Способ получения бактериальной закваски Российский патент 2022 года по МПК C12N1/20 A23C9/123 C12R1/225 

Изобретение относится к микробиологической и пищевой промышленности и может быть использовано для производства пищевых продуктов, обогащенных молочнокислыми бактериями.

Известен способ производства бактериального концентрата, предусматривающий выращивание симбиотической закваски из кефирной грибковой закваски и термофильных лактобактерий Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus helveticus в соотношении 1:0,5:0,5:1 на питательной среде на основе творожной сыворотки, ржаной муки и ростовых компонентов при температуре (30±2)°C в течение 8-10 ч. После получения закваски производят отделение биомассы с получением жидкого бактериального концентрата. В другом варианте для приготовления закваски прямого внесения полученный жидкий бактериальный концентрат смешивают с защитной средой и замораживают при температуре не выше минус 20°С (см. Патент RU №2524435, МПК A23C 9/12, A23C 9/127, C12P 1/00, опубл. 27.07.2014, бюл. № 21).

Недостатком известного способа является применение в составе питательной среды творожной сыворотки, содержащей лактозу, употребление которой недопустимо для людей, страдающих лактазной недостаточностью.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению по технической сущности и достигаемому результату является способ производства бактериального препарата бифидобактерий, предусматривающий использование в качестве основы питательной среды рисового отвара с добавлением ростовых компонентов. При изготовлении бактериального препарата применяют штамм Bifidobacterium longum DK-100 (см. Хамагаева И.С., Хазагаева С.Н., Марадудина И.П. Оптимизация питательной среды для получения гипоаллергенного биопрепарата // Вестник ВСГУТУ. 2017. № 3 (66) С. 93-96).

Недостатками известного способа являются трудоемкость приготовления рисового отвара и применение только для культивирования бифидобактерий.

Известно, что в настоящее время в большинстве внеевропейских популяций в том числе среди населения Азии, Африки, Латинской Америки и представителей северных народов широко распространена лактазная недостаточность. В России состояние, связанное со снижением уровня фермента лактазы, встречается у 16-18% взрослого населения. Игнорирование этого состояния может привести к серьезным медицинским и социальным последствиям. В связи с этим, растет спрос на производство пищевых ингредиентов, в том числе бактериальных заквасок, которые производят с использованием сырья, не содержащего молочных ингредиентов. Поэтому использование компонентов растительного происхождения для производства бактериальных препаратов представляет большой научный интерес.

Анализ патентных документов по заданной теме показал, что основными недостатками аналогичных способов производства являются трудоемкость изготовления питательной среды, применение в качестве основы для среды творожной сыворотки, содержащей лактозу.

Особенностью предлагаемого изобретения является то, что питательная среда, применяемая в предлагаемом способе получения бактериальной закваски, основана на рисовой муке, при этом она не содержит молокосодержащих компонентов и лактозы. Таким образом, бактериальная закваска может использоваться в питании людей, страдающих лактазной недостаточностью и применяться для производства продуктов, предназначенных для данной группы потребителей.

Основной технической задачей изобретения является получение бактериальной закваски молочнокислых бактерий вида Lactobacillus sakei, не содержащей лактозу.

Технический результат, обеспечиваемый при осуществлении предлагаемого изобретения, заключается в получении бактериальной закваски молочнокислых бактерий Lactobacillus sakei с высоким количеством бактериальных клеток, низкой трудоемкостью изготовления.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе получения бактериальной закваски, включающем приготовление питательной среды, внесение инокулята, наращивание клеток, отделение бактериальной массы от культуральной среды, смешивание ее с защитной средой, розлив, замораживание, согласно изобретению в качестве инокулята используют культуру молочнокислых бактерий Lactobacillus sakei штаммы Lactobacillus sakei LSK-45, Lactobacillus sakei DSM 20017, Lactobacillus sakei LSK-104 или Lactobacillus sakei LSK-103, а в качестве питательной среды применяют отвар на основе рисовой муки, приготовленный из расчета 55-75 г рисовой муки на 1 л воды, в составе питательной среды применяют пептон в количестве 7-10 г/дм³.

Отличительными признаками заявляемого изобретения являются:

- новые условия культивирования молочнокислых бактерий, а именно использование в качестве инокулята культуры молочнокислых бактерий штаммы Lactobacillus sakei LSK-45, Lactobacillus sakei DSM 20017, Lactobacillus sakei LSK-104, или Lactobacillus sakei LSK-103;

- применение в качестве основы питательной среды рисовой муки, не содержащей лактозу, что позволяет получить бактериальную закваску для производства безлактозных пищевых продуктов.

