ВАКЦИНА ПРОТИВ ВИРУСА БЕШЕНСТВА Российский патент 2022 года по МПК A61K39/205 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По этой заявке испрашивается приоритет согласно 35 U.S.C. §119(e) по временной заявке на патент США с серийным номером №62/581955, поданной 6 ноября 2017 года, содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым вакцинам против вируса бешенства. Также изобретение относится к способам получения и применения вакцины отдельно или в комбинациях с другими защитными средствами.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Бешенство представляет собой предотвратимое зоонозное заболевание, которое приводит к воспалению головного мозга у человека и других млекопитающих. Клиническое бешенство представляет собой острый прогрессирующий энцефалит, который обычно подразделяют на буйное или паралитическое бешенство. Буйное бешенство характеризуется беспокойством, раздражительностью и агрессией. Паралитическое бешенство характеризуется чрезмерным слюноотделением, глубоким затрудненным дыханием, параличом и в конечном итоге комой.

Этиологическим фактором бешенства является вирус бешенства, который способен инфицировать большинство млекопитающих и поддерживает резервуар заболевания в диких и восприимчивых домашних животных. Вирус бешенства присутствует в большинстве частей света, хотя в различных географических областях в качестве первичного резервуара для вируса бешенства выступают различные виды, включая бродячих собак, енотов, скунсов, лис, летучих мышей и мангустов [Robinson et al., Semin Vet Med Surg (small Anim) 6:203-211 (1991)]. Вирус бешенства наиболее часто передается через укус инфицированного животного. После того как вирус бешенства инфицирует центральную нервную систему проявляются клинические признаки бешенства.

Вирус бешенства представляет собой оболочечный РНК-вирус, который кодирует пять структурных белков: нуклеопротеин (N), фосфопротеин (P), матриксный белок (M), гликопротеин (G) и РНК-зависимую РНК-полимеразу [Dietzschold et al., Crit Rev Immunol 10:427-439 (1991)]. Гликопротеин (G) считается защитным антигеном, который индуцирует нейтрализующие вирус антитела [Cox et al., Infect Immun 16:754-759 (1977)]. Для борьбы с этим заболеванием было получено несколько типов вакцин. В США наиболее часто используются цельно-вирионные вакцины на основе происходящего из инактивированной клеточной культуры убитого вируса бешенства. Эти цельно-вирионные вакцины на основе убитого вируса бешенства требуют высокого уровня антигена и, таким образом, требуют адъюванта. К сожалению, это применение адъюванта ассоциировано с реактивностью области инъекции, гиперчувствительностью и даже с предполагаемым риском сарком в области инъекции у кошек. Недавно модифицированную живую вакцину успешно использовали с приманками для пероральных вакцин для иммунизации диких животных [Mahl et al., Vet Res 45(1):77 (2014)]. Кроме того, рекомбинантная вакцина, экспрессирующая гликопротеин (G), в настоящее время продается в США для применения у кошек. Вакцины на основе нуклеиновых кислот также использовали в лабораторных испытаниях, хотя ни одна из них не была лицензирована в США.

Ряд векторных стратегий используют в вакцинах на протяжении лет в попытках защитить против определенных патогенов животных. Одна такая векторная стратегия включает использование происходящих из альфавирусов РНК-репликонных частиц (RP) [Vander Veen, et al. Anim Health Res Rev. 13(1):1-9. (2012) doi: 10, 1017/ S1466252312000011; Kamrud et al., J Gen Virol. 91(Pt 7):1723-1727 (2010)], которые были разработаны из нескольких различных альфавирусов, включая вирус венесуэльского энцефалита лошадей (VEE) [Pushko et al., Virology 239:389-401 (1997)], Синдбис (SIN) [Bredenbeek et al., Journal of Virology 67:6439-6446 (1993)] и вирус леса Семлики(SFV) [Liljestrom and Garoff, Biotechnology (NY) 9:1356-1361 (1991)]. RP-вакцины доставляют РНК-репликоны альфавируса с дефектом увеличения в количестве в клетки-хозяева и обеспечивают экспрессию желаемого антигенного трансгена(ов) in vivo [Pushko et al., Virology 239(2):389-401 (1997)]. RP имеют привлекательный профиль безопасности и эффективности по сравнению с некоторыми традиционными вакцинными составами [Vander Veen, et al. Anim Health Res Rev. 13(1):1-9. (2012)]. Платформу RP используют для кодирования патогенных антигенов, и она является основой для нескольких лицензированных USDA вакцин для свиней и птиц.

Несмотря на широкую доступность цельно-вирионных убитых вакцин против бешенства, а также внедрение новых вакцин, бешенство все еще продолжает представлять угрозу как для домашних животных, так и для людей. Таким образом, остается продолжительная потребность в новых вакцинах против бешенства, которые будут способствовать защите млекопитающих, включая кошек, собак, лошадей, хорьков, овец и крупный рогатый скот, от этого изнуряющего заболевания.

Цитирование любых ссылок в настоящем описании не следует истолковывать как признание того, что такая ссылка доступна в качестве "уровня техники" для настоящей заявки.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, настоящее изобретение относится к векторам, которые кодируют один или несколько антигенов вируса бешенства. Такие векторы можно использовать в иммуногенных композициях, содержащих эти векторы. Иммуногенные композиции по настоящему изобретению можно использовать в вакцинах. В одном аспекте настоящего изобретения вакцина защищает вакцинированного индивидуума (например, млекопитающего) против вируса бешенства. В одном варианте осуществления этого типа вакцинированным индивидуумом является животное семейства собачьих. В другом варианте осуществления вакцинированным индивидуумом является животное семейства кошачьих. В более конкретном варианте осуществления этого типа вакцинированным индивидуумом является домашняя кошка. В другом варианте осуществления млекопитающим является животное семейства лошадиных (например, лошадь). Кроме того, настоящее изобретение относится к комбинированным вакцинам для индукции защитного иммунитета против бешенства и других заболеваний, например, других инфекционных заболеваний животных семейства собачьих, животных семейства лошадиных и/или животных семейства кошачьих. Также предусматриваются способы получения и применения иммуногенных композиций и вакцин по настоящему изобретению.

В конкретных вариантах осуществления вектор представляет собой РНК-репликонную частицу альфавируса, которая кодирует один или несколько антигенов, которые происходят из вируса бешенства. В еще более конкретных вариантах осуществления РНК-репликонная частица альфавируса представляет собой РНК-репликонную частицу альфавируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE). В еще более конкретных вариантах осуществления РНК-репликонная частица альфавируса VEE представляет собой РНК-репликонную частицу альфавируса VEE TC-83. В других вариантах осуществления РНК-репликонная частица альфавируса представляет собой РНК-репликонную частицу альфавируса Синдбис (SIN). В других вариантах осуществления РНК-репликонная частица альфавируса представляет собой РНК-репликонную частицу альфавируса леса Семлики (SFV). В альтернативном варианте осуществления вектор с голой ДНК содержит конструкцию нуклеиновой кислоты, которая кодирует антиген гликопротеина (G) вируса бешенства. Настоящее изобретение относится ко всем конструкциям нуклеиновых кислот по настоящему изобретению, включая РНК-плазмиды, РНК-репликоны, а также все РНК-репликонные частицы альфавирусов по настоящему изобретению, векторы с голой ДНК и иммуногенные композиции и/или вакцины, которые содержат конструкции нуклеиновых кислот (например, РНК-плазмиды, РНК-репликоны) РНК-репликонных частиц альфавирусов, и/или векторы с голой ДНК по настоящему изобретению.

В определенных вариантах осуществления РНК-репликонные частицы альфавируса кодируют один антиген G вируса бешенства. В родственных вариантах осуществления РНК-репликонные частицы альфавирусов кодируют один или несколько антигенов G вируса бешенства или их антигенных фрагментов. В других вариантах осуществления РНК-репликонные частицы альфавирусов кодируют от двух до четырех антигенов G вируса бешенства или их антигенных фрагментов. В конкретных вариантах осуществления РНК-репликонные частицы альфавирусов представляют собой РНК-репликонные частицы альфавируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE).

Настоящее изобретение также относится к иммуногенным композициям, которые содержат РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые кодируют один антиген G вируса бешенства. В родственных вариантах осуществления иммуногенные композиции содержат РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые кодируют один или несколько антигенов G вируса бешенства. В конкретных вариантах осуществления этого типа иммуногенные композиции содержат РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые кодируют от двух до четырех антигенов G вируса бешенства или их антигенных фрагментов. В более конкретных вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые представляют собой РНК-репликонные частицы альфавирусов венесуэльского энцефалита лошадей (VEE).

