ССЫЛКА НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет на основании предварительных заявок на патент США №: 62/520204, поданной 15 июня 2017 г.; 62/540973, поданной 3 августа 2017 г., 62/556291, поданной 8 сентября 2017 г.; 62/563544, поданной 26 сентября 2017 г.; 62/582859, поданной 7 ноября 2017 г.; 62/622748, поданной 26 января 2018 г.; 62/622755, поданной 26 января 2018 г.; 62/669262, поданной 9 мая 2018 г.; 62/677336, поданной 29 мая 2018 г.; и 62/680454, поданной 4 июня 2018 г.; каждая из которых полностью включена в данную заявку посредством ссылки с любой целью.
ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ
[0002] Настоящее описание в целом относится к областям фармацевтических и вакцинных составов.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0003] Иммунизация нуклеиновыми кислотами является перспективной стратегией для быстрой разработки вакцин против существующих или вновь возникающих угроз инфекционных заболеваний. Потенциально возможные вакцины на основе нуклеиновых кислот легко получают с помощью обычных способов синтеза, и их можно сконструировать в течение недель с момента возникновения нового инфекционного заболевания. Кроме того, поскольку биофизические свойства вакцины на основе нуклеиновых кислот не зависят от экспрессируемого антигена, для производства новой вакцины требуется минимальная антиген-специфическая технологическая разработка. Вакцины на основе плазмидной ДНК на сегодняшний день разрабатываются для избранных инфекционных заболеваний; тем не менее, до сих пор нет вакцин на основе ДНК, одобренных для применения у людей, вследствие связанных с ними осложнений (McKay, Cope и др. 2014, Tregoning и Kinnear 2014).
[0004] Доставка антигенов с применением платформ на основе РНК была предложена как перспективная альтернатива по сравнению с платформами на основе ДНК. Неустойчивая природа РНК подходит для доставки антигена; риск длительной персистенции (сохранения) вакцины ниже по сравнению с ДНК, и транслокация в ядро доставленной вакцины необязательна для продукции белка. Тем не менее, относительная нестабильность РНК и ограниченная экспрессия с одного транскрипта мРНК сделали крупномасштабное распространение и применение таких вакцин затруднительными в данной области и для коммерческой разработки. В результате многочисленных изысканий способов улучшения стабильности РНК посредством модификации структуры РНК предложили несколько решений данной проблемы (Tavernier, Andries и др. 2011, Youn и Chung 2015). В частности, самоамплифицирующиеся вакцины на основе РНК продемонстрировали потенциальный механизм улучшения масштаба и продолжительности экспрессии антигена (обзор приведен в Vander Veen, Harris и др. 2012, Ljungberg и Liljestrom 2015).
[0005] Для того чтобы обеспечить сильный иммунный ответ, обычно используют такие составы как липосомы и эмульсии типа масло в воде, чтобы улучшить доставку РНК в клетки (Geall, Verma и др. 2012, Ulmer, Mason и др. 2012, Brito, Chan и др. 2014, Bogers, Oostermeijer и др. 2015, Brito, Kommareddy и др. 2015, Geall и Ulmer 2015). Кроме того, данные составы также можно применять для улучшения доставки лекарственных средств или других терапевтических агентов в клетки. Тем не менее, липосомы или эмульсии типа масло в воде, такие как эмульсии на основе катионных липидов (катионные наноэмульсии, КНЭ, CNE), могут быть структурно нестабильны в физиологическом окружении, что повышает вероятность токсичности от резкого воздействия отдельных компонентов. Токсический потенциал таких носителей также может осложнять или усугублять проблемы токсичности, обычно связанные с катионными фосфолипидами, необходимыми для адсорбции РНК (Bertholet и др. 2010). Кроме того, существует ограниченное понимание того, как физико-химический состав эмульсий типа масло в воде (например, размер, поверхностный заряд, химическая природа вспомогательных веществ и их относительные соотношения) влияет на связывание, доставку РНК и, в конечном счете, на экспрессию антигена.
[0006] Таким образом, существует потребность в платформе для составов, которая как физически, так и химически подходит для того, чтобы служить в качестве универсальной, стабильной и безопасной системы для доставки биоактивных агентов, включая нуклеиновые кислоты, к клеткам.
[0007] Все ссылочные материалы, цитированные в данной заявке, включая заявки на патент и публикации патентов, полностью включены в данную заявку посредством ссылки, как если бы каждый отдельный противопоставленный материал был конкретно и отдельно указан как включенный посредством ссылки.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0008] Авторы настоящего изобретения разработали составы, которые неожиданно эффективно доставляют биоактивный агент в клетку. Соответственно, в данной заявке предложены, среди прочего, такие составы (которые также называют в данной заявке композициями) и способ их применения. Указанные составы представляют собой составы на основе наноструктурированного липидного носителя (НЛН). Квалифицированному практикующему специалисту будет понятно, что НЛН состоит из частиц НЛН. НЛН описаны в Beloqui и др., Nanomedicine. NBM 2016; 12:143-161. Типичные частицы НЛН согласно настоящему изобретению содержат: (a) масляную сердцевину, содержащую жидкофазный липид и твердофазный липид, (b) катионный липид, (c) гидрофобное поверхностно-активное вещество (предпочтительно сложный эфир сорбитана, например, сложный моноэфир, сложный диэфир или сложный триэфир сорбитана), и (d) гидрофильное поверхностно-активное вещество. Типичные композиции стабильны и способны доставлять биоактивные агенты в клетки. Доставку биоактивного агента могут осуществлять, например, для выработки иммунного ответа и/или для лечения заболевания и нарушений здоровья у субъекта.
[0009] Эти и другие аспекты настоящего изобретения станут очевидными после ознакомления со следующим подробным описанием и сопроводительными фигурами. Кроме того, в данной заявке представлены различные ссылочные материалы, в которых более подробно описаны некоторые аспекты настоящего изобретения, и, следовательно, они полностью включены в данную заявку посредством ссылки.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0010] На ФИГ. 1A - E представлено сравнение стабильности между составами КНЭ и НЛН. Сравнение размера частиц с помощью динамического рассеяния света (ДРС) (Malvern Zetasizer Z/ZS) между КНЭ (QG386) и QG752 (состав НЛН), которые хранили при 5°C (ФИГ. 1A), 25°C (ФИГ. 1B), 37°C (ФИГ. 1C) 60°C (ФИГ. 1D) и 80°C. Стрелки присутствуют только для того, чтобы помочь различить линии.
[0011] На ФИГ. 2A - B представлен z-средний диаметр частиц НЛН как функция отношения масло/поверхностно-активное вещество или поверхностно-активное вещество/масло, которое измеряли, применяя динамическое рассеяние света (ДРС).
[0012] На ФИГ. 3A - E представлен анализ методом оптической денситометрии результатов анализа замедления подвижности в геле (GRA) для определения количества РНК, связанных с частицами НЛН, как функции отношения азот/фосфат (N/P) (ФИГ. 3A). На ФИГ. 3B - E представлено наложение экспрессии in vitro секретируемой щелочной фосфатазы (SEAP, относительные единицы люминесценции, ОЕЛ) и кривых связывания РНК-НЛН как функции значений N:P для QG942, QG963, QG807 и QG843 (QG843 также называют в данной заявке КНЭ).
[0013] На ФИГ. 4A - C представлено сравнение размера частиц, измеренного с применением ДРС (Z-средний, нм), комплексов состав-РНК при различных отношениях азота к фосфату (рассчитанных) (ФИГ. 4A), отношениях РНК к частице (теоретических) (ФИГ. 4B) или отношениях масс ДОТАП (DOTAP) к РНК (рассчитанных) (ФИГ. 4C).
[0014] На ФИГ. 5 представлены титры нейтрализующих антител из мышей (n = 5/группу) через 14 дней после однократного внутримышечного (в/м) введения экспрессирующей антиген Zika рвРНК в комплексе с различными количествами состава QG768. Титры нейтрализующих антител определяли по реакции задержки (нейтрализации) бляшкообразования на 80% (РЗБО80). Значимость определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа.
[0015] ФИГ. 6: представлены титры нейтрализующих антител из мышей (N = 5/группу) после внутримышечного (в/м) введения РНК либо в комплексе с составом (0,1 мкг РНК, смешанной 1:1 (в объемном отношении) с составом), либо голой (0,1 мкг или 10 мкг РНК, смешанной 1:1 с солевым раствором). Титры нейтрализующих антител определяли по реакции задержки (нейтрализации) бляшкообразования на 80% (РЗБО80). Значимость определяли с помощью однофакторного дисперсионного анализа.
[0016] На ФИГ. 7A - E представлены уровни высвобождения хемокина из клеток цельной крови человека в присутствии указанных составов. Уровни экспрессии хемокина определяли с помощью анализа Luminex, применяя мультиплексный анализ цитокинов на микросферах.
[0017] На ФИГ. 8A - B представлена возможность выбора составов для доставки рвРНК in vitro. Клетки 293T или BHK трансфицировали либо 10 нг (ФИГ. 8A), либо 100 нг (ФИГ. 8B) рвРНК, кодирующей SEAP, применяя указанные составы, а также липофектамин в качестве положительного контроля и 10% раствор сахарозы в качестве отрицательного контроля. После трансфекции собирали супернатанты и измеряли активность SEAP, применяя анализ люминесценции.
[0018] На ФИГ. 9 представлена кинетика экспрессии белка in vivo для выбранных составов. Мышам C57BL/6 вводили путем в/м инъекции 1 мкг рвРНК, кодирующей SEAP и находящейся в составе с любым из агентов: 10% сахарозой, КНЭ, QG807 или QG808. Мышей, которым вводили путем инъекции солевой раствор, использовали в качестве контроля ложной инъекцией. Сыворотку собирали через 3, 7, 14, 21 и 28 дней после инъекции и активность SEAP измеряли, применяя анализ люминесценции.
[0019] На ФИГ. 10 представлена оптимизация загрузки РНК для состава QG807. рвРНК, кодирующую SEAP, разбавляли до различных концентраций, указанных на оси x, в 10% сахарозе и получали ее комплекс с QG807 при отношении 1:1. РНК, находящуюся в составе, затем разбавляли, чтобы получить дозу 1 мкг или 0,1 мкг в объеме 50 мкл. Мышам C57BL/6 затем вводили путем в/м инъекции каждую дозу и собирали сыворотку через 3 и 8 дней после инъекции. Затем измеряли активность SEAP с помощью анализа люминесценции.
[0020] ФИГ. 11A - C. На ФИГ. 11A и 11B ложная = 10% сахарозы, голая = 100 нг рвРНК SEAP, не находящейся в составе, КНЭ = рвРНК SEAP в комплексе с КНЭ (содержащим поверхностно-активное вещество спан 85), QG768 = НЛН, содержащий спан 60, QG906 = НЛН, содержащий спан 80, QG808 = НЛН, содержащий спан 85, SQ807 = НЛН, содержащий спан 60. На ФИГ. 11A представлено сравнение четырех составов НЛН, которые отличаются по композициям эмульгаторов, с КНЭ или разбавителем в отношении их способности повышать экспрессию белка после образования комплексa с РНК, кодирующей секретируемую щелочную фосфатазу (SEAP). Через три дня после однократной внутримышечной (в/м) инъекции 100 нг (n = 3 на группу) из мышей собирали сыворотки и анализировали активность SEAP. Каждую экспериментальную точку наносили на график, а также их среднее значение ± стандартное отклонение (С.О.) На ФИГ. 11B представлены те же составы, которые применяют на ФИГ. 11A, в комплексе с РНК, кодирующей prM и E ZIKV, и нейтрализующие антитела анализировали через 14 дней после однократной в/м инъекции 100 нг (n = 5 на группу). Результаты анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с критерием множественных сравнений Тьюки (*p < 0,05; НЛН спан 60 по сравнению с КНЭ или НЛН спан 85, ** p < 0,008; НЛН спан 60 по сравнению с НЛН спан 80, *** p=0,0007, КНЭ по сравнению с НЛН спан 80 или 85, не значимый). На ФИГ. 11C представлены КНЭ или НЛН, состоящие из 2 различных гидрофобных поверхностно-активных веществ спан 85 и спан 60 в комплексе с РНК, кодирующей prM и E ZIKV, и нейтрализующие антитела анализировали через 14 дней после однократной в/м инъекции 100 нг. Результаты анализировали с помощью множественного двухфакторного дисперсионного анализа с критерием множественных сравнений Тьюки. ** p < 0,0001.
ФИГ. 12A - H. Мышей C57BL/6 (n = 9/группу) иммунизировали с помощью однократной в/м инъекции 1 мкг РНК, находящейся в составе с КНЭ или НЛН, и сравнивали с 10 или 1 мкг РНК, не находящейся в составе (ФИГ. 12A). Нейтрализующие антитела оценивали через 14 дней после иммунизации, а затем через 28 дней 3 мышей на группу стимулировали второй дозой каждой вакцины (ФИГ. 12B - F). Через 46 дней после повторной стимуляции собирали селезенки и стимулировали пептидами CD8, соответствующими эпитопам в prM и E ZIKV. ФИГ. 14G - H: мышей (n = 6/группу), иммунизированных однократным в/м введением, сенсибилизировали в день 30, после блокирования рецепторов интерферона альфа введением моноклонального антитела, летальной дозой ZIKV. Анализировали наличие вируса в сыворотках (ФИГ. 12G) с помощью анализа образования бляшек на 4 день после сенсибилизации, при этом отслеживали выживаемость (ФИГ. 12H). НЛН4 представляет собой QG807.
[0021] ФИГ. 13A - B. Мышам C57BL/6 (n = 3/группу) вводили путем в/м инъекции 1 мкг РНК SEAP, не находящейся в составе или включенной в состав с QG807, QG924, QG925, QG941 или QG942 путем образования комплекса с РНК при концентрации 400 мкг/мл, и экспрессию SEAP сравнивали с таковой для QG807 в комплексе при оптимальной для него концентрации РНК - 40 мкг/мл (ФИГ. 13A). Клетки BHK инкубировали при разведении 1:20 каждого состава с высокой нагрузкой РНК в течение 4 часов, а затем окрашивали йодидом пропидия и аннексином, чтобы детектировать клетки, которые были мертвы или претерпевали апоптоз. Затем применяли проточную цитометрию, чтобы определить долю клеток, которые не были мертвы и не претерпевали апоптоз (ФИГ. 13B).
[0022] На ФИГ. 14 представлены результаты экспрессии SEAP in vivo, сравнивающие QG807 в комплексе либо с 400 мкг/мл, либо с 40 мкг РНК/мл.
[0023] На ФИГ. 15A - D представлены уровни высвобождения хемокина из клеток цельной крови человека в присутствии указанных составов. Уровни экспрессии хемокинов определяли с помощью анализа Luminex, применяя мультиплексный анализ цитокинов на микросферах.
[0024] ФИГ. 16A - D. На ФИГ. 16A представлен пример частицы НЛН. На ФИГ. 16B представлено взвешенное по интенсивности распределение по размерам НЛНv1 и КНЭ (QG386). На ФИГ. 16C представлено изменение размера частиц (z-среднего диаметра) на протяжении девяти месяцев для оценки коллоидной стабильности составов, которые хранили при 25°C. Сравнение размера частиц (z-среднего диаметра, Malvern Zetasizer Z/ZS), определенного с помощью динамического рассеяния света (ДРС), между КНЭ (QG386) и QG752 - составом НЛНv1. На ФИГ. 16D представлена защита от РНКаз с помощью частиц НЛН, где относительно низкая фракция твина 80 в фазе поверхностно-активного вещества (35% от общей массы поверхностно-активных веществ и катионных липидов) защищала рвРНК от деградации.
[0025] На ФИГ. 17 представлен пример процесса производства НЛН.
[0026] На ФИГ. 18A - B представлена продолжительность ответов нейтрализующих антител после двух независимых экспериментов либо с одной, либо с двумя дозами рвРНК ZIKV в составе с НЛН. Мышей C57BL/6 (n = 5/группу) однократно иммунизировали в день 0 (ФИГ. 18A) или в день 0 и 28 (ФИГ. 18B) в/м путем 1 или 0,1 мкг рвРНК ZIKV в составе с НЛНv1, и титры нейтрализующих антител в различные моменты времени сравнивали с таковыми у мышей, иммунизированных 10 или 1 мкг не находящейся в составе (голой) рвРНК ZIKV. Результаты наносили на график в виде среднего значения ± С.О. для каждого биологического повтора. Преобразование в log10 результатов на ФИГ. 18A - B анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с критерием множественных сравнений Тьюки, сравнивающим среднее значение РЗБО80 в каждый момент времени внутри каждой группы с соответствующим максимальным титром в день 14. На ФИГ. 18A 1 мкг НЛНv1, либо 10 мкг голой РНК в дни 88 и 156 сравнивали с титрами в день 14, ***p < 0,0001, **p < 0,001; на ФИГ. 18B 1 мкг НЛНv1 в дни 126 и 209 сравнивали с титрами в день 14, *p=0,05, ***p=0,0001, соответственно.
[0027] ФИГ. 19A - B. Мышей иммунизировали в/м инъекцией РНК в составе с НЛН и сравнивали с 10 или 1 мкг РНК, не находящейся в составе и находящейся в составе с КНЭ, для определения уровней CD+ T-клеток в день 14 (ФИГ. 19A) и день 49 (ФИГ. 19B).
[0028] ФИГ. 20A - E. Мышей иммунизировали в/м инъекцией РНК в составе с НЛН в указанных дозах. НЛНv2 (QG942) объединяли в комплекс с рвРНК, кодирующей prM/E ZIKV, при N:P, равном 15, дозы 100, 30, 10 и 3 нг вводили мышам C57BL/6 путем однократной в/м инъекции (n = 14/группу) и спустя 14 дней брали кровь, чтобы оценить титры нейтрализующих антител с помощью РЗБО80 (ФИГ. 20A), или умерщвляли (n = 4/группу), чтобы подсчитать процент антигенспецифических B220loCD8+IFNγ+ T-клеток среди всех спленоцитов (ФИГ. 20B) по сравнению с таковым для вакцинированных ложной вакциной мышей (среда), или 100 или 10 нг голой рвРНК (сахароза) (n = 14/группу), или 100 нг в составе с НЛНv1 (n = 14) или КНЭ (n = 4) при N:P, равном 15 (ФИГ. 20A - B). Результаты представлены в виде отдельных значений, а также в виде среднего значения ± С.О.
[0029] Через тридцать дней после иммунизации оставшихся 10 мышей на группу сенсибилизировали 5 log10 бляшкообразующими единицами (БОЕ) штамма 41525 ZIKV Dakar после блокирования антителом интерферона I типа, как описано в Smith и др., PLoS Negl Trop Dis. 11(1):e0005296 (2017), и брали кровь спустя 4 дня, чтобы определить виремию с помощью анализа образования бляшек (ФИГ. 20C). Результаты представлены в виде отдельных значений, а также в виде среднего значения ± С.О. Ежедневно контролировали выживаемость (ФИГ. 20D) и потерю массы тела мышей (ФИГ. 20E). Результаты на ФИГ. 25 представлены в виде среднего значения ± С.О. Преобразование в log10 результатов на ФИГ. 20A и 20C анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с критерием множественных сравнений Тьюки (титры РЗБО80 на ФИГ. 25 между контрольными группами - ложный, не находящиеся в составе дозы 100 и 10 нг и находящиеся в составе с НЛНv2 дозы 100, 30 и 10 нг, ****p < 0,0001, или находящаяся в составе с КНЭ доза 100 нг, *p = 0,04; между находящимися в составе с НЛНv2 дозами 100 и 30 нг и входящей в состав с КНЭ дозой 100 нг, **p = 0,006; титры виремии на ФИГ. 20C между контрольными группами - ложный, не находящиеся в составе дозы 100 и 10 нг и все находящиеся в составе с НЛНv2 или НЛНv1 дозы, ****p < 0,0001). Результаты на ФИГ. 20E анализировали с помощью двухфакторного дисперсионного анализа с критерием множественных сравнений Тьюки (в дни 5 - 10 процент изменения массы тела между контрольными группами - ложный, или 100 и 10 нг голой рвРНК, и все группы составов, *p < 0,05). Результаты на ФИГ. 20A - C представляют собой результаты двух независимых экспериментов.
[0030] На ФИГ. 21A - D представлена разработка и оценка качества рвРНК ZIKV. На ФИГ. 21A изображена плазмидная ДНК, кодирующая репликон венесуэльского энцефалита лошадей, полученный из вакцинного штамма TC-83, под контролем промотора РНК-полимеразы T7. Нетранслируемая область (НТО), субгеномный (СГ), интересующий ген (ИГ). На ФИГ. 21B представлена конструкция реплицирующихся вирусных РНК, кодирующих гены премембранного белка (prM) и белка оболочки (E) штамма H/PF/2013 ZIKV или секретируемую эмбриональную щелочную фосфатазу человека (SEAP). Супернатанты клеток 293T, трансфицированных рвРНК ZIKV или SEAP, анализировали после седиментации (осаждения) в 30% сахарозе с помощью вестерн-блоттинга, представленного на ФИГ. 21C, применяя поликлональные антитела против ZIKV, и/или трансмиссионной (просвечивающей) электронной микроскопии, представленной на ФИГ. 21D.
[0031] На ФИГ. 22A - H представлено картирование физической взаимосвязи между НЛНv2 и рвРНК с биологическими ответами, включающими экспрессию генов, иммуногенность и реактогенность. Для экспериментов in vitro (ФИГ. 22A - D) НЛНv2 объединяли в комплекс с рвРНК SEAP при различных отношениях N:P и измеряли экспрессию генов (ФИГ. 11A) с помощью анализа SEAP, описанного выше, размер частиц (ФИГ. 11B) и дзета-потенциал (ФИГ. 22C) измеряли с помощью динамического рассеяния света и процент связанной РНК (ФИГ. 22D) измеряли с помощью денситометрии после электрофореза в геле. Результаты на ФИГ. 22A - D представлены в виде среднего значения ± С.О. и представляют собой результаты по меньшей мере 3 независимых экспериментов. Для экспериментов in vivo с участием мышей C57BL/6 (ФИГ. 22E - G) НЛНv2 объединяли в комплекс с рвРНК ZIKV или SEAP при отношениях N:P, составляющих 3, 5,6, 15 и 37, и мышам (n = 3/группу для SEAP или n = 5/группу для ZIKV) вводили путем в/м инъекции 1000, 100 или 10 нг рвРНК SEAP или 1000 или 100 нг рвРНК ZIKV. Экспрессию SEAP определяли путем анализа SEAP через 3 дня после инъекции (ФИГ. 22E - G), тогда как титры нейтрализующего ZIKV антитела определяли с помощью РЗБО80 через 14 дней после инъекции (ФИГ. 22F - G). Для того чтобы определить реактогенность (ФИГ. 22H), морским свинкам (n = 4/группу) вводили путем в/к инъекции 50 мкг рвРНК ZIKV в комплексе с НЛНv2 при отношениях N:P, составляющих 3, 5,6, 15 и 37, и диаметр гиперемии измеряли через 24 часа. Результаты для SEAP на ФИГ. 22E - G представлены в виде среднего значения ± С.О. и получены в одном эксперименте, тогда как результаты для РЗБО80 на ФИГ. 22F и G представлены в виде среднего значения ± С.О. и мин/макс диаграммы типа «ящик с усами», и представляют собой типичные результаты 3 независимых экспериментов. Результаты на ФИГ. 22H были получены в одном эксперименте и представлены в виде отдельных биологических повторов со средним значением ± С.О. и мин/макс диаграмм типа «ящик с усами». Преобразование в log10 результатов для РЗБО80 на ФИГ. 22G анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с критерием множественных сравнений Тьюки (титры между отношениями N:P, равными 37 и 15, не значимый; титры между отношениями N:P, равными 15 и 5,6, **p = 0,0033). Результаты на ФИГ. 22H анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с критерием множественных сравнений Тьюки (диаметр гиперемии между отношениями N:P, равными 37 и 15, ***p = 0,0004; между отношениями N:P, равными 15 и 5,6 или 3, не значимый). Упрощенное изображение гипотетической модели физического взаимодействия между НЛН и рвРНК, подкрепленное полученными результатами, представлено на ФИГ. 22D.
[0032] На ФИГ. 23A - E представлены свойства НЛНv2 с повышенной емкостью загрузки РНК. На ФИГ. 23A представлен размер частиц, измеренный с помощью ДРС. Результаты представлены в виде Z-среднего. На ФИГ. 22B представлен РНК-электрофорез в агарозном геле в денатурирующих условиях необработанной рвРНК (дорожка 2) и НЛНv2 рвРНК (дорожка 4) или обработанной РНКазой рвРНК (дорожка 3) и НЛНv2 рвРНК (дорожка 5). Результаты представляют собой типичные результаты 3 независимых экспериментов. На ФИГ. 23C представлен процент РНК, связанной с НЛНv1 или НЛНv2, измеренный с помощью анализа денситометрии после электрофореза в агарозном геле в денатурирующих условиях НЛНv1 или НЛНv2 в комплексе с возрастающими концентрациями рвРНК. Результаты представляют собой типичные результаты 3 независимых экспериментов. На ФИГ. 23D представлена экспрессия SEAP в супернатанте клеток BHK через 24 часа после инкубации с НЛНv1 или НЛНv2 в комплексе при различных отношениях N:P с рвРНК SEAP. Результаты представлены в виде среднего значения ± С.О. для трех биологических повторов и представляют собой типичные результаты 3 независимых экспериментов. Результаты НЛНv1 скопированы с ФИГ. 23E с целью сравнения. Для ФИГ. 23E морских свиной (n = 4/группу) иммунизировали однократной дозой 50 мкг не находящейся в составе рвРНК ZIKV, или 5 или 0,5 мкг рвРНК ZIKV в составе с НЛНv1, или 50, 5 или 0,5 мкг рвРНК ZIKV в составе с НЛНv2 в/м или в/к путями, и титры в сыворотке нейтрализующего антитела, измеренные с помощью РЗБО80, анализировали через 28 дней. Указана каждая экспериментальная точка, а также среднее ± С.О. Преобразование в log10 результатов анализировали с помощью однофакторного дисперсионного анализа с критерием множественных сравнений Тьюки (дозы 5 мкг между составами с НЛНv1 и НЛНv2 в/м путем, *p = 0,05, или в/к путем, *p = 0,04).
[0033] ФИГ. 24A - B. На ФИГ. 24A представлена нейтрализация ZIKV in vitro серийным разведением сыворотки, собранной согласно описанию к ФИГ. 11C выше. Каждое разведение сыворотки наносили на график в виде среднего значения ± С.О. и кривую аппроксимировали, применяя сигмоидальную нелинейную модель регрессии. Результаты анализировали с помощью множественного двухфакторного дисперсионного анализа с критерием множественных сравнений Тьюки (при разведении сыворотки 1/640 НЛН спан 60 по сравнению с КНЭ спан 85 и КНЭ спан 60 по сравнению с КНЭ спан 85, *p < 0,05; НЛН спан 60 по сравнению с КНЭ спан 60, **p < 0,0001). На ФИГ. 24B представлена концентрация Mip-1β, определенная с помощью ELISA в супернатантах мононуклеарных клеток периферической крови человека (n = 6 доноров), собранных через 24 часа после инкубации с 40 нг рвРНК ZIKV, не находящейся в составе (голой) или находящейся в комплексе при N:P, равном 15, c КНЭ, содержащей спан 60 или 85 в эмульсии сквалена, или с частицами НЛН, содержащими спан 60, 80 или 85 и сквален/динасан, или с НЛН, содержащей спан 60 и эмульсию миглиол®/динасан. Исследовали по два технических повтора ELISA на донора и среднее значение по каждому донору наносили на график вместе со средним значением ± С.О. по 6 донорам. Результаты анализировали с помощью множественного однофакторного дисперсионного анализа с критерием множественных сравнений Тьюки (НЛН спан 60-сквален или НЛН спан 85-сквален сравнивали либо с голой (рвРНК), либо с КНЭ-спан 85, ** p < 0,005).
[0034] На ФИГ. 25 представлена кинетика экспрессии белка после доставки in vivo рвРНК в составе с НЛНv1 или КНЭ. рвРНК, кодирующая SEAP, находилась в составе либо с НЛНv1, либо с КНЭ, либо с 10% сахарозой (голая), и 100 нг вводили в/м путем мышам C57BL/6 (n = 3/группу). Мышей, которым вводили ложную инъекцию 10% сахарозы отдельно, использовали в качестве отрицательного контроля. У мышей брали кровь в дни 3, 7, 14, 21 и 28 и активность SEAP в сыворотке измеряли с помощью анализа SEAP.
[0035] На ФИГ. 26 представлена оптимизация емкости загрузки рвРНК на НЛНv1. рвРНК, кодирующую SEAP, разбавляли в 10% сахарозе до конечной концентрации 400, 300, 200, 100 и 40 мкг/мл и объединяли в комплекс 1:1 с НЛНv1 путем осторожного пипетирования. КНЭ объединяли в комплекс 1:1 с 40 мкг/мл рвРНК. Находящуюся в комплексе или не находящуюся в составе рвРНК затем разбавляли в 10% сахарозе для дозирования таким образом, чтобы в каждых 50 мкл в/м инъекции содержалась доза 100 нг. У мышей затем брали кровь через 3 дня и активность SEAP в сыворотке измеряли с помощью анализа SEAP и сравнивали ее с мышами, которым вводили ложную инъекцию.
[0036] На ФИГ. 27 представлено влияние снижения концентрации сквалена в частицах НЛН с высокой емкостью на активность SEAP в сыворотке. НЛН с высокой емкостью (содержащие 3% (масса/объем) ДОТАП), изготовленные с 30, 15, 7,5 и 3,75% (масса/объем) сквалена, объединяли в комплекс 1:1 с рвРНК, кодирующей SEAP, при N:P, равном 37, 100 нг вводили в/м путем мышам C57BL/6 (n = 3/группу) и активность SEAP в сыворотке измеряли через 3 дня и сравнивали с мышами, которым вводили не находящуюся в составе рвРНК или ложную инъекцию.
[0037] На ФИГ. 28A - G представлена иммуногенность и эффективность комплексов НЛНv1/рвРНК у мышей C57BL/6. НЛНv1 объединяли в комплекс с рвРНК или мРНК, кодирующей prM/E ZIKV, при N:P, равном 50, вводили разовую дозу 1 мкг мышам C57BL/6 путем в/м инъекции (n = 9/группу) и спустя 14 дней брали кровь, чтобы оценить титры нейтрализующих антител с помощью РЗБО80 (ФИГ. 28A) по сравнению с мышами, вакцинированными ложной вакциной или 10 или 1 мкг голой рвРНК или мРНК (n = 9/группу), или 1 мкг рвРНК в составе с КНЭ при N:P, равном 50. Результаты представлены в виде отдельных значений, а также в виде среднего значения ± С.О. Через тридцать дней после иммунизации 6 мышей на группу сенсибилизировали 5 log10 БОЕ штамма 41525 ZIKV Dakar после блокирования интерферона I типа антителом, как описано в Smith и др. PLoS Negl Trop Dis 11(1):e0005296 (2017), и брали кровь спустя 4 дня, чтобы определить виремию с помощью анализа образования бляшек (ФИГ. 28B). Ежедневно контролировали выживаемость мышей (ФИГ. 29C) и потерю массы тела (ФИГ. 28D). Оставшимся 3 мышам на группу проводили вторую иммунизацию в день 30, чтобы оценить ответы CD8+ T-клеток после повторной стимуляции. Через четырнадцать дней мышей умерщвляли, спленоциты выделяли, окрашивали и проводили количественный анализ %B220loCD8+ T-клеток, которые были IFNγ+ (ФИГ. 28E), CD107a+ (ФИГ. 28F) или TNFα+ (ФИГ. 28G), с помощью проточной цитометрии (ФИГ. 37).
[0038] На ФИГ. 29 изображен типичный слитый белок ID91, содержащий четыре антигена/белка Mtb: Rv3619, Rv2389, Rv3478 и Rv1886 (сверху), и конструкция репликона альфа-вируса, которая кодирует ID91. Конструкция репликона содержит сигнал люциферазы Gaussia в качестве репортерного гена.
[0039] На ФИГ. 30A - B представлен процент секретирующих TH1-цитокины CD4+/CD44+ (ФИГ. 30A) или CD8+/CD44+ (ФИГ. 30B) T-клеток в ответ на вакцины на основе белка или РНК ID91. Статистическую значимость с P < 0,05 анализировали, применяя двухфакторный дисперсионный анализ, и отметили звездочками.
[0040] На ФИГ. 31A - D представлены результаты для пролиферирующей или продуцирующей цитокины CD4+ популяции. Спленоциты из мышей, иммунизированных белком ID91/GLA-СЭ (синий) или РНК ID91/QG807 (красный), стимулировали средой, полноразмерным белком ID91, 13 пулами пептидов из 10 пептидов, объединенных с перекрывающимися пептидами ID91.
[0041] На ФИГ. 32A - D представлены результаты для пролиферирующей или продуцирующей цитокины популяции CD8+ клеток. Спленоциты из мышей, иммунизированных белком ID91/GLA-СЭ (синий) или РНК ID91/QG807 (красный), стимулировали средой, полноразмерным белком ID91, 13 пулами пептидов из 10 пептидов, объединенных с перекрывающимися пептидами ID91.
[0042] На ФИГ. 33A - B представлено наблюдение, что иммунизации РНК ID91 были профилактически защитными и индуцировали различные эпитопы CD8+ T-клеток по сравнению с белком ID91. Когорты мышей иммунизировали дважды с интервалами в три недели либо белком ID91+GLA-СЭ, либо РНК альфа-вируса, кодирующей антигены ID91, спленоциты выделяли и повторно стимулировали in vitro, применяя пептиды ID91. Шкала интенсивности тепловой карты указывает на процент пролиферации и цитокиновых ответов CD4+ (красный) и CD8+ (синий) T-клеток в ответ на каждый пул (ФИГ. 30A). На ФИГ. 33A: С - среда отдельно, ID91 - ID91 отдельно и ПП1 - ПП13 относятся к пулам пептидов 1 - 13. Шкалы с правой стороны указывают на процент пролиферирующих или цитокин+ клеток в CD4+ или CD8+ популяции. На ФИГ. 33B представлена бактериальная нагрузка, которую оценивали в гомогенатах легких через 3 недели после провокации H37Rv Mtb. Когорты мышей иммунизировали однократно за 3 недели до провокации либо солевым раствором, либо белком ID91 + GLA-СЭ, либо РНК альфа-вируса, кодирующей антигены ID91, в составе с РНК. Значимость с P < 0,05 по сравнению с солевым раствором, определенную с помощью однофакторного дисперсионного анализа с критерием множественных сравнений Даннета, отметили звездочкой.
