МЕЧЕНЫЕ НУКЛЕОТИДЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ Российский патент 2022 года по МПК C07H19/00 G01N27/26 G01N33/483 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Данная заявка заявляет приоритет по первоначальной заявке США №62/710465, поданной 16 февраля 2018 года, содержание которой включено в данный документ во всей своей полноте посредством ссылки.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Разные протоколы в биологическом или химическом исследовании включают проведение большого количества контролируемых реакций на локальных поверхностях подложек или в пределах предварительно определенных реакционных камер. За указанными реакциями можно затем наблюдать или их выявлять, и последующий анализ может помочь идентифицировать или обнаружить свойства химических веществ, участвующих в реакции. В некоторых примерах в контролируемых реакциях генерируются флуоресценция, и, таким образом, для выявления можно использовать оптическую систему. В других примерах контролируемые реакции изменяют заряд, проводимость или какое-нибудь другое электрическое свойство, и, таким образом, для выявления можно использовать электронную систему.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Первый аспект, раскрытый в данном документе, представляет собой меченый нуклеотид. Номера 1-6 относятся к данному первому аспекту.

1. В одном примере меченый нуклеотид содержит нуклеотид; связывающую группу, присоединенную к фосфатной группе данного нуклеотида; редокс-активную зарядную метку, присоединенную к связывающей группе, причем редокс-активная зарядная метка подлежит окислению или восстановлению посредством токопроводящего канала при удерживании вблизи чувствительной зоны токопроводящего канала.

2. В примере (1) меченого нуклеотида редокс-активная зарядная метка включает координированный атом металла, который подлежит вступлению в окислительно-восстановительную реакцию.

3. В примере (1) или (2) меченого нуклеотида связывающая группа содержит специфичную область, присоединенную к редокс-активной зарядной метке.

4. В примере (3) специфичная область предполагает взаимодействие с акцепторной областью на связке, связанной с токопроводящим каналом, и специфичная область включает аффинную метку.

5. В примере (4) специфичная область предполагает гибридизацию с акцепторной областью на связке, связанной с токопроводящим каналом, и аффинная метка включает нуклеотидную последовательность, включающую от примерно одного нуклеотида до примерно десяти нуклеотидов, или последовательность пептидо-нуклеиновой кислоты, включающую от примерно одной пептидо-нуклеиновой кислоты до примерно десяти пептидо-нуклеиновых кислот.

В любом из примеров (1)-(5) меченого нуклеотида редокс-активная зарядная метка включает 10 зарядов или меньше в неокисленном или невосстановленном состоянии; и редокс-активная зарядная метка включает от примерно 1 до примерно 100 зарядов в окисленном или восстановленном состоянии.

Следует понимать, что любые признаки меченого нуклеотида, раскрытые в данном документе, включая примеры (1)-(6), можно объединять вместе любым желаемым образом и/или в любой желаемой конфигурации.

Второй аспект, раскрытый в данном документе, представляет собой способ. Номера 7-18 относятся к данному второму аспекту.

7. В примере способ включает введение нуклеиновой кислоты - матрицы в токопроводящий канал, имеющий связанную с ним полимеразу; введение меченых нуклеотидов в токопроводящий канал, по меньшей мере одного из меченых нуклеотидов, включающего нуклеотид и нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку, присоединенную к нему, посредством чего один из меченых нуклеотидов ассоциирует с полимеразой; при ассоциации одного из меченых нуклеотидов, инициацию окислительно-восстановительной реакции нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки с токопроводящим каналом с изменением состояния заряда нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки; и под действием окислительно-восстановительной реакции, выявление ответа токопроводящего канала.

8. В примере (7) способа инициирование окислительно-восстановительной реакции включает прикладывание зарядного напряжения к токопроводящему каналу, и выявление ответа токопроводящего канала включает прикладывание напряжения считывания к токопроводящему каналу.

9. Пример способа (7) или (8) дополнительно включает ассоциирование ответа токопроводящего канала с нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной меткой ассоциированного одного из меченых нуклеотидов; и на основе нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки, идентификацию нуклеотида ассоциированного меченого нуклеотида.

10. Пример (9) может также дополнительно включать отщепление нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки от ассоциированного одного из меченых нуклеотидов, посредством чего нуклеотид ассоциированного меченого нуклеотида включается в растущую нить, комплементарную нуклеиновой кислоте - матрице.

11. В примере (10) ассоциирование одного из меченых нуклеотидов, инициирование окислительно-восстановительной реакции, выявление, ассоциирование и идентификация вместе представляют собой цикл секвенирования; и способ дополнительно включает выполнение следующего цикла секвенирования, позволяя следующему одному из меченых нуклеотидов ассоциировать с полимеразой; при ассоциации следующего одного из меченых нуклеотидов, инициирование другой окислительно-восстановительной реакции другой нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки и токопроводящего канала с изменением состояния заряда другой нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки; под действием другой окислительно-восстановительной реакции, выявление другого ответа токопроводящего канала; ассоциирование другого ответа токопроводящего канала с другой нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной меткой; и на основе другой нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки, идентификацию нуклеотида следующего одного из меченых нуклеотидов.

12. Пример (11) может также дополнительно включать отщепление другой нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки следующего одного из меченых нуклеотидов, посредством чего нуклеотид следующего одного из меченых нуклеотидов включается в растущую нить, комплементарную нуклеиновой кислоте - матрице; и повторение цикла секвенирования.

13. В любом из примеров (7)-(12) способа редокс-активная зарядная метка включает координированный атом металла, который подлежит вступлению в окислительно-восстановительную реакцию.

14. В любом из примеров (7)-(13) способа редокс-активная зарядная метка включает 10 зарядов или меньше в неокисленном или невосстановленном состоянии; и редокс-активная зарядная метка включает от примерно 1 заряда до примерно 100 зарядов в измененном состоянии заряда.

15. В любом из примеров (7)-(14) способа меченые нуклеотиды включают первый меченый нуклеотид, включающий дезоксиаденозинфосфат в качестве нуклеотида и первую нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку; второй меченый нуклеотид, включающий дезоксигуанозинфосфат в качестве нуклеотида и вторую нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку; третий меченый нуклеотид, включающий дезоксицитидинфосфат в качестве нуклеотида и третью нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку; и четвертый меченый нуклеотид, включающий дезокситимидинфосфат в качестве нуклеотида и четвертую нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку; и первая, вторая, третья и четвертая нуклеотид-специфичные редокс-активные зарядные метки отличаются друг от друга.

16. В примере (15) две из первой, второй, третьей и четвертой нуклеотид-специфичных редокс-активных зарядных меток являются положительно заряженными в измененном состоянии заряда, и где другие две из первой, второй, третьей и четвертой нуклеотид-специфичных редокс-активных зарядных меток являются отрицательно заряженными в измененном состоянии заряда.

17. В любом из примеров (7)-(16) способа меченые нуклеотиды находятся в буфере с низким содержанием соли.

18. В любом из примеров (7)-(17) способа токопроводящий канал представляет собой канал полевого транзистора.

Следует понимать, что любые признаки способа, включая примеры (7)-(17), можно объединять вместе любым желаемым образом. Кроме того, следует понимать, что любое сочетание признаков данного способа и/или меченого нуклеотида можно использовать вместе и/или объединять с любым из примеров, раскрытых в данном документе.

Третий аспект, раскрытый в данном документе, представляет собой набор. Номера 19-22 относятся к данному третьему аспекту.

19. В примере набор содержит проточную ячейку, включающую токопроводящий канал, имеющий связку, присоединенную к нему, и полимеразу, присоединенную к данному токопроводящему каналу посредством связки; нуклеиновую кислоту - матрицу, подлежащую введению в проточную ячейку; реагенты, подлежащие введению в проточную ячейку, причем реагенты включают меченые нуклеотиды, по меньшей мере один из меченых нуклеотидов, включающий: нуклеотид; связывающую группу, присоединенную к фосфатной группе нуклеотида; и редокс-активную зарядную метку, присоединенную к связывающей группе, причем редокс-активная зарядная метка подлежит окислению или восстановлению посредством токопроводящего канала при удерживании вблизи чувствительной зоны токопроводящего канала; и детектор для выявления ответа от токопроводящего канала, когда окислительно-восстановительная реакция протекает между редокс-активной зарядной меткой и токопроводящим каналом.

20. В примере (19) набора редокс-активная зарядная метка выбрана из группы, состоящей из ферроцена, цинк-тетрабензопорфирина, фталоцианина кобальта, трис-(2,2'-бипиримидин)рутения, 4-ферроценилбензилового спирта, 5-(4-гидроксиметилфенил)-10,15,20-тримезитилпорфинато-цинка (II) и редокс-активного каликсарена.

21. В любом из примеров (19) или (20) набора редокс-активная зарядная метка включает 10 зарядов или меньше в неокисленном или невосстановленном состоянии; и редокс-активная зарядная метка включает от примерно 1 заряда до примерно 100 зарядов в окисленном или восстановленном состоянии.

22. В любом из примеров (19)-(21) набора токопроводящий канал представляет собой канал полевого транзистора.

Следует понимать, что любые признаки данного набора, включая примеры (19)-(22), можно объединять вместе любым желательным образом. Кроме того, следует понимать, что любое сочетание признаков данного набора и/или способа и/или меченого нуклеотида можно использовать совместно и/или объединять с любым из примеров, раскрытых в данном документе.