В других вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит два или более наборов РНК-репликонных частиц альфавирусов. В конкретных вариантах осуществления этого типа один набор РНК-репликонных частиц альфавирусов кодирует антиген G вируса бешенства или его антигенный фрагмент, и второй набор РНК-репликонных частиц альфавирусов кодирует антиген кальцивируса кошек (FCV) или его антигенный фрагмент. В определенных вариантах осуществления этого типа антиген FCV происходит из вирулентного системного кальцивируса кошек. В других вариантах осуществления антиген FCV происходит из классического (F9-подобного) кальцивируса кошек. В других вариантах осуществления второй набор РНК-репликонных частиц альфавируса кодирует два антигена FCV, один из которых происходит из вирулентного системного кальцивируса кошек, в то время как другой происходит из классического (F9-подобного) кальцивируса кошек.

Таким образом, в определенных вариантах осуществления конструкция нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению кодирует один или несколько антигенов G вируса бешенства или их антигенных фрагментов. В конкретных вариантах осуществления этого типа конструкция нуклеиновой кислоты кодирует от двух до четырех антигенов G вируса бешенства или их антигенных фрагментов. В родственных вариантах осуществления РНК-репликонные частицы альфавируса содержат конструкцию нуклеиновой кислоты, которая кодирует один или несколько антигенов G вируса бешенства или их антигенных фрагментов. В других вариантах осуществления РНК-репликонные частицы альфавирусов содержат конструкцию нуклеиновой кислоты, которая кодирует от двух до четырех антигенов G или их антигенных фрагментов.

В конкретных вариантах осуществления иммуногенные композиции содержат РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые содержат конструкцию нуклеиновой кислоты, которая кодирует один или несколько антигенов G вируса бешенства или их антигенных фрагментов. В родственных вариантах осуществления иммуногенные композиции содержат РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые кодируют от двух до четырех антигенов G вируса бешенства или их антигенных фрагментов. В конкретных вариантах осуществления этого типа РНК-репликонные частицы альфавирусов кодируют антиген G вируса бешенства или его антигенные фрагменты. В более конкретных вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые представляют собой РНК-репликонные частицы альфавирусов венесуэльского энцефалита лошадей (VEE). В других вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит два или более наборов РНК-репликонных частиц альфавирусов. В конкретных вариантах осуществления этого типа один набор РНК-репликонных частиц альфавирусов содержит первую конструкцию нуклеиновой кислоты, в то время как другой набор РНК-репликонных частиц альфавирусов содержит вторую конструкцию нуклеиновой кислоты.

В других вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит один набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит первую конструкцию нуклеиновой кислоты, другой набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит вторую конструкцию нуклеиновой кислоты, и третий набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит третью конструкцию нуклеиновой кислоты. В конкретном варианте осуществления этого типа первая конструкция нуклеиновой кислоты кодирует антиген G вируса бешенства или его антигенный фрагмент, вторая конструкция нуклеиновой кислоты кодирует антиген кальцивируса кошек (FCV), который происходит из вирулентного системного кальцивируса кошек, или его антигенный фрагмент, и третья конструкция нуклеиновой кислоты кодирует антиген кальцивируса кошек (FCV), который происходит из классического (F9-подобного) кальцивируса кошек, или его антигенный фрагмент. В конкретных вариантах осуществления антиген кальцивируса кошек (FCV) представляет собой капсидный белок FCV.

В других вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, которые содержат первую конструкцию нуклеиновой кислоты, другой набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит вторую конструкцию нуклеиновой кислоты, и третий набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит третью конструкцию нуклеиновой кислоты, четвертый набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит четвертую конструкцию нуклеиновой кислоты, и пятый набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит пятую конструкцию нуклеиновой кислоты. В таких вариантах осуществления все из нуклеотидных последовательностей первой конструкции нуклеиновой кислоты, второй конструкции нуклеиновой кислоты, третей конструкции нуклеиновой кислоты, четвертой конструкции нуклеиновой кислоты и пятой конструкции нуклеиновой кислоты различаются.

Таким образом, иммуногенная композиция по настоящему изобретению может содержать РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые содержат конструкцию нуклеиновой кислоты, которая, кроме того, кодирует по меньшей мере один антиген не вируса бешенства, для индукции защитного иммунитета против патогена не вируса бешенства. В конкретных вариантах осуществления этого типа антиген не вируса бешенства представляет собой белковый антиген, который происходит из вируса герпеса кошек (FHV). В других вариантах осуществления антиген не вируса бешенства представляет собой белковый антиген, который происходит из кальцивируса кошек (FCV). В других вариантах осуществления антиген не вируса бешенства представляет собой белковый антиген, который происходит из пневмовируса кошек (FPN). В других вариантах осуществления антиген не вируса бешенства представляет собой белковый антиген, который происходит из парвовируса кошек (FPV).

В других вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит один набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит первую конструкцию нуклеиновой кислоты, другой набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит вторую конструкцию нуклеиновой кислоты, третий набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит третью конструкцию нуклеиновой кислоты, и четвертый набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит четвертую конструкцию нуклеиновой кислоты. В конкретном варианте осуществления этого типа, первая конструкция нуклеиновой кислоты кодирует антиген G вируса бешенства или его антигенный фрагмент, вторая конструкция нуклеиновой кислоты кодирует антиген кальцивируса кошек (FCV), который происходит из вирулентного системного кальцивируса кошек, или его антигенный фрагмент, третья конструкция нуклеиновой кислоты кодирует антиген кальцивируса кошек (FCV), который происходит из классического (F9-подобного) кальцивируса кошек, или его антигенный фрагмент, четвертая конструкция нуклеиновой кислоты кодирует антиген FeLV или его антигенный фрагмент.

В других вариантах осуществления иммуногенная композиция содержит набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, которые содержат первую конструкцию нуклеиновой кислоты, другой набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит вторую конструкцию нуклеиновой кислоты, третий набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит третью конструкцию нуклеиновой кислоты, четвертый набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит четвертую конструкцию нуклеиновой кислоты, и пятый набор РНК-репликонных частиц альфавирусов, который содержит пятую конструкцию нуклеиновой кислоты. В таких вариантах осуществления все из нуклеотидных последовательностей первой конструкции нуклеиновой кислоты, второй конструкции нуклеиновой кислоты, третьей конструкции нуклеиновой кислоты, четвертой конструкции нуклеиновой кислоты и пятой конструкции нуклеиновой кислоты различаются.

Таким образом, иммуногенная композиция по настоящему изобретению может содержать РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые содержат конструкцию нуклеиновой кислоты, которая кодирует по меньшей мере один антиген не вируса бешенства, для индукции защитного иммунитета против патогена не вируса бешенства. В конкретных вариантах осуществления этого типа, антиген не вируса бешенства представляет собой белковый антиген, который происходит из вируса герпеса кошек (FHV). В других вариантах осуществления антиген не вируса бешенства представляет собой белковый антиген, который происходит из кальцивируса кошек (FCV). В других вариантах осуществления антиген не вируса бешенства представляет собой белковый антиген, который происходит из пневмовируса (FPN). В других вариантах осуществления антиген не вируса бешенства представляет собой белковый антиген, который происходит из парвовируса кошек (FPV).

Настоящее изобретение, кроме того, относится к комбинированным иммуногенным композициям и/или вакцинам, которые содержат РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые кодируют антиген или его антигенный фрагмент, происходящий из вируса бешенства, вместе с одним или несколькими модифицированными живыми (например, ослабленными) или убитыми патогенами млекопитающих.

В конкретных вариантах осуществления настоящего изобретения антиген вируса бешенства представляет собой антиген G вируса бешенства. В конкретных вариантах осуществления этого типа антиген G вируса бешенства содержит аминокислотную последовательность, обладающую 95% или идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2. В более конкретных вариантах осуществления этого типа антиген G вируса бешенства содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В еще более конкретных вариантах осуществления этого типа антиген G вируса бешенства кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 4.

