НАНОЧАСТИЦЫ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕВРОЛОГИЧЕСКОГО РАССТРОЙСТВА Российский патент 2022 года по МПК A61K33/24 A61K33/38 A61K33/242 A61K33/243 A61K33/244 A61K33/44 A61K33/08 A61K9/14 A61K9/16 A61P25/00 

Настоящее изобретение относится к области медицины, в частности к лечению неврологических расстройств. Более конкретно, настоящее изобретение относится к наночастице или агрегату наночастиц для применения в профилактике или лечении неврологического заболевания или по меньшей мере одного его симптома у субъекта без воздействия на наночастицу или агрегат наночастиц электрического поля и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука, где материал наночастицы или агрегата наночастиц выбран из проводникового материала, полупроводникового материала, изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε_ijk, равной или выше 200, и изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε_ijk, равной или ниже 100. Кроме того, оно относится к композициям и наборам, включающим такие наночастицы и/или агрегаты наночастиц, а также к их применениям без воздействия на них электрического поля и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Неврологические расстройства представляют собой серьезную проблему для здоровья (Neurological disorders public health challenges. WHO, 2006). Нарушение функции нейронной сети может иметь различное происхождение. Болезнь Паркинсона представляет собой двигательное расстройство, вызванное гибелью дофаминовых нейронов в черной субстанции, расположенной в среднем мозге. Инсульт соответствует блоку кровоснабжения мозга. Без кислорода нейроны в пораженной области погибают, и часть тела, контролируемая этими клетками, не может функционировать. Болезнь Хантингтона представляет собой генетическое заболевание. Эпилепсия представляет собой расстройство, вызываемое аномальным возбуждением больших групп нейронов в различных областях головного мозга. Болезнь Альцгеймера представляет собой нейродегенеративное заболевание, характеризующееся гибелью нейронов в гиппокампе, коре головного мозга и других областях мозга. Причины расстройств аутистического спектра многофакторные: генетические, экологические и т.д.

Неврологические расстройства можно классифицировать в зависимости от первичных симптомов, которые влияют на пациентов. Наблюдаются три основных типа симптомов: двигательные расстройства, психические (аффективные/социальные) расстройства и когнитивные расстройства, как более подробно описано ниже в настоящей заявке.

Двигательные расстройства включают тремор, гипокинезию, такую как брадикинезия или дискинезия, скручивание мышц, ригидность, постуральную неустойчивость, «замораживание « походки и т.д. Заболевания, вызывающие двигательные расстройства, обычно включают болезнь Паркинсона, дистонию, эпилепсию, болезнь Хантингтона и синдром Туретта.

Психические расстройства включают множество заболеваний с проявлением симптомов аффективных/социальных ухудшений. Неполный перечень включает расстройства аутистического спектра, шизофренические расстройства, биполярные расстройства, депрессивные расстройства, тревожные расстройства, обсессивно-компульсивные расстройства, связанные с употреблением психоактивных веществ и/или аддиктивные расстройства (определение из Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, 2013, fifth edition, the American Psychiatric Association). У некоторых пациентов, страдающих двигательными расстройствами, такими как болезнь Паркинсона и дистония, могут развиться психические расстройства на поздней стадии заболевания.

Когнитивные расстройства присутствуют во многих, если не во всех, психических расстройствах (например, шизофрения, биполярные расстройства). Только расстройства, основные черты которых являются когнитивными, включены в категорию когнитивных расстройств. Когнитивные расстройства влияют на повседневную жизнь пациентов: простые задачи сложно решить. Деменция является типичным когнитивным расстройством, и это общий термин для снижения умственных способностей, достаточно серьезных, чтобы мешать повседневной жизни. Болезнь Альцгеймера представляет собой особый тип деменции с нейродегенеративным аспектом.

Неврологические расстройства, когда это возможно, лечат лекарственными средствами, которые играют роль в регуляции уровня нейротрансмиттеров в мозге и в контроле взаимодействий с специфическими рецепторами нейротрансмиттеров. Основными рассматриваемыми нейротрансмиттерами являются: глутамат, γ-аминомасляная кислота (GABA), дофамин и ацетилхолин. Нейротрансмиттеры глутамат и GABA представляют особый интерес, поскольку они играют основную роль в повышении (Platt et al., The Veterinary Journal, 2007, 173, 278-286: The role of glutamate in central nervous system health and disease - обзор) и в снижении возбудимости нейронов, соответственно (Holmes et al., Mental Retardation and Developmental Disabilities, 1995, 1, 208-219: Role of glutamate and GABA in the pathophysiology of epilepsy). Дофамин участвует в нескольких функциях мозга: контроле движения через базальные ганглии (неправильный уровень дофамина в базальных ганглиях приводит к неконтролируемым движениям), поведении, направленном на получение удовольствия (нарушение может привести к дисфункциональной зависимости), познавательной способности (нарушения уровня дофамина в лобных долях могут привести к снижению нейрокогнитивных функций) и т.д. (Alcaro et al., Brain Res. Rev., 2007, 56(2), 283-321: Behavioral functions of the mesolimbic dopaminergic system: an affective neuroethological perspective). Ацетилхолин является нейротрансмиттером, участвующим в обучении и памяти на уровне центральной нервной системы (Hasselmo et al., Curr Opin Neurobiol, 2006, 16(6), 710-715: The role of acetylcholine in learning and memory).

Обычным лекарственным средством для облегчения моторных симптомов болезни Паркинсона является леводопа, которая преобразуется в дофамин в мозге и тем самым помогает сбалансировать дефицит дофамина. Леводопа связана с карбидопой, которая помогает избежать преобразования леводопы в дофамин во всем организме. Одной из проблем лечения леводопой является феномен “включения-выключения”, который приводит к фазам неподвижности и неспособности, связанным с депрессией, чередующейся с радостными изменениями настроения (Lees et al., J Neurology Neurosurgery Psychiatry, Special Supplement, 1989, 29-37: The on-off phenomenon). Отсутствие ответа на это лечение у пациентов с поздней стадией болезни Паркинсона является проблемой (Fabbri et al., Parkinsonism and related disorders, 2016: Do patients with late-stage Parkinson’s disease still respond to levodopa?). Другие обычно применяемые лекарственные средства для лечения симптомов нейропсихиатрических расстройств, таких как “положительные” симптомы, бред и галлюцинации, при шизофрении представляют собой антипсихотические препараты.

Однако терапевтические лечения симптомов неврологических расстройств этими препаратами являются неспецифическими и, как таковые, могут вызывать серьезные побочные эффекты. Кроме того, может появиться рефрактерность к используемому препарату.

С продвижением в понимании нейронауки, мозг можно представить как электрическую сеть, кодирующую и передающую информацию по своим электрическим проводам, нейронам. Связь между нейронами проста и сложна одновременно: проста, потому что она основана на притоке/оттоке ионов внутри нейронов, которые приводят к потенциалам действия (или “спайкам” электрической активности); сложна, потому что сеть мозга состоит из сотен миллиардов нейронов, которые образуют узлы, хабы и модули, демонстрирующие скоординированные взаимодействия в различных пространственных и временных масштабах (Fornito et al., Nature Reviews Neuroscience, 2015, 16, 159-172: The connectomics of brain disorders). Нейронная связь зависит от анатомических компонентов, которые соединяют отдельные нейроны (структура) и от процесса передачи информации (функция). Оба аспекта влияют на общую работу нервной системы. Нейронные взаимодействия передаются колебаниями паттерна электрической активности мозга, которые обычно измеряют при помощи электроэнцефалограммы (ЭЭГ). Наблюдают разные полосы частот колебаний: дельта, тета, альфа, бета, гамма (Ward et al., Trends in Cognitive Sciences, 2003, 7(12), 553-559: Synchronous neural oscillations and cognitive processes). Структурно, наиболее яркой нейроанатомической особенностью мозга является обильная связь между нейронами, что отражает важность нейронной коммуникации. Синхронизация колебаний (“синхронность”) между одной областью мозга и другой, по-видимому, составляет последний уровень кодирования информации [первый уровень (нейрон): потенциалы действия; второй уровень (нейронная сеть(сети)): нейронные колебания] путем обеспечения пространственно-временной координации (Engel et al., Nature Reviews Neuroscience, 2001, 2, 704-716: Dynamic predictions: oscillations and synchrony in top-down processing). Важно отметить, что появляются доказательства того, что тонко сбалансированный паттерн синхронизации и десинхронизации в пространстве и времени является основополагающим для функциональных показателей нервной системы (Schnitzler et al., Nature Reviews Neuroscience, 2005, 6, 285-296: Normal and pathological oscillatory communication in the brain).

Аномальные процессы синхронизации (слишком высокая и/или слишком длительная синхронность, т.е. также называемая гиперсинхронностью, или слишком низкая синхронность, т.е. также называемая нарушенной синхронностью) связывают с некоторыми расстройствами головного мозга, такими как эпилепсия, шизофрения, деменция и болезнь Паркинсона (Schnitzler et al., Nature Reviews Neuroscience, 2005, 6, 285-296: Normal and pathological oscillatory communication in the brain).

В настоящее время модуляция паттерна электрической активности нейронов (нейромодуляция) может быть индуцирована при помощи электростимуляции. Современные методы для создания электрического стимула в мозге используют либо прямое электрическое раздражение, либо индукцию электрического поля посредством приложения электрического тока через магнитную катушку. Поскольку некоторые неврологические расстройства влияют на области глубоко в мозге и поскольку глубина проникновения электрического поля является слабой, была осуществлена хирургическая имплантация электродов внутрь мозга для непрерывной доставки электрических стимулов, и она представляет собой метод “глубокой стимуляции головного мозга” (DBS). Его эффективность зависит от параметров, используемых для стимуляции, особенно от частоты. В 1987 году было обнаружено, что высокочастотная стимуляция (≥100 Гц) вентрального интермедиального ядра таламуса (VIM) имплантированными электродами снимает симптомы тремора у пациентов, страдающих болезнью Паркинсона (Benabid et al., Applied Neurophysiology, 1987, 50, 344-346: Combined (thalamotomy and stimulation) stereotactic surgery of the VIM thalamic nucleus for bilateral Parkinson disease). Кроме того, у обезьян было показано, что высокочастотная стимуляция (>100 Гц), по сравнению с низкочастотной стимуляцией (<50 Гц), позволяет изменять временной паттерн импульсов нейронов в наружном сегменте бледного шара (GPe) и внутреннем сегменте бледного шара (GPi) (стимул-синхронизированный регулярный паттерн импульсов), который блокирует передачу измененных паттернов нейроннной активности в базальных ганглиях к их структурам-мишеням в таламусе и стволе мозга, таким образом облегчая симптомы брадикинезии и ригидности (Hashimoto et al., The Journal of Neuroscience, 2003, 23(5), 1916-1923: Stimulation of the subthalamic nucleus changes the firing pattern of pallidal neurons). В настоящее время DBS одобрен для лечения некоторых двигательных расстройств (болезнь Паркинсона, дистония, эссенциальный тремор, эпилепсия) и психических расстройств (обсессивно-компульсивное расстройство, депрессия).

Однако с DBS могут быть связаны несколько недостатков, во-первых, это инвазивность метода и риски различных осложнений, таких как кровоизлияние, эпилептические припадки, инфекции, миграция электрода, поломка электрода и т.д. (Fenoy et al., J Neurosurg, 2014, 120, 132-139: Risks of common complications in DBS surgery: management and avoidance).

Очаговость (т.е. пространственное разрешение) генерируемого электрического поля в мишени является еще одной проблемой. Распространение электрического стимула также связывают с побочными эффектами, такими как депрессия. Много исследований было посвящено разработке новых типов электродов, которые могут сдвигать и ограничивать стимул в пределах определенной области (Luan et al., Frontiers in Neuroengineering, 2014, 7(27), 1-9: Neuromodulation: present and emerging methods). Оцениваются и другие технологические аспекты: электроды (или питающие проводники), их размер, инвазивность устройства DBS, материал, из которого состоят электроды, совместимость с методами визуализации (магнитный резонанс), срок службы батареи внутреннего генератора импульсов (IPG), связанный с необходимостью постоянной стимуляции.

Основные другие существующие типы электростимуляции, а именно, транскраниальная электростимуляция или транскраниальная магнитная стимуляция, имеют преимущество, состоящее в том, что они не являются инвазивными, но глубина проникновения электрического поля является слабой. Таким образом, их применение ограничено стимуляцией коры головного мозга (глубокий мозг недоступен). Кроме того, пространственное разрешение остается плохим.

Настоящее изобретение относится к наночастицам и/или агрегатам наночастиц (агрегаты наночастиц) для применения для профилактики или лечения/для применения в профилактике или лечении неврологического заболевания (обычно нарушений нейронных сетей) или по меньшей мере одного его симптома.

Наночастицы или агрегаты наночастиц нормализуют синхронизацию нейронных колебаний (улучшают синхронность) внутри и/или между нейронными сетями, а также внутри и/или между отдельными областями мозга. Таким образом, описанные авторами в настоящей заявке наночастицы или агрегаты наночастиц помогают субъекту/пациенту вернуться к здоровому/нормальному состоянию.

Наночастицы и агрегаты наночастиц, описанные авторами в настоящей заявке, не требуют применения/индукции электрического тока или поля/стимула и предпочтительно не требуют воздействия любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука, чтобы проявить их функцию (т.е. быть эффективными). Для описанных в настоящей заявке наночастиц и агрегатов наночастиц не требуется воздействия на них электрического тока или поля/стимула, и предпочтительно не требуется воздействия любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука, чтобы они были функциональными в контексте описанных в настоящей заявке применений. Разработчики изобретения обнаружили, что эти наночастицы или агрегаты наночастиц можно выгодно и неожиданно эффективно использовать без воздействия на них, или без воздействия на субъекта, которому их вводят, электрического тока или поля/стимула, обычно электрического тока или поля/стимула, воздействующего на указанного субъекта, например, путем глубокой стимуляции головного мозга (DBS), транскраниальной электростимуляции (TES) или путем транскраниальной магнитной стимуляции (TMS), и предпочтительно без воздействия любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука. Это означает, что получающий лечение субъект не будет испытывать негативных побочных эффектов воздействия электрического тока или поля/стимула или любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука, благодаря настоящему изобретению.

Как хорошо известно специалисту в данной области техники, наночастица имеет повышенное/высокое отношение поверхность/объем, обычно приблизительно 35-40% атомов локализовано на поверхности наночастицы размером 10 нм по сравнению с менее чем 20% для наночастицы размером более 30 нм. Это высокое отношение поверхность/объем связано с высокой поверхностной реактивностью, которая зависит от размера. В результате, наночастицы (особенно те, которые размером менее 20 нм) могут проявлять новые свойства по сравнению с объемными материалами. Например, известно, что частицы золота химически инертны и устойчивы к окислению в макроскопическом масштабе, тогда как частицы золота размером менее 10 нм имеют химически активную поверхность. Токсичными механизмами, связанными с химической дестабилизацией металлических наночастиц, могут быть (i) прямое высвобождение металлов в растворах (процесс растворения), (ii) каталитические свойства металлических наночастиц и (iii) окислительно-восстановительная эволюция поверхности наночастиц, которые могут окислять белки, генерировать активные формы кислорода (АФК) и вызывать окислительный стресс (см. M. Auffan et al., Environmental Pollution 157 (2009) 1127-1133: Chemical Stability of metallic nanoparticles: a parameter controlling their potential cellular toxicity in vitro).

Помимо описанных выше наночастиц золота, которые обладают каталитическими свойствами, наночастицы оксида церия (7 нм частица CeO₂) или оксида железа (20 нм частица Fe₃O₄) показали окислительно-восстановительную модификацию их поверхности, что приводит к цитотоксическим эффектам, связанным с окислительным стрессом in vitro (см. M. Auffan et al., Environmental Pollution 157 (2009) 1127-1133: Chemical Stability of metallic nanoparticles: a parameter controlling their potential cellular toxicity in vitro). Кроме того, 11-нм наноструктура диоксида кремния разрушается биологическими средами (см. S-A Yang et al., Scientific Reports 2018 8:185: Silica nanoparticle stability in biological media revisited).

Как поясняется авторами изобретения ниже, наночастицы, имеющие размер менее 30 нм, должны быть тщательно отобраны, когда предполагают их использование in vivo у субъекта, обычно у млекопитающего, в частности у человека.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Обеспечивается преимущество, состоящее в том, что в настоящей заявке впервые описаны наночастица или агрегат наночастиц для применения для профилактики или лечения/для применения в профилактике или лечении неврологического заболевания или по меньшей мере одного его симптома у нуждающегося в этом субъекта без воздействия на наночастицу или агрегат наночастиц электрического поля и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука. Материал наночастицы или агрегата наночастиц обычно выбирают из проводникового материала, полупроводникового материала, изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε_ijk, равной или выше 200, и изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε_ijk, равной или ниже 100.

В настоящей заявке авторы изобретения описывают, в конкретном аспекте, наночастицу или агрегат наночастиц для применения в профилактике или лечении неврологического заболевания или по меньшей мере одного его симптома у субъекта без воздействия на наночастицу или агрегат наночастиц электрического поля или любого другого внешнего источника активации, где материал наночастицы или агрегата наночастиц выбран из проводникового материала, полупроводникового материала, изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε_ijk, равной или выше 200, и изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε_ijk, равной или ниже 100, где i) средний наибольший размер ядра наночастицы или агрегата наночастиц популяции составляет по меньшей мере 30 нм, когда материал представляет собой проводниковый материал, полупроводниковый материал или изоляционный материал с диэлектрической проницаемостью ε_ijk, равной или выше 200, и где ii) ядро наночастицы или агрегата наночастиц покрыто биосовместимым покрытием, обеспечивающим нейтральный или отрицательный поверхностный заряд, при измерении в растворе воды, имеющем концентрацию электролитов от 0,001 до 0,2 M, концентрацию материала наночастиц или агрегатов наночастиц от 0,01 до 10 г/л и уровень рН от 6 до 8.

Также в настоящей заявке описано применение наночастицы или агрегата наночастиц для получения композиции для профилактики или лечения неврологического заболевания, как описано в настоящей заявке, или по меньшей мере одного его симптома у нуждающегося в этом субъекта без воздействия на наночастицу или агрегат наночастиц электрического поля и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука.

Также в настоящей заявке описана композиция для применения для профилактики или лечения/для применения в профилактике или лечении неврологического заболевания или по меньшей мере одного его симптома у субъекта, где композиция включает или состоит из наночастиц и/или агрегатов наночастиц и фармацевтически приемлемого носителя, где материал наночастицы или агрегата наночастиц обычно выбирают из проводникового материала, полупроводникового материала, изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε_ijk, равной или выше 200, и изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε_ijk, равной или ниже 100, и где профилактику или лечение осуществляют без воздействия электрического поля на вводимые субъекту посредством композиции наночастицы или агрегаты наночастиц, и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука.

Кроме того, в настоящей заявке описан набор, включающий или состоящий из по меньшей мере из двух отдельных наночастиц и/или агрегатов наночастиц, при этом каждая наночастица или агрегат наночастиц состоит из отдельного материала, обычно выбранного из проводникового материала, полупроводникового материала, изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε_ijk, равной или выше 200, и изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε_ijk, равной или ниже 100, и его применения типично в профилактике или лечении/в способе профилактики или лечения неврологического заболевания или по меньшей мере одного его симптома у субъекта без воздействия на наночастицы или агрегаты наночастиц электрического поля, и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

По оценкам, нервная система человека состоит примерно из 80-120 миллиардов нервных клеток (Herculano-Houzel S. Frontier in Human Neuroscience (2009), 3(31): 1-11, The human brain in numbers: a linearly scaled-up primate brain). Определяющей характеристикой нейрона (или нервной клетки) является его способность передавать электрические сигналы в виде потенциалов действия.

Нейрон/нервная клетка составляет элементарный узел головного мозга. Нервные клетки могут сообщаться друг с другом высоко структурированным образом, образуя нейронные сети. Нейрон передает сигналы через синаптические связи. Внутри нейрона, наносхемы образуют основной биохимический механизм, опосредующий ключевые нейронные свойства, такие как обучение и память, а также генез ритмичности нейронов.

