное содержание цАМФ (фиг. 21a), а также стимулированную Gαs активность AC (фиг. 21b). Стимулированная Gαs активность AC уменьшалась в пределах интервала 3 минуты после инкубации с S1P и перед частичным восстановлением. Через 5-10 минут после начала обработки S1P стимулированная Gαs активность AC уменьшалась еще раз (фиг. 4b). Антисмысловые ODN к PAM устраняли ингибирование стимулированной Gαs активности AC через 60 минут после инкубации с S1P (фиг. 21c). Рассматриваемые вместе, эти данные впервые демонстрируют, что ингибирование активности AC в клетках HeLa посредством S1P достигается двумя различными механизмами: быстрое, независимое от PAM ингибирование AC (3-10 минут обработки S1P) и задержанное, зависимое от PAM ингибирование AC (10-60 минут обработки S1P).

Показано, что посредством связывания его соответствующих рецепторов S1P потенциально может активировать четыре независимых G-белка: G_i, G_q, G₁₂ и G₁₃ (Hla et al., Science, 2001; Kluk et al., BBA, 2002; Siehler and Manning, BBA, 2002; Spiegel and Milstein, JBC, 2002). Из них только G_i чувствителен к токсину коклюша. Обработка токсином коклюша устраняла ингибирующее действие S1P на стимулированную Gαs активность AC (фиг. 22a) и перемещение PAM к плазматической мембране (фиг. 22b). Таким образом, кажется вероятным, что ингибирующий G-белок, G_i, ответственен за быстрое, независимое от PAM ингибирование посредством S1P.

Далее выявляли дополнительные элементы пути передачи сигнала, вызывающего перемещение и активацию PAM. Так как описано, что рецепторы S1P_1-4 связываются с G_i, G_q и G_12/13 (Hla et al., 2001; Kluk et al., 2002; Siehler et al., 2002; Spiegel et al., 2002), а перемещение PAM, а также ингибирование AC зависят от токсина коклюша (фиг. 22a), приведенные выше данные позволяют предположить, что активация PAM в клетках HeLa зависит от активации G_i. Ранее описано, что S1P может активировать фосфолипазу C (PLC), а также путь передачи сигнала ERK1/2 посредством активации G_i (Kluk et al., 2002; Siehler et al., 2002; Spiegel et al., 2002). Таким образом, тестировали, вовлечена ли активация PLC в перемещение PAM, и можно обнаружить, что в присутствии ингибитора PLC U73122 перемещения PAM и ингибирования AC в позднюю фазу не происходило (фиг. 22a). PLC преобразует фосфатидилинозитол-4,5-бифосфат в инозитол-1,4,5-трифосфат (IP₃), мобилизующий кальций вторичный посредник, и 1,2-диацилглицерин (DAG), активатор протеинкиназы C (PKC) (Rebecchi et al., 2000; Wilde et al., 2001). Визуализация кальция показала, что S1P индуцирует зависимое от PLC увеличение кальция в клетках HeLa. Однако это уменьшение кальция не обязательно для перемещения PAM, так как предварительная обработка BAPTA-AM не препятствовала перемещению PAM (фиг. 22a). Еще несколько ингибиторов PKC, GF109203X и RO 31-8220, устраняли перемещение PAM и ингибирование AC соответственно (фиг. 22a). Эти данные позволяют предположить, что S1P активирует PLC посредством ингибиторного G-белка, G_i. Далее, воздействия PLC приводят к независимой от кальция активации PKC, которая является необходимой для опосредования перемещения PAM и задержанного, индуцированного S1P ингибирования AC.

Так как также показано, что S1P может активировать путь передачи сигнала ERK1/2 (Kluk et al., 2002; Siehler et al., 2002; Spiegel et al., 2002), тестировали, активирует ли S1P EK1/2 в HeLa. После инкубации HeLa с S1P с применением антител к активному ERK и антител к фосфо-Tyr¹⁸³-ERK выявляли фосфорилирование ERK1/2 (фиг. 22b). Неожиданно фосфорилирование ERK1/2 зависело от активации PLC (фиг. 22b), G_i и активности PKC (данные не показаны), но не зависело от увеличения внутриклеточного содержания кальция. Однако активация ERK1/2 не являлась необходимой для перемещения PAM или ингибирования активности AC (фиг. 22a). Все вместе эти открытия впервые показывают, что S1P индуцирует перемещение PAM и последующее ингибирование ферментативной активности AC посредством сигнального каскада, индуцирующего G_i, PLC и PKC. Представляет интерес, что S1P дополнительно индуцировал активацию ERK1/2 и увеличение внутриклеточных концентраций кальция, оба из которых не являлись необходимыми для перемещения PAM или ингибирования стимулированной Gαs активности AC.

Пути передачи сигнала, регулируемые S1P, представляют собой фокус интенсивных исследований (Kluk et al., 2002; Siehler et al., 2002; Spiegel et al., 2002). Хорошо известно, что рецепторы S1P могут ингибировать активность AC посредством зависимых от G_i механизмов (Kluk et al., 2002; Siehler et al., 2002; Spiegel et al., 2002). Однако здесь впервые показано, что ингибирование активности AC в течение продолжительного времени после стимуляции S1P не происходит вследствие прямого ингибирования AC ингибирующим G-белком, так как задержанное ингибирование AC зависело от активации PLC и PKC. Кроме того, данные авторов настоящего изобретения позволяют предположить, что длительное ингибирование активности AC в клетках HeLa после обработки S1P зависит от перемещения/активации PAM к плазматической мембране. Данное перемещение регулируется активацией G_i и путем передачи сигналов PLC/PKC. Так как PAM представляет собой мощный ингибитор ферментативной активности AC, индуцированное S1P зависимое от PAM ингибирование AC может представлять собой результат прямых взаимодействий между PAM и AC, хотя это все необходимо определить.