На первом этапе исследований изучали рост бактерий Lactobacillus sakei LSK-45 (номер в коллекции ВКПМ В-8896) на трех видах питательных сред: а) среде MRS, рекомендованной для культивирования молочнокислых бактерий, б) среде на основе рисового отвара, в) среде на основе рисовой муки.

В среды на основе рисового отвара и рисовой муки добавляли следующие компоненты:

глюкоза - 15 г,

магний хлористый - 0,3 г,

натрий лимоннокислый трехзамещенный - 1 г,

калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,5 г,

аскорбиновая кислота - 0,1 г,

пептон - 5 г,

рисовый отвар/ отвар на основе рисовой муки - до 1 л.

Известно, что для лучшего роста и развития Lactobacillus sakei необходимы аминокислоты, минералы и витамины, большое влияние на рост оказывают ионы магния и марганца. Известно, что рис и рисовая мука богаты марганцем, поэтому в питательные среды на основе рисового отвара и рисовой муки не добавляли марганецсодержащих солей. Пептон добавляли в бактериальную среду в качестве источника аминокислот. В результате были получены результаты, представленные в таблице 1.

Таблица 1 - Данные о росте двух штаммов Lactobacillus sakei Бактериальные штаммы Питательные среды Количество жизнеспособных клеток бактерий, log КОЕ/см³ после 24 ч культивирования pH питательной среды, ед. Lactobacillus sakei LSK-45 MRS 9 4.59 Среда на основе рисового отвара 6.77 5.42 Среда на основе рисовой муки 7.3 4.9

Таким образом, установлено, что среда на основе рисовой муки обеспечивает лучший рост микроорганизмов вида Lactobacillus sakei по сравнению со средой, основанной на рисовом отваре. В связи с этим, для дальнейших исследований применялась питательная среда, основанная на рисовой муке.

Для дальнейшего исследования была спроектирована матрица планирования эксперимента, приведенная в таблице 2. В качестве факторов были выбраны содержание пептона (x₁) и содержание рисовой муки (x₂), параметром оптимизации (у) служило количество жизнеспособных клеток бактерий. При планировании эксперимента использовали метод центрального композиционного эксперимента (Юдин Ю.В. Организация и математическое планирование эксперимента: учебное пособие / Ю.В. Юдин, М.В. Майсурадзе, Ф.В. Водолазский. - Екатеринбург : Изд-во Урал. ун-та, 2018. - 124 с.).

Таблица 2 - Матрица планирования эксперимента Номер опыта Уровни факторов Значения уровней факторов Количество клеток бактерий, log КОЕ/см³ (у) x₁ x₂ Содержание пептона, г/дм³ Содержание рисовой муки, г/дм³ 1 -1 -1 0 25 у₁ 2 0 -1 5 25 у₂ 3 +1 -1 10 25 у₃ 4 -1 0 0 50 у₄ 5 0 0 5 50 у₅ 6 +1 0 10 50 у₆ 7 -1 +1 0 75 у₇ 8 0 +1 5 75 у₈ 9 +1 +1 10 75 у₉

На поверхности отклика и контурном графике отображены линии уровня поверхности, разделяющие поверхность отклика на 10 зон, обозначенных от 1 до 10 (см.фиг.1). Зоне 1 соответствуют значения количества клеток бактерий от 8,461 до 9,048 log КОЕ/см³; зоне 2 - значения 7,875-8,461 log КОЕ/см³; зоне 3 - значения 7,288-7,875 log КОЕ/см³; зоне 4 - значения 6,701-7,288 log КОЕ/см³; зоне 5 - значения 6,115-6,701 log КОЕ/см³; зоне 6 - значения 5,528-6,115 log КОЕ/см³; зоне 7 - значения 4,941-5,528 log КОЕ/см³; зоне 8 - значения 4,355-4,941 log КОЕ/см³; зоне 9 - значения 3,768-4,355 log КОЕ/см³; зоне 10 - значения 3,181-3,768 log КОЕ/см³.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что для Lactobacillus sakei LSK-45 лучший рост бактерий получают при использовании 7-10 г/дм³ пептона и 55-75 г/дм³ рисовой муки (зона 1 поверхности отклика). И пептон, и рисовая мука стимулируют рост Lactobacillus sakei.

