[001] Данная заявка подается как Международная заявка РСТ 30 января 2015 г. и испрашивает приоритет по предварительной заявке США №61/934528, поданной 31 января 2014 г., которая включена в данное описание путем ссылки в полном объеме.
ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[002] Предлагаются новые соединения изоиндолина, связывающиеся с сигма-2-рецептором, фармацевтические композиции, содержащие такие соединения, и способы ингибирования или восполнения потери синапса в нейронах, модулирования изменений переноса через мембраны в нейронах и лечения снижения когнитивных способностей и нейродегенеративных заболеваний и нарушений.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[003] В настоящее время существует лишь пять лекарственных средств, утвержденных Управлением по контролю пищевых продуктов и лекарственных средств (FDA) для лечения болезни Альцгеймера (БА). Четыре из них являются ингибиторами холинэстеразы: такрин (COGNEX®; Sciele), донепезил (ARICEPT®; Pfizer), ривастигмин (EXELON®; Novartis) и галантамин (RAZADYNE®; Ortho-McNeil-Janssen). Донепезил, ривастигмин и галантамин являются более поздними альтернативами такрина, соединения первого поколения, редко назначаемого из-за потенциальной гепатотоксичности; они примерно так же эффективны при обеспечении симптоматического улучшения когниции и функции на всех стадиях болезни Альцгеймера. Пятым утвержденным лекарственным средством является мемантин (NAMENDA®; Forest) - низкоаффинный, обладающий зависимым от частоты использования эффектом антагонист рецептора N-метил-D-аспартатглутамата, который обеспечивает подобные преимущества, но только при БА от умеренной до тяжелой. Клинические эффекты этих соединений слабы и непостоянны, а имеющиеся в настоящее время данные неубедительны для подтверждения целесообразности их применения в качестве модифицирующих течение болезни средств. См., например, Kerchner et al, 2010, Bapineuzumab, Expert Opin Biol Ther., 10(7): 1121-1130. Очевидно, что требуются альтернативные подходы к лечению БА.
[004] Предлагаются некоторые соединения изоиндолина, действующие как функциональные антагонисты сигма-2-рецептора и ингибирующие вредное воздействие растворимых Аβ-олигомеров. В некоторых вариантах реализации изоиндолиновые соединения и композиции антагонистов сигма-2-рецептора применяют для лечения или профилактики синаптической дисфункции у субъекта.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[005] Обеспечиваются новые соединения изоиндолина, связывающиеся с сигма-2-рецептором, фармацевтические композиции, включающие такие соединения, и способы ингибирования или восполнения потери синапса в нейронах, модулирования изменений переноса через мембраны в нейронах и лечения снижения когнитивных способностей и нейродегенеративных заболеваний и нарушений.
[006] В некоторых вариантах реализации соединения изоиндолина и их фармацевтически приемлемые соли согласно Формуле I и/или Формуле II или их фармацевтически приемлемые соли демонстрируют антагонистическую активность в отношении сигма-2-рецептора, а также демонстрируют другие аспекты конкретного терапевтического фенотипа и, таким образом, ингибируют вредное воздействие растворимых бета-амилоидных ("Abeta", "Аβ") пептидов и олигомеров и других их растворимых разновидностей на нейроны, как определено ниже, и, следовательно, могут применяться для лечения состояний, включая болезни и нарушения, которые связаны с вызванной Abeta-олигомерами патологией, такой, как болезнь Альцгеймера.
[007] Растворимые Abeta-олигомеры ведут себя как обратимые фармакологические лиганды, связывающиеся со специфическими рецепторами препятствующие сигнальным путям, которые являются ключевыми для нормальной синаптической пластичности, что в результате ведет к потере шипика и синапса. Было обнаружено, что представленные авторами соединения изоиндолина согласно Формуле I, которые связываются с сигма-2-рецептором и ведут себя как функциональные нейрональные антагонисты, демонстрируют фармакологическую конкуренцию с Abeta-олигомерами. Таким образом, соединения изоиндолиновых антагонистов сигма-2, как описано авторами, могут снижать или исключать воздействие Abeta-олигомера, такое, как вызванная Abeta клеточная токсичность. Исключаются некоторые соединения существующего уровня техники. Также обеспечиваются способы подавления влияния Abeta-олигомеров или других растворимых разновидностей Abeta на нейроны, в более широком смысле - бета-амилоидных патологий, включающие контактирование клетки с антагонистом сигма-2 согласно Формуле I и/или Формуле II или его фармацевтически приемлемой солью. В некоторых вариантах реализации обеспечиваются способы лечения ранних стадий болезни Альцгеймера, включающие введение терапевтически эффективного количества функционального антагониста сигма-2 согласно Формуле I и/или Формуле II или его фармацевтически приемлемой соли.
[008] В одном варианте реализации предлагается выделенное соединение или его фармацевтически приемлемая соль согласно Формуле I:
где:
R1 и R2 каждый независимо выбран из Н, C1-С6алкила или CH2OR'; где R'=Н или С1-С6 алкил;
R3, R4, R5 и R6 каждый независимо выбран из Н, C1-С6 алкила, ОН, ОСН3, OCH(СН3)2, ОСН2СН(СН3)2, ОС(СН3)3, O(C1-C6 алкила), OCF3, OCH2CH2OH, O(C1-C6 алкил)ОН, O(C1-C6 галогеналкила), F, Cl, Br, I, CF3, CN, NO2, NH2, C1-С6 галогеналкила, C1-С6 гидроксиалкила, C1-6 алкокси C1-6алкила, арила, гетероарила, С3-7 циклоалкила, гетероциклоалкила, алкиларила, гетероарила, CO2R', C(O)R', NH(C1-4 алкила), N(C1-4 алкила)2, NH(С3-7 циклоалкила), NHC(O)(C1-4 алкила), CONR'2, NC(O)R', NS(O)nR', S(O)nNR'2, S(O)nR', С(O)O(С1-4 алкила), OC(O)N(R')2, C(O)(C1-4 алкила) и C(O)NH(C1-4 алкила); где n=0, 1 или 2; R' каждый независимо представляет собой Н, СН3, СН2СН3, С3-С6 алкил, C1-С6 галогеналкил; или необязательно замещенный арил, алкиларил, пиперазин-1-ил, пиперидин-1-ил, морфолинил, гетероциклоалкил, гетероарил, C1-6 алкокси, NH(C1-4 алкил) или NH(C1-4 алкил)2, причем необязательно замещенная группа выбрана из C1-С6 алкила или С2-С7 ацила;
или R3 и R4, вместе с атомом С, к которому они присоединены, образуют 4-, 5-, 6- 7- или 8-членный циклоалкил, арил, гетероарил или гетероциклоалкил, необязательно замещенный 1, 2, 3, 4 или 5 заместителями, независимо выбранными из ОН, амино, галогена, С1-6 алкила, C1-6 галогеналкила, С1-6 алкокси, C1-6 галогеналкокси, арила, арилалкила, гетероарила, гетероарилалкила, циклоалкила и гетероциклоалкила, и R3 и R4, или R4 и R5, каждый независимо выбран из связи, С, N, S и О; или R3 и R4 связаны вместе с образованием -O-С1-2 метилен-O-группы;
или R4 и R5, имеете с атомом С, к которому они присоединены, образуют 4-, 5-, 6- 7- или 8-членный циклоалкил, арил, гетероарил или гетероциклоалкил, необязательно замещенный 1, 2, 3, 4 или 5 заместителями, независимо выбранными из ОН, амино, галогена, С1-6 алкила, С1-6 галогеналкила, C1-6 алкокси, C1-6 галогеналкокси, арила, арилалкила, гетероарила, гетероарилалкила, циклоалкила и гетероциклоалкила, и R3 и R4, или R4 и R5, каждый независимо выбран из связи, С, N, S и О; или R4 и R5 связаны вместе с образованием -O-C1-2 метилен-O-группы;
R7, R8, R9, R10 и R11 каждый независимо выбран из Н, C1-С6 алкила, ОН, ОСН3, ОСН(СН3)2, ОСН2СН(СН3)2, ОС(СН3)3, O(C1-C6 алкила), OCF3, OCH2CH2OH, O(C1-C6 алкил)ОН, O(С1-С6 галогеналкила), O(CO)R', F, Cl, Br, I, CF3, CN, NO2, NH2, C1-С6 галогеналкила, C1-C6 гидроксиалкила, C1-6 алкокси C1-6алкила, арила, гетероарила, С3-7 циклоалкила, гетероциклоалкила, алкиларила, гетероарила, CO2R', C(O)R', NH(C1-4 алкила), N(C1-4 алкила)2, NH(С3-7 циклоалкила), NHC(O)(C1-4 алкила), CONR'2, NC(O)R', NS(O)nR', S(O)nNR'2, S(O)nR', С(O)O(С1-4 алкила), OC(O)N(R')2, C(O)(С1-4 алкила) и C(O)NH(C1-4 алкила); где n=0, 1 или 2; R' каждый независимо представляет собой Н, СН3, CH2CH3, С3-С6 алкил, C1-С6 галогеналкил, арил, алкиларил, пиперазин-1-ил, пиперидин-1-ил, морфолинил, гетероциклоалкил, гетероарил, C1-6 алкокси, NH(C1-4 алкил) или NH(C1-4 алкил)2;
или R7 и R8, вместе с атомами N или С, к которым они присоединены, образуют 4-, 5-, 6- 7- или 8-членную циклоалкильную, арильную, гетероциклоалкильную или гетероарильную группу, которая необязательно замещена 1, 2, 3, 4 или 5 заместителями, независимо выбранными из ОН, амино, галогена, C1-6 алкила, C1-6 галогеналкила, C1-6 алкокси, С1-6 галогеналкокси, арила, арилалкила, гетероарила, гетероарилалкила, циклоалкила и гетероциклоалкила, и R9 и R10 каждый независимо выбран из связи, С, N, S и О; или R7 и R8 связаны вместе с образованием -О-С1-2 метилен-О-группы;
или R8 и R9, вместе с атомами N или С, к которым они присоединены, образуют 4-, 5-, 6- 7- или 8-членпую циклоалкильную, арильную, гетероциклоалкильную или гетероарильную группу, необязательно замещенную 1, 2, 3, 4 или 5 заместителями, независимо выбранными из ОН, амино, галогена, С1-6 алкила, С1-6 галогеналкила, C1-6 алкокси, С1-6 галогеналкокси, арила, арилалкила, гетероарила, гетероарилалкила, циклоалкила и гетероциклоалкила, и R9 и R10 каждый независимо выбраны из связи, С, N, S и О; или R8 и R9 связаны вместе с образованием -O-С1-2 метилен-O-группы,
где каждый из О, С1-6 алкила, C1-6 галогеналкила, гетероарила, арила, гетероарила, гетероциклоалкила и циклоалкила необязательно независимо замещен 1, 2, 3, 4 или 5 заместителями, независимо выбранными из ОН, амино, галогена, C1-6 алкила, C1-6 галогеналкила, C1-6 алкокси, C1-6 галогеналкокси, арила, арилалкила, гетероарила, гетероарилалкила, циклоалкила и гетероциклоалкила;
при условии, что исключаются следующие соединения:
[009] В другом варианте реализации предлагается соединение или его фармацевтически приемлемая соль согласно Формуле I, где R1 и R2 каждый независимо выбран из Н или СН3; R3, R4, R5 и R6 каждый независимо выбран из Н, C1-С6 алкила, ОН, ОСН3, O(С1-С6 алкила), O(С1-С6 галогеналкила), F, Cl, CF3, арила, гетероарила, С3-7 циклоалкила, CO2R', C(O)R', OC(O)N(R')2, CONR'2, NC(O)R', NS(O)nR', S(O)nNR'2, S(O)nR'; где n=0, 1 или 2; R' каждый независимо представляет собой Н, СН3, СН2СН3, С3-С6 алкил, C1-С6 галогеналкил; или необязательно замещенный пиперазин-1-ил, пиперидин-1-ил, морфолинил, гетероциклоалкил или арил, причем необязательно замещенная группа выбрана из C1-С6 алкила или С2-С7 ацила; или R3 и R4, вместе с атомом С, к которому они присоединены, образуют 5- или 6-членный С3-7циклоалкил или арил; или R4 и R5, вместе с атомом С, к которому они присоединены, образуют С3-7циклоалкил или 5- или 6-членный арил; или R3 и R4 связаны вместе с образованием -O-C1-2 метилен-O-группы; или R4 и R5 связаны вместе с образованием -O-C1-2 метилен-O-группы; и R7, R8, R9, R10 и R11 каждый независимо выбран из H, ОН, СН3, CH2CH3, F, Cl, CF3, OCF3, C1-C6 галогеналкил, ОСН3, O(C1-C6 алкил), OCH2CH2OH, O(С1-С6 алкил)ОН, арил, гетероарил, С3-7 циклоалкил, алкиларил, CO2R', CONR'2, S(O)nNR'2, S(O)nR', С(O)O(С1-4 алкил), OC(O)N(R')2 и C(O)NH(C1-4 алкил); где n=0, 1 или 2; R' каждый независимо представляет собой Н, C1-C6 алкил, C1-С6 галогеналкил, арил, алкиларил или С1-6 алкокси.
[0010] В еще одном варианте реализации предлагается соединение или его фармацевтически приемлемая соль согласно Формуле I, где R7, R10, R11 каждый представляет собой Н; R3 и R4 каждый независимо выбран из Н, F, Cl, S(O)nR', C(O)R', где n=2, и R' выбран из СН3, пиперазин-1-ила, пиперидин-1-ила, морфолинила; R8 выбран из ОН, ОСН3, ОСН(СН3)2, ОСН2СН(СН3)2 или ОС(СН3)3; и R9 представляет собой ОН.
[0011] В другом варианте реализации предлагается соединение или его фармацевтически приемлемая соль, выбранное из группы, состоящей из:
и 
.
[0012] В дополнительном варианте реализации предлагается соединение или его фармацевтически приемлемая соль согласно Формуле II:
,
где R3, R4, R5 и R6 каждый независимо выбран из Н, Cl, F, ОН, СН3, C1-6 алкила, ОСН3, ОСН(СН3)2, ОСН2СН(СН3)2, ОС(СН3)3, OC1-6 алкила, арила, гетероарила, гетероциклоалкила, CO2R', CONR'2, NC(O)R', NS(O)nR', S(O)nNR'2, S(O)nR', C(O)R', OC(O)N(R')2 или C(O)NH(C1-4 алкила), где n=0, 1 или 2; и R' каждый независимо представляет собой Н, С1-С6 алкил, С1-С6 галогеналкил; или необязательно замещенный арил, алкиларил, пиперазин-1-ил, пиперидин-1-ил, морфолинил, гетероциклоалкил, гетероарил, C1-6 алкокси, NH(C1-4 алкил) или NH(C1-4 алкил)2, причем необязательно замещенная группа выбрана из C1-С6 алкила или С2-С7 ацила;
или R3 и R4, вместе с атомом С, к которому они присоединены, образуют 6-членный арил; или R3 и R4 связаны вместе с образованием -О-С1-2 метилен-О-группы; или R4 и R5, вместе с атомом С, к которому они присоединены, образуют 6-членный арил; или R4 и R5 связаны вместе с образованием -О-С1-2 метилен-О-группы; и
R8 и R9 каждый независимо выбран из Н, Cl, F, ОН, СН3, C1-6 алкила, ОСН3, OCH(CH3)2, OCH2CH(СН3)2, ОС(CH3)3, O(CO)R', OC1-6 алкила, арила, гетероарила, гетероциклоалкила, CO2R', CONR'2, NC(O)R', NS(O)nR', S(O)nNR'2, S(O)nR', OC(O)N(R')2, или C(O)NH(C1-4 алкила);
или R8 и R9, вместе с атомами N или С, к которым они присоединены, образуют 4-, 5-, 6- 7- или 8-членную циклоалкильную, арильную, гетероциклоалкильную или гетероарильную группу, необязательно замещенную 1, 2, 3, 4 или 5 заместителями, независимо выбранными из ОН, амино, галогена, C1-6 алкила, C1-6 галогеналкила, C1-6 алкокси, С1-6 галогеналкокси, арила, арилалкила, гетероарила, гетероарилалкила, циклоалкила и гетероциклоалкила, и R9 и R10 каждый независимо выбран из связи, С, N, S и О; или R8 и R9 связаны вместе с образованием -О-С1-2 метилен-О-группы.
[013] В еще одном варианте реализации предлагается соединение или фармацевтически приемлемая соль согласно Формуле II, где по меньшей мере один из R3, R4, R5 и R6 не представляет собой Н; и по меньшей мере один из R8 и R9 не представляет собой Н.
[014] В другом варианте реализации предлагается соединение или его фармацевтически приемлемая соль согласно Формуле II, где R7, R10, R11 каждый представляет собой Н; R3 и R4 каждый независимо выбран из Н, F, Cl, S(O)nR', C(O)R', где n=2, и R' выбран из СН3 или необязательно замещенного пиперазин-1-ила, пиперидин-1-ила или морфолинила, причем необязательно замещенная группа выбрана из C1-С6 алкила или С2-С7 ацила; R8 выбран из ОН, Cl, ОСН3, ОСН(СН3)2, ОСН2СН(СН3)2 или ОС(СН3)3; и R9 представляет собой ОН или Cl.
[015] В еще одном варианте реализации предлагается соединение или фармацевтически приемлемая соль согласно Формуле II, где R3 и R4 каждый независимо выбран из Н, F, Cl, S(O)nR', C(O)R', причем n=2, и R' выбран из СН3, пиперазин-1-ила, пиперидин-1-ила или морфолинила; R5 и R6 каждый представляет собой H; R8 выбран из ОН, ОСН3, ОСН(СН3)2, OCH2CH(СН3)2 или ОС(СН3)3; и R9 представляет собой ОН.
[016] В еще одном варианте реализации соединение или его фармацевтически приемлемую соль выбирают из группы, состоящей из:
[017] В еще одном варианте реализации предлагается соединение или его фармацевтически приемлемая соль, выбранное из группы, состоящей из:
and и 
.
[018] В одном варианте реализации предлагается соединение или его фармацевтически приемлемая соль, выбранное из группы, состоящей из:
и 
.
[019] В другом варианте реализации предлагается композиция для ингибирования влияния бета-амилоида на нейроны, содержащая соединение или его фармацевтически приемлемую соль согласно Формуле I:
где:
R1 и R2 каждый независимо выбран из Н, C1-С6алкила или CH2OR'; где R'=Н или C1-С6 алкил;
R3, R4, R5 и R6 каждый независимо выбран из Н, C1-С6 алкила, ОН, ОСН3, OCH(CH3)2, OCH2CH(СН3)2, ОС(СН3)3, O(C1-C6 алкила), OCF3, OCH2CH2OH, O(C1-C6 алкил)OH, O(С1-С6 галогеналкила), F, Cl, Br, I, CF3, CN, NO2, NH2, C1-С6 галогеналкила, C1-C6 гидроксиалкила, С1-6 алкокси C1-6алкила, арила, гетероарила, С3-7 циклоалкила, гетероциклоалкила, алкиларила, гетероарила, CO2R', C(O)R', NH(C1-4 алкила), N(C1-4 алкила)2, NH(С3-7 циклоалкила), NHC(O)(C1-4 алкила), CONR'2, NC(O)R', NS(O)nR', S(O)nNR'2, S(O)nR', C(O)R', С(O)O(С1-4 алкила), OC(O)N(R')2, C(O)(С1-4 алкила) и C(O)NH(C1-4 алкила); где n=0, 1 или 2; R' каждый независимо представляет собой Н, СН3, CH2CH3, С3-С6 алкил, C1-С6 галогеналкил; или необязательно замещенный арил, алкиларил, пиперазин-1-ил, пиперидин-1-ил, морфолинил, гетероциклоалкил, гетероарил, С1-6 алкокси, NH(C1-4 алкил) или NH(C1-4 алкил)2, причем необязательно замещенная группа выбрана из С1-С6 алкила или С2-С7 ацила;
или R3 и R4, вместе с атомом С, к которому они присоединены, образуют 4-, 5-, 6- 7- или 8-членный циклоалкил, арил, гетероарил или гетероциклоалкил, необязательно замещенный 1, 2, 3, 4 или 5 заместителями, независимо выбранными из ОН, амино, галогена, С1-6 алкила, С1-6 галогеналкила, C1-6 алкокси, С1-6 галогеналкокси, арила, арилалкила, гетероарила, гетероарилалкила, циклоалкила и гетероциклоалкила, и R3 и R4 или R4 и R5, каждый независимо выбран из связи, С, N, S и О; или R3 и R4 связаны вместе с образованием -O-C1-2 метилен-O-группы;
или R4 и R5, вместе с атомом С, к которому они присоединены, образуют 4-, 5-, 6- 7- или 8-членный циклоалкил, арил, гетероарил или гетероциклоалкил, необязательно замещенный 1, 2, 3, 4 или 5 заместителями, независимо выбранными из ОН, амино, галогена, С1-6 алкила, С1-6 галогеналкила, C1-6 алкокси, C1-6 галогеналкокси, арила, арилалкила, гетероарила, гетероарилалкила, циклоалкила и гетероциклоалкила, и R3 и R4, или R4 и R5, каждый независимо выбран из связи, С, N, S и О; или R4 и R5 связаны вместе с образован нем -O-С1-2 метилен-О-группы;
R7, R8, R9, R10 и R11 каждый независимо выбран из H, C1-С6 алкила, ОН, ОСН3, ОСН(СН3)2, ОСН2СН(СН3)2, ОС(СН3)3, O(C1-C6 алкила), OCF3, OCH2CH2OH, O(С1-С6 алкил)ОН, O(С1-С6 галогеналкила), F, Cl, Br, I, CF3, CN, NO2, NH2, C1-С6 галогеналкила, C1-С6 гидроксиалкила, С1-6 алкокси C1-6алкила, арила, гетероарила, С3-7 циклоалкила, гетероциклоалкила, алкиларила, гетероарила, CO2R', C(O)R', NH(C1-4 алкила), N(C1-4 алкила)2, NH(С3-7 циклоалкила), NHC(O)(C1-4 алкила), CONR'2, NC(O)R', NS(O)nR', S(O)nNR'2, S(O)nR', С(O)O(C1-4 алкила), OC(O)N(R')2, C(O)(С1-4 алкила) и C(O)NH(C1-4 алкила); где n=0, 1 или 2; R' каждый независимо представляет собой Н, СН3, СН2СН3, С3-С6 алкил, C1-С6 галогеналкил, арил, алкиларил, пиперазин-1-ил, пиперидин-1-ил, морфолинил, гетероциклоалкил, гетероарил, C1-6 алкокси, NH(C1-4 алкил) или NH(C1-4 алкил)2;
или R7 и R8, вместе с атомами N или С, к которым они присоединены, образуют 4-, 5-, 6- 7- или 8-членную циклоалкильную, арильную, гетероциклоалкильную или гетероарильную группу, необязательно замещенную 1, 2, 3, 4 или 5 заместителями, независимо выбранными из ОН, амино, галогена, С1-6 алкила, С1-6 галогеналкила, C1-6 алкокси, С1-6 галогеналкокси, арила, арилалкила, гетероарила, гетероарилалкила, циклоалкила и гетероциклоалкила, и R9 и R10 каждый независимо выбран из связи, С, N, S и O; или R7 и R8 связаны вместе с образованием -O-С1-2 метилен-O-группы;
или R8 и R9, вместе с атомами N или С, к которым они присоединены, образуют 4-, 5-, 6- 7- или 8-членную циклоалкильную, арильную, гетероциклоалкильную или гетероарильную группу, необязательно замещенную 1, 2, 3, 4 или 5 заместителями, независимо выбранными из ОН, амино, галогена, C1-6 алкила, C1-6 галогеналкила, С1-6 алкокси, C1-6 галогеналкокси, арила, арилалкила, гетероарила, гетероарилалкила, циклоалкила и гетероциклоалкила, и R9 и R10 каждый независимо выбран из связи, С, N, S и О; или R8 и R9 связаны вместе с образованием -O-С1-2 метилен-O-группы;
где каждый из О, C1-6 алкил, C1-6 галогеналкил, гетероарил, арил, гетероарил, гетероциклоалкил и циклоалкил необязательно независимо замещен 1, 2, 3, 4 или 5 заместителями, независимо выбранными из ОН, амино, галогена, C1-6 алкила, C1-6 галогеналкила, С1-6 алкокси, C1-6 галогеналкокси, арила, арилалкила, гетероарила, гетероарилалкила, циклоалкила и гетероциклоалкила;
при условии, что исключаются следующие соединения:
,
причем соединение или его соль присутствует в композиции в количестве, эффективном для ингибирования связывания бета-амилоидного олигомера в вышеупомянутой клетке; и фармацевтически приемлемый носитель.
[020] В другом варианте реализации предлагается композиция для ингибирования влияния бета-амилоида на нейроны, содержащая соединение или его фармацевтически приемлемую соль согласно Формуле I:
где R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10 и R11 являются такими, как определено в данном документе, при условии, что если R1, R3, R6, R7, R10 и R11 каждый представляет собой H; R2 представляет собой СН3; R8 представляет собой ОСН3 или Cl; и R9 представляет собой ОН или Cl; то R4 не представляет собой Cl или CF3, и R5 не представляет собой Cl или CF3, и соединение или его соль присутствует в композиции в количестве, эффективном для ингибирования связывания бета-амилоидного олигомера в вышеупомянутой клетке; и фармацевтически приемлемый носитель.
[021] В другом варианте реализации предлагается композиция, содержащая соединение или его фармацевтически приемлемую соль согласно Формуле I, где
R1 и R2 каждый независимо выбран из Н или СН3;
R3, R4, R5 и R6 каждый независимо выбран из Н, C1-С6алкила, ОН, ОСН3, O(C1-C6 алкила), O(С1-С6 галогеналкила), F, Cl, CF3, арила, гетероарила, С3-7 циклоалкила, CO2R', C(O)R', OC(O)N(R')2, CONR'2, NC(O)R', NS(O)nR', S(O)nNR'2, S(O)nR'; где n=0, 1 или 2; R' каждый независимо представляет собой Н, СН3, СН2СН3, С3-С6 алкил, C1-С6 галогеналкил, пиперазин-1-ил, пиперидин-1-ил, морфолинил, гетероциклоалкил или арил;
или R3 и R4, вместе с атомом С, к которому они присоединены, образуют 5- или 6-членный С3-7циклоалкил или арил; или R4 и R5, вместе с атомом С, к которому они присоединены, образуют С3-7циклоалкил или 5- или 6-членный арил; или R3 и R4 связаны вместе с образованием -O-C1-2 метилен-O-группы; или R4 и R5 связаны вместе с образованием -O-С1-2 метилен-O-группы; и
R7, R8, R9, R10 и R11 каждый независимо выбран из Н, ОН, СН3, СН2СН3, F, Cl, CF3, OCF3, C1-С6 галогеналкила, ОСН3, O(C1-C6 алкила), OCH2CH2OH, O(C1-C6 алкил)ОН, арила, гетероарила, С3-7 циклоалкила, алкиларила, CO2R', CONR'2, S(O)nNR'2, S(O)nR', С(O)O(С1-4 алкила), OC(O)N(R')2 и C(O)NH(C1-4 алкила); где n=0, 1 или 2; R' каждый независимо представляет собой Н, C1-С6 алкил, C1-С6 галогеналкил, арил, алкиларил или С1-6 алкокси; и фармацевтически приемлемый носитель.
[022] В другом варианте реализации предлагается композиция, содержащая соединение или его фармацевтически приемлемую соль согласно Формуле I и фармацевтически приемлемый носитель, где R7, R10, R11 каждый представляет собой Н; R3 и R4 каждый независимо выбран из Н, F, Cl, S(O)nR', C(O)R', где n=2, и R' выбран из СН3, пиперазин-1-ила, пиперидин-1-ила, морфолинила; R8 выбран из ОН, ОСН3, ОСН(СН3)2, OCH2CH(СН3)2 или ОС(СН3)3; и R9 представляет собой ОН; и фармацевтически приемлемый носитель.
[023] В другом варианте реализации предлагается композиция, содержащая соединение или его фармацевтически приемлемую соль согласно Формуле I и фармацевтически приемлемый носитель, причем соединение или его фармацевтически приемлемую соль выбирают из группы, состоящей из:
и 
.
[024] В другом варианте реализации предлагается композиция, содержащая соединение или его фармацевтически приемлемую соль согласно Формуле II:
где R3, R4, R5 и R6 каждый независимо выбран из Н, Cl, F, ОН, СН3, C1-6 алкила, ОСН3, ОСН(СН3)2, ОСН2СН(СН3)2, ОС(СН3)3, OC1-6 алкила, арила, гетероарила, гетероциклоалкила, CO2R', CONR'2, NC(O)R', NS(O)nR', S(O)nNR'2, S(O)nR', C(O)R', OC(O)N(R')2 или C(O)NH(C1-4 алкила), где n=0, 1 или 2; и R' каждый независимо представляет собой Н, C1-С6 алкил, C1-С6 галогеналкил или необязательно замещенный арил, алкиларил, пиперазин-1-ил, пиперидин-1-ил, морфолинил, гетероциклоалкил, гетероарил, C1-6 алкокси, NH(C1-4 алкил) или NH(C1-4 алкил)2, причем необязательно замещенная группа выбрана из C1-С6 алкила или С2-С7 ацила;
или R3 и R4, вместе с атомом С, к которому они присоединены, образуют 6-членный арил; или R3 и R4 связаны вместе с образованием -О-С1-2 метилен-О-группы; или R4 и R5, вместе с атомом С, к которому они присоединены, образуют 6-членный арил; или R4 и R5 связаны вместе с образованием -О-С1-2 метилен-О-группы; и
R8 и R9 каждый независимо выбран из Н, Cl, F, ОН, СН3, C1-6 алкила, ОСН3, ОСН(СН3)2, OCH2CH(СН3)2, ОС(СН3)3, OC1-6 алкила, арила, гетероарила, гетероциклоалкила, CO2R', CONR'2, NC(O)R', NS(O)nR', S(O)nNR'2, S(O)nR', OC(O)N(R')2 или C(O)NH(C1-4 алкила); и фармацевтически приемлемый носитель.
[025] В другом варианте реализации предлагается композиция, содержащая соединение или его фармацевтически приемлемую соль согласно Формуле II, где R3 и R4 каждый независимо выбран из Н, F, Cl, S(O)nR', C(O)R', где n=2, и R' выбран из СН3, пиперазин-1-ила, пиперидин-1-ила или морфолинила; R5 и R6 каждый представляет собой Н; R8 выбран из ОН, ОСН3, ОСН(СН3)2, ОСН2СН(СН3)2 или ОС(СН3)3; и R9 представляет собой ОН; и фармацевтически приемлемый носитель.
[026] В еще одном варианте реализации предлагается композиция, содержащая соединение или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель, причем соединение или соль выбирают из группы, состоящей из:
.
[027] В еще одном варианте реализации предлагается композиция, содержащая соединение или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель, причем соединение или соль выбирают из группы, состоящей из:
и 
.
[028] В еще одном варианте реализации предлагается композиция, содержащая соединение или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель, причем соединение или соль выбирают из группы, состоящей из:
и 
[029] В одном варианте реализации предлагается способ/применение для ингибирования влияния бета-амилоида на нейроны, включающие введение эффективного количества композиции, содержащей соединение селективного антагониста сигма-2-рецептора или его фармацевтически приемлемую соль согласно формуле I:
где:
R1 и R2 каждый независимо выбран из Н, C1-С6алкила или CH2OR'; где R'=Н или C1-C6 алкил;
R3, R4, R5 и R6 каждый независимо выбран из Н, C1-С6 алкила, ОН, ОСН3, ОСН(СН3)2, ОСН2СН(СН3)2, ОС(СН3)3, O(C1-C6 алкила), OCF3, OCH2CH2OH, O(C1-C6 алкил)ОН, O(C1-C6 галогеналкила), F, Cl, Br, I, CF3, CN, NO2, NH2, С1-С6 галогеналкила, C1-С6 гидроксиалкила, C1-6 алкокси C1-6алкила, арила, гетероарила, С3-7 циклоалкила, гетероциклоалкила, алкиларила, гетероарила, CO2R', C(O)R', NH(C1-4 алкила), N(C1-4 алкила)2, NH(С3-7 циклоалкила), NHC(O)(C1-4 алкила), CONR'2, NC(O)R', NS(O)nR', S(O)nNR'2, S(O)nR', C(O)R', C(O)O(C1-4 алкила), OC(O)N(R')2, C(O)(С1-4 алкила) и C(O)NH(C1-4 алкила); где n=0, 1 или 2; R' каждый независимо представляет собой Н, СН3, CH2CH3, С3-С6 алкил, С1-С6 галогеналкил; или необязательно замещенный арил, алкиларил, пиперазин-1-ил, пиперидин-1-ил, морфолинил, гетероциклоалкил, гетероарил, С1-6 алкокси, NH(C1-4 алкил) или NH(C1-4 алкил)2, причем необязательно замещенная группа выбрана из C1-С6 алкила или C2-C7 ацила;
или R3 и R4, вместе с атомом С, к которому они присоединены, образуют 4-, 5-, 6- 7- или 8-членный циклоалкил, арил, гетероарил или гетероциклоалкил, необязательно замещенный 1, 2, 3, 4 или 5 заместителями, независимо выбранными из ОН, амино, галогена, C1-6 алкила, C1-6 галогеналкила, C1-6 алкокси, C1-6 галогеналкокси, арила, арилалкила, гетероарила, гетероарилалкила, циклоалкила и гетероциклоалкила, и R3 и R4, или R4 и R5, каждый независимо выбран из связи. С, N, S и О; или R3 и R4 связаны вместе с образованием -O-C1-2 метилен-О-группы;
или R4 и R5, вместе с атомом С, к которому они присоединены, образуют 4-, 5-, 6- 7- или 8-членный циклоалкил, арил, гетероарил или гетероциклоалкил, необязательно замещенный 1, 2, 3, 4 или 5 заместителями, независимо выбранными из ОН, амино, галогена, C1-6 алкила, C1-6 галогеналкила, C1-6 алкокси, C1-6 галогеналкокси, арила, арилалкила, гетероарила, гетероарилалкила, циклоалкила и гетероциклоалкила, и R3 и R4, или R4 и R3, каждый независимо выбран из связи, С, N, S и О; или R4 и R5 связаны вместе с образованием -O-С1-2 метилен-O-группы;
R7, R8, R9, R10 и R11 каждый независимо выбран из Н, C1-С6алкила, ОН, ОСН3, ОСН(СН3)2, OCH2CH(CH3)2, ОС(СН3)3, O(С1-С6 алкила), OCF3, OCH2CH2OH, O(C1-C6 алкил)ОН, O(C1-С6 галогеналкила), F, Cl, Br, I, CF3, CN, NO2, NH2, С1-С6 галогеналкила, C1-С6 гидроксиалкила, C1-6 алкокси C1-6алкила, арила, гетероарила, С3-7 циклоалкила, гетероциклоалкила, алкиларила, гетероарила, CO2R', C(O)R', NH(C1-4 алкила), N(C1-4 алкила)2, NH(С3-7 циклоалкила), NHC(O)(C1-4 алкила), CONR'2, NC(O)R', NS(O)nR', S(O)nNR'2, S(O)nR', С(O)O(С1-4 алкила), OC(O)N(R')2, C(O)(С1-4 алкила) и C(O)NH(C1-4 алкила); где n=0, 1 или 2; R' каждый независимо представляет собой Н, СН3, СН2СН3, С3-С6 алкил, C1-С6 галогеналкил; или необязательно замещенный арил, алкиларил, ниперазин-1-ил, пиперидин-1-ил, морфолинил, гетероциклоалкил, гетероарил, C1-6 алкокси, NH(C1-4 алкил) или NH(C1-4 алкил)2, причем необязательно замещенная группа выбрана из C1-C6 алкила или С2-С7 ацила;
или R7 и R8, вместе с атомами N или С, к которым они присоединены, образуют 4-, 5-, 6- 7- или 8-членную циклоалкильную, арильную, гетероциклоалкильную или гетероарильную группу, необязательно замещенную 1, 2, 3, 4 или 5 заместителями, независимо выбранными из ОН, амино, галогена, C1-6 алкила, С1-6 галогеналкила, C1-6 алкокси, С1-6 галогеналкокси, арила, арилалкила, гетероарила, гетероарилалкила, циклоалкила и гетероциклоалкила, и R9 и R10 каждый независимо выбран из связи, С, N, S и О; или R7 и R8 связаны вместе с образованием -O-С1-2 метилен-O-группы;
или R8 и R9, вместе с атомами N или С, к которым они присоединены, образуют 4-, 5-, 6- 7- или 8-члеииую циклоалкильную, арильную, гетероциклоалкильную или гетероарильную группу, необязательно замещенную 1, 2, 3, 4 или 5 заместителями, независимо выбранными из ОН, амино, галогена, С1-6 алкила, C1-6 галогеналкила, C1-6 алкокси, C1-6 галогеналкокси, арила, арилалкила, гетероарила, гетероарилалкила, циклоалкила и гетероциклоалкила, и R9 и R10 каждый независимо выбран из связи, С, N, S и O; или R8 и R9 связаны вместе с образованием -O-С1-2 метилен-O-группы,
где каждый из О, C1-6 алкила, C1-6 галогеналкила, гетероарила, арила, гетероарила, гетероциклоалкила и циклоалкила необязательно независимо замещен 1, 2, 3, 4 или 5 заместителями, независимо выбранными из ОН, амино, галогена, C1-6 алкила, C1-6 галогеналкила, C1-6 алкокси, С1-6 галогеналкокси, арила, арилалкила, гетероарила, гетероарилалкила, циклоалкила и гетероциклоалкила;
при условии, что исключаются следующие соединения:
причем соединение или его фармацевтически приемлемая соль предусмотрены в количестве, эффективном для ингибирования связывания бета-амилоидного олигомера в вышеупомянутой клетке; и фармацевтически приемлемый носитель.
[030] В другом варианте реализации предлагается способ/применение для ингибирования влияния бета-амилоида на нейроны, включающие введение эффективного количества композиции, содержащей соединение селективного антагониста сигма-2-рецептора или его фармацевтически приемлемую соль согласно Формуле I, причем соединение или его фармацевтически приемлемую соль вводят в количестве, также эффективном для ингибирования дефицита переноса через мембраны в вышеупомянутой клетке, причем эффекты вышеупомянутого переноса через мембрану связаны с воздействием на вышеупомянутую клетку растворимых бета-амилоидных олигомеров.
[031] В другом варианте реализации предлагается способ/применение для ингибирования влияния бета-амилоида на нейроны, включающие введение эффективного количества композиции, содержащей соединение селективного антагониста сигма-2-рецептора или его фармацевтически приемлемую соль согласно Формуле I, причем соединение или его фармацевтически приемлемую соль вводят в количестве, эффективном для ингибирования как связывания олигомера, так и потери синапса в связи с воздействием на клетку растворимого бета-амилоидного олигомера в вышеупомянутой клетке.
[032] В другом варианте реализации предлагается способ/применение для ингибирования влияния бета-амилоида на нейроны, включающие введение композиции, содержащей эффективное количество соединения согласно Формуле I или его фармацевтически приемлемой соли и фармацевтически приемлемого носителя, причем соединение или его фармацевтически приемлемую соль вводят в количестве, эффективном для ингибирования обусловленного растворимым бета-амилоидным олигомером когнитивного эффекта. В одном аспекте когнитивным эффектом является снижение когнитивных способностей согласно испытанию на животной модели снижения когнитивных способностей. В другом аспекте снижением когнитивных способностей является ухудшение обучаемости согласно испытанию путем анализа условно-рефлекторного замирания. В еще одном аспекте снижением когнитивных способностей является ухудшение пространственного обучения и памяти согласно испытанию путем теста водного лабиринта Морриса. В другом аспекте снижением когнитивных способностей является ухудшение пространственного обучения и памяти гиппокамиальной природы согласно испытанию на трансгенной животной модели болезни Альцгеймера.
[033] В другом варианте реализации предлагается способ/применение для ингибирования влияния бета-амилоида на нейроны, включающие введение композиции, содержащей эффективное количество соединения согласно формуле I или его фармацевтически приемлемой соли, где:
R1 и R2 каждый независимо выбран из Н или СН3;
R3, R4, R5 и R6 каждый независимо выбран из Н, C1-С6 алкила, ОН, ОСН3, O(C1-C6 алкила), O(С1-С6 галогеналкила), F, Cl, CF3, арила, гетероарила, С3-7 циклоалкила, CO2R', C(O)R', OC(O)N(R')2, CONR'2, NC(O)R', NS(O)nR', S(O)nNR'2, S(O)nR'; где n=0, 1 или 2; R' каждый независимо представляет собой Н, СН3, СН2СН3, С3-С6 алкил, C1-С6 галогеналкил, пиперазин-1-ил, пиперидин-1-ил, морфолинил, гетероциклоалкил или арил;
или R3 и R4, вместе с атомом С, к которому они присоединены, образуют 5- или 6-членный С3-7циклоалкил или арил; или R4 и R5, вместе с атомом С, к которому они присоединены, образуют С3-7циклоалкил или 5- или 6-членный арил; или R3 и R4 связаны вместе с образованием -O-С1-2 метилен-O-группы; или R4 и R5 связаны вместе с образованием -O-С1-2 метилен-O-группы; и
R7, R8, R9, R10 и R11 каждый независимо выбран из Н, ОН, СН3, СН2СН3, F, Cl, CF3, OCF3, C1-C6 галогеналкила, ОСН3, O(C1-C6 алкила), OCH2CH2OH, O(C1-C6 алкил)ОН, арила, гетероарила, С3-7 циклоалкила, алкиларила, CO2R', CONR'2, S(O)nNR'2, S(O)nR', C(O)O(C1-4 алкила), OC(O)N(R')2 и C(O)NH(C1-4 алкила); где n=0, 1 или 2; R' каждый независимо представляет собой Н, C1-C6 алкил, C1-С6 галогеналкил, арил, алкиларил или С1-6 алкокси; и фармацевтически приемлемый носитель.
[034] В другом варианте реализации предлагается способ/применение для ингибирования влияния бета-амилоида на нейроны, включающие введение композиции, содержащей эффективное количество соединения согласно формуле I или его фармацевтически приемлемой соли, где R7, R10, R11 каждый представляет собой Н; R3 и R4 каждый независимо выбран из Н, F, Cl, S(O)nR', C(O)R', где n=2, и R' выбран из СН3 или необязательно замещенного пиперазин-1-ила, пиперидин-1-ила или морфолинила, причем необязательно замещенная группа выбрана из C1-С6 алкила или C2-C7 ацила; R8 выбран из OH, OCH3, ОСН(СН3)2, ОСН2СН(СН3)2 или ОС(СН3)3; и R9 представляет собой ОН; и фармацевтически приемлемый носитель.
[035] В другом варианте реализации предлагается способ/применение для ингибирования влияния бета-амилоида на нейроны, включающие введение композиции, содержащей эффективное количество соединения или его фармацевтически приемлемой соли, выбранных из группы, состоящей из:
и 
.
[036] В другом варианте реализации предлагается способ/применение для ингибирования влияния бета-амилоида на нейроны, включающие введение композиции, содержащей эффективное количество соединения или его фармацевтически приемлемой соли, согласно формуле II:
где R3, R4, R5 и R6 каждый независимо выбран из Н, Cl, F, ОН, СН3, C1-6 алкила, ОСН3, ОСН(СН3)2, ОСН2СН(СН3)2, ОС(СН3)3, ОС1-6 алкила, арила, гетероарила, гетероциклоалкила, CO2R', CONR'2, NC(O)R', NS(O)nR', S(O)nNR'2, S(O)nR', C(O)R', OC(O)N(R')2 или C(O)NH(C1-4 алкила), где n=0, 1 или 2; и R' каждый независимо представляет собой Н, C1-С6 алкил, C1-С6 галогеналкил или необязательно замещенный арил, алкиларил, пиперазин-1-ил, пиперидин-1-ил, морфолинил, гетероциклоалкил, гетероарил, С1-6 алкокси, NH(C1-4 алкил) или NH(C1-4 алкил)2, причем необязательно замещенная группа выбрана из C1-С6 алкила или С2-С7 ацила;
или R3 и R4, имеете с атомом С, к которому они присоединены, образуют 6-членный арил; или R3 и R4 связаны вместе с образованием -O-С1-2 метилен-O-группы; или R4 и R5, вместе с атомом С, к которому они присоединены, образуют 6-членный арил; или R4 и R5 связаны имеете с образованием -О-C1-2 метилен-О-группы; и
R8 и R9 каждый независимо выбран из Н, Cl, F, ОН, СН3, C1-6 алкила, ОСН3, ОСН(СН3)2, ОСН2СН(CH3)2, ОС(СН3)3, ОС1-6 алкила, арила, гетероарила, гетероциклоалкила, CO2R', CONR'2, NC(O)R', NS(O)nR', S(O)nNR'2, S(O)nR', OC(O)N(R')2, или C(O)NH(C1-4 алкил); и фармацевтически приемлемый носитель.
[037] В другом варианте реализации предлагается способ/применение для ингибирования влияния бета-амилоида на нейроны, включающие введение композиции, содержащей эффективное количество соединения или его фармацевтически приемлемой соли, согласно Формуле II, где по меньшей мере один из R3, R4, R5 и R6 не представляет собой Н; и но меньшей мере один из R8 и R9 не представляет собой Н.
[038] В другом варианте реализации предлагается способ/применение для ингибирования влияния бета-амилоида на нейроны, включающие введение композиции, содержащей эффективное количество соединения или его фармацевтически приемлемой соли, согласно Формуле II, где R3 и R4 каждый независимо выбран из Н, F, Cl, S(O)nR', C(O)R', где n=2, и R' выбран из СН3, пиперазин-1-ила, пиперидин-1-ила или морфолинила; R5 и R6 каждый представляет собой H; R8 выбран из ОН, ОСН3, ОСН(СН3)2, OCH2CH(CH3)2 или ОС(СН3)3; и R9 представляет собой ОН.
[039] В другом варианте реализации предлагается способ/применение для ингибирования влияния бета-амилоида на нейроны, включающие введение композиции, содержащей эффективное количество соединения или его фармацевтически приемлемой соли; и фармацевтически приемлемый носитель, причем соединение или его соль выбирают из группы, состоящей из:
.
[040] В другом варианте реализации предлагается способ/применение для ингибирования влияния бета-амилоида на нейроны, включающие введение композиции, содержащей эффективное количество соединения или его фармацевтически приемлемой соли; и фармацевтически приемлемый носитель, причем соединение или его соль выбирают из группы, состоящей из:
и 
.
[041] В другом варианте реализации предлагается способ/применение для ингибирования влияния бета-амилоида на нейроны, включающие введение композиции, содержащей эффективное количество соединения или его фармацевтически приемлемой соли; и фармацевтически приемлемый носитель, причем соединение или его соль выбирают из группы, состоящей из:
и 
.
[042] В другом варианте реализации предлагается способ/применение для ингибирования подавления долговременной потенциации у субъекта, который в этом нуждается, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей антагонист сигма-2-рецептора или его фармацевтически приемлемой соли согласно Формуле I и/или Формуле II; и фармацевтически приемлемого носителя.
[043] В другом варианте реализации предлагается способ/применение для ингибирования снижения когнитивных способностей у субъекта, у которого обнаружено или существует риск обнаружения снижения когнитивных способностей, включающие введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей антагонист сигма-2-рецептора или его фармацевтически приемлемой соли согласно Формуле I и/или Формуле II; и фармацевтически приемлемого носителя.
[044] В другом варианте реализации предлагается способ/применение для ингибирования снижения у субъекта когнитивных способностей, связанного с влиянием бета-амилоидного олигомера на центральные нейроны, включающие введение субъекту, страдающему от вышеупомянутого снижения когнитивных способностей, терапевтически эффективного количества композиции, содержащей антагонист сигма-2-рецептора или его фармацевтически приемлемую соль согласно Формуле I и/или Формуле II; и фармацевтически приемлемый носитель.
[045] В другом варианте реализации предлагается способ/применение для лечения умеренного когнитивного нарушения при болезни Альцгеймера у субъекта, который в этом нуждается, включающий введение субъекту терапевтически эффективного количества композиции, содержащей антагонист сигма-2-рецептора или его фармацевтически приемлемую соль согласно Формуле I и/или Формуле II; и фармацевтически приемлемый носитель.
[046] В еще одном варианте реализации обеспечиваются соединения изоиндолина согласно Формуле I и/или Формуле II или их фармацевтически приемлемые соли, которые действуют как антагонисты сигма-2 путем связывания с сигма-2-рецептором и ингибирования связывания Аβ-олигомеров с нейронами, в частности, с синапсом. В некоторых вариантах реализации антагонист сигма-2 конкурирует с Аβ-олигомером, связывающимся с нейронами, в частности, синапсом, или другим образом разрушает способность Аβ-олигомера к связыванию с нейронами, например, путем препятствования образованию Аβ-олигомера или связыванию с Аβ олигомером, или возможного препятствования способности Аβ-олигомера для запуска механизмов трансдукции сигнала, сопутствующих его связыванию с нейронами. В некоторых вариантах реализации антагонисты сигма-2, таким образом, ингибируют нелетальное патологическое действие Аβ ("нелетальную Аβ-патологию" или "нелегальную бета-амилоидную патологию), включая нарушение в переносе через мембрану, синаптическую дисфункцию, нарушение памяти и обучаемости у животных, уменьшение количества синапсов, изменение длины дендритного типика или морфологии типика, или нарушение долговременной потенциации (LTP) и др.
[047] В других вариантах реализации предлагаемые авторами изоиндолиновые антагонисты сигма-2, которые являются активными в других анализах, указанных авторами, обладают способностью восстанавливать нейроны до нормального состояния или препятствовать вызванной Аβ-олигомером синаптической дисфункции. Без привязывания к какой-либо теории предлагаемые авторами антагонисты сигма-2 воздействуют на один или более таких факторов, как структура Аβ-олигомера, связывание Аβ-олигомера с нейронами или вызываемые Аβ-олигомером механизмы молекулярного сигнала, и это используется для противодействия нелегальному действию Аβ-олигомеров и для лечения ранних стадий связанных с растворимым Аβ-олигомером патологий.
[048] В одном варианте реализации обеспечиваются антагонисты сигма-2 согласно Формуле 1 и/или Формуле II или их фармацевтически приемлемые соли, которые являются функциональными нейрональными антагонистами и применяются согласно способу ингибирования потери синапса в нейронах, потери, связанной с подверженностью клетки воздействию одного или более их Abeta-олигомеров или других Abeta-комплексов или Abeta-видов в целом, включая Abeta-пептиды в мономерной или олигомерной или другой растворимой комплексной форме (как определено ниже), причем способ включает приведение вышеупомянутой клетки в контакт с определенным количеством одного или более антагонистов сигма-2 в количестве, эффективном для устранения или уменьшения вышеупомянутой потери или для частичного или полного восстановления количества синапсов в вышеупомянутой клетке до уровня, наблюдаемого перед воздействием.
[049] В другом варианте реализации предлагается способ модулирования изменений переноса через мембраны в нейронах, причем вышеупомянутое изменение связано с воздействием на вышеупомянутую клетку одного или более видов Abeta, причем способ включает приведение вышеупомянутой клетки в контакт с определенным количеством одного или более антагонистов сигма-2 согласно Формуле I и/или Формуле II или их фармацевтически приемлемых солей в количестве, эффективном для устранения или уменьшения вышеупомянутого изменения переноса через мембрану или его сохранения на неизменном уровне или на уровне, приближенном к уровню, наблюдаемому перед воздействием на вышеупомянутую клетку вышеупомянутого Abeta-вида.
[050] В другом варианте реализации обеспечиваются антагонисты сигма-2 согласно Формуле I и/или Формуле II или их фармацевтически приемлемые соли, которые применяются согласно способу лечения снижения когнитивных способностей, включающему введение субъекту одного или более антагонистов сигма-2 согласно изобретению.
[051] В другом варианте реализации предлагается способ лечения снижения когнитивных способностей у субъекта, который в этом нуждается, включающий введение субъекту эффективного количества одного или более антагонистов сигма-2 согласно Формуле I и/или Формуле II или их фармацевтически приемлемых солей.
[052] В еще одном варианте реализации антагонисты сигма-2 согласно Формуле I и/или Формуле II или их фармацевтически приемлемые соли являются функциональными нейрональными антагонистами сигма-2, которые применяются согласно способу лечения снижения когнитивных способностей или нейродегенеративного нарушения или нарушения функции и/или количества синапсов, включающему введение субъекту одного или более антагонистов сигма-2 согласно изобретению.
[053] В еще одном варианте реализации предлагается способ лечения снижения когнитивных способностей или нейродегенеративного нарушения или нарушения функции и/или количества синапсов у субъекта, включающий введение субъекту одного или более антагонистов сигма-2 согласно Формуле I и/или Формуле II или их фармацевтически приемлемых солей, которые являются функциональными нейрональными антагонистами сигма-2.
[054] В других вариантах реализации обеспечиваются способы, включающие введение одного или более антагонистов сигма-2-рецептора согласно Формуле I и/или Формуле II, или их фармацевтически приемлемых солей субъекту, который в этом нуждается, в количестве, эффективном для ингибирования вызванной бета-амилоидным олигомером синаптической дисфункции нейронов; и/или для ингибирования подавления долговременной гиппокампальной потенциации, вызванной воздействием на нейроны Abeta-олигомеров.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[055] Перед ознакомлением с подробным описанием соединений, композиций и способов следует понимать, что это описание не ограничивается описанными конкретными процессами, композициями или методиками, поскольку они могут меняться. Также следует понимать, что терминология, применяемая в описании, предназначена лишь для описания конкретных вариантов осуществления и не ограничивает объем изобретения, который ограничивается лишь прилагаемой формулой изобретения. Если нет иного определения, все применяемые авторами технические и научные термины имеют общепринятое среди специалистов в данной области значение. Хотя для практического применения или испытания вариантов осуществления изобретения могут применяться любые способы и материалы, подобные или равноценные описанным, авторами описываются предпочтительные способы, устройства и материалы.
[055] Также следует понимать, что определенные особенности изобретения, которые для облегчения понимания описываются в контексте отдельных вариантов осуществления, также могут быть представлены в комбинации в одном варианте реализации. И наоборот, различные особенности изобретения, которые для краткости описываются в контексте одного варианта осуществления, также могут быть представлены по отдельности или в любой подходящей подкомбинации.