Указанные выше эксперименты авторов настоящего изобретения впервые привели к открытию того, что PAM в клетках HeLa расположен у эндоплазматического ретикулума и перемещается к плазматической мембране после обработки сывороткой. Перемещение PAM сопровождалось уменьшением стимулированной Gαs и форсколином активности AC по сравнению с необработанными клетками HeLa. Ингибирование AC опосредовано PAM, так как предварительная обработка клеток антисмысловыми олигонуклеотидами к PAM предотвращала ингибирование AC. В последующем авторы идентифицировали сфингозин-1-фосфат (S1P) как сывороточный фактор, ответственный за перемещение PAM. Обработка клеток HeLa 0,1-5 мкМ S1P индуцировала перемещение PAM к плазматической мембране в 80% клеток в пределах 10-30 минут. S1P снижал активность AC двумя независимыми механизмами. Начальное ингибирование AC не опосредовано PAM, но чувствительно к токсину коклюша. После длительного воздействия S1P ингибирование AC зависело от перемещения PAM. Действия S1P на перемещение PAM и опосредованное PAM ингибирование AC зависело от токсина коклюша и требовало активации PLC и PKC. Рассматриваемые вместе, эти данные впервые позволили идентифицировать регулятор активности PAM. Кроме того, можно показать, что долговременное ингибирование AC посредством S1P опосредовано перемещением ингибирующего AC белка PAM из ЭР к клеточной мембране.

21. Определение обезболивающего действия S1P

Для определения обезболивающего действия S1P S1P доставляли к спинному мозгу посредством интратекального применения.

21 a) Имплантация поясничных интратекальных катетеров:

Крыс анестезировали кетамином (60 мг/кг в./б.) и мидазоламом (0,5-1 мг/кг в./б.). Над позвоночником от позвонка Th13 до L3 рассекали кожу. Мышечную ткань вокруг L2-3 удаляли. Остистый отросток L3 удаляли, а у L2 проводили ламинэктомию. Затем в перидуральное пространство вводили полиэтиленовые катетеры (ID 0,28 мм, OD 0,61 мм) так, чтобы наконечник катетера достигал Th9-10. Катетер фиксировали цианакрилатным клеем, выводили наружу в области шеи и зашивали кожу.

21 b) Инфузия олигонуклеотидов PAM:

Через трое суток после хирургического вмешательства крыс помещали в "свободно перемещающуюся систему" (CMA, Stockholm, Швеция) и через катетер вводили 20 мкл 10 мкМ S1P.

21 c) Формалиновый тест:

В пределах 15 минут после прекращения инфузии проводили формалиновый тест. 50 мкл 5% раствора формальдегида подкожно (п/к) инъецировали на дорзальную поверхность одной задней лапы. В течение одноминутных интервалов, до 60 минуты, начиная сразу после инъекции формалина, подсчитывали подергивания. Подергивания 5 мин интервалов суммировали как среднее количество подергиваний в минуту. Для сравнения болевого поведения между группами сумму подергиваний в течение двух фаз периода одночасового наблюдения подвергали обработке посредством t-теста Стьюдента. В конце формалинового теста вырезали поясничную область спинного мозга и ганглии задних корешков (DRG), образец замораживали в жидком азоте и хранили при -80°C до дальнейшего анализа.

21 d) Результаты:

Посредством интратекального применения за 15 минут перед инъекцией формалина взрослым крысам вводили 20 мкл 10 мкМ S1P или 20 мкл PBS/DMSO. Затем в течение 5 минутных интервалов посчитывали подергивания в течение периода 60 минут. По сравнению с обработанными PBS/DMSO животными можно выявить значимое уменьшение количества ноцицептивных ответов для фазы 2A (от 20 до 35 минут после инъекции формалина) (см. фиг. 24). Данные эксперименты отчетливо показали, что экзогенный S1P действует как обезболивающее средство.

22. Определение обезболивающего/антиноцицептивного действия агонистов рецепторов S1P

Обезболивающе/антиноцицептивное действие агонистов рецепторов S1P, например FTY 720, можно, например, подкрепить следующим гипотетическим примером. Обезболивающе/антиноцицептивное действие, например, FTY 720, например, в формалиновой модели острой боли можно определить непосредственно путем интратекального или внутривенного применения, например, FTY 720 и последовательного тестирования его обезболивающего/антиноцицептивного действия, например, посредством теста подергиваний. Данный подход позволяет молекуле проникать в ткань и имитировать действия физиологического S1P в отношении AC.

