ПОЛИВАЛЕНТНАЯ ВАКЦИНА ДЛЯ ЖИВОТНЫХ СЕМЕЙСТВА КОШАЧЬИХ Российский патент 2023 года по МПК A61K39/12 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

По настоящей заявке испрашивается приоритет согласно 35 U.S.C. § 119(e) временной заявке США с серийным номером № 62/599401, поданной 15 декабря 2017 года, временной заявке США с серийным номером № 62/596508, поданной 8 декабря 2017 года, временной заявке США с серийным номером № 62/582050, поданной 6 ноября 2017 года и временной заявке США № 62/581955, поданной 6 ноября 2017 года, содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к новым поливалентным вакцинам для животных семейства кошачьих. Также предусматриваются способы получения и применения поливалентных вакцин отдельно или в комбинации с другими защитными средствами.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Респираторные заболевания кошек включают заболевания, характеризующиеся риносинуситом, конъюнктивитом, слезоотделением, слюноотделением и язвами полости рта. Двумя наиболее распространенными патогенами, ассоциированными с заболеваниями верхних дыхательных путей у кошек, являются кошачий кальцивирус (FCV) и вирус кошачьего вирусного ринотрахеита (FVR), который также известен как кошачий вирус герпеса 1 типа (FHV-1). Эти два вируса животных семейства кошачьих считаются ответственными приблизительно за 80% всех респираторных заболеваний у кошек по всему миру. Бактерия Chlamydophila felis является третьим патогеном, который также играет роль в респираторных заболеваниях кошек. Соответственно, в настоящее время коммерчески доступны вакцины против этих трех патогенов.

FVR представляет собой альфагерпесвирус, который является родственным вирусу герпеса 1 собак и, возможно, является наиболее важным среди респираторных патогенов кошек. FVR представляет собой крупный оболочечный ДНК-вирус, который является чрезвычайно контагиозным и может приводить к тяжелому заболеванию у котят, а также у кошек. Таким образом, большинство кошек сталкиваются с FVR в ходе их жизни. Коммерчески доступная вакцина Feline-1 Nobivac^® содержит модифицированный живой вирус кошачьего ринотрахеита.

Наиболее частой характеристикой и клиническими признаками инфекции FCV являются развитие везикул (язв) на языке и слизистой оболочке полости рта, которые начинаются как мелкие отдельные язвы, но могут распространяться и поражать большую часть языка. Часто у инфицированных кошек наблюдается лихорадка. Определенные штаммы FCV также вызывают заболевание у кошек, известное как синдром хромоты, который характеризуется лихорадкой, болезненностью суставов и мышц (хромота) и иногда изъязвлением языка/полости рта. Кроме того, некоторые штаммы FCV ассоциированы с хроническим стоматитом у инфицированных кошек. Кошки, инфицированные FCV, могут стать постоянно инфицированными и могут выделять инфекционный вирус в течение длительных периодов времени.

Изоляты FCV являются с антигенной точки зрения в высокой степени вариабельными и антитела от кошек, вакцинированных более ранними вакцинными штаммами FCV, такими как FCV F9, не осуществляют эффективную нейтрализацию всех современных полевых изолятов. Более того, идентифицированы новые штаммы FCV, ассоциированные с системным заболеванием и высокой смертностью [см. например, U.S. 7449323 B2]. Эти "вирулентные системные" (VS-FCV) изоляты ответственны за локализованные вспышки и современные вакцины также, по-видимому, не защищают кошек от заболевания, вызываемого этими штаммами.

FCV содержит одноцепочечный РНК-геном с положительной смысловой цепью, состоящий из трех открытых рамок считывания (ORF). Геном является полиаденилированным на 3’-конце и связан с кодируемым вирусом белком на 5’-конце. Первая открытая рамка считывания кодирует вирусную протеазу и РНК-зависимую РНК-полимеразу, которые экспрессируются на одном полипептиде. Затем этот полипептид подвергается посттрансляционному расщеплению вирусной протеазой. Вторая открытая рамка считывания кодирует основной капсидный белок (т.е. капсидный белок FCV), который имеет шесть областей, обозначаемых как A-F [Scott et al., 60 Am. J. Vet. Res.:652-658 (1999)]. Область A расщепляется с образованием зрелого капсидного белка. В то время как области B, D и F ORF2 являются относительно консервативными между изолятами FCV, области C и E являются вариабельными, причем область E ORF2 содержит основные B-клеточные эпитопы [см., Radford et al., 38(2) Vet Res.:319-335 (2007)]. ORF 3 кодирует малый структурный белок [Sosnovtsev and Green, 277 Virology: 193-203 (2000)].

Chlamydophila felis представляет собой бактерию, которая является эндемичной среди домашних кошек по всему миру.C. felis может приводить к воспалению конъюнктивы, риниту и респираторным проблемам у инфицированных кошек. C. felis имеет относительно небольшой геном, который кодирует только приблизительно тысячу белков. Эта бактерия также содержит плазмиду, содержащую 75000 пар оснований. Коммерчески доступная вакцина Feline-1 Nobivac^® содержит модифицированные живые Chlamydophila felis.

В дополнение к тремя патогенам, связанным с респираторным заболеванием у животных семейства кошачьих, описанным выше, кошек также часто вакцинируют против трех других вирусов: вируса кошачьего лейкоза (FeLV), вируса кошачьей панлейкопении (FPV или FPLV) и вируса бешенства. Вирус кошачьего лейкоза представляет собой ретровирус, который инфицирует домашних кошек, вызывая значительную заболеваемость и смертность по всему миру. Хотя он в основном передается через слюну, также описано, что FeLV распространяется через контакт с жидкостями организма [Pacitti et al., Vet Rec 118:381-384 (1986) doi:10,1136/vr.118,14.381; Levy et al., J Feline Med Surg 10:300-316 (2008) doi:10,1016/j.jfms.2008.03.002]. Клинические признаки у кошек, наблюдаемые в ходе инфекций FeLV, включают: цитопролиферативные нарушения (лимфоидные или миелоидные опухоли), цитосупрессивные нарушения (инфекционные заболевания, ассоциированные с иммуносупрессией, анемией, миелосупрессией), воспалительные нарушения, неврологические нарушения, выкидыши и энтериты [Hoover et al., J Am Vet Med Assoc 199:1287-1297 (1991); Levy and Crawford, Textbook of Veterinary Internal Medicine, 6^th ed (Ettinger SJ, Feldman EC., eds.) WB Saunders, Philadelphia, PA. (2005)]. Распространенность антигенемии может варьироваться от 1-5% у здоровых кошек до 15-30% у страдающих от заболевания кошек [Hosie et al. Veterinary Records, 128: 293-297 (1989); Braley, Feline Practice 22: 25-29 (1994); Malik et al., Australian Veterinary Journal 75:323-327 (1997); Arjona et al., Journal of Clinical Microbiology 38:3448-3449 (2000)]. FeLV часто вызывает длительную инфекцию с сопутствующей персистирующей виремией, что часто приводит к смерти кошки-хозяина.

Одноцепочечный РНК-геном FeLV кодирует только три гена: (i) ген ENV, который кодирует гликопротеин оболочки, (ii) ген GAG, который кодирует основные структурные компоненты вируса, и (iii) ген POL, который кодирует РНК-полимеразу [Thomsen et al., Journal of General Virology 73:1819-1824 (1992)]. Ген оболочки FeLV (ENV) кодирует белок-предшественник gp85, который протеолитически процессируется одним или несколькими клеточными ферментами с образованием основного гликопротеина оболочки gp70 и ассоциированного с ним трансмембранного белка p15E [DeNoronha, et al., Virology 85:617-621 (1978); Nunberg et al., PNAS 81:3675-3679 (1983)]. Трансмембранный белок p15E содержит последовательность, являющуюся консервативной среди гамма-ретровирусов с иммуносупрессивными свойствами [Mathes et al., Nature 274:687-689 (1978)]. Недавно комитет по медицинским продуктам для ветеринарного применения (CVMP) Европейского агентства по оценке лекарственных средств принял положительное заключение по вакцине, содержащей рекомбинантный антиген оболочки FeLV p45, происходящий из поверхностного гликопротеина gp70 подгруппы A FeLV, который экспрессируется в Escherichia coli, в качестве активного вещества. Гликопротеин оболочки FeLV является мишенью ответов FeLV-специфических цитотоксических T-клеток, а также нейтрализующих антител и, таким образом, одним из основных иммуногенов FeLV [Flynn et al., J. Virol. 76(5): 2306-2315 (2002)].

Кошачья панлейкопения (FPV или FPLV) является в высокой степени контагиозным вирусным заболеванием кошек, которое часто является летальным. Название панлейкопении происходит от низкого количества белых кровяных клеток (лейкоцитов) у страдающих ей животных. FPLV инфицирует и активно разрушает делящиеся клетки в лимфоидных тканях, костном мозге, эпителии кишечника и у очень молодых котят в сетчатке и мозжечке. Вирус также может распространяться у беременных кошек трансплацентарно, вызывая резорбцию эмбрионов, мумификацию плодов, мертворождение или выкидыш. Инфицированные кошки выделяют вирус в моче, стуле и носовых секретах, что приводит к инфицированию восприимчивых кошек, когда они контактируют с этими секретами или блохами инфицированных кошек. Клинические признаки инфекции FPLV также называют кошачьей чумкой или кошачьим парвовирусом.

Вирус кошачьей парлейкопении является представителем рода Parvovirus семейства Parvoviridae. Таким образом FPLV является близкородственным вирусу энтерита норок и собачьему парвовирусу 2 типа (CPV-2). FPLV имеет одноцепочечный ДНК-геном, который был отсеквенирован [см., Liu et al., Genome Announc. Mar-Apr; 3(2) (2015): e01556-14]. Коммерчески доступная вакцина Feline-1 Nobivac^® содержит модифицированный живой вирус кошачьей панлейкопении.

Бешенство представляет собой предотвратимое зоонозное заболевание, которое приводит к воспалению головного мозга у человека и других млекопитающих. Клиническое бешенство представляет собой острый прогрессирующий энцефалит, который обычно подразделяют на буйное или паралитическое бешенство. Буйное бешенство характеризуется беспокойством, раздражительностью и агрессией. Паралитическое бешенство характеризуется чрезмерным слюноотделением, глубоким затрудненным дыханием, параличом и в конечном итоге комой. Этиологическим фактором бешенства является вирус бешенства, который способен инфицировать большинство млекопитающих и поддерживает резервуар заболевания в диких и восприимчивых домашних животных.

Вирус бешенства представляет собой оболочечный РНК-вирус, который кодирует пять структурных белков: нуклеопротеин (N), фосфопротеин (P), матриксный белок (M), гликопротеин (G) и РНК-зависимую РНК-полимеразу [Dietzschold et al., Crit Rev Immunol 10:427-439 (1991)]. Гликопротеин (G) считается защитным антигеном, который индуцирует нейтрализующие вирус антитела [Cox et al., Infect Immun 16:754-759 (1977)]. Для борьбы с этим заболеванием было получено несколько типов вакцин. В США наиболее часто используются цельно-вирионные вакцины на основе происходящего из инактивированной клеточной культуры убитого вируса бешенства. Эти цельно-вирионные вакцины на основе убитого вируса бешенства требуют высокого уровня антигена и, таким образом, требуют адъюванта. К сожалению, это применение адъюванта ассоциировано с реактивностью области инъекции, гиперчувствительностью и даже с предполагаемым риском сарком в области инъекции у кошек. Недавно модифицированную живую вакцину успешно использовали с приманками для пероральных вакцин для иммунизации диких животных [Mahl et al., Vet Res 45(1):77 (2014)]. Кроме того, рекомбинантная вакцина, экспрессирующая гликопротеин (G), в настоящее время продается в США для применения у кошек. Вакцины на основе нуклеиновых кислот также использовали в лабораторных испытаниях, хотя ни одна из них не была лицензирована в США.

Ряд векторных стратегий используют в вакцинах на протяжении лет в попытках защитить против определенных патогенов животных. Одна такая векторная стратегия включает использование происходящих из альфавирусов РНК-репликонных частиц (RP) [Vander Veen, et al. Anim Health Res Rev. 13(1):1-9. (2012) doi: 10,1017/ S1466252312000011; Kamrud et al., J Gen Virol. 91(Pt 7):1723-1727 (2010)], которые были разработаны из нескольких различных альфавирусов, включая вирус венесуэльского энцефалита лошадей (VEE) [Pushko et al., Virology 239:389-401 (1997)], Синдбис (SIN) [Bredenbeek et al., Journal of Virology 67:6439-6446 (1993)] и вирус леса Семлики(SFV) [Liljestrom and Garoff, Biotechnology (NY) 9:1356-1361 (1991)]. RP-вакцины доставляют РНК-репликоны альфавируса с дефектом увеличения в количестве в клетки-хозяева и обеспечивают экспрессию желаемого антигенного трансгена(ов) in vivo [Pushko et al., Virology 239(2):389-401 (1997)]. RP имеют привлекательный профиль безопасности и эффективности по сравнению с некоторыми традиционными вакцинными составами [Vander Veen, et al. Anim Health Res Rev. 13(1):1-9. (2012)]. Платформу RP используют для кодирования патогенных антигенов, и она является основой для нескольких лицензированных USDA вакцин для свиней и птиц.

Примечательно, что было описано, что РНК-репликонные частицы альфавирусов и, в частности, РНК-репликонные частицы альфавируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE), катализируют системное противовирусное состояние и защищают против летальной вирусной нагрузки [Konopka et al., J. Virol., 83 (29):12432-12442 (2009)] и, более конкретно, индуцируют быструю защиту против вируса ящура [Segundo et al., J. Virol., 87 (10):5447-5460 (2013)]. Таким образом, поскольку РНК-репликонные частицы альфавирусов усиливают врожденный иммунный ответ против живого вируса, может оказаться, что их не следует комбинировать с модифицированным живым вирусом в вакцине, поскольку можно ожидать, что это будет вредным для иммунного ответа.

Цитирование любых ссылок в настоящем описании не следует истолковывать как признание того, что такая ссылка доступна в качестве "уровня техники" для настоящей заявки.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Таким образом, настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, которые содержат РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые кодируют один или несколько антигенов из одного или нескольких патогенов животных семейства кошачьих вместе с одним или несколькими модифицированными живыми патогенами животных семейства кошачьих. Все из иммуногенных композиций по настоящему изобретению также можно использовать в поливалентных вакцинах. В конкретном варианте осуществления этого типа вакцинируемым индивидуумом является животное семейства кошачьих. В более конкретном варианте осуществления вакцинируемым индивидуумом является домашняя кошка. Также предусматриваются способы получения и применения иммуногенных композиций и вакцин по настоящему изобретению.

В конкретных вариантах осуществления иммуногенные композиции содержат РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые кодируют один или несколько антигенов кошачьего кальцивируса (FCV) и модифицированный живой патоген животных семейства кошачьих. В других вариантах осуществления иммуногенные композиции содержат РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые кодируют один или несколько антигенов вируса кошачьего лейкоза (FeLV) и модифицированный живой патоген животного семейства кошачьих. В других вариантах осуществления иммуногенные композиции содержат РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые кодируют один или несколько антигенов вируса бешенства и модифицированный живой патоген животного семейства кошачьих. В определенных вариантах осуществления модифицированный живой патоген животного семейства кошачьих представляет собой вирус кошачьего вирусного ринотрахеита (FVR). В других вариантах осуществления модифицированный живой патоген животного семейства кошачьих представляет собой вирус кошачьей панлейкопении (FPLV). В других вариантах осуществления модифицированный живой патоген животного семейства кошачьих представляет собой модифицированные живые Chlamydophila felis. В других вариантах осуществления модифицированный живой патоген животного семейства кошачьих представляет собой модифицированный живой F9-подобный кошачий кальцивирус (FCV F9-подобный). В других вариантах осуществления модифицированный живой патоген животного семейства кошачьих представляет собой модифицированные живые Bordetella bronchiseptica. Настоящее изобретение, кроме того, относится к иммуногенным композициям, которые содержат любую комбинацию этих РНК-репликонных частиц альфавирусов и модифицированные живые патогены животных семейства кошачьих. В конкретных вариантах осуществления этого типа иммуногенная композиция содержит РНК-репликонные частицы альфавирусов, кодирующие антиген FCV, РНК-репликонные частицы альфавирусов, кодирующие антиген FeLV, модифицированный живой FVR, модифицированный живой FPLV и модифицированные живые Chlamydophila felis.

В определенных вариантах осуществления этого типа иммуногенные композиции содержат РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые кодируют капсидный белок FCV. В более конкретных вариантах осуществления капсидный белок FCV представляет собой капсидный белок F9-подобного FCV. В других вариантах осуществления РНК-репликонная частица альфавируса кодирует антигенный фрагмент капсидного белка F9-подобного FCV. В других вариантах осуществления капсидный белок FCV представляет собой вирулентный системный капсидный белок FCV (VS-FCV). В других вариантах осуществления РНК-репликонная частица альфавируса кодирует антигенный фрагмент капсидного белка VS-FCV. В других вариантах осуществления РНК-репликонная частица альфавируса кодирует как капсидный белок F9-подобного FCV или его антигенный фрагмент, так и капсидный белок VS-FCV или его антигенный фрагмент.

В других вариантах осуществления иммуногенные композиции содержат РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые кодируют капсидный белок VS-FCV или его антигенный фрагмент, где капсидный белок VS-FCV содержит аминокислотную последовательность, обладающую 95% или более идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2. В более конкретных вариантах осуществления капсидный белок VS-FCV содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 2. В еще более конкретных вариантах осуществления капсидный белок VS-FCV кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 12. В сходных вариантах осуществления РНК-репликонная частица альфавируса по настоящему изобретению кодирует капсидный белок F9-подобного FCV или его антигенный фрагмент. В конкретных вариантах осуществления этого типа капсидный белок F9-подобного FCV содержит аминокислотную последовательность, обладающую 95% или более идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4. В более конкретных вариантах осуществления капсидный белок F9-подобного FCV содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 4. В еще более конкретном варианте осуществления этого типа капсидный белок F9-подобного FCV кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 13.

В сходных вариантах осуществления иммуногенные композиции содержат РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые кодируют один или несколько антигенов вируса кошачьего лейкоза (FeLV). В определенных вариантах осуществления антиген FeLV представляет собой гликопротеин FeLV (например, gp85). В других вариантах осуществления РНК-репликонная частица альфавируса кодирует антигенный фрагмент gp85 FeLV. В более конкретных вариантах осуществления этого типа антигенный фрагмент гликопротеина FeLV представляет собой gp70 FeLV. В родственном варианте осуществления антигенный фрагмент гликопротеина FeLV представляет собой gp45 FeLV. В более конкретных вариантах осуществления этого типа gp85 FeLV содержит аминокислотную последовательность, обладающую 95% или более идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6. В более конкретных вариантах осуществления этого типа gp85 FeLV содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 6. В еще более конкретных вариантах осуществления этого типа gp85 FeLV кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 5 или SEQ ID NO: 14. В сходных вариантах осуществления gp70 FeLV содержит аминокислотную последовательность, обладающую 95% или более идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 8. В более конкретных вариантах осуществления этого типа gp70 FeLV содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 8. В еще более конкретных вариантах осуществления этого типа gp70 FeLV кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 7 или SEQ ID NO: 15.

В других вариантах осуществления иммуногенные композиции содержат РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые кодируют гликопротеин (G) вируса бешенства. В других вариантах осуществления РНК-репликонные частицы альфавирусов кодируют антигенный фрагмент G вируса бешенства. В более конкретных вариантах осуществления этого типа G вируса бешенства содержит аминокислотную последовательность, обладающую 95% или более идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 10. В еще более конкретных вариантах осуществления этого типа G вируса бешенства содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 10. В еще более конкретных вариантах осуществления этого типа G вируса бешенства кодируется нуклеотидной последовательностью SEQ ID NO: 9 или SEQ ID NO: 16.