Определения
[056] Формы единственного числа также включают множественное число, если контекст не подразумевает много. Таким образом, например, ссылка на "клетку" подразумевает одну или более клеток и их эквивалентов, известных специалистам в данной области, и т.д.
[057] В контексте данного описания термин "примерно" означает плюс или минус 10% от данного значения. Например, "примерно 50%" означает в диапазоне 45%-55%.
[058] "Сигма-2-лиганд" означает соединение, которое связывается с сигма-2-рецептором и включает агонисты, антагонисты, частичные агонисты, обратные агонисты и просто конкуренты для других лигандов данного рецептора или белка.
[059] Термин "агонист" означает соединение, присутствие которого в результате обеспечивает биологическую активность рецептора, которая является такой же, как и биологическая активность в результате присутствия встречающегося в природе лиганда для рецептора.
[060] Термин "частичный агонист" означает соединение, присутствие которого в результате обеспечивает биологическую активность рецептора, которая относится к тому же типу, что и биологическая активность, являющаяся результатом присутствия встречающегося в природе лиганда для рецептора, но меньшей величины.
[061] Термин "антагонист" означает образование, например, соединение, антитело или фрагмент, присутствие которого в результате обеспечивает уменьшение биологической активности рецептора. В некоторых вариантах реализации присутствие антагониста в результате приводит к полному ингибированию биологической активности рецептора. В контексте данного описания термин "антагонист сигма-2-рецептора" применяется для описания соединения, действующего как "функциональный антагонист" в сигма-2-рецепторе, то есть блокирующего действие Abeta, например, вызванную Abeta-олигомерами синаптическую дисфункцию, например, как наблюдается в in vitro анализе, таком, как анализ переноса через мембрану или анализ потери синапса, или опосредованную Abeta-олигомером сигма-2-рецепторную активацию каспазы-3, или в поведенческом анализе, или у пациента, который в этом нуждается. Функциональный антагонист может действовать непосредственно путем ингибирования связывания, например, Abeta-олигомера с сигма-2-рецептором, или косвенно, путем препятствования нисходящему сигналу в результате связывания Abeta-олигомера с сигма-2-рецептором.
[062] Термин "соединение антагониста сигма-2-рецептора" означает молекулу, которая связывается с сигма-2-рецептором в измеримом количестве и действует как функциональный антагонист по отношению к вызываемой действием Abeta-олигомера синаптической дисфункции в результате связывания с сигма-2-рецептором.
[063] Термин "селективность" или "селективный" означает разницу в аффинности связывания соединения (Ki) для сигма-рецептора, например, сигма-2-рецептора, по сравнению с отличным от сигма рецептором. Антагонисты сигма-2 обладают высокой селективностью к сигма-рецептору в синаптических нейронах. Значение Ki для сигма-2-рецептора или как для сигма-2, так и для сигма-1-рецептора сравнивают с Ki для отличного от сигма рецептора. В некоторых вариантах реализации селективный антагонист сигма-2-рецептора или лиганд сигма-1-рецептора имеет по меньшей мере в 10 раз, в 20 раз, в 30 раз, в 50 раз, в 70 раз, в 100 раз или в 500 и более раз большую аффинность связывания с сигма-рецептором по сравнению со значением отличного от сигма рецептора, согласно оценке путем сравнения значений константы диссоциации связывания Ki или значений IC50 или константы связывания в различных рецепторах. Может применяться любой известный протокол анализа для оценки значений Ki или IC50 в различных рецепторах, например, путем наблюдения конкурентного вытеснения из рецепторов радиоактивно меченного соединения с известной константой диссоциации, например, с применением способа Cheng and Prusoff (1973) (Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3108) или с применением конкретного предлагаемого авторами способа. В некоторых вариантах реализации соединение антагониста сигма-2 представляет собой антитело или его активный связывающийся фрагмент, специфичный к связыванию с сигма-2-рецептором но сравнению с отличным от сигма рецептором. В случае антитела или фрагмента константы связывания в сигма-2-рецепторе или фрагменте могут рассчитываться и сравниваться с константами связывания в отличном от сигма рецепторе известными специалистам способами, например, с применением способа Beatty et al., 1987, J Immunol Meth, 100(1-2): 173-179, или способа Chalquest, 1988, J. Clin. Microbiol. 26(12): 2561-2563. Отличный от сигма рецептор выбирают, например, из мускаринового рецептора М1-М4, серотонинового (5-НТ) рецептора, альфа-адренергического рецептора, бета-адренергического рецептора, опиоидного рецептора, транспортера серотонина, транспортера дофамина, адренергического транспортера, рецептора дофамина или рецептора NMDA.
[064] В данной заявке термин "высокая аффинность" относится к соединению, имеющему значение Ki менее 600 нМ, 500 нМ, 400 нМ, 300 нМ, 200 нМ, менее 150 нМ, менее 100 нМ, менее 80 нМ, менее 60 нМ или, предпочтительно, менее 50 нМ в анализе связывания сигма-рецептора, например, против [3H]-DTG, как описывается в публикации Weber et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 83: 8784-8788 (1986), включенной в данное описание путем ссылки, с измерением аффинности связывания соединений относительно центров сигма-1 и сигма-2-рецепторов. Особенно предпочтительные сигма-лиганды демонстрируют значения Ki менее чем примерно 150 нМ, предпочтительно менее 100 нМ, менее чем примерно 60 нМ, менее чем примерно 10 нМ или менее чем примерно 1 нМ, против [3H]-DTG.
[065] Термин "терапевтический фенотип" применяется для описания характера активности соединений в in vitro анализах, прогнозирующих поведенческую эффективность. Соединение, которое (1) выборочно связывается с высокой аффинностью с сигма-2-рецептором и (2) действует как функциональный антагонист по отношению к вызванному Abeta-олигомерами воздействию в нейронах, определяется как имеющее "терапевтический фенотип", если оно (i) блокирует или уменьшает Аβ-индуцированный дефицит переноса через мембраны; (ii) блокирует или уменьшает Аβ-индуцированную потерю синапса и (iii) не влияет на перенос или количество синапсов в отсутствие Abeta-олигомера. Этот характер активности в in vitro анализах называется "терапевтическим фенотипом" и может прогнозировать поведенческую эффективность.
[066] Термин "терапевтический профиль" применяется для описания соединения, соответствующего терапевтическому фенотипу и также обладающего высокой способностью к проникновению в головной мозг (способностью к преодолению гематоэнцефалического барьера), высокой устойчивостью в плазме и высокой метаболической устойчивостью.
[067] Термин "подобные лекарственным свойства" применяется для описания характеристик фармакокинетики и устойчивости сигма-2-рецепторных лигандов после введения, включая способность к проникновению в головной мозг, метаболическую устойчивость и/или устойчивость в плазме.
[068] "Abeta-виды" или "Аβ" означают композиции, включающие растворимые включающие амилоидный пептид компоненты, такие, как Abeta-мономеры, Abeta-олигомеры или комплексы Abeta-пептида (в мономерной, димерной или полимерной форме) с другими растворимыми пептидами или белками, а также другими растворимыми Abeta-блоками, включая любой обработанный продукт амилоидного белка-прекурсора. Известно, что растворимые Аβ-олигомеры являются нейротоксичными. Известно, что даже димеры Аβ1-42 нарушают синаптическую пластичность в гиппокампальных срезах мышей. Согласно одной известной специалистам теории, природные Aβ1-42 мономеры считаются нейропротективными, и для нейротоксичности требуется самоассоциация Аβ-мономеров в растворимые Abeta-олигомеры. Однако, по сообщениям, определенные мутантные Аβ-мономеры ("арктическая" мутация (E22G) связаны с наследственной БА. См., например, Giuffrida et al., β-Amyloid monomers are neuroprotective. J. Neurosci. 2009 29(34): 10582-10587. Неограничивающие примеры композиций, включающих Abeta-виды, описываются в Патентной заявке США под регистрационным номером 13/021,872; Патентной публикации США 2010/0240868; Международной патентной заявке WO/2004/067561; Международной патентной заявке WO/2010/011947; Патентной публикации США 20070098721; Патентной публикации США 20100209346; Международной патентной заявке WO/2007/005359; Патентной публикации США 20080044356; Патентной публикации США 20070218491; WO/2007/126473; Патентной публикации США 20050074763; Международной патентной заявке WO/2007/126473, Международной патентной заявке WO/2009/048631 и Патентной публикации США 20080044406, каждая из которых включена в это описание путем ссылки.
[069] "Введение" но отношению к соединениям согласно изобретению означает применение соединения в/на ткани-мишени или системное или местное применение соединения для пациента или другого субъекта.
[070] Термин "животное" в контексте данного описания включает, помимо прочих, человека и отличных от человека позвоночных, таких, как дикие, экспериментальные, домашние и сельскохозяйственные, а также комнатные животные.
[071] В контексте данного описания термины "субъект" и "пациент" применяются взаимозаменяемо и относятся к любому животному, включая млекопитающих, мышей, крыс, других грызунов, кроликов, собак, кошек, свиней, крупный рогатый скот, овец, лошадей, приматов, отличных от человека приматов, человека и т.п.
[072] В контексте данного описания термин "контактирование" означает сведение или комбинирование молекул (или молекулы со структурой высшего порядка, такой, как клетка или клеточная мембрана), таким образом, чтобы они пребывали на расстоянии, допускающем межмолекулярное взаимодействие, например, нековалентное взаимодействие между двумя пептидами или одним белком и другим белком или другой молекулой, такой, как малая молекула. В некоторых вариантах реализации контактирование происходит в растворе, в котором комбинированные или приведенные в контакт молекулы смешивают в общем растворителе и дают им свободно ассоциироваться. В некоторых вариантах реализации контактирование может происходить на клетке или в пределах клетки или в бесклеточной среде. В некоторых вариантах реализации бесклеточная среда представляет собой лизат, полученный из клетки. В некоторых вариантах реализации клеточный лизат может быть цельноклеточным лизатом, ядерным лизатом, цитоплазматическим лизатом и их комбинацией. В некоторых вариантах реализации бесклеточный лизат представляет собой лизат, полученный в результате ядерной экстракции и выделения, когда ядра популяции клеток удаляют из клеток, а затем подвергают лизису. В некоторых вариантах реализации ядра не подвергают лизису, но они все равно рассматриваются как бесклеточная среда. Молекулы могут быть объединены путем смешивания, например, вихревания, взбалтывания и т.п.
[073] Термин "улучшает" означает, что предмет изобретения изменяет характеристики и/или физические свойства ткани, для которой он предусматривается, применяется или вводится. Термин "улучшает" также может применяться в связи с болезненным состоянием, и, таким образом, если болезненное состояние "улучшается", симптомы или физические характеристики, связанные с болезненным состоянием, уменьшаются, снижаются, устраняются, задерживаются или предотвращаются.
[074] Термин "ингибирование" включает блокирование, предотвращение определенного результата или процесса или восстановление обратного результата или процесса. С точки зрения профилактики или лечения путем введения соединения согласно изобретению "ингибирование" включает защиту (частичную или полную) от симптомов или задержку их появления, ослабление симптомов или защиту от болезни, состояния или нарушения или их уменьшение или устранение.
[075] Термин "ингибирование дефицита переноса" касается способности к блокированию индуцированный растворимым Ab-олигомером дефицит переноса через мембраны в клетках, предпочтительно нейронах. Соединение, способное ингибировать дефицит переноса, имеет показатель ЕС50<20 мкМ, менее 15 мкМ, менее 10 мкМ, менее 5 мкМ, предпочтительно менее 1 мкМ согласно анализу переноса через мембрану и также способно на по меньшей мере 50%, предпочтительно по меньшей мере 60%, более предпочтительно - по меньшей мере 70% максимальное ингибирование влияния Abeta-олигомера при вызнанном растворимыми Abeta-олигомерами дефиците переноса через мембраны, например, как описывается в Примере 6.
[076] Термин "log P" означает коэффициент распределения соединения. Коэффициент распределения представляет собой соотношение концентрации неионизированного соединения в каждой из двух жидких фаз, например, октаноле и воде. Для измерения коэффициента распределения ионизируемых растворенных соединений рН водной фазы регулируют таким образом, чтобы преобладающая форма соединения была неионизированной. Логарифм соотношения значений концентрации неионизированного растворенного соединения в растворителях называется log P. Log P является мерой липофильности. Например,
log Рокт./вода=log([раств. вещ.]октанол/[раств. вещ.]неионизиров., вода).
[077] В разных местах представленного описания заместители соединений согласно изобретению описываются в группах или в диапазонах. Конкретно предусматривается, что варианты осуществления изобретения включают каждую в отдельности подкомбинацию элементов таких групп и диапазонов. Например, термин "C1-6 алкил" конкретно может означать, например, метил (C1 алкил), этил (С2 алкил), С3 алкил, C4 алкил, С5 алкил и С6 алкил, а также, например, C1-C2 алкил, С1-С3 алкил, C1-C4 алкил, С2-С3 алкил, С2-C4 алкил, С3-С6 алкил, С4-С5 алкил и С5-С6 алкил.
[078] Для соединений согласно изобретению, в которых переменная фигурирует более одного раза, каждая переменная может быть отличным от других компонентом, выбранным из группы Маркуша, определяющей переменную. Например, если описывается структура, имеющая две R-группы, которые одновременно присутствуют в одном соединении, две R-группы могут представлять разные компоненты, выбранные из группы Маркуша, определяемой для R.
[079] Термин "n-членный", где n является целым числом, как правило, означает количество образующих кольцо атомов в компоненте, в котором количество образующих кольцо атомов составляет n. Например, пиридин является примером 6-членного гетероарильного кольца, а тиофен является примером 5-членной гетероарильной группы.
[080] В контексте данного описания термин "алкил" относится к насыщенной углеводородной группе, которая является линейной или разветвленной. Примерами алкильных групп, помимо прочих, могут быть метил (Me), этил (Et), пропил (например, н-пропил и изопропил), бутил (например, н-бутил, изобутил, трет-бутил), пентил (например, н-пентил, изопентил, неопентил) и т.п. Алкильная группа может содержать от 1 до примерно 20, от 2 до примерно 20, от 1 до примерно 10, от 1 до примерно 8, от 1 до примерно 6, от 1 до примерно 4 или от 1 до примерно 3 атомов углерода. Термин "алкилен" означает двухвалентную алкильную связывающую группу. Примером алкилена может быть метилен (СН2).
[081] В контексте данного описания "алкенил" означает алкильную группу, имеющую одну или более двойных углерод-углеродных связей. Примером алкенильных групп, помимо прочих, могут быть этенил, пропенил, циклогексенил и т.п. Термин "алкениленил" означает двухвалентную связывающую алкенильную группу.
[082] В контексте данного описания "алкинил" означает алкильную группу, имеющую одну или более тройных углерод-углеродных связей. Примерами алкинильных групп, помимо прочих, могут быть этинил, пропинил и т.п. Термин "алкиниленил" означает двухвалентную связывающую алкинильную группу.
[083] В контексте данного описания "галогеналкил" означает алкильную группу, имеющую один или более галогеновых заместителей, выбранных из F, Cl, Br и/или I. Примерами галогеналкильных групп, помимо прочих, могут быть CF3, C2F5, CHF2, CCl3, CHCl2, C2Cl5, CH2CF3 и т.п.
[084] В контексте данного описания "арил" означает моноциклические или полициклические (например, имеющие 2, 3 или 4 слитых кольца) ароматические углеводороды, такие, как, например, фенил, нафтил, антраценил, фенантренил, инданил, инденил и т.п. В некоторых вариантах реализации арильные группы имеют от 6 до примерно 20 атомов углерода. В некоторых вариантах реализации арильные группы имеют от 6 до примерно 10 атомов углерода.
[085] В контексте данного описания "циклоалкил" означает неароматические циклические углеводороды, включая циклизированные алкильные, алкенильные и алкинильные группы, содержащие до 20 образующих кольцо атомов углерода. Циклоалкильные группы могут включать моно- или полициклические (например, имеющие 2, 3 или 4 слитых кольца) кольцевые системы, а также спирокольцевые системы. Циклоалкильная группа может содержать от 3 до примерно 15, от 3 до примерно 10, от 3 до примерно 8, от 3 до примерно 6, от 4 до примерно 6, от 3 до примерно 5 или от 5 до примерно 6 образующих кольцо атомов углерода. Образующие кольцо атомы углерода циклоалкильной группы могут быть необязательно замещенными оксо или сульфидо. Примерами циклоалкильных групп, помимо прочих, могут быть циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, циклопентенил, циклогексенил, циклогексадиенил, циклогептатриенил, норборнил, норпинил, норкарнил, адамантил и т.к. Также определение циклоалкила охватывает компоненты, имеющие одно или более ароматических колец, слитых (т.е., имеющих общую связь) с циклоалкильным кольцом, например, бензо или тиенильные производные пентана, пентена, гексана и т.п. (например, 2,3-дигидро-1Н-инден-1-ил или 1Н-инден-2(3Н)-он-1-ил). Предпочтительно "циклоалкил" означает циклизированные алкильные группы, содержащие до 20 образующих кольцо атомов углерода. Предпочтительными примерами циклоалкила могут быть циклопропил, циклобутил, циклопентил, циклогексил, циклогептил, адамантил и т.п.
[086] В контексте данного описания "гетероарильные" группы означают ароматический гетероцикл, имеющий до 20 образующих кольцо атомов и имеющих по меньшей мере один кольцевой гетероатом (образующий кольцо атом), такой, как сера, кислород или азот. В некоторых вариантах реализации гетероарильная группа имеет по меньшей мере один или более атомов, образующих кольцо гетероатомов, каждый из которых независимо выбран из серы, кислорода и азота. Гетероарильные группы включают моноциклические и полициклические (например, имеющие 2, 3 или 4 слитых кольца) системы. Примерами гетероарильных групп, помимо прочих, могут быть пиридил, пиримидинил, пиразинил, пиридазинил, триазинил, фурил, хинолил, изохинолил, тиенил, имидазолил, тиазолил, индолил, пиррил, оксазолил, бензофурил, бензотиенил, бензтиазолил, изоксазолил, пиразолил, триазолил, тетразолил, индазолил, 1,2,4-тиадиазолил, изотиазолил, бензотиенил, пуринил, карбазолил, бензимидазолил, индолинил и т.п. В некоторых вариантах реализации гетероарильная группа имеет от 1 до примерно 20 атомов углерода, а в других вариантах реализации - от примерно 1 до примерно 5, от примерно 1 до примерно 4, от примерно 1 до примерно 3, от примерно 1 до примерно 2 атомов углерода в качестве образующих кольцо атомов. В некоторых вариантах реализации гетероарильная группа содержит от 3 до примерно 14, от 3 до примерно 7 или от 5 до 6 образующих кольцо атомов. В некоторых вариантах реализации гетероарильная группа имеет от 1 до примерно 4, от 1 до примерно 3 или от 1 до 2 гетероатомов.
[087] В контексте данного описания "гетероциклоалкил" означает неароматические гетероциклы, имеющие до 20 образующих кольцо атомов, включая циклизированные алкильные, алкенильные и алкинильные группы, где один или более образующих кольцо атомов углерода заменены гетероатомом, таким, как атом О, N или S. Гетероциклоалкильные группы могут быть моно- или полициклическими (например, слитыми и спиросистемами). Примерами "гетероциклоалкильных" групп могут быть морфолино, тиоморфолино, пиперазинил, тетрагидрофуранил, тетрагидротиенил, 2,3-дигидробензофурил, 1,3-бензодиоксол, бензо-1,4-диоксан, пиперидинил, пирролидинил, изоксазолидинил, изотиазолидинил, пиразолидинил, оксазолидинил, тиазолидинил, имидазолидинил, пирролидин-2-он-3-ил и т.п. Образующие кольцо атомы углерода и гетероатомы гетероциклоалкильной группы могут быть необязательно замещенными оксо или сульфидо. Например, образующий кольцо атом S может быть замещен 1 или 2 оксо [т.е., образовывать S(O) или S(O)2]. В еще одном примере образующий кольцо атом С может быть замещен оксо (т.е., образовывать карбонил). Также определение гетероциклоалкила охватывает компоненты, имеющие одно или более ароматических колец, слитых (т.е., имеющих общую связь) с неароматическим гетероциклическим кольцом, например, пиридинил, тиофенил, фталимидил, нафталимидил, и бензо-производные гетероциклов, такие, как индолиновая, изоиндолиновая, изоиндолин-1-он-3-ильная, 4,5,6,7-тетрагидротиено[2,3-с]пиридин-5-ильная, 5,6-дигидротиено[2,3-с]пиридин-7(4Н)-он-5-ильная и 3,4-дигидризохинолин-1(2H)-он-3-ильная группы. Образующие кольцо атомы углерода и гетероатомы гетероциклоалкильной группы необязательно могу быть замещены оксо или сульфидо. В некоторых вариантах реализации гетероциклоалкильная группа имеет от 1 до примерно 20 атомов углерода, в других вариантах реализации - от примерно 3 до примерно 20 атомов углерода. В некоторых вариантах реализации гетероциклоалкильная группа содержит от 3 до примерно 14, от 3 до примерно 7 или от 5 до 6 образующих кольцо атомов. В некоторых вариантах реализации гетероциклоалкильная группа имеет от 1 до примерно 4, от 1 до примерно 3 или от 1 до 2 гетероатомов. В некоторых вариантах реализации гетероциклоалкильная группа содержит от 0 до 3 двойных связей. В некоторых вариантах реализации гетероциклоалкильная группа содержит от 0 до 2 тройных связей.
[088] В контексте данного описания "гало" или "галоген" означает фтор, хлор, бром и йод.
[089] В контексте данного описания "алкокси" означает -O-алкильную группу. Примерами алкоксигрупп могут быть метокси, этокси, пропокси (например, n-пропокси и изопропокси), трет-бутокси и т.п.
[090] В контексте данного описания "галогеналкокси" означает -O-галогеналкильную группу. Примером галогеналкоксигруппы может быть OCF3. В контексте данного описания "тригалометокси" означает метоксигруппу, имеющую три галогеновых заместителя. Примерами тригалометоксигрупп, помимо прочих, могут быть -OCF3, -OCClF2, -OCCl3 и т.п.
[091] В контексте данного описания "арилалкил" означает C1-6 алкил, замещенный арилом, а "циклоалкилалкил" означает C1-6 алкил, замещенный циклоалкилом.
[092] В контексте данного описания "гетероарилалкил" означает C1-6 алкильную группу, замещенную гетероарильной группой, а "гетероциклоалкилалкил" означает C1-6 алкил, замещенный гетероциклоалкилом.
[093] В контексте данного описания "амино" означает NH2.
[094] В контексте данного описания "алкиламино" означает аминогруппу, замещенную алкильной группой.
[095] В контексте данного описания "диалкиламино" означает аминогруппу, замещенную двумя алкильными группами.
[096] В контексте данного описания С(O) означает С(=O).
[097] В контексте данного описания термин "необязательно замещенный" означает, что замещение является необязательным, и поэтому включает как незамещенные, так и замещенные атомы и компоненты. "Замещенный" атом или компонент означает, что любой водород на указанном атоме или компоненте может быть заменен на выбранный из указанной группы заместителей, при условии, что нормальная валентность указанного атома или компонент не превышается, и замещение в результате обеспечивает устойчивое соединение. Например, если метальная группа (т.е., СН3) является необязательно замещенной, то 3 атомы водорода на атоме углерода могут быть заменены на замещающие группы, как указано.
[098] В контексте данного описания "бета-амилоидный эффект", например, "нелегальный бета-амилоидный эффект" или "Abeta-олигомерный эффект" означает воздействие, в частности, нелегальное, на клетку, которая контактирует с Abeta-видами. Например, было обнаружено, что при контакте нейрона с растворимым бета-амилоидным ("Abeta") олигомером олигомеры связываются с популяцией синапсов на популяции нейронов in vitro. Это связывание может количественно определяться путем анализа, например, с измерением связывания Abeta-олигомера in vitro. Еще один подтвержденный эффект Abeta-видов состоит в уменьшении количества синапсов, которое указывается на уровне примерно 18% в гиппокампе человека (Scheff et al, 2007) и поддается количественному определению (например, путем анализа с измерением количества синапсов). В другом примерке было обнаружено, что при контакте нейрона с бета-амилоидным ("Abeta") олигомером перенос через мембрану модулируется, что приводит к изменению переноса через мембрану. Это отклонение может быть визуализировано во многих анализах, включая, помимо прочих, анализ МТТ. Например, желтые тетразолиевые соли эндоцитозируются клетками и соли восстанавливаются до нерастворимого пурпурного формазана ферментами, находящимися в пределах везикул на эндосомальном пути. Уровень пурпурного формазана отражает количество активно метаболизирующих клеток в культуре, и снижение количества формазана считается мерой гибели клеток или метаболической токсичности в культуре. При наблюдении клеток, контактирующих с желтой тетразолиевой солью, в микроскоп пурпурный формазан сначала виден во внутриклеточных везикулах, заполняющих клетку. Со временем везикулы подвергаются экзоцитозу, и формазан осаждается в форме игольчатых кристаллов на внешней поверхности цитоплазматической мембраны при воздействии на нерастворимый формазан окружающей водной среды. К другим эффектам Abeta-видов относится снижение когнитивных способностей, такое, как снижение способности запоминать новую информацию и потеря памяти, которая может измеряться путем анализов на животных моделях in vivo. В некоторых вариантах реализации эффект Abeta является выбранным из вызванной Abeta-олигомерами синаптической дисфункции, например, наблюдаемой в in vitro анализе, таком, как анализ переноса через мембрану или анализ потери синапса или опосредованной Abeta-олигомером сигма-2-рецепторной активации каспазы-3 или вызванной Abeta дисфункции нейронов, опосредованного Abeta снижения долговременной потенциации (LTP) или снижения когнитивных способностей в поведенческом анализе, или у пациента, который в этом нуждается.
[099] В некоторых вариантах реализации указывается, что испытуемое соединение эффективно для лечения снижения когнитивных способностей или связанной с ним болезни, если оно может ингибировать связанное с растворимыми видами Abeta-олигомера воздействие на нейроны более чем на примерно 10%, предпочтительно более чем на 15%, более предпочтительно - более чем на 20% по сравнению с отрицательным контролем. В некоторых вариантах реализации указывается, что испытуемое средство эффективно, если оно может ингибировать обработанный продукт опосредованного амилоидным белком-прекурсором воздействие более чем примерно на 10%, предпочтительно более чем на 15%, более предпочтительно - более чем на 20% по сравнению с положительным контролем. Например, как показано в Примерах ниже, ингибирование связывания Abeta-олигомера всего на 18% полностью подавляет снижение синапса, Например, см. Фигуры 3С и 3D. Хотя представленное описание сосредоточено на ингибировании нелетальных эффектов Abeta-видов, таких, как отклонения в нейронном метаболизме и уменьшение количества синапсов, было продемонстрировано, что они коррелируют с когнитивной функцией, причем ожидается, что со временем они приведут к снижению (по сравнению с не подвергавшимися лечению субъектами) последующих измеримых симптомов амилоидной патологии, в частности, клинических симптомов, таких, как 1) скопление фибрилл и бляшек, измеряемое амилоидным визуализирующим средством, таким, как fluorbetapir, PittB или любое другое визуализирующее средство, 2) потеря синапса или гибель клеток, измеряемые по гипометаболизму глюкозы, обнаруживаемому при помощи FDG-PET, или 3) изменения в экспрессии белка или количестве метаболита в головном мозге или в организме, обнаруживаемые путем визуализации или обнаружения белка/метаболита в спинномозговой жидкости, биопсии головного мозга или плазме, которые определяют у пациентов путем ИФА-анализа (такие, как изменения уровня и/или соотношения Abeta 42, фосфорилированный тау-белок, общий тау-белок, измеряемый путем ИФА-анализа, или характер изменений экспрессии белка, обнаруживаемых в ИФА-панели (см. ссылку: Wyss-Coray T. et al. Modeling of pathological traits in Alzheimer's disease based on systemic extracellular signaling proteome. Mol Cell Proteomics 2011 Jul 8, включенную в данное описание путем ссылки в полном объеме), 4) цереброваскулярные отклонения, измеряемые по присутствию сосудистого отека или микрокровотечения, обнаруживаемого при помощи MRI, и любые другие симптомы, обнаруживаемые с применением способов визуализации, и 5) потеря когнитивной функции, измеряемая с применением любого когнитивного теста, например, ADAS-Cog, MMSE, CBIC, или любого другого способа испытания когнитивной функции.
[0100] В контексте данного описания термин "нейрон" может применяться по отношению к отдельной клетке или к популяции клеток. В некоторых вариантах реализации нейрон является первичным нейроном. В некоторых вариантах реализации нейрон является иммортализованным или трансформированным нейроном или стволовой клеткой. Первичный нейрон является нейроном, который не может видоизменяться в другие типы нейронов, такие, как глиальные клетки. Стволовая клетка представляет собой клетку, которая может видоизменяться в нейроны и другие типы нейроны, такие, как глиоцит. В некоторых вариантах реализации в анализах применяют композицию, включающую по меньшей мере один нейрон и не содержащую глиальных клеток. В некоторых вариантах реализации композиция включает менее, чем примерно 30%, 25%, 20%, 15%, 10%, 5% или 1% глиальных клеток, которые поглощают и накапливают Abeta. Первичный нейрон может быть взят из любого участка головного мозга животного. В некоторых вариантах реализации нейрон представляет собой гиппокампальную или корковую клетку. Присутствие глиальных клеток может определяться любым способом. В некоторых вариантах реализации глиальные клетки обнаруживают по присутствию GFAP, а нейроны могут обнаруживаться путем положительного окрашивания антителами, направленными против МАР2.
[0101] Фраза "фармацевтически приемлемый" относится к молекулярным соединениям и композициям, которые в целом считаются безопасными и нетоксичными. В частности, фармацевтически приемлемые носители, растворители или другие вспомогательные вещества, применяемые в фармацевтических композициях согласно настоящему изобретению, являются физиологически переносимыми, совместимыми с другими ингредиентами и, как правило, не вызывают аллергической или подобной нежелательной реакции (например, расстройства желудка, головокружения и т.п.) при введении пациенту. Предпочтительно в контексте данного описания термин "фармацевтически приемлемый" означает утвержденный регулирующим органом федерального правительства или правительства штата или включенный в Фармакопею США или другую общепризнанную фармакопею как применимый для животных, в частности, для человека. Фраза "фармацевтически приемлемая(ые) соль (соли)" в контексте данного описания охватывает соли соединений согласно изобретению, которые являются безопасными и эффективными для применения для млекопитающих и обладают необходимой биологической активностью. К фармацевтически приемлемым солям относятся соли кислотных или основных групп, которые присутствуют в соединениях согласно изобретению или в соединениях, распознаваемых согласно способам в соответствии с изобретением. Фармацевтически приемлемыми кислыми аддитивными солями, помимо прочих, могут быть гидрохлорид, гидробромид, гидройодид, нитрат, сульфат, бисульфат, фосфат, кислый фосфат, изоникотинат, ацетат, лактат, салицилат, цитрат, тартрат, пантотенат, битартрат, аскорбат, сукцинат, малеат, гентизинат, фумарат, глюконат, глюкаронат, сахарат, формиат, бензоат, глутамат, метансульфонат, этансульфонат, бензолсульфонат, п-толуолсульфонат и памоат (т.е., 1,1ʹ-метилен-бис-(2-гидрокси-3-нафтоат)). Некоторые соединения согласно изобретению могут образовывать фармацевтически приемлемые соли с различными аминокислотами. Приемлемыми основными солями, помимо прочих, могут быть соли алюминия, кальция, лития, магния, калий, натрия, цинка, железа и диэтаноламиновые соли. Фармацевтически приемлемые основные аддитивные соли также образуются с аминами, такими, как органические амины. Примерами подходящих аминов могут быть N,Nʹ-дибензилэтилендиамин, хлоропрокаин, холин, диэтаноламин, дициклогексиламин, этилендиамин, N-метилглюкамин и прокаин.
[0102] В контексте данного описания термин "терапевтический" означает средство, применяемое для лечения, ослабления, нежелательного состояния или заболевания субъекта, борьбы с ним, защиты от него или улучшения состояния.
[0103] В контексте данного описания термин "эффективное количество" означает количество, обеспечивающее в результате измеримое подавление по меньшей мере одного симптома или параметра конкретного нарушения или патологического процесса. Например, количество сигма-2-лиганда согласно изобретению, обеспечивающее измеримо меньшее уменьшение синапса в присутствии Abeta-олигомера, классифицируется как эффективное количество, поскольку оно уменьшает патологический процесс даже если ни один из клинических симптомов амилоидной патологии не меняется по меньшей мере немедленно.
[0104] "Терапевтически эффективное количество" или "эффективное количество" соединения или композиции согласно изобретению является заданным количеством, которое обеспечивает терапевтический эффект для поддающегося лечению субъекта при разумном соотношении пользы/риска, которое применяется к любому медицинскому лечению. Терапевтический эффект может быть объективным (т.е., измеряемым при помощи какого-либо теста или маркера) или субъективным (т.е., субъект сам характеризует или ощущает эффект или физически наблюдает изменения). Эффективное количество соединения согласно изобретению может быть в широких пределах от примерно 0,01 мг/кг до примерно 500 мг/кг, от примерно 0,1 мг/кг до примерно 400 мг/кг, от примерно 1 мг/кг до примерно 300 мг/кг, от примерно 0,05 до примерно 20 мг/кг, от примерно 0,1 мг/кг до примерно 10 мг/кг или от примерно 10 мг/кг до примерно 100 мг/кг. Предполагаемый эффект включает надлежащее медицинское терапевтическое и/или профилактическое лечение. Конечно, конкретная доза соединения, вводимая согласно данному изобретению для достижения терапевтического и/или профилактического эффекта, определяется конкретными обстоятельствами данного случая, включая, например, вводимое соединение, путь введения, параллельное введение других активных ингредиентов, состояние, поддающееся лечению, активность конкретного применяемого соединения, конкретную применяемую композицию, возраст, массу тела, общее состояние здоровья, пол и режим питания пациента; время введения, путь введения и скорость экскреции конкретного применяемого соединения и длительность лечения. Вводимое эффективное количество определяется врачом с учетом вышеупомянутых соответствующих обстоятельств и по результатам тщательной медицинской оценки. Терапевтически эффективное количество соединения согласно изобретению является таким количеством, при введении которого в композиции с физиологически переносимым вспомогательным веществом оно является достаточным для достижения эффективной системной концентрации или местной концентрации в ткани. Общая дневная доза соединений согласно изобретению, вводимых человеку или животному одной или более раздельными дозами, может составлять, например, от 0,01 мг/кг до примерно 500 мг/кг, от примерно 0,1 мг/кг до примерно 400 мг/кг, от примерно 1 мг/кг до примерно 300 мг/кг, от примерно 10 мг/кг до примерно 100 мг/кг или, более привычно, от 0,1 до 25 мг/кг массы тела в день. Однодозовые композиции могут содержать ее частичные количества или дольные единицы, которые вместе составляют дневную дозу. В целом режимы лечения в соответствии с изобретением включают введение пациенту, который нуждается в таком лечении, от примерно 1 мг до примерно 5000 мг, от 10 мг до примерно 2000 мг соединения(й), от 20 до 1000 мг, предпочтительно от 20 до 500 мг, наиболее предпочтительно - примерно 50 мг соединения согласно Формуле I и/или Формуле II или его фармацевтически приемлемой соли в день одной или более дозами.
[0105] Термины "лечить", "поддающийся лечению" или "лечение" в контексте данного описания означают как терапевтическое лечение, так и профилактические или превентивные меры, причем цель состоит в защите (частичной или полной) или замедлении (например, уменьшении или задержке возникновения) нежелательного физиологического состояния, нарушения или болезни, или в достижении благоприятных или желательных клинических результатов, таких, как частичное или полное восстановление или ингибирование снижения параметра, значения, функции или результата, которые стали или смогли бы стать аномальными. С точки зрения этого изобретения благоприятными или желательными клиническими результатами, помимо прочих, могут быть облегчение симптомов; уменьшение степени или силы или скорости развития состояния, нарушения или болезни; стабилизация (т.е., отсутствие ухудшения) состояния, нарушения или болезни; задержка возникновения или замедление прогрессирования состояния, нарушения или болезни; устранение состояния, нарушения или болезни; и ремиссия (частичная или полная), независимо от того, ведет ли это к непосредственному уменьшению фактических клинических симптомов или усилению или улучшению состояния, нарушения или болезни. Цель лечения состоит в том, чтобы добиться клинически значимой реакции без чрезмерного уровня побочных эффектов. Лечение также включает увеличение продолжительности жизни по сравнению с ожидаемыми показателями при отсутствии лечения.
[0106] В целом термин "ткань" относится к агрегации клеток подобной специализации, которые используются при выполнении конкретной функции.
[0107] В контексте данного описания "снижение когнитивных способностей" может означать любое отрицательное изменение в когнитивной функции животного. Например, снижение когнитивных способностей включает, помимо прочего, потерю памяти (например, потерю поведенческой памяти), неспособность к запоминанию, спутанность сознания, помутнение сознания, изменение личности, дезориентация или любая их комбинация. Таким образом, соединение, эффективное в лечении снижения когнитивных способностей может быть эффективным для восстановления долговременной потенциации нейронов (LTP) или долговременной депрессии нейронов (LTD) или баланса синаптической пластичности, измеряемого электрофизиологически; ингибирования, лечения и/или уменьшения нейродегенерации; ингибирования, лечения и/или уменьшения общего амилоидоза; ингибирования, лечения, уменьшения одного или более факторов, к которым относятся выработка амилоидов, сборка амилоидов, агрегация амилоидов и связывание амилоидных олигомеров; ингибирования, лечения и/или уменьшения нелетального воздействия одного или более Abeta-видов на нейроны (такого, как потеря синапса или дисфункция и нарушение переноса через мембрану); и любой их комбинации. Кроме того, это соединение также может быть эффективным в лечении связанных с Abeta нейродегенеративных заболеваний и нарушений, включая, помимо прочих, слабоумие, включая, помимо прочих, болезнь Альцгеймера (БА), включая умеренную болезнь Альцгеймера, синдром Дауна, сосудистую деменцию (церебральную амилоидную ангиопатию и инсульт), деменцию с тельцами Леви, деменцию при болезни, вызванной ВИЧ, умеренное когнитивное нарушение (MCI); возрастное нарушение памяти (AAMI); возрастное снижение когнитивных способностей (ARCD), преклиническую болезнь Альцгеймера (PCAD); и когнитивное нарушение без деменции (CIND).
[0108] В контексте данного описания термин "природный лиганд" означает присутствующий у субъекта лиганд, который связывается с белком, рецептором, мембранным липидом или другим партнером по связыванию in vivo, или реплицируется in vitro. Природный лиганд может иметь синтетическое происхождение, но также должен присутствовать в природе и без человеческого вмешательства в организм субъекта. Например, известно, что Abeta-олигомеры существуют в организме человека. Таким образом, Abeta-олигомеры, обнаруживаемые у субъекта, должны рассматриваться как природные лиганды. Связывание Abeta-олигомеров с партнером по связыванию может реплицироваться in vitro с применением технологий рекомбинации или синтеза, однако Abeta-олигомер все равно считается природным лигандом независимо от того, каким образом Abeta-олигомер получен или изготовлен. Синтетическая малая молекула, которая также может связываться с тем же партнером по связыванию, не является природным лигандом, если она не существует в организме субъекта. Например, описанные авторами соединения изоиндолина обычно отсутствуют у субъекта и поэтому не могут считаться природными лигандами.
[0109] Бета-амилоид человека.
[0110] Избыточная выработка и накопление бета-амилоида является патологической особенностью болезни Альцгеймера. Бета-амилоид человека (Abeta) является главным компонентом нерастворимых отложений амилоидных бляшек, находящихся в мозге пациентов с болезнью Альцгеймера. Бляшки состоят из фибриллярных агрегатов Abeta. Бета-амилоидные фибриллы связаны с поздними стадиями болезни Альцгеймера.
[0111] Когнитивным признаком ранней стадии болезни Альцгеймера (БА) является чрезвычайная неспособность к запоминанию новой информации. Ранняя потеря памяти считается дисфункцией синапса, вызванной растворимыми Аβ-олигомерами. Данные олигомеры блокируют долговременную потенциацию, классическую экспериментальную парадигму для синантической пластичности, и их содержание заметно повышается в ткани головного мозга при БА и в трансгенных моделях БА. Предполагается, что ранняя потеря памяти проистекает из дисфункции синапса до гибели нейронов, а дисфункция синапса является следствием действия растворимых Аβ-олигомеров, а не фибрилл. Lacor et al., Synaptic targeting by Alzheimer's-related amyloid β oligomers, J. Neurosci. 2004, 24(45): 10191-10200.
[0112] Abeta является продуктом расщепления интегрального мембранного белка, амилоидного белка-прекурсора (АРР), который в концентрированной форме содержится в синапсе нейронов. Растворимые формы Abeta присутствуют в мозге и тканях пациентов с болезнью Альцгеймера, и их присутствие коррелирует с прогрессированием болезни. Yu et al., 2009, Structural characterization of a soluble amyloid beta-peptide oligomer, Biochemistry, 48(9): 1870-1877. Было продемонстрировано, что растворимые амилоидные β-олигомеры вызывают изменения в нейронных синапсах и блокируют обучение и память.
[0113] Меньшие, растворимые Аβ-олигомеры создают помехи во многих сигнальных путях, которые являются ключевыми для нормальной синаптической пластичности, в итоге приводя к потере шипика и синапса. Selkoe et al., 2008, Soluble oligomers of the amyloid beta-protein impair synoptic plasticity and behavior, Behav Brain Res 192(1): 106-113. Болезнь Альцгеймера начинается и сохраняется как болезнь синаптической пластичности.
[0114] Считается, что присутствием растворимых Аβ-олигомеров обусловлено раннее снижение когнитивных способностей в мозгу перед болезнью Альцгеймера. Известно, что бета-амилоидные олигомеры связываются в нейронных синапсах, и сигма-2-рецепторы присутствуют в значительном количестве в нейронах и глиальных клетках.
[0115] Сигма-2-рецепторы
[0116] Сигма-рецепторы являются полифункциональными адапторными / шаперонными белками, участвующими в нескольких отдельных белковых сигнальных комплексах в зависимости от ткани и состояния. Сигма-2-рецептор экспрессируется в мозге и различных периферических тканях на низком уровне (Walker et al., 1990 Sigma receptors: biology and function. Pharmacol. Rev. 42: 355-402). Сигма-2-рецепторы присутствуют в гиппокампе и коре человека. Сигма-2-рецептор также ранее было подтвержден как биомаркер пролиферации опухолевых клеток. (Mach et al., Sigma-2 receptors as potential biomarkers of proliferation in breast cancer. Cancer Res. 57: 156-161, 1997).
[0117] Сигма-2-рецепторы задействованы во многих сигнальных путях, таких, как связывание гема, метаболизм Цитохрома Р450, синтез холестерина, сигнал прогестерона, апоптоз и перенос через мембрану. К сигналу олигомера при БА имеет отношение только подгруппа сайтов связывания / сигнальных путей сигма-рецептора. В настоящее время нет в наличии нокаутов сигма-2-рецептора, и человеческие мутации в последовательности сигма-2 не исследовались в контексте нейродегенерации.
[0118] Сигма-2-рецептор недавно был определен как мембранный компонент 1 рецептора прогестерона (PGRMC1) в печени крыс путем использования фотоаффинного зонда WC-21, который необратимо метит сигма-2-рецепторы в печени крыс. См. публикацию Xu et al. Identification of the PGRMC1 protein complex as the putative sigma-2 receptor binding site. Nature Communications 2, article number 380, July 5, 2011, включенную в это описание путем ссылки. PGRMC1 (мембранный компонент 1 рецептора прогестерона) был определен как ключевой 25 кДа компонент активности сигма-2-рецептора в августе 2011 г. группой Xu et al. PGRMC1 является одиночным трансмембранным белком без гомологии с белком сигма-1; к представителям группы относятся PGRMC2 и нейдезин. PGRMC1 содержит гем-связывающий домен цитохрома b5. PGRMC1 является одиночным трансмембранным белком без гомологии с белком S1; к представителям группы относятся PGRMC2 и нейдезин. PGRMC1 содержит гем-связывающий домен цитохрома b5. К эндогенным лигандам PGRMC1 относятся прогестерон/стероиды, метаболиты холестерина, глюкокортикоиды и гем. PGRMC1 функционирует как шаперон/адаптор, связанный с разными белковыми комплексами в разных субклеточных участках (Cahill 2007. Progesterone receptor membrane component 1: an integrative review. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 105: 16-36). PGRMC1 связывает гем со сниженной активностью, образует комплекс с белками CYP450 (регулируемые окислительно-восстановительные реакции), ассоциируется с PAIRBP1 и опосредует блокировку прогестерона при апоптозе и ассоциируется с Insig-1 и SCAP для вызывания связанной с SRE транскрипции гена в ответ на низкий уровень холестерина. Гомолог VEM1 С. elegans ассоциируется с UNC-40/DCC для опосредования аксонального наведения. PGRMC1 содержит две последовательности-мишени SH2, последовательность-мишень SH3, сайт тирозинкиназы, дна ацидофильных сайта киназы (CK2), и сайты консенсусного связывания для ERK1 и PDK1. PGRMC1 содержит несколько последовательностей ITAM, задействованных в переносе через мембрану (транспорт везикул, клатрин-зависимый эндоцитоз содержащих кальвеолин ямок).
[0119] Терапевтические средства на основе сигма-2-рецептора достигли клинических испытаний II фазы на человеке для других ЦНС-показаний, но не для лечения БА. Многие из сигма-2-рецепторных лигандов не являются очень селективными и имеют высокую аффинность к другим отличным от сигма рецепторам ЦНС. Например, Cyr-101/MT-210 (Cyrenaic Pharmaceuticals; Митсубиши) является антагонистом сигма-2-рецептора в клинических испытаниях фазы IIa для шизофрении, но имеет много других рецепторных взаимодействий, в том числе в 5НТ2а, ADRA1 и гистамине H1. Сирамезин (Lundbeck, Forest Lu28179) является агонистом сигма-2-рецептора, который ранее проходил клинические испытания как средство от боязни, однако они были прекращены. Сигма-1 рецепторные лиганды проходят клинические испытания для различных ЦНС-показаний. Кутамезин дигидрохлорид (AGY SA4503, M's Science Corp.) является агонистом сигма-1-рецептора, который проходил клинические испытания II фазы как средство от инсульта и испытания II фазы как средство от депрессии. Anavex 2-73 является агонистом сигма-1-рецептора, который также действует на мускариновых холинергических рецепторах как антагонист М2/3, агонист M1 и является антагонистом по отношению к разным ионным каналам (NMDAR, Na+, Ca++). Начались клинические испытания фазы IIa Anavex 2-73 для пациентов с БА и умеренным когнитивным нарушением. Ранее не проводилось клинических испытаний с высокоселективным сигма-2-рецепторным лигандом в качестве терапевтического средства от БА.
[0120] Антагонисты сигма-2
[0121] Без привязывания к какой-либо теории предполагается, что сигма-2-рецептор является рецептором для Abeta-олигомера в нейронах. В литературе предлагались различные рецепторы для растворимых Abeta-олигомеров, включая белок приона, рецептор инсулина, бета-адренергический рецептор и RAGE (рецептор для конечных продуктов гликации). 
, J. et al, 2009, Nature, 457(7233): 1128-1132; Townsend, M. et al, J. Biol. Chem. 2007, 282: 33305-33312; Sturchler, E. et al, 2008, J. Neurosci. 28(20): 5149-5158. Действительно, многие исследователи считают, что Abeta-олигомер может связываться с более чем одним рецепторным белком. Без привязывания к какой-либо теории, на основе представленных свидетельств, авторы настоящего изобретения предположили, что дополнительный рецептор для Abeta-олигомера находится (не обязательно исключительно) в нейронах.
[0122] Без привязывания к какой-либо теории Abeta-олигомеры относятся к агонистам сигма-рецептора, которые связываются с сигма-белковыми комплексами и вызывают нарушение переноса и потерю синапса. При этом демонстрируется, что высокая аффинность сигма-2-лигандов, которые противодействуют этому взаимодействию и/или функции сигма-рецептора в нейронах, конкурирует или иным образом препятствует Abeta-олигомерам и возвращает нейронные реакции к норме. Такие лиганды считаются функциональными антагонистами сигма-2-рецепторов и указываются как таковые или просто как антагонисты сигма-2-рецептора или как антагонисты сигма-2.
[0123] В некоторых вариантах реализации антагонист сигма-2-рецептора согласно Формуле I и/или Формуле II или его фармацевтически приемлемая соль действует как функциональный антагонист в нейроне по отношению к ингибированию индуцированной растворимым Аβ-олигомером потери синапса и ингибированию индуцированного растворимым Аβ-олигомером дефицита в анализе переноса через мембрану; демонстрирует высокую аффинность в сигма-2-рецепторе; а также обладает высокой селективностью к одному или более сигма-рецепторам по сравнению с любым другим отличным от сигма рецептором; и демонстрирует хорошие подобные лекарственным свойства.
[0124] В некоторых вариантах реализации функциональный антагонист сигма-2-рецептора, отвечающий подробно описанным авторами определенным критериям in vitro анализа, демонстрирует поведенческую эффективность или обладает прогнозируемой поведенческой эффективностью в одной или более соответствующих животных поведенческих моделях, как раскрывается в данном описании. В некоторых вариантах реализации поведенческая эффективность определяется на уровне 10 мг/кг п.о. или ниже.
[0125] В некоторых вариантах реализации изобретение обеспечивает платформу in vitro анализа, прогнозирующую поведенческую эффективность для высокоаффинных сигма-2-рецепторных лигандов. В соответствии с этой платформой in vitro анализа, лиганд с высокой аффинностью связывается с сигма-2-рецептором; действует как функциональный антагонист но отношению к вызванным Abeta-олигомерами эффектам в нейронах; ингибирует вызванную Abeta-олигомерами потерю синапса в центральном нейроне или снижает связывание Abeta-олигомера с нейронами для ингибирования потери синапса; и не влияет на перенос или количество синапсов в отсутствие Abeta-олигомера. Этот характер активности в in vitro анализах называется "терапевтическим фенотипом". Способность антагониста сигма-2-рецептора к блокированию Abeta-олигомерных эффектов в зрелых нейронах без воздействия на нормальную функцию в отсутствие Abeta-олигомеров отвечает критериям для терапевтического фенотипа. Авторами раскрывается, что селективный антагонист сигма-2, имеющий терапевтический фенотип, может блокировать вызванную Abeta-олигомерами синаптическую дисфункцию.
[0126] В некоторых вариантах реализации обеспечиваются высокоаффинные селективные антагонисты сигма-2, имеющие терапевтический фенотип и являющиеся подходящими в качестве возможных терапевтических средств для лечения вызванной Abeta-олигомером синантической дисфункции у пациента, который в этом нуждается, которые также обладают следующими характеристиками: высокой аффинностью в сигма-рецепторах; высокой селективностью к сигма-рецепторам по сравнению с другими отличными от сигма рецепторами ЦНС; высокой аффинностью к сигма-2-рецептору или сравнимой аффинностью, например, в пределах порядка величины, в сигма-2 и сигма-1 рецепторах; селективностью к сигма-рецепторам в отличие от других рецепторов, имеющих отношение к центральной нервной системе, и хорошими подобными лекарственным свойствами. К подобные лекарственным свойствам относятся приемлемая способность к проникновению в головной мозг (способность к преодолению гематоэнцефалического барьера), хорошая устойчивость в плазме и хорошая метаболическая устойчивость, например, измеряемая путем воздействия микросом печени. Без привязывания к какой-либо теории высокоаффинные антагонисты сигма-2-рецептора конкурируют с Abeta-олигомерами и/или прекращают патологический сигнал сигма-рецептора, ведущий к болезни Альцгеймера.
[0127] В некоторых вариантах реализации антагонист согласно изобретению может связываться с сигма-1-рецептором с большей аффинностью, чем с сигма-2-рецептором, однако все же должен вести себя как функциональный нейрональный антагонист по отношению к блокированию или ингибированию вызванного Abeta-олигомерами эффекта (Abeta-эффекта).
[0128] В некоторых вариантах реализации антагонист сигма-2, имеющий терапевтический фенотип, является подходящим в качестве возможного терапевтического средства для лечения вызванной Abeta-олигомером синаптической дисфункции у пациента, который в этом нуждается, а также обладает следующими характеристиками: высокой аффинностью в сигма-рецепторах; высокой селективностью к сигма-рецепторам по сравнению с другими отличными от сигма рецепторами ЦНС; высокой аффинностью к сигма-2-рецептору или сравнимой аффинностью в сигма-2 и сигма-1 рецепторах; и хорошими подобными лекарственным свойствами. К подобным лекарственным свойствам относятся высокая способность к проникновению в головной мозг, устойчивость в плазме и метаболическая устойчивость.
[0129] В некоторых вариантах реализации в исследованиях активности связывания показатель IC50 или Ki, составляющий не более чем примерно 600 нМ, 500 нМ, 400 нМ, 300 нМ, 200 нМ, 150 нМ, 100 нМ, предпочтительно не более чем примерно 75 нМ, предпочтительно не более чем примерно 60 нМ, предпочтительно не более чем примерно 40 нМ, более предпочтительно - не более 10 нМ, наиболее предпочтительно - не более 1 нМ, указывает на высокую аффинность связывания по отношению к сайтам связывания сигма-рецептора.
[0130] В некоторых вариантах реализации антагонисты сигма-2 -рецептора с высокой аффинностью (предпочтительно с Ki менее, чем примерно 600 нМ, 500 нМ, 400 нМ, 300 нМ, 200 нМ, 150 нМ, 100 нМ, 70 нМ, 60 нМ, 50 нМ, 30 нМ или 10 нМ) в сигмах-рецепторах, которые имеют более чем примерно 20-кратную, 30-кратную, 50-кратную, 70-кратиую или, предпочтительно, более чем 100-кратную селективность к сигма-рецепторам но сравнению с другими отличными от сигма рецепторами ЦНС или рецепторами-мишенями, и обладают хорошими подобными лекарственным свойствами, включая способность к проникновению в головной мозг и хорошую метаболическую устойчивость и/или устойчивость в плазме, и которые имеют терапевтический фенотип, согласно прогнозу, должны обладать поведенческой эффективностью и могут применяться для лечения вызванной Abeta-олигомерами синаптической дисфункции у пациента, который в этом нуждается.