Литература

Bailey C.H., Bartsch D., Kandel E.R.: Toward a molecular definition of long-term memory storage. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1996 Nov 26;93(24):13445-52;

Brandon E.P., Idzerda R.L., McKnight G.S.: PKA isoforms, neural pathways, and behaviour: making the connection. Curr. Opin. Neurobiol. 1997 Jun;7(3):397-403;

Bek M. J., Zheng S., Xu J., Yamaguchi I., Asico L. D., Sun X. G. and Jose P. A. (2001) Differential expression of adenylyl cyclases in the rat nephron. Kidney Int 60, 890-899;

Brinkmann, V., Davis, M. D., Heise, C. E., Albert, R., Cottens, S., Hof, R., Bruns, C., Prieschl, E., Baumruker, T., Hiestand, P., Foster, C. A., Zollinger, M. and Lynch, K. R., (2002), The Immune Modulator FTY720 Targets Sphingosine-1-Phosphate Receptors; the Journal of Biological Chemistry, Vol. 277, No. 24, June 14, p. 21453 to 21457;

Caligan, T. B., Peters, K., Ou, J., Wang, E., Saba, J., and Merrill, A. H., Jr. (2000) Anal Biochem 281, 36-44;

Chang Q. and Balice-Gordon R. J. (2000) Highwire, rpm-1, and futsch: balancing synaptic growth and stability. Neuron 26, 287-290;

Chen, Z., Nield, H. S., Sun, H., Barbier, A., and Patel, T. B. (1995) J Biol Chem 270, 27525-27530;

Chomczynski, P., Sacchi, N.: Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Anal. Biochem. 162, (1987) 156-159;

DiAntonio, A., Haghighi, A. P., Portman, S. L., Lee, J. D., Amaranto, A. M., and Goodman, C. S. (2001) Nature 412, 449-452;

Graziano, M.P. Freissmuth M., Gilman A.G.: Purification of recombinant Gs alpha. Meth. Enz. (1991) 195: 192-215;

Graziano M. P., Freissmuth M. and Gilman A. G. (1991) Purification of recombinant Gs alpha. Methods Enzymol 195, 192-202;

Guo Q., Xie J., Dang C.V., Liu E.T., Bishop J.M.: Identification of a large Myc-binding protein that contains RCC1-like repeats. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1998 Aug 4;95(16):9172-7);

Grossberger, R., Gieffers, C., Zachariae, W., Podtelejnikov, A. V., Schleiffer, A., Nasmyth, K., Mann, M., and Peters, J. M. (1999) J Biol Chem 274, 14500-14507;

Hla, T., Lee, M. J., Ancellin, N., Paik, J. H., and Kluk, M. J. (2001) Science 294, 1875-1878;

Jin Y. (2002) Synaptogenesis: insights from worm and fly. Curr Opin Neurobiol 12, 71-79;

Julius and Basbaum “Molecular mechanisms of nociception”, Nature, volume 413, 13. September 2001, pp. 203 - 209;

Kassis, S., and Fishman, P. H. (1982) J Biol Chem 257(9), 5312-5318;

Kind, P. C., and Neumann, P. E. (2001) Trends Neurosci 24, 553-555;

Kluk, M. J., and Hla, T. (2002) Biochim Biophys Acta 1582, 72-80;

Mandala, S., Hajdu, R., Bergstrom, J., Quackenbush, E., Xie, J., Milligan, J., Thornton, R., Shei, G., Card, D., Keohand, C., Rosenbach, M., Hale, J., Lynch, C. L., Rupprecht, K., Parsons, W. and Rosen, H., (2002), Alteration of Lymphocyte Trafficking by Spingosine-1-Phospate Receptor Agonists, Science, Vol.296, April 2002;

Meller S.T., Gebhart G.F. (1997), intraplantar zymosan as a reliable, quantifiable model of thermal and mechanical hyperalgesia in the rat; Eur. J. Pain 1, 43-52;

Nair, B. G., Parikh, B., Milligan, G., and Patel, T. B. (1990) J Biol Chem 265(34), 21317-21322;

Nestler, E. J. (2001) Nat Rev Neurosci 2, 119-128;

Patel T. B., Wittpoth C., Barbier A. J., Yigzaw Y. and Scholich K. (2002) Functional analyses of type V adenylyl cyclase. Methods Enzymol 345, 160-187;

Snyder S. H. (1985) Adenosine as a neuromodulator. Annu Rev Neurosci 8, 103-124;

Payne, S. G., Milstien, S., and Spiegel, S. (2002), Sphingosine-1-phosphate: dual messenger functions; FEBS Letters 531 (2002), p. 54 to 57;

Postma, F. R., Jalink, K., Hengeveld, T., and Moolenaar, W. H. (1996) Embo J 15, 2388-2392

Rebecchi, M. J., and Pentyala, S. N. (2000) Physiol Rev 80, 1291-1335;

Ruppert C., Goldowitz D., and Wille W. (1986), Proto-oncogene-c-myc is expressed in cerebellar neurons at different developmental stages, Embo J5, 1897-1901;

Sato, K., Tomura, H., Igarashi, Y., Ui, M., and Okajima, F. (1997) Biochem Biophys Res Commun 240, 329-334;

Schaefer A. M., Hadwiger G. D. and Nonet M. L. (2000) rpm-1, a conserved neuronal gene that regulates targeting and synaptogenesis in C. elegans. Neuron 26 , 345-356);

Schaible H.G., Vanegas H.: How do we manage chronic pain? Baillieres Best. Pract. Res. Clin. Rheumatol. 2000 Dec;14(4):797-811;

Scherr M., Morgan M.A., Eder M., Gene Silencing Mediated by Small Interfering RNAs in Mammalian Cells, Curr Med Chem. 2003, Feb; 10 (3): 245-256;

Scholich, K., Mullenix, J. B., Wittpoth, C., Poppleton, H. M., Pierre, S. C., Lindorfer, M. A., Garrison, J. C., and Patel, T. B. (1999) Science 283, 1328-1331;