В конкретных вариантах осуществления РНК-репликонная частица альфавируса представляет собой РНК-репликонную частицу альфавируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE). В еще более конкретных вариантах осуществления РНК-репликонная частица альфавируса VEE представляет собой РНК-репликонную частицу альфавируса VEE TC-83. В других вариантах осуществления РНК-репликонная частица альфавируса представляет собой РНК-репликонную частицу альфавируса Синдбис (SIN). В других вариантах осуществления РНК-репликонная частица альфавируса представляет собой РНК-репликонную частицу альфавируса леса Семлики (SFV). В альтернативном варианте осуществления вектор с голой ДНК кодирует один или несколько антигенов, которые происходят из одного или нескольких патогенов кошек. В конкретных вариантах осуществления этого типа векторы с голой ДНК кодируют капсидный белок FCV или его антигенный фрагмент. В конкретных вариантах осуществления этого типа векторы с голой ДНК кодируют капсидный белок VS-FCV или его антигенный фрагмент. В других вариантах осуществления этого типа векторы с голой ДНК кодируют gp85 FeLV или его антигенный фрагмент.

В определенных вариантах осуществления иммуногенные композиции могут включать по меньшей мере один модифицированный живой патоген животного семейства кошачьих и РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые кодируют один или несколько капсидных белков FCV или их антигенных фрагментов, один или несколько гликопротеинов FeLV или их антигенных фрагментов, и/или один или несколько белков G вируса бешенства или их антигенных фрагментов. В конкретных вариантах осуществления этого типа РНК-репликонные частицы альфавирусов кодируют как капсидный белок VS-FCV или его антигенный фрагмент, так и капсидный белок FCV F9-подобного вируса или его антигенный фрагмент. В сходных вариантах осуществления РНК-репликонные частицы альфавирусов кодируют как капсидный белок VS-FCV или его антигенный фрагмент, так и gp85 FeLV или его антигенный фрагмент. В других вариантах осуществления РНК-репликонные частицы альфавирусов кодируют как капсидный белок F9-подобного FCV или его антигенный фрагмент, так и gp85 FeLV или его антигенный фрагмент. В альтернативных вариантах осуществления РНК-репликонные частицы альфавирусов кодируют как капсидный белок VS-FCV или его антигенный фрагмент, так и белок G вируса бешенства или его антигенный фрагмент. В других вариантах осуществления РНК-репликонные частицы альфавирусов кодируют капсидный белок F9-подобного FCV или его антигенный фрагмент, и белок G вируса бешенства или его антигенный фрагмент. В других вариантах осуществления РНК-репликонные частицы альфавирусов кодируют капсидный белок VS-FCV или его антигенный фрагмент, gp85 FeLV или его антигенный фрагмент, и белок G вируса бешенства или его антигенный фрагмент. В альтернативных вариантах осуществления РНК-репликонные частицы альфавирусов кодируют капсидный белок VS-FCV или его антигенный фрагмент, капсидный белок F9-подобного FCV или его антигенный фрагмент, и gp85 FeLV или его антигенный фрагмент. В других вариантах осуществления РНК-репликонные частицы альфавирусов кодируют капсидный белок VS-FCV или его антигенный фрагмент, gp85 FeLV или его антигенный фрагмент, белок G вируса бешенства или его антигенный фрагмент, и капсидный белок F9-подобногов FCV или его антигенный фрагмент. В других вариантах осуществления РНК-репликонные частицы альфавирусов кодируют gp85 FeLV или его антигенный фрагмент, и белок G вируса бешенства или его антигенный фрагмент. В других вариантах осуществления РНК-репликонные частицы альфавирусов кодируют gp85 FeLV или его антигенный фрагмент, капсидный белок F9-подобного FCV или его антигенный фрагмент, и белок G вируса бешенства или его антигенный фрагмент.

Таким образом, настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям, которые включают по меньшей мере один модифицированный живой патоген и любую одну или несколько из РНК-репликонных частиц альфавирусов по настоящему изобретению, которые кодируют множество антигенов патогенов кошек, и/или любую одну или несколько РНК-репликонных частиц альфавирусов по настоящему изобретению, которые кодируют один антиген патогена кошек. В конкретных вариантах осуществления модифицированный живой патоген животного семейства кошачьих представляет собой модифицированный живой FVR. В других вариантах осуществления модифицированный живой патоген животного семейства кошачьих представляет собой модифицированный живой FPLV. В других вариантах осуществления модифицированный живой патоген животного семейства кошачьих представляет собой модифицированные живые Chlamydophila felis. В других вариантах осуществления модифицированный живой патоген животного семейства кошачьих представляет собой модифицированный живой F9-подобный FCV. В других вариантах осуществления модифицированный живой патоген животного семейства кошачьих представляет собой модифицированные живые Bordetella bronchiseptica. В конкретных вариантах осуществления в иммуногенную композицию включено два или более живых патогенов кошек. В конкретных вариантах осуществления этого типа иммуногенная композиция содержит модифицированный живой FVR и модифицированные живые Chlamydophila. В других вариантах осуществления в иммуногенную композицию включены три или более модифицированных живых патогенов кошек. В конкретных вариантах осуществления этого типа иммуногенная композиция содержит модифицированный живой FVR, модифицированные живые Chlamydophila, и модифицированный живой патоген животного семейства кошачьих представляет собой FPLV. В других вариантах осуществления в иммуногенную композицию включено четыре или более модифицированных живых патогенов кошек. В конкретных вариантах осуществления этого типа иммуногенная композиция содержит модифицированный живой FVR, модифицированные живые Chlamydophila, модифицированный живой FPLV, и модифицированный живой F9-подобный FCV. В конкретных вариантах осуществления все из РНК-репликонных частиц альфавирусов в иммуногенной композиции представляют собой РНК-репликонные частицы альфавируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE). В еще более конкретных вариантах осуществления все из РНК-репликонных частиц альфавирусов VEE в иммуногенных композициях представляют собой РНК-репликонные частицы альфавирусов TC-83 VEE.

В дополнительных вариантах осуществления РНК-репликонные частицы альфавирусов могут кодировать белковые антигены (или их антигенные фрагменты), которые происходят из других патогенов кошек. В конкретных вариантах осуществления этого типа белковый антиген происходит из пневмовируса кошек (FPN). В других вариантах осуществления белковый антиген происходит из парвовируса кошек (FPV). В других вариантах осуществления белковый антиген происходит из вируса инфекционного перитонита кошек (FIPV). В других вариантах осуществления белковый антиген происходит из вируса иммунодефицита кошек. В других вариантах осуществления белковый антиген происходит из вируса болезни Борна (BDV). В других вариантах осуществления белковый антиген происходит из вируса кошачьего гриппа. В других вариантах осуществления белковый антиген происходит и кошачьего коронавируса (FCoV).

Кроме того, настоящее изобретение относится к иммуногенным композициям и/или вакцинам (поливалентные вакцины), которые включают РНК-репликонные частицы альфавирусов по настоящему изобретению вместе с одним или несколькими модифицированными живыми (например, аттенуированными) патогенами кошек по настоящему изобретению, вместе с убитым кошачьим патогеном. В конкретных вариантах осуществления иммуногенные композиции, кроме того, могут содержать убитые Chlamydophila felis, и/или убитый FVR, и/или убитый F9-подобный FCV, и/или убитый VS-FCV, и/или убитый FeLV, и/или убитый FPLV. В определенных вариантах осуществления вакцины содержат иммунологически эффективное количество одной или нескольких из этих иммуногенных композиций.

Кроме того, настоящее изобретение относится к вакцинам и поливалентным вакцинам, которые содержат иммуногенные композиции по настоящему изобретению. В конкретных вариантах осуществления поливалентные вакцины представляют собой неадъювантные вакцины. В определенных вариантах осуществления вакцина способствует предупреждению заболевания вследствие FCV, и/или FeLV, и/или FVR, и/или FPLV, и/или вируса бешенства, и/или Chlamydophila felis. В сходных вариантах осуществления антитела индуцируются с кошки, когда кошку иммунизируют вакциной. Настоящее изобретение, кроме того, относится ко всем из РНК-репликонных частиц альфавирусов и векторов с голой ДНК по настоящему изобретению.

Также настоящее изобретение также относится к способам иммунизации животного семейства кошачьих против патогена животного семейства кошачьих, например, FCV, включающему введение животному семейства кошачьих иммунологически эффективного количества вакцины или поливалентной вакцины по настоящему изобретению. В конкретных вариантах осуществления вакцину вводят посредством внутримышечной инъекции. В альтернативных вариантах осуществления вакцину вводят посредством подкожной инъекции. В других вариантах осуществления вакцину вводят посредством внутривенной инъекции. В других вариантах осуществления вакцину вводят посредством внутрикожной инъекции. В других вариантах осуществления вакцину вводят посредством чрескожной инъекции. В других вариантах осуществления вакцину вводят посредством перорального введения. В других вариантах осуществления вакцину вводят посредством интраназального введения. В конкретных вариантах осуществления животное семейства кошачьих представляет собой домашнюю кошку.

Вакцины или поливалентные вакцины по настоящему изобретению можно вводить в качестве примирующей вакцины и/или в качестве бустерной вакцины. В конкретных вариантах осуществления вакцину по настоящему изобретению вводят в качестве однократной вакцины (одна доза), без необходимости в последующих введениях. В случае введения как примирующей вакцины, так и бустерной вакцины, в определенных вариантах осуществления примирующую вакцину и бустерную вакцину можно вводить одним и тем же путем. В других вариантах осуществления этого типа, как примирующую вакцину, так и бустерную вакцину, вводят посредством подкожной инъекции. В альтернативных вариантах осуществления введение примирующей вакцины можно проводить одним путем, а введение бустерной вакцины можно проводить другим путем. В определенных вариантах осуществления этого типа примирующую вакцину можно вводить посредством подкожной инъекции, и бустерную вакцину можно вводить перорально.

Кроме того, изобретение относится к способу иммунизации животного семейства кошачьих против FCV, включающему инъекцию животному семейства кошачьих иммунологически эффективного количества описанных выше вакцин по изобретению. В конкретных вариантах осуществления вакцина может включать, например, от приблизительно 1×10⁴ до приблизительно 1×10¹⁰ RP или более. В более конкретных вариантах осуществления вакцины могут включать от приблизительно 1×10⁵ до приблизительно 1×10⁹ RP. В еще более конкретных вариантах осуществления вакцины могут включать от приблизительно 1×10⁶ до приблизительно 1×10⁸ RP. В конкретных вариантах осуществления животное семейства кошачьих представляет собой домашнюю кошку.

В определенных вариантах осуществления вакцины по настоящему изобретению вводят в дозах от 0,05 мл до 3 мл. В конкретных вариантах осуществления вакцины по настоящему изобретению вводят в дозах от 0,05 мл до 3 мл. В более конкретных вариантах осуществления вводимая доза составляет от 0,1 мл до 2 мл. В еще более конкретных вариантах осуществления вводимая доза составляет от 0,2 мл до 1,5 мл. В еще более конкретных вариантах осуществления вводимая доза составляет от 0,3 до 1,0 мл. В еще более конкретных вариантах осуществления вводимая доза составляет от 0,4 мл до 0,8 мл.

Эти и другие аспекты настоящего изобретения станут лучше понятными с помощью приведенного ниже подробного описания.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к безопасным и эффективным поливалентным вакцинам. В конкретных вариантах осуществления вакцина является безадъювантной. В этом аспекте изобретения вакцины не индуцируют саркомы в области инъекции у животного семейства кошачьих, и тем не менее способствуют защите посредством вакцин от заболевания, вызываемого инфекциями кошачьего кальцивируса (FCV) и/или вируса кошачьего лейкоза (FeLV), и инфекциями вирусом кошачьего вирусного ринотрахеита (FVR) и/или вирусом кошачьей панлейкопении (FPLV), и/или живыми Chlamydophila felis.

Несмотря на известное усиление врожденной иммунной системы РНК-репликонными частицами альфавирусов, поливалентные вакцины по настоящему изобретению, которые содержат как РНК-репликонные частицы альфавирусов, так и модифицированные живые вирусы, неожиданно являются безопасными и эффективными, без значительного препятствования РНК-репликонными частицами альфавирусов иммунологическому эффекту модифицированных живых вирусов.

Действительно, известно, что РНК-репликонные частицы альфавирусов и, в частности, РНК-репликонные частицы альфавируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE), катализируют системное противовирусное состояние и защищают против летальной вирусной нагрузки [Konopka et al., J. Virol., 83 (29):12432-12442 (2009)]. Более того, было описано, что РНК-репликонные частицы альфавирусов VEE индуцируют быструю защиту против вируса ящура [Segundo et al., J. Virol., 87 (10):5447-5460 (2013)]. Таким образом, можно ожидать, что вакцины, содержащие как РНК-репликонные частицы альфавирусов, так и модифицированные живые вирусы, могут привести к значительному ингибированию иммунологического эффекта модифицированных живых вирусов. Однако неожиданно было показано, что усиление врожденного иммунного ответа вследствие присутствия РНК-репликонных частиц альфавирусов не является неблагоприятным для иммунного ответа, индуцируемого сопутствующими модифицированными живыми вирусами.

Таким образом, в конкретном аспекте настоящее изобретение относится к вакцинам, которые содержат РНК-репликонные частицы альфавирусов, которые кодируют капсидный белок FCV или его антигенный фрагмент, и/или gp85 FeLV или его антигенный фрагмент, вместе с модифицированным живым кошачьим FVR, и/или модифицированным живым FPLV, и/или модифицированными живыми Chlamydophila felis. В другом аспекте настоящего изобретения вакцины содержат векторы с голой ДНК, которые кодируют капсидный белок FCV или его антигенный фрагмент, и/или gp85 FeLV или его антигенный фрагмент, вместе с модифицированным живым кошачьим FVR, и/или модифицированным живым FPLV, и/или модифицированными живыми Chlamydophila felis.

Вакцины по настоящему изобретению можно вводить животному семейства кошачьих в отсутствии адъюванта, и они все еще могут способствовать защите вакцинированного животного семейства кошачьих от FCV.

Для более полного понимания изобретения приводятся следующие определения.

Использование терминов в единственном числе для удобства в описании никоим образом не предназначено для ограничения. Таким образом, например, указание на композицию, содержащую "полипептид", включает указание на один или несколько таких полипептидов. Кроме того, указание на "РНК-репликонную частицу альфавирусов" включает указание на множество таких РНК-репликонных частиц альфавирусов, если нет иных указаний.

Как используют в рамках изобретения, термин "примерно" используют взаимозаменяемо с термином термин "приблизительно", и он означает, что величина находится в пределах пятидесяти процентов от указанной величины, т.е. композиция, содержащая "примерно" 1×10⁸ РНК-репликонных частиц альфавирусов на миллилитр, содержит от 5×10⁸ до 1,5×10⁸ РНК-репликонных частиц альфавирусов на миллилитр.

Как используют в рамках изобретения, термин "животное семейства кошачьих" относится к любому представителю семейства Felidae. Все из домашних кошек, чистокровных и/или беспородных кошек-компаньонов, и диких или бездомных кошек являются животными семейства кошачьих.

Как используют в рамках изобретения, термин "репликон" относится к модифицированному вирусному РНК-геному, который лишен одного или несколько элементов (например, кодирующих последовательностей для структурных белков), которые, если бы они присутствовали, обеспечивали бы успешное увеличение в количестве родительского вируса в клеточных культурах или в животных-хозяевах. В подходящем клеточном контексте репликон будет амплифцироваться и может продуцировать один или несколько типов субгеномной РНК.

Как используют в рамках изобретения, термин "РНК-репликонная частица альфавируса", сокращенно обозначаемый как "RP", представляет собой происходящий из альфавируса РНК-репликон, упакованный в структурные белки, например, капсид и гликопротеины, которые также происходят из альфавирусов, например, как описано в Pushko et al., [Virology 239(2):389-401 (1997)]. RP не может увеличиваться в количестве в клеточных культурах или в животных-хозяевах (без плазмиды-помощника или аналогичного компонента), поскольку репликон не кодирует структурные компоненты альфавируса (например, капсид и гликопротеины).

Термины "FCV F9-подобный" и "F9-подобный FCV" используются взаимозаменяемо друг с другом и с термином "классический FCV" и, как используют в рамках изобретения, он представляет собой FCV, который может быть охарактеризован как более ранний и ранее универсальный вакцинный штамм FCV, для которого штамм FCV F9 считается типичным представителем. Напротив, FCV, называемый вирулентным системным "VS-FCV" или, как используют в рамках изобретения взаимозаменяемо, "(VS) FCV", представляет собой более новый класс FCV, который является необычно вирулентным и не может быть нейтрализован антителами, направленными против F9-подобных штаммов FCV [см., U.S. 7449323; Radford et al., 38(2) Vet res. 319-335 (2007)].

Термины "происходить из", "происходит из" и "происходящий из" используют взаимозаменяемо в отношении данного белкового антигена и патогена или штамма этого патогена, который в природе кодирует его, и, как используют в рамках изобретения, означает, что немодифицированная и/или укороченная аминокислотная последовательность данного белкового антигена кодируется этим патогеном или штаммом этого патогена. Кодирующую последовательность в конструкции нуклеиновой кислоты по настоящему изобретению для белкового антигена, происходящего из патогена, можно подвергать генетическому манипулированию, чтобы достигнуть модификации и/или укорочения аминокислотной последовательности экспрессируемого белка относительно соответствующей последовательности этого белкового антигена в патогене или штамме патогена (включая естественным образом ослабленные штаммы), из которого она происходит.

Как используют в рамках изобретения, термины "защита" или "обеспечение защиты" или "индукция защитного иммунитета" или "способствует предупреждению заболевания" и "способствует защите" не требуют полной защиты от какого-либо признака инфекции. Например, "способствует защите" может означать, что защита является достаточной, так что после заражения симптомы основной инфекции по меньшей мере уменьшаются, и/или что один или несколько из основных клеточных, физиологических или биохимических этиологических факторов или механизмов, вызывающих симптомы, уменьшаются и/или устраняются. Понятно, что "уменьшенный" как используют в этом контексте, означает относительно состояния инфекции, включая молекулярное состояние инфекции, не только физиологическое состояние инфекции.

Как используют в рамках изобретения, "вакцина" представляет собой композицию, которая является пригодной для применения у животного, например, у животного семейства кошачьих (включая, в определенных вариантах осуществления людей, в то время как в других вариантах осуществления для применения конкретно не у человека), содержащую один или несколько антигенов, как правило в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, таким как жидкость, содержащая воду, который при введении животному индуцирует иммунный ответ, достаточно сильный, чтобы способствовать защите от заболевания, возникающего в результате инфицирования микроорганизмом дикого типа, т.е. достаточно сильный, чтобы способствовать предупреждению заболевания и/или предупреждению, смягчению или излечению заболевания.

Как используют в рамках изобретения, поливалентная вакцина представляет собой вакцину, которая содержит два или более различных антигена. В конкретном варианте осуществления этого типа поливалентная молекула стимулирует иммунную систему реципиента против двух или нескольких различных патогенов.

Термины "адъювант" и "иммунный стимулятор" используют в настоящем описании взаимозаменяемо, и их определяют как одно или несколько веществ, которые вызывают стимуляцию иммунной системы. В этом контексте адъювант используют для усиления иммунного ответа на один или несколько вакцинных антигенов/изолятов. Таким образом, "адъюванты" представляют собой средства, которые неспецифически повышают иммунный ответ на конкретный антиген, таким образом, снижая количество антигена, необходимое в любой данной вакцине, и/или частоту инъекций, необходимых для индукции надлежащего иммунного ответа на представляющий интерес антиген. В этом контексте адъювант используют для усиления иммунного ответа на один или несколько антигенов/изолятов вакцин. В Feline Vaccination Guidelines от American Association of Feline Practitioners, например, предлагается применение безадъювантных вакцин против FeLV [AAFP Feline Advisory Panel, 15: 785-808 (2013)].

Как используют в рамках изобретения, "безадъювантная вакцина" представляет собой вакцину или поливалентную вакцину, которая не содержит адъювант.

Как используют в рамках изобретения, термин "фармацевтически приемлемый" используют в качестве прилагательного для обозначения того, что определяемое им существительное является пригодным для применения в фармацевтическом продукте. Когда его используют, например, для описания эксципиента в фармацевтической вакцине, он характеризует эксципиент как совместимый с другими ингредиентами композиции и не причиняющий вреда предполагаемому животному-реципиенту, например, животному семейства кошачьих.

