АНТИТЕЛО К CD40, ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ И ЕГО МЕДИЦИНСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2022 года по МПК C07K16/28 C12N15/13 A61K39/395 

Настоящая заявка испрашивает приоритет согласно заявке на патент Китая №CN201710402559.0, поданной 1 июня 2017 г. Полное содержание вышеупомянутой заявки включено в данный документ посредством ссылки.

Область техники изобретения

Настоящее изобретение относится к антителу к CD40, его антигенсвязывающему фрагменту, химерному антителу или гуманизированному антителу, содержащему CDR-области антитела к CD40, и фармацевтической композиции, содержащей антитело к CD40 человека и его антигенсвязывающий фрагмент, и его применению в качестве противоракового лекарственного средства.

Предпосылки изобретения

Как один из главных факторов, угрожающих здоровью, рак является серьезной проблемой, с которой человечество столкнется в долгосрочной перспективе. Такие средства терапии, как традиционное хирургическое вмешательство, химиотерапия и лучевая терапия, часто характеризуются ограниченным эффектом при лечении диссеминированных солидных опухолей. Иммунотерапия опухолей, особенно Т-клеточная иммунотерапия, является предметом повышенного интереса в области терапии опухолей. Иммунотерапия опухолей обеспечивает уничтожение опухолей за счет полной активации Т-клеток-киллеров у пациентов с опухолью, что может быть наиболее эффективным и безопасным способом лечения опухолей. Иммунотерапия опухолей в настоящее время показала многообещающие перспективы в лечении нескольких различных типов рака, включая диссеминированные метастатические опухоли.

В активации Т-клеток в организме человека задействована система, включающая два сигнальных пути. В дополнение к обеспечению первого сигнала Т-клеткам путем презентации пептидов МНС-антигена посредством антигенпрезентирующей клетки (АРС) требуется ряд костимулирующих молекул для обеспечения второго сигнала с активированием тем самым нормальных иммунных ответов Т-клеток. Эта система двойного сигнального пути играет решающую роль в балансе иммунной системы in vivo, которая строго регулирует организм, чтобы активировать различные иммунные ответы на собственные и чужеродные антигены. Отсутствие второго сигнала, обеспечиваемого костимулирующей молекулой, приведет к сбоям в ответах Т-клеток или потере устойчивых специфических иммунных ответов, что в результате приведет к иммунной толерантности. Следовательно, второй сигнальный путь играет очень важную роль в регуляции всего процесса иммунного ответа.

CD40 является одним из гликопротеинов, экспрессируемых на поверхности клетки. Это мембранный внутренний гликопротеин I типа размером 48 кДа, который принадлежит к суперсемейству рецепторов фактора некроза опухолей (TNFR) и играет решающую роль в иммунной системе. Он экспрессируется в различных иммунных клетках, таких как В-клетки, дендритные клетки, моноциты и макрофаги. Когда передача сигнала опосредуется CD40, будут активированы специализированные антигенпрезентирующие клетки. Природный лиганд CD40 обозначен как CD154 или CD40L и, как известно, преимущественно экспрессируется в зрелых Т-лимфоцитах. CD40L-опосредованная передача сигнала может инициировать ряд клеточных биологических событий, включая активацию и пролиферацию иммунных клеток, а также продуцирование цитокинов и хемокинов. Передача сигналов с участием CD40 чрезвычайно важна для Т-клеточнозависимых иммунных ответов, особенно в контексте опухолевой среды. CD40-стимулированные дендритные клетки способны активировать опухолеспецифические эффекторные Т-клетки, которые обладают потенциалом уничтожения опухолевых клеток.

Экспрессия CD40 была обнаружена во множестве нормальных клеток и опухолевых клеток, включая B-лимфоциты. Например, меланома является опухолью, экспрессирующей CD40, в то время как 30% - 70% солидных опухолей также экспрессируют CD40. В настоящее время известно, что активация CD40 может обеспечивать эффективный запуск противоопухолевых ответов (Tong et al., Cancer Gene Therapy, 2003, 10: 1-13), включая иммунную активацию опухолеспецифических Т-клеточных ответов, прямой апоптоз CD40-положительных опухолей и гуморальную реакцию ADCC, вызванную стимуляцией. Кроме того, наблюдаемое уничтожение опухоли тесно связано с появлением цитотоксических Т-лимфоцитов с опухолевой специфичностью. Между тем, также не следует игнорировать тот факт, что системное введение антител к CD40 обычно связано с различными побочными эффектами, такими как шоковый синдром и синдром высвобождения цитокинов (van Mierlo et al., Proc. Nat1. Acad. Sci. USA, 2002, 99: 5561-5566).

В настоящее время ряд международных фармацевтических компаний разрабатывают моноклональные антитела к CD40, которые специфически стимулируют иммунную активацию, повышая до максимума реакцию собственной иммунной системы пациентов в отношении опухолей, с достижением тем самым цели уничтожения опухолевых клеток. Связанные патенты включают CN1198647, CN1369015, CN1582165, CN100430419, CN101014386, CN101237882, CN101289510, CN101490086, CN103842382, CN104918957, WO2002028904, WO2011123489, WO2012149356, WO2013034904, WO2015091853, WO2016196314, WO2017040932 и WO2017004006 и т.д. На сегодняшний день антитела к CD40 от Pfizer (родственные продукты были лицензированы Roche), Alligator и других компаний, которые, как было установлено, имеют хорошие противоопухолевые эффекты на доклинических моделях животных, вступили в фазу I клинических испытаний.

Настоящее изобретение направлено на обеспечение антитела к CD40 с высокой аффинностью, высокой избирательностью и высокой биологической активностью, а также лекарственного средства/композиции для терапии рака и способа на его основе для активации иммунных ответов путем стимуляции CD40 и пути с его участием.

Краткое описание изобретения

Настоящее изобретение предусматривает антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область легкой цепи антитела, содержащую по меньшей мере одну LCDR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51, SEQ ID NO: 52, SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 или SEQ ID NO: 60; и/или

вариабельную область тяжелой цепи антитела, содержащую по меньшей мере одну HCDR, выбранную из группы, состоящей из SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48, SEQ ID NO: 49, SEQ ID NO: 55, или SEQ ID NO: 56, или SEQ ID NO: 57.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, где вариабельная область легкой цепи антитела содержит LCDR1, имеющую последовательность под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 50 или SEQ ID NO: 58.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, где вариабельная область легкой цепи антитела содержит LCDR2, имеющую последовательность под SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 51 или SEQ ID NO: 59.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, где вариабельная область легкой цепи антитела содержит LCDR3, имеющую последовательность под SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 44, SEQ ID NO: 52 или SEQ ID NO: 60.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, где вариабельная область легкой цепи антитела содержит HCDR1, имеющую последовательность под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 47 или SEQ ID NO: 55.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, где вариабельная область легкой цепи антитела содержит HCDR2, имеющую последовательность под SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 48 или SEQ ID NO: 56.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, где вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит HCDR3, имеющую последовательность под SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 41, SEQ ID NO: 49 или SEQ ID NO: 57.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, где вариабельная область легкой цепи антитела содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 соответственно.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, где вариабельная область легкой цепи антитела содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 соответственно.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, где вариабельная область легкой цепи антитела содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44 соответственно.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, где вариабельная область легкой цепи антитела содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52 соответственно.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, где вариабельная область легкой цепи антитела содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 и SEQ ID NO: 60 соответственно.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, где вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 соответственно.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, где вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13 соответственно.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, где вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 41 соответственно.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, где вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 49 соответственно.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, где вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 57 соответственно.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, где вариабельная область легкой цепи антитела содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 соответственно, или LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 соответственно, или LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44 соответственно, или LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52 соответственно, или LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 и SEQ ID NO: 60 соответственно; и

вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 соответственно, или HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13 соответственно, или HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 41 соответственно, или HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 49 соответственно, или HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 57 соответственно.

Особенно предпочтительные антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть выбраны из группы, состоящей из следующего:

(1) вариабельная область легкой цепи антитела содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 соответственно, и вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 соответственно;

(2) вариабельная область легкой цепи антитела содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 соответственно, и вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13 соответственно;

(3) вариабельная область легкой цепи антитела содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44 соответственно, и вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 41 соответственно;

(4) вариабельная область легкой цепи антитела содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52 соответственно, и вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 49 соответственно;

(5) вариабельная область легкой цепи антитела содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 и SEQ ID NO: 60 соответственно, и вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 57 соответственно.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения вариабельная область легкой цепи антитела имеет последовательность под SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 10; вариабельная область тяжелой цепи антитела имеет последовательность под SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 9.

Вышеупомянутые антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент могут представлять собой мышиное антитело или химерное антитело.

Предпочтительно аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи мышиного антитела или химерного антитела представлена под SEQ ID NO: 1, а аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена под SEQ ID NO: 2; или

аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена под SEQ ID NO: 9, а аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена под SEQ ID NO: 10; или

аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (LCVR) представлена под SEQ ID NO: 38, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (HCVR) представлена под SEQ ID NO: 37; или

аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (LCVR) представлена под SEQ ID NO: 46, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (HCVR) представлена под SEQ ID NO: 45; или

аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (LCVR) представлена под SEQ ID NO: 54, а аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (HCVR) представлена под SEQ ID NO: 53.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой мышиное антитело или его фрагмент.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены мышиное антитело или его фрагмент, описанные выше, где вариабельная область легкой цепи антитела дополнительно содержит FR-область легкой цепи из мышиной κ-, λ-цепи или ее варианты.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены мышиное антитело или его фрагмент, описанные выше, дополнительно содержащие константную область легкой цепи из мышиной κ-, λ-цепи или ее варианты.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены мышиное антитело или его фрагмент, описанные выше, где вариабельная область тяжелой цепи антитела дополнительно содержит FR-область тяжелой цепи из мышиного IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или ее варианты.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены мышиное антитело или его фрагмент, описанные выше, дополнительно содержащие константную область тяжелой цепи из мышиного IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или ее варианты.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, которые могут представлять собой химерное антитело или его фрагмент.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены химерное антитело к CD40 или его фрагмент, описанные выше, где последовательность вариабельной области легкой цепи представлена под SEQ ID NO: 2 или SEQ ID NO: 10.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены химерное антитело к CD40 или его фрагмент, описанные выше, где последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена под SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 9.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены химерное антитело к CD40 или его фрагмент, описанные выше, дополнительно содержащие константную область легкой цепи из человеческой κ-, λ-цепи или ее варианты.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены химерное антитело к CD40 или его фрагмент, описанные выше, дополнительно содержащие константную область тяжелой цепи из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 человека или ее варианты.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, которые представляют собой антитело человека или его фрагмент.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, которые представляют собой гуманизированное антитело или его фрагмент.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитело к CD40 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, где антитело человека имеет последовательность под SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20, или ее варианты; предпочтительно варианты характеризуются 0-10 мутациями аминокислот в легкой цепи, более предпочтительно мутации осуществлены по положениям 2 и 3, и в результате обеих мутаций происходит замена на аминокислоты, предпочтительно представляющие собой I, V или L.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитело к CD40 человека или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, где антитело человека имеет последовательность под SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 19, или ее варианты; предпочтительно варианты характеризуются 0-10 мутациями аминокислот в легкой цепи, более предпочтительно мутации осуществлены по положениям 6 и 8, и в результате обеих мутаций происходит замена на аминокислоты, предпочтительно представляющие собой I, A или L.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены человеческое антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, дополнительно содержащие константную область IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 или ее варианты.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены гуманизированное антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, дополнительно содержащие FR-область легкой цепи из человеческой κ-, λ-цепи или ее варианты.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены гуманизированное антитело к CD40 или его фрагмент, описанные выше, где последовательность FR-области легкой цепи в вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела получена из человеческой последовательности IGkV1-33 легкой цепи зародышевого типа, представленной под SEQ ID NO: 22, или получена из человеческой последовательности IGkV2-28 легкой цепи зародышевого типа, представленной под SEQ ID NO: 24.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены гуманизированное антитело к CD40 или его фрагмент, описанные выше, где последовательность легкой цепи гуманизированного антитела представляет собой последовательность, представленную под SEQ ID NO: 33 или SEQ ID NO: 34, или ее варианты.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены гуманизированное антитело к CD40 или его фрагмент, описанные выше, где последовательность легкой цепи гуманизированного антитела представляет собой последовательность, представленную под SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20, или ее варианты.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены гуманизированное антитело к CD40 или его фрагмент, описанные выше, где варианты вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела предпочтительно характеризуются 0-10 мутациями аминокислот в легкой цепи, более предпочтительно мутации осуществлены по положениям 2 и 3, и в результате обеих мутаций происходит замена на аминокислоты, предпочтительно представляющие собой I, V или L.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены гуманизированное антитело к CD40 или его фрагмент, описанные выше, дополнительно содержащие константную область легкой цепи человеческой κ-, λ-цепи или ее варианты.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены гуманизированное антитело к CD40 или его фрагмент, описанные выше, дополнительно содержащие FR-область тяжелой цепи из IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 человека или ее варианты.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены гуманизированное антитело к CD40 или его фрагмент, описанные выше, где FR-область тяжелой цепи вариабельной области из тяжелой цепи получена из человеческой последовательности IGHV1-69 тяжелой цепи зародышевого типа, представленной под SEQ ID NO: 21, или получена из человеческой последовательности IGHV1-2 тяжелой цепи зародышевого типа, представленной под SEQ ID NO: 23.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены гуманизированное антитело к CD40 или его фрагмент, описанные выше, где последовательность тяжелой цепи гуманизированного антитела представлена под SEQ ID NO: 26 или SEQ ID NO: 30, или ее варианты.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены гуманизированное антитело к CD40 или его фрагмент, описанные выше, где последовательность тяжелой цепи гуманизированного антитела представлена под SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 19, или ее варианты, предпочтительно варианты характеризуются 0-10 мутациями аминокислот в вариабельной области тяжелой цепи, более предпочтительно мутации осуществлены по положениям 6 и 8, и в результате мутаций происходит замена на аминокислоты, предпочтительно представляющие собой I, A или L.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены гуманизированное антитело к CD40 или его фрагмент, описанные выше, дополнительно содержащие константную область тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 человека или ее варианты, предпочтительно FR-область тяжелой цепи IgG1, IgG2 или IgG4, более предпочтительно FR-область тяжелой цепи IgG1 или IgG2.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены антитело к CD40 или антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше, где антигенсвязывающий фрагмент представляет собой Fab, Fv, sFv, F (ab’)₂, линейное антитело, одноцепочечное антитело, нанотело, доменные антитела или полиспецифическое антитело.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает последовательность ДНК, кодирующую антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, полиспецифическое антитело или одноцепочечное антитело, описанные выше.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает вектор экспрессии, содержащий последовательность ДНК, описанную выше.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает клетки-хозяева, трансформированные вектором экспрессии, описанным выше.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предусмотрены клетки-хозяева, описанные выше, где клеткой-хозяином является бактерия, предпочтительно Escherichia coli.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетки-хозяева, описанные выше, представляют собой дрожжи, предпочтительно Pichia pastoris.

В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения клетки-хозяева, описанные выше, представляют собой клетки млекопитающих, предпочтительно клетки яичника китайского хомячка (CHO) или клетки эмбриональной почки человека (HEK) 293.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает одноцепочечное антитело, предусматривающее антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает полиспецифическое антитело, предусматривающее антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные выше.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает конъюгат антитело-лекарственное средство, содержащий вариабельную область легкой цепи и/или вариабельную область тяжелой цепи антитела к CD40, описанного выше. Конъюгаты антитело-лекарственное средство хорошо известны в данной области техники и образуются путем соединения антитело-линкер-лекарственное средство (токсин), и известные линкеры включают расщепляемые линкеры, суб-расщепляемые линкеры, такие как линкеры, включая без ограничения SMCC, SPDP и т.п. Токсины также хорошо известны в данной области техники, такие как DM1, DM4, MMAE, MMAF и тому подобные.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает фармацевтическую композицию, содержащую антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, полиспецифическое антитело или одноцепочечное антитело и фармацевтически приемлемые вспомогательное вещество, разбавитель или носитель, описанные выше.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает применение антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента, полиспецифического антитела, одноцепочечного антитела, конъюгата антитело-лекарственное средство или фармацевтической композиции, описанных выше, при изготовлении лекарственного препарата, предназначенного для лечения или предупреждения опосредованного CD40 или CD40L заболевания или состояния; где заболевание предпочтительно представляет собой рак; при этом рак наиболее предпочтительно представляет собой лимфому, рак молочной железы, рак яичника, рак простаты, рак поджелудочной железы, рак почки, рак легкого, рак печени, рак желудка, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рабдомиосаркому, рак пищевода, рак шейки матки, множественную миелому, лейкоз, рак желчного пузыря, глиобластому и меланому.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает способ лечения и предупреждения заболевания или состояния, опосредованного CD40 или CD40L, при этом способ включает введение субъекту терапевтически эффективной дозы антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента, полиспецифического антитела, одноцепочечного антитела, конъюгата антитело-лекарственное средство или фармацевтической композиции, описанных выше, где заболевание предпочтительно представляет собой рак; рак наиболее предпочтительно представляет собой лимфому, рак молочной железы, рак яичника, рак простаты, рак поджелудочной железы, рак почки, рак легкого, рак печени, рак желудка, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рабдомиосаркому, рак пищевода, рак шейки матки, множественную миелому, лейкоз, рак желчного пузыря, глиобластому и меланому.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает применение антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента, полиспецифического антитела, одноцепочечного антитела, конъюгата антитело-лекарственное средство или фармацевтической композиции, описанных выше, при изготовлении лекарственного препарата, предназначенного для улучшения в отношении симптомов у пациента с аутоиммунным заболеванием.

Настоящее изобретение дополнительно предусматривает применение антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента, полиспецифического антитела, одноцепочечного антитела, конъюгата антитело-лекарственное средство или фармацевтической композиции, описанных выше, при изготовлении лекарственного препарата, предназначенного для улучшения в отношении симптомов у пациента с воспалительным заболеванием.

Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 показана активация мышиного антитела к CD40 человека на клетках DC на основе молекул, активирующих CD80.

На фиг. 2 показана активация мышиного антитела к CD40 человека на клетках DC на основе молекул, активирующих CD86.

Фиг. 3 представляет собой график, на котором показаны кривые роста опухоли трансплантированной лимфомы Raji, совместно трансплантированной с клетками РВМС и DC человека.

Фиг. 4 представляет собой график, на котором показаны изменения массы тела мышей NOG, трансплантированных Raji-трансплантированной лимфомой, совместно трансплантированной с клетками PBMC и DC человека.

Подробное описание предпочтительного варианта осуществления

1. Определения

Чтобы специалистам в данной области техники было легче понять настоящее изобретение, некоторые технические и научные термины конкретно определены ниже. Если четко не определено иное в других местах в данном документе, все другие технические и научные термины, применяемые в данном документе, имеют значение, которое обычно известно специалисту в области техники, к которой относится настоящее изобретение.

Аминокислотный трехбуквенный код и однобуквенный код, применяемые в настоящем изобретении, описаны в J. Biol. Chem, 243, p3558 (1968).

Термин «антитело», применяемый в настоящем изобретении, относится к иммуноглобулину, который представляет собой структуру тетрапептидной цепи, образованную путем связывания двух идентичных тяжелых цепей и двух идентичных легких цепей посредством межцепочечных дисульфидных связей. Поскольку константная область тяжелой цепи иммуноглобулина обладает разным составом и порядком аминокислот, антигенность разных иммуноглобулинов отличается. Соответственно, иммуноглобулины можно классифицировать на пять классов или можно называть изотипами иммуноглобулинов, а именно IgM, IgD, IgG, IgA и IgE, и соответствующие тяжелые цепи которых представляют собой μ-цепь, δ-цепь, γ-цепь, α-цепь и ε цепь соответственно. Один и тот же тип Ig может быть разделен на разные подклассы в соответствии с различием в аминокислотном составе шарнирной области, а также в количестве и положении дисульфидных связей тяжелой цепи. Например, IgG можно классифицировать на IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Легкие цепи могут быть классифицированы как κ-цепь или λ-цепь в соответствии с различием в константной области. Каждый из пяти классов Ig может иметь κ-цепь или λ-цепь.

В настоящем изобретении легкая цепь антитела по настоящему изобретению может дополнительно содержать константную область легкой цепи, которая предусматривает κ-, λ-цепь человека или мыши, или ее варианты.

В настоящем изобретении тяжелая цепь антитела по настоящему изобретению может дополнительно содержать константную область тяжелой цепи, которая предусматривает IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 человека или мыши, или ее варианты.

Вариабельная область (V-область), состоящая из приблизительно 110 аминокислот, близких к N-концу тяжелой и легкой цепей антитела, значительно варьируется в отношении своей аминокислотной последовательности. Константная область (C-область), состоящая из оставшейся аминокислотной последовательности, близкой к C-концу антитела, является относительно стабильной. Вариабельная область включает три гипервариабельные области (HVR) и четыре относительно консервативные каркасные области (FR). Три гипервариабельные области, которые определяют специфичность антитела, также называют областью, определяющей комплементарность (CDR). Каждая из вариабельной области легкой цепи (VL) и вариабельной области тяжелой цепи (VH) состоит из трех областей CDR и четырех областей FR, расположенных от аминоконца к карбоксиконцу в следующем порядке: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4. Три области CDR легкой цепи относятся к LCDR1, LCDR2 и LCDR3; три области CDR тяжелой цепи относятся к HCDR1, HCDR2 и HCDR3. Количество и положение аминокислотных остатков CDR VL- и VH-областей антител или антигенсвязывающих фрагментов по настоящему изобретению соответствуют известным критериям нумерации согласно IMGT.

Термин «антигенпрезентирующая клетка» или «АРС» представляет собой клетку, которая демонстрирует на своей поверхности чужеродный антиген, образующий комплекс с МНС. Т-клетки распознают этот комплекс посредством Т-клеточного рецептора (TCR). Примеры APC включают без ограничения дендритные клетки (DC), мононуклеарные клетки периферической крови (PBMC), моноциты, B-лимфобласты и дендритные клетки, происходящие из моноцитов (DC). Термин «презентация антигена» относится к процессу, с помощью которого АРС захватывают антигены и обеспечивают их распознавание Т-клетками, например, как компонент конъюгатов MHC-I/MHC-II.