[0043] На ФИГ. 34A - B сравнивают сигнальные последовательности, полученные из вирусов Зика (ZIKV) или японского энцефалита (JEV). На ФИГ. 34A представлены конструкции рвРНК, кодирующих prM/E ZIKV с сигнальной последовательностью ZIKV или JEV против хода транскрипции от prM. На ФИГ. 34B представлены рвРНК, кодирующие prM/E ZIKV с сигнальными последовательностями ZIKV или JEV, которые включили в состав вместе с 10% сахарозой (голая) или с катионной наноэмульсией (КНЭ), и 10 мкг первой или 1 мкг последней из упомянутых вводили путем в/м инъекции мышам C57BL/6 (n = 5/группу), и титры РЗБО80 измеряли в сыворотке через 21 день. Мышей затем повторно стимулировали второй иммунизацией и титры РЗБО80 измеряли еще через 21 день.
[0044] На ФИГ. 35 представлено влияние молярного отношения поверхностно-активного вещества к маслу на размер частиц НЛН (Z-средний (нм)). Отношение поверхностно-активного вещества к маслу изменяли путем изменения общего количества поверхностно-активного вещества, при этом сохраняя количество масла постоянным. Экспериментальные данные аппроксимировали уравнением однофазного экспоненциального спада (R-квадрат = 0,972). Все составы подвергали микрофлюидизации при идентичных условиях (10 пропусканий при 30000 фунтах/кв. дюйм).
[0045] На ФИГ. 36A - B представлено влияние гидрофильного поверхностно-активного вещества на защиту от воздействия РНКаз и доставку экспрессирующей SEAP рвРНК in vivo. рвРНК объединяли в комплекс с вариантами частиц НЛН, полученными с 70% или 35% общего количества поверхностно-активного вещества и катионного липида, произведенными с добавлением или без 10 мМ цитратного буфера, и оценивали их способность защищать рвРНК от воздействия РНКаз (ФИГ. 36A). Мышам C57BL/6 (n = 3/группу) вводили рвРНК, кодирующую SEAP, в комплексе с 10% сахарозой (голую) или с частицами НЛН, полученными с 70% или 35% общего количества поверхностно-активного вещества и катионного липида, или с КНЭ, и активность SEAP в сыворотке измеряли через 3 дня (ФИГ. 36B).
[0046] На ФИГ. 37 представлена типичная стратегия установки дискриминационного окна при проточной цитометрии.
[0047] На ФИГ. 38A - B представлены примеры ID91, модифицированного ферментами рестрикции. На ФИГ. 38 A представлен вектор pET29, а на ФИГ. 38B представлен вектор pET28.
[0048] На ФИГ. 39A - E представлена передача сигналов врожденного иммунитета в полученных из МКПК человека дендритных клетках (ДК) после стимуляции агонистами TLR3 (Riboxxol, высокомолекулярная полиинозиновая/полицитидиловая кислота (pIC:HMW)) и RIG-I (SEVDI), с составом НЛН и без него. МКПК-ДК из шести доноров-людей стимулировали поли-IC:HMW, Riboxxol или SEVDI, либо в составе с НЛН («в составе с QG942»), либо голыми («не находящиеся в составе»). Контроль состав отдельно обозначен «Контроль средой». Через 24 часа инкубации при 37°C и в атмосфере 5% CO2 анализировали концентрацию в супернатантах маркеров врожденного иммунитета, применяя доступные для приобретения наборы для ELISA. Статистический анализ проводили с помощью 2-факторного дисперсионного анализа с критерием множественного сравнения Сидака. P-значения: * p < 0,05, ** p < 0,005, *** p < 0,0005, **** p < 0,0001.
[0049] На ФИГ. 40 представлена индукция IFNα/β в клетках MM6, стимулированных адъювантом Riboxxol или pIC:HMW. Клетки стимулировали либо голой, либо находящейся в составе РНК; составы композиций представлены в таблице XX. IFNα/β из супернатантов стимулированных клеток MM6 измеряли по сравнению с нестимулированными клетками MM6 и определяли, применяя репортерную линию клеток HEK-blue IFNα/β SEAP. Пунктирные линии соответствуют относительной стимуляции, измеренной после добавления известной концентрации IFNα.
[0050] На ФИГ. 41 представлена тепловая карта, резюмирующая индукцию IFNα/β как функцию от молярного отношения N:P и дозы riboxxol.
[0051] На ФИГ. 42A - D представлена экспрессия цитокинов после введения адъювантов дцРНК в составе с НЛН или СЭ.
[0052] На ФИГ. 43 представлена сниженная экспрессия SEAP после введения SEAP в составе с адъювантами дцРНК (лигандом TLR3) и НЛН.
[0053] На ФИГ. 44A - B представлен IP-10 (ФИГ. 42A) и экспрессия SEAP (ФИГ. 42B) после введения VEErep-SEAP в составе с НЛН, СЭ или контроля. На ФИГ. 42A *** = статистическая значимость 1 мкг + QG942 по сравнению с 1 мкг голой. На ФИГ. 42B * = статистическая значимость 1 мкг + QG942 по сравнению с 0,1 мкг + QG942, ** = статистическая значимость 0,1 мкг + QG942 по сравнению с 0,1 мкг СЭ либо с голой, *** = статистическая значимость 0,1 мкг + QG942 по сравнению с 0,1 мкг голой. На ФИГ. 45 представлены антигенспецифические гуморальные иммунные ответы. Мышам C57BL/6 вводили путем инъекции всего 2 раза с интервалом в 3 недели 1 мкг белка LEISH-F2, смешанного с указанным адъювантным составом. Сыворотки собирали в день 21 (перед повторной стимулирующей иммунизацией) и день 42, затем конечные титры антигенспецифических IgG, IgG1 и IgG2c определяли с помощью ELISA. Результаты представлены в виде среднего значения и С.О., 5 мышей на группу.
[0054] На ФИГ. 46A - B представлено влияние состава Хилтонол (Hiltonol®) на ответы T-клеток. Мышам C57BL/6 вводили путем инъекции всего 2 раза с интервалом в 3 недели 1 мкг белка LEISH-F2, смешанного с указанным адъювантным составом. Через три недели после заключительной иммунизации селезенки удаляли для получения суспензий отдельных клеток, клетки инкубировали с антигеном LEISH-F2, затем определяли содержание цитокинов в культуральном супернатанте с помощью ELISA. Результаты представлены в виде минимума и максимума, при этом прямоугольник изображает 25ую и 75ую процентили, и среднее значение обозначено горизонтальной полосой внутри прямоугольника, 5 мышей на группу.
[0055] На ФИГ. 47A - E представлено влияние состава Хилтонол® на ответы T-клеток. Мышам C57BL/6 вводили путем инъекции всего 2 раза с интервалом в 3 недели 1 мкг белка LEISH-F2, смешанного с указанным адъювантным составом. Через три недели после заключительной иммунизации селезенки удаляли для получения суспензий отдельных клеток, клетки инкубировали с антигеном F2, затем определяли фенотипы клеток с помощью проточной цитометрии. Результаты представлены в виде отдельных точек для каждой мыши, причем среднее значение и стандартная ошибка среднего указаны горизонтальными и вертикальными планками, соответственно. N = 5 мышей на группу.
[0056] На ФИГ. 48 представлено влияние состава Хилтонол® на антигенспецифические гуморальные иммунные ответы. Мышам C57BL/6 вводили путем однократной инъекции 1 мг белка LEISH-F3+, смешанного с указанным адъювантным составом. Через четыре недели после иммунизации собирали сыворотки и определяли конечные титры антигенспецифических IgG с помощью ELISA. Результаты представлены в виде отдельных точек для каждого животного, наряду со средним значением и стандартной ошибкой среднего. N = 5 мышей на группу.
[0057] На ФИГ. 49A - C представлено влияние состава Хилтонол® на ответы T-клеток. Мышам C57BL/6 вводили путем однократной инъекции 1 мкг белка LEISH-F3+, смешанного с указанным адъювантным составом. Через четыре недели после иммунизации селезенки удаляли для получения суспензий отдельных клеток, клетки инкубировали с белком F3+ или рестриктированными по ГКГС I класса пептидами (эпитопы CD8 T-клеток), затем определяли содержание цитокинов в культуральном супернатанте с помощью ELISA. Результаты представлены в виде отдельных точек для каждой мыши, причем среднее значение и стандартная ошибка среднего указаны горизонтальными и вертикальными планками, соответственно. N = 5 мышей на группу.
[0058] На ФИГ. 50A - G представлено влияние доставки антигенной вакцины с различными составами на иммуногенные реакции.
[0059] На ФИГ. 51A - B представлено влияние доставки антигенной вакцины с различными составами на иммуногенные реакции.
[0060] На ФИГ. 52A - C представлено влияние доставки антигенной вакцины с различными составами на иммуногенные реакции.
Описание ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
[0061] таблице 1 представлен перечень некоторых последовательностей, которые упоминают в данной заявке.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0062] В данной заявке предложены композиции для доставки биоактивного агента в клетку и способы такой доставки. НЛН содержат сердцевину, содержащую комбинацию жидкофазных и твердофазных липидов. В противоположность твердым липидным наночастицам (ЛНЧ), которые содержат полностью твердую кристаллическую сердцевину, сердцевина со смешанными фазами в НЛН обеспечивает большую универсальность в отношении включения активных молекул с различными структурами. Без привязки к теории полагают, что добавление твердых липидов в композицию позволяет получить сердцевины НЛН со структурной целостностью и стабильностью. В НЛН согласно настоящему изобретению масляную сердцевину со смешанными фазами эмульгируют со смесью поверхностно-активных веществ (обычно сложного эфира сорбитана и гидрофильного поверхностно-активного вещества) и катионным компонентом (обычно катионным липидом или фосфолипидом). Тогда как обычно биоактивные агенты, такие как низкомолекулярные лекарственные средства, включают в масляную сердцевину НЛН, авторы настоящего изобретения синтезировали НЛН, которые могут также взаимодействовать с биоактивными агентами, такими как отрицательно заряженные молекулы (например, РНК), на их поверхности или рядом с ней (т.е., биоактивный агент не инкапсулирован в НЛН). Авторы настоящего изобретения обнаружили, что стабильность НЛН, способность описанных НЛН доставлять нуклеиновую кислоту в клетку и возможность производить и хранить биоактивный агент на основе нуклеиновых кислот и НЛН отдельно и смешивать непосредственно перед применением позволяют использование данных частиц НЛН в большом разнообразии применений, включая применение в качестве платформенной технологии доставки нуклеиновых кислот с быстрой ответной реакцией для разработки множества профилактических или терапевтических лекарственных средств. Платформенная технология доставки нуклеиновых кислот с быстрой ответной реакцией основана на гибкой системе, использующей композиции НЛН для доставки нуклеиновых кислот (например, реплицирующейся вирусной РНК (рвРНК)), чтобы запустить репликацию РНК и/или экспрессию белка (например, приводящих к сильным и быстрым иммунным ответам на разнообразные вирусные, бактериальные или паразитарные антигены). Композиции НЛН согласно настоящему изобретению можно производить и хранить на складе в течение длительных периодов времени. Хранящийся на складе носитель затем можно комбинировать с нуклеиновой кислотой (например, синтетической рвРНК, экспрессирующей защитный антиген) во время возникшей вспышки заболевания или другого события в сфере здравоохранения.
[0063] Помимо того, что предложены НЛН для комбинирования с биоактивным агентом, также предложены НЛН после комбинирования. Соответственно, в некоторых аспектах биоактивный агент связан с НЛН. Биоактивный агент можно доставлять субъекту в период потребности в нем путем введения композиции НЛН-биоактивный агент.
[0064] I. Определения
[0065] Следующие термины имеют следующие значения, если не указано иное. Любые термины, для которых не приводится определение, имеют значения, известные в данной области.
[0066] В настоящем описании термины «приблизительно» и «состоящий по существу из» означают ± 20% от указанного диапазона, значения или структуры, если не указано иное.
[0067] Использование альтернативы (например, «или») следует понимать как означающее либо один, либо оба, либо любая комбинация перечисленных альтернатив.
[0068] В данной заявке термины «содержат», «имеют» и «включают» используют синонимично, указанные термины и их варианты должны истолковываться как неограничивающие.
[0069] В данной заявке и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа включают ссылку на формы множественного числа, если только в контексте явно не указано иное.
[0070] Термин «макромолекула» в данной заявке относится к большим молекулам, примерами которых служат, но не ограничены, пептиды, белки, олигонуклеотиды и полинуклеотиды биологического или синтетического происхождения.
[0071] Термин «алкил» означает ациклический или циклический, ненасыщенный или насыщенный алифатический углеводород с нормальной (неразветвленной) или разветвленной цепью, содержащий указанное количество атомов углерода. Ненасыщенные алкилы содержат по меньшей мере одну двойную или тройную связь между соседними атомами углерода.
[0072] Термины «полипептид», «пептид» и «белок» используют взаимозаменяемо в данной заявке по отношению к полимерам из аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные нуклеотиды или аминокислоты, и он может прерываться не относящимися к нуклеотидам или не относящимися к аминокислотам молекулами. В объем указанных терминов также входит полимер из нуклеотидов или аминокислот, который был модифицирован естественным путем или путем вмешательства; например, образованием дисульфидной связи, гликозилированием, липидизацией, ацетилированием, фосфорилированием или любой другой манипуляцией или модификацией, такой как конъюгирование с метящим компонентом. Также в объем указанного определения входят, например, полинуклеотиды или полипептиды, содержащие один или более аналогов нуклеотида или аминокислоты (включая, например, неприродные аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные в данной области.
[0073] Термин «изолированный» означает, что молекулу удалили из ее природного окружения.
[0074] «Очищенный» означает, что повысили чистоту молекулы таким образом, что она присутствует в форме, которая является более чистой, чем форма, в которой она присутствует в ее природном окружении, и/или была исходно синтезирована и/или амплифицирована в лабораторных условиях. Чистота является относительным термином и необязательно означает абсолютную чистоту.
[0075] Термины «полинуклеотид» или «нуклеиновая кислота», используемые взаимозаменяемо в данной заявке, относятся к полимерам из нуклеотидов любой длины и включают ДНК и РНК. Нуклеотиды могут представлять собой, например, дезоксирибонуклеотиды, рибонуклеотиды, модифицированные нуклеотиды или основания, и/или их аналоги, или любой субстрат, который можно включить в полимер с помощью ДНК- или РНК-полимеразы или с помощью реакции синтеза. Полинуклеотид может содержать модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Если она присутствует, модификацию структуры нуклеотида можно осуществить до или после сборки полимера.
[0076] «Олигонуклеотид» в данной заявке в общем смысле относится к коротким, как правило, одноцепочечным, как правило, синтетическим полинуклеотидам, длина которых, как правило, но не обязательно, меньше приблизительно 200 нуклеотидов. Термины «олигонуклеотид» и «полинуклеотид» не являются взаимоисключающими. Приведенное выше описание полинуклеотидов в равной мере и полностью применимо к олигонуклеотидам.
[0077] «Индивид» или «субъект» представляет собой любое млекопитающее. Млекопитающие включают, но не ограничены перечисленными: людей, приматов, сельскохозяйственных животных, спортивных животных, домашних питомцев (таких как кошки, собаки, лошади) и грызунов.
[0078] «Репликон» в данной заявке включает любой генетический элемент, например, плазмиду, космиду, бакмиду, фаг или вирус, который способен реплицироваться по большей части под собственным контролем. Репликон может представлять собой либо РНК, либо ДНК и может быть одно- или двухцепочечным.
[0079] Витамин E относится как к токоферолам (ТКФ), так и к токотриенолам, и может быть встречающимися в природе или синтетическим.
[0080] Моноацилглицерины представляют собой эфиры трехатомного спирта глицерина, в котором одна из гидроксильных групп этерифицирована жирной кислотой с длинной цепью.
[0081] Лауроилполиоксилглицериды представляют собой смесь сложных моноэфиров, сложных диэфиров и сложных триэфиров глицерина и сложных моноэфиров и сложных диэфиров полиэтиленгликолей со средней относительной молекулярной массой обычно между приблизительно 300 и приблизительно 1500.
[0082] Каприновый/каприловый триглицерид представляет собой смешанный сложный триэфир глицерина и каприловых и каприновых кислот.
[0083] Термин жидкофазный липид относится к липиду, который перед смешиванием с каким-либо другим компонентом является жидким при температуре окружающей среды.
[0084] Термин твердофазный липид относится к липиду, который перед смешиванием с каким-либо другим компонентом является твердым при температуре окружающей среды.
[0085] Температура окружающей среды представляет собой температуру между 15°C и 25°C.
[0086] Глицеролипид представляет собой жирную молекулу, состоящую из глицерина, связанного путем этерификации с жирной кислотой. Глицеролипиды включают триглицериды и диглицериды.
[0087] Термин «сложный эфир сорбитана» в данной заявке относится к сложному эфиру сорбитана. Сорбитан отвечает Формуле A
[0088] Формула A
[0089] Особенно предпочтительные сложные эфиры сорбитана представляют собой алкиловые сложные эфиры сорбитана, в которых алкил представляет собой C1-C30 алкильную группу, предпочтительно насыщенную или ненасыщенную C1-C20 алкильную группу, более предпочтительно насыщенную или ненасыщенную C10-C20 алкильную группу.
[0090] При практическом осуществлении настоящего изобретения будут использовать, если не указано иное, обычные методики молекулярной биологии, рекомбинантной ДНК, биохимии и химии, которые находятся в рамках компетенции в данной области. Такие методики полностью разъяснены в литературе. См., например, Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2ое изд., Sambrook и др., ред., Cold Spring Harbor Laboratory Press: (1989); DNA Cloning, тома I и II (D. N. Glover ред., 1985); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait ред., 1984); Mullis и др., патент США номер: 4683195; Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames и S. J. Higgins ред. 1984); B. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning (1984); трактат Methods in Enzymology (Academic Press, Inc., Нью-Йорк); и in Ausubel и др., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Балтимор, Мэриленд (1989).
[0091] II. Наноструктурированные липидные носители
[0092] В настоящем изобретении предложены, среди прочего, НЛН для доставки биоактивного агента в клетку. Композиции НЛН состоят из частиц НЛН, содержащих (a) масляную сердцевину, содержащую жидкофазный липид и твердофазный липид, (b) катионный компонент (предпочтительно катионный липид или фосфолипид), (c) гидрофобное поверхностно-активное вещество, предпочтительно сложный эфир сорбитана (например, сложный моноэфир, сложный диэфир или сложный триэфир сорбитана и (d) поверхностно-активное вещество (предпочтительно гидрофильное поверхностно-активное вещество). НЛН согласно настоящему изобретению обычно содержат неструктурированную или аморфную твердую липидную матрицу, состоящую из смешанных твердых и жидких липидов, диспергированных в водной фазе. Одно или более из поверхностно-активных веществ могут присутствовать в масляной фазе, водной фазе или на границе раздела между масляной и водной фазами. В некоторых аспектах сложный эфир сорбитана и катионный липид присутствуют на границе раздела между масляной и водной фазами.
[0093] Авторы настоящего изобретения обнаружили, что предложенные НЛН особенно эффективно доставляют кодирующую белок нуклеиновую кислоту, такую как РНК. Кроме того, обнаружили, что посредством манипулирования некоторыми компонентами НЛН можно повысить уровни экспрессии кодируемого белка. Неожиданно, типичные НЛН оказались не только способны эффективно доставлять РНК, они также способны улучшить иммунный ответ на кодируемые белки.
[0094] A. Твердофазные и жидкофазные липиды.
[0095] НЛН состоят из смеси твердых и жидких липидов. Жидкие и твердые липиды для применения в НЛН могут представлять собой любой липид, способный образовывать неструктурированную или аморфную твердую липидную матрицу и образовывать стабильную композицию. Отношение масс твердого липида к жидкому может широко изменяться, например, от 0,1:99,9 до 99,9:0,1. В некоторых типичных вариантах реализации твердые липиды смешивают с жидкими липидами при отношении масс твердого к жидкому липиду, составляющем от приблизительно 70:30 до приблизительно 99,9:0,1 или от приблизительно 1:10 до приблизительно 1:30. В некоторых аспектах твердые липиды смешивают с жидкими липидами при отношении масс твердого к жидкому липиду, составляющем приблизительно 1:16.
[0096] Общий масляный компонент сердцевины (твердый липид + жидкое масло) композиции или состава на основе НЛН обычно присутствует в количестве от приблизительно 0,2% до приблизительно 50% (масса/объем). Например, НЛН может содержать от приблизительно 0,2% до приблизительно 50% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, от 0,2% до приблизительно 40% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, от приблизительно 0,2% до приблизительно 30% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, от приблизительно 0,2% до приблизительно 20% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, от приблизительно 0,2% до приблизительно 15% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, от приблизительно 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, от приблизительно 0,2% до приблизительно 9% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, от приблизительно 0,2% до приблизительно 8% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, от приблизительно 0,2% до приблизительно 7% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, от приблизительно 0,2% до приблизительно 6% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, от приблизительно 0,2% до приблизительно 5% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, от приблизительно 0,2% до приблизительно 4,3% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, от приблизительно 0,3% до приблизительно 20% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, от приблизительно 0,4% до приблизительно 20% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, от приблизительно 0,5% до приблизительно 20% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, от приблизительно 1% до приблизительно 20% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, от приблизительно 2% до приблизительно 20% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, от приблизительно 3% до приблизительно 20% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, от приблизительно 4% до приблизительно 20% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, от приблизительно 5% до приблизительно 20% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, приблизительно 0,5% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, приблизительно 1% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, приблизительно 1,5% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, приблизительно 2% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, приблизительно 2,5% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, приблизительно 3% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, приблизительно 3,5% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, приблизительно 4% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, приблизительно 4,3% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, приблизительно 5% (масса/объем) масляного компонента сердцевины или приблизительно 10% (масса/объем) масляного компонента сердцевины, или любое другое количество или диапазон, описанные в данной заявке для масляного компонента сердцевины. Более высокие или более низкие процентные соотношения масса/объем также предложены в данной заявке, особенно при рассмотрении разбавленных или концентрированных составов.
[0097] Масляная сердцевина НЛН содержит жидкофазный липид. Предпочтительно, хотя не обязательно, жидкофазный липид представляет собой метаболизируемое нетоксичное масло; более предпочтительно состоящее из от приблизительно 6 до приблизительно 30 атомов углерода, включая, но не ограничиваясь перечисленными: алканы, алкены, алкины и соответствующие их кислоты и спирты, эфиры и сложные эфиры, и их смеси. Масло может представлять собой, например, любое растительное масло, рыбий жир, животное масло или полученное синтетическим путем масло, которое можно вводить субъекту. В некоторых аспектах жидкофазный липид будет неметаболизируемым.
[0098] Масло может представлять собой, например, любой алкан, алкен или алкин с длинной цепью, или его кислотное или спиртовое производное либо в виде свободной кислоты, либо в виде ее соли, либо сложного эфира, такого как сложный моно-, или ди-, или триэфир, такой как триглицериды и сложные эфиры 1,2-пропандиола или аналогичных полигидроксиспиртов. Спирты можно ацилировать, используя моно- или полифункциональную кислоту, например, уксусную кислоту, пропановую кислоту, лимонную кислоту или тому подобные кислоты. Также можно применять эфиры, полученные из спиртов с длинной цепью, которые представляют собой масла и удовлетворяют другим критериям, описанным в данной заявке.
[0099] Отдельная молекула алкана, алкена или алкина и ее кислотные или спиртовые производные, как правило, будут содержать от приблизительно 6 до приблизительно 40 или от 6 до приблизительно 30 атомов углерода. У данной молекулы может быть структура линейной или разветвленной цепи. Она может быть полностью насыщенной или содержать одну или более двойных или тройных связей. Когда используют масла на основе сложных моно- или полиэфиров или простых эфиров, ограничение на от приблизительно 6 до приблизительно 40 атомов углерода распространяется на отдельные молекулы жирных кислот или жирных спиртов, а не на общее количество атомов углерода.
[00100] Можно применять любые подходящие масла из животного, рыбьего или растительного источника. Источники растительных масел включают орехи, семена и зерна, и подходящие масла включают, например, арахисовое масло, соевое масло, кокосовое масло, оливковое масло и тому подобные масла. Другие подходящие масла, полученные из семян, включают сафлоровое масло, хлопковое масло, подсолнечное масло, кунжутное масло и тому подобные масла. Из группы масел, полученных из зерна, также можно применять кукурузное масло и масло, полученное из зерен других злаковых, таких как пшеница, овес, рожь, рис, тефф, тритикале и тому подобные масла. Технология производства растительных масел хорошо разработана и хорошо известна. Композиции данных и других аналогичных масел можно найти, например, Merck Index и других источниках, относящихся к пищевым продуктам, питанию и технологиям производства пищевых продуктов.
[00101] Большинство рыб содержит метаболизируемые масла, которые можно легко извлечь. Например, масло печени трески, масло печени акулы и китовое масло, такое как спермацетовое масло, являются несколькими примерами рыбьих жиров, которые можно применять в данной заявке. Множество масел с разветвленной цепью синтезируют биохимическим способом из 5-углеродных изопреновых звеньев и обычно называют терпеноидами. Встречающиеся в природе или синтетические терпеноиды, которые также называют изопреноидами, можно применять в данной заявке в качестве жидкофазного липида. Сквален, разветвленный ненасыщенный терпеноид, особенно предпочтителен в данной заявке. Основным источником сквалена является масло печени акулы, хотя подходящими источниками также являются растительные масла (преимущественно овощные масла), включая масла, полученные из семян амаранта, рисовых отрубей, ростков пшеницы, и оливковое масло. Предпочтительным также является сквалан, насыщенный аналог сквалена. Масла, включая рыбьи масла, такие как сквален и сквалан, легко доступны из коммерческих источников или могут быть получены с помощью способов, известных в данной области. Масла для применения в данной заявке также можно получить с помощью способов синтеза, включая генную инженерию (например, масла, полученные из биоинженерных дрожжей, включая сквален).
[00102] Примеры жидкофазных липидов, которые можно применять в настоящем изобретении, включают, например, касторовое масло, кокосовое масло, кукурузное масло, хлопковое масло, масло вечерней примулы, рыбий жир, виноградное масло, масло жожоба, лярд-масло, льняное масло, оливковое масло, арахисовое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, соевое масло, сквален, сквалан, подсолнечное масло, масло из ростков пшеницы, минеральное масло, каприновый/каприловый триглицерид (например, миглиол (Myglyol)®810, миглиол®812, лабрафак (Labrafac)™), витамин E (например, токоферола сукцинат (ТОС), токоферилполиэтиленгликольсукцинат (ТПГС)), лауроилполиоксилглицериды (например, гелуцир (Gelucire)®44/14), моноацилглицерины (например, миверол (Myverol)18-99 K), соевый лецитин (например, эпикурон (Epikuron)™200), фарнезен или комбинацию перечисленных липидов.
[00103] Жидкофазный липид может включать, например, сквален, подсолнечное масло, соевое масло, оливковое масло, виноградное масло, сквалан, каприновый/каприловый триглицерид или комбинацию перечисленных липидов.
[00104] Жидкофазный липид может включать, например, сквален, сквален, каприновый/каприловый триглицерид или комбинацию перечисленных липидов.
[00105] Жидкофазный липид может включать, например, каприновый/каприловый триглицерид, витамин E, лауроилполиоксилглицериды, моноацилглицерины, соевый лецитин, сквален или сквалан, или комбинацию перечисленных липидов.
[00106] Жидкофазный липид может включать, например, сквален, сквален или фарнезен, или комбинацию перечисленных липидов.
[00107] Масляная сердцевина НЛН содержит твердофазный липид. Можно применять большое разнообразие твердофазных липидов, включая например, глицеролипиды. Примеры твердофазных липидов включают, например, глицерилпальмитостеарат (прецитол (Precitol) ATO®5), глицерилмоностеарат, глицерилдибегенат (компритол (Compritol)®888 ATO), цетилпальмитат (кродамол (Crodamol)™ CP), стеариновую кислоту, трипальмитин или микрокристаллический триглицерид. Примеры микрокристаллических триглицеридов включают триглицериды, реализуемые под торговым наименованием динасан (Dynasan)® (например, тримиристин (динасан®114), или тристеарин (динасан®118), или трипальмитин (динасан®116)).
[00108] Твердофазный липид может представлять собой, например, микрокристаллический триглицерид, например, триглицерид, выбранный из тримиристина (динасана®114) или тристеарина (динасана®118).
[00109] Предпочтительно твердофазный липид масляной сердцевины является твердым при температуре окружающей среды. В закрытом помещении температура окружающей среды обычно составляет от 15°C до 25°C.
[00110] В любом из вариантов реализации, предложенных в данной заявке, твердофазный липид может представлять собой глицеролипид, например, микрокристаллический триглицерид.
[00111] В любом из вариантов реализации, предложенных в данной заявке, жидкофазный липид может представлять собой синтетический или встречающийся в природе сквален.
[00112] B. Катионный компонент.
[00113] НЛН, описанные в данной заявке, содержат катионный компонент, обычно катионный липид. Катионный компонент пригоден для взаимодействия с отрицательно заряженными биоактивными агентами на поверхности НЛН. Можно применять любой катионный липид, способный взаимодействовать с отрицательно заряженными биоактивными агентами, которые не нарушат стабильность НЛН и которые можно вводить субъекту. Как правило, катионный липид содержит атом азота, который положительно заряжен при физиологических условиях. Подходящие катионные липиды включают хлорид бензалкония (BAK), хлорид бензетония, цетримид (который включает бромид тетрадецилтриметиламмония и возможно небольшие количества бромида додецилтриметиламмония и бромида гексадецилтриметиламмония), цетилпиридиния хлорид (ЦПХ), хлорид цетилтриметиламмония (ЦТАХ), первичные амины, вторичные амины, третичные амины, включая, но не ограничиваясь перечисленными: N,N′,N′-полиоксиэтилен (10)-N-таллоу-1,3-диаминопропан, другие соли четвертичного аммония, включая, но не ограничиваясь перечисленными: бромид додецилтриметиламмония, бромид гексадецилтриметиламмония, смешанный алкил-триметиламмония бромид, хлорид бензилдиметилдодециламмония, хлоридбензилдиметилгексадециламмония, метоксид бензилтриметиламмония, бромид цетилдиметилэтиламмония, бромид диметилдиоктадециламмония (ДДАБ), хлорид метилбензетония, хлорид декаметония, смешанный метил-триалкиламмония хлорид, метилтриоктиламмония хлорид, N,N-диметил-N-[2(2-метил-4-(1,1,3,3-тетраметилбутил)-фенокси]-этокси)этил]-бензолметанаммония хлорид (DEBDA), соли диалкилдиметиламмония, [1-(2,3-диолеилокси)-пропил]-N,N,N-триметиламмония хлорид, 1,2-диацил-3-(триметиламмонио) пропан (ацильная группа = димиристоил, дипальмитоил, дистеароил, диолеоил), 1,2-диацил-3(диметиламмонио)пропан (ацильная группа = димиристоил, дипальмитоил, дистеароил, диолеоил), 1,2-диолеоил-3-(4′-триметиламмонио)бутаноил-sn-глицерин, сложный эфир холина 1,2-диолеоил-3-сукцинил-sn-глицерина, холестерил(4′-триметиламмонио)бутаноат), соли N-алкилпиридиния (например, бромид цетилпиридиния и хлорид цетилпиридиния), соли N-алкилпиперидиния, дикатионные болаформные электролиты (C12Me6; C12Bu6), диалкилглицетилфосфорилхолин, лизолецитин, L-α диолеоилфосфатидилэтаноламин, сложный эфир холина холестерингемисукцината, липополиамины, включая, но не ограничиваясь перечисленными: диоктадециламидоглицилспермин (ДОГС), дипальмитоилфосфатидилэтаноламидоспермин (ДПФЭС), липополи-L (или D)-лизин (LPLL, LPDL), поли-L (или D)-лизин, конъюгированный с N-глутарилфосфатидилэтаноламином, сложный эфир дидодецилглутамата с боковой аминогруппой (C12GluPhCnN+), сложный эфир дитетрадецилглутамата с боковой аминогруппой (C14GluCnN+), катионные производные холестерина, включая, но не ограничиваясь перечисленными: соль холестерил-3β-оксисукцинамидоэтилентриметиламмония, холестерил-3β-оксисукцинамидоэтилендиметиламин, соль холестерил-3β-карбоксиамидоэтилентриметиламмония, холестерил-3β-карбоксиамидоэтилендиметиламин и 3γ-[N-(N',N-диметиламиноэтанкарбомоил]холестерин) (ДК-холестерин), 1,2-диолеоилокси-3-(триметиламмонио)пропан (ДОТАП), диметилдиоктадециламмоний (ДДА), 1,2-димиристоил-3-триметиламмоний-пропан (ДМТАП), дипальмитоил(C16:0)триметиламмоний-пропан (ДПТАП), дистеароилтриметиламмоний-пропан (ДСТАП) и комбинации перечисленных липидов.
[00114] Другие катионные липиды, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают, например, катионные липиды, описанные в публикациях патентов США 2008/0085870 (опубликованной 10 апреля 2008 г.) и 2008/0057080 (опубликованной 6 марта 2008 г).
[00115] Другие катионные липиды, подходящие для применения в настоящем изобретении, включают, например, липиды E0001-E0118 или E0119-E0180, описанные в таблице 6 (станицы 112 - 139) в WO 2011/076807 (в которой также описаны способы получения и способ применения данных катионных липидов). Дополнительные подходящие катионные липиды включают N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония хлорид (ДОТМА), N,N-диолеоил-N,N-диметиламмония хлорид (ДОДАХ), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-этилфосфохолин (ДОЭФХ), 1,2-диолеоил-3-диметиламмоний-пропан (ДОДАП), 1,2-дилинолеилокси-3-диметиламинопропан (ДЛинДМА).
[00116] НЛН могут содержать один или любую комбинацию двух или более катионных липидов, описанных в данной заявке.
[00117] В типичных вариантах реализации катионный липид выбран из группы, состоящей из 1,2-диолеоилокси-3-(триметиламмонио)пропана (ДОТАП), 313-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)-карбамоил]холестерина (ДК-холестерина), диметилдиоктадециламмония (ДДА), 1,2-димиристоил-3-триметиламмоний-пропана (ДМТАП), дипальмитоил(C16:0)-триметиламмоний-пропана (ДПТАП), дистеароилтриметиламмоний-пропана (ДСТАП), липидов E0001-E0118 или E0119-E0180, описанных в таблице 6 (станицы 112 - 139) в WO 2011/076807, и комбинаций перечисленных липидов.
[00118] В других типичных вариантах реализации катионный липид выбран из группы, состоящей из 1,2-диолеоилокси-3-(триметиламмонио)пропана (ДОТАП), 313-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)-карбамоил]холестерина (ДК-холестерина), диметилдиоктадециламмония (ДДА), 1,2-димиристоил-3-триметиламмоний-пропана (ДМТАП), дипальмитоил(C16:0)-триметиламмоний-пропана (ДПТАП), дистеароилтриметиламмоний-пропана (ДСТАП), N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония хлорида (ДОТМА), N,N-диолеоил-N,N-диметиламмония хлорида (ДОДАХ), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-этилфосфохолина (ДОЭФХ), 1,2-диолеоил-3-диметиламмоний-пропана (ДОДАП), 1,2-дилинолеилокси-3-диметиламинопропана (ДЛинДМА), липидов E0001-E0118 или E0119-E0180, описанных в таблице 6 (станицы 112 - 139) в WO 2011/076807, и комбинаций перечисленных липидов.
