Способ определения наличия реакции Т-клеток в крови человека на присутствие антигенов SARS-CoV2 Российский патент 2022 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к иммунологическим исследованиям и исследованиям функциональной активности иммунных клеток.

Заявленный способ позволяет определять специфическую реакцию Т-клеток - выброс различных цитокинов, в частности, ИФН гамма - на присутствие в среде антигенов SARS-CoV-2

Из уровня техники известен метод исследования реакции иммунной системы на вирус SARS-CoV2 «Стимуляция Т-клеток с желаемой антигенной специфичностью» [JP 1999155588, Stimulation Of Т Cell Having Desired Antigenic Specificity, 14.09.1998]. Изобретение представляет собой метод получения и стимуляции специфических Т-клеток посредством получения антиген презентирующих клеток, которым введен иммортализированный ген, с последующей трансдукцией таргетным геном целевых клеток, добавлением Т-клеток и дальнейшего совместного культивирования полученных клеточных популяций. Преимуществом данного метода является возможность получения любых специфических Т-клеток in vitro, недостатком является невозможность обнаружения данным методом сенсибилизированных к антигену SARS-CoV2 Т-клеток в культуре, полученной от человека.

Наиболее близким аналогом является изобретение «Методы стимуляции антиген-специфического Т-клеточного иммунитета» [US 20160068808, Methods for stimulating antigen-specific T cell responses, 22.04.2014]. В изобретении описан способ стимуляции специфических Т-клеток в культуре клеток крови или периферических мононуклеарных лимфоцитов, полученных от человека, посредством добавления ИЛ-10, ИЛ-10 и одного или нескольких антигенов, к которым требуется получение специфических иммунокомпетентных клеток. Отличие данного метода от заявляемого заключается в том, что приведенный метод позволяет получать in vitro специфические Т-клетки в культуре клеток крови и/или периферических мононуклеарных клеток к любому специфическому антигену, а не стимулировать исходные специфические Т-клетки, имеющиеся в исходном материале, полученном от пациента и/или донора.

Техническим результатом заявленного изобретения является возможность исследования реакции иммунокомпетентных клеток цельной крови на присутствие антигенов SARS-CoV2, дающая возможность определять специфическую реакцию Т-клеток - выброс различных цитокинов - на присутствие в среде антигенов SARS-CoV-2.

Вышеприведенный технический результат достигается благодаря тому, что производят забор цельной крови в объеме не менее 2 мл в пробирку с антикоагулянтом (гепарином), далее полученную кровь раскапывают в несколько лунок планшета или пробирки в объеме не менее 500 мкл, далее одну лунку или пробирку оставляют в качестве контрольной и не добавляют никаких дополнительных реагентов, где при последующем исследовании уровня интерферона гамма (ИФН гамма) значение последнего не должно превышать 100 пг/мл. Превышение значения 100 пг/мл будет возможно свидетельствовать о наличии у пациента иммунокомпрометирующего состояния, т.к. при обследовании 100 здоровых доноров не было получено значений, превышающих 100 пг/мл. В другую лунку или пробирку добавляют фитогемагглютинин (ФГА) в концентрации 10 мкг/мл, т.к. при превышении данных значений будет наблюдаться переактивирование клеток, при более низкой концентрации может наблюдаться недостаточная активаций клеток. В лунке, куда добавлен ФГА, при последующем исследовании уровня интерферона гамма (ИФН гамма) значение последнего не должно быть ниже 100 пг/мл. Получение более низких значений будет свидетельствовать о наличии у исследуемого иммунодефицитного состояния, в таком случае значения интерферона в лунках с антигеном нельзя интерпретировать как валидные. В другую - любой из антигенов SARS (S, N, Е) в концентрации 20-30 мкг/мл, в последнюю - поверхностный антиген гриппа А в концентрации 20-30 мкг/мл, при меньшей концентрации не наблюдается достаточной активации клеток, повышение концентрации экономически и биологически необоснованно, после чего весь планшет / все пробирки инкубируют в течение 24 часов, далее забирают супернатант в объеме не менее 150 мкл (100 мкл стандартный объем сыворотки, требуемый для исследования уровня цитокинов в биологической жидкости большинством ИФА тест систем, которые является наиболее распространенными) и проводят исследование уровня интерферона гамма (ИФН гамма) или другого цитокина любым доступным методом, при соблюдении условий по полученным концентрациям в контрольной лунке / пробирке и лунке / пробирке с ФГА, отмечают специфическую реакцию иммунокомпетентных клеток на присутствие в среде антигенов SARS при превышении концентрации ИФН гамма в лунке / пробирке с последним более чем на 20% (в связи с тем, что значение уровней цитокинов в сыворотке крови людей могут варьироваться в достаточно широком диапазоне, за значимую разницу принимается значение, которое превышает разницу, полученную при исследовании уровня цитокинов в сыворотке крови, полученной в аналогичных условиях, одного и того же пациента в течение 10 дней) аналогичного показателя в лунке / пробирке с поверхностным антигеном гриппа А.