"Парентеральное введение" включает подкожные инъекции, подслизистые инъекции, внутривенные инъекции, внутримышечные инъекции, внутрикожные инъекции и инфузию.

Как используют в рамках изобретения, термин "антигенный фрагмент" в отношении конкретного белка (например, белкового антигена) представляет собой фрагмент этого белка, который является антигенным, т.е. способен специфически взаимодействовать с распознающей антиген молекулой иммунной системы, такой как иммуноглобулин (антитело) или рецептор T-клеточного антигена. Например, антигенный фрагмент капсидного белка FCV представляет собой фрагмент капсидного белка, который является антигенным. Предпочтительно, антигенный фрагмент по настоящему изобретению является иммунодоминантным для распознавания антителом и/или T-клеточным рецептором. В конкретных вариантах осуществления антигенный фрагмент в отношении данного белкового антигена представляет собой фрагмент этого белка, который сохраняет по меньшей мере 25% антигенности полноразмерного белка. В предпочтительных вариантах осуществления антигенный фрагмент сохраняет по меньшей мере 50% антигенности полноразмерного белка. В более предпочтительных вариантах осуществления антигенный фрагмент сохраняет по меньшей мере 75% антигенности полноразмерного белка. Антигенные фрагменты могут составлять только 20 аминокислот или наоборот могут представлять собой крупные фрагменты, в которых отсутствует всего одна аминокислота из полноразмерного белка. В конкретных вариантах осуществления антигенный фрагмент содержит от 25 до 150 аминокислотных остатков. В других вариантах осуществления антигенный фрагмент содержит от 50 до 250 аминокислотных остатков. Например, для FeLV гликопротеин gp45 FeLV и гликопротеин gp70 FeLV являются антгенными фрагментами гликопротеина gp85 FeLV, в то время как для FCV один антигенный фрагмент капсидного белка FCV содержит область E ORF2.

Как используют в рамках изобретения одна аминокислотная последовательность на 100% "идентична" или обладает 100% "идентичностью" со второй аминокислотной последовательностью, когда аминокислотные остатки обеих последовательностей идентичны. Таким образом, аминокислотная последовательность является на 50% "идентичной" второй аминокислотной последовательности, когда 50% аминокислотных остатков двух аминокислотных последовательностей являются идентичными. Сравнение последовательностей проводят на протяжении непрерывного блока аминокислотных остатков, составляющих данный белок, например, белок или часть полипептида, подвергаемые сравнению. В конкретном варианте осуществления учитывают выбранные делеции или инсерции, которые в остальном могут изменять соответствие между двумя аминокислотными последовательностями.

Как используют в рамках изобретения, процентную идентичность нуклеотидных и аминокислотных последовательностей можно определять с использованием алгоритма C, MacVector (MacVector, Inc. Cary, NC 27519), Vector NTI (Informax, Inc. MD), Oxford Molecular Group PLC (1996) и Clustal W с параметрами выравнивания по умолчанию и параметрами по умолчанию для идентичности. Эти коммерчески доступные программы также можно использовать для определения сходства последовательностей с использованием одних и тех же или аналогичных параметров по умолчанию. Альтернативно можно использовать поиск Advanced Blast с условиями фильтра по умолчанию, например, с использованием программы GCG (Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7, Madison, Wisconsin) pileup с использованием параметров по умолчанию.

Как используют в рамках изобретения, термин "инактивированный" микроорганизм используют взаимозаменяемо с термином "убитый" микроорганизм. Для целей настоящего изобретения "инактивированный" микроорганизм представляет собой организм, который способен индуцировать иммунный ответ у животного, но который не способен инфицировать животное. Антиген по настоящему изобретению (например, инактивированный кошачий кальцивирус) может быть инактивирован средство, выбранным из группы, состоящей из бинарного этиленимина, формалина, бета-пропиолактона, тимеросала или нагревания. В конкретном варианте осуществления инактивированные изоляты кошачьего кальцивируса в комбинации с RP по настоящему изобретению инактивированы посредством бинарного этиленимина.

РНК-репликонные частицы альфавирусов по настоящему изобретению можно лиофилизировать и регидратировать посредством стерильного водного разбавителя. С другой стороны, когда РНК-репликонные частицы альфавирусов хранят по отдельности, но предполагается их смешение с другими компонентами вакцины перед введением, РНК-репликонные частицы альфавирусов можно хранить в стабилизирующем растворе этих компонентов, например, в растворе с высоким содержанием сахарозы.

Вакцину по настоящему изобретению можно без труда вводить любым стандартным путем, включая внутривенную, внутримышечную, подкожную, пероральную, интраназальную, внутрикожную и/или внутрибрюшинную вакцинацию. Специалисту в данной области будет понятно, что вакцинную композицию предпочтительно составляют надлежащим образом для каждого типа реципиентного животного и пути введения.

Таким образом, настоящее изобретение также относится к способам иммунизации животного семейства кошачьих против кошачьих патогенов. Один такой способ включает инъекцию животному семейства кошачьих иммунологически эффективного количества вакцины по настоящему изобретению, так что у животного семейства кошачьих продуцируются надлежащие антитела против патогена.

ПОЛИВАЛЕНТНЫЕ ВАКЦИНЫ

Таким образом, настоящее изобретение относится к поливалентным вакцинам, содержащим по меньшей мере один модифицированный живой кошачий патоген и одну или несколько РНК-репликонных частиц альфавирусов. Например, кодирующую последовательность белкового антигена или его антигенного фрагмента или комбинацию таких кодирующих последовательностей белковых антигенов, пригодных в вакцинах для животных семейства кошачьих, можно добавлять к РНК-репликонной частице альфавируса (RP) или комбинировать в одной RP, в качестве RP, которая кодирует, например, капсидный белок FCV и/или гликопротеин (gp85) FeLV в поливалентной вакцине.

В конкретных вариантах осуществления вакцины содержат по меньшей мере один модифицированный живой кошачий патоген и РНК-репликонную частицу альфавируса, которая кодирует капсидный белок F9-подобного FCV или его антигенный фрагмент, и/или капсидный белок VS-FCV или его антигенный фрагмент, с другой РНК-репликонной частицей альфавируса, которая кодирует gp85 FeLV или его антигенный фрагмент. В других вариантах осуществления вакцины содержат по меньшей мере один модифицированный живой кошачий патоген и одну РНК-репликонную частицу альфавируса, которая кодирует капсидный белок VS-FCV или его антигенный фрагмент, другую РНК-репликонную частицу альфавируса, которая кодирует gp85 FeLV или его антигенный фрагмент, и третью РНК-репликонную частицу альфавируса, которая кодирует капсидный белок F9-подобного FCV или его антигенный фрагмент. В других вариантах осуществления вакцины содержат по меньшей мере один модифицированный живой кошачий патоген и РНК-репликонную частицу альфавируса, которая кодирует капсидный белок F9-подобного FCV или его антигенный фрагмент, капсидный белок VS-FCV или его антигенный фрагмент, и gp85 FeLV или его антигенный фрагмент.

Примеры патогенов, из которых могут происходить один или несколько таких белковых антигенов, включают вирус кошачьего вирусного ринотрахеита (FVR), вирус кошачьего лейкоза (FeLV), вирус кошачьей панлейкопении (FPL), кошачий вирус герпеса (FHV), другие штаммы FCV, кошачий парвовирус (FPV), вирус кошачьего инфекционного перитонита (FIPV), вирус кошачьего иммунодефицита, вирус болезни Борна (BDV), вирус бешенства, вирус кошачьего гриппа, вирус собачьего гриппа, вирус птичьего гриппа, собачий пневмовирус, кошачий пневмовирус, Chlamydophila felis (FKA Chlamydophila psittaci), Bordetella bronchiseptica и Bartonella spp. (например, B. henselae). В конкретных вариантах осуществления кодирующая последовательность для капсидного белка или аналогичного белка из одного или нескольких из этих кошачьих или собачьих патогенов может быть встроена в одну и ту же RP в качестве антигена FCV. Альтернативно или в комбинации, кодирующая последовательность для капсидного белка или аналогичного белка из одного или нескольких из этих кошачьих или собачьих патогенов может быть встроена в одну или несколько других RP, которые могут быть скомбинированы в вакцине с RP, которая кодирует капсидный белок F9-подобного FCV или его антигенный фрагмент, и/или капсидный белок VS-FCV или его антигенный фрагмент.

Таким образом, настоящее изобретение относится к вакцинам, содержащим одну или несколько РНК-репликонных частиц альфавирусов (RP) по настоящему изобретению [например, капсидный белок VS-FCV или его антигенный фрагмент] вместе с одним или несколькими модифицированными живыми (аттенуированными) изолятами вируса, например, живым аттенуированным более ранним вакцинным штаммом FCV, таким как живой аттенуированный FCV F9, и/или живой аттенуированный кошачий вирус герпеса, и/или живой аттенуированный кошачий парвовирус, и/или живой аттенуированный вирус кошачьего лейкоза, и/или живой аттенуированный вирус кошачьего инфекционного перитонита, и/или живой аттенуированный вирус кошачьего иммунодефицита, и/или живой аттенуированный вирус болезни Борна, и/или живой аттенуированный вирус бешенства, и/или живой аттенуированный вирус кошачьего гриппа, и/или живой аттенуированный вирус собачьего гриппа, и/или живой аттенуированный вирус птичьего гриппа, и/или живой аттенуированный собачий пневмовирус, и/или живой аттенуированный кошачий пневмовирус. Кроме того, также в такие поливалентные вакцины могут быть включены живые аттенуированные Chlamydophila felis, и/или живые аттенуированные Bordetella bronchiseptica, и/или живые аттенуированные Bartonella spp. (например, B. henselae).

Более того, вакцины по настоящему изобретению, содержащие одну или несколько РНК-репликонных частиц альфавирусов по настоящему изобретению [например, кодирующих капсидный белок VS-FCV или его антигенный фрагмент] с одним или несколькими модифицированными живыми изолятами вируса, кроме того, могут содержать один или несколько убитых изолятов вируса, таких как убитый штамм FCV и/или убитый кошачий вирус герпеса, и/или убитый кошачий парвовирус, и/или убитый вирус кошачьего лейкоза, и/или убитый вирус кошачьего инфекционного перитонита, и/или убитый вирус кошачьего иммунодефицита, и/или убитый вирус болезни Борна, и/или убитый вирус бешенства, и/или убитый вирус кошачьего гриппа, и/или убитый вирус собачьего гриппа, и/или убитый вирус птичьего гриппа, и/или убитый собачий пневмовирус, и/или убитый кошачий пневмовирус. Кроме того, также в такие поливалентные вакцины могут быть включены бактерины Chlamydophila felis, и/или Bordetella bronchiseptica, и/или Bartonella spp. (например, B. henselae).

Также следует понимать, что настоящее изобретение не ограничивается конкретными конфигурациями, стадиями процесса и материалами, описанными в настоящем описании, поскольку такие конфигурации, стадии процесса и материалы могут в некоторой степени варьироваться. Также следует понимать, что терминологию, используемую в настоящем описании, используют только для описания конкретных вариантов осуществления, и она не предназначена для ограничения, поскольку объем настоящего изобретения ограничивается только прилагаемой формулой изобретения и ее эквивалентами.

ТАБЛИЦА ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

SEQ ID NO: Описание Тип 1 Кошачий кальцивирус (VS-FCV) нуклеиновая кислота
ДНК 2 Кошачий кальцивирус (VS-FCV) Аминокислотная 3 Кошачий кальцивирус (F9-подобный) нуклеиновая кислота
ДНК 4 Кошачий кальцивирус (F9-подобный) Аминокислотная 5 гликопротеин (gp85) вируса FeLV нуклеиновая кислота
ДНК 6 гликопротеин (gp85) вируса FeLV аминокислотная 7 гликопротеин (gp70) вируса FeLV нуклеиновая кислота
ДНК 8 гликопротеин (gp70) вируса FeLV аминокислотная 9 Гликопротеин вируса бешенства нуклеиновая кислота
ДНК 10 Гликопротеин вируса бешенства аминокислотная 11 GGCGCGCCGCACC нуклеиновая кислота 12 Кошачий кальцивирус (VS-FCV) нуклеиновая кислота
РНК 13 Кошачий кальцивирус (F9-подобный) нуклеиновая кислота
РНК 14 гликопротеин (gp85) вируса FeLV нуклеиновая кислота
РНК 15 гликопротеин (gp70) вируса FeLV нуклеиновая кислота
РНК 16 Гликопротеин вируса бешенства нуклеиновая кислота
РНК TTAATTAA нуклеиновая кислота

ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ

Капсид кошачьего кальцивируса (VS-FCV) SEQ ID NO: 1

atggctgacgacggatctgtgaccaccccagaacaaggaacaatggtcggaggagtgattgccgaacccagcgctcagatgtcaactgcggcggacatggcctccggaaagtcggtggactccgagtgggaagccttcttctcgttccacacgtccgtgaactggagcacctccgaaacccaaggaaagatcctcttcaagcagtccctgggtcccctgctgaacccgtacctggagcacatcagcaagctgtacgtcgcttggagcgggtcgatcgaagtgcgattttccatctcgggaagcggcgtgttcggtggtaaactggccgccatcgtcgtgccgcctggtgtcgaccctgtccagtcaacctccatgctgcagtacccgcacgtcctgttcgacgcaagacaagtggagccagtgatcttctccatcccggacctccgcaacagcctgtatcacttgatgtccgataccgataccacttccctcgtgatcatggtgtacaacgatctgatcaacccgtacgccaatgactccaacagctcgggttgcatcgtgaccgtcgaaacgaagcctggcatcgatttcaagtttcatctgctgaaaccgcccggatccatgcttactcacgggtccatcccttccgatctgatccccaagagctcctccctgtggattgggaaccgccactggaccgatattaccgatttcgtgattcggcctttcgtgttccaagccaaccggcacttcgacttcaaccaggagactgccggctggtcaactccacggttccgcccattggccgtgactgtgtcgcagtcaaagggagccaagctcgggaacggcatcgccaccgactacattgtgcctggaatccccgacggatggcctgatactaccatccccaccaagctgacccctaccggagattacgccatcacctcctccgacggcaatgatattgaaaccaagctggaatacgagaacgcggacgtgattaagaacaacaccaacttccgctccatgtatatctgcggaagcctccagagggcttggggcgacaagaagatcagcaacaccgggttcatcactaccggagtgatttctgacaactccatcagcccttcgaacacaattgaccagtccaagatcgtggtgtaccaggacaaccatgtcaattcggaggtccagactagcgacatcactcttgccatcctgggctacaccggaattggagaagaggccataggcgccaaccgggactccgtcgtgagaatttccgtgcttccggaaactggagcaaggggcggaaatcaccccatcttctacaaaaattccatgaagctgggctacgtgatctcctccattgacgtgttcaactcccaaatcctccacacctcgcgccagctgtcactgaacaactacttgttgccccctgactccttcgcggtgtaccggattattgacagcaacggatcatggttcgacattgggattgacagcgatgggttttcattcgtgggcgtgtcgtcatttccaaagctggagtttccgctgtccgcctcatacatgggcatccagctcgcaaagatccggctggcgtccaacatccggtcatccatgactaagctgtga

Капсид кошачьего кальцивируса (VS-FCV) SEQ ID NO: 2

MADDGSVTTPEQGTMVGGVIAEPSAQMSTAADMASGKSVDSEWEAFFSFHTSVNWSTSETQGKILFKQSLGPLLNPYLEHISKLYVAWSGSIEVRFSISGSGVFGGKLAAIVVPPGVDPVQSTSMLQYPHVLFDARQVEPVIFSIPDLRNSLYHLMSDTDTTSLVIMVYNDLINPYANDSNSSGCIVTVETKPGIDFKFHLLKPPGSMLTHGSIPSDLIPKSSSLWIGNRHWTDITDFVIRPFVFQANRHFDFNQETAGWSTPRFRPLAVTVSQSKGAKLGNGIATDYIVPGIPDGWPDTTIPTKLTPTGDYAITSSDGNDIETKLEYENADVIKNNTNFRSMYICGSLQRAWGDKKISNTGFITTGVISDNSISPSNTIDQSKIVVYQDNHVNSEVQTSDITLAILGYTGIGEEAIGANRDSVVRISVLPETGARGGNHPIFYKNSMKLGYVISSIDVFNSQILHTSRQLSLNNYLLPPDSFAVYRIIDSNGSWFDIGIDSDGFSFVGVSSFPKLEFPLSASYMGIQLAKIRLASNIRSSMTKL

Капсид кошачьего кальцивируса (VS-FCV) (SEQ ID NO: 12)

auggcugacgacggaucugugaccaccccagaacaaggaacaauggucggaggagugauugccgaacccagcgcucagaugucaacugcggcggacauggccuccggaaagucgguggacuccgagugggaagccuucuucucguuccacacguccgugaacuggagcaccuccgaaacccaaggaaagauccucuucaagcagucccuggguccccugcugaacccguaccuggagcacaucagcaagcuguacgucgcuuggagcgggucgaucgaagugcgauuuuccaucucgggaagcggcguguucggugguaaacuggccgccaucgucgugccgccuggugucgacccuguccagucaaccuccaugcugcaguacccgcacguccuguucgacgcaagacaaguggagccagugaucuucuccaucccggaccuccgcaacagccuguaucacuugauguccgauaccgauaccacuucccucgugaucaugguguacaacgaucugaucaacccguacgccaaugacuccaacagcucggguugcaucgugaccgucgaaacgaagccuggcaucgauuucaaguuucaucugcugaaaccgcccggauccaugcuuacucacggguccaucccuuccgaucugauccccaagagcuccucccuguggauugggaaccgccacuggaccgauauuaccgauuucgugauucggccuuucguguuccaagccaaccggcacuucgacuucaaccaggagacugccggcuggucaacuccacgguuccgcccauuggccgugacugugucgcagucaaagggagccaagcucgggaacggcaucgccaccgacuacauugugccuggaauccccgacggauggccugauacuaccauccccaccaagcugaccccuaccggagauuacgccaucaccuccuccgacggcaaugauauugaaaccaagcuggaauacgagaacgcggacgugauuaagaacaacaccaacuuccgcuccauguauaucugcggaagccuccagagggcuuggggcgacaagaagaucagcaacaccggguucaucacuaccggagugauuucugacaacuccaucagcccuucgaacacaauugaccaguccaagaucgugguguaccaggacaaccaugucaauucggagguccagacuagcgacaucacucuugccauccugggcuacaccggaauuggagaagaggccauaggcgccaaccgggacuccgucgugagaauuuccgugcuuccggaaacuggagcaaggggcggaaaucaccccaucuucuacaaaaauuccaugaagcugggcuacgugaucuccuccauugacguguucaacucccaaauccuccacaccucgcgccagcugucacugaacaacuacuuguugcccccugacuccuucgcgguguaccggauuauugacagcaacggaucaugguucgacauugggauugacagcgauggguuuucauucgugggcgugucgucauuuccaaagcuggaguuuccgcuguccgccucauacaugggcauccagcucgcaaagauccggcuggcguccaacauccggucauccaugacuaagcuguga