[0131] В контексте данного описания термин "способность к проникновению в головной мозг" означает способность медикамента, антитела или фрагмента к преодолению гематоэнцефалического барьера. В некоторых вариантах реализации может применяться фармакокинетическое (pK) исследование на животных, например, проводимое на мышах фармакокинетическое исследование/исследование гематоэнцефалического барьера, для определения или прогнозирования способности к проникновению в головной мозг. В некоторых вариантах реализации вводят различные концентрации медикамента, например, 3, 10 и 30 мг/кг, например, перорально, в течение 5 дней, и измеряют различные pK свойства, например, на животной модели. В некоторых вариантах реализации определяют зависящие от дозы показатели уровня в плазме и мозге. В некоторых вариантах реализации Cmax головного мозга составляет >100, 300, 600, 1000, 1300, 1600, или 1900 нг/мл. В некоторых вариантах реализации хорошая способность к проникновению в головной мозг определяется как соотношение мозга/плазмы >0,1, >0,3, >0,5, >0,7, >0,8, >0,9, предпочтительно >1, более предпочтительно >2, >5 или >10. В других вариантах реализации хорошая способность к проникновению в головной мозг определяется как большая, чем примерно 0,1%, 1%, 5%, большая, чем примерно 10%, предпочтительно - большая, чем примерно 15% введенной дозы, преодолевающей ВВВ после заданного периода времени. В некоторых вариантах реализации дозу вводят перорально (п.о.). В других вариантах реализации дозу вводят внутривенно (в.в.), перед измерением свойств pK. Фармакокинетические анализы и способность к проникновению в головной мозг описываются в Примере 7.
[0132] В контексте данного описания термин "устойчивость в плазме" означает распад соединений в плазме, например, под действием ферментов, таких, как гидролазы и эстеразы. Могут применяться любые из различных in vitro анализов. Медикаменты инкубируют в плазме в течение разных периодов времени. Процент исходного соединения (анализируемого вещества), остающегося в каждый момент времени, отражает устойчивость в плазме. Низкие характеристики устойчивости могут приводить к низкой биодоступности. Как хорошая может определяться устойчивость в плазме, превышающая 50% анализируемого вещества, остающегося через 30 мин, превышающая 50% анализируемого вещества, остающегося через 45 минут, предпочтительно - превышающая 50% анализируемого вещества, остающегося через 60 минут.
[0133] В контексте данного описания термин "метаболическая устойчивость" означает способность соединения к сохранению после пресистемного метаболизма (кишечного и печеночного распада или конъюгации перорально введенного медикамента). Она может определяться, например, in vitro путем подвергания соединений воздействию микросом печени мыши или человека. В некоторых вариантах реализации высокая метаболическая устойчивость означает t1/2>5 мин, >10 мин, >15 минут, >20 минут, предпочтительно >30 мин после воздействия на соединение микросом печени мыши или человека. В некоторых вариантах реализации высокая метаболическая устойчивость означает значение собственного клиренса (Clint)<300 мкл/мин/мг, предпочтительно ≤200 мкл/мин/мг, более предпочтительно ≤100 мкл/мин/мг.
[0134] В некоторых вариантах реализации исключаются некоторые соединения существующего уровня техники. В некоторых вариантах реализации соединения, представленные в Таблице 1, описываются в WO 2013/029057 и/или WO 2013/029060, каждый из которых включен в данное описание путем ссылки, и права на них по отношению к композициям или предлагаемым в этом описании способам не заявляются.
[0136] Предлагаемые в данной заявке соединения изоиндолина действуют как высокоаффинные селективные функциональные антагонисты сигма-2, имеющие терапевтический фенотип и обладающие хорошими подобными лекарственным свойствами, и, таким образом, могут применяться для лечения вызванной Abeta-олигомерами синаптической дисфункции.
[0137] В некоторых вариантах реализации обеспечиваются композиции, включающие соединения изоиндолина формулы I в качестве селективных функциональных антагонистов сигма-2, которые обладают высокой аффинностью связывания с сигма-рецепторами. В некоторых вариантах реализации к сигма-рецепторам относятся подтипы как сигма-1, так и сигма-2. См. Hellewell, S.В. and Bowen, W.D., Brain Res. 527: 224-253 (1990); и Wu, X.-Z. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 257: 351-359 (1991). Анализ связывания сигма-рецептора, позволяющий количественно определять аффинность связывания предполагаемого лиганда к обоим сигма-сайтам (на 3H-DTG, который метит оба сайта с примерно одинаковой аффинностью), описывается в публикации Weber et al., Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 83: 8784-8788 (1986). В альтернативном варианте может применяться [3H]пентазоцин для селективного мечения сигма-1-связывающего сайта в анализе связывания. Смесь [3H]DTG и немеченного (+)пентазоцина применяют для селективного мочения сайта сигма-2 в анализе связывания. Изобретение также касается композиций, включающих некоторые лиганды, которые являются селективными для сигма-1 и сигма-2-рецепторов и действуют как функциональные антагонисты сигма-2, а также применения этих композиций для лечения вызванной Abeta-олигомерами синаптической дисфункции. Обнаружение таких лигандов, которые являются селективными для одного из двух подтипов сигма-рецепторов, может быть важным фактором в определении соединений, являющихся эффективными для лечения нарушений центральной нервной системы с минимальными побочными эффектами.
[0138] В некоторых вариантах реализации соединения изоиндолина Формулы (I) демонстрируют активность антагониста сигма-2, высокую аффинность к сигма-2-рецептору и способность к блокированию связывания растворимого Abeta-олигомера или вызванной Abeta-олигомерами синаптической дисфункции.
[0139] В некоторых вариантах реализации антагонисты сигма-2 предназначены для повышения способности к преодолению гематоэнцефалического барьера.
[0140] В некоторых вариантах реализации конкретное соединение антагониста сигма-2-рецептора блокирует связывание между растворимыми Abeta-олигомерами и сигма-2-рецептором.
[0141] В некоторых вариантах реализации соединение антагониста сигма-2 демонстрирует высокую аффинность к сигма-2-рецептору.
[0142] Сигма-2-рецепторные лиганды для отбора в качестве антагонистов сигма-2-рецептора
[0143] В некоторых вариантах реализации антагонисты сигма-2-рецепторов для применения согласно настоящему изобретению выбирают из соединений сигма-2-рецепторных лигандов, которые также отвечают дополнительным критериям отбора. Дополнительные критерии применяют для отбора антагонистов сигма-2-рецепторов для применения согласно настоящему изобретению из числа сигма-2-рецепторных лигандов. К дополнительным критериям отбора относятся: действие в качестве функционального антагониста а нейронах по отношению к ингибированию индуцированной растворимым Аβ-олигомером потери синапса и ингибированию индуцированного растворимым Аβ-олигомером дефицита в анализе переноса через мембрану; наличие высокой селективности к одному или более сигма-рецепторам по сравнению с любым другим отличным от сигма рецептором; проявление высокой аффинности в сигма-2-рецепторе; и проявление хороших подобных лекарственным свойств, включая хорошую способность к проникновению в головной мозг, хорошую метаболическую устойчивость и высокую устойчивость в плазме. В некоторых вариантах реализации антагонист сигма-2-рецептора также выбирают на основе проявления одного или более следующих дополнительных свойств: отсутствие влияния на перенос или количество синапсов в отсутствие Abeta-олигомера; отсутствие индукции активности каспазы-3 в нейронах; ингибирование индукции активности каспазы-3 агонистом сигма-2-рецепторов; и/или снижение нейрональной токсичности в нейронах, вызываемой агонистом сигма-2-рецепторов, или защита от нее.
[0144] В некоторых вариантах реализации некоторые соединения сигма-2-рецепторных лигандов, подвергаемые отбору по дополнительным критериям, выбирают из описанных авторами соединений и синтезируют согласно способам, описанным в данной заявке или в заявках WO 2011/014880 (Заявка № PCT/US2010/044136), WO 2010/118055 (Заявка № PCT/US2010/030130), Заявка № PCT/US2011/026530, WO 2012/106426 (Заявка № PCT/US2012/023483), WO 2013/029057 (Заявка № PCT/US2012/052572) и WO 2013/029060 (Заявка № PCT/US2012/052578), каждая из которых включена в это описание путем ссылки в полном объеме. Дополнительные возможности получения этих соединений подробно обсуждаются ниже.
[0145] В некоторых вариантах реализации сигма-2-лиганд включает соединение Формулы I:
или его фармацевтически приемлемую соль, где:
R1 и R2 каждый независимо выбран из Н, C1-С6алкила или CH2OR'; где R'=Н или C1-С6 алкил;
R3, R4, R5 и R6 каждый независимо выбран из Н, C1-С6 алкила, ОН, ОСН3, OCH(CH3)2, OCH2CH(СН3)2, ОС(СН3)3, O(C1-C6 алкил), OCF3, OCH2CH2OH, O(C1-C6 алкил)ОН, O(С1-С6 галогеналкила), F, Cl, Br, I, CF3, CN, NO2, NH2, C1-С6 галогеналкила, C1-С6 гидроксиалкила, C1-6 алкокси C1-6алкила, арила, гетероарила, С3-7 циклоалкила, гетероциклоалкила, алкиларила, гетероарила, CO2R', C(O)R', NH(C1-4 алкила), N(C1-4 алкила)2, NH(С3-7 циклоалкила), NHC(O)(C1-4 алкила), CONR'2, NC(O)R', NS(O)nR', S(O)nNR'2, S(O)nR', C(O)O(C1-4 алкила), OC(O)N(R')2, C(O)(С1-4 алкила) и C(O)NH(C1-4 алкила); где n=0, 1 или 2; R' каждый независимо представляет собой Н, СН3, СН2СН3, С3-С6 алкил, C1-С6 галогеналкил; или необязательно замещенный арил, алкиларил, пиперазин-1-ил, пиперидин-1-ил, морфолинил, гетероциклоалкил, гетероарил, C1-6 алкокси, NH(C1-4 алкил) или NH(C1-4 алкил)2, причем необязательно замещенная группа выбрана из С1-С6 алкила или С2-С7 ацила;
или R3 и R4, вместе с атомом С, к которому они присоединены, образуют 4-, 5-, 6- 7- или 8-членный циклоалкил, арил, гетероарил или гетероциклоалкил, необязательно замещенный 1, 2, 3, 4 или 5 заместителями, независимо выбранными из ОН, амино, галогена, С1-6 алкила, C1-6 галогеналкила, C1-6 алкокси, C1-6 галогеналкокси, арила, арилалкила, гетероарила, гетероарилалкила, циклоалкила и гетероциклоалкила, и R3 и R4, или R4 и R5, каждый независимо выбран из связи, С, N, S и О; или R3 и R4 связаны вместе с образованием -О-С1-2 метилен-О-группы;
или R4 и R5, вместе с атомом С, к которому они присоединены, образуют 4-, 5-, 6- 7- или 8-членный циклоалкил, арил, гетероарил или гетероциклоалкил, необязательно замещенный 1, 2, 3, 4 или 5 заместителями, независимо выбранными из ОН, амино, галогена, C1-6 алкила, С1-6 галогеналкила, С1-6 алкокси, С1-6 галогеналкокси, арила, арилалкила, гетероарила, гетероарилалкила, циклоалкила и гетероциклоалкила, и R3 и R4, или R4 и R5, каждый независимо выбран из связи, С, N, S и О; или R4 и R5 связаны вместе с образованием -O-С1-2 метилен-О-группы;
R7, R8, R9, R10 и R11 каждый независимо выбран из Н, С1-С6 алкила, ОН, ОСН3, OCH(СН3)2, OCH2CH(CH3)2, ОС(СН3)3, O(C1-C6 алкила), OCF3, OCH2CH2OH, O(C1-C6 алкил)OH, O(С1-С6 галогеналкила), F, Cl, Br, I, CF3, CN, NO2, NH2, C1-С6 галогеналкила, C1-C6 гидроксиалкила, C1-6 алкокси C1-6алкила, арила, гетероарила, С3-7 циклоалкила, гетероциклоалкила, алкиларила, гетероарила, CO2R', C(O)R', NH(C1-4 алкила), N(C1-4 алкила)2, NH(C3-7 циклоалкила), NHC(O)(C1-4 алкила), CONR'2, NC(O)R', NS(O)nR', S(O)nNR'2, S(O)nR', С(O)O(С1-4 алкила), OC(O)N(R')2, C(O)(C1-4 алкила) и C(O)NH(C1-4 алкила); где n=0, 1 или 2; R' каждый независимо представляет собой Н, СН3, СН2СН3, С3-C6 алкил, C1-С6 галогеналкил, арил, алкиларил, пиперазин-1-ил, пиперидин-1-ил, морфолинил, гетероциклоалкил, гетероарил, C1-6 алкокси, NH(C1-4 алкил) или NH(C1-4 алкил)2;
или R7 и R8, вместе с атомами N или С, к которым они присоединены, образуют 4-, 5-, 6- 7- или 8-членную циклоалкильную, арильную, гетероциклоалкильную или гетероарильную группу, необязательно замещенную 1, 2, 3, 4 или 5 заместителями, независимо выбранными из ОН, амино, галогена, C1-6 алкила, C1-6 галогеналкила, C1-6 алкокси, С1-6 галогеналкокси, арила, арилалкила, гетероарила, гетероарилалкила, циклоалкила и гетероциклоалкила, и R9 и R10 каждый независимо выбран из связи, С, N, S и О; или R7 и R8 связаны вместе с образованием -O-С1-2 метилен-O-группы;
или R8 и R9, вместе с атомами N или С, к которым они присоединены, образуют 4-, 5-, 6- 7- или 8-членную циклоалкильную, арильную, гетероциклоалкильную или гетероарильную группу, необязательно замещенную 1, 2, 3, 4 или 5 заместителями, независимо выбранными из ОН, амино, галогена, C1-6 алкила, С1-6 галогеналкила, C1-6 алкокси, С1-6 галогеналкокси, арила, арилалкила, гетероарила, гетероарилалкила, циклоалкила и гетероциклоалкила, и R9 и R10 каждый независимо выбран из связи, С, N, S и О; или R8 и R9 связаны вместе с образованием -O-С1-2 метилен-O-группы;
где каждый из О, С1-6 алкила, С1-6 галогеналкила, гетероарила, арила, гетероарила, гетероциклоалкила и циклоалкила необязательно независимо замещен 1, 2, 3, 4 или 5 заместителями, независимо выбранными из ОН, амино, галогена, C1-6 алкила, C1-6 галогеналкила, C1-6 алкокси, C1-6 галогеналкокси, арила, арилалкила, гетероарила, гетероарилалкила, циклоалкила и гетероциклоалкила;
при условии, что исключаются следующие соединения:
.
[0146] В некоторых вариантах реализации сигма-2-лиганд включает рацемическую смесь или энантиомер соединения Формулы I, где R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10 и R11 являются такими, как описано выше.
[0147] В некоторых вариантах реализации предлагается выделенное соединение согласно Формуле I:
или его фармацевтически приемлемая соль, где R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10 и R11 являются такими, как определено в данном документе, при условии, что если R1, R3, R6, R7, R10 и R11 каждый представляет собой Н; R2 представляет собой СН3; R8 представляет собой ОСН3 или Cl; и R9 представляет собой ОН или Cl; то R4 не представляет собой Cl или CF3, и R5 не представляет собой Cl или CF3.
[0148] В других вариантах реализации предлагается выделенное соединение или его композиция или способ, включающий его введение, согласно Формуле I:
или его фармацевтически приемлемая соль, где R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10 и R11 являются такими, как определено в данном документе, при условии, что соединение согласно Формуле I, где R1, R3, R6, R7, R10 и R11 каждый представляет собой Н; R2 представляет собой СН3; R8 представляет собой ОСН3 или Cl; и R9 представляет собой ОН или Cl; R4 представляет собой Cl или CF3, и R5 представляет собой Cl или CF3, не является предпочтительным соединением.
[0149] В другом варианте реализации предлагается фармацевтическая композиция для ингибирования влияния бета-амилоида на нейроны, содержащая соединение согласно Формуле I:
или его фармацевтически приемлемая соль и фармацевтически приемлемый носитель, где R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10 и R11 являются такими, как определено в данном документе, при условии, что если R1, R3, R6, R7, R10 и R11 каждый представляет собой Н; R2 представляет собой CH3; R8 представляет собой ОСН3 или Cl; и R9 представляет собой ОН или Cl; то R4 не представляет собой Cl или CF3, и R5 не представляет собой Cl или CF3.
[0150] В другом варианте реализации предлагается способ/применение для ингибирования влияния бета-амилоида на нейроны, включающие введение эффективного количества композиции, содержащей соединение селективного антагониста сигма-2-рецептора согласно Формуле I:
или его фармацевтически приемлемая соль и фармацевтически приемлемый носитель, где R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10 и R11 являются такими, как определено в данном документе, при условии, что если R1, R3, R6, R7, R10 и R11 каждый представляет собой Н; R2 представляет собой СН3; R8 представляет собой ОСН3 или Cl; и R9 представляет собой ОН или Cl; то R4 не представляет собой Cl или CF3, и R5 не представляет собой Cl или CF3, и соединение или его соль присутствует в композиции в количестве, эффективном для ингибирования связывания бета-амилоидного олигомера в вышеупомянутой клетке; и фармацевтически приемлемый носитель.
[0151] В некоторых вариантах реализации сигма-2-лиганд включает рацемическую смесь или энантиомер соединения Формулы II:
где R3, R4, R5, R6, R8 и R9 являются такими, как описано авторами.
[0152] В другом варианте реализации предлагается соединение или его фармацевтически приемлемая соль согласно Формуле III, где R3, R4, R5, R6, R7, R8, R9, R10 и R11 являются такими, как представлено в данном описании, и 
каждый независимо выбран из одинарной, двойной или тройной связи.
[0153] В некоторых аспектах соединение согласно Формуле III выбрано из:
или 
,
или их фармацевтически приемлемых солей.
[0154] В некоторых вариантах реализации сигма-2-лиганд включает рацемическую смесь энантиомера соединения Формулы I, где R3, R4, R5, R6, R8 и R9 являются такими, как описано авторами.
[0155] и некоторых вариантах реализации сигма-2-лиганд является соединением или фармацевтически приемлемой солью Формулы I, где R8 и R9 независимо выбраны из OH, C1-6 алкокси и гидрокси C1-6 алкокси.
[0156] В некоторых вариантах реализации сигма-2-лигаид является соединением или фармацевтически приемлемой солью Формулы I, где R8 и R9 являются независимо выбранными из ОН и NH(C1-4 алкила).
[0157] В некоторых вариантах реализации сигма-2-лиганд является соединением или фармацевтически приемлемой солью Формулы I, где R8 и R9 являются независимо выбранными из Н, галогена, С1-6 галогеналкила и C1-6 галогеналкокси.
[0158] В некоторых вариантах реализации сигма-2-лиганд является соединением или фармацевтически приемлемой солью Формулы I, где R8 и R9 каждый независимо выбран из ОН, галогена, C1-6 алкокси и C1-6 галогеналкокси, и R1 и R2 независимо друг от друга представляют собой С1-6 алкил.
[0159] В некоторых вариантах реализации сигма-2-лиганд является соединением или фармацевтически приемлемой солью Формулы I, где каждый из R1 и R2 представляет собой метил.
[0160] В некоторых вариантах реализации сигма-2-лиганд является соединением или фармацевтически приемлемой солью Формулы I, где один из R1 и R2 представляет собой мстил, а другой представляет собой Н.
[0161] В некоторых вариантах реализации сигма-2-лиганд является соединением или фармацевтически приемлемой солью Формулы I, где R8 и R9 каждый независимо выбран из OH и C1-6 алкокси, и R1 и R2 независимо друг от друга представляют собой метил.
[0162] В некоторых вариантах реализации сигма-2-лиганд является соединением или фармацевтически приемлемой солью Формулы I, где R8 и R9 независимо выбраны из H, галогена и C1-6 галогеналкила, и R1 и R2 являются метилом.
[0163] В некоторых вариантах реализации сигма-2-лиганд является соединением или фармацевтически приемлемой солью Формулы I, где R8 и R9 каждый независимо выбран из Н, галогена и C1-6 галогеналкила.
[0164] В некоторых вариантах реализации сигма-2-лиганд является соединением или фармацевтически приемлемой солью Формулы I, где R7 и R11 каждый представляет собой H.
[0165] В некоторых вариантах реализации сигма-2-лиганд является соединением или фармацевтически приемлемой солью Формулы I, где R3, R4, R5 и R6 каждый независимо выбран из Н, галогена, C1-6 алкила, C1-6 галогеналкила и С1-6 алкокси.
[0166] В некоторых вариантах реализации сигма-2-лиганд является соединением или фармацевтически приемлемой солью Формулы I, где R3, R4 и R5 каждый независимо выбран из H, галогена, C1-6 алкила, С1-6 галогеналкила и C1-6 алкокси.
[0167] В некоторых вариантах реализации сигма-2-лиганд является соединением или фармацевтически приемлемой солью Формулы I, где R3, R4, R5 и R6 каждый независимо выбран из Н, галогена, S(O)nR', C(O)OR', C(O)N(R')2 и C(O)R'; где n=2; R' каждый независимо представляет собой Н, СН3, СН2СН3, С3-С6 алкил, C1-С6 галогеналкил, или необязательно C1-С6 алкил или С2-С7 ацил, замещенный арил, алкиларил, пиперазинил, пиперидинил, морфолинил, гетероциклоалкил и гетероарил.
[0168] В некоторых вариантах реализации сигма-2-лиганд является соединением или фармацевтически приемлемой солью Формулы I, где R3, R4 и R5 каждый независимо выбран из Н, галогена, S(O)nR' и C(O)R'; где n=2; R' каждый независимо представляет собой СН3, CH2CH3, С3-С6 алкил, арил, пиперазин-1-ил, пиперидин-1-ил и морфолинил-4-ил.
[0169] В некоторых вариантах реализации сигма-2-лиганд является соединением или фармацевтически приемлемой солью Формулы I, где R3, R4 и R5 каждый независимо выбран из Н, галогена, S(O)nR' и C(O)R'; где n=2; R' каждый независимо представляет собой СН3, СН2СН3, С3-С6 алкил, арил, пиперазин-1-ил, пиперидин-1-ил и морфолинил-4-ил; R8 и R9 каждый независимо выбран из ОН, галогена, C1-6 алкокси и C1-6 галогеналкокси; и R1 и R2 представляет собой метил.
[0170] В некоторых вариантах реализации сигма-2-лиганд является соединением или фармацевтически приемлемой солью Формулы I, где R3 и R4 или R4 и R5 вместе с атомом С, к которому они присоединены, образуют 6-членное циклоалкильное или гетероциклоалкильное, арильное или гетероарильное кольцо.
[0171] В некоторых вариантах реализации сигма-2-лиганд является соединением или фармацевтически приемлемой солью Формулы I, где R3 и R4 или R4 и R5 являются О и связаны вместе с образованием -О-С1-2 метилен-О-группы.
[0172] В некоторых вариантах реализации сигма-2-лиганд является соединением или фармацевтически приемлемой солью Формулы I, где R2 и R3 независимо выбраны из H, ОН, галогена, С1-6 алкокси и C1-6 галогеналкила.
[0173] В некоторых вариантах реализации сигма-2-лиганд является соединением или фармацевтически приемлемой солью Формулы II, где R3 и R4 независимо выбраны из H, Cl, F, -ОМе, -CF3, S(O)nR' и C(O)R'; где n=2; R' каждый независимо представляет собой Н, СН3, СН2СН3, С3-С6 алкил, арил, пиперазин-1-ил, пиперидин-1-ил и морфолинил-4-ил; R8 и R9 каждый независимо выбран из ОН и C1-6 алкокси.
[0174] В некоторых вариантах реализации сигма-2-лиганд является соединением или фармацевтически приемлемой солью Формулы I, где R2 и R3 независимо выбраны из H, OH, Cl, F, -ОМе и -CF3, где R7 и R8 каждый независимо выбран из Н и C1-6 алкила, причем R9 представляет собой Н, и R5 и R6 каждый независимо выбран из Н и C1-6 галогеналкила.
[0175] К предпочтительным солям для применения согласно изобретению относятся гидрохлориды вышеупомянутых соединений.
[0176] Их синтезируют в соответствии с предлагаемыми авторами общими способами, и конкретные примеры синтеза з любыми дополнительными этапами хорошо известны специалистам в данной области. Несколько из этих соединений испытывали в различных анализах, как подробно описано авторами, и они оказались активными. Испытуемые соединения также демонстрируют повышенную биодоступность согласно данным о соединениях, описанным в документе WO 2010/110855.
[0177] В некоторых вариантах реализации каждая из представленных выше общих формул может содержать условие удаления одного или более из следующих соединений:
.
[0178] Соединения согласно Формуле I и/или Формуле II были синтезированы в соответствии с представленными авторами общими способами, и конкретные примеры синтеза с любыми дополнительными этапами хорошо известны специалистам в данной области. Некоторые из этих соединений испытывали а различных анализах, как подробно описывается авторами, и они оказались активными. Испытуемые соединения также демонстрируют повышенную биодоступность согласно данным о соединениях, описанным в заявке WO 2010/110855, включенной в это описание путем ссылки.
[0179] В контексте данного описания термин "акцепторная группа водородной связи" означает группу, способную принимать водородную связь. Примеры акцепторных групп водородной связи известны специалистам, и ими, помимо прочих, могут быть алкоксигруппы, оксазолидин-2-оновые группы, -O-C(O)-N-; -C(O)-N-; -O-; гетероатом (например, кислород) в циклогетероалкиле; -N-SO2- и т.п. Группы могут связываться в любом направлении и могут быть связаны с другим атомом углерода или гетероатомом. Акцепторная группа водородной связи также может присутствовать в гидрофобной алифатической группе или поблизости от нее. Например, тетрагидрофурановая группа содержит как акцепторную группу водородной связи, так и гидрофобную алифатическую группу. Кислород, присутствующий в тетрагидрофурановом кольце, действует как акцептор водородной связи, а атомы углерода в тетрагидрофурановом кольце действует как гидрофобная алифатическая группа.
[0180] В контексте данного описания термин "гидрофобная алифатическая группа" означает углеродную цепь или углеродное кольцо. Углеродная цепь может присутствовать в циклогетероалкиле, но гидрофобная алифатическая группа не включает гетероатом. Представленный выше пример тетрагидрофурана является одним таким примером, однако существует и много других. В некоторых вариантах реализации гидрофобная алифатическая группа является необязательно замещенным С1-С6 алкилом, циклоалкилом или С1-С6 атомами углерода гетероциклоалкила. "Гидрофобная алифатическая группа" не является гидрофобной ароматической группой.
[0181] В контексте данного описания термин "положительная ионогенная группа" означает атом или группу атомов, присутствующих в структуре, которые могут быть положительно заряжены при определенных условиях, таких, как биологические условия, присутствующие в растворе или в клетке. В некоторых вариантах реализации положительной ионогенной группой является азот. В некоторых вариантах реализации положительной ионогенной группой является азот, присутствующий в циклогетероалкильном кольце. Например, в пиперазиновой группе два атома азота будут рассматриваться как две положительных ионогенных группы. Однако в некоторых вариантах реализации атомы углерода, связанные с положительной ионогенной группой, не считаются гидрофобной алифатической группой. В некоторых вариантах реализации положительная ионогенная группа является азотосодержащим кольцом. Примерами азотосодержащих колец, помимо прочих, могут быть пиперазин, пиперадин, триазинан, тетразинан и т.п. В некоторых вариантах реализации по отношению к положительной ионогенной группе азотосодержащее кольцо включает 1, 2, 3 или 4 атома азота. В некоторых вариантах реализации положительная ионогенная группа не является азотом, присутствующим в -N-SO2-группе.
[0182] К некоторых вариантах реализации группа включает как акцептор водородной связи, так и положительную ионогенную группу. Например, морфолиновая группа включает как акцептор водородной связи в кислородной группе, так и положительную ионогенную группу в азоте.
[0183] В контексте данного описания термин "донор водородной связи" означает группу, способную отдавать водородную связь. Примерами донора водородной связи, помимо прочих, могут быть -ОН и другие подобные группы.
Соли, сольваты, стереоизомеры, производные, пролекарства и активные метаболиты новых соединений.
[0184] Изобретение также охватывает соли, сольваты, стереоизомеры, пролекарства и активные метаболиты соединений по любой из представленных выше формул.
[0185] Термин "соли" может включать кислые аддитивные соли или аддитивные соли свободных оснований. Предпочтительно соли являются фармацевтически приемлемыми. Примерами кислот, которые могут применяться для образования фармацевтически приемлемых кислых аддитивных солей, помимо прочих, могут быть соли, образуемые из нетоксичных неорганических кислот, таких, как азотная, фосфорная, серная или бромистоводородная, йодистоводородная, фтористоводородная, фосфористая, а также соли, образуемые из нетоксичных органических кислот, таких, как алифатические моно- и дикарбоновые кислоты, фенил-замещенные алкановые кислоты, гидроксиалкановые кислоты, алкандикарбоновые кислоты, ароматические кислоты, алифатические и ароматические сульфоновые кислоты и уксусная, малеиновая, янтарная или лимонная кислоты. Неограничивающими примерами таких солей могут быть нападизилат, безилат, сульфат, пиросульфат, бисульфат, сульфит, бисульфит, нитрат, фосфат, моногидрофосфат, дигидрогенфосфат, метафосфат, пирофосфат, хлорид, бромид, йодид, ацетат, трифтороацетат, пропионат, каприлат, изобутират, оксалат, малонат, сукцинат, суберат, себацинат, фумарат, малеат, манделат, бензоат, хлоробензоат, метилбензоат, динитробензоат, фталат, бензолсульфонат, толуолсульфонат, фенилацетат, цитрат, лактат, малеат, тартрат, метансульфонат и т.п. Также предусматриваются соли аминокислот, такие, как аргинат и другие подобные соли и глюконат, галактуронат (см., например, Berge, et al. "Pharmaceutical Salts," J. Pharma. Sci. 1977; 66: 1).
[0186] Кислые аддитивные соли соединений по любой из представленных выше формул могут быть получены путем контакта формы свободного основания с достаточным количеством нужной кислоты для образования соли традиционным способом. Форма свободного основания может быть регенерирована путем контакта солевой формы с основанием и выделения свободного основания традиционным способом. Формы свободного основания несколько отличаются от их соответствующих солевых форм по определенным физическим свойствам, таким, как растворимость в полярных растворителях, но в других отношениях соли эквивалентны их соответствующим свободным основаниям с точки зрения изобретения.
[0187] Также включаются как полные, так и частичные соли, то есть, соли 1, 2 или 3, предпочтительно 2 эквивалентами основания на моль кислоты, например, соединения формулы I или соли, с 1, 2 или 3 эквивалентами, предпочтительно 1 эквивалентом кислоты на моль основания соединения по любой из приведенных выше формул.
[0188] С точки зрения выделения или очистка также возможно использование фармацевтически приемлемых солей. Однако терапевтическое применение находят лишь фармацевтически приемлемые нетоксичные соли, поэтому им отдается предпочтение.
[0189] Фармацевтически приемлемые основные аддитивные соли образуются с металлами или аминами, такими, как щелочные и щелочноземельные металлы или органические амины. Примерами металлов, используемых как катионы, являются натрий, калий, магний, кальций и т.п. Примерами подходящих аминов являются N,N'-дибензилэтилендиамин, хлоропрокаин, холин, диэтаноламин, дициклогексиламин, этилендиамин, N-метилглюкамин и прокаин.
[0190] Основные аддитивные соли вышеупомянутых кислотных соединений получают путем контакта формы свободной кислоты с достаточным количеством нужного основания для получения соли традиционным способом. Форма свободной кислоты может быть регенерирована путем контакта солевой формы с кислотой и выделения свободной кислоты.
[0191] Соединения согласно изобретению могут иметь как основный, так и кислотный центр и, таким образом, могут быть в форме цвиттер-ионов или внутренних солей.
[0192] Как правило, фармацевтически приемлемая соль соединения по любой из представленных выше формул может быть легко получена путем соответствующего использования нужной кислоты или основания. Соль осаждают из раствора и собирают путем фильтрации или извлекают путем выпаривания растворителя. Например, водный раствор кислоты, такой, как хлористоводородная кислота, добавляют к водной суспензии соединения по любой из представленных выше формул и полученную в результате смесь выпаривают до сухого состояния (лиофилизируют) для получения кислой аддитивной соли в виде твердого вещества. В альтернативном варианте соединение по любой из представленных выше формул может быть растворено в соответствующем растворителе, например, спирте, таком, как изопропанол, и кислота может добавляться в том же растворителе или другом подходящем растворителе. Затем полученную в результате кислую аддитивную соль осаждают непосредственно или путем добавления менее полярного растворителя, такого, как диизопропиловый эфир или гексан, и выделяют путем фильтрации.
[0193] Специалистам в области органической химии станет понятно, что многие органические соединения могут образовывать комплексы с растворителями, в которых они реагируют, или из которых они осаждаются или кристаллизуются. Эти комплексы известны как "сольваты". Например, комплекс с водой известен как "гидрат". Сольваты соединения согласно изобретению охватываются объемом этого изобретения. Соли соединения по любой из представленных выше формул могут образовывать сольваты (например, гидраты), и изобретение также охватывает все подобные сольваты. Значение слова "сольваты" хорошо известно специалистам в данной области как соединение, образуемое путем взаимодействия растворителя и растворяемого вещества (т.е., сольватации). Способы получения сольватов являются общепринятыми в данной области (см., например, Brittain. Polymorphism in Pharmaceutical solids. Marcel Decker, New York, 1999.).
[0194] Изобретение также охватывает N-оксиды соединений формул I. Термин "N-оксид" означает, что для гетероциклов, содержащих незамещенный в других условиях атом sp2N, атом N может нести ковалентно связанный атом О, т.е., -N→O. Примерами таких N-оксид-замещенных гетероциклов могут быть пиридил-N-оксиды, пиримидил-N-оксиды, пиразинил-N-оксиды и пиразолил-N-оксиды.
[0195] Соединения но любой из представленных выше формул могут иметь один или более хиральных центров и, в зависимости от характера отдельных заместителей, они также могут иметь геометрические изомеры. Изомеры, отличающиеся пространственным расположением их атомов, называются "стереоизомерами". Стереоизомеры, не являющиеся зеркальными отражениями друг друга, называются "диастереомерами", а те, которые являются не совпадающими при наложении зеркальными отражениями друг друга, называются "энантиомерами". Если соединение имеет хиральный центр, возможна пара энантиомеров. Энантиомер может характеризоваться абсолютной конфигурацией его асимметричного центра и описывается согласно правилам R-- и S-секвенирования Кана и Прелога или согласно способу, которым молекула вращает плоскость поляризованного света и определяется как правовращающая или левовращающая (т.е., как (+) или (-)-изомер, соответственно). Хиральное соединение может существовать как отдельный энантиомер или как смесь энантиомеров. Смесь, содержащая равные пропорции энантиомеров, называется "рацемической смесью". Смесь, содержащая неравные части энантиомеров, описывается как имеющая "энантиомерный избыток" (ее) R- или S-соединения. Избыток одного энантиомера в смеси часто описывается как процентный показатель энантиомерного избытка (% ее), определяемый но формуле:
% ее=(R)-(S)/(R)+(S)
[0196] Соотношение энантиомеров также может определяться по "оптической чистоте", причем степень, в которой смесь энантиомеров вращает плоскость поляризованного света, сравнивают с отдельными оптически чистыми R- или S-соединениями. Оптическую чистоту определяют по следующей формуле:
Оптическая чистота = энант.больш./(энант.больш. + энант.меньш.)
[0197] Соединение также может быть по сути чистым (+) или (-) энантиомером описанных авторами соединений. В некоторых вариантах реализации композиция, включающая по сути чистый энантиомер, включает по меньшей мере 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% одного энантиомера. В некоторых вариантах реализации композиция, включающая но сути чистый энантиомер, по меньшей мере на 99,5% состоит из одного энантиомера. В некоторых вариантах реализации композиция включает только один энантиомер описанного авторами соединения.
[0198] Изобретение охватывает все отдельные изомеры соединений по любой из представленных выше формул. Описание названия конкретного соединения в описательной части и формуле изобретения включает как отдельные энантиомеры, так и их смеси, рацемические или другие. Способы определения стереохимии и расщепления или стереотаксического синтеза стереоизомеров хорошо известны специалистам в данной области. В частности, существует хиральный центр, показанный в соединениях по любой из представленных выше формул, который образует один набор энантиомеров. Дополнительные хиральные центры могут присутствовать в зависимости от заместителей.
[0199] Во многих случаях применения предпочтение отдается стереоселективному синтезу и/или подверганию продукт реакции соответствующим этапам очистки для получения но сути оптически чистых материалов. Подходящие стереоселективные синтетические процедуры для получения оптически чистых материалов хорошо известны специалистам в данной области, как и процедуры очистки рацемических смесей до оптически чистых фракций. Специалистам в данной области также станет понятно, что соединения согласно изобретению могут существовать в полиморфных формах, в которых соединение способно кристаллизироваться в различных формах. Подходящие способы распознавания и отделения полиморфизмов известны специалистам в данной области.
[0200] Диастереомеры отличаются как по физическим свойствам, так и по химической реакционной способности. Смесь диастереомеров может расщепляться на энантиомерные пары па основе растворимости, фракционной кристаллизации или хроматографических свойств, определяемых, например, путем тонкослойной хроматографии, колоночной хроматографии или ВЭЖХ.
[0201] Очистка сложных смесей диастереомеров до энантиомеров, как правило, требует двух этапов. На первом этапе смесь диастереомеров расщепляют на энантиомерные пары, как описано выше. На втором этапе энантиомерные пары подвергают дальнейшей очистке до композиций, обогащенных одним или другим энантиомером, или, что более предпочтительно, расщепляют на композиции, включающие чистые энантиомеры. Расщепление энантиомеров, как правило, требует реакции или молекулярного взаимодействия с хиральным агентом, например, растворителем или матриксом колонки. Расщепление может достигаться, например, путем преобразования смеси энантиомеров, например, рацемической смеси, в смесь диастереомеров путем реакции с чистым энантиомером второго агента, т.е., расщепляющего агента. После этого могут быть разделены два полученных в результате диастереомерных продукта. Разделенные диастереомеры затем повторно преобразуют в чистые энантиомеры путем обращения первичной химической трансформации.
[0202] Расщепление энантиомеров также может выполняться по различиям в их нековалентном связывании с хиральным веществом, например, путем хроматографии на гомохиральных адсорбентах. Нековалентное связывание между энантиомерами и хроматографическим адсорбентом образует диастереомерные комплексы, что приводит к дифференциальному распределению в мобильном и связанном состояниях в хроматографической системе. Таким образом, два энантиомера перемещаются через хроматографическую систему, например, колонку, с разными скоростями, что обеспечивает возможность их расщепления.
[0203] Колонки для хирального расщепления хорошо известны специалистам в данной области и выпускаются серийно (например, компанией MetaChem Technologies Inc., подразделением ANSYS Technologies, Inc., Lake Forest, CA). Энантиомеры анализируют и очищают, применяя, например, хиральные неподвижные фазы (CSP) для ВЭЖХ. Хиральные колонки для ВЭЖХ, как правило, содержат одну форму энантиомерного соединения, иммобилизованного на поверхности силикагелевого наполнителя.
[0204] D-фенилглицин и L-лейцин являются примерами CSP I типа, и в них используются комбинации π-π-взаимодействий, водородных связей, диполь-дипольных взаимодействий и стерических взаимодействий для достижения хирального распознавания. Для расщепления на колонке I типа анализируемые энантиомеры должны содержать функциональную группу, комплементарную функциональной группе CSP, таки образом, чтобы анализируемое вещество подвергалось существенному взаимодействию с CSP. Образец предпочтительно должен содержать одну из следующих функциональных групп: π-кислоту или π-основание, донор и/или акцептор водородной связи или амидный диполь. Иногда применяют дериватизацию для добавления интерактивных сайтов к соединениям, в которых они отсутствуют. Наиболее распространенные производные включают образование амидов из аминов и карболовых кислот.
[0205] MetaChiral ODM™ является примером CSP II типа. Основные механизмы образования комплексов растворенных веществ с CSP считаются эффективными видами взаимодействия, однако комплексы включения также играют важную роль. Водородное связывание, π-π-взаимодействия и дипольный стэкинг важны для хирального расщепления на MetaChiral™ ODM. Дериватизация может быть необходима, если молекула растворенного вещества не содержит групп, необходимых для взаимодействия растворенного вещества с колонкой. Дериватизация, обычно до бензиламидов, может быть необходимой для некоторых сильно полярных молекул, таких, как амины и карболовые кислоты, которые иначе бы сильно взаимодействовали с неподвижной фазой через неспецифическое взаимодействие стереомеров.
[0206] В соответствующих случаях соединения по любой из представленных выше формул могут разделяться на диастереомерные пары, например, путем разделения с применением колоночной хроматографии или ТСХ на силикагеле. Эти диастереомерные пары называются диастереомером с верхним ТСХ Rf; и диастереомер с нижним ТСХ Rf. Диастереомеры также могут быть обогащенными конкретным энантиомером или расщепленными на один энантиомер с применением способов, хорошо известных специалистам в данной области, таких, как описанные авторами.
[0207] Относительная конфигурация диастереомерных пар может быть выведена путем применения теоретических моделей или правил (например, правила Крама, модели Фелкина-Ана) или с применением более надежных трехмерных моделей, создаваемых программами вычислительной химии. Во многих случаях эти способы позволяют прогнозировать, какой диастереомер является энергетически предпочтительным продуктом химического преобразования. В качестве альтернативы относительная конфигурация диастереомерных пар может быть косвенно определена путем обнаружения абсолютных конфигураций отдельного энантиомера в одном (или обоих) из диастереомерных пар.
[0208] Абсолютную конфигурацию стереоцентров определяют с применением способов, хороню известных специалистам в данной области (например, рентгеновской дифракции, кругового дихроизма). Определение абсолютной конфигурации также может применяться для подтверждения прогнозируемости теоретических моделей и может использоваться для расширения применения этих моделей к подобным молекулам, полученным путем реакций с аналогичными механизмами (например, восстановление кетонов и восстановительное аминирование кетонов гидридами).
[0209] Изобретение также может охватывать стереоизомеры Z-E-типа и их смеси обусловленные заместителями R2-R3 для двойной связи, прямо не связанной с кольцом. Дополнительные Z-E стереоизомеры встречаются в случаях, когда m не равняется l, и m и n отличаются друг от друга. Правила приоритета Кана - Ингольда - Прелога применяют, чтобы определить, являются ли стереоизомеры, обусловленные соответствующей позицией в плоскости двойной связи связанных двойной связью заместителей, Z или Е. Стереоизомер указывается как Z (zusammen = вместе), если 2 группы наивысшего приоритета находятся на одной стороне условной плоскости, проходящей через связь С=С. Другие стереоизомеры указываются как Е (entgegen = напротив). [0210] Смесь стереоизомеров E-Z-типа может быть разделена (и/или охарактеризована) на их компоненты с применением классического способа очистки на основе различий в химико-физических свойств этих соединений. Этот способ включает фракционную кристаллизацию, хроматографию, осуществляемую с применением технологий низкого, среднего или высокого давления, фракционную дистилляцию и любой другой способ, хорошо известный специалистам в данной области.
[0211] Изобретение также включает пролекарства соединений по любой из представленных выше формул, т.е., соединений, которые высвобождают активный медикамент в соответствии с любой из приведенных выше формул in vivo при введении млекопитающему. Пролекарство является фармакологически активным или, в более типичном варианте, неактивным соединением, которое преобразуется в фармакологически активный агент путем метаболического преобразования. Пролекарства соединения по любой из представленных выше формул получают путем модификации функциональных групп, присутствующих в соединении по любой из представленных выше формул, таким образом, чтобы модификации могли быть отщеплены in vivo для высвобождения исходного соединения. In vivo пролекарство легко поддается химическим изменениям в физиологических условиях (например, гидролизируется или подвергается воздействию встречающихся в природе ферментов, в результате чего высвобождается фармакологически активный агент. К пролекарствам относятся соединения по любой из представленных выше формул, в которых гидрокси, амино или карбоксильная группа связана с любой группой, которая может быть отщеплена in vivo для регенерации свободной гидроксильной, амино или карбоксильной группы, соответственно. Примерами пролекарств, помимо прочих, могут быть сложные эфиры (например, ацетатные, формиатные и бензоатные производные) соединений по любой из представленных выше формул или любая другая производная, которая после приведения к физиологическому уровню рН или под действием фермента преобразуется в активный исходный медикамент. Традиционные процедуры отбора и получения соответствующих пролекарственных производных описаны в источниках существующего уровня техники (см., например, Bundgaard. Bundgaard. Design of Prodrugs. Elsevier, 1985).[0212] Пролекарства вводят так же, как и активный ингредиент, в который их преобразуют, или доставляют в форме резервуара, например, трансдермального пластыря или другого резервуара, приспособленного для обеспечения возможности (благодаря ферменту или другому подходящему реагенту) медленного преобразования Пролекарства в активный ингредиент и доставки активного ингредиента в организм пациента.
[0213] Если специально не указано, термин "активный ингредиент" следует понимать как относящийся к соединению по любой из представленных выше формул, как определено в данном документе.
[0214] Изобретение также охватывает метаболиты. "Метаболит" описанного авторами соединения является производной соединения, которая образуется путем превращения соединения при обмене веществ. Термин "активный метаболит" означает биологически активную производную соединения, которая образуется при путем превращения соединения при обмене веществ. Термин "метаболизированный" означает сумму процессов, при которых конкретное вещество изменяется в живом организме. То есть, все соединения, присутствующие в организме, подвергаются воздействию ферментов в пределах организма для извлечения энергии и/или для их удаления из организма. Конкретные ферменты образуют обеспечивают конкретные структурные изменения в соединении. Например, цитохром Р450 катализирует различные окислительные и восстановительные реакции, тогда как уридиндифосфатглюкуронилтрансферазы катализируют перенос молекулы активированной глюкуроновой кислоты в ароматические спирты, алифатические спирты, карбоновые кислоты, амины и свободные сульфгидрильные группы. Дополнительную информацию метаболизме можно получить из публикации The Pharmacological Basis of Therapeutics, 9th Edition, McGraw-Hill (1996), стр. 11-17. Метаболиты описываемых авторами соединений могут распознаваться путем введения соединений в организм-хозяин и анализа образцов ткани хозяина или путем инкубации соединения с гепатоцитами in vitro и анализа полученных в результате соединений. Оба способа хорошо известны специалистам в данной области.
Применение антагонистов сигма-2-рецептора
[0215] В некоторых вариантах реализации изобретение обеспечивает способы ингибирования снижения количества синапсов или отклонений переноса через мембрану, связанных с воздействием на Abeta-видов, путем введения антагониста сигма-2-рецептора. Изобретение также обеспечивает способы лечения снижение когнитивных способностей и/или нейродегенеративного заболевания, например, болезни Альцгеймера или умеренного когнитивного нарушения (MCI) у пациента, включающие введение пациенту описанного авторами антагониста сигма-2, например, из тех, которые охватываются любой из описанных авторами формул, или его фармацевтически приемлемой соли. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования или лечения снижения когнитивных способностей и/или нейродегенеративного заболевания, например, болезни Альцгеймера, включает ингибирование или лечение одного или более симптомов снижения когнитивных способностей, выбранных из группы, к которой относятся потеря памяти, спутанность сознания, помутнение сознания, изменение личности, дезориентация, и потеря языковых навыков. В некоторых вариантах реализации способ включает ингибирование или лечение болезней, нарушений или состояний, опосредованных или связанных с Abeta-олигомерами (см. абзац 002). В некоторых вариантах реализации способ ингибирования или лечения снижения когнитивных способностей и/или а нейродегенеративного заболевания, например, болезни Альцгеймера, включает один или более элементов: (i) восстановление долговременной потенциации (LTP), длительной депрессии (LTD) или синаптической пластичности, которые обнаруживают путем электрофизиологических измерений любого из других неблагоприятных изменений в когнитивной функции, упомянутых в определении указанного термина; и/или (ii) ингибирование или лечение, нейродегенерации; и/или (iii) ингибирование или лечение общего амилоидоза; и/или (iv) ингибирование или лечение одного или более состояний, к которым относятся выработка амилоидов, сборка амилоидов, агрегация амилоидов и связывание амилоидных олигомеров и отложение амилоидов; и/или (v) ингибирование, лечение и/или ослабление действия, в частности, нелетального действия одного или более из Abeta-олигомеров на нейронные клетки. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования, лечения и/или ослабления снижения когнитивных способностей и/или нейродегенеративного заболевания, например, болезни Альцгеймера, включает ингибирование, лечение и/или ослабление одного или более состояний, к которым относятся выработка амилоидов, сборка амилоидов, активность/действие одного или более Abeta-олигомеров на нейронные клетки, агрегация амилоидов, связывание амилоидов и отложение амилоидов. В некоторых вариантах реализации способ ингибирования, лечения и/или ослабления снижение когнитивных способностей и/или нейродегенеративного заболевания, например, болезни Альцгеймера, включает ингибирование, лечение и/или ослабление одного или более видов активности/действия одного или более Abeta-олигомеров на нейронные клетки.
[0216] В некоторых вариантах реализации активность/действие одного или более Abeta-олигомеров на нейронные клетки, агрегацию амилоидов и связывание амилоидов представляет собой действие Abeta-олигомеров на перенос через мембрану или количество синапсов. В некоторых вариантах реализации антагонист сигма-2 ингибирует действие Abeta-олигомеров на перенос через мембрану или количество синапсов или связывание Abeta-олигомеров.
[0217] В некоторых вариантах реализации изобретение обеспечивает способы лечения протеопатического заболевания, связанного с токсичностью Abeta-олигомера, в частности, нелегального действия Abeta-олигомера. В некоторых вариантах реализации способ включает контакт субъекта, страдающего таким протеопатическим заболеванием, с антагонистом сигма-2 согласно изобретению или композицией, содержащей его, которая связывается с сигма-2-рецептором.
[0218] В некоторых вариантах реализации протеопатическое заболевание представляет собой протеопатию ЦНС, которая характеризуется повышением Abeta-белка, например, MCI, синдром Дауна, дегенерация желтого пятна или болезнь Альцгеймера, и т.п.
[0219] В некоторых вариантах реализации изобретение обеспечивает способы лечения одного или более умеренных когнитивных нарушений (MCI) или слабоумия путем введения антагониста сигма-2 в соответствии с изобретением. В некоторых вариантах реализации изобретение обеспечивает способы лечения MCI и слабоумия.
[0220] В некоторых вариантах реализации изобретение обеспечивает способы лечения субъекта антагонистом сигма-2 согласно изобретению для восстановления, полного или частичного, клеток субъекта до нормального фенотипа в связи с функциями, на которые отрицательно воздействуют Abeta-виды, такие, как Abeta-олигомеры. Примерами могут быть такие отклонения, как снижение количества синапсов и нарушения переноса через мембрану, которые могут измеряться различными способами, включая описываемые авторами анализы. Нормальным фенотипом может быть, например, нормальный перенос через мембрану. В некоторых вариантах реализации нормальным фенотипом является нормальная когнитивная способность. "Нормальный" фенотип может определяться путем сравнения результатов субъекта с образцами нормальных субъектов. Образец может представлять всего 1 субъекта или 1 образец может представлять более 10 образцов или субъектов, и нормой является среднее значение, которое рассчитывается на основе показателей нескольких субъектов.
[0221] В некоторых вариантах реализации способ включает введение субъекту, страдающему от снижения когнитивных способностей или от нейродегенеративного заболевания соединения или композиции, которые связываются с белком сигма-2 и ингибируют бета-амилоидную патологию. В некоторых вариантах реализации бета-амилоидной патологией является нарушение переноса через мембрану, снижение количества синапсов, уменьшение количества дендритных шипиков, изменение морфологии дендритного шипика, изменение в LTP, изменение в LTD, нарушения при измерении памяти и обучения у животного, или любая их комбинация и т.п. Вышеупомянутое применение является результатом следующих подтверждений, упомянутых авторами изобретения:
[0222] Оценка поведенческой эффективности: вызванные Abeta-олигомерами нарушения памяти при условно-рефлекторном замирании у мышей является моделью, принятой в лаборатории д-ра Ottavio Arancio из Колумбийского университета (Puzzo 2008). Несколько фармацевтических компаний применяют эту же модель в их исследованиях. Контекстуальное условно-рефлекторное замирание является утвержденной моделью формирования ассоциативной памяти, которая коррелирует с когнитивной функцией человека, в частности, с запоминанием новой информации (Delgado 2006). Abeta-олигомеры вводят путем инъекции в гиппокамп животных дикого типа непосредственно перед кондиционной тренировкой и память оценивают по замиранию через 24 часа. Эта модельная система была выбрана, поскольку внутригиппокампальное введение олигомеров обеспечивает возможность быстрой сравнительной оценки активности соединения и побочной токсичности.
[0223] Соединения также могут испытываться in vivo в двух трансгенных моделях болезни Альцгеймера для демонстрации действия соединения в реверсировании связанной с Abeta-олигомером потерей памяти. Эти поведенческие тесты вместе продемонстрировали, что соединения антагониста сигма-2 вызывают улучшение в обучении и памяти в двух различных поведенческих задачах, с двумя различными моделями болезни Альцгеймера, с обоими полами и после кратковременного или долговременного введения и демонстрируют, что in vitro анализы коррелируют с in vivo активностью.
