Перекрестная ссылка на родственную заявку
[0001] Данная заявка притязает на приоритет предварительной заявки на патент (США) порядковый номер 62/806,545, поданной 15 февраля 2019 года, содержимое которой полностью включено в данный документ посредством ссылки.
Уровень техники
[0002] Различные протоколы в биологическом или химическом исследовании заключают в себе выполнение большого числа управляемых реакций на локальных опорных поверхностях или в предварительно заданных реакционных камерах. Указанные реакции затем могут наблюдаться или обнаруживаться, и последующий анализ может помогать идентифицировать или раскрывать свойства химикатов, участвующих в реакции. В некоторых примерах, управляемые реакции генерируют люминесценцию, и в силу этого для обнаружения может использоваться оптическая система. В других примерах управляемые реакции изменяют заряд, проводимость или некоторое другое электрическое свойство, и в силу этого для обнаружения может использоваться электронная система.
Введение
[0003] Первый аспект, раскрытый в настоящем документе, представляет собой считывающую систему, содержащую pH-датчик, включающий в себя два электрода и проводящий канал, функционально соединенный с двумя электродами; и комплекс, присоединенный к проводящему каналу pH-датчика, причем комплекс включает в себя полимеразу, связанную, по меньшей мере, с одним изменяющим pH компонентом (компонентом изменения pH), который должен участвовать в формировании изменения pH поблизости от проводящего канала в силу потребления вторичного субстрата в текучей среде, которая раскрывается для pH-датчика, причем, по меньшей мере, один компонент изменения pH выбирается из группы, состоящей из фермента, координационного комплекса металла, кофактора и активатора.
[0004] В примере этого первого аспекта, по меньшей мере, один компонент изменения pH представляет собой фермент, при этом фермент формирует кислоту или основание в реакции с вторичным субстратом. В одном конкретном примере, фермент выбирается из группы, состоящей из гидролаз и оксидаз.
[0005] В примере этого первого аспекта, кинетика, по меньшей мере, одного компонента изменения pH, по меньшей мере, в 10 раз быстрее кинетики полимеразы.
[0006] В примере этого первого аспекта, по меньшей мере, один компонент изменения pH представляет собой фермент, и комплекс дополнительно содержит конъюгат нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента, присоединенный к ферменту.
[0007] В примере этого первого аспекта, по меньшей мере, один компонент изменения pH представляет собой фермент; и комплекс дополнительно включает в себя второй фермент, присоединенный к полимеразе.
[0008] В примере этого первого аспекта, комплекс представляет собой слитый белок или химеру белка.
[0009] В примере этого первого аспекта, проводящий канал pH-датчика выбирается из группы, состоящей из полупроводящей наноструктуры, графеновой наноструктуры, металлической наноструктуры и проводящей полимерной наноструктуры.
[0010] Пример этого первого аспекта дополнительно содержит опору, включающую в себя множество углублений, отделенных посредством промежуточных областей, при этом, по меньшей мере, проводящий канал pH-датчика находится внизу одного из множества углублений; и множество дополнительных pH-датчиков, при этом, по меньшей мере, проводящий канал каждого из множества дополнительных pH-датчиков находится внизу соответствующего одного из множества углублений. В одном конкретном примере, каждое из множества углублений включает в себя боковые стенки, при этом боковые стенки включают в себя буферный pH-материал.
[0011] Следует понимать, что любые признаки считывающей системы, раскрытой в данном документе, могут комбинироваться между собой согласно любому требуемому способу и/или конфигурации.
[0012] Второй аспект, раскрытый в данном документе, представляет собой комплект, содержащий pH-датчик, включающий в себя два электрода и проводящий канал, функционально соединенный с двумя электродами; и текучую среду, включающую в себя жидкость-носитель и комплекс в жидкости-носителе, причем комплекс включает в себя полимеразу, связанную, по меньшей мере, с одним ферментом, который должен создавать изменение pH поблизости от проводящего канала в силу потребления вторичного субстрата во второй текучей среде, которая раскрывается для pH-датчика.
[0013] Пример этого второго аспекта дополнительно содержит вторую текучую среду, включающую в себя вторую жидкость-носитель и меченый нуклеотид, который включает в себя нуклеотид, связывающую молекулу (молекулу-линкер), присоединенную к терминальной фосфатной группе нуклеотида, и метку, присоединенную к связывающей молекуле, причем метка выбирается из группы, состоящей из первой группы, которая улучшает кинетику фермента, и второй группы, которая замедляет кинетику фермента. В одном конкретном примере, вторичный субстрат находится во второй текучей среде и представляет собой отдельную молекулу относительно меченого нуклеотида, и первая группа или вторая группа должна изменять кинетику реакции формирования кислоты или основания, заключающей в себе фермент и вторичный субстрат. В другом конкретном примере, вторичный субстрат находится во второй текучей среде и представляет собой отдельную молекулу относительно меченого нуклеотида, метка представляет собой вторую группу, которая замедляет кинетику фермента, и вторая группа выбирается из группы, состоящей из аллостерического ингибитора, группы стерического исключения и буферизующей группы. В еще одном другом конкретном примере, вторичный субстрат находится во второй текучей среде и представляет собой отдельную молекулу относительно меченого нуклеотида, метка представляет собой первую группу, которая улучшает кинетику фермента, и первая группа представляет собой кофактор фермента.
[0014] Другой пример этого второго аспекта дополнительно содержит вторую текучую среду, включающую в себя вторую жидкость-носитель и меченый нуклеотид, который включает в себя нуклеотид и вторичный субстрат, присоединенный к основанию или сахару нуклеотида, при этом кинетика вторичного субстрата, по меньшей мере, в 10 раз быстрее кинетики полимеразы.
[0015] Следует понимать, что любые признаки комплекта могут комбинироваться между собой любым требуемым способом. Кроме того, следует понимать, что любая комбинация признаков этого комплекта и/или считывающей системы может использоваться совместно и/или комбинироваться с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
[0016] Третий аспект, раскрытый в данном документе, представляет собой комплект, содержащий pH-датчик, включающий в себя два электрода и проводящий канал, функционально соединенный с двумя электродами; и текучую среду, включающую в себя жидкость-носитель и комплекс в жидкости-носителе, причем комплекс включает в себя полимеразу, связанную с координационным комплексом металла, который должен создавать изменение pH поблизости от проводящего канала в силу потребления вторичного субстрата во второй текучей среде, которая раскрывается для pH-датчика.
[0017] Пример этого третьего аспекта дополнительно содержит вторую текучую среду, включающую в себя вторую жидкость-носитель; вторичный субстрат (при этом вторичный субстрат должен формировать кислоту или основание через реакцию с координационным комплексом металла) и меченый нуклеотид, который включает в себя нуклеотид, связывающую молекулу, присоединенную к терминальной фосфатной группе нуклеотида, и метку, присоединенную к связывающей молекуле, причем метка представляет собой лиганд для металла координационного комплекса металла, при этом лиганд изменяет каталитическое свойство координационного комплекса металла.
[0018] Следует понимать, что любые признаки этого комплекта могут комбинироваться между собой любым требуемым способом. Кроме того, следует понимать, что любая комбинация признаков этого комплекта и/или считывающей системы, и/или другого комплекта может использоваться совместно и/или комбинироваться с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
[0019] Четвертый аспект, раскрытый в данном документе, представляет собой меченый нуклеотид, содержащий нуклеотид, связывающую молекулу, присоединенную к терминальной фосфатной группе нуклеотида, и каталитическую метку, присоединенную к связывающей молекуле, при этом каталитическая метка должна создавать изменение pH в силу потребления вторичного субстрата в текучей среде с меченым нуклеотидом.
[0020] В примере четвертого аспекта, каталитическая метка выбирается из группы, состоящей из гидролаз и оксидаз.
[0021] Следует понимать, что любые признаки этого меченого нуклеотида могут комбинироваться между собой любым требуемым способом. Кроме того, следует понимать, что любая комбинация признаков этого меченого нуклеотида и/или считывающей системы, и/или комплектов может использоваться совместно и/или комбинироваться с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
[0022] Пятый аспект, раскрытый в данном документе, представляет собой комплект, содержащий меченый нуклеотид четвертого аспекта и считывающую систему, включающую в себя два электрода, проводящий канал, функционально соединенный с двумя электродами, и комплекс, присоединенный к проводящему каналу, причем комплекс включает полимеразу, конъюгированную с кофактором или активатором каталитической метки меченого нуклеотида.
[0023] Следует понимать, что любые признаки этого комплекта могут комбинироваться между собой любым требуемым способом. Кроме того, следует понимать, что любая комбинация признаков этого комплекта и/или считывающей системы, и/или других комплектов, и/или меченого нуклеотида может использоваться совместно и/или комбинироваться с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
[0024] Шестой аспект, раскрытый в данном документе, представляет собой меченый нуклеотид, содержащий нуклеотид, имеющий блокирующую группу 3'-OH, расщепляемую связывающую молекулу, присоединенную к основанию или сахару нуклеотида, и метку, присоединенную к расщепляемой связывающей молекуле, при этом метка должна участвовать в реакции изменения pH, заключающей в себе вторичный субстрат.
[0025] Следует понимать, что любые признаки этого меченого нуклеотида могут комбинироваться между собой любым требуемым способом. Кроме того, следует понимать, что любая комбинация признаков этого меченого нуклеотида и/или считывающей системы, и/или комплектов, и/или другого меченого нуклеотида может использоваться совместно и/или комбинироваться с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
[0026] Седьмой аспект, раскрытый в данном документе, представляет собой комплект, содержащий меченый нуклеотид шестого аспекта и считывающую систему, включающую в себя два электрода, проводящий канал, функционально соединенный с двумя электродами, и комплекс, присоединенный к проводящему каналу, причем комплекс включает в себя полимеразу, конъюгированную с кофактором или активатором каталитической метки меченого нуклеотида.
[0027] Следует понимать, что любые признаки этого комплекта могут комбинироваться между собой любым требуемым способом. Кроме того, следует понимать, что любая комбинация признаков этого комплекта и/или считывающей системы, и/или комплектов, и/или меченых нуклеотидов может использоваться совместно и/или комбинироваться с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
[0028] Восьмой аспект, раскрытый в данном документе, представляет собой способ, содержащий введение текучей среду в решетку датчиков, включающую в себя множество отдельно адресуемых проводящих каналов, за счет этого присоединяя комплекс, по меньшей мере, к некоторым из множества отдельно адресуемых проводящих каналов, причем комплекс включает в себя полимеразу и компонент изменения pH, связанный с полимеразой, причем компонент изменения pH выбирается из группы, состоящей из фермента, который должен катализировать потребление вторичного субстрата в растворе, который должен быть доступным для решетки датчиков, координационного комплекса металла, который должен катализировать потребление вторичного субстрата в растворе, который должен быть доступным для решетки датчиков, и кофактора или активатора каталитической метки, присоединенной к меченому нуклеотиду, который должен вводиться в решетку датчиков.
[0029] Следует понимать, что любые признаки этого способа могут комбинироваться между собой любым требуемым способом. Кроме того, следует понимать, что любая комбинация признаков этого способа и/или считывающей системы, и/или комплектов, и/или меченых нуклеотидов может использоваться совместно и/или комбинироваться с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
[0030] Девятый аспект, раскрытый в данном документе, представляет собой способ, содержащий введение матричной полинуклеотидной цепи в датчик, имеющий полимеразу, привязанную к проводящему каналу; введение текучей среды, включающей в себя вторичный субстрат и меченые нуклеотиды, в датчик, за счет чего нуклеотид одного из меченых нуклеотидов связывается с полимеразой, и метка одного из меченых нуклеотидов участвует в реакции изменения pH, заключающей в себе вторичный субстрат, который находится поблизости от проводящего канала; и обнаружение ответа проводящего канала.
[0031] В примере этого девятого аспекта, полимераза датчика представляет собой часть комплекса с ферментным катализатором, метка представляет собой группу, которая улучшает или замедляет кинетику ферментного катализатора, и способ дополнительно содержит обнаружение изменения заряда по сравнению с базовым зарядом.
[0032] В примере этого девятого аспекта, полимераза датчика представляет собой часть комплекса с ферментным катализатором, метка представляет собой вторичный субстрат, и способ дополнительно содержит обнаружение изменения заряда по сравнению с базовым зарядом.
[0033] В примере этого девятого аспекта, полимераза датчика представляет собой часть комплекса с координационным комплексом металла, метка представляет собой лиганд для металла координационного комплекса металла, и способ дополнительно содержит обнаружение изменения заряда по сравнению с базовым зарядом.
[0034] В примере этого девятого аспекта, полимераза датчика представляет собой часть комплекса с ферментным катализатором, конъюгат нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента присоединяется к ферментному катализатору, метка представляет собой олигонуклеотидную последовательность, которая является комплементарной части конъюгата нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента, и способ дополнительно содержит обнаружение изменения заряда по сравнению с базовым зарядом.
[0035] Любой один или более примеров девятого аспекта дополнительно могут содержать идентификацию нуклеотида, связанного с полимеразой, из изменения заряда и/или темпа изменения заряда.
[0036] В примере этого девятого аспекта, меченые нуклеотиды имеют отличающиеся скорости включения, и способ дополнительно содержит идентификацию связанного меченого нуклеотида посредством его отличающейся скорости включения.
[0037] Следует понимать, что любые признаки этого способа могут комбинироваться между собой любым требуемым способом. Кроме того, следует понимать, что любая комбинация признаков этого способа и/или других способов, и/или считывающей системы, и/или комплектов, и/или меченых нуклеотидов может использоваться совместно и/или комбинироваться с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
[0038] Десятый аспект, раскрытый в данном документе, представляет собой способ, содержащий выбор компонента изменения pH из группы, состоящей из фермента, который должен катализировать потребление вторичного субстрата в растворе, координационного комплекса металла, который должен катализировать потребление вторичного субстрата в растворе, и кофактора или активатора каталитической метки, присоединенной к меченому нуклеотиду; конъюгирование полимеразы с компонентом изменения pH для того, чтобы формировать комплекс; и присоединение комплекса к проводящему каналу, функционально соединенному с двумя электродами.
[0039] Следует понимать, что любые признаки этого способа могут комбинироваться между собой любым требуемым способом. Кроме того, следует понимать, что любая комбинация признаков этого способа и/или других способов, и/или считывающей системы, и/или комплектов, и/или меченых нуклеотидов может использоваться совместно и/или комбинироваться с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
[0040] Одиннадцатый аспект, раскрытый в данном документе, представляет собой смесь для включения, содержащую жидкость-носитель; комплекс, включающий в себя полимеразу и компонент изменения pH, связанный с полимеразой, причем компонент изменения pH выбирается из группы, состоящей из фермента, который должен катализировать потребление вторичного субстрата, координационного комплекса металла, который должен катализировать потребление вторичного субстрата, и кофактора или активатора, который должен катализировать потребление вторичного субстрата; и меченый нуклеотид, включающий в себя нуклеотид, связывающую молекулу, присоединенную к терминальной фосфатной группе нуклеотида, и метку, присоединенную к связывающей молекуле, при этом метка должна участвовать в реакции изменения pH, заключающей в себе вторичный субстрат.
[0041] В примере этого одиннадцатого аспекта, компонент изменения pH представляет собой фермент, и метка выбирается из группы, состоящей из первой группы, которая улучшает кинетику фермента, и второй группы, которая замедляет кинетику фермента; компонент изменения pH представляет собой координационный комплекс металла, и метка представляет собой лиганд для металла координационного комплекса металла, при этом лиганд изменяет каталитическое свойство координационного комплекса металла; или компонент изменения pH представляет собой кофактор или активатор, и метка представляет собой каталитическую метку, которая активируется посредством кофактора или активатора.
[0042] В примере этого одиннадцатого аспекта, компонент изменения pH представляет собой фермент; комплекс дополнительно включает в себя конъюгат нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента, присоединенный к ферменту; и метка представляет собой олигонуклеотидную последовательность, которая является комплементарной части конъюгата нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента.
[0043] Следует понимать, что любые признаки этой смеси для включения могут комбинироваться между собой любым требуемым способом. Кроме того, следует понимать, что любая комбинация признаков смеси для включения и/или способов, и/или считывающей системы, и/или комплектов, и/или меченых нуклеотидов может использоваться совместно и/или комбинироваться с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
[0044] Двенадцатый аспект, раскрытый в данном документе, представляет собой комплект, содержащий смесь для включения одиннадцатого аспекта и смесь с вторичным субстратом, включающую в себя вторую жидкость-носитель и вторичный субстрат.
[0045] Пример двенадцатого аспекта дополнительно содержит проточную кювету, включающую в себя подложку, включающую в себя множество углублений, отделенных посредством промежуточных областей; проводящий канал внизу каждого из множества углублений; и, по меньшей мере, один праймер, прикрепляемый в каждом из углублений.
[0046] Следует понимать, что любые признаки этого комплекта могут комбинироваться между собой любым требуемым способом. Кроме того, следует понимать, что любая комбинация признаков этого комплекта и/или смеси для включения, и/или способов, и/или считывающей системы, и/или других комплектов, и/или меченых нуклеотидов может использоваться совместно и/или комбинироваться с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
[0047] Тринадцатый аспект, раскрытый в данном документе, представляет собой смесь для включения, содержащую жидкость-носитель, включающую в себя буфер; комплекс, включающий в себя полимеразу и компонент изменения pH, связанный с полимеразой, причем компонент изменения pH выбирается из группы, состоящей из фермента, который должен катализировать потребление вторичного субстрата, координационного комплекса металла, который должен катализировать потребление вторичного субстрата, и кофактора или активатора, который должен катализировать потребление вторичного субстрата; и меченый нуклеотид, включающий в себя нуклеотид, имеющий блокирующую группу 3'-OH, расщепляемую связывающую молекулу, присоединенную к основанию или сахару нуклеотида, и метку, присоединенную к связывающей молекуле, при этом метка должна участвовать в реакции изменения pH, заключающей в себе вторичный субстрат.
[0048] В примере тринадцатого аспекта, компонент изменения pH представляет собой фермент, и метка выбирается из группы, состоящей из первой группы, которая улучшает кинетику фермента, второй группы, которая замедляет кинетику фермента, и вторичного субстрата; или компонент изменения pH представляет собой координационный комплекс металла, и метка представляет собой лиганд для металла координационного комплекса металла, при этом лиганд изменяет каталитическое свойство координационного комплекса металла; или компонент изменения pH представляет собой кофактор или активатор, и метка представляет собой каталитическую метку, которая активируется посредством кофактора или активатора.
[0049] В примере тринадцатого аспекта, компонент изменения pH представляет собой фермент; комплекс дополнительно включает в себя конъюгат нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента, присоединенный к ферменту; и метка представляет собой олигонуклеотидную последовательность, которая является комплементарной части конъюгата нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента.
[0050] Следует понимать, что любые признаки этого комплекта для включения могут комбинироваться между собой любым требуемым способом. Кроме того, следует понимать, что любая комбинация признаков этой смеси для включения и/или способов, и/или считывающей системы, и/или комплектов, и/или меченых нуклеотидов может использоваться совместно и/или комбинироваться с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
[0051] Четырнадцатый аспект, раскрытый в данном документе, представляет собой комплект, содержащий смесь для включения, заданную в тринадцатом аспекте, и смесь с вторичным субстратом, включающую в себя вторую жидкость-носитель и вторичный субстрат.
[0052] Пример четырнадцатого аспекта дополнительно содержит проточную кювету, включающую в себя подложку, включающую в себя множество углублений, отделенных посредством промежуточных областей; проводящий канал внизу каждого из множества углублений; и праймер, прикрепляемый в каждом из углублений.
[0053] Пример четырнадцатого аспекта дополнительно содержит раствор деблокирующего агента.
[0054] Следует понимать, что любые признаки этого комплекта могут комбинироваться между собой любым требуемым способом. Кроме того, следует понимать, что любая комбинация признаков этого комплекта и/или способов, и/или считывающей системы, и/или других комплектов, и/или меченых нуклеотидов, и/или смеси для включения может использоваться совместно и/или комбинироваться с любым из примеров, раскрытых в данном документе.
[0055] Еще дополнительно, следует понимать, что любые признаки любого из аспектов могут использоваться отдельно или в комбинации любым требуемым способом и/или могут комбинироваться с любым из примеров, раскрытых в данном документе, по меньшей мере, чтобы достигать выгод, как описано в данном документе.
Краткое описание чертежей
[0056] Признаки примеров настоящего раскрытия сущности должны становиться очевидными со ссылкой на нижеприведенное подробное описание и чертежи, на которых аналогичные ссылки с номерами соответствуют аналогичным, хотя, возможно, и не идентичным компонентам. Для краткости, ссылки с номерами или признаки, имеющие вышеописанную функцию, могут описываться или могут не описываться в связи с другими чертежами, на которых они появляются.