Капсид кошачьего кальцивируса (F9-подобного) (SEQ ID NO: 3)

atgactgccccggaacaaggaacgatggtcggaggagtgattgcagaaccgtcagcacagatgtccaccgctgccgacatggccactggaaagagcgtggactccgaatgggaagccttcttctccttccacacttcggtcaactggtcgactagcgaaacccaggggaagattttgttcaagcaatccctcggccctctgctgaacccctacctggagcatctggccaagctgtacgtggcatggtcgggcagcatcgaagtgcgctttagcatttccggctccggagtgttcgggggaaagcttgctgccattgtcgtgccgccaggagtggacccggtgcagtccacttctatgctccaatacccgcatgtcctgttcgacgccagacaggtggagcctgtgatcttttgcctgccggatctcaggtccaccctgtatcacctcatgtccgacaccgacaccacctcgctcgtgatcatggtgtacaacgacctgatcaacccctacgctaacgacgccaacagctcaggttgcattgtgactgtcgaaaccaagccaggccctgacttcaagtttcatttgctgaagccgcccggttccatgctgacccacggctcgatcccatccgacctgatccccaagacgagctccctgtggatcggaaaccgctactggtccgatattaccgacttcgtgatcagaccattcgtgttccaagccaaccgccatttcgacttcaaccaggaaaccgcaggatggtcgacccctcgattccgcccgatttcagtgaccatcaccgaacagaacggcgcgaagctgggaattggcgtggcgaccgactacatcgtgccgggaatcccggatggatggcctgatacgaccattcccggggagctgatccctgccggggactacgccatcaccaacggtactggaaacgacatcaccactgccaccggttacgacaccgccgacatcataaagaacaacaccaacttcagaggaatgtacatttgcggctccctgcaacgcgcttggggtgacaaaaagatctcgaacactgccttcatcacaacagcgactctggacggcgataacaacaacaagatcaatccttgtaataccatcgaccagtccaaaatcgtggtgttccaggataaccacgtgggaaagaaggcgcagacctccgacgacactctggcgctgcttggctacaccgggatcggcgagcaggccattggaagcgatcgggatcgggtcgtgcggatctccaccctccccgagactggagcaaggggaggcaaccaccccatcttttacaaaaacagcattaagctcggatacgtcatccgctccatcgatgtgttcaactctcaaatcctgcacacttcgcggcagctgtccctgaaccactacctcttgccgcccgactccttcgccgtctaccggatcattgattcgaacgggagctggttcgacatcggcattgatagcgatggcttctcgtttgtgggcgtgtcgggcttcgggaagctggagttcccactgagcgcctcatacatgggtatccagctggccaagatcaggctggcctccaacatccgctcacctatgactaagctgtga

Капсид кошачьего кальцивируса (F9-подобный) (SEQ ID NO: 4)

MTAPEQGTMVGGVIAEPSAQMSTAADMATGKSVDSEWEAFFSFHTSVNWSTSETQGKILFKQSLGPLLNPYLEHLAKLYVAWSGSIEVRFSISGSGVFGGKLAAIVVPPGVDPVQSTSMLQYPHVLFDARQVEPVIFCLPDLRSTLYHLMSDTDTTSLVIMVYNDLINPYANDANSSGCIVTVETKPGPDFKFHLLKPPGSMLTHGSIPSDLIPKTSSLWIGNRYWSDITDFVIRPFVFQANRHFDFNQETAGWSTPRFRPISVTITEQNGAKLGIGVATDYIVPGIPDGWPDTTIPGELIPAGDYAITNGTGNDITTATGYDTADIIKNNTNFRGMYICGSLQRAWGDKKISNTAFITTATLDGDNNNKINPCNTIDQSKIVVFQDNHVGKKAQTSDDTLALLGYTGIGEQAIGSDRDRVVRISTLPETGARGGNHPIFYKNSIKLGYVIRSIDVFNSQILHTSRQLSLNHYLLPPDSFAVYRIIDSNGSWFDIGIDSDGFSFVGVSGFGKLEFPLSASYMGIQLAKIRLASNIRSPMTKL

Капсид кошачьего кальцивируса (F9-подобного) (SEQ ID NO: 13)

augacugccccggaacaaggaacgauggucggaggagugauugcagaaccgucagcacagauguccaccgcugccgacauggccacuggaaagagcguggacuccgaaugggaagccuucuucuccuuccacacuucggucaacuggucgacuagcgaaacccaggggaagauuuuguucaagcaaucccucggcccucugcugaaccccuaccuggagcaucuggccaagcuguacguggcauggucgggcagcaucgaagugcgcuuuagcauuuccggcuccggaguguucgggggaaagcuugcugccauugucgugccgccaggaguggacccggugcaguccacuucuaugcuccaauacccgcauguccuguucgacgccagacagguggagccugugaucuuuugccugccggaucucagguccacccuguaucaccucauguccgacaccgacaccaccucgcucgugaucaugguguacaacgaccugaucaaccccuacgcuaacgacgccaacagcucagguugcauugugacugucgaaaccaagccaggcccugacuucaaguuucauuugcugaagccgcccgguuccaugcugacccacggcucgaucccauccgaccugauccccaagacgagcucccuguggaucggaaaccgcuacugguccgauauuaccgacuucgugaucagaccauucguguuccaagccaaccgccauuucgacuucaaccaggaaaccgcaggauggucgaccccucgauuccgcccgauuucagugaccaucaccgaacagaacggcgcgaagcugggaauuggcguggcgaccgacuacaucgugccgggaaucccggauggauggccugauacgaccauucccggggagcugaucccugccggggacuacgccaucaccaacgguacuggaaacgacaucaccacugccaccgguuacgacaccgccgacaucauaaagaacaacaccaacuucagaggaauguacauuugcggcucccugcaacgcgcuuggggugacaaaaagaucucgaacacugccuucaucacaacagcgacucuggacggcgauaacaacaacaagaucaauccuuguaauaccaucgaccaguccaaaaucgugguguuccaggauaaccacgugggaaagaaggcgcagaccuccgacgacacucuggcgcugcuuggcuacaccgggaucggcgagcaggccauuggaagcgaucgggaucgggucgugcggaucuccacccuccccgagacuggagcaaggggaggcaaccaccccaucuuuuacaaaaacagcauuaagcucggauacgucauccgcuccaucgauguguucaacucucaaauccugcacacuucgcggcagcugucccugaaccacuaccucuugccgcccgacuccuucgccgucuaccggaucauugauucgaacgggagcugguucgacaucggcauugauagcgauggcuucucguuugugggcgugucgggcuucgggaagcuggaguucccacugagcgccucauacauggguauccagcuggccaagaucaggcuggccuccaacauccgcucaccuaugacuaagcuguga

Гликопротеин (gp85) оболочки вируса кошачьего лейкоза SEQ ID NO: 5

atggagtcaccaacacaccctaaaccttctaaagacaaaaccctctcgtggaatctcgccttccttgtgggcatcctgttcacaatcgacatcggcatggccaacccttcgccgcatcagatctacaatgtgacatgggtcattactaatgtgcagacaaacacccaggcaaatgctacttctatgcttggtactctgactgatgcttatccaaccctgcacgtcgacctttgcgatctcgtcggtgacacatgggagcccatcgtgctgaatccaactaatgtcaaacatggtgccaggtattcttctagcaaatacgggtgtaagaccactgatcggaagaaacagcaacaaacctacccattctacgtgtgcccgggtcacgcaccgtccctgggtccgaagggaacacattgtgggggagcccaagacggtttttgcgctgcttggggttgtgaaacaaccggagaagcctggtggaagcctacctcatcttgggactacattactgtgaaaagaggctctagccaggataacagctgcgaaggaaagtgtaatcccctggtgcttcaattcacccagaaaggccggcaggcatcatgggatggaccgaaaatgtggggacttagactctatcgcaccggatacgaccccatcgctctgtttactgtgtcacgccaagtctccaccattactccgccacaggccatggggccgaatctggtcctccccgatcagaagccaccctcacggcaaagtcaaaccggctcaaaagtggccacccaacggccccagacaaatgagtccgcacctaggtcagtggcacctacaacaatgggtccaaagcggatcggaaccggagacaggctcattaacctcgtgcaagggacttatctggcccttaacgctactgaccccaacaagaccaaggattgctggctctgccttgtgagcagacctccttactatgaggggatcgccattctcggaaactactcaaatcagaccaacccccctccgtcgtgtctgagcaccccccagcacaagcttactatttcagaagtcagtggacagggaatgtgcatcggaaccgtgccaaagactcatcaagccctttgcaacaaaactcaacaagggcacactggagctcattatctcgccgcacctaacgggacctactgggcttgcaatactggattgaccccgtgtatctctatggccgtgctgaattggacttccgacttctgcgtgcttattgagctttggcctagagtgacataccatcagcctgagtacgtctatacccatttcgccaaggcagtcagattccggcgggagcctatctccctgactgtggccttgatgctcggtggactgacagtgggaggaattgcagctggagtcggaactggaaccaaggccctgctcgaaactgctcagttccggcagctgcagatggccatgcacactgacatccaggctctggaggaatcaatttcagcccttgagaaaagcttgacctcgctgtctgaagtggtcctccaaaacaggcgcggtttggacatcctgttccttcaagagggtggtctgtgcgccgctctcaaggaggaatgctgtttctacgctgaccataccgggctggtgcgcgataacatggcaaagctgcgggaacgcttgaaacagaggcagcaactgttcgactctcagcagggatggttcgagggctggtttaacaagagcccatggtttaccactctgatctcttcaatcatgggtccactgctcatcctgcttctgattcttctcttcggaccgtgtattctcaacaggctggtgcagtttgtcaaggacagaatctcggtggtccaggccctgattcttactcagcagtatcagcagattaagcagtacgaccccgatcggccttga

Гликопротеин (gp85) оболочки вируса кошачьего лейкоза SEQ ID NO: 6

MESPTHPKPSKDKTLSWNLAFLVGILFTIDIGMANPSPHQIYNVTWVITNVQTNTQANATSMLGTLTDAYPTLHVDLCDLVGDTWEPIVLNPTNVKHGARYSSSKYGCKTTDRKKQQQTYPFYVCPGHAPSLGPKGTHCGGAQDGFCAAWGCETTGEAWWKPTSSWDYITVKRGSSQDNSCEGKCNPLVLQFTQKGRQASWDGPKMWGLRLYRTGYDPIALFTVSRQVSTITPPQAMGPNLVLPDQKPPSRQSQTGSKVATQRPQTNESAPRSVAPTTMGPKRIGTGDRLINLVQGTYLALNATDPNKTKDCWLCLVSRPPYYEGIAILGNYSNQTNPPPSCLSTPQHKLTISEVSGQGMCIGTVPKTHQALCNKTQQGHTGAHYLAAPNGTYWACNTGLTPCISMAVLNWTSDFCVLIELWPRVTYHQPEYVYTHFAKAVRFRREPISLTVALMLGGLTVGGIAAGVGTGTKALLETAQFRQLQMAMHTDIQALEESISALEKSLTSLSEVVLQNRRGLDILFLQEGGLCAALKEECCFYADHTGLVRDNMAKLRERLKQRQQLFDSQQGWFEGWFNKSPWFTTLISSIMGPLLILLLILLFGPCILNRLVQFVKDRISVVQALILTQQYQQIKQYDPDRP*

Гликопротеин (gp85) оболочки вируса кошачьего лейкоза SEQ ID NO: 14

auggagucaccaacacacccuaaaccuucuaaagacaaaacccucucguggaaucucgccuuccuugugggcauccuguucacaaucgacaucggcauggccaacccuucgccgcaucagaucuacaaugugacaugggucauuacuaaugugcagacaaacacccaggcaaaugcuacuucuaugcuugguacucugacugaugcuuauccaacccugcacgucgaccuuugcgaucucgucggugacacaugggagcccaucgugcugaauccaacuaaugucaaacauggugccagguauucuucuagcaaauacggguguaagaccacugaucggaagaaacagcaacaaaccuacccauucuacgugugcccgggucacgcaccgucccuggguccgaagggaacacauugugggggagcccaagacgguuuuugcgcugcuugggguugugaaacaaccggagaagccugguggaagccuaccucaucuugggacuacauuacugugaaaagaggcucuagccaggauaacagcugcgaaggaaaguguaauccccuggugcuucaauucacccagaaaggccggcaggcaucaugggauggaccgaaaauguggggacuuagacucuaucgcaccggauacgaccccaucgcucuguuuacugugucacgccaagucuccaccauuacuccgccacaggccauggggccgaaucugguccuccccgaucagaagccacccucacggcaaagucaaaccggcucaaaaguggccacccaacggccccagacaaaugaguccgcaccuaggucaguggcaccuacaacaauggguccaaagcggaucggaaccggagacaggcucauuaaccucgugcaagggacuuaucuggcccuuaacgcuacugaccccaacaagaccaaggauugcuggcucugccuugugagcagaccuccuuacuaugaggggaucgccauucucggaaacuacucaaaucagaccaaccccccuccgucgugucugagcaccccccagcacaagcuuacuauuucagaagucaguggacagggaaugugcaucggaaccgugccaaagacucaucaagcccuuugcaacaaaacucaacaagggcacacuggagcucauuaucucgccgcaccuaacgggaccuacugggcuugcaauacuggauugaccccguguaucucuauggccgugcugaauuggacuuccgacuucugcgugcuuauugagcuuuggccuagagugacauaccaucagccugaguacgucuauacccauuucgccaaggcagucagauuccggcgggagccuaucucccugacuguggccuugaugcucgguggacugacagugggaggaauugcagcuggagucggaacuggaaccaaggcccugcucgaaacugcucaguuccggcagcugcagauggccaugcacacugacauccaggcucuggaggaaucaauuucagcccuugagaaaagcuugaccucgcugucugaagugguccuccaaaacaggcgcgguuuggacauccuguuccuucaagaggguggucugugcgccgcucucaaggaggaaugcuguuucuacgcugaccauaccgggcuggugcgcgauaacauggcaaagcugcgggaacgcuugaaacagaggcagcaacuguucgacucucagcagggaugguucgagggcugguuuaacaagagcccaugguuuaccacucugaucucuucaaucauggguccacugcucauccugcuucugauucuucucuucggaccguguauucucaacaggcuggugcaguuugucaaggacagaaucucggugguccaggcccugauucuuacucagcaguaucagcagauuaagcaguacgaccccgaucggccuuga

Гликопротеин (gp70) оболочки вируса кошачьего лейкоза SEQ ID NO: 7

aatcctagtccacaccaaatatataatgtaacttgggtaataaccaatgtacaaactaacacccaagctaacgccacctctatgttaggaaccttaaccgatgcctaccctaccctacatgttgacttatgtgacctagtgggagacacctgggaacctatagtcctaaacccaaccaatgtaaaacacggggcacgttactcctcctcaaaatatggatgtaaaactacagatagaaaaaaacagcaacagacataccccttttacgtctgccccggacatgccccctcgttggggccaaagggaacacattgtggaggggcacaagatgggttttgtgccgcatggggatgtgagaccaccggagaagcttggtggaagcccacctcctcatgggactatatcacagtaaaaagagggagtagtcaggacaatagctgtgagggaaaatgcaaccccctggttttgcagttcacccagaagggaagacaagcctcttgggacggacctaagatgtggggattgcgactataccgtacaggatatgaccctatcgctttattcacggtgtcccggcaggtatcaaccattacgccgcctcaggcaatgggaccaaacctagtcttacctgatcaaaaacccccatcccgacaatctcaaacagggtccaaagtggcgacccagaggccccaaacgaatgaaagcgccccaaggtctgttgcccccaccaccatgggtcccaaacggattgggaccggagataggttaataaatttagtacaagggacatacctagccttaaatgccaccgaccccaacaaaactaaagactgttggctctgcctggtttctcgaccaccctattacgaagggattgcaatcttaggtaactacagcaaccaaacaaacccccccccatcctgcctatctactccgcaacacaaactaactatatctgaagtatcagggcaaggaatgtgcatagggactgttcctaaaacccaccaggctttgtgcaataagacacaacagggacatacaggggcgcactatctagccgcccccaacggcacctattgggcctgtaacactggactcaccccatgcatttccatggcggtgctcaattggacctctgatttttgtgtcttaatcgaattatggcccagagtgacttaccatcaacccgaatatgtgtacacacattttgccaaagctgtcaggttccgaaga

Гликопротеин (gp70) оболочки вируса кошачьего лейкоза SEQ ID NO: 8

NPSPHQIYNVTWVITNVQTNTQANATSMLGTLTDAYPTLHVDLCDLVGDTWEPIVLNPTNVKHGARYSSSKYGCKTTDRKKQQQTYPFYVCPGHAPSLGPKGTHCGGAQDGFCAAWGCETTGEAWWKPTSSWDYITVKRGSSQDNSCEGKCNPLVLQFTQKGRQASWDGPKMWGLRLYRTGYDPIALFTVSRQVSTITPPQAMGPNLVLPDQKPPSRQSQTGSKVATQRPQTNESAPRSVAPTTMGPKRIGTGDRLINLVQGTYLALNATDPNKTKDCWLCLVSRPPYYEGIAILGNYSNQTNPPPSCLSTPQHKLTISEVSGQGMCIGTVPKTHQALCNKTQQGHTGAHYLAAPNGTYWACNTGLTPCISMAVLNWTSDFCVLIELWPRVTYHQPEYVYTHFAKAVRFRR

Гликопротеин (gp70) оболочки вируса кошачьего лейкоза SEQ ID NO: 15

aauccuaguccacaccaaauauauaauguaacuuggguaauaaccaauguacaaacuaacacccaagcuaacgccaccucuauguuaggaaccuuaaccgaugccuacccuacccuacauguugacuuaugugaccuagugggagacaccugggaaccuauaguccuaaacccaaccaauguaaaacacggggcacguuacuccuccucaaaauauggauguaaaacuacagauagaaaaaaacagcaacagacauaccccuuuuacgucugccccggacaugcccccucguuggggccaaagggaacacauuguggaggggcacaagauggguuuugugccgcauggggaugugagaccaccggagaagcuugguggaagcccaccuccucaugggacuauaucacaguaaaaagagggaguagucaggacaauagcugugagggaaaaugcaacccccugguuuugcaguucacccagaagggaagacaagccucuugggacggaccuaagauguggggauugcgacuauaccguacaggauaugacccuaucgcuuuauucacggugucccggcagguaucaaccauuacgccgccucaggcaaugggaccaaaccuagucuuaccugaucaaaaacccccaucccgacaaucucaaacaggguccaaaguggcgacccagaggccccaaacgaaugaaagcgccccaaggucuguugcccccaccaccaugggucccaaacggauugggaccggagauagguuaauaaauuuaguacaagggacauaccuagccuuaaaugccaccgaccccaacaaaacuaaagacuguuggcucugccugguuucucgaccacccuauuacgaagggauugcaaucuuagguaacuacagcaaccaaacaaacccccccccauccugccuaucuacuccgcaacacaaacuaacuauaucugaaguaucagggcaaggaaugugcauagggacuguuccuaaaacccaccaggcuuugugcaauaagacacaacagggacauacaggggcgcacuaucuagccgcccccaacggcaccuauugggccuguaacacuggacucaccccaugcauuuccauggcggugcucaauuggaccucugauuuuugugucuuaaucgaauuauggcccagagugacuuaccaucaacccgaauauguguacacacauuuugccaaagcugucagguuccgaaga

G ВИРУСА БЕШЕНСТВА (SEQ ID NO: 9)

atggtgccgcaggctctcctgtttgtcccccttctggtctttccattgtgttttgggaaattccctatctacacaattccggacaagttgggaccctggagcccaattgacattcatcatctcagctgcccgaacaatttggtcgtggaggacgaaggatgcaccaacctgtcggggttctcctacatggaattgaaagtcggatacatcagtgccattaagatgaacgggttcacttgcacaggcgtcgtgactgaagctgagacatacactaacttcgtgggatatgtcactaccactttcaaaagaaagcatttccgccctactcctgatgcttgtagggccgcatacaactggaagatggccggtgaccccagatatgaggaatcacttcacaatccgtaccctgactaccactggcttcggactgtcaaaaccaccaaggagtcactcgtgatcattagtccaagtgtggctgatcttgacccatacgaccggtcacttcactcacgggtgttcccgggggggaattgctctggtgtcgcagtgtcgtcaacctactgctccacaaaccacgattacaccatttggatgccagaaaatcctcggcttggtatgtcatgtgacattttcaccaattctcgggggaagagggcttccaaagggtctgaaacttgcggctttgtcgatgagcggggcttgtataagtcacttaaaggtgcttgcaaactcaagctttgtggtgtcttgggattgagattgatggatggaacttgggtcgcaatgcagacttctaacgaaaccaaatggtgccctcccggacagcttgtgaatttgcatgactttcgctctgacgaaattgagcatcttgtcgtcgaggagttggtcaagaagcgggaagagtgtctggatgctttggaatcaatcatgaccaccaagtcagtgtctttcagacggctctcacatcttaggaaattggtgccaggttttggaaaagcatataccattttcaacaagacccttatggaagccgatgctcactacaagtctgtcaggacttggaatgagatcatcccgtctaaagggtgtcttagggtcggagggagatgtcatcctcatgtcaacggagtctttttcaatggtatcattcttggacctgacggaaatgtccttatccctgagatgcaatcttccctcctccagcaacacatggaacttcttgtctcatcggtcatcccccttatgcaccccctggctgacccatcaaccgtgttcaagaacggtgacgaggcagaggattttgtcgaggtccaccttcccgatgtgcatgaacggatctctggtgtcgaccttggactccctaactggggaaagtatgtccttctgtcggcaggagccctgactgccttgatgttgattatcttcctgatgacttgttggaggagagtcaatcggtcggagccaacacaacataatctcagaggaacaggaagggaggtgtcagtcacaccccaaagcgggaagatcatttcgtcttgggagtcatacaagagcggaggtgaaaccggactgtga