Микросхема может быть сформирована только с несколькими взаимосвязанными нейронами и может выполнять сложные задачи, такие как опосредование рефлексов, обработка сенсорной информации, инициация двигательной активности, а также посредничество в обучении и запоминании. Макросхема представляет собой более сложную сеть, состоящую из нескольких встроенных микросхем. Макросхемы опосредуют более высокие функции мозга, такие как распознавание объектов и познавательная способность. Таким образом, несколько уровней сетей расположены в нервной системе.

Возбудимость нейронной сети

Нейроны посылают сообщения электрохимически (то есть химические вещества/ионы вызывают электрический сигнал). Важными ионами в нервной системе являются натрий и калий, кальций и хлорид. Когда нейрон не посылает сигнал, он находится «в покое «. Когда нейрон находится в состоянии покоя, внутренняя часть нейрона отрицательна по отношению к внешней части. Хотя концентрации различных ионов пытаются найти баланс на обеих сторонах мембраны, они не могут это сделать, потому что клеточная мембрана пропускает только некоторые ионы через каналы (ионные каналы). В дополнение к этим селективным ионным каналам есть насос, который использует энергию для перемещения трех ионов натрия из нейрона для каждых двух ионов калия, которые он вводит. Наконец, когда все эти силы уравновешиваются, и измерена разница в напряжении между внутренней и внешней частью нейрона, потенциал покоящейся мембраны (также называемый “потенциал покоя”) нейрона составляет около -70 мВ. Это означает, что внутри нейрона на 70 мВ меньше, чем снаружи. В состоянии покоя снаружи нейрона находится относительно больше ионов натрия, а внутри этого нейрона больше ионов калия. Потенциал действия (также обозначаемый как “спайк” или “импульс”) возникает, когда нейрон посылает информацию вниз по аксону, от тела клетки. Это означает, что некоторое событие (стимул) заставляет потенциал покоя двигаться к 0 мВ. Когда деполяризация достигает около -55 мВ, нейрон запускает потенциал действия. Если деполяризация не достигает этого критического порогового уровня, то не срабатывает потенциал действия (механизм включения/выключения). Кроме того, при достижении порогового уровня всегда срабатывает потенциал действия с фиксированной амплитудой. Следовательно, либо деполяризация не достигает порога, либо генерируется полный потенциал действия.

Большая вариабельность обнаружена в скорости распространения потенциалов действия. Фактически, скорость распространения потенциалов действия в нервах может варьироваться от 100 метров в секунду до менее одной десятой метра в секунду. В то время как постоянная времени является показателем того, насколько быстро мембрана будет отвечать на стимул по времени, пространственная постоянная (также постоянная длины) является показателем того, насколько хорошо электрический потенциал будет распространяться вдоль аксона в качестве функции расстояния.

Связь внутри и между нейронными сетями

Существует три типа сетей связи, которые используются для изучения передачи сигналов внутри головного мозга и по всему головному мозгу. Структурная связность основана на обнаружении проводящих путей, которые физически соединяют области мозга. Это анатомические сетевые карты, которые указывают возможные пути прохождения сигналов в мозге. Функциональная связность идентифицирует активность в областях мозга, которые имеют сходную частоту, фазу и/или амплитуду коррелированной активности. Эффективная связность использует информацию о функциональной связности и делает еще один шаг в определении прямого или косвенного влияния, которое одна нейронная система может оказывать на другую, более конкретно, направление динамического информационного потока в мозге (Bowyer et al., Neuropsychiatric Electrophysiology, 2016, 2(1), 1-12: Coherence a measure of the brain networks: past and present).

Синхронизированная активность в нейронной сети может быть обнаружена при помощи магнитоэнцефалограммы (МЭГ), электроэнцефалограммы (ЭЭГ), функциональной магнитно-резонансной томографии (фМРТ) или позитронно-эмиссионной томографии (ПЭТ), затем изображения с использованием анализа связности в сети. МЭГ (магнитоэнцефалограмма) или ЭЭГ (электроэнцефалограмма) являются предпочтительными, поскольку они имеют высокое временное разрешение для анализа динамического потока информации. Анализ связности мозга осуществляют для установления сетей связи, необходимых для функционирования мозга. Отдельные области мозга специализируются на обработке определенных типов информации. Методы визуализации показали, что эти области связаны и взаимодействуют с другими специализированными областями через сети в мозге. “Когерентность” (Bowyer et al., Neuropsychiatric Electrophysiology, 2016, 2(1), 1-12: Coherence a measure of the brain networks: past and present.) представляет собой математический метод, который количественно определяет частоту и амплитуду синхроничности (состояния синхронности или синхронизации) нейронных паттернов колебательной активности мозга. Детекцию синхронной активации нейронов можно использовать для определения благополучия или целостности функциональных связей в мозге человека. Наложение карт функциональной связности на изображения структурной связности, а также использование направления потока информации, полученного из эффективной связности, обеспечивает всеобъемлющее понимание того, как функционирует мозг. Эти методы помогают оценить способы лечения, основанные на визуализации плотности нейронных связей до и после лечения.

Интактный (т.е. “нормальный” или “здоровый”) мозг экспрессирует сложные паттерны (“нормальной” или “здоровой”) синхронной активности, ассоциированные с различными ‘состояниями’ организма, от медленного дельта-ритма (0,5-4 Гц), до тета (4-8 Гц), альфа (8-12 Гц), бета (15-30 Гц) и гамма (30-70 Гц) колебаний. Интересно отметить, что диссоциированная культура кортикальных структур предлагает удобную систему для изучения правил, которые определяют возникновение, генерацию и распространение сетевых ипульсов (спайки) и “взрыва” импульса (кластеры спайков) в популяциях плотно связанных друг с другом нейронов. Активность сети можно регистрировать в течение длительных периодов времени неинвазивным способом и с конечным временным разрешением с использованием мультиэлектродных матриц. Двумерную диссоциированную культуру можно использовать в качестве жизнеспособной тестовой системы для изучения правил, которые регулируют формирование и поддержание активности сети в мозге, позволяя проверить гипотезу, которая не может быть проверена в интактном мозге (Cohen E. et al., Brain Research, 2008, 1235, 21-30: Determinants of spontaneous activity in networks of cultured hippocampus.).

Обеспечивается преимущество, состоящее в том, что в настоящей заявке впервые описаны наночастица или агрегат наночастиц для применения для профилактики или лечения/для применения в профилактике или лечении неврологического заболевания или по меньшей мере одного его симптома у нуждающегося в этом субъекта без воздействия на наночастицу или агрегат наночастиц электрического поля и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука. Такое воздействие (терапевтическое или диагностическое) электрического поля или любого другого (терапевтического или диагностического) внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука, в настоящей заявке следует понимать, как правило, как терапевтическое или диагностическое воздействие, обычно осуществляемое медицинским персоналом, например, врачом или медсестрой.

Материал наночастицы или агрегата наночастиц обычно выбирают из проводникового материала, полупроводникового материала, изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε_ijk, равной или выше 200, и изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε_ijk, равной или ниже 100.

Термин “лечение” относится к терапевтическому лечению или мерам, способным предотвратить, облегчить или вылечить заболевание, расстройство или дисфункциональное состояние, описанное в настоящей заявке. Такое лечение предназначено для субъекта-млекопитающего, предпочтительно субъекта-человека, нуждающегося в нем. В качестве таковых рассматриваются субъекты, уже идентифицированные (диагностированные) как страдающие заболеванием, расстройством или дисфункциональным состоянием, описанным в настоящей заявке, или лица, которые считаются «подверженными риску развития « такого заболевания, расстройства или дисфункционального состояния, для которых лечение является превентивным или профилактическим лечением.

В конкретном аспекте субъект не является субъектом, страдающим эпилепсией.

Аномальная модуляция передачи колебаний между нейронами действительно существует при различных типах неврологических заболеваний или расстройств (также обозначаемых в настоящей заявке как «нервные заболевания или расстройства») (Uhlhaas et al., Neuron, 2006, 52, 155-168: Neural synchrony in brain disorders: relevance for cognitive dysfunctions and pathophysiology; Basar E. et al. International Journal of Psychophysiology 103 (2016) 135-148, What does the broken brain say to the neuroscientist? Oscillations and connectivity in schizophrenia, Alzheimer’s disease, and bipolar disorder).

Нервная система человека делится на центральную нервную систему (ЦНС) и периферическую нервную систему (ПНС). ЦНС, в свою очередь, делится на головной и спинной мозг, лежащие во внутричерепной полости и позвоночном канале, соответственно. ЦНС и ПНС, действуя согласованно, объединяют сенсорную информацию и управляют моторными и когнитивными функциями. Фиг. 1 показывает упрощенную картину структуры головного мозга.

Синхронность (или синхронизация) внутри и/или между нейронными сетями, внутри и/или между различными областями мозга осуществляется посредством координации нейронных колебаний во времени (Buzsaki et al., Science, 2004, 304, 1926-1929: Neuronal oscillations in cortical networks).

Двигательные расстройства у субъекта обычно обусловлены гиперсинхронностью, которая означает, что синхронизация колебаний внутри и/или между нейронными сетями внутри и/или между различными областями мозга, обычно наблюдаемая на электроэнцефалограмме (ЭЭГ), слишком высока и/или слишком растянута ( «избыточная «) по сравнению со здоровым/нормальным субъектом.

Психические и когнитивные расстройства у субъекта обычно обусловлены нарушенной синхронностью, которая означает, что синхронизация колебаний внутри и/или между нейронными сетями внутри и/или между различными областями мозга, обычно наблюдаемая на ЭЭГ, понижена (обычно присутствует снижение активности) по сравнению со здоровым/нормальным субъектом, или даже исчезает, т.е. не обнаруживается [см. Таблицу 1: Аномальная нейронная синхронность при неврологических расстройствах (адаптировано из Uhlhaas et al., Neuron, 2006, 52, 155-168: Neural synchrony in brain disorders: relevance for cognitive dysfunctions and pathophysiology].

Таблица 1

Тип симптомов Неврологическое расстройство Нейронная синхронность Двигательные Болезнь Паркинсона высокая/растянутая (избыточная) Эпилепсия Дистония Психические Шизофрения низкая/ не обнаруживаемая (нарушенная) Аутизм Когнитивные Болезнь Альцгеймера

Поскольку «когерентность» является математическим методом, который количественно определяет частоту и амплитуду синхроничности у субъекта (состояние синхронности или синхронизации) нейронных паттернов колебательной активности мозга, можно считать, что слишком высокая и слишком низкая когерентность по сравнению со здоровым/нормальным субъектом участвуют в двигательных расстройствах и психических/когнитивных расстройствах, соответственно (Bowyer et al., Neuropsychiatric Electrophysiology, 2016, 2(1), 1-12: Coherence a measure of the brain networks: past and present) (см. Фиг. 2).

В конкретном аспекте, целевое неврологическое заболевание или расстройство в контексте настоящего изобретения выбрано из болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, эпилепсии, обсессивно-компульсивного расстройства, расстройства аутистического спектра, депрессивного расстройства, дистонии, синдрома Туретта, шизофрении, инсульта, афазии, деменции, шума в ушах, болезни Хантингтона, эссенциального тремора, биполярного расстройства, тревожных расстройств, аддиктивного расстройства, вегетативного состояния сознания, например, выбрано из болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, эпилепсии, обсессивно-компульсивного расстройства, расстройства аутистического спектра, депрессивного расстройства, дистонии, синдрома Туретта, шизофрении, инсульта, афазии, деменции, шума в ушах, болезни Хантингтона, эссенциального тремора, биполярного расстройства, аддиктивного расстройства, вегетативного состояния сознания, и по меньшей мере одного их симптома.

Как уже объяснялось выше, неврологические заболевания или расстройства можно классифицировать в зависимости от первичных симптомов, которые влияют на пациентов, которые представляют собой двигательные расстройства, психические (аффективные/социальные) расстройства и когнитивные расстройства, как более подробно описано ниже.

Пример двигательных расстройств

Болезнь Паркинсона

Болезнь Паркинсона (БП) поражает от 7 до 10 миллионов человек во всем мире и характеризуется тремором, дискинезией, брадикинезией, «замораживанием « походки и т.д. БП представляет собой медленно прогрессирующее дегенеративное заболевание головного мозга. Оно поражает нервные клетки в областях мозга, называемых базальными ганглиями и черной субстанцией. Нервные клетки черной субстанции вырабатывают дофамин, нейротрансмиттер, который действует как химический мессенджер в цепях мозга, важных для планирования и контроля движений тела. При БП у некоторых людей преждевременно отмирают продуцирующие дофамин нервные клетки черной субстанции (Corti et al., Physiol Rev, 2011, 91, 1161-1218: What genetics tells us about the causes and mechanisms of Parkinson’s disease). Когда дофаминовые рецепторы в полосатом теле не стимулируются должным образом, части базальных ганглий либо недостаточно, либо чрезмерно стимулированы. В частности, субталамическое ядро (STN) становится сверхактивным и действует как ускоритель на внутреннем сегменте бледного шара (GPi). Сверхстимуляция GPi оказывает чрезмерное ингибирующее действие на таламус, что, в свою очередь, снижает его производительность и вызывает замедление движения и ригидность (Guo et al., Frontiers in Computational Neuroscience, 2013, 7, 124, 1-11: Basal ganglia modulation of thalamocortical relay in Parkinson’s disease and dystonia).

Недостаток дофамина при БП связан с чрезмерной колебательной синхронизацией на частоте бета во всей двигательной сети кортикально-базальных ганглий. Действительно, уровни дофамина в базальных ганглиях, по прогнозам, подавляют бета-синхронность, что, в свою очередь, опосредует дофаминергическое вовлечение, необходимое для антиципации движения (Jenkinson et al., Trends in Neuroscience, 2011, 34(12), 611-618: New insights into the relationship between dopamine, beta oscillations and motor function). Если уровень дофамина в базальных ганглиях недостаточно высок, то больше не контролируется синхронность бета-колебаний, и может появиться медлительность движений. Другое наблюдение у пациентов с паркинсонизмом приводит к заключению, что кортикальные колебания в бета-диапазоне, приводят и управляют колебаниями в базальных ганглиях (Lalo et al., The Journal of Neuroscience, 2008, 28(12), 3008-3016: Patterns of bidirectional communication between cortex and basal ganglia during movement in patients with Parkinson disease).

Глубокую стимуляцию головного мозга (DBS) можно использовать для лечения симптомов тремора и ригидности (Eusebio et al., J Neurol Neurosurg Psychiatry, 2011, 82, 569-573: Deep brain stimulation can suppress pathological synchronization in parkinsonian patients). Лечение симптомов БП при помощи DBS одобрено FDA с 2002 года (эссенциальный тремор с 1997 года). Электростимуляцию обычно осуществляют в базальных ганглиях, в STN и в GPi. Как указано выше, бета-колебания в коре также вовлечены в патофизиологию заболевания, поэтому транскраниальная стимуляция (например, транскраниальная магнитная стимуляция - TMS) коры может также использоваться для лечения симптомов болезни Паркинсона (Cantello et al., Brain Research Reviews, 2002, 38, 309-327: Transcranial magnetic stimulation and Parkinson’s disease).

Дистония

Дистония представляет собой неврологическое расстройство, характеризующееся неправильными, непроизвольными скручивающими и поворачивающими движениями, которые отражают нарушение функции двигательной системы. Существует несколько форм дистонии, в зависимости от части тела, пораженной симптомами, от их генетического происхождения, от типа вовлеченного нейротрансмиттера и т.д. Дистоническая центральная нервная система (ЦНС) демонстрирует недостаточное торможение, которое провоцирует потерю реципрокного спинального торможения между противоположными мышцами. В случае дистонии верхних конечностей, например, аномальная синхронизация нейронов/нервов, дающих входной сигнал мышцам-антагонистам предплечья, приводит к совместному сокращению этих мышц-антагонистов (симптом дистонии) (Farmer et al., Brain, 1998, 121, 801-814: Abnormal motor unit synchronization of antagonist muscles underlies pathological co-contraction in upper limb dystonia).

Целевой точкой DBS, демонстрирующей интересный антидистонический эффект, является внутренний сегмент бледного шара (GPi-DBS). GPi-DBS был одобрен FDA в 2003 году для пациентов с хронической, трудно поддающейся лечению дистонией (Hu et al., Translational Neurodegeneration, 2014, 3(2), 1-5: Deep brain stimulation for dystonia). Стимуляция вентрального интермедиального ядра (VIM) таламуса (VIM-DBS) дает значительно менее выраженные эффекты. Стимуляция с использованием субталамического ядра (STN-DBS) была экспериментальной. GPi-DBS обеспечивает облегчение основных симптомов дистонии, но для полного развития терапевтического эффекта могут потребоваться недели или месяцы (Dressler et al., J Neural Transm, 2015, DOI 10,1007/s00702-015-1453-x: Strategies for treatment of dystonia).

Эпилепсия

Эпилепсия представляет собой заболевание головного мозга, которым страдают около 50 миллионов человек во всем мире, и для которого характерны преимущественно периодические и непредсказуемые нарушения нормальной работы мозга, называемые эпилептическими припадками. Эпилепсия означает не одно заболевание, а целый ряд расстройств, отражающих основную дисфункцию головного мозга, которая может быть вызвана многими различными причинами (генетическая мутация, опухоли головного мозга, травмы головы, инсульты, алкоголизм, воспаление головного мозга, инфекции, такие как менингит, ВИЧ или вирусный энцефалит и т.д.) (Fisher et al., Neurology, 2015, 28(2), 130-135: Redefining epilepsy).

Эпилептический припадок определяется как временное возникновение признаков и/или симптомов вследствие чрезмерной синхронной активности нейронов в мозге (Fisher et al., Epilepsia, 2005, 46(4), 470-472: Epileptic seizures and epilepsy: definitions proposed by the International League Against Epilepsy (ILAE) and the International Bureau for Epilepsy (IBE)). Кора головного мозга является основным элементом в генерации эпилептических припадков: многим людям ставят диагноз судороги фокальной лобной доли или медиальной височной доли (National Institute of Neurological Disorders and Stroke: http://www.ninds.nih.gov/disorders/epilepsy/detail_epilepsy.htm#3109_7). Идентификация областей повышенной локальной синхронности, или «гиперсинхронности», в коре позволяет предположить, что локальная гиперсинхронность может быть маркером областей, вызывающих приступы (Schevon et al., Neuroimage, 2007, 35(1), 140-148: Cortical abnormalities in epilepsy revealed by local EEG synchrony).

Нейростимуляция для лечения эпилепсии может принимать форму стимуляции периферических нервов, такую как стимуляция блуждающего нерва (VNS); стимуляция спинного мозга; транскраниальная стимуляция мозга (TES или TMS); или глубокая стимуляция головного мозга (DBS). Реактивная нейростимуляция является еще одной стратегией, при которой стимуляция передается только тогда, когда обнаруживается начало приступа. VNS и реактивная нейростимуляция были одобрены FDA для лечения некоторых типов эпилепсии в США. DBS переднего ядра таламуса (ANT) была одобрена в странах Европейского Союза (Fisher et al., Nature Reviews Neurology, 2014, 10, 261-270: Electrical brain stimulation for epilepsy).

Примеры психических расстройств (аффективные/социальные ухудшения)

Обсессивно-компульсивные расстройства (ОКР)

Обсессивно-компульсивные расстройство (ОКР) является распространенным психическим расстройством, которое часто является хроническим, тяжелым и чрезвычайно ослабляющим. Оно также обычно невосприимчиво к лечению, при этом значительная часть пациентов плохо поддается лечению или получает лишь частичное облегчение.

Функциональные нейровизуальные исследования продемонстрировали дисфункцию в орбитофронтальной коре, базальных ганглиях и полосатом теле.

Исследование показало, что симптомы острого ОКР могут быть связаны с аномально высокой колебательной активностью в субталамическом ядре (STN), особенно в левом полушарии и в диапазоне частот дельта-альфа (1-12 Гц) (Bastin et al., Cortex, 2014, 60, 145-150: Changes of oscillatory activity in the subthalamic nucleus during obsessive-compulsive disorder symptoms: two case reports). Кроме того, некоторые субталамические нейроны специфически увеличивали их частоту пульсации, когда возникали сомнения во время задачи верификации (Burbaud et al., brain, 2013, 136(1), 304-317: Neuronal activity correlated with checking behavior in the subthalamic nucleus of patients with obsessive-compulsive disorder).