[00119] Типичные катионные липиды выбирают из следующих: 1,2-диолеоилокси-3-(триметиламмонио)пропан (ДОТАП), 3β-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)-карбамоил]холестерин (ДК-холестерин), диметилдиоктадециламмоний (ДДА), 1,2-димиристоил-3-триметиламмоний-пропан (ДМТАП), дипальмитоил(C16:0)-триметиламмоний-пропан (ДПТАП), дистеароилтриметиламмоний-пропан (ДСТАП), N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония хлорид (ДОТМА), N,N-диолеоил-N,N-диметиламмония хлорид (ДОДАХ), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-этилфосфохолин (ДОЭФХ), 1,2-диолеоил-3-диметиламмоний-пропан (ДОДАП), 1,2-дилинолеилокси-3-диметиламинопропан (ДЛинДМА) или комбинации перечисленных. Дополнительные подходящие катионные липиды могут быть известны специалисту в данной области.
[00120] В некоторых вариантах реализации композиция или состав на основе НЛН содержит от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 50 мг/мл катионного компонента (например, катионного липида). В некоторых вариантах реализации катионный липид представляет собой ДОТАП. НЛН может содержать, например, от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 25 мг/мл или 30 мг/мл ДОТАП, или любое другое количество или диапазон, описанные в данной заявке для ДОТАП.
[00121] В некоторых вариантах реализации катионный липид представляет собой ДК-холестерин. В некоторых аспектах, НЛН может содержать ДК-холестерин при концентрации от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 5 мг/мл ДК-холестерина. В некоторых вариантах реализации катионный липид представляет собой ДДА. НЛН может содержать, например, от приблизительно 0,1 мг/мл до приблизительно 5 мг/мл ДДА. В некоторых вариантах реализации катионный липид представляет собой ДОТМА. НЛН может содержать, например, от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 25 или 30 мг/мл ДОТМА. В некоторых вариантах реализации катионный липид представляет собой ДОЭФХ. НЛН может содержать, например, от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 25 мг/мл ДОЭФХ. В некоторых вариантах реализации катионный липид представляет собой ДСТАП. НЛН может содержать, например, от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 50 мг/мл ДСТАП. В некоторых вариантах реализации катионный липид представляет собой ДОДАХ. НЛН может содержать, например, от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 50 мг/мл ДОДАХ. В некоторых вариантах реализации катионный липид представляет собой ДОДАП. НЛН может содержать, например, от приблизительно 0,5 мг/мл до приблизительно 50 мг/мл ДОДАП.
[00122] В отношении массы к объему, типичная композиция или состав на основе НЛН может содержать, например, от приблизительно 0,05% до приблизительно 5% или до приблизительно 10% (масса/объем) катионного компонента (например, катионного липида, такого как ДОТАП), от приблизительно 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем) катионного компонента (например, катионного липида, такого как ДОТАП), от приблизительно 0,2% до приблизительно 5% (масса/объем) катионного компонента (например, катионного липида, такого как ДОТАП), от приблизительно 0,2% до приблизительно 2% (масса/объем) катионного компонента (например, катионного липида, такого как ДОТАП), приблизительно от 2% до 10% (масса/объем) катионного компонента (например, катионного липида, такого как ДОТАП), от приблизительно 2% до приблизительно 5% (масса/объем) катионного компонента (например, катионного липида, такого как ДОТАП), от приблизительно 1% до приблизительно 5% (масса/объем) катионного компонента (например, катионного липида, такого как ДОТАП), от приблизительно 3% до приблизительно 5% (масса/объем) катионного компонента (например, катионного липида, такого как ДОТАП), или от приблизительно 3% до приблизительно 4% (масса/объем) катионного компонента (например, катионного липида, такого как ДОТАП), или любое другое количество или диапазон, описанные в данной заявке для катионного компонента. Более высокие или более низкие процентные соотношения масса/объем предполагаются в данной заявке, в частности, при рассмотрении разбавленных или концентрированных составов.
[00123] В некоторых случаях может потребоваться применение катионного липида, который растворим в масляной сердцевине. Например, ДОТАП ДОЭФХ, ДОДАХ и ДОТМА растворимы в сквалене или сквалане. В других случаях может потребоваться применение катионного липида, который нерастворим в масляной сердцевине. Например, ДДА и ДСТАП нерастворимы в сквалене. Способность определить, является ли конкретный липид растворимым или нерастворимым в масле, и выбрать подходящую комбинацию масел и липидов, соответственно, находится в рамках компетенции в данной области. Например, растворимость можно спрогнозировать на основании структур липида и масла (например, растворимость липида можно определить по структуре его хвоста). Например, липиды, содержащие одну или две цепи ненасыщенных жирных кислот (например, олеоиловые хвосты), такие как ДОТАП, ДОЭФХ, ДОДАХ, ДОТМА, растворимы в сквалене или сквалане; тогда как липиды, содержащие цепи насыщенных жирных кислот (например, стеароиловые хвосты), нерастворимы в сквалене. В качестве альтернативы, растворимость можно определить по количеству липида, который растворяется в данном количестве масла с образованием насыщенного раствора).
[00124] НЛН может содержать дополнительные липиды (т.е., нейтральные и анионные липиды) в комбинации с катионным липидом при условии, что суммарный поверхностный заряд НЛН перед смешиванием с биоактивным агентом положителен. Способы измерения поверхностного заряда НЛН известны в данной области и включают, например, измерение с помощью динамического рассеяния света (ДРС), фотонной корреляционной спектроскопии (ФКС) или электрофореза в геле.
[00125] C. Сложный моноэфир сорбитана.
[00126] Авторы настоящего изобретения обнаружили, что сложный эфир сорбитана, когда его добавляют в НЛН, может повышать эффективность НЛН в отношении доставки биоактивного агента в клетку и/или в отношении индукции образования антител к антигену у субъекта, если биоактивный агент представляет собой антиген или кодирует антиген, и композицию вводят субъекту. В частности, обнаружили, что иммунный ответ на кодируемые белки в биоактивной нуклеиновой кислоте можно модулировать путем выбора сложного эфира сорбитана, применяемого в НЛН. Неожиданно обнаружили, что применение сложного моноэфира сорбитана особенно эффективно повышало эффективность НЛН. В некоторых аспектах ацильная цепь сложного моноэфира сорбитана является насыщенной. Кроме того, без привязки к теории, неожиданно обнаружили, что сложный эфир сорбитана и, в частности, сложный моноэфир сорбитана, действует в комбинации с твердым липидом (например, микрокристаллическими триглицеридами), повышая эффективность адъювантной активности НЛН (например, в отношении индукции образования антител к антигену у субъекта, если биоактивный агент представляет собой антиген или кодирует антиген и композицию вводят субъекту).
[00127] Типичные сложные моноэфиры сорбитана доступны для приобретения под торговыми наименованиями спан® или арлацель (Arlacel)®. Типичный сложный моноэфир сорбитана для применения в данной заявке может быть представлен в виде соединения формулы I или его стереоизомера (включая, но не ограничиваясь формулой Ia, Ib, Ic или Id), где R представляет собой насыщенную или ненасыщенную C1-C30 алкильную группу, предпочтительно насыщенную или ненасыщенную C1-C20 алкильную группу, более предпочтительно насыщенную или ненасыщенную C10-C20 алкильную группу. В типичных вариантах реализации алкильная группа ациклическая. Типичные сложные моноэфиры сорбитана также включают позиционные изомеры соединений, отвечающих формулам I, Ia, Ib, Ic или Id (например, одна из гидроксильных функциональных групп заменена на эфирную функциональную группу (например, сложный эфир алкила, где алкил представляет собой насыщенную или ненасыщенную C1-C30 алкильную группу, предпочтительно насыщенную или ненасыщенную C1-C20 алкильную группу, более предпочтительно насыщенную или ненасыщенную C10-C20 алкильную группу и R представляет собой OH). Для квалифицированного специалиста должно быть очевидно, что типичные сложные моноэфиры сорбитана могут представлять собой формы соли (например, фармацевтически приемлемых солей) соединений, отвечающих формулам I, Ia, Ib, Ic, Id, и их стереоизомеры или позиционные изомеры.
[00128] Особенно предпочтительные в этом отношении сложные моноэфиры сорбитана представляют собой сорбитана моностеарат (также известный как спан®60 и показанный ниже) и сорбитана моноолеат (также известный как спан®80 и показанный ниже), хотя можно применять и другие сложные моноэфиры сорбитана (включая, но не ограничиваясь перечисленными: сорбитана монолаурат (спан®20), сорбитана монопальмитат (спан®40)). Типичный сорбитана моностеарат представлен формулой II или IIa или ее формой соли и типичный сорбитана моноолеат представлен формулой III или IIIa или ее формой соли.
[00129] Дополнительно к предложенным в качестве компонентов НЛН сложным моноэфирам сорбитана также предложена замена сложного моноэфира сорбитана на альтернативное гидрофобное поверхностно-активное вещество, включая альтернативные неионные поверхностно-активные вещества на основе сорбитана. Соответственно, также в данной заявке предложены частицы НЛН, содержащие масляную сердцевину, содержащую жидкофазный липид и твердофазный липид, катионный компонент (предпочтительно катионный липид или фосфолипид), гидрофобное поверхностно-активное вещество (например, неионные поверхностно-активные вещества, включая неионные поверхностно-активные вещества на основе сорбитана) и гидрофильное поверхностно-активное вещество. Неионные поверхностно-активные вещества на основе сорбитана включают сложные эфиры сорбитана, отличные от сложных моноэфиров сорбитана, например, сложные диэфиры сорбитана и сложные триэфиры сорбитана, такие как, например, сорбитана триолеат (спан 85™) и сорбитана тристеарат (спан 65™). Как правило, неионное поверхностно-активное вещество (включая неионное поверхностно-активное вещество на основе сорбитана) будет иметь значение гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ) от 1,8 до 8,6. Все варианты реализации, предложенные в данной заявке для НЛН, содержащих сложный моноэфир сорбитана, применимы и предусмотрены для НЛН, содержащих альтернативное гидрофобное поверхностно-активное вещество вместо сложного моноэфира сорбитана, например, НЛН, содержащих сложный диэфир или сложный триэфир сорбитана вместо сложного моноэфира сорбитана. Сложный диэфир и сложный триэфир сорбитана или другое гидрофобное поверхностно-активное вещество может присутствовать в таких же концентрациях как и сложный моноэфир сорбитана. В некоторых аспектах ацильные цепи сложного диэфира или сложного триэфира сорбитана будут насыщенными.
[00130] Как правило, сложные эфиры сорбитана (например, сложные моноэфиры сорбитана) имеют значение гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ) от 1 до 9. В некоторых вариантах реализации сложные эфиры сорбитана (например, сложные моноэфиры сорбитана) имеют значение ГЛБ от 1 до 5. В некоторых вариантах реализации гидрофобное поверхностно-активное вещество имеет значение ГЛБ приблизительно от 4 до 5.
[00131] Типичный сложный диэфир сорбитана для применения в данной заявке может быть представлен как соединение формулы IV ниже или его стереоизомер (например, где R представляет собой насыщенную или ненасыщенную C1-C30 алкильную группу, предпочтительно насыщенную или ненасыщенную C1-C20 алкильную группу, более предпочтительно насыщенную или ненасыщенную C10-C20 алкильную группу и по меньшей мере один из R1 представляет собой H, тогда как другой представляет собой -C(=O)Y, где Y представляет собой насыщенную или ненасыщенную C1-C30 алкильную группу, предпочтительно насыщенную или ненасыщенную C1-C20 алкильную группу, более предпочтительно насыщенную или ненасыщенную C10-C20 алкильную группу). В типичных вариантах реализации алкильная группа ациклическая. Типичные сложные диэфиры сорбитана также включают позиционные изомеры соединений, отвечающих формулам IV. Для квалифицированного специалиста должно быть очевидно, что типичные сложные диэфиры сорбитана могут представлять собой формы соли (например, фармацевтически приемлемых солей) соединения, отвечающего формуле IV, и их стереоизомеры или позиционные изомеры.
[00132] Типичный сложный триэфир сорбитана для применения в данной заявке может быть представлен в виде соединения формулы V ниже или его стереоизомера (включая, но не ограничиваясь формулой Va, Vb или Vc), где R представляет собой насыщенную или ненасыщенную C1-C30 алкильную группу, предпочтительно насыщенную или ненасыщенную C1-C20 алкильную группу, более предпочтительно насыщенную или ненасыщенную C10-C20 алкильную группу и R1 представляет собой -C(=O)Y, где Y могут быть одинаковыми или различными в каждом случае и представляют собой насыщенную или ненасыщенную C1-C30 алкильную группу, предпочтительно насыщенную или ненасыщенную C1-C20 алкильную группу, более предпочтительно насыщенную или ненасыщенную C10-C20 алкильную группу. В типичных вариантах реализации алкильная группа ациклическая. Типичные сложные триэфиры сорбитана также включают позиционные изомеры соединений, отвечающих формулам V, Va, Vb или Vc (например, гидроксильная функциональная группа заменена на эфирную функциональную группу (например, сложный эфир алкила, где алкил представляет собой насыщенную или ненасыщенную C1-C30 алкильную группу, предпочтительно насыщенную или ненасыщенную C1-C20 алкильную группу, более предпочтительно насыщенную или ненасыщенную C10-C20 алкильную группу) и один из сложных эфиров алкила (например, циклический сложный эфир алкила или ациклический сложный эфир алкила) заменен на гидроксильную функциональную группу). Для квалифицированного специалиста должно быть очевидно, что типичные сложные триэфиры сорбитана могут представлять собой формы соли (например, фармацевтически приемлемых солей) соединений, отвечающих формулам V, Va, Vb или Vc, и их стереоизомеры или позиционные изомеры.
[00133] В отношении стереоизомеров, для квалифицированного специалиста должно быть очевидно, что сложные эфиры сорбитана могут содержать хиральные центры и могут встречаться, например, в виде рацематов, рацемических смесей и в виде отдельных энантиомеров и диастереомеров.
[00134] В вариантах реализации, в которых неионные поверхностно-активные вещества на основе сорбитана представляют собой сложный эфир сорбитана, композиция или состав на основе НЛН обычно содержит, например, от приблизительно 0,1% до приблизительно 15% (масса/объем) сложного эфира сорбитана, от 0,1% до приблизительно 10% (масса/объем) сложного эфира сорбитана, от 0,1% до приблизительно 5% (масса/объем) сложного эфира сорбитана, от приблизительно 0,1% до приблизительно 4 % (масса/объем) сложного эфира сорбитана, от приблизительно 0,1% до приблизительно 4% (масса/объем) сложного эфира сорбитана, от приблизительно 0,1% до приблизительно 2,5% (масса/объем) сложного эфира сорбитана, от приблизительно 0,1% до приблизительно 2% (масса/объем) сложного эфира сорбитана, от 0,1% до приблизительно 1,5% (масса/объем) сложного эфира сорбитана, от 0,1% до приблизительно 1% (масса/объем) сложного эфира сорбитана, от 0,1% до приблизительно 0,5% (масса/объем) сложного эфира сорбитана, от 0,3% до приблизительно 2,5% (масса/объем) сложного эфира сорбитана, от приблизительно 0,3% до приблизительно 2% (масса/объем) сложного эфира сорбитана, от 0,3% до приблизительно 1,5% (масса/объем) сложного эфира сорбитана, от 0,3% до приблизительно 1% (масса/объем) сложного эфира сорбитана, от 0,3% до приблизительно 0,5% (масса/объем) сложного эфира сорбитана или любое другое количество или диапазон, описанные в данной заявке для сложного эфира сорбитана, включая от приблизительно 0,25% до приблизительно 15% сложного эфира сорбитана. В некоторых аспектах композиции на основе НЛН содержат приблизительно 0,1%, приблизительно 0,2%, приблизительно 0,3%, приблизительно 0,4%, приблизительно 0,5%, приблизительно 0,6%, приблизительно 0,7%, приблизительно 0,8%, приблизительно 0,9%, приблизительно 1%, приблизительно 2%, приблизительно 3% или приблизительно 4% (масса/объем) сложного эфира сорбитана. Более высокие или более низкие процентные соотношения масса/объем также предложены в данной заявке, особенно при рассмотрении разбавленных или концентрированных составов.
[00135] Соответственно, если сложный эфир сорбитана представляет собой сложный моноэфир сорбитана (например, спан 60™, спан 80™), композиция или состав на основе НЛН обычно содержит, например, от приблизительно 0,1% до приблизительно 15% (масса/объем) сложного моноэфира сорбитана, от 0,1% до приблизительно 10% (масса/объем) сложного моноэфира сорбитана, от 0,1% до приблизительно 5% (масса/объем) сложного моноэфира сорбитана, от приблизительно 0,1% до приблизительно 4 % (масса/объем) сложного моноэфира сорбитана, от приблизительно 0,1% до приблизительно 4% (масса/объем) сложного моноэфира сорбитана, от приблизительно 0,1% до приблизительно 2,5% (масса/объем) сложного моноэфира сорбитана, от приблизительно 0,1% до приблизительно 2% (масса/объем) сложного моноэфира сорбитана, от 0,1% до приблизительно 1,5% (масса/объем) сложного моноэфира сорбитана, от 0,1% до приблизительно 1% (масса/объем) сложного моноэфира сорбитана, от 0,1% до приблизительно 0,5% (масса/объем) сложного моноэфира сорбитана, от 0,3% до приблизительно 2,5% (масса/объем) сложного моноэфира сорбитана, от приблизительно 0,3% до приблизительно 2% (масса/объем) сложного моноэфира сорбитана, от 0,3% до приблизительно 1,5% (масса/объем) сложного моноэфира сорбитана, от 0,3% до приблизительно 1% (масса/объем) сложного моноэфира сорбитана, от 0,3% до приблизительно 0,5% (масса/объем) сложного моноэфира сорбитана или любое другое количество или диапазон, описанные в данной заявке для сложного моноэфира сорбитана, включая от приблизительно 0,25% до приблизительно 15% сложного моноэфира сорбитана. В некоторых аспектах композиция или состав на основе НЛН содержит приблизительно 0,1%, приблизительно 0,2%, приблизительно 0,3%, приблизительно 0,4%, приблизительно 0,5%, приблизительно 0,6%, приблизительно 0,7%, приблизительно 0,8%, приблизительно 0,9% или приблизительно 1%, приблизительно 2%, приблизительно 3% или приблизительно 4% (масса/объем) сложного моноэфира сорбитана. Более высокие или более низкие процентные соотношения масса/объем также предложены в данной заявке, особенно при рассмотрении разбавленных или концентрированных составов.
[00136] Соответственно, если сложный эфир сорбитана представляет собой сложный диэфир сорбитана, композиция или состав на основе НЛН обычно содержит, например, от приблизительно 0,1% до приблизительно 15% (масса/объем) сложного диэфира сорбитана, от 0,1% до приблизительно 10% (масса/объем) сложного диэфира сорбитана, от 0,1% до приблизительно 5% (масса/объем) сложного диэфира сорбитана, от приблизительно 0,1% до приблизительно 4 % (масса/объем) сложного диэфира сорбитана, от приблизительно 0,1% до приблизительно 4% (масса/объем) сложного диэфира сорбитана, от приблизительно 0,1% до приблизительно 2,5% (масса/объем) сложного диэфира сорбитана, от приблизительно 0,1% до приблизительно 2% (масса/объем) сложного диэфира сорбитана, от 0,1% до приблизительно 1,5% (масса/объем) сложного диэфира сорбитана, от 0,1% до приблизительно 1% (масса/объем) сложного диэфира сорбитана, от 0,1% до приблизительно 0,5% (масса/объем) сложного диэфира сорбитана, от 0,3% до приблизительно 2,5% (масса/объем) сложного диэфира сорбитана, от приблизительно 0,3% до приблизительно 2% (масса/объем) сложного диэфира сорбитана, от 0,3% до приблизительно 1,5% (масса/объем) сложного диэфира сорбитана, от 0,3% до приблизительно 1% (масса/объем) сложного диэфира сорбитана, от 0,3% до приблизительно 0,5% (масса/объем) сложного диэфира сорбитана или любое другое количество или диапазон, описанные в данной заявке для сложного диэфира сорбитана, включая от приблизительно 0,25% до приблизительно 15% сложного диэфира сорбитана. В некоторых аспектах композиция или состав на основе НЛН содержит приблизительно 0,1%, приблизительно 0,2%, приблизительно 0,3%, приблизительно 0,4%, приблизительно 0,5%, приблизительно 0,6%, приблизительно 0,7%, приблизительно 0,8%, приблизительно 0,9% или приблизительно 1%, приблизительно 2%, приблизительно 3% или приблизительно 4% (масса/объем) сложного диэфира сорбитана. Более высокие или более низкие процентные соотношения масса/объем также предложены в данной заявке, особенно при рассмотрении разбавленных или концентрированных составов.
[00137] Соответственно, если сложный эфир сорбитана представляет собой сложный триэфир сорбитана (например, спан 85™ или спан 65™), композиция или состав на основе НЛН обычно содержит, например, от приблизительно 0,1% до приблизительно 15% (масса/объем) сложного триэфира сорбитана, от 0,1% до приблизительно 10% (масса/объем) сложного триэфира сорбитана, от 0,1% до приблизительно 5% (масса/объем) сложного триэфира сорбитана, от приблизительно 0,1% до приблизительно 4 % (масса/объем) сложного триэфира сорбитана, от приблизительно 0,1% до приблизительно 4% (масса/объем) сложного триэфира сорбитана, от приблизительно 0,1% до приблизительно 2,5% (масса/объем) сложного триэфира сорбитана, от приблизительно 0,1% до приблизительно 2% (масса/объем) сложного триэфира сорбитана, от 0,1% до приблизительно 1,5% (масса/объем) сложного триэфира сорбитана, от 0,1% до приблизительно 1% (масса/объем) сложного триэфира сорбитана, от 0,1% до приблизительно 0,5% (масса/объем) сложного триэфира сорбитана, от 0,3% до приблизительно 2,5% (масса/объем) сложного триэфира сорбитана, от приблизительно 0,3% до приблизительно 2% (масса/объем) сложного триэфира сорбитана, от 0,3% до приблизительно 1,5% (масса/объем) сложного триэфира сорбитана, от 0,3% до приблизительно 1% (масса/объем) сложного триэфира сорбитана, от 0,3% до приблизительно 0,5% (масса/объем) сложного триэфира сорбитана или любое другое количество или диапазон, описанные в данной заявке для сложного триэфира сорбитана, включая от приблизительно 0,25% до приблизительно 15% сложного триэфира сорбитана. В некоторых аспектах композиция или состав на основе НЛН содержит приблизительно 0,1%, приблизительно 0,2%, приблизительно 0,3%, приблизительно 0,4%, приблизительно 0,5%, приблизительно 0,6%, приблизительно 0,7%, приблизительно 0,8%, приблизительно 0,9%, приблизительно 1%, приблизительно 2%, приблизительно 3% или приблизительно 4% (масса/объем) сложного триэфира сорбитана. Более высокие или более низкие процентные соотношения масса/объем также предложены в данной заявке, особенно при рассмотрении разбавленных или концентрированных составов.
[00138] В типичных вариантах реализации сложный эфир сорбитана (например, сложный моноэфир, сложный диэфир или сложный триэфир сорбитана) присутствует в количестве, достаточном для повышения способности композиции способствовать доставке и/или экспрессии биоактивного агента (например, РНК) по сравнению с сопоставимой композицией, в которой отсутствует сложный эфир сорбитана (например, сложный моноэфир, сложный диэфир или сложный триэфир сорбитана, соответственно). В вариантах реализации, в которых композицию вводят субъекту в эффективном количестве, указанная композиция может вызывать титры антител к антигену, равные или большие, чем титры антител, вызванные, когда сопоставимую композицию, в которой отсутствует сложный эфир сорбитана, вводят субъекту или когда биоактивный агент вводят субъекту без НЛН. В некоторых вариантах реализации композиция вызывает иммунный ответ (например, титры нейтрализующих антител) у субъекта на более высоком уровне, чем иммунный ответ, вызванный у субъекта сопоставимой композицией, в которой отсутствует сложный эфир сорбитана. Иммунный ответ может представлять собой, например, врожденный, клеточный или гуморальный иммунный ответ. Титры нейтрализующих антител можно определить с помощью любого анализа, известного специалисту в данной области, включая, без ограничения, анализ титра нейтрализации бляшкообразования (Ratnam, S и др. J. Clin. Microbiol (2011), 33 (4): 811-815; Timiryazova, T и др. Am J Trop Med Hyg (2013), 88(5): 962-970).
[00139] D. Поверхностно-активные вещества.
[00140] НЛН, описанные в данной заявке, содержат поверхностно-активное вещество, дополнительно к неионным поверхностно-активным веществам на основе сорбитана (например, сложному эфиру сорбитана). Существует множество поверхностно-активных веществ, специально разработанных и широко используемых в биологических применениях. Такие поверхностно-активные вещества подразделяют на четыре основных типа, и их можно применять в настоящем изобретении: анионный, катионный, цвиттер-ионный и неионный. Особенно полезная группа поверхностно-активных веществ представляет собой гидрофильные неионные поверхностно-активные вещества и, в частности, сложные моноэфиры полиоксиэтиленсорбитана и сложные триэфиры полиоксиэтиленсорбитана. Данные материалы называют полисорбатами, и они доступны для приобретения под торговой маркой твин® (Tween®), и пригодны для получения НЛН. Поверхностно-активные вещества твин®, как правило, имеют значение ГЛБ в диапазоне от 9,6 до 16,7. Поверхностно-активные вещества твин® доступны для приобретения. Другие неионные поверхностно-активные вещества, которые можно применять, представляют собой, например, сложные эфиры жирных кислот полиоксиэтилена, полученные из лауриловых, ацетиловых, стеариловых и олеиловых спиртов, жирные кислоты полиоксиэтилена, полученные путем реакции оксида этилена с длинноцепочечной жирной кислотой, полиоксиэтилен, сложные эфиры жирных кислот и многоатомного спирта, эфиры полиоксиэтилена, эфиры жирных кислот полиоксипропилена, производные пчелиного воска, содержащие полиоксиэтилен, полиоксиэтиленовое производное ланолина, глицериды жирных кислот полиоксиэтилена, сложные эфиры жирных кислот глицерина или другие производные полиоксиэтиленовых жирных кислот, спиртов или эфиров длинноцепочечных жирных кислот, состоящих из 12 - 22 атомов углерода.
[00141] В некоторых вариантах реализации предпочтительно выбрать неионное поверхностно-активное вещество, которое имеет значение ГЛБ в диапазоне приблизительно от 7 до 16. Данное значение можно получить путем применения одного неионного поверхностно-активного вещества, такого как поверхностно-активное вещество твин®, или можно получить путем применения смеси поверхностно-активных веществ. В некоторых вариантах реализации НЛН содержит одно неионное поверхностно-активное вещество, наиболее предпочтительно, поверхностно-активное вещество твин®, в качестве стабилизирующего эмульсию неионного поверхностно-активного вещества. В типичном варианте реализации эмульсия содержит твин® 80, иначе известный как полисорбат 80.
[00142] Композиция или состав на основе НЛН может содержать, например, от приблизительно 0,01% до приблизительно 15% (масса/объем) поверхностно-активного вещества, от приблизительно 0,01% до приблизительно 10% (масса/объем) поверхностно-активного вещества, от приблизительно 0,01% до приблизительно 5% (масса/объем) поверхностно-активного вещества, от приблизительно 0,01% до приблизительно 2,5% поверхностно-активного вещества, от приблизительно 0,01% до приблизительно 2% поверхностно-активного вещества, от 0,01% до приблизительно 1,5% поверхностно-активного вещества, от 0,01% до приблизительно 1% поверхностно-активного вещества, от 0,01% до приблизительно 0,5% поверхностно-активного вещества, от 0,05% до приблизительно 0,5% поверхностно-активного вещества, от 0,08% до приблизительно 0,5% поверхностно-активного вещества, приблизительно 0,08% поверхностно-активного вещества, приблизительно 0,5% поверхностно-активного вещества, приблизительно 0,6% поверхностно-активного вещества, приблизительно 0,7% поверхностно-активного вещества, приблизительно 0,8% поверхностно-активного вещества, приблизительно 0,9% поверхностно-активного вещества, или приблизительно 1% поверхностно-активного вещества, или приблизительно 2%, приблизительно 3%, приблизительно 4% поверхностно-активного вещества, или любое другое количество или диапазон, описанные в данной заявке для поверхностно-активного вещества. Более высокие или более низкие процентные соотношения масса/объем также предложены в данной заявке, особенно при рассмотрении разбавленных или концентрированных составов.
[00143] В НЛН согласно настоящему изобретению можно включить дополнительные компоненты, включая, например, компоненты, которые способствуют образованию НЛН, улучшают образование комплекса между отрицательно заряженными молекулами и катионными частицами, способствуют подходящему высвобождению отрицательно заряженных молекул (таких как молекула РНК) и/или повышают стабильность отрицательно заряженной молекулы (например, чтобы предотвратить деградацию молекулы РНК).
[00144] Водная фаза (непрерывная фаза) НЛН обычно представляет собой буферный солевой раствор (например, солевой раствор) или воду. Буферный солевой раствор обычно представляет собой водный раствор, который содержит соль (например, NaCl), буфер (например, цитратный буфер) и может дополнительно содержать, например, регулирующий осмоляльность агент (например, сахарид), полимер, поверхностно-активное вещество или комбинацию перечисленных агентов. Если эмульсии находятся в составе для парентерального введения, предпочтительно получить конечные буферные растворы таким образом, чтобы тоничность, т.е., осмоляльность, была по существу такой же, как у нормальных физиологических жидкостей, чтобы предотвратить нежелательные последствия после введения, такие как отечность после введения или быстрое всасывание композиции. Также предпочтительно забуферить водную фазу, чтобы поддерживать pH, соответствующий нормальным физиологическим условиям. Также, в некоторых случаях, может потребоваться поддерживать pH на определенном уровне, чтобы гарантировать стабильность некоторых компонентов НЛН. Например, может потребоваться получение изотонических (т.е., с такой же концентрацией проникающего растворенного вещества (например, соли), как и в нормальных клетках организма и крови) и изосмотических НЛН. Для контроля тоничности НЛН может содержать физиологическую соль, такую как соль натрия. В некоторых аспектах хлорид натрия (NaCl), например, можно применять при концентрации приблизительно 0,9% (масса/объем) (физиологический солевой раствор). Другие соли, которые могут присутствовать, включают, например, хлорид калия, однозамещенный фосфорнокислый калий, двузамещенный фосфорнокислый натрий, хлорид магния, хлорид кальция и тому подобные соли. Неионные регулирующие тоничность агенты также можно применять для контроля тоничности. Моносахариды, классифицированные как альдозы, такие как глюкоза, манноза, арабиноза и рибоза, а также моносахариды, классифицированные как кетозы, такие как фруктоза, сорбоза и ксилулоза, можно применять в качестве неионных регулирующих тоничность агентов в настоящем изобретении. Также можно применять дисахариды, такие как сахароза, мальтоза, трегалоза и лактоза. Кроме того, альдиты (ациклические полигидроксиспирты, также называемые сахарными спиртами), такие как глицерин, маннит, ксилит и сорбит, представляют собой неионные регулирующие тоничность агенты, которые могут быть полезны в настоящем изобретении. Неионные модифицирующие тоничность агенты могут присутствовать, например, в концентрации от приблизительно 0,1% до приблизительно 10% или от приблизительно 1% до приблизительно 10%, в зависимости от конкретного применяемого агента.
[00145] Водную фазу можно забуферить. В данной заявке можно применять любой физиологически приемлемый буфер, такой как вода, цитратные буферы, фосфатные буферы, ацетатные буферы, Трис-буферы, бикарбонатные буферы, карбонатные буферы, сукцинатный буфер или тому подобные буферы. pH водного компонента предпочтительно будет находиться в диапазоне 4,0 - 8,0 или от приблизительно 4,5 до приблизительно 6,8. В другом типичном варианте реализации водная фаза представляет собой воду, не содержащую РНКаз, или воду, обработанную диэтилпирокарбонатом (ДЭПК), или буфер получают с применением такой воды. В некоторых случаях высокая концентрация соли в буфере может препятствовать образованию комплекса отрицательно заряженной молекулы с частицей эмульсии, следовательно, ее избегают. В других случаях можно включить некоторое количество соли в буфер.
[00146] В типичном варианте реализации буфер представляет собой 10 мМ цитратный буфер (например, цитрат натрия) с pH приблизительно от 5,0 до 8,0. В другом типичном варианте реализации водная фаза представляет собой воду, не содержащую РНКаз, или воду, обработанную ДЭПК, или буфер получают с применением такой воды. В других типичных вариантах реализации композиции согласно настоящему изобретению не содержат цитратный буфер.
[00147] Водная фаза также может содержать дополнительные компоненты, такие как молекулы, которые изменяют осмолярность водной фазы, или молекулы, которые стабилизируют отрицательно заряженную молекулу после комплексообразования. Предпочтительно осмолярность водной фазы регулируют, применяя неионный регулирующий тоничность агент, такой как сахар (например, трегалоза, сахароза, декстроза, фруктоза, восстановленная палатиноза и т.д.), сахарный спирт (такой как маннит, сорбит, ксилит, эритрит, лактит, мальтит, глицерин и т.д.) или комбинации перечисленных агентов. При необходимости можно применять неионный полимер (например, поли(алкилгликоль), такой как полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль или полибутиленгликоль) или неионное поверхностно-активное вещество.
[00148] E. Соотношения масло:поверхностно-активное вещество.