Изобретение может быть иллюстрировано следующими примерами.

Пример 1

Донор К., 35 лет, анамнез без особенностей, данные физикального осмотра без особенностей. Исследуемый тесно контактировал с пациентом (супружеская пара, проживали в одной квартире и в пределах одной спальни), у которого определялись характерные симптомы SARS-CoV2 (температура 38°С, головная боль, потеря обоняния) и у которого определялся в мазке из ротоглотки SARS-CoV2 методом ПЦР в 2 заборах с интервалом в 3 дня, при этом исследуемый донор К. не имел клинических симптомов заболевания, мазок на ПЦР сдал по прошествии карантинного периода, в мазке РНК SARS -СоV2 не была обнаружена. У данного донора также по окончании карантинного периода произвели забор крови в объеме 4 мл в пробирку с гепарином, в тот же день кровь поставили на инкубирование на 24 часа в планшете в следующем варианте: 500 мкл контроль кровь (без добавления реагентов), 500 мкл кровь + ФГА 10 мкг / мл, 500 мкл кровь + антиген SARS S 30 мкг/мл, 500 мкл кровь + антиген SARS N 30 мкг/мл, 500 мкл кровь + поверхностный антиген вируса гриппа А 30 мкг/мл. Далее планшет инкубировали в течение 24 часов в стандартных условиях 5% CO2 и 37°С. По прошествии инкубации отобрали 100 мкл супернатанта из каждой лунки и поставили реакцию иммуноферментного анализа (ИФА) на интерферон гамма.

Исходя из полученных данных можно сделать вывод о наличии специфического выброса Т-клетками ИФН гамма в ответ на присутствие в среде антигенов вируса SARS, т.к. по полученным результатам концентрации ИФН гамма соблюдены следующие условия: концентрация в контрольной лунке не превышает 100 пг/мл (0 пг/мл), концентрация в пробирке с ФГА превышает 100 пг/мл и составляет 900 пг/мл, концентрация в лунках с антигенами S и N SARS-CoV2 составляет 320 и 50 пг/мл соответственно на фоне 1,9 пг/мл, полученной в лунке с поверхностным антигеном вируса гриппа А. Анамнестические данные донора К. свидетельствуют о возможном контакте иммуннокомпентеных клеток с вирусом SARS-CoV2 и, как следствие, формирования ими специфической реакции, заключающейся в частности в выбросе ИФН гамма, в ответ на антиген SARS-CoV2, о чем свидетельствует проведенное исследование и что может быть одним из объяснений отсутствия у данного донора симптомов заболевания COVID 19 при его тесном и продолжительном контакте (проживание в одной квартире и одной спальне в течение 14 недель) с инфицированным.

Пример 2

Донор Л., 46 лет, анамнез без особенностей, данные физикального осмотра без особенностей. Исследуемый тесно контактировал с пациентом (инфицированный взрослый ребенок (22 года), проживали в одной квартире и в пределах одной спальни), у которого определялись характерные симптомы SARS-CoV2 (слабые катаральные явления, слабость, головная боль, потеря обоняния) и у которого определялся в мазке из ротоглотки SARS-CoV2 методом ПЦР в 2 заборах с интервалом в 2 дня, при этом исследуемый донор Л. сдал мазок из ротоглотки на определение РНК SARS-СоV2 методом ПЦР через неделю после получения первого положительного результата у инфицированного родственника, в мазке РНК SARS-CoV2 была обнаружена. В течение всего карантинного периода и далее (период наблюдения составлял 4 недели с момента получения положительного результата ПЦР) донор Л. не имел клинических симптомов заболевания. По прошествии карантинного периода, в мазке донора Л. РНК SARS-CoV2 не была обнаружена. У данного донора также по окончании карантинного периода произвели забор крови в объеме 4 мл в пробирку с гепарином, в тот же день раскапали кровь в планшет в следующем варианте: 500 мкл контроль кровь (без добавления реагентов), 500 мкл кровь + ФГА 10 мкг / мл, 500 мкл кровь + антиген SARS S 20 мкг/мл, 500 мкл кровь + антиген SARS N 20 мкг/мл, 500 мкл кровь + поверхностный антиген вируса гриппа А 20 мкг / мл. Далее планшет инкубировали в течение 24 часов в стандартных условиях 5% CO2 и 37°С. По прошествии инкубации отобрали 100 мкл супернатанта из каждой лунки и поставили реакцию ИФА на интерферон гамма.