G ВИРУСА БЕШЕНСТВА (SEQ ID NO: 10)

MVPQALLFVPLLVFPLCFGKFPIYTIPDKLGPWSPIDIHHLSCPNNLVVEDEGCTNLSGFSYMELKVGYISAIKMNGFTCTGVVTEAETYTNFVGYVTTTFKRKHFRPTPDACRAAYNWKMAGDPRYEESLHNPYPDYHWLRTVKTTKESLVIISPSVADLDPYDRSLHSRVFPGGNCSGVAVSSTYCSTNHDYTIWMPENPRLGMSCDIFTNSRGKRASKGSETCGFVDERGLYKSLKGACKLKLCGVLGLRLMDGTWVAMQTSNETKWCPPGQLVNLHDFRSDEIEHLVVEELVKKREECLDALESIMTTKSVSFRRLSHLRKLVPGFGKAYTIFNKTLMEADAHYKSVRTWNEIIPSKGCLRVGGRCHPHVNGVFFNGIILGPDGNVLIPEMQSSLLQQHMELLVSSVIPLMHPLADPSTVFKNGDEAEDFVEVHLPDVHERISGVDLGLPNWGKYVLLSAGALTALMLIIFLMTCWRRVNRSEPTQHNLRGTGREVSVTPQSGKIISSWESYKSGGETGL*

G ВИРУСА БЕШЕНСТВА (SEQ ID NO: 16)

auggugccgcaggcucuccuguuugucccccuucuggucuuuccauuguguuuugggaaauucccuaucuacacaauuccggacaaguugggacccuggagcccaauugacauucaucaucucagcugcccgaacaauuuggucguggaggacgaaggaugcaccaaccugucgggguucuccuacauggaauugaaagucggauacaucagugccauuaagaugaacggguucacuugcacaggcgucgugacugaagcugagacauacacuaacuucgugggauaugucacuaccacuuucaaaagaaagcauuuccgcccuacuccugaugcuuguagggccgcauacaacuggaagauggccggugaccccagauaugaggaaucacuucacaauccguacccugacuaccacuggcuucggacugucaaaaccaccaaggagucacucgugaucauuaguccaaguguggcugaucuugacccauacgaccggucacuucacucacggguguucccgggggggaauugcucuggugucgcagugucgucaaccuacugcuccacaaaccacgauuacaccauuuggaugccagaaaauccucggcuugguaugucaugugacauuuucaccaauucucgggggaagagggcuuccaaagggucugaaacuugcggcuuugucgaugagcggggcuuguauaagucacuuaaaggugcuugcaaacucaagcuuuguggugucuugggauugagauugauggauggaacuugggucgcaaugcagacuucuaacgaaaccaaauggugcccucccggacagcuugugaauuugcaugacuuucgcucugacgaaauugagcaucuugucgucgaggaguuggucaagaagcgggaagagugucuggaugcuuuggaaucaaucaugaccaccaagucagugucuuucagacggcucucacaucuuaggaaauuggugccagguuuuggaaaagcauauaccauuuucaacaagacccuuauggaagccgaugcucacuacaagucugucaggacuuggaaugagaucaucccgucuaaagggugucuuagggucggagggagaugucauccucaugucaacggagucuuuuucaaugguaucauucuuggaccugacggaaauguccuuaucccugagaugcaaucuucccuccuccagcaacacauggaacuucuugucucaucggucaucccccuuaugcacccccuggcugacccaucaaccguguucaagaacggugacgaggcagaggauuuugucgagguccaccuucccgaugugcaugaacggaucucuggugucgaccuuggacucccuaacuggggaaaguauguccuucugucggcaggagcccugacugccuugauguugauuaucuuccugaugacuuguuggaggagagucaaucggucggagccaacacaacauaaucucagaggaacaggaagggaggugucagucacaccccaaagcgggaagaucauuucgucuugggagucauacaagagcggaggugaaaccggacuguga

Следующие примеры служат для обеспечения дальнейшего понимания изобретения, но они не предназначены для ограничения каким-либо образом эффективного объема изобретения.

ПРИМЕРЫ

ПРИМЕР 1

ВКЛЮЧЕНИЕ КОДИРУЮЩИХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ДЛЯ КАПСИДНЫХ БЕЛКОВ FCV В РНК-РЕПЛИКОННЫЕ ЧАСТИЦЫ АЛЬФАВИРУСОВ

ВВЕДЕНИЕ

РНК-вирусы можно использовать в качестве векторных носителей для введения вакцинных антигенов, которые встроены способами генной инженерии в их геномы. Однако их применение на сегодняшний день ограничено в основном включением вирусных антигенов в РНК-вирус, а затем введением вируса в хозяина-реципиента. Результатом является индукция защитных антител против включенных вирусных антигенов. РНК-репликонные частицы альфавирусов используют для кодирования патогенных антигенов. Такие платформы репликонов альфавирусов разработаны на основе нескольких различных альфавирусов, включая вирус венесуэльского энцефалита лошадей (VEE) [Pushko et al., Virology 239:389-401 (1997)], вирус Синдбис (SIN) [Bredenbeek et al., Journal of Virology 67:6439-6446 (1993), содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме], и вирус леса Семлики (SFV) [Liljestrom and Garoff, Biotechnology (NY) 9:1356-1361 (1991), содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме]. Более того, РНК-репликонные частицы альфавирусов являются основой для нескольких лицензированных USDA вакцин для свиней и птиц. Они включают вакцину от эпидемической диареи свиней, РНК-частицы (код продукта 19U5.P1), вакцину против свиного гриппа, РНК (код продукта 19A5.D0), вакцину против птичьего гриппа, РНК (код продукта 19O5.D0) и рецептурный препарат, РНК-частицы (код продукта 9PP0.00).

КОНСТРУИРОВАНИЕ РНК-РЕПЛИКОННОЙ ЧАСТИЦЫ АЛЬФАВИРУСА

RP-FCV:

Аминокислотные последовательности для капсидных белков FCV использовали для получения кодон-оптимизированных (использование кодонов у животных семейства кошачьих) нуклеотидных последовательностей in silico. Оптимизированные последовательности получали в качестве синтезированной ДНК от коммерческого поставщика (ATUM, Newark, CA). Таким образом, синтетические гены конструировали на основе аминокислотных последовательностей капсидного белка VS-FCV и капсидного белка F9-подобного FCV, соответственно. Конструкции, кодирующие аминокислотную последовательность [SEQ ID NO: 2] для капсидного белка VS-FCV, или [SEQ ID NO: 4] для капсидного белка F9-подобного FCV, подвергали оптимизации кодонов для животных семейства кошачьих, с фланкирующей последовательностью, пригодной для клонирования в репликонную плазмиду альфавируса.

Репликонные векторы VEE, сконструированные для экспрессии капсидных белков FCV, конструировали, как описано ранее [см., U.S. 9441247 B2; содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки] со следующими модификациями. Происходящий из TC-83 репликонный вектор "pVEK" [раскрытый и описанный в U.S. 9441247 B2] расщепляли ферментами рестрикции AscI и PacI. ДНК-плазмиду, содержавшую кодон-оптимизированную нуклеотидную последовательность открытой рамки считывания генов капсида FCV с 5’-фланкирующей последовательностью (5’-GGCGCGCCGCACC-3’) [SEQ ID NO: 11] и 3’-фланкирующей последовательностью (5’-TTAATTAA-3’), аналогичным образом расщепляли ферментами рестрикции AscI и PacI. Затем синтетическую кассету лигировали в расщепленный вектор pVEK.

Получение РНК-репликонных частиц (RP) TC-83 проводили способами, описанными ранее [U.S. 9441247 B2 и U.S. 8460913 B2; содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки]. В кратком изложении, ДНК репликонного вектора pVHV и хелперные ДНК-плазмиды линеаризовывали с использованием фермента рестрикции NotI перед транскрипцией in vitro с использованием РНК-полимеразы T7 MegaScript и аналога кэпа (Promega, Madison, WI). Важно, что хелперные РНК, использованные для получения, не имели субгеномной промоторной последовательности VEE, как описано ранее [Kamrud et al., J Gen Virol. 91(Pt 7):1723-1727 (2010)]. Очищенную РНК для репликонного и хелперного компонентов комбинировали и смешивали с суспензией клеток Vero, подвергали электропорации в 4-мм кюветах и возвращали в среду для культивирования клеток OptiPro^® SFM (Thermo Fisher, Waltham MA). После инкубации в течение ночи РНК-репликонные частицы альфавирусов очищали из клеток и среды, пропуская суспензию через глубинный фильтр ZetaPlus BioCap (3M, Maplewood, MN), промывая фосфатно-солевым буфером, содержащим 5% сахарозу (масс./об.), и, наконец, элюируя задержанные RP посредством буфера из 400 мМ NaCl. Элюированные RP составляли до конечной концентрации сахарозы 5% (масс./об.), пропускали через 0,22-микронный мембранный фильтр, и распределяли на аликвоты для хранения. Титр функциональных RP определяли с использованием иммунофлуоресцентного анализа на инфицированных монослоях клеток Vero.

RP-FeLV:

Аминокислотную последовательность gp85 FeLV использовали для получения кодон-оптимизированных (использование кодонов животными семейства кошачьих) нуклеотидных последовательностей in silico. Оптимизированные последовательности получали в качестве синтезированной ДНК от коммерческого поставщика (ATUM, Newark, CA). Таким образом, синтетические гены конструировали на основе аминокислотной последовательности gp85. Конструкция (gp85_wt) представляла собой аминокислотную последовательность дикого типа [SEQ ID NO: 2], кодон-оптимизированную для животных семейства кошачьих, с фланкирующей последовательностью, пригодной для клонирования в репликонную плазмиду альфавируса.

Репликонные векторы VEE, сконструированные для экспрессии gp85 FeLV, конструировали, как описано ранее [см. U.S. 9441247 B2; содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки в полном объеме], со следующими модификациями. Происходящий из TC-83 репликонный вектор "pVEK" [раскрытый и описанный в U.S. 9441247 B2] расщепляли ферментами рестрикции AscI и PacI. ДНК-плазмиду, содержавшую кодон-оптимизированную нуклеотидную последовательность открытой рамки считывания генов gp85 FeLV с 5’-фланкирующей последовательностью (5’-GGCGCGCCGCACC-3’) [SEQ ID NO: 11] и 3’-фланкирующей последовательностью (5’-TTAATTAA-3’), аналогичным образом расщепляли ферментами рестрикции AscI и PacI. Затем синтетическую генную кассету лигировали в расщепленный вектор pVEK и полученный клон переименовывали как "pVHV-FeLV gp85". Номенклатура вектора "pVHV" была выбрана для отнесения к происходящим из pVEK репликонным векторам, содержащим трансгенные кассеты, клонированные через участки AscI и PacI в участок множественного клонирования pVEK.

Получение РНК-репликонных частиц (RP) TC-83 проводили способами, описанными ранее [U.S. 9441247 B2 и U.S. 8460913 B2; содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылки]. В кратком изложении, ДНК репликонного вектора pVHV и хелперные ДНК-плазмиды линеаризовывали с использованием фермента рестрикции NotI перед транскрипцией in vitro с использованием РНК-полимеразы T7 MegaScript и аналога кэпа (Promega, Madison, WI). Важно, что хелперные РНК, использованные для получения, не имели субгеномной промоторной последовательности VEE, как описано ранее [Kamrud et al., J Gen Virol. 91(Pt 7):1723-1727 (2010)]. Очищенную РНК для репликонного и хелперного компонентов комбинировали и смешивали с суспензией клеток Vero, подвергали электропорации в 4-мм кюветах и возвращали в среду для культивирования клеток OptiPro^® SFM (Thermo Fisher, Waltham MA). После инкубации в течение ночи РНК-репликонные частицы альфавирусов очищали из клеток и среды, пропуская суспензию через глубинный фильтр ZetaPlus BioCap (3M, Maplewood, MN), промывая фосфатно-солевым буфером, содержащим 5% сахарозу (масс./об.), и, наконец, элюируя задержанные RP посредством буфера из 400 мМ NaCl. Элюированные RP составляли до конечной концентрации сахарозы 5% (масс./об.), пропускали через 0,22-микронный мембранный фильтр, и распределяли на аликвоты для хранения. Титр функциональных RP определяли с использованием иммунофлуоресцентного анализа на инфицированных монослоях клеток Vero.

RP-RV

Получали вакцину, содержащую РНК-репликонную частицу альфавируса, кодирующую гликопротеин (G) вируса бешенства, из вируса бешенства (RV), упакованного в капсидный белок, и гликопротеинов авирулентного штамма TC-83 вируса венесуэльского энцефалита лошадей. Нуклеотидную последовательность белка G вируса бешенства подвергали кодон-оптимизации для человека. Полученная последовательность обладает только ~85% идентичностью нуклеотидов с последовательностью гликопротеина (G) живого вируса бешенства, несмотря на наличие 100% идентичности аминокислот. Вакцину можно использовать в качестве однократной дозы, вводимой млекопитающему, например, подкожно кошкам и собакам в возрасте 12 недель или старше, или альтернативно в качестве многократных доз, включающих первичное введение, за которым следует одно или несколько вспомогательных введений.

Аминокислотную последовательность гликопротеина (G) вируса бешенства использовали для получения кодон-оптимизированных (использование кодонов человека) нуклеотидных последовательностей in silico. Оптимизированные последовательности получали в качестве синтетической ДНК от коммерческого поставщика (ATUM, Newark, CA). Таким образом, конструировали синтетический ген [SEQ ID NO: 9] на основе аминокислотной последовательности гликопротеина вируса бешенства. Конструкция (RABV-G) представляла собой аминокислотную последовательность дикого типа [SEQ ID NO: 10], кодон-оптимизированную для человека, с фланкирующей последовательностью, пригодной для клонирования в репликонную плазмиду альфавируса.

Репликонные векторы VEE, сконструированные для экспрессии G вируса бешенства, конструировали, как описано выше [см., U.S. 9441247 B2; содержание которой включено в настоящее описание в качестве ссылки], со следующими модификациями. Происходящий из TC-83 репликонный вектор "pVEK" [раскрытый и описанный в U.S. 9441247 B2] расщепляли ферментами рестрикции AscI и PacI. ДНК-плазмиду, содержавшую нуклеотидную последовательность кодон-оптимизированной открытой рамки считывания гена G бешенства с 5’-фланкирующей последовательностью (5’-GGCGCGCCGCACC-3’) [SEQ ID NO: 11] и 3’-фланкирующей последовательностью (5’-TTAATTAA-3’), аналогичным образом расщепляли ферментами рестрикции AscI и PacI. Затем синтетическую генную кассету лигировали в расщепленный вектор pVEK и полученный клон переименовали как "pVHV-RABV-G". Номенклатура вектора "pVHV" была выбрана для указания на происходящие из pVEK репликонные векторы, содержащие трансгенные кассеты, клонированные через участки AscI и PacI в участок множественного клонирования pVEK.

Получение РНК-репликонных частиц (RP) TC-83 проводили способами, описанными ранее [U.S. 9441247 B2 и U.S. 8460913 B2; содержание которых включено в настоящее описание в качестве ссылок]. В кратком изложении, ДНК репликонного вектора pVHV и ДНК плазмид-помощников линеаризовывали с использованием фермента рестрикции NotI перед транскрипцией in vitro с использованием РНК-полимеразы MegaScript T7 и аналога кэпа (Promega, Madison, WI). Важно, что РНК-помощники, использованные для получения, лишены субгеномной промоторной последовательности VEE, как описано ранее [Kamrud et al., J Gen Virol. 91(Pt 7):1723-1727 (2010)]. Очищенную РНК для репликонных и хелперных компонентов объединяли и смешивали с суспензией клеток Vero, подвергали электропорации в кюветах размером 4 мм и возвращали в клеточную культуральную среду OptiPro^® SFM (Thermo Fisher, Waltham, MA). После инкубации в течение ночи РНК-репликонные частицы альфавирусов очищали от клеток и среды, пропуская суспензию через глубинный фильтр ZetaPlus BioCap^® (3M, Maplewood, MN), промывая фосфатно-солевым буфером, содержащим 5% сахарозу (масс./об.), и, наконец, элюируя оставшиеся RP 400 мМ буфером NaCl. Элюированные RP составляли до конечного содержания сахарозы 5% (масс./об.), пропускали через 0,22-микронный мембранный фильтр и распределяли на аликвоты для хранения. Титр функциональных RP определяли с использованием иммунофлуоресцентного анализа монослоев инфицированных клеток Vero.

ПРИМЕР 2

ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ КОМБИНИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ, СОДЕРЖАЩЕЙ ДВЕ КОНСТРУКЦИИ RP И ТРИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ЖИВЫХ ФРАКЦИИ, У КОШЕК

Различные составы и способы восстановления лиофилизированной пятивалентной комбинированной вакцины для животных семейства кошачьих оценивали в отношении их безопасности у кошек. Желаемым способом предоставления пятивалентной вакцины является доза 0,5 мл, оптимальным составом и способом заполнения является заполнение 0,5 мл. Стабилизатор содержал 1,1% NZ-амин (ферментативный гидролиза казеина), 1,1% желатин и 7,5% сахарозу, причем проценты соответствуют конечным концентрациям. Если ограничения по объему и конечной эффективности для добавления пяти фракций требуют объема более 0,5 мл, продукт можно составлять и заполнять в количестве 1,0 мл и восстанавливать 0,5 мл разбавителя. Это удваивает концентрацию стабилизирующих компонентов во введенной дозе. Безопасность такой концентрированной дозы стабилизатора с этими антигенами ранее еще не тестировали у кошек.

Также тестировали третью возможность объема заполнения 1,0 мл с гидратацией посредством 1,0 мл разбавителя на случай, если формат заполнение 1,0 мл/регидратация 0,5 мл оказался бы не безопасным у кошек. Вакцины смешивали, а затем лиофилизировали. Вакцины содержали РНК-репликонную частицу альфавируса, которая кодирует гликопротеин вируса кошачьего лейкоза (RP-FeLV), и РНК-репликонную частицу альфавируса, которая кодирует капсидный белок кошачьего кальцивируса (RP-FCV), вместе с компонентами коммерчески доступной вакцины Feline-1 Nobivac^®, т.е. модифицированным живым (MLV) вирусом кошачьей панлейкопении (FPL), модифицированным живым вирусом кошачьего вирусного ринотрахеита (FVR) и модифицированными живыми Chlamydophila felis в стабилизаторе, содержавшем 1,1% желатин, 1,1% NZ-амин и 7,5% сахарозу. Различные составы пятивалентной комбинированной вакцины для животных семейства кошачьих получали и восстанавливали, как описано в таблице 1 ниже:

ТАБЛИЦА 1

СОСТАВЫ ПЯТИВАЛЕНТНОЙ КОМБИНИРОВАННОЙ ВАКЦИНЫ

Группа введения № кошек Антигены тестируемого продукта Объем лиофилизированного кека (заполнения) Объем разбавителя (регидратации) 1 6 RP-FCV, RP-FeLV, FPL, FVR и C. felis 1,0 мл 1,0 мл 2 6 1,0 мл 0,5 мл 3 6 0,5 мл 0,5 мл 4 2 Только разбавитель NA 1,0 мл

Вакцины составляли, чтобы они содержали одну и ту же дозу каждого антигена (вакцину с кеком объемом 0,5 мл составляли с двукратной концентрацией каждого антигена), стабилизатор использовали с постоянной концентрацией во всех составах (вакцина с кеком 1,0 мл, регидратируемая 0,5 мл разбавителя, содержавшего двукратную концентрацию стабилизатора при регидратации).

