Способ диагностики аллоиммунной тромбоцитопении новорожденных Российский патент 2024 года по МПК G01N33/53 A61B5/00 

Заявляемое изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и в частности, к диагностике иммунных заболеваний крови. Оно может найти применение в диагностике тромбоцитопений новорожденных, а также в пренатальной диагностике беременных женщин для оценки риска возникновения у плода неонатальной аллоиммунной тромбоцитопенической пурпуры (НАТП).

Различают первичные тромбоцитопений, в основе которых, как правило, лежат иммунопатологические процессы, и вторичные (симптоматические) тромбоцитопений, возникающие на фоне различных состояний, среди которых вирусные или бактериальные инфекции, тяжелые гипоксические проявления, иммунодефицитные состояния, синдром внутрисосудистого свертывания крови и др. [Закиров И.И., Сафина А.И. Вестник современной клинической медицины. - 2013. - Т. 6, вып.6. - С.102-107]. Клинические проявления разных видов тромбоцитопений новорожденных практически одинаковы. Типичным клиническим проявлением тромбоцитопений является появление на поверхности кожи геморрагических высыпаний спустя минуты или часы после рождения ребенка (петехии, экхимозы), кровотечения из микроциркуляторного русла (носовые, десневые и пр.), кровотечения из пуповинного остатка, мелена. Грозным осложнением тромбоцитопений являются внутричерепные кровоизлияния, развивающиеся у 20% плодов/новорожденных с тромбоцитопенией, и приводящие к появлению неврологической симптоматики или пренатальной/постнатальной гибели ребенка (в 10% случаев). Диагностика тромбоцитопений новорожденных является весьма сложным процессом, грамотное проведение которого во многом предопределяет успех терапевтических мероприятий, которые кардинально различаются в зависимости от причины тромбоцитопений и от которых зависит прогноз и качество жизни пациента.

Неонатальная аллоиммунная тромбоцитопеническая пурпура (НАТП) обусловлена несовместимостью матери и плода по представленным на тромбоцитах антигенам НРА-1а, -2b, -3а, 3b, -5b, -15а, 15b, отсутствующим у матери и унаследованным ребенком от отца. Заболевание развивается, если в крови матери присутствуют аллоантитела, направленные против этих антигенов. Частота возникновения НАТП составляет один случай на 1000 - 1500 новорожденных, хотя антигенные различия между матерью и ребенком составляют один случай на 100 - 200 родов. [С Kaplan. Immunohematology. 2007; 23(1): 9-13].

Наиболее клинически значимыми являются анти-НРА-1а, анти-НРА-5b, анти-НРА-3а и анти-НРА-3b антитела. Таким образом, выявление антитромбоцитарных аллоантител необходимо в диагностике тромбоцитопений новорожденных, а также является важной частью пренатальной диагностики беременных женщин для оценки риска возникновения у плода НАТП, особенно если у старших детей в период новорожденности была диагностирована тромбоцитопения.

Для проведения иммунологических исследований необходима кровь матери и ребенка в количестве не менее 9 мл, однако иногда невозможно получить образец крови ребенка из-за невозможности забора достаточного количества биоматериала у новорожденного по различным причинам или в пренатальном периоде.

Известен способ определения антител к тромбоцитам методом прямой иммобилизации моноклональными антителами тромбоцитарного антигена (Monoclonal Antibody Immobilized Platelet Antigens, MAIPA). [C. Kaplan, J. Freedman et al. Vox Sang. 2007; Nov; 93 (4): 298-9. Doi: 10.1111/j.1423-0410.2007.00943] Однако, при проведении исследования образцов крови больных с глубокой тромбоцитопенией (количество тромбоцитов в крови менее 20×10⁹/л) препятствием является общее недостаточное количество тромбоцитов, концентрация которых значительно снижается еще и по причине больших потерь при подготовке проб для анализа. Также недостатком данного способа является высокая стоимость реактивов, трудоемкость и длительность процесса.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ обнаружения антитромбоцитарных антител с помощью проточной цитометрии [Kohler М., Dittmann J. et al.// Transfusion, 1996, 366: 250-255], при котором приготовленную суспензию тромбоцитов и лимфоцитов донора инкубируют с сывороткой крови реципиента, окрашивают мечеными моноклональными антителами и выявляют фиксированные на клетках антитела на проточном цитофлуориметре. Способ используется для определения иммунологической совместимости донора и реципиента по антигенам тромбоцитов и лимфоцитов перед трансфузией донорских тромбоцитов. Данный способ, обладая высокой специфичностью и чувствительностью, позволяет быстро получить результат, что имеет несомненное значение для практической трансфузиологии. Однако он применяется только для диагностики аллосенсибилизации больных и не предусматривает выявления антител аутологичной направленности. Также не всегда является возможным осуществить забор достаточного для выделения тромбоцитов количества крови у новорожденного, особенно при глубокой тромбоцитопений, так как это может привести к ухудшению состояния пациента.