Кроме того, следует понимать, что любые признаки любого из меченых нуклеотидов и/или любого из способов и/или любого из наборов можно объединять вместе любым желательным образом, и/или можно объединять с любым из примеров, раскрытых в данном документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

Признаки примеров настоящего раскрытия станут очевидными посредством ссылки на следующее подробное описание и графические материалы, в которых номера позиций соответствуют похожим, хотя возможно не идентичным, компонентам. Для краткости, номера позиций и признаки, имеющие ранее описанную функцию, могут быть или могут не быть описаны в связи с другими графическими материалами, в которых они встречаются.

Фиг. 1 представляет собой схематичное изображение примера меченого нуклеотида;

Фиг.2 представляет собой схематичное и частично перспективное изображение примера системы, раскрытой в данном документе;

Фиг. 3 представляет собой схематичное изображение полимераз, присоединенных к токопроводящему каналу сенсора заряда, и ассоциированных с мечеными нуклеотидами, которые можно различить на основе заряда.

Фиг. 4 представляет собой блок-схему, иллюстрирующую пример способа, раскрытого в данном документе;

Фиг. 5А представляет собой схематичное изображение примера меченого нуклеотида, используемого в способе секвенирования; и

Фиг. 5В представляет собой схематичное изображение примера взаимодействия связки и специфичной области примера меченого нуклеотида, раскрытого в данном документе.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

В данном документе раскрыты меченые нуклеотиды, которые можно использовать для выявления одиночных молекул в способах секвенирования нуклеиновых кислот. Сенсор, используемый при выявлении одиночных молекул, может иметь один токопроводящий канал с одной полимеразой, присоединенной к нему. Это позволяет выявлять одно событие включения (то есть включение основания в растущую нить посредством полимеразы) за один раз на каждом отдельном сенсоре. Меченые нуклеотиды обеспечивают уникальный способ выявления, который можно использовать для секвенирования нуклеиновой кислоты и для выявления нуклеиновых кислот и в общем других аналитов.

Пример меченого нуклеотида 10 схематично изображен на Фиг. 1. Как показано, меченый нуклеотид 10 включает нуклеотид 12, связывающую группу 14 или 14', присоединенную к фосфатной группе 16 нуклеотида 12, и редокс-активную зарядную метку 18, присоединенную к связывающей группе 14 или 14', причем редокс-активная зарядная метка 18 подлежит окислению или восстановлению посредством токопроводящего канала (номер позиции 32, Фиг. 2) при удерживании вблизи чувствительной зоны (номер позиции 31, Фиг. 3) токопроводящего канала 32. Меченый нуклеотид 10 можно считать неприродным или синтетическим нуклеотидом, поскольку он структурно или химически отличается от природного нуклеотида.

Нуклеотид 12 меченого нуклеотида 10 может представлять собой природный нуклеотид. Природные нуклеотиды включают азотсодержащее гетероциклическое основание 20, сахар 22 и одну или более фосфатных групп 16. Примеры природных нуклеотидов включают, например, рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды. В рибонуклеотиде сахар 22 представляет собой рибозу, и в дезоксирибонуклеотидах сахар 22 представляет собой дезоксирибозу, то есть сахар, лишенный гидроксильной группы, которая присутствует в положении 2' в рибозе. В примере нуклеотид 12 находится в полифосфатной форме, поскольку он включает несколько фосфатных групп 16 (например, трифосфат (то есть гамма фосфат), тетрафосфат, пентафосфат, гексафосфат и т.д.). Гетероциклическое основание 20 (то есть, нуклеооснование) может представлять собой пуриновое основание или пиримидиновое основание. Пуриновые основания включают аденин (А) и гуанин (G), и их модифицированные производные или аналоги. Пиримидиновые основания включают цитозин (С), тимин (Т) и урацил (U) и их модифицированные производные или аналоги. Атом С-1 дезоксирибозы связан с N-1 пиримидина или N-9 пурина. Аналог нуклеиновой кислоты может иметь любой фосфатный остов, сахар или измененное нуклеооснование. Примеры аналогов нуклеиновой кислоты включают, например, универсальные основания или аналоги фосфат-сахарного основа, такие как пептидо-нуклеиновые кислоты (PNA-от англ. peptide nucleic acid).

Меченый нуклеотид 10 также включает связывающую группу 14 или 14'. В некоторых примерах связывающая группа (показанная как 14 на Фиг. 1) не включает специфичную область 24. В других примерах связывающая группа (показанная как 14' на Фиг. 1) не включает специфичную область 24. Как схематично изображено на Фиг. 1, когда специфичная область 24 является частью связывающей группы 14', область 24 может быть расположена на конце, который химически связан с редокс-активной зарядной меткой 18. Специфичная область 24 будет описана дополнительно ниже в данном документе.

Связывающая группа 14 или 14' меченого нуклеотида 10 может представлять собой любую молекулу с длинной цепью, которая может химически связываться на одном конце с фосфатной группой 16 нуклеотида 12, и которая может химически связываться на другом конце с редокс-активной зарядной меткой 18. Связывающая группа 14 или 14' может быть также выбрана таким образом, чтобы она не взаимодействовала с полимеразой 26, используемой в системе 30 (см. Фиг. 2), раскрытой в данном документе. Связывающая группа 14 или 14' выбрана таким образом, чтобы они была достаточно длинной для того, чтобы позволить редокс-активной зарядной метке 18 расположиться в пределах чувствительной зоны 31 (Фиг. 3) токопроводящего канала 32 (Фиг. 2). В качестве примеров связывающая группа 14 или 14' может включать алкильную цепь, поли(этиленгликолевую) цепь, амидную группу, фосфатную группу, гетероцикл, такой как триазол, нуклеотиды или их комбинации. Примеры алкильной цепи могут включать по меньшей мере 6 атомов углерода и примеры поли(этиленгликолевой) цепи могут включать по меньшей мере 3 этиленгликолевых звена.

Следующий пример иллюстрирует пример меченого нуклеотида 10, где связывающая группа 14, 14' содержит алкильную цепь, амидную группу, поли(этиленгликолевую) цепь и триазол:

Следующий пример иллюстрирует другой пример меченого нуклеотида 10, где связывающая группа 14, 14' содержит алкильные цепи, амидную группу, поли(этиленгликолевые) цепи, триазол и фосфатную группу:

Следующий пример иллюстрирует еще один пример меченого нуклеотида 10, где связывающая группа 14, 14' содержит алкильные цепи, амидные группы, поли(этиленгликолевые) цепи, триазол и фосфатную группу:

Следующий пример иллюстрирует еще один пример меченого нуклеотида 10, где связывающая группа 14, 14' содержит алкильные цепи, амидную группу, поли(этиленгликолевые) цепи, триазол, фосфатную группу и полинуклеотидную цепь:

В то время, как было описано несколько примеров связывающих групп 14, 14', следует понимать, что могут быть использованы другие связывающие группы 14, 14'.

Как показано на Фиг. 1 и в предыдущих примерах, некоторые из меченых нуклеотидов 10 могут также включать специфичную область 24 в составе связывающей группы 14'. Специфичная область 24 может взаимодействовать с акцепторной областью на связке 28 (Фиг. 2), которая связана с токопроводящим каналом 32. Специфичная область 24 может включать аффинную метку, которая может временно присоединяться к акцепторной области связки 28. Аффинность связывания аффинной метки может быть достаточно сильной, чтобы связывать специфичную область 24 с акцепторной областью на связке 28, когда меченый нуклеотид 10 удерживается полимеразой 26, но может также быть достаточно слабой, чтобы освобождать специфичную область 24 от акцепторной области после события включения (например, когда полимераза 26 естественным образом расщепляет связь между альфа-фосфатом и связывающей группой 14, 14' или между альфа-фосфатом и бета-фосфатом). Иными словами, скорости ассоциации и диссоциации специфичной области 24 (например, аффинной метки) с или от акцепторной области могут быть выбраны для улучшения суммарной чувствительности в отношении одиночных молекул. Скорость ассоциации при взаимодействии аффинная метка/акцепторная область может быть высокой, например, благодаря эффективно высокой концентрации специфичной области 24, и таким образом аффинной метки, перед включением нуклеотида. Данная высокая скорость ассоциации увеличивает период времени, за который аффинная метка связывается с акцепторной областью. После расщепления скорость диссоциации взаимодействия также может быть выбрана такой, чтобы быть достаточно высокой для того, чтобы комплекс (между аффинной меткой и акцепторной областью) диссоциировал достаточно быстро для того, чтобы существовала низкая вероятность связанного состояния (между аффинной меткой ранее включенного нуклеотида и акцепторной областью), когда следующий меченый нуклеотид 10 поступает к активному сайту полимеразы 26.

В конкретном примере специфичная область 24 предполагает гибридизацию с акцепторной областью на связке 28, и таким образом аффинная метка может включать нуклеотидную последовательность или последовательность пептидо-нуклеиновой кислоты, которая способна временно присоединяться к акцепторной области на связке 28 (Фиг. 2). В одном примере аффинная метка включает нуклеотидную последовательность, включающую от примерно одного нуклеотида до примерно десяти нуклеотидов или от примерно одной пептидо-нуклеиновой кислоты до примерно десяти пептидо-нуклеиновых кислот. В других примерах аффинная метка включает вплоть до шести нуклеотидов или пептидо-нуклеиновых кислот. В еще одном примере (как показано и описано дополнительно на Фиг. 5В), специфичная область 24 может дополнительно включать инозин(ы), фланкирующий(ие) обе стороны нуклеотидной последовательности. В еще одних примерах аффинная метка может представлять собой группировку, не являющуюся нуклеиновой кислотой, как например пептиды, которые обладают аффинностью друг к другу или к гидрофобным полимерам. Конкретный пример белка включает суперспираль, которая представляет собой структурный мотив в белках, в котором от 2 до 7 альфа-спиралей скручены вместе подобно нитям веревки. Иными словами, суперспирали построены двумя или более альфа-спиралями, которые обматывают друг друга с образованием суперспирали. Примеры суперспиралей включают онкобелки, подобно c-Fos и c-jun.

