Способ диагностики иммунной нейтропении новорожденного Российский патент 2022 года по МПК G01N33/58 G01N33/49 C12Q1/686 

Заявляемое изобретение относится к медицине, а именно к диагностике, и в частности к диагностике иммунной нейтропении новорожденных (ИНН).

Нейтропении у новорожденных - это снижение количества нейтрофилов менее 1,0×10⁹/л; при этом тяжелой считается нейтропения с уровнем нейтрофилов менее 0,5×10⁹/л. Нейтропения может быть результатом комбинации сниженной продукции нейтрофилов (механизм, обычно встречающийся при определенных вирусных инфекциях и врожденной хронической нейтропении) и повышенной утилизации или разрушения клеток (наблюдается при присоединившейся бактериальной инфекции, аллоиммунной либо аутоиммунной нейтропении), а также результатом избыточного потребления нейтрофилов при тяжелых инфекциях

Различают три вида иммунноопосредованных первичных нейтропений: аллоиммунную, трансиммунную и аутоиммунную нейтропению. Каждая из них требует различной терапии: назначения ребенку адекватной медикаментозной терапии, определения возможности грудного вскармливания, установления риска развития нейтропении у детей в данной семье.

Аллоиммунная нейтропении обусловлена трансплацентарным переносом материнских аллоантител класса IgG к антигенам нейтрофилов ребенка. Такие антитела обычно фиксируют комплемент и направлены против антигенов, специфических для нейтрофилов. АНН - редкое заболевание. Патогенез АНН заключается в трансплацентарном попадании материнских антител к отцовским антигенам на поверхности нейтрофилов плода. Материнские антитела чаще являются лейкоагглютининами, реагируют с клетками пациента и его отца и не реагируют с клетками матери. Наиболее значимыми для выработки антител являются аллели нейтрофильных антигенов человека (HNA): HNA 1a, -1b, -1 с, которые являются полиморфными формами FCGR3B. Несовместимость с HNA2, -3а, -4а, -4b и -5а также может вызывать АНН. Заболевание обычно протекает в легкой форме, однако могут отмечаться тяжелые инфекционные осложнения нейтропении, такие как пневмония, сепсис, менингит. Аллоиммунная нейтропения, как правило, разрешается после отмены грудного вскармливания.

При трансиммунной нейтропении разрушение нейтрофилов ребенка происходит аутоантителами матери, страдающей иммунной нейтропенией, или системными заболеваниями, сопровождающимися аутосенсибилизацией. Наличие у матери аутоиммунной нейтропении либо других аутоиммунных заболеваний системного заболевания указанного типа позволяет предположить трансплацентарный перенос антинейтрофильных аутоантител.

Аутоиммунная нейтропения возникает в результате повышенной деструкции нейтрофилов под воздействием аутоантител к антигенам HNA. Анти-HNA антитела обычно являются IgG-антителами и направлены против специфических нейтрофильных антигенов HNA1a и HNA2b. Диагноз базируется на выявлении антинейтрофильных антител. Аутоиммунная нейтропения подразделяется на первичную и вторичную. Вторичная иммунная нейтропения развивается на фоне какого-либо аутоиммунного заболевания, как правило, системного характера - системной красной волчанки, ревматоидного артрита, гранулематоза Вегенера и др. Терапия вторичной нейтропении проводится в составе комплексного лечения основного заболевания. Первичная иммунная нейтропения, как правило, дебютирует в первые 3 года жизни, имеет доброкачественный характер и в 90% случаев разрешается самостоятельно в течение нескольких лет.

Известен [Новиков Д.К и др. Клиническая иммунология. Учебное пособие - Витебск: ВГМУ, 2006, 302 с.] способ диагностики иммунной нейтропении новорожденного, включающий исследование аллоантител к антигенам HNA в сыворотке матери и антител, фиксированных на HNA, у ребенка, согласно которому при обнаружении в сыворотке матери аллоантител диагностируют аллоиммунную нейтропению у ребенка [ibid. стр. 30 и 53], причем исследование проводят методом проточной цитометрии. Однако, кроме аллоиммунной, существуют другие виды иммунноопосредованных первичных нейтропений, определение которых в указанном способе не описано.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является алгоритм диагностики ИНН, включающий генетические (HNA-типирование) и иммунологические тесты (L.B. Lopes, S.A. Abbas, Е. Moritz et al, TRANSFUSION 2018;00;1-7, doi: 10.1111/trf.14524). Известный способ включает проведение следующих исследований: гранулоцитарного непрямого иммунофлуоресцентного теста (granulocyte indirect immunofluorescence test (GIFT), гранулоцитарного агглютинационного теста (granulocyte agglutination test (GAT) и теста мобилизации антигенов гранулоцитов моноклональными антителами (monoclonal antibody immobilisation of granulocyte antigens (MAIGA). По рекомендациям авторов, для скрининга необходимо использовать и GAT, и GIFT, поскольку GIFT позволяет выявлять антитела класса IgG, но не выявляет антитела класса IgM, a GAT выявляет антитела класса IgM и не выявляют антитела класса IgG. Специфичность антител авторы рекомендуют определять в MAIGA. Однако MAIGA не выявляет антитела к антигену HNA-3а, т.к. не существует коммерческих моноклональных антител анти-НИА-3а, необходимых для исследования.