Scholich K., Pierre S., Patel T.B.: Protein associated with myc (PAM) is a potent inhibitor of adenylyl cyclase. J. Biol. Chem. 2001, Dec 14;276(50):47583-9;

Scholz and Woolf “Can we conquer pain” , Nature neuroscience supplement, volume 5, November 2002, pp. 1062-1067;

Siehler, S., and Manning, D. R. (2002) Biochim Biophys Acta 1582, 94-99;

Snyder S.H. (1985), Adenosine as a neuromodulator. Annual Reviews of Neuroscience 8, 103-104;

Spiegel, S. and Milstien, S. (2000), Functions of a new family of sphingosine-1-phosphate receptors, Biochimica et Biophysica Acta 1484, p. 107 to 116;

Spiegel, S. and Milstien, S. (2002), J. Biol. Chem 277; 25851-24854;

Trajkovic V, Samardzic T, Stosic-Grujicic S, Ramic Z, Mostarica Stojkovic M. Muramyl dipeptide potentiates cytokine-induced activation of inducible nitric oxide synthase in rat astrocytes. Brain Res. 2000 Nov 10;883(1):157-63;

Wan H. I., DiAntonio A., Fetter R. D., Bergstrom K., Strauss R. and Goodman C. S. (2000) Highwire regulates synaptic growth in Drosophila. Neuron 26, 313-329.);

West, A. E., Chen, W. G., Dalva, M. B., Dolmetsch, R. E., Kornhauser, J. M., Shaywitz, A. J., Takasu, M. A., Tao, X., and Greenberg, M. E. (2001) Proc Natl Acad Sci USA 98, 11024-11031;

Wilde, J. I., and Watson, S. P. (2001) Cell Signal 13, 691-701;

Wittpoth C., Scholich K., Yigzaw Y., Stringfield T.M. and Patel T.B. (1999), Regions on adenylyl cyclase that are necessary for inhibition of activity by beta gamma G(iα) subunits of heterotrimeric G proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 7723-7730;

Wood, J.D. “Pathobiology of Visceral Pain: Molecular Mechanisms and Therapeutic Implications II. genetic approaches to pain therapy”, American Journal оf Physiological Gastrointestinal Liver Physiology, 2000, volume 278, G507-G512;

Woolf and Mannion “Neuropathic pain: aetiology, symptoms mechanisms, and management”, The LANCET, volume 353, June 5, 1999, pp. 1959-1964;

Woolf J. and Salter M.W. “Neuronal Plasticity: Increasing the Gain in Pain”, Science, volume 288, June 9, 2000, pp. 1765-1768;

Xia Z., Storm D.R.: Calmodulin-regulated adenylyl cyclases and neuromodulation. Curr. Opin. Neurobiol. 1997 Jun; 7(3):391-6;

Xu, D., Isaacs, C., Hall, I. P., and Emala, C. W. (2001) Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol 281, L832-843;

Yang H., Scholich K., Poser S., Storm D., Patel T.B., Goldowitz D.: Developmental expression of protein associated with myc (PAM) in the rodent brain. Brain Res Dev Brain Res 136, 2002, 35-42;

Zhen M., Huang X., Bamber B. and Jin Y. (2000) Regulation of presynaptic terminal organization by C. elegans RPM-1, a putative guanine nucleotide exchanger with a RING-H2 finger domain. Neuron 26, 331-343);

Стандартная литература по лабораторным методам

Если не указано иначе, лабораторные способы выполняют или могут быть выполнены в соответствии со стандартными способами, перечисленными ниже в стандартной литературе:

Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Second edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY. 545 pp. or Current Protocols in Molecular Biology;

Current Protocols in Molecular Biology; regularly updated, e.g. Volume 2000; John Wiley & Sons, Inc; Editors: Fred M. Ausubel, Roger Brent, Robert Eg. Kingston, David D. Moore, J.G. Seidman, John A. Smith, Kevin Struhl.

Current Protocols in Human Genetics; regularly updated, e.g. Volume 2003; John Wiley & Sons, Inc; Editors: Nicholas C. Dracopoli, Honathan L. Haines, Bruce R. Korf, Cynthia C. Morton, Christine E. Seidman, J.G. Seigman, Douglas R. Smith.

Current Protocols in Protein Science; regularly updated, e.g. Volume 2003; John Wiley & Sons, Inc; Editors: John E. Coligan, Ben M. Dunn, Hidde L. Ploegh, David W. Speicher, Paul T. Wingfield.

Molecular Biology of the Cell; third edition; Alberts, B., Bray, D., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Watson, J.D.; Garland Publishing, Inc. New York & London, 1994.

Gene Targeting: a practical approach (1995), Editor: A.L. Joyner, IRL Press.

Genetic Manipulation of Receptor Expression and Function; D. Accili, Wiley-Liss., USA, 2000; ISBN: 0-471-35057-5.

Antisense Therapeutics, S. Agrawal, Humana Press, USA, 1996, ISBN: 0-89603-305-8.

Remingtonґs Pharmaceutical Sciences, Edition 17, 1985.

Применяемые сокращения

AC - аденилатциклаза; Gαs - субъединица стимулирующего аденилатциклазу G-белка; Gαs* - постоянно активный мутант (Q213L) Gαs; Gαi - субъединица ингибирующего G-белка Gi; Gβγ - βγ-субъединицы гетеротримерных G-белков; ODN - олигодезоксинуклеотид; PAM - ассоциированный с Myc белок; RCC1 - регулятор конденсации хромосом; S1P - сфингозин-1-фосфат; TED - 50 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT; RT - комнатная температура.