DBS вентрального переднего бедра внутренней капсулы (VC) и смежного вентрального стриатума (VS) был одобрен в ЕС для лечения тяжелого и трудно поддающегося лечению ОКР (VC/VS-DBS).

Расстройства аутистического спектра

Аутизм представляет собой синдром нарушения нервно-психического развития, который определяется дефицитом социального взаимодействия и общения, а также необычными повторяющимися движениями, неизменными по форме и амплитуде. Аутизм представляет собой расстройство, которое обычно начинается в младенчестве, самое позднее в первые три года жизни. Аутизм является гетерогенным состоянием (нет двух детей или взрослых с аутизмом схожего профиля), что привело к концепции “расстройства аутистического спектра”, классифицирующей несколько уровней заболевания в зависимости от степени дефекта речи или общей когнитивной задержки, и в соответствии с серьезностью социальных или поведенческих симптомов (Lord et al., Neuron, 2000, 28, 355-363: Autism spectrum disorders). На одном конце этого спектра люди с аутизмом высоко функционируют, что позволяет им жить самостоятельно и сохранять работу. У людей, характеризующихся как низко функционирующие, проявляются более серьезные симптомы: трудности с речью (или даже невербальная речь), плохое социальное общение, самотравмирующее поведение (SIB), истерики и агрессия, которые могут быть потенциально опасными для жизни. Важной тенденцией в структурных и функциональных исследованиях головного мозга при аутизме является вовлечение сети для переработки социально-эмоциональной информации: лимбическая система, система переработки мимической информации и сеть зеркальных нейронов. Показано, что дефицит синхронизации колебаний гамма-диапазона связан с появлением симптомов (Sinha et al., Neurosurgery Focus, 2015, 38(6), E3: Deep brain stimulation for severe autism: from pathophysiology to procedure).

Двумя основными проявлениями симптомов, которые могут потребовать лечения при тяжелом аутизме, являются дефицит общения, включая невербальное общение и отсутствие реакции на речь, и SIB, которое может быть опасным для жизни. Похоже, что миндалевидное тело играет важную роль в патофизиологии этих нарушений. Измененный возбуждающий или ингибиторный контроль связан с аномалией патофизиологии аутизма. Нейромодуляция миндалевидных мишеней через DBS может представлять собой терапевтическое вмешательство для пациентов с тяжелым аутизмом. Три случая лечения при помощи DBS были описаны в литературе. Целью лечения было главным образом облегчить двигательные расстройства, такие как стереотипии (повторяющийся двигательный стереотип) и самотравмирующее поведение (SIB), связанные с заболеванием (Sinha et al., Neurosurgery Focus, 2015, 38(6), E3: Deep brain stimulation for severe autism: from pathophysiology to procedure; Stocco et al., Parkinsonism and related disorders, 2014, 20, 1035-1036: Deep brain stimulation for severe secondary stereotypies). Сообщалось, что в одном из трех случаев DBS в базально-латеральном ядре приводил к значительному улучшению связанных с аутизмом симптомов, такому как социальный контакт, модуляция аффекта и ночной сон (Sturm et al., Frontiers in Human Neuroscience, 2013, 6, 341, 1-10).

Шизофрения

Шизофрения представляет собой хроническое психиатрическое заболевание, для которого характерны, среди прочего, следующие симптомы: положительные симптомы, которые отражают аберрантную мыслительную деятельность (галлюцинации и бред); негативные симптомы, которые соответствуют дефициту ментальной функции, который обычно присутствует (расстройство мышления, притупление эмоциональной реакции, скудность речи). Что касается причин нетрудоспособности в течение жизни, шизофрения находится в первой десятке.

Значительное расширение желудочка и увеличение спинномозговой жидкости на поверхности мозга позволяют предположить, что мозг атрофирован. Эта потеря серого вещества и уменьшенное количество синаптических структур на нейронах позволяют предположить, что шизофрения является нарушением нервно-психического развития, что означает, что аномалии мозга уже присутствуют у пациентов с первым эпизодом (в отличие от нейродегенеративного расстройства).

Было продемонстрировано, что у пациентов с шизофренией наблюдаемое нарушение нервной системы связано с нарушением синхронизации гамма-диапазона (Spencer et al., The Journal of Neuroscience, 2003, 23(19), 7407-7411: Abnormal neural synchrony in schizophrenia; Gallinat et al., Clinical Neurophysiology, 2004, 115, 1863-1874: Reduced oscillatory gamma-band responses in unmedicated schizophrenic patients indicate impaired frontal network processing).

Электросудорожная терапия (ЭСТ), т.е. шоковая терапия, была продемонстрирована как один из наиболее успешных нефармакологических методов лечения шизофрении (Payne et al., J. Psychiatr. Pract., 2009, 15(5), 346-368: Electroconvulsive therapy part I: a perspective on the evolution and current practice of ECT). Она включает последовательное приложение электрического тока к мозгу, что вызывает судороги, сравнимые с эпилептическими.

Электростимуляция для симптоматического лечения шизофрении также возможна через DBS. Например, DBS прилежащего ядра (NAcc) при депрессия приводит к ремиссии ангедонии, т.е. восстановлению способности испытывать удовольствие (Schlaepfer et al., Neuropsychopharmacology, 2008, 33, 368-377: Deep brain stimulation to reward circuitry alleviates anhedonia in refractory major depression).

Пример когнитивного расстройства

Болезнь Альцгеймера

Болезнь Альцгеймера (AD) представляет собой нейродегенеративное расстройство, которое ведет к прогрессирующей потере умственных, поведенческих, функциональных способностей и способности к обучению. По состоянию на 2013 год, по оценкам, 5,2 миллиона американцев имели AD, приблизительно 200000 человек моложе 65 лет и 5 миллионов в возрасте 65 лет и старше (Alzheimers Dement. 2013, 9(2), 208-245: 2013 Alzheimer’s disease facts and figures).

Последние данные указывают на то, что когнитивные нарушения, наблюдаемые при болезни Альцгеймера, связаны с функциональным разрывом нейрокогнитивных сетей. Анализ глобальной синхронизации ЭЭГ показывает широко распространенное сокращение синхронизации альфа-, бета- и гамма-диапазонов, одновременно с увеличением синхронизации в дельта-диапазоне. Было показано, что у пациентов с легкой формой болезни Альцгеймера потеря синхронизации бета-диапазона коррелирует с когнитивными нарушениями (Schnitzler et al., Nature Reviews Neuroscience, 2005, 6, 285-296: Normal and pathological oscillatory communication in the brain). Клинические исследования продолжаются, чтобы оценить потенциал DBS для лечения болезни Альцгеймера.

НАНОЧАСТИЦЫ

В настоящей заявке описаны наночастица или агрегат наночастиц для применения в соответствии с настоящим изобретением для профилактики или лечения/для применения в профилактике или лечении неврологического заболевания или по меньшей мере одного его симптома у субъекта без воздействия на наночастицу или агрегат наночастиц электрического поля, и предпочтительно без воздействия на указанную наночастицу или агрегат наночастиц любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука, где материал наночастицы или агрегата наночастиц обычно выбирают из проводникового материала, полупроводникового материала, изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε_ijk, равной или выше 200, и изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε_ijk, равной или ниже 100.

Величина или размер наночастиц или агрегата наночастиц

В соответствии с настоящим изобретением, термины “наночастица” или “агрегат наночастиц” относятся к продукту, в частности, синтетическому продукту, с размером в нанометровом диапазоне, обычно от 1 нм до 1000 нм, или от 1 нм до 500 нм, например от по меньшей мере 10 нм до около 500 нм или до около 1000 нм, от по меньшей мере 30 нм до около 500 нм или до около 1000 нм, от по меньшей мере 40 нм до около 500 нм или до около 1000 нм, от по меньшей мере 45 нм до около 500 нм или до около 1000 нм, предпочтительно ниже 500 нм.

Термин “агрегат наночастиц” или “агрегат, состоящий из наночастиц” относится к совокупности наночастиц, которые сильно, как правило ковалентно, связаны друг с другом.

Электронная микроскопия, такая как сканирующая электронная микроскопия (SEM), просвечивающая электронная микроскопия (TEM), или крио-TEM, может использоваться для измерения размера наночастицы или агрегата наночастиц и, в частности, размера ядра наночастицы или агрегата наночастиц, т.е., наночастицы или агрегата наночастиц без их биосовместимого покрытия. Фактически, биосовместимое покрытие обычно состоит из соединений, которые состоят в основном из легких элементов (полимерные или органические соединения), чьи упругие взаимодействия с электронами повышенной энергии относительно слабы, что приводит к плохому контрасту изображения. TEM измеряет проецируемые изображения частиц, нанесенных на электронно-прозрачную подложку. Записанное изображение более чем около 50, предпочтительно более чем около 100, 150 или 200 наночастиц или агрегатов наночастиц на образец, как правило, следует обработать для оценки размера. Таким образом, записанное изображение более чем около 50 или предпочтительно более чем около 100, 150 или 200 наночастиц или агрегатов наночастиц позволяет установить средний по величине размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц популяции, а также размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц, представляющих 30%-70% процентиль популяции наночастиц и агрегатов наночастиц. Типичный протокол анализа можно найти в «NIST - NCL Joint Assay Protocol, PCC-7; Measuring the size of using transmission electron microscopy (TEM); version 1,1 December 2009».

Кроме того, динамическое рассеяние света (DLS) можно использовать для измерения гидродинамического диаметра наночастиц или агрегатов наночастиц (т.е., диаметра наночастиц или агрегата наночастиц, включающего как их ядро, так и их биосовместимое покрытие) в растворе. Гидродинамический диаметр - это диаметр эквивалентной твердой сферы, которая диффундирует с той же скоростью, что и аналит. Типичный протокол анализа можно найти в «NIST - NCL Joint Assay Protocol, PCC-1; Measuring the size of nanoparticles in aqueous media using batch-mode dynamic light scattering; version 1,1 February 2010». Результаты измерения размера частиц методом DLS могут не совпадать с результатами других методов (например, электронной микроскопии). Частично это связано с различиями в физических свойствах, которые фактически измеряются (например, гидродинамическая диффузия в сравнении с проектируемой площадью). Кроме того, DLS чувствителен к присутствию небольших количеств крупных частиц или кластеров более мелких частиц, тогда как электронная микроскопия обычно отражает размер первичных частиц (т.е. размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц) (см. NIST - NCL Joint Assay Protocol, PCC-1; Measuring the size of nanoparticles in aqueous media using batch-mode dynamic light scattering; version 1,1 February 2010).

Эти два метода, DLS и электронная микроскопия, могут далее использоваться один за другим для сравнения размеров и подтверждения указанного размера. Предпочтительным методом измерения размера наночастиц и агрегатов наночастиц является DLS (см. International Standard ISO22412 Particle Size Analysis- Dynamic Light Scattering, International Organisation for Standardisation (ISO) 2008). Средний гидродинамический диаметр наночастицы или агрегата наночастиц, измеренный при помощи DLS в растворе, представлен как распределение частиц по размерам по интенсивности (интенсивность рассеяния света пропорциональна размеру частиц) и измеренное при комнатной температуре (около 25°C).

Как правило, самая большая величина или размер представляет собой диаметр наночастицы круглой или сферической формы или самую большую длину наночастицы яйцевидной или овальной формы.

Самая большая величина наночастицы или агрегата, как определено в настоящей заявке, обычно составляет от около 2 нм до около 250 нм или до около 500 нм, предпочтительно от около 4 нм или 10 нм до около 100 нм или до около 200 нм, даже более предпочтительно от около (предпочтительно, по меньшей мере) 10 нм до около 150 нм, от около (предпочтительно, по меньшей мере) 30 нм до около 150 нм, от около (предпочтительно, по меньшей мере) 40 нм до около 500 нм, от около (предпочтительно, по меньшей мере) 45 нм до около 500 нм, предпочтительно ниже 500 нм.

При измерении среднего гидродинамического диаметра наночастицы или агрегата наночастиц в растворе обычно используют метод DLS. Определенный с использованием DLS, средний гидродинамический диаметр наночастицы или агрегата наночастиц в растворе обычно составляет от около 10 нм до около 500 нм, предпочтительно от около 10 нм или около 30 нм до около 100 нм или до около 500 нм, даже более предпочтительно от около 10 нм или около 30 нм до около 100 нм, около 150 нм, около 200 нм, около 250 нм, около 300 нм, около 350 нм, около 400 нм, около 450 нм или около 500 нм.

При измерении ядра наночастицы или агрегата наночастиц обычно используют метод электронной микроскопии. При использовании электронной микроскопии медианное значение наибольшего размера (также указано далее как «медианный наибольший размер») ядра наночастицы или агрегата наночастиц популяции обычно составляет от около 5 нм до около 250 нм или до около 500 нм, предпочтительно от около 5 нм, около 6 нм, около 7 нм, около 8 нм, около 9 нм, около 10 нм, около 11 нм, около 12 нм, около 13 нм, около 14 нм, около 15 нм, около 16 нм, около 17 нм, около 18 нм, около 19 нм, около 20 нм, около 21 нм, около 22 нм, около 23 нм, около 24 нм, около 25 нм, около 26 нм, около 27 нм, около 28 нм, около 29 нм, около 30 нм, около 31 нм, около 32 нм, около 33 нм, около 34 нм, около 35 нм, около 36 нм, около 37 нм, около 38 нм, около 39 нм, около 40 нм, около 41 нм, около 42 нм, около 43 нм, около 44 нм или около 45 нм до около 75 нм, около 76 нм, около 77 нм, около 78 нм, около 79 нм, около 80 нм, около 81 нм, около 82 нм, около 83 нм, около 84 нм, около 85 нм, около 86 нм, около 87 нм, около 88 нм, около 89 нм, около 90 нм, около 91 нм, около 92 нм, около 93 нм, около 94 нм, около 95 нм, около 96 нм, около 97 нм, около 98 нм, около 99 нм, около 100 нм, около 101 нм, около 102 нм, около 103 нм, около 104 нм, около 105 нм, около 106 нм, около 107 нм, около 108 нм, около 109 нм, около 110 нм, около 111 нм, около 112 нм, около 113 нм, около 114 нм, около 115 нм, около 116 нм, около 117 нм, около 118 нм, около 119 нм, около 120 нм, около 121 нм, около 122 нм, около 123 нм, около 124 нм, около 125 нм, около 130 нм, около 140 нм, около 150 нм, около 200 нм, около 250 нм, около 300 нм, около 350 нм, около 400 нм, около 450 нм или около 500 нм.

Обычно, при измерении размера ядра наночастицы или агрегата наночастиц при помощи инструментов электронной микроскопии, размер ядра наночастицы или агрегата наночастиц, представляющий 30%-70% процентиль популяции наночастиц и агрегатов наночастиц, составляет от около 5 нм, около 6 нм, около 7 нм, около 8 нм, около 9 нм, около 10 нм, около 11 нм, около 12 нм, около 13 нм, около 14 нм, около 15 нм, около 16 нм, около 17 нм, около 18 нм, около 19 нм, около 20 нм, около 21 нм, около 22 нм, около 23 нм, около 24 нм, около 25 нм, около 26 нм, около 27 нм, около 28 нм, около 29 нм, около 30 нм, около 31 нм, около 32 нм, около 33 нм, около 34 нм, около 35 нм, около 36 нм, около 37 нм, около 38 нм, около 39 нм, около 40 нм, около 41 нм, около 42 нм, около 43 нм, около 44 нм или около 45 нм до около 75 нм, около 76 нм, около 77 нм, около 78 нм, около 79 нм, около 80 нм, около 81 нм, около 82 нм, около 83 нм, около 84 нм, около 85 нм, около 86 нм, около 87 нм, около 88 нм, около 89 нм, около 90 нм, около 91 нм, около 92 нм, около 93 нм, около 94 нм, около 95 нм, около 96 нм, около 97 нм, около 98 нм, около 99 нм, около 100 нм, около 101 нм, около 102 нм, около 103 нм, около 104 нм, около 105 нм, около 106 нм, около 107 нм, около 108 нм, около 109 нм, около 110 нм, около 111 нм, около 112 нм, около 113 нм, около 114 нм, около 115 нм, около 116 нм, около 117 нм, около 118 нм, около 119 нм, около 120 нм, около 121 нм, около 122 нм, около 123 нм, около 124 нм, около 125 нм, около 130 нм, около 140 нм, около 150 нм, около 200 нм, около 250 нм, около 300 нм, около 350 нм, около 400 нм, около 450 нм, около 500 нм или около 520 нм.

Композиция наночастиц

Наночастица, полученная из проводникового материала

Наночастица, полученная из проводникового материала, представляет собой органическую наночастицу или неорганическую наночастицу.

Неорганическую наночастицу из проводникового материала обычно получают из металлического элемента, имеющего значение стандартного потенциала восстановления E°, равное или выше около 0,01, обычно измеряемое при 25°C и давлении 1 атм относительно стандартного водородного электрода (см. Table 2 «reduction reactions having E° values more positive than that of the standard hydrogen electrode», 8-25, Handbook of chemistry and physics; David R. Lide; 88^th Edition), более предпочтительно, равное или выше около 0,1, 0,2, 0,3, 0,4 или 0,5. Типичные металлические элементы, используемые для получения наночастицы, можно выбрать из Tl, Po, Ag, Pd, Ir, Pt, Au и их смесей. Предпочтительно металлический элемент, используемый в качестве проводникового материала для получения наночастицы, выбран из Ir, Pd, Pt, Au и их смеси, даже более предпочтительно выбран из Au, Pt, Pd и любой их смеси. Особенно предпочтительными материалами являются Au и Pt.

Обычно, наночастицы золота проявляют каталитическую активность, когда их размер уменьшается до нескольких нм (см. M. Auffan et al., Nature Nanotechnology 2009, 4(10), 634-641: Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective). Для того, чтобы уменьшить отношение поверхность/объем и, таким образом, минимизировать вклад поверхности неорганической наночастицы в каталитическую активность, предпочтительным является медианный наибольший размер ядра наночастицы или агрегата наночастиц популяции, составляющий по меньшей мере 30 нм, обычно по меньшей мере 40 нм или по меньшей мере 45 нм. Интересно, что авторы изобретения обнаружили, что наночастицы золота с наибольшим медианным размером ядра наночастицы или агрегата наночастиц популяции, равным 45 нм, и/или размером ядра наночастицы или агрегата наночастиц, представляющим 30%-70% процентиль популяции наночастиц и агрегатов наночастиц между 42 нм и 49 нм, были более эффективными для предотвращения/спасающего действия на индуцируемые MPP⁺ функциональные эффекты на нейронную сеть, чем наночастицы золота с наибольшим медианным размером ядра популяции наночастиц, равным 15 нм, и/или размером ядра наночастицы или агрегата наночастиц, представляющим 30%-70% процентиль популяции наночастиц и агрегатов наночастиц между 14 нм и 16 нм, при этом протестированные наночастицы золота содержали одинаковую концентрацию золота (см. примеры 9 и 10).

Органическую наночастицу из проводникового материала обычно получают из органического материала, имеющего в своей структуре смежные sp2-гибридизированные углеродные центры (т.е. двойную углеродную связь или ароматические циклы, содержащие гетероатомы, обычно N или S, в ароматическом цикле или вне ароматического цикла). Предпочтительные органические материалы выбирают из полианилина, полипиррола, полиацетилена, политиофена, поликарбазола, полипирена, поли (3,4-этилендиокситиофена) и/или поли(3,4-этилендиокситиофен)полистиролсульфоната.

В конкретном аспекте, наибольший медианный размер ядра наночастицы или агрегата наночастиц популяции составляет по меньшей мере 30 нм или по меньшей мере 40 нм и предпочтительно ниже 500 нм, как описано выше, например 45 нм, когда материал представляет собой проводниковый материал, как описано выше, в частности, металлический материал, обычно металл, имеющий стандартный потенциал восстановления E° выше 0,2, или органический материал, обычно органический материал, имеющий в своей структуре смежные sp2- гибридизированные углеродные центры, предпочтительно металлический материал, как описано выше, в частности, любой один из Au, Pt, Pd и любая их смесь.