[00149] Типичные НЛН состоят из гидрофобной сердцевины, содержащей жидкое масло и твердый липид, и поверхностно-активных веществ (также известных как эмульгаторы или эмульгирующие агенты), которые составляют граничный слой, отделяющий гидрофобную фазу - жидкое масло и твердый липид, в совокупности называемые в данной заявке маслом - от водной фазы. Поскольку поверхностно-активные вещества обычно находятся на поверхности наночастиц НЛН, их количество определяет общую доступную площадь поверхности. С другой стороны, масло находится в сердцевине и, главным образом, вносит вклад в общий доступный объем. Возрастающее отношение поверхностно-активного вещества к маслу, следовательно, увеличивает отношение площади поверхности (ПП) к объему (О); таким образом, для фиксированного объема материала возрастающее отношение ПП/О приводит к уменьшению диаметра частицы НЛН. Вместо или в дополнение к описанию типичных композиций НЛН в процентных отношениях массы к объему различных компонентов, их можно описать в молярных соотношениях различных компонентов. В некоторых аспектах у типичных НЛН согласно настоящему изобретению молярное отношение масла к поверхностно-активному веществу составляет от приблизительно 0,05 до приблизительно 12, или от приблизительно 0,05 до приблизительно 9, или от приблизительно 0,05 до приблизительно 8, или от приблизительно 0,05 до приблизительно 1, или от приблизительно 0,1 до приблизительно 1. Авторы настоящего изобретения продемонстрировали, что путем уменьшения молярного отношения масла к поверхностно-активному веществу можно синтезировать НЛН меньшего размера. Кроме того, путем уменьшения количества масла в частицах НЛН можно уменьшить потенциальную токсичность указанных составов. В других аспектах у типичных НЛН согласно настоящему изобретению молярное отношение масла к поверхностно-активному веществу составляет от приблизительно 0,5 до приблизительно 12, от приблизительно 0,5 до приблизительно 9, от 1 до приблизительно 9, от приблизительно 2 до приблизительно 9, от приблизительно 3 до приблизительно 9, от приблизительно 4 до приблизительно 9, от приблизительно 4,5 до приблизительно 9, или от приблизительно 4,5 или приблизительно 5 до приблизительно 7. У типичных составов молярное отношение масла к поверхностно-активному веществу составляет приблизительно 0,5, приблизительно 1, приблизительно 1,5, приблизительно 2, приблизительно 2,5, приблизительно 3, приблизительно 3,5, приблизительно 4, приблизительно 4,5, приблизительно 5, приблизительно 5,5, приблизительно 6, приблизительно 7, приблизительно 8, приблизительно 9, приблизительно 10, приблизительно 11 или приблизительно 12. В данной заявке молярное отношение масла к поверхностно-активному веществу определяют путем (i) сложения молей липида, который составляет масляную сердцевину (твердофазного липида и жидкофазного липида), чтобы получить значение для молей липида масляной сердцевины (ii), сложения молей катионного компонента (например, ДОТАП), гидрофобного поверхностно-активного вещества (например, сложного эфира сорбитана) и гидрофильного поверхностно-активного вещества (ТВИН 80), чтобы получить значение для молей поверхностно-активного вещества, и (iii) деления молей липида масляной сердцевины на моли поверхностно-активного вещества.
[00150] F. Соотношения гидрофильное поверхностно-активное вещество:катионный компонент.
[00151] Авторы настоящего изобретения обнаружили, что отношение гидрофильного поверхностно-активного вещества к катионному компоненту может влиять на способность НЛН оказывать защитное действие от разрушения РНКазами и может влиять на иммуногенность составов. В частности, авторы настоящего изобретения обнаружили, что отношения твин:ДОТАП, приблизительно равные 0,6, являются оптимальными для получения надежных результатов доставки и экспрессии биоактивных агентов на основе РНК, тогда как отношения твин:ДОТАП, приблизительно равные 2,0 и выше, не являются в той же степени оптимальными для получения такой надежности. Соответственно, у типичных НЛН согласно настоящему изобретению отношение гидрофильное поверхностно-активное вещество:катионный компонент (например, катионный липид) составляет от приблизительно 0,2 до приблизительно 1,5, от приблизительно 0,2 до приблизительно 1 или от приблизительно 0,5 до приблизительно 1. Если в композиции используют твин и ДОТАП, то у типичных НЛН согласно настоящему изобретению отношение твин:ДОТАП составляет от приблизительно 0,2 до приблизительно 1,5, от приблизительно 0,2 до приблизительно 1 или от приблизительно 0,5 до приблизительно 1. В данной заявке отношение гидрофильное поверхностно-активное вещество:катионный компонент определяют путем (i) сложения молей гидрофильного поверхностно-активного вещества, чтобы получить значение для молей гидрофильного поверхностно-активного вещества, (ii) сложения молей катионного компонента, чтобы получить значение для молей катионного компонента, и (iii) деления молей гидрофильного поверхностно-активного вещества на моли катионного компонента.
[00152] G. Емкости загрузки.
[00153] Авторы настоящего изобретения обнаружили, что емкость загрузки составов НЛН можно регулировать, изменяя отношение гидрофильного поверхностно-активного вещества к катионному компоненту и количество масла, присутствующего в составах, тем самым уменьшая средний размер частиц НЛН. У типичных составов НЛН емкость загрузки РНК составляет по меньшей мере приблизительно 10 мкг РНК/мл, по меньшей мере приблизительно 20 мкг РНК/мл, по меньшей мере приблизительно 50 мкг РНК/мл, по меньшей мере приблизительно 100 мкг РНК/мл, по меньшей мере приблизительно 200 мкг РНК/мл, по меньшей мере приблизительно 300 мкг РНК/мл или по меньшей мере приблизительно 400 мкг РНК/мл. Составы НЛН со средним размером частиц от 20 нм до приблизительно 110 нм, от приблизительно 20 нм до приблизительно 80 нм, от приблизительно 20 нм до приблизительно 70 нм, от приблизительно 20 нм до приблизительно 60 нм обычно имеют повышенную емкость загрузки.
[00154] H. Типичные наноструктурированные носители и их процентные соотношения (масса/объем).
[00155] В выбранных типичных вариантах реализации композиция НЛН содержит от приблизительно 0,2% до приблизительно 40% (масса/объем) жидкофазного липида, от приблизительно 0,02% до приблизительно 10% (масса/объем) твердофазного липида, от приблизительно 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем) катионного липида, от приблизительно 0,25% до приблизительно 5% (масса/объем) гидрофобного поверхностно-активного вещества (например, сложного эфира сорбитана) и от приблизительно 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем), от приблизительно 0,2% до приблизительно 5% (масса/объем), от приблизительно 0,5% до приблизительно 5% (масса/объем) или от приблизительно 0,5% до приблизительно 10% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества. Данную композицию НЛН называют в данной заявке составом A. В любом аспекте состава A гидрофильное поверхностно-активное вещество может присутствовать в концентрации от 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем), от 0,2% до приблизительно 5% (масса/объем), от 0,5% до приблизительно 5% (масса/объем) или от приблизительно 0,5% до приблизительно 10% (масса/объем).
[00156] В выбранных типичных вариантах реализации композиция НЛН содержит от приблизительно 0,2% до приблизительно 40% (масса/объем) жидкофазного липида, от приблизительно 0,1% до приблизительно 10% (масса/объем) твердофазного липида, от приблизительно 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем) катионного липида, от приблизительно 0,25% до приблизительно 5% (масса/объем) гидрофобного поверхностно-активного вещества (например, сложного эфира сорбитана) и от приблизительно 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем), от приблизительно 0,2% до приблизительно 5% (масса/объем), от приблизительно 0,5% до приблизительно 5% (масса/объем) или от приблизительно 0,5% до приблизительно 10% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества. Данную композицию НЛН называют в данной заявке составом B. В любом аспекте состава B гидрофильное поверхностно-активное вещество может присутствовать в концентрации от 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем), от 0,2% до приблизительно 5% (масса/объем), от 0,5% до приблизительно 5% (масса/объем) или от приблизительно 0,5% до приблизительно 10% (масса/объем).
[00157] В выбранных типичных вариантах реализации композиция НЛН содержит от приблизительно 0,2% до приблизительно 1% (масса/объем) жидкофазного липида, от приблизительно 0,02% до приблизительно 1% (масса/объем) твердофазного липида, от приблизительно 2% до приблизительно 10% (масса/объем) катионного липида, от приблизительно 2% до приблизительно 5% (масса/объем) сложного эфира сорбитана и от приблизительно 2% до приблизительно 5% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества. Данную композицию НЛН называют в данной заявке составом C.
[00158] В выбранных типичных вариантах реализации композиция НЛН содержит от приблизительно 2% до приблизительно 40% (масса/объем) жидкофазного липида, от приблизительно 0,1% до приблизительно 10% (масса/объем) твердофазного липида, от приблизительно 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем) катионного липида, от приблизительно 0,25% до приблизительно 5% (масса/объем) гидрофобного поверхностно-активного вещества (например, сложного эфира сорбитана) и от приблизительно 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем), от приблизительно 0,2% до приблизительно 5% (масса/объем), от приблизительно 0,5% до приблизительно 5% (масса/объем) или от приблизительно 0,5% до приблизительно 10% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества. Данную композицию НЛН называют в данной заявке составом D. В любом аспекте состава D гидрофильное поверхностно-активное вещество может присутствовать в концентрации от 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем), от 0,2% до приблизительно 5% (масса/объем), от приблизительно 0,5% до приблизительно 5% (масса/объем) или от приблизительно 0,5% до приблизительно 10% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества.
[00159] В выбранных типичных вариантах реализации композиция НЛН содержит от приблизительно 2% до приблизительно 10% (масса/объем) жидкофазного липида, от приблизительно 0,1% до приблизительно 10% (масса/объем) твердофазного липида, от приблизительно 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем) катионного липида, от приблизительно 0,25% до приблизительно 5% (масса/объем) сложного эфира сорбитана и от приблизительно 0,2% до приблизительно 10% или от приблизительно 0,2% до приблизительно 5% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества. Данную композицию НЛН называют в данной заявке составом E. В любом аспекте состава E гидрофильное поверхностно-активное вещество может присутствовать в концентрации от 0,2% до приблизительно 10% или от приблизительно 0,2% до приблизительно 5% (масса/объем).
[00160] В выбранных типичных вариантах реализации композиция НЛН содержит от приблизительно 2% до приблизительно 10% (масса/объем) жидкофазного липида, от приблизительно 0,1% до приблизительно 3% (масса/объем) твердофазного липида, от приблизительно 1% до приблизительно 5% (масса/объем) катионного липида, от приблизительно 1% до приблизительно 5% (масса/объем) сложного эфира сорбитана и от приблизительно 1% до приблизительно 5% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества. Данную композицию НЛН называют в данной заявке составом F.
[00161] В выбранных типичных вариантах реализации композиция НЛН содержит от приблизительно 2% до приблизительно 5% (масса/объем) жидкофазного липида, от приблизительно 0,1% до приблизительно 2% (масса/объем) твердофазного липида, от приблизительно 2% до приблизительно 5% (масса/объем) катионного липида, от приблизительно 2% до приблизительно 5% (масса/объем) сложного эфира сорбитана и от приблизительно 2% до приблизительно 5% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества. Данную композицию НЛН называют в данной заявке составом G.
[00162] В выбранных типичных вариантах реализации композиция НЛН содержит от приблизительно 2% до приблизительно 10% (масса/объем) жидкофазного липида, от приблизительно 0,1% до приблизительно 3% (масса/объем) твердофазного липида, от приблизительно 0,2% до приблизительно 2% (масса/объем) катионного липида, от приблизительно 0,25% до приблизительно 2% (масса/объем) сложного эфира сорбитана и от приблизительно 0,2% до приблизительно 5% (масса/объем) или от приблизительно 0,5% до приблизительно 5% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества. Данную композицию НЛН называют в данной заявке составом H. В любом аспекте состава H гидрофильное поверхностно-активное вещество может присутствовать в концентрации от приблизительно 0,2% до приблизительно 5% (масса/объем) или от приблизительно 0,5% до приблизительно 5% (масса/объем).
[00163] В выбранных типичных вариантах реализации композиция НЛН содержит от приблизительно 2% до приблизительно 6% (масса/объем) жидкофазного липида, от приблизительно 0,1% до приблизительно 1% (масса/объем) твердофазного липида, от приблизительно 0,2% до приблизительно 1% (масса/объем) катионного липида, от приблизительно 0,25% до приблизительно 1% (масса/объем) сложного эфира сорбитана и от приблизительно 0,2% до приблизительно 5% (масса/объем) или от приблизительно 0,5% до приблизительно 5% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества. Данную композицию НЛН называют в данной заявке составом I. В любом аспекте состава I гидрофильное поверхностно-активное вещество может присутствовать в концентрации от приблизительно 0,2% до приблизительно 5% (масса/объем) или от приблизительно 0,5% до приблизительно 5% (масса/объем).
[00164] В выбранных типичных вариантах реализации композиция НЛН содержит от приблизительно 2% до приблизительно 6% (масса/объем) жидкофазного липида, от приблизительно 0,1% до приблизительно 1% (масса/объем) твердофазного липида, от приблизительно 0,2% до приблизительно 1% (масса/объем) катионного липида, от приблизительно 0,25% до приблизительно 1% (масса/объем) сложного эфира сорбитана и от приблизительно 0,2% до приблизительно 2 % (масса/объем) или от приблизительно 0,2% до приблизительно 1% гидрофильного поверхностно-активного вещества. Данную композицию НЛН называют в данной заявке составом J.
[00165] В выбранных типичных вариантах реализации композиция НЛН содержит от приблизительно 2% до приблизительно 6% (масса/объем) жидкофазного липида, от приблизительно 0,1% до приблизительно 1% (масса/объем) твердофазного липида, от приблизительно 0,2% до приблизительно 1% (масса/объем) катионного липида, от приблизительно 0,25% до приблизительно 1% (масса/объем) сложного эфира сорбитана и от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,5% или от 0,2% до приблизительно 1% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества. Данную композицию НЛН называют в данной заявке составом K. В любом аспекте состава K гидрофильное поверхностно-активное вещество может присутствовать в концентрации от приблизительно 0,2% до приблизительно 0,5% или от 0,2% до приблизительно 1% (масса/объем).
[00166] В выбранных типичных вариантах реализации композиция НЛН содержит от приблизительно 10% до приблизительно 40% (масса/объем) жидкофазного липида, от приблизительно 1% до приблизительно 2 % твердофазного липида, от приблизительно 2 % до приблизительно 5% катионного липида, от приблизительно 3 до приблизительно 5% (масса/объем) сложного эфира сорбитана и от приблизительно 3% до приблизительно 5% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества. Данную композицию НЛН называют в данной заявке составом L.
[00167] В выбранных типичных вариантах реализации композиция НЛН содержит от приблизительно 10% до приблизительно 20% (масса/объем) жидкофазного липида, от приблизительно 0,5% до приблизительно 1,5% твердофазного липида, от приблизительно 3% до приблизительно 4% катионного липида, от приблизительно 3% до приблизительно 4% (масса/объем) сложного эфира сорбитана и от приблизительно 3% до приблизительно 5% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества. Данную композицию НЛН называют в данной заявке составом M.
[00168] В выбранных типичных вариантах реализации композиция НЛН содержит приблизительно 15% (масса/объем) жидкофазного липида, приблизительно 1% твердофазного липида, приблизительно 3% катионного липида, приблизительно 3,7% (масса/объем) сложного эфира сорбитана и приблизительно 3,7% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества. Данную композицию НЛН называют в данной заявке составом N.
[00169] В выбранных типичных вариантах реализации композиция НЛН содержит приблизительно 30% (масса/объем) жидкофазного липида, приблизительно 1,8% твердофазного липида, приблизительно 3% катионного липида, приблизительно 3,7% (масса/объем) сложного эфира сорбитана и приблизительно 3,7% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества. Данную композицию НЛН называют в данной заявке составом O.
[00170] В выбранных типичных вариантах реализации композиция НЛН содержит от приблизительно 3% до приблизительно 4% (масса/объем) жидкофазного липида, от приблизительно 0,2% до приблизительно 1% твердофазного липида, от приблизительно 3% до приблизительно 5% катионного липида, от приблизительно 3% до приблизительно 5% сложного эфира сорбитана и от приблизительно 3 до приблизительно 5% гидрофильного поверхностно-активного вещества. Данную композицию НЛН называют в данной заявке составом P.
[00171] В выбранных типичных вариантах реализации композиция НЛН содержит от приблизительно 0,2 % до приблизительно 40% (масса/объем) жидкофазного липида, от приблизительно 0,1% до приблизительно 10% (масса/объем) твердофазного липида, от приблизительно 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем) катионного липида, от приблизительно 0,25% до приблизительно 15% (масса/объем) сложного моноэфира сорбитана и от приблизительно 0,5% до приблизительно 15% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества. Данную композицию НЛН называют в данной заявке составом Q.
[00172] В выбранных типичных вариантах реализации композиция НЛН содержит приблизительно 4% (масса/объем) жидкофазного липида, приблизительно 0,25% (масса/объем) твердофазного липида, приблизительно 0,4% (масса/объем) катионного липида, приблизительно 0,5% (масса/объем) сложного эфира сорбитана, и приблизительно 2% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества. Данную композицию НЛН называют в данной заявке составом R.
[00173] В выбранных типичных вариантах реализации композиция НЛН содержит приблизительно 4% (масса/объем) жидкофазного липида, приблизительно 0,25% (масса/объем) твердофазного липида, приблизительно 0,4% (масса/объем) катионного липида, приблизительно 0,5% (масса/объем) сложного эфира сорбитана и приблизительно 0,5% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества. Данную композицию НЛН называют в данной заявке составом S.
[00174] В выбранных типичных вариантах реализации композиция НЛН содержит приблизительно 3,75% (масса/объем) жидкофазного липида, приблизительно 0,25% (масса/объем) твердофазного липида, приблизительно 3% (масса/объем) катионного липида, приблизительно 3,7% (масса/объем) сложного эфира сорбитана и приблизительно 3,7% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества. Данную композицию НЛН называют в данной заявке составом T.
[00175] В выбранных типичных вариантах реализации композиция НЛН содержит приблизительно 3,75% (масса/объем) жидкофазного липида, приблизительно 0,25% (масса/объем) твердофазного липида, приблизительно 1,5% (масса/объем) катионного липида, приблизительно 3,7% (масса/объем) сложного эфира сорбитана и приблизительно 1,5% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества. Данную композицию НЛН называют в данной заявке составом U.
[00176] В выбранных типичных вариантах реализации композиция НЛН содержит приблизительно 4,75% (масса/объем) жидкофазного липида, приблизительно 0,25% (масса/объем) твердофазного липида, приблизительно 0,5% (масса/объем) катионного липида, приблизительно 0,5% (масса/объем) сложного эфира сорбитана и приблизительно 0,4% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества. Данную композицию НЛН называют в данной заявке составом V.
[00177] В выбранных типичных вариантах реализации композиция НЛН содержит от приблизительно 0,2% до приблизительно 40% (масса/объем) жидкофазного липида, от приблизительно 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем) катионного липида, от приблизительно 0,25% до приблизительно 5% (масса/объем) гидрофобного поверхностно-активного вещества (например, сложного эфира сорбитана) и от приблизительно 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем), от приблизительно 0,2% до приблизительно 5% (масса/объем), от приблизительно 0,5% до приблизительно 5% (масса/объем) или от приблизительно 0,5% до приблизительно 10% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества. Данную композицию НЛН называют в данной заявке составом W. В любом аспекте состава W гидрофильное поверхностно-активное вещество может присутствовать в концентрации от 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем), от 0,2% до приблизительно 5% (масса/объем), от 0,5% до приблизительно 5% (масса/объем) или от приблизительно 0,5% до приблизительно 10% (масса/объем).
[00178] Для квалифицированного специалиста должно быть очевидно, что любые из композиций/составов НЛН, описанных в данной заявке, включая составы от A до W, можно разбавить или концентрировать для применения в настоящем изобретении. Например, при смешивании с биоактивным агентом для доставки, состав может быть разбавлен в процессе смешивания. Композиции/составы НЛН можно разбавить, например, 1:2. Все из композиций/составов НЛН, описанных в данной заявке, можно разбавить, например, в от приблизительно 2 до приблизительно 500 раз, предпочтительно в от приблизительно 2 до приблизительно 100 раз. Обычно, но не всегда, разбавление происходит при смешивании состава с биоактивным агентом (например, РНК или ДНК) для доставки. Они могут быть разбавлены, например, приблизительно в 2 раза, приблизительно в 3 раза, приблизительно в 4 раза, приблизительно в 5 раз, приблизительно в 6 раз, приблизительно в 7 раз, приблизительно в 8 раз, приблизительно в 9 раз, приблизительно в 10 раз, приблизительно в 15 раз, приблизительно в 20 раз, приблизительно в 25 раз, приблизительно в 30 раз, приблизительно в 100 раз или приблизительно в 500 раз. Квалифицированному практикующему специалисту будет понятно, что разбавленный состав согласно настоящему изобретению будет содержать сниженную концентрацию жидкофазного липида, твердофазного липида, катионного компонента, гидрофобного поверхностно-активного вещества (например, сложного эфира сорбитана) и поверхностно-активного вещества (например, гидрофильного поверхностно-активного вещества), тем не менее, отношение жидкофазного липида к твердофазному липиду, к катионному компоненту, к гидрофобному поверхностно-активному веществу (например, сложному эфиру сорбитана), к поверхностно-активному веществу будет оставаться таким же. В соответствии с настоящим изобретением предложены не только составы от A до W, но и разбавленные варианты составов от A до W. В некоторых случаях именно разбавленные составы связываются (например, образуют комплекс) с биоактивным агентом. Например, особенно предпочтительный состав представляет собой состав S или состав T, разбавленный в 2 раза. Такой разбавленный состав S содержит приблизительно 2% (масса/объем) жидкофазного липида, приблизительно 0,13% (масса/объем) твердофазного липида, приблизительно 0,2% (масса/объем) катионного липида, приблизительно 0,25% (масса/объем) сложного эфира сорбитана и приблизительно 0,25% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества. Такой разбавленный состав T содержит приблизительно 1,88 % (масса/объем) жидкофазного липида, приблизительно 0,13% (масса/объем) твердофазного липида, приблизительно 1,5% (масса/объем) катионного липида, приблизительно 1,85% (масса/объем) сложного эфира сорбитана и приблизительно 1,85% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества.
[00179] В качестве альтернативы композиции/составы могут быть концентрированными, например, в от приблизительно 2 до приблизительно 30 раз, предпочтительно в от приблизительно 2 до приблизительно 20 раз. Их можно концентрировать, например, приблизительно в 2 раза, приблизительно в 3 раза, приблизительно в 4 раза, приблизительно в 5 раз, приблизительно в 6 раз, приблизительно в 7 раз, приблизительно в 8 раз, приблизительно в 9 раз, приблизительно в 10 раз, приблизительно в 15 раз, приблизительно в 20 раз, приблизительно в 25 раз или приблизительно в 30 раз. Соответственно, в соответствии с настоящим изобретением предложены не только составы от A до W, но и концентрированные варианты составов от A до U.
[00180] На любой из составов НЛН согласно настоящему изобретению, включая составы с A по V, включая разбавленные и концентрированные составы от A до V, могут распространяться следующие утверждения и любая комбинация следующих утверждений: (i) сложный эфир сорбитана представляет собой сложный моноэфир, сложный диэфир или сложный триэфир сорбитана; (ii) сложный эфир сорбитана представляет собой сложный моноэфир сорбитана, выбранный из сорбитана моностеарата, или сорбитана моноолеата, или сорбитана монолаурата или сложного триэфира сорбитана, выбранного из сорбитана триолеата или сорбитана тристеарата; (iii) жидкофазный липид представляет собой сквален; (iv) твердофазный липид представляет собой глицеролипид; (v) твердофазный липид представляет собой микрокристаллический триглицерид; (vi) твердофазный липид представляет собой тримиристин; (vii) катионный липид представляет собой ДОТАП; (viii) гидрофильное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80 (также обозначают твин 80); (ix) сложный эфир сорбитана представляет собой сложный моноэфир, жидкофазный липид представляет собой сквален; и твердофазный липид представляет собой глицеролипид; (x) сложный эфир сорбитана представляет собой сложный моноэфир, жидкофазный липид представляет собой сквален; твердофазный липид представляет собой глицеролипид; катионный липид представляет собой ДОТАП и гидрофильное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80; (xi) сложный эфир сорбитана представляет собой сорбитана моностеарат, или сорбитана моноолеат, или сорбитана монолаурат, жидкофазный липид представляет собой сквален; твердофазный липид представляет собой тримиристин; катионный липид представляет собой ДОТАП и гидрофильное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80; (xii) сложный эфир сорбитана представляет собой сложный триэфир, жидкофазный липид представляет собой сквален; и твердофазный липид представляет собой глицеролипид; (xiii) сложный эфир сорбитана представляет собой сложный триэфир, жидкофазный липид представляет собой сквален; твердофазный липид представляет собой глицеролипид; катионный липид представляет собой ДОТАП и гидрофильное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80; (xiv) сложный эфир сорбитана представляет собой сорбитана триолеат или сорбитана тристеарат, жидкофазный липид представляет собой сквален; твердофазный липид представляет собой тримиристин; катионный липид представляет собой ДОТАП и гидрофильное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80.
[00181] В соответствии с настоящим изобретением также предложены составы от A до Q, включая составы, указанные выше в абзаце [00180], в которых отношение масла к поверхностно-активному веществу составляет от приблизительно 0,05 до приблизительно 12, или от приблизительно 0,05 до приблизительно 9, или от приблизительно 0,05 до приблизительно 8, или от приблизительно 0,05 до приблизительно 1, или от приблизительно 0,1 до приблизительно 1. Также предложены составы от A до Q, включая составы, указанные выше в абзаце [00180], в которых молярное отношение масла к поверхностно-активному веществу составляет от приблизительно 0,5 до приблизительно 12, от приблизительно 1 до приблизительно 9, от приблизительно 2 до приблизительно 9, от приблизительно 3 до приблизительно 9, от приблизительно 4 до приблизительно 9, от приблизительно 4,5 до приблизительно 9, или от приблизительно 4,5 или приблизительно 5 до приблизительно 7.
[00182] В соответствии с настоящим изобретением предложены составы от A до Q, включая составы, указанные выше, в которых отношение гидрофильное поверхностно-активное вещество:катионный компонент (например, катионный липид) составляет от приблизительно 0,2 до приблизительно 1 или от приблизительно 0,5 до приблизительно 1.
[00183] Соответственно, некоторые типичные композиции НЛН представляют собой составы A, B или Q, разбавленные или концентрированные, с молярным отношением масла к поверхностно-активному веществу, равным от приблизительно 0,5 до приблизительно 12, от приблизительно 1 до приблизительно 9, от приблизительно 2 до приблизительно 9, от приблизительно 3 до приблизительно 9, от приблизительно 4 до приблизительно 9, от приблизительно 4,5 до приблизительно 9 или от приблизительно 4,5 или приблизительно 5 до приблизительно 7, и с отношением гидрофильное поверхностно-активное вещество:катионный компонент (например, катионный липид), составляющим от приблизительно 0,2 до приблизительно 1,5.
[00184] Соответственно, некоторые типичные композиции НЛН представляют собой составы A, B или Q, разбавленные или концентрированные, с молярным отношением масла к поверхностно-активному веществу, равным от приблизительно 0,5 до приблизительно 12, от приблизительно 1 до приблизительно 9, от приблизительно 2 до приблизительно 9, от приблизительно 3 до приблизительно 9, от приблизительно 4 до приблизительно 9, от приблизительно 4,5 до приблизительно 9 или от приблизительно 4,5 или приблизительно 5 до приблизительно 7, и с отношением гидрофильное поверхностно-активное вещество:катионный компонент (например, катионный липид), составляющим от приблизительно 0,2 до приблизительно 1.
[00185] Некоторые типичные композиции НЛН представляют собой составы A, B или Q, разбавленные или концентрированные, с молярным отношением масла к поверхностно-активному веществу, равным от приблизительно 0,5 до приблизительно 12, от приблизительно 1 до приблизительно 9, от приблизительно 2 до приблизительно 9, от приблизительно 3 до приблизительно 9, от приблизительно 4 до приблизительно 9, от приблизительно 4,5 до приблизительно 9 или от приблизительно 4,5 или приблизительно 5 до приблизительно 7, и с отношением гидрофильное поверхностно-активное вещество:катионный компонент (например, катионный липид), составляющим от приблизительно 0,5 до приблизительно 1.
[00186] Некоторые типичные композиции НЛН представляют собой составы A, B или Q, разбавленные или концентрированные, с молярным отношением масла к поверхностно-активному веществу, равным от 0,05 до приблизительно 12, или от приблизительно 0,05 до приблизительно 9, или от приблизительно 0,05 до приблизительно 8, или от приблизительно 0,05 до приблизительно 1, или от приблизительно 0,1 до приблизительно 1, и с отношением гидрофильное поверхностно-активное вещество:катионный компонент (например, катионный липид), составляющим от приблизительно 0,5 до приблизительно 1,5.
[00187] Некоторые типичные композиции НЛН представляют собой составы A, B или Q, разбавленные или концентрированные, с молярным отношением масла к поверхностно-активному веществу, равным от 0,05 до приблизительно 12, или от приблизительно 0,05 до приблизительно 9, или от приблизительно 0,05 до приблизительно 8, или от приблизительно 0,05 до приблизительно 1, или от приблизительно 0,1 до приблизительно 1, и с отношением гидрофильное поверхностно-активное вещество:катионный компонент (например, катионный липид), составляющим от приблизительно 0,5 до приблизительно 1.
[00188] В соответствии с настоящим изобретением предложены составы от A до W, включая все составы, описанные в абзацах с [00180] по [00187], в которых средний диаметр частиц НЛН составляет от приблизительно 40 нм или 50 нм до приблизительно 80 нм, от приблизительно 40 нм или 50 нм до приблизительно 70 нм, от приблизительно 40 нм или 50 нм до приблизительно 60 нм.
[00189] III. Физико-химические свойства наноструктурированных липидных носителей.
[00190] A. Размер.
[00191] Размер НЛН можно оценить с помощью известных в данной области методик, включая, но не ограничиваясь перечисленными: рентгеновскую и лазерную дифракцию, динамическое рассеяние света (ДРС), криогенную электронную микроскопию (CryoEM) или Malvern Zetasize. В некоторых вариантах реализации размер НЛН относится к Z-среднему диаметру.
[00192] Средний диаметр (т.е. среднечисловой диаметр) НЛН составляет 1 микрометр или менее. Особенно желательно, чтобы средний размер частиц (т.е., среднечисловой диаметр) НЛН составлял приблизительно 900 нм или менее, приблизительно 800 нм или менее, приблизительно 700 нм или менее, приблизительно 600 нм или менее, приблизительно 500 нм или менее, приблизительно 400 нм или менее, 300 нм или менее, 200 нм или менее, 100 нм или менее или 80 нм или менее, например, от приблизительно 50 нм до приблизительно 900 нм, от приблизительно 50 нм до приблизительно 800 нм, от приблизительно 50 нм до приблизительно 700 нм, от приблизительно 50 нм до приблизительно 600 нм, от приблизительно 50 нм до приблизительно 500 нм, от приблизительно 50 нм до приблизительно 400 нм, от приблизительно 50 нм до приблизительно 300 нм, от приблизительно 50 нм до приблизительно 200 нм, от приблизительно 50 нм до приблизительно 175 нм, от приблизительно 50 нм до приблизительно 150 нм, от приблизительно 50 нм до приблизительно 125 нм, от приблизительно 50 нм до приблизительно 100 нм, от приблизительно 50 нм до приблизительно 80 нм, от приблизительно 40 нм до приблизительно 80 нм, от приблизительно 20 нм до приблизительно 80 нм, от приблизительно 40 нм до приблизительно 80 нм или от приблизительно 40 нм до приблизительно 60 нм. Квалифицированному практику будет понятно, что НЛН состоит из частиц НЛН. Средний размер частиц относится к среднему диаметру частиц, из которых состоит НЛН. Средний диаметр частиц НЛН обычно составляет приблизительно 40 нм, составляет приблизительно 60 нм, составляет приблизительно 80 нм, составляет приблизительно 85 нм, составляет приблизительно 90 нм, составляет приблизительно 95 нм, составляет приблизительно 100 нм, составляет приблизительно 105 нм, составляет приблизительно 110 нм, составляет приблизительно 115 нм, составляет приблизительно 120 нм, составляет приблизительно 125 нм, составляет приблизительно 130 нм, составляет приблизительно 135 нм, составляет приблизительно 140 нм, составляет приблизительно 145 нм, составляет приблизительно 150 нм, составляет приблизительно 155 нм, составляет приблизительно 160 нм, составляет приблизительно 165 нм, составляет приблизительно 170 нм, составляет приблизительно 175 нм, составляет приблизительно 180 нм, составляет приблизительно 185 нм, составляет приблизительно 190 нм, составляет приблизительно 195 нм или составляет приблизительно 200 нм.
[00193] В некоторых аспектах средний диаметр частиц НЛН составляет от приблизительно 20 нм до приблизительно 200 нм, от приблизительно 20 нм до приблизительно 150 нм, от приблизительно 20 нм до приблизительно 110 нм, от приблизительно 20 нм до приблизительно 80 нм, от приблизительно 20 нм до приблизительно 70 нм, от приблизительно 20 нм до приблизительно 60 нм.
[00194] В некоторых аспектах средний диаметр частиц НЛН составляет от приблизительно 50 нм до приблизительно 200 нм, от приблизительно 50 нм до приблизительно 150 нм, от приблизительно 50 нм до приблизительно 110 нм, от приблизительно 50 нм до приблизительно 80 нм, от приблизительно 50 нм до приблизительно 70 нм, от приблизительно 50 нм до приблизительно 60 нм.
[00195] В некоторых аспектах средний диаметр частиц НЛН составляет от приблизительно 40 нм до приблизительно 80 или от приблизительно 40 нм до приблизительно 60 нм.
[00196] Типичные НЛН согласно настоящему изобретению пригодны для фильтрации через фильтр с диаметром пор по меньшей мере 0,45 микрон. В типичном варианте реализации НЛН пригоден для фильтрации через фильтр с диаметром пор 0,20 или 0,22 микрона.
[00197] B. Стабильность.
[00198] Типичные НЛН, предложенные в данной заявке, стабильны, позволяют легкое применение, производство, транспортируемость и хранение. Физико-химические свойства НЛН, включая, но не ограничиваясь их размером, сохраняются с течением времени при различных температурах и при различных условиях.
[00199] Изменение размера частиц как функция времени дает информацию о коллоидной стабильности. Типичная стабильная композиция НЛН представляет собой такую композицию, у частиц в которой сохраняется по существу одинаковая величина z-среднего диаметра в течение некоторого периода времени (например, в течение периода времени 30 дней или 7 дней) при различных температурах, обычно, но не ограничиваясь перечисленными, при 37, 25 или 5 градусах Цельсия. Под сохранением по существу одинаковой величины z-среднего диаметра подразумевают, что размер частицы сохраняется в пределах отклонения на 20%, 15%, 10%, 5% от исходного размера в течение периода времени 30 дней. Особенно стабильной композицией НЛН является композиция, у частиц в которой сохраняется по существу одинаковая величина z-среднего диаметра в течение периода времени 30 дней при 4 градусах Цельсия, 25 градусах Цельсия или даже 37 градусах Цельсия.
[00200] Стабильность НЛН можно измерить с помощью методик, хорошо известных специалистам в данной области. В некоторых вариантах реализации стабильность наблюдают визуально. Визуальное наблюдение может включать наблюдение частиц, хлопьевидности или агрегатов. Обычно, коллоидную стабильность определяют по размеру частиц НЛН, например, путем измерения z-среднего диаметра, и необязательно выражают в виде изменения размера с течением времени, или при различных температурах, или при некоторых условиях. В некоторых вариантах реализации стабильность определяют путем оценки увеличения размера частиц. В некоторых вариантах реализации стабильность определяют путем измерения коэффициента полидисперсности (PDI), например, с применением методики динамического рассеяния света (ДРС). В других вариантах реализации стабильность определяют путем измерения дзета-потенциала с применением методики ДРС.
[00201] В некоторых вариантах реализации Z-средний диаметр НЛН увеличвается менее чем на 50%, менее чем на 40%, менее чем на 30%, менее чем на 25%, менее чем на 20%, менее чем на 15%, менее чем на 12%, менее чем на 10%, менее чем на 7%, менее чем на 5%, менее чем на 3%, менее чем на 1% в течение анализируемого периода времени.