Редокс-активная зарядная метка 18 может представлять собой любую зарядную метку, которая может увеличивать свой заряд при окислении (потеря электрона) или восстановлении (получение электрона) посредством токопроводящего канала 32, например, при удерживании вблизи чувствительной зоны 31 токопроводящего канала 32. Зарядная метка 18 может быть нейтральной по суммарному заряду (нулевой заряд) или близкой к данному состоянию (10 зарядов или меньше), перед тем, как произойдет окислительно-восстановительная реакция. Иными словами, в неокисленном или невосстановленном состоянии редокс-активная зарядная метка 18 несет 10 зарядов или меньше. Заряды, которые несет редокс-активная зарядная метка 18, не включают какого-либо заряда фосфата 16 или связывающей группы 14, 14' меченого нуклеотида 10. После протекания окислительно-восстановительной реакции общий суммарный заряд редокс-активной зарядной метки 18 меняется (то есть она несет больше положительных зарядов или больше отрицательных зарядов). В одном примере редокс-активная зарядная метка 18 включает 10 зарядов или меньше в неокисленном или невосстановленном состоянии, и редокс-активная зарядная метка 18 включает от примерно 1 заряда до примерно 100 зарядов в окисленном или восстановленном состоянии. Следует понимать, что число зарядов редокс-активной зарядной метки 18 в неокисленном или невосстановленном состоянии меньше, чем число зарядов редокс-активной зарядной метки 18 в окисленном или восстановленном состоянии. В другом примере редокс-активная зарядная метка 18 включает 10 зарядов или меньше в неокисленном или невосстановленном состоянии, и редокс-активная зарядная метка 18 включает от примерно 20 зарядов до примерно 50 зарядов в окисленном или восстановленном состоянии.

Редокс-активная зарядная метка 18 может включать любой координированный (то есть закрепленный на месте) атом металла, который может вступать в окислительно-восстановительную реакцию. Примеры атомов металла включают железо, кобальт, рутений, цинк, медь, литий, серебро и т.д. В качестве некоторых конкретных примеров редокс-активная зарядная метка 18 выбрана из группы, состоящей из ферроцена, цинк-тетрабензопорфирина, фталоцианина кобальта, трис-(2,2'-бипиримидин)рутения, 4-ферроценилбензилового спирта, 5-(4-гидроксиметилфенил)-10,15,20-тримезитилпорфинато-цинка (II) и редокс-активного каликсарена.

Ферроцен может представлять собой любое металлоорганическое соединение, которое включает формулу Fe(C₅H₅)₂. Конкретным примером является ферроценсодержащий дендример:

в котором Fe²+ может становиться Fe³+ при окислении, вводя, таким образом, положительный заряд в каждом «Fe».

Цинк-тетрабензопорфирин имеет структуру:

в которой R=C₂H₅, С₆Н₁₃ или С₁₂Н₂₅. Zn¹⁺ может становиться Zn²⁺ при окислении, вводя, таким образом, положительный заряд.

Примеры фталоцианина кобальта включают:

и

оба из которых представляют собой суммарно нейтральные молекулы в растворе. При окислении Со²⁺ становится Со³⁺, вводя, таким образом, положительный заряд в каждом «Со» (например, один положительный заряд для первой структуры и пять положительных зарядов для второй структуры). Известны другие кобальт-содержащие соединения со степенями окисления, находящимися в интервале от -3 до +5, и они могут быть использованы в качестве отрицательно заряжаемых редокс-активных зарядных меток 18 или положительно заряжаемых редокс-активных зарядных меток 18.

Трис-(2,2'-бипиримидин)рутений имеет структуру:

в которой Ru²+ может становиться Ru³+ при окислении, вводя, таким образом, положительный заряд.

4-ферроценилбензиловый спирт имеет структуру:

в которой Fe²+ может становиться Fe³+ при окислении, вводя, таким образом, положительный заряд.

5-(4-гидроксиметилфенил)-10,15,20-тримезитилпорфинато-цинк (II) имеет структуру:

в которой Zn²+ может становиться Zn¹+ при восстановлении, вводя, таким образом, отрицательный заряд.

Некоторые примеры редокс-активных каликсаренов включают:

Каждая из ранее описанных окислительно-восстановительных реакций обратима, и таким образом соединения могут быть использованы в своем более окисленном состоянии и могут быть восстановлены в чувствительной зоне 31 токопроводящего канала, или могут быть использованы в своем менее окисленном состоянии и могут быть окислены в чувствительной зоне 31 токопроводящего канала.

Как упомянуто выше, редокс-активная зарядная метка 18, раскрытая в данном документе, может быть нейтральной или почти нейтральной в растворе, и не несет большего заряда до тех пор, пока не вступит в окислительно-восстановительную реакцию. В связи с этим, нуклеотиды 10 в растворе не считаются высоко зарядными молекулами, и агломерация среди противоположно заряженных меченых нуклеотидов 10 (содержащих противоположно заряженные почти нейтральные редокс-активные зарядные метки 18) менее вероятно произойдет.

Меченые нуклеотиды 10 можно использовать в наборе и/или в системе 30 (пример которой показан на Фиг. 2). Набор или система 30 может включать токопроводящий канал 32. Токопроводящий канал 32 может быть в пределах или частью сосуда, такого как лунка, трубка, канал, кювета, чашка Петри, бутыль или тому подобное. Другим примером подходящего сосуда является проточная ячейка 34. Может быть использована любая конфигурация проточной ячейки, подходящая для реализаций, описанных в данном документе. Некоторые примеры проточных ячеек представляют собой проточные ячейки, которые имеются в продаже от Ilumina, Inc. (San Diego, CA). Проточные ячейки 34 удобны для доставки основного объема реагентов к ряду токопроводящих каналов 32 с индивидуальной адресацией во время присоединения компонентов реакции (например, нуклеиновых кислот - матриц, меченых нуклеотидов 10 и т.д.) к соответствующему токопроводящему каналу 32 или во время последующих реакций, проводимых с компонентами реакции на соответствующих токопроводящих каналах 32. Циклические процессы, такие как реакции секвенирования нуклеиновых кислот, особенно хорошо подходят для проточных ячеек 34. Другим особенно полезным сосудом является лунка в многолуночном планшете или планшете для микротитрования.

В примере, показанном на Фиг. 2, проточная ячейка 34 включает токопроводящий канал 32. В том виде, в котором он используется в данном документе, термин «токопроводящий канал» предназначен для обозначения части устройства выявления, которое преобразует возмущения на своей поверхности или в окружающем его электрическом поле в электрический сигнал. Например, токопроводящий канал 32 может преобразовывать прибытие или отправление компонента реакции (например, меченого нуклеотида 10) в электрический сигнал. В примерах, раскрытых в данном документе, токопроводящий канал 32 может также преобразовывать взаимодействия двух компонентов реакции (нуклеиновой кислоты - матрицы и нуклеотида 20 меченого нуклеотида 10) в выявляемый сигнал в результате его взаимодействия с редокс-активной зарядной меткой 18 меченого нуклеотида 10.

Токопроводящий канал 32 может представлять собой канал сенсора заряда 35. Сенсор заряда 35 может включать исток и электроды стока S, D и канал 32, соединяющий электроды S, D. Канал 32 может иметь подходящую геометрию, такую как, например, трубка, проволока, пластина и т.д.

Электроды S, D могут представлять собой любой подходящий проводниковый материал. Примеры подходящих материалов истока и электродов стока включают кобальт, силицид кобальта, никель, силицид никеля, алюминий, вольфрам, медь, титан, молибден, оксид индия-олова (ITO - от англ. Indium tin oxide), оксид индия-цинка, золото, платину, углерод и т.д.

Токопроводящий канал 32 может включать любой проводниковый или полупроводниковый материал, который может окислять или восстанавливать редокс-активную зарядную метку 18. Материал может включать органический материал, неорганический материал или оба материала. Некоторые примеры подходящих материалов канала включают кремний, углерод (например, стеклоуглерод, графен и т.п.), полимеры, такие как проводящие полимеры (например, полипиррол, полианилин, политиофен, поли(3,4-этилендиокситиофен) с примесью поли(4-стиролсульфоната) (PEDOT-PSS) и т.д.), металлы и т.д.

В некоторых примерах токопроводящий канал 26 может также представлять собой наноструктуру, которая имеет по меньшей мере один линейный размер по наношкале (находясь в интервале от 1 нм до меньше чем 1 мкм). В одном примере данный линейный размер относится к наибольшему линейному размеру. В качестве примеров, токопроводящий канал 26 может представлять собой полупроводящую наноструктуру, графеновую наноструктуру, металлическую наноструктуру и наноструктуру на основе проводящего полимера. Наноструктура может представлять собой многостенную или одностенную нанотрубку, нанопроволоку, наноленту и т.д

Примером сенсора заряда 35 является полевой транзистор (FET - от англ. field effect transistor), такой как FET на основе углеродной нанотрубки (CNT - от англ. carbon nanotube), FET на основе одностенной углеродной нанотрубки (SWNT - от англ. single-walled carbon nanotube), FET на основе кремниевой нанопроволоки (SiNW - от англ. silicon nanowire), FET на основе полимерной нанопроволоки, FET на основе графеновой наноленты (и родственные FET - наноленты, изготовленные из двухмерных материалов, таких как MoS₂, силицен, и т.д.), туннельный FET (TFET - от англ. tunnel FET) и устройства с большой допороговой крутизной.