Наночастица, полученная из полупроводникового материала

Наночастица, полученная из полупроводникового материала обычно представляет собой неорганическую наночастицу.

Неорганические наночастицы обычно получают с использованием полупроводникового материала, имеющего относительно малую энергию запрещенной зоны (Eg) между его валентной зоной и зоной проводимости. Обычно полупроводниковый материал имеет энергию запрещенной зоны (энергетическую щель) Eg ниже 3,0 эВ, обычно при измерении при комнатной температуре (около 25°C) (см., например, table 12-77, Table 3; Handbook of chemistry and physics; David R. Lide; 88^th Edition). В конкретном аспекте, материал представляет собой беспримесный полупроводниковый материал или примесный полупроводниковый материал, как дополнительно описано ниже.

Беспримесные полупроводниковые материалы обычно состоят из элемента из группы IV A периодической таблицы Менделеева, такого как кремний (Si) или германий (Ge), в смешанной композиции элементов из групп III и V периодической таблицы Менделеева, такой как AlSb, AlN, GaP, GaN, InP, InN и т.д., или в смешанной композиции элементов из групп II и VI периодической таблицы Менделеева, такой как ZnSe, ZnTe, CdTe и т.д.

Примесные полупроводниковые материалы обычно включают или состоят из беспримесного полупроводника, полученного с высокой степенью химической чистоты, причем беспримесный полупроводниковый материал содержит легирующую примесь. В конкретном аспекте, когда примесный полупроводниковый материал наночастиц или агрегата наночастиц состоит из элемента из группы IVA периодической таблицы Менделеева, он легируется носителем заряда, выбранным из Al, B, Ga, In и P. Такие примесные полупроводниковые материалы могут быть либо n-типа, в которых преобладают отрицательные носители заряда, либо p-типа, в которых преобладают положительные носители заряда. Типичный примесный полупроводниковый материал p-типа состоит из кремния (Si) или германия (Ge), легированного заряженным носителем, выбранным из алюминия (Al), бора (B), галлия (Ga) и индия (In); Типичный примесный полупроводниковый материал p-типа состоит из кремния (Si) или германия (Ge), обычно легированного фосфором (P).

Как правило, было показано, что энергия запрещенной зоны полупроводниковых наночастиц увеличивается, когда размер наночастиц уменьшается ниже 10 нм (см. M. Auffan et al., Nature Nanotechnology 2009, 4(10), 634-641: Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective). Чтобы обеспечить низкое отношение поверхность/объем и поддерживать объемную энергетическую щель наночастиц или агрегатов наночастиц ниже 3,0 эВ, предпочтительным является наибольший медианный размер ядра наночастицы или агрегата наночастиц популяции, составляющий по меньшей мере 30 нм, предпочтительно по меньшей мере 40 нм.

Таким образом, в конкретном аспекте наибольший медианный размер ядра наночастицы или агрегата наночастиц популяции составляет по меньшей мере 30 нм или по меньшей мере 40 нм и предпочтительно ниже 500 нм, когда материал представляет собой полупроводниковый материал, как описано выше, в частности, полупроводниковый материал с энергетической щелью Eg ниже 3,0 эВ, обычно материал, состоящий из элемента из группы IVA периодической таблицы Менделеева, в частности, элемента из группы IVA периодической таблицы Менделеева, легированного носителем заряда, выбранным из Al, B, Ga, In и P, или смешанной композиции элементов из группы III и V периодической таблицы Менделеева или смешанной композиции элементов из группы II и VI периодической таблицы Менделеева.

Наночастица, полученная из изоляционного материала, имеющего высокую относительную диэлектрическую проницаемость (диэлектрическую проницаемость), т.е. равную или выше 200

Наночастицы, полученные из, или состоящие из, изоляционного материала, имеющего высокую относительную диэлектрическую проницаемость ε_ijk (также называемую диэлектрической проницаемостью), обычно получают из материала, имеющего величину энергетической щели Eg, равную или выше 3,0 эВ, обычно при измерении при комнатной температуре (около 25°C), и относительную диэлектрическую проницаемость ε_ijk, равную или выше 200, которую обычно измеряют между 20°C и 30°C и от 10² Гц до частоты инфракрасного диапазона (см., например, table 12-45 “Permittivity (dielectric constant) of inorganic solid”; Handbook of chemistry and physics; David R. Lide; 88^th Edition; Compilation of the static dielectric constant of inorganic solid. K.F. Young and H.P.R. Frederikse. J. Phys. Chem. Ref. Data, Vol. 2, No. 2, 1973).

Такие наночастицы обычно получают из диэлектрического материала, который представляет собой смешанный металлооксид, предпочтительно выбранный из BaTiO₃, PbTiO₃, KTaNbO₃, KTaO₃, SrTiO₃, BaSrTiO₃ и т.д.

Как правило, структура типа перовскита PbTiO₃ наночастиц показала изменение температуры их перехода из параэлектрической в сегнетоэлектрическую фазу для наночастиц размером менее 20 нм - 30 нм (см. M. Auffan et al., Nature Nanotechnology 2009, 4(10), 634-641: Towards a definition of inorganic nanoparticles from an environmental, health and safety perspective). Для обеспечения низкого соотношения поверхность/объем и поддержания диэлектрических свойств наночастиц или агрегатов наночастиц предпочтительным является наибольший медианный размер ядра наночастицы или агрегата наночастиц популяции, составляющий по меньшей мере 30 нм, обычно по меньшей мере 40 нм.

Таким образом, в конкретном аспекте наибольший медианный размер ядра наночастицы или агрегата наночастиц популяции составляет по меньшей мере 30 нм или по меньшей мере 40 нм и предпочтительно ниже 500 нм, когда материал представляет собой изоляционный материал, как описано выше, имеющий высокую относительную диэлектрическую проницаемость ε_ijk, равную или выше 200, в частности, изоляционный материал с энергетической щелью Eg, равной или выше 3,0 эВ, предпочтительно смешанный металлооксид, выбранный из BaTiO₃, KTaNbO₃, KTaO₃, SrTiO₃ и BaSrTiO₃.

Наночастица, полученная из изоляционного материала, имеющего низкую относительную диэлектрическую проницаемость (диэлектрическую проницаемость), т.е. равную или ниже 100

Наночастицы, полученные из, или состоящие из, изоляционного материала, имеющего низкую относительную диэлектрическую проницаемость, обычно получают из материала, имеющего величину энергетической щели Eg, равную или выше 3,0 эВ, обычно при измерении при комнатной температуре (около 25°C), и относительную диэлектрическую проницаемость ε_ijk, равную или ниже 100, предпочтительно ниже 50 или ниже 20, которую обычно измеряют между 20°C и 30°C и от 10² Гц до частоты инфракрасного диапазона, (см., например, table 12-45 “Permittivity (dielectric constant) of inorganic solid”; Handbook of chemistry and physics; David R. Lide; 88th Edition; Compilation of the static dielectric constant of inorganic solid. K.F. Young and H.P.R. Frederikse. J. Phys. Chem. Ref. Data, Vol. 2, No. 2, 1973).

Такие наночастицы обычно получают из диэлектрического материала, который выбран из оксида металла, смешанного оксида металла, металлический элемент которого выбран из периода 3, 5 или 6 периодической таблицы Менделеева или лантаноида, и углеродного материала. Диэлектрический материал предпочтительно выбирают из Al₂O₃, LaAlO₃, La₂O₃, SiO₂, SnO₂, Ta₂O₅, ReO₂, ZrO₂, HfO₂ и алмазоподобного углерода. Более предпочтительно, диэлектрический материал представляет собой оксид металла, выбранный из ReO₂, ZrO₂, HfO₂ и любой их смеси. Особенно предпочтительным является диэлектрический материал, выбранный из ZrO₂ и HfO₂. В конкретном и предпочтительном аспекте диэлектрический материал или оксид металла не является CeO₂ (оксид церия), Fe₃O₄ (оксид железа), SiO₂ (диоксид кремния) или любой их смесью.

Цирконий (Zr) и гафний (Hf) оба являются элементами в состоянии окисления 4⁺, а элементы Zr⁴⁺ и Hf⁴⁺ практически идентичны по размеру и химическим свойствам; именно поэтому эти два иона рассматривают вместе при установлении химии их водных растворов (см. chapter 8, section 8,2 Zr4+ and Hf4+, p. 147 “The hydrolysis of cations”, Baes C.F. & Mesmer R.E.; John Wiley and Sons, Inc. reprint Edition 1986).

В конкретном аспекте наибольший медианный размер ядра наночастицы или агрегата наночастиц популяции составляет по меньшей мере 10 нм и предпочтительно ниже 500 нм, как описано выше, когда материал выбран из ReO₂, ZrO₂, HfO₂, предпочтительно из ZrO₂ и HfO₂, и любой их смеси, как описано выше.

Форма наночастиц или агрегата наночастиц

Поскольку форма частицы или агрегата может влиять на их «биосовместимость», предпочтительными являются частица или агрегат, имеющие довольно однородную форму. По фармакокинетическим причинам предпочтительными являются наночастицы или агрегаты по существу сферической, круглой или яйцевидной формы. Такая форма также способствует взаимодействию наночастицы или агрегата с клетками или поглощению клетками. Сферическая или круглая форма является особенно предпочтительной.

Форму наночастицы или агрегата наночастиц обычно оценивают при помощи электронной микроскопии, такой как просвечивающая электронная микроскопия (TEM).

Биосовместимое покрытие наночастиц или агрегатов наночастиц

В предпочтительном варианте осуществления ядро наночастицы или агрегата наночастиц, используемых в контексте настоящего изобретения для получения представляющей интерес композиции, может быть покрыто биосовместимым материалом, выбранным из агента, проявляющего малозаметные свойства. Агент, проявляющий малозаметные свойства, может быть агентом, демонстрирующим стерическую группу. Такая группа может быть выбрана, например, из полиакрилата; полиакриламид(поли(N-изопропилакриламида)); поликарбамида; биополимера; полисахарида, такого как декстран или ксилан; и коллагена. В другом предпочтительном варианте осуществления ядро наночастиц или агрегатов наночастиц может быть покрыто биосовместимым материалом, выбранным из агента, обеспечивающего взаимодействие с биологической мишенью. Такой агент обычно может вносить положительный или отрицательный заряд на поверхность наночастиц или агрегата наночастиц. Агент, образующий положительный заряд на поверхности наночастицы или агрегата наночастиц, может представлять собой, например, аминопропилтриэтоксисилан или полилизин. Агент, образующий отрицательный заряд на поверхности наночастицы или агрегата наночастиц, может представлять собой, например, фосфат (например, полифосфат, метафосфат, пирофосфат и т.д.), карбоксилат (например, цитрат или дикарбоновую кислоту, в частности, янтарную кислоту) или сульфат.

В предпочтительном варианте осуществления ядро наночастицы или агрегата наночастиц, используемых в контексте настоящего изобретения, представляет гидрофильный нейтральный поверхностный заряд или покрыто биосовместимым материалом (т.е. агентом для покрытия), выбранным из гидрофильного агента, придающего нейтральный поверхностный заряд наночастице. Действительно, когда наночастицы по настоящему изобретению вводят субъекту, наночастицы, представляющие гидрофильный нейтральный поверхностный заряд, или ядро наночастиц, покрытых биосовместимым агентом, выбранным из гидрофильного агента, придающего нейтральный поверхностный заряд наночастицам, являются особенно выгодными для оптимизации использования описанных в настоящей заявке наночастиц при лечении неврологического заболевания.

Гидрофильный агент, придающий нейтральный поверхностный заряд ядру наночастицы или агрегата наночастиц, может представлять собой агент, включающий функциональную группу, выбранную из спирта (R-OH), альдегида (R-COH), кетона (R-CO- R), сложного эфира (R-COOR), кислоты (R-COOH), тиола (R-SH), сахарида (например, глюкозы, фруктозы, рибозы), ангидрида (RCOOOC-R) и пиррола. Гидрофильный агент, придающий нейтральный поверхностный заряд ядру наночастицы или агрегата наночастиц, может представлять собой мономер, димер, олигомер, полимер или сополимер. Когда агент представляет собой олигомер, он может представлять собой олигосахарид, такой как циклодекстрин. Когда агент представляет собой полимер, он может быть сложным полиэфиром (таким как поли(молочная кислота) или полигидроксиалкановая кислота), простым полиэфиром, полиэтиленоксидом, полиэтиленгликолем, поливиниловым спиртом, поликапролактоном, поливинилпирролидоном, полисахаридом, таким как целлюлоза, полипирролом и т.д.

Кроме того, гидрофильный агент, придающий нейтральный поверхностный заряд ядру наночастицы или агрегата наночастиц, может представлять собой агент, включающий специфические группы (R-), способные взаимодействовать с поверхностью наночастицы или агрегата наночастиц. R обычно выбирают из тиольной, силановой, карбоксильной и фосфатной группы.

Когда ядро наночастицы или агрегата наночастиц представляет собой проводник или полупроводник и металлическую наночастицу, R предпочтительно представляет собой тиольную, тиоэфирную, сложную тиоэфирную, дитиолановую или карбоксильную группу. Предпочтительно, гидрофильный нейтральный агент для покрытия выбран из тиоглюкозы, 2-меркаптоэтанола, 1-тиоглицерина, тиодигликоля и гидроксимасляной кислоты.

Когда ядро наночастицы или агрегата наночастиц представляет собой диэлектрик и оксидную или смешанную оксидную наночастицу, R предпочтительно представляет собой силановую или фосфатную группу. Предпочтительно, гидрофильный нейтральный агент для покрытия представляет собой гидроксиметилтриэтоксисилан, фруктозо-6-фосфатное или глюкозо-6-фосфатное соединение.

Гидрофильный агент, придающий нейтральный поверхностный заряд ядру наночастицы или агрегата наночастиц, может представлять собой цвиттерионное соединение, такое как аминокислота, пептид, полипептид, витамин или фосфолипид.

Поверхностный заряд наночастицы или агрегата наночастиц обычно определяют, как хорошо известно специалисту, путем измерения зета-потенциала, обычно в (растворе) в воде, имеющем концентрацию материала наночастиц или агрегатов наночастиц от 0,01 до 10 г/л, рН между 6 и 8 и типично концентрацию электролитов (в воде) от 0,001 до 0,2 M, например 0,01 M или 0,15 M. В условиях, определенных выше, поверхностный заряд наночастицы или агрегата наночастиц обычно составляет от -10 мВ до+10 мВ (соответствует нейтральному поверхностному заряду), от -20 мВ до+20 мВ или от -35 мВ до+35 мВ. В нейтральном состоянии поверхностный заряд наночастиц или агрегатов наночастиц обычно находится в диапазоне от -10 мВ, -9 мВ, -8 мВ, -7 мВ, -6 мВ, -5 мВ, -4 мВ, -3 мВ, -2 мВ или -1 мВ до 1мВ, 2 мВ, 3 мВ, 4 мВ, 5 мВ, 6 мВ, 7 мВ, 8 мВ, 9 мВ или 10 мВ. При отрицательном значении поверхностный заряд наночастиц или агрегата наночастиц обычно ниже -11 мВ, -12 мВ, -13 мВ, -14 мВ -15 мВ, -16 мВ, -17 мВ, -18 мВ, -19 мВ, -20 мВ, -21 мВ, -22 мВ, -23 мВ, -24 мВ, -25 мВ, -26 мВ, -27 мВ, -28 мВ, -29 мВ, -30 мВ, -31 мВ, -32 мВ, -33 мВ, -34 мВ или -35 мВ.

Полное биосовместимое покрытие наночастицы или агрегата может быть выгодным в контексте настоящего изобретения, чтобы избежать какого-либо электрического заряда на поверхности наночастицы, когда наночастица представляет гидрофильный нейтральный поверхностный заряд. “Полное покрытие” подразумевает наличие очень высокой плотности/компактности биосовместимых молекул, способных создавать по меньшей мере полный монослой на поверхности частицы.

Биосовместимое покрытие обеспечивает, в частности, стабильность наночастиц в жидкости, такой как физиологическая жидкость (кровь, плазма, сыворотка и т.д.) или любой изотонической среде или физиологической среде, необходимой для фармацевтического введения.

Стабильность может быть подтверждена количественным определением сухого экстракта с использованием сушильной печи и измерением на суспензии наночастиц до и после фильтрации, обычно на фильтре 0,45 мкм.

Преимущественно покрытие сохраняет целостность частицы in vivo, обеспечивает или улучшает ее биосовместимость и облегчает ее необязательную функционализацию (например, с молекулами спейсера, биосовместимыми полимерами, таргетирующими агентами, белками и т.д.).

Биосовместимая наночастица или агрегат наночастиц по изобретению не должна ни растворять, ни высвобождать токсичные вещества после введения in vivo (т.е. при физиологическом pH), ни представлять окислительно-восстановительное поведение, обычно для того, чтобы указанную наночастицу или агрегат наночастиц считали биосовместимой, то есть для безопасного применения для субъекта, в частности млекопитающего, предпочтительно человека.

Другой конкретный объект, описанный в настоящей заявке, относится к композиции, в частности, фармацевтической композиции, включающей наночастицы и/или агрегаты наночастиц, такие, которые определены выше, предпочтительно вместе с фармацевтически приемлемым носителем или растворителем.

В частности, в настоящей заявке описана композиция для применения для профилактики или лечения/для применения в профилактике или лечении неврологического заболевания, описанного в настоящей заявке, или по меньшей мере одного его симптома у субъекта без воздействия на наночастицы или агрегаты наночастиц электрического поля, и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука, где композиция включает или состоит из наночастиц и/или агрегатов наночастиц и фармацевтически приемлемого носителя, и где материал наночастицы или агрегата наночастиц обычно выбирают из проводникового материала, полупроводникового материала, изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε_ijk, равной или выше 200, и изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε_ijk, равной или ниже 100, как описано и объяснено выше.

В предпочтительном аспекте, композиция включает или состоит из по меньшей мере двух отдельных наночастиц и/или агрегатов наночастиц, при этом каждая наночастица или агрегат наночастиц состоит из отдельного материала, обычно выбранного из проводникового материала, полупроводникового материала, изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε_ijk, равной или выше 200, и изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε_ijk, равной или ниже 100.

В типичном аспекте изобретения описанные в настоящей заявке наночастица(ы) или агрегат(ы) наночастиц не используются в качестве носителя(носителей) (активного) терапевтического соединения(соединений) или лекарственного средства(средств).

В конкретном аспекте композиция может включать наночастицы или агрегаты наночастиц по изобретению вместе с терапевтическим средством. В контексте настоящего изобретения такое терапевтическое средство обычно не является наночастицей или агрегатом наночастиц. Терапевтическое средство может быть выбрано из любого лекарственного средства, используемого при лечении неврологического расстройства. Терапевтическое средство обычно выбирают из антипсихотических, антидофаминергических, дофаминергических, антихолинергических, холинергических, антиглутаматергических, глутаматергических лекарственных средств, ингибиторов ацетилхолинэстеразы, антагонистов рецепторов N-метил D-аспартата (NMDA), агонистов гамма-аминомасляной кислоты (GABA), ботулинического токсина, антидистонических препаратов, противоэпилептических препаратов, противосудорожных средств, стабилизаторов настроения, антидепрессантов и седативных средств.

Композиция может быть в форме твердого вещества, жидкости (частицы в суспензии), аэрозоля, геля, пасты и т.п. Предпочтительные композиции находятся в форме жидкости или геля. Особенно предпочтительные композиции находятся в жидкой форме.

Используемая фармацевтически приемлемая подложка или носитель может представлять собой любой классический носитель, известный специалистам в данной области, такой как, например, солевой, изотонический, стерильный, буферный раствор, неводный раствор носителя и т.п.

Композиция также может включать стабилизаторы, подсластители, поверхностно-активные вещества, полимеры и т.п.

Она может быть сформулирована, например, в виде ампулы, аэрозоля, флакона, таблетки, капсулы с использованием методов формулирования фармацевтических препаратов, известных специалисту в данной области.