Термин «CD40» относится к рецептору клеточной поверхности, который является членом суперсемейства рецепторов TNF, также известным как TNFRSF5. CD40 повсеместно экспрессируется на поверхности дендритных клеток, В-клеток и макрофагов и представляет собой молекулу, необходимую для выработки и поддержания Т-клеточного иммунитета. Термин «CD40» включает любой вариант или изоформу CD40, которая естественным образом экспрессируется клеткой. Антитела по настоящему изобретению могут быть перекрестно-реагирующими с CD40 из видов, отличных от человека. Альтернативно, антитело может быть специфичным к CD40 человека и может не проявлять перекрестную реактивность с другими видами. CD40 или любой его вариант или изоформа могут быть выделены из клеток или тканей, в которых они экспрессируются естественным путем, или продуцированы с помощью рекомбинантных методик с применением методик, известных в данной области техники и описанных в данном документе. Предпочтительно антитело к CD40 нацеливается на CD40 человека с нормальным профилем гликозилирования.

Термин «рекомбинантное человеческое антитело» включает человеческое антитело, которое получено, экспрессировано, сконструировано или выделено с помощью рекомбинантных методик, и соответствующие методики и способы хорошо известны в данной области, например, (1) антитело, выделенное из трансгенных трансхромосомных животных (например, мыши), содержащих ген иммуноглобулина или гибридомы, полученные из него; (2) антитело, выделенное из клеток-хозяев, трансформированных с возможностью экспрессии антител, таких как трансфектома; (3) антитело, выделенное из библиотеки рекомбинантных комбинаторных антител человека, и (4) антитело, полученное, экспрессированное, сконструированное или выделенное путем сплайсинга последовательности гена иммуноглобулина человека с другими последовательностями ДНК и т.п. Такое рекомбинантное человеческое антитело содержит вариабельные области и константные области, в которых предусмотрено использование не только специфических последовательностей зародышевого типа человеческого иммуноглобулина, кодируемых генами зародышевого типа, но также последующие перестройки и мутации, такие как имеющие место во время созревания антитела.

Термин «мышиное антитело» в настоящем изобретении представляет собой моноклональное антитело к CD40 человека, полученное в соответствии со знаниями и навыками в данной области техники. Исследуемому субъекту вводят антиген CD40 во время получения, а затем выделяют гибридому, экспрессирующую антитело, имеющее необходимую последовательность или функциональные свойства. В предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения мышиное антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент могут дополнительно содержать константную область легкой цепи из мышиной κ-, λ-цепи или ее варианты или дополнительно содержать константную область тяжелой цепи из мышиного IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или ее варианты.

Термин «человеческое антитело» включает антитела, имеющие вариабельные и константные области человеческих последовательностей зародышевого типа иммуноглобулина. Человеческое антитело по настоящему изобретению может включать аминокислотные остатки, не кодируемые последовательностями человеческого иммуноглобулина зародышевого типа (например, мутации, введенные путем случайного или сайт-специфического мутагенеза in vitro или соматической мутации in vivo). Однако термин «человеческое антитело» не включает антитело, в котором последовательность CDR, полученная из зародышевого типа другого вида млекопитающего, такого как мышь, была привита на человеческие каркасные последовательности (т.е. «гуманизированное антитело»).

Термин «гуманизированное антитело», также известное как CDR-привитое антитело, относится к антителу, полученному путем прививания последовательности CDR мыши в каркасные области вариабельной области человеческого антитела. Оно может обеспечивать преодоление интенсивного иммунного ответа, вызванного химерным антителом, несущим большое количество компонентов белка мыши. Чтобы избежать снижения активности, вызванного снижением иммуногенности, вариабельная область антитела человека может быть подвергнута минимальной обратной мутации с целью поддержания активности.

Термин «химерное антитело» представляет собой антитело, образованное путем слияния вариабельной области мышиного антитела с константной областью антитела человека, которое может обеспечивать ослабление иммунного ответа, индуцированного мышиным антителом. Для конструирования химерного антитела сначала конструируют и отбирают гибридому, которая секретирует мышиное специфическое моноклональное антитело, затем ген вариабельной области клонируют из мышиной гибридомной клетки. Затем по мере необходимости клонируют ген константной области антитела человека. Ген вариабельной области мыши и ген константной области человека лигируют в химерный ген и затем встраивают в человеческий вектор, и, наконец, обеспечивают экспрессию молекулы химерного антитела в эукариотической или прокариотической промышленной системе. Константная область человеческого антитела может быть выбрана из константной области тяжелой цепи из человеческого IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 или ее вариантов, при этом она предпочтительно предусматривает константную область тяжелой цепи из человеческого IgG1 или IgG2.

Термин «антигенсвязывающий фрагмент» относится к антигенсвязывающему фрагменту антитела и аналога антитела, который обычно включает по меньшей мере часть антигенсвязывающей области или вариабельной области (например, одну или более CDR) исходного антитела. Фрагмент антитела сохраняет по меньшей мере некоторую специфичность связывания исходного антитела. Как правило, фрагмент антитела сохраняет по меньшей мере 10% исходной связывающей активности при указании в молях. Предпочтительно фрагмент антитела сохраняет по меньшей мере 20%, 50%, 70%, 80%, 90%, 95% или 100% или больше аффинности связывания исходного антитела с мишенью. Примеры антигенсвязывающих фрагментов включают без ограничения Fab, Fab', F(ab')₂, фрагменты Fv, линейные антитела, одноцепочечные антитела, нанотела, доменные антитела и полиспецифические антитела. Варианты сконструированных антител рассматриваются в Holliger and Hudson (2005) Nat. Biotechnol. 23: 1126-1136.

«Fab-фрагмент» состоит из легкой цепи и CH1 и вариабельной области тяжелой цепи. Тяжелая цепь молекулы Fab не может образовывать дисульфидную(-ые) связь (связи) с другой молекулой тяжелой цепи.

Область «Fc» содержит два фрагмента тяжелой цепи, содержащих домены СН1 и СН2 антитела. Два фрагмента тяжелой цепи удерживаются вместе двумя или более дисульфидными связями и гидрофобным взаимодействием доменов СН3.

«Fab'-фрагмент» содержит легкую цепь и часть тяжелой цепи, содержащую домен VH, домен CH1 и область между доменами CH1 и CH2. Таким образом, межцепочечные дисульфидные связи могут образовываться между двумя тяжелыми цепями с образованием молекулы F(ab')₂.

«Фрагмент F(ab')₂» содержит две легкие цепи и две тяжелые цепи, содержащие часть константной области между доменами CH1 и CH2, с образованием тем самым дисульфидных связей между двумя тяжелыми цепями. Таким образом, фрагмент F(ab')₂ состоит из двух фрагментов Fab', удерживаемых вместе дисульфидными связями между двумя тяжелыми цепями.

«Область Fv» содержит вариабельные области как тяжелых, так и легких цепей, но не имеет константной области.

Термин «полиспецифическое антитело» применяется в его самом широком смысле для охвата антител, обладающих специфичностью в отношении множества эпитопов. Эти полиспецифичные антитела включают без ограничения антитела, содержащие вариабельную область тяжелой цепи (VH) и вариабельную область легкой цепи (VL), где единица VH-VL обладает специфичностью в отношении множества эпитопов; антитела, имеющие две или более областей VL и VH, при этом каждая единица VH-VL связывается с разными мишенями или разными эпитопами одной и той же мишени; антитела, имеющие две или более одиночных вариабельных областей, при этом каждая одиночная вариабельная область связывается с разными мишенями или разными эпитопами одной и той же мишени; полноразмерные антитела, фрагменты антител, диатела, биспецифические диатела и триатела, фрагменты антител, которые ковалентно или нековалентно связаны друг с другом, и т.п.

Термин «коньюгат антитело-лекарственное средство» (ADC) относится к антителу или фрагменту антитела, конъюгированному с одной или более гетерологичными химически синтезированными молекулами, включая без ограничения антитело или фрагменты антитела, конъюгированные с цитотоксическими средствами.

Термин «одноцепочечное антитело» представляет собой одноцепочечный рекомбинантный белок, образованный путем соединения вариабельной области тяжелой цепи (VH) и вариабельной области легкой цепи (VL) антитела посредством линкерного пептида, который является наименьшим фрагментом антитела с полными антигенсвязывающими участками.

Термин «фрагмент доменного антитела» представляет собой иммунологически функциональный фрагмент иммуноглобулина, содержащий только вариабельную область тяжелой цепи или цепь вариабельной области легкой цепи. В некоторых случаях две или более VH-областей ковалентно связаны с пептидным линкером с образованием бивалентного фрагмента доменного антитела. Две VH-области бивалентного фрагмента доменного антитела могут нацеливаться на один и тот же или разные антигены.

Применяемый в данном документе термин «связывание с CD40» относится к способности взаимодействовать с CD40 человека. Применяемый в настоящем изобретении термин «антигенсвязывающий участок» относится к трехмерному пространственному участку, который обладает дискретностью на антигене и распознается антителом или антигенсвязывающим фрагментом по настоящему изобретению.

Термин «эпитоп» относится к участку на антигене, который специфически связывается с иммуноглобулином или антителом. Эпитоп может быть образован смежными аминокислотами, несмежными аминокислотами, расположенными рядом благодаря третичному сворачиванию белка. Эпитопы, образованные смежными аминокислотами, обычно сохраняются после воздействия денатурирующих растворителей, тогда как эпитопы, образованные с помощью третичного сворачивания, обычно разрушаются после обработки денатурирующими растворителями. Эпитопы обычно включают по меньшей мере 3-15 аминокислот в уникальной пространственной конформации. Способы определения того, какие эпитопы связаны с данным антителом, хорошо известны в данной области техники, включая анализы с применением иммуноблоттинга и иммунопреципитации и т.п. Способы определения пространственной конформации эпитопов включают методики в данной области техники и методики, описанные в данном документе, такие как рентгенокристаллография и двумерный ядерный магнитный резонанс.

Применяемые в данном документе термины «специфически связывать» или «избирательно связывать» относятся к связыванию антитела с эпитопом на предварительно определенном антигене. Как правило, когда рекомбинантный CD40 человека применяется в качестве анализируемого вещества, а антитело применяется в качестве лиганда, антитело связывается с предварительно определенным антигеном с равновесной константой диссоциации (K_D), составляющей менее чем приблизительно 10^-7 М или даже меньше, при измерении с помощью методик поверхностного плазмонного резонанса (SPR) в приборе, и его аффинность в отношении связывания с предварительно определенным антигеном по меньшей мере вдвое превышает его аффинность в отношении связывания с неспецифическим антигеном (таким как BSA и т.д.), отличным от предварительно определенного антигена или близкородственного антигена. Термин «антитело (антитела), которое(-ые) распознает(-ют) антиген», может применяться в настоящем документе взаимозаменяемо с термином «антитело(антитела), которое(-ые) специфически связывает(-ются)».

Термин «перекрестная реактивность» относится к способности антитела по настоящему изобретению связываться с CD40 из разных видов. Например, антитело по настоящему изобретению, которое связывается с CD40 человека, также может связываться с CD40 из другого вида. Перекрестную реактивность измеряют путем определения специфической реактивности антител с очищенными антигенами в анализах связывания (например, SPR и ELISA) или путем связывания или функциональных взаимодействий антител с клетками, которые физиологически экспрессируют CD40. Способы определения перекрестной реактивности включают стандартные анализы связывания, описанные в данном документе, такие как анализ поверхностного плазмонного резонанса (SPR) или проточная цитометрия.