Фигуры

Фигура 1: PAM высоко экспрессирован в нейронах спинного мозга. В гибридизации in situ с применением горизонтальных срезов спинного мозга, гибридизуемых со смысловыми или антисмысловыми зондами к крысиному PAM, как описано выше.

Фигура 2: PAM экспрессирован в нейронах DRG, а также в нейрональных клетках спинного мозга крысы.

Панель A: Иммуногистохимический анализ срезов спинного мозга крысы. Срезы окрашивали антителами к PAM (зеленые) и антителами к NeuN или GFAP (красные) для визуализации нейронов или глиальных клеток соответственно. Перекрывание обоих сигналов представлено на правых панелях. Объекты увеличены 20×.

Панель B: Иммуногистохимический анализ срезов DRG крысы. Срезы окрашивали антителами к PAM (зеленые) и антителами к Neu68, к гистонам или к GFAP (красные) для визуализации нейронов, ядер или глиальных клеток соответственно. Перекрывание обоих сигналов представлено на правых панелях. Объекты увеличены 40× за исключением окрашивания гистонов, которое увеличивали 63×.

Фигура 3: PAM дифференциально экспрессирован в DRG и спинном мозге в течение стадий развития. Для выявления PAM в РНК (40 нг) спинного мозга и DRG эмбрионов крыс на 16 сутки (E16), сутки после рождения 0,5 (P0,5), 3 (P3), 5 (P5), 9 (P9) и у взрослых крыс применяли количественный ОТ-ПЦР (Taqman™). Показано среднее ± SEM по меньшей мере 3 определений.

Фигура 4: у PAM повышена экспрессия в спинном мозге крыс после обработки зимозаном и формалином.

Панель A: анализ ОТ-ПЦР с РНК (40 нг) спинного мозга контрольных животных или обработанных зимозаном животных после 24 час, 48 час и 96 час. На последней панели показано среднее ± SEM 7 экспериментов. T-тест Стьюдента: *p< 0,001.

Панель B: анализ "вестерн"-блот с применением 7% геля SDS-PAGE лизатов спинного мозга контрольных животных или обработанных зимозаном животных после 24 часов, 48 часов и 96 часов (40 мкг) с антителами к PAM и к ERK1/2.

Панель C: Анализ количественной ОТ-ПЦР с РНК (40 нг) спинного мозга контрольных животных или животных, обработанных в течение 1 часа формалином.

Фигура 5: PAM ингибирует стимулированную Gαs активность AC в лизатах спинного мозга.

Панель A: ОТ-ПЦР применяли для определения экспрессии РНК изоформ AC в спинном мозге и DRG (40 нг).

Панель B: Лизаты спинного мозга или DRG (10 мкг) анализировали на активность AC в присутствии 80 нМ Gαs, как описано в материалах и методах. Показано среднее ± SEM по меньшей мере 3 определений, проведенных в трех экземплярах.

Фигура 6: Интратекальное применение антисмысловых ODN к PAM увеличивает болевое поведение.

Панель A: Взрослым крысам интратекально вводили смысловые и антисмысловые ODN, как описано. После обработки формалином спинной мозг удаляли и подвергали иммуногистохимическому анализу с применением антител к PAM (зеленые) или к NeuN (красные).

Панель B: Формалиновый анализ животных, обработанных смысловыми и антисмысловыми ODN, как описано в разделе материалов. Показано общее количество подергиванием в течение 1 часа. Показано среднее ± SE, по меньшей мере, из 4 определений.

Панель C: Формалиновый анализ у животных, обработанных смысловыми и антисмысловыми ODN, как описано в разделе материалов. Показано количество подергиваний в течение 1 часа. Показано среднее ± SE, по меньшей мере, из 4 определений.

Фигура 7: Белковая, геномная и кодирующая нуклеотидные последовательности человеческого PAM согласно инвентарному номеру NCBI AAC39928 (белковая последовательность; SEQ ID NO:1), AF075587 (кодирующая последовательность; SEQ ID NO:2). Человеческий PAM расположен на хромосоме 13q22; его геномная последовательность общедоступна под NT_024524.11 (старт: положение 24679861; стоп: положение 24962245; SEQ ID NO:3).

На фигуре 7C показана непрерывная последовательность от положения 24679861 до положения 24962245.

Фигура 8: Кодирующая последовательность EST-клонов для крысиного PAM.

Фигура 8A: AW921303 (соответствует 960-1394 п.н. кДНК человека; SEQ ID NO:4).

Фигура 8B: AW918711 (соответствует 8188-8632 п.н. кДНК человека; SEQ ID NO:5).

Фигура 8C: BQ201485 (соответствует 8966-9633 п.н. кДНК человека; SEQ ID NO:6).

Фигура 8D: BE112881 (соответствует 10311-10830 п.н. кДНК человека; SEQ ID NO:7).

Фигура 8E: AW441131 (соответствует 13569-14152 п.н. кДНК человека; SEQ ID NO:8).

Фигура 8F: BF409872 (соответствует 13569-14807 п.н. кДНК человека). (SEQ ID NO:9).

Фигура 9: Обзор доменной структуры человеческого PAM по Guo et al., 1988/Grossberger et al., JBC 1999 и Scholich et al., JBC 2001).