Применение для исследования всех трех методов требует значительного количества нейтрофилов. Для технологий GAT, GIFT необходимо использование только нейтрофилов, что достигается путем разделения клеток на градиенте плотности фикола. Техника разделения ведет к большой потере клеток, что затрудняет дальнейшее исследование, т.к. у ребенка нейтропения (сниженное число нейтрофилов). Продолжительность процедуры составляет не менее 4 часов. Авторы исследуют аллоантитела к антигенам HNA в сыворотке матери и фиксированные на HNA антитела у ребенка.

Но результаты этих исследований не позволяют в полной мере оценить природу антител, т.к. при выявлении антител у ребенка и отсутствии антител у матери мы можем предположить наличие аутоантител у самого ребенка. Однако эти антитела у ребенка могут быть материнскими аутоантителами, что требует иного подхода в лечении.

Целью заявляемого изобретения является разработка точного способа диагностики, позволяющего в одном анализе определить антитела и класса IgG, и класса IgM, используя при этом небольшое количество клеток, и сделать заключение о природе нейтропении с возможностью установления специфичности выявленных антител.

Поставленная цель достигается тем, что в способе диагностики иммунной нейтропении новорожденного, включающем исследование аутоантител к HNA в сыворотке матери и антител, фиксированных на HNA, у ребенка, проводят скрининг аутоантител у матери, и при обнаружении в сыворотке матери аутоантител к HNA диагностируют трансиммунную нейтропению у ребенка, а при наличии антител, фиксированных на HNA, у ребенка диагностируют аутоиммунную нейтропению у ребенка, причем исследование проводят методом проточной цитометрии.

Метод проточной цитометрии описан в статье [Кробинец И.И., Минеева Н.В., Богданова И.О., и др., Казанский мед. журнал, 2020; 101 (2): 182-187. DOI: 10.17816/KMJ2020-182]; он позволяет выявить как аллоантитела к отсутствующим у индивида антигенам нейтрофилов, так и фиксированные и циркулирующие в плазме крови аутоантитела классов G и М к собственным нейтрофилам. Исследование показало высокую специфичность и чувствительность метода проточной цитометрии при исследовании антител к нейтрофилам, что позволило использовать в заявляемом способе технологию проточной цитометрии вместо технологий GAT и GIFT.

Заявляемый способ предусматривает следующую последовательность исследований:

1. Скрининг аутоантител к нейтрофилам в крови матери и ребенка. Исследование осуществляют в соответствии со способом, описанным в [Кробинец И.И., Минеева Н.В., Богданова И.О., и др., Казанский мед. журнал, 2020; 101 (2): 182-187. DOI: 10.17816/KMJ2020-182]; оно заключается в определении методом проточной цитометрии процентного содержания нейтрофилов, фиксирующих иммуноглобулины классов G и М, причем в качестве маркеров аутоиммунного процесса используют моноклональные антитела классов G и М.

Для проведения исследования требуется небольшое количество материала: у матери забирают 9 мл цельной крови, заготовленной с этилендиаминтетрауксусной кислотой; у ребенка - 5-7 мл крови. Процедура непродолжительна и занимает 1 час 40 минут.

2. Получение препаратов геномной ДНК из образцов периферической крови матери и ребенка и проведение процедуры HNA-типирования ДНК матери и ребенка. Анализ заключается в определении а- и b-форм генов локусов HNA-1, -2, -3, -4, -5 методом аллель-специфичной полимеразной цепной реакции (АС-ПЦР). Результат оценивался на термоциклере iCycler iQ5 (Bio-Rad, США) в режиме реального времени по регистрируемому в процессе амплификации нарастанию сигнала от флуорофора EVA Green, как это описано в статье [Кробинец И.И. Минеева Н.В., Богданова И.О., Чечеткин А.В Бюллетень сибирской медицины. 2020; 19(2): 48-54.doi.org/10.20538/1682-0363-2020-2-48-54].

Далее способ иллюстрируется примерами, но не ограничен ими.

Пример 1.

Ребенок В., 1 месяца жизни, родился от 2 беременности, 2 родов. Вес при рождении 2900 г. Поскольку ребенок страдал от нейтропении и отита средней степени тяжести, была поставлена задача определения типа нейтропении для назначения адекватного режима и лечения.

Образцы крови матери ребенка и его отца доставлены в лабораторию для проведения иммуногематологического и молекулярно-генетического анализа.