Наночастицы или агрегаты наночастиц по изобретению можно вводить субъекту с использованием различных возможных путей, таких как внутричерепной, внутривенный (IV), через дыхательные пути (ингаляция), интратекальный, внутриглазной или пероральный путь (per os), интрацеребровентрикулярный (ICV), предпочтительно с использованием внутричерепного или интратекального пути.

При необходимости можно использовать повторные инъекции или введения наночастиц. Предпочтительно, наночастицы или агрегаты наночастиц должны вводиться один раз.

После введения наночастицы и/или агрегаты наночастиц обычно взаимодействуют с нейронами. В предпочтительном аспекте это взаимодействие представляет собой длительное взаимодействие, то есть взаимодействие в течение нескольких часов, дней, недель или месяцев. В конкретном аспекте наночастицы или агрегаты наночастиц остаются в организме субъекта.

В настоящей заявке описаны наночастицы, агрегаты наночастиц и композиции, включающие такие наночастицы или агрегаты наночастиц, предназначенные для применения у субъекта, обычно для применения у животного, предпочтительно у млекопитающего, даже более предпочтительно у человека-пациента, независимо от его возраста и пола.

Типичное количество(количества) наночастиц или агрегатов наночастиц, вводимых в кору головного мозга, гиппокамп и/или миндалевидное тело субъекта, составляет(составляют) от 10⁵ до 10¹⁷, от 10⁵ до 10¹⁶ или от 10⁵ до 10¹⁵, предпочтительно от 10⁷ до 10¹⁴, более предпочтительно от 10⁹ до 10¹². Кроме того, типичное количество(количества) наночастиц или агрегатов наночастиц, вводимых в кору головного мозга, гиппокамп и/или миндалевидное тело субъекта, составляет(составляют) от 10² до 10¹² наночастиц или агрегатов наночастиц на см³.

Типичное количество(количества) наночастиц или агрегата наночастиц, вводимых глубоко в мозг субъекта, составляет(составляют) от 10⁴ до 10¹⁷, от 10⁴ до 10¹⁶, от 10⁴ до 10¹⁵ или от 10⁴ до 10¹⁴, предпочтительно от 10⁶ до 10¹², более предпочтительно от 10⁸ до 10¹¹. Кроме того, типичное количество(количества) наночастиц или агрегатов наночастиц, вводимых глубоко в мозг субъекта, составляет(составляют) от 10¹ до 10¹¹ наночастиц или агрегатов наночастиц на см³.

Кроме того, в настоящей заявке описан способ для профилактики или лечения неврологического заболевания или по меньшей мере одного его симптома у субъекта, где способ включает стадию введения любых из описанных в настоящей заявке наночастиц или агрегатов наночастиц субъекту. Этот способ обычно не включает какую-либо стадию воздействия на субъекта, и более точно на наночастицы или агрегаты наночастиц, которые были введены указанному субъекту, электрического поля, и предпочтительно также не включает какую-либо стадию воздействия на субъекта, и более точно на наночастицы или агрегаты наночастиц, которые были введены указанному субъекту, любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука.

Следующий объект, описанный в настоящей заявке, относится к набору, включающему или состоящему из по меньшей мере двух отдельных наночастиц и/или по меньшей мере двух отдельных агрегатов наночастиц, как описано в настоящей заявке, при этом каждая наночастица или агрегат наночастиц состоит из отдельного материала, обычно выбранного из проводникового материала, полупроводникового материала, изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε_ijk, равной или выше 200, и изоляционного материала с диэлектрической проницаемостью ε_ijk, равной или ниже 100, как описано в настоящей заявке.

В конкретном варианте осуществления набор включает, в отдельных контейнерах, отдельные наночастицы и/или агрегаты наночастиц, как описано в настоящей заявке, (которые предназначены для контакта, обычно в смешанном виде, либо in situ, т.е. на участке-мишени, либо in vitro, либо ex vivo до осаждения смеси на участке-мишени).

Следующий объект относится к набору, дополнительно включающему по меньшей мере одно дополнительное терапевтическое средство, отличное от наночастиц или агрегатов наночастиц, как описано в настоящей заявке, такое как антипсихотическое, антидофаминергическое, дофаминергическое, антихолинергическое, холинергическое, антиглутаматергическое, глутаматергическое средства, ингибитор ацетилхолинэстеразы, антагонист рецептора N-метил D-аспартата (NMDA), агонист гамма-аминомасляной кислоты (GABA), ботулинический токсин, антидистоническое средство, антиэпилептическое средство, противосудорожные средства, стабилизатор настроения, антидепрессант и седативное средство, которое специалист в данной области сможет выбрать в зависимости от характера целевого заболевания. Как объяснено выше, такое дополнительное терапевтическое средство обычно не является ни наночастицей, ни агрегатом наночастиц.

Также в настоящей заявке описано применение, in vivo, in vitro или ex vivo такого набора в способе для профилактики или лечения неврологического заболевания, как описано в настоящей заявке, или по меньшей мере одного его симптома у субъекта, без воздействия на наночастицы или агрегаты наночастиц, вводимые субъекту, электрического поля, и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука. Кроме того, в настоящей заявке раскрыт набор, как описано в настоящей заявке, для применения в профилактике или лечении неврологического заболевания или по меньшей мере одного его симптома у субъекта, без воздействия на наночастицы или агрегаты наночастиц, вводимые субъекту, электрического поля, и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука.

На уровне нейронов наночастицы, как было описано, усиливают или ингибируют электрическую возбудимость нейронов. Например, авторы обнаружили, что оксид цинка, углеродные нанотрубки и наночастицы золота усиливают электрическую возбудимость нейронов, тогда как оксид меди, серебро, сажа, оксид железа и оксид титана, как было обнаружено, ингибируют электрическую возбудимость нейронов (Polak P & Shefi O. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology and Medicine 11 (2015) 1467-1479, Nanometric agents in the service of neuroscience: Manipulation of neuronal growth and activity using nanoparticles).

Исследования системного влияния на нейронные системы наночастиц серебра с покрытием (cAgNP) - с использованием амфифильного полимера полиэтиленгликоля - [cAgNP с гидродинамическим диаметром 13 нм ± 2 нм (метод динамического рассеяния света) и зета-потенциалом -69 мВ (Zetasizer Nano) в чистой воде]) показали, что наночастицы вызывают изменения в механизме, влияющем на возбудимость. Кроме того, моделирование нейронной сети показало, что локально вызванные cAgNP изменения приводят к изменениям сетевой активности во всей сети, указывая на то, что локальное применение cAgNP может влиять на активность всей сети (Busse M. et al. International Journal of Nanomedicine 2013:8 3559-3572, Estimating the modulatory effects of nanoparticles on neuronal circuits using computational upscaling).

Кроме того, было описано, что повышенная возбудимость нейронов, ассоциированных с внутриклеточными наночастицами золота, потенциально может оказывать вредное воздействие на нейроны при патологических состояниях, таких как эпилептический припадок (Jung S, et al. PLOS ONE 2014, 9(3) e91360, Intracellular gold nanoparticles increase neuronal excitability and aggravate seizure activity in the mouse brain).

Наночастицы или агрегаты наночастиц по настоящему изобретению предназначены для применения для профилактики или лечения/для применения в профилактике или лечении неврологического заболевания или по меньшей мере одного его симптома, путем нормализации синхронизации колебаний внутри и/или между нейронными сетями внутри и/или между различными областями мозга, без воздействия на указанные наночастицы или агрегаты наночастиц электрического поля, и предпочтительно без воздействия на них любого другого внешнего источника активации, такого как источник света, магнитное поле или источник ультразвука.

Как показано Фиг. 2 и 3, коммуникация внутри и/или между отдельными областями мозга нарушается при неврологическом заболевании. В соответствии с неврологическим расстройством и связанными с ним симптомами, воздействие на конкретную область мозга наночастиц по настоящему изобретению улучшит коммуникацию путем нормализации синхронизации колебаний внутри и/или между нейронными сетями внутри и/или между отдельными областями мозга (т.е. нормализацию когерентности) (Фиг. 4 и 5).

Следующие примеры и соответствующие им чертежи иллюстрируют изобретение, не ограничивая его объем.

ЧЕРТЕЖИ

Фиг. 1. Схематическое представление головного мозга (сагиттальная плоскость).

Фиг. 2. Гиперсинхронность и нарушенная синхронность между двумя нейронными сетями.

Фиг. 3. Области мозга, вовлеченные в различные неврологические заболевания.

Фиг. 4. Эффект наночастиц (NP) на нормализацию гиперсинхронности (двигательные расстройства).

Фиг. 5. Эффект наночастиц (NP) на нормализацию нарушенной синхронности (психические и когнитивные расстройства).

Фиг. 6. Экспериментальная схема индукции болезни Паркинсона с MPP⁺ обработкой и регистрацией электрической активности.

Совместные культуры вентрального среднего мозга/коры мыши получали от мышей NMRI E14.5 и культивировали на 48-луночных MEA в течение 3 недель (общий период культивирования). Культуры обрабатывали через 7 дней в культуре (день 7) суспензиями наночастиц (группы “Наночастицы”), GDNF (20 нг/мл) (“Референтная” группа) или водой (“Контрольная” группа и “MPP⁺” группа) и на 8 день при помощи MPP⁺ (20 мкМ) (группы “Наночастицы”, “Референтная” группа и “MPP⁺” группа) или водой (“Контрольная” группа). Спонтанная активность была зарегистрирована на 21 день.

Фиг. 7. Схема двух упрощенных вспышек (импульса), показывающая некоторые из параметров, которые можно извлечь из записи электрической активности. Указываются параметры, описывающие общую активность (спайк, вспышка, интервал между вспышками (IBI) и период вспышки) и структуру вспышки (длительность вспышки, плато вспышки, амплитуда вспышки, интервал между импульсами вспышки (ISI) и площадь вспышки). Стандартные отклонения (SD) этих параметров являются показателями регулярности общей активности и структуры вспышки, соответственно. Коэффициент вариации во времени (CVtime) отражает временную регулярность паттерна активности каждой единицы. CVtime рассчитывают как отношение стандартного отклонения параметра к среднему значению. Коэффициент вариации среди сети (CVnet) отражает синхронизацию между нейронами в сети. CVnet рассчитывают как отношение стандартного отклонения параметра к среднему значению по сети. Большие значения CVnet предполагают широкий диапазон изменений активности в сети, что означает меньшую синхронизацию.

Фиг. 8. Функциональные эффекты, наблюдаемые в группах “Наночастицы” (наночастицы из примеров 1 и 2) и “Референтной” группе по сравнению с “Контрольной” группой и группой “MPP⁺” на активность сети среднего мозга/коры. Данные показывают MPP⁺-индуцированные функциональные эффекты и демонстрируют эффективность предотвращения/спасающего действия, обеспечиваемую наночастицами по изобретению или GDNF (т.е. способность предотвращать/оказывать спасающее действие на функциональные эффекты до уровня, аналогичного уровню в “Контрольной” группе).

Фиг. 9. Функциональные эффекты, наблюдаемые в группах “Наночастицы” (наночастицы из примеров 5 и 6) по сравнению с “Контрольной” группой и группой “MPP⁺” на активность сети среднего мозга/коры. Данные показывают функциональные эффекты, индуцированные MPP⁺, и демонстрируют эффективность предотвращения/спасающего действия, обеспечиваемую наночастицами по изобретению (т.е. способность предотвращать/оказывать спасающее действие на функциональные эффекты до уровня, аналогичного уровню в “Контрольной” группе).

Фиг. 10. Анализ оценки эффекта для групп “Наночастицы”, “Референтной” группы, “Контрольной” группы и группы “MPP⁺”.

Фиг. 11. Экспериментальная схема индукции болезни Альцгеймера с амилоидом бета 1-42 (Abeta 1-42), регистрациями обработки и электрической активности. Через 4 недели в культурах (период культивирования) к нейронной сети добавляли Abeta 1-42 (100 нм) (группа “Наночастица”, “Референтная” группа и группа “Abeta”) или воду (“Контрольная” группа) (T0). Через четыре (4) часа добавляли суспензии наночастиц (группы “Наночастица”), Донепезил (300 нм) (“Референтная” группа) или воду (“Контрольная” группа и группа “Abeta”). Спонтанную активность записывали следующим образом:

- при T0 (до добавления Abeta 1-42)

- при T0+1ч, +2ч, +3ч, +4ч (до добавления наночастиц, донепезила или воды), +5ч, и +6ч.

Фиг. 12. Функциональные эффекты, наблюдаемые в группах “Наночастицы” и “Референтной” группе по сравнению с “Контрольной” группой и группой “Abeta 1-42” на активность сети коры головного мозга. Данные показывают функциональные эффекты Abeta 1-42 и демонстрируют эффективность спасающего действия, обеспечиваемого наночастицами по изобретению или донепезилом (т.е. способность оказывать спасающее действие на функциональные эффекты до уровня, аналогичного уровню в “Контрольной” группе).

Фиг. 13. Анализ оценки эффекта для групп “Наночастицы”, “Референтной” группы, “Контрольной” группы (Оценка эффекта=0) и группы “Abeta” (Оценка эффекта=1).

Фиг. 14. Репрезентативные TEM изображения наночастиц золота из примеров 9, наибольший медианный размер ядра наночастиц популяции, равный 108 нм (GOLD-110), 83 нм (GOLD-80), 45 нм (GOLD-45), 34 нм (GOLD-30) и 15 нм (GOLD-15), соответственно.

Фиг. 15. Анализ оценки эффекта для групп “Наночастицы” (наночастицы GOLD-45 и GOLD-15 из примера 9), “Контрольной” группы (Оценка эффекта=0) и группы “MPP⁺” (Оценка эффекта=1).

Фиг. 16. Репрезентативное изображение, полученное при помощи сканирующей электронной микроскопии (SEM), наночастиц PEDOT из примера 11.

Фиг. 17. Анализ оценки эффекта для групп “Наночастицы” (наночастицы PEDOT из примера 11), “Контрольной” группы (Оценка эффекта=0) и группы “MPP⁺” (Оценка эффекта=1).

ПРИМЕРЫ

Исследования нейронов in vitro

На уровне нейронов пэтч-кламп метод очень полезен для определения потенциалов действия, поскольку он позволяет одновременно напрямую измерять и контролировать мембранный потенциал нейрона.

Этот метод используют для оценки эффектов наночастиц на отдельный нейрон.

Исследования in vitro сети нейронов

Диссоциированные нейронные культуры, связанные с мультиэлектродными матрицами (MEA), широко используют для лучшего понимания сложности сетей мозга. Кроме того, использование диссоциированных нейронных агрегатов позволяет манипулировать и контролировать связность сети. Система MEA позволяет осуществлять неинвазивные длительные одновременные внеклеточные регистрации из нескольких участков в нейронной сети в режиме реального времени, увеличивая пространственное разрешение и тем самым обеспечивая надежное измерение активности сети. Одновременный сбор данных о потенциале действия и потенциале поля в течение длительных периодов времени позволяет осуществлять мониторинг функций сети, возникающих в результате взаимодействия всех клеточных механизмов, ответственных за образование пространственно-временных паттернов (Johnstone A. F. M. et al., Neurotoxicology, 2010, 31, 331-350: Microelectrode arrays: a physicologically based neurotoxicity testing platform for the 21^st century). По сравнению с пэтч-кламп методом и другими одноэлектродными методами регистрации, MEA измеряет отклики всей сети, объединяя глобальную информацию о взаимодействии всех рецепторов, синапсов и типов нейронов, присутствующих в сети (Novellino A. et al., Frontiers in Neuroengineering, 2011, 4(4), 1-14: Development of micro-electrode array based tests for neurotoxicity: assessment of interlaboratory reproducibility with neuroactive chemicals). Как таковые, MEA регистрации применяются для понимания нейронной коммуникации, кодирования, распространения и обработки информации в нейронных культурах (Taketani, M., and Baudry, M.(2006). Advances in Network Electrophysiology. New York, NY: Springer; Obien et al., Frontiers in Neurosciences, 2015, 8(423): Revealing neuronal functions through microelectrode array recordings). Технология MEA представляет собой усовершенствованный фенотипический многопараметрический способ скрининга для характеристики функциональных изменений в активности сети в электрически активных клеточных культурах, и он очень чувствителен к нейрогенезу, а также нейрорегенеративным и нейродегенеративным аспектам. Более того, известно, что нейронные сети, выращенные на MEA, способны реагировать на нейроактивные или нейротоксичные соединения примерно в тех же диапазонах концентраций, которые изменяют функции интактной нервной системы млекопитающих (Xia et al., Alcohol, 2003, 30, 167-174: Histiotypic electrophysiological responses of cultured neuronal networks to ethanol; Gramowski et al., European Journal of Neuroscience, 2006, 24, 455-465: Functional screening of traditional antidepressants with primary cortical neuronal networks grown on multielectrode neurochips; Gramowski et al., Frontiers in Neurology, 2015, 6(158): Enhancement of cortical network activity in vitro and promotion of GABAergic neurogenesis by stimulation with an electromagnetic field with 150MHz carrier wave pulsed with an alternating 10 and 16 Hz modulation).

Этот метод используют для оценки эффекта наночастиц на нейронную сеть(сети).

Исследования in vivo сети нейронов

Считают, что подходящая животная модель позволяет оценить эффект наночастиц по изобретению на нейронные сети животных.

Например, мышиные модели болезни Паркинсона используются для оценки эффектов наночастиц на ослабление нарушений поведения (двигательные расстройства). Кроме того, модели болезни Альцгеймера на крысах и мышах используются для оценки эффектов наночастиц на обучение пространственной ориентации и дисфункцию памяти (когнитивные расстройства) животных.

ПРИМЕР 1. Наночастицы, полученные из проводникового материала: синтез наночастиц золота, покрытых биосовместимым покрытием, имеющим нейтральный поверхностный заряд

Наночастицы золота синтезировали путем восстановления соли хлорида золота (HAuCl₄) защитным агентом (цитрат натрия) (протокол был адаптирован из G. Frens Nature Physical Science 241 (1973) 21). В типичном эксперименте раствор HAuCl₄ нагревали до кипения. Затем добавляли раствор цитрата натрия. Полученный раствор поддерживали при кипении в течение дополнительных 5 минут.

Осуществляли 0,22 мкм фильтрацию (фильтрующая мембрана: поли(эфирсульфон) (PES)) суспензии наночастиц и концентрацию золота в суспензии определяли при помощи спектроскопии в видимой области УФ-излучения при 530 нм.

Покрытие поверхности осуществляли с использованием α-метокси-ω-меркаптополи(этиленгликоля) 20 кДа (“тиол-ПЭГ20кДа”). Достаточное количество “тиол-ПЭГ 20кДа” добавляли к суспензии наночастиц, чтобы достичь по меньшей мере половины покрытия монослоем (2,5 молекулы/нм²) на поверхности наночастицы золота. Уровень рН регулировали между 7 и 7,2, и суспензию наночастиц перемешивали в течение ночи.

Гидродинамический диаметр (измерение интенсивности) определяли при помощи динамического рассеяния света (DLS) при комнатной температуре (около 25°C) с использованием нанозетасайзера (Nano-Zetasizer) (Malvern) под углом рассеяния 173° с использованием лазера, излучающего при 633 нм, путем разбавления суспензии наночастиц в воде (конечная концентрация: [Au] = 0,1 г/л). Было обнаружено, что гидродинамический диаметр полученных таким образом биосовместимых наночастиц золота в суспензии равен 118 нм, с индексом полидисперсности (дисперсия популяции наночастиц по размеру), равным 0,13.

Зета-потенциал определяли путем измерения электрофоретической подвижности наночастиц (Нанозетасайзер, Malvern) путем разбавления суспензии наночастиц в растворе NaCl при 1 мМ при pH 7 (конечная концентрация: [Au] = 0,1г/л). Зета-потенциал при pH 7 был найден равным -1мВ.

ПРИМЕР 2. Наночастицы, полученные из проводникового материала: синтез наночастиц золота, покрытых биосовместимым покрытием, имеющим отрицательный поверхностный заряд

Наночастицы золота получали как описано в примере 1 (такое же ядро неорганического золота).