Термины «подавлять», «подавление», «блокада» или «блокирование» применяются взаимозаменяемо и охватывают как частичное, так и полное подавление/блокаду. Подавление/блокада лиганда предпочтительно снижает или изменяет нормальный уровень или тип активности, что имеет место, когда связывание лиганда происходит без подавления или блокады. Предполагается также, что подавление и блокада включают любое измеримое снижение аффинности связывания лиганда при контакте с антителом к CD40 по сравнению с лигандом, который не контактирует с антителом к CD40.

Предполагается, что термин «подавление роста» (например, с участием клеток) включает любое измеримое снижение роста клеток.

Термины «индуцирование иммунного ответа» и «усиление иммунного ответа» могут применяться взаимозаменяемо и относятся к стимуляции (т.е. пассивной или адаптивной) иммунного ответа на конкретный антиген. Термин «индуцирование», особенно в случае индуцирования CDC или ADCC, относится к стимулированию специфического механизма прямого уничтожения клеток.

«ADCC», описанная в настоящем изобретении, то есть антителозависимая клеточноопосредованная цитотоксичность, означает, что клетки, экспрессирующие рецепторы Fc, непосредственно уничтожают клетки-мишени, покрытые антителами, путем распознавания сегмента Fc антитела. Эффекторная функция ADCC антитела может быть уменьшена или устранена путем модификации сегмента Fc на IgG. Модификация относится к мутациям в константной области тяжелой цепи антитела, таким как мутации, выбранные из группы, состоящей из N297A, L234A, L235A в случае IgG1; химеры IgG2/4, F235E в случае IgG4 и мутации L234A/E235A.

Способы получения и очистки антител и антигенсвязывающих фрагментов хорошо известны и могут быть найдены в уровне техники, например, в Using Antibodies: A Laboratory Manual, Chapters 5-8 and 15, Cold Spring Harbor. Например, мышь можно иммунизировать CD40 человека или его фрагментом, а полученное антитело можно ренатурировать, очищать и подвергать аминокислотному секвенированию традиционным способом. Антигенсвязывающий фрагмент также может быть получен традиционным способом. Антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению генетически сконструированы с введением одной или более FR-областей человека в CDR-область, отличную от человека. Человеческие последовательности FR зародышевого типа доступны на веб-сайте ImMunoGeneTic (IMGT) http://imgt.cines.fr или из The Immunoglobulin FactsBook, 2001 ISBN 014441351.

Сконструированные антитела или антигенсвязывающие фрагменты по настоящему изобретению могут быть получены и очищены традиционными способами. Последовательность cDNA соответствующего антитела может быть клонирована и рекомбинирована в вектор экспрессии GS. Клетки СНО могут стабильно трансфицированы рекомбинантным вектором экспрессии иммуноглобулина. В качестве более рекомендуемого способа, хорошо известного из уровня техники, системы экспрессии млекопитающих будут обеспечивать гликозилирование антител, в частности, на высококонсервативном N-конце FC-области. Стабильные клоны получают путем осуществления экспрессии антител, которые специфически связываются с человеческими антигенами. Положительные клоны размножали в бессывороточной среде в биореакторе для получения антител. Культуральную среду, в которую секретируется антитело, можно очищать и собирать традиционными методиками. Антитело можно концентрировать с помощью фильтрации традиционным способом. Растворимые смеси и мультимеры также можно удалить традиционными способами, такими как молекулярные сита, ионный обмен. Полученный продукт необходимо немедленно заморозить, например, при температуре -70°C, или лиофилизировать.

Антитело по настоящему изобретению относится к моноклональному антителу. Моноклональное антитело (mAb) по настоящему изобретению относится к антителу, полученному из одной клональной клеточной линии, и клеточная линия не ограничена эукариотической, прокариотической или фаговой клональной клеточной линией. Моноклональные антитела или антигенсвязывающие фрагменты можно получать рекомбинантным способом с применением, например, гибридомной технологии, рекомбинантных методик, технологии фагового дисплея, синтетических методик (например, прививание CDR) или других методик из предшествующего уровня техники.

При применении в отношении животного, человека, экспериментального субъекта, клетки, ткани, органа или биологической жидкости термин «введение» и «лечение» относится к приведению экзогенного лекарственного средства, терапевтического средства, диагностического средства или композиции в контакт с животным, человеком, субъектом, клеткой, тканью, органом или биологической жидкостью. «Введение» и «лечение» могут относиться, например, к терапевтическим, фармакокинетическим, диагностическим, исследовательским и экспериментальным способам. Обработка клеток включает приведение реагентов в контакт с клетками, а также приведение реагентов в контакт с жидкостью, где жидкости находятся в контакте с клетками. «Введение» и «лечение» также означает обработку, например, клеток in vitro и ex vivo с помощью реагентов, средств диагностики, связывающих композиций или другой клетки. «Лечение», при применении к человеку, ветеринарному или исследовательскому субъекту, относится к терапевтическому лечению, профилактическим или превентивным мерам, к исследовательским и диагностическим путям применения.

«Терапия» означает введение терапевтического средства для внутреннего или наружного применения, такого как композиция, содержащая любое из связывающих соединений по настоящему изобретению, пациенту, имеющему один или более симптомов заболевания, в отношении которых, как известно, терапевтическое средство обладает терапевтическим эффектом. Как правило, терапевтическое средство вводят в количестве, которое обеспечивает эффективное ослабление симптомов одного или более заболеваний у пациента или популяции, подлежащих лечению, будь то путем индуцирования дегенерации таких симптомов или подавления прогрессирования таких симптомов до какой-либо не подлежащей клиническому измерению степени. Количество терапевтического средства (также называемого «терапевтически эффективным количеством»), эффективного для ослабления симптомов какого-либо конкретного заболевания, может варьироваться в зависимости от множества факторов, таких как состояние заболевания, возраст и вес пациента, а также способности лекарственного средства вызывать необходимый эффект у пациента. Насколько были ослаблены симптомы заболевания, можно оценить с помощью любого метода клинических испытаний, обычно применяемого врачом или другими специалистами в области здравоохранения для оценки тяжести или прогрессирования заболевания. Несмотря на то, что варианты осуществления настоящего изобретения (например, терапевтические способы или препараты) могут быть неэффективными в ослаблении симптомов целевого заболевания, общих для каждого пациента, установлено, что симптомы целевого заболевания должны быть ослаблены у статистически значимого числа пациентов в соответствии с любыми способами статистических исследований, известными в данной области техники, такими как t-критерий Стьюдента, критерий хи-квадрат, U-критерий Манна-Уитни, критерий Крускала-Уоллиса (H-критерий), критерий Джонкхиера-Терпстра и критерий Уилкоксона.

«Консервативная модификация» или «консервативная замена или замещение» относится к замене аминокислот в белках другой аминокислотой, имеющей сходные характеристики (например, заряд, размер боковой цепи, гидрофобность/гидрофильность, конформацию и жесткость остова и т.п.), так, чтобы можно было часто осуществлять изменения без изменения биологической активности белка. Специалистам в данной области техники известно, что, как правило, одна аминокислотная замена в несущественной области полипептида существенно не изменяет биологическую активность (см., например, Watson et al. (1987) Molecular Biology of the Gene, The Benjamin/Cummings Pub. Co., Page 224 (4^th edition)). Кроме того, замены структурно или функционально сходных аминокислот вряд ли нарушат биологическую активность. Общие консервативные замены аминокислот являются следующими.

Термин «состоящий по существу из» или его вариации, применяемые по всему описанию изобретения и формуле изобретения, включает все такие элементы или группы элементов и необязательно включает другие элементы, которые похожи или отличаются по природе от указанных элементов, при этом другие элементы существенно не меняют основные или новые свойства данной схемы введения дозы, способа или композиции. В качестве неограничивающего примера связывающее соединение, состоящее по существу из указанной аминокислотной последовательности, может также включать одну или более аминокислот, которые не оказывают значительного влияния на свойства связывающего соединения.

Термин «встречающийся в природе», применяемый в отношении объекта в соответствии с настоящим изобретением, относится к тому факту, что объект может быть обнаружен в природе. Например, полипептидная последовательность или полинуклеотидная последовательность, присутствующая в организме (включая вирусы), которую можно выделить из природного источника и которая не была намеренно искусственно модифицирована в лаборатории, является встречающейся в природе.

«Эффективное количество» включает количество, достаточное для ослабления или предупреждения симптома или признака болезненного состояния. Эффективное количество также означает количество, достаточное для того, чтобы обеспечивать или облегчать диагностику. Эффективное количество для конкретного пациента или ветеринарного субъекта может варьироваться в зависимости от таких факторов, как состояние, подлежащее лечению, общее состояние здоровья пациента, путь и доза способа введения и тяжесть побочных эффектов. Эффективным количеством может быть максимальная доза или схема введения дозы, позволяющие избежать значительных побочных эффектов или токсических эффектов.

«Экзогенный» относится к веществу, которое продуцируется вне живого организма, клетки или человеческого организма в соответствии с окружением. «Эндогенный» относится к веществу, продуцируемому в клетке, организме или организме человека в соответствии с окружением.

«Гомология» относится к сходству последовательностей между двумя полинуклеотидными или полипептидными последовательностями. Если положения в обеих сравниваемых последовательностях заняты одной и той же мономерной субъединицей, представляющей собой основание или аминокислоту, например, если каждое положение двух молекул ДНК занято аденином, то молекула является гомологичной по этому положению. Процент гомологии между двумя последовательностями является функцией числа совпадающих или гомологичных положений, общих для двух последовательностей, деленного на число сравниваемых положений × 100%. Например, когда последовательности оптимально выровнены, если 6 из 10 положений в двух последовательностях совпадают или являются гомологичными, то эти две последовательности являются на 60% гомологичными. В целом сравнения производят, когда получен максимальный процент гомологии путем выравнивания двух последовательностей.

Применяемые в данном документе выражения «клетка», «клеточная линия» и «культура клеток» могут применяться взаимозаменяемо, и все такие наименования включают их потомство. Таким образом, слова «трансформант» и «трансформированные клетки» включают первичные исследуемые клетки и полученные из них культуры независимо от количества переносов. Следует также понимать, что все потомство может не быть полностью идентичным с точки зрения содержания ДНК вследствие преднамеренных или непреднамеренных мутаций. Включено мутантное потомство, имеющее ту же функцию или биологическую активность, что и подвергнутая скринингу в первоначально трансформированной клетке. Когда подразумеваются разные названия, они четко различимы из контекста.

«Необязательный» или «необязательно» означает, что событие или среда, описанные впоследствии, могут, но не обязательно, иметь место, в том числе, если событие или среда имеют место или не имеют место. Например, «необязательно содержащий 1-3 вариабельные области тяжелой цепи антитела» означает, что вариабельная область тяжелой цепи антитела с конкретной последовательностью может присутствовать, но не обязательно.

«Фармацевтическая композиция» означает смесь, содержащую одно или более соединений, описанных в данном документе, или их физиологически/фармацевтически приемлемую соль или пролекарство и другие химические компоненты, а также другие компоненты, такие как физиологические/фармацевтически приемлемые носители и вспомогательные вещества. Цель фармацевтической композиции состоит в том, чтобы обеспечивать введение в организм, что способствует абсорбции активного ингредиента и тем самым оказывает биологическую активность.