Примером сенсора заряда 35, показанного на Фиг. 2, является наноструктура FET, включающая исток S, электрод стока D и токопроводящий канал 32 между истоком S и электродом стока D. Токопроводящий канал 32 может представлять собой углеродную нанотрубку, одностенную углеродную нанотрубку, кремниевую нанопроволоку, полимерную нанопроволоку и т.д. Токопроводящий канал 32 функционирует как вывод затвора и, таким образом, также показан как «G» на Фиг. 2. В примерах, раскрытых в данном документе, вывод затвора G/токопроводящий канал 32 может служить в качестве окислительно-восстановительного электрода (отдающего или принимающего электроны) в отношении редокс-активной зарядной метки 18 меченого нуклеотида 10. Более конкретно, вывод затвора G/токопроводящий канал 32 можно использовать для переноса электронов к или от редокс-активной зарядной метки 18. Перенос электронов может происходить посредством туннелирования через оксидный слой затвора (не показан) на по меньшей мере части поверхности вывода затвора G/токопроводящего канала 32. В некоторых примерах для модуляции эффективности передачи тока можно использовать толщину оксидного слоя затвора, такую, чтобы минимальное количество времени контакта проходило перед тем, как редокс-активная зарядная метка 18 станет достаточно активированной. Время контакта может относиться ко времени, на протяжении которого редокс-активная зарядная метка 18 удерживается в достаточной близости от вывода затвора G/токопроводящего канала 32 для того, чтобы перенос электронов происходил с высокой долей вероятности. Данный период времени будет зависеть от многих факторов, включая тип редокс-активной зарядной метки 18, толщину оксидного слоя затвора и расстояние от вывода затвора G/токопроводящего канала 32 до зарядной метки 18. Это можно использовать для обеспечения того, чтобы сенсор заряда 35 достаточно устанавливал различие между диффундирующими мечеными нуклеотидами 10, которые временно контактируют с выводом затвора G/токопроводящим каналом 32, но которые фактически не ассоциированы с полимеразой 26, присоединенной к выводу затвора G/токопроводящему каналу 32. Ожидают, что нуклеотиды 10, которые ассоциированы с активным сайтом полимеразы 26, остаются в ассоциированном состоянии на протяжении периода времени, который значительно продолжительнее, чем период времени, за который происходит временное взаимодействие. Например, меченый нуклеотид 10 может оставаться ассоциированным с активным сайтом полимеразы (например, полимеразы 26) на протяжении от сотен микросекунд до сотен миллисекунд. Временное взаимодействие будет происходить в сроки для диффузии, которые на порядки величины быстрее.

В данном примере полимераза 26 иммобилизована на выводе затвора G/токопроводящем канале 32 сенсора заряда 32 посредством связки 28. Связку 28 используют в качестве якоря для полимеразы 26. Связка 28 может демонстрировать способность к транспорту электронов. Примеры подходящих связок 28 включают цепи нуклеиновых кислот (например, имеющие от 5 до 25 нуклеотидов), пептиды, одиночные углеродные цепи, непроводящие олигомеры или полимеры или олигомеры или полимеры с низкой проводимостью и т.д.

В некоторых примерах связка 28 удерживает полимеразу 26 на расстоянии по меньшей мере 10 нм от вывода затвора G/токопроводящего канала 32 сенсора заряда 35. Это может быть желательным, например, когда не желательно обнаруживать заряды полимеразы 26 и/или отрицательные заряды нуклеиновой кислоты - матрицы 36, удерживаемой полимеразой 26. Однако, если желательно обнаружить заряды полимеразы 26 и/или нуклеиновой кислоты - матрицы 36, тогда связка 28 может удерживать полимеразу 26 на расстоянии меньше чем примерно 10 нм, меньше чем примерно 9 нм, меньше чем примерно 8 нм, меньше чем примерно 7 нм, меньше чем примерно 6 нм, меньше чем примерно 5 нм, меньше чем примерно 4 нм, меньше чем примерно 3 нм, меньше чем примерно 2 нм или примерно 1 нм от вывода затвора G сенсора заряда 32.

Применение сенсора заряда на основе FET 35 может обеспечивать следующее: (1) чувствительность в отношении одиночной молекулы может достигаться посредством как следует сконструированного FET, и (2) можно способствовать высокой степени параллелизации (так называемая «способность к мультиплексированию»), поскольку выявляемое изменение в заряде локализовано вблизи вывода затвора G/токопроводящего канала 32, избегая, таким образом, перекрестных помех между соседними сайтами FET с индивидуальной адресацией (например, в ряду). Кроме того, кремниевую наноструктуру FET можно изготовлять с использованием способов, которые совместимы со средствами производства полупроводников.

Примеры набора и/или системы 30 могут также включать нуклеиновую кислоту - матрицу 36, которая подлежит введению в проточную ячейку 34, и реагенты (не показаны на Фиг. 2), которые подлежат введению в проточную ячейку 34.

Нуклеиновая кислота - матрица 36 может представлять собой любой образец, который подлежит секвенированию, и может состоять из ДНК, РНК или их аналогов. Источник нуклеиновых кислот - матриц (или мишеней) 36 может представлять собой геномную ДНК, матричную РНК или другие нуклеиновые кислоты из нативных источников. В некоторых случаях нуклеиновые кислоты - матрицы 36, которые происходят из таких источников, могут быть амплифицированы перед применением в способе или системе 30 в данном документе. Можно использовать любую из множества известных методик амплификации, включая полимеразную цепную реакцию (ПЦР), амплификацию по типу катящегося кольца (RCA - от англ. rolling circle amplification), амплификацию с множественным замещением (MDA- от англ. multiple displacement amplification) или амплификацию со случайными праймерами (RPA - от англ. random primer amplification), но, не ограничиваясь ими. Следует понимать, что амплификация нуклеиновых кислот - мишеней 26 перед применением в способе или системе 30, изложенной в данном документе, является необязательной. В связи с этим, нуклеиновые кислоты - матрицы 36 не будут амплифицированы перед применением в некоторых примерах. Нуклеиновые кислоты - матрицы/мишени могут возможно происходить из синтетических библиотек. Синтетические нуклеиновые кислоты могут иметь композиции нативной ДНК или РНК или могут представлять собой их аналоги.

Биологические образцы, из которых могут происходить нуклеиновые кислоты - матрицы 36, включают, например, биологические образцы из млекопитающего, такого как грызун, мышь, крыса, кролик, морская свинка, копытное животное, лошадь, овца, свинья, коза, корова, кошка, собака, примат, человекообразный примат или примат, отличный от человека; растения, такого как Arabidopsis thaliana, кукуруза, сорго, овес, пшеница, рис, канола или соя; водоросли, такой как Chlamydomonas reinhardtii; круглого червя, такого как Caenorhabditis elegans; насекомого, такого как Drosophila melanogaster, комар, плодовая мушка, медоносная пчела или паук; рыбы, такой как данио-рерио; рептилии; амфибии, такой как лягушка или Xenopus laevis; dictyostelium discoideum; грибов, таких как Pneumocystis carinii, Takifugu rubripes, дрожжи, Saccharamoyces cerevisiae или Schizosaccharomyces pombe; или Plasmodium falciparum. Нуклеиновые кислоты - матрицы 36 могут также происходить из прокариот, таких как бактерия, Escherichia coli, staphylococci или mycoplasma pneumoniae; архей; вируса, такого как вирус Гепатита С, вирус Эбола или вирус иммунодефицита человека; или вироида. Нуклеиновые кислоты - матрицы 36 могут происходить из гомогенной культуры или популяции указанных выше организмов или в качестве альтернативы из коллекции нескольких разных организмов, например, в сообществе или экосистеме.

Кроме того, нуклеиновые кислоты - матрицы/мишени 36 могут не происходить из природных источников, а скорее могут быть синтезированы с использованием известных методик. Например, зонды для анализа экспрессии генов или зонды генотипирования могут быть синтезированы и использованы в примерах, изложенных в данном документе.

В некоторых примерах, нуклеиновые кислоты - матрицы/мишени 36 могут быть получены в виде фрагментов одной или более чем одной более длинной нуклеиновой кислоты. Фрагментацию можно проводить, используя любую из множества методик, известных в данной области, включая, например, распыление, обработку ультразвуком, химическое расщепление, ферментативное расщепление или физическую фрагментацию.

Фрагментация может также получаться в результате применения конкретной методики амплификации, посредством которой получают ампликоны в результате создания копий только части более длинной нуклеиновой кислоты. Например, посредством ПЦР-амплификации получаются фрагменты, имеющие размер, определенный длиной нуклеотидной последовательности на исходной матрице, которая находится между положениями, где во время амплификации гибридизуются фланкирущие праймеры.