Фигура 10: Праймеры ПЦР для ОТ-ПЦР крысиного PAM.

Фигура 11: Антисмысловые олигодезоксинуклеотиды для ингибирования экспрессии крысиного PAM и контрольный олигонуклеотид.

Фигура 12: Различные полипептиды человеческого PAM для применения в контексте настоящего изобретения. Полипептиды представляют собой фрагменты, полученные из полипептида по SEQ ID NO:2.

Фигура 13: Различные полинуклеотиды человеческого PAM для применения в контексте настоящего изобретения.

Фигура 13A: последовательность кДНК, кодирующая фрагмент белка, соответствующий SEQ ID NO:17, содержащая нуклеотидные положения кДНК человеческого PAM с 1317 по 4366 (SEQ ID NO:24).

Фигура 13B: последовательность кДНК, кодирующая фрагмент белка, соответствующий SEQ ID NO:18, содержащая нуклеотидные положения кДНК человеческого PAM с 1482 по 3332 (SEQ ID NO:25).

Фигура 13C: последовательность кДНК, кодирующая фрагмент белка, соответствующий SEQ ID NO:19, содержащая нуклеотидные положения кДНК человеческого PAM с 1641 по 3341 (SEQ ID NO:26).

Фигура 13D: последовательность кДНК, кодирующая фрагмент белка, соответствующий SEQ ID NO:20, содержащая нуклеотидные положения кДНК человеческого PAM с 3142 по 4046 (SEQ ID NO:27).

Фигура 13E: последовательность кДНК, кодирующая фрагмент белка, соответствующий SEQ ID NO:21, содержащая нуклеотидные положения кДНК человеческого PAM с 3142 по 3446 (SEQ ID NO:28).

Фигура 13F: последовательность кДНК, кодирующая фрагмент белка, соответствующий SEQ ID NO:22, содержащая нуклеотидные положения кДНК человеческого PAM с 3228 по 3839 (SEQ ID NO:29).

Фигура 13G: последовательность кДНК, кодирующая фрагмент белка, соответствующий SEQ ID NO:23, содержащая нуклеотидные положения кДНК человеческого PAM с 3228 по 3341 (SEQ ID NO:30).

Фигура 14: Путь передачи сигнала PAM, исходя из указанных выше открытий.

Фигура 15: Структура сфингозин-1-фосфата.

Фигура 16: мРНК и аминокислотные последовательности рецепторов S1P.

16a) аминокислотная последовательность S1P₁ (SEQ ID NO:31);

16b) последовательность мРНК S1P₁ (SEQ ID NO:32); кодирующая последовательность начинается в положении 244 и оканчивается в положении 1392;

16c) аминокислотная последовательность S1P₂ (SEQ ID NO:33);

16d) последовательность мРНК S1P₂ (SEQ ID NO:34); кодирующая последовательность начинается в положении 1 и оканчивается в положении 1062;

16e) аминокислотная последовательность S1P₃ (SEQ ID NO:35);

16f) последовательность мРНК S1P₃ (SEQ ID NO:36), кодирующая последовательность начинается в положении 1 и оканчивается в положении 1137;

16g) аминокислотная последовательность S1P₄(SEQ ID NO:37);

16h) последовательность мРНК S1P₄ (SEQ ID NO:38), кодирующая последовательность начинается в положении 23 и оканчивается в положении 1177;

16i) аминокислотная последовательность S1P₅ (SEQ ID NO:39);

16j) последовательность мРНК S1P₅ (SEQ ID NO:40), кодирующая последовательность начинается в положении 10 и оканчивается в положении 1206.

Фигура 17: Структура FT720.

Фигура 18: после стимуляции сывороткой PAM в клетках HeLa перемещается из ЭР к плазматической мембране.

Панель A: клетки HeLa с недостатком сыворотки (24 часа) фиксировали и окрашивали антителами к PAM (зелеными) и антителами к калнексину (красными), как описано выше.

Панель B: клетки HeLa обрабатывали 10% эмбриональной телячьей сывороткой в различные моменты времени и окрашивали антителами к PAM для мониторинга субклеточной локализации.

Фигура 19: Обработка сывороткой клеток HeLa уменьшает активность AC посредством зависимого от PAM процесса.

Панель A: Накопление цАМФ в клетках HeLa измеряли в отсутствие и в присутствии сыворотки, как описано выше. Показано среднее ± SEM (стандартная ошибка среднего) трех определений.

Панель B: Активность аденилатциклазы лизатов клеток HeLa измеряли в отсутствие и в присутствии сыворотки, как описано в разделе материалы и методы. Специфические активности ACV, стимулируемые Gsα* (80 нМ; серые полосы) и форксолином (100 мкМ; черные полосы), составляли 124±10 пмоль/мг/мин и 464±89 пмоль/мин/мг соответственно. Базальная активность составляла 11,75±2 пмоль/мг/мин. Показано среднее ± SE по меньшей мере 2 экспериментов, проведенного в трех экземплярах. T-тест Стьюдента: *p< 0,001.

Панель C: анализ ОТ-ПЦР экспрессии изоформ AC в клетках HeLa с недостатком сыворотки и после 1 часа инкубации с 10% FBS.

Панель D: Клетки HeLa с недостатком сыворотки трансфицировали по 3 мкМ антисмысловым, смысловым и несущим три точковых мутации (3M-as) антисмысловым ODN, как описано выше. Клетки собирали и подвергали анализу "вестерн"-блотингу с применением 7% SDS-PAGE (30 мкг белка) с антителами к PAM и антителами к Hsp70.