[00202] В некоторых вариантах реализации коэффициент полидисперсности НЛН сохраняется равным приблизительно 0,5, приблизительно 0,4, приблизительно 0,3, приблизительно 0,2, приблизительно 0,1 или от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,5, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,4, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,3, от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,2, от приблизительно 0,2 до приблизительно 0,4, или от приблизительно 0,2 до приблизительно 0,3. В некоторых предпочтительных аспектах коэффициент полидисперсности больше чем 0,1, больше чем 0,15, или больше чем 0,2.
[00203] Типичные композиции на основе НЛН согласно настоящему изобретению стабильны в течение более 6 месяцев при 25 градусах Цельсия (например, у них сохраняется по существу одинаковая величина z-среднего диаметра)
[00204] IV. Биоактивные агенты.
[00205] В некоторых типичных вариантах реализации для того, чтобы доставить биоактивный агент, составы согласно настоящему изобретению смешивают или другим способом включают в состав вместе с одним или более биоактивными агентами. Термин «биоактивный агент» в данной заявке относится к любому материалу, которые нужно доставить с помощью составов согласно настоящему описанию, и может включать, без ограничения, макромолекулы, пептиды, белки, пептидомиметики, нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды, дезоксирибонуклеотиды, плазмидную ДНК, кольцевую ДНК, линейную ДНК, одноцепочечную ДНК, модифицированную ДНК, антисмысловую ДНК, рибонуклеотиды, мРНК, химически модифицированную РНК, некодирующую РНК, миРНК, миРНК, тРНК, рибосомную РНК, РНК-рибозимы, РНК-репликон, РНК-аптамеры, ДНК-аптамеры, двухцепочечную РНК, РНК с замещенными основаниями, содержащую инозин РНК, адъюванты, включая агонисты TLR (например, агонисты TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 и TLR9), агонисты Rig-I, сапонины, углеводы, углеводные полимеры, конъюгированные углеводы, целые вирусные частицы, подобные вирусу частицы, фрагменты вирусов и фрагменты клеток. Лишь некоторые из типичных адъювантов включают двухцепочечную РНК, RIBOXXOL, поли(I:C) и хилтонол® (полиICLC). хилтонол® (полиICLC) представляет собой синтетический комплекс карбоксиметилцеллюлозы, полиинозиновой/полицитидиловой кислоты двухцепочечной РНК и поли-L-лизина. RIBOXXOL представляет собой гибридизованный дуплекс РНК длиной 50 п.о. (Riboxx GmbH). Любой биоактивный агент, который можно безопасно доставить в клетку, можно смешать с НЛН согласно настоящему изобретению. Если необходимо доставить отрицательно заряженные молекулы, то в некоторых вариантах реализации поверхность катионных НЛН может взаимодействовать с отрицательно заряженными биоактивными агентами, тем самым заякоревая молекулы в НЛН.
[00206] Примеры отрицательно заряженных молекул для применения в качестве биоактивных агентов включают, например, содержащие пептид антигены, молекулы нуклеиновых кислот (например, РНК или ДНК), которые кодируют один или более содержащих пептид антигенов, отрицательно заряженные полисахариды, отрицательно заряженные малые молекулы и отрицательно заряженные иммунологические адъюванты. Отрицательно заряженные иммунологические адъюванты включают, например, иммуностимулирующие олигонуклеотиды (например, олигонуклеотиды CpG), одноцепочечные молекулы РНК, низкомолекулярные иммунопотенциаторы (SMIP) и тому подобные адъюванты. Отрицательно заряженные малые молекулы включают, например, фосфонат, фторфосфонат и тому подобные молекулы.
[00207] Современные адъюванты по большей части направлены на активацию иммунного ответа Th2, такие как Alum. В некоторых вариантах реализации для вакцин против рака и мишеней, вызывающих инфекционные заболевания (например, туберкулез, некоторые вирусные заболевания и т.д.), а также аллергии, существует неудовлетворенная потребность в адъювантах, которые вызывают активацию иммунного ответа Th1. В этом отношении, как описано в данной заявке, авторы настоящего изобретения продемонстрировали составы, стимулирующие иммунный ответ Th1, для TLR3 агонистов, например. Такие составы вызывают продукцию IFN-гамма и снижают экспрессию IL-5, и подходят для различных применений, в которых требуется активация иммунного ответа Th1.
[00208] Один или более биоактивных агентов может быть связан с составами согласно настоящему изобретению. Для специалиста в данной области должно быть очевидно, что с составами могут быть связаны различные комбинации биоактивных агентов, таких как, но не ограничиваясь перечисленными: множество молекул РНК, множество молекул ДНК, одна или более молекул РНК с определенной последовательностью и один или более белков, одна или более ДНК и один или более белков, и одна или более РНК и одна или более ДНК. В некоторых аспектах один биоактивный агент может присутствовать в масляной сердцевине НЛН, тогда как другой связан с поверхностью НЛН. Например, нуклеиновая кислота может быть связана с поверхностью НЛН, тогда как биологически активная малая молекула может присутствовать внутри масляной сердцевины НЛН.
[00209] В типичном варианте реализации отрицательно заряженный биоактивный агент находится в комплексе с НЛН благодаря ассоциации с катионной поверхностью. Ассоциация отрицательно заряженного биоактивного агента с поверхностью НЛН может представлять собой нековалентное или обратимое ковалентное взаимодействие.
[00210] В другом варианте реализации гидрофобный биоактивный агент, такой как лиганд Toll-подобного рецептора (например, лиганд TLR4), может быть включен в масляную сердцевину или может находиться в граничном слое частицы НЛН.
[00211] A. Молекулы РНК.
[00212] В вариантах реализации, в которых биоактивный агент представляет собой молекулу РНК, молекула РНК может кодировать белки различных типов, включая, без ограничения, антигены, антитела, токсины, факторы роста, цитокины и гормоны. Молекулы РНК, применяемые в данной заявке, могут также представлять собой некодирующие РНК, включая, без ограничения, миРНК, миРНК, направляющую CRISPR РНК, РНК-рибозим, шпильки, РНК-аптамеры, РНК-агонисты и иммуномодулирующие РНК.
[00213] В типичном варианте реализации отрицательно заряженная молекула РНК соединена в комплекс с НЛН путем ассоциации с катионной поверхностью. Ассоциация молекулы РНК с поверхностью НЛН может представлять собой нековалентное или обратимое ковалентное взаимодействие.
[00214] В типичных вариантах реализации биоактивный агент представляет собой самореплицирующуюся молекулу РНК. Самореплицирующиеся молекулы РНК хорошо известны в данной области, и их можно получить, применяя элементы репликации, полученные из вирусов (например, альфавируса, флавивируса, пикорнавируса), и заменяя структурные вирусные белки на последовательность нуклеотидов, кодирующую интересующий белок. Самореплицирующаяся молекула РНК обычно представляет собой молекулу с (+)-цепью, которая может непосредственно транслироваться после доставки в клетку, и такая трансляция обеспечивается РНК-зависимой РНК-полимеразой, которая затем продуцирует антисмысловой и смысловой транскрипты с доставленной РНК. Таким образом, доставленная РНК приводит к образованию множества дочерних молекул РНК. Данные дочерние молекулы РНК, а также колинеарные субгеномные транскрипты, могут транслироваться сами, чтобы обеспечить экспрессию in situ кодируемого антигена, или могут транскрибироваться с образованием дополнительных транскриптов с таким же смыслом, как и у доставленной РНК, которые транслируются, чтобы обеспечить экспрессию антигена in situ. Итоговым результатом данных последовательных транскрипций является увеличение количества внедренных РНК репликона, и в результате этого кодируемый антиген становится основным полипептидным продуктом данных клеток.
[00215] Предпочтительно, трансляционный аппарат клетки используется самореплицирующимися молекулами РНК для образования значительно повышенного количества кодируемых продуктов гена, таких как белки или антигены, которые могут накапливаться в клетках или секретироваться из клеток. Самореплицирующиеся молекулы РНК могут, например, стимулировать Toll-подобные рецепторы (TLR) 3, 7 и 8 и пути передачи сигналов, отличные от TLR (например, RIG-I, MD-5), продуктами репликации, амплификации и трансляции РНК, которые могут вызывать апоптоз трансфицированной клетки.
[00216] Самореплицирующиеся РНК могут, например, содержать по меньшей мере один или более генов, выбранных из группы, состоящей из репликаз вируса, протеаз вируса, геликаз вируса и других неструктурных белков вируса, а также содержат 5′- и 3′-концевые цис-действующие репликационные последовательности и, при необходимости, гетерологичные последовательности, которые кодируют желательные последовательности аминокислот (например, интересующий антиген). Субгеномный промотор, который направляет экспрессию гетерологичной последовательности, можно включить в самореплицирующиеся РНК. При необходимости, гетерологичную последовательность (например, интересующий антиген) можно слить в одной рамке считывания с другими кодирующими областями, с пептидной последовательностью проскока рибосомы или без нее, в самореплицирующейся РНК, и/или она может находиться под контролем участка внутренней посадки рибосомы (IRES).
[00217] В некоторых вариантах реализации самореплицирующаяся молекула РНК не инкапсулирована в подобную вирусу частицу. Самореплицирующиеся молекулы РНК согласно настоящему изобретению можно разработать таким образом, что самореплицирующаяся молекула РНК не может вызывать продукцию инфекционных вирусных частиц. Этого можно добиться, например, путем исключения из самореплицирующейся РНК одного или более генов вируса, кодирующих структурные белки, которые необходимы для продукции вирусных частиц. Например, если самореплицирующаяся молекула РНК получена на основе альфа-вируса, такого как вирус Синдбис (SIN), вирус леса Семлики и вирус венесуэльского энцефалита лошадей (VEE), один или более генов, кодирующих вирусные структурные белки, такие как гликопротеины капсида (C) и/или оболочки (E), можно удалить.
[00218] При необходимости, самореплицирующиеся молекулы РНК согласно настоящему изобретению также можно разработать таким образом, чтобы они вызывали образование инфекционных вирусных частиц, которые аттенуированы или вирулентны, или чтобы продуцировать вирусные частицы, которые способны на один раунд последующей инфекции.
[00219] Одной подходящей системой для достижения саморепликации, таким образом, является применение репликона на основе альфавируса. Альфавирусы включают набор генетически, структурно и серологически родственных артропонозных вирусов семейства Togaviridae. В роду альфавирусов классифицировали тридцать один вид, включая вирус Синдбис, вирус леса Семлики, вирус Росс-ривер, вирус чикунгунья и вирус венесуэльского энцефалита лошадей. По этой причине самореплицирующиеся РНК согласно настоящему изобретению могут содержать РНК-репликазу, полученную из вируса леса Семлики (SFV), вируса Синдбис (SIN), вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE), вируса Росс-ривер (RRV), вируса восточного энцефалита лошадей, вируса чикунгунья или других вирусов, относящихся к роду альфавирусов.
[00220] Вектор экспрессии на основе «репликона», полученного из альфавируса, можно применять в настоящем изобретении. Векторы на основе репликона можно применять в нескольких форматах, включая ДНК, РНК и рекомбинантные частицы репликона. Такие векторы на основе репликона были получены из альфавирусов, которые включают, например, вирус Синдбис (Xiong и др. (1989) Science 243:1188-1191; Dubensky и др., (1996) J. Virol. 70:508-519; Hariharan и др. (1998) J. Virol. 72:950-958; Polo и др. (1999) PNAS 96:4598-4603), вирус леса Семлики (Liljestrom (1991) Bio/Technology 9:1356-1361; Berglund и др. (1998) Nat. Biotech. 16:562-565) и вирус венесуэльского энцефалита лошадей (Pushko и др. (1997) Virology 239:389-401). Репликоны, полученные из альфавирусов, как правило, достаточно сходны по общим свойствам (например, структуре, репликации), отдельные альфавирусы могут проявлять некоторое отдельное уникальное свойство (например, чувствительность к интерферону и профиль заболевания). Следовательно, также могут быть пригодны химерные репликоны альфавирусов, полученные из дивергентных семейств вируса.
[00221] РНК-репликоны на основе альфавируса обычно представляют собой (+)-цепочечные РНК, которые приводят к трансляции репликазы (или репликазы-транскриптазы) после доставки в клетку. Репликаза транслируется в виде полипротеина, который ауторасщепляется с образованием репликационного комплекса, который создает геномные (-)-цепочечные копии (+)-цепочечной доставленной РНК. Данные (-)-цепочечные транскрипты могут сами транскрибироваться с образованием дополнительных копий (+)-цепочечной исходной РНК, а также с образованием субгеномного транскрипта, который кодирует антиген. Трансляция субгеномного транскрипта, следовательно, приводит к экспрессии антигена in situ инфицированной клеткой. В подходящих репликонах альфавирусов могут использовать репликазу из вируса Синдбис, вируса леса Семлики, вируса восточного энцефалита лошадей, вируса венесуэльского энцефалита лошадей и т.д.
[00222] РНК-репликон может содержать, например, РНК-геном из пикорнавируса, тогавируса (например, альфавирусов, таких как, например, вирус Синдбис, вирус леса Семлики, вирус венесуэльского энцефалита лошадей или вирус Росс-ривер), флавивируса (например, вируса желтой лихорадки), коронавируса, парамиксовируса, который был модифицирован путем замены одного или более генов структурных белков на выбранную гетерологичную последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую интересующий продукт.
[00223] В некоторых аспектах репликон будет кодировать (i) РНК-зависимую РНК-полимеразу, которая может транскрибировать РНК с репликона, и (ii) антиген. Полимераза может представлять собой, например, репликазу альфавируса, например, содержащую один или более белков альфавируса nsP1, nsP2, nsP3 и nsP4. Хотя природные геномы альфавируса кодируют структурные белки вириона дополнительно к неструктурному полипротеину репликазы, предпочтительно, чтобы репликон не кодировал структурные белки альфавируса. Таким образом, репликон может приводить к продукции копий геномной РНК самого себя в клетке, но не к продукции РНК-содержащих вирионов. Неспособность продуцировать данные вирионы означает, что, в отличие от альфавируса дикого типа, предпочтительный репликон не может воспроизводить себя в инфекционной форме. Структурные белки альфавируса, которые необходимы для воспроизводства вирусов дикого типа, отсутствуют в предпочтительном репликоне, и их место занимает(-ют) ген(ы), кодирующий(-е) интересующий антиген, так что субгеномный транскрипт кодирует антиген вместо структурных белков вириона альфавируса.
[00224] Репликон, пригодный в настоящем изобретении, может, например, содержать две открытые рамки считывания. В одном примере, первая (5′) открытая рамка считывания кодирует репликазу; вторая (3′) открытая рамка считывания кодирует антиген. В некоторых вариантах реализации РНК может содержать дополнительные (например, расположенные по ходу транскрипции) открытые рамки считывания, например, для кодирования дополнительных антигенов или для кодирования вспомогательных полипептидов.
[00225] Репликон, например, может содержать 5'-кэп (например, 7-метилгуанозин), который часто может повышать трансляцию РНК in vivo. В некоторых вариантах реализации может потребоваться выбрать 5'-последовательность репликона, чтобы гарантировать совместимость с кодируемой репликазой.
[00226] Репликон может содержать 3′-поли(A)-хвост. Он также может содержать последовательность узнавания поли(A)-полимеразой (например, AAUAAA) около его 3'-конца.
[00227] Репликоны могут быть различной длины, но обычно их длина составляет 5000 - 25000 нуклеотидов, например, 8000 - 15000 нуклеотидов или 9000 - 12000 нуклеотидов.
[00228] Репликон можно удобным способом получить путем транскрипции in vitro (IVT). Для IVT могут применять матрицу (кДНК), созданную и размножаемую в виде плазмиды в бактериях или созданную синтетическим путем (например, путем синтеза генов и/или с помощью методов инженерии на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР)). Например, можно применять ДНК-зависимую РНК-полимеразу (такую как РНК-полимеразы бактериофага T7, T3 или SP6) для транскрипции репликона с ДНК-матрицы. Подходящие реакции кэпирования и добавления поли(A) можно применять при необходимости (хотя поли(A) репликона обычно закодирован внутри ДНК-матрицы). У данных РНК-полимераз могут быть строгие требования к транскрибируемому(-ым) 5'-нуклеотиду(-ам), и в некоторых вариантах реализации данные требования должны соответствовать требованиям кодируемой репликазы, чтобы гарантировать, что транскрибированная путем IVT РНК может эффективно выполнять функцию субстрата для кодируемой ею репликазы. Конкретные примеры включают плазмиды на основе вируса Синдбис (pSIN), такие как pSINCP, описанные, например, в патентах США № 5814482 и 6015686, а также в международных публикациях № WO 97/38087, WO 99/18226 и WO 02/26209. Конструирование таких репликонов, в общих чертах, описано в патентах США № 5814482 и 6015686.
[00229] В других аспектах самореплицирующуюся молекулу РНК получают из или на основе вируса, отличного от альфавируса, предпочтительно, вируса с положительной цепью РНК, пикорнавируса, флавивируса, рубивируса, пестивируса, гепацивируса, калицивируса или коронавируса. Подходящие последовательности альфавируса дикого типа хорошо известны и доступны из депозитариев последовательностей, таких как Американская коллекция типовых культур (ATCC), Роквилл, Мэриленд. Типичные примеры подходящих альфавирусов включают аура-вирус (ATCC VR-368), вирус Бебару (ATCC VR-600, ATCC VR-1240), вирус Кабассоу (ATCC VR-922), вирус чикунгунья (ATCC VR-64, ATCC VR-1241), вирус восточного энцефаломиелита лошадей (ATCC VR-65, ATCC VR-1242), Форт-Морган (ATCC VR-924), вирус Гета (ATCC VR-369, ATCC VR-1243), Кызылагач (ATCC VR-927), Майяро (ATCC VR-66), вирус Майяро (ATCC VR-1277), Мидделбурга (ATCC VR-370), вирус Мукамбо (ATCC VR-580, ATCC VR-1244), Ндуму (ATCC VR-371), вирус Пиксуна (ATCC VR-372, ATCC VR-1245), вирус Росс-ривер (ATCC VR-373, ATCC VR-1246), вирус леса Семлики (ATCC VR-67, ATCC VR-1247), вирус Синдбис (ATCC VR-68, ATCC VR-1248), Тонате (ATCC VR-925), Тринити (ATCC VR-469), Уна (ATCC VR-374), венесуэльского энцефалита лошадей (ATCC VR-69, ATCC VR-923, ATCC VR-1250 ATCC VR-1249, ATCC VR-532), западного энцефаломиелита лошадей (ATCC VR-70, ATCC VR-1251, ATCC VR-622, ATCC VR-1252), Ватароа (ATCC VR-926) и Y-62-33 (ATCC VR-375).
[00230] В других аспектах самореплицирующуюся молекулу РНК получают из или на основе репликационно-компетентного вируса (например, онколитического вируса). Онколитический вирус преимущественно инфицирует и лизирует (разрушает) раковые клетки. При разрушении инфицированных раковых клеток высвобождаются новые инфекционные вирусные частицы или вирионы, которые могут инфицировать и разрушать дополнительные раковые клетки. Таким образом, онколитические вирусы не только вызывают непосредственное разрушение раковых клеток, но также стимулируют противораковые иммунные ответы у хозяев. В некоторых вариантах реализации онколитический вирус может кодировать ассоциированный с опухолью или вирусом антиген, неоантиген и/или пептиды. Подходящие онколитические вирусы известны в данной области и доступны из депозитариев последовательностей, таких как Американская коллекция типовых культур, Роквилл, Мэриленд. Типичные примеры подходящих онколитических вирусов включают, но не ограничены перечисленными: поксвирус, аденовирус, аденоассоциированный вирус, реовирус, ретровирус, сенекавирус, вирус кори, вирус простого герпеса, вирус ньюкаслской болезни (NDV), вирус везикулярного стоматита (VSV), вирус эпидемического паротита, вирус гриппа, парвовирус, хантавирус человека, вирус миксомы, цитомегаловирус (CMV), лентивирус, вирус Коксаки, эховирусы, вирус долины Сенека, вирус Синдбис, JX-594, экспрессирующие p53 вирусы, ONYX-15, Delta24, телемелизин (Telemelysin), телемелизин-GFP и вирус коровьей оспы, и тому подобные вирусы, и их рекомбинантные варианты. В некоторых вариантах реализации онколитический вирус генетически сконструирован для селективности к опухоли. В других вариантах реализации онколитический вирус является встречающимся в природе. Встречающиеся в природе онколитические вирусы включают, но не ограничены реовирусом и сенекавирусом.
[00231] Самореплицирующиеся молекулы РНК согласно настоящему изобретению обычно длиннее, чем другие типы РНК (например, мРНК), которые были получены с применением модифицированных нуклеотидов. Обычно самореплицирующиеся молекулы РНК согласно настоящему изобретению содержат по меньшей мере приблизительно 3 т.п.н. Например, самореплицирующиеся РНК могут содержать по меньшей мере приблизительно 4 т.п.н., по меньшей мере приблизительно 5 т.п.н., по меньшей мере приблизительно 6 т.п.н., по меньшей мере приблизительно 7 т.п.н., по меньшей мере приблизительно 8 т.п.н., по меньшей мере приблизительно 9 т.п.н., по меньшей мере приблизительно 10 т.п.н., по меньшей мере приблизительно 11 т.п.н., по меньшей мере приблизительно 12 т.п.н. или более 12 т.п.н. В некоторых примерах самореплицирующиеся РНК содержат от приблизительно 4 т.п.н. до приблизительно 12 т.п.н., от приблизительно 5 т.п.н. до приблизительно 12 т.п.н., от приблизительно 6 т.п.н. до приблизительно 12 т.п.н., от приблизительно 7 т.п.н. до приблизительно 12 т.п.н., от приблизительно 8 т.п.н. до приблизительно 12 т.п.н., от приблизительно 9 т.п.н. до приблизительно 12 т.п.н., от приблизительно 10 т.п.н. до приблизительно 12 т.п.н., от приблизительно 11 т.п.н. до приблизительно 12 т.п.н., от приблизительно 5 т.п.н. до приблизительно 11 т.п.н., от приблизительно 5 т.п.н. до приблизительно 10 т.п.н., от приблизительно 5 т.п.н. до приблизительно 9 т.п.н., от приблизительно 5 т.п.н. до приблизительно 8 т.п.н., от приблизительно 5 т.п.н. до приблизительно 7 т.п.н., от приблизительно 5 т.п.н. до приблизительно 6 т.п.н., от приблизительно 6 т.п.н. до приблизительно 12 т.п.н., от приблизительно 6 т.п.н. до приблизительно 11 т.п.н., от приблизительно 6 т.п.н. до приблизительно 10 т.п.н., от приблизительно 6 т.п.н. до приблизительно 9 т.п.н., от приблизительно 6 т.п.н. до приблизительно 8 т.п.н., от приблизительно 6 т.п.н. до приблизительно 7 т.п.н., от приблизительно 7 т.п.н. до приблизительно 11 т.п.н., от приблизительно 7 т.п.н. до приблизительно 10 т.п.н., от приблизительно 7 т.п.н. до приблизительно 9 т.п.н., от приблизительно 7 т.п.н. до приблизительно 8 т.п.н., от приблизительно 8 т.п.н. до приблизительно 11 т.п.н., от приблизительно 8 т.п.н. до приблизительно 10 т.п.н., от приблизительно 8 т.п.н. до приблизительно 9 т.п.н., от приблизительно 9 т.п.н. до приблизительно 11 т.п.н., от приблизительно 9 т.п.н. до приблизительно 10 т.п.н. или от приблизительно 10 т.п.н. до приблизительно 11 т.п.н.
[00232] Самореплицирующиеся молекулы РНК согласно настоящему изобретению могут содержать один или более типов модифицированных нуклеотидов (например, псевдоуридин, N6-метиладенозин, 5-метилцитидин, 5-метилуридин).
[00233] Самореплицирующаяся молекула РНК может кодировать отдельный гетерологичный полипептидный антиген или, необязательно, два или более гетерологичных полипептидных антигенов, связанных друг с другом таким образом, что каждая из последовательностей (например, связанных последовательно) сохраняет свою индивидуальность при экспрессии в виде последовательности аминокислот. Гетерологичные полипептиды, полученные из самореплицирующихся РНК, затем можно получить в виде слитого полипептида или сконструировать таким образом, чтобы в результате получить отдельные полипептидные или пептидные последовательности.
[00234] Самореплицирующиеся РНК согласно настоящему изобретению могут кодировать один или более полипептидов. Данные полипептиды могут состоять из связывающих белков, ферментов, цитокинов, хемокинов, гормонов или других функциональных белков. В качестве альтернативы, данные полипептиды могут состоять из антигенов, которые содержат диапазон эпитопов, предпочтительно эпитопов, способных вызывать либо ответ хелперных T-клеток, либо ответ цитотоксических T- клеток, либо оба ответа.
[00235] Самореплицирующиеся молекулы РНК, описанные в данной заявке, могут быть сконструированы для экспрессии множества последовательностей нуклеотидов с двух или более открытых рамок считывания, тем самым позволяя коэкспрессию белков, таких как две или более последовательностей антител или два или более антигенов вместе с цитокинами или другими иммуномодуляторами, которые могут усиливать выработку иммунного ответа. Такая самореплицирующаяся молекула РНК может быть особенно полезна, например, для получения различных продуктов генов (например, белков) в одно и то же время, например, в виде двух различных одноцепочечных последовательностей антител, последовательностей тяжелой и легкой цепей антитела или множества антигенов, для создания бивалентной или поливалентной вакцины.
[00236] Самореплицирующиеся молекулы РНК согласно настоящему изобретению можно получить, применяя любой подходящий способ. В данной области известно несколько подходящих способов получения молекул РНК, которые содержат модифицированные нуклеотиды. Например, самореплицирующуюся молекулу РНК, которая содержит модифицированные нуклеотиды, можно получить путем транскрибирования (например, транскрипции in vitro) ДНК, которая кодирует самореплицирующуюся молекулу РНК, с применением подходящей ДНК-зависимой РНК-полимеразы, такой как РНК-полимераза фага T7, РНК-полимераза фага SP6, РНК-полимераза фага T3 и тому подобных РНК-полимераз или мутантов данных полимераз, которые позволяет эффективное включание модифицированных нуклеотидов в молекулы РНК. Реакционная смесь для транскрипции будет содержать нуклеотиды и модифицированные нуклеотиды и другие компоненты, которые поддерживают активность выбранной полимеразы, такие как подходящий буфер и подходящие соли. Включение аналогов нуклеотидов в самореплицирующиеся РНК можно спроектировать, например, чтобы изменить стабильность таких молекул РНК, чтобы повысить устойчивость к РНКазам, чтобы обеспечить репликацию после внедрения в подходящие клетки-хозяева («инфективность» РНК) и/или чтобы стимулировать или уменьшить врожденные и приобретенные иммунные ответы.
[00237] Подходящие способы синтеза можно применять отдельно или в комбинации с одним или более другими способами (например, технология рекомбинантных ДНК или РНК) для получения самореплицирующейся молекулы РНК согласно настоящему изобретению. Подходящие способы синтеза de novo хорошо известны в данной области и могут быть приспособлены для конкретных применений. Примеры способов включают, например, химический синтез с применением подходящих защитных групп, таких как CEM, β-цианоэтилфосфорамидитный способ; и нуклеозид-H-фосфонатный способ. Данные химические реакции можно провести или адаптировать для применения с автоматизированными синтезаторами нуклеиновых кислот, которые доступны для приобретения. Дополнительные подходящие способы синтеза описаны в Uhlmann и др. (1990) Chem Rev 90:544-84, и Goodchild J (1990) Bioconjugate Chem 1: 165. Синтез нуклеиновых кислот также можно осуществить с помощью подходящих рекомбинантных способов, которые хорошо известны и стандартны в данной области, включая клонирование, процессинг и/или экспрессию полинуклеотидов и продуктов генов, кодируемых такими полинуклеотидами. Перетасовка ДНК путем неспецифической фрагментации и повторной сборки с помощью ПЦР фрагментов гена и получение синтетических полинуклеотидов представляют собой примеры известных методик, которые можно применять для разработки и конструирования полинуклеотидных последовательностей. Сайт-направленный мутагенез можно применять, чтобы изменить нуклеиновые кислоты и кодируемые белки, например, чтобы вставить новые сайты рестрикции, изменить паттерны гликозилирования, изменить предпочтение кодонов, получить варианты сплайсинга, ввести мутации и тому подобное. Подходящие способы транскрипции, трансляции и экспрессии последовательностей нуклеиновых кислот известны и стандартны в данной области.
[00238] Присутствие и/или количество одного или более модифицированных нуклеотидов в самореплицирующейся молекуле РНК можно определить, применяя любой подходящий способ. Например, самореплицирующуюся РНК можно расщепить до монофосфатов (например, применяя нуклеазу P1) и дефосфорилировать (например, применяя подходящую фосфатазу, такую как CIAP), и полученные в результате этого нуклеозиды анализировать с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ.
[00239] Необязательно самореплицирующиеся молекулы РНК согласно настоящему изобретению могут содержать один или более модифицированных нуклеотидов, чтобы у самореплицирующейся молекулы РНК была меньшая иммуномодулирующая активность при внедрении или проникновении в клетку-хозяина (например, клетку человека) по сравнению с соответствующей самореплицирующейся молекулой РНК, которая не содержит модифицированные нуклеотиды.
[00240] При необходимости, самореплицирующиеся молекулы РНК можно подвергнуть скринингу или анализу, чтобы подтвердить их терапевтические и профилактические свойства, применяя различные способы тестирования in vitro или in vivo, которые известны специалистам в данной области. Например, можно исследовать влияние вакцин, содержащих самореплицирующуюся молекулу РНК, на индукцию пролиферации или эффекторной функции конкретного интересующего типа лимфоцитов, например, B-клетки, T-клетки, линии T-клеток и клонов T-клеток. Например, можно выделить клетки селезенки из иммунизированных мышей и исследовать способность цитотоксических T-лимфоцитов лизировать аутологические клетки-мишени, которые содержат самореплицирующуюся молекулу РНК, которая кодирует полипептидный антиген. Кроме того, можно проанализировать дифференцировку хелперных T-клеток путем измерения пролиферации или продукции цитокинов TH1 (IL-2 и IFN-γ) и/или TH2 (IL-4 и IL-5) с помощью ELISA или непосредственно в CD4+ T-клетках путем окрашивания цитоплазматических цитокинов и проточной цитометрии после стимуляции антигеном.
[00241] Также можно исследовать способность самореплицирующихся молекул РНК, которые кодируют полипептидный антиген, вызывать гуморальные иммунные ответы, о чем свидетельствует, например, стимуляция продукции B-клетками антител, специфичных к интересующему антигену. Данный анализ можно осуществить, используя, например, B-лимфоциты периферической крови из иммунизированных индивидов. Такие способы анализа известны специалистам в данной области. Другие способы анализа, которые можно применять для определения особенностей самореплицирующихся молекул РНК согласно настоящему изобретению, могут включать детектирование экспрессии кодируемого антигена клетками-мишенями. Например, для детектирования экспрессии антигена на поверхности клетки или внутри клетки можно применять сортировку клеток с возбуждением флуоресценции (FACS). Другим преимуществом селекции с помощью FACS является возможность сортировки по различным уровням экспрессии; иногда может быть желательна более низкая экспрессия. Другой подходящий способ идентификации клеток, которые экспрессируют конкретный антиген, включает пэннинг с применением моноклональных антител на планшете или захват с применением магнитных гранул, покрытых моноклональными антителами.
[00242] B. Молекулы ДНК.
[00243] В вариантах реализации, в которых биоактивный агент представляет собой молекулу ДНК, указанная молекула ДНК может кодировать белки различных типов, включая, без ограничения, антигены, антитела, токсины, факторы роста, цитокины и гормоны. ДНК может включать, без ограничения, плазмидную ДНК, кольцевую ДНК, линейную ДНК, одноцепочечную ДНК, модифицированную ДНК, антисмысловую ДНК и ДНК-аптамер.
[00244] C. Антигены.
[00245] Биоактивный агент, описанный в данной заявке, может представлять собой молекулу нуклеиновой кислоты (например, ДНК или РНК), которая кодирует антиген. Подходящие антигены включают, но не ограничены перечисленными: антиген бактерии, антиген вируса, антиген гриба, антиген простейших, антиген растения, антиген рака или их комбинацию. Антиген может быть вовлечен или может быть получен, например, из аллергического заболевания, рака, инфекционного заболевания или аутоиммунного заболевания.
[00246] Антиген может представлять собой любой целевой эпитоп, молекулу (включая биомолекулу), молекулярный комплекс (включая молекулярные комплексы, которые содержат биомолекулы), субклеточный комплекс, клетку или ткань, против которых необходимо вызвать или повысить иммунореактивность у субъекта. Часто термин антиген будет относиться к интересующему полипептидному антигену. В некоторых вариантах реализации антиген может представлять собой, или может быть получен, или может вступать в иммунологическую перекрестную реакцию с инфекционным патогеном и/или эпитопом, биомолекулой, клеткой или тканью, которые связаны с инфекцией, раком, аутоиммунным заболеванием, аллергией, астмой или любым другим состоянием, при котором будет желательна или полезна стимуляция антигенспецифического иммунного ответа.
[00247] В некоторых вариантах реализации предложен антиген, который получен из по меньшей мере одного инфекционного патогена, такого как бактерия, вирус или гриб, включая актинобактерию, такую как M. tuberculosis или M. leprae, или другую микобактерию; бактерию, такую как представитель рода Escherichia, Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia, Clostridium или Bordetella; вирус, такой как вирус простого герпеса, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ, такой как ВИЧ-1 или ВИЧ-2), вирус гриппа, вирус парагриппа, вирус кори, вирус свинки, вирус краснухи, коронавирус (такой как SARS или MERS), ротавирус, норовирус, пикорнавирус (такой как полиовирус, энтеровирус или вирус Коксаки), ветеринарный патоген, например, вирус иммунодефицита кошек (FIV), цитомегаловирус, вирус варицелла-зостер, вирус гепатита, вирус Эпштейна-Барр (EBV), флавивирус (такой как вирус денге, вирус японского энцефалита, вирус желтой лихорадки, вирус Зика, вирус Повассан или вирус клещевого энцефалита), генипавирус (такой как вирус Хендра или вирус Нипах), буньявирус (такой как хантавирус или вирус лихорадки долины Рифт), аренавирус (такой как вирус Ласса, вирус Джунин, вирус Мачупо или вирус Гуанарито), филовирус (такой как вирус Эбола или вирус Марбург), лиссавирус (такой как вирус бешенства), респираторно-синцитиальный вирус, вирус папилломы человека (ВПЧ) и цитомегаловирус; гриб, такой как Aspergillus, Blastomyces, Coccidioides и Pneumocysti, или дрожжи, включая виды Candida, такие как C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. lusitaniae, C. tropicalis и C. parapsilosis; паразит, такой как простейшее, например, виды Plasmodium, включая P. falciparum, P. vivax, P. malariae и P. ovale; или другой паразит, такой как один или более из Acanthamoeba, Entamoeba histolytica, Angiostrongylus, Schistosoma mansonii, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Cryptosporidium, Ancylostoma, Entamoeba histolytica, Entamoeba coli, Entamoeba dispar, Entamoeba hartmanni, Entamoeba polecki, Wuchereria bancrofti, Giardia, Toxoplasma gondii и Leishmania. В конкретных вариантах реализации антиген может быть получен или родственным антигенам, вовлеченным в туберкулез, грипп, амебиаз, ВИЧ, гепатит или лейшманиоз.