[0057] Фиг. 1A-1C являются схематичными иллюстрациями различных примеров меченых нуклеотидов, раскрытых в данном документе;
[0058] Фиг. 2 является схематичной иллюстрацией, иллюстрирующей один пример считывающей системы, раскрытой в данном документе, и пример меченого нуклеотида и вторичного субстрата, которые могут использоваться в этом примере считывающей системы;
[0059] Фиг. 3A является схематичной иллюстрацией, иллюстрирующей другой пример считывающей системы, раскрытой в данном документе, и пример меченых нуклеотидов и вторичного субстрата, которые могут использоваться в этом примере считывающей системы;
[0060] Фиг. 3B иллюстрирует пример считывающей системы по фиг. 3,A используемой в другом примере меченого нуклеотида, раскрытого в данном документе;
[0061] Фиг. 4 является схематичной иллюстрацией, иллюстрирующей другой пример считывающей системы, раскрытой в данном документе, и пример меченого нуклеотида и вторичного субстрата, которые могут использоваться в этом примере считывающей системы;
[0062] Фиг. 5 является схематичной иллюстрацией, иллюстрирующей еще один другой пример считывающей системы, раскрытой в данном документе, и пример меченого нуклеотида и вторичного субстрата, которые могут использоваться в этом примере считывающей системы;
[0063] Фиг. 6A является схематичной иллюстрацией, иллюстрирующей еще один другой пример считывающей системы, раскрытой в данном документе;
[0064] Фиг. 6B иллюстрирует пример считывающей системы по фиг. 6A, используемой в другом примере меченого нуклеотида, раскрытого в данном документе;
[0065] Фиг. 7A является видом сверху примера проточной кюветы;
[0066] Фиг. 7B является укрупненным видом в частичном сечении примера проточной кюветы, подходящей для использования при считывании одиночных молекул;
[0067] Фиг. 7C является укрупненным видом в частичном сечении примера проточной кюветы, подходящей для использования при секвенировании ансамблей; и
[0068] Фиг. 7D является укрупненным видом в частичном сечении еще одного другого примера проточной кюветы, подходящей для использования при секвенировании ансамблей.
Подробное описание изобретения
[0069] Некоторые примерные считывающие системы, раскрытые в данном документе, могут использоваться для обнаружения одиночных молекул в процедурах секвенирования нуклеиновых кислот. Каждая из этих считывающих систем включает в себя один проводящий канал с одной полимеразой или одним полимеразосодержащим комплексом, присоединенным к нему. Этот проводящий канал может обнаруживать изменение заряда как результат локализованного изменения pH (концентрации ионов водорода). При использовании, меченые нуклеотиды и вторичный субстрат вводятся в считывающую систему. По мере того, как азотистое основание одного из меченых нуклеотидов включается в образующуюся цепь посредством полимеразы, вторичный субстрат потребляется в реакции формирования кислоты или основания (что увеличивает или уменьшает концентрацию заряженных ионов). Реакция формирования кислоты или основания также заключает в себе компонент изменения pH, который, в некоторых примерах, иммобилизируется на проводящем канале в качестве части комплекса; и, в других примерах, представляет собой метку включенного меченого нуклеотида. Некоторые реакции формирования кислоты или основания заключают в себе несколько компонентов изменения pH, например, один в качестве части комплекса и другой в качестве метки меченого нуклеотида. Эти конфигурации обеспечивают возможность расположения компонента изменения pH на/около поверхности проводящего канала; и в силу этого реакция формирования кислоты или основания локализуется на поверхности проводящего канала. В некоторых случаях, заряженные ионы реагируют с поверхностными группами проводящего канала, вызывая протонирование или депротонирование поверхностных групп, что изменяет заряд поверхностных групп. В этих случаях, заряд поверхностных групп считывается. Поскольку заряды находятся непосредственно на поверхности проводящего канала, они не могут эффективно экранироваться посредством ионов в растворе и в силу этого могут вызывать большие изменения порогового напряжения и тока. В других случаях, заряженные ионы, получающиеся в результате формирования кислоты или основания, считываются.
[0070] Некоторые другие примерные считывающие системы, раскрытые в данном документе, могут использоваться для процедур секвенирования нуклеиновых кислот в ансамблях. Каждая из этих считывающих систем включает в себя проводящий канал с газоном праймеров (например, олигопар) на нем. Этот проводящий канал может обнаруживать изменение заряда как результат локализованного изменения pH. При использовании, библиотечные матрицы вводятся и гибридизируются в праймерах. Формирование кластеров выполняется для того, чтобы формировать несколько матричных полинуклеотидных цепей. Полимеразосодержащие комплексы, меченые нуклеотиды и вторичные субстраты затем вводятся в считывающую систему. Во время или после того, как азотистое основание соответствующих меченых нуклеотидов включается (посредством соответствующих полимераз комплексов) в соответствующие образующиеся цепи, сформированные вдоль соответствующих матричных полинуклеотидных цепей, вторичные субстраты потребляются в реакции формирования кислоты или основания (что увеличивает или уменьшает концентрацию заряженных ионов). Аналогично считыванию одиночных молекул, реакция формирования кислоты или основания также заключает в себе компонент изменения pH, который представляет собой часть полимеразосодержащего комплекса или представляет собой метку включенных меченых нуклеотидов. Эти конфигурации обеспечивают возможность расположения компонента изменения pH на/около поверхности проводящего канала; и в силу этого реакция формирования кислоты или основания локализуется на поверхности проводящего канала. Заряженные ионы или реакция заряженных ионов с поверхностными группами проводящего канала считывается.
[0071] В любом из примеров, раскрытых в данном документе, реакции формирования кислоты или основания могут формировать сотни или тысячи либо еще большее число протонов или молекул основания, за счет этого формируя большое и локализованное изменение pH.
[0072] В любом из примеров, раскрытых в данном документе, компонент изменения pH может представлять собой любые химические частицы, которые могут участвовать в реакции формирования кислоты или основания с вторичным субстратом или модифицировать активность другого компонента изменения pH, который действует на вторичный субстрат. В качестве примеров, компонент изменения pH может катализировать (вызывать или ускорять) реакцию формирования кислоты или основания, заключающую в себе вторичный субстрат, может ингибировать реакцию формирования кислоты или основания, заключающую в себе вторичный субстрат, может улучшать или замедлять кинетику реакции формирования кислоты или основания либо может иным способом участвовать в реакции формирования кислоты или основания, заключающей в себе вторичный субстрат. Некоторые примеры компонента изменения pH иммобилизируются на проводящем канале в качестве части комплекса; и другие примеры компонента изменения pH представляют собой метку включенного меченого нуклеотида. В некоторых случаях, два компонента изменения pH могут взаимодействовать между собой для того, чтобы формировать изменение pH.
[0073] Реакции формирования кислоты или основания (изменения pH), раскрытые в данном документе, заключают в себе вторичный субстрат. При использовании в данном документе, термин "вторичный субстрат" означает химические частицы, которые потребляются в реакции, которая формирует кислоту или основание, причем химические частицы представляют собой отдельную молекулу относительно нуклеотида, основание которого допускает взаимодействие с полимеразой комплекса, либо представляют собой отличающуюся молекулу, присоединенную к сахару или основанию нуклеотида, основание которого допускает взаимодействие с полимеразой комплекса, и не представляют собой побочный продукт события включения азотистого основания. Использование отличающегося вторичного субстрата обеспечивает возможность разъединения кинетики обнаруженного изменения pH от кинетики включения нуклеотида. В некоторых примерах, компонент изменения pH, который взаимодействует с вторичным субстратом, может быть кинетически значительно быстрее полимеразы, которая взаимодействует с нуклеотидом. Это обеспечивает возможность наблюдения большего изменения pH для одного события включения или для группы событий включения.
[0074] Желательно, если реакции формирования кислоты или основания (изменения pH) осуществляются поблизости от проводящего канала. "Поблизости", в общем, означает любое расстояние, на которое может диффундировать сформированная кислота или основание. В решетке с повторяющимися/периодическими считывающими системами, "поблизости" может задаваться с точки зрения шага датчика/считывающей системы. Шаг датчика или шаг считывающей системы означает расстояние между двумя последовательными датчиками/считывающими системами вдоль линии. В примере, зона реакции (в которой формируется кислота или основание) считывающей системы может составлять в пределах 1/2 относительно шага датчика из проводящего канала считывающей системы.
[0075] Несколько примеров считывающей системы 10A-10E для считывания одиночных молекул раскрываются в данном документе и показаны и описываются на фиг. 2, фиг. 3A, фиг. 3B, фиг. 4, фиг. 5, фиг. 6A и фиг. 6B. Пример считывающих систем 40A и 40B для секвенирования ансамблей показывается на фиг. 7C и фиг. 7D. Каждый пример считывающей системы 10A-10E или 40A-40B может использоваться с меченым нуклеотидом. Некоторые меченые нуклеотиды допускают расщепление естественным путем после включения основания, и этот пример схематично показывается на фиг. 1A. Некоторые другие меченые нуклеотиды включают в себя обратимый терминатор, который обеспечивает возможность возникать только включению одиночного основания в каждом цикле секвенирования, и примеры химической структуры некоторых из этих меченых нуклеотидов показаны на фиг. 1B. Любой из этих примеров также может включать в себя вторичный субстрат в качестве отличающейся молекулы, присоединенной к сахару или основанию (фиг. 1C). Ниже описывается каждый из меченых нуклеотидов.
[0076] Меченые нуклеотиды
[0077] Как проиллюстрировано на фиг. 1A, меченый нуклеотид 12 включает в себя нуклеотид 14, связывающую молекулу 16, присоединенную к терминальной фосфатной группе нуклеотида 14, и метку 18, присоединенную к связывающей молекуле 16. Меченый нуклеотид 12 может считаться неестественным или синтетическим нуклеотидом, поскольку он структурно или химически отличается от естественного нуклеотида.
[0078] Нуклеотид 14 меченого нуклеотида 12 может представлять собой естественный нуклеотид. Естественные нуклеотиды включают в себя азотсодержащее гетероциклическое основание (либо азотистое основание), сахар и одну или более фосфатных групп. Примеры естественных нуклеотидов включают в себя, например, рибонуклеотиды или дезоксирибонуклеотиды. В рибонуклеотиде, сахар представляет собой рибозу, а в дезоксирибонуклеотиде, сахар представляет собой дезоксирибозу (т.е. сахар с отсутствующей гидроксильной группой, которая присутствует в 2'-позиции в рибозе). В примере, нуклеотид 14 находится в форме полифосфата, поскольку он включает в себя несколько фосфатных групп (например, трифосфат (т.е. гамма-фосфат), тетрафосфат, пентафосфат, гексафосфат и т.д.). Гетероциклическое основание может представлять собой пуриновое основание или пиримидиновое основание, или любой другой аналог нуклеооснования. Пуриновые основания включают в себя аденин (A) и гуанин (G) и их модифицированные производные либо аналоги. Пиримидиновые основания включают в себя цитозин (C), тимин (T) и урацил (U) и их модифицированные производные либо аналоги. Атом C-1 дезоксирибозы связывается с N-1 пиримидина или N-9 пурина.
[0079] Меченый нуклеотид 12 также включает в себя связывающую молекулу 16. Связывающая молекула 16 может представлять собой любую длинноцепочечную молекулу, которая может химически связываться, на одном конце, с фосфатной группой(ами) нуклеотида 14, и которая может химически связываться, на другом конце, с меткой 18. В некоторых случаях, связывающая молекула 16 также может выбираться таким образом, что она не взаимодействует с полимеразой 28 (см., например, фиг. 2, фиг. 3A, фиг. 4, фиг. 5, фиг. 6A и фиг. 6B). В других случаях, связывающая молекула 16 также может выбираться таким образом, что она слабо взаимодействует с полимеразой 28, поскольку это слабое взаимодействие может помогать направлять метку 18 в позицию поблизости от проводящего канала. Связывающая молекула 16 может выбираться таким образом, что она является достаточно длинной для того чтобы разрешать метке 18 связываться с компонентом изменения pH и/или вторичным субстратом 34 (см., например, фиг. 2), в то время как, например, нуклеотид 14 удерживается посредством полимеразы 28 во время события включения.
[0080] В качестве примеров, связывающая молекула 16 может включать в себя алкильную цепь, поли(этиленгликольную) цепь, амидогруппу, фосфатную группу, гетероцикл, такой как триазол, нуклеотиды либо комбинации вышеозначенного. Примеры алкильной цепи могут включать в себя, по меньшей мере, 6 атомов углерода, и примеры поли(этиленгликольной) цепи могут включать в себя, по меньшей мере, 3 этиленгликольных звена.
[0081] Нижеприведенный пример иллюстрирует пример меченого нуклеотида 12, в котором связывающая молекула 16 содержит алкильную цепь, амидную группу, поли(этиленгликольную) цепь и триазол:
Нижеприведенный пример иллюстрирует другой пример меченого нуклеотида 12, в котором связывающая молекула 16 содержит алкильные цепи, амидную группу, поли(этиленгликольные) цепи, триазол и фосфатную группу:
Нижеприведенный пример иллюстрирует еще один другой пример меченого нуклеотида 12, в котором связывающая молекула 16 содержит алкильные цепи, амидные группы, поли(этиленгликольные) цепи, триазол и фосфатную группу:
Нижеприведенный пример иллюстрирует еще дополнительный пример меченого нуклеотида 12, в котором связывающая молекула 16 содержит алкильные цепи, амидную группу, поли(этиленгликольные) цепи, триазол, фосфатную группу и полинуклеотидную цепь:
[0082] [0083] Хотя описываются несколько примерных связывающих молекул 16, следует понимать, что могут использоваться другие связывающие молекулы 16. Выбор связывающей молекулы 16 должен зависеть, частично, от метки 18, которая должна присоединяться к нуклеотиду 14. Кроме того, длина связывающей молекулы 16 может выбираться таким образом, что когда соответствующий нуклеотид 14 удерживается посредством полимеразы отдельной считывающей системы, соответствующая метка 18 может участвовать в реакции формирования кислоты или основания на поверхности проводящего канала 26 (см., например, фиг. 2).
[0084] В каждом примерном меченом нуклеотиде 12, метка 18 присоединяется (через связывающую молекулу 16) к терминальному фосфатному концу нуклеотида 14. Присоединение на терминальном фосфатном конце может быть желательным в некоторых технологиях секвенирования, поскольку после включения нуклеотидного основания, связь между альфа-фосфатом и связывающей молекулой 16 или между альфа-фосфатом и бета-фосфатом расщепляется естественным путем. Это естественное расщепление обеспечивает возможность метке 18 (и связывающей молекуле 16) диссоциироваться от включенного нуклеотидного основания и диффундировать в направлении от считывающей системы 10A-10E таким образом, что другой меченый нуклеотид 12 может связываться с полимеразой 28 считывающей системы 10A-10E, и таким образом, что ранее включенное основание не создает длительные сигналы, которые создают помехи обнаружению следующего включенного основания.
[0085] Метка 18, которая включается в меченый нуклеотид 12, может зависеть, частично, от считывающей системы 10A-10E или 40A-40B, которая должна использоваться с меченым нуклеотидом 12. В дальнейшем подробнее описываются различные метки 18 в отношении каждой из считывающих систем 10A-10E и 40A-40B.
[0086] Как проиллюстрировано на фиг. 1B, каждый меченый нуклеотид 12A, 12B, 12C включает в себя нуклеотид 14', имеющий блокирующую группу 38A, 38B, 38C 3'-OH, расщепляемую связывающую молекулу 16', присоединенную к основанию или сахару нуклеотида 14', и метку 18, присоединенную к связывающей молекуле 16'.
[0087] Нуклеотид 14' может представлять собой любой из примеров, изложенных для нуклеотида 14. В примерах, раскрытых в данном документе, нуклеотид 14' имеет присоединенную блокирующую группу 3'-OH. Блокирующая группа 38A, 38B, 38C 3'-OH может сцепляться с атомом кислорода молекулы сахара в нуклеотиде 14'. Блокирующая группа 38A, 38B, 38C 3'-OH может представлять собой обратимый терминатор, который обеспечивает возможность возникать только включению одиночного основания в каждом цикле секвенирования. Обратимый терминатор мешает включению дополнительных оснований в образующуюся цепь, которая является комплементарной матричной полинуклеотидной цепи. Это обеспечивает обнаружение и идентификацию одного включенного основания. Блокирующая группа 38A, 38B, 38C 3'-OH затем может удаляться, обеспечивая осуществление дополнительных циклов секвенирования в каждой матричной полинуклеотидной цепи. Примеры различных блокирующих групп 38A, 38B, 38C 3'-OH показаны на фиг. 1B, включающих в себя обратимый терминатор 3'-ONH2 (показан в 38A), обратимый терминатор 3'-O-аллила (-CH=CHCH2, показан в 38B) и обратимый терминатор 3'-O-азидометила (-CH2N3, показан в 38C). Другие подходящие обратимые терминаторы включают в себя простые o-нитробензилэфиры, алкиловый o-нитробензилкарбонат, компоненты сложных эфиров, другие аллилкомпоненты, ацетали (например, трет-бутокси-этокси), MOM-(-CH2OCH3)-компоненты, 2,4-динитробензолсульфенил, тетрагидрофураниловый простой эфир, 3'-фосфат, простые эфиры, -F, -H2, -OCH3, -N3, -HCOCH3 и 2-нитробензолкарбонат.
[0088] В примерах, показанных на фиг. 1B, связывающая молекула 16' присоединяется к основанию (например, к пуриновому основанию или пиримидиновому основанию) нуклеотида 14'. В некоторых примерах, связывающая молекула 16' включает в себя участок расщепления, идентифицированный посредством стрелки 42 на фиг. 1B. Некоторые примеры подходящих связывающих молекул 16' показаны на фиг. 1B, хотя следует понимать, что может использоваться любой подходящий расщепляемый связывающий агент, который может присоединять метку 18 к основанию или сахару нуклеотида 14'.
[0089] Метка 18, которая включается в меченый нуклеотид 12A, 12B, 12C, может зависеть, частично, от считывающей системы 10A-10E или 40A-40B, которая должна использоваться с меченым нуклеотидом 12A, 12B, 12C. В дальнейшем подробнее описываются различные метки 18 в отношении каждой из считывающих систем 10A-10E и 40A-40B.
[0090] Еще один другой пример меченого нуклеотида 12' показывается на фиг. 1C. Как проиллюстрировано на фиг. 1C, меченый нуклеотид 12' включает в себя нуклеотид 14 и вторичный субстрат 34, присоединенный к основанию или сахару нуклеотида 14. Любой из нуклеотидов 14 или 14' может использоваться в этом случае. Вторичный субстрат 34 может присоединяться непосредственно к основанию или сахару нуклеотида 14 или 14'. В одном примере, вторичный субстрат 34 может присоединяться непосредственно к атому углерода или атому азота основания нуклеотида 14 или 14'. В другом примере, вторичный субстрат 34 может присоединяться непосредственно к атому кислорода или атому углерода молекулы сахара нуклеотида 14 или 14'. Если вторичный субстрат 34 присоединяется к 3'-OH нуклеотида 14, как показано на фиг. 1C, она должна блокировать дополнительное включение следующего основания (аналогично меченым нуклеотидам 12A-12C). Это позиционирование на молекуле сахара может быть желательным, поскольку оно приводит к потреблению вторичного субстрата 34 перед следующим событием включения и не требует отдельного деблокирующего агента для того, чтобы удалять блокирующую группу. Если используется нуклеотид 14' (который включает в себя блокирующую группу 38A, 38B, 38C 3'-OH), вторичный субстрат 34 может присоединяться непосредственно к 2'-позиции молекулы сахара нуклеотида 14'. Альтернативно, вторичный субстрат 34 может присоединяться косвенно к основанию или сахару нуклеотида 14 или 14', например, через связывающую молекулу. Примеры подходящих связывающих молекул для присоединения вторичного субстрата 34 к основанию или сахару нуклеотида 14 или 14' включают в себя полиэтиленгликольную цепь, алкильную группу, биотин/стрептавидин, пропарглиамино- либо любую группу, присоединенную к предлагаемому на рынке функционализированному нуклеооснованию.
[0091] В этом примерном меченом нуклеотиде 12', вторичный субстрат 34 выбирается таким образом, что кинетика потребления вторичного субстрата 34, по меньшей мере, в десять (10) раз быстрее кинетики полимеразы 28, которая используется при включении нуклеотидного основания. Таким образом, потребление вторичного субстрата 34 возникает быстрее события включения, и в силу этого изменение pH может обнаруживаться до либо по мере того, как событие включения осуществляется. В примере, вторичный субстрат 34 может представлять собой субстрат для гидролазы, такой как сложная полиэфирная цепь (которая может потребляться посредством эстеразы), целлюлоза (которая может потребляться посредством целлюлазы), пептид (который может потребляться посредством протеазы), крахмал (который может потребляться посредством амилазы) и т.д. В другом примере, вторичный субстрат 34 представляет собой дополнительную полифосфатную цепь. В этом примере, дополнительная полифосфатная цепь не блокируется, и ее реактивность должна зависеть от более высокой локальной концентрации, когда на нуклеотид 12' реагирует полимераза 28. Также в этом примере, терминальный фосфат нуклеотида 14 или 14' может включать в себя блокирующую группу таким образом, что полифосфатная цепь нуклеотида 14 или 14' не участвует в реакции формирования кислоты или основания.
[0092] Обнаружение одиночных молекул
[0093] Ссылаясь теперь на фиг. 2, фиг. 3A, фиг. 3B, фиг. 4, фиг. 5, фиг. 6A и фиг. 6B, каждая из считывающих систем 10A-10E может использоваться при считывании одиночных молекул. Каждая из систем включает в себя pH-датчик 20, который включает в себя два электрода 22, 24 и проводящий канал 26, соединяющий два электрода 22, 24.
[0094] Каждый pH-датчик 20 может представлять собой полевой транзистор (FET). В FET, электроды 22, 24 представляют собой контактные выводы истока и стока, и проводящий канал 26 представляет собой контактный вывод затвора. Полевой транзистор может представлять собой канал p-типа или канал n-типа, который затрагивает полярность ответа, но не принцип считывания. Ионно-чувствительные FET (ISFET), FET с плоскостным затвором (JFET), FET со структурой "металл-полупроводник" (MESFET), FET со структурой "металл-оксид-полупроводник" (MOSFET) или беспереходные полевые устройства представляют собой подходящие детекторы в примерах, раскрытых в данном документе.
[0095] Электроды 22, 24 могут содержать любой подходящий проводящий материал. Примеры подходящих материалов истока и стока включают в себя кобальт, силицид кобальта, никель, силицид никеля, алюминий, вольфрам, медь, титан, молибден, оксид индия и олова (ITO), оксид индия и цинка, золото, платину, углерод и т.д.