Популяция нуклеиновых кислот - матриц/мишеней 36 или их ампликонов может иметь среднюю длину нити, которая желательна или подходит для конкретного применения способов, наборов или системы 30, изложенных в данном документе. Например, средняя длина нити может составлять меньше чем примерно 100000 нуклеотидов, 50000 нуклеотидов, 10000 нуклеотидов, 5000 нуклеотидов, 1000 нуклеотидов, 500 нуклеотидов, 100 нуклеотидов или 50 нуклеотидов. В качестве альтернативы или дополнительно средняя длина нити может быть больше чем примерно 10 нуклеотидов, 50 нуклеотидов, 100 нуклеотидов, 500 нуклеотидов, 1000 нуклеотидов, 5000 нуклеотидов, 10000 нуклеотидов, 50000 нуклеотидов или 100000 нуклеотидов. Средняя длина нити для популяции нуклеиновых кислот - мишеней или их ампликонов может находиться в интервале от максимального до минимального значения, установленного выше.

В некоторых случаях популяция нуклеиновых кислот - матриц/мишеней 36 может быть получена в условиях или иначе сконфигурирована таким образом, чтобы иметь максимальную длину для своих членов. Например, максимальная длина для членов может составлять меньше чем примерно 100000 нуклеотидов, 50000 нуклеотидов, 10000 нуклеотидов, 5000 нуклеотидов, 1000 нуклеотидов, 500 нуклеотидов, 100 нуклеотидов или 50 нуклеотидов. В качестве альтернативы или дополнительно популяция нуклеиновых кислот в качестве матрицы 36 или их ампликонов может быть получена в условиях или иначе сконфигурирована таким образом, чтобы иметь минимальную длину для своих членов. Например, минимальная длина для членов может составлять больше чем примерно 10 нуклеотидов, 50 нуклеотидов, 100 нуклеотидов, 500 нуклеотидов, 1000 нуклеотидов, 5000 нуклеотидов, 10000 нуклеотидов, 50000 нуклеотидов или 100000 нуклеотидов. Максимальная и минимальная длина нити для нуклеиновых кислот - матриц 36 в популяции может находиться в интервале от максимального до минимального значения, изложенного выше.

Как показано на Фиг. 2, нуклеиновая кислота - матрица 36 (например, нить одноцепочечной ДНК), подлежащая секвенированию, связана с полимеразой 26 после введения в жидкость вместе с или отдельно от реагентов, таких как ранее описанные меченые нуклеотиды 10 (не показано на Фиг. 2).

Нуклеиновая кислота - матрица 36 и/или реагенты (например, меченые нуклеотиды 10) могут находиться в жидкости и быть введены в проточную ячейку 34. Жидкость может включать буфер с низким содержанием соли. В качестве примеров, буфер с низким содержанием соли может включать от больше чем 0 мМ до примерно 50 мМ соли. В качестве одного примера, буфер с низким содержанием соли может включать вплоть до 5 мМ Mg²⁺ в трис-буфере (рН 8,0). Применение буфера с низким содержанием соли может быть желательным таким образом, чтобы на чувствительную зону 31 (то есть, Дебаевскую длину) не оказывалось вредного действия, то есть, чтобы она не была слишком длинной, таким образом, чтобы исключить возможность обнаружения зарядных меток 18. Жидкость может также включать катализаторы, такие как ферменты, которые облегчают реакцию, другие добавки и растворители (например, вода, диметилсульфоксид (ДМСО), бетаин, формамид и т.д.).

В некоторых примерах несколько разных меченых нуклеотидов 10 можно использовать вместе в жидкости, которую вводят в сенсор заряда 35. В данных примерах следует понимать, что связывающая группа 14, 14' может быть либо идентична для всех типов меченых нуклеотидов, либо может быть разной. Свойства связывающей группы 14, 14', такие как длина и жесткость, могут быть изменены таким образом, чтобы влиять на скорость окислительно-восстановительной реакции. Такие свойства могут быть отрегулированы индивидуально для меченого нуклеотида 10 и его ассоциированной редокс-активной зарядной метки 18. Свойства специфичной области 24 связывающей группы 14' можно также менять для влияния на скорость окислительно-восстановительной реакции. Связывающую группу 14, 14' можно изменять для увеличения или уменьшения количества времени, на протяжении которого редокс-активная зарядная метка 18 находится вблизи токопроводящего канала 32. Такие изменения можно использовать для влияния на скорость переноса электронов. Таким образом, временные взаимодействия между зарядной меткой 18 и токопроводящим каналом 32 в результате диффузии меченых нуклеотидов 10 могут быть сделаны с меньшей вероятностью переноса электронов. В качестве альтернативы, удерживание редокс-активной зарядной метки 18 на протяжении более длительного периода в непосредственной близости от токопроводящего канала 32 может приводить к более высокой вероятности переноса электронов.

В одном примере четыре разных меченых нуклеотида 10 используют в жидкости, которую вводят в сенсор заряда 35, причем каждый включает отличающийся нуклеотид 12 (в частности отличающееся основание 20) и отличающуюся нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку 18. Пример этого показан на Фиг. 3. В данном примере меченые нуклеотиды 10 включают: первый меченый нуклеотид 10А, включающий дезоксиаденозинполифосфат в качестве нуклеотида и первую нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку (показано с четырьмя положительными зарядами на Фиг. 3); второй меченый нуклеотид 10G, включающий дезоксигуанозинполифосфат в качестве нуклеотида и вторую нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку (показано с четырьмя отрицательными зарядами на Фиг. 3); третий меченый нуклеотид 10С, включающий дезоксицитидинполифосфат в качестве нуклеотида и третью нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку (показано с двумя отрицательными зарядами на Фиг. 3); и четвертый меченый нуклеотид 10Т, включающий дезокситимидинфосфат в качестве нуклеотида и четвертую нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку (показано с одним положительным зарядом на Фиг. 3). В данном примере первая, вторая, третья и четвертая нуклеотид-специфичные редокс-активные зарядные метки отличаются друг от друга.

В примере, показанном на Фиг. 3, две из первой, второй, третьей и четвертой нуклеотид-специфичных редокс-активных зарядных меток положительно заряжены (например, dATP и dTTP) в измененном состоянии заряда (то есть, после протекания окислительно-восстановительной реакции), и другие две из первой, второй, третьей и четвертой нуклеотид-специфичных редокс-активных зарядных меток (например, dGTP и dCTP) отрицательно заряжены в измененном состоянии заряда (то есть, после протекания окислительно-восстановительной реакции).

В примере, показанном на Фиг. 3, даже в том случае, если заряды на двух из нуклеотид-специфичных редокс-активных зарядных меток являются одинаковыми (положительными или отрицательными), метки 18 можно еще использовать для того, чтобы установить различие между разными типами нуклеотидов, поскольку заряды имеют разную силу (например, после редокс-активации). Согласно примеру конфигурации, показанному на Фиг. 3, предложено установление различия между четырьмя состояниями на основе единственного положения гибридизации со связкой и четырех разных редокс-активных зарядных меток 18. Конкретнее, как dGTP, так и dCTP содержат отрицательно заряженные редокс-активные зарядные метки 18, которые отличают их от dATP и dTTP; и dGTP можно отличить от dCTP, благодаря заряду, который различимо выше, чем заряд на dCTP. Аналогично, dATP и dTTP можно отличить друг от друга, благодаря более высокому положительному заряду на группировке dATP, по сравнению с группировкой dTTP.

В некоторых примерах может быть невозможным иметь редокс-активные зарядные метки 18 как положительной, так и отрицательной величины, функционирующие в одной и той же жидкости, поскольку напряжение, требуемое для того, чтобы зарядить отрицательно зарядную метку, может разряжать положительно зарядную метку, и наоборот. В связи с этим, в других примерах может быть желательным использовать примеры меченых нуклеотидов 10, раскрытые в данном документе, которые включают редокс-активные зарядные метки 18 одной полярности, и использовать другие меченые нуклеотиды, которые включают постоянно зарядные (то есть, не редокс) метки. Примеры постоянно заряженных меток включают отрицательно заряженные метки, такие как, например, фосфатная группа, DMT и/или FMOC (от англ. 9-fluorenylmethoxycarbonyl - 9-флуоренилметоксикарбонил); или положительно заряженные метки, такие как первичный амин. В качестве примера, можно использовать от одного до трех разных меченых нуклеотидов 10 (включая редокс-активные зарядные метки 18), и остальная часть меченых нуклеотидов будет включать постоянно зарядные метки и не редокс-активные зарядные метки 18. Это особенно полезно в случае, когда используют условия восстановления или окисления (но не и те и другие). Следует понимать, что в данных примерах не должно происходить агломерации, поскольку отсутствует относительно высокая концентрация больших группировок обоих типов заряда в растворе в одно и то же время.

На Фиг. 3 также проиллюстрирована чувствительная зона 31 (заштрихованная область вокруг вывода затвора G/токопроводящего канала 32). Сенсоры заряда 35 могут функционировать в биологически релевантных солевых условиях, например, в интервале от примерно 1 мМ до примерно 100 мМ. Дебаевская длина таких солевых растворов может находиться в интервале от примерно 0,3 нМ до примерно 10 нМ, что может ограничивать чувствительную зону 31 до нескольких нм снаружи от поверхности вывода затвора G и часто может уменьшать уровни сигнала с ограничением возможности выявления.

В то время как несколько связанных полимераз 28 показаны на токопроводящем канале 32 на Фиг. 3, следует понимать, что в конкретном сенсоре заряда 35 одна полимераза 28 связана с одним токопроводящим каналом 32. Вследствие этого, в примере, показанном на Фиг. 3, проиллюстрирована полимераза 28 во время событий включения четырех разных нуклеотидов, и эффект, оказываемый на разные редокс-активные зарядные метки 18 во время соответствующих событий включения.

