Способ диагностики инвазии Blastocystis hominis по биоптатам Российский патент 2022 года по МПК G01N1/28 G01N1/30 G01N33/48 

Настоящее изобретение относится к медицинским наукам, а именно, к патологической анатомии, гастроэнтерологии, паразитологии и медицинской микробиологии и может быть использовано для идентификации Blastocystis hominis в слизистой оболочке разных отделов желудочно-кишечного тракта.

Бластоцистоз - это протозойная инвазия, вызываемая Blastocystis hominis. Этот паразит относится к типу Простейшие, подтипу Саркодовые [1-3] и вызывает болезнь Zierdta-Garavelli. Впервые о бластоцистозе упоминает E.Brumpt (1912). Мофологически в жизненном цикле различают шесть форм бластоцист [4-5]: вакуолярную, гранулярную, амебоидную, цистную, мультивакуолярную и клесторную. Первые три формы бластоцист хорошо морфологически идентифицируются, тогда как цистная, мультивакуолярная и клесторная - трудно различимы. Бластоцисты могут быть разделены более чем на 10 субтипов.

Клетки бластоцист чаще имеют круглую, овальную, редко амебоидную форму, последняя служит индикатором патогенности. По размеру паразитарной клетки вакуолярные формы различаются: чаще 5-10 мкм, реже 10-15 мкм. Цисты бластоцист бывают тонкостенные и толстостенные. По числу ядер в цитоплазме клетки бластоцист разделяют на: двухядерные (редко), четырехядерные (часто), многоядерные (редко). Светооптически в цитоплазме бластоцист выявлены митохондрии, комплекс Гольджи, эндоплазматическая сеть [4, 6, 7].

В большинстве территорий РФ лабораторная диагностика кишечной инфекции паразитарной природы проводится недостаточно.

В настоящее время известны следующие методы для верификации бластоцист:

1. Идентификация методом ПЦР. Известен способ идентификации бластоцист методом ПЦР [Stensvold С.R. et al. Detection of Blastocystis hominis in unpreserved stool specimens by using polymerase chain reaction // Journal of Parasitology. - 2006. - Vol.92. - №. 5. - P. 1081-108; Eroglu F., Koltas I.S. Evaluation of the transmission mode of Blastocystis hominis by using PCR method // Parasitology Research. - 2010. -Vol.107. - №4. - P. 841-845]. Данный метод является высокочувствительным и специфичным. Для его реализации необходимо специальное оборудование, квалифицированный персонал и тест-система. Этим объясняется дороговизна и большая продолжительность исследования.

2. Способ определения простейших Blastocystis spp.с различной степенью вирулентности с помощью рестрикционного анализа бактериальной ДНК бластоцист с использованием комбинации эндонуклеаз рестрикции - Нае III, Pst I и Hind III [Патент РФ №2520742RU от 13.12.2012 опубл. 27.06.2014 Бюл. №18]. Анализ обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Для его реализации требуется специальное оборудование и тест система. К недостаткам анализа можно отнести его высокую стоимость и продолжительность.

3. Способ определения бластоцист в кале методом микроскопии описан в методических указаниях [МУК 4.2.735-99. Паразитологические методы лабораторной диагностики гельминтозов и протозоозов. - М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России- 2012. - 72 с.]. Несмотря на простоту и небольшую продолжительность исследования, есть сложности с идентификацией клеток бастоцист, связанные с феноменальными возможностями вариаций морфотипов Blastocystis. Изменение формы клетки позволяет паразиту мимикрировать и быть неотличимым от других амеб. Данный метод имеет ограничения по специфичности, так как может определяться только в нативном биологическом материале, что существенно ограничивает возможности его идентификации, так как на определенных этапах его жизненного цикла паразит находится в цистной форме, неидентифицируемой микроскопически в кале.

Учитывая недостатки вышеприведенных методов диагностики, разработка наиболее достоверных методов верификации паразитарной инфекции, вызванной Blastocystis hominis, является актуальной. [8-13].

Технической проблемой решаемой изобретением, является экспресс-диагностика бластоцистоза (в течение 6 часов) с одновременной гистологической оценкой морфологических структур биоптата и определением разных жизненных форм паразита. Данный способ позволит в кратчайшие сроки сделать гистологическое заключение и верифицировать диагноз, что даст возможность решить поставленную в работе задачу.