Подробное описание предпочтительного варианта осуществления

Следующие примеры дополнительно иллюстрируют настоящее изобретение и не должны рассматриваться как ограничивающие настоящее изобретение. Экспериментальные способы без указания конкретных условий в вариантах осуществления по настоящему изобретению обычно проводят в соответствии с традиционными условиями, такими как в Using Antibodies: A Laboratory Manual, or Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory; или в соответствии с условиями, рекомендованными производителем сырьевого материала или товара. Реагенты без указания источника являются обычными реагентами, приобретенными на рынке.

Пример 1. Иммунный антиген, последовательность подвергнутого скринингу антигена и его получение

His-меченый рекомбинантный белок CD40 человека (h-CD40-his), Fc-меченый рекомбинантный белок CD40 человека (h-CD40-Fc), His-меченый рекомбинантный белок CD40 мыши (m-CD40-his) и His-меченный CD40 макаки-резуса (rhesus-CD40-his), рекомбинантный белок (№ CD0-C52H7) представляли собой очищенный промышленный белок, приобретенный у Acrobiosystems, и источники их соответствующих последовательностей показаны в таблице 1. Эти белки могут быть использованы в экспериментах следующих примеров.

Пример 2. Получение гибридомы антител

Моноклональные антитела к CD40 человека получали с помощью иммунизации мышей, которые представляли собой экспериментальных мышей C57BL/6, самок в возрасте 6-8 недель [Zhao Yan (Suzhou) New Drug Research Center Co., Ltd., номер лицензии на производство животных: 201503259]. Кормовая среда: уровень SPF. Мышей приобретали и кормили в лабораторной среде в течение 1 недели с 12/12-часовой регуляцией цикла свет/темнота при температуре 20-25°С и влажности 40-60%. Мышей, которые адаптировались к окружающей среде, делили на 2 клетки по 5 мышей в каждой клетке.

Иммунный антиген представлял собой Fc-меченный модифицированный рекомбинантный белок CD40 человека (h-CD40-Fc, составленный в фосфатном буфере до концентрации 1 мкг/мкл). Адъювант Фрейнда (Sigma, № лота: F5881/F5506) применяли для эмульгирования, где полный адъювант Фрейнда (CFA) применяли для первичной иммунизации, а адъювант на основе нуклеиновой кислоты (CpG, Sangon Biotech) и алюминия - для инъекций (Imject Alum), Thermo, № лота: PH203866) для оставшейся бустерной иммунизации. Иммунизацию проводили в день 0, день 14, день 28, день 42, день 56 и день 70. Кровь собирали в 21-й, 35-й, 49-й, 63-й и 77-й день для анализа крови, а сыворотку крови мыши выявляли с помощью ELISA для определения титра антител в сыворотке крови мыши.

После четвертой иммунизации проводили слияние клеток селезенки у мышей, у которых титр антител был высоким и имел тенденцию к стабильности в сыворотке крови. Бустерную иммунизацию проводили за 3 дня до слияния и 10 мкг раствора антигена, составленного с фосфатным буфером, вводили интраперитонеально (IP) каждой мыши. Лимфоциты селезенки сливали с клетками Sp2/0 клеточной миеломы (ATCC® CRL-8287TM) с применением оптимизированной PEG-опосредованной стадии слияния с получением клеток гибридомы и отбирали пять моноклональных линий клеток гибридомы с хорошей активностью in vitro.

Пример 3. Анализ связывания ELISA

Связывающие свойства антител к CD40 выявляли с помощью анализа ELISA. Рекомбинантный белок CD40 с his-меткой применяли непосредственно для покрытия, после добавления антитела выявляли активность связывания антитела с антигеном путем добавления вторичного антитела (HRP-конъюгированного антитела к Fc антитела) и субстрата TMB для HRP.

Покрывали 96-луночный планшет для микротитрования с помощью 100 мкл/лунка белка CD40-his человека или макаки-резуса в концентрации 0,5 мкг/мл и инкубировали в течение ночи при 4°C. Планшет трижды промывали промывочным буфером, 250 мкл на лунку. При каждой промывке планшет встряхивали в течение 10 секунд, чтобы обеспечить достаточную очистку. Добавляли 200 мкл блокирующего раствора в каждую лунку и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем планшет трижды промывали с помощью 250 мкл на лунку. Планшет встряхивали в течение 10 секунд при каждом полоскании, чтобы обеспечить достаточную очистку. 100 мкл исследуемого антитела к CD40, разведенного согласно разведениям, добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, затем трижды промывали планшет с помощью 250 мкл промывочного буфера на лунку. Добавляли в каждую лунку 100 мкл HRP-меченого вторичного антитела козы к IgG человека, разведенного при 1:20000 разбавителем, и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем планшет трижды промывали с помощью 250 мкл на лунку. Добавляли в каждую лунку 100 мкл TMB и обеспечивали протекание реакции в течение 15 минут в темноте. Добавляли 50 мкл 0,16 М серной кислоты на лунку. Величину OD измеряли при 450 нм с помощью планшет-ридера Thermo MμltiSkanFc и рассчитывали величину связывания EC50 антитела к CD40 с CD40.

Таблица 2. Связывание при ELISA мышиных гибридомных антител с различными CD40 зародышевого типа

Вариант осуществления 4. Антитело к CD40 блокирует связывание CD40 и CD40L

В этом эксперименте обнаружено, что подвергнутое скринингу антитело к CD40 человека блокирует связывание CD40 человека и CD40L человека, с применением анализа блокирования in vitro. В особенности, Fc-меченым рекомбинантным белком CD40 (h-CD40-Fc) покрывали 96-луночный планшет для микротитрования. После того, как добавляли антитело к CD40 для полного связывания и захвата эпитопа, добавляли his-меченый CD40L. Путем выявления his-метки, рассчитывали количество связанного CD40 с CD40L, а затем рассчитывали значение IC50 антитела CD40, блокирующего активный участок CD40.

Покрывали 96-луночный планшет для микротитрования с помощью 100 мкл/лунка белка CD40-Fc человека или макаки-резуса в концентрации 1 мкг/мл и инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшет трижды промывали промывочным буфером, 250 мкл на лунку. При каждой промывке планшет встряхивали в течение 10 секунд, чтобы обеспечить достаточную очистку. Добавляли 200 мкл блокирующего раствора в каждую лунку и инкубировали в течение 2 часов при комнатной температуре. Затем планшет трижды промывали с помощью 250 мкл на лунку. Планшет встряхивали в течение 10 секунд при каждом полоскании, чтобы обеспечить достаточную очистку. 100 мкл исследуемого антитела к CD40, разведенного согласно разведениям, добавляли в каждую лунку и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре, затем трижды промывали планшет с помощью 250 мкл промывочного буфера на лунку. Добавляли в каждую лунку 100 мкл HRP-меченого вторичного антитела козы к IgG человека, разведенного при 1:2000 разбавителем, и инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем планшет трижды промывали с помощью 250 мкл на лунку. Добавляли в каждую лунку 100 мкл TMB и обеспечивали протекание реакции в течение 15 минут в темноте. Добавляли 50 мкл 0,16 М серной кислоты на лунку. Величину OD измеряли при 450 нм с помощью планшет-ридера Thermo MμltiSkanFc и рассчитывали значение IC50 антитела CD40, блокируещего связывание CD40 с CD40L.

Таблица 3. Результаты ELISA блокирования с помощью hCD40/hCD40L человека

Вариант осуществления 5. Определение аффинности с помощью Biacore

Захваченное антитело человека ковалентно связывали с биосенсорным чипом СМ5 прибора Biacore (Biacore X100, GE) в соответствии со способом, описанным в описании набора для захвата антител человека (№ по кат. BR-1008-39, GE), с захватыванием таким образом определенного количества химерных или гуманизированных антител, подлежащих исследованию на основе аффинности. Затем серия антигенов CD40 при градиенте концентрации (приобретенных у Acrobiosystems) проходила через поверхность чипа, и применяли Biacore X100 (GE) для выявления сигналов протекания реакции в режиме реального времени с получением кривых связывания и диссоциации. После завершения каждого цикла диссоциации биочип ополаскивали и регенерировали с помощью регенерационного раствора, предоставленного в наборе для захвата антител человека. Наборы для аминного связывания (№ по кат. BR-1000-50, GE) приобретали у GE, а буферный раствор HBS-EP + буфер 1 × (pH 7,4) получали из HBS-EP + буфер 10 × (№ по кат. BR-1006-69, GE) путем разбавления водой D. I. Экспериментальные данные аппроксимировали с помощью BiacoreX100 Evaluation Software 2.0 (программное обеспечение GE) с помощью модели связывания (1:1) для получения значений аффинности, как показано в таблицах 10 и 11.

Вариант осуществления 6. Исследование клеточной активности антитела к CD40 на основе репортерного гена

Клетки HEK-Blue CD40L приобретали у Invitrogen (№ по кат. hkb-cd40), которые стабильно трансфицированы геном CD40 человека и NF-κB-опосредованным геномом SEAP. Таким образом, уровень активации сигнального пути с участием CD40 можно охарактеризовать путем выявления секретированного SEAP в супернатанте с помощью QUANTI-Blue (субстрат SEAP). В этом эксперименте жизнеспособность клеток антитела CD40 in vitro оценивали согласно значению EC50 путем выявления активации CD40L клеток HEK-Blue. Клетки HEK-Blue CD40L культивировали в среде DMEM, содержащей 10% FBS, 100 мкг/мл зеоцина и 30 мкг/мл бластицидина, и пассировали 2-3 раза в неделю, и соотношение при пассажах составляло 1:5 или 1:10. При субкультивировании клеток среду удаляли с помощью пипетирования, а клеточный слой ополаскивали с помощью 5 мл 0,25% трипсина. Затем трипсин удаляли с помощью пипетирования, клетки расщепляли в инкубаторе в течение 3-5 минут с последующим суспендированием клеток с помощью свежей средой. Добавляли 100 мкл клеточной суспензии в 96-луночный планшет для культивирования клеток при плотности 5×10⁵ клеток/мл, и культуральная среда представляла собой DMEM, содержащую 10% FBS, 100 мкг/мл зеоцина и 30 мкг/мл бластицидина. Тем временем, только 100 мкл стерильной воды добавляли на периферии 96-луночного планшета. Планшеты инкубировали в инкубаторе в течение 24 часов (37°С, 5% СО₂). После прилипания клеток к стенке в каждую лунку добавляли 100 мкл разведенного с градиентом антитела, подлежащего исследованию. Планшеты инкубировали в инкубаторе в течение 20-24 часов (37°С, 5% СО₂). Затем 40 мкл супернатанта клеток отбирали из каждой лунки в новый 96-луночный планшет с плоским дном, добавляли 160 мкл раствора субстрата QUANTI-Blue и планшет инкубировали в инкубаторе в течение 1-3 часов в темноте. Поглощение при 620 нм измеряли с помощью микропланшет-ридера (Thermo M μlti SkanFc) и значение EC₅₀ рассчитывали для оценки жизнеспособности клеток in vitro для антитела к CD40.