[00248] В некоторых вариантах реализации антиген представляет собой связанный с гриппом антиген. В некоторых вариантах реализации антиген представляет собой вызывающий грипп антиген. В некоторых вариантах реализации антиген получен из вызывающего грипп вируса. В одном варианте реализации антиген включает гемагглютинин (HA) из H5N1. В одном варианте реализации антиген включает нейраминидазу из H5N1.
[00249] Например, в некоторых вариантах реализации антигены получены из видов Borrelia, указанные антигены могут включать: нуклеиновую кислоту, полученные из патогена антиген или антигенные препараты, полученные рекомбинантным способом белок или пептиды и химерный слитые белки. Один такой антиген представляет собой OspA. OspA может представляет собой полноразмерный зрелый белок в липидированной форме благодаря его биосинтезу в клетке-хозяине (Lipo-OspA) или, в качестве альтернативы, может представлять собой нелипидированное производное. Такие нелипидированные производные включают нелипидированный слитый белок NS1-OspA, который содержит первые 81 N-концевую аминокислоту из неструктурного белка (NS1) вируса гриппа и полноразмерный белок OspA, и другой белок MDP-OspA представляет собой нелипидированную форму OspA, несущего 3 дополнительные N-концевые аминокислоты.
[00250] В некоторых вариантах реализации антиген получен из вируса, такой как антиген, полученный из ВИЧ-1 (такой как tat, nef, gp120 или gp160), вирусов герпеса человека, такой как антиген gD или его производные или немедленно-ранний белок, такой как ICP27, из ВПГ1 или ВПГ2, цитомегаловируса ((особенно человека) (такой как gB или его производные), ротавируса (включая живые аттенуированные вирусы), вируса Эпштейна-Барр (такой как gp350 или его производные), вируса варицелла-зостер (такой как gpl, II и IE63) или из вируса гепатита, такого как вирус гепатита B (например, поверхностный антиген вируса гепатита B или его производное), вирус гепатита A, вирус гепатита C и вирус гепатита E, или из других вирусных патогенов, таких как парамиксовирусы: респираторно-синцитиальный вирус (такой как белки F и G или их производные), вирус парагриппа, вирус кори, вирус свинки, вирусы папилломы человека (например, ВПЧ6, 11, 16, 18 и т.д.), флавивирусы (например, вирус денге, вирус японского энцефалита, вирус желтой лихорадки, вирус Зика, вирус Повассан, вирус клещевого энцефалита) или вирус гриппа (целый живой или инактивированный вирус, расщепленный вирус гриппа, выращенный в яйцах или клетках MDCK, или целые виросомы гриппа (описанные у Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920) или его очищенные или рекомбинантные белки, такие как белки HA, NP, NA, PB1, PB2, PA, NS1 или M, или их комбинации).
[00251] В некоторых других вариантах реализации антиген получен из одного или более бактериальных патогенов, таких как виды Neisseria, включая N. gonorrhea и N. meningitidis (например, капсульные полисахариды и их конъюгаты, связывающие трансферрин белки, связывающие лактоферрин белки, PilC, адгезины); S. pyogenes (например, M-белки или их фрагменты, протеаза C5A, липотейхоевые кислоты), S. agalactiae, S. mutans: H. ducreyi; виды Moraxella, включая M. catarrhalis, также известный как Branhamella catarrhalis (например, высоко- и низкомолекулярные адгезины и инвазины); виды Bordetella, включая B. pertussis (например, пертактин, коклюшный токсин или его производные, филаментный гемагглютинин, аденилатциклаза, фимбрии), B. parapertussis и B. bronchiseptica; виды Mycobacterium, включая M. tuberculosis (например, ESAT6, антиген 85A, -B или -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; виды Legionella, включая L. pneumophila; виды Escherichia, включая энтеротоксическую E. coli (например, факторы колонизации, термолабильный токсин или его производные, термостабильный токсин или его производные), энтерогеморрагическую E. coli, энтеропатогенную E. coli (например, шига-подобный токсин или его производные); виды Vibrio, включая V. cholera (например, холерный токсин или его производные); виды Shigella, включая S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; виды Yersinia, включая Y. enterocolitica (например, белок Yop), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; виды Campylobacter, включая C. jejuni (например, токсины, адгезины и инвазины) и C. coli; виды Salmonella, включая S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; виды Listeria, включая L. monocytogenes; виды Helicobacter, включая H. pylori (например, уреаза, каталаза, вакуолизирующий токсин); виды Pseudomonas, включая P. aeruginosa; виды Staphylococcus, включая S. aureus, S. epidermidis; виды Enterococcus, включая E. faecalis, E. faecium; виды Clostridium, включая C. tetani (например, столбнячный токсин и его производное), C. botulinum (например, ботулинический токсин и его производное), C. difficile (например, токсины клостридий A или B и их производные); виды Bacillus, включая B. anthracis (например, ботулинический токсин и его производные); виды Corynebacterium, включая C. diphtheriae (например, дифтерийный токсин и его производные); виды Borrelia, включая B. burgdorferi (например, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (например, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (например, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (например, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; виды Ehrlichia, включая E. equi и агент гранулоцитарного эрлихиоза человека; виды Rickettsia, включая R. rickettsii; виды Chlamydia, включая C. trachomatis (например, главный белок наружной мембраны (MOMP), связывающие гепарин белки), C. pneumoniae (например, MOMP, связывающие гепарин белки), C. psittaci; виды Leptospira, включая L. interrogans; виды Treponema, включая T. pallidum (например, редкие белки наружной мембраны), T. denticola, T. hyodysenteriae; или другие бактериальные патогены.
[00252] В некоторых других вариантах реализации антиген получен из одного или более паразитов (см., например, John, D.T. и Petri, W.A., Markell and Voge’s Medical Parasitology, 9ое изд., 2006 г., WB Saunders, Филадельфия; Bowman, D.D., Georgis’ Parasitology for Veterinarians, 8ое изд., 2002 г., WB Saunders, Филадельфия), такого как виды Plasmodium, включая P. falciparum; виды Toxoplasma, включая T. gondii (например, SAG2, SAG3, Tg34); виды Entamoeba, включая E. histolytica; виды Babesia, включая B. microti; виды Trypanosoma, включая T. cruzi; виды Giardia, включая G. lamblia; виды Leshmania, включая L. major; виды Pneumocystis, включая P. carinii; виды Trichomonas, включая T. vaginalis; или из гельминта, способного инфицировать млекопитающее, например: (i) инфицирование нематодами (включая, но не ограничиваясь перечисленными: Enterobius vermicularis, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichuria, Necator americanus, Ancylostoma duodenale, Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Onchocerca volvulus, Dracanculus medinensis, Trichinella spiralis и Strongyloides stercoralis); (ii) инфицирование трематодами (включая, но не ограничиваясь перечисленными: Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Schistosoma mekongi, Opisthorchis sinensis, вид Paragonimus, Fasciola hepatica, Fasciola magna, Fasciola gigantica); и (iii) инфицирование цестодами (включая, но не ограничиваясь перечисленными: Taenia saginata и Taenia solium). В некоторых вариантах реализации антиген получен из видов Schisostoma, Schistosoma mansonii, Schistosoma haematobium и/или Schistosoma japonicum, или получен из дрожжей, таких как виды Candida, включая C. albicans; виды Cryptococcus, включая C. neoformans.
[00253] Другие специфические антигены получены из M. tuberculosis, например, Th Ra12, Tb H9, Tb Ra35, Tb38-1, Erd 14, DPV, MTI, MSL, mTTC2 и hTCC1 (WO 99/51748). Белки из M. tuberculosis также включают слитые белки и их варианты, в которых по меньшей мере два, три, четыре или более полипептидов M. tuberculosis были слиты в белок большего размера. Некоторые слитые белки включают Ra12-TbH9-Ra35, Erd14-DPV-MTI, DPV-MTI-MSL, Erd14DPV-MTI-MSL-mTCC2, Erd14-DPV-MTI-MSL, DPV-MTI-MSL-mTCC2, TbH9-DPV-MTI (WO 99151748). Другие антигены, которые можно применять, включают антигены, комбинацию антигенов и слитые белки, описанные в US 2010/0129391 и WO 2008/124647. В одном типичном варианте реализации слитый белок представляет собой ID93. В одном типичном варианте реализации слитый белок представляет собой ID91 (SEQ ID NO: 1).
[00254] Слитый белок ID91 содержит слитые четыре белка Mtb: Rv3619 (фактор вирулентности семейства EsX, SEQ ID NO: 2), Rv2389 (продуцируемый в условиях гипоксии, фактор оживления D SEQ ID NO: 3), Rv3478 (представитель семейства PE/PPE, SEQ ID NO: 4) и Rv1886 (Ag85A, секретируемый/мембранный белок; миколилтрансфераза, SEQ ID NO: 5) (ФИГ. 29). Антигены Mtb, включенные в ID91, расположены в порядке приоритета на основании отсутствия гомологии с последовательностями человека и секреции IFN-γ из МКПК человека у доноров с положительной туберкулиновой пробой (PPD+) (но не у доноров PPD-) после стимуляции антигеном, чтобы гарантировать иммуногенность в человеческой популяции (Bertholet и др., J Immunol. 181(11):7948-57 (2008)). Белок ID91 в комбинации с синтетическим агонистом Toll-подобного рецептора 4 (TLR4) глюкопиранозил-липидным адъювантом в стабильной эмульсии (GLA-СЭ) продемонстрировал защиту против H37Rv Mtb через четыре недели после одной иммунизации в доклинической модели на мышах (Orr и др., J Immunol. 193(6):2911-18 (2014)). Для данной субъединичной вакцины наблюдали сильный TH1-ответ (IFN- γ, TNF и IL-2) на ID91. Id.
[00255] В некоторых вариантах реализации ID91 может содержать ферменты рестрикции, хорошо известные специалистам в данной области. Примеры ферментов рестрикции, включают но не ограничиваются перечисленными: Ndel, Kpnl, BamHI, EcoRI и/или HindIII. См., например, вектор pET29 на ФИГ. 38A и последовательности SEQ ID NO: 6 и 12 и вектор pET28 на ФИГ. 38B.
[00256] Другие специфические антигены получены из хламидий и включают, например, высокомолекулярный белок (HWMP) (WO 99/17741), ORF3 (EP 366 412) и предполагаемые мембранные белки (Pmps). Другие антигены хламидий можно выбрать из группы, описанной в WO 99128475. Некоторые антигены можно получить из видов Streptococcus, включая S. pneumoniae: например, капсульные полисахариды и их конъюгаты, PsaA, PspA, стрептолизин, связывающие холин белки, белковый антиген пневмолизин (Biochem Biophys Acta, 1989, 67, 1007; Rubins и др., Microbial Pathogenesis, 25, 337-342), и мутантные детоксифицированные его производные (WO 90/06951; WO 99/03884). Другие бактериальные вакцины содержат антигены, полученные из видов Haemophilus, включая H. influenzae типа B (например, PRP и его конъюгаты), нетипируемый H. influenzae, например, OMP26, высокомолекулярные адгезины, P5, P6, белок D и липопротеин D, и фимбрин и полученные из фимбрина пептиды (патент США № 5843464) или многокопийные варианты или слитые с ними белки.
[00257] Другие специфические антигены получают из вируса гепатита B. Производные поверхностного антигена вируса гепатита B хорошо известны в данной области и включают, среди прочих, антигены PreS1, PreS2, S, описанные в заявках на европейский патент EP-A414 374; EP-A-0304 578 и EP 198474.
[00258] В других вариантах реализации антиген получен из вируса папилломы человека (ВПЧ), который считают ответственным за остроконечные кондиломы (ВПЧ 6 или ВПЧ 11 и другие), и вирусов ВПЧ, отвечающих за рак шейки матки (ВПЧ16, ВПЧ18 и другие). Конкретные антигены включают частицы L1 или капсомеры, и слитые белки, содержащие один или более антигенов, выбранных из белков E6, E7, L1 и L2 ВПЧ 6 и ВПЧ 11. Некоторые формы слитого белка включают L2E7, описанный в WO 96/26277, и белок D(1/3)-E7, описанный в GB 9717953.5 (PCT/EP98/05285). Дополнительные возможные антигены включают антигены ВПЧ 16,18, 33, 58. Например, мономеры антигенов L1 или L2, или антигены L1 или L2, представленные вместе в виде подобной вирусу частицы (VLP), или белок L1, представленный отдельно в структуре VLP или капсомера. Такие антигены, подобные вирусам частицы и капсомер по существу известны. См., например, WO94/00152, WO94/20137, WO94/05792 и WO93/02184.
[00259] В других вариантах реализации антиген представляет собой слитый белок. Слитые белки можно включить отдельно или в виде слитых белков, таких как E7, E2 или F5, например; конкретные варианты реализации включают VLP, содержащую слитые белки L1E7 (WO 96/11272). Конкретные антигены ВПЧ 16 включают ранние белки E6 или F7, слитые с носителем белком D с образованием слитых белков: белка D-E6 или белка D-E7 из ВПЧ 16, или их комбинации; или комбинации E6 или E7 с L2 (WO 96/26277). В качестве альтернативы, ранние белки E6 и E7 ВПЧ 16 или 18 могут присутствовать в виде одной молекулы, например, слитого белка D-E6/E7. Композиции необязательно могут содержать любой или оба белка E6 и E7 из ВПЧ 18, например, в виде слитых белков: белок D-E6, или белок D-E7, или белок D-E6/E7. Композиции могут дополнительно содержать антигены из других штаммов ВПЧ, например, из штаммов ВПЧ 31 или 33.
[00260] Антигены также можно получить из паразитов, которые вызывают малярию. Например, антигены из Plasmodia falciparum включают RTS,S и TRAP. RTS представляет собой гибридный белок, содержащий по существу всю C-концевую часть белка циркумспорозоита (CS) из P.falciparum, связанную посредством четырех аминокислот preS2-части поверхностного антигена вируса гепатита B с поверхностным (S) антигеном вируса гепатита B. Его полноразмерная структура описана в заявке на международный патент № PCT/EP92/02591, опубликованной как WO 93/10152, испрашивающей приоритет на основании заявки на патент Великобритании № 91243907. При экспрессии в дрожжах RTS продуцируется в виде липопротеиновой частицы, и когда он коэкспрессируется с антигеном S из HBV, он образует смешанную частицу, известную как RTS,S.
[00261] Антигены TRAP описаны в заявке на международный патент № PCT/GB89/00895, опубликованной как WO 90/01496. В варианте реализации настоящего изобретения предложена вакцина от малярии, в которой антигенный препарат содержит комбинацию антигенов RTS,S и TRAP. Другие антигены плазмодиев, которые являются потенциально подходящими в качестве компонентов многоступенчатой вакцины от малярии, представляют собой MSP1, AMA1, MSP3, EBA, GLURP, RAP1, RAP2, секвестрин, PfEMP1, Pf332, LSA1, LSA3, STARP, SALSA, PfEXP1, Pfs25, Pfs28, PFS27125, Pfs16, Pfs48/45, Pfs230 P. faciparum и их аналоги в видах Plasmodium.
[00262] В одном варианте реализации антиген получен из клетки рака, что может быть полезно для иммунотерапевтического лечения видов рака. Например, антиген может представлять собой антиген, вызывающий отторжение опухоли, такой как антигены типов рака предстательной железы, молочной железы, колоректального рака, рака легкого, поджелудочной железы, почки или меланомы. Примеры антигенов рака или клетки рака включают MAGE 1, 3 и MAGE 4 или другие антигены MAGE, такие как описанные в WO99/40188, PRAME, BAGE, Lage (также известный как NY Eos 1), SAGE и HAGE (WO 99/53061) или GAGE (Robbins и Kawakami, 1996 Current Opinions in Immunology 8, стр. 628-636; Van den Eynde и др., International Journal of Clinical & Laboratory Research (1997 и 1998); Correale и др. (1997), Journal of the National Cancer Institute 89, стр. 293. Данные лишь некоторые из примеров раковых антигенов экспрессируются в широком диапазоне типов опухолей, таких как меланома, карцинома легкого, саркома и карцинома мочевого пузыря. См., например, патент США № 6544518.
[00263] Другие опухолеспецифические антигены включают, но не ограничены опухолеспецифическими или связанными с опухолью ганглиозидами, такими как GM2 и GM3 или их конъюгатами с белками-переносчиками; или собственным пептидным гормоном, таким как полноразмерный гонадотропин-рилизинг гормон (GnRH, WO 95/20600), короткий пептид длиной 10 аминокислот, пригодный для лечения множества типов рака. В другом варианте реализации применяют антигены предстательной железы, такие как простатический специфический антиген (ПСА), простатическая кислая фосфатаза (ПКФ), антиген стволовых клеток предстательной железы (АСКП) (например, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 95(4) 1735-1740 1998), простатический специфический мембранный антиген (ПСМА) или, в одном варианте реализации, антиген, известный как простаза (например, Nelson, и др., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1999) 96: 3114-3119; Ferguson, и др. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999. 96, 3114-3119; WO 98/12302; патент США № 5955306; WO 98/20117; патенты США № 5840871 и 5786148; WO 00/04149. Другие простатические специфические антигены известны из WO 98/137418 и WO/004149. Другой представляет собой эпителиальный антиген предстательной железы с шестью трансмембранными доменами (STEAP) (PNAS 96 14523 14528 7-12 1999).
[00264] Другие опухолеассоциированные антигены, пригодные в контексте настоящего изобретения, включают: Plu -1 (J Biol. Chem 274 (22) 15633-15645, 1999), HASH-1, HasH-2, Cripto (Salomon и др. Bioessays 199, 21:61-70, патент США № 5654140) и криптин (criptin) (патент США № 5981215). Кроме того, антигены, особенно важные для вакцин в терапии рака, также включают тирозиназу и сурвивин.
[00265] В других вариантах реализации агенты, применяемые в композициях согласно настоящему изобретению, включают антигены, связанные с респираторными заболеваниями, такими как вызванные или осложненные бактериальной инфекцией (например, пневмококковой) заболевания, для профилактики и терапии таких состояний, как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ). ХОБЛ определяют физиологически по присутствию необратимой или частично обратимой обструкции дыхательных путей у пациентов с хроническим бронхитом и/или эмфиземой (Am J Respir Crit Care Med. Ноябрь 1995 г.;152(5 Pt 2):S77-121). Осложнения ХОБЛ часто вызваны бактериальной (например, пневмококковой) инфекцией (Clin Microbiol Rev. Апрель 2001 г.;14(2):336-63).
[00266] D. Кодирующая антитело нуклеиновая кислота.
[00267] Биоактивные агенты, описанные в данной заявке (например, РНК), могут кодировать антитело и/или антигенсвязывающий фрагмент антитела, необязательно функционально связанный с одним или более контролирующими экспрессию элементами, так что доставка субъекту приводит к продукции указанного антитела или антигенсвязывающего фрагмента у субъекта. В некоторых вариантах реализации биоактивный агент может содержать кодирующую последовательность тяжелой цепи и легкой цепи в одной открытой рамке считывания. В других вариантах реализации НЛН согласно настоящему изобретению может содержать два биоактивных агента, причем один из биоактивных агентов кодирует тяжелую цепь, тогда как другой кодирует легкую цепь. В других вариантах реализации биоактивный агент может содержать кодирующую последовательность вариабельных областей тяжелой и легкой цепи, связанных короткой гибкой полипептидной последовательностью, так что экспрессируемая биомолекула связывает интересующий антиген. В некоторых конкретных вариантах реализации полученное антитело способно вызывать иммунный ответ у индивида.
[00268] E. РНК-интерференция.
[00269] В некоторых вариантах реализации биоактивный полинуклеотид, связанный с НЛН, представляет собой некодирующую РНК, такую как РНК-интерферирующий (РНКи) полинуклеотид. РНКи представляет собой молекулу, способную вызывать РНК-интерференцию посредством взаимодействия с аппаратом пути РНК-интерференции в клетках млекопитающих, чтобы разрушить или ингибировать трансляцию транскриптов информационной РНК (мРНК) трансгена специфичным к последовательности образом. Два основных РНКи-полинуклеотида представляют собой малые (или короткие) интерферирующие РНК (миРНК) и микроРНК (миРНК). РНКи-полинуклеотиды можно выбрать из группы, включающей: миРНК, микроРНК, двухцепочечную РНК (дцРНК), короткую шпилечную РНК (кшРНК) и кассеты экспрессии, кодирующие РНК, способные вызывать РНК-интерференцию. миРНК имеет двухцепочечную структуру, обычно содержащую 15 - 50 пар оснований и предпочтительно 21 - 25 пар оснований, и последовательность нуклеотидов, идентичную (полностью комплементарную) или почти идентичную (частично комплементарную) кодирующей последовательности в экспрессированном целевом гене или РНК в клетке. миРНК может содержать динуклеотидные 3′-липкие концы. миРНК может состоять из двух гибридизованных полинуклеотидов или одного полинуклеотида, который образует структуру шпильки.
[00270] МикроРНК (миРНК) представляют собой малые некодирующие РНК-продукты генов длиной приблизительно 22 нуклеотида, которые направляют разрушение своих мРНК-мишеней или подавление их трансляции. Если комплементарность между миРНК и целевой мРНК частичная, то трансляция целевой мРНК подавляется. Если комплементарность протяженная, целевая мРНК расщепляется. В отношении миРНК, указанный комплекс связывается с целевыми сайтами, обычно расположенными в 3′ НТО мРНК, которые обычно лишь частично гомологичны миРНК. «Участок затравки» - участок из приблизительно семи (7) последовательных нуклеотидов на 5′-конце миРНК, который образует идеальные пары оснований с мишенью, - играет ключевую роль в специфичности миРНК. Связывание комплекса RISC/миРНК с мРНК может приводить либо к репрессии трансляции белка, либо к расщеплению и деградации мРНК.
[00271] F. РНК CRISPR.
[00272] В некоторых вариантах реализации состав НЛН содержит синтетическую короткую направляющую РНК (кнРНК) из системы редактирования генома CRISPR/Cas9, посредством которой он нацеливается на интересующий ген. CRISPR (кластерные короткие палиндромные повторы, разделенные регулярными промежутками) представляют собой локусы, содержащие множество коротких прямых повторов, которые находятся в геномах приблизительно 40% секвенированных бактерий и 90% секвенированных архей. CRISPR функционирует как прокариотическая иммунная система, в том отношении, что она придает устойчивость к экзогенным генетическим элементам, таким как плазмиды и фаги. Система CRISPR представляет собой форму приобретенного иммунитета. Короткие фрагменты чужеродной ДНК, называемые спейсерами, встраиваются в геном между повторами CRISPR и служат в качестве памяти прошедших воздействий. Спейсеры CRISPR затем используются для распознавания и замалчивания экзогенных генетических элементов способом, аналогичным РНКи в эукариотических организмах. Cas9, незаменимый белковый компонент в системе CRISPR/Cas9 II типа, образует активную эндонуклеазу, когда он находится в комплексе с двумя молекулами РНК, названными РНК CRISPR (крРНК) и трансактивирующей крРНК (тракрРНК), посредством чего разрезает чужеродные генетические элементы во вторгающихся фагах или плазмидах, чтобы защитить клетки-хозяева.
[00273] Направляемую РНК эндонуклеазу на основе системы CRISPR/Cas9 используют для редактирования эукариотического генома. В некоторых вариантах реализации согласно настоящему изобретению биоактивный агент представляет собой РНК, которая кодирует кнРНК и/или эндонуклеазы Cas9. В некоторых вариантах реализации РНК содержит один или более полинуклеотидов, кодирующих Cas9, и две направляющие молекулы РНК: первая направляющая РНК содержит последовательность спейсера, которая комплементарна фрагменту локуса 5'-двухцепочечного разрыва (ДЦР), и вторая направляющая РНК содержит последовательность спейсера, которая комплементарна фрагменту локуса 3'-ДЦР. Обе направляющие молекулы РНК могут быть представлены в виде единой молекулы направляющих РНК (содержащей тракрРНК и крРНК), или любая или обе могут быть представлены в виде двух молекул направляющих РНК, включая крРНК и тракрРНК, котоорые не соединены друг с другом, а вместо этого представляют собой отдельные молекулы.
[00274] G. Полипептиды.
[00275] В некоторых вариантах реализации один или более биоактивных агентов представляют собой полипептид. Полипептид может представлять собой полноразмерный белок или его фрагмент. В некоторых вариантах реализации полипептид представляет собой пептид. В некоторых вариантах реализации полипептид представляет собой слитый белок. В некоторых конкретных вариантах реализации слитый белок способен вызывать иммунный ответ после введения индивиду. В некоторых вариантах реализации полипептид представляет собой антиген, что дополнительно описано выше. Полипептиды можно получить с помощью любого подходящего способа, известного специалисту в данной области, включая, например, рекомбинантную экспрессию.
[00276] H. Малые молекулы.
[00277] В некоторых вариантах реализации настоящее описание в целом относится к композиции НЛН, в которой один или более биоактивных агентов представляют собой низкомолекулярный или терапевтический агент для доставки лекарственного средства. На тесную связь молекулы лекарственного средства и НЛН могут влиять физико-химические свойства лекарственного средства, тип и концентрация поверхностно-активного вещества, тип липидов и способ получения. В некоторых вариантах реализации низкомолекулярное лекарственное средство инкапсулировано в НЛН, что позволяет жидкий компонент липидной фазы масляной сердцевины, который обеспечивает высокую растворимость лекарственного средства (Beloqui, A., и др. Nanomedicine 2016; 12(1): 143-161).
[00278] Композиции НЛН, предложенные в данной заявке, могут быть подходящими для доставки лекарственного средства с помощью различных путей введения, включая, без ограничения, дермальный, трансдермальный, пероральный, интраназальный, пульмональный или офтальмологический пути введения.
[00279] I. Гормоны.
[00280] В некоторых вариантах реализации один или более биоактивных агентов, связанных с НЛН, представляет собой полинуклеотид или полипептид, который кодирует гормон или аналог гормона. В некоторых вариантах реализации НЛН содержит липид, который конъюгирован с гормоном. Гормон можно выбрать из группы, включающей гормон роста человека, адренокортикотропин, гонадотропин-рилизинг-гормон, окситоцин, гормон, стимулирующий высвобождение лютеинизирующего гормона, фолликулостимулирующий гормон, инсулин, инсулиноподобный фактор роста, лептин, паратиреоидный гормон, тиреотропный гормон или некоторые комбинации перечисленных гормонов. В некоторых вариантах реализации состав НЛН содержит гормон или аналог гормона в комбинации с низкомолекулярным терапевтическим соединением, описанным выше.
[00281] J. Адъюванты.
[00282] В некоторых вариантах реализации НЛН предназначен для доставки вакцины, и один или более биоактивных агентов представляет собой адъювант, или, в качестве альтернативы, композиции НЛН, предложенные в данной заявке, можно вводить вместе с адъювантом. В данной заявке термин адъювант относится к веществу, которое повышает или усиливает иммунный ответ. Иммунный ответ может представлять собой, например, антигенспецифический иммунный ответ, например, на экзогенный антиген.
[00283] Многие адъюванты содержат вещество, разработанное для защиты антигена от быстрого катаболизма, такое как гидроксид алюминия или минеральное масло, и стимулятор иммунных ответов, такой как липид A (природный или синтетический). Подходящие адъюванты доступны для приобретения, например, неполный адъювант и полный адъювант Фрейнда (Difco Laboratories, Детройт, Мичиган); адъювант 65 от Merck (Merck and Company, Inc., Рауэй, Нью-Джерси); AS-2 и его производные (SmithKline Beecham, Филадельфия, Пенсильвания); CWS, TDM, Leif, соли алюминия, такие как гель гидроксида алюминия (Alum) или фосфат алюминия; соли кальция, железа или цинка; нерастворимая суспензия ацилированного тирозина; ацилированные сахара; катионные или анионные производные полисахаридов; полифосфазены; биоразлагаемые микросферы; монофосфорил-липид A и квил-A. Цитокины, такие как GM-CSF или интерлейкин-2, -7 или -12, также можно применять в качестве адъювантов.
[00284] В некоторых типичных композициях применяют системы адъювантов, разработанные таким образом, чтобы вызывать иммунный ответ преимущественно Th1-типа. Высокие уровни цитокинов Th1-типа (например, IFN-γ, TNFα, IL-2 и IL-12) склонны вызывать клеточные иммунные ответы на введенный антиген. Напротив, высокие уровни цитокинов Th2-типа (например, IL-4, IL-5, IL-6 и IL-10) склонны вызывать гуморальные иммунные ответы. После применения композиций, предложенных в данной заявке, у пациента может поддерживаться иммунный ответ, который включает ответы Th1- и Th2-типа. В типичном варианте реализации, в котором ответ преимущественно Th1-типа, уровень цитокинов Th1-типа будет повышаться в большей степени, чем уровень цитокинов Th2-типа. Уровни данных цитокинов можно легко оценить, применяя стандартные тесты. Обзор семейств цитокинов см. в Mossman & Coffman, Ann. Rev. Immunol. 7:145-173 (1989).
[00285] Некоторые адъюванты для применения для индукции преимущественно ответа Th1-типа включают, например, комбинацию монофосфорил-липида A, например, 3-де-O-ацилированного монофосфорил-липида A (3D-MPLTM), вместе с солью алюминия (патенты США № 4436727; 4877611; 4866034 и 4912094). Содержащие CpG олигонуклеотиды (в которых динуклеотид CpG не метилирован) также вызывают преимущественно Th1-ответ. Такие олигонуклеотиды хорошо известны и описаны, например, в WO 96/02555, WO 99/33488 и патентах США № 6008200 и 5856462. Иммуностимулирующие последовательности ДНК также описаны, например, у Sato и др., Science 273:352 (1996). Другой пример адъюванта включает сапонин, такой как квил-A, или его производные, включая QS21 и QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Фремингхем, Массачусетс); эсцин; дигитонин; или сапонины гипсофила или хеноподия киноа. Другие примеры составов содержат более чем один сапонин в комбинациях адъювантов согласно настоящему описанию, например, комбинации по меньшей мере двух из следующей группы, включающей QS21, QS7, квил-A, β-эсцин или дигитонин.
[00286] Другие примеры адъювантов, пригодных в контексте настоящего описания, включают агонисты Toll-подобных рецепторов, такие как агонисты TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR5, TLR6, TLR7, TLR8, TLR7/8, TLR9 и тому подобных рецепторов. Другие дополнительные примеры адъювантов включают имихимод, гардихимод, резиквимод и родственные соединения.
[00287] В других вариантах реализации адъювант представляет собой адъювант глюкопиранозил-липид A (GLA), описанный в патентах США № 8609114 или 8722064, описания которых полностью включены в данную заявку посредством ссылки.
[00288] Например, в некоторых вариантах реализации агонист TLR4 представляет собой синтетический адъювант GLA, имеющий следующую структуру, отвечающую формуле (VII):
или фармацевтически приемлемую соль указанного соединения, где:
L1, L2, L3, L4, L5 и L6 одинаковы или различны и независимо представляют собой -O-, -NH- или -(CH2)-;
L7, L8, L9, и L10 одинаковы или различны и независимо отсутствуют или представляют собой -C(=O)-;
Y1 представляет собой кислую функциональную группу;
Y2 и Y3 одинаковы или различны и независимо представляют собой -OH, -SH или кислую функциональную группу;
Y4 представляет собой -OH или -SH;
R1, R3, R5 и R6 одинаковы или различны и независимо представляют собой C8-13 алкил; и
R2 и R4 одинаковы или различны и независимо представляют собой C6-11 алкил.
[00289] В некоторых вариантах реализации синтетической структуры GLA, R1, R3, R5 и R6 представляют собой C10 алкил; и R2 и R4 представляют собой C8 алкил. В некоторых вариантах реализации R1, R3, R5 и R6 представляют собой C11 алкил; и R2 и R4 представляют собой C9 алкил.
[00290] Например, в некоторых вариантах реализации агонист TLR4 представляет собой синтетический адъювант GLA, имеющий следующую структуру, отвечающую формуле (VIII), или фармацевтически приемлемую соль указанного соединения:
[00291] В некоторых вариантах реализации приведенной выше структуры GLA R1, R3, R5 и R6 представляют собой C11-C20 алкил; и R2 и R4 представляют собой C12-C20 алкил. В другом конкретном варианте реализации GLA отвечает формуле, приведенной выше, где R1, R3, R5 и R6 представляют собой C11 алкил; и R2 и R4 представляют собой C13 алкил. В другом конкретном варианте реализации GLA отвечает формуле, приведенной выше, где R1, R3, R5 и R6 представляют собой C10 алкил; и R2 и R4 представляют собой C8 алкил.
[00292] В другом конкретном варианте реализации GLA отвечает формуле, приведенной выше, где R1, R3, R5 и R6 представляют собой C11-C20 алкил; и R2 и R4 представляют собой C9-C20 алкил. В некоторых вариантах реализации R1, R3, R5 и R6 представляют собой C11 алкил; и R2 и R4 представляют собой C9 алкил.
[00293] В некоторых вариантах реализации агонист TLR4 представляет собой синтетический адъювант GLA, имеющий следующую структуру, отвечающую формуле (IX), или фармацевтически приемлемую соль указанного соединения:
[00294] В некоторых вариантах реализации приведенной выше структуры GLA R1, R3, R5 и R6 представляют собой C11-C20 алкил; и R2 и R4 представляют собой C9-C20 алкил. В некоторых вариантах реализации R1, R3, R5 и R6 представляют собой C11 алкил; и R2 и R4 представляют собой C9 алкил.
[00295] В некоторых вариантах реализации агонист TLR4 представляет собой синтетический адъювант GLA, имеющий следующую структуру, отвечающую формуле (X):
[00296] В некоторых вариантах реализации приведенной выше структуры GLA R1, R3, R5 и R6 представляют собой C11-C20 алкил; и R2 и R4 представляют собой C9-C20 алкил. В некоторых вариантах реализации R1, R3, R5 и R6 представляют собой C11 алкил; и R2 и R4 представляют собой C9 алкил.
[00297] В некоторых вариантах реализации агонист TLR4 представляет собой синтетический адъювант GLA, имеющий следующую структуру, отвечающую формуле (XI), или фармацевтически приемлемую соль указанного соединения:
[00298] В некоторых вариантах реализации приведенной выше структуры GLA R1, R3, R5 и R6 представляют собой C11-C20 алкил; и R2 и R4 представляют собой C9-C20 алкил. В некоторых вариантах реализации R1, R3, R5 и R6 представляют собой C11 алкил; и R2 и R4 представляют собой C9 алкил.
[00299] В некоторых вариантах реализации агонист TLR4 представляет собой синтетический адъювант GLA, имеющий следующую структуру, или фармацевтически приемлемую соль указанного соединения:
.