Для подтверждения этиологии инвазии Blastocystis hominis выполнялись посевы испражнений на питательные среды, микроскопия нативных препаратов и биоптатов, полученных из слизистой оболочки желудка, 12-перстной и толстой кишок. Сравнительный анализ применяемых методов лабораторной диагностики бластоцист показал, что полная и достоверная верификация разных жизненных форм бластоцист, степень контаминации и выраженности воспалительных изменений в слизистой оболочке разных отделов ЖКТ, возможна только при гистологическом исследовании биоптата.

Сущность изобретения заключается в том, что гистологическим методом в биоптатах слизистой оболочки разных отделов ЖКТ после окрашивания по методу Май-Грюнвальда идентифицируют разные жизненные формы бластоцист в короткие сроки.

Заявленный способ осуществляется в несколько этапов:

1. Эзофагогастроскопия и фиброволоконная колоноскопия со взятием биоптата - 10 мин;

2. Фиксация биоптатов в 10% нейтральном забуференном растворе формалина в течение 3-х часов при комнатной температуре;

3. Промывка фиксированных биоптатов в Н₂O водопроводной - 1 час;

4. Заливка биоптатов в парафин и приготовление серийных срезов толщиной 5 мкм - 10 минут;

5. Дофиксация полученных срезов в абсолютном метаноле - 5 минут;

6. Высушивание срезов на воздухе - 5 минут;

7. Окрашивание срезов по Май-Грюнвальду (сочетание метиленового синего с азуром II и эозином) - 15 минут;

8. Промывка окрашенных срезов в Н₂O дистиллированной - 10 минут;

9. Высушивание в термостате при 56% Цельсия - 30 минут;

10. Заключение готовых гистологических препаратов в канадский бальзам - 5 минут;

11. Полимеризация окрашенных препаратов в термостате - 2 часа;

12. Просмотр готовых полимеризованных препаратов при ок7 х объект 100 в течение 6 часов;

Технический результат заключается в том, что предлагаемый нами метод морфологической диагностики бластоцистоза по биоптатам позволит верифицировать наиболее часто встречаемые жизненные формы бластоцист и установить их роль в развитии воспалительных изменений в слизистой оболочке ЖКТ [4].

Гистологическим, гистохимическим и морфометрическим методами изучено 72 биоптата слизистой оболочки разных отделов ЖКТ. Биоптаты были получены при эзофагогастродуоденоскопии и фиброволоконной колоноскопии от 21 пациента обоего пола (женщин 15, а мужчин - 6). Возраст пациентов варьировал от 56 до 78 лет.

Гистохимическое изучение осуществляли после окраски биоптатов 0,1% раствором альцианового синего с верификацией в слизи кислых гликопротеинов. Морфометрическое исследование биоптатов включало верификацию трех жизненных форм бластоцист.

В гистологических препаратах бластоцисты были представлены клетками округлой или овальной формы с азурофильной гомогенной цитоплазмой, в поперечнике не более 50 мкм, которые располагались на поверхности покровного и ямочного эпителия желудка, в просвете желудочных ямочек, каемчатых эпителиоцитов, кишечных желез 12-перстной кишки, а также на поверхностном эпителии кишечных желез слизистой оболочки толстой кишки.

Заявляемый метод включает использование окраски биоптата по Май-Грюнвальду, что значительно повышает частоту выявления разных форм Blastocystis hominis в короткие сроки. Так, в проведенных исследованиях в слизистой оболочке разных отделов ЖКТ Blastocystis hominis были верифицированы в 45,8%: на поверхностном и ямочном эпителии слизистой оболочки тела желудка в 12,4% случаев, в антральном отделе - в 50,0%, на слизистой оболочке 12-ти перстной кишки - в 12,5%, толстой кишки - в 25,2%). Вакуолярные формы бластоцист встречались в 65,4% случаев, гранулярные в 27,7%, а амебоидные - в 6,9%, что значительно выше, чем при других методах обследования. Одновременно с оценкой выраженности контаминации Blastocystis hominis, были установлены морфологические особенности слизистой оболочки пораженных участков: лимфофолликулярная гиперплазия разных отделов ЖКТ (5,5%>) и дисплазия ямочного эпителия тела и антрального отдела желудка и толстой кишки разной степени выраженности и частоты (2,8 до 4,2%), 2,8%) соответственно).

Изобретение иллюстрируют следующие примеры.