Настоящее изобретение, кроме того, относится к вакцинам и поливалентным вакцинам, содержащим иммуногенные композиции по настоящему изобретению. В конкретных вариантах осуществления вакцина представляет собой безадъювантную вакцину. Вакцины по настоящему изобретению могут способствовать предупреждению заболевания, ассоциированного с вирусом бешенства. В определенных вариантах осуществления антитела индуцируются у млекопитающего, когда млекопитающего иммунизируют вакциной. В конкретных вариантах осуществления млекопитающим является животное семейства собачьих. В других вариантах осуществления млекопитающим является животное семейства кошачьих. В других вариантах осуществления млекопитающим является животное семейства лошадиных (лошадь). В других вариантах осуществления млекопитающим является животное семейства куньих. В конкретных вариантах осуществления этого типа, животным семейства куньих является хорек. В других вариантах осуществления млекопитающим является животное семейства полорогих. В конкретных вариантах осуществления этого типа, животным семейства полорогих является животное подсемейства бычьих. В других вариантах осуществления этого типа, животным семейства полорогих является овца.

Настоящее изобретение также относится к способам иммунизации млекопитающего против вируса бешенства, включающим введение млекопитающему иммунологически эффективного количества вакцины по настоящему изобретению. В конкретных вариантах осуществления вакцину вводят посредством внутримышечной инъекции. В альтернативных вариантах осуществления вакцину вводят посредством подкожной инъекции. В других вариантах осуществления вакцину вводят посредством внутривенной инъекции. В других вариантах осуществления вакцину вводят посредством внутрикожной инъекции. В других вариантах осуществления вакцину вводят посредством перорального введения. В других вариантах осуществления вакцину вводят посредством интраназального введения. В конкретных вариантах осуществления млекопитающим является кошка. В других конкретных вариантах осуществления млекопитающим является животное семейства собачьих. В других вариантах осуществления млекопитающим является лошадь.

Вакцины (включая поливалентные вакцины) по настоящему изобретению можно вводить в качестве примирующей вакцины и/или в качестве бустерной вакцины. В конкретных вариантах осуществления вакцину по настоящему изобретению вводят в качестве однократной вакцины (одна доза), без необходимости в последующих введениях. В случае введения как примирующей вакцины, так и бустерной вакцины, в определенных вариантах осуществления примирующую вакцину и бустерную вакцину можно вводить одним и тем же путем. В других вариантах осуществления этого типа, как примирующую вакцину, так и бустерную вакцину, вводят посредством подкожной инъекции. В альтернативных вариантах осуществления введение примирующей вакцины можно проводить одним путем, а введение бустерной вакцины можно проводить другим путем. В определенных вариантах осуществления этого типа примирующую вакцину можно вводить посредством подкожной инъекции, и бустерную вакцину можно вводить перорально.

Кроме того, изобретение относится к способам иммунизации млекопитающего против вируса бешенства, включающим инъекцию млекопитающему иммунологически эффективного количества вакцины по изобретению. В конкретных вариантах осуществления вакцина может включать от приблизительно 1×10⁵ до приблизительно 1×10¹⁰ RP или более. В более конкретных вариантах осуществления вакцины могут включать от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 1×10⁹ RP. В еще более конкретных вариантах осуществления вакцины могут включать от приблизительно 1×10⁷ до приблизительно 1×10⁸ RP.

В определенных вариантах осуществления вакцины по настоящему изобретению вводят в дозах от 0,03 мл до 5 мл. В конкретных вариантах осуществления вакцины по настоящему изобретению вводят в дозах от 0,05 мл до 3 мл. В более конкретных вариантах осуществления вводимая доза составляет от 0,1 мл до 2 мл. В еще более конкретных вариантах осуществления вводимая доза составляет от 0,2 мл до 1,5 мл. В еще более конкретных вариантах осуществления вводимая доза составляет от 0,3 до 1,0 мл. В еще более конкретных вариантах осуществления вводимая доза составляет от 0,4 мл до 0,8 мл.

Эти и другие аспекты настоящего изобретения станут лучше понятны посредством приведенного ниже подробного описания.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к вакцинным композициям, которые включают иммунологически эффективное количество антигена из одного или нескольких штаммов вируса бешенства, который способствует индукции защитного иммунитета у вакцинированного животного, являющегося реципиентом. В одном аспекте настоящего изобретения вакцины содержат РНК-репликонные частицы альфавирусов (RP), которые содержат капсидный белок и гликопротеины вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE), и кодируют гликопротеин (G) бешенства или его антигенный фрагмент. В еще более конкретных вариантах осуществления вакцины содержат РНК-репликонные частицы альфавирусов (RP), которые содержат капсидный белок и гликопротеины авирулентного штамма VEE TC-83 и кодируют бешенство гликопротеин (G) или его антигенный фрагмент. В другом аспекте настоящего изобретения вакцины содержат векторы с голой ДНК, которые кодируют гликопротеин (G) бешенства. Вакцины, содержащие РНК-репликонные частицы альфавирусов, кодирующие гликопротеин (G) бешенства, можно вводить в отсутствие адъюванта, и они еще могут эффективно способствовать индукции защитного иммунитета у вакцинированного млекопитающего против вируса бешенства.

Таким образом, один аспект изобретения относится к усовершенствованной неадъювантной вакцине против вируса бешенства. В родственном аспекте вакцины по настоящему изобретению не индуцируют саркому в области инъекции и, тем не менее, обеспечивают защиту вакцинированного животного от изнуряющего болезненного состояния, вызываемого инфекцией вирусом бешенства, и являются по меньшей мере настолько же эффективными, как и соответствующие адъювантные вакцины.

Для более полного понимания изобретения приводятся следующие определения.

Использование терминов в единственном числе для удобства в описании никоим образом не предназначено для ограничения. Таким образом, например, указание на композицию, содержащую "полипептид", включает указание на один или несколько таких полипептидов. Кроме того, указание на "РНК-репликонную частицу альфавирусов" включает указание на множество таких РНК-репликонных частиц альфавирусов, если нет иных указаний.

Как используют в рамках изобретения, термин "примерно" используют взаимозаменяемо с термином термин "приблизительно", и он означает, что величина находится в пределах пятидесяти процентов от указанной величины, т.е. композиция, содержащая "примерно" 1×10⁸ РНК-репликонных частиц альфавирусов на миллилитр, содержит от 5×10⁷ до 1,5×10⁸ РНК-репликонных частиц альфавирусов на миллилитр.

Как используют в рамках изобретения, термин "животное семейства кошачьих" относится к любому представителю семейства Felidae. Все из домашних кошек, чистокровных и/или беспородных кошек-компаньонов, и диких или бездомных кошек являются животными семейства кошачьих.

Как используют в рамках изобретения термин "животное семейства собачьих" включает всех домашних собак, Canis lupus familiaris или Canis familiaris, если нет иных указаний.

Как используют в рамках изобретения, "хорек" представляет собой млекопитающее, которое является одним из млекопитающих, которые относятся к семейству куньих.

Как используют в рамках изобретения, "семейство полорогих" представляет собой семейство млекопитающих, включающее двухкопытных жвачных млекопитающих, которые включают антилоп, овец (овечьи), коз, овцебыка и животных подсемейства бычьих, например, бизона, африканского буйвола, азиатского буйвола и крупный рогатый скот.

Как используют в рамках изобретения, термин "репликон" относится к модифицированному вирусному РНК-геному, который лишен одного или несколько элементов (например, кодирующих последовательностей для структурных белков), которые, если бы они присутствовали, обеспечивали бы успешное увеличение в количестве родительского вируса в клеточных культурах или в животных-хозяевах. В подходящем клеточном контексте репликон будет амплифцироваться и может продуцировать один или несколько типов субгеномной РНК.

Как используют в рамках изобретения, термин "РНК-репликонная частица альфавируса", сокращенно обозначаемый как "RP", представляет собой происходящий из альфавируса РНК-репликон, упакованный в структурные белки, например, капсид и гликопротеины, которые также происходят из альфавирусов, например, как описано в Pushko et al., [Virology 239(2):389-401 (1997)]. RP не может увеличиваться в количестве в клеточных культурах или в животных-хозяевах (без плазмиды-помощника или аналогичного компонента), поскольку репликон не кодирует структурные компоненты альфавируса (например, капсид и гликопротеины).

Термин "вирус не бешенства" используют для определения терминов, таких как патоген и/или антиген (или иммуноген), для указания на то, что соответствующий патоген и/или антиген (или иммуноген) не является ни вирусом бешенства, ни антигеном (или иммуногеном) вируса бешенства, и что белковый антиген (или иммуноген) не вируса бешенства не происходит из вируса бешенства.