[0224] Как обсуждается в данном описании, свидетельства указывают на то, что опосредованное Abeta-олигомером снижение экспрессии рецептора поверхности нейронов, которая опосредуется переносом через мембрану, является основой для олигомерного ингибирования электрофизиологических измерений синаптической пластичности (LTP) и, таким образом, обучения и памяти (см. Kamenetz F, Tomita T, Hsieh H. Seabrook G, Borchelt D, Iwatsubo T, Sisodia S, Malinow R. APP processing and synaptic function. Neuron. 2003 Mar 27; 37(6): 925-37; и Hsieh H, Boehm J, Sato C, Iwatsubo T, Tomita T, Sisodia S, Malinow R. AMPAR removal underlies Abeta oligomer-induced synaptic depression and dendritic spine loss. Neuron. 2006 Dec 7; 52(5): 831-43). Измерение изменений скорости переноса через мембрану, вызываемых олигомерами из-за морфологических сдвигов формазана, применяли в линиях клеток для обнаружения блокирующих Abeta-олигомер медикаментов [Maezawa I, Hong HS, Wu HC, Battina SK, Rana S, Iwamoto T, Radke GA, Pettersson E, Martin GM, Hua DH, Jin LW. A novel tricyclic pyrone compound ameliorates cell death associated with intracellular amyloid-beta oligomeric complexes. J Neurochem. 2006 Jul; 98(1): 57-67; Liu Y, Schubert D. Cytotoxic amyloid peptides inhibit cellular 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction by enhancing MTT formazan exocytosis. J Neurochem. 1997 Dec; 69(6): 2285-93; Liu Y, Dargusch R, Banh C, Miller CA, Schubert D. Detecting bioactive amyloid beta peptide species in Alzheimer's disease. J Neurochem. 2004 Nov; 91(3): 648-56; Liu Y, Schubert D. Treating Alzheimer's disease by inactivating bioactive amyloid beta peptide. Curr Alzheimer Res. 2006 Apr; 3(2): 129-35; Rana S, Hong HS, Barrigan L, Jin LW, Hua DH. Syntheses of tricyclic pyrones and pyridinones and protection of Abeta-peptide induced MC65 neuronal cell death. Bioorg Med Chem Lett. 2009 Feb 1; 19(3): 670-4. Epub 2008 Dec 24; и Hong HS, Maezawa I, Budamagunta M, Rana S, Shi A, Vassar R, Liu R, Lam KS, Cheng RH, Hua DH, Voss JC, Jin LW. Candidate anti-Abeta fluorene compounds selected from analogs of amyloid imaging agents. Neurobiol Aging. 2008 Nov 18. (электронная публикация до выхода в печать)] that lower Abeta brain levels in rodents in vivo [Hong HS, Rana S, Barrigan L, Shi A, Zhang Y, Zhou P, Jin LW, Hua DH. Inhibition of Alzheimer's amyloid toxicity with a tricyclic pyrone molecule in vitro and in vivo. J Neurochem. 2009 Feb; 108(4): 1097-1108]. Соответственно, представленные выше испытания обоснованно применяются для распознавания соединений для лечения ранних стадий болезни Альцгеймера и умеренного когнитивного нарушения.
[0225] В некоторых вариантах реализации соединение по любой из представленных выше формул имеет показатель IC50 менее 100 мкМ, 50 мкМ, 20 мкМ, 15 мкМ, 10 мкМ, 5 мкМ, 1 мкМ, 500 нМ, 100 нМ, 50 нМ или 10 нМ по отношению к ингибированию одного или более видов воздействия Abeta-олигомеров на нейроны (такие, как нейроны головного мозга), сборке амилоидов или их разрушению и связыванию амилоидов (включая амилоидным олигомер) и отложению амилоидов. В некоторых вариантах реализации соединение имеет показатель IC50 менее 100 мкМ, 50 мкМ, 20 мкМ, 15 мкМ, 10 мкМ, 5 мкМ, 1 мкМ, 500 нМ, 100 нМ, 50 нМ или 10 нМ по отношению к ингибированию активности/действия Abeta-видов, таких, как олигомеры, на нейроны (такие, как нейроны центральной нервной системы).
[0226] В некоторых вариантах реализации процент ингибирования соединением согласно изобретению одного или более видов воздействия Abeta-видов, таких, как олигомеры, на нейроны (такие, как нейроны головного мозга), таких, как связывание амилоидов (включая амилоидный олигомер) с синапсами и отклонения в переносе через мембрану, опосредованные Abeta-олигомером, измеряли при концентрации от 10 нМ до 10 мкМ. В некоторых вариантах реализации измеренный процент ингибирования составляет от примерно 1% до примерно 20%, от примерно 20% до примерно 50%, от примерно 1% до примерно 50% или от примерно 1% до примерно 80%. Ингибирование оценивают, например, путем подсчета количества синапсов нейрона до или после воздействия бета-амилоидных видов или подсчета количества синапсов в присутствии антагониста сигма-2 и Abeta-видов, причем воздействие антагониста сигма-2 происходит одновременно или до или после воздействия Abeta-видов. В качестве еще одного примера ингибирование оценивают путем определения переноса через мембрану и сравнения одного или более параметров, которые позволяют измерять скорость и степень экзоцитоза, скорость и степень эндоцитоза или другие показатели клеточного метаболизма в присутствии и в отсутствие Abeta-видов и в присутствии и в отсутствие антагониста сигма-2 согласно изобретению. Авторы настоящего изобретения представили данные биохимического анализа, свидетельствующие о том, что соединения согласно изобретению также ингибируют агрегацию амилоидов (данные не показаны).
[0227] В некоторых вариантах реализации описываемые авторами соединения специфично связываются с сигма-2-рецептором. Соединение, специфично связывающееся со специфическим рецептором, означает соединение, отдающее предпочтение одному рецептору перед другим. Например, хотя соединение может быть способно связываться с сигма-1 и сигма-2-рецептором, соединение может определяться как специфичное к сигма-2-рецептору, если оно связывается с аффинностью связывания, которая является по меньшей мере на 10% большей, чем к сигма-1-рецептору. В некоторых вариантах реализации специфичность является по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 200, 300, 400, 500 или 1000% большей в отношении одного партнера по связыванию (например, рецептора), чем в отношении второго партнера по связыванию.
[0228] В некоторых вариантах реализации изобретение обеспечивает способы измерения связанного с бета-амилоидами снижения когнитивных способностей у животного с применением меченого сигма-2-лиганда. В некоторых вариантах реализации способ включает контакт животного с меченым сигма-2-лигандом согласно изобретению и измерение активности или экспрессии сигма-2. В некоторых вариантах реализации способ включает сравнение активности или экспрессии сигма-2 в организме животного с показателем животного с вызванным бета-амилоидами снижением когнитивных способностей. Если активность или экспрессия не отличается от показателя животного с вызванным бета-амилоидами снижением когнитивных способностей, животное считается имеющим тот же уровень снижения когнитивных способностей. Животные могут классифицироваться по подобию в известной активности или экспрессии различных стадий вызванного бета-амилоидами снижения когнитивных способностей. Любой из описываемых авторами сигма-2-лигандов может быть меченым, таким образом, чтобы меченый сигма-2-лиганд мог использоваться in vivo.
[0229] При определении наличия эффективности соединения по любой из представленных выше формул и других соединений, описанных выше как антагонисты сигма-2, в лечении от различных описанных авторами состояний применяют in vitro анализы. In vitro анализы сопоставляют с in vivo эффектом при применении, например. Соединения II, если соединение формул III-IV, имеющее структурное подобие с соединением II, является активным, например, в описываемых авторами in vitro анализах, оно также может применяться in vivo для лечения или ослабления описываемых авторами состояний, включая ингибирование или восполнения потери синапса, модулирование изменений переноса через мембраны в нейронах, защиту от потери памяти или ее восполнение и лечение от состояний, болезней и нарушений, связанных со снижением когнитивных способностей, таких, как MCI и болезнь Альцгеймера. Анализы частично основываются на бета-амилоидных олигомерах и их функцией в связывании с нейронами в синапсах и на воздействии, которое бета-амилоидные олигомеры оказывают на нейроны in vitro. В некоторых вариантах реализации рецептор Abeta-олигомеров в нейронах, который, по мнению авторов изобретения, включает белок сигма-2, приводят в контакт с собранным бета-амилоидом, как описано авторами, и соединение согласно Формуле I, II или III, связывающееся с белком сигма-2, ингибирует связывание собранного бета-амилоида с рецептором. В анализе конкурентного радиолигандного связывания авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что представленные соединения являются специфичными к сигма-2-рецептору. Авторами изобретения также было продемонстрировано, что соединения согласно изобретению ингибируют связывание Abeta-олигомеров с их ранее не распознанным рецептором на поверхности нейронов. В некоторых вариантах реализации предлагаются способы определения эффективности соединения сигма-2-лиганда по любой из представленных выше формул для нейронного сигнала. В некоторых вариантах реализации способ включает контакт клетки, которой, помимо прочих, может быть первичный нейрон, с сигма-2-лигандом и измерения нейронной функции. В некоторых вариантах реализации клетку приводят в контакт in vitro. В некоторых вариантах реализации клетку приводят в контакт in vivo. Нейронная активность может быть сигнальной активностью, электрической активностью, продуцированном или высвобождением синаптических белков и т.п. Антагонист сигма-2, который усиливает или восстанавливает сигнал, определяется как соединение, эффективное для модулирования нейронной активности. В некоторых вариантах реализации клетку берут из патологического образца. В некоторых вариантах реализации клетку берут у субъекта, имеющего нейродегенеративное заболевание. В некоторых вариантах реализации нейродегенеративным заболеванием является MCI или болезнь Альцгеймера, в частности, умеренная болезнь Альцгеймера.
Анализы рецепторного связывания и скрининг соединений
[0230] В некоторых вариантах реализации испытуемое соединение приводят в контакт с клеткой или клеточной мембраной для определения способности испытуемого соединения к связыванию с сигма-2-рецептором. В некоторых вариантах реализации испытуемое соединение растворяют в носителе или основе, к которым, помимо прочих, может относиться диметилсульфоксид. В некоторых вариантах реализации клетки культивируют до слияния. В некоторых вариантах реализации после слияния клетки отделяют путем осторожного соскабливания. В некоторых вариантах реализации клетки отделяют путем трипсинизации или любым другим подходящим способом отделения.
[0231] В некоторых вариантах реализации связывание испытуемого соединения с сигма-2-рецептором определяют, например, путем анализа конкурентного радиолигандного связывания. Анализы радиолигандного связывания могут осуществляться на интактных клетках, стабильно экспрессирующих рецепторы человека, или источнике ткани. Отделенные клетки или ткань, например, промыванию, центрифугируют и/или ресуспендируют в буфере. Испытуемое соединение может быть радиоактивно мечено в соответствии с любым способом, включая, помимо прочих, описываемые авторами. Радиолиганд может применяться в фиксированной концентрации 0,1 мкКи в отсутствие и в присутствии различных концентраций (в диапазоне, например, 1010-103М или 1011-104М конкурирующих медикаментов. Медикаменты добавляют к ткани или клеткам (например, ~50000 клеток) в буфере и оставляют для инкубации. Неспецифическое связывание определяют в присутствии активаторов или ингибиторов широкого спектра или функциональных агонистов или антагонистов для каждого подтипа рецепторов (например, для сигма-рецепторов, в присутствии, например, 10 мкМ соответствующего лиганда для каждого рецептора). Реакции прекращают путем быстрой фильтрации, после которой выполняют двухкратное промывание ледяным буфером. Радиоактивность на высушенных дисках фильтрата может измеряться с применением любого способа, включая, помимо прочих, жидкостно-сцинтилляционный анализатор. Строят кривые вытеснения и значения Ki испытуемых лигандов для подтипов рецептора определяют, например, при помощи программы GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., Сан-Диего, Калифорния). Процент специфического связывания определяют путем деления разницы между общим связыванием (распадов в минуту) и неспецифическим связыванием (распадов в минуту) на общее связывание (распадов в минуту).
[0232] В некоторых вариантах реализации для исследования связывания в линиях клеток или источниках тканей, различные концентрации каждого медикамента добавляли в двух эхкземплярах в каждом эксперименте и отдельные значения IC50 определяли, например, при помощи программы GraphPad Prism. Значение Ki каждого лиганда может определяться согласно уравнению, описанному Cheng and Prusoff (1973), и окончательные данные могут быть представлены как pKi±S.E.M., причем в некоторых вариантах реализации количество испытаний составляет примерно 1-6.
[0233] В некоторых вариантах реализации способ также включает определение, действует ли соединение, связывающееся с сигма-2-рецептором, как функциональный антагонист на сигма-2-рецепторе, путем ингибирования вызванной растворимым Аβ-олигомером нейротоксичности по отношению к ингибированию вызванной растворимым Аβ-олигомером потере синапса и ингибирования вызванного растворимым Аβ-олигомером дефицита в анализе переноса через мембрану. В некоторых вариантах реализации способ также определяет, что антагонист сигма-2-рецептора не влияет на перенос или количество синапсов в отсутствие Abeta-олигомера; не вызывает активности каспазы-3 в нейроне; ингибирует индукцию активности каспазы-3 агонистом сигма-2-рецепторов; и/или снижает нейрональную токсичность в нейронах, вызванную агонистом сигма-2-рецепторов, или защищает от нее.
[0234] Испытание также может включать функциональный анализ для определения воздействия испытуемого соединения на функцию партнера по связыванию, которым, помимо прочих, может быть сигма-2-рецептор. Могут применяться различные стандартные способы анализа. Например, могут применяться способы измерения активности соединений, подобной активности функционального агониста или антагониста, в живых клетках или тканях. К этим способам, помимо прочих, относятся TR-FRET для определения концентрации сАМР и уровня IP1, флуоресценция в реальном времени для контроля кальциевого потока, клеточная диэлектрическая спектроскопия для измерения модуляции импеданса, сужения подвздошной кишки или апоптоза опухолевых клеток. Специфичность испытуемого соединения также может определяться, например, путем определения, связывается ли соединение с сигма-1-рецептором, сигма-2-рецептором, или не связывается ни с одним из них, или связывается с обоими. Способ определения связывания испытуемого соединения с сигма-1-рецептором описывается в публикации Ganapathy, M.E et al. (1999) J. Pharmacol. Exp. Ther., 289: 251-260, включенной в данное описание путем ссылки в полном объеме. Способ определения наличия связывания испытуемого соединения с сигма-1-рецептором описывается в публикации Bowen, W.D et al. (1993) Mol. Neuropharmacol., 3: 117-126, включенной в данное описание путем ссылки в полном объеме, а также Xu, J. et al, Nature Communications, 2011, 2:380 DOI:10.1038/ncomms 1386, которая также включена в данное описание путем ссылки в полном объеме.
[0235] В различных вариантах реализации изобретение обеспечивает протоколы анализов для распознавания селективных, высокоаффинных сигма-2-рецепторных лигандов, которые могут действовать как функциональные антагонисты в сигма-2-рецепторе путем ингибирования вызванной растворимым Аβ-олигомером нейротоксичности по отношению к ингибированию вызванной растворимым Аβ-олигомером потере синапса, которые ингибируют вызванный растворимым Аβ-олигомером дефицит в анализе переноса через мембрану, которые не влияют на перенос или количество синапсов в отсутствие Abeta-олигомера; и демонстрируют хорошие подобные лекарственным свойства, как описано авторами, таким образом, чтобы распознанной таким образом селективное, высокоаффинное соединение антагониста сигма-2-рецептора могло применяться для лечения вызванной растворимым Аβ-олигомером синаптической дисфункции in vivo.
[0236] В некоторых вариантах реализации изобретение обеспечивает способы определения возможности лечения субъекта с применением антагониста сигма-2, когда у субъекта подозревается наличие снижения когнитивных способностей или нейродегенеративного заболевания или другого состояния, болезни или нарушения, как описано авторами. В некоторых вариантах реализации способ включает контакт образца, взятого у пациента, с антагонистом сигма-2 и определение, ингибирует ли или ослабляет ли модулирующее сигма-2 соединение бета-амилоидную патологию, присутствующую в образце, причем образец, демонстрирующий ингибирование или ослабление бета-амилоидной патологии, присутствующей в образце, указывает, что субъект требует лечения с применением антагониста сигма-2.
[0237] Кроме того, изобретение включает способы распознавания антагонистов сигма-2, которые ингибируют вызванное Аβ-олигомером уменьшение количества синапсов и т.п. В некоторых вариантах реализации эти способы применяют для распознавания антагонистов сигма-2 для бета-амилоидной патологии. В некоторых вариантах реализации способы применяют для определения эффективности лечения бета-амилоидной патологии. В некоторых вариантах реализации бета-амилоидной патологией является нарушение переноса через мембрану, синаптическая дисфункция, нарушение памяти и обучаемости у животного, уменьшение количества синапсов, изменение длины дендритного шипика или морфологии шипика, нарушение LTP или повышение фосфорилирования тау-белка.
Бета-амилоиды, применяемые согласно настоящему изобретению
[0238] Человеческий β-амилоид является продуктом расщепления интегрального мембранного белка, амилоидного белка-прекурсора (АРР), сконцентрированного в синапсах нейронов. β-амилоид самоассоциируется для образования метастабильных олигомерных сборок. При высоких концентрациях Abeta полимеризируется и собирается в линейные фибриллы, чему способствует снижение уровня рН. До настоящего времени не выяснено, образуются ли фибриллы из олигомеров. Было продемонстрировано, что β-амилоидные олигомеры вызывают болезнь Альцгеймера в животных моделях путем вызывания изменений в нейронных синапсах, которые блокируют обучение и память, и β-амилоидные фибрилы долгое время связывались с поздними стадиями болезни Альцгеймера у животных и человека. Фактически современная рабочая гипотеза болезни Альцгеймера, которая получила широкую поддержку, состоит в том, что Abeta-сборки, в частности, Abeta-олигомеры, являются ключевым фактором ранней патологии, связанной с болезнью Альцгеймера, а также патологий, связанных с менее серьезными формами слабоумия, такими, как MCI и умеренная БА. Cleary, James P. et al. "Natural oligomers of the amyloid-β protein specifically disrupt cognitive function". Nature Neuroscience Vol. 8 (2005): 79-84; Klyubin, I. et al. "Amyloid beta protein dimer-containing human CSF disrupts synaptic plasticity: prevention by systemic passive immunization." J Neurosci. Vol. 28 (2008): 4231-4237. Однако очень мало известно об образовании олигомеров и о структурном состоянии олигомера. Например, количество β-амилоидных субъединиц, ассоциирующихся для образования олигомера, в данное время неизвестно, как и структурная форма олигомеров, или какие остатки подвергаются воздействию. Существует подтверждение того, что несколько структурных состояний олигомера являются нейроактивными. Reed, Jess D. el al. "MALDI-TOF mass spectrometry of oligomeric food polyphenols". Phytochemistry 66:18 (September 2005): 2248-2263; Cleary, James P. et al. "Natural oligomers of the amyloid-β protein specifically disrupt cognitive function.". Nature Neuroscience Vol. 8 (2005): 79-84.
[0239] β-амилоид обладает аффинностью к многим белкам головного мозга, включая АроЕ и ApoJ. Однако остается невыясненным, образуют ли шапероны или другие белки ассоциации с белком с возможностью воздействия на его конечное структурное состояние и/или его нейроактивность.
[0240] Растворимый Abeta-пептид может играть ключевую роль во время ранних стадий БА путем нарушения синаптической дисфункции и когнитивных процессов. Например, в публикации Origlia et al. продемонстрировано, что растворимый Abeta (Abeta 42) нарушает долговременную потенциацию (LTP) в энторинальной области коры через опосредованную нейронным рецептором для конечных продуктов гликации (RAGE) активацию p38MAPK. См. публикацию Origlia et al. 2008, Receptor for advanced glycation end product-dependnet activation of p38 mitogen-activated protein kinase contributes to amyloid-beta-mediated cortical synaptic dysfunction. J. Neuroscience 28(13): 3521-3530, включенную в это описание путем ссылки.
[0241] Синаптическая дисфункция связана с ранними стадиями болезни Альцгеймера. Было продемонстрировано, что бета-амилоидные пептиды изменяют синаптическую функцию. Puzzo et al. сообщали, что синтетическая фибриллярная форма Abeta нарушает зависящую от синтеза позднего белка фазу LTP, не влияя на фазу синтеза раннего белка. Это сообщение согласуется с более ранними сообщениями о том, что Abeta-олигомеры являются высокотоксичными для клеток и задействованными в синаптической дисфункции. См. публикацию Puzzo et al., 2006, Curr Alzheimer's Res 3(3): 179-183, включенную в это описание путем ссылки. Было обнаружено, что Abeta заметно нарушает гиппокампальную долговременную потенциацию (LTP) через различные каскады передачи сигнала, включая каскад оксида азота. NO/cGMP/cGK/CREB. Puzzo et al., J Neurosci. 2005. В некоторых вариантах реализации изобретение обеспечивает композиции и способы, включающие антагонисты сигма-2-рецептора, для ингибирования вызванной бета-амилоидным олигомером синаптической дисфункции нейронов; и ингибирование подавления долговременной гиппокампальной потенциации, вызванной воздействием па нейроны Abeta-олигомеров.
[0242] Для практического осуществления способов скрининга и анализов согласно изобретению может применяться любая форма β-амилоида, включая β-амилоидные мономеры, олигомеры, фибрилы, а также β-амилоиды, ассоциированные е белками ("белковыми комплексами") и в целом сборки β-амилоидов. Например, в способах скрининга могут применяться различные формы растворимых β-амилоидных олигомеров, как, описывается, например, в Патентной заявке США под регистрационным номером 13/021872; Патентной публикации США 2010/0240868; Международной патентной заявке WO/2004/067561; Международной патентной заявке WO/2010/011947; Патентной публикации США 20070098721; Патентной публикации США 20100209346; Международной патентной заявке WO/2007/005359; Патентной публикации США 20080044356; Патентной публикации США 20070218491; WO/2007/126473; Патентной публикации США 20050074763; Международной патентной заявке WO/2007/126473, Международной патентной заявке WO/2009/048631 и Патентной публикации США 20080044406, Патенте США №7902328 и Патенте США №6218506, включенных в это описание путем ссылки.
[0243] Формы β-амилоидов, включая мономеры или олигомеры β-амилоидов, могут быть получены из любого источника. Например, в некоторых вариантах реализации серийно выпускаемые β-амилоидные мономеры и/или β-амилоидные олигомеры могут применяться в водном рас-пюре, а в других вариантах реализации β-амилоидные мономеры и/или β-амилоидные олигомеры, которые применяются в водном белковом растворе, могут быть выделены и очищены специалистами в данной области с применением любого количества известных способов. В целом β-амилоидные мономеры и/или β-амилоидные олигомеры, применяемые при приготовлении водного раствора белков и β-амилоида согласно различным вариантам осуществления, могут быть растворимыми в водном растворе. Таким образом, и белки водного раствора, и β-амилоид могут быть растворимыми.
[0244] Добавляемый β-амилоид может представлять любую изоформу. Например, в некоторых вариантах реализации β-амилоидные мономеры могут быть β-амилоидами 1-42, а в других вариантах реализации β-амилоидные мономеры могут быть β-амилоидами 1-40. В других вариантах реализации β-амилоид может быть β-амилоидом 1-39 или β-амилоидом 1-41. Таким образом, β-амилоиды различных вариантов осуществления могут охватывать любую С-концевую изоформу β-амилоида. Другие варианты осуществления включают β-амилоид, в котором N-конец был расщеплен, и в некоторых вариантах реализации N-конец любого из вышеописанных С-концевых изомеров β-амилоидов может быть аминокислотой 2, 3, 4, 5 или 6. Например, β-амилоид 1-42 может включать β-амилоид 2-42, β-амилоид 3-42, β-амилоид 4-42 или β-амилоид 5-42 и их смеси, и, подобным образом, β-амилоид 1-40 может включать β-амилоид 2-40, β-амилоид 3-40, β-амилоид 4-40 или β-амилоид 5-40.
[0245] Формы β-амилоидов, применяемые в различных вариантах реализации, могут относиться к дикому типу, т.е., имеющему аминокислотную последовательность, идентичную аминокислотной последовательности β-амилоида, синтезируемого in vivo большинством популяции, или в некоторых вариантах реализации β-амилоид может быть мутантным β-амилоидом. Варианты осуществления не ограничиваются какой-либо конкретной разновидностью мутантного β-амилоида. Например, в некоторых вариантах реализации β-амилоид, включенный в водный раствор, может включать известную мутацию, такую, как, например, β-амилоид, имеющий "Dutch" (E22Q) мутацию или "Arctic" (E22G) мутацию. Такие мутантные мономеры могут включать встречающиеся в природе мутации, такие, как, например, формы β-амилоида, выделенные из популяций субъектов, предрасположенных, например, к болезни Альцгеймера, наследственные формы β-амилоида В других вариантах реализации мутантные β-амилоидные мономеры могут быть получены синтетически путем применения молекулярных технологий для получения мутанта β-амилоида со специфической мутацией. В других вариантах реализации мутантные β-амилоидные мономеры могут включать ранее не распознанные мутации, например, мутанты, находящиеся в случайно образованных мутантах β-амилоида. Термин "β-амилоид" в контексте данного описания охватывает как формы β-амилоида дикого типа, так и любые мутантные формы β-амилоида.
[0246] В некоторых вариантах реализации β-амилоид в водном белковом растворе может представлять одну изоформу. В других вариантах реализации различные С-концевые изоформы β-амилоида и/или различные N-концевые изоформы β-амилоида комбинируют для образования β-амилоидных смесей, которые могут быть предусмотрены в водном белковом растворе. В других вариантах реализации β-амилоид может быть производным амилоидного белка-прекурсора (АРР), который добавляют к белку, содержащему водный раствор, и расщепляют in situ, и такие варианты осуществления, различные изоформы β-амилоида могут содержаться в растворе. Расщепление N-конца и/или удаление С-концевых аминокислот может производиться в водном растворе после добавления β-амилоида. Таким образом, водные растворы, приготовленные, как описано авторами, могут включать различные изоформы β-амилоида даже если изначально к раствору добавляют одну изоформу.
[0247] β-амилоидные мономеры, добавляемые к водному раствору, могут быть выделены из природного источника, такого, как живая ткань, а в других вариантах реализации β-амилоид может быть взят из синтетического источника, такого, как трансгенные мыши или культивированные клетки. В некоторых вариантах реализации формы β-амилоидов, включая мономеры, олигомеры или их комбинации, выделяют из организма нормальных субъектов и/или пациентов, у которых диагностированы снижение когнитивных способностей или связанные с ним болезни, к которым, помимо прочих, относится болезнь Альцгеймера. В некоторых вариантах реализации β-амилоидными мономерами, олигомерами или их комбинациями, являются Abeta-сборки, выделенные из организма нормальных субъектов или пациентов. В некоторых вариантах реализации Abeta-сборки являются высокомолекулярными, например, более 100 кДа. В некоторых вариантах реализации Abeta-сборки имеют среднюю молекулярную массу, например, от 10 до 100 кДа. В некоторых вариантах реализации Abeta-сборки имеют молекулярную массу менее 10 кДа.
[0248] β-амилоидные олигомеры согласно некоторым вариантам осуществления могут состоять из любого количества β-амилоидных мономеров, соответствующих общепринятому определению "олигомер." Например, в некоторых вариантах реализации β-амилоидные олигомеры могут включать от примерно 2 до примерно 300, от примерно 2 до примерно 250, от примерно 2 до примерно 200 β-амилоидных мономеров, а в других вариантах реализации β-амилоидные олигомеры могут включать от примерно 2 до примерно 150, от примерно 2 до примерно 100, от примерно 2 до примерно 50 или от примерно 2 до примерно 25 β-амилоидных мономеров. В некоторых вариантах реализации β-амилоидные олигомеры могут включать 2 или более мономеров. β-амилоидные олигомеры различных вариантов осуществления могут отличаться от β-амилоидных фибрилл и β-амилоидных протофибрилл на основе подтверждения мономеров. В частности, β-амилоидные мономеры β-амилоидных олигомеров в целом являются глобулярными и состоят из β-складчатых листов, тогда как вторичная структура β-амилоидных мономеров фибрилл и протофибрилл представляет собой параллельные β-листы.
Распознавание субъектов с наличием или риском болезни Альцгеймера
[0249] Болезнь Альцгеймера (БА) определяют гистологически по присутствию внеклеточных β-амилоидных (Аβ) бляшек и внутринейронных нейрофибриллярных клубков в коре головного мозга. Специалистам в данной области известны различные диагностические и прогностические биомаркеры, такие, как магнитно-резонансная визуализация, однофотонная эмиссионная томография, FDG PET, PiB PET, CSF-тау и Abeta-анализ, а также имеющиеся данные об их диагностической точности обсуждаются в публикации Alves et al., 2012, Alzheimer's disease: a clinical practice-oriented review, Frontiers in Neurology, April, 2012, vol 3, Article 63, 1-20, которая включена в это описание путем ссылки.
[0250] Диагностированию слабоумия, вместе с прогнозом относительно субъектов у которых предполагается развитие слабоумия, способствует магнитно-резонансная визуализация и позитронно-эмиссионная томография (PET) путем использования [(18)F]фтордеоксиглюкозы (FDG). Эти способы не являются специально разработанными для БА. См., например, Vallabhajosula S. Positron emission tomography radiopharmaceuticals for imaging brain Beta-amyloid. Semin Nucl Med. 2011 Jul; 41(4): 283-99. Другим РЕТ-лигандом, недавно утвержденным FDA для визуализации от умеренных до частых амилоидных сенильных бляшек у пациентов с когнитивным нарушением, является инъекция Florbetapir F 18, (4-((1Е)-2-(6-{2-(2-(2-(18F)фтороэтокси)этокси)этокси}пиридин-3-ил)этенил)-N-метилбензоламин, AMYVID®, Lilly). Флорбетапир специфично связывается с фибриллярным Abeta, но не с нейрофибриллярными клубками. См., например, публикацию Choi SR, et al., Correlation of amyloid PET ligand florbetapir F 18 binding with Aβ aggregation and neuritic plaque deposition in postmortem brain tissue. Alzheimer Dis Assoc Disord. 2012 Jan; 26(1): 8-16. Недостатком РЕТ-лиганда флорбетапира является низкая специфичность по отношению к качественной визуальной оценке РЕТ-сканов. См. Camus et al., 2012, Eur J Nucl Med Mol Imaging 39: 621-631. Однако у многих людей с сенильными бляшками когнитивная функция выглядит в норме.
[0251] К CSF-маркерам для болезни Альцгеймера относятся общий тау-белок, фосфор-тау и Abeta42. См., например, публикацию Andreasen, Sjogren and Blennow, World J Biol Psyciatry, 2003, 4(4): 147-155, включенную в это описание путем ссылки. Сниженный уровень в CSF 42-аминокислотной формы Abeta (Abeta42) и повышенный уровень в CSF общего тау-белка при БА обнаруживали во многих исследованиях. Кроме того, существуют известные генетические маркеры для мутаций в АРР-гене, которые применяются в распознавании субъектов, для которых существует риск развития БА. См., например, публикацию Goate et al., Segregation of a missense mutation in the amyloid precursor protein gene with familial Alzheimer's disease. Nature, 349, 704-706, 1991, включенную в это описание путем ссылки. В вариантах реализации могут применяться любые известные диагностические или прогностические способы для распознавания субъекта с наличием или риском болезни Альцгеймера. Фармацевтические композиции включают антагонист сигма-2-рецептора.
[0252] Обеспечиваемые изобретением соединения антагониста сигма-2-рецептора могут быть введены в скорме фармацевтических композиций. Эти композиции могут быть получены с применением способа, хорошо известного в области фармацевтики, и могут вводиться различными путями, в зависимости от того, требуется ли местное или системное лечение, и от площади, подлежащей лечению.
[0253] Таким образом, еще один вариант осуществления изобретения охватывает фармацевтические композиции, включающие фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество или разбавитель и терапевтически эффективное количество соединения антагониста сигма-2-рецептора согласно изобретению, включая энантиомер, диастереомер, N-оксид или его фармацевтически приемлемую соль.
[0254] Если существует возможность введения соединения в виде нерасфасованного вещества, предпочтение отдается приготовлению активного ингредиента в фармацевтической композиции, в которой, например, активное вещество находится в смеси с фармацевтически приемлемым носителем, выбранным с учетом предусмотренного пути введения и стандартной фармацевтической практики.
[0255] Соответственно, в одном аспекте изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую по меньшей мере одно соединение, антитело или фрагмент по любой из представленных выше формул и другие соединения описанные выше как антагонисты сигма-2-рецептора, или их фармацевтически приемлемые производные (например, соли или сольваты) и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель. В частности, изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую терапевтически эффективное количество по меньшей мере одного соединения по любой из представленных выше формул или его фармацевтически приемлемой производной и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.
Комбинации
[0256] Для композиций и способов согласно изобретению соединение по любой из представленных выше формул и другие соединения, описанные выше как антагонисты сигма-2-рецептора могут применяться в комбинации с другими видами терапии и/или активных веществ.
[0257] В некоторых вариантах реализации соединение антагониста сигма-2 может комбинироваться с одним или более из компонентов, к которым относятся ингибитор холинэстеразы, антагонист глутаматного рецептора типа N-метил-D-аспартата (NMDA), специфичное к бета-амилоиду антитело, ингибитор бета-секретазы 1 (ВАСЕ1, фермент1, расщепляющий по бета-участку белок-прекурсор амилоида), модулятор фактора некроза опухолей альфа (TNF-альфа), внутривенный иммуноглобулин (IVIG) или антагонист белка приона. В некоторых вариантах реализации антагонист сигма-2-рецептора комбинируют с ингибитором холинэстеразы, выбранным из такрина (COGNEX®; Sciele), донепезила (ARICEPT®; Pfizer), ривастигмина (EXELON®; Novartis) или галантамина (RAZADYNE®; Ortho-McNeil-Janssen). В некоторых вариантах реализации антагонист сигма-2-рецептора комбинируют с модулятором TNF-альфа, который является периспинальным этанерцентом (ENBREL®, Amgen/Pfizer). В некоторых вариантах реализации антагонист сигма-2-рецептора комбинируют со специфичным к бета-амилоиду антителом, выбранным из бапинейзумаба (Pfizer), соланезумаба (Lilly), PF-04360365 (Pfizer), GSK933776 (GlaxoSmithKline), Gammagard (Baxter) или Octagam (Octapharma). В некоторых вариантах реализации антагонист сигма-2-рецептора комбинируют е антагонистом рецептора NMDA, которым является мемантин (NAMENDA®; Forest). В некоторых вариантах реализации ингибитором ВАСЕ1 является MK-8931 (Merek). В некоторых вариантах реализации антагонист сигма-2-рецептора комбинируют с IVIG, как описывается в публикациях Magga et al., J Neuroinflam 2010, 7:90, Human intravenous immunoglobulin provides protection against Ab toxicity by multiple mechanisms in a mouse model of Alzheimer's disease, и Whaley et al., 2011, Human Vaccines 7:3, 349-356, Emerging antibody products and Nicotiana manufacturing, каждая из которых включена в это описание путем ссылки. В некоторых вариантах реализации антагонист сигма-2-рецептора комбинируют с антагонистом белка приона, как описывается в публикации Strittmatter et al., US 2010/0291090, включенной в это описание путем ссылки.
[0258] Соответственно, изобретение в еще одном аспекте обеспечивает фармацевтическую композицию, включающую по меньшей мере одно соединение по любой из представленных выше формул или его фармацевтически приемлемую производную, второе активное вещество и, необязательно, фармацевтически приемлемый носитель.
[0259] При комбинировании в одной композиции следует учитывать, что два или больше соединений должны быть устойчивыми и совместимыми друг с другом и другими компонентами состава. При отдельном рецептировании они могут быть предусмотрены в любом удобном составе, желательно известным в данной области способом, предусмотренным для таких соединений.
[0260] В фармацевтической композиции могут быть предусмотрены консерванты, стабилизаторы, красители и даже ароматизаторы. Примерами консервантов могут быть натрия бензоат, аскорбиновая кислота и сложные эфиры п-гидроксибензойной кислоты. Также могут применяться антиоксиданты и суспендирующие агенты.
[0261] По отношению к комбинациям, включающим высокомолекулярные лекарственные средства, такие, как моноклональные антитела или фрагменты, подходящие вспомогательные вещества применяют для предотвращения агрегации и обеспечения стабилизации антитела или фрагмента в растворе с низкой эндотоксичностью, как правило, для парентерального, например, внутривенного, введения. Например, см. публикацию Formulation and Delivery Issues for Monoclonal Antibody Therapeutics, Daugherty el al., Current Trends in Monoclonal Antibody Development and Manufacturing, Part 4, 2010, Springer, New York, стр. 103-129.
[0262] Соединения согласно изобретению перемалывают, применяя известные процедуры размола, такие, как мокрый размол, для получения размера частиц, подходящего для формования таблеток и для других типов составления. Тонко диспергированные (в форме наночастиц) композиции соединений согласно изобретению приготавливают с применением процессов, известных специалистам в данной области. См., например, документ WO 02/00196 (SmithKline Beecham).
Пути введения и единичные лекарственные формы
[0263] Пути введения (доставки), помимо прочих, могут представлять один или более из следующих: пероральный (например, в форме таблетки, капсулы или в качестве проглатываемого раствора), местный, мукозальный (например, в форме назального спрея или аэрозоля для ингаляции), парентеральный (например, с применением инъекционной формы), желудочно-кишечный, интраспинальный, внутрибрюшинный, внутримышечный, внутривенный, интрацеребровентрикулярный или другой способ, обеспечивающий замедленное всасывание, и т.п. Введение антитела или фрагмента, как правило, производится парентеральными средствами.
[0264] Таким образом, к композициям согласно изобретению относятся композиции в форме, специально репетируемой для конкретного режима введения. В некоторых вариантах реализации фармацевтические композиции согласно изобретению рецептируют в форме, подходящей для пероральной доставки. Например, соединение СВ и соединение CF являются соединениями антагониста сигма-2-рецептора, которые являются биодоступными при пероральном введении в животных моделях, вводятся перорально раз в день и демонстрируют эффективность в модели условно-рефлекторного замирания. См., например, Фигуру 12В. Биодоступные при пероральном введении соединения, как описано авторами, могут быть рецептированы в композиции для перорального введения. В некоторых вариантах реализации соединение антагониста сигма-2 является биодоступным при пероральном введении соединением, подходящим для пероральной доставки. В других вариантах реализации фармацевтические композиции согласно изобретению рецептируют в форме, которая является подходящей для парентеральной доставки. В некоторых вариантах реализации соединение антагониста сигма-2-рецептора является антителом или его фрагментом, причем антитело или фрагмент рецептируют в композиции для парентерального введения. Например, антитело против сигма-2-рецептора, такое, как анти-PGRMC1 антитело, которое блокирует связывание Abeta-олигомеров с сигма-2-рецептором, может быть рецептировано для парентеральной доставки.
[0265] Соединения согласно изобретению могут быть рецептированы для введения любым удобным способом для применения в медицине или ветеринарии, и объем изобретения, таким образом, охватывает фармацевтические композиции, включающие соединение согласно изобретению, приспособленное для применения в медицине или ветеринарии. Такие композиции могут быть предназначены для применения традиционным способом при помощи одного или более подходящих носителей. Приемлемые носители для терапевтического применения хорошо известны в области фармацевтики и описываются, например, в публикации Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985). Выбор фармацевтического носителя производят с учетом предусмотренного пути введения и стандартной фармацевтической практики. Фармацевтические композиции могут включать, помимо носителя, любой(ые) подходящий(е) связующее(ие), лубрикант(ы), суспендирующий(е) агент(ы), покрывающий(е) агент(ы) и/или солюбилизирующий(е) агент(ы).
[0266] Могут быть предусмотрены различные требования к составлению / рецептированию в зависимости от различных систем доставки. Следует понимать, что не все соединения должны вводиться одинаковым путем. Подобным образом, если композиция включает больше одного активного компонента, эти компоненты могут вводиться различными путями. Например, фармацевтическая композиция согласно изобретению может быть рецептирована для доставки с применением мининасоса или мукозальным путем, например, в форме назального спрея или аэрозоля для ингаляции или проглатываемого раствора, или парентерально, причем композицию рецептируют с применением инъекционной формы для доставки, например, внутривенным, внутримышечным или подкожным путем. В альтернативном варианте композиция может быть предназначена для доставки различными путями.
[0267] Комбинация предлагаемого авторами соединения и молекулы антитела или фрагмента антитела может быть рецептирована и введена любым из многих путей и вводится в концентрации, которая является терапевтически эффективной при соответствующем показании или с соответствующей целью. Для достижения этой цели антитела могут быть рецептированы с применением различных приемлемых вспомогательных веществ, известных специалистам в данной области. Как правило, антитела вводят путем инъекции, например, внутривенной инъекции. Способы выполнения этого введения известны специалистам в данной области. Например, в публикации Gokarn et al., 2008, J Pharm Sci 97(8): 3051-3066, включенной в это описание путем ссылки, описываются высококонцентрированные самобуферирующиеся композиции антитела. Например, моноклональные антитела в самобуферирующейся композиции, например, при 50 мг/мл mAb в 5,25% сорбита, рН 5,0, или 60 мг/мл mAb в 5% сорбита, 0,01% полисорбата 20, рН 5,2; или традиционных буферных композициях, например, 50 мг/мл mAb1 в 5,25% сорбита, 25 или 50 мМ ацетата, глутамата или сукцината, при рН 5,0; или 60 мг/мл в 10 мМ ацетата или глутамата, 5,25% сорбита, 0,01% полисорбата 20, рН 5,2; могут применяться другие низкоконцентрированные композиции, как известно специалистам в данной области.
[0268] Поскольку предпочтительные соединения антагониста сигма-2-рецептора согласно изобретению преодолевают гематоэнцефалический барьер, их вводят различными способами, включая, например, системный (например, внутривенный, подкожный, пероральный, мукозальный, чрескожный) или локализованные способы (например, внутричерепной). Если соединение согласно изобретению должно доставляться мукозальным путем через желудочно-кишечную слизистую оболочку, оно должно быть способно сохранять устойчивость во время перехода через желудочно-кишечный тракт; например, оно должно быть устойчивым к протеолитическому распаду, стойким при кислотном уровне рН и устойчивым к детергентному воздействию желчи. Например, соединения антагониста сигма-2, выбранные из сигма-2-лигандов и приготовленные для перорального введения, как описано выше, могут быть покрыты слоем кишечнорастворимого покрытия. Материал слоя кишечнорастворимого покрытия может быть диспергирован или растворен в воде или в подходящем органическом растворителе. В качестве полимеров слоя кишечнорастворимого покрытия могут применяться, отдельно или в комбинации, один или более из следующих материалов; например, растворы или дисперсии сополимеров метакриловой кислоты, ацетатфталат целлюлозы, ацетатбутират целлюлозы, фталат гидроксипропилметилцеллюлозы, ацетатсукцинат гидроксипропилметилцеллюлозы, фталат поливинилацетата, ацетат-тримеллитат целлюлозы, карбоксиметилэтилцеллюлоза, шеллак или другие подходящие полимеры для слоя кишечнорастворимого покрытия. Из экологических соображений предпочтение отдастся водному процессу покрытия. В таких водных процессах наиболее предпочтительными являются сополимеры метакриловой кислоты.
[0269] В соответствующих случаях фармацевтические композиции вводят путем ингаляции, с применением кожных пластырей, перорально в форме таблеток, содержащих вспомогательные вещества, такие, как крахмал или лактоза, или в капсулах или овулах, отдельно или в смеси со вспомогательными веществами, или в форме эликсиров, растворов или суспензий, содержащих ароматизаторы или красители, или же вводят парентерально, например внутривенно, внутримышечно или подкожно. Для буккального или сублингвального введения композиции вводят в форме таблеток или пастилок, которые могут быть рецептированы традиционным способом.
[0270] Если композиция согласно изобретению предназначена для парентерального введения, такое введение включает, помимо прочих: внутривенное, внутриартериальное, интратекальное, внутрижелудочковое, внутричерепное, внутримышечное или подкожное введение соединения согласно изобретению; и/или применение технологий инфузии. Антитела или фрагменты, как правило, вводят парентерально, например, внутривенно.
[0271] Фармацевтические композиции, подходящие для инъекции или инфузии, могут быть в форме стерильного водного раствора, дисперсии или стерильного порошка, который содержит активный ингредиент, отрегулированный, в случае необходимости, для получения такого стерильного раствора или дисперсии, подходящих для инфузии или инъекции. Такая композиция необязательно может быть инкапсулирована в липосомы. Во всех случаях готовая композиция должна быть стерильной, жидкой и стойкой в условиях получения и хранения. Для улучшения стойкости при хранении такие композиции могут содержать консервант для предотвращения роста микроорганизмов. Предотвращение действия микроорганизмов может достигаться путем добавления различных антибактериальных и противогрибковых агентов, например, парабена, хлорбутанола или аскорбиновой кислоты. Во многих случаях рекомендуются изотонические вещества, например, сахара, буферы и хлорид натрия, для обеспечения осмотического давления, подобного показателям жидкостей организма, в частности, крови. Пролонгированное всасывание таких инъекционных смесей достигается путем введения замедляющих всасывание агентов, таких, как моностеарат алюминия или желатин.
[0272] Дисперсии приготавливают в жидком носителе или промежуточном соединении, таком, как глицерин, жидкие полиэтиленгликоли, триацетиновые масла и их смеси. Жидкий носитель или промежуточное соединение могут быть растворителем или жидкой диспергирующей средой, которая содержит, например, воду, этанол, полиол (например, глицерин, пропиленгликоль и т.п.), растительные масла, нетоксичные сложные эфиры глицерина и их подходящие смеси. Соответствующая текучесть может поддерживаться путем образования липосом, включения частиц соответствующего размера в случае дисперсий или путем добавления поверхностно-активных веществ.
[0273] Для парентерального введения соединение предпочтительно применяют в форме стерильного водного раствора, который может содержать другие вещества, например, достаточное количество солей или глюкозу для обеспечения изотоничности раствора с кровью. Водные растворы в случае необходимости должны быть соответствующим образом буферированы (предпочтительно до рН от 3 до 9). Приготовление подходящих композиций для парентерального введения в стерильных условиях легко выполняется с применением стандартных фармацевтических технологий, хорошо известных специалистам в данной области.
[0274] Стерильные инъекционные растворы приготавливают путем смешивания соединений формулы I с соответствующим растворителем и одним или более из вышеупомянутых носителей, с последующей стерильной фильтрацией. В случае стерильных порошков, подходящих для получения стерильных инъекционных растворов предпочтительные способы получения включают сушку в вакууме и лиофилизацию, которые обеспечивают порошковые смеси антагонистов сигма-2-рецептора и необходимые вспомогательные вещества для дальнейшего получения стерильных растворов.
[0275] Соединения согласно изобретению могут быть рецептированы для применения в медицине или ветеринарии путем инъекции (например, путем внутривенной болюсной инъекции или инфузии или внутримышечным, подкожным или интратекальным путями) и могут быть представлены в форме стандартной дозы, в ампулах или других вместилищах для стандартных доз, или в многодозовых вместилищах, в случае необходимости с добавлением консерванта. Композиции для инъекций могут быть в форме суспензий, растворов или эмульсий, в масляных или водных основах, и могут содержать вспомогательные вещества, такие, как суспендирующие, стабилизирующие, солюбилизирующие и/или диспергирующие агенты. В альтернативном варианте активный ингредиент может быть в форме стерильного порошка для восстановления перед применением влагосодержания соответствующей основой, например, стерильной, апирогенной водой.
[0276] Соединения согласно изобретению вводят в форме таблеток, капсул, пастилок, овул, эликсиров, растворов или суспензий, для немедленного, задержанного, модифицированного, замедленного, прерывистого или контролируемого высвобождения.
[0277] Соединения согласно изобретению также могут быть представлены для медицинского или ветеринарного применения в форме, подходящей для перорального или буккального введения, например в форме растворов, гелей, сиропов или суспензий, или сухого порошка для восстановления перед применением влагосодержания водой или другой подходящей основой. Также могут применяться твердые композиции, такие, как таблетки, капсулы, пастилки, лепешки, пилюли, шарики, порошки, пасты, гранулы или предварительно приготовленные смеси. Твердые и жидкие композиции для перорального применения приготавливают в соответствии со способами, хорошо известными специалистам в данной области. Такие композиции также могут содержать один или более фармацевтически приемлемых носителей и вспомогательные вещества, которые могут быть в твердой или жидкой форме.
[0278] Таблетки могут содержать вспомогательные вещества, такие, как микрокристаллическая целлюлоза, лактоза, цитрат натрия, карбонат кальция, двухосновный фосфат кальция и глицин, разрыхлители, такие, как крахмал (предпочтительно кукурузный, картофельный или тапиоковый крахмал), натрий крахмал гликолят, кроскармеллоза натрия, и некоторые сложные силикаты и связующие вещества для гранулирования, такие, как поливинилпирролидон, гидроксипропилметилцеллюлоза (НPMC), гидроксипропилцеллюлоза (НРС), сахароза, желатин и камедь.
[0279] Кроме того, могут быть включены лубриканты, такие, как стеарат магния, стеариновая кислота, глицерилбегенат и тальк.
[0280] Композиции могут вводиться перорально, в форме таблеток быстрого или контролируемого высвобождения, микрочастиц, минитаблеток, капсул, саше и растворов или суспензий для перорального введения, или порошков для их получения. Композиции для перорального введения необязательно могут включать различные стандартные фармацевтические носители и вспомогательные вещества, такие, как связующие, наполнители, буферы, лубриканты, глиданты, красители, разрыхлители, отдушки, подсластители, поверхностно-активные вещества, смазывающие вещества для форм, антиадгезивные агенты и покрытия. Некоторые вспомогательные вещества могут выполнять в композициях несколько функций, например, действовать и как связующие, и как рыхлители.
[0281] Примерами фармацевтически приемлемых разрыхлителей для пероральных композиций, применяемых согласно изобретению, помимо прочих, могут быть крахмал, прежелатинизированный крахмал, крахмалгликолят натрия, карбоксиметилцеллюлоза натрия, кроскармеллоза натрия, микрокристаллическая целлюлоза, альгинаты, смолы, поверхностно-активные вещества, шипучие композиции, водные алюмосиликаты и сшитый поливинилпирролидон.
[0282] Примерами фармацевтически приемлемых связующих для пероральных композиций, применяемых согласно настоящему изобретению, помимо прочих, могут быть камедь; производные целлюлозы, такие, как метилцеллюлоза, карбоксиметилцеллюлоза, гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза или гидроксиэтилцеллюлоза; желатин, глюкоза, декстроза, ксилит, полиметакрилаты, поливинилпирролидон, сорбит, крахмал, прежелатинизированный крахмал, трагакант, ксантиновая смола, альгинаты, алюмосиликат магния, полиэтиленгликоль или бентонит.
[0283] Примерами фармацевтически приемлемых наполнителей для пероральных композиций, помимо прочих, могут быть лактоза, ангидролактоза, лактоза моногидрат, сахароза, декстроза, маннит, сорбит, крахмал, целлюлоза (в частности, микрокристаллическая целлюлоза), дигидро- или ангидрофосфат кальция, карбонат кальция и сульфат кальция.
[0284] Примерами фармацевтически приемлемых лубрикантов, применяемых в композициях согласно изобретению, помимо прочих, могут быть стеарат магния, тальк, полиэтиленгликоль, полимеры этиленоксида, лаурилсульфат натрия, лаурилсульфат магния, олеат натрия, стеарилфумарат натрия и коллоидный диоксид кремния.
[0285] Примерами подходящих фармацевтически приемлемых отдушек для пероральных композиций, помимо прочих, могут быть синтетическими ароматизаторами и натуральными ароматическими маслами, такими, как экстракты масел, цветов, плодов (например, банана, яблока, вишни, персика) и их комбинации и другие подобные ароматизаторы. Их применение зависит от многих факторов, самым и важными из которых является органолептическая приемлемость для субъектов, принимающих эти фармацевтические композиции.
[0286] Примерами подходящих фармацевтически приемлемых красителей для пероральных композиций, помимо прочих, могут быть синтетические и натуральные красители, такие, как диоксид титана, бета-каротин и экстракты кожуры грейпфрута.
[0287] При мерами подходящих фармацевтически приемлемых покрытий для пероральных композиций, которые обычно применяют для облегчения глотания, изменения свойств высвобождения, улучшения внешнего вида и/или маскировки вкуса композиций, помимо прочих, могут быть гидроксипропилметилцеллюлоза, гидроксипропилцеллюлоза и сополимеры акрилата-метакрилата.
[0288] Подходящими примерами фармацевтически приемлемых подсластителей для пероральных композиций, помимо прочих, могут быть аспартам, сахарин, сахарин натрия, цикламат натрия, ксилит, маннит, сорбит, лактоза и сахароза.
[0289] Подходящими примерами фармацевтически приемлемых буферов, помимо прочих, могут быть лимонная кислота, цитрат натрия, бикарбонат натрия, двухосновный фосфат натрия, оксид магния, карбонат кальция и гидроксид магния.
[0290] Подходящими примерами фармацевтически приемлемых поверхностно-активных веществ, помимо прочих, могут быть лаурилсульфат натрия и полисорбаты.
[0291] Твердые композиции подобного типа также могут применяться в качестве наполнителей в желатиновых капсулах. К предпочтительным вспомогательным веществам в этом отношении относятся лактоза, крахмал, целлюлоза, молочный сахар или высокомолекулярные полиэтиленгликоли. Для водных суспензий и/или эликсиров агент может комбинироваться с различными подсластителями или ароматизаторами, пигментами или красителями, с эмульгаторами и/или суспендирующими агентами и с разбавителями, такими, как вода, этанол, пропиленгликоль и глицерин и их комбинации.
[0292] Как указано, соединения согласно изобретению могут вводиться интраназально или путем ингаляции и доставляться в форме сухого порошка для ингаляции или аэрозоля из баллона под давлением, насоса, пульверизатора или распылителя с использованием соответствующего газа-вытеснителя, например, дихлородифторометана, трихлорофторометана, дихлоротетрафтороэтана, гидрофтороалкана, такого, как 1,1,1,2-тетрафтороэтан (НРА 134АТ) или 1,1,1,2,3,3,3-гептафторопропан (HFA 227EA), диоксида углерода или другого подходящего газа. В случае аэрозоля под давлением единичная доза может определяться при помощи клапана, для доставки отмеренного количества. Баллон под давлением, насос, пульверизатор или распылитель может содержать раствор или суспензию активного соединения, например, с использованием смеси этанола и газа-вытеснителя в качестве растворителя, который также может содержать лубрикант, например, сорбиттриолеат.
[0293] Капсулы и картриджи (выполненные, например, из желатина) для применения в ингаляторе или инсуфляторе, могут быть составлены таким образом, чтобы содержать порошковую смесь соединения и соответствующую порошковую основу, такую, как лактоза или крахмал.
[0294] Для местного введения путем ингаляции соединения согласно изобретению могут доставляться для применения в медицине или ветеринарии через распылитель.