Экспериментальных кошек вакцинировали указанным объемом соответствующей тестируемой вакцины в возрасте 7-8 недель (как правило, имеющих минимальный возраст вакцинации для базовой вакцинации животных семейства кошачьих) и вновь через 21 сутки. За кошками наблюдали в течение 15 минут после каждой вакцинации в отношении реакций на тестируемую вакцину, которые могут включать боль или дискомфорт, такой как издавание звуков, жжение, зуд, кусание, внезапное движение при инъекции вакцин или любую необычную реакцию (см. таблицы 2 и 3 ниже). Клиническая оценка проводилась ветеринаром через 4-6 часов после вакцинации и каждые сутки в течение трех суток после вакцинации.

Клиническая оценка включала пальпацию области инъекции и наблюдение каких-либо локальных реакций, включая боль при прикосновении, опухание, покраснение или абсцесс. Кошек также наблюдали в отношении каких-либо системных реакций, таких как депрессия, вялость, хромота, рвота, тремор, возбуждение и диарея. Также измеряли температуру тела, и ее регистрировали через 4-6 часов после вакцинации и каждые сутки в течение двух суток после каждой вакцинации. Кроме того, проводили пальпацию областей инъекции в отношении локальных реакций три раза в неделю с 7 суток по 21 сутки после каждой вакцинации.

Было выявлено, что все вакцинные составы и протоколы регидратации являются безопасными. Ни у одной из кошек не наблюдали локальных или системных реакций. Температура тела в каждый момент измерения для всех кошек была нормальной за исключением одной кошки в группе введения 3 (0,5 мл кека/ 0,5 мл разбавителя), которая имела температуру тела 103,6° (39,8°С) через пять часов после вакцинации. Таким образом, было выявлено, что все три препарата пятивалентной вакцины являются приемлемыми.

ТАБЛИЦА 2

НЕМЕДЛЕННЫЕ РЕАКЦИИ НА ВАКЦИНАЦИЮ ПЯТИВАЛЕНТНОЙ КОМБИНИРОВАННОЙ ВАКЦИНОЙ

Группа введения ID вакцины Издавание звуков Кусание (в ходе инъекции) Внезапное движение от инъекции Чесание области инъекции (после инъекции) 1-я вакцинация 2-я вакцинация 1-я вакцинация 2-я вакцинация 1-я вакцинация 2-я вакцинация 1-я вакцинация 2-я вакцинация 1 Пятивалентная вакцина для животных семейства кошачьих 1,0 мл кека/1,0 мл разбавителя 0/6 1/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 2 Пятивалентная вакцина для животных семейства кошачьих 1,0 мл кека/0,5 мл разбавителя 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 3 Пятивалентная вакцина для животных семейства кошачьих 0,5 мл кека/0,5 мл разбавителя 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 4 Только разбавитель, 1,0 мл 1/2 1/2 0/2 0/2 1/2 1/2 0/2 0/2

ТАБЛИЦА 3

ЛОКАЛЬНЫЕ/СИСТЕМНЫЕ РЕАКЦИИ НА ВАКЦИНАЦИЮ ПЯТИВАЛЕНТНОЙ КОМБИНИРОВАННОЙ ВАКЦИНОЙ

Группа введения ID вакцины Локальные реакции (покраснение, боль при прикосновении, опухание или абсцесс) Системные реакции
(рвота, хромота, депрессия, вялость, тремор, возбуждение или диарея) Температура тела
≥103,5° (39,8°С) после вакцинации 1-я вакцинация 2-я вакцинация 1-я вакцинация 2-я вакцинация 1-я вакцинация 2-я вакцинация 1 Пятивалентная вакцина для животных семейства кошачьих 1,0 мл кека/1,0 мл разбавителя 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 2 Пятивалентная вакцина для животных семейства кошачьих 1,0 мл кека/0,5 мл разбавителя 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 3 Пятивалентная вакцина для животных семейства кошачьих 0,5 мл кека/0,5 мл разбавителя 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 1/6 4 Только разбавитель, 1,0 мл 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2 0/2

Объем настоящего изобретения не ограничивается конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем описании. Действительно, различные модификации изобретения в дополнение к модификациям, описанным в настоящем описании, станут понятными специалистам в данной области из приведенного выше описания. Подразумевается, что такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.

Кроме того, должно быть понятно, что все размеры оснований или размеры аминокислот, и все величины молекулярного веса или молекулярной массы, приведенные для нуклеиновых кислот или полипептидов, являются приблизительными и предоставлены для описания.

--->

Перечень последовательностей

SEQUENCE LISTING

<110> Intervet, Inc.

Intervet International BV

Xu, Zhichang

Lafleur, Rhonda

Tarpey, Ian

<120> Multivalent Feline Vaccine

<130> 24553

<150> 62/599,401

<151> 2017-12-15

<150> 62/596,508

<151> 2017-12-08

<150> 62/582,050

<151> 2017-11-06

<150> 62/581,955

<151> 2017-11-06

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1638

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> codon optimized for feline

<400> 1

atggctgacg acggatctgt gaccacccca gaacaaggaa caatggtcgg aggagtgatt 60

gccgaaccca gcgctcagat gtcaactgcg gcggacatgg cctccggaaa gtcggtggac 120

tccgagtggg aagccttctt ctcgttccac acgtccgtga actggagcac ctccgaaacc 180

caaggaaaga tcctcttcaa gcagtccctg ggtcccctgc tgaacccgta cctggagcac 240

atcagcaagc tgtacgtcgc ttggagcggg tcgatcgaag tgcgattttc catctcggga 300

agcggcgtgt tcggtggtaa actggccgcc atcgtcgtgc cgcctggtgt cgaccctgtc 360

cagtcaacct ccatgctgca gtacccgcac gtcctgttcg acgcaagaca agtggagcca 420

gtgatcttct ccatcccgga cctccgcaac agcctgtatc acttgatgtc cgataccgat 480

accacttccc tcgtgatcat ggtgtacaac gatctgatca acccgtacgc caatgactcc 540

aacagctcgg gttgcatcgt gaccgtcgaa acgaagcctg gcatcgattt caagtttcat 600

ctgctgaaac cgcccggatc catgcttact cacgggtcca tcccttccga tctgatcccc 660

aagagctcct ccctgtggat tgggaaccgc cactggaccg atattaccga tttcgtgatt 720

cggcctttcg tgttccaagc caaccggcac ttcgacttca accaggagac tgccggctgg 780

tcaactccac ggttccgccc attggccgtg actgtgtcgc agtcaaaggg agccaagctc 840

gggaacggca tcgccaccga ctacattgtg cctggaatcc ccgacggatg gcctgatact 900

accatcccca ccaagctgac ccctaccgga gattacgcca tcacctcctc cgacggcaat 960

gatattgaaa ccaagctgga atacgagaac gcggacgtga ttaagaacaa caccaacttc 1020

cgctccatgt atatctgcgg aagcctccag agggcttggg gcgacaagaa gatcagcaac 1080

accgggttca tcactaccgg agtgatttct gacaactcca tcagcccttc gaacacaatt 1140

gaccagtcca agatcgtggt gtaccaggac aaccatgtca attcggaggt ccagactagc 1200

gacatcactc ttgccatcct gggctacacc ggaattggag aagaggccat aggcgccaac 1260

cgggactccg tcgtgagaat ttccgtgctt ccggaaactg gagcaagggg cggaaatcac 1320

cccatcttct acaaaaattc catgaagctg ggctacgtga tctcctccat tgacgtgttc 1380

aactcccaaa tcctccacac ctcgcgccag ctgtcactga acaactactt gttgccccct 1440

gactccttcg cggtgtaccg gattattgac agcaacggat catggttcga cattgggatt 1500

gacagcgatg ggttttcatt cgtgggcgtg tcgtcatttc caaagctgga gtttccgctg 1560

tccgcctcat acatgggcat ccagctcgca aagatccggc tggcgtccaa catccggtca 1620

tccatgacta agctgtga 1638

<210> 2

<211> 545

<212> PRT

<213> Feline calicivirus

<400> 2

Met Ala Asp Asp Gly Ser Val Thr Thr Pro Glu Gln Gly Thr Met Val

1 5 10 15

Gly Gly Val Ile Ala Glu Pro Ser Ala Gln Met Ser Thr Ala Ala Asp

20 25 30

Met Ala Ser Gly Lys Ser Val Asp Ser Glu Trp Glu Ala Phe Phe Ser

35 40 45

Phe His Thr Ser Val Asn Trp Ser Thr Ser Glu Thr Gln Gly Lys Ile

50 55 60

Leu Phe Lys Gln Ser Leu Gly Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Leu Glu His

65 70 75 80

Ile Ser Lys Leu Tyr Val Ala Trp Ser Gly Ser Ile Glu Val Arg Phe

85 90 95

Ser Ile Ser Gly Ser Gly Val Phe Gly Gly Lys Leu Ala Ala Ile Val

100 105 110

Val Pro Pro Gly Val Asp Pro Val Gln Ser Thr Ser Met Leu Gln Tyr

115 120 125

Pro His Val Leu Phe Asp Ala Arg Gln Val Glu Pro Val Ile Phe Ser

130 135 140

Ile Pro Asp Leu Arg Asn Ser Leu Tyr His Leu Met Ser Asp Thr Asp

145 150 155 160

Thr Thr Ser Leu Val Ile Met Val Tyr Asn Asp Leu Ile Asn Pro Tyr

165 170 175

Ala Asn Asp Ser Asn Ser Ser Gly Cys Ile Val Thr Val Glu Thr Lys

180 185 190

Pro Gly Ile Asp Phe Lys Phe His Leu Leu Lys Pro Pro Gly Ser Met

195 200 205

Leu Thr His Gly Ser Ile Pro Ser Asp Leu Ile Pro Lys Ser Ser Ser

210 215 220

Leu Trp Ile Gly Asn Arg His Trp Thr Asp Ile Thr Asp Phe Val Ile

225 230 235 240

Arg Pro Phe Val Phe Gln Ala Asn Arg His Phe Asp Phe Asn Gln Glu

245 250 255

Thr Ala Gly Trp Ser Thr Pro Arg Phe Arg Pro Leu Ala Val Thr Val

260 265 270

Ser Gln Ser Lys Gly Ala Lys Leu Gly Asn Gly Ile Ala Thr Asp Tyr

275 280 285

Ile Val Pro Gly Ile Pro Asp Gly Trp Pro Asp Thr Thr Ile Pro Thr

290 295 300

Lys Leu Thr Pro Thr Gly Asp Tyr Ala Ile Thr Ser Ser Asp Gly Asn

305 310 315 320

Asp Ile Glu Thr Lys Leu Glu Tyr Glu Asn Ala Asp Val Ile Lys Asn

325 330 335

Asn Thr Asn Phe Arg Ser Met Tyr Ile Cys Gly Ser Leu Gln Arg Ala

340 345 350

Trp Gly Asp Lys Lys Ile Ser Asn Thr Gly Phe Ile Thr Thr Gly Val

355 360 365

Ile Ser Asp Asn Ser Ile Ser Pro Ser Asn Thr Ile Asp Gln Ser Lys

370 375 380

Ile Val Val Tyr Gln Asp Asn His Val Asn Ser Glu Val Gln Thr Ser

385 390 395 400

Asp Ile Thr Leu Ala Ile Leu Gly Tyr Thr Gly Ile Gly Glu Glu Ala

405 410 415

Ile Gly Ala Asn Arg Asp Ser Val Val Arg Ile Ser Val Leu Pro Glu

420 425 430

Thr Gly Ala Arg Gly Gly Asn His Pro Ile Phe Tyr Lys Asn Ser Met

435 440 445

Lys Leu Gly Tyr Val Ile Ser Ser Ile Asp Val Phe Asn Ser Gln Ile

450 455 460

Leu His Thr Ser Arg Gln Leu Ser Leu Asn Asn Tyr Leu Leu Pro Pro

465 470 475 480

Asp Ser Phe Ala Val Tyr Arg Ile Ile Asp Ser Asn Gly Ser Trp Phe

485 490 495

Asp Ile Gly Ile Asp Ser Asp Gly Phe Ser Phe Val Gly Val Ser Ser

500 505 510

Phe Pro Lys Leu Glu Phe Pro Leu Ser Ala Ser Tyr Met Gly Ile Gln

515 520 525

Leu Ala Lys Ile Arg Leu Ala Ser Asn Ile Arg Ser Ser Met Thr Lys

530 535 540

Leu

545

<210> 3

<211> 1629

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> codon optimized for feline

<400> 3

atgactgccc cggaacaagg aacgatggtc ggaggagtga ttgcagaacc gtcagcacag 60

atgtccaccg ctgccgacat ggccactgga aagagcgtgg actccgaatg ggaagccttc 120

ttctccttcc acacttcggt caactggtcg actagcgaaa cccaggggaa gattttgttc 180

aagcaatccc tcggccctct gctgaacccc tacctggagc atctggccaa gctgtacgtg 240

gcatggtcgg gcagcatcga agtgcgcttt agcatttccg gctccggagt gttcggggga 300

aagcttgctg ccattgtcgt gccgccagga gtggacccgg tgcagtccac ttctatgctc 360

caatacccgc atgtcctgtt cgacgccaga caggtggagc ctgtgatctt ttgcctgccg 420

gatctcaggt ccaccctgta tcacctcatg tccgacaccg acaccacctc gctcgtgatc 480

atggtgtaca acgacctgat caacccctac gctaacgacg ccaacagctc aggttgcatt 540

gtgactgtcg aaaccaagcc aggccctgac ttcaagtttc atttgctgaa gccgcccggt 600

tccatgctga cccacggctc gatcccatcc gacctgatcc ccaagacgag ctccctgtgg 660

atcggaaacc gctactggtc cgatattacc gacttcgtga tcagaccatt cgtgttccaa 720

gccaaccgcc atttcgactt caaccaggaa accgcaggat ggtcgacccc tcgattccgc 780

ccgatttcag tgaccatcac cgaacagaac ggcgcgaagc tgggaattgg cgtggcgacc 840

gactacatcg tgccgggaat cccggatgga tggcctgata cgaccattcc cggggagctg 900

atccctgccg gggactacgc catcaccaac ggtactggaa acgacatcac cactgccacc 960

ggttacgaca ccgccgacat cataaagaac aacaccaact tcagaggaat gtacatttgc 1020

ggctccctgc aacgcgcttg gggtgacaaa aagatctcga acactgcctt catcacaaca 1080

gcgactctgg acggcgataa caacaacaag atcaatcctt gtaataccat cgaccagtcc 1140

aaaatcgtgg tgttccagga taaccacgtg ggaaagaagg cgcagacctc cgacgacact 1200

ctggcgctgc ttggctacac cgggatcggc gagcaggcca ttggaagcga tcgggatcgg 1260

gtcgtgcgga tctccaccct ccccgagact ggagcaaggg gaggcaacca ccccatcttt 1320

tacaaaaaca gcattaagct cggatacgtc atccgctcca tcgatgtgtt caactctcaa 1380

atcctgcaca cttcgcggca gctgtccctg aaccactacc tcttgccgcc cgactccttc 1440

gccgtctacc ggatcattga ttcgaacggg agctggttcg acatcggcat tgatagcgat 1500

ggcttctcgt ttgtgggcgt gtcgggcttc gggaagctgg agttcccact gagcgcctca 1560

tacatgggta tccagctggc caagatcagg ctggcctcca acatccgctc acctatgact 1620

aagctgtga 1629

<210> 4

<211> 542

<212> PRT

<213> Feline calicivirus

<400> 4

Met Thr Ala Pro Glu Gln Gly Thr Met Val Gly Gly Val Ile Ala Glu

1 5 10 15

Pro Ser Ala Gln Met Ser Thr Ala Ala Asp Met Ala Thr Gly Lys Ser

20 25 30

Val Asp Ser Glu Trp Glu Ala Phe Phe Ser Phe His Thr Ser Val Asn

35 40 45

Trp Ser Thr Ser Glu Thr Gln Gly Lys Ile Leu Phe Lys Gln Ser Leu

50 55 60

Gly Pro Leu Leu Asn Pro Tyr Leu Glu His Leu Ala Lys Leu Tyr Val

65 70 75 80

Ala Trp Ser Gly Ser Ile Glu Val Arg Phe Ser Ile Ser Gly Ser Gly

85 90 95

Val Phe Gly Gly Lys Leu Ala Ala Ile Val Val Pro Pro Gly Val Asp

100 105 110

Pro Val Gln Ser Thr Ser Met Leu Gln Tyr Pro His Val Leu Phe Asp

115 120 125

Ala Arg Gln Val Glu Pro Val Ile Phe Cys Leu Pro Asp Leu Arg Ser

130 135 140

Thr Leu Tyr His Leu Met Ser Asp Thr Asp Thr Thr Ser Leu Val Ile

145 150 155 160

Met Val Tyr Asn Asp Leu Ile Asn Pro Tyr Ala Asn Asp Ala Asn Ser

165 170 175

Ser Gly Cys Ile Val Thr Val Glu Thr Lys Pro Gly Pro Asp Phe Lys

180 185 190

Phe His Leu Leu Lys Pro Pro Gly Ser Met Leu Thr His Gly Ser Ile

195 200 205

Pro Ser Asp Leu Ile Pro Lys Thr Ser Ser Leu Trp Ile Gly Asn Arg

210 215 220

Tyr Trp Ser Asp Ile Thr Asp Phe Val Ile Arg Pro Phe Val Phe Gln

225 230 235 240

Ala Asn Arg His Phe Asp Phe Asn Gln Glu Thr Ala Gly Trp Ser Thr

245 250 255

Pro Arg Phe Arg Pro Ile Ser Val Thr Ile Thr Glu Gln Asn Gly Ala

260 265 270

Lys Leu Gly Ile Gly Val Ala Thr Asp Tyr Ile Val Pro Gly Ile Pro

275 280 285

Asp Gly Trp Pro Asp Thr Thr Ile Pro Gly Glu Leu Ile Pro Ala Gly

290 295 300

Asp Tyr Ala Ile Thr Asn Gly Thr Gly Asn Asp Ile Thr Thr Ala Thr

305 310 315 320

Gly Tyr Asp Thr Ala Asp Ile Ile Lys Asn Asn Thr Asn Phe Arg Gly

325 330 335

Met Tyr Ile Cys Gly Ser Leu Gln Arg Ala Trp Gly Asp Lys Lys Ile

340 345 350

Ser Asn Thr Ala Phe Ile Thr Thr Ala Thr Leu Asp Gly Asp Asn Asn

355 360 365

Asn Lys Ile Asn Pro Cys Asn Thr Ile Asp Gln Ser Lys Ile Val Val

370 375 380

Phe Gln Asp Asn His Val Gly Lys Lys Ala Gln Thr Ser Asp Asp Thr

385 390 395 400

Leu Ala Leu Leu Gly Tyr Thr Gly Ile Gly Glu Gln Ala Ile Gly Ser

405 410 415

Asp Arg Asp Arg Val Val Arg Ile Ser Thr Leu Pro Glu Thr Gly Ala

420 425 430

Arg Gly Gly Asn His Pro Ile Phe Tyr Lys Asn Ser Ile Lys Leu Gly

435 440 445

Tyr Val Ile Arg Ser Ile Asp Val Phe Asn Ser Gln Ile Leu His Thr

450 455 460

Ser Arg Gln Leu Ser Leu Asn His Tyr Leu Leu Pro Pro Asp Ser Phe

465 470 475 480

Ala Val Tyr Arg Ile Ile Asp Ser Asn Gly Ser Trp Phe Asp Ile Gly

485 490 495

Ile Asp Ser Asp Gly Phe Ser Phe Val Gly Val Ser Gly Phe Gly Lys

500 505 510

Leu Glu Phe Pro Leu Ser Ala Ser Tyr Met Gly Ile Gln Leu Ala Lys

515 520 525

Ile Arg Leu Ala Ser Asn Ile Arg Ser Pro Met Thr Lys Leu

530 535 540

<210> 5

<211> 1929

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> codon optimized for feline