Термины "происходить из", "происходит из" и "происходящий из" используют взаимозаменяемо в отношении данного белкового антигена и патогена или штамма этого патогена, который в природе кодирует его, и, как используют в рамках изобретения, означает, что немодифицированная и/или укороченная аминокислотная последовательность данного белкового антигена кодируется этим патогеном или штаммом этого патогена. Кодирующую последовательность в конструкции нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению для белкового антигена, происходящего из патогена, можно подвергать генетическому манипулированию, чтобы достигнуть модификации и/или укорочения аминокислотной последовательности экспрессируемого белка относительно соответствующей последовательности этого белкового антигена в патогене или штамме патогена (включая естественным образом ослабленные штаммы), из которого она происходит.

Как используют в рамках изобретения, термины "защита" или "обеспечение защиты" или "индукция защитного иммунитета" или "способствует предупреждению заболевания" и "способствует защите" не требуют полной защиты от какого-либо признака инфекции. Например, "способствует защите" может означать, что защита является достаточной, так что после заражения симптомы основной инфекции по меньшей мере уменьшаются, и/или что один или несколько из основных клеточных, физиологических или биохимических этиологических факторов или механизмов, вызывающих симптомы, уменьшаются и/или устраняются. Понятно, что "уменьшенный" как используют в этом контексте, означает относительно состояния инфекции, включая молекулярное состояние инфекции, не только физиологическое состояние инфекции.

Как используют в рамках изобретения, "вакцина" представляет собой композицию, которая является пригодной для применения у животного, например, у животного семейства собачьих (включая, в определенных вариантах осуществления людей, в то время как в других вариантах осуществления для применения конкретно не у человека), содержащую один или несколько антигенов, как правило в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, таким как жидкость, содержащая воду, который при введении животному индуцирует иммунный ответ, достаточно сильный, чтобы способствовать защите от заболевания, возникающего в результате инфицирования микроорганизмом дикого типа, т.е. достаточно сильный, чтобы способствовать предупреждению заболевания и/или предупреждению, смягчению или излечению заболевания.

Как используют в рамках изобретения, поливалентная вакцина представляет собой вакцину, которая содержит два или более различных антигена. В конкретном варианте осуществления этого типа поливалентная молекула стимулирует иммунную систему реципиента против двух или нескольких различных патогенов.

Термины "адъювант" и "иммунный стимулятор" используют в настоящем описании взаимозаменяемо, и их определяют как одно или несколько веществ, которые вызывают стимуляцию иммунной системы. В этом контексте адъювант используют для усиления иммунного ответа на один или несколько вакцинных антигенов/изолятов. Таким образом, "адъюванты" представляют собой средства, которые неспецифически повышают иммунный ответ на конкретный антиген, таким образом, снижая количество антигена, необходимое в любой данной вакцине, и/или частоту инъекций, необходимых для индукции надлежащего иммунного ответа на представляющий интерес антиген. В этом контексте адъювант используют для усиления иммунного ответа на один или несколько антигенов/изолятов вакцин.

Как используют в рамках изобретения, "неадъювантная вакцина" представляет собой вакцину или поливалентную вакцину, которая не содержит адъювант.

Как используют в рамках изобретения, термин "фармацевтически приемлемый" используют в качестве прилагательного для обозначения того, что определяемое им существительное является пригодным для применения в фармацевтическом продукте. Когда его используют, например, для описания эксципиента в фармацевтической вакцине, он характеризует эксципиент как совместимый с другими ингредиентами композиции и не причиняющий вреда предполагаемому животному-реципиенту, например, животному семейства собачьих.

"Парентеральное введение" включает подкожные инъекции, подслизистые инъекции, внутривенные инъекции, внутримышечные инъекции, внутрикожные инъекции и инфузию.

Как используют в рамках изобретения, термин "антигенный фрагмент" в отношении конкретного белка (например, белкового антигена) представляет собой фрагмент этого белка, который является антигенным, т.е. способен специфически взаимодействовать с распознающей антиген молекулой иммунной системы, такой как иммуноглобулин (антитело) или рецептор T-клеточного антигена. Предпочтительно, антигенный фрагмент по настоящему изобретению является иммунодоминантным для распознавания антителом и/или T-клеточным рецептором. В конкретных вариантах осуществления антигенный фрагмент в отношении данного белкового антигена представляет собой фрагмент этого белка, который сохраняет по меньшей мере 25% антигенности полноразмерного белка. В предпочтительных вариантах осуществления антигенный фрагмент сохраняет по меньшей мере 50% антигенности полноразмерного белка. В более предпочтительных вариантах осуществления антигенный фрагмент сохраняет по меньшей мере 75% антигенности полноразмерного белка. Антигенные фрагменты могут составлять только 20 аминокислот или наоборот могут представлять собой крупные фрагменты, в которых отсутствует всего одна аминокислота из полноразмерного белка. В конкретных вариантах осуществления антигенный фрагмент содержит от 25 до 150 аминокислотных остатков. В других вариантах осуществления антигенный фрагмент содержит от 50 до 250 аминокислотных остатков.

Как используют в рамках изобретения одна аминокислотная последовательность на 100% "идентична" или обладает 100% "идентичностью" со второй аминокислотной последовательностью, когда аминокислотные остатки обеих последовательностей идентичны. Таким образом, аминокислотная последовательность является на 50% "идентичной" второй аминокислотной последовательности, когда 50% аминокислотных остатков двух аминокислотных последовательностей являются идентичными. Сравнение последовательностей проводят на протяжении непрерывного блока аминокислотных остатков, составляющих данный белок, например, белок или часть полипептида, подвергаемые сравнению. В конкретном варианте осуществления учитывают выбранные делеции или инсерции, которые в остальном могут изменять соответствие между двумя аминокислотными последовательностями.

Как используют в рамках изобретения, процентную идентичность нуклеотидных и аминокислотных последовательностей можно определять с использованием алгоритма C, MacVector (MacVector, Inc. Cary, NC 27519), Vector NTI (Informax, Inc. MD), Oxford Molecular Group PLC (1996) и Clustal W с параметрами выравнивания по умолчанию и параметрами по умолчанию для идентичности. Эти коммерчески доступные программы также можно использовать для определения сходства последовательностей с использованием одних и тех же или аналогичных параметров по умолчанию. Альтернативно можно использовать поиск Advanced Blast с условиями фильтра по умолчанию, например, с использованием программы GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) pileup с использованием параметров по умолчанию.

Для целей настоящего изобретения "инактивированный" микроорганизм представляет собой организм, который способен индуцировать иммунный ответ у животного, но который не способен инфицировать животное. Например, инактивированный вирус бешенства может быть инактивирован посредством средства, выбранного из группы, состоящей из бинарного этиленимина, формалина, бета-пропиолактона, тимеросала или нагревания.

РНК-репликонные частицы альфавирусов по настоящему изобретению можно лиофилизировать и регидратировать посредством стерильного водного разбавителя. С другой стороны, когда РНК-репликонные частицы альфавирусов хранят по отдельности, но предполагается их смешение с другими компонентами вакцины перед введением, РНК-репликонные частицы альфавирусов можно хранить в стабилизирующем растворе этих компонентов, например, в растворе с высоким содержанием сахарозы.

Вакцину по настоящему изобретению можно без труда вводить любым стандартным путем, включая внутривенную, внутримышечную, подкожную, пероральную, интраназальную, внутрикожную и/или внутрибрюшинную вакцинацию. Специалисту в данной области будет понятно, что вакцинную композицию предпочтительно составляют надлежащим образом для каждого типа реципиентного животного и пути введения. Таким образом, настоящее изобретение также относится к способам иммунизации млекопитающего против бешенства и/или других патогенов млекопитающих. Один такой способ включает инъекцию млекопитающему иммунологически эффективного количества вакцины по настоящему изобретению, так чтобы у млекопитающего продуцировались подходящие антитела против гликопротиена (G) вируса бешенства.

Поливалентные вакцины:

Настоящее изобретение также относится к поливалентным вакцинам. Любой антиген или комбинацию таких антигенов, пригодных в вакцине для млекопитающего, можно добавлять к дефектной в отношении увеличения в количестве РНК-репликонной частице (RP) альфавирусов, которая кодирует антиген вируса бешенства для млекопитающего [например, гликопротеин (G) бешенства] в вакцине. Таким образом, такие поливалентные вакцины включены в настоящее изобретение.