[0295] Фармацевтические композиции согласно изобретению могут содержать от 0,01 до 99% весовых частей на объем активного материала. Например, для местного введения композиция обычно содержит 0,01-10%, более предпочтительно 0,01-1% активного материала.
[0296] Соединения также могут вводиться в форме липосомальных систем доставки, таких, как малые моноламеллярные везикулы, большие моноламеллярные везикулы и полиламеллярные везикулы. Липосомы могут быть образованы из разных фосфолипидов, таких, как холестерин, стеариламин или фосфатидилхолины.
[0297] Фармацевтическую композицию или единичную лекарственную форму согласно изобретению вводят в соответствии с режимом дозирования и введения, определяемым путем традиционного тестирования с учетом представленных выше рекомендаций с целью достижения оптимальной активности при минимизации токсичности или побочных эффектов для конкретного пациента. Однако такая точная корректировка терапевтического режима является привычной с учетом представленных авторами рекомендаций.
[0298] Дозы соединений согласно изобретению могут быть разными в зависимости от различных факторов, таких, как основные болезненные состояния, состояние здоровья субъекта, вес, пол и возраст и режим введения. Эффективное количество для лечения от нарушения может быть легко определено эмпирическими способами, известными специалистам в данной области, например, путем построения матрицы дозировки и частоты введения и сравнения группы экспериментальных единиц или субъектов в каждой точке матрицы. Точное количество, которое должно вводиться пациенту, может меняться в зависимости от состояния и тяжести нарушения и физического состояния пациента. Измеримое устранение любого симптома или параметра может определяться специалистом в данной области или сообщаться пациентом врачу. Следует понимать, что любое клинически или статистически значимое снижение или устранение любого симптома или параметра нарушений мочевыводящих путей охватывается объемом изобретения. Клинически значимое снижение или устранение означает ощутимое для пациента и/или врача.
[0299] Количество вводимого соединения может составлять от примерно 0,01 до примерно 25 мг/кг/день, обычно от примерно 0,1 до примерно 10 мг/кг/день, чаще всего от 0,2 до примерно 5 мг/кг/день. Следует понимать, что фармацевтические композиции согласно изобретению не обязательно должны содержать полное количество соединения, которое является эффективным для лечения от нарушения, поскольку такое эффективное количество может достигаться путем введения множества раздельных доз таких фармацевтических композиций.
[0300] В предпочтительном варианте реализации изобретения соединения I рецептируют в форме капсул или таблеток, которые обычно содержат от 10 до 200 мг соединений согласно изобретению, и предпочтительно вводят пациенту в общей дневной дозе от 10 до 300 мг, предпочтительно от 20 до 150, наиболее предпочтительно - примерно 50 мг.
[0301] Фармацевтическая композиция для парентерального введения содержит от примерно 0,01% до примерно 100% но массе активного соединения согласно изобретению от 100% массы всей фармацевтической композиции.
[0302] Как правило, дозированные формы для чрескожного введения содержат от примерно 0,01% до примерно 100% по массе активного соединения от 100% общей массы дозированной формы.
[0303] Фармацевтическая композиция или единичная лекарственная форма может вводиться одной дневной дозой, или же общая дневная доза может вводиться раздельными дозами. Кроме того, может быть желательным совместное введение или последовательное введение другого соединения для лечения от нарушения. С этой целью комбинированные действующие вещества рецептируют в простую дозированную единицу.
Синтез соединений
[0304] Соединения формул I и II и их энантиомеры, диастереомеры, N-оксиды и фармацевтически приемлемые соли получают общими способами, описываемыми, например, в заявке WO 2013/029057, включенной в это описание путем ссылки, или как описано далее, причем вышеупомянутые способы составляют еще один аспект изобретения.
[0305] Специалистам в данной области станет понятно, что может возникнуть потребность в применении защищенных производных промежуточных соединений, используемых при приготовлении конечных соединений. Присоединение и снятие защитных групп с функциональных групп выполняют способами, известными специалистам в данной области (см., например, Green and Wuts Protective Groups in Organic Synthesis. John Wiley and Sons, New York, 1999.). Гидрокси- и аминогруппы могут быть защищены любой гидрокси- или аминозащитной группой. Аминозащитные группы могут быть удалены традиционными способами. Например, ацильные группы, такие, как алканоильные, алкоксикарбонильные и арильные группы, могут быть удалены путем сольволиза, например, путем гидролиза в кислотных или основных условиях. Арилметоксикарбонильные группы (например, бензилоксикарбонил) могут расщепляться путем гидрогенолиза в присутствии катализатора, такого, как палладий на активированном угле.
[0306] Синтез заданных соединений выполняют путем удаления любых защитных групп, которые могут присутствовать в предпоследних промежуточных соединениях, с применением стандартных способов, которые хорошо известны специалистам в данной области. Готовые продукты со снятыми защитными группами затем очищают в случае необходимости с применением стандартных технологий, таких, как хроматография на силикагеле, ВЭЖХ на силикагеле и т.п., или путем рекристаллизации.
ПРИМЕРЫ ОБРАБОТКИ И СИНТЕЗА
[0307] В Примерах 1 и 2 описываются препараты Abeta-олигомеров, которые могут применяться для экспериментов, таких, как описываемые авторами. Конкретные препараты, применяемые в переносе через мембрану, и анализы связывания олигомера / снижения синапса, а также те, которые применяются в описываемых ниже in vivo анализах, описываются в примере, к которому они относятся.
Пример 1: Приготовление β-амилоидных олигомеров
[0308] Условия, в которых β-амилоид может олигомеризироваться в нервной ткани, среду водорастворимых белков, с которыми они могут ассоциироваться, создавали для распознавания более связанного с заболеванием структурного состояния β-амилоидных олигомеров и фибрилл. Водорастворимые белки получали из головного мозга крыс путем ультрацентрифугирования. В частности, 5 объемов TBS-буфера (20 мМ Tris-HCL, pH 7,5, 34 мМ NaCl и полную смесь ингибиторов протеаз (Santa Cruz) на грамм ткани мозга добавляли к тканям мозга крыс на льду. Гомогенизацию Даунса осуществляли с использованием плотно пригнанного пестика. Гомогенизированные ткани головного мозга затем центрифугировали при 150000×g в течение 1 часа при 4°С (40000 об/мин Ту65). Инфранатант (под всплывающим миелином и полсантиметра над осадком) затем удаляли и аликвоты замораживали при -75°С. Затем осадок ресуспендировали в TBS до пepвoнaчального объема и замораживали в аликвотном количестве при -75°С. Синтетический мономерный человеческий β-амилоид 1-42 добавляли к этой смеси для обеспечения конечной концентрации 1,5 мкМ β-амилоида и раствор инкубировали в течение 24 часов при 4°С. Центрифугирование смеси при 5800 g в течение 10 минут выполняли для удаления фибриллярных образований, а затем выполняли иммунопреципитацию с применением спин-колонок с конъюгированной агарозой 6Е10 (Pierce Chemical Company) в течение 24 часов при 4°С. Элюированные β-амилоидные олигомеры затем подвергали анализу с применением времяпролетной масс-спектрометрии с лазерной ионизацией и десорбцией из жидкой матрицы для определения содержимого образца.
[0309] β-амилоид самоассоциировался в содержащем белок растворе для образования сборок субъединиц 22599 Да 5-субъединичные пентамеры и 31950 Да 7-субъединичные 7-меры. Другой пик при 49291 Да может представлять 12-субъединичные 12-меры, хотя это может быть неточная молекулярная масса для β-амилоидных 12-меров. Следует заметить, что пики не наблюдаются при 4518 Да или 9036 Да, которые представляют β-амилоидные мономеры и димеры. Однако пики при 9882 Да и 14731 Да могут представлять β-амилоидные димеры, ассоциированные с 786 Да (или 2×393 Да) липидами или белками и β-амилоидные тримеры, ассоциированные с 3×393 Да липидами или белками, соответственно. Кроме того, присутствие пиков при 19686 Да указывает на состояние сборки, которая может включать гримерный комплекс и крысиный β-амилоидный фрагмент 4954 Да. Соответственно, эти данные могут отражать ассоциацию малых липидов или белков с димерами и тримерами β-амилоида, которые могут направлять сборку конформационных состояний, уникальных для физиологических систем.
Пример 2: Приготовление бета-амилоидных олигомеров
[0310] Раствор 1,5 мкМ мономерного человеческого β-амилоида 1-42 в смеси растворимых белков головного мозга крыс инкубировали в течение 24 часов при 4°С, как описывается в Примере 1. Этот раствор затем обрабатывали трифтороэтанолом (TFE) перед получением спектров. В TFE собранные белковые структуры и нековалентно связанные белковые комплексы диссоциируются на денатурированные белки, и пики, ассоциированные с собранными олигомерами должны исчезать. Исчезало большинство белковых пиков, наблюдаемых в Примере 1, включая пики 9822 Да, 14731 Да, 31950 Да и 49291 Да, распознанные ранее. Однако наблюдается лишний пик при 4518 Да, который представляет пик β-амилоидного мономера. Пик при 4954,7 является выраженным и может представлять более длинный abeta-фрагмент, подобный β-амилоиду 1-46. При 7086 Да наблюдается дополнительный пик, который отсутствовал в препарате, описанном в Примере 1, и может представлять β-амилоидные мономеры, ассоциированные с 2550 Да ковалентно связанным белком.
Пример 3: Выделение бета-амилоидных олигомеров из ткани головного мозга человека с БА.
[0311] Растворимые в TBS экстракты: образцы взятых в ходе патологоанатомического исследования тканей головного мозга людей, характеризуемые путем гистопатологического анализа как Соответствующие болезни Альцгеймера (БА) стадии V/VI по Брааку, получали из больничного банка тканей головного мозга. Подобранные по возрасту и полу Образцы ткани с БА и нормальной ткани разбавляли до 0,15 мг ткани/мл в 20 мМ Tris-HCL, 137 мМ NaCl, pH 7,6 содержащем 1 мМ EDTA и 1 мг/мл полной смеси ингибиторов протеаз (Сигма Р8340) и гомогенизировали. Ультрацентрифугирование гомогенатов ткани выполняли при 105000 g в течение 1 часа в ультрацентрифуге Beckman Optima XL-80K. Полученные в результате растворимые в TBS фракции подвергали иммуноистощению с применением агарозных колонок на белке-А и белке-G (Pierce Chemical), а затем фракционировали по размеру при помощи фильтров Amicon Ultra 3, 10 и 100 кДа NMWCO (Millipore Corporation).
[0312] Иммунопреципитация: фракционированные по размеру и иммуноистощенные растворимые в TBS экстракты концентрировали до примерно 200 мкл в соответствующих фильтрах NMWCO Amicon Ultra. Концентрированные растворимые в TBS экстракты разбавляли до 400 мкл TBS-буфером для образца (Pierce Chemical) и центрифугировали в течение 10 минут при 5800 g для удаления фибрилл. Образовавшийся в результате супернатант затем подвергали иммунопреципитации с 6Е10-конъюгированными агарозными шариками в течение суток при 4°С с последующим антигенным элюированием с применением высокоосмотических элюирующих буферов Gentle (Pierce Chemical) для выделения содержащих Abeta образцов белка.
[0313] MALDI-масс-спектрометрия: иммуноизолированный бета-амилоид подвергали масс-спектроскопическому анализу с применением устройства Applied Biosystems (ABI) Voyager DE-Pro MALDI-Tof. Образцы анализировали с использованием различных типов матрицы, таких, как α-циано-4-гидроксикоричная кислота (СНСА), синаповая кислота (SA) или 6-аза-2-тиотимин (АТТ), в зависимости от заданного диапазона молекулярной массы для анализа. Устройство работало в линейном режиме определения положительных ионов с изменяемой задержкой экстракции. Ненакопленные спектры представляли 100 снимков "горячей точки" на каждое обнаружение, тогда как накопленные спектры были представлены 12 отдельными участками каждой точки с 200 лазерными снимками на каждое обнаружение.
[0314] Анализ данных: получение и анализ данных выполняли с применением пакета программ Voyager Data Explorer. Стандартная обработка масс-спектров включала функции сглаживания спектра и вычитание исходного показателя в дополнение к изменениям соотношения сигнала и шума.
[0315ъ ИФА-анализ для количественного определения антитела: подвергнутые иммунопреципитации растворимые в TBS фракции анализировали на "общий" показатель Abeta и концентрацию Abeta-олигомера с применением модифицированной технологии сэндвич-ИФА. В общих чертах, покрытые 6Е10 и 4G8 96-луночные планшеты Nunc MaxiSorp инкубировали с содержащими Abeta образцами, а затем зондировали обнаруживающим биотинилированный 4G8 антителом. Инкубация со стрептавидином-HRP (Rockland) с последующей проявкой тетраметилбензидинового (ТМВ) субстрата обеспечивала возможность колориметрического обнаружения (OD 450) Abeta на устройстве для считывания планшетов BioTEk Synergy HT. Мономерный Abeta 1-42 использовали для построения стандартной кривой, и вместе с программой GEN 5 он позволял определять уровень Abeta в подвергнутых иммунопреципитации образцах.
Пример 4: Анализы рецепторного связывания
[0316] Некоторые соединения испытывают на взаимодействие с несколькими рецепторами путем блокирования связывания или действия их агонистов или антагонистов. Некоторые соединения испытывают, чтобы проверить, взаимодействуют ли они непосредственно с известными клеточными рецепторными или сигнальными белками. Соединения испытывают на их способность к смещению связывания известных агонистов или антагонистов известного рецептора человека, который сверхэкспрессировался в линиях клеток или был выделен из ткани. Соединения также испытывают на их способность к блокированию нисходящего сигнала, вызванного агонистами или антагонистами данного рецептора человека. Соединения испытывают на действие в 100 известных рецепторах, и желательно, чтобы специфическая активность имела место лишь в небольшой подгруппе связанных с ЦНС рецепторов. Соединения, связывающиеся с сигма-2-рецептором с наивысшей аффинностью по сравнению с другими рецепторами, отмечаются как селективные лиганды сигма-2-рецептора.
[0317] С применением того же протокола некоторые соединения, для которых данные перекоса через мембрану представлены в Таблице 2, испытывают на распознавание сигма-2-рецептора. Некоторые предпочтительные соединения Формулы I являются селективными лигандами сигма-2-рецептора, т.е., предпочтительно связываются с сигма-2-рецептором.
[0318] Анализ конкурентного радиолигандного связывания.
[0319] Анализы радиолигандного связывания для сигма-1-рецепторов и сигма-2-рецепторов осуществлялись исследовательской организацией по коммерческому контракту. Для связывания сигма-1 применяли различные концентрации испытуемых соединений от 100 мкМ до 1 нМ для смещения 8 нМ [3Н](+)пентазоцина с эндогенных рецепторов на Мембранах клеток Юркат (Ganapathy ME et al. 1991, J Pharmacol. Exp. Ther. 289: 251-260). Использовали 10 мкМ галоперидола для определения неспецифического связывания. Для сигма-2-рецепторов применяли различные концентрации испытуемых соединений от 100 мкМ до 1 нМ для смещения 5 нМ [3Н] 1,3-ди-(2-толил)гуанидина с эндогенных рецепторов на мембранах из коры мозга крыс в присутствии 300 нМ (+)пентазоцина для маскировки сигма-1-рецепторов. (Bowen WD, et al. 1993, Mol. Neuropharmcol 3: 117-126). Использовали 10 мкМ галоперидола для определения неспецифического связывания. Реакции прекращали путем быстрой фильтрации через фильтры Whatman GF/C с применением сборщика клеток Brandel 12R с последующими двумя промываниями ледяным буфером. Радиоактивность на высушенных дисках фильтрата измеряли с применением жидкостно-сцинтилляционного анализатора (Tri-Carb 2900TR; PerkinElmer Life and Analytical Sciences). Строили кривые смещения и значения Ki испытуемых лигандов для подтипов рецептора определяли при помощи GraphPad Prism (GraphPad Software Inc., San Diego, СА). Процент специфического связывания определяли путем деления разницы между общим связыванием (распадов в минуту) и неспецифическим связыванием (распадов в минуту) на общее связывание (распадов в минуту).
[0320] Данные аффинности к сигма-1 и сигма-2-рецепторам обычно получают в результате опубликованных исследований с использованием гомогенатов мозговой ткани с [3H](+)пентазоцином для измерения смещения с сигма-1-рецепторов и [3Н] 1,3-ди-(2-толил)гуанидином в присутствии 300 нМ (+)пентазоцина для измерения смещения с сигма-2-рецепторов.
[0321] Анализ 2 конкурентного радиолигандного связывания.
[0322] Аффинность потенциальных соединений сигма-2-лиганда в сигма-1 и сигма-2-рецепторах также определяли путем смещения различных известных лигандов сигма-2 или сигма-1. Анализы фильтрации осуществляли в соответствии с ранее опубликованной процедурой (Xu, et al., 2005). Испытуемые соединения растворяли в N,N-диметилформамиде (ДМФА), диметилсульфоксиде (ДМСО) или этаноле, а затем разбавляли в 50 мМ буфера Tris-HCl, pH 7,4, который содержал 150 мМ NaCl и 100 мМ EDTA. Гомогенаты мембран получали из мозга морской свинки для анализа связывания сигма-1 и печени крыс для анализа связывания сигма-2. Гомогенаты мембран разбавляли 50 мМ буфера Tris-HCl, pH 8,0, и инкубировали при 25°С в общем объеме 150 мкл в 96-луночных планшетах с радиолигандом и испытуемыми соединениями с концентрацией от 0,1 нМ до 10 мкМ. После завершения инкубации реакции прекращали путем добавления 150 мкл ледяного промывочного буфера (10 мМ Tris HCl, 150 мМ NaCl, pH 7,4) с применением 96-каналыюй пипетки для переноса (Fisher Scientific, Питтсбург, Пенсильвания) и образцы собирали и быстро фильтровали через 96-луночный стекловолоконный фильтровальный планшет (Millipore, Биллерика, Массачусетс) предварительно пропитанный 100 мкл 50 мМ буфера Tris-HCl. Каждый фильтр промывали четыре раза 200 мкл ледяного промывочного буфера (10 мМ Tris-HCl, 150 мМ NaCl, pH 7,4). Применяли жидкостный сцинтилляционный счетчик Wallac 1450 MicroBeta (Perkin Elmer, Бостон, Массачусетс) для количественного определения связанной радиоактивности.
[0323] Анализы рецепторного связывания сигма-1 выполняли с использованием гомогенатов мембран мозга морской свинки (~300 мкг белка) и ~5 нМ [3Н](+)пентазоцина (34.9 Ки/ммоль, Perkin Elmer, Бостон, Массачусетс), время инкубации составляло 90 мин при комнатной температуре. Неспецифическое связывание определяли по образцам, которые содержали 10 мкМ холодного галоперидола.
[0324] Анализы рецепторного связывания сигма-2 выполняли с использованием гомогенатов мембран печени крыс (~300 мкг белка) и ~2 нМ высокоселективного радиолиганда сигма-2 [только 3H]RHM-1 (без других блокаторов) (America Radiolabeled Chemicals Inc. St. Louis, МО), ~10 нМ [3H]DTG (58,1 Ки/ммоль, Perkin Elmer, Бостон, Массачусетс) или ~10 нМ [3Н]галоперидола (America Radiolabeled Chemicals Inc., St. Louis, МО) в присутствии 1 мкМ (+)-пентазоцина для блокирования сайтов сигма-1, время инкубации составляло 6 минут для [3H]RHM-1, 120 мин для [3H]DTG и [3H]галоперидола при комнатной температуре. Неспецифическое связывание определяли по образцам, которые содержат 10 мкМ холодного галоперидола.
[0325] Данные экспериментов конкурентного ингибирования моделировали с применением анализ нелинейной регрессии для определения концентрации ингибитора, которая ингибирует 50% специфического связывания радиолиганда (показатель IC50). Аффинность связывания, показатели Ki рассчитывали с применением способа Cheng and Prusoff. Значение Kd, используемое для [3H](+)-пентазоцина в мозге морской свинки, составляло 7,89 нМ для [3H]RHM-1 и [3H]DTG в печени крыс - 0,66 нМ и 30,73 нМ, соответственно. Стандартное соединение галоперидол использовали для гарантии качества. Данные об аффинности в сигма-2-рецепторе для типичных соединений согласно Примерам 1-118 показаны в Таблице 2.
[0326] В некоторых вариантах реализации соединения изоиндолина согласно Формуле I и/или Формуле II, обеспечиваемые настоящим изобретением, или их фармацевтически приемлемые соли демонстрируют аффинность связывания Ki с сигма-2-рецептором не более 1000 нМ, не более 750 нМ, не более 500 нМ, не более 250 нМ, не более 100 нМ, не более 50 нМ, не более 25 нМ или не более 10 нМ при испытании в соответствии с предлагаемым авторами протоколом анализа связывания с сигма-2-рецептором.
Пример 5: Потеря памяти у трансгенных мышей: тест Морриса с плаванием
[0327] Выбранные соединения испытывают для определения способности к реверсированию потери памяти, наблюдаемой в модели болезни Альцгеймера на старых трансгенных мышах, при которой с возрастом накапливаются олигомеры. Для этого исследования выбирали мышей hAPP, экспрессирующих человеческие мутации АРР751 Swedish (670/671) и London (717) под контролем мышиного промотора Thy-1. Эти мыши демонстрируют зависимое от возраста увеличение количества Abeta, с появлением бляшек, начиная с 3-6 месяцев, и демонстрируют постоянное нарушение когнитивной функции к 8-месячному возрасту. В этом исследовании вместо профилактики нарушения осуществляли лечение уже устоявшегося нарушения. Эти исследования осуществлялись в соответствии с контрактом на услуги учеными, которым не сообщались условия эксперимента. Испытуемое соединение вливают в дозе 0,5 и 0,1 мг/кг/день в течение одного месяца 8-месячным самкам мышей через подкожный мининасос и когнитивное функционирование испытывают в водном лабиринте Морриса с применением теста на гиппокамнальное пространственное обучение и память. Эта мышиная модель не демонстрирует нейронной потери, поэтому восстановление памяти не может объясняться предотвращением апоптоза.
[0328] Скорость плавания анализируют в рамках измерений по Моррису для того, чтобы определить, существует ли какой-либо двигательный или мотивационный дефект. Основа представляет собой солевую смесь 5% ДМСО/5% Solutol, 90%. Трансгенные животные получают низкую дозу (например, 0,1 мг/кг/день) и высокую дозу (например, 0,5 мг/кг/день) соединений. Определяют средний показатель трех ежедневных испытаний в каждый из четырех последовательных дней. Как правило, в ходе исследования не наблюдается существенных двигательных дефектов или отклонений в поведении, что соответствует уровню смертности ниже ожидаемого для данного возраста. Кроме того, содержат контрольную группу животных, у которой периодически берут образцы крови для наблюдения уровня соединения в плазме.
[0329] Измеряли латентность спасения в ходе водного теста Морриса. Как правило, на второй день испытания наблюдается значительное отличие между животными дикого типа и трансгенными животными, причем животные дикого типа обучаются быстрее, чем трансгенные. Как правило, в этот день наблюдается значительное улучшение показателей у трансгенных животных при более высокой дозе соединения по сравнению с индифферентной основой, поэтому делается вывод, что соединение, вводимое в более высокой дозе, например, 0,5 мг/кг/день, способно улучшить когнитивное функционирование в трансгенных моделях БА.
[0330] Как правило, олигомеры Abeta 42 вызывают примерно 18% увеличение количества синапсов; 100% этой потери могут быть устранены благодаря предпочтительным испытуемым соединениям. Другие антагонисты сигма-2-рецептора также блокируют потерю синапса. Известные из существующего уровня техники лиганды сигма-2-рецептора NE-100 и галоперидол полностью устраняли потерю синапса, тогда как SM-21, селективный лиганд сигма-1, имел слабую активность в устранении потери синапса (20% восстановление).
[0331] Испытуемые соединения также могут испытываться с применением подобного анализа. Соединение (например, 1 мг/кг/день, N=8 или 10 мг/кг/день, N=8) или основа (5% ДМСО/5% Solutol/90% солевого раствора, N=15) системно вводят через подкожную дозу (мининасос Alzet), например, 9-месячным самцам трансгенных мышей hAPPSL (например, N=8) или нетрансгенным однопометникам (например, N=6) в течение 20 дней и пространственное обучение и память этих мышей оценивают в водном лабиринте Морриса. В течение последних четырех дней лечения мышей исследовали на наличие скрытой платформы в трех испытаниях в день. Компьютеризированная система отслеживания автоматически вычисляет латентность спасения или проплытый путь.
[0332] Не существует значительной разницы в показателях трансгенных животных но сравнению с нетрансгенными животными в любой день испытания (анализ, ограниченный этими двумя группами; двухфакторный (генотип и время) ANOVA с повторяемыми измерениями с последующим ретроспективным тестом Бонферрони). Согласно ожиданиям, подобный анализ, ограниченный трансгенными группами (лечение и время), с трансгенными животными получавшими 10 мг/кг/день испытуемого соединения, должен продемонстрировать значительно лучшие показатели у подвергнутых лечению животных но сравнению с получавшими индифферентную основу трансгенными животными после первого дня тестирования при анализе, например, по t-критерию Стьюдента. Ожидается, что животные, получавшие испытуемые соединения, должны демонстрировать улучшенные показатели среди трансгенных животных по сравнению с получавшими индифферентную основу в течение периода испытания.
[0333] Успению испытанные соединения способны реверсировать устоявшиеся поведенческие дефекты обучения и памяти у старых трансгенных животных в зависимости от дозы.
Пример 6: Ингибирование воздействия Abeta-олигомера на нейроны в анализе переноса через мембрану
[0334] Обеспечиваемые согласно изобретению сигма-2-лиганды испытывали на способность к ингибированию действия бета-амилоидов на клетки. Сигма-2-лиганды, как правило, были способны ингибировать бета-амилоидный эффект согласно измерению с применением анализа переноса через мембрану / экзоцитоза (МТТ-анализа). Результаты указаны в Таблице 2. Основной принцип этого анализа был следующим:
[0335] Поскольку на самых ранних стадиях болезни Альцгеймера преобладают синаптические дефекты и нарушения памяти, а не широко распространенная гибель клеток, анализы с измерением этих изменений являются особенно подходящими для обнаружения низкомолекулярных ингибиторов активности олигомеров. Анализ МТТ часто применяют в качестве меры токсичности в культурах. Желтые тетразолиевые соли эндоцитозируются клетками и восстанавливаются до нерастворимого пурпурного формазана в эндосомальном пути. Уровень пурпурного формазана отражает количество активно метаболизирующихся клеток в культуре, а уменьшение количества формазана является мерой гибели клеток или метаболической токсичности в культуре. При наблюдении через микроскоп пурпурный формазан сначала виден во внутриклеточных везикулах, заполняющих клетку. Со временем везикулы экзоцитозируются, и формазан осаждается в виде игольчатых кристаллов на внешней поверхности цитоплазматической мембраны при воздействии на нерастворимый формазан окружающей водной среды. Liu and Schubert ('97) обнаружили, что клетки реагируют на сублетальный уровень Abeta-олигомеров путем выборочного ускорения экзоцитоза восстановленного формазана, тогда как скорость эндоцитоза остается неизменной. Авторы изобретения воспроизвели эти наблюдения в зрелых первичных нейронах в культуре и подсчитали эти морфологические сдвиги при помощи автоматизированной микроскопии и обработки изображений. В этих обстоятельствах не наблюдается общих изменений в общем количестве восстановленного формазана, а просто сдвиг в его морфологии, отражающий изменения в скорости его образования и/или вытеснения из клетки. Авторы изобретения подтвердили более ранние выводы о том, что этот анализ чувствителен к низкому уровню олигомеров, которые не вызывают гибели клеток (Liu and Schubert '04, Hong et al., '07). Действительно, малое количество олигомеров, которые приводят к ингибированию LTP, не ведет к гибели клеток (Tong et al., '04) и не должно вызывать изменений в общем количестве формазана в культуре (или в срезах головного мозга).
[0336] Свидетельства, приведенные другими исследователями, показывают, что опосредованное Abeta-олигомером снижение экспрессии рецептора поверхности нейронов, опосредованное переносом через мембрану, является основой для олигомерное ингибирование электрофизиологических показателей синаптической пластичности (LTP) и, таким образом, обучения и памяти (Kamenetz et al., '03, Hseih et al., '06). Изменения показателей скорости переноса через мембрану, вызванные олигомерами из-за морфологических сдвигов формазана, использовали в линиях клеток для обнаружения блокирующих Abeta-олигомер медикаментов (Maezawa et al., '06, Liu and Schubert '97, '04, '06, Rana et al., '09, Hong et al., '08), которые снижают уровень Abeta в головном мозге грызунов in vivo (Hong et al., '09). Подобные процедуры анализов экзоцитоза / МТТ-анализов описываются в литературе. См., например, Liu Y, et. al., Detecting bioactive amyloid beta peptide species in Alzheimer's disease. J Neurochem. 2004 Nov; 91(3): 648-56; Liu Y, and Schubert D. "Cytotoxic amyloid peptides inhibit cellular 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) reduction by enhancing MTT formazan exocytosis". J Neurochem. 1997 Dec; 69(6): 2285-93; и Liu Y, and Schubert D. "Treating Alzheimer's disease by inactivating bioactive amyloid beta peptide". Curr. Alzheimer Res. 2006 Apr; 3(2): 129-35. Таким образом, этот подход является эффективным.
[0337] Представленный анализ экзоцитоза был приспособлен для применения со зрелыми первичными культурами нейронов, выращиваемых в течение 3 недель in vitro. См. заявку WO 2011/106785, включенную в это описание путем ссылки в полном объеме. Abeta-олигомеры вызывают зависимое от дозы снижение количества внутриклеточных везикул (точек), заполненных восстановленным пурпурным формазаном, согласно измерению путем обработки изображений с применением Cellomics VTI система автоматизированной микроскопии. На микрофотоснимках культивированных нейронов, подвергнутых воздействию только индифферентной основы, видны везикулы, заполненные формазаном; при этом на микрофотоснимке нейрона, подвергнутого воздействию индифферентной основы плюс Abeta-олигомера, видно значительно меньшее количество везикул, заполненных формазаном, зато можно увидеть экзоцитозированный формазан, который при наличии во внеклеточной среде, осаждается в форме кристаллов. Увеличение количества Abeta-олигомеров в итоге приводит к выраженной токсичности. Таким образом, концентрация нейроактивных Abeta-олигомеров, используемых в анализе, является намного меньшей, чем та, которая вызывает гибель клеток. Авторы изобретения подтвердили эффективность анализа, продемонстрировав, что действие Abeta-олигомера блокируется после добавления анти-Abeta антитела, однако само по себе антитело не имеет воздействия (данные не показаны). При такой конфигурации анализ позволяет обнаруживать соединения, которые ингибируют нелегальное действие Abeta-олигомера, независимо от того, действуют ли эти соединения через разрушение олигомеров, ингибирование связывания олигомеров с нейронами или противодействие механизмам действия трансдукции сигнала, вызванной связыванием олигомеров.
[0338] Для достижения результатов применяли способы, представленные ниже в описании анализа переноса через мембрану / экзоцитоза (МТТ).
[0339] Первичные гиппокампальные нейроны эмбрионов крыс Е18 Sprague-Dawley высевали в оптимизированной концентрации в 384-луночных планшетах в NB-среде (Invitrogen). Нейроны держали в культурах в течение 3 недель с подпитыванием NB-среды два раза в неделю путем добавления N2 (Invitrogen). Эти нейроны экспрессируют полный комплемент синаптических белков, характерных для нейронов в зрелом головном мозге, и демонстрируют сложную систему зависимого от активности электрического сигнала. Нейроны и глиальные клетки в таких культурах имеют системы молекулярного сигнала, демонстрирующие отличное совпадение с интактной сетью головного мозга, и поэтому уже более двадцати лет используются в качестве модельной системы обучения и памяти (см., например, Kaech S, Banker G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 2006; 1(5): 2406-15. Epub 2007 Jan 11; См. также Craig AM, Graf ER, Linhoff MW. How to build a central synapse: clues from cell culture. Trends Neurosci. 2006 Jan; 29(1): 8-20. Epub 2005 Dec 7. Review).
[0340] Испытуемое соединение добавляли к клеткам в концентрации от 100 мкМ до 0,001 нМ с последующим добавлением препаратов основы или Abeta-олигомера (общая концентрация белка Abeta 3 мкМ) и инкубировали в течение от 1 до 24 ч при 37°С в 5% СO2. Влагосодержание реагента МТТ бромида (3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия) (Roche Molecular Biochemicals) восстанавливали в фосфатно-буферном растворе до 5 мг/мл. 10 мкл МТТ-метящий реагент добавляют в каждую лунку и инкубируют при 37°С в течение 1 ч, а затем визуализируют. Экзоцитоз определяли путем автоматизированной микроскопии и обработки изображений для подсчета количества эндоцитозированного и экзоцитозированного формазана.
[0341] Каждый аналитический планшет форматировали таким образом, чтобы соединения испытывались с Abeta-олигомером и без него на каждом планшете. Этот план предусматривает удаление токсичных или метаболически активных соединений на ранней стадии каскада скрининга (на первичном уровне). Восстановленный формазан сначала был видимым во внутриклеточных везикулах. Последующий экзоцитоз формазана ускоряли пoд действием Abeta-олигомеров. На Фигуре 1А и 1В показаны примеры микрофотоснимков нейронов, причем первый представляет внутриклеточные везикулы, в которых впервые наблюдается формазан, а второй представляет нейрон, покрытый нерастворимым пурпурным красителем, который был экструдирован путем экзоцитоза. Краситель осаждался в водной среде культуры и образовывал игольчатые кристаллы на поверхности нейрона.
[0342] В присутствии эффективной концентрации активного испытуемого соединения изменения переноса через мембрану блокируются, и клетка не отличается от обработанного основой нейрона. Кроме того, в некоторых случаях этот эффект испытуемого соединения оказывается не зависящим от того, добавляется ли испытуемое соединение до или после воздействия на клетки Abeta-олигомера, что указывает на терапевтический, а также профилактический эффект. Достаточная концентрация активного испытуемого соединения блокирует эффект переноса через мембрану Abeta-олигомера, наблюдаемый в этом анализе. Увеличиваемые дозы селективных высокоаффинных соединений антагонистов сигма-2-рецептора прекращают действие олигомера, и культуры вследствие этого выглядят более похожими на обработанные основной культуры.
[0343] Согласно этим результатам, описанные авторами селективные высокоаффинные соединения антагониста сигма-2-рецептора являются эффективными для ингибирования токсичности Abeta-олигомера и перспективными в качестве терапевтических и (на очень ранних стадиях) профилактических средств при связанном с токсичностью бета-амилоидного олигомера снижении когнитивных способностей, таком, как наблюдаемое при болезни Альцгеймера.
[0344] Дозы синтетических Abeta-олигомеров вводили при анализе переноса через мембрану, и они демонстрировали ЕС50 820 нМ. Каждую концентрацию Abeta испытывали но отношению к нескольким концентрациям каждого селективного высокоаффинного антагониста сигма-2-рецептора в качестве испытуемого соединения. Активные соединения вызывали сдвиг вправо EC50 почти на два порядка величины. При согласовании данных с классическими линейными и нелинейными моделями данные были линейными согласно анализу Шилда (угловой коэффициент Хилла nH 1), что указывает на то, что соединения сигма-2-рецептора демонстрируют настоящую фармакологическую конкуренцию между олигомерами и соединением за мишени, которые опосредуют перенос через мембрану.
[0345] Abeta-олигомеры, взятые из головного мозга пациентов с болезнью Альцгеймера, могут дозироваться в сравнении с испытуемыми соединениями, и ожидается, что воздействие соединения также должно демонстрировать сдвиг вправо. В частности, при эффективных дозах активные испытуемые соединения демонстрируют фармакологическую конкуренцию как с синтетическими, так и с взятыми из организма человека с болезнью Альцгеймера олигомерами. Селективные высокоаффинные соединения антагонистов сигма-2-рецептора в качестве потенциальных медикаментов эффективно снижают синаптотоксичность Abeta-олигомеров. Без привязывания к какой-либо теории простейшим из возможных механизмов действия является действие соединений сигма-2-рецептора в качестве конкурентных антагонистов рецептора.
Экспериментальный контроль:
[0346] Abeta 1-42 олигомеры, полученные в соответствии с опубликованными способами, использовали в качестве положительного контроля. [См., например, Dahlgren et al., "Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability" J Biol Chem. 2002 Aug 30; 277(35): 32046-53. Epub 2002 Jun 10.; LeVine H 3rd. "Alzheimer's beta-peptide oligomer formation at physiologic concentrations" Anal Biochem. 2004 Dec 1; 335(1): 81-90; Shrestha et. al, "Amyloid beta peptide adversely affects spine number and motility in hippocampal neurons" Mol Cell Neurosci. 2006 Nov; 33(3): 274-82. Epub 2006 Sep 8; Puzzo et al., "Amyloid-beta peptide inhibits activation of the nitric oxide/cGMP/cAMP-responsive element-binding protein pathway during hippocampal synaptic plasticity" J Neurosci. 2005 Jul 20; 25(29): 6887-97; Barghorn et al., ""Globular amyloid beta-peptide oligomer - a homogenous and stable neuropathological protein in Alzheimer's disease" J Neurochem. 2005 Nov; 95(3): 834-47. Epub 2005 Aug 31; Johansson et al., Physiochemical characterization of the Alzheimer's disease-related peptides A beta 1-42 Arctic and A beta 1-42 wt. FEBS J. 2006 Jun; 2 73(12): 2618-30], а также Abeta-олигомеры головного мозга (см., например, Walsh et al., Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature (2002). 416, 535-539; Lesne et al., A specific amyloid-beta protein assembly in the brain impairs memory. Nature. 2006 Mar 16; 440(7082): 352-7; Shankar et al, Amyloid-beta protein dimers isolated directly from Alzheimer's brains impair synaptic plasticity and memory. Nat Med. 2008 Aug; 14(8); 837-42. Epub 2008 Jun 22). Следует заметить, что любая композиция Abeta-олигомера может использоваться в этом анализе или в качестве контроля, включая композиции, описываемые в источниках патентной литературы, приведенных выше и включенных путем ссылки в их полном объеме.
[0347] Было продемонстрировано, что различные Abeta-олигомерные композиции вызывают действие Abeta в анализе переноса через мембрану, в особенности включая олигомерные композиции, выделенные из головного мозга пациентов с болезнью Альцгеймера.
[0348] Олигомеры выделяли из гиппокампа или префронтальной коры людей в процессе посмертного вскрытия без применения детергентов, и они ингибировали перенос через мембрану в зависимости от дозы при Kd 6 pMolar. Взятые у пациента с болезнью Альцгеймера Abeta-олигомеры (137 пМ, второй столбик на Фиг. 1J) обеспечивают статистически значимое ингибирование переноса через мембрану по сравнению с основой (первый столбик, Фиг. 1J). Соединение II (третий столбик) устраняет дефицит переноса через мембраны, вызванный взятыми из головного мозга пациентов с БА Abeta-олигомерами, но не влияет на перенос при дозировании в отсутствие Abeta (четвертый, заштрихованный столбик). Усредняют данные 3-х экспериментов (n=3),
[0349] Хотя показатели различных Abeta-олигомерных композиций разнятся (например, природные изоляты болезни Альцгеймера являются более эффективными по сравнению с любыми испытанными синтетическими композициями - данные не представлены), качественно результаты являются одинаковыми: патологиям, опосредованным олигомерами, противодействуют композиции согласно изобретению, включающие соединение антагониста сигма-2-рецептора.
Первичные культуры нейронов
[0350] Оптимальную плотность клеток определяют на основе клеточной реакции на Abeta-олигомеры с применением анализа экзоцитоза для считывания данных и иммуногистохимического анализа соотношения глиальных клеток с нейронами в культурах. Культуры наблюдают еженедельно при помощи иммуногистохимии и количественного определения на основе обработки изображений для отслеживания процента культур с соотношением нейронов и глиальных клеток. Отбраковываются культуры, содержащие более 20% глиальных клеток (положительные на GFAP) относительно нейронов (положительно окрашенные (куриными поликлональными) антителами (Millipore) против МАР2 при 1:5000 (переменная концентрации)) в возрасте отбора 21 день in vitro (21 DIV).
Композиции Abeta-олигомеров
[0351] Человеческий амилоидный пептид 1-42 получали от многих коммерческих поставщиков, таких, как California Peptide, с выбором партии в зависимости от результатов анализа контроля качества. Контроль качества олигомерных композиций состоит из Western-блотов для определения диапазона размеров олигомеров и относительной концентрации и МТТ-анализа для подтверждения ускорения экзоцитоза без токсичности. Токсичность наблюдали в каждом анализе изображений путем количественной оценки ядерной морфологии, которая визуализируется ДНК-связывающим синим красителем DAPI (Invitrogen). Ядра, которые фрагментируются, рассматриваются как пребывающие на поздней стадии апоптоза (Majno and Joris '95), и тест отбраковывается. Партии пептидов, создающие необычный диапазон размеров пептидов или значительную токсичность при стандартной концентрации 1,5 мкМ на нейронах, также отбраковываются.
[0352] Контроль планшетов - оптимизация анализа считалась завершенной, если нереформатированные планшеты достигали минимума статистически значимого двухкратного разделения между обработанными основой и Abeta-олигомером нейронами (р<0,01, t-критерий Стьюдента, неодинаковая дисперсия) на традиционной основе, с коэффициентом вариации между планшетами не более 10%.
Статистическая программа и анализ:
[0353] Обработку и анализ данных выполняли при помощи программы для анализа изображений Cellomics VTI и программы STORE для автоматизированной обработки базы данных. Из-за низкого динамического диапазона и различий между нейронами в разных лунках после трех недель культивирования осуществляют статистические сравнения с применением попарного анализа Тьюки-Крамера для определения значимости отделения между соединением + Abeta-олигомерами от Abeta в отдельности и между соединением в отдельности от основы. Способность зрелых первичных нейронов к большему приближению к электрофизиологически опосредованной системе трансдукции сигнала взрослого головного мозга оправдывает такую методику скрининга. Анализ мощности был предусмотрен для нескольких копий скрининговых лунок, что минимизировало ложноотрицательные результаты (например, N=4). Испытуемые соединения согласно изобретению в значительной степени реверсируют действие Abeta-олигомеров на перенос через мембрану, но сами не влияют на нейронный метаболизм.
[0354] Выбранные соединения согласно Формуле I и/или Формуле II дозировали в описанном авторами МТТ-анализе перед добавлением Abeta-олигомера, и было обнаружено, что они блокируют вызванный Abeta-олигомерами дефицит переноса через мембраны с указанным EC50. В частности, эти результаты показывают, что соединения блокируют / ослабляют активность /действие Abeta-олигомера па перенос через мембрану нейронных клеток в микромолярных концентрациях.
[0355] Комбинированные результаты для соединений Формулы I и/или Формулы II, касающиеся log P, psa 
, переноса через мембрану (мкМ), аффинности к сигма-2-рецептору, микросомальной устойчивости в микросомах печени мышей (MLM) (t1/2, мин), in vitro токсичности калиевых каналов hERG (IC50, нМ) и нейронному фенотипу представлены в Таблице 2.
[0356] Таблица 2: Сигма-2-рецепторные лиганды: липофильность, способность к ингибированию действия амилоидных олигомеров на перенос через мембрану, связывание с сигма-2-рецепторами, микросомальная устойчивость и in vitro токсичность.
NA = данные пока отсутствуют
[0357] Было продемонстрировало, что некоторые соединения в Таблице 2 блокируют вызванное Abeta-олигомерами ускорение экзоцитоза с указанным ЕС50. Соответственно, соединения is Таблице 2 в значительной мере блокировали опосредованные Abeta-oлигомерами изменения в переносе через мембрану. Эти результаты указывают, что соединения блокируют / ослабляют активность / действие Abeta-олигомера на нейронах, и что сигма-2-лиганды могут применяться для вызванных Abeta-олигомером нарушений переноса через мембрану.
[0358] Выбранные соединения из Таблицы 2 дозировали при анализе переноса через мембрану, и было продемонстрировано, что они блокируют вызванные Abeta-олигомерами нарушения переноса через мембрану с указанным EC50. Соответственно, соединения из Таблицы 2 в значительной степени блокировали опосредованные Abeta-олигомерами изменения в переносе через мембрану. Эти результаты показывают, что соединения блокируют / ослабляют активность / действие Abeta-олигомера на нейроны, и лиганды сигма-2-рецептора могут применяться в качестве потенциально эффективных соединений при вызванных Abeta-олигомером нарушений переноса через мембрану.
[0359] В некоторых вариантах реализации предлагаемые авторами соединения изоиндолина согласно Формуле I и/или Формуле II или их фармацевтически приемлемые соли ингибируют вызванный Abeta-олигомерами дефицит переноса через мембраны с ЕС50 не более 20 мкМ, не более 15 мкМ, не более 10 мкМ, не более 5 мкМ, не более 1 мкМ, не более 0,5 мкМ при испытании в соответствии с предусмотренным протоколом анализа переноса через мембрану.
[0360] Поскольку соединения, охватываемые приведенными выше формулами, также являются сигма-2-лигандами, они, таким образом, также могут применяться для блокирования вызванного Abeta-олигомерами ускорения экзоцитоза.
Пример 7. Исследование фармакокинетической и метаболической устойчивости.
[0361] Первое фармакокинетическое исследование выполнялось в микросомах печени мышей, MLM) исследовательской организацией по коммерческому контракту. Исследования выполняли в соответствии с публикацией Obach, R.S et al. (1997) J. Pharmacol. Exp. Ther., 283: 46-58, включенной в это описание путем ссылки. Показатели периода полувыведения (t1/2) соединений в анализе MLM представлены в Таблице 2 и составляют 3-617 минут.
[0362] В некоторых вариантах реализации предлагаемые авторами соединения изоиндолина согласно Формуле I и/или Формуле II или их фармацевтически приемлемые соли демонстрируют период полувыведения (t1/2) в предусмотренном авторами анализе микросом печени мышей (MLM) по меньшей мере 5 минут, по меньшей мере 10 минут, по меньшей мере 25 минут, по меньшей мере 50 минут, по меньшей мере 100 минут или по меньшей мере 200 минут.
[0363] Результаты показывают, что несколько испытанных соединений имели значительно более длительный период полувыведения в микросомах печени мышей. Этот результат предполагает большую биодоступность после перорального введения для этих соединений. Те же соединения испытывали путем вышеописанного анализа переноса через мембрану и по их активности, как указано авторами.
[0364] Если скорость собственного клиренса испытуемого соединения была высокой, это указывает на значительный пресистемный метаболизм. Для улучшения фармакокинетических свойств предусматривались соединения, повышающие метаболическую устойчивость и улучшающие подобные лекарственным свойства. Эксперименты с микросомальной устойчивостью и эксперименты с устойчивостью в плазме выполняли для определения метаболической и печеночной устойчивости потенциально эффективных соединений. В некоторых вариантах реализации in vitro микросомальную устойчивость нормализовали до стандартного соединения СТ010914.
[0365] Второе фармакокинетическое исследование может быть проведено in vivo, и оно включает измерение уровня в плазме и уровня в головном мозге для испытуемых соединений, вводимых различными путями и острым и хроническим способами, как указано ниже:
Оптимизация ВЭЖХ-МС
[0366] Раствор каждого испытуемого соединения приготавливают и вводят путем инфузии в источник спектрометра TSQ Quantum (Fisher Thermo Scientific) через шприцевой насос с неизменной скоростью. Осуществляют МС (масс-спектроскопический) анализ с полным сканированием и генерируют хроматограммы общего ионного тока и соответствующие масс-спектры для каждого испытуемого соединения как в положительном, так и в отрицательном режимах ионизации. Родительские ионы для МС/МС выбирают из положительного или отрицательного масс-спектра в зависимости от соответствующей распространенности ионов. Кроме того, выполняют МС/МС анализ дочерних ионов с целью определения соответствующей выбранной реакции фрагментации для применения в количественном анализе. Конечные параметры контроля реакции выбирают для обеспечения максимальной возможности определения количества испытуемого соединения при наличии в сложной смеси компонентов. После распознавания специфического SRM-перехода, применяемого для каждого испытуемого соединения, параметры обнаружения оптимизируют с применением автоматизированного протокола в рабочей среде TSQ Quantum Compound Optimization. И наконец, хроматографические условия, применяемые для ЖХ-МС-анализа, определяют путем впрыскивания и отделения анализируемого вещества на соответствующей колонке для жидкостной хроматографии и в случае необходимости выполняют регулирование градиентных условий.
Композиция для внутривенного введения:
[0367] Растворимость испытуемого соединения в фосфатно-буферном растворе, рН 7,4 (PBS), сначала определяют путем визуального наблюдения. PBS используют в качестве основы, если соединение является растворимым в заданной концентрации (могут оцениваться другие основы, совместимые с внутривенным введением, если соединение не является полностью растворимым в PBS. К таким основам, помимо прочих, относятся ДМСО, полиэтиленгликоль (ПЭG 400), Solutol HS 15 и Cremophor EL). В описываемых авторами экспериментах внутривенно вводят одноразовую дозу 10 мг/кг испытуемого соединения.
[0368] Композиция для перорального введения: сначала определяют растворимость испытуемого соединения в PBS. PBS используют в качестве основы, если соединение является растворимым в заданной концентрации (применяют ДМСО/Solutol HS 15/PBS (5/5/90, объем/объем/объем) или ДМСО/1% метилцеллюлозы (5/95, объем/объем), если испытуемое соединение не является полностью растворимым в PBS в соответствующей концентрации).
Линейность в плазме
[0369] В аликвоты плазмы в качестве аналитического вещества добавляют испытуемые соединения в указанных концентрациях. Образцы с аналитическим веществом обрабатывают, применяя осаждение ацетонитрилом, и анализируют путем ВЭЖХ-МС или ВЭЖХ-МС/МС. Строят градуировочную кривую зависимости площади под пиком от концентрации. Определяют регистрируемый линейный диапазон анализа, вместе с нижним пределом количественного определения (LLQ).
Количественный биоанализ образцов плазмы
[0370] Образцы плазмы обрабатывают, применяя осаждение ацетонитрилом, и анализируют путем ВЭЖХ-МС или ВЭЖХ-МС/МС. Строили градуировочную кривую плазмы. В аликвоты не содержащей медикамента плазмы в качестве аналитического вещества добавляют испытуемое соединение в указанной концентрации. Образцы плазмы с аналитическим веществом обрабатывают вместе с неизвестными образцами плазмы с применением одной и той же процедуры. Обработанные образцы плазмы (высушенные экстракты) обычно хранят замороженными (-20°С) до анализа ВЭЖХ-МС или ВЭЖХ-МС/МС. Влагосодержание высушенных экстрактов восстанавливают в подходящем растворителе и после центрифугирования анализируют путем ВЭЖХ-МС или ВЭЖХ-МС/МС. Записывают показатели площади под пиками и концентрацию испытуемого соединения в неизвестных образцах плазмы определяют, используя соответствующую градуировочную кривую. Определяют регистрируемый линейный диапазон анализа, имеете с нижним пределом количественного определения (LLQ).
[0371] Животными, используемыми в исследовании, обычно являются самцы мышей C57BL/6 массой 20-30 г каждый или самцы крыс Sprague-Dawley массой 180-250 г. Троих животных подвергали лечению для каждого из условий введения и каждого момента времени, таким образом, чтобы у каждого животного лишь один раз брали образец крови. Подкожное введение соединения осуществляют путем внутрибрюшинной инъекции. Пероральное введение выполняют через желудочный зонд. Внутривенное введение выполняют через яремный катетер.
[0372] После введения соединение в различных концентрациях собирают образцы плазмы, например, через 10, 30, 60, 120, 240, 360, 480 и 1440 мин.
Сбор образцов плазмы у мышей и крыс
[0373] Животных усыпляют при помощи общей ингаляционной анестезии (3% изофлуран) для сбора образцов крови путем сердечной пункции (мыши) или через яремный катетер (крысы). Аликвоты крови (300-400 мкл) собирают в трубки, покрытые литий-гепарином, осторожно смешивают и держат на льду и центрифугируют при 2500×g в течение 15 минут при 4°С в пределах 1 часа после сбора. Затем собирают образцы плазмы и хранят замороженными при -20°С до дальнейшей обработки.
Режим дозировки для животных - In vivo PK - неканюлированные животные, без ограничений в пище
Группа 1: SC, n=3 животных на каждый момент времени (всего 24 животных) или
IV, n=3 животных на каждый момент времени (всего 24 животных)
Группа 2: РО, n=3 животных на каждый момент времени (всего 24 животных)
Группа 3: Контрольные животные (для крови без медикамента), n=5 мышей
У каждого животного берут один образец крови и один образец головного мозга.
[0374] Взятие образцов головного мозга у животных
[0375] Сразу после взятия образца крови животных обезглавливают и головной мозг быстро извлекают, промывают холодным солевым раствором (0,9% NaCl, г/мл), освобождают от поверхностных сосудов, промакивают марлевой сеткой, взвешивают, держат на льду до дальнейшей обработки в пределах одного часа после сбора. Каждый образец головного мозга гомогенизируют в 1,5 мл холодного фосфатно-буферного раствора, рН 7,4 (мыши = 1,5 мл, крысы =) в течение 10 секунд на льду с использованием Power Gen 125. Гомогенат каждого образца головного мозга затем хранят при -20°С до дальнейшей обработки.
Линейность, в образцах головного мозга
[0376] К аликвотам гомогената головного мозга в качестве аналитического вещества добавляют испытуемое соединение в указанных концентрациях. К каждому аликвотному количеству головного мозга добавляют один и тот же объем охлажденного 26% (г/мл) раствора нейтрального декстрана (средняя молекулярная масса 65000-85000 от Sigma, номер но каталогу D-1390) для получения конечной концентрации декстрана 13%. Гомогенат центрифугируют при 54000×g в течение 15 минут при 4°С. Затем супернатанты обрабатывают, применяя осаждение ацетонитрилом, и анализируют с применением ВЭЖХ-МС/МС. Строят градуировочную кривую зависимости пика от концентрации. Определяют регистрируемый линейный диапазон анализа, вместе с нижним пределом количественного определения (LLQ).