Обращаясь теперь к Фиг. 4, изображен пример способа. Способ 100 включает следующее: введение нуклеиновой кислоты - матрицы 36 в токопроводящий канал 32, имеющий связанную с ним полимеразу 26 (номер позиции 102); введение меченых нуклеотидов 10 в токопроводящий канал 32, причем по меньшей мере один из меченых нуклеотидов 10 включает нуклеотид 12 и нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку 18, присоединенную к нему, посредством чего один из меченых нуклеотидов 10 ассоциирует с полимеразой 26 (номер позиции 104); при ассоциации одного из меченых нуклеотидов 10, инициация окислительно-восстановительной реакции между нуклеотид-специфичной редокс-активной меткой 18 и токопроводящим каналом 32 с изменением состояния заряда нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки 18 (номер позиции 106); и под действием окислительно-восстановительной реакции, выявление ответа сенсора заряда 32 (номер позиции 108). На Фиг. 5А и 5Б также будут ссылаться на протяжении обсуждения способа 100.

Как показано на Фиг. 5А, нуклеиновая кислота - матрица 36, вводимая в сенсор заряда 32, может закрепляться на месте посредством полимеразы 26, которая связана с сенсором заряда 32. Нуклеиновая кислота - матрица 36, показанная на Фиг. 5А, может представлять собой нить ДНК - матрицу.

Также как показано на Фиг. 5А, меченый нуклеотид 10 может включать основание 20, которое комплементарно целевой нуклеиновой кислоте нуклеиновой кислоты - матрицы 36. Меченый нуклеотид 10 будет закреплен на месте, частично, посредством полимеразы 26, которая также связана с нуклеиновой кислотой - матрицей 36. Если имеется, специфичная область 24 связывающей группы 14' меченого нуклеотида 10 может взаимодействовать со связкой 28.

Пример меченого нуклеотида 10, ассоциированного со связкой 28, показан на 5В. В данном примере связывающая группа 14' меченого нуклеотида 10 включает специфичную область 24 (например, А', В', С), которая обладает аффинностью в отношении части (например, А, В, С) связки 28. В данном конкретном примере специфичная область 24 (например, А', В', С) включает нуклеотиды или пептидо-нуклеиновые кислоты, которые комплементарны нуклеотидам или пептидо-нуклеиновым кислотам данной части (например, А, В, С) связки 28. В другом примере, специфичная область 24 и акцепторная область связки 28 может представлять собой группировки, не являющиеся нуклеиновыми кислотами, которые обладают аффинностью друг к другу. В еще одном примере специфичная область 24 может представлять собой группировку, не являющуюся нуклеиновой кислотой, которая обладает аффинностью в отношении гидрофобного полимера (один пример связки 28). Специфичное связывание данных областей может быть получено в результате стандартного спаривания оснований по Уотсону-Крику. Специфичная область 24, в данном примере, может также включать инозины (I), фланкирующие А', В', С нуклеотидную последовательность. Инозины представляют собой универсальные основания, и, таким образом, могут спариваться со всеми четырьмя нативными нуклеотидами ДНК. В связи с этим, дополнительные связывающие взаимодействия могут быть результатом взаимодействий универсальных оснований (например, инозина I) с нативными нуклеотидами на связке 28. Таким образом, когда меченый нуклеотид 10 связывается с полимеразой 26 во время включения, происходит синергическое связывание между специфичной областью 24 меченого нуклеотида 10 и связкой 28, что значительно увеличивает стабильность взаимодействия меченого нуклеотида 10 и связки 28.

Когда связывающая группа14 меченого нуклеотида 10 не включает специфичную область 24, следует понимать, что меченый нуклеотид 10 будет закреплен на месте в результате взаимодействия с полимеразой 26. Длина связывающей группы 14 может способствовать удерживанию редокс-активной зарядной метки 18 в пределах чувствительной зоны 31 вывода затвора G/токопроводящего канала 32.

Взаимодействие меченого нуклеотида 10 и полимеразы 26 или меченого нуклеотида 10 и полимеразы 26 и связки 28 вызывает попадание редокс-активной зарядной метки 18 в чувствительную зону 31 токопроводящего канала 32. Взаимодействие(я) также помогает(ют) в удержании редокс-активной зарядной метки 18 в чувствительной зоне 31 на протяжении периода времени, достаточного для эффективного и полного переноса заряда. Период времени может составлять вплоть до десятков миллисекунд. Данное относительно длительное взаимодействие отличается от других меченых нуклеотидов 10, находящихся в растворе, которые могут диффундировать и на протяжении непродолжительного времени соприкасаться с токопроводящим каналом 32. Непродолжительное взаимодействие не является достаточно длительным для того, чтобы происходил достаточный перенос заряда, и таким образом в данных примерах редокс-активная зарядная метка 18 не является заряженной, и ответа не выявляют посредством сенсора заряда 32.

В примере, показанном на Фиг. 5А, редокс-активная зарядная метка 18 на основе фталоцианина меди меченого нуклеотида поступает в поле (например, чувствительную зону 31), которое находится в пределах от примерно 1 нм до примерно 2 нм от токопроводящего канала 32. Поскольку меченый нуклеотид 10 закреплен на месте, редокс-активная зарядная метка 18 способна стать заряженной посредством вывода затвора G/токопроводящего канала 32.

Для инициации окислительно-восстановительной реакции между выводом затвора G/токопроводящим каналом 32 (например, кремниевой нанопроволокой, углеродной нанотрубкой и т.д.) и редокс-активной зарядной меткой 18, напряжение, прикладываемое к выводу затвора G/токопроводящему каналу 32, можно доводить до напряжения оксидирования или напряжения восстановления редокс-активной зарядной метки 18. При окислении, редокс-активная зарядная метка 18 теряет электроны, и, таким образом, вывод затвора G/токопроводящий канал 32 создает суммарные положительные заряды на редокс-активной зарядной метке 18. При восстановлении, редокс-активная зарядная метка 18 получает электроны, и, таким образом, вывод затвора G/токопроводящий канал 32 привносит суммарные отрицательные заряды в редокс-активную зарядную метку 18. В результате окислительно-восстановительной реакции состояние заряда редокс-активной зарядной метки 18 меняется. Данное измененное сильно заряженное состояние (например, по сравнению с состоянием редокс-активной зарядной метки 18 перед зарядкой, которое является неокисленным или невосстановленным состоянием) вносит помехи в поле вокруг токопроводящего канала 32 и формирует выявляемый сигнал.

Напряжение, прикладываемое к токопроводящему каналу 32 во время окислительно-восстановительной реакции и во время выявления, может зависеть от используемой редокс-активной зарядной метки 18. Например, зарядное напряжение может отличаться от напряжения считывания, и, таким образом, токопроводящий канал 32 может циклично меняться от зарядного(ых) напряжения(ий) до напряжения(ий) считывания. В одном примере инициирование окислительно-восстановительной реакции включает прикладывание зарядного напряжения к токопроводящему каналу 32, и выявление ответа токопроводящего канала 32 включает прикладывание напряжения считывания к токопроводящему каналу 32.

Ответ токопроводящего канала 32 после окислительно-восстановительной реакции является показателем измененного состояния заряда редокс-активной зарядной метки 18. Ответ токопроводящего канала 32 после окислительно-восстановительной реакции может также указывать на основание 20 меченого нуклеотида 10, поскольку редокс-активная зарядная метка 18 является нуклеотид-специфичной (то есть специфичная метка 18 выбрана для конкретного основания 20). В связи с этим, способ 100 может также включать ассоциирование ответа токопроводящего канала 32 с нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной меткой 18 ассоциированного одного из меченых нуклеотидов 10 (то есть меченого нуклеотида 10, ассоциировал с полимеразой 26), и, на основе нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки 18, идентификацию нуклеотида (например, основания 20) ассоциированного меченого нуклеотида 10 (то есть, меченого нуклеотида 10, который ассоциировал с полимеразой 26).

Основание 20 ассоциированного меченого нуклеотида 10 будет включено в растущую нить 38, которая подвергается гибридизации с нуклеиновой кислотой - матрицей 36. В свою очередь, при этом будет естественно рваться связь между фосфатной группой 16 меченого нуклеотида 10 и только что включенного нуклеотидного основания 20. Например, после включения нуклеотидного основания 20 в растущую нить 38 связь между альфа-фосфатом и связывающей группой 16 или между альфа-фосфатом и бета-фосфатом естественно расщепляется. В результате, оставшееся количество меченого нуклеотида 10 (например, компоненты 14 или 14' и 18) может диссоциировать от нуклеотидного основания 20 и диффундировать в сторону от токопроводящего канала 32, возвращая, таким образом, поле вокруг токопроводящего канала 32 в состояние, в котором оно было до ассоциации меченого нуклеотида 10 с полимеразой 26. Появление и исчезновение сигнала, когда в поле вокруг токопроводящего канала 32 вносятся помехи, и оно возвращается в невозбужденное состояние, соответственно, может коррелировать с включением нуклеотидного основания 20 в растущую нить 38 нуклеиновой кислоты - матрицы 36. В связи с этим, примеры способа 100 также включают отщепление (например, на уровне фосфатной группы 16) нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки 18 и связывающей группы 14, 14' от ассоциированного одного из меченых нуклеотидов 10, вследствие чего нуклеотидное основание 20 ассоциированного меченого нуклеотида 10 включается в растущую нить 38, комплементарную нуклеиновой кислоте - матрице 36. Отщепление может включать ожидание того, чтобы происходило естественное отщепление. Поскольку сигнал возвращается к исходному состоянию между последовательными включениями оснований меченого нуклеотида 20, возможно выявление гомополимерных сегментов в растущей нити 38 вдоль нити матрицы 36.