ТАБЛИЦА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO: Описание Тип 1 Гликопротеин бешенства Нуклеиновая кислота
(ДНК) 2 Гликопротеин бешенства Аминокислотная 3 GGCGCGCCGCACC нуклеиновая кислота 4 Гликопротеин бешенства нуклеиновая кислота
(РНК) TTAATTAA нуклеиновая кислота

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

Ген гликопротеина (G) бешенства подвергали кодон-оптимизации для человека. Полученный ген имеет только ~85% нуклеотидную идентичность с последовательностью гликопротеина (G) живого вируса бешенства, несмотря на наличие 100% аминокислотной идентичности.

G ВИРУСА БЕШЕНСТВА (SEQ ID NO: 1)

G ВИРУСА БЕШЕНСТВА (SEQ ID NO: 2)

G ВИРУСА БЕШЕНСТВА (SEQ ID NO: 4)

ПРИМЕРЫ

Приведенные ниже примеры служат для обеспечения дальнейшего понимания изобретения, но они не предназначены для ограничения каким-либо образом эффективного объема изобретения.

ПРИМЕР 1

ВКЛЮЧЕНИЕ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, КОДИРУЮЩИХ ГЛИКОПРОТЕИН ВИРУСА БЕШЕНСТВА, В РНК-РЕПЛИКОННЫЕ ЧАСТИЦЫ АЛЬФАВИРУСОВ

ВВЕДЕНИЕ

РНК-вирусы можно использовать в качестве векторных носителей для введения вакцинных антигенов, которые встроены способами генной инженерии в их геномы. Однако их применение на сегодняшний день ограничено в основном включением вирусных антигенов в РНК-вирус, а затем введением вируса в хозяина-реципиента. Результатом является индукция защитных антител против включенных вирусных антигенов. РНК-репликонные частицы альфавирусов используют для кодирования патогенных антигенов. Такие платформы репликонов альфавирусов разработаны на основе нескольких различных альфавирусов, включая вирус венесуэльского энцефалита лошадей (VEE) [Pushko et al., Virology 239:389-401 (1997)], вирус Синдбис (SIN) [Bredenbeek et al., Journal of Virology 67:6439-6446 (1993), содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме], и вирус леса Семлики (SFV) [Liljestrom and Garoff, Biotechnology (NY) 9:1356-1361 (1991), содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме]. Более того, РНК-репликонные частицы альфавирусов являются основой для нескольких лицензированных USDA вакцин для свиней и птиц. Они включают вакцину от эпидемической диареи свиней, РНК-частицы (код продукта 19U5.P1), вакцину против свиного гриппа, РНК (код продукта 19A5.D0), вакцину против птичьего гриппа, РНК (код продукта 19O5.D0) и рецептурный препарат, РНК-частицы (код продукта 9PP0.00).

КОНСТРУИРОВАНИЕ РНК-РЕПЛИКОНА АЛЬФАВИРУСА

Получали вакцину, содержащую РНК-репликонную частицу альфавируса, кодирующую гликопротеин (G) вируса бешенства, из вируса бешенства, упакованного в капсидный белок, и гликопротеинов авирулентного штамма TC-83 вируса венесуэльского энцефалита лошадей. Нуклеотидную последовательность белка G вируса бешенства подвергали кодон-оптимизации для человека. Полученная последовательность обладает только ~85% идентичностью нуклеотидов с последовательностью гликопротеина (G) живого вируса бешенства, несмотря на наличие 100% идентичности аминокислот. Вакцину можно использовать в качестве однократной дозы, вводимой млекопитающему, например, подкожно кошкам и собакам в возрасте 12 недель или старше, или альтернативно в качестве многократных доз, включающих первичное введение, за которым следует одно или несколько вспомогательных введений.

Аминокислотную последовательность гликопротеина (G) вируса бешенства использовали для получения кодон-оптимизированных (использование кодонов человека) нуклеотидных последовательностей in silico. Оптимизированные последовательности получали в качестве синтетической ДНК от коммерческого поставщика (ATUM, Newark, CA). Таким образом, конструировали синтетический ген [SEQ ID NO: 1] на основе аминокислотной последовательности гликопротеина вируса бешенства. Конструкция (RABV-G) представляла собой аминокислотную последовательность дикого типа [SEQ ID NO: 2], кодон-оптимизированную для человека, с фланкирующей последовательностью, пригодной для клонирования в репликонную плазмиду альфавируса.

Репликонные векторы VEE, сконструированные для экспрессии G вируса бешенства, конструировали, как описано выше [см., U.S. 9441247 B2; содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки], со следующими модификациями. Происходящий из TC-83 репликонный вектор "pVEK" [раскрытый и описанный в U.S. 9441247 B2] расщепляли ферментами рестрикции AscI и PacI. ДНК-плазмиду, содержавшую нуклеотидную последовательность кодон-оптимизированной открытой рамки считывания гена G бешенства с 5’-фланкирующей последовательностью (5’-GGCGCGCCGCACC-3’) [SEQ ID NO: 3] и 3’-фланкирующей последовательностью (5’-TTAATTAA-3’), аналогичным образом расщепляли ферментами рестрикции AscI и PacI. Затем синтетическую генную кассету лигировали в расщепленный вектор pVEK и полученный клон переименовали как "pVHV-RABV-G". Номенклатура вектора "pVHV" была выбрана для указания на происходящие из pVEK репликонные векторы, содержащие трансгенные кассеты, клонированные через участки AscI и PacI в участок множественного клонирования pVEK.

Получение РНК-репликонных частиц (RP) TC-83 проводили способами, описанными ранее [U.S. 9441247 B2 и U.S. 8460913 B2; содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылок]. В кратком изложении, ДНК репликонного вектора pVHV и ДНК плазмид-помощников линеаризовывали с использованием фермента рестрикции NotI перед транскрипцией in vitro с использованием РНК-полимеразы MegaScript T7 и аналога кэпа (Promega, Madison, WI). Важно, что РНК-помощники, использованные для получения, лишены субгеномной промоторной последовательности VEE, как описано ранее [Kamrud et al., J Gen Virol. 91(Pt 7):1723-1727 (2010)]. Очищенную РНК для репликонных и хелперных компонентов объединяли и смешивали с суспензией клеток Vero, подвергали электропорации в кюветах размером 4 мм и возвращали в клеточную культуральную среду OptiPro^® SFM (Thermo Fisher, Waltham, MA). После инкубации в течение ночи РНК-репликонные частицы альфавирусов очищали от клеток и среды, пропуская суспензию через глубинный фильтр ZetaPlus BioCap^® (3M, Maplewood, MN), промывая фосфатно-солевым буфером, содержащим 5% сахарозу (масс./об.), и, наконец, элюируя оставшиеся RP 400 мМ буфером NaCl. Элюированные RP составляли до конечного содержания сахарозы 5% (масс./об.), пропускали через 0,22-микронный мембранный фильтр и распределяли на аликвоты для хранения. Титр функциональных RP определяли с использованием иммунофлуоресцентного анализа монослоев инфицированных клеток Vero.

ПРИМЕР 2

ВАКЦИНЫ, СОДЕРЖАЩИЕ РНК-РЕПЛИКОННЫЕ ЧАСТИЦЫ АЛЬФАВИРУСОВ, КОДИРУЮЩИЕ ГЛИКОПРОТЕИН ВИРУСА БЕШЕНСТВА, ВВОДИМЫЕ ЖИВОТНЫМ СЕМЕЙСТВА СОБАЧЬИХ

Первоначальное испытание проводили для оценки безопасности и серологического ответа у собак после вакцинации вакциной на основе RP-G вируса бешенства. Вакцины на основе RP-G вируса бешенства для испытания составляли с 5% сахарозе и 1% собачьей сыворотке в качестве стабилизатора и жидкую вакцину замораживали для хранения. Проводили вакцинацию пяти групп по пять собак, как обобщенно представлено ниже:

ТАБЛИЦА 1

ВВЕДЕНИЕ ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ RP G ВИРУСА БЕШЕНСТВА ЖИВОТНЫМ СЕМЕЙСТВА СОБАЧЬИХ

Группа № животных Вакцина RP/доза Сутки вакцинации 1 5 RP-Бешенство 4,1×10⁸ 0 2 5 RP-Бешенство 5,0×10⁷ 0 3 5 RP-Бешенство 8,3×10⁶ 0 4 5 Коммерческая ^# 0 5 5 Плацебо ^* 3,9×10⁷ 0, 21

^# Коммерческая вакцина представляла собой DEFENSOR^® 3 (продаваемый Zoetis).