На следующем этапе экспериментальных исследований изучают рост следующих штаммов бактерий при внесении инокулята бактерий в количестве 3-7% от объема питательной среды:

- Lactobacillus sakei LSK-45 (номер в коллекции ВКПМ В-8896);

- Lactobacillus sakei DSM 20017 (номер в коллекции ВКПМ В-10905);

- Lactobacillus sakei LSK-104 (номер в коллекции ВКПМ В-8936);

- Lactobacillus sakei LSK-103 (номер в коллекции ВКПМ В-8932).

При этом в качестве инокулята применяли культуру молочнокислых бактерий вида Lactobacillus sakei, культивирование которой проводят на полужидкой среде MRS в течение (20±4) ч. Содержание жизнеспособных клеток в инокуляте составляет не менее 1⋅108 КОЕ/ см3.

Результаты представлены на фиг. 2 и 3.

Таким образом, было установлено, что оптимальная продолжительность культивирования составляет (24-32) ч при температуре (37±1)°С.

Известно, что жидкая бактериальная закваска не является стойкой при хранении. Снижение количества клеток в жидкой закваске обусловлено кислой реакцией среды, высокой влажностью, отсутствием защитных веществ. Повысить срок хранения бакпрепарата можно с применением криоконсервации. В связи с этим, на следующем этапе исследований проводят замораживание бактерий. Перед проведением замораживания питательную среду центрифугируют, полученную суспензию клеток смешивают с защитной средой в соотношении 2:1. Смесь замораживают при температуре не менее минус 18°С.

Установлено, что после замораживания количество клеток бактерий составляет: для штамма Lactobacillus sakei LSK-45 - 7⋅10⁸ КОЕ/см³, для штамма Lactobacillus sakei DSM 20017 - 1⋅10⁹ КОЕ/см³; для штамма Lactobacillus sakei LSK-104 - 3⋅10⁹ КОЕ/см³, для штамма Lactobacillus sakei LSK-103 - 2⋅10⁹ КОЕ/см³.

На следующем этапе изучают качественные характеристики бактериальной закваски молочнокислых бактерий. В качестве инокулята при производстве закваски применяют культуру молочнокислых бактерий вида Lactobacillus sakei, культивирование которой проводят на полужидкой среде MRS в течение 20±4 ч. Результаты представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Качественная характеристика бактериальной закваски молочнокислых бактерий Lactobacillus sakei Наименование показателя Значение показателя жидкий замороженный Консистенция и внешний вид Густая суспензия бактериальных клеток Цвет От белого до темно-кремового Вкус и запах Чистый, слегка кисловатый, без посторонних привкусов Активная кислотность (рН), ед 6,5±0,5 Температура при выпуске с предприятия, °С, не более 4±2°С не менее минус 12°С Количество бактерий, КОЕ в 1 см³, не менее 1⋅10⁸ Микрокартина Грамположительные палочки, расположенные одиночно, попарно или короткими цепочками Объем продукта (см³), в котором не допускаются:
БГКП (колиформы) 10 Стафилококки S. aureus 10 Патогенные микроорганизмы (в т.ч. сальмонеллы) 100 Дрожжи и плесени, КОЕ/см³, не более 5 в сумме

Предлагаемый способ получения бактериальной закваски молочнокислых бактерий вида Lactobacillus sakei осуществляют следующим образом.

Способ получения бактериальной закваски поясняется графиками, где на фиг. 1 изображена поверхность отклика, отражающая предполагаемый рост штамма Lactobacillus sakei LSK-45 - график показывает влияние двух факторов - содержание пептона и содержание рисовой муки на количество жизнеспособных клеток молочнокислых бактерий (log КОЕ/см³; на фиг.2 изображено изменение количества жизнеспособных клеток четырех штаммов бактерий вида Lactobacillus sakei на среде на основе рисовой муки; на фиг.3 изображено изменение рН в процессе культивирования четырех штаммов бактерий вида Lactobacillus sakei на среде на основе рисовой муки.

Для получения жидкой и замороженной закваски бактерий вида Lactobacillus sakei применяют среду, основанную на рисовой муке. Предварительно рисовую муку (55-75 г/дм³) смешивают с водой и доводят до кипения. Для приготовления питательной среды используют следующие компоненты:

Глюкоза - 15 г,

магний хлористый - 0,3 г,

натрий лимоннокислый трехзамещенный - 1 г,

калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,5 г,

аскорбиновая кислота - 0,1 г,

пептон - (7-10) г/дм³,

отвар на основе рисовой муки - до 1 л.