[00300] В некоторых вариантах реализации агонист TLR4 представляет собой синтетический адъювант GLA, имеющий следующую структуру, или фармацевтически приемлемую соль указанного соединения:
.
[00301] В некоторых вариантах реализации агонист TLR4 представляет собой синтетический адъювант GLA, имеющий следующую структуру, или фармацевтически приемлемую соль указанного соединения:
.
[00302] В другом варианте реализации производное аттенуированного липида A (ALD) включено в состав композиций, описанных в данной заявке. ALD представляют собой подобные липиду A молекулы, которые изменили или сконструировали таким образом, чтобы данная молекула приводила к меньшим нежелательным явлениям или отличным от таковых для липида A. Данные нежелательные явления включают пирогенность, местную реакцию Шварцмана и токсичность, которую оценивают в анализе 50% летальной дозы для куриных эмбрионов (CELD50). ALD, полезные в соответствии с настоящим описанием, включают монофосфорил-липид A (MLA или MPL) и 3-деацилированный монофосфорил-липид A (3D-MLA или 3D-MPL). MLA (MPL) и 3D-MLA (3D-MPL) известны, и нет необходимости подробно описывать их в данной заявке.
[00303] В описанных выше соединениях агонистов TLR4 общий заряд можно определить по функциональным группам в молекуле. Например, фосфатная группа может быть отрицательно заряженной или нейтральной в зависимости от ионизированного состояния фосфатной группы.
[00304] V. Способы получения типичных композиций, содержащих биоактивные агенты и наноструктурированные липидные носители.
[00305] В данной заявке один способ получения НЛН, описанных в данной заявке, включает (a) смешивание твердофазного липида, жидкофазного липида, катионного липида и гидрофобного поверхностно-активного вещества (например, сложного эфира сорбитана) с получением смеси масляной фазы; (b) смешивание гидрофильного поверхностно-активного вещества и воды с получением водной фазы; и (c) смешивание смеси масляной фазы со смесью водной фазы с получением НЛН. В некоторых вариантах реализации дополнительный этап включает объединение биоактивного агента с НЛН таким образом, что биоактивный агент связывается с поверхностью НЛН посредством нековалентных взаимодействий или посредством обратимых ковалентных взаимодействий. Такие варианты реализации предпочтительны, когда биоактивный агент отрицательно заряжен, как, например, молекула РНК или молекула ДНК. Отрицательные заряды на биоактивном агенте взаимодействуют с катионным липидом в НЛН, посредством этого связывая отрицательно заряженный биоактивный агент с НЛН. В других вариантах реализации, в которых биоактивный агент гидрофобный, его объединяют с компонентами этапа (a), чтобы он стал частью смеси масляной фазы. В некоторых вариантах реализации биоактивный агент можно присоединить к компоненту поверхности НЛН посредством ковалентных взаимодействий.
[00306] Смешивание твердофазного липида, жидкофазного липида, катионного липида и гидрофобного поверхностно-активного вещества (например, сложного эфира сорбитана) с получением смеси масляной фазы можно осуществить, например, путем нагревания и обработки ультразвуком. Смешивание смеси масляной фазы со смесью водной фазы можно осуществить, например, с помощью различных способов эмульгирования, включая, без ограничения, эмульгирование с большим усилием сдвига и микрофлюидизацию.
[00307] VI. Композиции, содержащие наноструктурированные липидные носители.
[00308] В данной заявке предложены составы, композиции и фармацевтические композиции, содержащие композиции НЛН, описанные в данной заявке.
[00309] Композиции, содержащие НЛН и биоактивный агент, могут необязательно дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель, вспомогательное вещество или разбавитель.
[00310] Композиции, описанные в данной заявке, можно вводить субъекту с любыми целями вакцинации, терапии или диагностики.
[00311] В данной заявке предложены фармацевтические композиции, содержащие описанные в данном документе композиции, дополнительно объединенные с фармацевтически приемлемым носителем, вспомогательным веществом или разбавителем.
[00312] В особенно предпочтительных вариантах реализации, предложенных в данной заявке, НЛН и фармацевтические композиции, предложенные в данной заявке, пригодны для фильтрации через фильтр с диаметром пор 0,45 микрон. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция пригодна для фильтрации через фильтр с диаметром пор 0,20 микрон. В некоторых вариантах реализации фармацевтическая композиция пригодна для фильтрации через фильтр с диаметром пор 0,22 микрона.
[00313] В одном варианте реализации настоящего изобретения предложена фармацевтическая композиция, содержащая композицию, содержащую НЛН и связанный с ней биоактивный агент. Такую композицию можно вводить субъекту для того, чтобы стимулировать иммунный ответ, например, неспецифический иммунный ответ или антигенспецифический иммунный ответ, с целью диагностики, лечения или предотвращения заболевания или другого состояния, такого как инфицирование некоторым организмом.
[00314] В некоторых других вариантах реализации фармацевтическая композиция представляет собой композицию вакцины, которая содержит композиции, описанные в данной заявке, в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, вспомогательным веществом или разбавителем. Типичные носители обычно нетоксичны для реципиентов при применяемых дозировках и концентрациях.
[00315] В некоторых аспектах фармацевтические композиции, предложенные в данной заявке, вводят субъекту для выработки ответа у субъекта, например, для выработки иммунного ответа у субъекта. Обычно, субъекту вводят терапевтически эффективное количество.
[00316] Термин «эффективное количество» или «терапевтически эффективное количество» относится к количеству, которого достаточно, чтобы добиться или по меньшей мере частично добиться желательного эффекта, например, достаточно для выработки желательного иммунного ответа. Эффективное количество НЛН или фармацевтической композиции вводят в рамках «эффективной схемы введения». Термин «эффективная схема введения» относится к комбинации количества композиции, которое вводят, и частоты введения дозы, достаточных для достижения желательного эффекта.
[00317] Фактические уровни доз можно изменять, чтобы получить количество, которое эффективно для достижения желательного ответа для конкретного пациента, композиции и способа введения, без токсичного действия на пациента. Выбранный уровень дозы будет зависеть от различных фармакокинетических факторов помимо конкретных используемых композиций, таких как возраст, пол, масса тела, состояние, общее состояние здоровья и анамнез перенесенных заболеваний субъекта, которого лечат, и тому подобные факторы, хорошо известные в области медицины.
[00318] В типичных терапевтических вариантах реализации, предложенных в данной заявке, вводят дозу от приблизительно 1 мкг/кг до приблизительно 10 мг/кг терапевтической фармацевтической композиции. Для специалиста в данной области будет очевидно, что количество и частота введений будет зависеть от ответа субъекта.
[00319] В типичных основанных на вакцине вариантах реализации, предложенных в данной заявке, будут вводить приблизительно 1 мкг - 100 мкг антигена или 0,1 мкг - 10 мг нуклеиновой кислоты, кодирующей антиген, при каждом введении. Типичные составы согласно настоящему изобретению допускают дозу для человека, равную приблизительно 0,1 мкг, приблизительно 1 мкг, приблизительно 5 мкг или от приблизительно 10 мкг до приблизительно 500 мкг РНК-репликона. Типичные составы согласно настоящему изобретению допускают дозу для человека, равную от приблизительно 5 мкг до приблизительно 20 мкг РНК-репликона.
[00320] Для специалиста в данной области будет очевидно, что количество и частота введений будут зависеть от ответа субъекта. Типичные составы допускают терапевтическую эффективность после всего лишь одной иммунизации.
[00321] «Фармацевтически приемлемые носители» для терапевтического применения хорошо известны в области фармацевтики и описаны, например, в Remingtons Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro, ред. 1985). Например, можно применять стерильный солевой раствор и фосфатно-солевой буферный раствор при физиологическом pH. Консерванты, стабилизаторы, красители и даже ароматизирующие агенты могут входить в состав фармацевтической композиции. Например, бензоат натрия, сорбиновую кислоту и сложные эфиры пара-гидроксибензойной кислоты можно добавить в качетве консервантов. Id. на 1449. Кроме того, можно использовать антиоксиданты и суспендирующие агенты. Id.
[00322] Фармацевтические композиции могут находиться в любой форме, которая позволяет вводить указанную композицию пациенту. Например, композиция может находиться в форме твердого, жидкого или газообразного (аэрозоля) вещества. Обычные пути введения включают, без ограничения, пероральный, топический, парентеральный, сублингвальный, буккальный, ректальный, вагинальный, внутривенный, внутрикожный, трансдермальный, интраназальный, внутрислизистый, пульмональный или подкожный. Термин парентеральный в данной заявке включает ионофоретическое, сонофоретическое, термическое, трансдермальное введение, а также подкожные инъекции, методики внутривенной, внутримышечной, внутристернальной, внутрикавернозной, интратекальной, интрамеатальной, внутриуретральной инъекции или инфузии. В некоторых вариантах реализации, композицию, описанную в данной заявке (включая вакцинные и фармацевтические композиции), вводят внутрикожно с помощью методики, выбранной из ионтофореза, микрокавитации, сонофореза, безыгольного впрыскивания или микроигл. В одном предпочтительном варианте реализации композицию, описанную в данной заявке, вводят внутрикожно, применяя устройство с микроиглами, произведенное NanoPass Technologies Ltd., Нес-Циона, Израиль, например, MicronJet600 (см., например, патенты США № 6533949 и 7998119 и Yotam, и др., Human Vaccines & Immunotherapeutics 11(4): 991-997 (2015), каждый из которых полностью включен в данную заявку посредством ссылки).
[00323] Фармацевтическая композиция может находиться в таком составе, который позволяет находящимся в нем активным ингредиентам быть биодоступными при введении указанной композиции субъекту. Композиции, которые будут вводить субъекту, принимают форму одной или более разовых доз, причем, например, таблетка может представлять собой единичную дозу, а контейнер с одним или более соединениями согласно настоящему изобретению в аэрозольной форме может содержать множество единичных доз.
[00324] Для перорального введения может присутствовать вспомогательное вещество и/или связующее вещество. Примерами являются сахароза, каолин, глицерин, крахмал декстрины, альгинат натрия, карбоксиметилцеллюлоза и этилцеллюлоза. Могут присутствовать красящие и/или ароматизирующие агенты. Можно применять покрывающую оболочку.
[00325] Композиция может находиться в форме жидкости, например, эликсира, сиропа, раствора, эмульсии или суспензии. Жидкость может быть предназначена для перорального введения или для доставки путем инъекции, в качестве двух примеров. Если они предназначены для перорального введения, композиции могут содержать один или более из подслащивающего агента, консервантов, красителя/окрашивающего вещества и усилителя вкуса. В композицию, предназначенную для введения путем инъекции с помощью иглы и шприца или безыгольного впрыскивания, можно включить один или более из агентов: поверхностно-активное вещество, консервант, смачивающий агент, диспергирующий агент, суспендирующий агент, буфер, стабилизатор и изотонический агент.
[00326] Жидкая фармацевтическая композиция, применяемая в данной заявке, в форме либо раствора, либо суспензии, либо в другой подобной форме, может содержать один или более из следующих носителей или вспомогательных веществ: стерильные разбавители, такие как вода для инъекции, солевой раствор, предпочтительно физиологический солевой раствор, раствор Рингера, изотонический хлорид натрия, нелетучие масла, такие как сквален, сквалан, минеральное масло, моноолеат маннида, холестерин и/или синтетические моно- или диглицериды, которые могут служить в качестве растворителя или суспендирующей среды, полиэтиленгликоли, глицерин, пропиленгликоль или другие растворители; антибактериальные агенты, такие как бензиловый спирт или метилпарабен; антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота или бисульфит натрия; хелатирующие агенты, такие как этилендиаминтетрауксусная кислота; буферы, такие как ацетаты, цитраты или фосфаты, и агенты для регулировки тоничности, такие как хлорид натрия или декстроза.
[00327] В другом варианте реализации композиция согласно настоящему описанию составлена таким образом, что ее можно перевести в аэрозольное состояние.
[00328] Также может потребоваться включить в фармацевтическую композицию другие компоненты, такие как средства доставки, включая, но не ограничиваясь перечисленными: соли алюминия, эмульсии типа вода в масле, средства доставки на основе биоразлагаемых масел, эмульсии типа масло в воде, биоразлагаемые микрокапсулы и липосомы. Примеры дополнительных иммуностимулирующих веществ (коадъювантов) для применения в таких средствах доставки также описаны выше и могут включать N-ацетилмурамил-L-аланин-D-изоглутамин (MDP), глюкан, IL-12, GM-CSF, гамма интерферон и IL-12.
[00329] Хотя любой подходящий носитель, известный средним специалистам в данной области, можно применять в фармацевтических композициях согласно настоящему описанию, тип носителя будет изменяться в зависимости от способа введения и от того, требуется ли продолжительное высвобождение. Для парентерального введения, такого как подкожная инъекция, носитель может включать воду, солевой раствор, спирт, жир, воск или буфер. Для перорального введения можно применять любой из перечисленных выше носителей или твердый носитель, такой как маннит, лактоза, крахмал, стеарат магния, сахарин натрия, тальк, целлюлоза, глюкоза, сахароза и карбонат магния. Биоразлагаемые микросферы (например, полимолочный галактид) также можно применять в качестве носителей для фармацевтических композиций согласно настоящему изобретению. Подходящие биоразлагаемые микросферы описаны, например, в патентах США № 4897268 и 5075109. В этом отношении, предпочтительно, чтобы микросферы были больше, чем приблизительно 25 микрон.
[00330] Фармацевтические композиции также могут содержать разбавители, такие как буферы, антиоксиданты, такие как аскорбиновая кислота, полипептиды, белки, аминокислоты, углеводы, включая глюкозу, сахарозу или декстрины, хелатирующие агенты, такие как ЭДТА, глутатион и другие стабилизаторы и вспомогательные вещества. Нейтральный буферный солевой раствор или солевой раствор, смешанный с неспецифическим сывороточным альбумином, представляют собой примеры подходящих разбавителей. Например, продукт можно включить в состав в виде лиофилизата, применяя подходящие растворы вспомогательных веществ (например, сахарозы) в качестве разбавителей.
[00331] Фармацевтическая композиция может быть предназначена для топического введения, в данном случае носитель может подходящим образом включать раствор, эмульсию, мазь или гелевую основу. Основа, например, может включать один или более из следующих агентов: петролатум, ланолин, полиэтиленгликоли, пчелиный воск, минеральное масло, разбавители, такие как вода и спирт, и эмульгаторы и стабилизаторы. Загущающие средства могут присутствовать в фармацевтической композиции для топического введения. Если композиция предназначена для трансдермального введения, то она может включать трансдермальный пластырь или устройство для ионтофореза. Топические составы могут содержать концентрацию антигена (например, композиция вакцины GLA-антиген) или GLA (например, композиция иммунологического адъюванта; GLA доступен от Avanti Polar Lipids, Inc., Алабастер, Алабама; например, продукт № 699800) от приблизительно 0,1 до приблизительно 10% (масса/объем) (массы на единицу объема).
[00332] Композиция может быть предназначена для ректального введения в виде, например, суппозитория, который может таять в прямой кишке и высвобождать лекарственное средство. Композиция для ректального введения может содержать маслянистую основу в качестве подходящего не вызывающего раздражения вспомогательного вещества. Такие основы включают, без ограничения, ланолин, масло какао и полиэтиленгликоль. В способах согласно настоящему изобретению фармацевтические композиции/адъюванты можно вводить путем применения вкладыша(-ей), гранул(ы), состава(-ов) с контролируемым по времени высвобождением, пластыря(-ей) или состава(-ов) с быстрым высвобождением.
[00333] Необязательно, для контроля тоничности, НЛН может содержать физиологическую соль, такую как соль натрия. Хлорид натрия (NaCl), например, можно применять в концентрации приблизительно 0,9% (масса/объем) (физиологический солевой раствор). Другие соли, которые могут присутствовать, включают хлорид калия, однозамещенный фосфорнокислый калий, двузамещенный фосфорнокислый натрий, хлорид магния, хлорид кальция и т.д. Неионные регулирующие тоничность агенты также можно применять для контроля тоничности. Моносахариды, классифицированные как альдозы, такие как глюкоза, манноза, арабиноза и рибоза, а также классифицированные как кетозы, такие как фруктоза, сорбоза и ксилулоза, можно применять в качестве неионных регулирующих тоничность агентов в описанных в данном документе композициях. Также можно применять дисахариды, такие как сахароза, мальтоза, трегалоза и лактоза. Кроме того, альдиты (ациклические полигидроксиспирты, также называемые сахарными спиртами), такие как глицерин, маннит, ксилит и сорбит, представляют собой неионные регулирующие тоничность агенты, пригодные в описанных в данном документе композициях. Неионные модифицирующие тоничность агенты могут присутствовать в концентрации от приблизительно 0,1% до приблизительно 10% или от приблизительно 1% до приблизительно 10%, в зависимости от конкретного применяемого агента. Если состав с НЛН предназначен для парентерального введения, то предпочтительно сделать осмолярность композиции НЛН такой же, как у нормальных физиологических жидкостей, чтобы предотвратить последствия после введения, такие как отечность или быстрое всасывание композиции после введения.
[00334] Необязательно состав с НЛН может содержать криопротекторы, включая трегалозу, сахарозу, маннит, сорбит, авицел PH102 (микрокристаллическую целлюлозу), авицел RC591 (смесь микрокристаллической целлюлозы и карбоксиметилцеллюлозы натрия), микроцелак® (смесь лактозы и авицела), или комбинации перечисленных криопротекторов. Необязательно состав с НЛН может содержать консервирующее средство, такое как, например, гидролит 5.
[00335] VII. Стабильные эмульсии.
[00336] В некоторых вариантах реализации предложены стабильные эмульсии, причем указанные стабильные эмульсии содержат по меньшей мере один адъювант. Лишь некоторые из примеров адъювантов, которые могут входить в состав стабильной эмульсии, включают агонисты TLR3 и агонисты Rig-I. Неограничивающие примеры таких адъювантов включают двухцепочечную РНК, RIBOXXOL, поли(I:C) и хилтонол®.
[00337] В некоторых вариантах реализации стабильная эмульсия (СЭ) представляет собой эмульсию масло в воде. В некоторых таких вариантах реализации эмульсия типа масло в воде представляет собой эмульсию сквален в воде. В некоторых вариантах реализации эмульсия содержит антиоксидант, такой как альфа-токоферол (витамин E, см., например, EP 0 382 271 B1). В WO 95/17210 и WO 99/11241 обсуждают эмульсии на основе сквалена, альфа-токоферола и твин® 80. В WO 99/12565 обсуждают улучшение данных эмульсий на основе сквалена путем добавления стерина в масляную фазу.
[00338] В WO08/153541 обсуждают эмульсии типа масло в воде как обычно содержащие количества компонентов в диапазоне от 2 до 10% масла, такого как сквален; и, когда он присутствует, от 0,01 до 0,1% альфа-токоферола; и от 0,3 до 3% поверхностно-активного вещества, такого как полиоксиэтиленсорбитана моноолеат или полоксамер 188 (сополимер полиоксиэтилена и полиоксипропилена). Отношение масло:поверхностно-активное вещество может быть равным или меньшим чем 1, для повышения стабильности эмульсии. Спан 85 также может присутствовать на уровне, составляющем приблизительно 1%. В некоторых случаях может быть предпочтительно, чтобы вакцины дополнительно содержали стабилизатор. В одном варианте реализации стабилизатор может представлять собой триглицерид, такой как трикаприлин (C27H5OO6) (см., например, WO 98/56414). В некоторых вариантах реализации эмульсия типа масло в воде содержит от 0,5% до 5%, или от 0,5% до 5%, или от 0,5% до 3%, или от 1% до 3% глицерина. В некоторых вариантах реализации эмульсия типа масло в воде содержит от 0,5% до 5%, или от 0,5% до 5%, или от 0,5% до 3%, или от 1% до 3% 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (ДМФХ). Лишь один из примеров эмульсии типа масло в воде обсуждается в разделе Примеры в данной заявке.
[00339] Размер капель масла, находящихся в стабильной эмульсии масло в воде, составляет предпочтительно менее 1 микрона, может быть в диапазоне по существу 30 - 600 нм, предпочтительно по существу приблизительно 30 - 500 нм в диаметре, и наиболее предпочтительно по существу 150 - 500 нм в диаметре и, в частности, составлять приблизительно 150 нм в диаметре, что измеряют с помощью фотонной корреляционной спектроскопии. В этом отношении, 80% (по количеству) капель масла должно находиться внутри предпочтительных диапазонов, более предпочтительно более 90% и наиболее предпочтительно более 95% (по количеству) капель масла находятся в рамках установленных диапазонов размера. Количества компонентов, присутствующих в масляных эмульсиях согласно настоящему изобретению, обычно находятся в диапазоне от 2 до 10% масла, такого как сквален; и, когда он присутствует, от 2 до 10% альфа-токоферола; и от 0,3 до 3% поверхностно-активного вещества, такого как полиоксиэтиленсорбитана моноолеат. Предпочтительно отношение масло:альфа-токоферол больше 1, так как это позволяет получить более стабильную эмульсию. Спан 85 также может присутствовать на уровне, составляющем приблизительно 1%. В некоторых случаях может быть предпочтительно, чтобы вакцины согласно настоящему изобретению дополнительно содержали стабилизатор.
[00340] Способы получения эмульсий типа масло в воде хорошо известны специалисту в данной области. Обычно указанный способ включает смешивание масляной фазы с поверхностно-активным веществом, таким как раствор ФБР/твин 80®, с последующей гомогенизацией с применением гомогенизатора. Например, способ, который включает пропускание смеси один, два или более раз через иглу шприца будет подходящим для гомогенизации небольших объемов жидкости. В равной мере, процесс эмульгирования в микрофлюидизаторе (микрофлюидном устройстве M110S, максимум 50 пропусканий, в течение периода 2 минуты при максимальном давлении на входе 6 бар (давление на выходе приблизительно 850 бар)) можно адаптировать для получения меньших или больших объемов эмульсии. Такую адаптацию можно осуществить путем проведения обычных экспериментов, включающих измерение капель в полученной эмульсии до тех пор, пока не получат препарат с каплями масла необходимого диаметра.
[00341] VIII. Способы применения композиций согласно настоящему описанию.
[00342] A. Лекарственные средства.
[00343] В некоторых вариантах реализации агент пригоден для терапевтических целей. Таким образом, в некоторых вариантах реализации описанные композиции содержат НЛН, предложенные в данной заявке, и дополнительно содержат биоактивный агент для лечения заболевания, состояния или расстройства.
[00344] В некоторых вариантах реализации указанный агент пригоден для лечения или предотвращения аллергии, рака, инфекционного заболевания, аутоиммунитета или зависимости. В некоторых вариантах реализации агент пригоден для стимуляции, усиления и/или модуляции иммунного ответа.
[00345] В некоторых аспектах описанных вариантов реализации композиции содержат антигены рака или нуклеиновые кислоты, кодирующие антиген рака. В некоторых вариантах реализации композиция вакцины, содержащая антиген рака, будет полезна против любого рака, для которого характерна экспрессия опухолеассоциированного антигена, такая как экспрессия HER-2/neu или других специфических для рака или связанных с раком антигенов.
[00346] Композиции и способы согласно некоторым вариантам реализации настоящего изобретения также можно применять для профилактики или терапии аутоиммунных заболеваний, которые включают заболевания, патологические состояния или расстройства, при которых иммунная система хозяина или субъекта пагубным образом опосредует иммунный ответ, который направлен против «собственных» тканей, клеток, биомолекул (например, пептидов, полипептидов, белков, гликопротеинов, липопротеинов, протеолипидов, липидов, гликолипидов, нуклеиновых кислот, таких как РНК и ДНК, олигосахаридов, полисахаридов, протеогликанов, гликозаминогликанов или тому подобных молекул и других молекулярных компонентов клеток и тканей субъекта) или эпитопов (например, специфических иммунологически определенных распознаваемых структур, таких как структуры, распознаваемые определяющей комплементарность областью (CDR) вариабельной области антитела или CDR T-клеточного рецептора).
[00347] Для аутоиммунных заболеваний, следовательно, характерен патологический иммунный ответ, вовлекающий либо клетки, либо антитела, которые в любом случае направлены против нормальных аутологических тканей. Аутоиммунные заболевания у млекопитающих, как правило, можно классифицировать как относящиеся к одной из двух различных категорий: опосредованным клетками (т.е. T-клетками) заболеваниям или опосредованным антителами расстройствам. Лишь некоторые из примеров опосредованных клетками аутоиммунных заболеваний включают рассеянный склероз, ревматоидный артрит, тиреоидит Хашимото, сахарный диабет I типа (диабет с ювенильным началом) и аутоиммунный увеоретинит. Опосредованные антителами аутоиммунные расстройства включают, но не ограничены перечисленными: тяжелую миастению, системную красную волчанку (или СКВ), болезнь Грейвса, аутоиммунную гемолитическую анемию, аутоиммунную тромбоцитопению, аутоиммунную астму, криоглобулинемию, тромботическую тромбоцитопеническую пурпуру, первичный билиарный склероз и злокачественную анемию. Антиген(ы), ассоциированный(-е) с системной красной волчанкой, представляет собой малые ядерные рибонуклеопротеины (мяРНП); с болезнью Грейвса - рецептор тиреотропина, тироглобулин и другие компоненты эпителиальных клеток щитовидной железы; с пузырчаткой - кадгерин-подобные антигены пузырчатки, такие как десмоглеин 3 и другие молекулы адгезии; и с тромботической тромбоцитопенической пурпурой - антигены тромбоцитов.
[00348] Композиции, предложенные в данной заявке, можно применять для стимуляции защитного иммунитета, например, композиции против туберкулеза содержат полипептиды, которые содержат по меньшей мере одну иммуногенную часть одного или более белков микобактерии и молекул ДНК и РНК, кодирующих такие полипептиды. Кроме того, такие соединения можно включить в состав вакцин и/или фармацевтических композиций для иммунизации против инфицирования микобактериями.
[00349] В других вариантах реализации композиции согласно настоящему изобретению содержат антигены, связанные с респираторными заболеваниями, такими как заболевания, вызванные или осложненные бактериальной инфекцией (например, пневмококковой), для профилактики и терапии таких состояний как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ).
[00350] Дополнительно к прямым процедурам in vivo можно применять процедуры ex vivo, в которых клетки удаляют из хозяина, модифицируют и помещают в того же или другого животного-хозяина. Должно быть очевидно, что можно применять любую из композиций, указанных выше, для внедрения кодирующих антиген молекул нуклеиновых кислот в клетки ткани в контексте ex vivo. Протоколы для вирусных, физических и химических способов внедрения хорошо известны в данной области.
[00351] В некоторых вариантах реализации композиции согласно настоящему изобретению применяют для повторной стимуляции или усиления иммунного ответа у субъекта. В некоторых таких вариантах реализации биоактивный агент представляет собой адъювант. Лишь некоторые из примеров адъювантов включают агонисты TLR (включая агонисты TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 и TLR9), агонисты Rig-I, сапонины, углеводы, углеводные полимеры, конъюгированные углеводы, целые вирусные частицы, подобные вирусу частицы, фрагменты вирусов и фрагменты клеток. Примеры таких адъювантов включают, но не ограничены перечисленными: двухцепочечную РНК, RIBOXXOL, поли(I:C) и хилтонол®. В некоторых вариантах реализации композиция содержит стабильную эмульсию и/или наноструктурированный липидный носитель. В некоторых вариантах реализации композиция содержит стабильную эмульсию и/или наноструктурированный липидный носитель, который содержит сквален. Авторы настоящего изобретения обнаружили, что составы на основе сквалена неожиданно усиливают действие, например, агонистов TLR3.
[00352] В некоторых предпочтительных аспектах композиции согласно настоящему изобретению полезны для усиления или индукции иммунного ответа у хозяина, пациента или в культуре клеток. В данной заявке термин «субъект» относится к любому млекопитающему. Пациент может страдать от инфекционного заболевания, рака, такого как рак молочной железы, или аутоиммунного заболевания, или может быть нормальным (т.е. не иметь детектируемого заболевания и/или инфекции). «Культура клеток» представляет собой любой препарат, содержащий иммунокомпетентные клетки или выделенные клетки иммунной системы (включая, но не ограничиваясь перечисленными: T-клетки, макрофаги, моноциты, B-клетки и дендритные клетки). Такие клетки можно выделить с помощью любых из различных методик, хорошо известных средним специалистам в данной области (например, центрифугирования в градиенте плотности фиколла-гипак). Указанные клетки можно (но не обязательно) выделить из пациента, страдающиго от рака, и можно ввести обратно пациенту после обработки.
[00353] B. Вакцина.
[00354] В настоящем описании, следовательно, предложены композиции для изменения (т.е., повышения или снижения статистически значимым образом, например, по сравнению с подходящим контролем, что будет хорошо известно специалистам в данной области) иммунных ответов у хозяина, способного осуществлять иммунный ответ. Средним специалистам в данной области будет известно, что иммунный ответ может представлять собой любое активное изменение иммунного статуса хозяина, что может включать любое изменение структуры или функции одной или более тканей, органов, клеток или молекул, которые участвуют в поддержании и/или регуляции иммунного статуса хозяина. Как правило, иммунные ответы можно обнаружить с помощью любого из различных хорошо известных параметров, включая, но не ограничиваясь определением in vivo или in vitro: растворимых иммуноглобулинов или антител; растворимых медиаторов, таких как цитокины, лимфокины, хемокины, гормоны, факторы роста и тому подобные медиаторы, а также другие растворимые малые пептидные, углеводные, нуклеотидные и/или липидные медиаторы; изменения состояния активации клеток, что определяют по изменению функциональных или структурных свойств клеток иммунной системы, например, пролиферации клеток, измененной подвижности, индукции специализированных активностей, таких как экспрессия специфических генов или цитолитическое поведение; дифференцировки клеток иммунной системы, включая измененные профили экспрессии антигенов на поверхности или начало апоптоза (запрограммированной гибели клетки); или любым другим критериям, по которым можно обнаружить наличие иммунного ответа.
[00355] Определение индукции иммунного ответа композициями согласно настоящему изобретению можно установить с помощью любого из множества хорошо известных иммунологических тестов, с которыми хорошо знакомы средние специалисты в данной области. Такие тесты включают, но не обязательно должны быть ограничены определением in vivo или in vitro: растворимых антител; растворимых медиаторов, таких как цитокины, лимфокины, хемокины, гормоны, факторы роста и тому подобные медиаторы, а также другие растворимые малые пептидные, углеводные, нуклеотидные и/или липидные медиаторы; изменения состояния активации клеток, что определяют по изменению функциональных или структурных свойств клеток иммунной системы, например, пролиферации клеток, измененной подвижности, индукции специализированных активностей, таких как экспрессия специфических генов или цитолитическое поведение; дифференцировки клеток иммунной системы, включая измененные профили экспрессии антигенов на поверхности или начало апоптоза (запрограммированной гибели клетки). Процедуры проведения данных и аналогичных тестов широко известны, и их можно найти, например, в Lefkovits (Immunology Methods Manual: The Comprehensive Sourcebook of Techniques, 1998); см. также Current Protocols in Immunology; см. также, например, Weir, Handbook of Experimental Immunology, 1986 Blackwell Scientific, Бостон, Массачусетс; Mishell и Shigii (ред.) Selected Methods in Cellular Immunology, 1979 Freeman Publishing, Сан-Франциско, Калифорния; Green и Reed, 1998 Science 281:1309 и ссылочные материалы, цитированные в указанных источниках.
[00356] Детектирование пролиферации антиген-реактивных T-клеток можно осуществить с помощью различных известных методик. Например, пролиферацию T-клеток можно детектировать путем измерения скорости синтеза ДНК, и специфичность к антигену можно определить с помощью контролирования стимулов (таких как, например, сенсибилизация антигенпредставляющих клеток специфическим желательным антигеном или контрольным антигеном), которым подвергаются потенциально подходящие антиген-реактивные T-клетки. T-клетки, которые стимулировали к пролиферации, проявляют повышенную скорость синтеза ДНК. Обычным способом измерения скорости синтеза ДНК является, например, импульсное мечение культур T-клеток меченым тритием тимидином - предшественником нуклеозида, который включается во вновь синтезированную ДНК. Количество включенного меченого тритием тимидина можно определить, применяя жидкостной сцинтилляционный спектрофотометр. Другие способы детектирования пролиферации T-клеток включают измерение увеличения продукции интерлейкина-2 (IL-2), потока Ca2+ или поглощения красителя, такого как 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразол. В качестве альтернативы можно измерить синтез лимфокинов (таких как интерферон-гамма) или можно определить относительное количество T-клеток, которые могут отвечать на конкретный антиген.
[00357] Детектирование продукции антигенспецифического антитела можно осуществить, например, путем анализа образца (например, образца, содержащего иммуноглобулины, такого как сыворотка, плазма или кровь) из хозяина, которому вводили вакцину согласно настоящему описанию, с применением методик in vitro, таких как радиоиммуноанализ (RIA), твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA), равновесный диализ или твердофазный иммуноблоттинг, включая вестерн-блоттинг. В вариантах реализации анализ ELISA может дополнительно включать захват и иммобилизацию целевого антигена с помощью моноклонального антитела твердой фазы, специфичного к указанному антигену, например, для повышения чувствительности данного анализа. Выработку растворимых медиаторов (например, цитокинов, хемокинов, лимфокинов, простагландинов и т.д.) также можно легко определить с помощью твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA), например, применяя способы, устройство и реагенты, которые легко доступны из коммерческих источников (например, Sigma, Сент-Луис, Миссури; см. также R & D Systems, каталог 2006 г., R & D Systems, Миннеаполис, Миннесота).
[00358] Любое количество других иммунологических параметров можно отслеживать, применяя стандартные тесты, которые хорошо известны в данной области. Они могут включать, например, анализ антителозависимой клеточной цитотоксичности (АЗКЦ), вторичные гуморальные иммунные ответы in vitro, проточный иммуноцитофлуорометрический анализ различных субпопуляций клеток периферической крови или лимфоидных мононуклеарных клеток с применением хорошо отработанных маркерных антигенных систем, иммуногистохимию или другие уместные тесты. Данные и другие тесты можно найти, например, в Rose и др. (ред.), Manual of Clinical Laboratory Immunology, 5ое изд., 1997 American Society of Microbiology, Вашингтон, федеральный округ Колумбия.
[00359] Соответственно, предполагается, что композиции, предложенные в данной заявке, будут способны вызывать или усиливать у хозяина по меньшей мере один иммунный ответ, который выбран из ответа T-лимфоцитов Th1-типа, ответа T-лимфоцитов Th2-типа, ответа цитотоксических T-лимфоцитов (CTL), гуморального иммунного ответа, цитокинового ответа, лимфокинового ответа, хемокинового ответа и воспалительного ответа. В некоторых вариантах реализации иммунный ответ может включать по меньшей мере один из следующих ответов: продукцию одного или множества цитокинов, причем цитокин выбирают из интерферона-гамма (IFN-γ), фактора некроза опухоли-альфа (TNF-α), продукцию одного или множества интерлейкинов, причем интерлейкин выбирают из IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-12, IL-13, IL-16, IL-18 и IL-23, продукцию одного или множества хемокинов, причем хемокин выбирают из MIP-1α, MIP-1β, RANTES, CCL2, CCL4, CCL5, CXCL1 и CXCL5, и ответ лимфоцитов, который выбирают из ответа T-клеток памяти, ответа B-клеток памяти, ответа эффекторных T-клеток, ответа цитотоксических T-клеток и ответа эффекторных B-клеток.