^* Плацебо-вакцина представляла собой RP, кодирующие вставку не вируса бешенства для животного семейства собачьих (RP-NR), вместо антигена вируса бешенства.

Собак в возрасте 12-13 недель вакцинировали 1,0 мл соответствующей вакцины (см. таблицу 1 выше), вводимой подкожно в правую лопаточную область. Как указано, собакам в четвертой группе вводили лицензированную в настоящее время коммерческую вакцину против бешенства DEFENSOR^® 3, продаваемую Zoetis. Собакам в пятой группе вводили постороннюю конструкцию RP, вставку не из вируса бешенства животного семейства собачьих (RP-NR), в качестве плацебо. После вакцинации собак наблюдали в отношении неблагоприятных реакций на вакцины путем проведения клинической оценки и пальпации области инъекции через 4-8 часов после вакцинации и каждые сутки в течение семи суток после вакцинации. Не наблюдали неблагоприятных локальных или системных реакций на какую-либо из вакцин. У собак проводили взятие крови за сутки до вакцинации и с интервалами один месяц после вакцинации в течение первых трех месяцев испытания. Сыворотку тестировали в отношении титра антител против вируса бешенства посредством теста быстрого ингибирования флуоресцентных очагов (RFFIT).

Результаты серологии против бешенства приведены в таблице 2 ниже. Титры выражены в качестве международных единиц на мл (МЕ/ мл), причем 0,5 МЕ/ мл считались защитным титром.

ТАБЛИЦА 2

РЕЗУЛЬТАТЫ СЕРОЛОГИИ ДЛЯ ПЕРИОДА 3 МЕСЯЦА ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ ВАКЦИН ЖИВОТНЫМ СЕМЕЙСТВА СОБАЧЬИХ

ID собаки Группа Сутки -1 Сутки 30 Сутки 59 Сутки 90 64914 1 < 0,1 37,0 8,9 4,0 65822 1 0,2 33,0 10,0 4,0 66313 1 0,1 38,0 11,1 4,7 66356 1 < 0,1 33,0 11,1 3,3 67743 1 < 0,1 18,5 6,6 3,3 64052 2 < 0,1 12,5 2,6 2,8 66062 2 < 0,1 8,5 3,1 2,2 67034 2 < 0,1 17,5 3,8 2,4 67085 2 < 0,1 14,5 11,1 2,4 68022 2 0,1 11,0 2,8 1,3 63586 3 < 0,1 13,7 3,8 2,2 65864 3 0,2 3,5 1,1 0,7 66593 3 < 0,1 4,3 2,0 1,3 67379 3 < 0,1 4,7 1,3 2,0 67816 3 < 0,1 13,7 1,2 0,9 64451 4 < 0,1 6,6 1,1 0,5 66097 4 < 0,1 0,2 < 0,1 < 0,1 66292 4 < 0,1 2,2 0,4 0,1 67620 4 < 0,1 3,4 0,7 0,1 67867 4 < 0,1 3,4 0,6 0,1 62032 5 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 66003 5 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 66984 5 < 0,1 < 0,1 < 0,1 < 0,1 67051 5 < 0,1 0,1 < 0,1 < 0,1 67701 5 < 0,1 0,1 < 0,1 < 0,1

Хотя изначально предполагалось, что исследование закончится через три месяца после вакцинации, исследование продлили, поскольку серологические титры в группах RP вируса бешенства неожиданно: (i) сохранялись на защитных уровни в течение этого периода времени и (ii) были лучшими, чем у лицензированной на настоящий момент коммерческой вакцины против бешенства. Были оставлены пять собак из группы 1, три собаки из группы 2 и две собаки из группы 4.

У оставленных собак проводили взятие крови для получения сыворотки с интервалами приблизительно один месяц для испытания в течение одного года после вакцинации.

Результаты серологии против бешенства для первого года для выбранных собак представлены в таблице 3 ниже. Титры выражают в качестве международных единиц на мл (МЕ/ мл), причем защитным титром считался титр 0,5 МЕ/мл:

ТАБЛИЦА 3

РЕЗУЛЬТАТЫ СЕРОЛОГИИ ДЛЯ ПЕРИОДА 1 ГОД ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ ВАКЦИН ЖИВОТНЫМ СЕМЕЙСТВА СОБАЧЬИХ

ID собаки Группа Сутки -1 Сутки 30 Сутки 59 Сутки 90 Сутки 120 Сутки 150 Сутки 181 Сутки 210 Сутки 240 Сутки 300 Сутки 330 Сутки 365 64914 1 < 0,1 37,0 8,9 4,0 2,0 0,9 1,3 0,6 2,2 0,6 0,6 0,5 65822 1 0,2 33,0 10,0 4,0 3,8 2,8 2,3 1,6 2,7 2,0 2,2 2,6 66313 1 0,1 38,0 11,1 4,7 5,9 9,0 10,6 11,1 11,8 16,0 10,8 11,0 66356 1 < 0,1 33,0 11,1 3,3 3,4 3,1 1,9 2,3 2,3 1,6 2,3 2,2 67743 1 < 0,1 18,5 6,6 3,3 3,4 1,6 0,5 0,5 0,8 0,5 0,3 0,5 64052 2 < 0,1 12,5 2,6 2,8 3,1 3,0 2,1 1,6 2,5 0,8 0,7 2,0 66062 2 < 0,1 8,5 3,1 2,2 1,8 2,7 1,3 1,1 1,1 1,0 0,6 1,5 68022 2 0,1 11,0 2,8 1,3 0,7 0,6 0,1 0,1 0,1 <0,1 <0,1 <0,1 64451 4 < 0,1 6,6 1,1 0,5 0,1 0,1 0,1 0,1 0,2 <0,1 <0,1 0,1 67620 4 < 0,1 3,4 0,7 0,1 <0,1 0,1 <0,1 <0,1 0,1 <0,1 ≤0,1 <0,1

После этого первоначального испытания следовало второе испытание (в настоящее время продолжающееся), которое дало аналогичные результаты, по меньшей мере на протяжении истекшего периода шести месяцев.

ПРИМЕР 3

ВАКЦИНЫ, СОДЕРЖАЩИЕ РНК-РЕПЛИКОННЫЕ ЧАСТИЦЫ АЛЬФАВИРУСОВ, КОДИРУЮЩИЕ ГЛИКОПРОТЕИН ВИРУСА БЕШЕНСТВА, ВВОДИМЫЕ ЖИВОТНЫМ СЕМЕЙСТВА КОШАЧЬИХ

Первоначальное испытание проводили для оценки безопасности и серологического ответа у кошек после вакцинации RP-вакциной на основе G вируса бешенства. RP-вакцины на основе G вируса бешенства для этого испытания составляли в экспериментальном жидком стабилизаторе [см., например, U.S. 9314519 B2] и хранили охлажденными при 2-7°C. Вакцинировали четыре группы кошек, как обобщенно представлено в таблице 4 ниже:

ТАБЛИЦА 4

ВВЕДЕНИЕ RP-ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ G ВИРУСА БЕШЕНСТВА ЖИВОТНЫМ СЕМЕЙСТВА КОШАЧЬИХ

Группа № животных Вакцина RP/доза 1 10 RP-Бешенство 2,7×10⁷ 2 10 RP-Бешенство 2,6×10⁶ 3 10 RP-Бешенство 4,0×10⁵ 4 5 Коммерческая ^#

^# Коммерческая вакцина представляла собой DEFENSOR^® 3 (продаваемую Zoetis).

Кошек в возрасте 15-16 недель вакцинировали 1,0 мл репрезентативной вакцины (см. таблицу 4 выше), вводимой подкожно в правую лопаточную область. Как указано, кошкам в четвертой группе вводили лицензированную в настоящее время коммерческую вакцину против бешенства DEFENSOR^® 3, продаваемую Zoetis, которая содержит химически инактивированный вирус бешенства вместе с адъювантом гидроксидом алюминия.