[0096] Проводящий канал 26 может включать в себя любой электропроводящий или полупроводящий и pH-чувствительный материал. В одном примере, проводящий канал 26 представляет собой электропроводящий канал. В одном примере, электропроводящий или полупроводящий и pH-чувствительный материал допускает считывание заряженных ионов на своей поверхности. В другом примере, электропроводящий или полупроводящий и pH-чувствительный материал включает в себя поверхностные группы или покрывается другим материалом, который включает в себя поверхностные группы, которые допускают подвергание протонированию и/или депротонированию в ответ на заряженные ионы, сформированные посредством реакции вторичного субстрата 34 с компонентом изменения pH. Электропроводящий или полупроводящий и pH-чувствительный материал может содержать органический материал, неорганический материал либо и то, и другое.
[0097] В некоторых примерах, электропроводящий или полупроводящий и pH-чувствительный материал может включать в себя полупроводниковый материал, такой как кремний, который допускает обнаружение заряда. Полупроводящий и pH-чувствительный материал также может иметь диэлектрик затвора, по меньшей мере, на части своей поверхности. В некоторых примерах, диэлектрик затвора может окружать всю внешнюю поверхность полупроводящего и pH-чувствительного материала (за исключением контактных точек с электродами 22, 24), и в других примерах, диэлектрик затвора может позиционироваться на части внешней поверхности полупроводящего и pH-чувствительного материала. В одном примере, диэлектрик затвора служит с возможностью предотвращать утечку тока в окружающую среду (например, текучую среду) и также может предоставлять поверхностные группы, которые допускают подвергание протонированию и/или депротонированию. Примеры диэлектрика затвора включают в себя диоксид кремния (SiO2), оксинитрид кремния (SiON), нитрид кремния (Si3N4), пентоксид тантала (Ta2O5), оксид гафния (HfO2), оксид циркония (ZrO2), оксид алюминия (Al2O3), силикаты гафния или циркония (HfSiO4, ZrSiO4) и т.д. Поверхностные группы могут представлять собой силаноловые группы (Si-OH), Si-NH2-группы, карбоксильные группы (-COOH) или гидроксильные (-OH) группы.
[0098] В других примерах, электропроводящий или полупроводящий и pH-чувствительный материал может включать в себя углеродный материал (например, углеродные нанотрубки, стекловидный углерод, графен) без диэлектрика затвора. Эти электропроводящие или полупроводящие и pH-чувствительные материалы могут включать в себя карбоксильные (-COOH) группы, гидроксильные (-OH) группы или другую поверхностную функциональность, которая реагирует на pH или обеспечивает возможность присоединения pH-чувствительных функциональных групп.
[0099] В еще одних других примерах, электропроводящий или полупроводящий и pH-чувствительный материал может представлять собой биомолекулу. Примеры подходящих биомолекул включают в себя пептиды и дезоксирибонуклеиновые кислоты. Эти материалы могут иметь низкое значение в pKa при pH, сформированном как результат реакции формирования кислоты или основания, и в силу этого также могут включать в себя модулятор проводимости, который имеет почти нейтральное значение в pKa. Например, проводимость пептидов может модулироваться посредством pH-чувствительных аминокислот (гистидина и т.д.). В качестве другого примера, проводимость ДНК может модулироваться с помощью pH-быстрореагирующего интеркалятора, такого как доксорубицин (pKa ~ 8) и его аналогов.
[00100] В считывающих системах 10A-10E для одиночных молекул, проводящий канал 26 может иметь любую подходящую геометрию, такую как трубчатая структура, проводная структура, планарная структура и т.д. В некоторых примерах, проводящий канал 26 также может представлять собой наноструктуру, которая имеет, по меньшей мере, одну размерность в наномасштабе (в пределах от 1 нм до менее 1 мкм). В одном примере, эта размерность означает наибольшую размерность. В примере, проводящий канал 26 pH-датчика выбирается из группы, состоящей из полупроводящей наноструктуры, графеновой наноструктуры, металлической наноструктуры и проводящей полимерной наноструктуры. Наноструктура может представлять собой много- или одностенную нанотрубку, нанопровод, наноленту и т.д.
[00101] Каждая из считывающих систем 10A-10E, подходящих для использования при считывании одиночных молекул, включает в себя полимеразу 28, присоединенную к поверхности проводящего канала 26. В некоторых примерах, только полимераза 28 присоединяется к проводящему каналу 26 (см., например, фиг. 2), и в других примерах, полимераза 28 представляет собой часть комплекса 30A-30D (см., например, фиг. 3A, фиг. 3B, фиг. 4, фиг. 5, фиг. 6A и фиг. 6B), который включает в себя другой компонент, связанный с полимеразой 28.
[00102] Следует понимать, что полимераза 28 допускает удерживание матричной полинуклеотидной цепи и включение одного нуклеотида (из меченого нуклеотида 12, 12A, 12B, 12C или 12') за раз в образующуюся цепь, которая формируется вдоль матрицы. Следует понимать, что полимераза 28 и ее функции являются отдельными и отличающимися от реакции(й) формирования кислоты и основания, заключающей в себе вторичный субстрат 34. В частности, полимераза 28 участвует в отдельной реакции формирования кислоты относительно реакции(й) формирования кислоты и основания, заключающей в себе вторичный субстрат 34. Например, полимераза 28 формирует небольшое количество кислоты как результат включения нуклеотидного основания (например, 1 молекулы в расчете на событие включения), тогда как реакция(и) формирования кислоты или основания формирует сотни или тысячи либо еще большее число протонов или молекул основания. Кислота, сформированная посредством полимеразы 28, должна переполняться посредством большого количества кислоты или основания, сформированного из реакции, заключающей в себе вторичный субстрат 34. В некоторых случаях, локальное изменение pH, получающееся в результате реакций формирования кислоты или основания, может затрагивать кинетику полимеразы 28. В некоторых случаях, изменение pH может выключать активность полимеразы 28 до тех пор, пока не восстановится базовый pH. Это может быть преимущественным для того, чтобы создавать задержку между событиями включения (например, когда используется нуклеотид 12 или 12'). Другие факторы, такие как выбор компонента изменения pH, буфер, изменения температуры во время включения и т.д., также могут регулироваться с возможностью дополнительно улучшать или уравновешивать конкретный эффект в отношении полимеразной кинетики.
[00103] При использовании любой из считывающих систем 10A-10E, способ для считывания одиночных молекул включает в себя введение матричной полинуклеотидной цепи 44 (см., например, фиг. 2) в датчик 20, имеющий полимеразу 28 (отдельно или в качестве части комплекса), привязанную к проводящему каналу 26; введение текучей среды, включающей в себя вторичный субстрат 34 и меченые нуклеотиды 12, 12A, 12B, 12C или 12', в датчик 20, за счет чего нуклеотид одного из меченых нуклеотидов 12, 12A, 12B, 12C или 12' связывается с полимеразой 28, и метка 18 одного из меченых нуклеотидов 12, 12A, 12B, 12C или 12' участвует в реакции изменения pH, заключающей в себе вторичный субстрат 34, который находится поблизости от проводящего канала 26; и обнаружение ответа проводящего канала 26. В некоторых случаях, обнаруженное изменение заряда должно быть относительным касательно базового заряда. Кроме того, различные нуклеотиды 12, 12A-12C или 12' могут иметь различные скорости включения, которые могут затрагивать, например, то, насколько длинная кислота или основание формируется, либо то, сколько времени ингибируется реакция формирования кислоты или основания. Это, в свою очередь, должно затрагивать локальный рН-уровень и заряд на поверхности проводящего канала 26. Скорость включения может использоваться для того, чтобы отличать различные нуклеотиды.
[00104] Ниже подробнее описываются каждая из считывающих систем 10A-10E и любых способов, связанных со считывающими системами 10A-10E, со ссылкой на отдельные чертежи, на которых они показаны.
[00105] Считывающая система 10A
[00106] Конкретно ссылаясь на фиг. 2, считывающая система 10A включает в себя pH-датчик 20 и полимеразу 28, присоединенную к проводящему каналу 26 через привязку 32.
[00107] В этой примерной считывающей системе 10A, может использоваться любая полимераза 28, которая может принимать меченые нуклеотиды 12 или 12A-12C (фиг. 2) и которая может успешно включать нуклеотидное основание в образующуюся цепь 46 вдоль матрицы 44,. В технологиях считывания одиночных молекул, раскрытых в данном документе, желательно, если полимераза 28 является высокопроцессивной таким образом, что могут осуществляться несколько событий включения. Примерные полимеразы включают в себя эти полимеразы из семейства A, такие как Bsu-полимераза, Bst-полимераза, Taq-полимераза, T7-полимераза и многие другие; полимеразы из семейств B и B2, такие как Phi29-полимераза и другие высокопроцессивные полимеразы (семейство B2), Pfu-полимераза (семейство B), KOD-полимераза (семейство B), 9oN (семейство B) и многие другие; полимеразы из семейства C, такие как ДНК-полимераза III типа Эштерихия Коли и многие другие, полимеразы из семейства D, такие как ДНК-полимераза II типа Pyrococcus furiosus и многие другие; полимеразы из семейства X, такие как ДНК-полимераза м, ДНК-полимераза в, ДНК-полимераза у и многие другие. В одном примере, может быть желательным выбирать полимеразу 28, которая известна как функционирующая, по меньшей мере, для 2 pH-единиц, что является достаточным для того, чтобы предоставлять диапазон в 100 мВ в сигнале. Для четырех различных нуклеотидов и отключенного состояния, этот диапазон может заключать в себе отличительные изменения в 20 мВ, которые являются обнаруживаемыми.
[00108] В этой примерной считывающей системе 10A, привязка 32 используется в качестве анкера для полимеразы 28. Пример подходящей привязки 32 включает в себя полиэтиленгликоль (PEG). В считывающей системе 10A, длина привязки 32 является достаточной для того, чтобы удерживать полимеразу 28 достаточно близко к каналу 26 таким образом, что любая сформированная кислота или основание имеет возможность диффундировать в канал 26 до того, как она нейтрализуется в растворе. В примере, привязка 32 может иметь длину в пределах приблизительно от 2 нм приблизительно до 200 нм или приблизительно от 5 нм приблизительно до 150 нм, или приблизительно от 10 нм приблизительно до 100 нм. В некоторых примерах, привязка 32 удерживает полимеразу 28 на расстоянии, по меньшей мере, в 10 нм от проводящего канала 26. Это может быть желательным, например, таким образом, что конформные изменения полимеразы 28, зарядов полимеразы 28 и/или зарядов целевой/матричной полинуклеотидной цепи, удерживаемой посредством полимеразы 28, не создают помехи операции считывания pH-датчика 20. Тем не менее, следует понимать, что это примерное минимальное расстояние (по меньшей мере, 10 нм) может не требоваться, например, когда изменения pH доминируют над сигналом, который считывается.
[00109] Хотя не показано, считывающая система 10A также может включать в себя детектор для того, чтобы обнаруживать изменения напряжения и/или тока, которые соответствуют изменению pH, возникающему на/около поверхности считывающего pH-канала 26.
[00110] Также хотя не показано, считывающая система 10A может позиционироваться на опоре, такой как кремниевая микросхема или комплементарная структура "металл-оксид-полупроводник" (CMOS). Электроды 22, 24 могут соединяться с электронной схемой, которая обеспечивает их работу (например, после подключения к детектору и источнику мощности).
[00111] В некоторых примерах, датчик 10A может поступать заранее собранным.
[00112] В других примерах, компоненты датчика могут представлять собой часть комплекта, и компоненты комплекта могут использоваться для того, чтобы собирать датчик 10A. Пример комплекта включает в себя pH-датчик 20 на опоре и отдельный полимеразный раствор. Полимеразный раствор включает в себя жидкость-носитель и любой пример полимеразы 28. В некоторых примерах, полимераза 28 присоединяется к привязке 32, и в других примерах, привязка 32 присоединяется к считывающему pH-каналу 26 в качестве части считывающей системы 10A. В качестве примеров, жидкость-носитель полимеразного раствора может представлять собой воду или ионно-солевую буферную текучую среду, такую как солевой цитрат при миллимолярных-молярных концентрациях.
[00113] При использовании комплекта, пользователь может осаждать полимеразный раствор на опоре и обеспечивать возможность полимеразному раствору оставаться на опоре в течение подходящего времени для присоединения, посредством привязки 32, к проводящему каналу 26, либо для присоединения, посредством полимеразы 28, к привязке 32 на проводящем канале 26. Опора может промываться с помощью подходящего буфера для того, чтобы удалять все несвязанные полимеразы 28.
[00114] На фиг. 2, примеры комплекта также могут включать в себя текучую среду, которая должна использоваться с датчиком 10A во время считывания одиночных молекул. Эта текучая среда включает в себя жидкость-носитель, меченые нуклеотиды 12 или 12A-12C и вторичный субстрат 34. В некоторых случаях, эта текучая среда также включает в себя матричную полинуклеотидную цепь 44. В других случаях, один раствор включает в себя жидкость-носитель, меченые нуклеотиды 12 или 12A-12C и вторичный субстрат 34, и другой раствор включает в себя матричную полинуклеотидную цепь 44.
[00115] Матричная полинуклеотидная цепь 44 может представлять собой любой образец, который должен секвенироваться, и может состоять из ДНК, РНК либо их аналогов (например, пептидных нуклеиновых кислот). Матричная полинуклеотидная цепь 44 может представлять собой круглую матрицу. Источник матричной (или целевой) полинуклеотидной цепи 44 может представлять собой геномную ДНК, информационную РНК либо другие нуклеиновые кислоты из нативных источников. В некоторых случаях, матричная полинуклеотидная цепь 44, которая извлекается из таких источников, может амплифицироваться до использования в способе или системе 40, раскрытых в данном документе. Может использоваться любая из множества известных технологий амплификации, включающих в себя, но не только, полимеразную цепную реакцию (PCR), амплификацию по типу катящегося кольца (RCA), амплификацию со множественным замещением (MDA) или амплификацию на основе случайных праймеров (RPA). Следует понимать, что амплификация матричной полинуклеотидной цепи 44 до использования в способе или системе, изложенных в данном документе, является необязательной. В связи с этим, матричная полинуклеотидная цепь 44 не амплифицируется до использования в некоторых примерах. Матричные/целевые полинуклеотидные цепи 44 могут необязательно извлекаться из синтетических библиотек. Синтетические нуклеиновые кислоты могут иметь нативные ДНК или РНК-составы либо могут представлять собой их аналоги.
[00116] Меченые нуклеотиды 12 или 12A-12C включают в себя любой пример нуклеотида 14 или 14' и связывающей молекулы 16 или 16', раскрытых в данном документе. Метка 18 меченого нуклеотида 12 или 12A-12C, показанная на фиг. 2, представляет собой каталитическую метку 18A. При использовании в данном документе, "каталитическая метка" означает химические частицы, которые инициируют или ускоряют реакцию формирования кислоты или основания, заключающую в себе вторичный субстрат 34. В связи с этим, каталитическая метка 18A представляет собой один пример компонента изменения pH, который присоединяется к меченому нуклеотиду 12 или 12A-12C. Например, каталитическая метка 18A может представлять собой фермент, который реагирует с вторичным субстратом 34 для того, чтобы формировать кислоту, за счет этого понижая pH. Конкретный пример пары для формирования кислоты включает в себя ацетилхолинэстеразу в качестве каталитической метки 18A и сложноэфирную подложку (например, ацетилхолин) в качестве вторичного субстрата 34. Другой конкретный пример пары для формирования кислоты включает в себя углеродистую ангидразу в качестве каталитической метки 18A и бикарбонатный ион в качестве вторичного субстрата 34. В качестве другого примера, каталитическая метка 18A может представлять собой фермент, который реагирует с вторичным субстратом 34 для того, чтобы формировать основание, за счет этого увеличивая pH. В некоторых примерах, поверхностные группы на поверхности канала 26 являются чувствительными к кислотным или основным ионам, которые формируются, и могут подвергаться протонированию или депротонированию, за счет этого изменяя плотность заряда непосредственно на поверхности канала 26. В других примерах, заряженные ионы, сформированные во время реакций формирования кислоты или формирования основания, считываются посредством проводящего канала 26.
[00117] Жидкость-носитель текучей среды, которая может использоваться с датчиком 10A во время считывания одиночных молекул, представляет собой воду или низкобуферную текучую среду (10 мМ или меньше), имеющую pH в пределах приблизительно от 6 приблизительно до 9 или приблизительно от 7 приблизительно до 8. PH текучей среды зависит от полимеразы 28, которая используется, и всех условий, которые помогают максимизировать сигнал, когда возникает изменение pH. Поскольку каталитическая метка 18A и вторичный субстрат 34 присутствуют в текучей среде в этом примере, некоторая реакция(и) формирования кислоты или основания может осуществляться в текучей среде на большом расстоянии от проводящего канала 26. Тем не менее, ионы, сформированные в этих реакциях, могут нейтрализоваться в текучей среде (посредством низкобуферной текучей среды) и в силу этого могут не приводить к обнаруживаемому сигналу. Это предотвращает большие глобальные изменения pH в текучей среде. Тем не менее, следует понимать, что когда меченый нуклеотид 12 или 12A-12C удерживается посредством полимеразы 28, каталитическая метка 18A удерживается в более непосредственной близости к считывающему pH-каналу 26 (например, по сравнению со случаем, когда меченый нуклеотид 12 или 12A-12C плавает в растворе). В свою очередь, любое изменение pH, получающееся в результате реакции, заключающей в себе вторичный субстрат 34 и временно связанную каталитическую метку 18A, также находится в более непосредственной близости к считывающему pH-каналу 26. Кроме того, кинетика каталитической метки 18A может быть быстрее кинетики полимеразы 28. Например, частота оборота фермента для формирования кислоты, ацетилхолинэстеразы, может достигать не менее 25000 с-1, в то время как событие включения может составлять любое значение приблизительно от 0,1 с-1 приблизительно до 100 с-1. В этом примере, каталитическая метка 18A может формироваться из приблизительно от 250 приблизительно до 250000 молекул кислоты в расчете на нуклеотид, который включается (в расчете одно событие включения). Когда каталитическая метка 18A и формирование кислоты или основания локализуются на поверхности проводящего канала 26, pH-градиент может формироваться вокруг считывающего pH-канала 26, который может формировать сигналы обнаруживаемого заряда в считывающем pH-канале 26. Эти сигналы могут записываться.
[00118] В примере, буферная концентрация в низкобуферной текучей среде может составлять меньше приблизительно 10 мМ, что, как описано в данном документе, позволяет предотвращать глобальные изменения pH, но позволяет обеспечивать возможность обнаружения локальных изменений pH около проводящего канала 16. В некоторых случаях, буферная концентрация составляет значительно меньше 10 мМ, примеры чего включают в себя приблизительно 5 мМ, приблизительно 2,5 мМ, приблизительно 2 мМ, приблизительно 1 мМ, приблизительно 0,5 мМ или приблизительно 0,25 мМ. В других примерах, твердофазные буферы могут использоваться для того, чтобы помогать поддерживать глобальный pH без буферизации локального окружения.
[00119] В одном примере текучей среды, которая может использоваться со считывающей системой 10A, могут быть включены четыре различных меченых нуклеотида 12 или 12A-12C. Четыре различных меченых нуклеотида 12 или 12A-12C включают в себя отличающиеся нуклеотиды 14 или 14' (например, T, A, G или C) и отличающиеся каталитические метки 18A. Отличающиеся каталитические метки 18A могут обладать различной кинетикой таким образом, что кислота или основание формируется на различных скоростях, что, в свою очередь, должно приводить к различным плотностям заряда в канале 26. Поскольку отличающиеся каталитические метки 10A являются конкретными для нуклеотидов (например, конкретная метка 18A выбирается для конкретного основания), ответ pH-датчика 20 может указывать включенное основание меченого нуклеотида 12 или 12A-12C.
[00120] Нижеприведенное описание относится к примерному способу, который заключает в себе меченые нуклеотиды 12 и считывающую систему 10A. В этом примере, матричная полинуклеотидная цепь 44 может вводиться в считывающую систему 10A в текучей среде, такой как биологически стабильный раствор, вместе или отдельно от меченых нуклеотидов 12 и вторичного субстрата 34. Полимераза 28 связывается с матричной полинуклеотидной цепью 44 таким образом, что цепь 44 удерживается на месте. Комплементарное основание одного из меченых нуклеотидов 12 должно включаться в образующуюся цепь 46 (которая формируется вдоль матричной полинуклеотидной цепи 44) посредством полимеразы 28. Во время события включения, каталитическая метка 18A меченого нуклеотида 12 появляется поблизости от канала 26 и любого вторичного субстрата 34 в текучей среде, которая также находится поблизости от канала 26. Поскольку кинетика каталитической метки 18A может быть быстрее события включения, реакция формирования кислоты или основания с вторичным субстратом 34 осуществляется до того, как включение основания заканчивается. Заряженные ионы из реакции формирования кислоты или основания могут обнаруживаться в проводящем канале 26, либо, если реакционноспособные поверхностные группы присутствуют, могут реагировать с поверхностными группами, чтобы изменять состояние заряда поверхностных групп. Измененный заряд обнаруживается посредством pH-датчика 20.
[00121] В этом примерном способе, после включения нуклеотидного основания в образующуюся цепь 46, связь между альфа-фосфатом и связывающей молекулой 16 или между альфа-фосфатом и бета-фосфатом расщепляется естественным путем. Это естественное расщепление обеспечивает возможность метке 18A (и связывающей молекуле 16) диссоциироваться от включенного нуклеотидного основания и диффундировать в направлении от считывающей системы 10A. Полимераза 28 затем может принимать другой меченый нуклеотид 12, который включает в себя нуклеотидное основание, которое является комплементарным следующему нуклеотиду в матричной полинуклеотидной цепи 44.