Таблица 4. Показатели клеточной активности антитела к CD40 на основе репортерного гена

Вариант осуществления 7. Анализ активации клеток DC с помощью антитела к cd40

РВМС выделяли из нормальной периферической крови человека, а затем моноциты сортировали с помощью гранул CD14 MACS. К клеткам добавляли среду RPMI 1640, содержащую 10 нг/мл IL4 и 100 нг/мл GM-CSF, и культивировали в течение 6 дней с осуществлением таким образом индуцирования культуры клеток MoDC (дендритные клетки, полученные из моноцитов). Через 6 дней клетки собирали, брали 1×10⁵ клеток и окрашивали с помощью CD209-PE, CD1a-PerCP/Cy5.5 и CD14-PE/Cy7 и применяли FACS для анализа, успешно ли были индуцированы MoDC (все вышеуказанные операции являются традиционными операциями в данной области техники). Успешно индуцированные DC собирали и добавляли соответственно ряд исследуемых антител и эталонные антитела с соответствующими градиентами концентрации (см. фигуру 1 для градиентной концентрации антитела). Через 48 часов культивирования клетки собирали и затем окрашивали с помощью CD80, CD86 и HLA-DR, а данные собирали с помощью анализа FACS. Согласно данным анализа активации первичных клеток DC, все пять мышиных антител продемонстрировали значительную активность и активировали молекулы активации CD80 и CD86 на поверхности DC дозозависимым образом. Общий эффект пяти антител является сопоставимым или немного лучше, чем у двух эталонных антител (CP-870, 893 от Pfizer и ADC-1013 от Alligator Bioscience). См. фиг. 1 и фиг. 2.

Вариант осуществления 8. Клонирование и секвенирование антитела к CD40

Отбирали подклоны гибридом пяти антител, подвергнутых скринингу и идентифицированных выше, и собирали клетки гибридомы, которые находились в логарифмической фазе роста. РНК экстрагировали с применением тризола (Invitrogen, 15596-018) в соответствии с инструкцией из набора и осуществляли обратную транскрипцию (обратная транскриптаза PrimeScript TM, Takara, № по кат. 2680A). Затем полученную cDNA амплифицировали с помощью ПЦР с применением набора Ig-Primer для мыши (Novagen, TB326 Rev. B 0503) и отправляли в секвенирующую компанию для секвенирования. Наконец, получали последовательности 5 антител мыши.

Последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей мышиного mAb 2H6 являются следующими:

HCVR 2H6

QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFSDYLIEWAKQRPGQGLEWIGVINPGSGGSNYNEK

IKDRATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARGGGGFTYWGQGTLVTVSA

SEQ ID NO: 1

LCVR 2H6

EIQLTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISNYLNWYQQKPDGTIKLLLNFASRLHSGVPSRFS GSGSGTDFFLTISNLEQDDIATYFCQQGSTLPWTFGGGTKLEIK

SEQ ID NO: 2

Последовательности CDR mAb 2H6 показаны в таблице 5 ниже.

Таблица 5

Последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей 9E5 мыши являются следующими.

HCVR 9E5

QVQLQQPGADLVKPGASVKMSCKASGYILTTYWITWVKQRPGQGLEWIGDIHPGSGSTKYNEK FKSKATLTVDTSSSTAYMQLTRLSSEDSAVYYCARRDYWGQGTTLTVSS

SEQ ID NO: 9

LCVR 9E5

DVLMTQSPLSLPVSLGDQASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGESPKLLIYKVTNRFSGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQASLVPWTFGGGTKLEIK

SEQ ID NO：10

Последовательности CDR 9E5 показаны в таблице 6 ниже.

Таблица 6

Последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей 1D9 являются следующими.

HCVR 1D9

QVRLQQSGAELVRPGTSMRVSCKASGYAFTNYLINWVKQRPGQGLEWIGILNPGSGGTNYNEN FKDKATLTADKSSNTAYMQLSSLTSEDSAVYFCIRGSPGFAYWGQGTLVTVSA

SEQ ID NO: 37

LCVR 1D9

DIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDINIYLNWYQQKPDGTVKLLIYSTSGLHSGVPSRFN GSGSGTDYSLTISNLEQEDIATYFCQQGYTLPYTFGGGTKLEIK

SEQ ID NO: 38

Последовательности CDR 1D9 показаны в таблице 7 ниже.

Таблица 7

Последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей 14C10 являются следующими.

HCVR 14C10

QVQVQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYAFTNYLIEWVKQRPGQGLEWIGVINPEFGGTNYNEK FKGKATLTADKSSSTAYMQLSSLTSEDSAVYFCARGGGGFTYWGQGTLVTVSA

SEQ ID NO：45

LCVR 14C10

HIQMTQTTSSLSASLGDRVTISCRASQDISSHLNWYQQKPDGTVKLLISYTSRLHSGVPSRFS GSGSGADYSLTISNLEQEDIATYFCQQGNTLPWTFGGGTKLEIK

SEQ ID NO：46

Последовательности CDR 14C10 показаны в таблице 8 ниже.

Таблица 8

Последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей 38B4 являются следующими.

HCVR 38B4

QVRLKQSGAELVRPGASVKVSCKASGYTFTDYYINWVKQRPGQGLEWIAGIYPGTGNTYYNEK FKGKATLTAERSSSTAYMQLTSLTSEDSAVYFCTRRGLPSLCFDYWGQGTTLTVSS

SEQ ID NO：53

LCVR 38B4

DFQMTQTTSSLSASLGDRVTISCSASQGISNYLNWYQQKPDGTVKLLIYYTSSLHSGVPSRFS GSGSGTDYSLTISNLEPEDIATYYCQQYSKLPPTFGGGTKLEIK

SEQ ID NO：54

Последовательности CDR 38B4 показаны в таблице 9 ниже.

Таблица 9

Среди них два оптимальных антитела, 2H6 и 9E5, подвергали последующей разработке. Полученные последовательности вариабельных областей лигировали с последовательностью константной области антитела IgG1 человека соответственно с получением последовательности химерного антитела с последовательностями человека и мыши, а последовательность химерного антитела вставляли в вектор экспрессии pCP (приобретенный у MabSpace biology Co., Ltd) с помощью методики молекулярного клонирования. Эти последовательности секвенировали и идентифицировали после амплификации с помощью ПЦР (молекулярно-биологические рабочие способы, такие как молекулярное клонирование, выполняются в соответствии с традиционными рабочими условиями и могут быть отнесены конкретно к "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", и систему экспрессии на основе клеток HEK293 можно применять для получения химерных антител с последовательностями человека и мыши, 2H6-C и 9E5-C. Проводили различные анализы активности in vitro для характеристики химерных антител, очищенных с помощью аффинной хроматографии MabSelect SuRe (GE Lifesciences). Данные приведены в таблице 10.

Таблица 10. In vitro активность химерных антител

Вариант осуществления 9. Эксперимент по гуманизации мышиных антител

На основании типичной структуры VH/VLCDR полученных мышиных антител 2H6 и 9E5 последовательности вариабельных областей тяжелой и легкой цепей сравнивали с базой данных антител зародышевого типа для получения человеческой матрицы зародышевого типа с высокой гомологией. Тогда как человеческая каркасная область легкой цепи зародышевого типа получена из гена легкой κ-цепи человека, каркасная область легкой цепи антитела по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой человеческую матрицу Vk1-33/JK4 (2H6) или Vk2-28/JK4 (9E5) легкой цепи зародышевого типа. Каркасная область человеческой тяжелой цепи зародышевого типа получена из тяжелой цепи человека, и каркасная область тяжелой цепи антитела по настоящему изобретению предпочтительно представляет собой человеческую матрицу VH1-69/JH6 (2H6) или VH1-2/JH6 (9E5) тяжелой цепи зародышевого типа, как показано ниже.

Каркасная область тяжелой цепи 2H6 предпочтительно представляет собой человеческую матрицу IGHV1-69 тяжелой цепи зародышевого типа (SEQ ID NO: 21):

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSSYAISWVRQAPGQGLEWMGGIIPIFGTANYAQK FQGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCAR.

Каркасная область легкой цепи 2H6 предпочтительно представляет собой человеческую матрицу IGkV1-33 легкой цепи зародышевого типа (SEQ ID NO: 22):

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCQASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFS GSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYDNLP.

Каркасная область тяжелой цепи 9E5 предпочтительно представляет собой человеческую матрицу IGHV1-2 тяжелой цепи зародышевого типа (SEQ ID NO: 23):

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQK FQGRVTMTRDTSISTAYMELSRLRSDDTAVYYCAR.

Каркасная область легкой цепи 9E5 предпочтительно представляет собой человеческую матрицу IGkV2-28 легкой цепи зародышевого типа (SEQ ID NO: 24):

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQSLLHSNGYNYLDWYLQKPGQSPQLLIYLGSNRASGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCMQALQTP.

Области CDR мышиного антитела прививали к отобранной гуманизированной матрице с заменой гуманизированной вариабельной области, а затем рекомбинировали с соответствующей константной областью IgG человека (предпочтительно тяжелая цепь представляет собой IgG1, а легкая цепь представляет собой κ). Затем, основываясь на трехмерной структуре мышиного антитела, встроенные остатки, остатки, которые характеризуются прямым взаимодействием с CDR, и остатки, которые обладают важным влиянием в отношении конформации VL и VH, подвергали обратной мутации, и химически неустойчивые аминокислотные остатки областей CDR оптимизировали с получением конечной гуманизированной молекулы. Их последовательности вариабельных областей тяжелой цепи представлены под SEQ ID NO: 25-30, и последовательности вариабельных областей легкой цепи представлены под SEQ ID NO: 31-36.

hu2H6-H1a（SEQ ID NO: 25）：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSDYLIEWVRQAPGQGLEWMGVINPGSGGSNYNEK IKDRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGGGFTYWGQGTLVTVSS

hu2H6-H1b（SEQ ID NO: 26）：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSDYLIEWVRQAPGQGLEWMGVINPGSGGSNYNEK IKDRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGGGFTYWGQGTLVTVSS

hu2H6-H1c（SEQ ID NO: 27）：

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSDYLIEWVRQAPGQGLEWIGVINPGSGGSNYNEK IKDRATLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGGGFTYWGQGTLVTVSSFGQGTKLEIK

hu9E5-H1a（SEQ ID NO: 28）：

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPGSGSTKYNEK FKSRVTMTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRDYWGQGTTVTVSS

hu9E5-H1b (SEQ ID NO: 29):

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTTYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPGSGSTKYNEK FKSRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRDYWGQGTTVTVSS

hu9E5-H1c (SEQ ID NO: 30):

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYILTTYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPGSGSTKYNEK FKSRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRDYWGQGTTVTVSS

hu2H6-L1a (SEQ ID NO: 31):

DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLLNFASRLHSGVPSRFS GSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGSTLPWTFGGGTKVEIK

hu2H6-L1b (SEQ ID NO: 32):

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLLNFASRLHSGVPSRFS GSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGSTLPWTFGGGTKVEIK

hu2H6-L1c (SEQ ID NO: 33):

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKTIKLLLNFASRLHSGVPSRFS GSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGSTLPWTFGGGTKVEIK

hu9E5-L1a (SEQ ID NO: 34):

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVTNRFSGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASLVPWTFGGGTKVEIK

hu9E5-L1b (SEQ ID NO: 35):

DVVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVTNRFSGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASLVPWTFGGGTKVEIK

hu9E5-L1c (SEQ ID NO: 36):

DVLMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVTNRFSGV PDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASLVPWTFGGGTKVEIK

Конечные гуманизированные молекулы антител hu2H6 (содержащая тяжелую цепь H1b и легкую цепь L1c) и hu9E5 (содержащая тяжелую цепь H1c и легкую цепь L1a) отбирали с помощью вышеуказанных исследований экспрессии и сравнения количества обратных мутаций комбинаций легкой и тяжелой цепей, а полные последовательности легких и тяжелых цепей которых приведены под SEQ ID NO: 17-20 соответственно.