После вакцинации кошек наблюдали в отношении неблагоприятных реакций на вакцины путем проведения клинической оценки и пальпации области инъекции через 4-8 часов после вакцинации и каждые сутки в течение семи суток после вакцинации. Кошек также наблюдали в течение периода 10-15 минут сразу после вакцинации в отношении системных реакций. Некоторые немедленные системные реакции наблюдали у кошек в группах 1, 2 и 3, что указывало на то, что кошки испытывали жжение и болезненную реакцию при инъекции. Эти реакции сохранялись в течение не более чем пять минут. Эти реакции области инъекции были приписаны композиции экспериментального жидкого стабильного состава. Не наблюдали локальных неблагоприятных реакций после вакцинации. У кошек проводили взятие сыворотки за сутки до вакцинации и с интервалами один месяц после вакцинации в ходе испытания в течение трех месяцев. Сыворотку тестировали в отношении титра антител к вирусу бешенства посредством теста быстрого ингибирования флуоресцентных очагов (RFFIT). Результаты серологии против вируса бешенства представлены в таблице 5 ниже. Титры выражены в качестве международных единиц на мл (МЕ/ мл), причем 0,5 МЕ/мл считаются защитным титром.

ТАБЛИЦА 5

РЕЗУЛЬТАТЫ СЕРОЛОГИИ ДЛЯ ПЕРИОДА 5 МЕСЯЦЕВ ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ ВАКЦИН ЖИВОТНЫМ СЕМЕЙСТВА КОШАЧЬИХ

ID ЖИВОТНОГО Группа Сутки -1 Сутки 30 Сутки 58 Сутки 91 Сутки 120 Сутки 149 16CNH2 1 <0,1 119,0 69,0 40,0 37,0 106,0 16CNL4 <0,1 30,0 24,0 16,0 12,5 11,0 16CNM6 <0,1 37,0 28,0 32,0 29,0 71,0 16JNA2 <0,1 19,0 30,0 27,0 22,0 23,0 16JNE1 <0,1 45,0 31,0 28,0 15,0 23,0 16JNF1 <0,1 113,0 40,0 31,0 27,0 34,0 16JNG3 <0,1 45,0 31,0 16,0 12,5 26,0 16JNI1 <0,1 26,0 25,0 28,0 10,0 22,0 16JNM1 <0,1 27,0 30,0 31,0 27,0 30,0 16JNM2 <0,1 50,0 28,0 32,0 26,0 26,0 Геометрический средний титр <0,1 42,7 32,0 27,1 20,0 30,4 16CMX5 2 <0,1 25,0 28,0 32,0 33,0 106,0 16CNF4 <0,1 10,0 9,0 5,0 5,5 5,1 16CNH4 <0,1 24,0 14,8 6,0 10,8 17,0 16CNJ2 <0,1 32,0 31,0 27,0 22,0 27,0 16JNB3 <0,1 25,0 31,0 31,0 18,0 23,0 16JNB4 <0,1 23,0 30,0 31,0 23,0 26,0 16JNG2 <0,1 10,5 12,6 11,0 13,5 21,0 16JNJ1 <0,1 11,0 22,0 25,0 6,0 23,0 16JNJ2 <0,1 23,0 28,0 28,0 18,0 23,0 16JNK1 <0,1 10,0 13,4 7,0 8,3 5,0 Геометрический средний титр <0,1 17,6 20,2 16,3 13,6 19,6 16CMV3 3 <0,1 6,0 6,0 6,0 12,3 9,4 16CNB4 <0,1 25,0 28,0 25,0 16,0 24,0 16CNB5 <0,1 33,0 36,0 40,0 27,0 38,0 16CNC5 <0,1 25,0 22,0 8,0 13,5 19,0 16CNC6 <0,1 26,0 24,0 20,0 20,0 28,0 16CNM7 <0,1 68,0 126,0 134,0 115,0 210,0 16JNF2 <0,1 11,0 12,6 6,0 10,8 9,4 16JNG1 <0,1 8,0 14,8 7,0 12,3 11,0 16JNJ5 <0,1 19,0 14,8 25,0 23,0 27,0 16JNK2 <0,1 10,5 3,1 3,0 2,8 3,5 Геометрический средний титр <0,1 18,1 17,9 14,5 16,4 19,8 16CNM8 4 <0,1 26,0 10,0 3,0 6,3 9,4 16CNO1 <0,1 24,0 14,1 6,0 11,5 23,0 16JNC1 <0,1 11,0 3,8 1,0 1,0 1,5 16JNJ3 <0,1 9,4 2,8 1,0 1,3 2,2 16JNO1 <0,1 113,0 31,0 14,0 9,0 8,8 Геометрический средний титр <0,1 23,6 8,6 3,0 3,9 5,7

RP-вакцина против вируса бешенства индуцирует высокие серологические титры против бешенства при введении кошкам в качестве однократной дозы. Примечательно, что титры RFFIT у кошек являются более высокими, чем титры, наблюдаемые для собак, вакцинированных сходной дозой. Титр 0,5 МЕ/мл в соответствии с тестом RFFIT считается защитным титром, однако известно, что кошки с серологическим титром ниже этого уровня часто защищены от заражения вирулентным вирусом в испытаниях длительного иммунитета. Все три группы, вакцинированных различными дозами RP-вакцины против вируса бешенства, имеют более высокие групповые геометрические средние титры против вируса бешенства согласно RFFIT, чем группа, вакцинированная лицензированным в настоящее время коммерческим продуктом против бешенства, которая имеет указание на ярлыке о трехлетней длительности иммунитета.

После этого первоначального испытания следовало второе испытание (в настоящее время продолжающееся), которое дало аналогичные результаты, по меньшей мере на протяжении истекшего периода шести месяцев.

Объем настоящего изобретения не ограничивается конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем описании. Действительно, различные модификации изобретения в дополнение к модификациям, описанным в настоящем описании, станут понятными специалистам в данной области из приведенного выше описания. Подразумевается, что такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.

Кроме того, должно быть понятно, что все размеры оснований или размеры аминокислот, и все величины молекулярного веса или молекулярной массы, приведенные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными и предоставлены для описания.

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ:

<110> Intervet, Inc.

Intervet, International, BV

Tarpey, Ian

<120> ВАКЦИНА ПРОТИВ ВИРУСА БЕШЕНСТВА

<130> 24532

<150> 62/581,955

<151> 2017-11-06

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1575

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> кодон-оптимизированная для человека

<400> 1

atggtgccgc aggctctcct gtttgtcccc cttctggtct ttccattgtg ttttgggaaa 60

ttccctatct acacaattcc ggacaagttg ggaccctgga gcccaattga cattcatcat 120

ctcagctgcc cgaacaattt ggtcgtggag gacgaaggat gcaccaacct gtcggggttc 180

tcctacatgg aattgaaagt cggatacatc agtgccatta agatgaacgg gttcacttgc 240

acaggcgtcg tgactgaagc tgagacatac actaacttcg tgggatatgt cactaccact 300

ttcaaaagaa agcatttccg ccctactcct gatgcttgta gggccgcata caactggaag 360

atggccggtg accccagata tgaggaatca cttcacaatc cgtaccctga ctaccactgg 420

cttcggactg tcaaaaccac caaggagtca ctcgtgatca ttagtccaag tgtggctgat 480

cttgacccat acgaccggtc acttcactca cgggtgttcc cgggggggaa ttgctctggt 540

gtcgcagtgt cgtcaaccta ctgctccaca aaccacgatt acaccatttg gatgccagaa 600

aatcctcggc ttggtatgtc atgtgacatt ttcaccaatt ctcgggggaa gagggcttcc 660

aaagggtctg aaacttgcgg ctttgtcgat gagcggggct tgtataagtc acttaaaggt 720

gcttgcaaac tcaagctttg tggtgtcttg ggattgagat tgatggatgg aacttgggtc 780

gcaatgcaga cttctaacga aaccaaatgg tgccctcccg gacagcttgt gaatttgcat 840

gactttcgct ctgacgaaat tgagcatctt gtcgtcgagg agttggtcaa gaagcgggaa 900

gagtgtctgg atgctttgga atcaatcatg accaccaagt cagtgtcttt cagacggctc 960

tcacatctta ggaaattggt gccaggtttt ggaaaagcat ataccatttt caacaagacc 1020

cttatggaag ccgatgctca ctacaagtct gtcaggactt ggaatgagat catcccgtct 1080

aaagggtgtc ttagggtcgg agggagatgt catcctcatg tcaacggagt ctttttcaat 1140

ggtatcattc ttggacctga cggaaatgtc cttatccctg agatgcaatc ttccctcctc 1200

cagcaacaca tggaacttct tgtctcatcg gtcatccccc ttatgcaccc cctggctgac 1260

ccatcaaccg tgttcaagaa cggtgacgag gcagaggatt ttgtcgaggt ccaccttccc 1320

gatgtgcatg aacggatctc tggtgtcgac cttggactcc ctaactgggg aaagtatgtc 1380

cttctgtcgg caggagccct gactgccttg atgttgatta tcttcctgat gacttgttgg 1440

aggagagtca atcggtcgga gccaacacaa cataatctca gaggaacagg aagggaggtg 1500

tcagtcacac cccaaagcgg gaagatcatt tcgtcttggg agtcatacaa gagcggaggt 1560

gaaaccggac tgtga 1575

<210> 2

<211> 524

<212> БЕЛОК

<213> Вирус бешенства

<400> 2

Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu

1 5 10 15

Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro

20 25 30

Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val

35 40 45

Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu

50 55 60

Leu Lys Val Gly Tyr Ile Ser Ala Ile Lys Met Asn Gly Phe Thr Cys

65 70 75 80

Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr

85 90 95

Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala

100 105 110

Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu

115 120 125

Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val

130 135 140

Lys Thr Thr Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Ala Asp

145 150 155 160

Leu Asp Pro Tyr Asp Arg Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Gly Gly