[00122] Нижеприведенное описание относится к примерному способу, который заключает в себе меченые нуклеотиды 12A-12C и считывающую систему 10A. В этом примере, матричная полинуклеотидная цепь 44 может вводиться в считывающую систему 10A в текучей среде, такой как биологически стабильный раствор, вместе или отдельно от меченых нуклеотидов 12A-12C и вторичного субстрата 34. Полимераза 28 связывается с матричной полинуклеотидной цепью 44 таким образом, что цепь 44 удерживается на месте. Комплементарное основание одного из меченых нуклеотидов 12A-12C должно включаться в образующуюся цепь 46 (которая формируется вдоль матричной полинуклеотидной цепи 44) посредством полимеразы 28. В этом примере, меченый нуклеотид 12A-12C включает в себя обратимый терминатор. В связи с этим, включение меченого нуклеотида 12A-12C служит в качестве терминатора для полимеризации. Это обеспечивает осуществление формирования кислоты или основания и обнаружения заряда аналогично вышеописанному.
[00123] В этом примерном способе, после включения нуклеотидного основания в образующуюся цепь 46, текучая среда, которая включает в себя любые невключенные нуклеотиды, может удаляться из считывающей системы 10A. Это может достигаться с использованием промывочного раствора (например, воды). Деблокирующий агент затем может вводиться в считывающую систему 10A. Деблокирующий агент может допускать i), расщепление всех расщепляемых связывающих молекул 16' от включенного меченого нуклеотида 12A-12C (что также удаляет каталитическую метку 18A), и ii) удаление блокирующей группы 38A, 38B, 38C 3'-OH (см. фиг. 1B) из включенного меченого нуклеотида 12A-12C. Удаление блокирующей группы 38A, 38B, 38C 3'-OH обеспечивает возможность выполнения последующего цикла секвенирования. Примеры блокирующих групп 3'-OH и подходящих деблокирующих агентов включают в себя: простые o-нитробензилэфиры и алкиловый o-нитробензилкарбонат, которые могут удаляться фотолитически; компоненты сложных эфиров, которые могут удаляться посредством гидролиза основания; аллилкомпоненты, которые могут удаляться с помощью Nal, хлортриметилсилана и Na2S2O3 либо с помощью Hg(II) в ацетоне/воде; азидометил, который может расщепляться с помощью фосфинов, таких как трис-(2-карбоксиэтил)-фосфин (TCEP) или три-(гидроксипропил)-фосфин (THP); ацетали, такие как, трет-бутокси-этокси, который может расщепляться при кислых условиях; MOM-(-CH2OCH3)-компоненты, которые могут расщепляться с помощью LiBF4 и CH3CN/H2O; 2,4-динитробензолсульфенил, который может расщепляться с помощью нуклеофилов, таких как тиофенол и тиосульфат; тетрагидрофураниловый простой эфир, который может расщепляться с помощью Ag(I) или Hg(II); и 3'-фосфат, который может расщепляться посредством ферментов фосфатазы (например, полинуклеотидкиназы). Другие полезные обратимые компоненты включают в себя простые эфиры, -F, -H2, -OCH3, -N3, -HCOCH3 и 2-нитробензолкарбонат, и полезные обработки деблокирования включают в себя облучение светом (например, чтобы вызывать фоторасщепление), нагрев, воздействие химических реактантов, воздействие катализаторов, воздействие электрического тока (например, чтобы вызывать электролиз) и т.п.
[00124] Считывающая система 10B
[00125] Конкретно ссылаясь на фиг. 3A и фиг. 3B, считывающая система 10B включает в себя pH-датчик 20 и комплекс 30A, присоединенный к проводящему каналу 26 pH-датчика 20.
[00126] Комплекс 30A включает в себя полимеразу 28, связанную с компонентом изменения pH (показан в этих примерах в качестве 50A, 50B или 50C), который должен участвовать в формировании изменения pH поблизости от проводящего канала 26 в силу потребления вторичного субстрата 34 в текучей среде, которая раскрывается для pH-датчика 20.
[00127] Полимераза 28 комплекса 30A может представлять собой любой пример полимеразы, описанной со ссылкой на фиг. 2.
[00128] В этом примере, компонент изменения pH выбирается из группы, состоящей из фермента 50A, кофактора 50B и активатора 50C.
[00129] Фермент 50A формирует кислоту или основание в реакции с вторичным субстратом 34. В качестве примеров, фермент 50A может выбираться из группы, состоящей из гидролаз и оксидаз. Примеры подходящих гидролаз включают в себя фосфатазы, эстеразы (например, ацетилхолинэстеразу), конкретные для последовательности протеазы (например, TEV-протеазу или тромбин) и гликозидазы (которые не ухудшают характеристики рибозы, такие как целлюлоза или амилаза). Другая подходящая гидролаза представляет собой углеродистую ангидразу. Примеры подходящих оксидаз включают в себя глюкозооксидазу, моноаминоксидазу, ксантиноксидазу и т.д. Хотя предоставлено несколько примеров, считается, что может использоваться любой доступный фермент 50A или спроектированный фермент 50A, при условии, что ферментативная кинетика быстрее полимеразной кинетики.
[00130] Кофактор 50B представляет собой вещество, присутствие которого является важным для активности фермента, который формирует кислоту или основание в реакции с вторичным субстратом 34. Некоторые примеры подходящих кофакторов 50B для оксидаз включают в себя флавинадениндинуклеотид (FAD), никотинадениндинуклеотид (NAD), никотинадениндинуклеотидафосфат (NADP) и т.д.
[00131] Активатор 50C представляет собой вещество, которое инициирует или стимулирует реакцию формирования кислоты или основания с вторичным субстратом 34. В некоторых случаях, активатор 50C функционирует аналогично кофактору 50B, и в силу этого любые примеры кофактора 50B могут использоваться для активатора 50C. Для металло-зависимых гидролаз, примеры подходящих активаторов 50C включают в себя двухвалентные металлы.
[00132] В комплексе 30A, полимераза 28 и любой пример компонента 50A-50C изменения pH конъюгируются между собой. В одном примере, этот комплекс 30A представляет собой слитый белок или химеру белка. Комплекс 30A может формироваться с использованием способов конъюгирования, таких как реакция сочетания SpyTag/SpyCatcher, конъюгирование цистеина с опосредованным р-фиксатором, биотин/стрептавидин, белок на основе SUMO (малого убиквитин-подобного модификатора), His6/NTA-хелирование с металлом, цистеин/малеимид, дибензоциклооктин (DBCO)/азид или любой другой подходящий способ конъюгирования.
[00133] Комплекс 30A может присоединяться к проводящему каналу 26 через привязку 32, примеры которой описываются со ссылкой на фиг. 2. Альтернативно, комплекс 30A может непосредственно присоединяться через связывание между компонентом 50A-50C изменения pH и группами на поверхности проводящего канала 26.
[00134] Хотя не показано, считывающая система 10B также может включать в себя детектор для того, чтобы обнаруживать изменения напряжения и/или тока, которые соответствуют изменению pH, возникающему на/около поверхности считывающего pH-канала 26.
[00135] Также хотя не показано, считывающая система 10B может позиционироваться на опоре, такой как кремниевая микросхема. Электроды 22, 24 могут соединяться с электронной схемой, которая обеспечивает их работу (например, после подключения к детектору и источнику мощности).
[00136] В некоторых примерах, датчик 10B может поступать заранее собранным.
[00137] В других примерах, компоненты датчика могут представлять собой часть комплекта, и компоненты комплекта могут использоваться для того, чтобы собирать датчик 10B. Пример комплекта включает в себя pH-датчик 20 на опоре и текучую среду, которая используется для того, чтобы вводить комплекс 30A в pH-датчик 20. Текучая среда включает в себя жидкость-носитель и комплекс 30A. В некоторых примерах, комплекс 30A в текучей среде присоединяется к привязке 32. В других примерах, привязка 32 присоединяется к считывающему pH-каналу 26 в качестве части считывающей системы 10B. В еще одних других примерах, в которых имеется прямая связь, созданная между компонентом 50A-50C изменения pH и поверхностными группами канала 26, следует понимать, что комплекс 30A в текучей среде не присоединяется к привязке 32, и привязка 32 не присоединяется к считывающему pH-каналу 26. В примере, жидкость-носитель представляет собой воду или пример низкобуферной текучей среды, такой как солевой цитрат при миллимолярных концентрациях.
[00138] В одном примере этого комплекта, комплекс 30A в жидкости-носителе включает в себя полимеразу 28, связанную, по меньшей мере, с одним ферментом 50A. В другом примере этого комплекта, комплекс 30A в жидкости-носителе включает в себя полимеразу 28, конъюгированную с кофактором 50B. В еще одном другом примере этого комплекта, комплекс 30A в жидкости-носителе включает в себя полимеразу 28, конъюгированную с активатором 50C. В каждом из этих примеров, комплекс 30A также может включать в себя привязку 32. При использовании этих примеров комплекта, пользователь может осаждать текучую среду на опоре и обеспечивать возможность текучей среде оставаться на опоре в течение подходящего времени для присоединения, посредством привязки 32, комплекса 30A к проводящему каналу 26, для присоединения, посредством комплекса 30A, к привязке 32 на канале 26, или для связывания, посредством компонента 50A-50C изменения pH, с поверхностными группами канала 26. Опора может промываться с помощью подходящего буфера для того, чтобы удалять все несвязанные комплексы 30A.
[00139] Некоторые примеры комплекта также могут включать в себя текучую среду(ы), которая должна использоваться со считывающей системой 10B во время считывания одиночных молекул. Содержание текучей среды может варьироваться в зависимости от того, какой компонент 50A-50C изменения pH представляет собой часть комплекса 30A считывающей системы 10B, и того, какие меченые нуклеотиды 12, 12A-12C или 12' используются. Ниже описываются несколько примеров этих текучих сред.
[00140] В примерах, показанных на фиг. 3A, текучая среда(ы), которая должна использоваться во время секвенирования одиночных молекул, включает в себя любой пример жидкости-носителя, раскрытой в данном документе, меченых нуклеотидов 12 или 12A-12C и вторичного субстрата 34 (который, в этих примерах, представляет собой отдельную молекулу относительно меченых нуклеотидов 12 или 12A-12C).
[00141] Метка 18B или 18C, которая присоединяется к меченым нуклеотидам 12 или 12A-12C, должна зависеть от того, какой компонент изменения pH включается в комплекс 30A.
[00142] Когда считывающая система 10B включает в себя фермент 50A в качестве части комплекса 30A, метка 18B используется. Как упомянуто в данном документе, фермент 50A формирует кислоту или основание в реакции с вторичным субстратом 34, когда они находятся поблизости друг от друга. Чтобы коррелировать реакцию формирования кислоты или основания между ферментом 50A и вторичным субстратом 34 с включенным меченым нуклеотидом 12 или 12A-12C, метка 18B на меченых нуклеотидах 12 или 12A-12C может индивидуально адаптироваться с возможностью улучшать кинетику фермента 50A или замедлять кинетику фермента 50A. В связи с этим, метка 18B представляет собой один пример компонента изменения pH, который присоединяется к меченому нуклеотиду 12 или 12A-12C. Этот пример системы 10B в силу этого включает в себя два различных примера компонента изменения pH. Таким образом, в одном примере, метка 18B выбирается из группы, состоящей из первой группы, которая улучшает кинетику фермента 50A, и второй группы, которая замедляет кинетику фермента 50A.
[00143] Когда метка 18B улучшает кинетику фермента 50A, она также улучшает (например, инициирует или ускоряет) кинетику реакции формирования кислоты или основания, заключающей в себе фермент 50A и вторичный субстрат 34. Примеры меток 18B, которые улучшают кинетику фермента 50A, включают в себя кофакторы фермента. Примеры других меток 18B, которые улучшают кинетику фермента 50A, включают в себя метки, которые имеют эффект скученности. Этот тип метки 18B может представлять собой агент обеспечения скученности, который может уменьшать объем воды, доступной для других молекул, и эффективно увеличивать локальную концентрацию вторичного субстрата 34 (что, в свою очередь, увеличивает скорость реакции).
[00144] Напротив, когда метка 18B замедляет кинетику фермента 50A, она также замедляет кинетику реакции формирования кислоты или основания, заключающей в себе фермент 50A и вторичный субстрат 34. Примеры меток 18B, которые замедляют кинетику фермента 50A, могут выбираться из группы, состоящей из аллостерического ингибитора, группы стерического исключения и буферизующей группы. Аллостерический ингибитор связывается с аллостерическим участком фермента 50A и изменяет конформацию активного участка фермента 50A. Как результат, фермент 50A более не имеет возможность реагировать с вторичным субстратом 34 и становится неактивным. Может быть желательным, если связывание между аллостерическим ингибитором и ферментом 50A является более слабым, чем связывание между полимеразой 28 и основанием меченого нуклеотида 12 или 12A-12C таким образом, что меченые нуклеотиды 12 или 12A-12C не являются связанными только посредством метки 18B. Группа стерического исключения может представлять собой молекулу, которая является более объемистой, чем вторичный субстрат 34. Группа стерического исключения включенного меченого нуклеотида может блокировать приближение вторичного субстрата 34 к ферменту 50A достаточно вплотную для того, чтобы реагировать. Другими словами, группа стерического исключения может уменьшать доступ к ферменту 50A без фактического связывания с ферментом 50A. Буферизующая группа может выступать в качестве локального буфера для того, чтобы абсорбировать протоны, сформированные во время реакции формирования кислоты, либо молекулы основания, сформированных во время реакции формирования основания, и в силу этого нейтрализовать pH. В качестве примера, дендримеры, обладающие несколькими группами кислот или оснований, могут служить с возможностью буферизовать локальную окрестность проводящего канала 26.
[00145] В примере, метки 18B, которые присоединяются к различным нуклеотидам 12 или 12A-12C (например, A, T, C, G), могут выбираться с возможностью увеличивать или уменьшать формирование кислоты или основания на различных скоростях. В этом примере, когда один из меченого нуклеотида 12 или 12A-12C включается посредством полимеразы 28, метка 18B переходит в позицию поблизости от фермента 50A и вторичного субстрата 34 и улучшает или замедляет реакцию на уникальной зависимой от метки скорости. В свою очередь, pH в проводящем канале 26 изменяется. Изменение pH коррелируется с повышенным или пониженным формированием кислоты или основания и в силу этого может использоваться для того, чтобы идентифицировать включенный меченый нуклеотид 12 или 12A-12C.
[00146] Когда считывающая система 10B включает в себя кофактор 50B или активатор 50C в качестве части комплекса 30A, метка 18C используется. Метка 18C может представлять собой фермент, который формирует кислоту или основание в реакции с вторичным субстратом 34. В связи с этим, метка 18C представляет собой один пример компонента изменения pH, который присоединяется к меченому нуклеотиду 12 или 12A-12C. Этот пример системы 10B в силу этого включает в себя два различных примера компонента изменения pH. Когда меченый нуклеотид 12 или 12A-12C включается посредством полимеразы 28, ферментная метка 18C переходит в позицию поблизости от кофактора 50B или активатора 50C и вторичного субстрата 34. Присоединенный кофактор 50B или активатор 50C может улучшать или инициировать реакцию между ферментной меткой 18C и вторичным субстратом 34 в текучей среде.
[00147] Поскольку меченые нуклеотиды 12 или 12A-12C не включают в себя вторичный субстрат 34, текучая среда(ы), представленная в примере по фиг. 3A, также включает в себя вторичный субстрат 34. Вторичный субстрат 34 может представлять собой любой вторичный субстрат 34, который может реагировать с ферментом 50A для того, чтобы формировать кислоту или основание, либо реакция которой с ферментной меткой 18C может улучшаться или инициироваться посредством кофактора 50B или активатора 50C.
[00148] Нижеприведенное описание относится к примерному способу, который заключает в себе меченые нуклеотиды 12 и считывающую систему 10B. В этом примере, матричная полинуклеотидная цепь 44 может вводиться в считывающую систему 10B в текучей среде, такой как биологически стабильный раствор, вместе или отдельно от меченых нуклеотидов 12 и вторичного субстрата 34. Полимераза 28 связывается с матричной полинуклеотидной цепью 44 таким образом, что цепь 44 удерживается на месте. Комплементарное основание одного из меченых нуклеотидов 12 должно включаться в образующуюся цепь 46 (которая формируется вдоль матричной полинуклеотидной цепи 44) посредством полимеразы 28. Во время события включения, метка 18B или 18C меченого нуклеотида 12 появляется поблизости от канала 26, компонента 50A-50C изменения pH и любого вторичного субстрата 34 в текучей среде, которая также находится поблизости от компонента 50A-50C изменения pH. Реакция формирования кислоты или основания с вторичным субстратом 34 может улучшаться, замедляться или ингибироваться в зависимости от комплекса 30A и меток 18B или 18C, которые используются, что изменяет pH текучей среды и заряд на поверхности канала 26. В этом примерном способе, после включения нуклеотидного основания в образующуюся цепь 46, связь между альфа-фосфатом и связывающей молекулой 16 или между альфа-фосфатом и бета-фосфатом расщепляется естественным путем. Это естественное расщепление обеспечивает возможность метке 18B или 18C (и связывающей молекуле 16) диссоциироваться от включенного нуклеотидного основания и диффундировать в направлении от считывающей системы 10B. Полимераза 28 затем может принимать другой меченый нуклеотид 12, который включает в себя нуклеотидное основание, которое является комплементарным следующему нуклеотиду в матричной полинуклеотидной цепи 44.
[00149] Нижеприведенное описание относится к примерному способу, который заключает в себе меченые нуклеотиды 12A-12C и считывающую систему 10B. В этом примере, матричная полинуклеотидная цепь 44 может вводиться в считывающую систему 10B в текучей среде, такой как биологически стабильный раствор, вместе или отдельно от меченых нуклеотидов 12A-12C и вторичного субстрата 34. Полимераза 28 связывается с матричной полинуклеотидной цепью 44 таким образом, что цепь 44 удерживается на месте. Комплементарное основание одного из меченых нуклеотидов 12A-12C должно включаться в образующуюся цепь 46 (которая формируется вдоль матричной полинуклеотидной цепи 44) посредством полимеразы 28. Реакция формирования кислоты или основания с вторичным субстратом 34 может улучшаться, замедляться или ингибироваться в зависимости от комплекса 30A и меток 18B или 18C, которые используются, что изменяет pH текучей среды и заряд на поверхности канала 26. В этом примере, меченый нуклеотид 12A-12C включает в себя обратимый терминатор. В связи с этим, включение меченого нуклеотида 12A-12C служит в качестве терминатора для полимеризации. Это обеспечивает осуществление улучшенного, замедленного или ингибированного формирования кислоты или основания и обнаружения заряда аналогично вышеописанному. В этом примерном способе, мытье и воздействие деблокирующего агента может использоваться для того, чтобы подготавливать считывающую систему 10B к другому циклу секвенирования.
[00150] В любом из примеров, описанных со ссылкой на фиг. 3A, следует понимать, что расстояние между полимеразой 28 и компонентом 50A-50C изменения pH и длина связывающей молекулы 16, 16' могут выбираться таким образом, что метка 18B или 18C переходит в позицию поблизости от компонента 50A-50C изменения pH, когда ее меченый нуклеотид 12 или 12A-12C включается посредством полимеразы 28. Это обеспечивает прогнозируемые эффекты в отношении реакции формирования кислоты или основания.
[00151] Как упомянуто в данном документе, считывающая система 10B также может использоваться с меченым нуклеотидом 12', который, как описано со ссылкой на фиг. 1C, включает в себя вторичный субстрат 34, присоединенный к нуклеотиду 14. Фиг. 3B иллюстрирует систему 10B и меченый нуклеотид 12'.
[00152] В этом примере, текучая среда в комплекте включает в себя меченые нуклеотиды 12', а не меченые нуклеотиды 12 или 12A-12C. В отличие от текучих сред, описанных со ссылкой на фиг. 3A, эта текучая среда не включает в себя отдельный вторичный субстрат 34, поскольку вторичный субстрат 34 присоединяется к нуклеотиду 14.
[00153] Когда считывающая система 10B включает в себя фермент 50A в качестве части комплекса 30A, текучая среда, доступная для системы 10B, может включать в себя жидкость-носитель и меченые нуклеотиды 12'. Когда полимераза 28 включает основание меченых нуклеотидов 12', вторичный субстрат 34 переходит в позицию поблизости от фермента 50A, и реакция формирования кислоты или основания может осуществляться.
[00154] Когда считывающая система 10B включает в себя кофактор 50B или активатор 50C в качестве части комплекса 30A, текучая среда, доступная для системы 10B, может включать в себя жидкость-носитель и меченые нуклеотиды 12'. Этот пример комплекта также может включать в себя ферментную текучую среду, которая является отдельной от текучей среды, содержащей меченые нуклеотиды 12'. Ферментная текучая среда включается, поскольку ни меченый нуклеотид 12', ни комплекс 30A не содержат фермент, который участвует в реакции формирования кислоты или основания с вторичным субстратом 34. Ферментная текучая среда может включать в себя жидкость-носитель (например, любой из буферов, раскрытых в данном документе) и фермент 54, который должен участвовать в потреблении вторичного субстрата 34. Используемый фермент 54 зависит от вторичного субстрата 34, который присоединяется к меченому нуклеотиду 12'.
[00155] Когда текучая среда(ы), содержащая матричную полинуклеотидную цепь 44 и меченый нуклеотид 12', и, в некоторых случаях, ферментная текучая среда вводятся (последовательно или одновременно) в считывающую систему 10B, матричная полинуклеотидная цепь 44 связывается с полимеразой 28, и один комплементарный меченых нуклеотидов 12' включается в растущую образующуюся цепь 46. В этом примере, фермент 50A комплекса 30A либо свободно плавающий фермент 54 реагирует таким образом, чтобы потреблять вторичный субстрат 34 для того, чтобы формировать кислоту или основание, и эта реакция должна быть быстрее включения нуклеотида. В этих примерах, вторичный субстрат 34 потребляется, и после его потребления, pH должен возвращаться к базовому уровню, и нуклеотидное основание должно включаться.