Некоторые примеры, раскрытые в данном документе, используют синергическое связывание меченого нуклеотида 10 с полимеразой 26, отдельно или в комбинации со связкой 28, для приведения и удерживания редокс-активной зарядной метки 18 вблизи чувствительной зоны 31 токопроводящего канала 32. Стабильность комплекса, образованного связкой 28 и специфичной областью 24, может быть относительно низкой, такой что комплекс (образованный специфичной областью 24 и связкой 28) не образуется в случае меченых нуклеотидов 10, которые также не связаны с полимеразой 26 (то есть меченые нуклеотиды 10, которые свободны в растворе, по существу не связываются со связкой 28). Иными словами, скорость диссоциации комплекса может быть достаточной высокой, чтобы время жизни было коротким. Однако, когда образуется стабильная ассоциация между меченым нуклеотидом 10 и полимеразой 26, локальная концентрация связывающей группы 14, 14' повышается вокруг связки 28, таким образом, приводя к высокой скорости ассоциации специфичной области 24 со связкой 28. Таким образом, общая продолжительность ассоциации значительно увеличена в ассоциированном с полимеразой состоянии меченого нуклеотида 10, по сравнению с неассоциированным состоянием свободноплавающих меченых нуклеотидов 10. Синергическое действие аффинностей меченого нуклеотида 10 в отношении полимеразы 30, отдельно или в комбинации со связкой 28, делает возможной существенную общую аффинность связывания. После естественного отщепления посредством полимеразы 26 после включения нуклеотидного основания 20, синергическое действие теряется, и зарядная метка 18 также будет диссоциировать от токопроводящего канала 32.

В примере способа 100 ассоциирование одного из меченых нуклеотидов 10 с полимеразой 28, инициирование окислительно-восстановительной реакции, выявление, ассоциирование ответа и идентификация включенного нуклеотидного основания 20 вместе представляют собой цикл секвенирования. Способ 100 может дополнительно включать следующее: проведение другого цикла секвенирования с другим меченым нуклеотидом 10, который ассоциирует с полимеразой 26. Проведение следующего цикла секвенирования может включать обеспечение ассоциации следующего из меченых нуклеотидов 10 с полимеразой 26; при ассоциации следующего из меченых нуклеотидов 10 инициирование другой окислительно-восстановительной реакции между другой нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной меткой 18 и сенсором заряда 32 с изменением состояния заряда другой нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки 18; под действием другой окислительно-восстановительной реакции выявление другого ответа сенсора заряда 32; ассоциирование другого ответа сенсора заряда 32 с другой нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной меткой; и на основе другой нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки 18, идентификацию нуклеотида (основания 20) следующего одного из меченых нуклеотидов 10 (то есть, который проассоциировал с полимеразой 26). Другая нуклеотид-специфичная редокс-активная зарядная метка может быть отщеплена, и нуклеотид (основание 20) следующего одного из меченых нуклеотидов 10 включается в растущую нить 38, комплементарную нуклеиновой кислоте - матрице 36. Цикл секвенирования можно повторять.

В примерах, раскрытых в данном документе, также можно использовать форму волны. За формой волны можно следить для определения того, когда она достигнет одного или более пороговых значений напряжения в отношении окислительно-восстановительного потенциала редокс-активных зарядных меток 18, которые имеют разные окислительно-восстановительные потенциалы. В данных примерах изменение в полученном токе через вывод затвора G/токопроводящий канал 32 может быть использовано в качестве информации для идентификации основания 20 меченого нуклеотида 10, включая редокс-активную зарядную метку 18, которая ассоциирована с конкретным пороговым напряжением.

В примерах, раскрытых в данном документе, число электронов, переносимых к или от редокс-активной зарядной метки 18, можно также отслеживать. Переносимое число электронов можно использовать для идентификации основания нуклеотида 20, ассоциированного с полимеразой 26, и что полимераза 26 включается в растущую нить 38.

Меченые нуклеотиды 10 и систему 10, раскрытую в данном документе, можно использовать для любого из множества применений. Как описано в ссылке на Фиг. 4, 5А и 5В, конкретным полезным применением является секвенирование нуклеиновой кислоты, такое как секвенирование одиночных молекул методом синтеза (SBS - от англ. sequencing-by-synthesis). В SBS одиночных молекул удлинение праймера нуклеиновой кислоты вдоль нуклеиновой кислоты - матрицы 36 (например, целевая нуклеиновая кислота или ее ампликон) отслеживают для определения последовательности нуклеотидов в матрице 36. Лежащий в основе химический процесс может представлять собой полимеризацию (например, катализируемую ферментом полимеразой 26, как описано в данном документе). В конкретном примере SBS одиночных молекул на основе полимеразы нуклеотиды (например, основания 20) добавляют к праймеру (удлиняя, таким образом, праймер и образуя растущую нить 38) в матрице зависимым образом таким образом, чтобы можно было использовать выявление порядка и типа нуклеотидов, добавляемых к праймеру, для определения последовательности матрицы. Множество разных матриц 36 в разных токопроводящих каналах 32 целого ряда можно подвергать анализу на основе методики SBS одиночных молекул в условиях, где события, происходящие в случае разных матриц 36, можно различить посредством индивидуальных детекторов, которые функционально связаны с каждым из токопроводящих каналов 32. Каждый токопроводящий канал 32 (и его исток и электроды стока S, D) может быть размещен в углублении или лунке проточной ячейки, что помогает физически отделять один канал 32 от соседнего канала 32 в ряду.

Другие подходящие применения для меченых нуклеотидов 10, набора и системы 30, раскрытых в данном документе, включают секвенирование методом лигирования и секвенирование методом гибридизации. Другим полезным применением для меченых нуклеотидов 10 и системы 30, раскрытых в данном документе, является анализ экспрессии генов. Экспрессию генов можно выявлять или количественно определять, используя методики секвенирования РНК, такие как методики, называемые цифровым секвенированием РНК. Методики секвенирования РНК можно осуществлять, используя методы секвенирования, известные в данной области, такие как методы, изложенные выше, за исключением того, что флуоресцентное выявление оптически меченых нуклеотидов можно заменить способами выявления на основе заряда, изложенными в данном документе.

Экспрессию генов можно также выявлять или количественно определять с использованием методик гибридизации, проводимых посредством прямой гибридизации с чипом, или с использованием мультиплексного анализа, продукты которого выявляют на чипе. Данные способы можно легко адаптировать посредством замены оптических меток и флуоресцентного выявления методиками выявления на основе заряда и редокс-активными зарядными метками 18, изложенными в данном документе.

Следует понимать, что все комбинации приведенных выше понятий и дополнительных понятий, обсуждаемых более подробно ниже (в том случае, если такие понятия не являются взаимно противоречащими), рассматриваются как часть предмета изобретения, раскрытого в данном документе. В частности, все комбинации заявленного предмета изобретения, появляющиеся в конце данного раскрытия, рассматриваются как часть предмета изобретения, раскрытого в данном документе. Также следует понимать, что терминология, в явном виде используемая в данном документе, которая также может появляться в любом раскрытии, включенном посредством ссылки, должна предоставлять значение, наиболее соответствующее конкретным понятиям, раскрытым в данном документе.

Ссылка на протяжении всего описания изобретения на «один пример», «другой пример», «пример» и т.п., означает, что конкретный элемент (например, признак, структура и/или характеристика), описанный в связи с данным примером, включен в по меньшей мере один пример, описанный в данном документе, и может быть представлен или может не быть представлен в других примерах. Кроме того, следует понимать, что описанные элементы для любого примера можно объединять любым подходящим образом в разных примерах, если контекстом явным образом не продиктовано иное.

Термины «по существу» и «примерно», используемые на протяжении данного раскрытия, включая формулу изобретения, используют для описания и объяснения небольших отклонений, как например, вследствие разброса при обработке. Например, они могут относиться к меньше чем или равным плюс/минус 5%, как например, меньше чем или равным плюс/минус 2%, как например, меньше чем или равным плюс/минус 1%, как например, меньше чем или равным плюс/минус 0,5%, как например, меньше чем или равным плюс/минус 0,2%, как например, меньше чем или равным плюс/минус 0,1%, как например, меньше чем или равным плюс/минус 0,05%.

Кроме того, следует понимать, что диапазоны, предложенные в данном документе, включают установленный диапазон или любое значение или поддиапазон в пределах установленного диапазона, как если бы такое значение или поддиапазон были в явном виде перечислены. Например, следует понимать, что диапазон, представленный от примерно 1 заряда до примерно 100 зарядов, включает не только в явном виде перечисленные пределы от примерно 1 заряда до примерно 100 зарядов, но также включает отдельные значения, такие как, например, 5 зарядов, 50 зарядов, 75 зарядов и т.д., и поддиапазоны, как например, от примерно 15 зарядов до примерно 85 зарядов, и т.д.

В то время как несколько примеров было подробно описано, следует понимать, что раскрытые примеры можно модифицировать. Таким образом, приведенное выше описание нужно считать неограничивающим.