165 170 175

Asn Cys Ser Gly Val Ala Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His

180 185 190

Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met Ser Cys

195 200 205

Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Ser Glu

210 215 220

Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly

225 230 235 240

Ala Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp

245 250 255

Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp Cys Pro

260 265 270

Pro Gly Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu

275 280 285

His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Lys Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp

290 295 300

Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu

305 310 315 320

Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile

325 330 335

Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg

340 345 350

Thr Trp Asn Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly

355 360 365

Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu

370 375 380

Gly Pro Asp Gly Asn Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu

385 390 395 400

Gln Gln His Met Glu Leu Leu Val Ser Ser Val Ile Pro Leu Met His

405 410 415

Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asn Gly Asp Glu Ala Glu

420 425 430

Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val His Glu Arg Ile Ser Gly

435 440 445

Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Leu Ser Ala

450 455 460

Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Trp

465 470 475 480

Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr

485 490 495

Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser

500 505 510

Trp Glu Ser Tyr Lys Ser Gly Gly Glu Thr Gly Leu

515 520

<210> 3

<211> 13

<212> ДНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> 5'-фланкирующая последовательность

<400> 3

ggcgcgccgc acc 13

<210> 4

<211> 1575

<212> РНК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> кодон-оптимизированная для человека

<400> 4

auggugccgc aggcucuccu guuugucccc cuucuggucu uuccauugug uuuugggaaa 60

uucccuaucu acacaauucc ggacaaguug ggacccugga gcccaauuga cauucaucau 120

cucagcugcc cgaacaauuu ggucguggag gacgaaggau gcaccaaccu gucgggguuc 180

uccuacaugg aauugaaagu cggauacauc agugccauua agaugaacgg guucacuugc 240

acaggcgucg ugacugaagc ugagacauac acuaacuucg ugggauaugu cacuaccacu 300

uucaaaagaa agcauuuccg cccuacuccu gaugcuugua gggccgcaua caacuggaag 360

auggccggug accccagaua ugaggaauca cuucacaauc cguacccuga cuaccacugg 420

cuucggacug ucaaaaccac caaggaguca cucgugauca uuaguccaag uguggcugau 480

cuugacccau acgaccgguc acuucacuca cggguguucc cgggggggaa uugcucuggu 540

gucgcagugu cgucaaccua cugcuccaca aaccacgauu acaccauuug gaugccagaa 600

aauccucggc uugguauguc augugacauu uucaccaauu cucgggggaa gagggcuucc 660

aaagggucug aaacuugcgg cuuugucgau gagcggggcu uguauaaguc acuuaaaggu 720

gcuugcaaac ucaagcuuug uggugucuug ggauugagau ugauggaugg aacuuggguc 780

gcaaugcaga cuucuaacga aaccaaaugg ugcccucccg gacagcuugu gaauuugcau 840

gacuuucgcu cugacgaaau ugagcaucuu gucgucgagg aguuggucaa gaagcgggaa 900

gagugucugg augcuuugga aucaaucaug accaccaagu cagugucuuu cagacggcuc 960

ucacaucuua ggaaauuggu gccagguuuu ggaaaagcau auaccauuuu caacaagacc 1020

cuuauggaag ccgaugcuca cuacaagucu gucaggacuu ggaaugagau caucccgucu 1080

aaaggguguc uuagggucgg agggagaugu cauccucaug ucaacggagu cuuuuucaau 1140

gguaucauuc uuggaccuga cggaaauguc cuuaucccug agaugcaauc uucccuccuc 1200

cagcaacaca uggaacuucu ugucucaucg gucauccccc uuaugcaccc ccuggcugac 1260

ccaucaaccg uguucaagaa cggugacgag gcagaggauu uugucgaggu ccaccuuccc 1320

gaugugcaug aacggaucuc uggugucgac cuuggacucc cuaacugggg aaaguauguc 1380

cuucugucgg caggagcccu gacugccuug auguugauua ucuuccugau gacuuguugg 1440

aggagaguca aucggucgga gccaacacaa cauaaucuca gaggaacagg aagggaggug 1500

ucagucacac cccaaagcgg gaagaucauu ucgucuuggg agucauacaa gagcggaggu 1560

gaaaccggac uguga 1575

<---

Настоящее изобретение относится к биотехнологии и ветеринарии. Предложена вакцина для способствования предупреждению заболевания вследствие вируса бешенства, содержащая РНК-репликонную частицу альфавируса, которая кодирует антиген вируса бешенства, и фармацевтически приемлемый носитель. Предложен способ иммунизации млекопитающего против вируса бешенства, включающий введение млекопитающему одной дозы иммунологически эффективного количества вакцины. Вакцинирование различными дозами RP-вакцины против вируса бешенства дает более высокие групповые геометрические средние титры против вируса бешенства согласно RFFIT, чем вакцинирование лицензированным в настоящее время коммерческим продуктом против бешенства, который имеет указание на ярлыке о трехлетней длительности иммунитета. Длительная защита достигается с помощью одноразовой дозы. 2 н. и 12 з.п. ф-лы, 5 табл., 3 пр.

1. Вакцина для способствования предупреждению заболевания вследствие вируса бешенства, содержащая РНК-репликонную частицу альфавируса, которая кодирует антиген вируса бешенства, и фармацевтически приемлемый носитель.

2. Вакцина по п.1, в которой РНК-репликонная частица альфавируса представляет собой РНК-репликонную частицу альфавируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE).

3. Вакцина по п.1 или 2, в которой антиген вируса бешенства представляет собой гликопротеин (G).

4. Вакцина по пп.1, 2 или 3, которая содержит одну или более дополнительных РНК-репликонных частиц альфавирусов, которые кодируют второй антиген вируса бешенства, который происходит из другого штамма вируса бешенства, чем штамм вируса бешенства, из которого происходит указанный антиген вируса бешенства.

5. Вакцина по п.4, в которой второй антиген вируса бешенства представляет собой гликопротеин (G).

6. Вакцина по п.4 или 5, в которой одна или более дополнительных РНК-репликонных частиц альфавирусов представляют собой РНК-репликонные частицы альфавирусов VEE.

7. Вакцина по пп.1-5 или 6, в которой гликопротеин (G) вируса бешенства содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 95% идентичности с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2.

8. Вакцина по любому из пп.1-7 и фармацевтически приемлемый носитель.

9. Вакцина по любому из пп.1-8, где млекопитающее выбрано из группы, состоящей из животного семейства собачьих, животного семейства кошачьих, животного семейства лошадиных, хорька, овцы и животного подсемейства бычьих.

10. Вакцина по любому из пп.1-9, которая дополнительно содержит по меньшей мере один антиген не вируса бешенства, для индукции защитного иммунитета против патогена не вируса бешенства.

11. Вакцина по любому из пп.1-10, которая дополнительно содержит РНК-репликонную частицу альфавируса, содержащую нуклеотидную последовательность, кодирующую по меньшей мере один белковый антиген или его антигенный фрагмент, который происходит из патогена не вируса бешенства.

12. Вакцина по любому из пп.1-11, которая представляет собой безадъювантную вакцину.

13. Способ иммунизации млекопитающего против вируса бешенства, включающий введение млекопитающему одной дозы иммунологически эффективного количества вакцины по любому из пп.1-12.

14. Способ по п.13, в котором млекопитающее выбрано из группы из животного семейства собачьих, животного семейства кошачьих и животного семейства лошадиных.