Пример 1. Пациент Щ-ков, 76 лет. Клинический диагноз: Бластоцистоз, кишечная форма (В. hominis), среднетяжелое течение.

Сопутствующее заболевание: Язвенная болезнь 12-перстной кишки в фазе обострения. Хроническая ишемическая болезнь сердца, стабильное нарушение ритма, гипертоническая болезнь, стадия II Б, сахарный диабет 2-го типа инсулинозависимая форма.

В течение 50 лет страдает язвенной болезнью 12.п.кишки с частыми обострениями. Получает много препаратов по поводу основного заболевания. В последние годы стал отмечать нарушения стула, которые чередовались запорами и поносами. Ухудшение самочувствия отмечал в течение последней недели, появились голодные и утренние боли в эпигастральной области, присоединился частый жидкий водянистый стул до 5 раз в сутки, вздутие живота, периодические рези в кишечнике. Прошел очередной курс обследования и лечения по поводу обострения язвенной болезни. Получал антибактериальные препараты. После курса лечения отмечал усиление диарейного синдрома, болей в животе, вздутия кишечника, присоединилась субфебрильная температура. С целью исключения развития псевдомембранозного колита было проведено комплексное обследование на группу возбудителей кишечных инфекций - сальмонеллез, шигеллез, рота-, норо-, аденовирусную инфекцию. При микроскопии мазка на паразитарные заболевания были обнаружены бластоцисты. При фиброволоконной микроскопии - слизистая толстой кишки была умеренно гиперемирована, отечная, с явлениями усиления сосудистого рисунка и, местами, мелкоточечных геморрагий. На стенках и в просвете отмечались густые слизистые наложения в умеренном количестве. При окраске гистологических срезов биоптата слизистой толстой кишки по Май-Грюнвальду на поверхностном эпителии и в просвете кишечных желез выявляли цисты и бластоцисты амебоидной формы (В. hominis).

Пример 2. С-ва, 70 лет. Диагноз: Бластоцистоз, кишечная форма, (В. hominis), легкое течение. Сопутствующее заболевание: обострение хронического цистита, гипертоническая болезнь 2Б стадии. Хронический цистит часто рецидивирующая форма. Настоящее заболевание началось с признаков геморрагического цистита после переохлаждения. На фоне лечения ципрофлоксацином на 2-ой день появилась диарея до 5 раз в сутки, тенезмы и вздутие живота. Для исключения кишечной инфекции и патологии толстой кишки проводилось обследование: посев фекалий на кишечную группу и инструментальное исследование кишечника. При эндоскопическом исследовании толстой кишки был диагностирован хронический катаральный сигмоидит. Гистологически в биоптате слизистой оболочки толстой кишки при окраске по Май-Грюнвальду были выявлены единичные цисты паразитов в слизистых наложениях на поверхности эпителия, а в просвете кишечных желез - вакуолярные и гранулярные формы бластоцист (В. hominis).

Пример 3. Пациентка Щ-ва, 40 лет. Основной диагноз: хронический бескаменный холецистит в стадии обострения. Сопутствующее заболевание: бластоцистоз, кишечная форма, латентное течение. Хронический пиелонефрит.

Обратилась с жалобами на боль в правом подреберье. Длительное время страдает хроническим пиелонефритом с периодическими обострениями. На фоне частого приема антибактериальных препаратов и уросептиков отмечала нарушения стула. Больная с диагностической целью была обследована. При инструментальном исследовании толстой кишки был диагностирован катаральный проктосигмоидит. Микроскопия кала на паразитарные заболевания - отрицательная. При гистологическом исследовании биоптата слизистой оболочки толстой кишки после окраски по Май-Грюнвальду в слизи на поверхностном эпителии выявляли единичные цисты и вегетативные формы бластоцист (В. hominis), представленные вакуолярными и гранулярными формами.

Литература

1. Медицинская паразитология и паразитарные болезни: учебное пособие / под ред. А. Б. Ходжаян, С.С. Козлова, М.В. Голубевой. - М.: ГЭОТАРМедиа, 2014. - 448 с.

2. Zierdt, С.Н. Blastocystis hominis an intestinal protozoa parasite of man / С.Н. Zierdt // Publ.Hith Lab. - 1973. - Vol. - P. 147-161.

3. Бронштейн A.M. Паразитарные болезни человека: протозоозы и гельминтозы: учебное пособие / А.М. Бронщтейн, А.К. Токмалаев. - М.: Изд-во РУДН, 2002. - 207 с.