Результат, на получение которого направлено заявляемое изобретение, состоит в определении наличия аллоиммунной тромбоцитопений у новорожденного без использования его крови.

Еще один результат, на достижение которого направлено заявляемое изобретение, заключается в возможности исследования вероятности возникновения аллоиммунной тромбоцитопений у еще нерожденного ребенка (плода) в тех случаях, когда у старших детей в период новорожденности была диагностирована тромбоцитопения.

Указанный результат достигается тем, что в способе диагностики аллоиммунной тромбоцитопений новорожденных, включающем инкубацию исследуемого материала с плазмой крови матери, окрашивание мечеными моноклональными антителами, выявление фиксированных на клетках антител на проточном цитофлуориметре и определение показателя аллосенсибилизации матери как процент IgG-позитивных клеток от числа клеток, фиксирующих анти-CD41 антитела, в качестве исследуемого материала используют тромбоциты отца, и при получении значения показателя аллосенсибилизации матери не менее 15% диагностируют аллоимунную тромбоцитопению.

Для осуществления способа из венозной крови отца новорожденного выделяют тромбоциты, инкубируют с плазмой крови матери, окрашивают их мечеными моноклональными антителами к CD41, IgG человека и анализируют с помощью проточной цитометрии. Показатель аллосенсибилизации вычисляют как процент IgG-позитивных клеток к числу клеток, фиксирующих анти-CD41 антитела. При значении 15% и более результат считают положительным, оценивая полуколичественно от 1+ до 4+, и интерпретируют как наличие у матери антитромбоцитарных аллоантител, циркулирующих в плазме ее крови (и являющихся причиной аллоиммунной тромбоцитопений новорожденного).

Заявляемый способ осуществляется следующим образом.

9-10 мл венозной крови отца ребенка собирают в пробирки с K2E (EDTA), центрифугируют 10 минут при 1500 об/мин, отбирают обогащенную тромбоцитами плазму в чистую пробирку и центрифугируют 5 минут при 3000 g. Супернатант удаляют, полученный осадок ресуспензируют, заливают фосфатно-солевым буфером (Биолот) с 0,009М этилендиаминтетрауксусной кислоты (PBS EDTA), центрифугируют 5 минут при 3000 g, надосадок сливают. Процедуру повторяют 2 раза. Ресуспензируют в PBS EDTA, доводя концентрацию тромбоцитов до 4-6×10⁵/мкл.

9-10 мл венозной крови матери собирают в пробирки с K2E (EDTA), центрифугируют 10 минут при 3000 g, отбирают полученную плазму в чистую пробирку.

В промаркированную пробирку вносят 150 мкл полученной суспензии тромбоцитов отца и 150 мкл плазмы матери. Параллельно ставят аутоконтроль: 150 мкл полученной суспензии тромбоцитов матери и 150 мкл ее же плазмы. Пробирки перемешивают, плотно закрывают, инкубируют 30 минут при 37°С. После инкубации пробирки центрифугируют 5 минут при 3000 g, надосадок сливают, осадок ресуспензируют, заливают PBS EDTA, центрифугируют 5 минут при 3000 g. Процедуру повторяют. Осадок клеток ресуспензируют в 500 мкл PBS EDTA.

Осадок клеток последовательно разводят PBS EDTA 2 раза в соотношении 1:10 и помещают в пробирку для проточной цитометрии, вносят 5 мкл моноклональных антител Goat F(ab')2 Anti-Human IgG-FITC (в разведении 1:15 в PBS EDTA) и 5 мкл моноклональных антител CD41-PE (Beckman Coulter). Пробы инкубируют в темноте 20 минут. Затем добавляют по 500 мкл PBS EDTA.

Образцы анализируют на проточном цитофлуориметре, оснащенном двумя флуоресцентными каналами и лазером (длина волны 488 нм). Анализ клеток в образце проводят по трем параметрам: интенсивности прямого и бокового светорассеяния (линейная шкала), флуоресценции изотиоцианат флуоресцеина (FITC), используемого в данном случае для метки моноклональных антител Anti-Human IgG-FITC.