[0377] Количественный анализ образцов головного мозга
[0378] К каждому аликвотному количеству гомогената головного мозга добавляют один и тот же объем охлажденного 26% (г/мл) раствор нейтрального декстрана (средняя молекулярная масса 65000-85000 от Sigma, номер по каталогу D-1390) для получения конечной концентрации декстрана 13%. Гомогенат центрифугируют при 54000×g в течение 15 минут при 4°С. Затем супернатанты обрабатывают, применяя осаждение ацетонитрилом, и анализируют с применением ВЭЖХ-МС/МС. Строят градуировочную кривую для образцов головного мозга. К аликвотам не содержащего медикамента гомогената головного мозга в качестве аналитического вещества добавляют испытуемое соединение и указанной концентрации. Образцы гомогената головного мозга с аналитическим веществом обрабатывают вместе с неизвестными образцами гомогената головного мозга с применением одной и той же процедуры. Обработанные образцы головного мозга хранят при -20°С до анализа ЖХ-МС/МС, и в это время записывают значения площади под пиками и концентрацию испытуемого соединения в неизвестных образцах головного мозга определяют с применением соответствующей градуировочной кривой. Регистрируемый линейный диапазон анализа определяли вместе с нижним пределом количественного определения (LLQ).
Проницаемость в головной мозг
[0379) Концентрацию испытуемого соединения в головном мозге (нг/г ткани) и в плазме (нг/мл), а также соотношение концентрации в головном мозге и концентрации в плазме в каждый момент времени определяют при помощи ЖХ-МС/МС и указывают, как описано выше.
Фармакокинетика
[0380] Строят графики зависимости концентрации соединения в плазме от времени. Фундаментальные фармакокинетические параметры соединения после перорального и подкожного введения дозы (AUClast, AUCINF, Т1/2, Tmax и Cmax) получают в результате некомпартментного анализа (NCA) данных плазмы с применением WinNonlin (Pharsight). Некомпартментный анализ не требует принятия конкретной некомпартментной модели для медикамента или метаболита. NCA допускает применение правила трапеций для измерений площади под кривой зависимости концентрации в плазме от времени (Gabrielsson, J. and Weiner, D. Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Data Analysis: Concepts and Applications. Swedish Pharmaceutical Press. 1997).
Определение терминов
[0381] Площадь под кривой (AUC) - мера общего количества неизменного медикамента, который достигает большого круга кровообращения. Площадь под кривой представляет собой геометрический показатель, который рассчитывают путем построения графика зависимости концентрации от времени и сложения возрастающих площадей каждой трапеции.
[0382] WinNonlin включает два способа вычисления площади: линейный метод трапеций и линейно-логарифмический метод трапеций. Поскольку линейный метод трапеций может давать смещенные результаты на нисходящей части кривой зависимости концентрации от времени и завышать AUC, WinNonlin обеспечивает линейно-логарифмический вариант для вычисления AUC. По умолчанию применяют логарифмически-линейный метод хранений для измерения площади после Tmax для остальной части кривой зависимости концентрации в плазме от времени.
[0383] AUClast: площадь под кривой со времени введения дозы до времени последнего наблюдения, которая превышала предел количественного определения.
[0384] AUCINF: площадь под кривой со времени введения дозы, экстраполированная на бесконечность.
[0385] Сmax - максимальная концентрация медикамента в плазме, достигнутая после перорального или отличного от внутривенного введения медикамента между временем введения и конечным наблюдаемым моментом времени.
[0386] Tmax - время при максимальной наблюдаемой концентрации в плазме (Сmax), указываемое в минутах после введения медикамента.
[0387] Т1/2 - период полувыведения в конечной фазе при внутривенном и отличном от внутривенного введении.
[0388] Где лямбда Z (z) является константой скорости первого порядка, связанной с конечной (логарифмически-линейной) частью кривой зависимости концентрации в плазме от времени. Z определяют но линейной регрессии кривой времени и логарифмической концентрации.
[0389] Ожидается, что результаты должны показать, что определенные испытуемые соединения демонстрируют хорошую биодоступность и хорошую способность к проникновению в головной мозг при введении в дозах от 0,1 до 0,5 мг/кг в остром или хроническом режиме (ежедневно в течение 5 дней). Выбранные испытуемые соединения таким способом оценивают на пероральную биодоступность.
Пример 8: Связывание Abeta 1-42 олигомеров и анализ потери синапса
[0390] В этом анализе Abeta-олигомеры приводят в контакт со зрелыми первичными нейронами в культуре и их связывание определяют иммуногистохимическим способом (антитело против Abeta) и количественно измеряют путем обработки изображений. Количество Abeta в нейронных дендритах оценивают путем подсчета количества меченых точек на нейрите. Известно, что Abeta-олигомеры связываются, с насыщением (Kd примерно 400 нМ; Lauren 2009) и с высокой аффинностью, с подгруппой постсинаптических нейронов, присутствующих на значительном проценте (от 30 до 50%) гиппокампальных нейронов в первичных культурах (Lacor et al, 2004; Lambert et al, 2007), и это вполне коррелирует с наблюдениями связывания Abeta в головном мозге пациентов с болезнью Альцгеймера (Lambert et al, 2007). Это мечение связано с синапсами, колокализирующимися с постсинаптическим каркасным белком PSD-95 (Lacor et al., '04). Также известно, что Abeta-олигомеры опосредуют потерю синапса, составляющую 18% в человеческих гиппокампальных нейронах в срезах головного мозга (Schef et al, 2007) и ингибируют долговременную потенциацию (LTP). Количество синапсов также может быть подсчитано в этом анализе иммунофлуорохимическим способом. Описание подобных процедур анализов связывания можно найти в литературе. См., например. Look GC, et. al. Discovery of ADDL--targeting small molecule drugs for Alzheimer's disease. Curr Alzheimer Res. 2007 Dec; 4(5): 562-7. Review.
[0391] Измерение количества Abeta, связанного с поверхностью нейронов, применяют в качестве второго уровня для распознавания соединений, действующих через один или более из следующих механизмов: блокирование действия Abeta путем препятствования связыванию Abeta-олигомера с нейронной поверхностью или выполнения изменений в самих олигомерах (обратный агонизм или диссоциация олигомеров) или изменения поверхностных рецепторов, с которыми связываются олигомеры (аллостерическая модуляция или классический рецепторный антагонизм). Оно также позволяет отличать эти соединения от соединений, действующих на нисходящие сигналы. Соответственно, этот анализ касается болезненных состояний, характеризуемых нелетальным действием Abeta-олигомера на нейроны и составляет часть каскада скрининга, применяемого авторами настоящего изобретения для распознавания клинически релевантных соединений. Выбранные испытуемые соединения, которые активны в анализе переноса через мембрану и в этом анализе связывания / потери синапса, испытывают на активность в двух различных трансгенных моделях болезни Альцгеймера, а также в индуцированной модели. Соответственно, вышеуказанное, а также анализ переноса через мембрану применяют в распознавании клинически релевантных соединений, и они, очевидно, имеют прогностическое значение для in vivo результатов. Прогностическая ценность этого анализа подтверждается демонстрацией его способности к прогнозированию свойств соединения с применением соединений, не охватываемых объемом данного изобретения.
[0392] Первичную культуру гиппокампальных нейронов образуют так же, как и для вышеописанного анализа переноса через мембрану. В планшеты добавляют испытуемое соединение (в концентрации от 10-8 до 30 мкмоль) с последующим добавлением содержащей Abeta 1-42 олигомер композиции в концентрации, позволяющей достигать насыщающего связывания. После предварительной обработки испытуемыми соединениями в течение 1 ч и добавления Abeta-олигомеров или только основы без олигомера осуществляют инкубацию в течение дополнительных 23 ч.
[0393] Планшеты фиксируют 3,7% параформальдегидом в фосфатно-буферном растворе в течение 15 мин. Затем планшеты промывают 3х PBS каждый в течение 5 мин. Планшеты блокируют при комнатной температуре в течение 1 ч в 5% сыворотке козы и 0,5% Triton Х-100 в PBS. Первичные антитела (поликлональное против MAP 2, Millipore №АВ5622, и моноклональное против бета-амилоида 6Е10, Covance №SIG-39300, при 1 мкг/мл, и поликлональное антитело кролика против синаптофизина, Anaspec, при 0,2 мкг/мл) разбавляют 1:1000 в 5% сыворотке козы с использованием PBS. Первичные антитела инкубируют в течение суток при 4°С. Затем планшеты промывают 3× PBS каждый в течение 5 мин. Вторичные антитела (поликлональное Alex Flor 488, Invitrogen №А11008, и моноклональное Alexa Flor 647, Invitrogen №А21235) разбавляют 1:1000 в 5% сыворотке козы с использованием PBS. Вторичные антитела инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч. Планшеты промывают один раз PBS. Затем вносят DAPI (4',6-диамидино-2-фенилиндол, Invitrogen) в количестве 0,03 мкг/мкл и инкубируют при комнатной температуре в течение 5 мин и промывают PBS.
[0394] Ожидается, что результаты должны продемонстрировать, что Abeta-олигомер, приготовленный, как подробно описано ниже, и вводимый в количестве 3 или 1 мкМ, в зависимости от применяемой композиции, связанный с нейронами в синапсах, обнаруживается красным красителем. Было обнаружено, что у людей с ранней болезнью Альцгеймера количество синапсов в гиппокампе снижается на 18% по сравнению с подобранными по возрасту субъектами с нормальной когнитивной функцией (Scheff et al., '07), и этот результат также может быть визуализирован в этом анализе через 20% регрессию флуоресцентных точек и, таким образом, количества синапсов. Ожидается, что при одновременном присутствии выбранного испытуемого соединения связывание Abeta должно снижаться фактически до контрольного уровня, и зеленая флуоресценция остается неизменной, что указывает на неуменьшенное количество синапсов. Abeta 42 олигомеры связываются с постсинаптическими шипиками; и метятся синаптофизином в первичных нейронах. Ожидается, что постсинаптические шипики и синапсы должны обнаруживаться на контрольном уровне при добавлении к культуре эффективного количества предпочтительного испытуемого соединения. Abeta 42 олигомеры, добавляемые отдельно, вызывают 20% снижение плотности синаптофизиновых точек через 24 ч сравнению с используемой отдельно основой. Эта потеря реверсируется эффективным количеством предпочтительного испытуемого соединения. В отсутствие Abeta-олигомера предпочтительное испытуемое соединение не влияет на количество синапсов, и оно остается на уровне, сравнимом с контрольным (только основа). Ожидается, что интенсивность связывания Abeta, вычисляемая по точкам Abeta, должна снижаться примерно па 18% в присутствии эффективного количества испытуемого соединения, однако это снижение является достаточным для того, чтобы количество синапсов достигло контрольного уровня в присутствии этого соединения.
[0395] Кроме того, ожидается что точечное связывание синаптического Abeta-олигомера должно снижаться примерно на 38% в присутствии определенных испытуемых соединений в зависимости от концентрации. Гистограмма интенсивности точек обнаруживает, что популяция нормального бимодального связывания (нейроны с яркими точками и популяция с менее яркими точками) сдвигается влево в присутствии медикамента (данные не показаны). Сообщается, что частичное ингибирование связывания Abeta-олигомера восстанавливает 100% функции LTP (Strittmatter SM et al., Cellular Prion Protein Mediates Impairment of Synaptic Plasticity by Amyloid-Beta Oligomers Nature (2009) 457 (7233: 1128-32)).
[0396] Abeta-олигомер вызывает 20% снижение плотности синаптофизиновых точек через 24 ч по сравнению с обработкой основой (первый столбик), которая реверсируется эффективным количеством испытуемого соединения. См., например, заявку WO 2013/029060, включенную в это описание путем ссылки.
[0397] Желательно, чтобы в отсутствие Abeta испытуемое соединение не влияло на количество синапсов. Abeta-олигомеры вызывает 18,2% уменьшение количества синапсов; 100% этой потери устраняется эффективным количеством предпочтительного испытуемого соединения.
[0398] Ядра, визуализированные DAPI, демонстрируют нормальную морфологию, указывая на отсутствие нейродегенерации. Процедуру выполняют с испытуемыми соединениями, выбранными из тех, которые охватываются Формулой I и/или II.
Приготовление Abeta-олигомера:
[0399] Человеческий амилоидный пептид 1-42 получают из пептида California, с выбором партии, который зависит от анализа контроля качества. Abeta 1-42 олигомеры получают в соответствии с опубликованными способами, как описано выше [см., например, Dahlgren et al., "Oligomeric and fibrillar species of amyloid-beta peptides differentially affect neuronal viability" J Biol Chem. 2002 Aug 30; 277(35): 32046-53. Epub 2002 Jun 10.; LeVine H 3rd. "Alzheimer's beta-peptide oligomer formation at physiologic concentrations" Anal Biochem. 2004 Dec 1; 335(1): 81-90; Shrestha et. al, Amyloid beta peptide adversely affects spine number and motility in hippocampal neurons" Mol Cell Neurosci. 2006 Nov; 33(3): 274-82. Epub 2006 Sep 8; Puzzo et al., "Amyloid-beta peptide inhibits activation of the nitric oxide/cGMP/cAMP-responsive element-binding protein pathway during hippocampal synaptic plasticity" J Neurosci. 2005 Jul 20; 25(29): 6887-97; Barghorn et al., "Globular amyloid beta-peptide oligomer - a homogenous and stable neuropathological protein in Alzheimer's disease" J Neurochem. 2005 Nov; 95(3): 834-47. Epub 2005 Aug 31; Johansson et al., Physiochemical characterization of the Alzheimer's disease-related peptides A beta 1-42 Arctic and A beta 1-42 wt. FEBS J. 2006 Jun; 2 73(12): 2618-30], а также взятые из головного мозга Abeta-олигомеры (см., например, Walsh et al., Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal long-term potentiation in vivo. Nature (2002). 416, 535-539; Lesne et al., A specific amyloid-beta protein assembly in the brain impairs memory. Nature. 2006 Mar 16; 440(7082): 352-7; Shankar et al. Amyloid-beta protein dimers isolated directly from Alzheimer's brains impair synaptic plasticity and memory. Nat Med. 2008 Aug; 14(8): 837-42. Epub 2008 Jun 22). Контроль качества для композиций олигомеров состоит из вестерн-блоттингов для определения диапазона размеров олигомера и относительной концентрации и МТТ-анализа для подтверждения ускорения экзоцитоза без токсичности. Токсичность наблюдают в каждом анализе изображений путем количественной оценки ядерной морфологии, которая визуализируется ДНК-связывающим красителем DAPI (Invitrogen). Ядра, которые фрагментируются, рассматриваются как пребывающие на поздней стадии апоптоза и из теста исключаются (Majno and Joris Apoptosis, oncosis, and necrosis. An overview of cell death. Am J Pathol 1995; 146: 3-16). Партии пептида, образующие непривычный диапазон размеров пептида или значительную токсичность при стандартных концентрациях на нейронах, отбраковываются.
Контроль
[0400] Предварительное поглощение антитела против Abeta 6E10 композицией олигомера ингибирует связывание синапса в зависимости от дозы (при 7,84×10-6) и применяется в качестве положительного контроля. Антитело применяют в пропорции 1:1000 (1 мкг/мл). Для анализа потери синапса применяют антагонист NMDA дизоцилпин (MK-801) в качестве положительного контроля в количестве 80 мкМ.
Обработка изображений
[0401] Изображения получают и анализируют при помощи платформы для автоматизированного микроскопа Cellomics VTI с применением алгоритма Neuronal Profiling. Для статистического анализа применяют Критерий попарного сравнения Тьюки-Крамера с неодинаковой дисперсией.
Вестерн-блоттинг
[0402] Образны, содержащие Abeta 1-42, разбавляют (1:5) в невосстанавливающем маркирующем буфере для образца (Pierce №1859594). Образец 30 мкл размещают в восемнадцати лунках с готовым 4-15% гелем Tris-HCl (BIORAD №345-0028). Электрофорез выполняют в системе готового геля BIO-RAD Criterian с применением трис-глицинового буфера при 125 В в течение 90 минут. Гели блотируют на 0,2 мкМ нитроцеллюлозные мембраны в буфере из трис-глицина / 10% метанола при 30 В в течение 120 минут. Мембраны кипятят в течение 5 минут в растворе PBS и блокируют в течение суток раствором TBS / 5% молока при 4°С. Мембрану зондируют с использованием 6E10-HRP (Covance №SIG-39345), разведенного до 10 мкг/мл в растворе TBS/1% молока в течение одного часа при комнатной температуре. Мембрану трижды промывают и течение 40 минут каждый раз раствором TBS/0,05% tween-20 и проявляют реагентом ECL (BIO-RAD №162-0112) в течение 5 минут. Получение изображения выполняют на системе количественной визуализации Alpha Innotech FluorChem Q и анализируют при помощи программы AlphaView Q.
Активность
[0403] Ожидается, что предпочтительные испытуемые соединения должны демонстрировать частичное блокирование связывания лиганда Abeta-олигомера с нейронами примерно на 25% согласно анализу связывания (с применением алгоритма обработки изображений).
Пример 9: Анализ условно-рефлекторного замирания
[0404] Выбранные испытуемые соединения испытывают на животной модели зависящей от памяти поведенческой задачи, известной как условно-рефлекторное замирание. Протокол исследования составляли на основе опубликованных протоколов (см., например, Puzzo D, Privitera L, Leznik E, 
M, Staniszewski A, Palmeri A, Arancio О. Picomolar amyloid-beta positively modulates synaptic plasticity and memory in hippocampus. J Neurosci. 2008 Dec 31; 28(53): 14537-45.). Формирование контекстной памяти зависит от целостности структур медиальной височной доли, таких, как гиппокамп. В этом анализе мышей учат запоминать, что конкретный выраженная ситуация (условный раздражитель; CS) связана с вызывающим отвращение событием, в данном случае - умеренным электроболевым раздражением лап (безусловным раздражителем, БР). Животные с хорошей обучаемостью демонстрируют увеличенное замирание при повторном помещении в ту же ситуацию. Это замирание отсутствует в новой ситуации. Увеличенное замирание в ситуации указывает на зависящее от гиппокампа формирование памяти у животных. Память, исследуемая с применением условно-рефлекторного замирания, чувствительна к повышению растворимого Аβ. Соединение II было эффективным в прекращении опосредованного Abeta-олигомером действия на перенос через мембрану. Ожидается, что при введении животным перед введением Abeta-олигомера предпочтительное испытуемое соединение должно блокировать действие олигомера на память в зависимости от дозы.
[0405] Предпочтение среди испытуемых соединений отдается тем, которые способны устранять вызванные Abeta-олигомерами нарушения памяти, но не влияют на память при отдельном введении. Эта поведенческая эффективность демонстрирует, что анализ переноса через мембрану позволяет прогнозировать, какие соединения будут эффективны для лечения потери поведенческой памяти, вызванной олигомерами. Модель условно-рефлекторного замирания для памяти выполняли, как описано авторами. Желательно, чтобы ни при одной дозе не наблюдалось отрицательных изменений в поведении. Соответственно, существует корреляция между характеристиками этого соединения в анализе переноса через мембрану и его характеристиками в анализе условно-рефлекторного замирания, причем последние являются показателем потери памяти. Предполагается, что предлагаемые авторами соединения изоиндолина должны быть активными при анализе условно-рефлекторного замирания и, таким образом, должны продемонстрировать свою эффективность в лечении потери памяти. Корреляция между характеристиками соединения в модели условно-рефлекторного замирания и его эффективности в лечении от потери памяти была установлена в литературе. (Delgado MR, Olsson A, Phelps EA. "Extending animal models of fear conditioning to humans" Biol. Psychol. 2006 Jul; 73(1): 39-48).
Пример 10. Авторадиографические исследования посмертных образцов головного мозга крыс, макак-резусов и человека.
[0406] Исследование авторадиографических изображений на неврологический и фармакологический профиль рецепторных лигандов сигма-2 и сигма-1 проводят с применением модификации протокола, ранее описанного в публикации Xu et al., 2010. Xu, J., Hassanzadeh В, Chu W, Tu Z, Vangveravong S, .Tones LA, Leudtke RR, Perlmutter JS, Mintun MA, Mach RH. [3H]4-(Dimethylamino)-N-[4-(4-(2-methoxyphenyl)piperazin-1-yl)bulyl]benzamide, a selective radioligand for dopamine D(3) receptors. II. Quantitative analysis of dopamine D3 and D2 receptor density ratio in the caudate-putamen. Synapse 64: 449-159 (2010), включенной в это описание путем ссылки. Меченый RHM-1 получали с применением способа согласно публикации Xu J, Tu Z, Jones LA, Wheeler KT, Mach RH. [3H]N-[4-(3,4-dihydro-6,7-dimethoxyisoquinolin-2(1H)-yl)butyl]-2-methoxy-5-methylbenzamide: a Novel Sigma-2 Receptor Probe. Eur. J. Pharmacol. 525: 8-17 (2005), включенной в это описание путем ссылки.
[0407] Посмертные срезы головного мозга толщиной 20 мкМ, взятые у крыс, макак-резусов и человека выполняют с применением замораживающего микротома Microm и закрепляют на предметных стеклах SuperFrost Plus (Fisher Scientific, Питсбург, Пенсильвания) и в этом исследовании используют последовательные срезы участков коры и гиппокампа головного мозга. Срезы головного мозга инкубируют с 5 нМ [3Н](+)-пентазоцина на профиль сигма-1-рецептора, 4 нМ [3H]RHM-1 только для характеризации сигма-2-рецептора, 10 нМ [3H]DTG и [3H]галоперидола в присутствии блока сигма-1-рецептора (+)-пентазоцина для визуализации распределения сигма-2-рецептора; после инкубации с радиолигандами в течение 30 минут содержащие срезы головного мозга предметные стекла промывают 5 раз ледяным буфером, каждый раз в течение одной минуты.
[0408] Предметные стекла сушат и придают им проводимость путем покрытия медной фольговой лентой на свободной стороне, а затем помещают в газовую камеру [смесь аргона и триэтиламина (Sigma-Aldrich, США)] газового детектора. Beta Imager 2000Z Digital Beta Imaging System (Biospace, Франция). После надлежащего смешивания газа и достижения гомогенного состояния подвергают дальнейшему воздействию от 24 часов до 48 часов до появления высококачественных изображений. Одновременно в качестве контроля подсчитывают [3H]Microscale (American Radiolabeled Chemicals, Inc., St. Louis, МО) для количественного анализа общей радиоактивности, т.е., для преобразования ц/мин/мм2 в нКи/мг ткани. Количественный анализ выполняют с применением программы Beta-Image Plus (BioSpace, Франция) для исследуемых анатомических участков (ROI), т.е., для определения количественного поглощения радиоактивности (ц/мин/мм2) в участках коры и гиппокампа. Плотность связывания нормализуют до фмоль/мг ткани на основе специфической активности соответствующих радиолигандов и градуировочной крином стандартного [3H]Microscale. Последовательно разбавляемые испытуемые соединения (10 нМ, 100 нМ, 1000 нМ и 10000 нМ) испытывают на конкуренцию сайтов связывания с применением количественной авторадиографии за эти четыре радиолиганда, [3Н](+)-пентазоцин, [3H]RHM-l, [3H]DTG и [3H]галоперидол, а затем анализируют специфическое связывание (% контроль) для выведения аффинности связывания в участках коры и гиппокампа (зубчатая извилина, гиппокампальные СА I и СА3).
[0409] Выполняют авторадиографию специфического связывания в сигма-1 и сигмах-рецепторах с [3Н]-(+)-пентазоцином (лиганд сигма-1-рецептора) и/или [125I]-RНМ-4 или [3H]-RHM-1 (лиганды сигма-2-рецептора), например, в срезах лобной коры человека, взятых у нормальных пациентов, пациентов с болезнью диффузных телец Леви (DLB) или болезнью Альцгеймера (НА) и сравнивают с контролем. Сигма-1-рецепторы демонстрируют статистически значимое снижение при болезни Альцгеймера и, возможно, DLB но сравнению с нормальным контролем. Например, в публикации Mishina et al. сообщается о низкой плотности-сигма-1-рецепторов при ранней болезни Альцгеймера. Mishina et al., 2008, Low density of sigmal receptors in early Alzheimer's disease. Ann. Nucl Med 22: 151-156. Однако сигма-2-рецепторы не демонстрируют статистически значимого снижения при БА. Авторадиографию применяют для демонстрации вытеснения, например, 18,4 нМ [3H]-RHM-1 в лобной коре обезьян, гиппокампе обезьян или височной коре человека под действием сигма-2-лигандов испытуемого соединения. Согласно прогнозу, сирамезин, известный лиганд сигма-2-рецепторов, и испытуемые соединения должны частично вытеснить [3H]-RHM-1 в тканях-мишенях.
Пример 11. MTS-анализ: определение агонистической или антагонистической активности различных сигма-2-лигандов.
[0410] Цитотоксичность испытуемых соединений определяют с применением анализа CellTiter96 Aqueous One Solution Assay (Promega, Madison, WI). В общих чертах, клетки MDA-MB-435 или MDA-MB231 или SKOV-3 высевали в 96-луночный планшет при плотности 2000 клеток/лунку в день, предшествующий обработке селективными лигандами сигма-2-рецептора. После 24-часовой обработки в каждую лунку добавляют реагент CellTiter 96 AQueous One Solution Reagent и планшет инкубируют в течение 2 часов при 37°С. Планшет считывают при 490 им в планшет-ридере Victor3 (PerkinElmer Life and Analytical Sciences, Shelton, CT). Значение ЕС50, определяемое как концентрация сигма-лиганда, необходимая для ингибирования выживаемости клеток на 50% относительно не подвергаемых обработке клеток, определяют по кривой доза-эффект для каждом линии клеток. Сирамезин является приемлемым в качестве агониста. Агонисты и антагонисты сигма-2-лигандов определяют следующим образом: если показатель ЕС50 испытуемого соединения сигма-2-лиганда составляет менее 2-кратного показателя ЕС50 сирамезина, это испытуемое соединение сигма-2-лиганда считается агонистом. Если показатель EC50 сигма-2-лиганда составляет от 2- до 10-кратного показателя ЕС50 сирамезина, этот сигма-2-лиганд считается частичным агонистом. Если показатель ЕС50 сигма-2-лиганда больше, чем 10-кратный показатель ЕС50 сирамезина, этот сигма-2-лиганд считается антагонистом. Стандартными соединениями сигма-2-лиганда, применяемыми для исследований, являются: агонисты (сирамезин и SV 119), частичный агонист (WC26) и антагонист (RHM-1). Результаты для стандартов показаны в Таблице 3.
[0411] Таблица 3. Показатели IC50 для анализа выживаемости опухолевых клеток.
[0412] Нейронные культуры обрабатывают различными концентрациями сигма-соединений в течение 24 часов и измеряют ядерную плотность по сравнению с основой. Агонисты сигма-2 (сирамезин, SV-119, WC-26) вызывают значительное отклонение ядерной морфологии в нейронах в отличие от антагонистов сигма-2 (RHM-1), которые не снижают ядерную интенсивность в испытываемых концентрациях. См., например, заявку WO 2013/029060, Фиг. 9В, включенную в это описание путем ссылки, согласно которой агонисты сигма-2-рецепторов оказывались цитотоксичными для нейронов или раковых клеток; однако антагонисты сигма-2-рецептора не были токсичными и дополнительно блокировали цитотоксичность, вызываемую агонистами сигма-2-рецепторов. Испытуемые соединения изоиндолина согласно настоящему изобретению анализируют в этом анализе для облегчения определения нейронного фенотипа. Результаты показаны в Таблице 2.
Пример 12. Анализы каспазы-3. Определение агонистической или антагонистической активности сигма-2-лигаидов.
[0413] Как описано авторами, Xu et al. определили белковый комплекс PGRMC1 как предполагаемый сайт связывания сигма-2-рецептора. См. публикацию Xu et al., 2011. Nature Commun. 2, article number 380, включенную в это описание путем ссылки. Агонисты cигма-2-рецепторов могут вызывать зависимую от каспазы-3 гибель клеток. Xu et al 2011 описывают функциональные анализы для исследования способности PGRMC1 к регулированию активации каспазы-3 агонистом сигма-2-рецепторов WC-26.
[0414] Abeta-олигомеры вызывают низкий уровень активации каспазы-3 и ведут к LTD. Высокий уровень Abeta-олигомеров и активации каспазы-3 ведут к гибели клеток. См. Li et al., 2010; Olsen and Sheng 2012. В заявке WO 2013/029060, включенной в это описание путем ссылки, было продемонстрировано, что агонисты сигма-2-рецепторов (SV-119, сирамезин) активируют каспазу-3 в опухолевых клетках и нейронах; см., например, Фигуры 10А и 10В. Антагонист сигма-2-рецептора RHM-1 ингибирует активацию в опухолевых клетках (Фиг. 10А), но в этом эксперименте был не способен блокировать активацию со стороны агониста SV-119 в нейронах (Фиг. 10В). Испытуемые соединения, являющиеся антагонистами сигма-2-рецептора, способны ингибировать активацию каспазы-3 в опухолевых клетках и блокировать активацию агониста сигма-2-рецепторов SV-119 каспазы-3 в нейронах. Таким образом, некоторые испытуемые соединения испытывают на поведение антагониста сигма-2-рецептора в анализах каспазы-3 в опухолевых клетках и нейронах, как продемонстрировано в этом примере.
[0415] Активацию эндогенной каспазы-3 лигандами сигма-2-рецептора измеряют с применением аналитического комплекта Caspase-3 Colorimetric Activity Assay Kit (Milipore, Беллерика, Массачусетс) в соответствии с протоколом производителя. В общих чертах, клетки MDA-MB 435 или MDA-MB23I высевали в количестве 0,5×106 клеток в 100 м чашку. Через 24 часа после высевания в чашки с культурой добавляют сигма-2-лиганды для вызывания активации каспазы-3. Конечной концентрацией сигма-2-лиганда является его ЕС50. через 24 часа после обработки клетки собирают, подвергают лизису в 300 мкл буфера для лизиса клеток и центрифугируют в течение 5 минут при 10000×g. Супернатант собирали и инкубировали с субстратом каспазы-3, DEVD-pNA, в течение 2 часов при 37°С. Концентрацию белка определяют при помощи аналитического комплекта для белка Dc (Bio-Rad, Геркулес, Калифорния). Образуемую в результате свободную pNA измеряют с применением ридера для микропланшетов Victor3 (PerkinEliner Life and Analytical Sciences, Шелтон, Коннектикут) при 405 нм. К испытываемым лигандам относятся стандартные агонисты сигма-2 (сирамезин, SV119, WC26) и антагонист сигма-2, RHMWU-I-102 (RHM-1) и испытуемые соединения. Лиганды, активирующие каспазу-3, считаются агонистами, а лиганды, не активирующие каспазу-3, считаются антагонистами. Как показано в заявке - WO 2013/029060, Фиг. 10А, агонист сигма-2 сирамезин вызывает активность каспазы-3, а антагонисты сигма-2, например, RHM-1, и испытуемые соединения, являющиеся антагонистами сигма-2, не вызывают активности каспазы-3 ни в раковых клетках, ни в нейронах.
Пример 13. Терапевтический фенотип.
[0416] Терапевтический фенотип для испытуемого соединения определяют при помощи платформы in vitro анализа, и он позволяет прогнозировать поведенческую эффективность. Согласно прогнозу, соединение, которое (1) выборочно связывается с высокой аффинностью с сигма-2-рецептором; и (2) действует как функциональный антагонист в нейронах, должно обладать поведенческой эффективностью, если: оно блокирует Аβ-индуцированный дефицит переноса через мембраны; блокирует Аβ-индуцированную потерю синапса и не влияет на перенос или количество синапсов в отсутствие Abeta-олигомера. Эта модель активности в in vitro анализах называется "терапевтическим фенотипом". Способность антагониста сигма-2-рецептора к блокированию Abeta-олигомерных эффектов в зрелых нейронах без воздействия на нормальную функцию в отсутствие Abeta-олигомеров является одним из критериев терапевтического фенотипа. Соединения, влияющие на перенос или количество синапсов а отсутствие олигомеров, не обладают поведенческой эффективностью. Лишь соединения, выборочно блокирующие олигомеры без воздействия на нормальный перенос или изменения количества синапсов, обладают поведенческой эффективностью для профилактики и лечения вызванной Abeta-олигомерами потери памяти. В одном варианте реализации платформа in vitro анализа позволяет прогнозировать поведенческую эффективность. Таким образом, эта модель активности в анализах платформы представляет терапевтический фенотип.
[0417] В общих чертах, антагонисты сигма-2 с высокой аффинностью (предпочтительно Ki менее, чем примерно 600 нМ, 500 нМ, 400 нМ, 300 нМ, 200 нМ, 150 нМ, 100 нМ или 70 нМ) в сигма-2-рецепторах, которые обладают более чем примерно 20-кратной, 30-кратной, 50-кратной, 70-кратной или, предпочтительно, более чем 100-кратной селективностью к сигма-рецепторам по сравнению с другими отличными от сигма рецепторами ЦНС или рецепторами-мишенями, обладают хорошими подобными лекарственным свойствами, включая способность к проникновению в головной мозг и хорошую метаболическую устойчивость и/или устойчивость в плазме, и имеют терапевтический фенотип, по прогнозам должны обладать поведенческой эффективностью и могут применяться для лечения вызванной Abeta-олигомерами синаптической дисфункции у пациента, который в этом нуждается.
[0418] Функциональный нейрональный фенотип для нескольких соединений изоиндолина согласно Формуле I и/или Формуле II, который, согласно прогнозу, должен обладать пероральной биодоступностью, с характеризацией в in vitro анализе, показывается в Таблице 2.
Терапевтический фенотип
[0419] Несколько сигма-2-лигандов соответствуют трем функциональным нейрональным фенотипам: антагонисты (блокирую сигнал Abeta); агонисты (блокируют сигнал Abetac U-образной кривой доза-эффект и токсичностью при высоких дозах; и неактивные (без эффекта в нейрональных культурах). Известные из существующего уровня техники рецепторные лиганды сигма-1 соответствуют двум категориям: антагонисты (блокируют сигнал Abeta) и неактивные (без эффекта в нейрональных культурах). Недостатком большинства соединений существующего уровня техники является их низкая селективность, которая состоит в том, что они обладают достаточной аффинностью к другим, отличным от сигма, рецепторам. Некоторые соединения существующего уровня техники могут быть неспособны к преодолению гематоэнцефалического барьера (ВВВ) и, очевидно, являются субстратами для окислительного метаболизма и, таким образом, не соответствуют терапевтическому профилю.
[0420] Хотя некоторые клинически применимые соединения имеют нужный функциональный фенотип, они не соответствуют необходимому терапевтическому профилю. Известные соединения существующего уровня техники с необходимым функциональным нейрональным фенотипом антагониста, но не соответствующие критериям для терапевтического профиля, либо из-за отсутствия селективности, либо из-за неспособности к преодолению ВВВ, либо из-за прогнозируемой роли окислительного субстрата и метаболической неустойчивости, показаны в заявке WO 2013/029060, Таблицы 11C и 11D, включенной в это описание путем ссылки.
Пример 14: In vitro токсичность.
[0421] Типичные антагонисты сигма-2 в качестве испытуемых соединений не вызывают нейронной или глиальной токсичности при остром или хроническом дозировании in vitro. Антагонисты сигма-2-рецептора устраняют или уменьшают вызванные Abeta-олигомерами изменения в переносе через мембрану. При введении доз без олигомеров отсутствует значительное воздействие соединений на перенос через мембрану. Отсутствует токсичность относительно количества нейронов, количество глиальных клочок, размера ядра, ядерной морфологии, длины нейритов, цитоскелетной морфологии при испытании до 10 раз концентрации ЕС50 в течение трех дней. См., например, заявку WO 2013/029060, Таблица 12, включенную в это описание путем ссылки.
[0422] In vitro токсичность испытуемого соединения испытывают во многих стандартных анализах. Предпочтительно при in vitro исследовании токсичности отсутствует гепотоксичность при 10 мкМ (AMES, микроядро, бактериальная цитотоксичность); токсичность HepG2 при 100-кратном превышении аффинности в сигма-2-рецепторе, в линии опухолевых клеток HepG2; ингибирование CYP 450 ферментов 2D6, 3А4 и 2С19 при 10 мкМ; и ингибирование hERG. Результаты для испытуемых соединений для ингибирования hERG (IC50, нМ) показаны в Таблице 2.
[0423] В некоторых вариантах реализации соединения изоиндолина согласно Формуле I или Формуле II, как предусмотрено авторами, или их фармацевтически приемлемые соли демонстрируют минимальное ингибирование hERG, с показателем IC50 более 300 нМ, более 500 нМ, более 1000 нМ, более 3000 нМ, более 5000 нМ, более 10000 или более 20000 нМ. 13 конкретных вариантах реализации соединения изоиндолина согласно Формуле I или Формуле II, как предусмотрено авторами, или их фармацевтически приемлемые соли, демонстрируют минимальное ингибирование hERG, с показателем IC50 более 5000 пМ, более 10000 или более 20000 нМ.
Пример 15: Отделение и активность энантиомеров соединения II в анализе переноса через мембрану.
[0424] В некоторых вариантах реализации синтез выполняют асимметрично с целью получения практически чистого или чистого энантиомера одного из аналогов. В некоторых случаях хиральные соединения отделяют от рацемической смеси любым из способов, известных специалистам в данной области.
[0425] В некоторых случаях хиральные соединения разделяют на (+) и (-) энантиомеры путем хиральной хроматографии. Рацемическую смесь подают на хиральную колонку CHIRALPAK AD-H (трис-(3,5-диметилфенилкарбамат) амилозы, нанесенный на силикагель; 4,6×250 мм) известными способами; например, как описано в заявке WO 2013/029060, Пример 15, включенной в это описание путем ссылки. После элюирования из колонки определяют удельное вращение для (+) энантиомера и (-) энантиомера. Отделенные энантиомеры испытывают по отдельности, например, в анализе переноса через мембрану.
Пример 16. Поведенческая эффективность перорально доступных соединений - уменьшение нарушений памяти в трансгенной мышиной модели болезни Альцгеймера.
[0426] Самцов трансгенных (Tg) мышей hAPP Swe/Ldn используют в качестве TG-модели БА. К трансгенным мышам, получавшим индифферентную основу или 10 или 30 мг/кг/день испытуемого соединения перорально в течение определенного периода времени, а также нетрансгенным получавшим индифферентную основу однопометникам применяют стандартную модель условно-рефлекторного замирания. У получавших индифферентную основу 9-месячных самцов трансгенных (Tg) мышей hAPP Swe/Ldn, которым перорально водили основу в течение такого же периода времени, наблюдались значительные нарушения памяти по сравнению с получавшими индифферентную основу нетрансгенными однопометниками в контекстуальном условно-рефлекторном замирании.
[0427] При тестировании животных на ассоциативную память через 24 часа после обучения применяют двухфакторный (генотип и время) анализ ANOVA с повторяемыми измерениями для обнаружения любых значительных различий в общем времени замирания между трансгенными и нетрансгенными получавшими индифферентную основу мышами. Определяют соотношения концентрации в головном мозге / остаточной концентрации в плазме и в головном мозге/пиковой концентрации в плазме для перорально доступных соединений. Последующие исследования применяют для определения минимальной эффективной дозы предпочтительного испытуемого соединения.
Примеры синтеза
[0428] Предлагаемые авторами соединения могут быть синтезированы любым синтетическим путем; см., например, заявки WO 2013/029060 и WO 2013/029067, каждая из которых включена в это описание путем ссылки.
Пример 17: Синтез промежуточных соединений gem-диметиламина.
[0429] Пример 17А поясняет приготовление типичных промежуточных соединений gem-диметиламина, как показано на Схеме 1.
[0430] Схема 1. Получение типичного промежуточного соединения gem-диметиламина 4-(3-(трет-бутокси)-4-((трет-бутилдиметилсилил)окси)фенил)-2-метилбутин-2-амина.
[0431] На Схеме 1 поясняется процедура получения промежуточного соединения gem-диметиламина, соединения 11; 4-(3-(трет-бутокси)-4-((трет-бутилдиметилсилил)окси)фенил)-2-метилбутан-2-амина.
[0432] Получение соединения 3; 3-(трет-бутокси)-4-гидроксибензальдегида (Схема 1): К перемешиваемому раствору 3,4-дигидроксибензальдегида 1 (2,0 г, 14,5 ммоль) в ДХМ (30 мл) добавляли конц. H2SO4 (0,1 мл) и барботированный изобутилен в течение 3 ч. Добавляли триэтиламин (2 мл) и смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч и концентрировали при пониженном давлении для получения остатка, который очищали путем колоночной хроматографии на силикагеле (ПЭ:ЭА=5:1) для получения соединения 3 (1,01 г, 35%).
[0433] Получение соединения 5, (Е)-4-(3-(трет-бутокси)-4-гидроксифенил)бут-3-ен-2-она (Схема 1): К перемешиваемому раствору 3 (0,8 г, 4,1 ммоль) в ацетоне (10 мл) добавляли 10% водный раствор NaOH (0,5 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч, выливали в ледяную воду и экстрагировали этилацетатом (3×20 мл). Водную фазу подкисляли 1N HCl до достижения pH 6. Реакционную смесь экстрагировали EtOAc (3×30 мл) и органические слои промывали насыщенным раствором хлорида натрия и водой, сушили над сульфатом натрия и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении для получения остатка, который очищали путем колоночной хроматографии на силикагеле (ПЭ:ЭА=3:1) для получения указанного в заголовке соединения 5 (0,5 г, 50%).
[0434] Получение соединения 7, (Е)-4-(3-(трет-бутокси)-4-((трет-бутилдиметилсилил)окси)фенил)бут-3-ен-2-она (Схема 1): К перемешиваемому раствору 5 (0,22 г, 0,9 ммоль) в ДХМ (40 мл) добавляли TBSCl (0,28 г, 1,8 ммоль) и имидазол (0,14 г, 2 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 8 ч, концентрировали при пониженном давлении для получения остатка, который очищали путем колоночной хроматографии на силикагеле (ПЭ:ЭА=10:1) для получения указанного в заголовке соединения 7 (0,22 г, 67%).
[0435] Получение соединения 8, 4-(3-(трет-бутокси)-4-((трет-бутилдиметилсилил)окси)фенил)бутан-2-она (Схема 1): К перемешиваемому раствору 7 (0,22 г, 0,6 ммоль) в ЭА (10 мл) добавляли 10% Pd/C (0,02 г). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч и фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении для получения остатка, который очищали путем колоночной хроматографии на силикагеле (ПЭ:ЭА=10:1) для получения указанного в заголовке соединения 8 (0,6 г, 0,4 ммоль, 68%).
[0436] Получение соединения 9, (R,E)-N-(4-(3-(трет-бутокси)-4-((трет-бутилдиметилсилил)окси)фенил)бутан-2-илиден)-2-метилпропан-2-сульфинамида (Схема 1): К перемешиваемому раствору 8 (2,6 г, 7,4 ммоль, 1 экв.) в ТГФ (30 мл) добавляли (R)-(+)-трет-бутилсульфинамид (1,0 г, 8,14 ммоль, 1,1 экв.) и Ti(OEt)4 (3,2 г, 14,8 ммоль, 2,0 экв.). Смесь перемешивали при 70°С в течение суток. Реакционную смесь гасили ледяной подои и фильтровали. Фильтрат экстрагировали этилацетатом. Органический слой высушивали над Na2SO4, концентрировали для получения неочищенного продукта 9 (2,7 г, 80%), который использовали непосредственно на следующем этапе.
[0437] Получение соединения 10, (R)-N-(4-(3-(трет-бутокси)-4-((трет-бутилдиметилсилил)окси)фенил)-2-метилбутан-2-ил)-2-метилпропан-2-сульфинамида (Схема 1): К перемешиваемому раствору 9 (2,7 г, 5,9 ммоль, 1 экв.) в эфире (30 мл) при 0°С добавляли метилмагния бромид (10 мл, 30 ммоль, 5 экв.). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. Реакционную смесь гасили ледяной водой, экстрагировали этилацетатом. Органический слой высушивали над Na2SO4, концентрировали при пониженном давлении для получения остатка, который очищали путем колоночной хроматографии на силикагеле (ПЭ:ЭА=10:1) для получения соединения 10 (1,6 г, 57%).
[0438] Получение соединения 11; 4-(3-(трет-бутокси)-4-((трет-бутилдиметилсилил)окси)фенил)-2-метилбутан-2-амина (Схема 1): К перемешиваемому раствору 10 (1,2 г, 2,55 ммоль, 1 экв.) в ЭА (30 мл) добавляли ЭА (НСl) (10 мл) при 0°С. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и концентрировали при пониженном давлении для получения 11 (1,3 г, 100%) в виде желтого масла. Аналогичные способы синтеза применяют для получения промежуточных соединений gem-диметиламина для использования в синтезе изоиндолинов Формулы I и/или II. Заместитель трет-бутилдиметилсилилокси и/или заместитель трет-бутокси могут быть замерены альтернативными заместителями, или также могут использоваться дополнительные R1 группы для образования других аналогов.
[0439] Пример 17В поясняет общий принцип получения промежуточного соединения gem-диметиламина, как показано на Схеме 3.
[0440] Схема 3: Общий принцип получения gem-диметиламинов
[0441] Получение соединения 2; (Е)-4-(4-фторфенил)бут-3-ен-2-она (Схема 3): К перемешиваемому раствору 1, 4-фторбензальдегиду (100 г, 805,7 ммоль, 1 экв.) в ацетоне (1000 мл) добавляли 10% водный раствор NaOH (100 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч, а затем выливали в ледяную воду и экстрагировали EtOAc (3×300 мл). Органический слой промывали насыщенным раствором хлорида натрия, водой, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и фильтрат концентрировали при пониженном давлении для получения остатка, который очищали путем колоночной хроматографии на силикагеле (ПЭ:ЭА=10:1) для получения указанного в заголовке соединения 2; (Е)-4-(4-фторфенил)бут-3-ен-2-она (110 г, 85%).
[0442] Получение соединении 3; 4-(4-фторфенил)бутан-2-она (Схема 3): К перемешиваемому раствору 2 (50 г, 304,5 ммоль) в МеОН (40 мл) добавляли Pd/C (10%, 5 г). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч, а затем фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении для получения соединения 3; 4-(4-фторфенил)бутан-2-она (50 г, 300,9 ммоль, 99%), который использовали непосредственно на следующем этапе.
[0443] Получение соединения 4; (R,E)-N-(4-(4-фторфенил)бутан-2-илиден)-2-метилпропан-2-сульфинамида (Схема 3): К перемешиваемому раствору 3 (50 г, 300,9 ммоль, 1 экв.) в ТГФ (30 мл) добавляли (R)-(+)-трет-бутилсульфинамид (40,4 г, 331 ммоль, 1.1 экв.) и Ti(OEt)4 (136,8 г, 600,2 ммоль, 2 экв.). Смесь перемешивали при 70°С в течение суток и гасили ледяной водой, фильтровали и промывали ЭА. Органический слой высушивали над Na2SO4, концентрировали для получения неочищенного продукта 4 (65 г, 80%), который использовали непосредственно на следующем этапе.
[0444] Получение соединения 5; (R)-N-(4-(4-фторфенил)-2-метилбутан-2-ил)-2-метилпропан-2-сульфинамида (Схема 3): К перемешиваемому раствору 4 (30 г, 111,4 ммоль, 1,0 экв.) в эфире (30 мл) добавляли MeMgBr (111 мл, 333 ммоль, 3,0 экв.) при 0°С. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. Реакционную смесь гасили ледяной водой, экстрагировали ЭА. Органический слой высушивали над Na2SO4, концентрировали при пониженном давлении для получения остатка, который очищали цугом колоночной хроматографии на силикагеле (ПЭ:ЭА=10:1) для получения указанного в заголовке соединения 5 (28,6 г, 90%).
[0445] Получение соединения 6; 4-(4-фторфенил)-2-метилбутан-2-амин (Схема 3): К перемешиваемому раствору 5 (28,6 г, 100 ммоль, 1 экв.) в ЭА (150 мл) добавляли ЭА (НСl) (200 мл) при 0°С. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, концентрировали при пониженном давлении для получения 6 (18 г, 100%) в виде желтого масла.
[0446] Пример 17С поясняет общий принцип получения промежуточного соединения gem-диметиламина 4-(3-амино-3-метилбутил)-2-(трифторометокси)фенолгидрохлорида, как показано на Схеме 7.
[0447] Схема 7: Получение промежуточного соединения gem-диметиламина 4-(3-амино-3-метилбутил)-2-(трифторометокси)фенола гидрохлорид.
[0448] Получение соединении 2 (Схема 7): К перемешиваемому раствору 2-(трифторометокси)фенол 1 (40,0 г, 0,224 моль, 1 экв.) в трифтороуксусной кислоте (400 мл) добавляли гексаметилентетрамин (188,7 г, 1,35 моль, 6 экв.). Смесь перемешивали при 70°С в течение 12 ч. После концентрирования в вакууме, реакционную смесь разводили 2 н НСl, экстрагировали ЭА (3×400 мл). Комбинированные органические слои промывали насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над Na2SO4 и концентрировали в вакууме для получения оранжевого масла. Неочищенный продукт подвергали колоночной хроматографии (ПЭ:ЭА=5:1) для получения указанного в заголовке соединения 2 (30,0 г, 65%).
[0449] Получение соединения 3 (Схема 7): К перемешиваемому раствору 4-гидрокси-3-трифторометокси-бензальдегида (30,0 г, 145,5 ммоль, 1,0 экв.) в ацетоне (300 мл) добавляли 10% водный раствор NaOH (150 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч и выливали в ледяную воду. Реакционную смесь экстрагировали EtOAc (3×20 мл). Водную фазу подкисляли 1 и НСl до достижения pH 6. Реакционную смесь экстрагировали EtOAc (3×100 мл). Органический слой промывали насыщенным раствором хлорида натрия и водой и сушили над сульфатом натрия, фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении для получения остатка, который очищали путем колоночной хроматографии на силикагеле (ПЭ:ЭА=3:1) для получения указанного в заголовке соединения 3 (30,1 г, 84%).
[0450] Получение соединения 4 (Схема 7): К раствору 4-(4-гидрокси-3-трифторометокси-фенил)-бут-3-ен-2-она (12 г, 47,5 ммоль) в метаноле (100 мл) добавляли 10% Pd/C (1 г). Полученный в результате раствор перемешивали в атмосфере H2 в течение 8 ч. Раствор фильтровали через слой целита, концентрировали для получения необработанного 4-(4-гидрокси-3-трифторометокси-фенил)-бутан-2-она (11 г, 94%).
[0451] Получение соединения 5 (Схема 7): К раствору 4-(4-гидрокси-3-трифторометокси-фенил)-бутан-2-она (11 г, 44,3 ммоль) в ТГФ (100 мл) добавляли (R)-(+)-трет-бутилсульфинамид (7,0 г, 58 ммоль) и Ti(OEt)4 (22,0 г, 96,7 ммоль). Образовавшийся в результате раствор перемешивали в течение суток. Реакционную смесь гасили ледяной водой, фильтровали. Фильтрат экстрагировали этилацетатом. Органический слой высушивали над Na2SO4, концентрировали для получения неочищенного продукта 5 (11,2 г, 78%), который использовали на следующем этапе.
[0452] Получение соединения 6 (Схема 7): К перемешиваемому раствору 5 (23 г, 49,4 ммоль, 1 экв.) в эфире (120 мл) добавляли MeMgBr (82 мл, 247 ммоль, 5 экв.) при 0°С. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. Реакционную смесь гасили ледяной водой, экстрагировали ЭА. Органический слой высушивали над Na2SO4, концентрировали при пониженном давлении для получения остатка, который очищали путем колоночной хроматографии на силикагеле (ПЭ:ЭА=10:1) для получения указанного в заголовке соединения 6 (16,7 г, 70%).
[0453] Получение соединения 7 (Схема 7): К перемешиваемому раствору 6 (1,0 г, 2,08 ммоль, 1 экв.) в этилацетате (5 мл) добавляли насыщенный НСl в ацетате (5 мл) при 0°С. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и концентрировали при пониженном давлении для получения соединения 7 (0,85 г, 100%) в виде желтого масла.
[0454] Пример 17D поясняет общий принцип получения промежуточного соединения gem-диметиламина 4-(4-((трет-бутилдиметилсилил)окси)-3-(трифторометокси)фенил)-2-метилбутан-2-амина, как показано на Схеме 8.
[0455] Схема 8: Получение 4-(4-((трет-бутилдиметилсилил)окси)-3-(трифторометокси)фенил)-2-метилбутан-2-амина gem-диметиламина.
[0456] Получение соединения 5 (Схема 8):
К перемешиваемому раствору 4 (18 г, 72,5 ммоль, 1 экв.) в ДХМ (200 мл) добавляли TBSCl (16,4 г, 108,8 ммоль, 1,5 экв.) и имидазол (9,9 г, 145 ммоль, 2,0 экв.). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 8 ч, концентрировали при пониженном давлении для получения остатка, который очищали путем колоночной хроматографии на силикагеле (ПЭ:ЭА=10:1) для получения указанного в заголовке соединения 5 (19 г, 73%).
[0457] Получение соединения 6 (Схема 8): К перемешиваемому раствору 5 (1,2 г, 3,3 ммоль, 1 экв.) в ТГФ (20 мл) добавляли (R)-(+)-трет-бутилсульфинамид (0,4 г, 3,6 ммоль, 1.1 экв.) и Ti(OEt)4 (1,5 г, 6,6 ммоль, 2 экв.). Смесь перемешивали при 70°С в течение суток. Реакционную смесь гасили ледяной водой, фильтровали и экстрагировали этилацетатом. Органический слой высушивали над Na2SO4, концентрировали для получения неочищенного продукта 6 (1,6 г, 97%), который непосредственно использовали па следующем этапе.
[0458] Получение соединения 7 (Схема 8): К перемешиваемому раствору 6 (1,6 г, 3,4 ммоль, 1,0 экв.) в эфире (30 мл) при 0°С добавляли MeMgBr (5 мл, 17 ммоль, 5,0 экв.). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч. Реакционную смесь тепли ледяной водой, экстрагировали этилацетатом. Органический слой высушивали над Na2SO4, концентрировали при пониженном давлении для получения остатка, который очищали путем колоночной хроматографии на силикагеле (ПЭ:ЭА=10:1) для получения указанного в заголовке соединения 7 (0,6 г, 1,2 ммоль, 37%).