Панель E: Клетки HeLa с недостатком сыворотки обрабатывали смысловым, антисмысловым и 3M-as ODN, как описано выше. Через 24 часа клетки в течение 30 минут инкубировали с 10% FBS. Клетки собирали и определяли активность AC в присутствии Gαs* (80 nM; серые полосы) и форксолина (100 мкМ; черные полосы), как описано ранее. Данные, по меньшей мере, 3 экспериментов, измеренных в трех экземплярах, представлены как среднее ± SEM. T-тест Стьюдента: *p< 0,001.

Фигура 20: S1P индуцирует перемещение PAM к плазматической мембране и ингибирует зависимую от PAM ферментативную активность AC.

Панель A: анализ ОТ-ПЦР экспрессии изоформ рецептора S1P клеток HeLa с недостатком сыворотки.

Панель B: клетки HeLa обрабатывали 0,5 мкМ S1P в течение 30 минут и окрашивали антителами к PAM для мониторинга субклеточной локализации.

Панель C: Зависимость от времени перемещения PAM в клетках HeLa. Клетки HeLa с недостатком сыворотки обрабатывали 0,5 мкМ S1P в различные моменты времени и окрашивали антителами к PAM для мониторинга субклеточной локализации. Представлен процент клеток с перемещением PAM.

Фигура 21: обработка клеток HeLa S1P уменьшает активность AC посредством зависимого от PAM процесса.

Панель A: Накопление цАМФ в клетках HeLa в отсутствие (черные полосы) и в присутствии (серые полосы) 0,5 мкМ S1P в различные моменты времени, как описано в разделе материалы и методы. Показано среднее ± SEM трех определений.

Панель B: Клетки HeLa с недостатком сыворотки в различные моменты времени обрабатывали 0,5 мкМ S1P. Клетки собирали и определяли активность в присутствии 80 нМ Gαs*, как описано в разделе материалы и методы. Данные, по меньшей мере, из 4 экспериментов, измеренные в трех экземплярах, представлены как среднее ± SE.

Панель C: Клетки HeLa с недостатком сыворотки обрабатывали смысловыми, антисмысловыми и 3M-as ODN, как описано в разделе материалы и методы. Через 24 часа клетки инкубировали в указанные моменты времени с 0,5 мкМ S1P. Клетки собирали и определяли активность в присутствии 80 нМ Gαs*, как описано выше. Данные представлены как среднее ± SEM трех определений.

Фигура 22: Перемещение PAM и зависимое от PAM ингибирование ферментативной активности AC опосредовано путем передачи сигнала PLC/PKC.

Панель A: Клетки HeLa с недостатком сыворотки обрабатывали 0,5 мкМ S1P в течение 3 (серые полосы) или 60 (черные полосы) минут. Перед инкубацией с S1P клетки инкубировали в течение 24 часов с 1 мкг/мкл токсина коклюша (PTX). Активность AC определяли в присутствии 80 нМ Gαs*. Данные, по меньшей мере, 2 экспериментов измеряли в трех экземплярах и представляли как среднее ± SE.

Панель B: Клетки HeLa с недостатком сыворотки обрабатывали 0,5 мкМ S1P. Перед инкубацией с S1P клетки инкубировали в течение 20 минут с 10 мкМ U73122, RO31-8220, BAPTA-AM или U0126. Активность AC определяли в присутствии 80 нМ Gαs*. Данные, по меньшей мере, 2 экспериментов измеряли в трех экземплярах и представляли как среднее ± SE.

Панель C: анализ "вестерн"-блот клеток HeLa, обработанных в течение 10 минут 0,5 мкМ S1P. Перед инкубацией с S1P клетки инкубировали в течение 20 минут с 10 мкМ U73122, BAPTA-AM или U0126. Клетки собирали в кипящем буфере Лэммли и подвергали анализу "вестерн"-блот с применением антител к активному ERK1/2. В качестве контроля загрузки применяли антитела к Hsp70.

Панель D: клетки HeLa обрабатывали 0,5 мкМ S1P в течение 20 минут и окрашивали антителами к PAM для мониторинга субклеточной локализации. Перед обработкой S1P клетки инкубировали в течение 24 часов с 1 мкг/мкл токсина коклюша (PTX), в течение 20 минут с 1 мкМ GF109203X, 10 мкМ U0126, BAPTA-AM, U73122 или Ro31-223.

Фигура 23: Схематическое изображение предлагаемого пути передачи сигнала, ведущего к перемещению PAM и зависимому от PAM ингибированию ферментативной активности AC.

Фигура 24: Болевое поведение взрослых крыс в формалиновом анализе с применением S1P в течение периода 60 минут или без применения S1P.

Взрослым крысам вводили 20 мкл 10 мкМ S1P или 20 мкл PBS/DMSO посредством интратекального применения за 15 минут до введения формалина. После введения формалина подсчитывали подергивания в течение 5 минутных интервалов в течение периода времени 60 минут. Показано среднее шести экспериментов на животных + SEM.

Таблица 1

Базальная активность AC в лизатах спинного мозга у обработанных антисмысловыми олигонуклеотидами крыс повышена. Лизаты спинного мозга (20 мкг) анализировали на их активность AC в присутствии или в отсутствие 80 нМ Gαs или 100 мкМ форсколина, как описано выше. Показана средняя активность AC ± SEM лизатов спинного мозга, по меньшей мере, из трех крыс на группу, каждая измерена дважды в трех экземплярах (ns = не значимо).