Осуществляли 0,22 мкм фильтрацию на мембранном фильтре PES и концентрацию золота в суспензии определяли при помощи спектроскопии в видимой области УФ-излучения при 530 нм.

Биосовместимое поверхностное покрытие наносили с использованием мезо-2,3-димеркаптосукциновой кислоты (DMSA). Достаточное количество DMSA добавляли к суспензии наночастиц, чтобы достичь по меньшей мере половины покрытия монослоем (2,5 молекулы/нм²) на поверхности. Уровень рН регулировали между 7 и 7,2, и суспензию наночастиц перемешивали в течение ночи.

Гидродинамический диаметр (измерение интенсивности) определяли при помощи динамического рассеяния света (DLS) при комнатной температуре (около 25°C) с использованием нанозетасайзера (Malvern) под углом рассеяния 173° с использованием лазера, излучающего при 633 нм, путем разбавления суспензии наночастиц в воде (конечная концентрация: [Au] = 0,1 г/л). Гидродинамический диаметр полученных таким образом наночастиц в суспензии был равен 76 нм, с индексом полидисперсности (дисперсия популяции наночастиц по размеру), равным 0,46.

Зета-потенциал определяли путем измерения электрофоретической подвижности наночастиц (Нанозетасайзер, Malvern) путем разбавления суспензии наночастиц в растворе NaCl при 1 мМ при pH 7 (конечная концентрация: [Au] = 0,1г/л). Зета-потенциал при pH 7 был найден равным -23мВ.

ПРИМЕР 3. Наночастицы, полученные из изоляционного материала, имеющего низкую относительную диэлектрическую проницаемость, равную или ниже 100: синтез наночастиц оксида циркония, покрытых биосовместимым покрытием, имеющим нейтральный поверхностный заряд

Наночастицы оксида циркония (ZrO₂) синтезировали путем осаждения хлорида циркония (ZrCl₄) гидроксидом тетраметиламмония (ТМАОН) при основном значении pH. Полученную суспензию переносили в автоклав и нагревали при температуре выше 110°C. После охлаждения суспензию промывали деионизированной водой и подкисляли.

Наибольший медианный размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц популяции и размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц, представляющих 30-70% процентиль популяции наночастиц и агрегатов наночастиц, оценивали с использованием электронной микроскопии и находили равным 10 нм и 8 нм - 12 нм, соответственно. Было подсчитано 446 наночастиц и измерен их наибольший размер.

Осуществляли 0,22 мкм фильтрацию на мембранном фильтре PES и определяли концентрацию наночастиц (ZrO₂) путем сушки водного раствора до состояния порошка и взвешивания полученной таким образом массы. Биосовместимое покрытие получали с использованием силан-поли(этилен)гликоля 2кДа (“Si-ПЭГ 2кДа”). Достаточное количество “Si-ПЭГ 2кДа” добавляли к суспензии наночастиц, чтобы достичь по меньшей мере половины покрытия монослоем (2,5 молекулы/нм²) на поверхности. Суспензию наночастиц перемешивали в течение ночи и затем рН доводили до 7.

Гидродинамический диаметр (измерение интенсивности) определяли при помощи динамического рассеяния света (DLS) при комнатной температуре (около 25°C) с использованием нанозетасайзера (Malvern) под углом рассеяния 173° с использованием лазера, излучающего при 633 нм, путем разбавления суспензии наночастиц в воде (конечная концентрация ZrO₂, составляющего ядро наночастицы: [ZrO₂] = 0,1 г/л). Гидродинамический диаметр наночастиц был найден равным 55 нм, с индексом полидисперсности (дисперсия популяции наночастиц по размеру), равным 0,1.

Зета-потенциал определяли путем измерения электрофоретической подвижности наночастиц (Нанозетасайзер, Malvern) путем разбавления суспензии наночастиц в растворе NaCl при 1 мМ при pH 7 (конечная концентрация: [ZrO₂] = 0,1г/л). Зета-потенциал при pH7 был найден равным -1мВ.

ПРИМЕР 4. Наночастицы, полученные из изоляционного материала, имеющего низкую относительную диэлектрическую проницаемость, равную или ниже 100: синтез наночастиц оксида циркония, покрытых биосовместимым покрытием, имеющим отрицательный поверхностный заряд

Наночастицы оксида циркония получали как описано в примере 3 (такое же неорганическое ядро).

Осуществляли 0,22 мкм фильтрацию на мембранном фильтре PES и определяли концентрацию наночастиц (ZrO₂) путем сушки водного раствора до порошка и взвешивания полученной таким образом массы.

Функционализацию поверхности осуществляли с использованием гексаметафосфата натрия. Достаточную массу гексаметафосфата натрия добавляли к суспензии наночастиц, чтобы достичь по меньшей мере половины покрытия монослоем (2,5 молекулы/нм²) на поверхности. Суспензию наночастиц перемешивали в течение ночи и затем рН доводили до 7.

Гидродинамический диаметр (измерение интенсивности) определяли при помощи динамического рассеяния света (DLS) при комнатной температуре (около 25°C) с использованием нанозетасайзера (Malvern) под углом рассеяния 173° с использованием лазера, излучающего при 633 нм, путем разбавления суспензии наночастиц в воде (конечная концентрация ZrO₂, составляющего ядро наночастицы: [ZrO₂] = 0,1 г/л). Гидродинамический диаметр наночастиц был найден равным 70 нм, с индексом полидисперсности (дисперсия популяции наночастиц по размеру), равным 0,11.

Зета-потенциал определяли путем измерения электрофоретической подвижности наночастиц (Нанозетасайзер, Malvern) путем разбавления суспензии наночастиц в растворе NaCl при 1 мМ при pH 7 (конечная концентрация: [ZrO₂] = 0,1г/л). Зета-потенциал при pH 7 был найден равным -33мВ.

ПРИМЕР 5. Наночастицы, полученные из полупроводникового материала: наночастицы кремния (Si), покрытые биосовместимым покрытием, имеющим отрицательный поверхностный заряд

Наночастицы кремния (Si) (порошок) получали от US Research Nanomaterials Inc. Они были покрыты PVP (1 масс.%), что составляет менее 0,1 молекулы/нм² на поверхности.

Их диспергировали в воде при 30 г/л при обработке ультразвуком (при помощи зонда).

Осуществляли 0,22 мкм фильтрацию на мембранном фильтре PES и определяли концентрацию наночастиц (Si) путем сушки суспензии до порошка и взвешивания полученной таким образом массы.

Гидродинамический диаметр (измерение интенсивности) определяли при помощи динамического рассеяния света (DLS) при комнатной температуре (около 25°C) с использованием нанозетасайзера (Malvern) под углом рассеяния 173° с использованием лазера, излучающего при 633 нм, путем разбавления суспензии наночастиц в воде (конечная концентрация Si, составляющего ядро наночастицы: [Si] = 0,1 г/л). Гидродинамический диаметр наночастиц был найден равным 164 нм, с индексом полидисперсности (дисперсия популяции наночастиц по размеру), равным 0,16.

Наибольший медианный размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц популяции и размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц, представляющих 30-70% процентиль популяции наночастиц и агрегатов наночастиц, оценивали с использованием электронной микроскопии и находили равным 53 нм и 45-61 нм, соответственно. Были подсчитаны семьдесят одна (71) наночастица и был измерен их наибольший размер.

Зета-потенциал определяли путем измерения электрофоретической подвижности наночастиц (Нанозетасайзер, Malvern) путем разбавления суспензии наночастиц в растворе NaCl при 1 мМ при pH 7 (конечная концентрация: [Si] = 0,1г/л). Зета-потенциал при pH 7 был найден равным -19мВ.

ПРИМЕР 6. Наночастицы, полученные из изоляционного материала, имеющего высокую относительную диэлектрическую проницаемость, равную или выше 200: наночастицы титаната бария, покрытые биосовместимым покрытием, имеющим отрицательный поверхностный заряд

Суспензию наночастиц титаната бария (BaTiO₃) (20 масс.% в воде) получали от US Research Materials Inc. (US3835).

Функционализацию поверхности осуществляли с использованием силан-поли(этилен)гликоля 10кДа (“Si-ПЭГ 10кДа”). Вкратце, “Si-ПЭГ 10кДа” сначала растворяли в растворе этанол/вода (1/3 об/об) и добавляли к суспензии BaTiO₃ (20 масс.% в воде) для достижения полного монослойного покрытия на поверхности наночастиц. Суспензию обрабатывали ультразвуком и затем перемешивали в течение ночи. После 0,22 мкм фильтрации (фильтрующая мембрана: поли(эфирсульфон)) осуществляли стадию промывки для удаления непрореагировавших полимеров “Si-ПЭГ 10кДа”.

Гидродинамический диаметр (измерение интенсивности) определяли при помощи динамического рассеяния света (DLS) при комнатной температуре (около 25°C) с использованием нанозетасайзера (Malvern) под углом рассеяния 173° с использованием лазера, излучающего при 633 нм, путем разбавления суспензии наночастиц в воде (конечная концентрация BaTiO₃, составляющего ядро наночастицы: [BaTiO₃] = 0,1 г/л). Гидродинамический диаметр наночастиц был найден равным 164 нм, с индексом полидисперсности (дисперсия популяции наночастиц по размеру), равным 0,16.

Зета-потенциал определяли путем измерения электрофоретической подвижности наночастиц (Нанозетасайзер, Malvern) путем разбавления суспензии наночастиц в растворе NaCl при 1 мМ при pH 7 (конечная концентрация: [BaTiO₃] = 0,1г/л). Зета-потенциал при pH 7 был обнаружен при -11мВ.

Наибольший медианный размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц популяции и размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц, представляющих 30-70% процентиль популяции наночастиц и агрегатов наночастиц, оценивали с использованием электронной микроскопии и находили равным 67 нм и 60-77 нм соответственно. Были подсчитаны пятьдесят одна (51) наночастица и был измерен их наибольший размер.

ПРИМЕР 7. Оценка эффективности предотвращения/спасающего действия наночастиц из примеров 1, 2, 5 и 6 на MPP⁺-индуцированные нейронные сети с использованием технологии MEA фенотипического скрининга

Эффективность предотвращения/спасающего действия наночастиц по изобретению тестировали на ко-культурах вентральной части среднего мозга/коры мышей, обработанных MPP⁺, культивируемых на 48-луночной MEA в течение 3 недель. Эта модель представляет собой in vitro модель Паркинсона для скрининга соединений, основанную на функциональном спасении дофаминергических нейронов с использованием индуцированных культур среднего мозга/коры, выращенных на MEA. Средний мозг является областью головного мозга, включающей черную субстанцию, которая является частью базальных ганглий и содержит большую часть дофаминергических нейронов. Оценку эффекта предотвращения/спасающего действия наночастиц осуществляли путем измерения внеклеточной электрической активности ко-культивированных нейронов, нанесенных на чипы микроэлектродной матрицы (MEA).

Индукцию паркинсонического фенотипа в нейронах мыши in vitro осуществляли при помощи 1-метил-4-фенилпиридиний йодида (MPP⁺). Существуют убедительные доказательства того, что митохондриальное нарушение играет роль в патогенезе болезни Паркинсона (БП). Было обнаружено, что MPP⁺ является митохондриальным ядом, который ингибирует клеточное дыхание посредством блокады ферментного комплекса I транспорта электронов (NADH: убихиноноксидоредуктаза). Несколько лабораторий сообщили, что наблюдали селективный дефект в комплексе I митохондриальной электронно-транспортной цепи в черной субстанции посмертной ткани пациентов с БП, а также наблюдали снижение активности комплекса I в тромбоцитах пациентов с ранней стадией БП. Лекарственные средства, такие как нейротрофический фактор глиальных клеток (GDNF), действуют как нейропротекторные средства, чтобы предотвращать/оказывать спасающее действие при эффектах MPP⁺ с хорошими доклиническими результатами. GDNF часто используют в качестве эталона в экспериментальных доклинических протоколах (Peng J. et al., Journal of Biomolecular screening, 2013, 18(5), 522-533: Using human pluripotent stem cell-derived dopaminergic neurons to evaluate candidate Parkinson’s disease therapeutic agents in MPP+ and rotenone models.).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Первичная культура клеток, условия обработки

Ткань среднего мозга и лобной коры собирали у эмбрионов (день 14,5) chr:NMRI мышей (Charles River). Мышей умерщвляли путем цервикальной дислокации. Ткань диссоциировали ферментативным расщеплением (133,3 единицы Кунитца/мл ДНКазы; 10 единиц/мл папаина) и механическим растиранием в порошок, подсчитывали, контролировали жизнеспособность и высевали в 20 мкл каплю DMEM, содержащей ламинин (10 мкг/мл), 10% фетальной бычьей сыворотки и 10% лошадиной сыворотки, на MEA. Культуры на MEA инкубировали при 37°C в атмосфере 10% CO₂, до готовности к применению. Культуральные среды пополняли два раза в неделю DMEM, содержащей 10% лошадиной сыворотки.

В группах “Наночастицы” на 7-й день лунки обрабатывали суспензией наночастиц из примеров 1 ([Au] = 800 мкМ), 2 ([Au] = 800 мкМ), 5 ([Si] = 800 мкМ) и суспензией наночастиц из примера 6 ([BaTiO₃] = 2000 мкМ), и затем 20 мкМ MPP⁺ на 8-й день. В “Контрольной” группе в лунки добавляли воду на 7-й день, с последующим добавлением воды на 8-й день. В группе “MPP⁺” в лунки добавляли воду на 7-й день, и затем 20 мкМ MPP⁺ на 8-й день. В “Референтной” группе GDNF (20 нг/мл) добавляли в лунки на 7-й день, и затем 20 мкМ MPP⁺ на 8-й день.

Через двадцать четыре (24) часа после добавления MPP+ (или воды для “Контрольной” группы) среду меняли для достижения вымывания MPP⁺. Среду впоследствии меняли дважды в неделю и GDNF добавляли только для “Референтной” группы при каждой замене среды.

На 21-й день зарегистрировали 120 минут активности нейронов и проанализировали 30 минут стабильной активности (Фиг. 6).

Нейрочипы с микроэлектродной матрицей

Нейрочипы с 48-луночной микроэлектродной матрицей приобретали у Axion Biosystems Inc. Эти чипы имеют 16 пассивных электродов на лунку. Поверхность в течение 1 часа покрывали полиэтиленимином (PEI, 50% в боратном буфере), промывали и высушивали на воздухе.

Многоканальная регистрация и многопараметрический анализ данных

Для записи использовали многоканальную систему регистрации MAESTRO от Axion Biosystems (США). Для внеклеточной регистрации 48-луночные МЕА помещали на регистрирующую станцию MAESTRO и поддерживали при 37°C. Регистрации осуществляли в DMEM/10% термоинактивированной лошадиной сыворотке. рH поддерживали на уровне 7,4 с использованием непрерывного потока отфильтрованного увлажненного воздушного потока с 10% CO₂.

Каждая единица представляет активность, исходящую от одного нейрона, зарегистрированную на одном электроде. Единицы разделяются в начале регистрации. Для каждой единицы потенциалы действия (т.е. спайки) регистрировали как последовательности спайков, которые объединены в так называемые “вспышки”. Вспышки количественно описывали при помощи прямого анализа последовательности спайков с использованием программ Spike Wrangler и NPWaveX (обе от компании NeuroProof GmbH, Rostock, Germany). Вспышки определялись началом и концом коротких спайковых событий (Фиг. 7).

При помощи многопараметрического высокопроизводительного анализа паттернов активности сети получали 204 описывающих активность параметра последовательности спайков. Эти параметры позволяют получить точное описание изменений активности в следующих четырех категориях: общая активность, структура вспышки, характеристика колебаний и синхронность.

- Изменения в “параметрах общей активности” описывают эффекты на частоту потенциалов действия (скорость спайков), скорость вспышки и период вспышки как время между вспышками.

- “Параметры структуры вспышки” определяют не только внутреннюю структуру спайков в высокочастотной спайковой фазе (“вспышка”), например, частоту спайков во вспышках, скорость спайков во вспышках и плотность спайков вспышки, но также общую структуру вспышки, такую как длительность, площадь и плато.

- “Параметры колебаний” количественно определяют регулярность возникновения или структуру вспышек, которые рассчитывают по коэффициентам вариации параметров первичной активности, описывающих вариабельность параметров (общая активность, структура вспышки) в экспериментальных эпизодах (Gramowski A. et al., Eur. J. Neurosci., 2004, 19, 2815-2825: Substance identification by quantitative characterization of oscillator activity in murine spinal cord networks on microelectrode arrays). Более высокие значения указывают на менее регулярную структуру вспышки или менее регулярную общую активность (например, пульсация, ‘взрыв’ импульса).

- В качестве меры синхроничности в последовательности спайков, “параметры CVnet” отражают “синхронизацию” между нейронами в сети (Gramowski A. et al., Eur. J. Neurosci., 2004, 19, 2815-2825: Substance identification by quantitative characterization of oscillator activity in murine spinal cord networks on microelectrode arrays). CVnet представляет собой коэффициент вариации по сети. Большие значения CVnet предполагают широкий диапазон изменений активности в сети, что означает меньшую синхронизацию. (Gramowski A. et al., Frontiers in Neurology, 2015, 6(158): Enhancement of cortical network activity in vitro and promotion of GABAergic neurogenesis by stimulation with an electromagnetic field with 150MHz carrier wave pulsed with an alternating 10 and 16 Hz modulation).

Функциональные эффекты, индуцированные MPP⁺, на нейронную сеть и эффективность предотвращения/спасающего действия наночастиц по изобретению оценивали по описанным выше параметрам (также обобщенно представленные для некоторых из них в таблице 2 ниже).

Таблица 2

Параметры, описывающие активность, из многопараметрического анализа данных в следующих трех категориях: общая активность, характеристики колебаний и синхроничность

Общая активность Частота спайков Количество спайков в секунду, усредненное по всем зарегистрированным последовательностям спайков Характеристики колебаний SD Скорости вспышки (регулярность вспышки) Стандартное отклонение количества вспышек в минуту, указывающее на вариабельность частоты вспышек единиц в экспериментальных эпизодах SD Площади вспышки (регулярность структуры вспышки) Стандартное отклонение площади под кривой после после интегрирования вспышек, определяемое длительностью вспышки, количеством спайков во вспышках, частотой спайков во вспышках. Параметр описывает вариабельность площади вспышки в экспериментальных эпизодах. Более высокие значения указывают на менее регулярную структуру вспышки SD количества спайков во вспышках (регулярность структуры образования вспышек) Стандартное отклонение количества спайков во вспышках описывает вариабельность отдельных единиц количества спайков во вспышках в экспериментальных эпизодах. Более низкие значения являются показателем, указывающим на более низкую степень варьирования количества спайков во вспышках, с более регулярной структурой. Синхроничность Симплекс (комплексность пульсации) Для вычисления симплекса спайка, последовательности спайков делят на временные интервалы с размером бина 1 мс. В рамках этих бинов различные единицы в сети генерируют спайки. Все единицы, демонстрирующие спайк, определяют как один симплекс. Результатом количества всего симплекса является симплекс спайка. Он является мерой связности и комплексности в нейронной сети. Более высокие значения отражают более высокую синхроничность между нейронами.

Значения, связанные со спонтанной нативной активностью на 21-й день, получали из 60-секундных групп данных, взятых из 30-минутного промежутка после 30-минутной стабилизации активности. Результаты (значения параметров) выражали как среднее значение ± SEM независимых сетей. Для каждой группы “Наночастицы” по меньшей мере 8 активных лунок, для “Контрольной” группы по меньшей мере 30 активных лунок, и для группы “MPP⁺” по меньшей мере 26 активных лунок (“активные” означает лунки с достаточным количеством электродов измерения электрической активности) были включены в анализ. Распределения абсолютных параметров тестировали на нормальность и статистическую значимость между группами оценивали при помощи однофакторного дисперсионного анализа.

Фиг. 8 и 9 представляют некоторые репрезентативные параметры из следующих категорий: общая активность, характеристики колебаний и синхроничность. Эти параметры характеризуют индуцированные MPP⁺ функциональные эффекты и эффективность предотвращения/спасающего действия наночастиц по изобретению или GDNF (т.е. способность предотвращать/оказывать спасающее действие на функциональные эффекты до уровня, аналогичного уровню в “Контрольной” группе).