HC hu2H6

QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGYAFSDYLIEWVRQAPGQGLEWMGVINPGSGGSNYNEKIKDRVTLTADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGGGGFTYWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 17

LC hu2H6

DIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDISNYLNWYQQKPGKTIKLLLNFASRLHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQGSTLPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 18

HC hu9E5

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYILTTYWITWVRQAPGQGLEWMGDIHPGSGSTKYNEKFKSRVTLTVDTSISTAYMELSRLRSEDTAVYYCARRDYWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK SEQ ID NO: 19

LC hu9E5

DIVMTQSPLSLPVTPGEPASISCRSSQNIVNSQGNTYLEWYLQKPGQSPQLLIYKVTNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQASLVPWTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC SEQ ID NO: 20

Вариант осуществления 10. Данные исследования гуманизированных антител

Активность связывания, блокирующая активность и т.п. гуманизированных антител hu2H6 и hu9E5 по настоящему изобретению в отношении CD40 человека, макаки-резуса показаны в таблице 11. Результаты показали, что связывающая и блокирующая активность при ELISA гуманизированного антитела к CD40 человека по настоящему изобретению была сопоставима с активностью антитела положительного контроля Pfizer/Alligator. В частности, измеренная с помощью Biacore аффинность hu9E5 к CD40 человека была в 9 раз выше, чем таковая эталонного антитела положительного контроля Alligator, и в 3 раза выше, чем у эталона Pfizer.

Таблица 11. In vitro активность гуманизированных антител hu2H6 и hu9E5

Вариант осуществления 11. Подавление с помощью антитела к CD40 роста опухоли у мышей

Брали нормальную периферическую кровь человека и выделяли РВМС здорового человека с помощью центрифугирования в градиенте плотности. Моноциты сортировали с применением набора с CD14⁺ микрогранулами и выделяли CD14⁺ моноциты в соответствии с протоколом, предоставленным с набором, т.е. 20 мкл микроносителей к CD14 добавляли на каждые 10⁷ клеток и инкубировали при 4°С в течение 15 минут. Затем клетки добавляли в магнитную колонку и ополаскивали три раза. Клетки в магнитной колонке, то есть CD14⁺ моноциты, собирали. Среду RPMI 1640, содержащую 10 нг/мл IL4 и 100 нг/мл GM-CSF, добавляли к CD14⁺ моноцитам, таким образом, культивируя моноциты в течение 6 дней (способ культивирования является традиционным способом в данной области техники) для осуществления индуцирования культуры клеток MoDC. RPMI 1640, содержащую IL-2, добавляли к оставшимся клеткам, и суспендированные клетки собирали после культивирования (способ культивирования и способ сбора клеток являются традиционными в данной области техники). Т-клетки сортировали с применением набора CD3⁺ микрогранул. Через шесть дней клетки MoDC и CD3⁺ T-клетки собирали и смешивали с клетками Raji (банк клеток Шанхайского института биотехнологиии, культивируемые в среде RPMI1640, содержащей 10% эмбриональную бычью сыворотку) в соотношении 1:5:20 соответственно, и инокулировали в каждую мышь NOG (Nanjing Galaxy Biopharma, адаптивное питание в течение 5 дней) подкожно. Экспериментальные животные содержались в отдельном вентилируемом боксе с постоянными температурой и влажностью. Температура в помещении для разведения составляла 18,0-26,0°C, влажность составляла 40-70%, вентиляция проводилась 10-20 раз/ч, а день и ночь переключались при 12 ч/12 ч.

Экспериментальные группы включают контрольную группу антитела IgG1 человека, hu2H6, hu9E5 и эталонного антитела G12, и доза для каждой группы составляла 3 мг/кг. Пяти мышам в каждой группе вводили клетки один раз в неделю в течение шести недель с помощью трех последовательных введений. В течение всего эксперимента диаметр длинной оси и диаметр широкой оси опухоли измеряли два раза в неделю с применением штангенциркуля с нониусом и рассчитывали объем опухоли (мм³) = 0,5 × (диаметр длинной оси опухоли × диаметр широкой оси опухоли²). Относительная степень подавления опухоли TGI (%): TGI% = (1-T/C) × 100%. T/C% - относительная скорость роста опухоли, то есть процент относительного объема опухоли или массы опухоли в группе обработки и контрольной группе в определенный момент времени. Т и С - объем опухоли (TV) или масса опухоли (TW) в группе обработки и контрольной группе IgG1 в определенный момент времени соответственно.

Результаты показали, что гуманизированные антитела к CD40 hu2H6 и hu9E5 обладали очень значительным противоопухолевым эффектом по сравнению с контролем IgG1, а опухоль была почти полностью устранена через 21 день после введения; противоопухолевый эффект hu2H6 и hu9E5 в целом был эквивалентен или немного лучше, чем у эталонного антитела G12, как показано на фиг. 3 и фиг. 4.

Хотя конкретные варианты осуществления настоящего изобретения были описаны выше, специалисты в данной области техники должны понимать, что они являются просто иллюстративными, и в настоящее изобретение могут быть внесены различные изменения или модификации без отступления от принципов и сущности настоящего изобретения, и эти эквивалентные формы также входят в объем, определенный прилагаемой формулой изобретения настоящей заявки.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> ЦЗЯНСУ ХЭНЖУЙ МЕДИСИН КО., ЛТД.;

ШАНХАЙ ХЭНЖУЙ ФАРМАСЬЮТИКАЛ КО., ЛТД

<120> АНТИТЕЛО К CD40, ЕГО АНТИГЕНСВЯЗЫВАЮЩИЙ ФРАГМЕНТ И ЕГО

МЕДИЦИНСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ

<130> P19413048RU

<150> CN201710402559.0

<151> 01-06-2017

<160> 60

<170> PatentIn, версия 3.5

<210> 1

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 1

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu Ile Glu Trp Ala Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Ile

50 55 60

Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Gly Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ala

115

<210> 2

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 2

Glu Ile Gln Leu Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Ile Lys Leu Leu Leu

35 40 45

Asn Phe Ala Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Phe Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Asp Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 3

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 3

Gly Tyr Ala Phe Ser Asp Tyr Leu Ile Glu

1 5 10

<210> 4

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 4

Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Ile Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 5

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 5

Gly Gly Gly Gly Phe Thr Tyr

1 5

<210> 6

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 6

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 7

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 7

Phe Ala Ser Arg Leu His Ser

1 5

<210> 8

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 8

Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp Thr

1 5

<210> 9

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 9

Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asp Ile His Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Thr Arg Leu Ser Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 10

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 10

Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Asn Ser

20 25 30

Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Glu Ser

35 40 45

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala

85 90 95

Ser Leu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 11

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 11

Gly Tyr Ile Leu Thr Thr Tyr Trp Ile Thr

1 5 10

<210> 12

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 12

Asp Ile His Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Ser

<210> 13

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 13

Arg Asp Tyr

1

<210> 14

<211> 16

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 14

Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Asn Ser Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu

1 5 10 15

<210> 15

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 15

Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser

1 5

<210> 16

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 16

Phe Gln Ala Ser Leu Val Pro Trp Thr

1 5

<210> 17

<211> 446

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированное антитело

<400> 17

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Ile

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Gly Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala

115 120 125

Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu

130 135 140

Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly

145 150 155 160

Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser

165 170 175

Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu

180 185 190

Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr

195 200 205

Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr

210 215 220

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

225 230 235 240

Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

245 250 255

Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val

260 265 270

Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr

275 280 285

Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val

290 295 300

Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys

305 310 315 320

Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser

325 330 335

Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro

340 345 350

Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val

355 360 365

Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly

370 375 380

Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp

385 390 395 400

Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp

405 410 415

Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His

420 425 430

Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440 445

<210> 18

<211> 214

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированное антитело

<400> 18

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Ile Lys Leu Leu Leu

35 40 45

Asn Phe Ala Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 19

<211> 442

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированное антитело

<400> 19

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile His Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

115 120 125

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

130 135 140

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

145 150 155 160

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

165 170 175

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

180 185 190

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

195 200 205

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

210 215 220

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

225 230 235 240

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

245 250 255

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

260 265 270

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

275 280 285

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

290 295 300

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

305 310 315 320

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

325 330 335

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

340 345 350

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

355 360 365

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

370 375 380

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

385 390 395 400

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

405 410 415

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

420 425 430

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

435 440

<210> 20

<211> 219

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Гуманизированное антитело

<400> 20

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Asn Ser

20 25 30

Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala

85 90 95

Ser Leu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

115 120 125

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

130 135 140

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

145 150 155 160

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

165 170 175

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

180 185 190

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

195 200 205

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210 215

<210> 21

<211> 98

<212> БЕЛОК

<213> Зародышевый тип человека

<400> 21

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr

20 25 30

Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210> 22

<211> 95

<212> БЕЛОК

<213> Зародышевый тип человека

<400> 22

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Glu Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Asn Leu Pro

85 90 95

<210> 23

<211> 98

<212> БЕЛОК

<213> Зародышевый тип человека

<400> 23

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Gly Tyr

20 25 30

Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Trp Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg

<210> 24

<211> 100

<212> БЕЛОК

<213> Зародышевый тип человека

<400> 24

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser

20 25 30

Asn Gly Tyr Asn Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Leu Gly Ser Asn Arg Ala Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala

85 90 95

Leu Gln Thr Pro

100

<210> 25

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи гуманизированного антитела

<400> 25

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Ile

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Gly Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 26

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи гуманизированного антитела

<400> 26

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Ile

50 55 60

Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Gly Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 27

<211> 126

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи гуманизированного антитела

<400> 27

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Asp Tyr

20 25 30

Leu Ile Glu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Gly Ser Gly Gly Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Ile

50 55 60

Lys Asp Arg Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Gly Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

115 120 125

<210> 28

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи гуманизированного антитела

<400> 28

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile His Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Met Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 29

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи гуманизированного антитела

<400> 29

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile His Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 30

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область тяжелой цепи гуманизированного антитела

<400> 30

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Leu Thr Thr Tyr

20 25 30

Trp Ile Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Asp Ile His Pro Gly Ser Gly Ser Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Ser Arg Val Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Arg Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

100 105 110

<210> 31

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела

<400> 31

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu

35 40 45

Asn Phe Ala Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 32

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела

<400> 32

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Leu

35 40 45

Asn Phe Ala Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 33

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела

<400> 33

Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Thr Ile Lys Leu Leu Leu

35 40 45

Asn Phe Ala Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Ser Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 34

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела

<400> 34

Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Asn Ser

20 25 30

Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala

85 90 95

Ser Leu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 35

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела

<400> 35

Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Asn Ser

20 25 30

Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala

85 90 95

Ser Leu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 36

<211> 112

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Вариабельная область легкой цепи гуманизированного антитела

<400> 36

Asp Val Leu Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly

1 5 10 15

Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile Val Asn Ser

20 25 30

Gln Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser

35 40 45

Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Thr Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro

50 55 60

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile

65 70 75 80

Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Ala

85 90 95

Ser Leu Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105 110

<210> 37

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 37

Gln Val Arg Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Met Arg Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Leu Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Ile Leu Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Asn Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ile Arg Gly Ser Pro Gly Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ala

115

<210> 38

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 38

Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ile Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ser Thr Ser Gly Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Asn Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Tyr

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 39

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 39

Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr Leu Ile Asn

1 5 10

<210> 40

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 40

Ile Leu Asn Pro Gly Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe Lys

1 5 10 15

Asp

<210> 41

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 41

Gly Ser Pro Gly Phe Ala Tyr

1 5

<210> 42

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 42

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Ile Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 43

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 43

Ser Thr Ser Gly Leu His Ser

1 5

<210> 44

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 44

Gln Gln Gly Tyr Thr Leu Pro Tyr Thr

1 5

<210> 45

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 45

Gln Val Gln Val Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Leu Ile Glu Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Val Ile Asn Pro Glu Phe Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Gly Gly Gly Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ala

115

<210> 46

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 46

His Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser His

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Ser Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Ala Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 47

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 47

Gly Tyr Ala Phe Thr Asn Tyr Leu Ile Glu

1 5 10

<210> 48

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 48

Val Ile Asn Pro Glu Phe Gly Gly Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 49

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 49

Gly Gly Gly Gly Phe Thr Tyr

1 5

<210> 50

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 50

Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser His Leu Asn

1 5 10

<210> 51

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 51

Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser

1 5

<210> 52

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 52

Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Trp Thr

1 5

<210> 53

<211> 119

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 53

Gln Val Arg Leu Lys Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr

20 25 30

Tyr Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Ala Gly Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Glu Arg Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Thr Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Thr Arg Arg Gly Leu Pro Ser Leu Cys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 54

<211> 107

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 54

Asp Phe Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr

20 25 30

Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Pro

65 70 75 80

Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Pro

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys

100 105

<210> 55

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 55

Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Ile Asn

1 5 10

<210> 56

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 56

Gly Ile Tyr Pro Gly Thr Gly Asn Thr Tyr Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 57

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 57

Arg Gly Leu Pro Ser Leu Cys Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 58

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 58

Ser Ala Ser Gln Gly Ile Ser Asn Tyr Leu Asn

1 5 10

<210> 59

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 59

Tyr Thr Ser Ser Leu His Ser

1 5

<210> 60

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Mus musculus

<400> 60

Gln Gln Tyr Ser Lys Leu Pro Pro Thr

1 5

<---

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область легкой цепи антитела и вариабельную область тяжелой цепи антитела, где вариабельная область легкой цепи антитела содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие определенные последовательности. Изобретение относится также к фармацевтической композиции для лечения и предупреждения заболевания или состояния, опосредованного CD40 или CD40L, содержащей указанное антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент и фармацевтически приемлемые вспомогательное вещество, разбавитель или носитель. Изобретение позволяет эффективно лечить заболевания или состояния, опосредованного CD40 или CD40L. 12 н. и 11 з.п. ф-лы, 11 табл., 11 пр., 4 ил.

1. Антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент, содержащие вариабельную область легкой цепи антитела и вариабельную область тяжелой цепи антитела, где вариабельная область легкой цепи антитела содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8 соответственно; и вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 и SEQ ID NO: 5 соответственно; или

вариабельная область легкой цепи антитела содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 и SEQ ID NO: 16 соответственно; и вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12 и SEQ ID NO: 13 соответственно; или

вариабельная область легкой цепи антитела содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43 и SEQ ID NO: 44 соответственно; и вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 40 и SEQ ID NO: 41 соответственно; или

вариабельная область легкой цепи антитела содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 50, SEQ ID NO: 51 и SEQ ID NO: 52 соответственно; и вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 47, SEQ ID NO: 48 и SEQ ID NO: 49 соответственно; или

вариабельная область легкой цепи антитела содержит LCDR1, LCDR2 и LCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 58, SEQ ID NO: 59 и SEQ ID NO: 60 соответственно; и вариабельная область тяжелой цепи антитела содержит HCDR1, HCDR2 и HCDR3, имеющие последовательность под SEQ ID NO: 55, SEQ ID NO: 56 и SEQ ID NO: 57 соответственно.

2. Антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой мышиное антитело или химерное антитело.

3. Антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент по п.2, где аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи мышиного антитела или химерного антитела представлена под SEQ ID NO: 1, а аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена под SEQ ID NO: 2; или

аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена под SEQ ID NO: 9, а аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена под SEQ ID NO: 10; или

аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена под SEQ ID NO: 37, а аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена под SEQ ID NO: 38; или

аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена под SEQ ID NO: 45, а аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена под SEQ ID NO: 46; или

аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена под SEQ ID NO: 53, а аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи представлена под SEQ ID NO: 54.

4. Антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент по п.1, где антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляют собой гуманизированное антитело или человеческое антитело.

5. Антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент по п.4, где последовательность FR-области легкой цепи в вариабельной области легкой цепи гуманизированного антитела получена из человеческой последовательности IGkV1-33 легкой цепи зародышевого типа, представленной под SEQ ID NO: 22, или последовательности IGkV2-28 легкой цепи зародышевого типа, представленной под SEQ ID NO: 24.

6. Антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент по п.4, где последовательность легкой цепи антитела из гуманизированного антитела представляет собой последовательность, представленную под SEQ ID NO: 18 или SEQ ID NO: 20, или ее варианты; при этом варианты предпочтительно характеризуются 0-10 мутациями аминокислот в вариабельной области легкой цепи, более предпочтительно мутации введены по положениям 2 и 3, и в результате мутаций происходит замена на аминокислоты, предпочтительно представляющие собой I, V или L.

7. Антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.4-6, где вариабельная область тяжелой цепи гуманизированного антитела дополнительно содержит FR-область тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека или ее варианты, предпочтительно содержит FR-область тяжелой цепи IgG1, IgG2, IgG3 или IgG4 человека, более предпочтительно содержит FR-область тяжелой цепи IgG1 или IgG2 человека.

8. Антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент по п.7, где последовательность FR-области тяжелой цепи в вариабельной области тяжелой цепи гуманизированного антитела получена из человеческой последовательности IGHV1-69 тяжелой цепи зародышевого типа, представленной под SEQ ID NO: 21, или человеческой последовательности IGHV1-2 тяжелой цепи зародышевого типа, представленной под SEQ ID NO: 23.

9. Антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.4-8, где последовательность тяжелой цепи гуманизированного антитела представляет собой последовательность, представленную под SEQ ID NO: 17 или SEQ ID NO: 19, или ее варианты, предпочтительно варианты характеризуются 0-10 мутациями аминокислот в вариабельной области тяжелой цепи, более предпочтительно мутации введены по положениям 6 и 8, и в результате мутаций происходит замена на аминокислоты, предпочтительно представляющие собой I, A или L.

10. Антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.4-9, где гуманизированное антитело представляет собой гуманизированное антитело hu9E5 или hu2H6, при этом последовательность вариабельной области гуманизированного антитела представляет собой следующее:

для гуманизированного антитела hu2H6 последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена под SEQ ID NO: 26, и последовательность вариабельной области легкой цепи представлена под SEQ ID NO: 33;

для гуманизированного антитела hu9E5 последовательность вариабельной области тяжелой цепи представлена под SEQ ID NO: 30, и последовательность вариабельной области легкой цепи представлена под SEQ ID NO: 34.

11. Антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент по п.10, где гуманизированное антитело hu9E5 содержит последовательность тяжелой цепи антитела под SEQ ID NO: 19 и последовательность легкой цепи антитела под SEQ ID NO: 20; при этом гуманизированное антитело hu2H6 содержит последовательность тяжелой цепи антитела под SEQ ID NO: 17 и последовательность легкой цепи антитела под SEQ ID NO: 18.

12. Одноцепочечное антитело для лечения и предупреждения заболевания или состояния, опосредованного CD40 или CD40L, содержащее вариабельную область легкой цепи или вариабельную область тяжелой цепи антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-11.

13. Конъюгат антитело-лекарственное средство для лечения и предупреждения заболевания или состояния, опосредованного CD40 или CD40L, где антитело содержит вариабельную область легкой цепи и/или вариабельную область тяжелой цепи антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-11.

14. ДНК, кодирующая антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-11.

15. ДНК, кодирующая одноцепочечное антитело по п.12.

16. Вектор экспрессии, содержащий ДНК по п.14 или 15.

17. Клетка-хозяин для лечения и предупреждения заболевания или состояния, опосредованного CD40 или CD40L, где клетка-хозяин трансформирована с помощью вектора экспрессии по п.16.

18. Клетка-хозяин по п.17, где клетка-хозяин представляет собой бактерию, предпочтительно Escherichia coli; или представляет собой дрожжи, предпочтительно Pichia pastoris; или представляет собой клетку млекопитающего, предпочтительно клетку яичника китайского хомячка (CHO) или клетку эмбриональной почки человека (HEK) 293.

19. Фармацевтическая композиция для лечения и предупреждения заболевания или состояния, опосредованного CD40 или CD40L, содержащая антитело к CD40 или его антигенсвязывающий фрагмент по любому из пп.1-11, одноцепочечное антитело по п.12 или конъюгат антитело-лекарственное средство по п.13 и фармацевтически приемлемые вспомогательное вещество, разбавитель или носитель.

20. Применение антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-11, одноцепочечного антитела по п.12, конъюгата антитело-лекарственное средство по п.13 или фармацевтической композиции по п.19 в изготовлении лекарственного препарата для лечения или предупреждения заболевания или состояния, опосредованного CD40 или CD40L; где заболевание предпочтительно представляет собой рак; при этом рак наиболее предпочтительно представляет собой лимфому, рак молочной железы, рак яичника, рак простаты, рак поджелудочной железы, рак почки, рак легкого, рак печени, рак желудка, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рабдомиосаркому, рак пищевода, рак шейки матки, множественную миелому, лейкоз, рак желчного пузыря, глиобластому и меланому.

21. Способ лечения и предупреждения заболевания или состояния, опосредованного CD40 или CD40L, при этом способ включает введение субъекту терапевтически эффективной дозы антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-11, одноцепочечного антитела по п.12, конъюгата антитело-лекарственное средство по п.13 или фармацевтической композиции по п.19, при этом заболевание предпочтительно представляет собой рак; при этом рак наиболее предпочтительно представляет собой лимфому, рак молочной железы, рак яичника, рак простаты, рак поджелудочной железы, рак почки, рак легкого, рак печени, рак желудка, колоректальный рак, рак мочевого пузыря, рабдомиосаркому, рак пищевода, рак шейки матки, множественную миелому, лейкоз, рак желчного пузыря, глиобластому и меланому.

22. Применение антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-11, одноцепочечного антитела по п.12, конъюгата антитело-лекарственное средство по п.13 или фармацевтической композиции по п.19 в изготовлении лекарственного препарата, предназначенного для улучшения в отношении симптомов у пациента с аутоиммунным заболеванием.

23. Применение антитела к CD40 или его антигенсвязывающего фрагмента по любому из пп.1-11, одноцепочечного антитела по п.12, конъюгата антитело-лекарственное средство по п.13 или фармацевтической композиции по п.19 в изготовлении лекарственного препарата, предназначенного для улучшения в отношении симптомов у пациента с воспалительным заболеванием.