4. Parasites - Blastocystis spp. Infection // Centers for Disease Control and Prevention. - 2020.

5. Продеус Т.В., Федянкина Л.В., Фролова А.А. Морфологическая идентификация бластоцист // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. - 2014. - №1. - С.9-13.

6. Потатуркина-Нестерова Н.П., Чебан Н.М., Ильина Н.А., Нестеров А.С. Простейшие Blastocystis hominis в патологии человека / Практические рекомендации - Ульяновск: УлГУ. - 2000. - 38 с.

7. Christina М. Coyle, Julie Varughese, Louis M. Weiss, Herbert В. Tanowitz. Blastocystis: To Treat or Not to Treat... // Clinical Infectious Diseases. - 2012. - V. 54(1). - P. 105-110.

8. Bjarnason 1., MacPherson A., Hollander D. Intestinal permeability: an overview// Gastroenterology- 1995; 108: 1566-1581.

9. Tamalee Roberts, Damien Stark, John Harkness, John Ellis. Update on the pathogenic potential and treatment options for Blastocystis spp II Gut Pathog. - 2014; 6: 17.

10. Manoj K. Puthia, Selena W.S. Sio, Jia Lu, Kevin S.W. Tan Blastocystis ratti Induces Contact-Independent Apoptosis, F-Actin Rearrangement, and Barrier Function Disruption in IEC-6 Cells // Infect Immun. - 2006; 74(7): 4114-4123.

11. Dagci H., S. Ustun M. S. Taner G. Ersoz, F. Karacasu, S. Budak. Protozoon infections and intestinal permeability // Acta Trop.- 2002; 81: 1-5.

12. Hala S. Elwakil, Iman H. Hewedi Pathogenic potential of Blastocystis hominis in laboratory mice // Parasitol Res. - 2010; 107(3):685-689.

13. СанПиН 3.2.3215-14 "Профилактика паразитарных болезней на территории Российской Федерации".

Изобретение относится к медицине, а именно к патологической анатомии, гастроэнтерологии, паразитологии и медицинской микробиологии, и может быть использовано для диагностики бластоцистоза. Биоптаты слизистой оболочки тела и антрального отдела желудка, 12-перстной и толстой кишок фиксируют в 10% нейтральном забуференном растворе формалина в течение 3-х часов. Далее биоптаты промывают водопроводной водой, заливают в парафин и изготавливают срезы толщиной 5 мкм, срезы окрашивают раствором Май-Грюнвальда в сочетании с азуром II. Бластоцитоз диагностируют при выявлении на поверхности покровного и ямочного эпителия желудка, в просвете желудочных ямочек, каемчатых эпителиоцитов, кишечных желез 12-перстной кишки, а также на поверхностном эпителии кишечных желез слизистой оболочки толстой кишки вакуолярной, гранулярной, амебоидной и цистной форм Blastocystis hominis в виде клеток округлой или овальной формы с азурофильной гомогенной цитоплазмой, в поперечнике не более 50 мкм. Способ обеспечивает возможность морфологической диагностики бластоцистоза по биоптатам, что позволит верифицировать наиболее часто встречаемые жизненные формы бластоцист и установить их роль в развитии воспалительных изменений в слизистой оболочке ЖКТ, за счет исследования биоптатов слизистой оболочки разных отделов ЖКТ гистологическим методом с окрашиванием срезов по методу Май-Грюнвальда. 3 пр.

Способ диагностики бластоцистоза, отличающийся тем, что биоптаты слизистой оболочки тела и антрального отдела желудка, 12-перстной и толстой кишок фиксируют в 10% нейтральном забуференном растворе формалина в течение 3-х часов, далее биоптаты промывают водопроводной водой, заливают в парафин и изготавливают срезы толщиной 5 мкм, срезы окрашивают раствором Май-Грюнвальда в сочетании с азуром II, бластоцитоз диагностируют при выявлении на поверхности покровного и ямочного эпителия желудка, в просвете желудочных ямочек, каемчатых эпителиоцитов, кишечных желез 12-перстной кишки, а также на поверхностном эпителии кишечных желез слизистой оболочки толстой кишки вакуолярной, гранулярной, амебоидной и цистной форм Blastocystis hominis в виде клеток округлой или овальной формы с азурофильной гомогенной цитоплазмой, в поперечнике не более 50 мкм.