Таблица 1 Состояние   Активность AC
(пмоль/мин/кг)   базальная       смысловой   102,7±6,6   антисмысловой   124,0±6,2 (р≤0,01) Gαs       смысловой   398,8±16,9   антисмысловой   432,6±17,2 (ns) Форсколин       смысловой   283,9±25,7   антисмысловой   316,2±24,3 (ns)

Предложено применение сфингозин-1-фосфата, ранее известного для лечения нейродегенеративных заболеваний, фиброза, цирроза (S1P) или гидроксилированных или метилированных S1P или их солей для модуляции ноцицептивной боли; или для идентификации соединений, модулирующих ноцицептивную боль; или для профилактики (лечения) ноцицептивной боли, соответствующий способ лечения и способы скрининга соединений для модуляции или профилактики боли (варианты), способ идентификации модулирующего боль соединения. Показано действие S1P как обезболивающего средства на модели ноцицептивной боли в тесте с формалином на животных. Раскрыта возможность скринига модулирующих ноцицептивную боль соединений с рецептором S1P (его производным или функциональным фрагментом) или с РАМ. 10 н.п. и 7 з.п. ф-лы, 24 ил., 1 табл.

1. Применение S1P или гидроксилированных или метилированных S1P или их физиологически толерантных органических или неорганических солей для модуляции ноцицептивной боли.

2. Применение S1P или гидроксилированных или метилированных S1P или их физиологически толерантных органических или неорганических солей для идентификации модулирующих ноцицептивную боль соединений.

3. Применение S1P или гидроксилированных или метилированных S1P или их физиологически толерантных органических или неорганических солей в качестве лекарственного средства для профилактики или лечения ноцицептивной боли.

4. Применение по п.2, где соединения уменьшают или прекращают боль.

5. Применение по пп.1-4, где гидроксилированные или метилированные S1P или физиологически толерантные органические или неорганические соли способны ингибировать активность аденилатциклазы.

6. Применение по п.5, где аденилатциклаза представляет собой аденилатциклазу типа I, V, VI.

7. Способ уменьшения ноцицептивной боли, предусматривающий введение индивидууму достаточного количества S1Р или гидроксилированного или метилированного S1P или их физиологически толерантных органических или неорганических солей.

8. Способ скрининга фармацевтических соединений, которые могут использоваться для модуляции и/или профилактики боли, предусматривающий стадии
а. получения образца, содержащего РАМ, или его функциональный фрагмент, или производное и не содержащего S1P;
b. получения второго образца, содержащего РАМ, или его функциональный фрагмент, или производное, а также содержащего S1P;
с. измерения активности РАМ в обоих образцах;
d. приведения первого образца в контакт с соединением;
е. определения способности соединения имитировать действие S1P.

9. Способ скрининга фармацевтических соединений, которые могут использоваться для модуляции и/или профилактики соли, предусматривающий стадии
a) получения двух образцов, содержащих клетки, экспрессирующие рецептор S1P, или его функциональный фрагмент, или производное;
b) приведения одного образца в контакт с соединением; и
c) измерения активности рецептора в обоих образцах.

10. Способ по п.9, дополнительно предусматривающий стадию, где клетки вместо соединения приводят в контакт с S1P, и где активность РАМ по с) и d) сравнивают с активностью РАМ в присутствии S1P.

11. Способ скрининга фармацевтических соединений, которые могут использоваться для модуляции и/или профилактики боли, предусматривающий стадии
a) получения двух образцов, содержащих клетки, экспрессирующие рецептор S1P, или его функциональный фрагмент, или производное;
b) приведения образцов в контакт с S1P;
c) приведения одного образца в контакт с соединением; и
d) измерения активности рецептора или взаимодействия S1P и рецептора в обоих образцах.

12. Способ скрининга фармацевтических соединений, которые могут использоваться для модуляции и/или профилактики боли, предусматривающий стадии
а. получения клеток, экспрессирующих рецептор S1P, или его функциональный фрагмент, или производное и экспрессирующих РАМ, или его функциональный фрагмент, или его производное;
b. приведения клеток в контакт с соединением;
с. определения активности S1P в присутствии соединения;
d. определения активности S1P в отсутствие соединения; и
е. сравнения активности S1P по с) с активностью по d).

13. Способ скрининга фармацевтических соединений, которые могут использоваться для модуляции и/или профилактики боли, предусматривающий стадии
а. получения двух образцов, содержащих S1P или его функциональный фрагмент или производное и содержащих рецептор S1P или его функциональный фрагмент или производное;
b. приведения одного из образцов в контакт с соединением;
с. определения и сравнения активности S1P в обоих образцах.

14. Способ по пп.8-13, где его функциональные фрагменты или производные способны ингибировать активность аденилатциклазы.

15. Способ по п.14, где аденилатциклаза представляет собой аденилатциклазу типа I, V или VI.

16. Способ по пп.8-13, где определение активности S1P относится к его способности взаимодействовать с рецептором S1P и/или активировать его, для опосредования переноса РАМ, для активации функции РАМ или для инактивации функции АС.

17. Способ идентификации соединения, модулирующего соль, предусматривающий
a) отбор соединения, модулирующего или имитирующего активность S1P в качестве тестируемого соединения,
b) введение указанного тестируемого соединения индивидууму; и
c) определение того, модулируется ли боль у индивидуума.