[00156] Считывающая система 10C
[00157] Конкретно ссылаясь на фиг. 4, считывающая система 10C включает в себя pH-датчик 20 и комплекс 30B, присоединенный к проводящему каналу 26 pH-датчика 20.
[00158] Комплекс 30B включает в себя полимеразу 28, присоединенную к двум различным ферментам 50A и 50D. Полимераза 28 комплекса 30A может представлять собой любой пример полимеразы, описанной со ссылкой на фиг. 2.
[00159] Ферменты 50A, 50D могут представлять собой любой пример фермента, описанного со ссылкой на фиг. 3A и фиг. 3B, при условии, что два фермента 50A, 50D отличаются. Каждый из ферментов 50A и 50D формирует кислоту или основание в реакции с вторичным субстратом 34; тем не менее, ферменты 50A и 50D могут выбираться таким образом, что они имеют различный ответ при нахождении поблизости от конкретной нуклеотидной метки 18D. В качестве одного примера, фермент 50A может реагировать на соответствующие метки 18D, присоединенные к двум типам меченых нуклеотидов 12 или 12A-12C (например, A и T), и может не реагировать на соответствующие метки 18D, присоединенные к другим двум типам меченых нуклеотидов 12 или 12A-12C (например, C и G). С другой стороны, фермент 50D может реагировать на соответствующие метки 18D, присоединенные к другим двум типам меченых нуклеотидов 12 или 12A-12C (например, C и G), но может не реагировать на соответствующие метки 18D, присоединенные к двум типам меченых нуклеотидов 12 или 12A-12C (например, A и T). В этом примере, каждая метка 18D, соответственно, присоединенная к нуклеотидам 12 или 12A-12C, может отличаться от каждой другой метки 18D, соответственно, присоединенной к другим нуклеотидам 12 или 12A-12C.
[00160] В комплексе 30B, полимераза 28 и два различных фермента 50A, 50D конъюгируются между собой. В одном примере, этот комплекс 30B представляет собой слитый белок или химеру белка. Комплекс 30B может формироваться с использованием способов конъюгирования, таких как реакция сочетания SpyTag/SpyCatcher, конъюгирование цистеина с опосредованным р-фиксатором, биотин/стрептавидин, белок на основе SUMO (малого убиквитин-подобного модификатора), His6/NTA-хелирование с металлом, цистеин/малеимид, дибензоциклооктин (DBCO)/азид или любой другой подходящий способ конъюгирования.
[00161] В одном примере (как показано на фиг. 4), комплекс 30B может присоединяться к проводящему каналу 26 через привязки 32, 32', присоединенные к каждому из ферментов 50A, 50D. В другом примере, одна привязка 32 может присоединять полимеразу 28 к проводящему каналу 26, и ферменты 50A, 50D, соответственно, могут присоединяться к полимеразе 28. В еще одном другом примере, привязки 32, 32' отсутствуют, но вместо этого один или оба из ферментов 50A, 50D могут создавать связь непосредственно с поверхностными группами проводящего канала 26 и с полимеразой 28.
[00162] Хотя не показано, считывающая система 10C также может включать в себя детектор для того, чтобы обнаруживать изменения напряжения и/или тока, которые соответствуют изменению pH, возникающему на/около поверхности считывающего pH-канала 26.
[00163] Также хотя не показано, считывающая система 10C может позиционироваться на опоре, такой как кремниевая микросхема. Электроды 22, 24 могут соединяться с электронной схемой, которая обеспечивает их работу (например, после подключения к детектору и источнику мощности).
[00164] В некоторых примерах, датчик 10C может поступать заранее собранным.
[00165] В других примерах, компоненты датчика могут представлять собой часть комплекта, и компоненты комплекта могут использоваться для того, чтобы собирать датчик 10C. Пример комплекта включает в себя pH-датчик 20 на опоре и текучую среду, которая используется для того, чтобы вводить комплекс 30B в pH-датчик 20. Текучая среда включает в себя жидкость-носитель и комплекс 30B. В некоторых примерах, комплекс 30B в текучей среде присоединяется к привязкам 32, 32'. В других примерах, комплекс 30B в текучей среде включает в себя одну привязку 32, присоединенную к полимеразе 28, и ферменты 50A и 50D присоединяются к полимеразе 28. В еще одних некоторых других примерах, привязка(ки) 32, 32' присоединяется к считывающему pH-каналу 26 в качестве части считывающей системы 10C. В еще одних других примерах, в которых имеется прямая связь, созданная между ферментами 50A, 50D и поверхностными группами канала 26, следует понимать, что комплекс 30B в текучей среде не присоединяется к привязкам 32, 32', и привязки 32, 32' не присоединяются к считывающему pH-каналу 26. В примере, жидкость-носитель представляет собой воду или пример низкобуферной текучей среды, такой как солевой цитрат при миллимолярных концентрациях.
[00166] При использовании этих примеров комплекта, пользователь может осаждать текучую среду на опоре и обеспечивать возможность текучей среде оставаться на опоре в течение подходящего времени для присоединения, посредством привязок 32, 32', комплекса 30B к проводящему каналу 26, для присоединения, посредством привязки 32, полимеразы 28 комплекса 30B к проводящему каналу 26, либо для связывания, посредством ферментов 50A и 50D, с поверхностными группами канала 26. Опора может промываться с помощью подходящего буфера для того, чтобы удалять все несвязанные комплексы 30B.
[00167] Некоторые примеры комплекта также могут включать в себя текучую среду(ы), которая должна использоваться со считывающей системой 10C во время считывания одиночных молекул. В этом примере, текучая среда(ы) включает в себя любой пример жидкости-носителя, раскрытой в данном документе, меченых нуклеотидов 12 или 12A-12C и вторичного субстрата 34 (которая, в этих примерах, представляет собой отдельную молекулу относительно меченых нуклеотидов 12 или 12A-12C).
[00168] Метка 18D, которая присоединяется к меченым нуклеотидам 12 или 12A-12C, должна зависеть от двух ферментов 50A, 50D комплекса 30B. Как упомянуто в данном документе, каждый из ферментов 50A, 50D формирует кислоту или основание в реакции с вторичным субстратом 34. Чтобы коррелировать конкретную реакцию формирования кислоты или основания между ферментом 50A и вторичным субстратом 34 или между ферментом 50D и вторичным субстратом 34, каждая метка 18D на меченых нуклеотидах 12 или 12A-12C может индивидуально адаптироваться с возможностью улучшать (например, инициировать или ускорять) кинетику фермента 50A или фермента 50D либо замедлять кинетику фермента 50A или фермента 50D. В связи с этим, метка 18D представляет собой один пример компонента изменения pH, который присоединяется к меченому нуклеотиду 12 или 12A-12C. Этот пример системы 10B в силу этого включает в себя два различных примера компонента изменения pH. Любая из меток 18B может использоваться для меток 18D, и каждый из четырех нуклеотидов (например, A, T, C, G) может помечаться различной меткой, которая затрагивает реакции формирования кислоты или основания по-разному. В одном примере, метка 18D, выбранная для меченого нуклеотида 12 или 12A-12C с "A" в качестве азотистого основания, может улучшать формирование кислоты на первой скорости, при нахождении поблизости от фермента 50A и вторичного субстрата 34; метка 18D, выбранная для меченого нуклеотида 12 или 12A-12C с "T" в качестве азотистого основания, может замедлять формирование кислоты на второй скорости, при нахождении поблизости от фермента 50A и вторичного субстрата 34; метка 18D, выбранная для меченого нуклеотида 12 или 12A-12C с "C" в качестве азотистого основания, может улучшать формирование основания на третьей скорости, при нахождении поблизости от фермента 50D и вторичного субстрата 34; и метка 18D, выбранная для меченого нуклеотида 12 или 12A-12C с "G" в качестве азотистого основания, может замедлять формирование основания на четвертой скорости, при нахождении поблизости от фермента 50A и вторичного субстрата 34. Когда различные меченые нуклеотиды включаются в образующуюся цепь 46, различные рН-уровни должны получаться в результате локально на поверхности зарядово-чувствительного канала 46.
[00169] Поскольку меченые нуклеотиды 12 или 12A-12C не включают в себя вторичный субстрат 34, текучая среда(ы), представленная в примере по фиг. 4, также включает в себя вторичный субстрат 34. Вторичный субстрат 34 может представлять собой любой вторичный субстрат 34, который может реагировать с ферментом 50A или 50D для того, чтобы формировать кислоту или основание.
[00170] Нижеприведенное описание относится к примерному способу, который заключает в себе меченые нуклеотиды 12 и считывающую систему 10C. В этом примере, матричная полинуклеотидная цепь 44 может вводиться в считывающую систему 10C в текучей среде, такой как биологически стабильный раствор, вместе или отдельно от меченых нуклеотидов 12 и вторичного субстрата 34. Полимераза 28 связывается с матричной полинуклеотидной цепью 44 таким образом, что цепь 44 удерживается на месте. Комплементарное основание одного из меченых нуклеотидов 12 должно включаться в образующуюся цепь 46 (которая формируется вдоль матричной полинуклеотидной цепи 44) посредством полимеразы 28. Во время события включения, метка 18D меченого нуклеотида 12 появляется поблизости от канала 26, ферментов 50A и 50D и любого вторичного субстрата 34 в текучей среде, которая также находится поблизости от ферментов 50A и 50D. Реакция формирования кислоты или основания с вторичным субстратом 34 может улучшаться, замедляться или ингибироваться в зависимости от метки 18D и ее эффекта в отношении реакции, заключающей в себе фермент 50A или 50D. Это изменяет pH текучей среды и заряд на поверхности канала 26. В этом примерном способе, после включения нуклеотидного основания в образующуюся цепь 46, связь между альфа-фосфатом и связывающей молекулой 16 или между альфа-фосфатом и бета-фосфатом расщепляется естественным путем. Это естественное расщепление обеспечивает возможность метке 18D (и связывающей молекуле 16) диссоциироваться от включенного нуклеотидного основания и диффундировать в направлении от считывающей системы 10C. Полимераза 28 затем может принимать другой меченый нуклеотид 12, который включает в себя нуклеотидное основание, которое является комплементарным следующему нуклеотиду в матричной полинуклеотидной цепи 44.
[00171] Нижеприведенное описание относится к примерному способу, который заключает в себе меченые нуклеотиды 12A-12C и считывающую систему 10C. В этом примере, матричная полинуклеотидная цепь 44 может вводиться в считывающую систему 10C в текучей среде, такой как биологически стабильный раствор, вместе или отдельно от меченых нуклеотидов 12A-12C и вторичного субстрата 34. Полимераза 28 связывается с матричной полинуклеотидной цепью 44 таким образом, что цепь 44 удерживается на месте. Комплементарное основание одного из меченых нуклеотидов 12A-12C должно включаться в образующуюся цепь 46 (которая формируется вдоль матричной полинуклеотидной цепи 44) посредством полимеразы 28. Реакция формирования кислоты или основания с вторичным субстратом 34 может улучшаться, замедляться или ингибироваться в зависимости от метки 18D и ее эффекта в отношении реакции, заключающей в себе фермент 50A или 50D. Это изменяет pH текучей среды и заряд на поверхности канала 26. В этом примере, меченый нуклеотид 12A-12C включает в себя обратимый терминатор. В связи с этим, включение меченого нуклеотида 12A-12C служит в качестве терминатора для полимеризации. Это обеспечивает осуществление улучшенного, замедленного или ингибированного формирования кислоты или основания и обнаружения заряда аналогично вышеописанному. В этом примерном способе, мытье и воздействие деблокирующего агента может использоваться для того, чтобы подготавливать считывающую систему 10C к другому циклу секвенирования.
[00172] В любом из примеров, описанных со ссылкой на фиг. 4, следует понимать, что расстояние между полимеразой 28 и соответствующими ферментами 50A, 50D и длина связывающей молекулы 16, 16' могут выбираться таким образом, что метка 18D переходит в позицию поблизости от фермента 50A и/или и 50D, когда ее меченый нуклеотид 12 или 12A-12C включается посредством полимеразы 28. Это обеспечивает прогнозируемые эффекты в отношении реакции формирования кислоты или основания.
[00173] Считывающая система 10D
[00174] Конкретно ссылаясь на фиг. 5, считывающая система 10D включает в себя pH-датчик 20 и комплекс 30C, присоединенный к проводящему каналу 26 pH-датчика 20.
[00175] Комплекс 30C включает в себя полимеразу 28, связанную с координационным комплексом металла ("M"), который должен создавать изменение pH поблизости от проводящего канала 26 в силу потребления вторичного субстрата 34 в текучей среде, которая раскрывается для pH-датчика 20. В комплексе 30C, соотношение полимеразы 28 к координационному комплексу металла M составляет 1:1. Координационный комплекс металла M может присоединяться непосредственно к полимеразе 28, или привязка может сцеплять их между собой.
[00176] Полимераза 28 комплекса 30C может представлять собой любой пример полимеразы, описанной со ссылкой на фиг. 2.
[00177] Координационный комплекс металла 50E является аналогичным ферменту 50A в то, что он формирует кислоту или основание в реакции с вторичным субстратом 34. Примеры координационного комплекса металла включают в себя медные (II) комплексы с лигандами, такими как бис-(2-пиридилметил)-амин или пиридин-функционализированный циклодекстрин.
[00178] В комплексе 30C, полимераза 28 и координационный комплекс металла 50E конъюгируются между собой. Комплекс 30C может формироваться с использованием любого числа способов конъюгирования, таких как реакция сочетания SpyTag/SpyCatcher, конъюгирование цистеина с опосредованным р-фиксатором, биотин/стрептавидин, белок на основе SUMO (малого убиквитин-подобного модификатора), His6/NTA-хелирование с металлом, цистеин/малеимид, дибензоциклооктин (DBCO)/азид или любой другой подходящий способ конъюгирования.
[00179] Комплекс 30C может присоединяться к проводящему каналу 26. В примере, показанном на фиг. 5, координационный комплекс металла 50E присоединяется к поверхности канала 26, и полимераза 28 присоединяется к координационному комплексу металла 50E. В этом примере, присоединение комплекса 30C может осуществляться через привязку 32 (не показана на фиг. 5) либо терминальную группу координационного комплекса металла 50E. В другом примере, полимераза 28 присоединяется к поверхности канала 26, и координационный комплекс металла 50E присоединяется к полимеразе 28. В этом примере, присоединение комплекса 30C может осуществляться через привязку 32 (не показана на фиг. 5), присоединенную к полимеразе 28.
[00180] Хотя не показано, считывающая система 10D также может включать в себя детектор для того, чтобы обнаруживать изменения напряжения и/или тока, которые соответствуют изменению pH, возникающему на/около поверхности считывающего pH-канала 26.
[00181] Также хотя не показано, считывающая система 10D может позиционироваться на опоре, такой как кремниевая микросхема. Электроды 22, 24 могут соединяться с электронной схемой, которая обеспечивает их работу (например, после подключения к детектору и источнику мощности).
[00182] В некоторых примерах, датчик 10D может поступать заранее собранным.
[00183] В других примерах, компоненты датчика могут представлять собой часть комплекта, и компоненты комплекта могут использоваться для того, чтобы собирать датчик 10D. Пример комплекта включает в себя pH-датчик 20 на опоре и текучую среду, которая используется для того, чтобы вводить комплекс 30C в pH-датчик 20. Текучая среда включает в себя жидкость-носитель и комплекс 30C. В примере, жидкость-носитель представляет собой воду или пример низкобуферной текучей среды, такой как солевой цитрат при миллимолярных концентрациях.
[00184] При использовании этих примеров комплекта, пользователь может осаждать текучую среду на опоре и обеспечивать возможность текучей среде оставаться на опоре в течение подходящего времени для присоединения, посредством привязки 32 или терминального конца координационного комплекса металла 50E, комплекса 30C к проводящему каналу 26. Опора может промываться с помощью подходящего буфера для того, чтобы удалять все несвязанные комплексы 30C.
[00185] Некоторые примеры комплекта также могут включать в себя текучую среду(ы), которая должна использоваться со считывающей системой 10D во время считывания одиночных молекул. В этом примере, текучая среда(ы) включает в себя любой пример жидкости-носителя, раскрытой в данном документе, меченых нуклеотидов 12 или 12A-12C и вторичного субстрата 34 (который, в этих примерах, представляет собой отдельную молекулу относительно меченых нуклеотидов 12 или 12A-12C).
[00186] Метка 18E, которая присоединяется к меченым нуклеотидам 12 или 12A-12C, может представлять собой лиганд для металла координационного комплекса металла 50E, при этом лиганд изменяет каталитическое свойство координационного комплекса металла 50E. Лиганд может выбираться с возможностью улучшать кинетику координационного комплекса металла 50E или замедлять кинетику координационного комплекса металла 50E. В этих примерах, метка 18E представляет собой один пример компонента изменения pH, который присоединяется к меченому нуклеотиду 12 или 12A-12C. Этот пример системы 10D в силу этого включает в себя два различных примера компонента изменения pH (например, координационный комплекс металла 50E и метку 18E).
[00187] Другие примеры метки 18E могут функционировать в качестве отдельного катализатора (в дополнение к координационному комплексу металла 50E) для потребления вторичного субстрата 34. Примеры меток 18E, которые функционируют в качестве отдельных катализаторов, включают в себя неметаллические органокатализаторы, такие как диазабициклоундецен, N-гетероциклические карбены, тетраметилгуанидин и т.д. В этих примерах, метка 18E представляет собой один пример компонента изменения pH, который присоединяется к меченому нуклеотиду 12 или 12A-12C. Этот пример системы 10D в силу этого включает в себя два различных примера компонента изменения pH (например, координационный комплекс металла 50E и метку 18E).
[00188] Еще одни другие примеры метки 18E замедляют кинетику координационного комплекса металла 50E и в силу этого также замедляют кинетику реакции формирования кислоты или основания, заключающей в себе координационный комплекс металла 50E и вторичный субстрат 34. Примеры меток 18E, которые замедляют кинетику координационного комплекса металла 50E, могут представлять собой любой лиганд, который ингибирует каталитическую активность металла, либо любой лиганд, который изменяет электронное состояние металла, чтобы изменять каталитическую активность металла. В этих примерах, метка 18E представляет собой один пример компонента изменения pH, который присоединяется к меченому нуклеотиду 12 или 12A-12C. Этот пример системы 10D в силу этого включает в себя два различных примера компонента изменения pH (например, координационный комплекс металла 50E и метку 18E).
[00189] В примере, соответствующие метки 18E, которые присоединяются к различным нуклеотидам 12 или 12A-12C (например, A, T, C, G), могут выбираться с возможностью увеличивать или уменьшать формирование кислоты или основания на различных скоростях. В этом примере, когда один из меченого нуклеотида 12 или 12A-12C включается посредством полимеразы 28, метка 18E переходит в позицию поблизости от координационного комплекса металла 50E и вторичного субстрата 34 и улучшает или замедляет реакцию на уникальной зависимой от метки скорости. В свою очередь, pH в проводящем канале 26 изменяется. Изменение pH коррелируется с повышенным или пониженным формированием кислоты или основания и в силу этого может использоваться для того, чтобы идентифицировать включенный меченый нуклеотид 12 или 12A-12C.
[00190] Поскольку меченые нуклеотиды 12 или 12A-12C не включают в себя вторичный субстрат 34, текучая среда(ы), представленная в примере по фиг. 5, также включает в себя вторичный субстрат 34. Вторичный субстрат 34 может представлять собой любой вторичный субстрат 34, который может реагировать с координационным комплексом металла 50E для того, чтобы формировать кислоту или основание.
[00191] Нижеприведенное описание относится к примерному способу, который заключает в себе меченые нуклеотиды 12 и считывающую систему 10D. В этом примере, матричная полинуклеотидная цепь 44 может вводиться в считывающую систему 10D в текучей среде, такой как биологически стабильный раствор, вместе или отдельно от меченых нуклеотидов 12 и вторичного субстрата 34. Полимераза 28 связывается с матричной полинуклеотидной цепью 44 таким образом, что цепь 44 удерживается на месте. Комплементарное основание одного из меченых нуклеотидов 12 должно включаться в образующуюся цепь 46 (которая формируется вдоль матричной полинуклеотидной цепи 44) посредством полимеразы 28. Во время события включения, метка 18E меченого нуклеотида 12 появляется поблизости от канала 26, координационного комплекса металла 50E и любого вторичного субстрата 34 в текучей среде, которая также находится поблизости от координационного комплекса металла 50E. В некоторых примерах, реакция формирования кислоты или основания с вторичным субстратом 34 может улучшаться, замедляться или ингибироваться в зависимости от лигандной метки 18E и ее эффекта в отношении реакции, заключающей в себе координационный комплекс металла 50E. В других примерах, метка 18E может участвовать в потреблении вторичного субстрата 34 наряду с координационным комплексом металла 50E, за счет этого формируя больше кислоты или основания. Все эти примеры изменяют pH текучей среды и заряд на поверхности канала 26. В этих примерных способах, после включения нуклеотидного основания в образующуюся цепь 46, связь между альфа-фосфатом и связывающей молекулой 16 или между альфа-фосфатом и бета-фосфатом расщепляется естественным путем. В этих примерах, может быть желательным, если связывание лигандной метки 18E является достаточно слабым таким образом, что оно резко ослабевает, когда фосфатная цепь расщепляется естественным путем. Это естественное расщепление обеспечивает возможность метке 18E (и связывающей молекуле 16) диссоциироваться от включенного нуклеотидного основания и диффундировать в направлении от считывающей системы 10D. Полимераза 28 затем может принимать другой меченый нуклеотид 12, который включает в себя нуклеотидное основание, которое является комплементарным следующему нуклеотиду в матричной полинуклеотидной цепи 44.