Генотип ребенка: HNA-1abd, -3ab, -4аа, -5аа

Генотип матери: HNA-1bdbd, -3ab, -4аа, -5ab

Генотип отца: HNA-1aa, -3аа, -4аа, -5ab

Методом проточной цитометрии установлено: аутоантитела на нейтрофилах матери не обнаружены (0,9%), аллоантитела в сыворотке матери обнаружены (15,1%), на нейтрофилах ребенка фиксированы антитела (24%).

Поскольку выявлены аллоантитела анти-HNA-1a в сыворотке матери, определена высокая вероятность аллоиммунной нейтропении. Рекомендации: отмена грудного вскармливания и симптоматическое лечение.

Пример 2.

Ребенок Н., 3 месяца, родилась от 1 беременности, 1 родов. Вес при рождении 3230 г. У матери в анамнезе - системная красная волчанка, вследствие этого была поставлена задача выявления нейтропении и определения ее типа для назначения адекватного режима и лечения.

Образцы крови матери, ребенка и отца доставлены в лабораторию для проведения иммуногематологического и молекулярно-генетического анализа.

Методом проточной цитометрии установлено: обнаружены аутоантитела на нейтрофилах матери (21,4%), не обнаружены аллоантитела в сыворотке матери (1,1%), на нейтрофилах ребенка фиксированы антитела (17%).

Поскольку выявлены аутоантитела к HNA у матери, у ребенка предполагается трансиммунная нейтропения. Рекомендации: отмена грудного вскармливания и симптоматическое лечение.

Пример 3.

Ребенок А., 6 месяцев, родился от 3 беременности, 2 родов. Вес при рождении 3500 г. У ребенка наблюдается нейтропения и бронхит средней степени тяжести, поэтому была поставлена задача определения типа нейтропении для назначения адекватного режима и лечения.

Образцы крови матери, ребенка и отца доставлены в лабораторию для проведения иммуногематологического и молекулярно-генетического анализа.

Методом проточной цитометрии установлено: аутоантитела на нейтрофилах матери не обнаружены (0,7%), аллоантитела в сыворотке матери не обнаружены (0,4%), а на нейтрофилах ребенка фиксированы антитела (42%).

Поскольку выявлены аутоантитела к HNA у ребенка, высока вероятность аутоиммунной нейтропении. Рекомендации: симптоматическое лечение без отмены грудного вскармливания.

Таким образом, преимуществами предлагаемого способа являются высокая чувствительность и специфичность, высокая производительность, быстрота выполнения, возможность анализировать небольшое число клеток, что очень актуально для пациентов с нейтропенией. Введение в протокол исследования «гейтов» позволяет анализировать отдельные субпопуляции лейкоцитов и определять их фенотип без предварительного разделения клеток в градиенте плотности фикола, что неизбежно сопровождается потерей клеток и очень критично для пациентов с нейтропенией. Предлагаемый метод позволяет выявлять ауто- и аллоантитела классов G и М в одном анализе. Использование Fc блокатора, представляющего собой Fc фрагмент IgG, «вытесняющий» молекулу IgG с сайта связывания Fc рецептора, позволяет с высокой степенью точности дифференцировать специфические аутоантитела к антигенам нейтрофилов и антитела IgG, входящие в состав иммунных комплексов и связанных с Fc рецептором. Оценка результата производится на проточном цитометре автоматически в режиме реального времени и не требует использования микроскопа. Преимуществами методики аллель-специфичной ПЦР в присутствии интеркалирующего красителя EVAGreen с использованием оригинальных праймеров являются возможность детекции ПЦР-продуктов в процессе реакции, исследование кинетики их накопления, отсутствие стадии электрофореза. Оценка результатов в режиме реального времени снижает риск контаминации продукта ПЦР.

Изобретение относится к области медицины и предназначено для диагностики иммунной нейтропении новорожденного. Проводят исследование аутоантител к HNA в сыворотке матери и антител, фиксированных на HNA, у ребенка методом проточной цитометрии. При обнаружении в сыворотке матери аутоантител к HNA диагностируют трансиммунную нейтропению у ребенка. При наличии антител, фиксированных на HNA, у ребенка диагностируют аутоиммунную нейтропению у ребенка. Изобретение обеспечивает разработку точного способа диагностики, позволяющего в одном анализе определить антитела и класс IgG и класс IgM, используя при этом небольшое количество клеток, и сделать заключение о природе нейтропении с возможностью установления специфичности выявленных антител. 3 пр.

Способ диагностики иммунной нейтропении новорожденного, включающий исследование аутоантител к HNA в сыворотке матери и антител, фиксированных на HNA, у ребенка, отличающийся тем, что проводят скрининг аутоантител у матери и при обнаружении в сыворотке матери аутоантител к HNA диагностируют трансиммунную нейтропению у ребенка, а при наличии антител, фиксированных на HNA, у ребенка диагностируют аутоиммунную нейтропению у ребенка, причем исследование проводят методом проточной цитометрии.