<400> 5

atggagtcac caacacaccc taaaccttct aaagacaaaa ccctctcgtg gaatctcgcc 60

ttccttgtgg gcatcctgtt cacaatcgac atcggcatgg ccaacccttc gccgcatcag 120

atctacaatg tgacatgggt cattactaat gtgcagacaa acacccaggc aaatgctact 180

tctatgcttg gtactctgac tgatgcttat ccaaccctgc acgtcgacct ttgcgatctc 240

gtcggtgaca catgggagcc catcgtgctg aatccaacta atgtcaaaca tggtgccagg 300

tattcttcta gcaaatacgg gtgtaagacc actgatcgga agaaacagca acaaacctac 360

ccattctacg tgtgcccggg tcacgcaccg tccctgggtc cgaagggaac acattgtggg 420

ggagcccaag acggtttttg cgctgcttgg ggttgtgaaa caaccggaga agcctggtgg 480

aagcctacct catcttggga ctacattact gtgaaaagag gctctagcca ggataacagc 540

tgcgaaggaa agtgtaatcc cctggtgctt caattcaccc agaaaggccg gcaggcatca 600

tgggatggac cgaaaatgtg gggacttaga ctctatcgca ccggatacga ccccatcgct 660

ctgtttactg tgtcacgcca agtctccacc attactccgc cacaggccat ggggccgaat 720

ctggtcctcc ccgatcagaa gccaccctca cggcaaagtc aaaccggctc aaaagtggcc 780

acccaacggc cccagacaaa tgagtccgca cctaggtcag tggcacctac aacaatgggt 840

ccaaagcgga tcggaaccgg agacaggctc attaacctcg tgcaagggac ttatctggcc 900

cttaacgcta ctgaccccaa caagaccaag gattgctggc tctgccttgt gagcagacct 960

ccttactatg aggggatcgc cattctcgga aactactcaa atcagaccaa cccccctccg 1020

tcgtgtctga gcacccccca gcacaagctt actatttcag aagtcagtgg acagggaatg 1080

tgcatcggaa ccgtgccaaa gactcatcaa gccctttgca acaaaactca acaagggcac 1140

actggagctc attatctcgc cgcacctaac gggacctact gggcttgcaa tactggattg 1200

accccgtgta tctctatggc cgtgctgaat tggacttccg acttctgcgt gcttattgag 1260

ctttggccta gagtgacata ccatcagcct gagtacgtct atacccattt cgccaaggca 1320

gtcagattcc ggcgggagcc tatctccctg actgtggcct tgatgctcgg tggactgaca 1380

gtgggaggaa ttgcagctgg agtcggaact ggaaccaagg ccctgctcga aactgctcag 1440

ttccggcagc tgcagatggc catgcacact gacatccagg ctctggagga atcaatttca 1500

gcccttgaga aaagcttgac ctcgctgtct gaagtggtcc tccaaaacag gcgcggtttg 1560

gacatcctgt tccttcaaga gggtggtctg tgcgccgctc tcaaggagga atgctgtttc 1620

tacgctgacc ataccgggct ggtgcgcgat aacatggcaa agctgcggga acgcttgaaa 1680

cagaggcagc aactgttcga ctctcagcag ggatggttcg agggctggtt taacaagagc 1740

ccatggttta ccactctgat ctcttcaatc atgggtccac tgctcatcct gcttctgatt 1800

cttctcttcg gaccgtgtat tctcaacagg ctggtgcagt ttgtcaagga cagaatctcg 1860

gtggtccagg ccctgattct tactcagcag tatcagcaga ttaagcagta cgaccccgat 1920

cggccttga 1929

<210> 6

<211> 642

<212> PRT

<213> Feline leukemia virus

<400> 6

Met Glu Ser Pro Thr His Pro Lys Pro Ser Lys Asp Lys Thr Leu Ser

1 5 10 15

Trp Asn Leu Ala Phe Leu Val Gly Ile Leu Phe Thr Ile Asp Ile Gly

20 25 30

Met Ala Asn Pro Ser Pro His Gln Ile Tyr Asn Val Thr Trp Val Ile

35 40 45

Thr Asn Val Gln Thr Asn Thr Gln Ala Asn Ala Thr Ser Met Leu Gly

50 55 60

Thr Leu Thr Asp Ala Tyr Pro Thr Leu His Val Asp Leu Cys Asp Leu

65 70 75 80

Val Gly Asp Thr Trp Glu Pro Ile Val Leu Asn Pro Thr Asn Val Lys

85 90 95

His Gly Ala Arg Tyr Ser Ser Ser Lys Tyr Gly Cys Lys Thr Thr Asp

100 105 110

Arg Lys Lys Gln Gln Gln Thr Tyr Pro Phe Tyr Val Cys Pro Gly His

115 120 125

Ala Pro Ser Leu Gly Pro Lys Gly Thr His Cys Gly Gly Ala Gln Asp

130 135 140

Gly Phe Cys Ala Ala Trp Gly Cys Glu Thr Thr Gly Glu Ala Trp Trp

145 150 155 160

Lys Pro Thr Ser Ser Trp Asp Tyr Ile Thr Val Lys Arg Gly Ser Ser

165 170 175

Gln Asp Asn Ser Cys Glu Gly Lys Cys Asn Pro Leu Val Leu Gln Phe

180 185 190

Thr Gln Lys Gly Arg Gln Ala Ser Trp Asp Gly Pro Lys Met Trp Gly

195 200 205

Leu Arg Leu Tyr Arg Thr Gly Tyr Asp Pro Ile Ala Leu Phe Thr Val

210 215 220

Ser Arg Gln Val Ser Thr Ile Thr Pro Pro Gln Ala Met Gly Pro Asn

225 230 235 240

Leu Val Leu Pro Asp Gln Lys Pro Pro Ser Arg Gln Ser Gln Thr Gly

245 250 255

Ser Lys Val Ala Thr Gln Arg Pro Gln Thr Asn Glu Ser Ala Pro Arg

260 265 270

Ser Val Ala Pro Thr Thr Met Gly Pro Lys Arg Ile Gly Thr Gly Asp

275 280 285

Arg Leu Ile Asn Leu Val Gln Gly Thr Tyr Leu Ala Leu Asn Ala Thr

290 295 300

Asp Pro Asn Lys Thr Lys Asp Cys Trp Leu Cys Leu Val Ser Arg Pro

305 310 315 320

Pro Tyr Tyr Glu Gly Ile Ala Ile Leu Gly Asn Tyr Ser Asn Gln Thr

325 330 335

Asn Pro Pro Pro Ser Cys Leu Ser Thr Pro Gln His Lys Leu Thr Ile

340 345 350

Ser Glu Val Ser Gly Gln Gly Met Cys Ile Gly Thr Val Pro Lys Thr

355 360 365

His Gln Ala Leu Cys Asn Lys Thr Gln Gln Gly His Thr Gly Ala His

370 375 380

Tyr Leu Ala Ala Pro Asn Gly Thr Tyr Trp Ala Cys Asn Thr Gly Leu

385 390 395 400

Thr Pro Cys Ile Ser Met Ala Val Leu Asn Trp Thr Ser Asp Phe Cys

405 410 415

Val Leu Ile Glu Leu Trp Pro Arg Val Thr Tyr His Gln Pro Glu Tyr

420 425 430

Val Tyr Thr His Phe Ala Lys Ala Val Arg Phe Arg Arg Glu Pro Ile

435 440 445

Ser Leu Thr Val Ala Leu Met Leu Gly Gly Leu Thr Val Gly Gly Ile

450 455 460

Ala Ala Gly Val Gly Thr Gly Thr Lys Ala Leu Leu Glu Thr Ala Gln

465 470 475 480

Phe Arg Gln Leu Gln Met Ala Met His Thr Asp Ile Gln Ala Leu Glu

485 490 495

Glu Ser Ile Ser Ala Leu Glu Lys Ser Leu Thr Ser Leu Ser Glu Val

500 505 510

Val Leu Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Ile Leu Phe Leu Gln Glu Gly

515 520 525

Gly Leu Cys Ala Ala Leu Lys Glu Glu Cys Cys Phe Tyr Ala Asp His

530 535 540

Thr Gly Leu Val Arg Asp Asn Met Ala Lys Leu Arg Glu Arg Leu Lys

545 550 555 560

Gln Arg Gln Gln Leu Phe Asp Ser Gln Gln Gly Trp Phe Glu Gly Trp

565 570 575

Phe Asn Lys Ser Pro Trp Phe Thr Thr Leu Ile Ser Ser Ile Met Gly

580 585 590

Pro Leu Leu Ile Leu Leu Leu Ile Leu Leu Phe Gly Pro Cys Ile Leu

595 600 605

Asn Arg Leu Val Gln Phe Val Lys Asp Arg Ile Ser Val Val Gln Ala

610 615 620

Leu Ile Leu Thr Gln Gln Tyr Gln Gln Ile Lys Gln Tyr Asp Pro Asp

625 630 635 640

Arg Pro

<210> 7

<211> 1233

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> codon optimized for feline

<400> 7

aatcctagtc cacaccaaat atataatgta acttgggtaa taaccaatgt acaaactaac 60

acccaagcta acgccacctc tatgttagga accttaaccg atgcctaccc taccctacat 120

gttgacttat gtgacctagt gggagacacc tgggaaccta tagtcctaaa cccaaccaat 180

gtaaaacacg gggcacgtta ctcctcctca aaatatggat gtaaaactac agatagaaaa 240

aaacagcaac agacataccc cttttacgtc tgccccggac atgccccctc gttggggcca 300

aagggaacac attgtggagg ggcacaagat gggttttgtg ccgcatgggg atgtgagacc 360

accggagaag cttggtggaa gcccacctcc tcatgggact atatcacagt aaaaagaggg 420

agtagtcagg acaatagctg tgagggaaaa tgcaaccccc tggttttgca gttcacccag 480

aagggaagac aagcctcttg ggacggacct aagatgtggg gattgcgact ataccgtaca 540

ggatatgacc ctatcgcttt attcacggtg tcccggcagg tatcaaccat tacgccgcct 600

caggcaatgg gaccaaacct agtcttacct gatcaaaaac ccccatcccg acaatctcaa 660

acagggtcca aagtggcgac ccagaggccc caaacgaatg aaagcgcccc aaggtctgtt 720

gcccccacca ccatgggtcc caaacggatt gggaccggag ataggttaat aaatttagta 780

caagggacat acctagcctt aaatgccacc gaccccaaca aaactaaaga ctgttggctc 840

tgcctggttt ctcgaccacc ctattacgaa gggattgcaa tcttaggtaa ctacagcaac 900

caaacaaacc cccccccatc ctgcctatct actccgcaac acaaactaac tatatctgaa 960

gtatcagggc aaggaatgtg catagggact gttcctaaaa cccaccaggc tttgtgcaat 1020

aagacacaac agggacatac aggggcgcac tatctagccg cccccaacgg cacctattgg 1080

gcctgtaaca ctggactcac cccatgcatt tccatggcgg tgctcaattg gacctctgat 1140

ttttgtgtct taatcgaatt atggcccaga gtgacttacc atcaacccga atatgtgtac 1200

acacattttg ccaaagctgt caggttccga aga 1233

<210> 8

<211> 411

<212> PRT

<213> Feline leukemia virus

<400> 8

Asn Pro Ser Pro His Gln Ile Tyr Asn Val Thr Trp Val Ile Thr Asn

1 5 10 15

Val Gln Thr Asn Thr Gln Ala Asn Ala Thr Ser Met Leu Gly Thr Leu

20 25 30

Thr Asp Ala Tyr Pro Thr Leu His Val Asp Leu Cys Asp Leu Val Gly

35 40 45

Asp Thr Trp Glu Pro Ile Val Leu Asn Pro Thr Asn Val Lys His Gly

50 55 60

Ala Arg Tyr Ser Ser Ser Lys Tyr Gly Cys Lys Thr Thr Asp Arg Lys

65 70 75 80

Lys Gln Gln Gln Thr Tyr Pro Phe Tyr Val Cys Pro Gly His Ala Pro

85 90 95

Ser Leu Gly Pro Lys Gly Thr His Cys Gly Gly Ala Gln Asp Gly Phe

100 105 110

Cys Ala Ala Trp Gly Cys Glu Thr Thr Gly Glu Ala Trp Trp Lys Pro

115 120 125

Thr Ser Ser Trp Asp Tyr Ile Thr Val Lys Arg Gly Ser Ser Gln Asp

130 135 140

Asn Ser Cys Glu Gly Lys Cys Asn Pro Leu Val Leu Gln Phe Thr Gln

145 150 155 160

Lys Gly Arg Gln Ala Ser Trp Asp Gly Pro Lys Met Trp Gly Leu Arg

165 170 175

Leu Tyr Arg Thr Gly Tyr Asp Pro Ile Ala Leu Phe Thr Val Ser Arg

180 185 190

Gln Val Ser Thr Ile Thr Pro Pro Gln Ala Met Gly Pro Asn Leu Val

195 200 205

Leu Pro Asp Gln Lys Pro Pro Ser Arg Gln Ser Gln Thr Gly Ser Lys

210 215 220

Val Ala Thr Gln Arg Pro Gln Thr Asn Glu Ser Ala Pro Arg Ser Val

225 230 235 240

Ala Pro Thr Thr Met Gly Pro Lys Arg Ile Gly Thr Gly Asp Arg Leu

245 250 255

Ile Asn Leu Val Gln Gly Thr Tyr Leu Ala Leu Asn Ala Thr Asp Pro

260 265 270

Asn Lys Thr Lys Asp Cys Trp Leu Cys Leu Val Ser Arg Pro Pro Tyr

275 280 285

Tyr Glu Gly Ile Ala Ile Leu Gly Asn Tyr Ser Asn Gln Thr Asn Pro

290 295 300

Pro Pro Ser Cys Leu Ser Thr Pro Gln His Lys Leu Thr Ile Ser Glu

305 310 315 320

Val Ser Gly Gln Gly Met Cys Ile Gly Thr Val Pro Lys Thr His Gln

325 330 335

Ala Leu Cys Asn Lys Thr Gln Gln Gly His Thr Gly Ala His Tyr Leu

340 345 350

Ala Ala Pro Asn Gly Thr Tyr Trp Ala Cys Asn Thr Gly Leu Thr Pro

355 360 365

Cys Ile Ser Met Ala Val Leu Asn Trp Thr Ser Asp Phe Cys Val Leu

370 375 380

Ile Glu Leu Trp Pro Arg Val Thr Tyr His Gln Pro Glu Tyr Val Tyr

385 390 395 400

Thr His Phe Ala Lys Ala Val Arg Phe Arg Arg

405 410

<210> 9

<211> 1575

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> codon optimized for human

<400> 9

atggtgccgc aggctctcct gtttgtcccc cttctggtct ttccattgtg ttttgggaaa 60

ttccctatct acacaattcc ggacaagttg ggaccctgga gcccaattga cattcatcat 120

ctcagctgcc cgaacaattt ggtcgtggag gacgaaggat gcaccaacct gtcggggttc 180

tcctacatgg aattgaaagt cggatacatc agtgccatta agatgaacgg gttcacttgc 240

acaggcgtcg tgactgaagc tgagacatac actaacttcg tgggatatgt cactaccact 300

ttcaaaagaa agcatttccg ccctactcct gatgcttgta gggccgcata caactggaag 360

atggccggtg accccagata tgaggaatca cttcacaatc cgtaccctga ctaccactgg 420

cttcggactg tcaaaaccac caaggagtca ctcgtgatca ttagtccaag tgtggctgat 480

cttgacccat acgaccggtc acttcactca cgggtgttcc cgggggggaa ttgctctggt 540

gtcgcagtgt cgtcaaccta ctgctccaca aaccacgatt acaccatttg gatgccagaa 600

aatcctcggc ttggtatgtc atgtgacatt ttcaccaatt ctcgggggaa gagggcttcc 660

aaagggtctg aaacttgcgg ctttgtcgat gagcggggct tgtataagtc acttaaaggt 720

gcttgcaaac tcaagctttg tggtgtcttg ggattgagat tgatggatgg aacttgggtc 780

gcaatgcaga cttctaacga aaccaaatgg tgccctcccg gacagcttgt gaatttgcat 840

gactttcgct ctgacgaaat tgagcatctt gtcgtcgagg agttggtcaa gaagcgggaa 900

gagtgtctgg atgctttgga atcaatcatg accaccaagt cagtgtcttt cagacggctc 960

tcacatctta ggaaattggt gccaggtttt ggaaaagcat ataccatttt caacaagacc 1020

cttatggaag ccgatgctca ctacaagtct gtcaggactt ggaatgagat catcccgtct 1080

aaagggtgtc ttagggtcgg agggagatgt catcctcatg tcaacggagt ctttttcaat 1140

ggtatcattc ttggacctga cggaaatgtc cttatccctg agatgcaatc ttccctcctc 1200

cagcaacaca tggaacttct tgtctcatcg gtcatccccc ttatgcaccc cctggctgac 1260

ccatcaaccg tgttcaagaa cggtgacgag gcagaggatt ttgtcgaggt ccaccttccc 1320

gatgtgcatg aacggatctc tggtgtcgac cttggactcc ctaactgggg aaagtatgtc 1380

cttctgtcgg caggagccct gactgccttg atgttgatta tcttcctgat gacttgttgg 1440

aggagagtca atcggtcgga gccaacacaa cataatctca gaggaacagg aagggaggtg 1500

tcagtcacac cccaaagcgg gaagatcatt tcgtcttggg agtcatacaa gagcggaggt 1560

gaaaccggac tgtga 1575

<210> 10

<211> 524

<212> PRT

<213> Rabies virus

<400> 10

Met Val Pro Gln Ala Leu Leu Phe Val Pro Leu Leu Val Phe Pro Leu

1 5 10 15

Cys Phe Gly Lys Phe Pro Ile Tyr Thr Ile Pro Asp Lys Leu Gly Pro

20 25 30

Trp Ser Pro Ile Asp Ile His His Leu Ser Cys Pro Asn Asn Leu Val

35 40 45

Val Glu Asp Glu Gly Cys Thr Asn Leu Ser Gly Phe Ser Tyr Met Glu

50 55 60

Leu Lys Val Gly Tyr Ile Ser Ala Ile Lys Met Asn Gly Phe Thr Cys

65 70 75 80

Thr Gly Val Val Thr Glu Ala Glu Thr Tyr Thr Asn Phe Val Gly Tyr

85 90 95

Val Thr Thr Thr Phe Lys Arg Lys His Phe Arg Pro Thr Pro Asp Ala

100 105 110

Cys Arg Ala Ala Tyr Asn Trp Lys Met Ala Gly Asp Pro Arg Tyr Glu

115 120 125

Glu Ser Leu His Asn Pro Tyr Pro Asp Tyr His Trp Leu Arg Thr Val

130 135 140

Lys Thr Thr Lys Glu Ser Leu Val Ile Ile Ser Pro Ser Val Ala Asp

145 150 155 160

Leu Asp Pro Tyr Asp Arg Ser Leu His Ser Arg Val Phe Pro Gly Gly

165 170 175

Asn Cys Ser Gly Val Ala Val Ser Ser Thr Tyr Cys Ser Thr Asn His

180 185 190

Asp Tyr Thr Ile Trp Met Pro Glu Asn Pro Arg Leu Gly Met Ser Cys

195 200 205

Asp Ile Phe Thr Asn Ser Arg Gly Lys Arg Ala Ser Lys Gly Ser Glu

210 215 220

Thr Cys Gly Phe Val Asp Glu Arg Gly Leu Tyr Lys Ser Leu Lys Gly

225 230 235 240

Ala Cys Lys Leu Lys Leu Cys Gly Val Leu Gly Leu Arg Leu Met Asp

245 250 255

Gly Thr Trp Val Ala Met Gln Thr Ser Asn Glu Thr Lys Trp Cys Pro

260 265 270

Pro Gly Gln Leu Val Asn Leu His Asp Phe Arg Ser Asp Glu Ile Glu

275 280 285

His Leu Val Val Glu Glu Leu Val Lys Lys Arg Glu Glu Cys Leu Asp

290 295 300

Ala Leu Glu Ser Ile Met Thr Thr Lys Ser Val Ser Phe Arg Arg Leu

305 310 315 320

Ser His Leu Arg Lys Leu Val Pro Gly Phe Gly Lys Ala Tyr Thr Ile

325 330 335

Phe Asn Lys Thr Leu Met Glu Ala Asp Ala His Tyr Lys Ser Val Arg

340 345 350

Thr Trp Asn Glu Ile Ile Pro Ser Lys Gly Cys Leu Arg Val Gly Gly

355 360 365

Arg Cys His Pro His Val Asn Gly Val Phe Phe Asn Gly Ile Ile Leu

370 375 380

Gly Pro Asp Gly Asn Val Leu Ile Pro Glu Met Gln Ser Ser Leu Leu

385 390 395 400

Gln Gln His Met Glu Leu Leu Val Ser Ser Val Ile Pro Leu Met His

405 410 415

Pro Leu Ala Asp Pro Ser Thr Val Phe Lys Asn Gly Asp Glu Ala Glu

420 425 430

Asp Phe Val Glu Val His Leu Pro Asp Val His Glu Arg Ile Ser Gly

435 440 445

Val Asp Leu Gly Leu Pro Asn Trp Gly Lys Tyr Val Leu Leu Ser Ala

450 455 460

Gly Ala Leu Thr Ala Leu Met Leu Ile Ile Phe Leu Met Thr Cys Trp

465 470 475 480

Arg Arg Val Asn Arg Ser Glu Pro Thr Gln His Asn Leu Arg Gly Thr

485 490 495

Gly Arg Glu Val Ser Val Thr Pro Gln Ser Gly Lys Ile Ile Ser Ser

500 505 510

Trp Glu Ser Tyr Lys Ser Gly Gly Glu Thr Gly Leu

515 520

<210> 11

<211> 13

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 5 'flanking sequence

<400> 11

ggcgcgccgc acc 13

<210> 12

<211> 1638

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> codon optimized for feline