[00192] Нижеприведенное описание относится к примерному способу, который заключает в себе меченые нуклеотиды 12A-12C и считывающую систему 10D. В этом примере, матричная полинуклеотидная цепь 44 может вводиться в считывающую систему 10D в текучей среде, такой как биологически стабильный раствор, вместе или отдельно от меченых нуклеотидов 12A-12C и вторичного субстрата 34. Полимераза 28 связывается с матричной полинуклеотидной цепью 44 таким образом, что цепь 44 удерживается на месте. Комплементарное основание одного из меченых нуклеотидов 12A-12C должно включаться в образующуюся цепь 46 (которая формируется вдоль матричной полинуклеотидной цепи 44) посредством полимеразы 28. В некоторых примерах, реакция формирования кислоты или основания с вторичным субстратом 34 может улучшаться, замедляться или ингибироваться в зависимости от лигандной метки 18E и ее эффекта в отношении реакции, заключающей в себе координационный комплекс металла 50E. В других примерах, метка 18E может участвовать в потреблении вторичного субстрата 34 наряду с координационным комплексом металла 50E, за счет этого формируя больше кислоты или основания. Все эти примеры изменяют pH текучей среды и заряд на поверхности канала 26. В этом примере, меченый нуклеотид 12A-12C включает в себя обратимый терминатор. В связи с этим, включение меченого нуклеотида 12A-12C служит в качестве терминатора для полимеризации. Это обеспечивает осуществление улучшенного, замедленного или ингибированного формирования кислоты или основания и обнаружения заряда аналогично вышеописанному. В этом примерном способе, мытье и воздействие деблокирующего агента может использоваться для того, чтобы подготавливать считывающую систему 10D к другому циклу секвенирования.
[00193] В любом из примеров, описанных со ссылкой на фиг. 5, следует понимать, что расстояние между полимеразой 28 и координационным комплексом металла 50E и длина связывающей молекулы 16, 16' могут выбираться таким образом, что метка 18E переходит в позицию поблизости от координационного комплекса металла 50E, когда ее меченый нуклеотид 12 или 12A-12C включается посредством полимеразы 28. Это обеспечивает прогнозируемые эффекты в отношении реакции формирования кислоты или основания.
[00194] Считывающая система 10E
[00195] Конкретно ссылаясь на фиг. 6A и фиг. 6B, считывающая система 10D включает в себя pH-датчик 20 и комплекс 30D, присоединенный к проводящему каналу 26 pH-датчика 20.
[00196] Комплекс 30D включает в себя полимеразу 28, связанную с ферментом 50A. В этом примере, комплекс 30D дополнительно включает в себя конъюгат 58 нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента, присоединенный к ферменту 50A.
[00197] Полимераза 28 комплекса 30D может представлять собой любые примеры полимеразы, описанной со ссылкой на фиг. 2.
[00198] Фермент 50A может представлять собой любой пример фермента, описанного со ссылкой на фиг. 3A и фиг. 3B.
[00199] Конъюгат 58 нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента включает в себя одноцепочечную ДНК или РНК, имеющую две области, которые являются комплементарными и которые подвергаются внутримолекулярному спариванию оснований, чтобы формировать двойную винтовую спираль, которая завершается в непарном контуре. Один конец непарного контура присоединяется к ферменту 50A, и другой конец непарного контура включает в себя ингибитор 60 фермента. В контурной конфигурации, как показано на фиг. 6A, ингибитор 60 фермента, по меньшей мере, уменьшает активность фермента.
[00200] В комплексе 30D, фермент 50A и конъюгат 58 нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента конъюгируются между собой, и фермент 50A также конъюгируется с полимеразой 28.
[00201] Комплекс 30D может присоединяться к проводящему каналу 26 через привязку 32, примеры которой описываются со ссылкой на фиг. 2. Альтернативно, комплекс 30D может непосредственно присоединяться через связывание между компонентом 50A изменения pH и группами на поверхности проводящего канала 26.
[00202] Хотя не показано, считывающая система 10E также может включать в себя детектор для того, чтобы обнаруживать изменения напряжения и/или тока, которые соответствуют изменению pH, возникающему на/около поверхности считывающего pH-канала 26.
[00203] Также хотя не показано, считывающая система 10E может позиционироваться на опоре, такой как кремниевая микросхема. Электроды 22, 24 могут соединяться с электронной схемой, которая обеспечивает их работу (например, после подключения к детектору и источнику мощности).
[00204] В некоторых примерах, датчик 10E может поступать заранее собранным.
[00205] В других примерах, компоненты датчика могут представлять собой часть комплекта, и компоненты комплекта могут использоваться для того, чтобы собирать датчик 10E. Пример комплекта включает в себя pH-датчик 20 на опоре и текучую среду, которая используется для того, чтобы вводить комплекс 30D в pH-датчик 20. Текучая среда включает в себя жидкость-носитель и комплекс 30D. В некоторых примерах, комплекс 30D в текучей среде присоединяется к привязке 32. В других примерах, привязка 32 присоединяется к считывающему pH-каналу 26 в качестве части считывающей системы 10E. В еще одних других примерах, в которых имеется прямая связь, созданная между компонентом 50A изменения pH и поверхностными группами канала 26, следует понимать, что комплекс 30D в текучей среде не присоединяется к привязке 32, и привязка 32 не присоединяется к считывающему pH-каналу 26. В примере, жидкость-носитель представляет собой воду или пример низкобуферной текучей среды, такой как солевой цитрат при миллимолярных концентрациях.
[00206] При использовании этих примеров комплекта, пользователь может осаждать текучую среду на опоре и обеспечивать возможность текучей среде оставаться на опоре в течение подходящего времени для присоединения, посредством привязки 32, комплекса 30D к проводящему каналу 26, для присоединения, посредством комплекса 30D, к привязке 32 на канале 26, либо для связывания, посредством компонента 50A изменения pH, с поверхностными группами канала 26. Опора может промываться с помощью подходящего буфера для того, чтобы удалять все несвязанные комплексы 30D.
[00207] Некоторые примеры комплекта также могут включать в себя текучую среду(ы), которая должна использоваться со считывающей системой 10E во время считывания одиночных молекул. В этом примере, текучая среда(ы) включает в себя любой пример жидкости-носителя, раскрытой в данном документе, меченых нуклеотидов 12 или 12A-12C и вторичного субстрата 34 (который, в этих примерах, представляет собой отдельную молекулу относительно меченых нуклеотидов 12 или 12A-12C).
[00208] Метка 18F, которая присоединяется к меченым нуклеотидам 12 или 12A-12C, представляет собой цепь нуклеотидов, включающих в себя основания, комплементарные, по меньшей мере, некоторым нуклеотидным основаниям конъюгата 58 нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента. Метка 18F допускает инициирование реакции для открытия шпильки и затем спаривание оснований с частью одной ДНК- или РНК-цепи конъюгата 58 нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента. Как показано на фиг. 6B, введение и реакция метки 18F перемещает ингибитор 60 фермента в направлении от фермента 50A, за счет этого обеспечивая его ферментативную активность. Поскольку метка 18F может затрагивать ферментативную активность, которая приводит к формированию кислоты или основания, она также представляет собой один пример компонента изменения pH. Реакция формирования кислоты или основания с вторичным субстратом 34 может осуществляться, когда метка 18F открывает конъюгат 58 нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента, приводя к изменению pH на поверхности проводящего канала 26. Открытие и закрытие шпильки может представлять собой быстрый процесс, приводящий к усредненному уровню ингибирования полимеразы 28. Таким образом, различные уровни активности или ингибирования могут достигаться с использованием различного числа комплементарных оснований, за счет этого обеспечивая различение оснований.
[00209] Поскольку меченые нуклеотиды 12 или 12A-12C не включают в себя вторичный субстрат 34, текучая среда(ы), представленная в примере по фиг. 6A и 6B, также включает в себя вторичный субстрат 34. Вторичный субстрат 34 может представлять собой любой вторичный субстрат 34, который может реагировать с ферментом 50A для того, чтобы формировать кислоту или основание.
[00210] Нижеприведенное описание относится к примерному способу, который заключает в себе меченые нуклеотиды 12 и считывающую систему 10E. В этом примере, матричная полинуклеотидная цепь 44 может вводиться в считывающую систему 10E в текучей среде, такой как биологически стабильный раствор, вместе или отдельно от меченых нуклеотидов 12 и вторичного субстрата 34. Полимераза 28 связывается с матричной полинуклеотидной цепью 44 таким образом, что цепь 44 удерживается на месте. Комплементарное основание одного из меченых нуклеотидов 12 должно включаться в образующуюся цепь 46 (которая формируется вдоль матричной полинуклеотидной цепи 44) посредством полимеразы 28. Во время события включения, метка 18F меченого нуклеотида 12 появляется поблизости от канала 26, конъюгата 58 нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента и любого вторичного субстрата 34 в текучей среде, которая также находится поблизости от конъюгата 58 нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента. Метка 18F открывает конъюгат 58 нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента, что обеспечивает возможность ферменту 50A реагировать с вторичным субстратом 34 для того, чтобы формировать кислоту или основание. Это изменяет pH текучей среды и заряд на поверхности канала 26. В этом примерном способе, после включения нуклеотидного основания в образующуюся цепь 46, связь между альфа-фосфатом и связывающей молекулой 16 или между альфа-фосфатом и бета-фосфатом расщепляется естественным путем. В этих примерах, может быть желательным, если связывание лигандной метки 18F является достаточно слабым таким образом, что оно резко ослабевает, когда фосфатная цепь расщепляется естественным путем. Это естественное расщепление обеспечивает возможность метке 18F (и связывающей молекуле 16) диссоциироваться от включенного нуклеотидного основания и диффундировать в направлении от считывающей системы 10E. Конъюгат 58 нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента возвращается в позицию-первоисточник контура, за счет этого снова, по меньшей мере, частично ингибируя активность фермента 50A. Полимераза 28 затем может принимать другой меченый нуклеотид 12, который включает в себя нуклеотидное основание, которое является комплементарным следующему нуклеотиду в матричной полинуклеотидной цепи 44.
[00211] Нижеприведенное описание относится к примерному способу, который заключает в себе меченые нуклеотиды 12A-12C и считывающую систему 10E. В этом примере, матричная полинуклеотидная цепь 44 может вводиться в считывающую систему 10C в текучей среде, такой как биологически стабильный раствор, вместе или отдельно от меченых нуклеотидов 12A-12C и вторичного субстрата 34. Полимераза 28 связывается с матричной полинуклеотидной цепью 44 таким образом, что цепь 44 удерживается на месте. Комплементарное основание одного из меченых нуклеотидов 12A-12C должно включаться в образующуюся цепь 46 (которая формируется вдоль матричной полинуклеотидной цепи 44) посредством полимеразы 28. Метка 18F открывает конъюгат 58 нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента, что обеспечивает возможность ферменту 50A реагировать с вторичным субстратом 34 для того, чтобы формировать кислоту или основание. Это изменяет pH текучей среды и заряд на поверхности канала 26. В этом примере, меченый нуклеотид 12A-12C включает в себя обратимый терминатор. В связи с этим, включение меченого нуклеотида 12A-12C служит в качестве терминатора для полимеризации. Это обеспечивает осуществление формирования кислоты или основания и обнаружения заряда аналогично вышеописанному. В этом примерном способе, мытье и воздействие деблокирующего агента может использоваться для того, чтобы подготавливать считывающую систему 10E к другому циклу секвенирования.
[00212] В любом из примеров, описанных со ссылкой на фиг. 6A и 6B, следует понимать, что расстояние между полимеразой 28 и конъюгатом 58 нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента и длина связывающей молекулы 16, 16' могут выбираться таким образом, что метка 18F переходит в позицию поблизости от конъюгата 58 нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента, когда ее меченый нуклеотид 12 или 12A-12C включается посредством полимеразы 28. Это обеспечивает прогнозируемые эффекты в отношении реакции формирования кислоты или основания.
[00213] Решетки считывающих систем
[00214] Любой пример считывающих систем 10A-10E для одиночных молекул может включаться в решетку таких считывающих систем. В некоторых примерах, решетка может включать в себя несколько считывающих систем 10A-10E, каждая из которых позиционируется на опоре и сконфигурирована с помощью электронной схемы таким образом, что она является отдельно адресуемой и считываемой. В примере, каждая считывающая система 10A-10E решетки может позиционироваться на опоре в отдельном углублении. Углубления физически отделяют каждую из считывающих систем 10A-10E, что, по меньшей мере, уменьшает перекрестное загрязнение градиентов pH со смежными считывающими системами 10A-10E. Решетка считывающих систем 10A-10E может представлять собой часть проточной кюветы 62, пример которой проиллюстрирован на фиг. 7A. В этом примере, проточная кювета 62 включает в себя проточные каналы 64. Хотя несколько проточных каналов 64 показаны, следует понимать, что любое число каналов 64 может включаться в проточную кювету 62 (например, один канал 64, четыре канала 64 и т.д.). Каждый проточный канал 64 представляет собой зону, заданную между двумя связанными компонентами (например, подложкой и крышкой либо двумя подложками), которые могут иметь текучие среды (например, текучие среды, описанные в данном документе), введенные в них и удаленные из них. Каждый проточный канал 64 может изолироваться от другого проточного канала 64 таким образом, что текучая среда, введенная в любой конкретный проточный канал 64, не протекает ни в один смежный проточный канал 64. Некоторые примеры текучих сред, введенных в проточные каналы 64, могут вводить компоненты реакции (например, комплексы 30A-30D, меченые нуклеотиды 12, 12A-12C, 12' и т.д.), промывочные растворы, деблокирующие агенты и т.д.
[00215] Пример архитектуры в проточных каналах 64 проточной кюветы 62 показан на фиг. 7B.
[00216] В примере, показанном на фиг. 7B, проточная кювета 64 включает в себя опору 66 и материал 68 с рисунком, позиционированный на опоре 66. Материал 68 с рисунком задает углубления 70, отделенные посредством промежуточных областей 72. В этом примере, поверхность опоры 66 раскрывается в каждом из углублений 70, и считывающая система 10A-10E позиционируется на поверхности.
[00217] Опора 66 на фиг. 7B предоставляет опору для других компонентов проточной кюветы 62. Опора 66, в общем, является жесткой и является нерастворимой в водной жидкости. Примеры подходящих опор 66 включают в себя эпоксилоксан, стекло, модифицированное стекло, пластмассу, нейлон, керамику/керамические оксиды, диоксид кремния (оксид кремния (SiO2)), плавленый кварц, материалы на основе диоксида кремния, силикат алюминия, кремний, модифицированный кремний (например, легированный бором p+-кремний), нитрид кремния (Si3N4), пентоксид тантала (TaO5) или другой оксид(ы) тантала (TaOx), оксид гафния (HfO2), неорганические стекла и т.п. Некоторые примеры подходящей пластмассы для подложки 14 включают в себя акриловые полимеры, полистирол, сополимеры стирола и других материалов, полипропилен, полиэтилен, полибутилен, полиуретаны, политетрафторэтилен (такой как тефлон® компании Chemours), циклические олефины/циклоолефиновые полимеры (COP) (такие как зеонор® компании Zeon), полиимиды и т.д. Опора также может представлять собой стекло или кремний с покровным слоем из оксида тантала или другого керамического оксида на поверхности.
[00218] Форма опоры 66 может представлять собой слоистую пластину, панель, прямоугольный лист, штамп или любую другую подходящую конфигурацию. В примере, опора 66 может представлять собой круглую слоистую пластину или панель, имеющую диаметр в пределах приблизительно от 2 мм приблизительно до 300 мм. В качестве более конкретного примера, опора 66 представляет собой слоистую пластину, имеющей диаметр в пределах приблизительно от 200 мм приблизительно до 300 мм. В другом примере, опора 66 может представлять собой прямоугольный лист или панель, имеющую наибольшую размерность приблизительно вплоть до 10 футов (~3 метра). В качестве конкретного примера, опора 66 представляет собой штамп, имеющий ширину в пределах приблизительно от 0,1 мм приблизительно до 10 мм. Хотя предоставлены примерные размерности, следует понимать, что может использоваться опора 66 с любыми подходящими размерностями.
[00219] В примере, показанном на фиг. 7B, материал 68 с рисунком позиционируется на опоре 66. Следует понимать, что любой материал, который может избирательно осаждаться либо осаждаться и формировать рисунок, чтобы формировать углубления 70 и промежуточные области 72, может использоваться для материала 68 с рисунком.
[00220] В качестве одного примера, неорганический оксид может избирательно применяться к опоре 66 через осаждение из паровой фазы, аэрозольную печать или струйную печать. Примеры подходящих неорганических оксидов включают в себя оксид тантала (например, Ta2O5), оксид алюминия (например, Al2O3), оксид кремния (например, SiO2), оксид гафния (например, HfO2) и т.д.
[00221] В качестве другого примера, смола может применяться к опоре 66 и затем формировать рисунок. Подходящие технологии осаждения включают в себя химическое осаждение из паровой фазы, нанесение покрытия погружением, нанесение покрытия маканием, нанесение покрытия методом центрифугирования, нанесение покрытия распылением, разлив из ванночки, нанесение покрытия ультразвуковым распылением, нанесение покрытия ножевым устройством, аэрозольную печать, трафаретную печать, микроконтактную печать и т.д. Подходящие технологии формирования рисунка включают в себя фотолитографию, литографию на основе нановпечатывания (NIL), технологии штамповки, технологии тиснения, технологии формования, технологии микротравления, технологии печати и т.д., Некоторые примеры подходящих смол включают в себя смолу на основе полиэдральных олигомерных силсесквиоксанов (POSS), эпоксидную смолу не на основе POSS, поли(этиленгликольную) смолу, полиэфирную смолу (например, эпоксиды с раскрытием кольца), акриловую смолу, акрилатную смолу, метакрилатную смолу, аморфную фторполимерную смолу (например, цитоп® компании Bellex) и комбинации вышеозначенного.
[00222] При использовании в данном документе, термин "полиэдральный олигомерный силсесквиоксан (POSS)" означает химический состав, который представляет собой гибридное промежуточное соединение (например, RSiO1.5) между диоксидом кремния (SiO2) и силиконом (R2SiO). Пример POSS может представлять собой POSS, описанный в работе авторов Kehagias и др., "Microelectronic Engineering 86" (2009 год), стр. 776-778, которая полностью содержится по ссылке. В примере, состав представляет собой кремнийорганическое соединение с химической формулой [RSiO3/2]n, в котором R-группы могут быть идентичными или отличающимися. Примерные R-группы для POSS включают в себя эпоксид, азид/азидо, тиол, поли(этиленгликоль), норборнен, тетразин, акрилаты и/или метакрилаты или дополнительно, например, алкильные, арильные, алкоксильные и/или галогеналкильные группы. Состав на основе смолы, раскрытый в данном документе, может содержать одну или более различных клеточных или сердцевинных структур в качестве мономерных звеньев.
[00223] В качестве еще одного другого примера, материал 68 с рисунком может представлять собой буферный pH-материал. Буферный pH-материал имеет высокую буферную pH-емкость, которая обеспечивает использование текучей среды с низкой буферной концентрацией раствора. Пример высокой буферной pH-емкости может составлять в пределах приблизительно от 0,01 мэкв/г приблизительно до 2 мэкв/г. Пример буферного pH-материала представляет собой SiCOH, который имеет большую площадь поверхности и высокую буферную емкость. В примерах, в которых материал 68 с рисунком не представляет собой буферный pH-материал, боковые стенки углублений 70 могут покрываться буферным pH-материалом, чтобы обеспечивать высокую буферную pH-емкость для каждого из углублений 70.
[00224] Как показано на фиг. 7B, материал 68 с рисунком включает в себя углубления 70, заданные в нем, и промежуточные области 72, разделяющие смежные углубления 70. Может быть предусмотрено множество различных схем размещения углублений 70, включающих в себя регулярные, повторяющиеся и нерегулярные рисунки. В примере, углубления 70 располагаются в шестиугольной сетке для плотной упаковки и повышенной плотности. Другие схемы размещения могут включать в себя, например, прямолинейные (прямоугольные) схемы размещения, треугольные схемы размещения и т.д. В некоторых примерах, схема размещения или рисунок может представлять собой x-y формат углублений 70, которые находятся в строках и столбцах. В некоторых других примерах, схема размещения или рисунок может представлять собой повторяющуюся компоновку углублений 70 и/или промежуточных областей 72. В еще одних других примерах, схема размещения или рисунок может представлять собой случайную компоновку углублений 70 и/или промежуточных областей 72. Рисунок может включать в себя точки, подушки, лунки, столбцы, полоски, завитки, линии, треугольники, прямоугольники, окружности, дуги, галочки, клеточки, диагонали, стрелки, квадраты и/или штриховки.
[00225] Схема размещения или рисунок углублений 70 может характеризоваться относительно плотности углублений 70 (числа углублений 70) в заданной зоне. Например, углубления 70 могут присутствовать с плотностью приблизительно в 2 миллиона на мм2. Плотность может подстраиваться как различные плотности, включающие в себя, например, плотность приблизительно в 100 на мм2, приблизительно в 1000 на мм2, приблизительно в 0,1 миллиона на мм2, приблизительно в 1 миллион на мм2, приблизительно в 2 миллиона на мм2, приблизительно в 5 миллионов на мм2, приблизительно в 10 миллионов на мм2, приблизительно в 50 миллионов на мм2 либо больше или меньше. Дополнительно следует понимать, что плотность углублений 70 в материале 68 с рисунком может находиться между одним из нижних значений и одним из верхних значений, выбранных из вышеприведенных диапазонов. В качестве примеров, решетка высокой плотности может характеризоваться как имеющая углубления 70, разделенные менее чем приблизительно на 100 нм, решетка средней плотности может характеризоваться как имеющая углубления 20, разделенные на приблизительно от 400 нм приблизительно до 1 мкм, и решетка низкой плотности может характеризоваться как имеющая углубления 70, разделенные более чем приблизительно на 1 мкм. Хотя примерные плотности предоставлены, следует понимать, что могут использоваться любые подходящие плотности. Плотность углублений 70 может зависеть, частично, от глубины углублений 70 и диффузионной способности сформированной кислоты или основания. В некоторых случаях, может быть желательным, если разнесение между углублениями составляет еще больше, чем в примерах, перечисленных в данном документе.