Для оценки комбинированных эффектов многопараметрические результаты выбора из 204 параметров были отражены в одном параметре, называемом “Оценка Эффекта”. Это линейная комбинация выбранных характеристик, преобразующая наборы данных на вектор с “Контрольной” группой со средним значением “0” и группой “MPP⁺” со средним значением “1”. Вычисление Z-фактора оценки эффекта осуществляли путем выбора 18 из 204 измеренных параметров, оптимизированных для нахождения наилучшего разграничения между “Контрольной” группой и группой “MPP⁺” (Kümmel A, et al., J Biomol Screen., 2010, 15(1), 95-101: Integration of multiple readouts into the z' factor for assay quality assessment).

Анализ оценки эффекта показан на Фиг. 10,

Эффективность предотвращения/спасающего действия наночастиц по изобретению показана в Таблице 3.

Таблица 3

Суммарная оценка эффекта и эффективности предотвращения/спасающего действия наночастиц по изобретению (из примеров 1, 2, 5 и 6) или GDNF на индуцированные MPP⁺ эффекты на нейронную сеть

Группа Оценка эффекта Эффективность предотвращения/спасающего действия “Контрольная” группа 0 Референтная (установлена на 100%) группа “MPP⁺” 1 0% группа “Наночастицы”: биосовместимые наночастицы золота из примера 1 0 100% группа “Наночастицы”: биосовместимые наночастицы золота из примера 2 0,22 78% группа “Наночастицы”: биосовместимые наночастицы Si из примера 5 0,49 51% группа “Наночастицы”: биосовместимые наночастицы BaTiO₃ из примера 6 0,39 61% “Референтная” группа: GDNF 0,44 56%

Фиг. 8, 9 и 10 и Таблица 3 показывают, что предварительная обработка нейронной сети наночастицами по изобретению предотвращает/оказывает спасающее действие на индуцированные MPP⁺ функциональные эффекты на нейронную сеть. Интересно, что эффективность предотвращения/спасающего действия наблюдают для параметров в категориях, связанных с характеристиками колебаний и синхроничностью, и она может достигать уровня, который наблюдают в “Контрольной” группе. Эти характеристики колебаний и параметры синхронизации обычно отслеживают как показатель развития измененной сети. Эти параметры могут быть успешно восстановлены в присутствии наночастиц по изобретению.

Эти результаты демонстрируют способность наночастиц, описанных в настоящей заявке, предотвращать/оказывать спасающее действие на индуцированные MPP⁺ функциональные эффекты на нейронную сеть.

ПРИМЕР 8: Оценка эффектов наночастиц из примеров 1, 2, 3, 4, 5 и 6 на амилоид бета 1-42-индуцированные функциональные эффекты на первичные нейронные сети мыши с использованием технологии фенотипического скрининга MEA

Эффективность спасающего действия наночастиц по изобретению тестировали in vitro при помощи MEA на амилоид бета 1-42 (Abeta 1-42)-индуцированной модели болезни Альцгеймера в культурах лобной коры нейронов мыши.

Известно, что β-амилоидный пептид 1-42, основной компонент невротических бляшек, наблюдаемых у пациентов с болезнью Альцгеймера (AD), запускает избыточное количество глутамата в синаптической щели, ингибируя астроглиальный транспортер глутамата и повышая внутриклеточный уровень Ca²⁺ через усиление активности рецептора N-метил-D-аспартата (NMDA). Другие механизмы, ведущие к экситотоксичности, могут включать индукцию окислительного стресса и прямое воздействие Abeta на глутаматергический NMDA-рецептор. Какими бы ни были точные основные патогенные процессы, сверхстимуляция нервной клетки глутаматом и внутриклеточное накопление кальция в конечном итоге приведет к апоптозу нейронов, нарушит синаптическую пластичность и в результате такой дисрегуляции сильно нарушит функции обучения и памяти (Nyakas C. et al., Behavioural Brain Research, 2011, 221, 594-603: The basal forebrain cholinergic system in aging and dementia. Rescuing cholinergic neurons from neurotoxic amyloid-β42 with memantine.). В настоящее время одобренные FDA анти-AD препараты ограничены ингибиторами ацетилхолинэстеразы (AChE) и антагонистами NMDA-рецепторов. Традиционные ингибиторы AChE включают донепезил, который в основном действует на центральный сайт действия AChE.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Первичная культура клеток

Ткань лобной коры собирали у эмбрионов (день 15/16) chr:NMRI мышей (Charles River). Мышей умерщвляли путем цервикальной дислокации. Ткань диссоциировали ферментативным расщеплением (133,3 единицы Кунитца/мл ДНКазы; 10 единиц/мл папаина) и механическим растиранием в порошок, подсчитывали, контролировали жизнеспособность и высевали в 20 мкл каплю DMEM, содержащей ламинин (10 мкг/мл), 10% фетальной бычьей сыворотки и 10% лошадиной сыворотки, на MEA. Культуры на MEA инкубировали при 37°C в атмосфере 10% CO₂, до готовности к применению. Культуральные среды пополняли два раза в неделю DMEM, содержащей 10% лошадиной сыворотки. Развивающиеся совместные культуры обрабатывали ингибиторами митоза 5-фтор-2’-дезоксиуридином (25 мкМ) и уридином (63 мкМ) на 5-й день после посева для предотвращения дальнейшей глиальной пролиферации.

Для индукции функционального фенотипа, связанного с болезнью Альцгеймера, использовали синтетические HFIP (гексафторизопропанол)-обработанные пептиды Abeta 1-42 (обработка HFIP приводит к получению мономеров бета-амилоида) в субтоксической дозе (100 нм).

В группах “Наночастицы” лунки сначала обрабатывали Abeta 1-42 (синтетические HFIP-обработанные пептиды Амилоид-бета 1-42) при T0 (T0 в конце 28-дневного периода культивирования in vitro). Затем лунки обрабатывали при T0+4 часа суспензией наночастиц из примеров 1 ([Au] = 800 мкМ), 2 ([Au] = 800 мкМ), 3 ([ZrO₂] = 800 мкМ), 4 ([ZrO₂] = 800 мкМ), 5 ([Si] = 800 мкМ) и из примера 6 ([BaTiO₃] = 2000 мкМ), в независимых и параллельных экспериментах. В “Контрольной” группе в лунки добавляли воду при T0, и затем при T0+4 часа. В группе “Abeta”, Abeta 1-42 добавляли в лунки при T0, и затем в лунки добавляли воду при T0+4 часа. В “Референтной” группе Abeta 1-42 добавляли в лунки при T0, и донепезил (300 нм) добавляли в лунки при T0+4 часа.

Активность нейронов регистрировали следующим образом (см. Фиг. 11):

- При T0, до добавления Abeta 1-42 (или воды в “Контрольной” группе)

- При T0+1ч, T0+2ч, T0+3ч, T0+4ч (до добавления наночастиц в группе «Наночастицы « или донепезила в “Референтной” группе или “воды” в Контрольной группе), T0+5ч и T0+6ч.

Значения получали из 60-секундных групп данных, взятых из 30-минутного промежутка после 30-минутной стабилизации активности.

Нейрочипы с микроэлектродной матрицей

Нейрочипы с 48-луночной микроэлектродной матрицей приобретали у Axion Biosystems Inc. Эти чипы имеют 16 пассивных электродов на лунку. Поверхность в течение 1 часа покрывали полиэтиленимином (PEI, 50% в боратном буфере), промывали и высушивали на воздухе.

Многоканальная регистрация и многопараметрический анализ данных

Для регистрации использовали многоканальную систему регистрации MAESTRO от Axion Biosystems (США). Для внеклеточной регистрации 48-луночные МЕА помещали на регистрирующую станцию MAESTRO и поддерживали при 37°C. Регистрации осуществляли в DMEM/10% термоинактивированной лошадиной сыворотке. рH поддерживали на уровне 7,4 с использованием непрерывного потока отфильтрованного увлажненного воздушного потока с 10% CO₂. Потенциалы действия, или “спайки”, регистрировали в последовательности спайков и объединяли в так называемые “вспышки”. Вспышки количественно описывали при помощи прямого анализа последовательности спайков с использованием программ Spike Wrangler и NPWaveX (обе от компании NeuroProof GmbH, Rostock, Germany). Вспышки определялись началом и концом коротких спайковых событий.

При помощи многопараметрического высокопроизводительного анализа паттернов активности сети получали 204 описывающих активность параметра последовательности спайков. Эти параметры позволяют получить точное описание изменений активности в следующих четырех категориях: общая активность, структура вспышки, характеристика колебаний и синхронность.

Функциональные эффекты амилоида бета 1-42 на нейронную сеть и эффективность спасения функциональных эффектов нейронной сети наночастицами по изобретению оценивали по описанным выше параметрам (также обобщенно представленные для некоторых из них в таблице 4 ниже).

Таблица 4

Параметры, описывающие активность, из многопараметрического анализа данных в следующих четырех категориях: общая активность, структура вспышки, характеристика колебаний и синхронность

Общая активность Контраст спайка Описывает возникновение или отсутствие спайков в соседних временных сегментах последовательности спайков, отражая вариабельность частоты вспышек единиц в экспериментальных эпизодах Структура вспышки Площадь вспышки Площадь под кривой, интегрирующая вспышки, определяемая длительностью вспышки, количеством спайков во вспышках, частотой спайков во вспышках Характеристики колебаний Форма вспышки, число импульсов CVвремя Каждая вспышка разделена на три интервала с использованием их гравитационных центров. Импульс представляет собой отношение спайков каждого из этих интервалов к общему количеству спайков в каждой вспышке. Этот параметр описывает коэффициент вариации по времени распределения спайков во вспышках Синхроничность Форма быстрой вспышки CVnet Коэффициент вариации по сети фракции вспышек, характеризующихся быстрым началом действия. Более высокие значения указывают на более низкую синхроничность формы вспышки в экспериментальном эпизоде

Значения, связанные со спонтанной нативной активностью, получали из 60-секундных групп данных, взятых из 30-минутного промежутка после 30-минутной стабилизации активности. Результаты (значения параметров) выражали как среднее значение ± SEM независимых сетей. Для каждой группы “Наночастицы” по меньшей мере 9 активных лунок, для “Контрольной” группы по меньшей мере 18 активных лунок и для группы “Abeta” по меньшей мере 18 активных лунок (“активные” означает лунки с достаточным количеством электродов измерения электрической активности) были включены в анализ. Распределения абсолютных параметров тестировали на нормальность и статистическую значимость между группами оценивали при помощи однофакторного дисперсионного анализа.

Фиг. 12 показывает некоторые репрезентативные параметры из следующих категорий: общая активность, структура вспышки, характеристика колебаний и синхронность, характеризующих Abeta 1-42 функциональные эффекты и эффективность спасения, обеспечиваемую наночастицами по изобретению или донепезилом (т.е. способность оказывать спасающее действие на функциональные эффекты до уровня, аналогичного уровню в “Контрольной” группе).

Для оценки комбинированных эффектов многопараметрические результаты выбора из 204 параметров были отражены в одном параметре, называемом “Оценка Эффекта”. Это линейная комбинация выбранных характеристик, преобразующая наборы данных на вектор с “Контрольной” группой со средним значением “0” и группой “Abeta” со средним значением “1”. Вычисление Z-фактора Оценки Эффекта осуществляли путем выбора 15 из 204 измеренных параметров, оптимизированных для нахождения наилучшего разграничения между “Контрольной” группой и группой “Abeta” (Kümmel A, et al., J Biomol Screen., 2010, 15(1),95-101: Integration of multiple readouts into the z' factor for assay quality assessment.).

Анализ оценки эффекта показан на Фиг. 13.

Эффективность спасающего действия наночастиц по изобретению показана в Таблице 5.

Таблица 5

Суммарная оценка эффекта и эффективность спасающего действия наночастиц по изобретению или донепезила на индуцированные Abeta 1-42 эффекты на нейронную сеть

Группа Оценка эффекта Эффективность спасения “Контрольная” группа 0 Референтная (установлена на 100%) группа “Abeta” 1 0% группа “Наночастицы”: биосовместимые наночастицы золота из примера 1 0,24 76% группа “Наночастицы”: биосовместимые наночастицы золота из примера 2 0,61 39% группа “Наночастицы”: биосовместимые наночастицы оксида циркония из примера 3 0,40 60% группа “Наночастицы”: биосовместимые наночастицы оксида циркония из примера 4 0,49 51% группа “Наночастицы”: биосовместимые наночастицы кремния из примера 5 0,46 54% группа “Наночастицы”: биосовместимые наночастицы BaTiO₃ из примера 5 0,36 64% Донепезил 0,46 54%

Фиг. 12 и 13 и Таблица 5 показывают, что предварительная обработка нейронной сети наночастицами по изобретению оказывает спасающее действие на Abeta 1-42 индуцированные функциональные эффекты на нейронную сеть. Эффективность спасения наблюдают для параметров в категориях, связанных с характеристиками колебаний и синхроничностью, и она может достигать уровня, который наблюдают в “Контрольной” группе. Эти характеристики колебаний и параметры синхронизации классически оценивают для обнаружения развития измененной сети. Характеристики колебаний и синхронизация могут быть спасены в присутствии наночастиц по изобретению.

Эти результаты подчеркивают полезные свойства наночастиц, описанных в настоящей заявке, что касается их спасающего действия на индуцированные Abeta 1-42 функциональные эффекты на нейронную сеть.

ПРИМЕР 9. Синтез и физико-химическая характеристика наночастиц золота с различными размерами, имеющих нейтральный поверхностный заряд

Наночастицы золота получают восстановлением хлорида золота цитратом натрия в водном растворе. Протокол был адаптирован из G. Frens Nature Physical Science 241 (1973) 21.

В типичном эксперименте раствор HAuCl₄ нагревали до кипения. Затем добавляли раствор цитрата натрия. Полученную суспензию поддерживали при кипении в течение дополнительных 5 минут.

Размер наночастиц регулировали от примерно 15 нм до примерно 110 нм путем осторожной модификации соотношения цитрата к предшественнику золота (см. Таблицу 6).

Полученную суспензию наночастиц золота затем концентрировали, используя ультрафильтрационное устройство (кювета с перемешиванием Amicon, модель 8400 от Millipore) с целлюлозной мембраной, имеющей соответствующую границу отсечки по молекулярному весу задерживаемых компонентов (MWCO) и фильтровали через 0,22 мкМ мембранный фильтр с отсечкой (мембрана PES от Millipore) в ламинарном шкафу.

Покрытие поверхности осуществляли с использованием α-метокси-ω-меркаптополи(этиленгликоля) 20 кДа (“тиол-ПЭГ20кДа”). Достаточное количество “тиол-ПЭГ 20кДа” добавляли к суспензии наночастиц для получения монослойного покрытия на поверхности наночастиц золота. pH регулировали в пределах между 6,8 и 7,4 и суспензию наночастиц перемешивали в течение ночи. Избыток тиол-ПЭГ 20кДа удаляли при помощи ультрафильтрационного центрифужного фильтра (Vivaspin от Sartorius или Amicon Ultra от Merck Millipore) с соответствующей мембраной MWCO в ламинарном шкафу и полученную суспензию хранили при 4°C.

Размер частиц определяли при помощи просвечивающей электронной микроскопии путем подсчета по меньшей мере 200 наночастиц, беря самый большой размер наночастиц для определения размера. Наибольший медианный размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц популяции и размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц, представляющий 30% - 70% процентиль популяции наночастиц и агрегатов наночастиц, представлены в Таблице 6 вместе с концентрацией золота ([Au]), измеренной при помощи оптико-эмиссионной спектрометрии с индуктивно-связанной плазмой (ICP-OES), и зета-потенциалом, определенным путем измерения электрофоретической подвижности наночастиц (Нанозетасайзер, Malvern) путем разбавления суспензии наночастиц в растворе NaCl при 1 мМ, при концентрации золота ([Au]) от 0,01 до 0,05 г/л и при pH около 7.

Таблица 6

Образцы Соотношение цитрат/Au в процессе синтеза (моль/моль) Наибольший медианный размер ядра наночастицы (нм) 30%-70% процентиль (нм) Зета-потенциал (мВ) [Au] мг/мл (по ICP-OES) GOLD-15 3,5 15 14-16 -3 3,6 GOLD-30 1,96 34 30-37 -3 3,9 GOLD-45
Такое же ядро наночастиц, как наночастицы из примеров 1 & 2 1,26 45 42-49 -4 3,6 GOLD-80 0,8 83 77-93 -2 3,4 GOLD-110 0,7 108 91-123 -2 2,9

Фиг. 14 показывает репрезентативные изображения, полученные методом просвечивающей электронной микроскопии (TEM), наночастиц золота, описанных в таблице 6.

ПРИМЕР 10. Оценка эффективности предотвращения/спасающего действия наночастиц GOLD-15 и GOLD-45 из примера 9 на MPP⁺-индуцированные нейронные сети с использованием технологии фенотипического MEA скрининга

Эффективность предотвращения/спасающего действия наночастиц по изобретению тестировали на ко-культурах вентральной части среднего мозга/коры мышей, обработанных MPP⁺, культивируемых на 48-луночной MEA в течение 3 недель. Оценку эффекта предотвращения/спасающего действия наночастиц осуществляли путем измерения внеклеточной электрической активности ко-культивированных нейронов, нанесенных на чипы микроэлектродной матрицы (MEA).

Индукцию паркинсонического фенотипа в нейронах мыши in vitro осуществляли при помощи 1-метил-4-фенилпиридиний йодида (MPP⁺)

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Первичная культура клеток, условия обработки

Ткань среднего мозга и лобной коры собирали у эмбрионов (день 14,5) chr:NMRI мышей (Charles River). Мышей умерщвляли путем цервикальной дислокации. Ткань диссоциировали ферментативным расщеплением (133,3 единицы Кунитца/мл ДНКазы; 10 единиц/мл папаина) и механическим растиранием в порошок, подсчитывали, контролировали жизнеспособность и высевали в 20 мкл каплю DMEM, содержащей ламинин (10 мкг/мл), 10% фетальной бычьей сыворотки и 10% лошадиной сыворотки, на MEA. Культуры на MEA инкубировали при 37°C в атмосфере 10% CO₂ до готовности к применению. Культуральные среды пополняли два раза в неделю DMEM, содержащей 10% лошадиной сыворотки.

В группах “Наночастицы” на 7-й день лунки обрабатывали суспензией наночастиц ([Au] = 310 +/- 40 мкМ) из примера 9 (GOLD-15 и GOLD-45) и затем 20 мкМ MPP⁺ на 8-й день. В “Контрольной” группе в лунки добавляли воду на 7-й день, с последующим добавлением воды на 8-й день. В группе “MPP⁺” в лунки добавляли воду на 7-й день, затем 20 мкМ MPP⁺ на 8-й день.

Через двадцать четыре (24) часа после добавления MPP+ (или воды для “Контрольной” группы) среду меняли для достижения вымывания MPP⁺. Среду впоследствии меняли дважды в неделю.

На 21-й день зарегистрировали 120 минут активности нейронов и проанализировали 30 минут стабильной активности.

Нейрочипы с микроэлектродной матрицей

Нейрочипы с 48-луночной микроэлектродной матрицей приобретали у Axion Biosystems Inc. Эти чипы имеют 16 пассивных электродов на лунку. Поверхность в течение 1 часа покрывали полиэтиленимином (PEI, 50% в боратном буфере), промывали и высушивали на воздухе.

Многоканальная регистрация и многопараметрический анализ данных

Для регистрации использовали многоканальную систему регистрации MAESTRO от Axion Biosystems (США). Для внеклеточной регистрации 48-луночные МЕА помещали на регистрирующую станцию MAESTRO и поддерживали при 37°C. Регистрации осуществляли в DMEM/10% термоинактивированной лошадиной сыворотке. рH поддерживали на уровне 7,4 с использованием непрерывного потока отфильтрованного увлажненного воздушного потока с 10% CO₂.