С помощью программного обеспечения строят график распределения клеток по интенсивности светорассеяния и флуоресценции FITC. При анализе пробы на графике выбирают регион неповрежденных тромбоцитов, окрашенных моноклональными антителами к CD41. Далее анализируют тот же регион, определяя % клеток, окрашенных моноклональными антителами Anti-Human IgG. При значении ≥ 15% и отсутствии аутоантител делают вывод о наличии в образце антитромбоцитарных аллоантител. Оценивают полуколичественно от 1+ до 4+ (15-40% 1+; 40-60% 2+; 60-80% 3+; ≥ 90% 4+).

Далее заявляемый способ иллюстрируется примерами, но не ограничен ими.

Пример 1

Пациентка Т. Групповая принадлежность A(II) Rh+. У мужа 0(1) rh-. В анамнезе 5 беременностей. 1 и 2 - нормальные роды. 5-я - у ребенка (возраст новорожденного 4 дня) группа крови A(II) Rh+, количество тромбоцитов (34-36)×10⁹/л., парвовирус, низкий гемоглобин, диагностирована тромбоцитопения новорожденного.

Для определения природы тромбоцитопений новорожденного было проведено обследование заявляемым способом, для чего у матери и отца новорожденного произведен забор 9 мл крови. Результат обследования приведен в табл.1.

Как видно из приведенных в табл.1 данных, в плазме крови пациентки Т. обнаружены (строка 3 табл.1) аллоантитела к тромбоцитам отца ребенка (4+), что свидетельствует об иммунной природе тромбоцитопений новорожденного.

Пример 2.

Пациентка Т. Групповая принадлежность A(II) Rh+. У мужа 0(1) Rh+. У ребенка (возраст новорожденного 9 дней) неонатальная тромбоцитопения, количество тромбоцитов 60×10⁹/л, высокий уровень С реактивного белка, подозрение на бактериальную инфекцию. На фоне антибиотикотерапии наблюдался рост количества тромбоцитов 80-100-150×10⁹/л.

Для определения природы тромбоцитопений новорожденного было проведено обследование заявляемым способом, для чего у матери и отца новорожденного произведен забор 9 мл крови. Результат обследования приведен в табл.2.

Как видно из приведенных данных (строка 3 табл.2), тромбоцитопения у новорожденного не имеет аллоиммунного характера и, по-видимому, развилась вследствие бактериального инфицирования плода внутриутробно, в процессе родов либо в постнатальном периоде.

Приведенные выше примеры демонстрируют, что заявляемый способ определения циркулирующих антитромбоцитарных аллоантител в крови матери, проводимый с использованием тромбоцитов отца новорожденного, позволяет осуществить исследование при невозможности забора достаточного для анализа количества тромбоцитов при высокой тромбоцитопений у ребенка. Он повышает точность диагностики, что, в свою очередь, позволяет назначить адекватную медикаментозную терапию, проводить контроль эффективности лечения, решить вопрос о возможности грудного вскармливания ребенка и отслеживать момент возникновения рецидива заболевания.

Изобретение относится к медицине, а именно к гематологии, и, в частности, к диагностике иммунных заболеваний крови, и касается диагностики аллоиммунной тромбоцитопении новорожденных. Исследуемый материал, в качестве которого используют тромбоциты отца, инкубируют с плазмой крови матери, окрашивают мечеными моноклональными антителами, выявляют фиксированные на клетках антитела на проточном цитофлуориметре. Затем определяют показатель аллосенсибилизации матери как процент IgG-позитивных клеток от числа клеток, фиксирующих анти-CD41 антитела. При получении значения показателя аллосенсибилизации матери не менее 15% диагностируют аллоиммунную тромбоцитопению новорожденного. Изобретение обеспечивает диагностику аллоиммунной тромбоцитопений у новорожденных без использования его крови. 2 табл., 2 пр.

Способ диагностики аллоиммунной тромбоцитопении новорожденных, включающий инкубацию исследуемого материала с плазмой крови матери, окрашивание мечеными моноклональными антителами, выявление фиксированных на клетках антител на проточном цитофлуориметре и определение показателя аллосенсибилизации матери как процент IgG-позитивных клеток от числа клеток, фиксирующих анти-CD41 антитела, отличающийся тем, что в качестве исследуемого материала используют тромбоциты отца, и при получении значения показателя аллосенсибилизации матери не менее 15% диагностируют аллоимунную тромбоцитопению новорожденного.