[0459] Получение соединения 8 (Схема 8): К перемешиваемому раствору 7 (3,0 г, 6,2 ммоль, 1 экв.) в этилацетате (30 мл) добавляли насыщенную НСl в ацетате (10 мл) при 0°С. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и концентрировали при пониженном давлении для получения соединения 8 4-(4-((трет-бутилдиметилсилил)окси)-3-(трифторометокси)фенил)-2-метилбутан-2-амина (2,6 г, 100%) к виде желтого масла.
[0460] Пример 17Е поясняет общий принцип получения промежуточного соединения gem-диметиламина 4-(3-амино-3-метилбутил)-2-(трифторометокси)фенил диметилкарбамат гидрохлорида, как показано на Схеме 11.
[0461] Схема 11: Получение 4-(3-амино-3-метилбутил)-2-(трифторометокси)фенил диметилкарбамат гидрохлорида gem-диметиламина.
[0462] Получение соединения 8с (Схема 11): К раствору 7с (5,0 г, 13,6 ммоль, 1,0 экв.) и диметилкарбамилхлорида (3,0 г, 27,8 ммоль, 2,2 экв.) в ДХМ (100 мл) добавляли DMAP (0,25 г, 5 мол. %), TEA (2,9 г, 22,6 ммоль, 2,0 экв.). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч. После концентрирования в вакууме неочищенный продукт подвергали колоночной хроматографии (20%-30% EtOAc/смесь изомеров гексана) для получения продукта 8 с (4,8 г, 48%).
[0463] Получение соединения 8d; 4-(3-амино-3-мстилбутил)-2-(трифторометокси)фенил диметилкарбамат гидрохлорида (Схема 11): К перемешиваемому раствору 8с (4,8 г, 11,0 ммоль, 1 экв.) в ЭА (30 мл) при 0°С добавляли ЭА (НСl) (30 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, концентрировали при пониженном давлении для получения 8d (4,1 г, 100%) в виде желтого масла.
Пример 18: Общин принцип получения хиральных аминных промежуточных соединений.
[0464] Пример 18А поясняет типичный пример получения промежуточного хирального амина (R)-4-(3-аминобутил)-2-изопропоксифенола, как показано на Схеме 2.
[0465] Схема 2: Общий принцип получения промежуточного хирального амина (R)-4-(3-аминобутил)-2-изопропоксифенола.
[0466] Получение соединения 2; (R)-N-((R)-4-(4-гидрокси-3-изопропоксифенил)бутан-2-ил)-2-метилпропан-2-сульфинамида (Схема 2): К перемешиваемому раствору 1; (R,E)-N-(4-(4-гидрокси-3-изопропоксифенил)бутан-2-илиден)-2-метилпропан-2-сульфинамида (20 г, 61,4 ммоль, 1 экв.) в ТГФ (200 мл) добавляли DABAL-H (180 мл, 180 ммоль, 3 экв.) при -78°С. Смесь перемешивали при -78°С в течение 4 ч, затем гасили ледяной водой (20 мл), фильтровали и фильтрат концентрировали при пониженном давлении для получения остатка, который очищали путем колоночной хроматографии на силикагеле (ПЭ:ЭА=5:1) для получения указанного в заголовке соединения 2 (17,1 г, 52,2 ммоль, 85%).
[0467] Получение соединения 3; (R)-4-(3-аминобутил)-2-изопропоксифенола (Схема 2): К перемешиваемому раствору 2 (17,1 г, 52,2 ммоль, 1 экв.) в ЭА (50 мл) добавляли ЭА (НСl) (50 мл, 100 ммоль, 2 экв., 2 н) при 0°С. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и концентрировали при пониженном давлении для получения соединения 3 (11,6 г, 100%) в виде желтого масла.
[0468] Пример 18В поясняет получение промежуточного хирального амина (R)-4-(3,4-диизопропоксифенил)бутан-2-амина из исходного вещества 3,4-бензальдегида, как показано на Схеме 4.
[0469] Схема 4: Общий принцип получения хирального амина (R)-4-(3,4-диизопропоксифенил)бутан-2-амина.
[0470] Получение соединения 1 (Схема 4): Смесь 3,4-дигидрокси-бензальдегида 1а (30,0 г, 65,7 ммоль, 1 экв.) и 2-бромопропана (18,4 г, 131,4 ммоль, 2 экв.) и NaH (5,4 г, 60% в масле, 130 ммоль) в ДМФА (300 мл) перемешивали при 70°С в течение 12 ч. После концентрирования в вакууме смесь разбавляли 2 и НСl, экстрагировали этилацетатом (3×100 мл). Комбинированные органические слои промывали насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над Na2SO4 и концентрировали в вакууме для получения оранжевого масла. Неочищенный продукт подвергали колоночной хроматографии (20%-30% EtOAc/смесь изомеров гексана) для получения продукта 1; 3,4-диизопропоксибензальдегида (10,1 г, 30%).
[0471] Получение соединения 2 (Схема 4): Соединение 1 (20 г, 90 ммоль) растворяли в ацетоне (80 мл). Затем в сосуд добавляли этанол (8 мл), 10% NaOH (80 мл) и воду (200 мл). Образовавшийся в результате раствор перемешивали в течение 8 ч и экстрагировали ЭА (3×100 мл). Комбинированные органические слои промывали насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над Na2SO4 и концентрировали в вакууме для получения оранжевого масла. Неочищенный продукт подвергали колоночной хроматографии для получения соединения 2; (Е)-4-(3,4-диизопропоксифенил)бут-3-ен-2-она (12 г, 98%).
[0472] Получение соединения 3 (Схема 4): К перемешиваемому раствору соединения 2 (30,0 г, 114 ммоль, 1 экв.) в МеОН (300 мл) добавляли 10% Pd/C (3 г). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 12 ч и фильтровали через слой целита. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении для получения остатка, который очищали путем колоночной хроматографии на силикагеле (ПЭ:ЭА=5:1) для получения указанного в заголовке соединения 3; 4-(3,4-диизопропоксифенил)бутан-2-она (11,4 г, 38%).
[0473] Получение соединения 4 (Схема 4): К перемешиваемому раствору соединения 3 (11,4 г, 43,1 ммоль, 1,0 экв.) в ТГФ (100 мл) добавляли (R)-(+)-трет-бутилсульфинамид (5,7 г, 47,4 ммоль, 1,1 экв.) и Ti(OEt)4 (19,7 г, 86,2 ммоль, 2,0 экв.). Смесь перемешивали при 70°С в течение суток. Реакционную смесь гасили ледяной водой, фильтровали и экстрагировали этилацетатом. Органический слой высушивали над Na2SO4, концентрировали для получения неочищенного продукта 4 (15 г, 95%), который использовали непосредственно на следующем этапе.
[0474] Получение соединения 5 (Схема 4): К перемешиваемому раствору 4 (6,3 г, 17,1 ммоль, 1 экв,) в ТГФ (50 мл) при -78°С добавляли DABAL-H (34 мл, 34 ммоль, 2,0 экв.). Смесь перемешивали при -78°С в течение 4 часов и гасили ледяной водой (20 мл), фильтровали. Фильтрат концентрировали при пониженном давлении для получения остатка, который очищали путем колоночной хроматографии на силикагеле (ПЭ:ЭА=5:1) для получения указанного в заголовке соединения 5; (R)-N-((R)-4-(3,4-диизопропоксифенил)бутан-2-ил)-2-метилпропан-2-сульфинамида (2,5 г, 40%).
[0475] Получение соединения 6 (Схема 4): К перемешиваемому раствору 5 (2,5 г, 6,8 ммоль, 1,0 экв.) в ЭА (30 мл) добавляли насыщенный НС1 в этилацетате (10 мл) при 0°С. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и концентрировали при пониженном давлении для получения соединения 6; (R)-4-(3,4-диизопропоксифенил)бутан-2-амина (2,1 г, 100%) в виде желтого масла.
[0476] Пример 18С поясняет получение промежуточного хирального амина (R)-2-(4-(3-аминобутил)-2-метоксифенокси)этан-1-ола, как показано на Схеме 5.
Общий принцип получения хиральных аминов
[0477] Схема 5: Получение промежуточного хирального амина (R)-2-(4-(3-аминобутил)-2-метоксифенокси)этан-1-ола.
[0478] Получение соединения 2; (R)-N-((R)-4-(4-(2-гидроксиэтокси)-3-метоксифенил)бутан-2-ил)-2-метилпропан-2-сульфинамида (Схема 5): К перемешиваемому раствору соединения 1; (R)-N-((R)-4-(4-гидрокси-3-метоксифенил)бутан-2-ил)-2-метилпропан-2-сульфинамида (4,3 г, 14,4 ммоль, 1,0 экв.) в ДМФА (50 мл) добавляли K2СО3 (4,0 г, 28,8 ммоль, 2,0 экв.) и 2-бромоэтанол (1,5 г, 13,6 ммоль, 1,2 экв.). Смесь перемешивали при 80°С в течение 8 ч и гасили ледяной водой (100 мл), экстрагировали ЭА (3×50 мл). Комбинированный органический слой промывали насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над Na2SO4 и концентрировали в вакууме для получения оранжевого масла. Неочищенный продукт очищали путем колоночной хроматографии на силикагеле (ПЭ:ЭА=5:1) для получения указанного в заголовке соединения 2 (3,1 г, 63%).
[0479] Получение соединения 3; (R)-2-(4-(3-аминобутил)-2-метоксифенокси)этан-1-ол (Схема 5): К перемешиваемому раствору 2 (3,1 г, 9,0 ммоль, 1,0 экв.) в ЭА (30 мл) добавляли НСl-ЭА (10 мл) при 0°С. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и концентрировали при пониженном давлении для получения 3 (2,1 г, 100%) в виде желтого масла.
[0480] Пример 18D поясняет получение промежуточного хирального амина (S)-4-(3,4-дихлорофенил)-1-метоксибутан-2-амина, как показано на Схеме 6.
[0481] Схема 6: Получение промежуточного хирального амина, (S)-4-(3,4-дихлорофенил)-1-метоксибутан-2-амина.
[0482] Получение соединения 2; 3-(трет-бутил) 4-метил (R)-2,2-диметилоксазолидин-3,4-дикарбоксилата (Схема 6): К раствору соединения 1; метил N-(трет-бутоксикарбонил)-D-серина (13 г, 59,2 ммоль) в ДХМ (150 мл) при комнатной температуре добавляли моногидрат толуол-4-сульфоновой кислоты (2,0 г, 10,3 ммоль) и 2,2-диметоксипропан (18,5 г, 177,6 ммоль). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 48 ч и концентрировали для получения остатка, который очищали путем колоночной флэш-хроматографии (ПЭ:ЭА=4:1) для получения соединения 2 (13 г, 84%) в виде желтого масла.
[0483] Получение соединения 3 (Схема 6): Смесь LiAlH4 (2,85 г, 75 ммоль) в ТГФ (200 мл) при 0°С в атмосфере N2 перемешивали в течение 20 мин. К смеси при 0°С по каплям добавляли соединение 2 (13,0 г, 50,1 ммоль). Смесь перемешивали в течение 30 мин, гасили Na2SO4.10H2O и фильтровали. Фильтрат концентрировали для получения остатка, который очищали путем FCC (ПЭ:ЭА=4:1) для получения соединения 3 (10,3 г, 89%) в виде желтого масла.
[0484] Получение соединения 4 (Схема 6): К предварительно охлажденному раствору оксалилхлорида (7,6 г, 60,1 ммоль) в метиленхлориде (200 мл) при -78°С добавляли ДМСО (9,3 г, 120,21 ммоль) в метиленхлориде (20 мл). Смесь перемешивали в течение 30 мин. К смеси при -78°С добавляли соединение 3 (10,3 г, 44,5 ммоль) в метиленхлориде (30 мл). Реакционную смесь перемешивали при -78°С в течение 2 ч, и в это время добавляли триэтиламин (18,0 г, 178,13). Образовавшийся в результате раствор нагревали до 0°С, гасили насыщенным раствором хлорида натрия (30 мл) и экстрагировали диэтиловым эфиром (2×300 мл). Органический слой высушивали над Na2SO4, фильтровали и концентрировали для получения соединения 4 (9,0 г, 85%) в виде масла.
[0485] Получение соединения 6 (Схема 6): К раствору соединения 5 (285 мг, 0,56 ммоль) в ТГФ (15 мл) в атмосфере N2 при -78°С добавляли н-BuLi (0,3 мл, 2,5 М). Через 10 мин реакционную смесь нагревали до -40°С до исчезновения осадка. Реакционную смесь охлаждали до -78°С, но каплям добавляли соединение 4 (130 мг, 0,56 ммоль) в ТГФ (5 мл) при -78°С. Образовавшийся в результате раствор нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение суток перед гашением метанолом (2 мл). После перемешивания в течение 30 мин смесь концентрировали для получения остатка, который очищали путем колоночной флэш-хроматографии (ПЭ:ЭА=4:1) для получения соединения 6 (200 мг, 90%) в виде желтого масла.
[0486] Получение соединения 7 (Схема 6): К раствору соединения 6 (2,6 г, 6,98 ммоль) в метаноле (50 мл) добавляли Pd/C (2,0 г) при комнатной температуре под шаром, заполненным Н2. Смесь перемешивали в течение 12 ч, фильтровали, концентрировали для получения остатка, который очищали путем FCC (ПЭ) для получения соединения 7 (2,0 г, 77%) в виде желтого масла.
[0487] Получение соединения 8 (Схема 6): К раствору соединения 7 (500 мг, 1,34 ммоль) и ТГФ (20 мл) добавляли 0,5 М НСl (1 мл) при комнатной температуре. Реакционную смесь перемешивали в течение 12 ч, сушили над Mg2SO4 и фильтровали. Фильтрат концентрировали для получения остатка, который очищали путем FCC (ПЭ) для получения 7 (400 мг, 90%) в виде желтого масла.
[0488] Получение соединения 9 (Схема 6); К раствору соединения 8 (140 мг, 0,42 ммоль) в ацетонитриле (10 мл) добавляли Ag2O (200 мг, 0,87 ммоль), затем метилйодид (0,15 мл, 2,4 ммоль). Смесь перемешивали в течение 24 ч и фильтровали через слой целита. Фильтрат концентрировали для получения остатка, который очищали путем препаративной ВЭЖХ для получения соединения 9 (70 мг, 48%) в виде желтого масла.
[0489] Получение соединения 10 (Схема 6): К раствору соединения 9 (70 мг, 0,20 ммоль) в ДХМ (2 мл) добавляли ТФК (1 мл). Смесь перемешивали в течение 24 ч и концентрировали для получения соединения 10; (S)-4-(3,4-дихлорофенил)-1-метоксибутан-2-амина (50 мг, 100%) в виде масла.
[0490] Пример 18Е поясняет получение промежуточного хирального амина (R)-4-(3-аминобутил)-2-(трифторометокси)фенола, как показано на Схеме 9.
[0491] Схема 9: Получение хирального амина (R)-4-(3-аминобутил)-2-(трифторометокси)фенола.
[0492] Получение соединения 6 (Схема 9): Соединение 5 (11 г, 31,3 ммоль) растворяли в ТГФ (100 мл) и охлаждали до -78°С. Затем в сосуд добавляли DIBAL-H (60 мл, 1,5 М в ТГФ, 90 ммоль) и образовавшийся в результате раствор перемешивали в течение 3 ч. Анализ реакционной смеси путем ТСХ показал полный расход исходного имина для получения сульфинамидного соединения 5. Раствор затем гасили водой и экстрагировали ЭА (3×500 мл). Комбинированные органические слои промывали насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над Na2SO4 и концентрировали в вакууме для получения оранжевого масла. Неочищенный продукт подвергали колоночной хроматографии (50%-75% EtOAc/смесь изомеров гексана) для получения продукта 6 (6 г, 55%).
[0493] Получение соединения 7; (R)-4-(3-аминобутил)-2-(трифторометокси)фенола (Схема 9): Соединение 6 (7 г, 15 ммоль) растворяли в ЭА (20 мл). Затем в сосуд добавляли ЭА-HCl (20 мл, 1,5 М, 30 ммоль) и образовавшийся в результате раствор перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. Раствор экстрагировали водой (50 мл за 3 раза). Комбинированный водный слой доводили до рН 10 насыщенным Na2СО3, экстрагировали ЭА (50 мл за 3 раза), сушили над Na2SO4 и концентрировали в вакууме для получения продукта 7 (5 г, 95%).
[0494] Пример 18F поясняет получение промежуточного хирального амина (R)-4-(3-аминобутил)-2-(трифторометокси)фенил диметилкарбамата, как показано на Схеме 10.
[0495] Схема 10: Получение хирального амина (R)-4-(3-аминобутил)-2-(трифторометокси)фенилдиметилкарбамата.
[0496] Получение соединения 6b (Схема 10): К перемешиваемому раствору 6 (4 г, 11,3 ммоль, 1,0 экв.) в ДХМ (50 мл) добавляли DMAP (0,2 г, 5 мол. %), TEA (2,3 г, 22,6 ммоль, 2,0 экв.) и диметилкарбамилхлорид 5 (1,5 г, 13,6 ммоль, 1,2 экв.). Смесь перемешивали при 40°С в течение 4 часов и гасили ледяной водой (20 мл). Смесь экстрагировали ДХМ (3×50 мл). Комбинированные органические слои промывали насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над Na2SO4 и концентрировали в вакууме для получения оранжевого масла. Неочищенный продукт очищали путем колоночной хроматографии на силикагеле (ПЭ:ЭА=5:1) для получения указанного в заголовке соединения 6b (2,8 г, 58%).
[0497] Получение соединения 7b (Схема 10): К перемешиваемому раствору 6b (3 г, 7,1 ммоль, 1 экв.) в ЭА (30 мл) при 0°С добавляли ЭА (НСl) (10 мл). Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, концентрировали при пониженном давлении для получения 7b (1,8 г, 100%) в виде желтого масла.
[0498] Пример 18G поясняет получение промежуточного хирального амина (R)-2-(4-(3-аминобутил)-2-(трифторометокси)фенокси)этан-1-ола, как показано на Схеме 12.
[0499] Схема 12: Получение хирального амина (R)-2-(4-(3-аминобутил)-2-(трифторометокси)фенокси)этан-1-ола.
[0500] Получение соединения 2 (Схема 12): К перемешиваемому раствору 1 (0,7 г, 2 ммоль, 1,0 экв.) в ДМФА (10 мл) добавляли K2CO3 (0,55 г, 4 ммоль, 2,0 экв.) и 2-бромоэтанол (0,3 г, 2,4 ммоль, 1,2 экв.). Смесь перемешивали при 80°С в течение 8 ч, затем гасили ледяной водой (30 мл), экстрагировали ЭА (20 мл за 3 раза). Комбинированный органический слой промывали насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над Na2SO4 и концентрировали в вакууме для получения оранжевого масла. Неочищенный продукт очищали путем колоночной хроматографии на силикагеле (ПЭ:ЭА=5:1) для получения указанного в заголовке соединения 2 (0,66 г, 83%).
[0501] Получение соединения 3 (Схема 12): К перемешиваемому раствору 2 (0,9 г, 2,3 ммоль, 1 экв.) в ЭА (30 мл) добавляли ЭА (НСl) (10 мл) при 0°С. Смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч, концентрировали при пониженном давлении для получения 3 (0,75 г, 100%) в виде желтого масла.
Пример 19: Общий принцип получения изоиндолинов из хиральных промежуточных аминов или промежуточных соединений gem-диметиламина.
[0502] Пример 19А поясняет получение изоиндолинового соединения 56, 2-(4-(4-гидрокси-3-(трифторометокси)фенил)-2-метилбутан-2-ил)изоиндолин-4-карбоновой кислоты, из промежуточного соединения gem-диметиламина, как показано на Схеме 13.
[0503] Схема 13: Получение изоиндолин 2-(4-(4-гидрокси-3-(трифторометокси)фенил)-2-метилбутан-2-ил)изоиндолин-4-карбоновой кислоты (ПРИМЕР 56).
[0504] Получение соединения 2 (Схема 13): К раствору 1; 2,3-диметилбензойной кислоты (2.0 г, 13,3 ммоль, 1,0 экв.) в МеОН (30 мл) добавляли тионилхлорид (1,5 мл) и перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение 3 ч. Смесь концентрировали, экстрагировали ЭА (30 мл). Органические слои промывали водой (2×30 мл), сушили над Na2SO4, концентрировали для получения нужного продукта 2 без дальнейшей очистки (2,1 г, 98%).
[0505] Получение соединения 3 (Схема 13): К раствору 2 (2,1 г, 13,3 ммоль, 1,0 экв.) в CCl4 (30 мл) добавляли NBS (4,7 г, 26,6 ммоль, 2,0 экв.) и ВРО (0,2 г). Смесь нагревали до кипения с обратным холодильником в течение 4 ч. Реакционную смесь разбавляли ДХМ (30 мл), промывали водой (2×30 мл), сушили над Na2SO4, концентрировали для получения неочищенного продукта, который очищали путем колоночной хроматографии для получения соединения 3; метил 2,3-бис(бромметил)бензоата (4,0 г, 94%).
[0506] Получение соединения 5 (Схема 13): К раствору 3 (0,3 г, 0,93 ммоль, 1,0 экв.) в ТГФ (10 мл) добавляли Na2СО3 (0,2 г, 1,9 ммоль, 2,0 экв.). Смесь перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение 4 ч. Образовавшуюся в результате смесь разбавляли ЭА, промывали насыщенным раствором хлорида натрия, концентрировали для получения неочищенного продукта 5 без дальнейшей очистки (300 мг, 82%).
[0507] Получение соединения 6 (Схема 13): К раствору 5 (0,3 г, 0,56 ммоль, 1,0 экв.) в ТГФ (5 мл) добавляли 10 и NaOH (5 мл). Смесь перемешивали при 55°С в течение 4 ч. Образовавшуюся в результате смесь концентрировали и доводили до рН 5 с использованием 6 и НСl. Смесь экстрагировали ЭА. Органический слой сушили над сульфатом натрия и концентрировали для получения остатка, который очищали путем препарата иной ВЭЖХ для получения нужного продукта, 2-(4-(4-гидрокси-3-(трифторометокси)фенил)-2-метилбутан-2-ил)изоиндолин-4-карбоновой кислоты (Соединение согласно Примеру 56) в виде белого твердого вещества (86 мг, 37%). 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 8,04 (д, J = 7,6 Гц, 1H), 7,63 (д, J = 7,2 Гц, 1Н), 7,54 (т, J = 8,0 Гц, 1Н), 7,14 (с, 1Н), 7,10 (д, J = 8,8 Гц, 1Н), 6,90 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 5,10-4,70 (м, 4Н), 2,73-2,69 (м, 2H), 2,10-2,06 (м, 2Н), 1,56 (с, 6Н); m/z (ЭСИ+) (М+Н)+ = 410,15. ЖХ-МС: 410,1 (M+1)+.
[0508] Пример 19В поясняет типичный способ получения сульфон-замещенного изоиндолинового соединения, 2-метокси-4-(3-метил-3-(4-(метилсульфонил)изоиндолин-2-ил)бутил)фенолгидрохлорида, из промежуточного соединения gem-диметиламина, как показано на Схеме 14.
[0509] Схема 14: Общая процедура получения сульфон-замещенного изоиндолина 2-метокси-4-(3-метил-3-(4-(метилсульфонил)изоиндолин-2-ил)бутил)фенола гидрохлорид (Соединение согласно Примеру 64).
[0510] Получение соединения 2 (Схема 14); К перемешиваемому раствору 1 (12,0 г, 64,8 ммоль. 1 экв.) в ТГФ (150 мл) добавляли н-BuLi (30 мл, 2.5М) при -75°С. Смесь перемешивали при -75°С в течение 1 ч, а затем по каплям добавляли диметилдисульфид (7,2 г, 76,4 ммоль). Смесь перемешивали при -75°С в течение 4 ч и гасили насыщенным раствором NH4Cl, экстрагировали этилацетатом, сушили над Na2SO4, концентрировали при пониженном давлении для получения неочищенного продукта 2 (12 г, 100%). 1-бромо-2,3-диметилбензол приобретали у Shanghai RuiDing Chemical Co. Ltd.
[0511] Получение соединении 3 (Схема 14); К перемешиваемому раствору 2 (12,0 г, 78,8 ммоль, 1 экв.) в ДХМ (200 мл) добавляли m-СРВА (30 г, 173,8 ммоль) при 0°С. Смесь перемешивали при 10°С в течение 2 ч и гасили 10% Na2SO3. Водный раствор доводили до pH 10 с использованием 10% NaOH, экстрагировали ДХМ, сушили над Na2SO4, концентрировали при пониженном давлении для получения неочищенного продукта, который очищали путем колоночной хроматографии (ПЭ:ЭА=5:1) для получения укачанного соединения 3 (9,0 г, 62%). 3-хлорхлорпербензойную кислоту приобретали у Shanghai DeMo Chemical Co. Ltd.
[0512] Получение соединения 4 (Схема 14): К перемешиваемому раствору 3 (1,0 г, 5,42 ммоль) в CCl4 (15 мл) добавляли NBS (2,22 г, 12,4 ммоль, 1,2 экв.) и AIBN (400 мг, 2,43 ммоль). Смесь перемешивали при 70°С в течение 6 ч, охлаждали, концентрировали in vacuo, очищали путем колоночной хроматографии (ПЭ:ЭА=3:1) для получения указанного соединения 4 (1,4 г, 75%). N-бромосукцинимид приобретали у Shanghai JingChun Chemical Co. Ltd. Азобисизобутиронитрил приобретали у Shanghai GuoYao Chemical Co. Ltd.
[0513] Получение соединения 6 (Схема 14): К раствору 6 (4,0 г, 1,2 моль) в ЭА (100 мл) добавляли HCl/ЭА (1,2 г, 2М, 200 моль). Образовавшийся в результате раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь концентрировали для получения неочищенного продукта 7 (2,8 г, 99%), который использовали на следующем этапе без дальнейшей очистки.
[0514] Получение соединения 7 (Схема 14): К раствору 6 (280 мг, 1.20 ммоль) в ТГФ (10 мл), 4 (410 мг, 1,2 ммоль) добавляли K2CO3 (330 мг, 2,4 ммоль). Образовавшийся в результате раствор перемешивали при 70°С в течение 12 ч. Реакционную смесь (фильтровали через слой целита, промывали ЭА и фильтрат концентрировали для получения неочищенного продукта 7 (500 мг, 100%), который использовали на следующем этапе без дальнейшей очистки.
[0515] Получение соединения 8 (Схема 14): К раствору 7 (500 мг, неочищенному) в ТГФ (10 мл) добавляли TBAF (1,2 мл, 1М). Образовавшийся в результате раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь концентрировали для получения остатка, который очищали путем препаративной ВЭЖХ для получения 8 (120 мг, 20% в два этапа).
[0516] Получение соединения 9; 2-метокси-4-(3-метил-3-(4-(метилсульфонил)изоиндолин-2-ил)бутил)фенола гидрохлорид (Соединение согласно Примеру 64) (Схема 14): К раствору 8 (120 мг, 0,30 моль) в ЭА (10 мл) добавляли НСl/ЭА (1,2 г, 2М, 2 ммоль). Образовавшийся в результате раствор перемешивали при комнатной температуре в течение 1 ч. Реакционную смесь концентрировали для получения продукта 9 (90 мг, 75%). 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,97 (д, J = 7,2 Гц, 1Н), 7,78-7,68 (м, 2Н), 6,88 (с, 1Н), 6,72 (с, 2Н), 5,09 (с, 2Н), 4,85 (с, 2Н), 3,85 (с, 3Н), 3,20 (с, 3Н), 2,73-2,70 (м, 2H), 2,13-2,10 (м, 2H), 1,58 (с, 6H); m/z (ЭСИ+) (М+Н)+ = 390,15.
[0517] Пример 19С поясняет типичный способ получения сульфон-замещенного изоиндолинового соединения, 2-метокси-4-(3-метил-3-(5-(метилсульфонил)изоиндолин-2-ил)бутил)фенола гидрохлорид, из промежуточного соединения gem-диметиламина, как покачано на Схеме 15.
[0518] Схема 15: Общая процедура получения сульфон-замещенного индолинового соединения 2-метокси-4-(3-метил-3-(5-(метилсульфонил)изоиндолин-2-ил)бутил)фенола гидрохлорид.
[0519] Получение соединения 2а (Схема 15): К раствору 1 (50 г, 0,47 моль, 1,00 экв.) в CHCl3 (500 мл) в ледяной бане по каплям добавляли HSO3Cl (75,5 мл, 0,95 моль, 2,00 экв.). После завершения добавления смесь нагревали до комнатной температуры и перемешивали в течение 1 ч. Образовавшуюся в результате смесь выливали в ледяную воду, а затем экстрагировали ДХМ (500 мл) за 3 раза. Комбинированный органический слой промывали водой, насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над Na2SO4, концентрировали in vacuo для получения твердого белого продукта 2а (76,5 г, 79,3%). 1,2-диметилбензол приобретали у Shanghai GuoYao Chemical Co. Ltd. Хлорсульфоновую кислоту приобретали у Shanghai AoYue Chemical Co. Ltd.
[0520] Получение соединении 3а (Схема 15): К суспензии 2 (77 г, 0,38 моль, 1,00 экв.) в насыщенном Na2SO3 (118 г, 0,94 моль, 2,50 экв.) добавляли 32% раствор NaOH (30 г, 0,75 моль, 2,00 экв.). После перемешивания в течение 3 ч при комнатной температуре, реакционную смесь подкисляли до рН=1 25% раствором НСl в ледяной бане. Осадок представляет собой неочищенный продукт 3а (59,75 г, 93,8%), который использовали без дальнейшей очистки.
[0521] Получение соединении 4а (Схема 15): В запаянной стеклянной пробирке к суспензии 3 (20 г, 0,12 моль, 1,00 экв.) в смеси H2O (50 мл) и раствора МеОН (67,5 мл), добавляли метилйодид (20 г, 0,14 моль, 1,15 экв.) и 32% раствор NaOH (47 г, 1,2 моль, 10,00 экв.). Реакционную смесь нагревали до 90°С и перемешивали в течение суток. После завершения реакции метанол удаляли при пониженном давлении и экстрагировали ЭА, концентрировали для получения продукта 4а (8,33 г, 38,5%). Метилйодид приобретали у Shanghai AoYue Chemical Co. Ltd.
[0522] Получение соединения 5а (Схема 15): К раствору соединения 4 (9,5 г, 51,6 ммоль, 1,00 экв.) в CCl4 добавляли NBS (18,3 г, 103 ммоль, 2,00 экв.) и ВРО (1,0 г, 5,2 ммоль, 0,10 экв.). Реакционную смесь нагревали до кипения с обратным холодильником в течение 6 ч. После завершения реакции растворитель удаляли при пониженном давлении. Полученный остаток разбавляли ПЭ и H2O. Органический слой высушивали над Na2SO4 и концентрировали для получения неочищенного продукта, который очищали путем FCC (ПЭ:ЭА=10:1~3:1) для получения сульфонового промежуточного соединения 5а; 1,2-бис(бромметил)-4-(метилсульфонил)бензол.
[0523] Получение соединения 9а, 2-метокси-4-(3-метил-3-(5-(метилсульфонил)изоиндолин-2-ил)бутил)фенола гидрохлорид, выполняли из промежуточного соединения 5а способами, описываемыми в Примере 19В.
Пример 20: Получение 4-(3-(4-фторизоиндолин-2-ил)-3-метилбутил)-2-изопропоксифенола гидрохлорида, соединения согласно Примеру 28
[0524] Пример 20 поясняет типичный способ получения 4-(3-(4-фторизоиндолин-2-ил)-3-метилбутил)-2-изопропоксифенола гидрохлорид, соединения согласно Примеру 28, как показано на Схеме 16.
[0525] Схема 16: Процедура получения 4-(3-(4-фторизоиндолин-2-ил)-3-метилбутил)-2-изопропоксифенола гидрохлорида, соединения согласно Примеру 28.
[0526] Получение соединения 2 (Схема 16): К суспензии 1-фтор-2,3-диметилбензола (100 г, 0,81 ммоль) в четыреххлористом углероде (1,5 л) добавляли N-бромосукцинимид (288 г, 1,62 ммоль), пероксид бензоила (10 г). Смесь нагревали до 70°С. После перемешивания в течение 15 ч смесь охлаждали до комнатной температуры, выливали в воду (1 л) и экстрагировали ДХМ (3×1 л). Комбинированные органические слои очищали путем колоночной флэш-хроматографии петролейным эфиром для получения продукта 2 (161 г, 70%) в виде белого твердого вещества.
ТСХ:ПЭ/ЭА = 10/1; Rf (Соединение 1) = 1; Rf (Соединение 2) = 0,8
[0527] Получение соединения 3 (Схема 16): К смеси 1,1-диметилпропаргиламина (20 г, 240 ммоль, 1,0 экв.) в ТГФ (900 мл) добавляли соединение 2 (70,7 г, 253 ммоль, 1,05 экв.) и триэтиламин (73 г, 720 ммоль, 3 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 60°С в течение 12 ч. Смесь фильтровали через слой целита и слой промывали этилацетатом. Фильтрат концентрировали in vacuo для получения оранжевого масла. Остаток очищали путем колоночной флэш-хроматографии (ПЭ/ЭА, 10/1) для получения соединения 3 (30 г, 61%) в виде желтого твердого вещества. ТСХ:ПЭ/ЭА = 10/1; Rf (Соединение 2) = 0,8; Rf (Соединение 3) = 0,5.
[0528] Получение соединения 5 (Схема 16): К раствору 2-изопропоксифенола (100 г, 0,66 моль, 1,0 экв.) в метаноле (700 мл) добавляли гидроксид натрия (39,4 г, 1,0 моль, 1,5 экв.) и йодид калия (114,5 г, 0,69 моль, 1,05 экв.). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре. К реакционной смеси по каплямкаплям добавляли гипохлорит натрия (978 г, 1,31 моль, 2,0 экв.). Когда ЖХМС указывала на расход исходного вещества, добавляли концентрированную НСl до pH 1. Добавляли сульфит натрия (56 г, 445 ммоль, 1,0 экв.). Смесь экстрагировали этилацетатом (3×500 мл) и комбинированные органические слои промывали насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo для получения соединения 5 (175 г, 96%) в виде белого твердого вещества. ТСХ:ПЭ/ЭА=10/1; Rf (Соединение 4) = 0,4; Rf (Соединение 5) = 0,4
[0529] Получение соединения 6 (Схема 16): К раствору соединения 5 (350 г, 1,26 моль, 1,0 экв.) в ДМФА (2 л) добавляли гидрид натрия (65,4 г, 1,64 моль, 1,3 экв.) при 0°С в атмосфере азота. После перемешивания в течение 0,5 ч медленно добавляли хлорметилметиловый эфир (131,7 г, 1,64 ммоль, 1,3 экв.). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь гасили водой (4 л) и экстрагировали этилацетатом (3×1 л). Комбинированные органические слои промывали насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo для получения неочищенного продукта. Остаток очищали путем колоночной флэш-хроматографии (ПЭ/ЭА, 10/1) для получения соединения 6 (300 г, 74%) в виде белого твердого вещества. ТСХ:ПЭ/ЭА = 10/1; Rf (Соединение 5) = 0,4; Rf (Соединение 6) = 0,6.
[0530] Получение соединения 7 (Схема 16): К раствору соединения 6 (56,2 г, 174 ммоль, 1,0 экв.) в ацетонитриле (600 мл) добавляли соединение 3 (39 г, 192 ммоль, 1,1 экв.) и X-Phos (4,16 г, 9,0 ммоль, 0,05 экв.) с последующим добавлением карбоната цезия (56.9 г, 174 ммоль, 1,0 экв.) и диацетата палладия (1,2 г, 5,23 ммоль, 0,03 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 60°С в течение 12 ч. Реакционную смесь гасили ледяной водой (1 л) с последующей экстракцией этилацетатом (3×500 мл). Комбинированные органические слои промывали насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo для получения неочищенного продукта. Остаток очищали путем колоночной флэш-хроматографии (ПЭ/ЭА, 10/1) для получения соединения 6 (48,5 г, 70%) в виде бурого твердого вещества. ТСХ:ПЭ/ЭА = 10/1; Rf (Соединение 6) = 0,6; Rf (Соединение 7) = 0,3.
[0531] Получение соединения 28 (Схема 16): К раствору соединения 7 (72 г, 181 ммоль, 1,0 экв.) в метаноле (1,4 л) добавляли концентрированную НСl (36 мл, 360 ммоль, 2,0 экв.) и 10% палладий на активированном угле (14 г). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч под шаром, заполненным H2. Смесь фильтровали через слой целита и слой промывали метанолом. Фильтрат концентрировали in vacuo для получения бледно-оранжевого масла. Остаток разбавляли эфиром, перемешивали при комнатой температуре, и образовывалось твердое вещество. Твердое вещество фильтровали и промывали этанолом для получения соединения согласно Примеру 28 (60 г, 93%) в виде белого твердого вещества. ТСХ:ПЭ/ЭА = 3/1; Rf (Соединение 7) = 0.6; Rf (Продукт соединение согласно Примеру 28) = 0,3, ЖХ-МС: 358,2 (М+1)+, 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6) δ 12,17 (с, 1Н), δ 8,59 (с, 1Н), δ 7,43 (м, 1Н), δ 7,21 (м, 2Н), δ 6,80 (с, 1Н), 6,71-6,63 (м, 2Н), 4,88-4,79 (м, 2Н), δ 4,66 (м, 2Н), δ 4,47 (м, 2Н), δ 2,53 (м, 2Н), δ 1,97 (м, 2Н), δ 1,43 (с, 6Н), δ 1,22 (с, 6Н).
Пример 21: Получение 2-(трет-бутокси)-4-(3-метил-3-(5-(метилсульфонил)изоиндолин-2-ил)бутил)фенола, соединения согласно Примеру 62.
[0532] Пример 21 поясняет типичный способ получения 2-(трет-бутокси)-4-(3-метил-3-(5-(метилсульфонил)изоиндолин-2-ил)бутил)фенола, соединения согласно Примеру 62, как показано на Схеме 17.
[0533] Схема 17: Процедура получения 2-(трет-бутокси)-4-(3-метил-3-(5-(метилсульфонил)изоиндолин-2-ил)бутил)фенола, соединения согласно Примеру 62.
[0534] Получение соединения 1 (Схема 17): В толстостенную стеклянную бутылку для реакций под давлением при -30°С, содержавшую смесь катехола (50,0 г, 454 ммоль, 1,0 экв.) и концентрированной серной кислоты (0,3 мл) в дихлорметане (200 мл) конденсировали изобутен (152,6 г, 2,72 моль, 6,0 экв.). После герметичного закрывания бутылки резьбовой тефлоновой крышкой, оснащенной защищенным тефлоном резиновым кольцом, смесь нагревали при 35°С в течение 3 ч до получения прозрачного раствора. После охлаждения (-30°С) добавляли триэтиламин (1,5 мл, 10,8 ммоль) и смесь концентрировали. Остаток суспендировали в 0,5 М NaOH (1 л) и перемешивали в течение 10 мин. Темно-зеленый раствор промывали петролейным эфиром (2×100 мл) и промывочные слои повторно экстрагировали 0,5 М NaOH (3×100 мл). Комбинированные водные слои доводили до pH 7-8 с использованием 2 н HCl (400 мл) и экстрагировали этилацетатом (2×1 л), сушили над сульфатом натрия и концентрировали для получения продукта 1 (67,7 г, 90%) в виде бесцветного масла, которое использовали непосредственно для реакции следующего этапа без дальнейшей очистки. ТСХ:ПЭ/ЭА = 50/1; Rf (Катехол) = 0,1; Rf (Соединение 1) = 0,6.
[0535] Получение соединения 2 (Схема 17): К перемешиваемому раствору соединения 1 (112,2 г, 676 ммоль, 1,2 экв.) и йодида калия (112,2 г, 676 ммоль, 1,0 экв.) в метаноле (2 л) при 0°С медленно добавляли гидроксид натрия (27,0 г, 676 ммоль, 1,0 экв.) с последующим добавлением по каплямкаплям водного хлорита натрия (7% водн., 718,8 мл, 710 ммоль, 1,05 экв.) в течение 3 ч при поддержании температуры реакционной смеси ниже 0°С. Смесь перемешивали при 0°С в течение дополнительных 30 мин и нейтрализовали путем добавления 2 н НСl при 0°С до pH 7, экстрагировали ДХМ (2×1 л). Органические слои сушили над сульфатом натрия и концентрировали для получения продукта 2 (179,8 г, 91%). ТСХ:ПЭ/ЭА = 50/1; Rf (Соединение 1) = 0,6; Rf (Соединение 2) = 0,6.
[0536] Получение соединения 3 (Схема 17): К перемешиваемому раствору соединения 2 (179,8 г, 616 ммоль, 1,0 экв.) и триэтиламина (186,6 г, 1,85 моль, 3,0 экв.) в дихлорметане (2 1.) при 0°С медленно добавляли ацетилхлорид (53.2 г, 677 ммоль, 1,1 экв.). Смесь перемешивали при 0°С в течение дополнительных 30 мин, нагревали до комнатной температуры и перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч, в реакционную смесь добавляли воду (1 л) и органический слой промывали насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над сульфатом натрия и концентрировали для получения продукта 3 (206 г, 100%), который использовали непосредственно на следующем этапе без дальнейшей очистки. ТСХ:ПЭ/ЭА = 50/1; Rf (Соединение 2) = 0,6; Rf (Соединение 3) = 0,5.
[0537] Получение соединении 4 (Схема 17): К перемешиваемому раствору соединения 3 (206 г, 616 ммоль, 1,0 экв.) в триэтиламине (4,0 л) добавляли 2-метилбут-3-ин-2-амин (102,5 г, 1,23 моль, 2,0 экв.), Pd(PPH3)2Сl2 (15,1 г, 18,5 м моль, 0,03 экв.) и йодид меди(I) (5,9 г, 31 ммоль, 0,05 экв.) и образовавшуюся в результате смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 17 ч. Растворитель удаляли при пониженном давлении и неочищенный продукт очищали путем хроматографии на силикагеле для получения указанного соединения 4 (132,7 г, 74%). ТСХ:ПЭ/ЭА = 1/1; Rf (Соединение 3) = 0,9; Rf (Соединение 4) = 0,3.
[0538] Получение соединения 5 (Схема 17): К перемешиваемому раствору соединения 4 (104,5 г, 0,36 моль) в этаноле (1,5 л) добавляли Pd/C (10% мае., 10,5 г). Смесь перемешивали под шаром, заполненным H2 в течение суток и фильтровали. Фильтрат выпаривали до сухого состояния для получения соединения 5 (106,3 г, 100%), которое использовали непосредственно на следующем этапе без дальнейшей очистки. ТСХ:ПЭ/ЭА = 1/1; Rf (Соединение 4) = 0,3; Rf (Соединение 5) = 0,3.
[0539] Получение соединения 6 (Схема 17): К раствору о-ксилол (115,7 г, 1,09 моль, 1,0 экв.) в хлороформе (1,0 л) при 0°С по каплям добавляли СlSO3H (254 г, 2,18 моль, 2,0 экв.). После добавления реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 суток и выливали в лед. Необработанную смесь экстрагировали дихлорметаном (3×1,0 л). Органические слои комбинировали, сушили над безводным сульфатом натрия, концентрировали для получения необработанного соединения 6 (161,5 г, 80%) в виде белого твердого вещества, которое использовали непосредственно на следующем этапе без дальнейшей очистки. ТСХ:ПЭ/ЭА = 5/1; Rf (Соединение 6) = 0,7.
[0540] Общая процедура получения соединения 7 (Схема 17): К перемешиваемому раствору соединения 6 (161,5 г, 0,87 моль, 1,0 экв.) в насыщенном растворе сульфита натрия (273 г, 2,17 моль, 2,5 экв., в 2,0 л воды) по каплям добавляли 32% NaOH (69,4 г, 1,73 моль, 2,0 экв.), пока раствор не достигал pH 9. После перемешивания при комнатной температуре в течение суток реакционную смесь подкисляли концентрированной НСl в ледяной бане до pH 1. Осадок фильтровали и промывали ледяной водой (2×), сушили in vacuo для получения неочищенного продукта 7 (131 г, 88%), который использовали непосредственно на следующем этапе без дальнейшей очистки. ТСХ:ПЭ/ЭА = 5/1; Rf (Соединение 6) = 0,7; Rf (Соединение 7) = 0,6.
[0541] Получение соединения 8 (Схема 17): К перемешиваемому раствору соединения 7 (130 г, 0,76 моль, 1,0 экв.) и карбоната калия (211 г, 1,53 моль, 2,0 экв.) в ДМФА (300 мл) добавляли йодометан (96 мл, 1,53 моль, 2,0 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 40°С в течение суток. Реакционную смесь выпаривали до сухого состояния, экстрагировали этилацетатом. Органические слои промывали водой и насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над сульфатом натрия и концентрировали, очищали путем колоночной флэш-хроматографии (ПЭ:ЭА, 10:1~5:1) для получения соединения 8 (85,2 г, 61%). ТСХ:ПЭ/ЭА = 5/1; Rf (Соединение 7) = 0,6; Rf (Соединение 8) = 0,3.
[0542] Получение соединения 9 (Схема 17): К перемешиваемому раствору соединения 8 (78,2 г, 424 ммоль, 1,0 экв.) в 1,2-дихлорэтане (1,2 л), добавляли N-бромосукцинимид (166 г, 934 ммоль, 2,2 экв.) и AIBN (6,9 г, 42,4 ммоль, 0,1 экв.). Реакционную смесь перемешивали при нагревании с обратным холодильником в течение суток. Реакционную смесь разбавляли водой и дихлорметаном. Органический слой собирали и сушили над сульфатом натрия и концентрировали, очищали путем колоночной флэш-хроматографии для получения соединения 9, которое затем перекристаллизировали из горячего метанола для получения чистого продукта 8 (75 г, 52%). ТСХ:ПЭ/ЭА = 5/1; Rf (Соединение 8) = 0,3; Rf (Соединение 9) = 0,2.
[0543] Получение соединения 10 (Схема 17): К перемешиваемому раствору соединения 5 (46 г, 157 ммоль, 1,0 экв.) и соединения 9 (53,5 г, 157 ммоль, 1,0 экв.) в ТГФ (460 мл) добавляли триэтиламин (47,7 г, 472 ммоль, 3,0 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 40°С в течение суток, фильтровали и фильтрат выпаривали до сухого состояния и очищали путем колоночной флэш-хроматографии для получения соединения 10 (45 г, 63%). ТСХ:ПЭ/ЭА = 1/1; Rf (Соединение 5) = 0,3; Rf (Соединение 9) = 1,0; Rf (Соединение 10) = 0,4.
[0544] Получение соединения 62 (Схема 17): К перемешиваемому раствору соединения 10 (45 г, 98,4 ммоль) в метаноле (300 мл) добавляли метоксид натрия (844 мг, 15,6 ммоль, 0,16 экв.) одной порцией. Раствор перемешивали при комнатной температуре в течение суток. В реакционную смесь по каплям добавляли воду (250 мл) в течение 1 ч, смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч и фильтровали. Белое твердое вещество собирали и сушили в вакууме в течение суток для получения чистого основания - соединения согласно Примеру 62 (38 г, 89%). ТСХ:ПЭ/ЭА = 1/1; Rf (Соединение 10) = 0,4; Rf (Соединение 62) = 0,4; ЭСИ-МС: 432 (М+1)+; 1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3) δ 7,80-7,78 (м, 2H), 7,40-7,38 (м, 1Н), 6,87-6,79 (м, 3Н), 5,58 (с, 1Н), 4,11 (с, 4Н), 3,05 (с, 3Н), 2,61-2,57 (м, 2H), 1,76-1,72 (м, 2H), 1,48 (с, 9Н), 1,18 (с, 6Н).
Пример 22: Получение (2-(4-(4-гидрокси-3-метоксифенил)-2-метилбутан-2-ил)изоиндолин-4-ил)(пиперазин-1-ил)метанона, соединения согласно Примеру 76.
[0545] Пример 22 поясняет типичный способ получения (2-(4-(4-гидрокси-3-метоксифенил)-2-метилбутан-2-ил)изоиндолин-4-ил)(пиперазин-1-ил)метанона, соединения согласно Примеру 76, как показано на Схеме 18.
[0546] Схема 18: Процедура получения (2-(4-(4-Гидрокси-3-метоксифенил)-2-метилбутан-2-ил)изоиндолин-4-ил)(пиперазин-1-ил)метанона, соединения согласно Примеру 76.
[0547] Получение соединения 2 (Схема 18): К раствору 2,3-диметилбензойной кислоты (60 г, 0,399 моль) в метаноле при 0°С добавляли тионилхлорид (20 мл). Реакционную смесь нагревали до 60°С. После перемешивания в течение суток реакционную смесь охлаждали и концентрировали для получения неочищенного сложного метилового эфира (65 г, 0,396 моль). К суспензии неочищенного сложного метилового эфира (65 г, 0,396 моль) в четыреххлористом углероде (500 мл) добавляли N-бромосукцинимид (142,2 г, 0,798 ммоль), пероксид бензоила (6 г, 24,8 ммоль). Смесь нагревали до 70°С. После перемешивания в течение 15 ч смесь охлаждали до комнатной температуры, выливали в воду (250 мл) и экстрагировали дихлорметаном (3×250 мл). Комбинированные органические слои очищали путем колоночной флэш-хроматографии с петролейным эфиром для получения продукта 2 (120 г, 94%) в виде белого твердого вещества. ТСХ:ПЭ/ЭА = 10/1; Rf (сложного метилового эфира соединения 1) = 0,8; Rf (Соединение 2) = 0,7.
[0548] Получение соединения 3 (Схема 18):
К смеси 1,1-диметилпропаргиламин (11,4 г, 0,14 моль, 1,0 экв.) в ТГФ (500 мл) добавляли метил 2,3-бис(бромметил)бензоат (40,0 г, 0,125 моль, 1,1 экв.) и триэтиламин (50,5 г, 0,50 моль, 4,0 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 60°С в течение 12 ч. Смесь фильтровали через слой целита и слой промывали этилацетатом. Фильтрат концентрировали in vacuo для получения оранжевого масла. Остаток очищали путем колоночной флэш-хроматографии (ПЭ/ЭА: 10/1) для получения соединения 3 (19 г, 62%) в виде желтого твердого вещества. ТСХ:ПЭ/ЭА = 10/1; Rf (Соединение 2) = 0,8; Rf (Соединение 3) = 0,5.
[0549] Получение соединения 5 (Схема 18): К раствору 2-метоксифенола (100 г, 0,81 моль, 1,0 экв.) в метаноле (1 л) добавляли гидроксид натрия (48,3 г, 1,21 моль, 1,5 экв.) и йодид калия (140,4 г, 0,84 моль, 1,05 экв.). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре. К реакционной смеси по каплям добавляли гипохлорит натрия (1199 г, 1,61 моль, 2,0 экв.). Когда ЖХМС указывала на расход исходного вещества, добавляли концентрированную НСl до pH 1. Добавляли сульфит натрия (56 г, 0,44 моль, 0,54 экв.). Смесь экстрагировали этилацетатом (3×500 мл) и комбинированные органические слои промывали насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo для получения соединения 5 (160 г.79%) в виде желтого масла. ТСХ:ПЭ/ЭА = 10/1; Rf (Соединение 4) = 0,4; Rf (Соединение 5) = 0,4.
[0550] Получение соединения 6 (Схема 18): К раствору соединения 5 (31,4 г, 125,8 ммоль, 1,0 экв.) в ДМФА (200 мл) добавляли гидрид натрия (6,54 г, 163,6 ммоль, 1,3 экв.) при 0°С в атмосфере азота. Через 0,5 ч медленно добавляли хлорметилметиловый эфир (13,2 г, 163,6 ммоль, 1,3 экв.). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 2 ч. Реакционную смесь гасили водой (400 мл) и экстрагировали этилацетатом (3×200 мл). Комбинированные органические слои промывали насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo для получения неочищенного продукта. Остаток очищали путем колоночной флэш-хроматографии (ПЭ/ЭА, 10/1) для получения соединения 6 (30 г, 74%) в виде желтого масла. ТСХ:ПЭ/ЭА = 10/1; Rf (Соединение 5) = 0,4; Rf (Соединение 6) = 0,6.
[0551] Получение соединения 7 (Схема 18): К раствору соединения 6 (10,2 г, 34,5 ммоль, 1,2 экв.) в ацетонитриле (120 мл) добавляли соединение 3 (7,00 г, 28,7 ммоль, 1,0 экв.) и X-Phos (624 мг, 1,30 ммоль, 0,05 экв.) с последующим добавлением карбоната цезия (9,38 г, 28,7 ммоль, 1,0 экв.) и диацетата палладия (168 мг, 0,74 ммоль, 0,03 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 60°С в течение 12 ч. Реакционную смесь гасили ледяной водой (100 мл) и экстрагировали этилацетатом (3×300 мл). Комбинированные органические слои промывали насыщенным раствором хлорида натрия, сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo для получения неочищенного продукта. Остаток очищали путем колоночной флэш-хроматографии (ПЭ/ЭА, 10/1) для получения соединения 6 (9,4 г, 79%) в виде бурого твердого вещества. ТСХ:ПЭ/ЭА = 10/1; Rf (Соединение 6) = 0,6; Rf (Соединение 7) = 0,3.
[0552] Получение соединения 8 (Схема 18): К раствору соединения 7 (3,81 г, 9,31 ммоль, 1,0 экв.) в метаноле (220 мл) добавляли концентрированную НСl (2 мл) и палладий на активированном угле (1,8 г, 10%). Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 4 ч в атмосфере водорода. Смесь фильтровали через слой целита и слой промывали метанолом. Фильтрат концентрировали in vacuo для получения бледно-оранжевого масла. Остаток разбавляли эфиром, перемешивали при комнатной температуре, и образовывалось твердое вещество. Твердое вещество фильтровали и промывали этанолом для получения соединения 8 (4,8 г, 100%) в виде желтого твердого вещества. ТСХ:ПЭ/ЭА = 3/1; Rf (Соединение 7) = 0,6; Rf (Продукт 8) = 0,3.