Исходя из полученных данных можно сделать вывод о наличии специфического выброса Т-клетками ИФН гамма в ответ на присутствие в среде антигенов вируса SARS, т.к. по полученным результатам концентрации ИФН гамма соблюдены следующие условия: концентрация в контрольной лунке не превышает 100 пг/мл (0 пг/мл), концентрация в пробирке с ФГА превышает 100 пг/л и составляет 680 пг/мл, концентрация в лунках с антигенами S и N SARS-CoV2 составляет 20 и 240 пг/мл соответственно на фоне 50 пг/мл, полученной в лунке с поверхностным антигеном вируса гриппа А, концентрация ИФН гамма в лунке с антигеном N SARS-CoV2 превышает более чем на 20% таковое значение в лунке с поверхностным антигеном вируса гриппа А (240 пг/мл и 50 пг/мл соответственно). Анамнестические данные донора Л. свидетельствуют о возможном контакте иммуннокомпентеных клеток с вирусом SARS-CoV2 и, как следствие, формирования ими специфической реакции, заключающейся в частности в выбросе ИФН гамма, в ответ на антиген SARS-CoV2, о чем свидетельствует проведенное исследование и что может быть одним из объяснений отсутствия у данного донора симптомов заболевания COVID 19 при его тесном и продолжительном контакте (проживание в одной квартире и одной спальне в течение 14 недель) с инфицированным и несмотря на положительный результат ПЦР на РНК вируса SARS-CoV2.

Настоящий тест будет способствовать отражению статуса в отношении инфекции вирусом SARS не только гуморального звена иммунитета (наличие антител в плазме крови), но и клеточного, т.е. будет отображать способность Т-клеток реагировать выбросом цитокинов, прежде всего, противовирусного интерферона гамма, в ответ на встречу с антигенами вируса SARS.

Результаты подобного теста помогут клиницистам в определении показаний к мерам специфической профилактики и, при накоплении определенного массива данных, формировании прогноза течения инфекции SARS.

Изобретение относится к медицине и биологии, а именно к иммунологическим исследованиям и исследованиям функциональной активности иммунных клеток. Производят забор цельной крови в объеме не менее 2 мл в пробирку с антикоагулянтом, далее полученную кровь распределяют в несколько лунок планшета или пробирки в объеме не менее 500 мкл в каждую, далее одну лунку или пробирку оставляют в качестве контрольной, в другую добавляют фитогемагглютинин в концентрации 10 мкг/мл, в третью - антиген SARS-CoV2 в концентрации 20-30 мкг/мл, в последнюю - поверхностный антиген гриппа А в концентрации 20-30 мкг/мл, после чего весь планшет / все пробирки инкубируют в течение 24 часов, далее забирают супернатант в объеме не менее 150 мкл и проводят исследование уровня интерферона гамма, по результатам которого судят о наличии реакции Т-клеток на присутствие антигенов SARS-CoV2 при соблюдении следующих условий: концентрация интерферона гамма в контрольной лунке/пробирке менее 100 пг/мл, концентрация интерферона гамма в лунке/пробирке с фитогемагглютинином более 100 пг/мл, концентрация интерферона гамма в лунке/пробирке с антиген SARS-CoV2 более чем на 20% превышает концентрацию интерферона гамма в лунке/пробирке с поверхностным антигеном гриппа А. Техническим результатом заявленного изобретения является возможность исследования реакции иммунокомпетентных клеток цельной крови на присутствие антигенов SARS-CoV2, дающая возможность определять специфическую реакцию Т-клеток - выброс различных цитокинов - на присутствие в среде антигенов SARS-CoV-2. 2 пр.

Способ определения наличия реакции Т-клеток в крови человека на присутствие антигенов SARS-CoV2, характеризующийся тем, что производят забор цельной крови в пробирку с антикоагулянтом, далее полученную кровь распределяют в несколько лунок планшета или пробирки в объеме не менее 500 мкл в каждую, далее одну лунку или пробирку оставляют в качестве контрольной, в другую добавляют фитогемагглютинин в концентрации 10 мкг/мл, в третью - антиген SARS-CoV2 в концентрации 20-30 мкг/мл, в последнюю - поверхностный антиген гриппа А в концентрации 20-30 мкг/мл, после чего весь планшет / все пробирки инкубируют в течение 24 часов, забирают супернатант в объеме не менее 150 мкл из каждой лунки или пробирки и проводят исследование уровня интерферона гамма, по результатам которого судят о наличии реакции Т-клеток на присутствие антигенов SARS-CoV2 при соблюдении следующих условий: концентрация интерферона гамма в контрольной лунке/пробирке менее 100 пг/мл, концентрация интерферона гамма в лунке/пробирке с фитогемагглютинином более 100 пг/мл, концентрация интерферона гамма в лунке/пробирке с антиген SARS-CoV2 более чем на 20% превышает концентрацию интерферона гамма в лунке/пробирке с поверхностным антигеном гриппа А.