Изобретение относится к меченому нуклеотиду для секвенирования нуклеиновых кислот, к способу секвенирования нуклеиновых кислот с его использованием и к набору для секвенирования нуклеиновых кислот. Предлагаемый меченый нуклеотид содержит нуклеотид, связывающую группу, присоединенную к фосфатной группе указанного нуклеотида, и редокс-активную зарядную метку, присоединенную к связывающей группе, причем указанная редокс-активная зарядная метка подлежит окислению или восстановлению посредством токопроводящего канала при удерживании вблизи чувствительной зоны токопроводящего канала. При этом связывающая группа содержит алкильную цепь, содержащую по меньшей мере 6 атомов углерода, амидную группу, поли(этиленгликолевую)цепь, содержащую по меньшей мере 3 этиленгликолевых звена, и триазол, а редокс-активная зарядная метка выбрана из группы, состоящей из ферроцена, цинк-тетрабензопорфирина, фталоцианина кобальта, трис-(2,2'-бипиримидин)рутения, 4-ферроценилбензилового спирта, 5-(4-гидроксиметилфенил)-10,15,20-тримезитилпорфинато-цинка (II) и редокс-активного каликсарена. 3 н. и 18 з.п. ф-лы, 6 ил.

1. Меченый нуклеотид для секвенирования нуклеиновых кислот, содержащий:

нуклеотид;

связывающую группу, присоединенную к фосфатной группе указанного нуклеотида; и

редокс-активную зарядную метку, присоединенную к связывающей группе, причем указанная редокс-активная зарядная метка подлежит окислению или восстановлению посредством токопроводящего канала при удерживании вблизи чувствительной зоны токопроводящего канала;

где указанная связывающая группа содержит алкильную цепь, содержащую по меньшей мере 6 атомов углерода, амидную группу, поли(этиленгликолевую)цепь, содержащую по меньшей мере 3 этиленгликолевых звена, и триазол;

где редокс-активная зарядная метка выбрана из группы, состоящей из ферроцена, цинк-тетрабензопорфирина, фталоцианина кобальта, трис-(2,2'-бипиримидин)рутения, 4-ферроценилбензилового спирта, 5-(4-гидроксиметилфенил)-10,15,20-тримезитилпорфинато-цинка (II) и редокс-активного каликсарена.

2. Меченый нуклеотид по п. 1, в котором редокс-активная зарядная метка включает координированный атом металла, который подлежит вступлению в окислительно-восстановительную реакцию.

3. Меченый нуклеотид по п. 1 или 2, в котором связывающая группа содержит специфичную область, присоединенную к редокс-активной зарядной метке.

4. Меченый нуклеотид по п. 3, в котором специфичная область подлежит взаимодействию с акцепторной областью на связке, связанной с токопроводящим каналом, при этом специфичная область включает аффинную метку.

5. Меченый нуклеотид по п. 4, в котором специфичная область подлежит гибридизации с акцепторной областью на связке, связанной с токопроводящим каналом, и аффинная метка включает нуклеотидную последовательность, включающую от одного нуклеотида до десяти нуклеотидов, или последовательность пептидо-нуклеиновой кислоты, включающую от одной пептидо-нуклеиновой кислоты до десяти пептидо-нуклеиновых кислот.

6. Меченый нуклеотид по любому из пп. 1-5, в котором:

редокс-активная зарядная метка включает 10 зарядов или менее в неокисленном или невосстановленном состоянии; и

редокс-активная зарядная метка включает от 1 до 100 зарядов в окисленном или восстановленном состоянии.

7. Способ секвенирования нуклеиновых кислот, включающий:

введение нуклеиновой кислоты - матрицы в токопроводящий канал, имеющий связанную с ним полимеразу;

введение меченых нуклеотидов по п.1 в токопроводящий канал, причем по меньшей мере один из меченых нуклеотидов включает нуклеотид, связывающую группу, присоединенную к фосфатной группе указанного нуклеотида, и нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку, присоединенную к нему, посредством чего один из меченых нуклеотидов ассоциирует с полимеразой, и где указанная связывающая группа содержит алкильную цепь, содержащую по меньшей мере 6 атомов углерода, амидную группу, поли(этиленгликолевую)цепь, содержащую по меньшей мере 3 этиленгликолевых звена, и триазол; и где редокс-активная зарядная метка выбрана из группы, состоящей из ферроцена, цинк-тетрабензопорфирина, фталоцианина кобальта, трис-(2,2'-бипиримидин)рутения, 4-ферроценилбензилового спирта, 5-(4-гидроксиметилфенил)-10,15,20-тримезитилпорфинато-цинка (II) и редокс-активного каликсарена,

при ассоциировании одного из меченых нуклеотидов инициирование окислительно-восстановительной реакции между нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной меткой и токопроводящим каналом с изменением состояния заряда нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки; и

под действием окислительно-восстановительной реакции выявление ответа токопроводящего канала.

8. Способ по п. 7, в котором:

инициирование окислительно-восстановительной реакции включает прикладывание зарядного напряжения к токопроводящему каналу, и

выявление ответа включает прикладывание напряжения считывания к токопроводящему каналу.

9. Способ по п. 7 или 8, дополнительно включающий:

ассоциирование ответа токопроводящего канала с нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной меткой одного из меченых нуклеотидов, являющегося ассоциированным; и

идентификацию нуклеотида ассоциированного меченого нуклеотида на основе нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки.

10 Способ по п. 9, дополнительно включающий отщепление нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки от одного из меченых нуклеотидов, являющегося ассоциированным, посредством чего нуклеотид ассоциированного меченого нуклеотида включается в растущую нить, комплементарную нуклеиновой кислоте - матрице.

11. Способ по п. 10, в котором

ассоциирование одного из меченых нуклеотидов, инициирование окислительно-восстановительной реакции, выявление, ассоциирование и идентификация совместно представляют собой цикл секвенирования; при этом

способ дополнительно включает

проведение следующего цикла секвенирования посредством следующего:

обеспечение возможности ассоциирования следующего одного из меченых нуклеотидов с полимеразой;

при ассоциировании указанного следующего одного из меченых нуклеотидов инициирование другой окислительно-восстановительной реакции между другой нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной меткой и токопроводящим каналом с изменением состояния заряда указанной другой нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки;

под действием указанной другой окислительно-восстановительной реакции выявление другого ответа токопроводящего канала;

ассоциирование указанного другого ответа токопроводящего канала с указанной другой нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной меткой; и

идентификация нуклеотида следующего одного из меченых нуклеотидов на основе указанной другой нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки.

12. Способ по п. 11, дополнительно включающий:

отщепление указанной другой нуклеотид-специфичной редокс-активной зарядной метки, посредством чего нуклеотид следующего одного из меченых нуклеотидов включается в растущую нить, комплементарную нуклеиновой кислоте-матрице; и

повторение цикла секвенирования.

13. Способ по любому из пп. 7-12, в котором редокс-активная зарядная метка включает координированный атом металла, который подлежит вступлению в окислительно-восстановительную реакцию.

14. Способ по любому из пп. 7-13, в котором:

редокс-активная зарядная метка включает 10 зарядов или менее в неокисленном или невосстановленном состоянии; и

редокс-активная зарядная метка включает от 1 заряда до 100 зарядов в измененном состоянии заряда.

15. Способ по любому из пп. 7-14, в котором

меченые нуклеотиды включают:

первый меченый нуклеотид, включающий дезоксиаденозинполифосфат в качестве нуклеотида и первую нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку;

второй меченый нуклеотид, включающий дезоксигуанозинполифосфат в качестве нуклеотида и вторую нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку;

третий меченый нуклеотид, включающий дезоксицитидинполифосфат в качестве нуклеотида и третью нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку; и

четвертый меченый нуклеотид, включающий дезокситимидинполифосфат в качестве нуклеотида и четвертую нуклеотид-специфичную редокс-активную зарядную метку; при этом

первая, вторая, третья и четвертая нуклеотид-специфичные редокс-активные зарядные метки отличаются друг от друга.

16. Способ по п. 15, в котором две из первой, второй, третьей и четвертой нуклеотид-специфичных редокс-активных зарядных меток являются положительно заряженными в измененном состоянии заряда и где другие две из первой, второй, третьей и четвертой нуклеотид-специфичных редокс-активных зарядных меток являются отрицательно заряженными в измененном состоянии заряда.

17. Способ по любому из пп. 7-16, в котором меченые нуклеотиды находятся в буфере с низким содержанием соли.

18. Способ по любому из пп. 7-17, в котором токопроводящий канал представляет собой канал полевого транзистора.

19. Набор для секвенирования нуклеиновых кислот, содержащий:

проточную ячейку, включающую:

токопроводящий канал, имеющий полимеразу, связанную с ним;

нуклеиновую кислоту - матрицу, подлежащую введению в проточную ячейку;

реагенты, подлежащие введению в проточную ячейку, включающие меченые нуклеотиды, при этом по меньшей мере один из меченых нуклеотидов представляет собой меченый нуклеотид по п. 1; и

детектор для выявления ответа от токопроводящего канала, когда протекает окислительно-восстановительная реакция между редокс-активной зарядной меткой и токопроводящим каналом,

где редокс-активная зарядная метка выбрана из группы, состоящей из ферроцена, цинк-тетрабензопорфирина, фталоцианина кобальта, трис-(2,2'-бипиримидин)рутения, 4-ферроценилбензилового спирта, 5-(4-гидроксиметилфенил)-10,15,20-тримезитилпорфинато-цинка (II) и редокс-активного каликсарена.

20. Набор по п. 19, в котором:

редокс-активная зарядная метка включает 10 зарядов или менее в неокисленном или невосстановленном состоянии; и

редокс-активная зарядная метка включает от 1 заряда до 100 зарядов в окисленном или восстановленном состоянии.

21. Набор по любому из пп. 19, 20, в котором токопроводящий канал представляет собой канал полевого транзистора.