[0553] Получение соединения 9 (Схема 18): К раствору соединения 8 (4,80 г, 13,0 ммоль, 1,0 экв.) в метаноле (100 мл) добавляли гидроксид натрия (2,0 г, 50 ммоль) и воду (15 мл). Реакционную смесь перемешивали при 40°С в течение 6 ч. После охлаждения до комнатной температуры реакционную смесь доводили до pH 7 с использованием 6 н НСl, экстрагировали (ДХМ/МеОН, 10/1; 3×100 мл). Органическую фазу сушили над сульфатом натрия, фильтровали и концентрировали in vacuo для получения неочищенного продукта, который растирали с этилацетатом для получения 9 (2,8 г, 60%) в виде синего твердого вещества. ТСХ:ПЭ/ЭА=2/1; Rf (Соединение 8) = 0,6; Rf (Продукт 9) = 0,05.
[0554] Получение соединения 76 (Схема 18): К смеси 9 (2,8 г, 7,87 ммоль, 1,0 экв.) в ДМФА (50 мл) последовательно добавляли 1-(трет-бутоксикарбонил)пиперазин (1,54 г, 8,26 ммоль, 1,04 экв.), EDCI (1,81 г, 9,44 ммоль, 1,2 экв.), НОВТ (615 мг, 4,55 ммоль, 0,57 экв.) и триэтиламин (1,74 г, 17,2 ммоль, 2,18 экв.). Реакционную смесь перемешивали при 25°С в течение 36 ч. Смесь фильтровали через слой целита и слой промывали этилацетатом. Фильтрат концентрировали in vacuo для получения масла. Остаток очищали путем препаративной ВЭЖХ для получения соединения 10 (2,0 г) в виде белого твердого вещества. Соединение 10 (2,0 г) обрабатывали НСl в этилацетате (3,5 М, 15 мл). После перемешивания при 25°С в течение 1 ч добавляли петролейный эфир (100 мл). Образовавшееся в результате белое твердое вещество фильтровали, промывали эфиром и сушили на воздухе для получения соединения согласно Примеру 76 (1,6 г, 41%, два этапа) в виде белого твердого вещества. ТСХ:ДХМ/МеОН = 10/1; Rf (Соединение 9) = 0,3; Rf (Продукт 10) = 0,35; ЖХ-МС: 424,70 (М+1)+; 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD) δ 7,55-7,48 (м, 3H), 6,87 (с, 1Н), 6,72-6,70 (м, 2Н), 4,95-4,79 (м, 4Н) 3,90-3,80 (м, 7Н), 3,35-3,30 (м, 4Н), 2,72-2,69 (м, 2Н), 2,12-2,08 (м, 2Н), 1,56 (с, 6Н).
Пример 23: Аналитические данные образцов соединений изоиндолина.
[0555] Пример 23 представляет аналитические данные для соединений, полученных с применением способов, аналогичных вышеописанным.
[0556] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 1: 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 11,45 (уш с, 1H), 8,76 (уш с, 1Н), 7,48-7,41 (м, 3Н), 6,82 (с, 1Н), 6,69 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 6,53 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 4,80-4,50 (м, 4Н), 3,75 (с, 3Н), 3,53-3,50 (м, 1Н), 2,70-2,65 (м, 1H), 2,12-2,10 (м, 1Н), 1,83-1,80 (м, 1Н), 1,36 (д, J = 6,0 Гц, 3Н); m/z (ЭСИ+) (M+H)+ = 332,05.
[0557] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 2: 1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3): δ 7,75-7,45 (м, 4H), 6,85-6,60 (м, 5Н), 5,71 (уш с, 2Н), 4,14-3,75 (м, 7Н), 2,90-2,50 (м, 5Н), 1,78-1,20 (м, 8Н0, 1,26-1,23 (м, 3Н); m/z (ЭСИ+) (М+Н)+ = 366,10.
[0558] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 3: 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 12,57 (уш с, 1Н), 8.80 (уш с, 1Н), 7,66 (д, J = 5,2 Гц, 2Н), 6,79 (с, 1Н), 6,68 (д, J = 7,2 Гц, 1H), 6,60 (д, J = 7,2 Гц, 1Н) 3,74 (с, 3Н), 3,53-3,50 (м, 1Н), 2,70-2,60 (м, 1Н), 2,12-2,10 (м, 1H), 1,83-1,80 (м, 1Н), 1,36 (д, J = 6,0 Гц, 3Н); m/z (ЭСИ+) (М+Н)+ = 366,20.
[0559] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 4: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,75-7,72 (м, 2Н), 7,61 (д, J = 7,6 Гц, 1Н), 7,51-7,45 (м, 2Н), 7,24 (дд, J1 = 8,0 Гц, J2 = 2,0 Гц, 1H), 5,05-4,90 (м, 2Н), 4,75-4,65 (м, 2Н), 3,69-3,64 (м, 1Н), 2,89-2,82 (м, 1Н), 2,73-2,67 (м, 1Н), 2,27-2,22 (м, 1Н), 1,98-1,93 (м, 1Н), 1,52 (д, J = 6,4 Гц, 3Н); m/z (ЭСИ+) (M+H)+ = 388,10.
[0560] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 5: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,61 (уш с, 2Н), 7,49-7,45 (м, 2Н), 7,22 (дд, J1 = 8,4 Гц, J2 = 2,0 Гц, 1Н), 4,80-4,20 (м, 4Н), 3,66-3,62 (м, 1Н), 2,89-2,80 (м, 1Н), 2,75-2,65 (м, 1Н), 2,25-2,20 (м, 1Н), 1,98-1,90 (м, 1Н), 1,52 (д, J = 6,4 Гц, 3H); m/z (ЭСИ+) (M+H)+ = 390,00.
[0561] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 6: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 6,84 (с, 2H), 6,74-6,68 (м, 2Н), 5,99 (с, 2Н), 4,74-4,65 (м, 2Н), 4,47-4,41 (м, 2Н), 3,85 (с, 3Н), 3,60-3,55 (м, 1Н), 2,80-2,70 (м, 1Н), 2,65-2,55 (м, 1Н), 2,25-2,15 (м, 1Н), 1,98-1,90 (м, 1H), 1,46 (д, J = 6,4 Гц, 3Н); m/z (ЭСИ+) (М+Н)+ = 342,05.
[0562] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 7: 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 8,61 (с, 1H), 6,83 (с, 2Н), 6,74 (с, 1Н), 6,65 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 6,57 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 3,80 (с, 4Н), 3,69 (с, 6Н), 3,60-3,55 (м, 1Н), 2,85-2,80 (м, 1Н), 2,75-2,70 (м, 1Н), 1,82-1,75 (м, 1H), 1,60-1,55 (м, 1 Н), 1,06 (д, J = 6,4 Гц, 3Н); m/z (ЭСИ+) (М+Н)+ = 358,25.
[0563] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 8: 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 12,20 (с, 1H), 8,79 (с, 1Н), 7,44-7,40 (м, 1Н), 7,24-7,19 (м, 2Н), 6,84 (с, 1Н), 6,70 (д, J = 8,0 Гц, 1 Н), 6,65 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 4,85-4,57 (м, 4Н), 3,52-3,48 (м, 1Н), 2,71-2,64 (м, 1Н), 2,20-2,17 (м, 1Н), 1,97-1,84 (м, 1Н), 1,40-1,38 (м, 3Н); m/z (ЭСИ+) (M+H)+ = 316,10.
[0564] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 9: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,60 (д, J = 2,0 Гц, 1Н), 7,48-7,43 (м, 2Н), 7,24 (дд, J1 = 8,8 Гц, J2 - 2,0 Гц, 2Н), 7,15 (т, J = 8,4 Гц, 1Н), 4,90-4,70 (м, 4Н), 3,70-3,60 (м, 1Н), 2,90-2,80 (м, 1Н), 2,30-2,20 (м, 1Н), 2,00-1,80 (м, 1H), 1,51 (д, J = 6,8 Гц, 3Н); m/z (ЭСИ+) (M+H)+ = 338,10.
[0565] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 10: 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 11,90 (с, 1H), 7,58 (д, J = 2,0 Гц, 1Н), 7,54 (д, J = 8,4 Гц, 1Н), 7,28 (дд, J1 = 8,0 Гц, J2 = 2,0 Гц, 1H), 6,90 (д, J = 5,2 Гц, 2Н), 4,65-4,50 (м, 2Н), 4,48-4,35 (м, 2Н), 3,55-3,45 (м, 1Н), 2,82-2,78 (м, 1Н), 2,65-2,55 (м, 1Н), 2,15-2,05 (м, 1Н), 1,90-1,80 (м, 1Н), 1,35 (д, J = 6,4 Гц, 3Н); m/z (ЭСИ+) (М+Н)+ = 364,10.
[0566] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 11: 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 11,96 (с, 1Н), 7,59 (с, 1Н), 7,55 (д, J = 8,4 Гц, 1Н), 7,29 (дд, J1 = 8,0 Гц, J2 = 2,0 Гц, 1Н), 6,94 (д, J = 5,2 Гц, 2Н), 4,66-4,55 (м, 2Н), 4,48-4,35 (м, 2Н), 3,74 (с, 6Н), 3,55-3,45 (м, 1Н), 2,82-2,78 (м, 1Н), 2,65-2,55 (м, 1Н), 2,20-2,10 (м, 1Н), 1,95-1,80 (м, 1Н), 1,37 (д, J = 6,4 Гц, 3H); m/z (ЭСИ+) (М+Н)+ = 380,15.
[0567] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 12: 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 7,58 д, J = 2,0 Гц, 1H), 7,55 (д, J = 8,4 Гц, 1Н), 7,41-7,38 (м, 1Н), 7,28 (дд, J1 = 8,0 Гц, J2 = 2,0 Гц, 1H), 7,24-7,16 (м, 3Н), 4,73-4,62 (м, 2Н), 4,58-4,45 (м, 2Н), 3,55-3,45 (м, 1Н), 2,82-2,78 (м, 1Н), 2,65-2,55(м, 1Н), 2,20-2,10 (м, 1Н), 1,95-1,80 (м, 1Н), 1,37 (д, J = 6,4 Гц, 3Н); m/z (ЭСИ+) (M+H)+ = 338,10.
[0568] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 13: 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 7,58 (д, J = 2,0 Гц, 1Н), 7,55 (д, J = 8,4 Гц, 1Н), 7,28 (дд, J1 = 8,0 Гц, J2 = 2,0 Гц, 1Н), 7,22 (дд, J1 = 8,0 Гц, J2 = 3,2 Гц, 1Н), 7,14 (д, J = 6,4 Гц, 2Н), 4,73-4,61 (м, 2Н), 4,54-4,45 (м, 2H), 3,52-3,49 (м, 1Н), 2,80-2,75 (м, 1Н), 2,65-2,59 (м, 1Н), 2,30 (с, 3Н), 2,16-2,14 (м, 1H), 1,90-1,85 (м, 1Н), 1,35 (д, J = 6,4 Гц, 3Н); m/z (ЭСИ+) (М+Н)+ = 334,15.
[0569] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 14: 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 7,41-7,38 (м, 1Н), 7,25-7,15 (м, 2Н), 6,80 (д, J = 6,0 Гц, 1Н), 6,68 (д, 8,0 Гц, 1Н), 6,62 (дд, J1 = 8,0 Гц, J2 = 2,0 Гц, 1Н), 4,77-4,63 (м, 2Н), 4,59-4,44 (м, 2Н), 3,75 (с, 3Н), 3,51-3,48 (м, 1H), 2,70-2,62 (м, 1Н), 2,52-2,44 (м, 1Н), 2,14-2,11 (м, 1Н), 1,90-1,85 (м, 1Н), 1,35 (д, J = 6,4 Гц, 3Н); m/z (ЭСИ+) (M+H)+ = 316,60.
[0570] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 15: 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 11,60 (с, 1H), 7,59 (с, 1Н), 7,55 (д, J = 8,4 Гц, 1Н), 7,29-7,24 (м, 2Н), 6,93-6,90 (м, 2Н), 4,75-4,58 (м, 2Н), 4,58-4,44 (м, 2Н), 3,74 (с, 3Н), 3,52-3,50 (м, 1Н), 2,81-2,74 (м, 1Н), 2,65-2,57 (м, 1Н), 2,20-2,10 (м, 1Н), 1,90-1,80 (м, 1Н), 1,36 (д, J = 6,0 Гц, 3Н); m/z (ЭСИ+)(М+Н)+ = 350,15.
[0571] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 16: 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 12,32 (с, 1Н), 7,60 (с, 1Н), 7,56-7,54 (м, 1Н), 7,44-7,28 (м, 4Н), 4,86-4,40 (м, 4Н), 3,60-3,50 (м, 1Н), 2,83-2,75 (м, 1Н), 2,65-2,59 (м, 1Н), 2,30-2,15 (м, 1Н), 1,95-1,82 (м, 1Н), 1,17-1,13 (м, 3Н); m/z (ЭСИ+) (М+Н)+ = 356,15.
[0572] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 17: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,93 (дд, J1 = 11,6 Гц, J2 = 8,4 Гц, 2Н), 7,82 (д, J = 8,4 Гц, 1Н), 7,63-7,54 (м, 2Н), 7,48 (д, J = 11,6 Гц, 1Н), 6,92-6,86 (м, 1Н), 6,78-6,70 (м, 2Н), 5,22-4,76 (м, 4Н), 3,85 (с, 3Н), 3,75-3,65 (м, 1H), 2,83-2,77 (м, 1Н), 2,68-2,60 (м, 1Н), 2,40-2,30 (м, 1Н), 2,10-1,95 (м, 1Н), 1,58-1,50 (м, 3Н); m/z (ЭСИ+) (M+H)+ = 348,65.
[0573] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 18: 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6б): δ 12,06 (с, 1Н), 7,95-7,87 (м, 4Н), 7,62-7,50 (м, 4Н), 7,31 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 4,98-4,85 (м, 2H), 4,73-4,63 (м, 2H), 3,59-3,55 (м, 1Н), 2,86-2,78 (м, 1Н), 2,68-2,60 (м, 1Н), 2,25-2,20 (м, 1H), 2,00-1,90 (м, 1 Н), 1,43 (д, J = 6,4 Гц, 3Н); m/z (ЭСИ+) (М+Н)+ = 370,20.
[0574] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 19: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,94 (т, J = 8,8 Гц, 2H), 7,83 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 7,64-7,43 (м, 5Н), 7,40-7,30 (м, 1Н), 5,34-4,80 (м, 4H), 3,80-3,70 (м, 1Н), 2,90-2,80 (м, 1Н), 2,80-2,70 (м, 1Н), 2,40-2,30 (м, 1Н), 2,10-2,00 (м, 1H), 1,60-1,55 (м, 3Н); m/z (ЭСИ+) (M+H)+ = 370,10.
[0575] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 20: 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 11,62 (с, 1Н), 7,59 (с, 1Н), 7,56 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 7,29 (д, J = 8,4 Гц, 1Н), 6,94 (с, 2Н), 4,68-5,55 (м, 2Н), 4,49-4,40 (м, 2Н), 3,73 (с, 6Н), 3,55-3,48 (м, 1Н), 2,82-2,78 (м, 1Н), 2,65-2,57 (м, 1H), 2,20-2,08 (м, 1Н), 1,90-1,80 (м, 1Н), 1,36 (д, J = 6,4 Гц, 3Н); m/z (ЭСИ+) (М+H)+ = 380,10.
[0576] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 21: 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 12,20 (с, 1H), 7,42 (дд, J1 = 12,8 Гц, J2 = 8,0 Гц, 1Н), 7,33-7,30 (м, 2Н), 7,23-7,18 (м, 2Н), 7,15-7,05 (м, 2Н), 4,88-4,72 (м, 2Н), 4,70-4,55 (м, 2Н), 3,60-3,50 (м, 1Н), 2,80-2,70 (м, 1Н), 2,65-2,52 (м, 1Н), 2,22-2,10 (м, 1Н), 1,90-1,82 (м, 1Н), 1,42-1,35 (м, 3Н); m/z (ЭСИ+)(М+Н)+ = 288,15.
[0577] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 22: 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 12,05 (с, 1Н), 7,40-7,09 (м, 7Н), 4,76-4,65 (м, 2Н), 4,60-4,45 (м, 2Н), 3,55-3,48 (м, 1Н), 2,80-2,70 (м, 1Н), 2,62-2,52 (м, 1Н), 2,20-2,08 (м, 1Н), 1,90-1,82 (м, 1Н), 1,37 (д, J = 6,0 Гц, 3Н); m/z (ЭСИ+) (М+Н)+ = 288,15.
[0578] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 23: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,29 (дд, J1 = 8,0 Гц, J2 - 6,4 Гц, 2Н), 7,03 (т, J = 8,8 Гц, 2Н), 6,85 (с, 2Н), 6,00 (д, J = 2,4 Гц, 2Н) 4,75-4,67 (м, 2H), 4,51-4,44 (м, 2Н), 3,60-3,55 (м, 1Н), 2,83-2,79 (м, 1Н), 2,72-2,67 (м, 1H), 2,22-2,18 (м, 1Н), 1,93-1,89 (м, 1Н), 1,47 (д, J = 6,4 Гц, 3Н); m/z (ЭСИ+) (М+Н)+ = 314,20.
[0579] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 24: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,12 (с, 1H), 7,08 (дд, J1 = 8,4 Гц, J2 = 2,0 Гц, 1Н), 6,90 (д, 8,4 Гц, 1Н), 6,84 (с, 2Н), 6,00 (с, 2Н), 4,75-4,50 (м, 4Н), 3,58-3,53 (м, 1Н), 2,81-2,73 (м, 1Н), 2,65-2,58 (м, 1Н), 2,22-2,18 (м, 1Н), 1,93-1,82 (м, 1Н), 1,45 (д, J = 6,4 Гц, 3Н); m/z (ЭСИ+) (М+Н)+ = 396,15.
[0580] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 25: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 6,91 (уш с, 3Н), 6,81 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 6,76 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 6,06 (д, J = 2,8 Гц, 2Н), 4,82-4,72 (м, 2Н), 4,68-4,61 (м, 1Н), 4,55-4,48 (м, 2Н), 3,62-3,57 (, 1Н), 2,86-2,78 (м, 1Н), 2,68-2,60 (м, 1Н), 2,26-2,22 (м, 1Н), 1,97-1,91 (м, 1Н), 1,52 (д, J = 6,8 Гц, 3Н), 1,38 (д, J = 6,0 Гц, 6Н); m/z (ЭСИ+) (М+Н)+ = 370,20.
[0581] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 26: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,45-7,41 (м, 1Н), 7,21 (д, J = 7,6 Гц, 1Н), 7,17-7,11 (м, 1Н), 6,84 (с, 1Н), 6,74 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 6,69 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 4,82-4,50 (м, 5Н), 3,61-3,56 (, 1Н), 2,80-2,70 (м, 1Н), 2,62-2,55 (м, 1H), 2,25-2,18 (м, 1Н), 1,95-1,85 (м, 1Н), 1,48 (д, J = 6,8 Гц, 3Н), 1,30 (д, J = 6,0 Гц, 6H); m/z (ЭСИ+) (М+Н)+ = 370,20.
[0582] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 27: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,41 (дд, J1 = 8,0 Гц, J2 = 4,8 Гц, 1Н), 7,17 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 6,16-7,14 (м, 1Н), 6,84 (д, J = 1,6 Гц, 1H), 6,74 (д, J = 8,4 Гц, 1Н), 6,71 (дд, J1 = 8,0 Гц, J2 = 1,6 Гц, 1Н), 4,82-4,62 (м, 4Н), 4,58-4,55 (м, 1Н), 2,67-2,63 (м, 2Н), 2,05-2,00 (м, 2Н), 1,52 (с, 6Н), 1,30 (д, J = 6,0 Гц, 6Н); m/z (ЭСИ+) (M+H)+ = 358,15.
[0583] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 28: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,49-7,43 (м, 1H), 7,24 (д, J = 7,6 Гц, 1Н), 7,16 (т, J = 8,4 Гц, 1Н), 6,85 (с, 1Н), 6,74 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 6,71 (дд, J1 = 8,0 Гц, J2 = 1,6 Гц, 1Н), 4,87-4,79 (м, 4Н), 4,58-4,56 (м, 1Н), 2,67-2,63 (м, 2H), 2,07-2,03 (м, 2Н), 1,54 (с, 6Н), 1,30 (д, J = 6,0 Гц, 6Н); m/z (ЭСИ+) (М+Н)+ = 358,25.
[0584] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 29: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 6,84 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 6,83 (с, 2Н), 6,73 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 6,70 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 5,98 (д, J = 2,4 Гц, 2Н), 4,68-4,54 (м, 5H), 2,66-2,62 (м, 2Н), 2,04-2,00 (м, 2Н), 1,50 (с, 6Н), 1,30 (д, J = 6,0 Гц, 6Н); m/z (ЭСИ+) (M+H)+ = 384,25.
[0585] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 30: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,40 (дд, J1 = 8,0 Гц, J2 = 4,8 Гц, 1Н), 7,16 (д, J = 8,4 Гц, 1Н), 7,15-7,12 (м, 1Н), 6,92-6,90 (м, 2Н), 6,80 (дд, J1 = 8,0 Гц, J2 = 2,0 Гц, 1Н), 4,85-4,52 (м, 4Н), 4,02-4,00 (м, 1Н), 3,85 (с, 3H), 3,85-3,82 (м, 2Н), 3,61-3,55 (м, 1Н), 2,84-2,77 (м, 1Н), 2,67-2,59 (м, 1Н), 2,24-2,18 (м, 1Н), 1,94-1,88 (м, 1Н), 1,48 (д, J = 6,4 Гц, 3Н); m/z (ЭСИ+) (M+H)+ = 360,20.
[0586] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 31: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,38-7,34 (м, 1Н), 7,14-7,08 (м, 3Н), 7,04 (дд, J1 = 8,0 Гц, J2 = 2,0 Гц, 1Н), 6,86 (д, J = 8,8 Гц, 1H), 4,86-4,73 (м, 2Н), 4,60-4,48 (м, 2Н), 3,60-3,53 (м, 1Н), 2,76-2,69 (м, 1Н), 2,61-2,53 (м, 1H), 2,16-2,12 (м, 1Н), 1,86-1,82 (м, 1Н), 1,42 (д, J = 6,8 Гц, 3Н); m/z (ЭСИ+) (М+Н)+ = 370,10.
[0587] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 32: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,42-7,38 (м, 1H), 7,24-7,11 (м, 5Н), 4,92-4,80 (м, 2Н), 4,68-4,55 (м, 2Н), 4,10-4,07 (м, 2Н), 3,88-3,86 (м, 2Н), 6,64-3,60 (м, 1Н), 2,85-2,75 (м, 1Н), 2,72-2,60 (м, 1Н), 2,24-2,18 (м, 1H), 1,98-1,88 (м, 1Н), 1,49 (д, J = 6,0 Гц, 3Н); m/z (ЭСИ+) (М+Н)+ = 414,20.
[0588] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 33: 1Н ЯМР (400 МГц, СD3OD): δ 7,46-7,41 (м, 1H), 7,32-7,29 (м, 2Н), 7,23 (д, J = 7,6 Гц, 1Н), 7,13 (т, J = 8,4 Гц, 1Н), 7,01 (т, 8,8 Гц, 2Н), 4,86-4,80 (м, 4Н), 2,78-2,73 (м, 2Н), 2,12-2,08 (м, 2Н), 1,56 (с, 6Н); m/z (ЭСИ+) (M+H)+ = 302,10.
[0589] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 34: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,31-7,27 (м, 2H), 7,03 (т, J = 8,8 Гц, 2Н), 6,98 (с, 2Н), 4,72 (д, J = 13,6 Гц, 2Н), 4,61 (д, J = 13,6 Гц, 2H), 3,83 (6Н), 2,81-2,72 (м, 2Н), 2,07-1,98 (м, 2Н), 1,56 (с, 6Н); m/z (ЭСИ+) (М+Н)+ = 344,20.
[0590] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 35: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,43-7,40 (м, 2Н), 7,32-7,27 (м, 2Н), 7,20-7,14 (м, 2Н), 7,03 (т, J = 8,8 Гц, 2Н), 4,85-4,70 (м, 4Н), 2,77-2,72 (м, 2Н), 2,08-2,03 (м, 2Н), 1,54 (с, 6Н); m/z (ЭСИ+) (М+Н)+ = 302,20.
[0591] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 36: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,29 (дд, J1 = 8,4 Гц, J2 = 5,6 Гц, 2Н), 7,01 (т, J = 8,4 Гц, 2Н), 6,83 (с, 2Н), 4,67 (д, J = 14,0 Гц, 2H), 4,58 (д, J = 14,0 Гц, 2Н), 2,78-2,71 (м, 2Н), 2,07-2,03 (м, 2Н), 1,53 (с, 6Н); m/z (ЭСИ+)(М+Н)+ = 328,10.
[0592] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 37: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3ОD): δ 7,38 (дд, J1 = 8,0 Гц, J2 = 4,4 Гц, 1Н), 7,16-7,10 (м, 2Н), 6,86 (с, 1Н), 6,75 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 6,70 (д, J = 8,8 Гц, 1Н), 4,93-4,76 (м, 2Н), 4,62-4,50 (м, 3Н), 3,60-3,52 (м, 1Н), 2,78-2,70 (м, 1Н), 2,62-2,55 (м, 1Н), 2,25-2,15 (м, 1Н), 1,95-1,85 (м, 1Н), 1,47 (д, J = 6,4 Гц, 3Н), 1,30 (д, J = 6,4 Гц, 6Н); m/z (ЭСИ+)(M+H)+ = 344,15.
[0593] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 38: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,39 (дд, J1 = 8,4 Гц, J2 = 4,8 Гц, 1Н), 7,17-7,10 (м, 2Н), 6,89 (с, 1Н), 6,88 (д, J = 8,4 Гц, 1Н), 6,81 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 4,92-4,83 (м, 2Н), 4,58-4,42 (м, 4Н), 3,60-3,55 (м, 1Н), 2,80-2,70 (м, 1Н), 2,65-2,55 (м, 1Н), 2,25-2,15 (м, 1Н), 1,95-1,85 (м, 1Н), 1,47 (д, J = 6,4 Гц, 3Н), 1,30-1,25 (м, 12H); m/z (ЭСИ+)(М+Н)+ = 386,25.
[0594] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 39: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,46-7,40 (м, 1Н), 7,22 (д, J = 7,6 Гц, 1Н), 7,12 (т, J = 8,8 Гц, 1Н), 6,90 (с, 1Н), 6,89 (д, J = 8,4 Гц, 1Н), 6,82 (дд, J1 = 8,0 Гц, J2 = 2,0 Гц, 1Н), 4,95-4,85 (м, 2Н), 4,70-4,62 (м, 2Н), 4,60-4,52 (м, 1Н), 4,50-4,42 (м, 1Н), 3,60-3,52 (м, 1Н), 2,82-2,72 (м, 1Н), 2,65-2,55 (м, 1Н), 2,28-2,18 (м, 1Н), 1,95-1,88 (м, 1Н), 1,49 (д, J = 6,4 Гц, 3Н), 1,30-1,25 (м, 12Н); m/z (ЭСИ+)(M+H)+ = 386,70.
[0595] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 40: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,26 (с, 1H), 6,84 (д, J = 8,8 Гц, 1Н), 6,72-6,65 (м, 4Н), 6,00 (д, J = 5,2 Гц, 2Н), 4,96-4,87 (м, 2H), 4,50-4,41 (м, 2Н), 4,18-4,10 (м, 2Н), 3,42-3,36 (м, 1Н), 2,77-2,74 (м, 1Н), 2,58-2,50 (м, 1Н), 2,18-2,10 (м, 1Н), 1,92-1,86 (м, 1Н), 1,42 (д, J = 5,6 Гц, 3Н), 1,30-1,25 (м, 12Н); m/z (ЭСИ+)(M+H)+ = 412,30.
[0596] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 41: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,47-7,42 (м, 1H), 7,35-7,30 (м, 2Н), 7,25-7,22 (м, 2Н), 7,13 (т, J = 8,8 Гц, 1Н), 5,01-4,91 (м, 2H), 4,72-4,65 (м, 2Н), 3,72-3,65 (м, 1Н), 3,12 (с, 3Н), 2,98 (с, 3Н), 2,92-2,85 (м, 1Н), 2,80-2,70 (м, 1Н), 2,30-2,20 (м, 1Н), 2,02-1,95 (м, 1Н), 1,52 (д, J = 4,0 Гц, 3Н); m/z (ЭСИ+)(M+H)+ = 441,20.
[0597] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 42: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,43-7,40 (м, 1Н), 7,19-7,16 (м, 2Н), 6,89-6,87 (м, 2Н), 6,82 (дд, J1 = 8,8 Гц, J2 = 2,0 Гц, 1Н), 4,84-4,67 (м, 4Н), 4,55-4,45 (м, 2Н), 2,71-2,66 (м, 2Н), 2,08-2,03 (м, 2Н), 1,53 (с, 6Н), 1,30-1,26 (м, 12H); m/z (ЭСИ+)(М+Н)+ = 400,25.
[0598] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 43: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,46-7,38 (м, 1Н), 7,36-7,32 (м, 2Н), 7,26-7,22 (м, 1Н), 7,20-7,12 (м, 2Н), 4,90-4,80 (м, 2Н), 4,70-4,55 (м, 2Н), 3,70-3,60 (м, 1Н), 3,12 (с, 3Н), 2,99 (с, 3Н), 2,95-2,85 (м, 1Н), 2,80-2,70 (м, 1Н), 2,30-2,20 (м, 1Н), 2,00-1,90 (м, 1Н), 1,50 (д, J = 6,0 Гц, 3Н); m/z (ЭСИ+)(М+Н)+ = 441,15.
[0599] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 44: 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 12,15 (с, 1H), 7,44-7,42 (м, 1Н), 7,24-7,21 (м, 2Н), 6,88-6,86 (м, 2Н), 6,77-6,75 (м, 1Н), 4,88-4,79 (м, 2Н), 4,71-4,66 (м, 2Н), 3,93-3,90 (м, 2Н), 3,76 (с, 3Н), 3,69-3,66 (м, 2Н), 2,63-2,58 (м, 2Н), 2,05-2,00 (м, 2Н), 1,45 (с, 3Н); m/z (ЭСИ+)(М+Н)+ = 347,15.
[0600] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 45: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,43-7,39 (м, 1Н), 7,18-7,12 (м, 2Н), 6,92-6,88 (м, 2Н), 6,82-6,80 (м, 1Н), 4,85-4,70 (м, 4Н), 4,02-3,99 (м, 2Н), 3,85-3,82 (м, 5Н), 2,73-2,69 (м, 2Н), 2,10-2,05 (м, 2Н), 1,54 (с, 3Н); m/z (ЭСИ+)(M+H)+ = 374,15.
[0601] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 46: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,48 (д, J = 1,6 Гц, 1H), 7,46 (д, J = 8,4 Гц, 1Н), 7,44-7,38 (м, 1Н), 7,23 (дд, J1 = 8,0 Гц, J2 = 2,0 Гц, 1H), 7,20-7,12 (м, 2Н), 4,85-4,55 (м, 4Н), 3,86-3,75 (м, 2Н), 3,72-3,65 (м, 1Н), 3,46 (с, 3Н), 2,85-2,70 (м, 2Н), 2,18-2,12 (м, 2Н); m/z (ЭСИ+)(M+H)+ = 368,05.
[0602] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 47: 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 6,90-6,86 (м, 4Н), 6,74 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 6,04 (д, J = 8,8 Гц, 2Н), 4,63 (дд, J1 = 14,0 Гц, J2 = 6,4 Гц, 2Н), 4,46 (дд, J1 = 14,0 Гц, J2 = 6,4 Гц, 2Н), 3,75 (с, 3Н), 3,69-3,67 (м, 2Н), 2,62-2,57 (м, 2H), 1,99-1,96 (м, 2Н), 1,42 (с, 6Н); m/z (ЭСИ+)(М+Н)+ = 400,15.
[0603] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 48: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 6,99 (уш с, 2Н), 6,92-6,89 (м, 2Н), 6,81 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 4,72 (д, J = 11,6 Гц, 2Н), 4,62 (д, J = 11,6 Гц, 2Н), 4,02-4,00 (м, 2Н), 3,86-3,82 (м, 11Н), 2,73-2,68 (м, 2Н), 2,09-2,05 (м, 2Н), 1,53 (с, 6H); m/z (ЭСИ+)(M+H)+ = 416,20.
[0604] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 49: 1H ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 12,22 (уш с, 1Н), 7,46-7,41 (м, 1Н), 7,24-7,20 (м, 2Н), 7,01 (с, 1Н), 6,96 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 6,82 (д, J = 7,2 Гц, 1Н), 4,92-4,80 (м, 2Н), 4,72-4,69 (м, 2Н), 3,02 (с, 3Н), 2,88 (с, 3Н), 2,70-2,66 (м, 2Н), 2,09-2,05 (м, 2Н), 1,47 (с, 6Н); m/z (ЭСИ+)(М+Н)+ = 401,20.
[0605] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 50: 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 12,07 (уш с, 1Н), 7,42-7,39 (м, 1Н), 7,24-7,18 (м, 2Н), 7,01-6,95 (м, 2Н), 6,82 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 4,82-4,60 (м, 4Н), 3,02 (с, 3Н), 2,88 (с, 3Н), 2,70-2,65 (м, 2Н), 2,07-2,04 (м, 2Н), 1,44 (с, 6H); m/z (ЭСИ+)(М+Н)+ = 401,15.
[0606] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 51: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,48-7,42 (м, 1H), 7,23 (д, J = 7,2 Гц, 1Н), 7,14 (т, J = 8,4 Гц, 1Н), 6,92 (с, 1Н), 6,90 (д, J = 8,4 Гц, 1H), 6,80 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 5,01-4,89 (м, 2Н), 4,69-4,63 (м, 2Н), 4,03-4,00 (м, 2Н), 3,86-3,83 (м, 5Н), 3,64-3,60 (м, 1Н), 2,86-2,78 (м, 1Н), 2,67-2,60 (м, 1Н), 2,30-2,20 (м, 1Н), 1,98-1,90 (м, 1Н), 1,50 (д, J = 6,0 Гц, 3Н); m/z (ЭСИ+)(М+Н)+ = 360,15.
[0607] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 52: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 6,91 (с, 1Н), 6,90 (д, J = 8,4 Гц, 1Н), 6,83 (с, 2Н), 6,79 (д, J = 8,8 Гц, 1Н), 5,98 (д, J = 2,4 Гц, 2Н), 4,75-4,66 (м, 2Н), 4,49-4,42 (м, 2Н), 4,02-3,99 (м, 2Н), 3,86-3,79 (м, 5Н), 3,50-3,44 (м, 1H), 2,82-2,75 (м, 1Н), 2,66-2,58 (м, 1Н), 2,25-2,18 (м, 1Н), 1,95-1,86 (м, 1Н), 1,46 (д, J = 6,4 Гц, 3H); m/z (ЭСИ+)(M+H)+ = 386,20.
[0608] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 53: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,40-7,36 (м, 1H), 7,18 (д, J = 7,6 Гц, 1Н), 7,08 (т, J = 8,8 Гц, 1Н), 6,86 (с, 1Н), 6,73 (д, J = 7,6 Гц, 1Н), 6,68 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 3,58 (уш с, 4Н), 4,81-4,75 (м, 3Н), 3,82 (с, 3Н), 2,67-2,63 (м, 2H), 2,10-2,06 (м, 2Н), 1,52 (с, 6Н); m/z (ЭСИ+)(M+H)+ = 330,10.
[0609] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 54: 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 10,04 (с, 1H), 7,46-7,40 (м, 1Н), 7,23-7,18 (м, 3Н), 7,10 (д, J = 8,4 Гц, 1Н), 6,97 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 4,85-4,78 (м, 2Н), 4,69-4,66 (м, 2Н), 2,63-2,59 (м, 2Н), 2,03-1,98 (м, 2Н), 1,46 (с, 6H); m/z (ЭСИ+)(М+Н)+ = 384,15.
[0610] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 55: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,20 (т, J = 6,0 Гц, 2Н), 7,15 (с, 1Н), 7,11 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 6,90 (д, J = 8,4 Гц, 1Н), 4,90-4,86 (м, 4H), 2,73-2,68 (м, 2Н), 2,10-2,06 (м, 2Н), 1,54 (с, 6Н); m/z (ЭСИ+)(М+Н)+ = 402,15.
[0611] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 56: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 8,04 (д, J = 7,6 Гц, 1Н), 7,63 (д, J = 7,2 Гц, 1Н), 7,54 (т, J = 8,0 Гц, 1Н), 7,14 (с, 1Н), 7,10 (д, J = 8,8 Гц, 1Н), 6,90 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 5,10-4,70 (м, 4Н), 2,73-2,69 (м, 2Н), 2,10-2,06 (м, 2Н), 1,56 (с, 6Н); m/z (ЭСИ+)(M+H)+ = 410,15.
[0612] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 57: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,48-7,38 (м, 3Н), 7,12 (с, 1Н), 7,10 (д, J = 8,4 Гц, 1Н), 6,90 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 4,81-4,71 (м, 4Н), 3,09 9s, 3H), 209 (с, 3Н), 2,71-2,66 (м, 2Н), 2,07-2,03 (м, 2Н), 1,62 (с, 6Н); m/z (ЭСИ+)(M+H)+ = 437,25.
[0613] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 58: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 8,07-8,05 (м, 1H), 7,66-7,54 (м, 2H), 6,90-6,78 (м, 3Н), 5,20-4,80 (м, 4Н), 2,67-2,60 (м, 2Н), 2,07-2,00 (м, 2Н), 1,55 (с, 6Н), 1,35 (с, 9Н); m/z (ЭСИ+)(M+H)+ = 398,25.
[0614] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 59: 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 11,32 (с, 1H), 7,44-7,37 (м, 3Н), 6,83-6,74 (м, 3Н), 4,81-4,56 (м, 4Н), 3,00 (с, 3Н), 2,91 (с, 3H), 2,60-2,50 (м, 2Н), 2,00-1,90 (м, 2Н), 1,43 (с, 6Н), 1,28 (с, 9Н); m/z (ЭСИ+)(М+Н)+ = 425,35.
[0615] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 60А: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,19 (т, J = 6,0 Гц, 2Н), 6,90 (с, 1Н), 6,85 (д, J = 7,6 Гц, 1Н), 6,79 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 4,86-4,80 (м, 4Н), 3,65-3,60 (м, 1Н), 2,80-2,70 (м, 1Н), 2,62-2,52 (м, 1Н), 2,25-2,15 (м, 2Н), 1,95-1,85 (м, 1Н), 1,48 (д, J = 6,0 Гц, 3Н), 1,36 (с, 9Н); m/z (ЭСИ+)(М+Н)+ = 376,25.
[0616] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 60В: 1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3): δ 7,18-7,15 (м, 1H), 6,98 (д, J = 7,2 Гц, 1Н), 6,88-6,80 (м, 4Н), 4,04-4,00 (м, 4Н), 2,80-2,72 (м, 1H), 2,70-2,62 (м, 1Н), 2,60-2,50 (м, 1Н), 1,95-1,88 (м, 1Н), 1,76-1,70 (м, 1Н), 1,42 (с, 9H), 1,20 (д, J = 6,4 Гц, 3Н); m/z (ЭСИ+)(М+Н)+ = 358,25.
[0617] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 61: 1Н ЯМР (400 МГц, ДМСО-d6): δ 11,95 (уш с, 1Н), 10,00 (уш с, 1Н), 7,93 (с, 2Н), 7,65-7,64 (м, 1), 7,22-7,09 (м, 2Н), 6,92-6,90 (м, 1Н), 4,85-4,75 (м, 4Н), 3,23 (с, 3Н), 2,65-2,60 (м, 2Н), 2,02-1,95 (м, 2Н), 1,45 (с, 6H); m/z (ЭСИ+)(М+Н)+ = 444,20.
[0618] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 62: 1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3): δ 7,80-7,78 (м, 2H), 7,40-7,38 (м, 1Н), 6,87-6,78 (м, 3Н), 4,18-4,10 (м, 4Н), 3,02 (с, 3Н), 2,62-2,56 (м, 2Н), 1,80-1,60 (м, 2Н), 1,45 (с, 9Н), 1,20 (с, 6Н); m/z (ЭСИ+)(M+H)+ = 432,25.
[0619] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 63: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,98-7,95 (м, 1H), 7,63 (д, J = 7,6 Гц, 1Н), 6,90 (с, 1Н), 6,85 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 6,79 (д, J=8,0 Гц, HI), 4,90-4,80 (м, 4Н), 3,66-3,60 (м, 1Н), 3,12 (с, 3Н), 2,80-2,72 (м, 1Н), 2,65-2,55 (м, 1H), 2,25-2,15 (м, 1Н), 1,95-1,85 (м, 1Н), 1,47 (д, J = 6,4 Гц, 3Н), 1,36 (с, 9Н); m/z (ЭСИ+)(М+Н)+ = 418,20.
[0620] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 64: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,97 (д, J = 7,2 Гц, 1H), 7,78-7,68 (м, 2Н), 6,88 (с, 1Н), 6,72 (с, 2Н), 5,09 (с, 2Н), 4,85 (с, 2Н), 3,85 (с, 3Н), 3,20 (с, 3Н), 2,73-2,70 (м, 2Н), 2,13-2,10 (м, 2Н), 1,58 (с, 6Н); m/z (ЭСИ+)(M+H)+ = 390,15.
[0621] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 65: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 8,75 (с, 1H), 7,85 (д, J = 7,2 Гц, 1Н), 7,74 (д, J = 6,8 Гц, 1Н), 7,68 (д, J = 6,8 Гц, 1Н), 6,83 (с, 1Н), 6,70 (д, J = 7,6 Гц, 1Н), 6,64 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 5,05-4,60 (м, 4Н), 3,76 (с, 3Н), 3,60-3,50 (м, 1H), 3,40-3,30 (м, 2Н), 2,72-2,65 (м, 1Н), 2,20-2,10 (м, 1Н), 1,90-1,80 (м, 1Н), 1,45-1,40 (м, 3H); m/z (ЭСИ+)(М+Н)+ = 376,10.
[0622] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 66: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 8,55 (уш с, 1 Н), 7,86 (д, J = 6,4 Гц, 1Н), 7,74-7,67 (м, 2Н), 6,83-6,77 (м, 3Н), 4,93 (с, 2Н), 4,81-4,73 (м, 2Н), 3,28 (с, 3Н), 2,60-2,55 (м, 2Н), 2,02-1,98 (м, 2Н), 1,48-1,46 (м, 6Н), 1,28 (с, 9Н); m/z (ЭСИ+)(M+H)+ = 432,30.
[0623] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 67: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,93 (д, J = 7,2 Гц, 1Н), 7,76-7,66 (м, 2Н), 7,15 (с, 1Н), 7,11 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 6,91 (д, J = 7,2 Гц, 1Н), 5,05 (с, 2Н), 4,82 (с, 2Н), 3,20 (с, 3Н), 2,75-2,70 (м, 2Н), 2,30-2,00 (м, 2Н), 1,57-1,56 (м, 6Н); m/z (ЭСИ+)(M+H)+ = 444,15.
[0624] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 68: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,98 (с, 2H), 7,66-7,63 (м, 1Н), 6,84 (с, 1Н), 6,75-6,69 (м, 2Н), 4,83 (с, 4Н), 3,85 (с, 3Н), 3,63-3,59 (м, 1H), 3,13 (с, 3Н), 2,82-2,76 (м, 1Н), 2,66-2,58 (м, 1Н), 2,24-2,21 (м, 1Н), 1,96-1,91 (м, 1Н), 1,49 (д, J = 6,4 Гц, 3Н); m/z (ЭСИ+)(М+Н)+ = 376,15.
[0625] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 69: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,99 (с, 2H), 7,64 (д, J = 8,4 Гц, 1H), 6,85 (с, 1Н), 6,75 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 6,71 (д, J = 7,6 Гц, 1Н), 4,84 (с, 4H), 4,60-4,55 (м, 1H), 3,60-3,56 (м, 1Н), 3,13 (с, 3Н), 2,78-2,73 (м, 1Н), 2,62-2,58 (м, 1Н), 2,22-2,18 (м, 1Н), 1,93-1,89 (м, 1Н), 1,48 (д, J = 6,4 Гц, 3Н), 1,31 (д, J = 6,0 Гц, 6Н); m/z (ЭСИ+)(М+Н)+ = 404,20.
[0626] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 70: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 8,01 (с, 2Н), 7,67 (д, J = 8,4 Гц, 1Н), 6,85 (с, 1Н), 6,78-6,70 (м, 2Н), 4,84 (с, 4Н), 4,60-4,56 (м, 1H), 3,13 (с, 3Н), 2,70-2,66 (м, 2Н), 2,08-2,04 (м, 2Н), 1,55 (с, 6Н), 1,31 (д, J = 6,0 Гц, 6Н); m/z (ЭСИ+)(М+Н)+ = 418,25.
[0627] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 71: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 7,99-7,91 (м, 4Н), 7,62-7,54 (м, 4Н), 6,83 (с, 1Н), 6,72-6,68 (м, 2Н), 4,82 (с, 4Н), 3,81 (с, 3Н), 2,70-2,65 (м, 2Н), 2,08-2,02 (м, 2Н), 1,51 (с, 6Н); m/z (ЭСИ+)(М+Н)+ = 452,00.
[0628] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 72: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 8,00 (с, 1H), 7,86 (д, J = 8,0 Гц, 1Н), 6,85 (с, 1Н), 6,74-6,70 (м, 2Н), 4,85 (с, 4Н), 3,85 (с, 3Н), 3,13 (с, 3Н), 2,72-2,68 (м, 2Н), 2,10-2,06 (м, 2Н), 1,56 (с, 6Н); m/z (ЭСИ+)(М+Н)+ = 390,15.
СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 73.
[0629] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 74: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): 1Н ЯМР (400 МГц, CDCl3): δ 7,03-6,99 (м, 2Н), 6,88-6,83 (м, 2Н), 6,78-6,75 (м, 1Н), 4,80-4,65 (м, 4Н), 2,65-2,60 (м, 2Н), 2,03-1,99 (м, 2Н), 1,52 (с, 6Н), 1,40 (с, 9Н); m/z (ЭСИ+)(M+H)+ = 390,20.
[0630] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 75: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD): δ 8,07-8,05 (м, 1Н), 7,66-7,54 (м, 2Н), 6,90-6,78 (м, 3Н), 5,20-4,80 (м, 4Н), 2,67-2,60 (м, 2Н), 2,07-2,00 (м, 2Н), 1,55 (с, 6Н), 1,35 (с, 9Н); m/z (ЭСИ+)(M+H)+ = 398,25.
[0631] СОЕДИНЕНИЕ СОГЛАСНО ПРИМЕРУ 76: 1Н ЯМР (400 МГц, CD3OD) δ 7,55-7,48 (м, 3H), 6,87 (с, 1Н), 6,72-6,70 (м, 2Н), 4,95-4,79 (м, 4Н) 3,90-3,80 (м, 7Н), 3,35-3,30 (м, 4Н), 2,72-2,69 (м, 2Н), 2,12-2,08 (м, 2Н), 1,56 (с, 6Н), ЖХ-МС: 424,70 (M+1)+.
[0632] Дополнительные соединения получали с применением способов, аналогичных вышеописанным, и структуру каждого подтверждали при помощи 1Н-ЯМР и МС, как показано в Таблице 4.
[0633] Таблица 4. Дополнительные соединения изоиндолина.
[0634] Все особенности, раскрываемые в описании, включая реферат и фигуры, и все этапы любого раскрываемого способа или процесса могут сочетаться в любой комбинации за исключением комбинаций, в которых по меньшей мере некоторые из таких особенностей и/или этапов являются взаимоисключающими. Каждая особенность, раскрываемая в описании, включая реферат и фигуры, может быть заменена альтернативными особенностями, которые служат для той же, равноценной или подобной цели, если прямо не указывается иного. Таким образом, если прямо не указывается иного, каждая раскрываемая особенность представляет лишь один пример из общей группы равноценных или подобных особенностей. Различные модификации изобретения, помимо описываемых авторами, станут очевидными для специалистов в данной области из представленного выше описания. Такие модификации также охватываются объемом прилагаемой формулы изобретения.
[0635] Все упоминаемые авторами публикации включаются путем ссылки в их полном объеме. Ни одно положение данного описания не должно истолковываться как признание того, что изобретение не дает права на датирование более ранним числом такое изобретение ввиду более раннего раскрытия.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| КОМПОЗИЦИИ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ | 2018 |
|
RU2792562C2 |
| ПРОИЗВОДНЫЕ БЕНЗОТИАЗОЛА, ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ, ОБЛАДАЮЩАЯ СВОЙСТВОМ СВЯЗЫВАТЬ АМИЛОИД, И СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ ОТЛОЖЕНИЙ АМИЛОИДА У МЛЕКОПИТАЮЩЕГО | 2004 |
|
RU2440995C2 |
| ХИНОЛИНКАРБОКСАМИДНЫЕ И ХИНОЛИНКАРБОНИТРИЛЬНЫЕ ПРОИЗВОДНЫЕ В КАЧЕСТВЕ mGLuR2-НЕГАТИВНЫХ АЛЛОСТЕРИЧЕСКИХ МОДУЛЯТОРОВ, КОМПОЗИЦИИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2012 |
|
RU2610262C2 |
| ИНГИБИТОРЫ СНИЖЕНИЯ КОГНИТИВНЫХ СПОСОБНОСТЕЙ | 2010 |
|
RU2595720C2 |
| БИЦИКЛИЧЕСКИЕ ГЕТЕРОЦИКЛИЧЕСКИЕ СПИРОСОЕДИНЕНИЯ | 2010 |
|
RU2506266C2 |
| ЗАМЕЩЁННЫЕ ИНДОЛЬНЫЕ СОЕДИНЕНИЯ В КАЧЕСТВЕ ПОНИЖАЮЩИХ РЕГУЛЯТОРОВ РЕЦЕПТОРОВ ЭСТРОГЕНА | 2017 |
|
RU2722441C2 |
| СОЕДИНЕНИЯ И ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ 2-АМИНОПИРИМИДИНА И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2020 |
|
RU2795914C1 |
| ПРОИЗВОДНЫЕ ПИРИДОПИРИМИДИНОНА И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В КАЧЕСТВЕ МОДУЛЯТОРОВ РЕЦЕПТОРА АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ | 2021 |
|
RU2818954C1 |
| ПРОИЗВОДНЫЕ 1,2,4-ТРИАЗОЛА В КАЧЕСТВЕ ИНГИБИТОРОВ СИГМА РЕЦЕПТОРА | 2007 |
|
RU2451015C2 |
| НОВЫЕ СОЕДИНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С АМИЛОИДОМ ИЛИ АМИЛОИДПОДОБНЫМИ БЕЛКАМИ | 2007 |
|
RU2469026C2 |
Изобретение относится к изоиндолинову антагонисту сигма-2-рецептора, его фармацевтическим композициям, которые содержат указанное соединение, способу ингибирования влияния бета-амилоида на нейроны. Соединение может найти применение для лечения болезни Альцгеймера. 10 н. и 9 з.п. ф-лы, 4 табл., 118 пр.
1. Соединение формулы
или его фармацевтически приемлемая соль.
2. Соединение по п. 1, где фармацевтически приемлемая соль выбрана из группы, состоящей из гидрохлорида, гидробромида, гидройодида, нитрата, сульфата, бисульфата, фосфата, кислого фосфата, изоникотината, ацетата, лактата, салицилата, цитрата, тартрата, пантотената, битартрата, аскорбата, сукцината, малеата, гентизината, фумарата, глюконата, глюкароната, сахарата, формиата, бензоата, глутамата, метансульфоната, этансульфоната, бензолсульфоната, п-толуолсульфоната и памоата.
3. Соединение по п. 1, где фармацевтически приемлемая соль представляет собой фумарат.
4. Фармацевтическая композиция для ингибирования влияния бета-амилоида на нейроны, содержащая эффективное количество соединения формулы:
или его фармацевтически приемлемой соли и фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество.
5. Композиция по п. 4, где фармацевтически приемлемая соль представляет собой фумарат.
6. Способ ингибирования влияния бета-амилоида на нейроны, включающий введение субъекту, который в этом нуждается, эффективного количества соединения формулы
или его фармацевтически приемлемой соли.
7. Способ по п. 6, где влияние бета-амилоида связано со снижением когнитивных способностей, и у субъекта обнаружено или существует риск обнаружения снижения когнитивных способностей.
8. Способ по п. 6, где влияние бета-амилоида связано с умеренным когнитивным нарушением при болезни Альцгеймера.
9. Способ по п. 6, где фармацевтически приемлемая соль представляет собой фумарат.
10. Способ лечения болезни Альцгеймера, включающий введение субъекту, имеющему указанное заболевание, эффективного количества соединения по п. 1 или его фармацевтически приемлемой соли.
11. Способ по п. 10, где фармацевтически приемлемая соль представляет собой фумарат.
12. Соединение формулы
13. Фармацевтическая композиция для ингибирования влияния бета-амилоида на нейроны, содержащая эффективное количество соединения по п. 12 и фармацевтически приемлемый носитель или вспомогательное вещество.
14. Способ ингибирования влияния бета-амилоида на нейроны, включающий введение субъекту, который в этом нуждается, эффективного количества соединения по п. 12.
15. Способ лечения болезни Альцгеймера, включающий введение субъекту, имеющему указанное заболевание, эффективного количества соединения по п. 12.
16. Фармацевтическая композиция для применения в способе ингибирования снижения когнитивных способностей у субъекта, у которого обнаружено или существует риск обнаружения снижения когнитивных способностей, включающем ингибирование влияния бета-амилоида на нейроны, содержащая соединение формулы
или его фармацевтически приемлемую соль и фармацевтически приемлемый носитель,
причем соединение или его фармацевтически приемлемая соль присутствует в количестве, эффективном для ингибирования связывания бета-амилоидного олигомера в указанных нейронах.
17. Фармацевтическая композиция по п. 16, где снижение когнитивных способностей связано с влиянием бета-амилоидного олигомера на центральные нейроны.
18. Фармацевтическая композиция по п. 16 для применения в способе лечения умеренного когнитивного нарушения при болезни Альцгеймера.
19. Применение соединения формулы
или его фармацевтически приемлемой соли для лечения болезни Альцгеймера.
| RU 2014111079 A, 27.09.2015 | |||
| US 4958029 A1, 18.09.1990 | |||
| US 6235731 B1, 22.05.2001 | |||
| Database CA (online): RN 1307880-18-7, RN 1099652-84-2, RN 1099652-96-6 и RN1307058-18-9. |