<400> 12

auggcugacg acggaucugu gaccacccca gaacaaggaa caauggucgg aggagugauu 60

gccgaaccca gcgcucagau gucaacugcg gcggacaugg ccuccggaaa gucgguggac 120

uccgaguggg aagccuucuu cucguuccac acguccguga acuggagcac cuccgaaacc 180

caaggaaaga uccucuucaa gcagucccug gguccccugc ugaacccgua ccuggagcac 240

aucagcaagc uguacgucgc uuggagcggg ucgaucgaag ugcgauuuuc caucucggga 300

agcggcgugu ucggugguaa acuggccgcc aucgucgugc cgccuggugu cgacccuguc 360

cagucaaccu ccaugcugca guacccgcac guccuguucg acgcaagaca aguggagcca 420

gugaucuucu ccaucccgga ccuccgcaac agccuguauc acuugauguc cgauaccgau 480

accacuuccc ucgugaucau gguguacaac gaucugauca acccguacgc caaugacucc 540

aacagcucgg guugcaucgu gaccgucgaa acgaagccug gcaucgauuu caaguuucau 600

cugcugaaac cgcccggauc caugcuuacu cacgggucca ucccuuccga ucugaucccc 660

aagagcuccu cccuguggau ugggaaccgc cacuggaccg auauuaccga uuucgugauu 720

cggccuuucg uguuccaagc caaccggcac uucgacuuca accaggagac ugccggcugg 780

ucaacuccac gguuccgccc auuggccgug acugugucgc agucaaaggg agccaagcuc 840

gggaacggca ucgccaccga cuacauugug ccuggaaucc ccgacggaug gccugauacu 900

accaucccca ccaagcugac cccuaccgga gauuacgcca ucaccuccuc cgacggcaau 960

gauauugaaa ccaagcugga auacgagaac gcggacguga uuaagaacaa caccaacuuc 1020

cgcuccaugu auaucugcgg aagccuccag agggcuuggg gcgacaagaa gaucagcaac 1080

accggguuca ucacuaccgg agugauuucu gacaacucca ucagcccuuc gaacacaauu 1140

gaccagucca agaucguggu guaccaggac aaccauguca auucggaggu ccagacuagc 1200

gacaucacuc uugccauccu gggcuacacc ggaauuggag aagaggccau aggcgccaac 1260

cgggacuccg ucgugagaau uuccgugcuu ccggaaacug gagcaagggg cggaaaucac 1320

cccaucuucu acaaaaauuc caugaagcug ggcuacguga ucuccuccau ugacguguuc 1380

aacucccaaa uccuccacac cucgcgccag cugucacuga acaacuacuu guugcccccu 1440

gacuccuucg cgguguaccg gauuauugac agcaacggau caugguucga cauugggauu 1500

gacagcgaug gguuuucauu cgugggcgug ucgucauuuc caaagcugga guuuccgcug 1560

uccgccucau acaugggcau ccagcucgca aagauccggc uggcguccaa cauccgguca 1620

uccaugacua agcuguga 1638

<210> 13

<211> 1629

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> codon optimized for feline

<400> 13

augacugccc cggaacaagg aacgaugguc ggaggaguga uugcagaacc gucagcacag 60

auguccaccg cugccgacau ggccacugga aagagcgugg acuccgaaug ggaagccuuc 120

uucuccuucc acacuucggu caacuggucg acuagcgaaa cccaggggaa gauuuuguuc 180

aagcaauccc ucggcccucu gcugaacccc uaccuggagc aucuggccaa gcuguacgug 240

gcauggucgg gcagcaucga agugcgcuuu agcauuuccg gcuccggagu guucggggga 300

aagcuugcug ccauugucgu gccgccagga guggacccgg ugcaguccac uucuaugcuc 360

caauacccgc auguccuguu cgacgccaga cagguggagc cugugaucuu uugccugccg 420

gaucucaggu ccacccugua ucaccucaug uccgacaccg acaccaccuc gcucgugauc 480

augguguaca acgaccugau caaccccuac gcuaacgacg ccaacagcuc agguugcauu 540

gugacugucg aaaccaagcc aggcccugac uucaaguuuc auuugcugaa gccgcccggu 600

uccaugcuga cccacggcuc gaucccaucc gaccugaucc ccaagacgag cucccugugg 660

aucggaaacc gcuacugguc cgauauuacc gacuucguga ucagaccauu cguguuccaa 720

gccaaccgcc auuucgacuu caaccaggaa accgcaggau ggucgacccc ucgauuccgc 780

ccgauuucag ugaccaucac cgaacagaac ggcgcgaagc ugggaauugg cguggcgacc 840

gacuacaucg ugccgggaau cccggaugga uggccugaua cgaccauucc cggggagcug 900

aucccugccg gggacuacgc caucaccaac gguacuggaa acgacaucac cacugccacc 960

gguuacgaca ccgccgacau cauaaagaac aacaccaacu ucagaggaau guacauuugc 1020

ggcucccugc aacgcgcuug gggugacaaa aagaucucga acacugccuu caucacaaca 1080

gcgacucugg acggcgauaa caacaacaag aucaauccuu guaauaccau cgaccagucc 1140

aaaaucgugg uguuccagga uaaccacgug ggaaagaagg cgcagaccuc cgacgacacu 1200

cuggcgcugc uuggcuacac cgggaucggc gagcaggcca uuggaagcga ucgggaucgg 1260

gucgugcgga ucuccacccu ccccgagacu ggagcaaggg gaggcaacca ccccaucuuu 1320

uacaaaaaca gcauuaagcu cggauacguc auccgcucca ucgauguguu caacucucaa 1380

auccugcaca cuucgcggca gcugucccug aaccacuacc ucuugccgcc cgacuccuuc 1440

gccgucuacc ggaucauuga uucgaacggg agcugguucg acaucggcau ugauagcgau 1500

ggcuucucgu uugugggcgu gucgggcuuc gggaagcugg aguucccacu gagcgccuca 1560

uacaugggua uccagcuggc caagaucagg cuggccucca acauccgcuc accuaugacu 1620

aagcuguga 1629

<210> 14

<211> 1929

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> codon optimized for feline

<400> 14

auggagucac caacacaccc uaaaccuucu aaagacaaaa cccucucgug gaaucucgcc 60

uuccuugugg gcauccuguu cacaaucgac aucggcaugg ccaacccuuc gccgcaucag 120

aucuacaaug ugacaugggu cauuacuaau gugcagacaa acacccaggc aaaugcuacu 180

ucuaugcuug guacucugac ugaugcuuau ccaacccugc acgucgaccu uugcgaucuc 240

gucggugaca caugggagcc caucgugcug aauccaacua augucaaaca uggugccagg 300

uauucuucua gcaaauacgg guguaagacc acugaucgga agaaacagca acaaaccuac 360

ccauucuacg ugugcccggg ucacgcaccg ucccuggguc cgaagggaac acauuguggg 420

ggagcccaag acgguuuuug cgcugcuugg gguugugaaa caaccggaga agccuggugg 480

aagccuaccu caucuuggga cuacauuacu gugaaaagag gcucuagcca ggauaacagc 540

ugcgaaggaa aguguaaucc ccuggugcuu caauucaccc agaaaggccg gcaggcauca 600

ugggauggac cgaaaaugug gggacuuaga cucuaucgca ccggauacga ccccaucgcu 660

cuguuuacug ugucacgcca agucuccacc auuacuccgc cacaggccau ggggccgaau 720

cugguccucc ccgaucagaa gccacccuca cggcaaaguc aaaccggcuc aaaaguggcc 780

acccaacggc cccagacaaa ugaguccgca ccuaggucag uggcaccuac aacaaugggu 840

ccaaagcgga ucggaaccgg agacaggcuc auuaaccucg ugcaagggac uuaucuggcc 900

cuuaacgcua cugaccccaa caagaccaag gauugcuggc ucugccuugu gagcagaccu 960

ccuuacuaug aggggaucgc cauucucgga aacuacucaa aucagaccaa ccccccuccg 1020

ucgugucuga gcacccccca gcacaagcuu acuauuucag aagucagugg acagggaaug 1080

ugcaucggaa ccgugccaaa gacucaucaa gcccuuugca acaaaacuca acaagggcac 1140

acuggagcuc auuaucucgc cgcaccuaac gggaccuacu gggcuugcaa uacuggauug 1200

accccgugua ucucuauggc cgugcugaau uggacuuccg acuucugcgu gcuuauugag 1260

cuuuggccua gagugacaua ccaucagccu gaguacgucu auacccauuu cgccaaggca 1320

gucagauucc ggcgggagcc uaucucccug acuguggccu ugaugcucgg uggacugaca 1380

gugggaggaa uugcagcugg agucggaacu ggaaccaagg cccugcucga aacugcucag 1440

uuccggcagc ugcagauggc caugcacacu gacauccagg cucuggagga aucaauuuca 1500

gcccuugaga aaagcuugac cucgcugucu gaaguggucc uccaaaacag gcgcgguuug 1560

gacauccugu uccuucaaga ggguggucug ugcgccgcuc ucaaggagga augcuguuuc 1620

uacgcugacc auaccgggcu ggugcgcgau aacauggcaa agcugcggga acgcuugaaa 1680

cagaggcagc aacuguucga cucucagcag ggaugguucg agggcugguu uaacaagagc 1740

ccaugguuua ccacucugau cucuucaauc auggguccac ugcucauccu gcuucugauu 1800

cuucucuucg gaccguguau ucucaacagg cuggugcagu uugucaagga cagaaucucg 1860

gugguccagg cccugauucu uacucagcag uaucagcaga uuaagcagua cgaccccgau 1920

cggccuuga 1929

<210> 15

<211> 1233

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> codon optimized for feline

<400> 15

aauccuaguc cacaccaaau auauaaugua acuuggguaa uaaccaaugu acaaacuaac 60

acccaagcua acgccaccuc uauguuagga accuuaaccg augccuaccc uacccuacau 120

guugacuuau gugaccuagu gggagacacc ugggaaccua uaguccuaaa cccaaccaau 180

guaaaacacg gggcacguua cuccuccuca aaauauggau guaaaacuac agauagaaaa 240

aaacagcaac agacauaccc cuuuuacguc ugccccggac augcccccuc guuggggcca 300

aagggaacac auuguggagg ggcacaagau ggguuuugug ccgcaugggg augugagacc 360

accggagaag cuugguggaa gcccaccucc ucaugggacu auaucacagu aaaaagaggg 420

aguagucagg acaauagcug ugagggaaaa ugcaaccccc ugguuuugca guucacccag 480

aagggaagac aagccucuug ggacggaccu aagauguggg gauugcgacu auaccguaca 540

ggauaugacc cuaucgcuuu auucacggug ucccggcagg uaucaaccau uacgccgccu 600

caggcaaugg gaccaaaccu agucuuaccu gaucaaaaac ccccaucccg acaaucucaa 660

acagggucca aaguggcgac ccagaggccc caaacgaaug aaagcgcccc aaggucuguu 720

gcccccacca ccaugggucc caaacggauu gggaccggag auagguuaau aaauuuagua 780

caagggacau accuagccuu aaaugccacc gaccccaaca aaacuaaaga cuguuggcuc 840

ugccugguuu cucgaccacc cuauuacgaa gggauugcaa ucuuagguaa cuacagcaac 900

caaacaaacc cccccccauc cugccuaucu acuccgcaac acaaacuaac uauaucugaa 960

guaucagggc aaggaaugug cauagggacu guuccuaaaa cccaccaggc uuugugcaau 1020

aagacacaac agggacauac aggggcgcac uaucuagccg cccccaacgg caccuauugg 1080

gccuguaaca cuggacucac cccaugcauu uccauggcgg ugcucaauug gaccucugau 1140

uuuugugucu uaaucgaauu auggcccaga gugacuuacc aucaacccga auauguguac 1200

acacauuuug ccaaagcugu cagguuccga aga 1233

<210> 16

<211> 1575

<212> RNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> codon optimized for human

<400> 16

auggugccgc aggcucuccu guuugucccc cuucuggucu uuccauugug uuuugggaaa 60

uucccuaucu acacaauucc ggacaaguug ggacccugga gcccaauuga cauucaucau 120

cucagcugcc cgaacaauuu ggucguggag gacgaaggau gcaccaaccu gucgggguuc 180

uccuacaugg aauugaaagu cggauacauc agugccauua agaugaacgg guucacuugc 240

acaggcgucg ugacugaagc ugagacauac acuaacuucg ugggauaugu cacuaccacu 300

uucaaaagaa agcauuuccg cccuacuccu gaugcuugua gggccgcaua caacuggaag 360

auggccggug accccagaua ugaggaauca cuucacaauc cguacccuga cuaccacugg 420

cuucggacug ucaaaaccac caaggaguca cucgugauca uuaguccaag uguggcugau 480

cuugacccau acgaccgguc acuucacuca cggguguucc cgggggggaa uugcucuggu 540

gucgcagugu cgucaaccua cugcuccaca aaccacgauu acaccauuug gaugccagaa 600

aauccucggc uugguauguc augugacauu uucaccaauu cucgggggaa gagggcuucc 660

aaagggucug aaacuugcgg cuuugucgau gagcggggcu uguauaaguc acuuaaaggu 720

gcuugcaaac ucaagcuuug uggugucuug ggauugagau ugauggaugg aacuuggguc 780

gcaaugcaga cuucuaacga aaccaaaugg ugcccucccg gacagcuugu gaauuugcau 840

gacuuucgcu cugacgaaau ugagcaucuu gucgucgagg aguuggucaa gaagcgggaa 900

gagugucugg augcuuugga aucaaucaug accaccaagu cagugucuuu cagacggcuc 960

ucacaucuua ggaaauuggu gccagguuuu ggaaaagcau auaccauuuu caacaagacc 1020

cuuauggaag ccgaugcuca cuacaagucu gucaggacuu ggaaugagau caucccgucu 1080

aaaggguguc uuagggucgg agggagaugu cauccucaug ucaacggagu cuuuuucaau 1140

gguaucauuc uuggaccuga cggaaauguc cuuaucccug agaugcaauc uucccuccuc 1200

cagcaacaca uggaacuucu ugucucaucg gucauccccc uuaugcaccc ccuggcugac 1260

ccaucaaccg uguucaagaa cggugacgag gcagaggauu uugucgaggu ccaccuuccc 1320

gaugugcaug aacggaucuc uggugucgac cuuggacucc cuaacugggg aaaguauguc 1380

cuucugucgg caggagcccu gacugccuug auguugauua ucuuccugau gacuuguugg 1440

aggagaguca aucggucgga gccaacacaa cauaaucuca gaggaacagg aagggaggug 1500

ucagucacac cccaaagcgg gaagaucauu ucgucuuggg agucauacaa gagcggaggu 1560

gaaaccggac uguga 1575

<---

Настоящее изобретение относится к биотехнологии, вирусологии и ветеринарии. Предложена иммуногенная композиция, содержащая РНК-репликонную частицу альфавируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE), которая кодирует капсидный белок кошачьего кальцивируса (FCV) и модифицированный живой патоген животного семейства кошачьих, выбранный из группы, состоящей из модифицированного живого вируса кошачьего вирусного ринотрахеита (FVR), модифицированного живого вируса кошачьей панлейкопении (FPLV), модифицированных живых Chlamydophila felis и любой их комбинации. Предложена вакцина для способствования предупреждению заболевания вследствие FCV, содержащая указанную иммуногенную композицию, и способ иммунизации животного семейства кошачьих против патогенного FCV. Изобретение позволяет получить поливалентные вакцины для животных семейства кошачьих. 3 н. и 11 з.п. ф-лы, 3 табл., 2 пр.

1. Иммуногенная композиция для способствования предупреждению заболевания вследствие FCV, содержащая РНК-репликонную частицу альфавируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE), которая кодирует капсидный белок кошачьего кальцивируса (FCV) и модифицированный живой патоген животного семейства кошачьих, выбранный из группы, состоящей из модифицированного живого вируса кошачьего вирусного ринотрахеита (FVR), модифицированного живого вируса кошачьей панлейкопении (FPLV), модифицированных живых Chlamydophila felis и любой их комбинации.

2. Иммуногенная композиция по п.1, где капсидный белок FCV выбран из группы, состоящей из капсидного белка F9-подобного FCV, и капсидного белка вирулентного системного FCV (VS-FCV).

3. Иммуногенная композиция по п.2, где капсидный белок FCV представляет собой капсидный белок VS-FCV.

4. Иммуногенная композиция по п.3, где РНК-репликонная частица альфавируса VEE также кодирует антиген, выбранный из группы, состоящей из капсидного белка F9-подобного FCV.

5. Иммуногенная композиция по п.3, которая дополнительно содержит дополнительную РНК-репликонную частицу альфавируса VEE, которая кодирует капсидный белок F9-подобного FCV.

6. Иммуногенная композиция по п.2, где капсидный белок представляет собой F9-подобный капсидный белок FCV.

7. Иммуногенная композиция по пп.1-5 или 6, которая содержит одну или более дополнительных РНК-репликонных частиц альфавируса VEE, которые кодируют антиген, выбранный из группы, состоящей из гликопротеина FeLV (gp85), антигенного фрагмента gp85 и их комбинации.

8. Иммуногенная композиция по пп.1-5 или 6, где РНК-репликонная частица альфавируса VEE, или дополнительная РНК-репликонная частица альфавируса VEE дополнительно кодирует антиген, выбранный из группы, состоящей из гликопротеина (gp85) вируса кошачьего лейкоза (FeLV), антигенного фрагмента gp85 и их комбинации.

9. Иммуногенная композиция по пп.2-5, 7 или 8, где капсидный белок VS-FCV содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 2.

10. Иммуногенная композиция по пп.2, 4-8 или 9, где капсидный белок F9-подобного FCV содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 4.

11. Иммуногенная композиция по пп.7-9 или 10, где гликопротеин (gp85) FeLV содержит аминокислотную последовательность, обладающую по меньшей мере 95% идентичностью с аминокислотной последовательностью SEQ ID NO: 6.

12. Вакцина для способствования предупреждению заболевания вследствие FCV, содержащая иммуногенную композицию по пп.1-10 или 11, и фармацевтически приемлемый носитель.

13. Вакцинная композиция по п.12, которая представляет собой безадъювантную вакцину.

14. Способ иммунизации животного семейства кошачьих против патогенного FCV, включающий введение животному семейства кошачьих иммунологически эффективного количества вакцины по п.12 или 13.