[00226] Схема размещения или рисунок углублений 70 также или альтернативно может характеризоваться с точки зрения среднего шага или разнесения от центра углубления 70 до центра смежного углубления 70 (межцентрового разнесения) или от края одного углубления 70 до края смежного углубления 70 (межкраевого разнесения). Рисунок может быть регулярным таким образом, что коэффициент вариации вокруг среднего шага является небольшим, или рисунок может быть нерегулярным, причем в этом случае коэффициент вариации может быть относительно большим. В любом случае, средний шаг, например, может составлять приблизительно 50 нм, приблизительно 0,1 мкм, приблизительно 0,5 мкм, приблизительно 1 мкм, приблизительно 5 мкм, приблизительно 10 мкм, приблизительно 100 мкм либо больше или меньше. Средний шаг для конкретного рисунка углублений 20 может находиться между одним из нижних значений и одним из верхних значений, выбранных из вышеприведенных диапазонов. В примере, углубления 20 имеют шаг (межцентровое разнесение) приблизительно в 1,5 мкм. Хотя предоставлены примерные средние значения шага, следует понимать, что могут использоваться другие средние значения шага.
[00227] Размер каждого углубления 70 может характеризоваться посредством его объема, площади отверстия, глубины и/или диаметра.
[00228] Каждое углубление 70 может иметь любой объем, который допускает ограничение текучей среды. Минимальный объем или максимальный объем может выбираться, например, с возможностью приспосабливать пропускную способность (например, мультиплексируемость), разрешение, меченые нуклеотиды 12, 12A-12C или 12', вторичные субстраты 34 или реактивность аналитов, ожидаемую для нижерасположенных вариантов использования проточной кюветы 62. Например, объем может составлять, по меньшей мере, приблизительно 1*10-3 мкм3, по меньшей мере, приблизительно 1*10-2 мкм3, по меньшей мере, приблизительно 0,1 мкм3, по меньшей мере, приблизительно 1 мкм3, по меньшей мере, приблизительно 10 мкм3, по меньшей мере, приблизительно 100 мкм3 или больше. Альтернативно или дополнительно, объем может составлять самое большее приблизительно 1*104 мкм3, самое большее приблизительно 1*103 мкм3, самое большее приблизительно 100 мкм3, самое большее приблизительно 10 мкм3, самое большее приблизительно 1 мкм3, самое большее приблизительно 0,1 мкм3 или меньше. Площадь, занимаемая посредством каждого отверстия углубления, может выбираться на основе критериев, аналогичных критериям, изложенным выше для объема. Например, площадь для каждого отверстия углубления может составлять, по меньшей мере, приблизительно 1*10-3 мкм2, по меньшей мере, приблизительно 1*10-2 мкм2, по меньшей мере, приблизительно 0,1 мкм2, по меньшей мере, приблизительно 1 мкм2, по меньшей мере, приблизительно 10 мкм2, по меньшей мере, приблизительно 100 мкм2 или больше. Альтернативно или дополнительно, площадь может составлять самое большее приблизительно 1*103 мкм2, самое большее приблизительно 100 мкм2, самое большее приблизительно 10 мкм2, самое большее приблизительно 1 мкм2, самое большее приблизительно 0,1 мкм2, самое большее приблизительно 1*10-2 мкм2 или меньше. Площадь, занимаемая посредством каждого отверстия углубления, может быть больше, меньше или составлять между значениями, указываемыми выше.
[00229] Глубина каждого углубления 70 может быть достаточно большой для того, чтобы размещать одну считывающую систему 10A-10E. В примере, глубина может составлять, по меньшей мере, приблизительно 1 мкм, по меньшей мере, приблизительно 10 мкм, по меньшей мере, приблизительно 100 мкм или больше. Альтернативно или дополнительно, глубина может составлять самое большее приблизительно 1*103 мкм, самое большее приблизительно 100 мкм, самое большее приблизительно 10 мкм или меньше. Глубина каждого углубления 70 может составлять больше, меньше или между значениями, указываемыми выше.
[00230] В некоторых случаях, диаметр или длина и ширина каждого углубления 70 могут составлять, по меньшей мере, приблизительно 50 нм, по меньшей мере, приблизительно 0,1 мкм, по меньшей мере, приблизительно 0,5 мкм, по меньшей мере, приблизительно 1 мкм, по меньшей мере, приблизительно 10 мкм, по меньшей мере, приблизительно 100 мкм или больше. Альтернативно или дополнительно, диаметр или длина и ширина могут составлять самое большее приблизительно 1*103 мкм, самое большее приблизительно 100 мкм, самое большее приблизительно 10 мкм, самое большее приблизительно 1 мкм, самое большее приблизительно 0,5 мкм, самое большее приблизительно 0,1 мкм или меньше (например, приблизительно 50 нм). Диаметр или длина и ширина каждого углубления 70 могут составлять больше, меньше или между значениями, указываемыми выше.
[00231] Как проиллюстрировано на фиг. 7B, каждое из углублений 70 в решетке включает в себя соответствующий датчик 10A-10E. Желательно, если каждый датчик 10A-10E в каждом углублении 70 имеет одну полимеразу 28, отдельно или в качестве части комплекса 30A-30D, присоединенного к нему. В некоторых примерах, каждый датчик 10A-10E в каждом углублении 70 имеет одну полимеразу 28 или комплекс 30A-30D, присоединенный к нему. В других примерах, некоторые датчики 10A-10E в некоторых углублениях 70 имеют одну полимеразу 28 или комплекс 30A-30D, присоединенный к ним; другие датчики 10A-10E в других углублениях 70 имеют более одной полимеразы 28 или комплекса 30A-30D, присоединенных к ним; и еще другие датчики 10A-10E в других углублениях 70 не имеют полимеразы 28 или комплекса 30A-30D, присоединенного к ним. В этих примерах, число полимераз 28 или комплексов 30A-30D, которые становятся присоединенными к любой данной считывающей системе 10A-10E, может быть случайным и определяться посредством пуассоновского распределения.
[00232] Чтобы присоединять полимеразы 28 или комплексы 30A-30D, способ включает в себя введение текучей среды в решетку датчиков, включающую в себя множество отдельно адресуемых проводящих каналов 26, за счет этого присоединяя полимеразу 28 или комплекс 30A-30D, по меньшей мере, к некоторым из множества отдельно адресуемых проводящих каналов 26, комплекс 30A-30D, включающий в себя полимеразу 28 и другие примеры компонента 50A-50E изменения pH, связанного с полимеразой 28, причем компонент 50A-50E изменения pH выбирается из группы, состоящей из фермента 50A, который должен катализировать потребление вторичного субстрата 34 в растворе, который должен быть доступным для решетки датчиков, координационного комплекса металла 50E, который должен катализировать потребление вторичного субстрата 34 в растворе, который должен быть доступным для решетки датчиков, и кофактора 50B или активатора 50C каталитической метки, присоединенной к меченому нуклеотиду, который должен вводиться в решетку датчиков. Текучей среде может разрешаться инкубироваться в течение требуемого времени и при требуемой температуре, чтобы обеспечивать возможность полимеразам 28 или комплексам 30A-30D присоединяться.
[00233] В ходе любых примеров способов, раскрытых в данном документе для считывания одиночных молекул, один из меченых нуклеотидов 12 или 12A-12C или 12' включается, посредством соответствующей полимеразы 28, в образующуюся цепь 46, которая формируется в считывающей системе 10A-10E в каждом из углублений 70. Другими словами, в каждой матричной полинуклеотидной цепи 44 в проточной кювете 62, соответствующие полимеразы 28 расширяют образующуюся цепь 46 посредством одного из нуклеотидов 12, 12A-12C или 12', присутствующих во введенной текучей среде.
[00234] Каждый из датчиков 10A-10E является отдельно электрически адресуемым и считываемым. В связи с этим, сигналы заряда, получающиеся в результате изменений pH, возникающих в каждом углублении 70, в ответ на потребление вторичного субстрата 34, могут отдельно обнаруживаться и анализироваться, чтобы идентифицировать включенный меченый нуклеотид 12, 12A-12C или 12'. Реакция формирования кислоты или основания, возникающая в каждом углублении, должна зависеть от комбинации меток 18A-18F и полимераз 28 либо комплексов 30A-30D, которая используется, примеры которой описываются со ссылкой на фиг. 3A и фиг. 3B, фиг. 4, фиг. 5 и фиг. 6A и фиг. 6B.
[00235] Обнаружение ансамблей
[00236] Другие примеры считывающих систем 40A и 40B показаны на фиг. 7C и фиг. 7D, и эти считывающие системы 40A и 40B могут использоваться при считывании ансамблей. В этих примерах, считывающие системы 40A и 40B могут позиционироваться в каждом из углублений 70 проточной кюветы 62. Проточная кювета 62 включает в себя каналы 64, опору 66, материал 68 с рисунком и материал 68 с рисунком, как описано в данном документе.
[00237] В примере, показанном на фиг. 7C, считывающая система 40A включает в себя pH-датчик 20 и праймеры 74, присоединенные к проводящему каналу 26 pH-датчика 20, и/или к поверхности опоры 66, доступной в каждом углублении 70.
[00238] Поверхность опоры 66, доступная в углублениях 70, может функционализироваться таким образом, что праймеры 74 могут присоединяться к поверхности, а не к промежуточным областям 72 материала 68 с рисунком. В некоторых примерах, функционализация поверхности подложки заключает в себе силанизацию поверхности, доступной в углублениях 70, и формирование полимерного слоя на силанизированной поверхности. Силанизация может осуществляться с использованием любого силана или производного силана. Полимер (не показан) затем может применяться к силанизированной поверхности. Полимер может представлять собой полужесткий полимерный материал, который является проницаемым для жидкостей и газов. Пример полимера включает в себя акриламидный сополимер, такой как поли-(N-(5-азидоацетамидилпентил)-акриламид-со-акриламид, PAZAM или другой подходящий полимерный гидрогель.
[00239] Праймеры 74 могут представлять собой любой прямой праймер амплификации или обратный праймер амплификации, который включает в себя функциональную группу, которая может присоединяться к поверхности проводящего канала 26 и/или к поверхности опоры 66. Примеры подходящих терминальных по функциональной группе праймеров включают в себя алкинотерминальный праймер, тетразинотерминальный праймер, азидотерминальный праймер, аминотерминальный праймер, эпокси- или глицидилотерминальный праймер, тиофосфатнотерминальный праймер, тиолотерминальный праймер, альдегидотерминальный праймер, гидразинотерминальный праймер и триазолиндионотерминальный праймер. Также может использоваться смесь праймеров. Конкретные примеры подходящих праймеров включают в себя P5- и/или P7-праймеры, которые используются на поверхности некоторых коммерческих проточных ячеек, продаваемых компанией Illumina Inc.
[00240] В примере, праймеры 74 могут присоединяться с использованием процесса прикрепления, такого как поток через осаждение (например, когда проточная кювета 62 имеет крышку, связанную с ней), нанесение покрытия маканием, нанесение покрытия распылением, разлив из ванночки, либо посредством другого подходящего способа, который должен присоединять праймер(ы) 74. Каждая из этих примерных технологий может использовать праймерный раствор или смесь, который может включать в себя праймер(ы), воду, буфер (например, соляной раствор) и катализатор.
[00241] В примере, показанном на фиг. 7D, считывающая система 40B включает в себя планарный проводящий канал 26' и праймеры 74, присоединенные к планарному проводящему каналу 26'. Планарный проводящий канал 26' может представлять собой любой материал, который допускает считывание заряженных ионов, либо который включает в себя поверхностные группы, которые могут протонироваться или депротонироваться посредством заряженных ионов, сформированных во время реакций формирования кислоты или основания, раскрытых в данном документе. Планарный проводящий канал 26' соединяется с электродами 22, 24 (не показаны на фиг. 7D), которые могут интегрироваться в опору 66 и соединяться с электронной схемой, которая обеспечивает их работу. Любой из праймеров 74 может использоваться и может присоединяться, как описано в данном документе. Кроме того, если планарный проводящий канал 26' имеет поверхностные группы, которые могут присоединять праймеры 74, дополнительная функционализация планарного проводящего канала 26' может не выполняться.
[00242] Эти примеры проточной кюветы 62 могут использоваться для секвенирования ансамблей. При секвенировании ансамблей, матричная полинуклеотидная цепь 44 (не показана на фиг. 7C и фиг. 7D), которая должна секвенироваться, может формироваться на поверхности проточной кюветы с использованием праймеров 74. В начале образования матричной полинуклеотидной цепи, библиотечные матрицы могут подготавливаться из любого образца нуклеиновой кислоты (например, ДНК-образца или РНК-образца). Образец нуклеиновой кислоты может компонентироваться на одноцепочечные ДНК- или РНК-компоненты аналогичного размера (например, <1000 bp). Во время подготовки, адаптеры могут добавляться на концы этих компонентов. Через амплификацию с сокращенным циклом, различные мотивы могут вводиться в адаптерах, такие как связывающие участки секвенирования, индексы и области, которые являются комплементарными праймерам 74 в углублениях 70. Конечные библиотечные матрицы включают в себя ДНК- или РНК-компонент и адаптеры на обоих концах. В некоторых примерах, компоненты из одного образца нуклеиновой кислоты имеют идентичные адаптеры, добавленные в них.
[00243] Множество библиотечных матриц могут вводиться в проточную кювету 62. Поскольку проточная кювета 62 включает в себя решетку углублений 70, несколько библиотечных матриц гибридизируются, например, в один из двух типов праймеров 74, иммобилизированных в них.
[00244] После этого может выполняться формирование кластеров. В одном примере формирования кластеров, библиотечные матрицы копируются из гибридизированных праймеров 74 посредством 3'-расширения с использованием высокоточной ДНК-полимеразы. Исходные библиотечные матрицы денатурируются, оставляя копии, иммобилизированные в углублениях 70. Изотермическая мостиковая амплификация может использоваться для того, чтобы амплифицировать иммобилизированные копии. Например, скопированные матрицы образуют контур для того, чтобы гибридизироваться в смежный комплементарный праймер 74, и полимераза копирует скопированные матрицы для того, чтобы формировать двухцепочечные мостики, которые денатурируются таким образом, что они формируют две одноцепочечных цепи. Эти две цепи образуют контур и гибридизируются в смежные комплементарные праймеры 74 и снова расширяются таким образом, что они формируют два новых двухцепочечных контура. Процесс повторяется для каждой копии матрицы посредством циклов изотермической денатурации и амплификации, чтобы создавать плотные клоновые кластеры. Каждый кластер двухцепочечных мостиков денатурируется. В примере, обратная цепь удаляется посредством расщепления конкретного основания, оставляя прямые матричные полинуклеотидные цепи. Кластеризация приводит в результате к образованию нескольких матричных полинуклеотидных цепей 44 в каждом углублении 70. Этот пример кластеризации представляет собой мостиковую амплификацию и представляет собой один пример амплификации, которая может выполняться. Следует понимать, что могут использоваться другие технологии амплификации, такие как поток обработки для амплификации исключения (Examp) (Illumina Inc.).
[00245] Чтобы инициировать секвенирование, смесь для включения может добавляться в проточную кювету 62.
[00246] В одном примере, смесь для включения включает в себя жидкость-носитель, любой пример комплекса 30A-30D, раскрытого в данном документе, и любой пример меченого нуклеотида 12 или 12A-12C. Комплекс 30A-30D включает в себя полимеразу 28 и компонент 50A-50E изменения pH, связанный с полимеразой 28, причем компонент 50A-50E изменения pH выбирается из группы, состоящей из фермента 50A, который должен катализировать потребление вторичного субстрата 34, координационного комплекса металла 50D, который должен катализировать потребление вторичного субстрата 34, и кофактора 50B или активатора 50C, который должен катализировать потребление вторичного субстрата 34. Меченый нуклеотид 12 включает в себя нуклеотид 14; связывающую молекулу 16, присоединенную к терминальной фосфатной группе нуклеотида 14; и метку 18, присоединенную к связывающей молекуле 16, при этом метка должна участвовать в реакции изменения pH, заключающей в себе вторичный субстрат 34. Меченый нуклеотид 12A-12C включает в себя нуклеотид 14', имеющий блокирующую группу 3'-OH; расщепляемую связывающую молекулу 16', присоединенную к основанию или сахару нуклеотида 14'; и метку 18, присоединенную к связывающей молекуле 16', при этом метка 18 должна участвовать в реакции изменения pH, заключающей в себе вторичный субстрат 34.
[00247] Метка 18 меченого нуклеотида 12 или 12A-12C должна зависеть от комплекса 30A-30D, который используется, и комбинаций, и могут использоваться связанные реакции формирования кислоты или основания, как описано со ссылкой на фиг. 3A и фиг. 3B, фиг. 4, фиг. 5 и фиг. 6A и фиг. 6B. В качестве одного примера, когда компонент изменения pH комплекса 30A представляет собой фермент 50A, метка 18B используется и может выбираться из группы, состоящей из первой группы, которая улучшает кинетику фермента 50A, и второй группы, которая замедляет кинетику фермента 50A. В качестве другого примера, компонент изменения pH представляет собой координационный комплекс металла 50E, и метка 18E может использоваться. Как пояснено в данном документе со ссылкой на фиг. 5, метка 18E представляет собой лиганд для металла координационного комплекса металла 50E, при этом лиганд изменяет каталитическое свойство координационного комплекса металла 50E. В качестве еще одного другого примера, компонент изменения pH представляет собой кофактор 50B или активатор 50C, и метка 18C представляет собой каталитическую метку, которая активируется посредством кофактора 50B или активатора 50C. В качестве еще одного другого примера, компонент изменения pH представляет собой фермент 50A, и комплекс 30D включает в себя конъюгат 58 нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента. Метка 18F представляет собой олигонуклеотидную последовательность, которая является комплементарной части конъюгата 58 нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента.
[00248] Смесь для включения вводит комплекс 30A-30D и меченый нуклеотид 12 или 12A-12C в проточную кювету 62. Смесь для включения также может включать в себя праймер для секвенирования, который гибридизируется в комплементарную последовательность на матричной полинуклеотидной цепи 44. Этот праймер для секвенирования обеспечивает готовность матричной полинуклеотидной цепи 44 к секвенированию.
[00249] Другая текучая среда может использоваться для того, чтобы вводить вторичный субстрат 34 в проточную кювету 62. Смесь для включения и текучая среда, включающая в себя вторичный субстрат 34, могут представлять собой часть комплекта. Любой пример проточной кюветы 62 (показан на фиг. 7C и фиг. 7D) может включаться в комплект.
[00250] Когда смесь для включения включает в себя меченый нуклеотид 12 (метка 18 которого расщепляется естественным путем после включения), следует понимать, что смесь для включения и текучая среда с вторичным субстратом 34 могут вводиться в проточную кювету 62 одновременно или непосредственно одна за другой таким образом, что вторичный субстрат 34 присутствует в проточной кювете 62 во время события включения. Поскольку метка 18 расщепляется естественным путем после включения, желательно, если вторичный субстрат 34 присутствует, в то время как метка 18 удерживается поблизости от проводящего канала 26 или 26'. Напротив, когда смесь для включения включает в себя меченый нуклеотид 12A-12C (который включает в себя блокирующую группу, и в силу этого его метка 18 не расщепляется естественным путем), следует понимать, что смесь для включения и текучая среда с вторичным субстратом 34 могут вводиться в проточную кювету 62 одновременно непосредственно одна за другой, или текучая среда с вторичным субстратом 34 может вводиться после того, как осуществляется включение. Поскольку метка 18 остается привязанной до тех пор, пока деблокирующий агент не вводится, вторичный субстрат 34 может вводиться в любое время в ходе или после события включения.
[00251] Когда смесь для включения и текучая среда с вторичным субстратом 34 вводятся в проточную кювету 62, текучие среды входят в углубления 70 (в которых присутствуют матричные полинуклеотидные цепи 44). Один из меченых нуклеотидов 12 или 12A-12C включается, посредством соответствующей полимеразы 28 соответствующего комплекса 30A-30D, в образующуюся цепь 46, которая расширяет праймер для секвенирования и которая является комплементарной матричной полинуклеотидной цепи 44. Другими словами, по меньшей мере, в некоторых матричных полинуклеотидных цепьх 44 в проточной кювете 62, соответствующие полимеразы 28 расширяют гибридизированный праймер для секвенирования посредством одного из меченых нуклеотидов 12 или 12A-12C в растворе.
[00252] В этих примерах, поскольку полимераза 28 представляет собой часть комплекса 30A-30D, включающего в себя компонент 50A-50E изменения pH, и поскольку полимераза 28 участвует во включении нуклеотида, компонент 50A-50E изменения pH переходит в позицию поблизости от проводящего канала 26 или 26' во время события включения. Метка 18 включенного нуклеотида 12 или 12A-12C также появляется поблизости от компонента 50A-50E изменения pH и проводящего канала 26, 26'. Это обеспечивает возможность компоненту 50A-50E изменения pH и метке 18 участвовать в реакции формирования кислоты или основания с вторичным субстратом 34 около проводящего канала 26, 26'. Различные реакции и эффекты конкретных комбинаций компонентов 50A-50E и меток 18 являются идентичными тому, что описано со ссылкой на фиг. 3A и фиг. 3B, фиг. 4, фиг. 5 и фиг. 6A и фиг. 6B. Изменение pH как результат реакции формирования кислоты или основания изменяет заряд в проводящем канале 26, 26', и изменение заряда обнаруживается. Изменение заряда и/или темп изменения заряда может использоваться для того, чтобы идентифицировать включенные нуклеотиды. Поскольку несколько событий включения осуществляются на нескольких праймерах 74 в одном углублении, сигналы заряда могут быть сильными и легко обнаруживаемыми в каждом отдельном проводящем канале 26, 26'.