Каждая единица представляет активность, исходящую от одного нейрона, зарегистрированную на одном электроде. Единицы разделяются в начале регистрации. Для каждой единицы потенциалы действия (т.е. спайки) регистрировали как последовательности спайков, которые объединены в так называемые “вспышки”. Вспышки количественно описывали при помощи прямого анализа последовательности спайков с использованием программ Spike Wrangler и NPWaveX (обе от компании NeuroProof GmbH, Rostock, Germany). Вспышки определялись началом и концом коротких спайковых событий.

При помощи многопараметрического высокопроизводительного анализа паттернов активности сети получали 204 описывающих активность параметра последовательности спайков. Эти параметры позволяют получить точное описание изменений активности в следующих четырех категориях: общая активность, структура вспышки, характеристика колебаний и синхронность.

Функциональные эффекты, индуцированные MPP⁺, на нейронную сеть и эффективность предотвращения/спасающего действия наночастиц по изобретению оценивали по описанным выше параметрам.

Значения, связанные со спонтанной нативной активностью на 21-й день, получали из 60-секундных групп данных, взятых из 30-минутного промежутка после 30-минутной стабилизации активности. Результаты (значения параметров) выражали как среднее значение ± SEM независимых сетей. Для каждой группы “Наночастицы”, “Контрольной” группы и группы “MPP⁺” по меньшей мере 19 активных лунок (“активные” означает лунки с достаточным количеством электродов измерения электрической активности) были включены в анализ. Распределения абсолютных параметров тестировали на нормальность и статистическую значимость между группами оценивали при помощи однофакторного дисперсионного анализа.

Для оценки комбинированных эффектов многопараметрические результаты выбора из 204 параметров были отражены в одном параметре, называемом “Оценка эффекта”. Это линейная комбинация выбранных характеристик, преобразующая наборы данных на вектор с “Контрольной” группой со средним значением “0” и группой “MPP⁺” со средним значением “1”. Вычисление Z-фактора оценки эффекта осуществляли путем выбора 20 из 204 измеренных параметров, оптимизированных для нахождения наилучшего разграничения между “Контрольной” группой и группой “MPP⁺” (Kümmel A, et al., J Biomol Screen., 2010, 15(1), 95-101: Integration of multiple readouts into the z' factor for assay quality assessment).

Анализ оценки эффекта показан на Фиг. 15.

Эффективность предотвращения/спасающего действия наночастиц по изобретению показана в Таблице 7. Таблица 7

Суммарная оценка эффекта и эффективности предотвращения/спасающего действия наночастиц по изобретению (GOLD-15 и GOLD-45 из примеров 9) на индуцированные MPP⁺ эффекты на нейронную сеть

Группа Оценка эффекта Эффективность предотвращения/спасающего действия “Контрольная” группа 0 Референтная (установлена на 100%) группа “MPP⁺” 1 0% группа “Наночастицы”: биосовместимые наночастицы золота GOLD-45 из примера 9 0,14 86% группа “Наночастицы”: биосовместимые наночастицы золота GOLD-15 из примера 9 0,46 54%

Фиг. 15 и Таблица 7 показывают, что предварительная обработка нейронной сети наночастицами по изобретению предотвращает/оказывает спасающее действие на индуцированные MPP⁺ функциональные эффекты на нейронную сеть. Интересно, что наночастицы золота со средним по величине размером ядра наночастиц популяции, равным 15 нм, менее эффективны для предотвращения/спасающего действия на индуцированные MPP⁺ функциональные эффекты на нейронную сеть, чем наночастицы золота, имеющие наибольший медианный размер ядра наночастиц популяции, равный 45 нм.

Эти результаты подчеркивают способность обеих наночастиц золота предотвращать/оказывать спасающее действие на индуцированные MPP⁺ функциональные эффекты на нейронную сеть, причем наночастицы золота с наибольшим медианным размером 45 нм являются более эффективными, чем наночастицы золота с наибольшим медианным размером 15 нм.

ПРИМЕР 11. Синтез наночастиц, полученных из проводникового материала: Поли(3,4-этилендиокситиофеновые) наночастицы (PEDOT наночастицы), имеющие отрицательный поверхностный заряд

Дисперсию поли(3,4-этилендиокситиофеновых) наночастиц (наночастиц PEDOT) в воде (1,1% масс/масс) получали от Sigma (Sigma 675288) и использовали без дополнительной очистки.

Зета-потенциал определяли путем измерения электрофоретической подвижности наночастиц (Нанозетасайзер, Malvern) путем разбавления суспензии наночастиц в растворе NaCl при 1 мМ при pH 7,3 (конечная концентрация PEDOT: 1г/л). Зета-потенциал при pH 7,3 был найден равным -53мВ.

Наибольший медианный размер наночастиц или агрегатов наночастиц популяции и размер ядра наночастиц или агрегатов наночастиц, представляющий 30%-70% процентиль популяции наночастиц и агрегатов наночастиц, оценивали с использованием сканирующей электронной микроскопии (SEM), и они были равны 408 нм и 311 нм - 518 нм, соответственно (были подсчитаны 56 наночастиц и был измерен их наибольший размер).

ПРИМЕР 12. Оценка эффективности предотвращения/спасающего действия PEDOT наночастиц из примера 11 на MPP⁺-индуцированные нейронные сети с использованием технологии MEA фенотипического скрининга

Эффективность предотвращения/спасающего действия наночастиц по изобретению тестировали на ко-культурах вентральной части среднего мозга/коры мышей, обработанных MPP⁺, культивируемых на 48-луночной MEA в течение 3 недель. Оценку эффекта предотвращения/спасающего действия наночастиц осуществляли путем измерения внеклеточной электрической активности ко-культивированных нейронов, нанесенных на чипы микроэлектродной матрицы (MEA).

Индукцию паркинсонического фенотипа в нейронах мыши in vitro осуществляли при помощи 1-метил-4-фенилпиридиний йодида (MPP⁺).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Первичная культура клеток, условия обработки

Ткань среднего мозга и лобной коры собирали у эмбрионов (день 14,5) chr:NMRI мышей (Charles River). Мышей умерщвляли путем цервикальной дислокации. Ткань диссоциировали ферментативным расщеплением (133,3 единицы Кунитца/мл ДНКазы; 10 единиц/мл папаина) и механическим растиранием в порошок, подсчитывали, контролировали жизнеспособность и высевали в 20 мкл каплю DMEM, содержащей ламинин (10 мкг/мл), 10% фетальной бычьей сыворотки и 10% лошадиной сыворотки, на MEA. Культуры на MEA инкубировали при 37°C в атмосфере 10% CO₂ до готовности к применению. Культуральные среды пополняли два раза в неделю DMEM, содержащей 10% лошадиной сыворотки.

В группах “Наночастицы” на 7-й день лунки обрабатывали суспензией наночастиц ([PEDOT] = 500 мкМ) из примера 11, и затем 20 мкМ MPP⁺ на 8-й день. В “Контрольной” группе в лунки добавляли воду на 7-й день, с последующим добавлением воды на 8-й день. В группе “MPP⁺” в лунки добавляли воду на 7-й день и затем 20 мкМ MPP⁺ на 8-й день.

Через двадцать четыре (24) часа после добавления MPP+ (или воды для “Контрольной” группы) среду меняли для достижения вымывания MPP⁺. Среду впоследствии меняли дважды в неделю.

На 21-й день зарегистрировали 120 минут активности нейронов и проанализировали 30 минут стабильной активности.

Нейрочипы с микроэлектродной матрицей

Нейрочипы с 48-луночной микроэлектродной матрицей приобретали у Axion Biosystems Inc. Эти чипы имеют 16 пассивных электродов на лунку. Поверхность в течение 1 часа покрывали полиэтиленимином (PEI, 50% в боратном буфере), промывали и высушивали на воздухе.

Многоканальная регистрация и многопараметрический анализ данных

Для регистрации использовали многоканальную систему регистрации MAESTRO от Axion Biosystems (США). Для внеклеточной регистрации 48-луночные МЕА помещали на регистрирующую станцию MAESTRO и поддерживали при 37°C. Регистрации осуществляли в DMEM/10% термоинактивированной лошадиной сыворотке. рH поддерживали на уровне 7,4 с использованием непрерывного потока отфильтрованного увлажненного воздушного потока с 10% CO₂.

Каждая единица представляет активность, исходящую от одного нейрона, зарегистрированную на одном электроде. Единицы разделяются в начале регистрации. Для каждой единицы потенциалы действия (т.е. спайки) регистрировали как последовательности спайков которые объединены в так называемые “вспышки”. Вспышки количественно описывали при помощи прямого анализа последовательности спайков с использованием программ Spike Wrangler и NPWaveX (обе от компании NeuroProof GmbH, Rostock, Germany). Вспышки определялись началом и концом коротких спайковых событий.

При помощи многопараметрического высокопроизводительного анализа паттернов активности сети получали 204 описывающих активность параметра последовательности спайков. Эти параметры позволяют получить точное описание изменений активности в следующих четырех категориях: общая активность, структура вспышки, характеристика колебаний и синхронность.

Функциональные эффекты, индуцированные MPP⁺, на нейронную сеть и эффективность предотвращения/спасающего действия наночастиц по изобретению оценивали по описанным выше параметрам.

Значения, связанные со спонтанной нативной активностью на 21-й день, получали из 60-секундных групп данных, взятых из 30-минутного промежутка после 30-90-минутной стабилизации активности. Результаты (значения параметров) выражали как среднее значение ± SEM независимых сетей. Для группы “Наночастицы” по меньшей мере 5 активных лунок, для “Контрольной” группы по меньшей мере 20 активных лунок и для группы “MPP⁺” по меньшей мере 20 активных лунок (“активные” означает лунки с достаточным количеством электродов измерения электрической активности) были включены в анализ. Распределения абсолютных параметров тестировали на нормальность и статистическую значимость между группами оценивали при помощи однофакторного дисперсионного анализа.

Для оценки комбинированных эффектов многопараметрические результаты выбора из 204 параметров были отражены в одном параметре, называемом “Оценка эффекта”. Это линейная комбинация выбранных характеристик, преобразующая наборы данных на вектор с “Контрольной” группой со средним значением “0” и группой “MPP⁺” со средним значением “1”. Вычисление Z-фактора оценки эффекта осуществляли путем выбора 20 из 204 измеренных параметров, оптимизированных для нахождения наилучшего разграничения между “Контрольной” группой и группой “MPP⁺” (Kümmel A, et al., J Biomol Screen., 2010, 15(1), 95-101: Integration of multiple readouts into the z' factor for assay quality assessment).

Анализ оценки эффекта показан на Фиг. 17.

Эффективность предотвращения/спасающего действия наночастиц по изобретению показана в Таблице 8.

Таблица 8

Суммарная оценка эффекта и эффективности предотвращения/спасающего действия PEDOT наночастиц по изобретению (из примера 11) на индуцированные MPP⁺ эффекты на нейронную сеть

Группа Оценка эффекта Эффективность предотвращения/спасающего действия “Контрольная” группа 0 Референтная (установлена на 100%) группа “MPP⁺” 1 0% группа “Наночастицы”: биосовместимые PEDOT наночастицы из примера 11 0,59 41%

Фиг. 17 и Таблица 8 показывают, что предварительная обработка нейронной сети наночастицами PEDOT по изобретению предотвращает/оказывает спасающее действие на индуцированные MPP⁺ функциональные эффекты на нейронную сеть.

Эти результаты демонстрируют способность наночастиц, описанных в настоящей заявке, предотвращать/оказывать спасающее действие на индуцированные MPP⁺ функциональные эффекты на нейронную сеть.

ПРИМЕР 13. Синтез наночастиц, полученных из изоляционного материала, имеющего низкую относительную диэлектрическую проницаемость, равную или ниже 100: синтез наночастиц оксида гафния, покрытых биосовместимым покрытием, имеющим отрицательный поверхностный заряд

Наночастицы оксида гафния (HfO₂) синтезировали путем осаждения хлорида гафния (HfCl₄) гидроксидом тетраметиламмония (ТМАОН) при основном значении pH. Полученную суспензию переносили в автоклав и нагревали при температуре выше 110°C. После охлаждения суспензию промывали деионизированной водой и подкисляли.

Функционализацию поверхности осуществляли с использованием гексаметафосфата натрия. Достаточную массу гексаметафосфата натрия добавляли к суспензии наночастиц, чтобы достичь по меньшей мере половины покрытия монослоем (2,5 молекулы/нм²) на поверхности. Суспензию наночастиц перемешивали в течение ночи и затем рН доводили до 7.

Группа изобретений относится к области медицины. Раскрыто применение наночастицы или агрегата наночастиц для профилактики или лечения неврологического заболевания или по меньшей мере одного его симптома у субъекта без воздействия на наночастицу или агрегат наночастиц электрического поля или любого другого внешнего источника активации, где материал наночастицы или агрегата наночастиц выбран из проводникового материала, выбранного из Tl, Po, Ag, Pd, Ir, Pt и/или Au и органического материала, имеющего смежные sp2-гибридизированные углеродные центры в своей структуре; и изоляционного материала, выбранного из Al₂O₃, LaAlO₃, La₂O₃, SiO₂, SnO₂, Ta₂O₅, ReO₂, ZrO₂, HfO₂ и алмазоподобного углерода, где i) медианный размер ядра наночастицы или агрегата наночастиц популяции составляет по меньшей мере 30 нм, когда материал представляет собой проводниковый материал, и где ii) ядро наночастицы или агрегата наночастиц покрыто биосовместимым покрытием, где iii) биосовместимое покрытие, обеспечивающее отрицательный поверхностный заряд, выбирают из фосфата, дикарбоновой кислоты, янтарной кислоты или сульфата, и биосовместимое покрытие, обеспечивающее нейтральный поверхностный заряд, выбирают из агента, включающего функциональную группу, выбранную из спирта (R-OH), альдегида (R-COH), кетона (R-CO-R), сложного эфира (R-COOR), кислоты (R-COOH), тиола (R-SH), сахарида, ангидрида (RCOOOC-R) и пиррола. Также раскрыто применение композиции, включающей описанные выше частицы и/или агрегаты наночастиц и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики или лечения неврологического заболевания или по меньшей мере одного его симптома у субъекта. Группа изобретений обеспечивает профилактику или лечение неврологического заболевания или по меньшей мере одного его симптома без воздействия на наночастицу или агрегат наночастиц электрического поля. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 21 ил., 8 табл., 13 пр.

1. Применение наночастицы или агрегата наночастиц для профилактики или лечения неврологического заболевания, выбранного из болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, эпилепсии, обсессивно-компульсивного расстройства, расстройства аутистического спектра, депрессивного расстройства, дистонии, синдрома Туретта, шизофрении, инсульта, афазии, деменции, шума в ушах, болезни Хантингтона, эссенциального тремора, биполярного расстройства, тревожного расстройства, аддиктивного расстройства и вегетативного состояния сознания, или по меньшей мере одного его симптома у субъекта без воздействия на наночастицу или агрегат наночастиц электрического поля или любого другого внешнего источника активации, где материал наночастицы или агрегата наночастиц выбран из проводникового материала, выбранного из металла, имеющего значение стандартного потенциала восстановления E°, равное или выше 0,2, выбранного из Tl, Po, Ag, Pd, Ir, Pt и/или Au, и органического материала, имеющего смежные sp2-гибридизированные углеродные центры в своей структуре; и изоляционного материала с относительной диэлектрической проницаемостью ε_ijk, равной или ниже 100, выбранного из Al₂O₃, LaAlO₃, La₂O₃, SiO₂, SnO₂, Ta₂O₅, ReO₂, ZrO₂, HfO₂ и алмазоподобного углерода, где относительная диэлектрическая проницаемость ε_ijk измерена в диапазоне от 20°C до 30°C и от 10² Гц до частоты инфракрасного диапазона, где i) медианный размер ядра наночастицы или агрегата наночастиц популяции составляет по меньшей мере 30 нм, когда материал представляет собой проводниковый материал, и где ii) ядро наночастицы или агрегата наночастиц покрыто биосовместимым покрытием, обеспечивающим нейтральный или отрицательный поверхностный заряд, при измерении в растворе воды, имеющем концентрацию электролитов от 0,001 до 0,2 M, концентрацию материала наночастиц или агрегатов наночастиц от 0,01 до 10 г/л и рН между 6 и 8, и где iii) биосовместимое покрытие, обеспечивающее отрицательный поверхностный заряд, выбирают из фосфата, дикарбоновой кислоты, янтарной кислоты или сульфата, и биосовместимое покрытие, обеспечивающее нейтральный поверхностный заряд, выбирают из агента, включающего функциональную группу, выбранную из спирта (R-OH), альдегида (R-COH), кетона (R-CO-R), сложного эфира (R-COOR), кислоты (R-COOH), тиола (R-SH), сахарида, ангидрида (RCOOOC-R) и пиррола.

2. Применение по п. 1, где материал наночастицы или агрегата наночастиц выбран из металлической наночастицы, где металлический элемент представляет собой Ir, Pd, Pt, Au или любую их смесь, и органической наночастицы, состоящей из поли(3,4-этилендиокситиофена) (PEDOT), полианилина, полипиррола, полиацетилена, политиофена, поликарбазола и/или полипирена.

3. Применение по п. 1, где материал представляет собой изоляционный материал с энергетической щелью Eg, равной или выше 3,0 эВ, и относительной диэлектрической проницаемостью ε_ijk, равной или выше 100, и материал наночастицы или агрегата наночастиц представляет собой оксид металла, выбранный из ReO₂, ZrO₂ и HfO₂.

4. Применение по любому из пп. 1-3, где неврологическое заболевание выбрано из болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, эпилепсии и по меньшей мере одного их симптома.

5. Применение композиции, включающей наночастицы и/или агрегаты наночастиц и фармацевтически приемлемый носитель, для профилактики или лечения неврологического заболевания, выбранного из болезни Паркинсона, болезни Альцгеймера, эпилепсии, обсессивно-компульсивного расстройства, расстройства аутистического спектра, депрессивного расстройства, дистонии, синдрома Туретта, шизофрении, инсульта, афазии, деменции, шума в ушах, болезни Хантингтона, эссенциального тремора, биполярного расстройства, тревожного расстройства, аддиктивного расстройства и вегетативного состояния сознания, или по меньшей мере одного его симптома у субъекта без воздействия на наночастицы и/или агрегаты наночастиц электрического поля или любого другого внешнего источника активации,

где материал наночастицы или агрегата наночастиц выбран из проводникового материала, выбранного из металла, имеющего значение стандартного потенциала восстановления E°, равное или выше 0,2, выбранного из Tl, Po, Ag, Pd, Ir, Pt и/или Au, и органического материала, имеющего смежные sp2-гибридизированные углеродные центры в своей структуре; и изоляционного материала с относительной диэлектрической проницаемостью ε_ijk, равной или ниже 100, выбранного из Al₂O₃, LaAlO₃, La₂O₃, SiO₂, SnO₂, Ta₂O₅, ReO₂, ZrO₂, HfO₂ и алмазоподобного углерода, где относительная диэлектрическая проницаемость ε_ijk измерена в диапазоне от 20°C до 30°C и от 10² Гц до частоты инфракрасного диапазона, где i) медианный размер ядра наночастицы или агрегата наночастиц популяции составляет по меньшей мере 30 нм, когда материал представляет собой проводниковый материал, и где ii) ядро наночастицы или агрегата наночастиц покрыто биосовместимым покрытием, обеспечивающим нейтральный или отрицательный поверхностный заряд, при измерении в растворе воды, имеющем концентрацию электролитов от 0,001 до 0,2 M, концентрацию материала наночастиц или агрегатов наночастиц от 0,01 до 10 г/л и рН между 6 и 8, и где iii) биосовместимое покрытие, обеспечивающее отрицательный поверхностный заряд, выбирают из фосфата, дикарбоновой кислоты, янтарной кислоты или сульфата, и биосовместимое покрытие, обеспечивающее нейтральный поверхностный заряд, выбирают из агента, включающего функциональную группу, выбранную из спирта (R-OH), альдегида (R-COH), кетона (R-CO-R), сложного эфира (R-COOR), кислоты (R-COOH), тиола (R-SH), сахарида, ангидрида (RCOOOC-R) и пиррола.

6. Применение по п. 5, где композиция включает по меньшей мере две разные наночастицы и/или агрегата наночастиц, описанных в любом из пп. 1-5.