Питательную среду стерилизуют при (120±1)°С с выдержкой 30 минут и охлаждают до температуры 37°С. В качестве инокулята используют культуру молочнокислых бактерий штаммы Lactobacillus sakei LSK-45, Lactobacillus sakei DSM 20017, Lactobacillus sakei LSK-104, Lactobacillus sakei LSK-103, культивирование которых проводят на полужидкой среде MRS в течение (20±4) ч, которую вносят в количестве 5% от объема питательной среды. Наращивание клеток бактерий проводят в течение (24-32) ч. Полученную бактериальную массу охлаждают до (4±2)°С, отделяют от культуральной среды центрифугированием, смешивают с защитной средой в соотношении 2:1, разливают по флаконам, замораживают при температуре не менее минус 18°С.

При получении замороженной закваски применяют защитную среду следующего состава: сахароза - 10%, натрий лимоннокислый - 2%, дистиллированная вода - остальное. Защитную среду стерилизуют при температуре (121±1)°С в течение 30 минут, затем среду охлаждают и хранят до использования.

Примеры, подтверждающие возможность осуществления способа получения бактериальной закваски:

Пример 1

Приготовление жидкой бактериальной закваски.

При получении жидкой бактериальной закваски молочнокислых бактерий используют питательную среду на основе рисовой муки. Для приготовления питательной среды рисовую муку в количестве 55 г/дм³ смешивают с водой и доводят до кипения. Готовят питательную среду следующего состава:

глюкоза - 15 г,

магний хлористый - 0,3 г,

натрий лимоннокислый трехзамещенный - 1 г,

калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,5 г,

аскорбиновая кислота - 0,1 г,

пептон - 10 г,

отвар на основе рисовой муки - до 1 л (содержание рисовой муки 55 г/дм³).

Готовую среду стерилизуют при (121±1)°С с выдержкой 30 минут и охлаждают до 37°С. Затем в среду вносят инокулят молочнокислых бактерий, содержащий штамм Lactobacillus sakei LSK-45 в количестве 3% и наращивают клетки в течение 32 ч. По окончании процесса бактериальную массу охлаждают до 4°С. Затем отделяют клетки от культуральной среды центрифугированием и разливают по флаконам. Флаконы с бактериальной закваской закрывают стерильными пробками и закатывают металлическими колпачками. Жидкую бактериальную закваску молочнокислых бактерий хранят до 3-х месяцев при температуре (4±2)°С.

Пример 2

Приготовление замороженной бактериальной закваски.

При получении жидкой бактериальной закваски молочнокислых бактерий используют питательную среду на основе рисовой муки. Для приготовления питательной среды рисовую муку в количестве 75 г/дм³ смешивают с водой и доводят до кипения. Готовят питательную среду следующего состава:

глюкоза - 15 г,

магний хлористый - 0,3 г,

натрий лимоннокислый трехзамещенный - 1 г,

калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,5 г,

аскорбиновая кислота - 0,1 г,

пептон - 7 г,

отвар на основе рисовой муки - до 1 л (содержание рисовой муки 75 г/дм³).

Готовую среду стерилизуют при (121±1)°С с выдержкой 30 минут и охлаждают до (37±1)°С. Затем в среду вносят инокулят молочнокислых бактерий, содержащий штамм Lactobacillus sakei DSM 20017 в количестве 5% и наращивают клетки в течение 24 ч. По окончании процесса бактериальную массу охлаждают до 4°С.

Полученную бактериальную закваску перемешивают, отделяют клетки от культуральной среды центрифугированием, добавляют защитную среду в соотношении 2:1. В составе среды используют следующие компоненты:

Сахароза - 10%;

Натрий лимоннокислый трехзамещенный - 2%;

Дистиллированная вода - остальное.

Полученную смесь в стерильных условиях разливают в стеклянные флаконы по 2 мл и замораживают при температуре не менее минус 18°С. Флаконы закрывают стерильными пробками и закатывают металлическими колпачками. Замороженную закваску хранят до 6 месяцев при температуре не менее минус 12°С.

Пример 3

Приготовление жидкой бактериальной закваски.

При получении жидкой бактериальной закваски молочнокислых бактерий используют питательную среду на основе рисовой муки. Для приготовления питательной среды рисовую муку в количестве 65 г/дм³ смешивают с водой и доводят до кипения. Готовят питательную среду следующего состава:

глюкоза - 15 г,

магний хлористый - 0,3 г,

натрий лимоннокислый трехзамещенный - 1 г,

калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,5 г,

аскорбиновая кислота - 0,1 г,

пептон - 10 г,

отвар на основе рисовой муки - до 1 л (содержание рисовой муки 65 г/дм³).