[00253] В примерах секвенирования ансамблей, включающих в себя меченый нуклеотид 12, метка 18 и связывающая молекула 16 расщепляются естественным путем после включения.
[00254] В примерах секвенирования ансамблей, включающих в себя меченый нуклеотид 12A-12C, метка 18 и связывающая молекула 16' остаются включенными до тех пор, пока деблокирующий агент не добавляется и моется через проточную кювету 62.
[00255] В некоторых примерах секвенирования ансамблей, полимераза 28 комплекса 30A-30D может быть высокопроцессивной и в силу этого, возможно, не должна обязательно вводиться в каждом цикле секвенирования. В других примерах, новая полимераза 28 (например, в качестве части комплекса 30A-30D) может вводиться в каждом цикле секвенирования.
[00256] В другом примере секвенирования ансамблей с использованием проточной кюветы 62, как описано со ссылкой на фиг. 7C и фиг. 7D, смесь для включения может не включать в себя пример комплекса 30A-30D, а вместо этого может включать в себя непосредственно полимеразу 28. Этот пример является аналогичным примеру, описанному на фиг. 2, за исключением того, что полимераза 28 присутствует в смеси для включения и не привязывается к поверхности проводящего канала 26, 26'. Этот пример смеси для включения может включать в себя жидкость-носитель, полимеразу 28 и меченые нуклеотиды 12 или 12A-12C, включающие в себя метку 18A; которая, как описано со ссылкой на фиг. 2, представляет собой катализатор, который инициирует или ускоряет реакцию формирования кислоты или основания, заключающую в себе вторичный субстрат 34. Вторая текучая среда, включающая в себя жидкость-носитель и вторичный субстрат 34, может использоваться в этом примере смеси для включения.
[00257] Когда этот пример смеси для включения и текучей среды с вторичным субстратом 34 вводится в пример проточной кюветы 62, показанной на фиг. 7B и фиг. 7C, текучие среды входят в углубления 70 (в которых присутствуют матричные полинуклеотидные цепи 44). Один из меченых нуклеотидов 12 или 12A-12C включается, посредством соответствующей полимеразы 28, в образующуюся цепь 46, которая расширяет праймер для секвенирования и которая является комплементарной матричной полинуклеотидной цепи 44. Другими словами, по меньшей мере, в некоторых матричных полинуклеотидных цепьх 44 в проточной кювете 62, соответствующие полимеразы 28 расширяют гибридизированный праймер для секвенирования посредством одного из меченых нуклеотидов 12 или 12A-12C в растворе.
[00258] В этих примерах, каталитическая метка 18A включенного нуклеотида 12 или 12A-12C появляется поблизости от проводящего канала 26, 26'. Это обеспечивает возможность каталитической метке 18A участвовать в реакции формирования кислоты или основания с вторичным субстратом 34 около проводящего канала 26. 26'. Различные реакции и эффекты каталитической метки 18A являются идентичными тому, что описано со ссылкой на фиг. 2. Изменение pH как результат реакции формирования кислоты или основания изменяет заряд в проводящем канале 26, 26', и изменение заряда обнаруживается. Изменение заряда и/или темп изменения заряда может использоваться для того, чтобы идентифицировать включенные нуклеотиды. Поскольку несколько событий включения осуществляются на любых нескольких праймерах 74 в одном углублении, сигналы заряда могут быть сильными и легко обнаруживаемыми в каждом отдельном проводящем канале 26, 26'.
[00259] Заключение
[00260] Хотя обнаружение одиночных молекул и обнаружение ансамблей описываются подробно, следует понимать, что реакции формирования кислоты или основания, раскрытые в данном документе, могут использоваться с другим протоколом секвенирования, для генотипирования или в других химических и/или биологических вариантах применения.
[00261] Следует принимать во внимание, что все комбинации вышеприведенных принципов и дополнительных принципов, подробнее поясненных ниже (если такие принципы не являются взаимно несогласованными), считаются частью изобретаемого предмета изобретения, раскрытого в данном документе. В частности, все комбинации заявленного предмета изобретения, указанного в конце этого раскрытия сущности, считаются частью изобретаемого предмета изобретения, раскрытого в данном документе. Также следует принимать во внимание, что термины, явно используемые в данном документе, которые также могут указываться в любом раскрытии сущности, содержащемся по ссылке, должны соответствовать значению, наиболее согласующемуся с конкретными принципами, раскрытыми в данном документе.
[00262] Ссылка во всем подробном описании на "один пример", "другой пример", "пример" и т.д. означает то, что конкретный элемент (например, признак, структура и/или характеристика), описанный в связи с примером, включается, по меньшей мере, в один пример, описанный в данном документе, и может присутствовать или может не присутствовать в других примерах. Помимо этого, следует понимать, что описанные элементы для любого примера могут комбинироваться любым подходящим способом в различных примерах, если контекст явно не предписывает иное.
[00263] Термины "практически" и "приблизительно", используемые в ходе этого раскрытия сущности, включающего в себя формулу изобретения, используются для того, чтобы описывать и учитывать небольшие флуктуации, к примеру, вследствие варьирований обработки. Например, они могут означать меньше или равный ±5%, к примеру, меньше или равный ±2%, к примеру, меньше или равный ±1%, к примеру, меньше или равный ±0,5%, к примеру, меньше или равный ±0,2%, к примеру, меньше или равный ±0,1%, к примеру, меньше или равный ±0,05%.
[00264] Кроме того, следует понимать, что диапазоны, предусмотренные в настоящем документе, включают в себя установленный диапазон и любое значение или поддиапазон в пределах установленного диапазона, как если они явно изложены. Например, диапазон, представленный как составляющий от 1 нм до менее 1 мкм, должен интерпретироваться как включающий в себя не только явно изложенные пределы от 1 нм до менее 1 мкм, но также и как включающий в себя отдельные значения, к примеру, приблизительно 5 нм, 222,5 нм, 275 нм и т.д. и поддиапазоны, к примеру, приблизительно от 150 нм приблизительно до 800 нм и т.д.
[00265] Хотя выше подробно описываются несколько примеров, следует понимать, что раскрытые примеры могут модифицироваться. Следовательно, вышеприведенное описание должно считаться неограничивающим.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| СЕНСОРНЫЕ СИСТЕМЫ | 2019 |
|
RU2772924C1 |
| НУКЛЕОТИДЫ, МЕЧЕННЫЕ ЗАРЯДОМ, И СПОСОБЫ ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2019 |
|
RU2751359C2 |
| СПОСОБ ОДНОКАНАЛЬНОГО СЕКВЕНИРОВАНИЯ НА ОСНОВЕ САМОЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ | 2019 |
|
RU2794177C1 |
| СЕНСОР И СЕНСОРНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ СЕКВЕНИРОВАНИЯ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ | 2019 |
|
RU2747795C1 |
| ПОЛУЧЕНИЕ БИБЛИОТЕКИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА | 2020 |
|
RU2798952C2 |
| СПОСОБ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ | 2002 |
|
RU2291197C2 |
| СПОСОБЫ И СРЕДСТВА ПОЛУЧЕНИЯ БИБЛИОТЕКИ ДЛЯ СЕКВЕНИРОВАНИЯ | 2019 |
|
RU2815513C2 |
| ПРОТОЧНЫЕ ЯЧЕЙКИ И НАБОРЫ ДЛЯ СЕКВЕНИРОВАНИЯ | 2019 |
|
RU2823075C2 |
| НУКЛЕОЗИДЫ И НУКЛЕОТИДЫ С 3’-ГИДРОКСИ БЛОКИРУЮЩИМИ ГРУППАМИ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В СПОСОБАХ СЕКВЕНИРОВАНИЯ ПОЛИНУКЛЕОТИДОВ | 2019 |
|
RU2818762C2 |
| СИСТЕМЫ И СПОСОБЫ ПРИМЕНЕНИЯ МАГНИТОЧУВСТВИТЕЛЬНЫХ ДАТЧИКОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ | 2016 |
|
RU2709986C2 |
Изобретение относится к биотехнологии, а именно к считывающим системам. Считывающая система включает датчик pH. Датчик pH включает в себя два электрода и проводящий канал, оперативно соединенный с двумя электродами. Комплекс прикрепляется к токопроводящему каналу датчика pH. Комплекс включает полимеразу, связанную по меньшей мере с одним фрагментом, изменяющим pH, который должен участвовать в генерации изменения pH вблизи проводящего канала в результате потребления вторичного субстрата в жидкости, на которую воздействует датчик pH. По меньшей мере один фрагмент, изменяющий рН, выбирают из группы, состоящей из фермента, координационного комплекса металла, кофактора и активатора. Технический результат заключается в расширении арсенала средств определенного назначения. 10 н. и 20 з.п. ф-лы, 7 ил.
1. Система, считывающая изменение pH, содержащая:
- pH-датчик, включающий в себя:
- два электрода; и
- проводящий канал, функционально соединенный с двумя электродами; и
- комплекс с изменяющим pH компонентом, присоединенный к проводящему каналу pH-датчика, причем комплекс включает в себя полимеразу, связанную, по меньшей мере, с одним изменяющим pH компонентом, который должен участвовать в формировании изменения pH поблизости от проводящего канала за счет потребления вторичного субстрата в текучей среде, которая контактирует с pH-датчиком, причем, по меньшей мере, один изменяющий pH компонент представляет собой фермент, при этом фермент генерирует кислоту или основание в реакции с вторичным субстратом.
2. Считывающая система по п. 1, в которой фермент выбран из группы, состоящей из гидролаз и оксидаз.
3. Считывающая система по п. 1, в которой кинетика, по меньшей мере, одного изменяющего pH компонента, по меньшей мере, в 10 раз быстрее кинетики полимеразы.
4. Считывающая система по п. 1, в которой комплекс дополнительно содержит конъюгат нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента, присоединенный к ферменту.
5. Считывающая система по п. 1, в которой комплекс дополнительно включает в себя второй фермент, присоединенный к полимеразе.
6. Считывающая система по п. 1, в которой комплекс представляет собой слитый белок или химеру белка.
7. Считывающая система по п. 1, в которой проводящий канал pH-датчика выбран из группы, состоящей из полупроводящей наноструктуры, графеновой наноструктуры, металлической наноструктуры и проводящей полимерной наноструктуры.
8. Считывающая система по п. 1, дополнительно содержащая:
- подложку, включающую в себя множество углублений, отделенных посредством промежуточных областей, при этом, по меньшей мере, проводящий канал pH-датчика находится внизу одного из множества углублений; и
- множество дополнительных pH-датчиков, при этом, по меньшей мере, проводящий канал каждого из множества дополнительных pH-датчиков находится внизу соответствующего одного из множества углублений.
9. Считывающая система по п. 8, в которой каждое из множества углублений включает в себя боковые стенки, при этом боковые стенки включают в себя pH-буферный материал.
10. Меченый нуклеотид для использования при считывании изменения pH, содержащий:
- нуклеотид;
- молекулу-линкер, присоединенную к терминальной фосфатной группе нуклеотида; и
- каталитическую метку, присоединенную к молекуле-линкеру, при этом каталитическая метка должна создавать изменение pH за счет потребления вторичного субстрата в текучей среде с меченым нуклеотидом, где каталитическая метка выбрана из группы, состоящей из гидролаз и оксидаз;
причем в создании изменения pH участвует комплекс с изменяющим pH компонентом.
11. Меченый нуклеотид по п. 10, в котором молекула-линкер является расщепляемой.
12. Комплект для считывания изменения pH, созданного в результате потребления вторичного субстрата, содержащий:
- нуклеотид, содержащий:
- молекулу-линкер, присоединенную к терминальной фосфатной группе нуклеотида; и
- кофактор или ингибитор, присоединенный к молекуле-линкеру; и
- считывающую систему, включающую в себя:
- два электрода;
- проводящий канал, функционально соединенный с двумя электродами; и
- комплекс с изменяющим pH компонентом, присоединенный к проводящему каналу, причем комплекс включает в себя полимеразу, конъюгированную с изменяющим pH компонентом,
где изменяющий pH компонент представляет собой фермент, и
где кофактор или активатор изменяет кинетику фермента.
13. Комплект по п. 12, в котором молекула-линкер является расщепляемой.
14. Способ детектирования изменения pH в реакции с участием вторичного субстрата, включающий в себя этапы, на которых:
- вводят матричную полинуклеотидную цепь в датчик, имеющий полимеразу, привязанную к проводящему каналу, где полимераза датчика представляет собой часть комплекса с ферментным катализатором;
- вводят в датчик текучую среду, включающую в себя вторичный субстрат и меченые нуклеотиды, за счет чего нуклеотид одного из меченых нуклеотидов связывается с полимеразой, и метка данного одного из меченых нуклеотидов участвует в реакции изменения pH, в которой участвует вторичный субстрат, который находится поблизости от проводящего канала, причем реакция с изменением pH выполняется с помощью комплекса с изменяющим pH компонентом; и
- детектируют ответ проводящего канала.
15. Способ по п. 14, в котором:
- метка представляет собой группу, которая улучшает или замедляет кинетику ферментного катализатора; и
- способ дополнительно включает этап, на котором детектируют изменение заряда по сравнению с базовым зарядом.
16. Способ по п. 14, в котором:
- метка представляет собой вторичный субстрат; и
- способ дополнительно включает этап, на котором детектируют изменение заряда по сравнению с базовым зарядом.
17. Способ детектирования изменения pH в реакции с участием вторичного субстрата, включающий в себя этапы, на которых:
- вводят матричную полинуклеотидную цепь в датчик, имеющий полимеразу, привязанную к проводящему каналу;
- вводят в датчик текучую среду, включающую в себя вторичный субстрат и меченые нуклеотиды, за счет чего нуклеотид одного из меченых нуклеотидов связывается с полимеразой, и метка данного одного из меченых нуклеотидов участвует в реакции изменения pH, в которой участвует вторичный субстрат, который находится поблизости от проводящего канала, причем реакция с изменением pH выполняется с помощью комплекса с изменяющим pH компонентом; и
- детектируют ответ проводящего канала, причем
- полимераза датчика представляет собой часть комплекса с координационным комплексом металла;
- метка представляет собой лиганд для металла координационного комплекса металла; и
- способ дополнительно включает этап, на котором детектируют изменение заряда по сравнению с базовым зарядом.
18. Способ детектирования изменения pH в реакции с участием вторичного субстрата, включающий в себя этапы, на которых:
- вводят матричную полинуклеотидную цепь в датчик, имеющий полимеразу, привязанную к проводящему каналу;
- вводят в датчик текучую среду, включающую в себя вторичный субстрат и меченые нуклеотиды, за счет чего нуклеотид одного из меченых нуклеотидов связывается с полимеразой, и метка данного одного из меченых нуклеотидов участвует в реакции изменения pH, в которой участвует вторичный субстрат, который находится поблизости от проводящего канала, причем реакция с изменением pH выполняется с помощью комплекса с изменяющим pH компонентом; и
- детектируют ответ проводящего канала, причем
- полимераза датчика представляет собой часть комплекса с ферментным катализатором;
- конъюгат нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента присоединяется к ферментному катализатору;
- метка представляет собой олигонуклеотидную последовательность, которая является комплементарной к части конъюгата нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента; и
- способ дополнительно включает этап, на котором детектируют изменение заряда по сравнению с базовым зарядом.
19. Способ по любому из пп. 15-18, дополнительно включающий этап, на котором идентифицируют нуклеотид, связанный с полимеразой, исходя из изменения заряда и/или скорости изменения заряда.
20. Способ по п. 14, в котором меченые нуклеотиды имеют разные индивидуальные скорости накопления, при этом способ дополнительно содержит этап, на котором идентифицируют связанный меченый нуклеотид посредством его индивидуальной скорости накопления.
21. Смесь для включения, предназначенная для включения в комплект для считывания изменения pH по п. 12, содержащая:
- жидкость-носитель;
- комплекс с изменяющим pH компонентом, включающий в себя:
- полимеразу; и
- изменяющий pH компонент, связанный с полимеразой, причем изменяющий pH компонент выбран из группы, состоящей из фермента, который должен катализировать потребление вторичного субстрата, координационного комплекса металла, который должен катализировать потребление вторичного субстрата, и кофактора или активатора, который должен катализировать потребление вторичного субстрата; и
- меченый нуклеотид, включающий в себя:
- нуклеотид;
- молекулу-линкер, присоединенную к терминальной фосфатной группе нуклеотида; и
- метку, присоединенную к молекуле-линкеру, при этом метка должна участвовать в реакции изменения pH, в которой участвует вторичный субстрат.
22. Смесь для включения по п. 21, в которой:
- изменяющий pH компонент представляет собой фермент, и метка выбрана из группы, состоящей из первой группы, которая улучшает кинетику фермента, и второй группы, которая замедляет кинетику фермента;
- изменяющий pH компонент представляет собой координационный комплекс металла, и метка представляет собой лиганд для металла координационного комплекса металла, при этом лиганд изменяет каталитическое свойство координационного комплекса металла; или
- изменяющий pH компонент представляет собой кофактор или активатор, и метка представляет собой каталитическую метку, которая активируется посредством кофактора или активатора.
23. Смесь для включения по п. 21, в которой:
- изменяющий pH компонент представляет собой фермент;
- комплекс дополнительно включает в себя конъюгат нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента, присоединенный к ферменту; и
- метка представляет собой олигонуклеотидную последовательность, которая является комплементарной к части конъюгата нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента.
24. Комплект для считывания изменения pH в реакции с участием вторичного субстрата, содержащий:
- смесь для включения по п. 21; и
- смесь с вторичным субстратом, включающую в себя вторую жидкость-носитель и вторичный субстрат.
25. Комплект по п. 24, дополнительно содержащий:
- проточную кювету, включающую в себя:
- подложку, включающую в себя множество углублений, отделенных посредством промежуточных областей;
- проводящий канал внизу каждого из множества углублений; и
- по меньшей мере, один праймер, прикрепленный в каждом из углублений.
26. Смесь для включения в систему для считывания изменения pH, содержащая:
- жидкость-носитель, включающую в себя буфер;
- комплекс с изменяющим pH компонентом, включающий в себя:
- полимеразу; и
- изменяющий pH компонент, связанный с полимеразой, причем изменяющий pH компонент выбран из группы, состоящей из фермента, который должен катализировать потребление вторичного субстрата, координационного комплекса металла, который должен катализировать потребление вторичного субстрата, и кофактора или активатора, который должен катализировать потребление вторичного субстрата; и
- меченый нуклеотид, включающий в себя:
- нуклеотид, имеющий блокирующую группу 3'-OH;
- расщепляемую молекулу-линкер, присоединенную к основанию или сахару нуклеотида; и
- метку, присоединенную к молекуле-линкеру, при этом метка должна участвовать в реакции изменения pH, в которой участвует вторичный субстрат, при этом в указанной смеси:
- изменяющий pH компонент представляет собой фермент, и метка выбрана из группы, состоящей из первой группы, которая улучшает кинетику фермента, второй группы, которая замедляет кинетику фермента, и вторичного субстрата; или
- изменяющий pH компонент представляет собой координационный комплекс металла, и метка представляет собой лиганд для металла координационного комплекса металла, при этом лиганд изменяет каталитическое свойство координационного комплекса металла; или
- изменяющий pH компонент представляет собой кофактор или активатор, и метка представляет собой каталитическую метку, которая активируется посредством кофактора или активатора.
27. Смесь для включения по п. 26, в которой:
- изменяющий pH компонент представляет собой фермент;
- комплекс дополнительно включает в себя конъюгат нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента, присоединенный к ферменту; и
- метка представляет собой олигонуклеотидную последовательность, которая является комплементарной к части конъюгата нуклеинокислотной шпильки/ингибитора фермента.
28. Комплект для считывания изменения pH в реакции с участием вторичного субстрата, содержащий:
- смесь для включения по п. 26; и
- смесь с вторичным субстратом, включающую в себя вторую жидкость-носитель и вторичный субстрат.
29. Комплект по п. 28, дополнительно содержащий:
- проточную кювету, включающую в себя:
- подложку, включающую в себя множество углублений, отделенных посредством промежуточных областей;
- проводящий канал внизу каждого из множества углублений; и
- праймер, прикрепляемый в каждом из углублений.
30. Комплект по п. 28, дополнительно содержащий раствор деблокирующего агента.
| US7198776 B2 (GE HEALTHCARE AS), 03.04.2007 | |||
| СПОСОБ ПРОИЗВОДСТВА КОНСЕРВОВ "ПТИЦА С ТУШЕНОЙ КАПУСТОЙ И КРАСНЫМ ОСНОВНЫМ СОУСОМ" | 2013 |
|
RU2509481C1 |
| WO2017203059 (F | |||
| HOFFMANN-LA ROCHE AG),30.11.2017 | |||
| СПОСОБ ОТБОРА И ПОЛУЧЕНИЯ СЕЛЕКТИВНЫХ И МУЛЬТИСПЕЦИФИЧЕСКИХ ТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ МОЛЕКУЛ С ЗАДАННЫМИ СВОЙСТВАМИ, ВКЛЮЧАЮЩИХ ПО МЕНЬШЕЙ МЕРЕ ДВЕ РАЗЛИЧНЫЕ НАЦЕЛИВАЮЩИЕ ГРУППИРОВКИ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2013 |
|
RU2644263C2 |
| KHOFFMANN-LYA ROSH AG), 08.02.2018. | |||