Готовую среду стерилизуют при (121±1)°С с выдержкой 30 минут и охлаждают до 37°С. Затем в среду вносят инокулят молочнокислых бактерий, содержащий штамм Lactobacillus sakei LSK-103 в количестве 7% и наращивают клетки в течение 28 ч. По окончании процесса бактериальную массу охлаждают до 4°С. Затем отделяют клетки от культуральной среды центрифугированием и разливают по флаконам. Флаконы с бактериальной закваской закрывают стерильными пробками и закатывают металлическими колпачками. Жидкую бактериальную закваску молочнокислых бактерий хранят до 3-х месяцев при температуре (4±2)°С.

Пример 4

Приготовление замороженной бактериальной закваски.

При получении жидкой бактериальной закваски молочнокислых бактерий используют питательную среду на основе рисовой муки. Для приготовления питательной среды рисовую муку в количестве 75 г/дм³ смешивают с водой и доводят до кипения. Готовят питательную среду следующего состава:

глюкоза - 15 г,

магний хлористый - 0,3 г,

натрий лимоннокислый трехзамещенный - 1 г,

калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,5 г,

аскорбиновая кислота - 0,1 г,

пептон - 7 г,

отвар на основе рисовой муки - до 1 л (содержание рисовой муки 75 г/дм³).

Готовую среду стерилизуют при (121±1)°С с выдержкой 30 минут и охлаждают до 37±1°С. Затем в среду вносят инокулят молочнокислых бактерий, содержащий штамм Lactobacillus sakei LSK-104 в количестве 3% и наращивают клетки в течение 24 ч. По окончании процесса бактериальную массу охлаждают до 4°С.

Полученную бактериальную закваску перемешивают, отделяют клетки от культуральной среды центрифугированием, добавляют защитную среду в соотношении 2:1. В составе среды используют следующие компоненты:

Сахароза - 10%;

Натрий лимоннокислый трехзамещенный - 2%;

Дистиллированная вода - остальное.

Полученную смесь в стерильных условиях разливают в стеклянные флаконы по 2 мл и замораживают при температуре не менее минус 18°С. Флаконы закрывают стерильными пробками и закатывают металлическими колпачками. Замороженную закваску хранят до 6 месяцев при температуре не менее минус 12°С.

Предлагаемое изобретение «Способ получения бактериальной закваски» по сравнению с прототипом (см. Хамагаева И.С., Хазагаева С.Н., Марадудина И.П. Оптимизация питательной среды для получения гипоаллергенного биопрепарата // Вестник ВСГУТУ. 2017. №3 (66) С. 93-96) обладает следующими преимуществами:

- новые условия культивирования молочнокислых бактерий, а именно использование в качестве инокулята культуры молочнокислых бактерий штаммы Lactobacillus sakei LSK-45, Lactobacillus sakei DSM 20017, Lactobacillus sakei LSK-104, или Lactobacillus sakei LSK-103;

- применение в качестве основы питательной среды рисовой муки, не содержащей лактозу, что позволяет получить бактериальную закваску, которую возможно применять для производства безлактозных пищевых продуктов.

- приготовление отвара на основе рисовой муки - менее трудоемкий процесс по сравнению с приготовлением рисового отвара на основе зерен риса.

Изобретение относится к биотехнологии. Предложен способ получения бактериальной закваски молочнокислых бактерий вида Lactobacillus sakei, включающий культивирование штаммов Lactobacillus sakei LSK-45, Lactobacillus sakei DSM 20017, Lactobacillus sakei LSK-104 или Lactobacillus sakei LSK-103 на питательной среде из отвара на основе рисовой муки, приготовленном из расчета 55-75 г рисовой муки на 1 л воды, и содержащей пептон в количестве 7-10 г/дм³. Изобретение обеспечивает создание бактериальной закваски бактерий вида Lactobacillus sakei, не содержащей лактозу и обладающей повышенной биохимической активностью. 3 ил., 3 табл., 4 пр.

Способ получения бактериальной закваски молочнокислых бактерий вида Lactobacillus sakei, предусматривающий приготовление питательной среды, внесение инокулята, наращивание клеток, отделение бактериальной массы от культуральной среды, смешивание ее с защитной средой, розлив, замораживание, отличающийся тем, что в качестве инокулята используют культуру молочнокислых бактерий Lactobacillus sakei штаммов Lactobacillus sakei LSK-45, Lactobacillus sakei DSM 20017, Lactobacillus sakei LSK-104 или Lactobacillus sakei LSK-103, а в качестве питательной среды применяют отвар на основе рисовой муки, приготовленный из расчета 55-75 г рисовой муки на 1 л воды, в составе питательной среды применяют пептон в количестве 7-10 г/дм³.