[00360] C. Диагностические агенты.
[00361] В некоторых вариантах реализации биоактивный агент представляет собой диагностический агент. Таким образом, в данных вариантах реализации описанные композиции содержат НЛН, предложенный в данной заявке, и дополнительно содержат диагностический агент, и они полезны для диагностики любого заболевания, состояния или расстройства.
[00362] В некоторых вариантах реализации диагностические агенты пригодны для детектирования рака. Известные в данной области композиции и способы для идентификации субъектов, страдающих раком или у которых подозревают наличие риска развития рака, описаны в данной заявке. Диагностику рака у субъекта, страдающего раком или у которого подозревают наличие риска развития рака, можно провести с помощью любой из широкого диапазона принятых в данной области методик, которые могут изменяться в зависимости от различных факторов, включая клиническое проявление, степень прогрессирования рака, тип рака и другие факторы. Примеры способов диагностики рака включают гистопатологическое, гистоцитохимическое, иммуногистоцитохимическое и иммуногистопатологическое исследование образцов из пациента (например, крови, биоптата кожи, биоптата другой ткани, хирургических образцов и т.д.), анализы ПЦР на присутствие определенных генетических (например, нуклеиновых кислот) маркеров, серологические тесты на присутствие в кровотоке ассоциированных с раком антигенов или клеток, несущих такие антигены, или на присутствие антител с определенной специфичностью, или другие методики, которые известны специалистам в данной области.
[00363] В некоторых вариантах реализации диагностические агенты пригодны для обнаружения аутоиммунного заболевания. Детектирование аутоантитела, следовательно, позволяет раннее обнаружение или распознавание наличия или риска развития аутоиммунного заболевания. На основании данных находок были обнаружены различные аутоантитела против аутоантигенов, и указанные аутоантитела против аутоантигенов были измерены в клинических тестах.
[00364] В одном варианте реализации диагностические агенты пригодны для обнаружения инфекционных заболеваний. В данной области известны композиции и способы для идентификации субъектов, которые страдают или у которых подозревают наличие риска развития инфекции инфекционным патогеном, описанным в данной заявке.
[00365] Например, бактерия Mycobacterium tuberculosis вызывает туберкулез (TB). Таким образом, в некоторых вариантах реализации композиции, содержащие любой НЛН, описанный в данной заявке, дополнительно содержат агент для диагностики туберкулеза.
[00366] В некоторых вариантах реализации композиции, содержащие любой НЛН, описанный в данной заявке, дополнительно содержат агент для диагностики малярии.
[00367] В данной области были описаны полинуклеотиды, которые кодируют видоспецифичные малярийные пептидные антигены P. vivax, которые представляют собой белки или фрагменты белков, секретируемые в плазму восприимчивого хозяина-млекопитающего после инфекции, в которую также секретируются моноклональные или поликлональные антитела, направленные против данных антигенов. Пептидные антигены, моноклональные антитела и/или поликлональные антитела используют в анализе, применяемом для диагностики малярии, а также для определения того, является ли Plasmodium vivax тем самым видом, который является причиной данной инфекции. Также были описаны видоспецифичные малярийные пептидные антигены P. vivax, которые представляют собой белки или фрагменты белков, секретируемые в плазму восприимчивого хозяина-млекопитающего после инфекции, в которую также секретируются моноклональные или поликлональные антитела, направленные против данных антигенов. Пептидные антигены, моноклональные антитела и/или поликлональные антитела используют в анализе, применяемом для диагностики малярии, а также для определения того, является ли Plasmodium vivax тем самым видом, который является причиной данной инфекции.
[00368] Рекомбинантный эктодомен AMA-1 Plasmodium falciparum (изолят 3D7) также экспрессировали с помощью способа, который позволяет получить особо чистый белок, в котором сохраняетя укладка и дисульфидные мостики нативной молекулы. Рекомбинантный AMA-1 пригоден в качестве диагностического реагента для применения для получения антител и в качестве вакцины. Аналогично, известны способы экспрессии и очистки рекомбинантного MSP-142 Plasmodium falciparum (3D7), в которых сохраняетя укладка и дисульфидные мостики нативной молекулы. Рекомбинантный MSP-142 пригоден в качестве диагностического реагента для применения для получения антител и в качестве вакцины.
[00369] В некоторых вариантах реализации композиции, содержащие любой НЛН, описанный в данной заявке, дополнительно содержат агент, пригодный для диагностики лейшманиоза.
[00370] В некоторых вариантах реализации композиции, содержащие любой НЛН, описанный в данной заявке, дополнительно содержат агент, пригодный для диагностики ВИЧ.
[00371] IX. Способы выработки иммунного ответа.
[00372] В данной заявке предложены способы выработки иммунного ответа у субъекта, включающие этап введения нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества композиции, описанной в данной заявке, в которой биоактивный агент представляет собой белковый антиген или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белковый антиген. В типичных вариантах реализации биоактивный агент представляет собой РНК (например, мРНК) или молекулу ДНК, кодирующую белковый антиген. В некоторых вариантах реализации предложены способы стимуляции или усиления иммунного ответа, в которых биоактивный агент представляет собой адъювант.
[00373] Обычные пути введения терапевтически эффективного количества композиции включают, без ограничения, пероральный, топический, парентеральный, сублингвальный, буккальный, ректальный, вагинальный, внутривенный, внутрикожный, трансдермальный, интраназальный, внутрислизистый или подкожный пути. В некоторых типичных вариантах реализации введение композиции представляет собой внутримышечное, глазное, парентеральное или пульмональное введение.
[00374] В типичных вариантах реализации композиции, описанные в данной заявке, представляют собой вакцинные композиции, и их применяют в качестве вакцин. Композиции, описанные в данной заявке, можно применять для выработки иммунного ответа у субъекта (включая неспецифический ответ и антигенспецифический ответ). В некоторых вариантах реализации иммунный ответ включает системный иммунный ответ. В некоторых вариантах реализации иммунный ответ включает мукозальный иммунный ответ. Выработка иммунного ответа включает стимуляцию иммунного ответа, повышение иммунного ответа или усиление иммунного ответа.
[00375] Композиции, описанные в данной заявке, можно применять для повышения защитного иммунитета против вируса. Такие вирусы и вирусные антигены включают, например, ВИЧ-1 (такие антигены, как tat, nef, gp120 или gp160), вирусы герпеса человека (такой антиген, как gD или его производные или немедленно-ранний белок, такой как ICP27 из ВПГ1 или ВПГ2), цитомегаловирус (особенно, человека) (такой антиген, как gB или его производные), ротавирус (включая живые аттенуированные вирусы), вирус Эпштейна-Барр (такой антиген, как gp350 или его производные), вирус варицелла-зостер (такие антигены, как gpl, II и IE63), или вирус гепатита, такой как вирус гепатита B (например, поверхностный антиген вируса гепатита B или его производное), вирус гепатита A, вирус гепатита C и вирус гепатита E, или другие вирусные патогены, такие как парамиксовирусы: респираторно-синцитиальный вирус (такие антигены, как белки F и G или их производные), вирус парагриппа, вирус кори, вирус свинки, вирусы папилломы человека (например, ВПЧ6, 11, 16, 18 и т.д.), флавивирусы (например, вирус денге, вирус японского энцефалита, вирус желтой лихорадки, вирус Зика, посвананский вирус, вирус клещевого энцефалита) или вирус гриппа (целый живой или инактивированный вирус, расщепленный вирус гриппа, выращенный в яйцах или клетках MDCK, или целые виросомы гриппа (описанные у Gluck, Vaccine, 1992, 10, 915-920), или очищенные или рекомбинантные белки из них, такие как белки HA, NP, NA или M, или комбинации перечисленных белков).
[00376] Композиции, описанные в данной заявке, можно применять для повышения защитного иммунитета против одного или более бактериальных патогенов, таких как таких как виды Neisseria, включая N. gonorrhea и N. meningitidis (например, капсульные полисахариды и их конъюгаты, связывающие трансферрин белки, связывающие лактоферрин белки, PilC, адгезины); S. pyogenes (например, M-белки или их фрагменты, протеаза C5A, липотейхоевые кислоты), S. agalactiae, S. mutans: H. ducreyi; виды Moraxella, включая M. catarrhalis, также известный как Branhamella catarrhalis (например, высоко- и низкомолекулярные адгезины и инвазины); виды Bordetella, включая B. pertussis (например, пертактин, коклюшный токсин или его производные, филаментный гемагглютинин, аденилатциклаза, фимбрии), B. parapertussis и B. bronchiseptica; виды Mycobacterium, включая M. tuberculosis (например, ESAT6, антиген 85A, -B или -C), M. bovis, M. leprae, M. avium, M. paratuberculosis, M. smegmatis; виды Legionella, включая L. pneumophila; виды Escherichia, включая энтеротоксическую E. coli (например, факторы колонизации, термолабильный токсин или его производные, термостабильный токсин или его производные), энтерогеморрагическую E. coli, энтеропатогенную E. coli (например, шига-подобный токсин или его производные); виды Vibrio, включая V. cholera (например, холерный токсин или его производные); виды Shigella, включая S. sonnei, S. dysenteriae, S. flexnerii; виды Yersinia, включая Y. enterocolitica (например, белок Yop), Y. pestis, Y. pseudotuberculosis; виды Campylobacter, включая C. jejuni (например, токсины, адгезины и инвазины) и C. coli; виды Salmonella, включая S. typhi, S. paratyphi, S. choleraesuis, S. enteritidis; виды Listeria, включая L. monocytogenes; виды Helicobacter, включая H. pylori (например, уреаза, каталаза, вакуолизирующий токсин); виды Pseudomonas, включая P. aeruginosa; виды Staphylococcus, включая S. aureus, S. epidermidis; виды Enterococcus, включая E. faecalis, E. faecium; виды Clostridium, включая C. tetani (например, столбнячный токсин и его производное), C. botulinum (например, ботулинический токсин и его производное), C. difficile (например, токсины клостридий A или B и их производные); виды Bacillus, включая B. anthracis (например, ботулинический токсин и его производные); виды Corynebacterium, включая C. diphtheriae (например, дифтерийный токсин и его производные); виды Borrelia, включая B. burgdorferi (например, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. garinii (например, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. afzelii (например, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. andersonii (например, OspA, OspC, DbpA, DbpB), B. hermsii; виды Ehrlichia, включая E. equi и агент гранулоцитарного эрлихиоза человека; виды Rickettsia, включая R. rickettsii; виды Chlamydia, включая C. trachomatis (например, MOMP, связывающие гепарин белки), C. pneumoniae (например, MOMP, связывающие гепарин белки), C. psittaci; виды Leptospira, включая L. interrogans; виды Treponema, включая T. pallidum (например, редкие белки наружной мембраны), T. denticola, T. hyodysenteriae; или другие бактериальные патогены.
[00377] Композиции, описанные в данной заявке, можно применять для повышения защитного иммунитета против одного или более паразитов (см., например, John, D.T. и Petri, W.A., Markell and Voge’s Medical Parasitology, 9ое изд., 2006 г., WB Saunders, Филадельфия; Bowman, D.D., Georgis’ Parasitology for Veterinarians, 8ое изд., 2002 г., WB Saunders, Филадельфия), такого как виды Plasmodium, включая P. falciparum; виды Toxoplasma, включая T. gondii (например, SAG2, SAG3, Tg34); виды Entamoeba, включая E. histolytica; виды Babesia, включая B. microti; виды Trypanosoma, включая T. cruzi; виды Giardia, включая G. lamblia; виды Leshmania, включая L. major; виды Pneumocystis, включая P. carinii; виды Trichomonas, включая T. vaginalis; или из гельминта, способного инфицировать млекопитающее, например: (i) инфицирование нематодами (включая, но не ограничиваясь перечисленными: Enterobius vermicularis, Ascaris lumbricoides, Trichuris trichuria, Necator americanus, Ancylostoma duodenale, Wuchereria bancrofti, Brugia malayi, Onchocerca volvulus, Dracanculus medinensis, Trichinella spiralis и Strongyloides stercoralis); (ii) инфицирование трематодами (включая, но не ограничиваясь перечисленными: Schistosoma mansoni, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Schistosoma mekongi, Opisthorchis sinensis, вид Paragonimus, Fasciola hepatica, Fasciola magna, Fasciola gigantica); и (iii) инфицирование цестодами (включая, но не ограничиваясь перечисленными: Taenia saginata и Taenia solium). В некоторых вариантах реализации антиген получен из видов Schisostoma, Schistosoma mansonii, Schistosoma haematobium и/или Schistosoma japonicum, или получен из дрожжей, таких как виды Candida, включая C. albicans; виды Cryptococcus, включая C. neoformans, из инфекционного патогена, такого как бактерия, вирус или гриб, включая актинобактерию, такую как M. tuberculosis или M. leprae, или другую микобактерию; бактерию, такую как представитель рода Salmonella, Neisseria, Borrelia, Chlamydia или Bordetella; вирус, такой как вирус простого герпеса, вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), вирус иммунодефицита кошек (FIV), цитомегаловирус, вирус варицелла-зостер, вирус гепатита, вирус Эпштейна-Барр (EBV), вирус Зика (ZIKV), респираторно-синцитиальный вирус, вирус папилломы человека (ВПЧ) и цитомегаловирус; ВИЧ, такой как ВИЧ-1 или ВИЧ-2; гриб, такой как Aspergillus, Blastomyces, Coccidioides и Pneumocysti, или дрожжи, включая виды Candida, такие как C. albicans, C. glabrata, C. krusei, C. lusitaniae, C. tropicalis и C. parapsilosis; паразит, такой как простейшее, например, виды Plasmodium, включая P. falciparum, P. vivax, P. malariae и P. ovale; или другой паразит, такой как один или более из Acanthamoeba, Entamoeba histolytica, Angiostrongylus, Schistosoma mansonii, Schistosoma haematobium, Schistosoma japonicum, Cryptosporidium, Ancylostoma, Entamoeba histolytica, Entamoeba coli, Entamoeba dispar, Entamoeba hartmanni, Entamoeba polecki, Wuchereria bancrofti, Giardia и Leishmania.
[00378] Способы определения того, способна ли композиция согласно настоящему изобретению эффективно доставлять биоактивный агент и/или оказывать желательное действие на субъекта, известны в данной области и не описаны подробно в данной заявке. В одном аспекте иммунные ответы против антигена можно определить путем отслеживания уровня антигенспецифического антитела до и после введения (например, системного IgM, IgG (IgG1, IgG2a и др.) или IgA) в образцах крови или из участков слизистой. Клеточные иммунные ответы также можно отслеживать после введения путем оценки функции T- и B-клеток после стимуляции антигеном.
[00379] Другим способом оценки иммуногенности композиций или вакцин, описанных в данной заявке, в которых молекула нуклеиновой кислоты (например, РНК) кодирует белковый антиген, является экспрессия рекомбинантного белкового антигена для скрининга сыворотки или секретов слизистых пациента с помощью иммуноблоттинга и/или микрочипов. Положительная реакция между белком и образцом из пациента свидетельствует о том, что у пациента возник иммунный ответ на обсуждаемый белок. Данный способ также можно применять, чтобы определить иммунодоминантные антигены и/или эпитопы в белковых антигенах.
[00380] Эффективность композиций также можно определить in vivo путем стимуляции подходящих моделей на животных с помощью инфицирования интересующим патогеном.
[00381] В вариантах реализации, предложенных в данной заявке, субъект представляет собой млекопитающее (например, животное, включая сельскохозяйственных животных (коров, свинней, коз, лошадей и т.д.), домашних питомцев (кошек, собак и т.д.), и грызунов (крыс, мышей и т.д.), или человека). В одном варианте реализации субъект представляет собой человека. В другом варианте реализации субъект представляет собой не относящееся к человеку млекопитающее. В другом варианте реализации не относящееся к человеку млекопитающее представляет собой собаку, корову или лошадь.
[00382] X. Способы доставки биоактивного агента в клетку.
[00383] В данной заявке предложены способы доставки биоактивного агента в клетку, включающие этап приведения клетки в контакт с композицией, описанной в данной заявке. В некоторых вариантах реализации биоактивный агент представляет собой нуклеиновую кислоту. В некоторых вариантах реализации приведение клетки в контакт с композицией включает этап введения композиции субъекту, если клетка находится в организме субъекта. Такие способы пригодны для доставки антигена или кодирующих антиген нуклеиновых кислот для выработки иммунного ответа. Такие способы также пригодны для доставки кодирующих антиген нуклеиновых кислот, белковых или низкомолекулярных лекарственных средств, гормонов, некодирующих молекул РНК и других биоактивных агентов для лечения заболевания и нарушений здоровья.
[00384] Способы доставки биоактивного агента в клетку, описанные в данной заявке, могут найти применение при лечении заболеваний и нарушений здоровья, включая, без ограничения, рак, такой как менингиомы, гепатоцеллюлярная карцинома, опухоли поджелудочной железы; аллергию; инфекционные заболевания, включая грибковые, бактериальные или паразитарные заболевания; воспалительные заболевания, включая псориаз и артрит, и атриовентрикулярные мальформации; аутоиммунные заболевания и неврологические заболевания.
[00385] В вариантах реализации способов доставки композиции в клетку, включающих этап введения композиции субъекту, если клетка находится в организме субъекта, обычные пути введения терапевтически эффективного количества композиции включают, без ограничения, пероральный, топический, парентеральный, сублингвальный, буккальный, ректальный, вагинальный, внутривенный, внутрикожный, трансдермальный, интраназальный, внутрислизистый или подкожный пути. В предпочтительных вариантах реализации введение композиции осуществляют внутримышечным, парентеральным или внутрикожным путем. В таких вариантах реализации субъект представляет собой млекопитающее (например, животное, включая сельскохозяйственных животных (коров, свинней, коз, лошадей и т.д.), домашних питомцев (кошек, собак и т.д.), и грызунов (крыс, мышей и т.д.), или человека). В одном варианте реализации субъект представляет собой человека. В другом варианте реализации субъект представляет собой не относящееся к человеку млекопитающее. В другом варианте реализации не относящееся к человеку млекопитающее представляет собой собаку, корову или лошадь.
[00386] В некоторых вариантах реализации можно использовать множество режимов доставки для получения более сильного иммунного ответа. Например, композицию можно вводить 1, 2, 3 или 4 раза. В некотором варианте реализации одно или более введений можно осуществить в рамках протокола так называемого «примирования/стимулирования». В некоторых вариантах реализации подход «примирования/стимулирования» включает введение несколькими этапами, в которых один и тот же антиген вводят посредством различных векторов или множеством доз. В некоторых вариантах реализации введение можно осуществить более двух раз, например, три раза, четыре раза и т.д., так что за первым примирующим введением следует более чем одно стимулирующее введение. Если вводят множество векторов или доз, то их введение можно отделить друг от друга, например, интервалом в одну неделю, две недели, три недели, один месяц, шесть недель, два месяца, три месяца, шесть месяцев, один год или большим интервалом. В некоторых вариантах реализации подход примирования/стимулирования включает стадию РНК и стадию белка. Стадия РНК может включать, например, введение РНК, несущей ген, кодирующий антигенный белок, трансляцию указанной РНК с получением антигена и продукцию соответствующих антител у субъекта. Стадия белка может включать, например, введение антигена непосредственно в виде белка. В некоторых вариантах реализации субъекту вводят (например, примируют) онколитический вирус (который может входить в состав с НЛН или без НЛН), который кодирует неоантиген, а затем дополнительно вводят (например, повторно стимулируют) НЛН, содержащий конструкцию РНК, которая кодирует неоантиген.
[00387] XI. Внутрикожная доставка РНК (необязательно посредством MicronJet600™)
[00388] MicronJet600® представляет собой малое пластиковое устройство, оборудованное 3 микроиглами, каждая длиной 600 микрометров (0,6 мм). Данное устройство можно закрепить на любом стандартном шприце вместо стандартной иглы. Сами микроиглы сделаны из кремниевого кристалла и встроены (присоединены) после размещения рядами в поликарбонатную основу с применением биосовместимого УФ-отверждаемого клея.
[00389] Внутрикожную доставку можно осуществить путем применения микроигл высотой менее 1 мм или 1000 микрон; и более предпочтительно высотой 500 - 750 микрон.
[00390] Инъекционное устройство с микроиглами предпочтительно содержит множество игл, обычно 3 микроиглы.
[00391] Инъекционное устройство с микроиглами обращено «вниз» (срезом вниз), т.е. инъекционное отверстие обращено вглубь кожи, а не срезом вверх. Это позволяет надежно провести инъекцию без утечки. Ориентацию инъекции предпочтительно определяют по видимым или механическим элементам основы/адаптера.
[00392] Инъекцию микроиглами осуществляют в неглубокую дерму и эпидерму. Это позволяет эффективную экспрессию и иммунизацию.
[00393] Глубина инъекции микроиглами обычно составляет приблизительно 100 - 750 микрон, и более предпочтительно приблизительно 300 - 400 микрон. Это противоположно применению обычных игл или других мини- или микроигл, которыми обычно осуществляют доставку в более глубокий слой кожи или под кожу.
[00394] Угол инъекции предпочтительно составляет приблизительно 45 градусов (обычно ±20° и более предпочтительно ±10°), позволяя выбирать поверхностное место инъекции по сравнению со стандартными иглами и другими перпендикулярными микроиглами.
[00395] В настоящей заявке предложены система и способ доставки РНК, включая рвРНК (РНК-репликон), животному или пациенту-человеку (например, субъекту), включающие введение РНК (например, рвРНК) в эпидерму или дерму кожи на глубину от приблизительно 100 до приблизительно 700 микрон от поверхности кожи. Будет доставлено количество РНК, эффективное для осуществления экспрессии белка, кодируемого указанной РНК. Белок может представлять собой антиген, описанный в данной заявке, и может представлять собой, например, компонент вакцины.
[00396] РНК можно вводить с помощью устройства внутрикожной доставки, содержащего одну или более микроигл; причем устройство внутрикожной доставки разработано для неглубокой внутрикожной доставки.
[00397] РНК можно вводить с помощью устройства внутрикожной доставки согласно идее US6533949 и/или US7998119, которые полностью включены в данную заявку посредством ссылки.
[00398] Любые из содержащих РНК составов и/или композиций, описанных в данной заявке, можно вводить внутрикожно посредством устройства с микроиглами, описанного в данной заявке. Также можно применять другие внутрикожные устройства для доставки РНК, включая, например, устройства внутрикожной доставки путем электропорации. В некоторых предпочтительных вариантах реализации доставка РНК будет вызывать иммунный ответ у субъекта.
[00399] XII. Способы оптимизации доставки РНК в клетку.
[00400] В данной заявке предложены способы оптимизации доставки РНК в клетку, включающие этап выбора молярного отношения азота (N) к фосфату (P), которое оптимизирует титры антител, продуцированных у субъекта, содержащего указанную клетку. В типичном варианте реализации фактическое отношение N к P используют для интерпретации связывания РНК-НЛН и соответствующей экспрессии in vitro кодируемого РНК белка. Типичное молярное отношение N к P может составлять от 1 до 200, от 1 до 100, предпочтительно от 1 до 50, более предпочтительно от приблизительно 5 до приблизительно 50 или от приблизительно 5 до приблизительно 40. В некоторых типичных вариантах реализации молярное отношение N к P может составлять от 1 до 15 или от 1 до 7.
[00401] XIII. Наборы и продукты производства.
[00402] Также в некоторых вариантах реализации предложены наборы, содержащие описанные в данной заявке наноструктурированные липидные носители (НЛН) и композиции, которые могут быть предоставлены в одном или более контейнерах. В одном варианте реализации все компоненты указанных композиций присутствуют вместе в одном контейнере. В других вариантах реализации компоненты указанных композиций могут находиться в двух или более контейнерах. В предпочтительном варианте реализации НЛН предоставлен в одном контейнере, в биоактивный агент предоставлен в другом контейнере.
[00403] В некоторых вариантах реализации один флакон набора содержит НЛН, предложенный в данной заявке, а второй флакон набора содержит молекулу РНК. В некоторых вариантах реализации набор содержит третий флакон, содержащий необязательный компонент.
[00404] Наборы согласно настоящему изобретению могут дополнительно содержать инструкции по применению, описанному в данной заявке, или инструкции по смешиванию материалов, содержащихся во флаконах. В некоторых вариантах реализации материал во флаконе сухой или лиофилизированный. В некоторых вариантах реализации материал во флаконе жидкий.
[00405] Контейнер согласно таким вариантам реализации наборов может представлять собой любой подходящий контейнер, сосуд, флакон, ампулу, пробирку, стакан, коробку, бутылку, флакон, банку, чашку, лунку однолуночного или многолуночного устройства, резервуар, бак или тому подобный контейнер, или другое устройство, в котором описанные в данной заявке композиции можно разместить, хранить и/или транспортировать, и иметь доступ, чтобы вынуть содержимое. Обычно такой контейнер может быть сделан из материала, который совместим с предполагаемым применением и из которого можно легко вынуть находящееся в нем содержимое. Лишь некоторые из примеров таких контейнеров включают стеклянные и/или пластиковые герметичные или повторно герметизируемые пробирки и ампулы, включая содержащие резиновую перегородку или другие средства герметизации, которые совместимы с изъятием содержимого с применением иглы и шприца. Такие контейнеры, например, могут быть сделаны из стекла или химически совместимого пластика или полимера, которые могут быть сделаны или покрыты материалом, позволяющим эффективное изъятие материала из контейнера и/или защищающим материал, например, от деструктивных условий, таких как ультрафиолетовое излучение или перепады температур, или от проникновения нежелательных примесей, включая контаминацию микробами. Указанные контейнеры предпочтительно стерильные или могут быть стерилизованы, и сделаны из материалов, которые будут совместимы с любым носителем, вспомогательным веществом, растворителем, средой или тому подобными материалами, например, их можно использовать для суспендирования или растворения описанных в данной заявке вакцинных композиций, и/или иммунологических адъювантных композиций, и/или антигенов, и/или конструкций для рекомбинантной экспрессии, и т.д.
[00406] XIV. Типичные варианты реализации.
Вариант реализации 1. Композиция, содержащая частицы наноструктурированного липидного носителя (НЛН) для доставки биоактивного агента в клетку, в которой частицы НЛН содержат:
(a) масляную сердцевину, содержащую смесь жидкофазного липида и твердофазного липида,
(b) катионный компонент, предпочтительно катионный липид,
(c) гидрофобное поверхностно-активное вещество, предпочтительно сложный эфир сорбитана, и
(d) поверхностно-активное вещество, предпочтительно гидрофильное поверхностно-активное вещество.
Вариант реализации 2. Композиция согласно варианту реализации 1, отличающаяся тем, что биоактивный агент связан с частицами НЛН.
Вариант реализации 3. Композиция согласно варианту реализации 1 или варианту реализации 2, отличающаяся тем, что указанная композиция доставляет биоактивный агент в клетку.
Вариант реализации 4. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 3, отличающаяся тем, что гидрофобное поверхностно-активное вещество представляет собой сложный эфир сорбитана, и он присутствует в количестве, достаточном для повышения способности композиции доставлять биоактивный агент в клетку по сравнению с таковой у сопоставимой композиции без сложного эфира сорбитана.
Вариант реализации 5. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 4, отличающаяся тем, что биоактивный агент представляет собой белок, или биоактивный агент кодирует белок.
Вариант реализации 6. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 4, отличающаяся тем, что биоактивный агент представляет собой белковый антиген, или биоактивный агент кодирует белковый антиген.
Вариант реализации 7. Композиция согласно варианту реализации 6, отличающаяся тем, что клетка находится в организме субъекта, и отличающаяся тем, что композиция вызывает иммунный ответ у субъекта против указанного антигена.
Вариант реализации 8. Композиция согласно варианту реализации 6 или 7, отличающаяся тем, что антиген получен или вступает в иммунологическую перекрестную реакцию с инфекционным патогеном и/или эпитопом, биомолекулой, клеткой или тканью, которые связаны с инфекцией, раком или аутоиммунным заболеванием.
Вариант реализации 9. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 6 по 8, отличающаяся тем, что гидрофобное поверхностно-активное вещество представляет собой сложный эфир сорбитана, и указанный сложный эфир сорбитана присутствует в количестве, достаточном для повышения способности композиции вызывать иммунный ответ к антигену по сравнению с таковой у сопоставимой композиции без сложного эфира сорбитана.
Вариант реализации 10. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 6 по 9, отличающаяся тем, что при введении в эффективном количестве субъекту, указанная композиция вызывает иммунный ответ к антигену, равный или больший, чем иммунный ответ, вызванный, когда биоактивный агент вводят субъекту без НЛН.
Вариант реализации 11. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 6 по 10, отличающаяся тем, что гидрофобное поверхностно-активное вещество представляет собой сложный эфир сорбитана, и при введении в эффективном количестве субъекту указанная композиция вызывает образование титров антител к антигену на более высоком уровне, чем титры антител, вызванные, когда сопоставимую композицию, в которой отсутствует сложный эфир сорбитана, вводят субъекту.
Вариант реализации 12. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 6 по 11, отличающаяся тем, что гидрофобное поверхностно-активное вещество представляет собой сложный эфир сорбитана, и композиция вызывает образование титров нейтрализующих антител у субъекта на более высоком уровне, чем титры нейтрализующих антител, вызванные у субъекта сопоставимой композицией, в которой отсутствует сложный эфир сорбитана.
Вариант реализации 13. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 12, отличающаяся тем, что биоактивный агент представляет собой РНК или ДНК.
Вариант реализации 14. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 12, отличающаяся тем, что биоактивный агент представляет собой мРНК.
Вариант реализации 15. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 12, отличающаяся тем, что биоактивный агент представляет собой онколитическую вирусную РНК.
Вариант реализации 16. Композиция согласно варианту реализации 13 или 14, отличающаяся тем, что РНК представляет собой репликон.
Вариант реализации 17. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 13 по 16, отличающаяся тем, что РНК кодирует антиген.
Вариант реализации 18. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 13 по 16, отличающаяся тем, что РНК кодирует антитело.
Вариант реализации 19. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 13 по 16, отличающаяся тем, что РНК представляет собой некодирующую РНК.
Вариант реализации 20. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 19, отличающаяся тем, что жидкофазный липид способен метаболизироваться.
Вариант реализации 21. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 20, отличающаяся тем, что жидкофазный липид представляет собой растительное масло, животное масло или полученное синтетическим путем масло.
Вариант реализации 22. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 21, отличающаяся тем, что жидкофазный липид представляет собой рыбий жир.
Вариант реализации 23. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 20, отличающаяся тем, что жидкофазный липид представляет собой каприновый/каприловый триглицерид, витамин E, лауроилполиоксилглицерид, моноацилглицерин, соевый лецитин, сквален или сквалан, или комбинацию перечисленных липидов.
Вариант реализации 24. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 21, отличающаяся тем, что жидкофазный липид представляет собой сквален, подсолнечное масло, соевое масло, оливковое масло, виноградное масло, сквалан, каприновый/каприловый триглицерид, или комбинацию перечисленных липидов.
Вариант реализации 25. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 21, отличающаяся тем, что жидкофазный липид представляет собой встречающийся в природе или синтетический терпеноид.
Вариант реализации 26. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 21, отличающаяся тем, что жидкофазный липид представляет собой сквален.
Вариант реализации 27. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 26, отличающаяся тем, что твердофазный липид представляет собой глицеролипид.
Вариант реализации 28. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 26, отличающаяся тем, что твердофазный липид представляет собой микрокристаллический триглицерид.
Вариант реализации 29. Композиция согласно варианту реализации 28, отличающаяся тем, что микрокристаллический триглицерид представляет собой тримиристин.
Вариант реализации 30. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 29, отличающаяся тем, что катионный компонент представляет собой катионный липид, выбранный из: 1,2-диолеоилокси-3-(триметиламмонио)пропана (ДОТАП), 3β-[N-(N',N'-диметиламиноэтан)-карбамоил]холестерина (ДК-холестерина), диметилдиоктадециламмония (ДДА), 1,2-димиристоил-3-триметиламмоний-пропана (ДМТАП), дипальмитоил(C16:0)-триметиламмоний-пропана (ДПТАП), дистеароилтриметиламмоний-пропана (ДСТАП), N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония хлорида (ДОТМА), N,N-диолеоил-N,N-диметиламмония хлорида (ДОДАХ), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-этилфосфохолина (ДОЭФХ), 1,2-диолеоил-3-диметиламмоний-пропана (ДОДАП) и 1,2-дилинолеилокси-3-диметиламинопропана (ДЛинДМА), и комбинации перечисленных липидов.
Вариант реализации 31. Композиция согласно варианту реализации 30, отличающаяся тем, что катионный липид представляет собой 1,2-диолеоилокси-3-(триметиламмонио)пропан (ДОТАП).
Вариант реализации 32. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 31, отличающаяся тем, что гидрофильное поверхностно-активное вещество представляет собой полиэтиленгликоль.
Вариант реализации 33. Композиция согласно варианту реализации 32, отличающаяся тем, что гидрофильное поверхностно-активное вещество представляет собой сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана.
Вариант реализации 34. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 33, отличающаяся тем, что средний коэффициент полидисперсности частиц НЛН составляет от 0,1 до приблизительно 0,5.
Вариант реализации 35. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 33, отличающаяся тем, что средний коэффициент полидисперсности частиц НЛН составляет от приблизительно 0,2 до приблизительно 0,5.
Вариант реализации 36. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 33, отличающаяся тем, что средний коэффициент полидисперсности частиц НЛН составляет от приблизительно 0,2 до приблизительно 0,4 или от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,4.
Вариант реализации 37. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 33, отличающаяся тем, что средний коэффициент полидисперсности частиц НЛН составляет от приблизительно 0,2 до приблизительно 0,3 или от приблизительно 0,1 до приблизительно 0,3.
Вариант реализации 38. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 37, отличающаяся тем, что Z-средний диаметр частиц НЛН составляет от приблизительно 40 нм до приблизительно 60 нм.
Вариант реализации 39. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 37, отличающаяся тем, что Z-средний диаметр частиц НЛН составляет от приблизительно 20 нм до приблизительно 200 нм, от приблизительно 20 нм до приблизительно 150 нм, от приблизительно 20 нм до приблизительно 100 нм, от приблизительно 20 нм до приблизительно 80 нм, или от приблизительно 20 нм до приблизительно 60 нм, или от приблизительно 40 нм до приблизительно 200 нм, от приблизительно 40 нм до приблизительно 150 нм, от приблизительно 40 нм до приблизительно 100 нм, от приблизительно 40 нм до приблизительно 80 нм, или от приблизительно 40 нм до приблизительно 60 нм.
Вариант реализации 40. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 39, отличающаяся тем, что гидрофобное поверхностно-активное вещество представляет собой сложный эфир сорбитана, имеющий значение гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ) от 1 до 5.
Вариант реализации 41. Композиция согласно варианту реализации 40, отличающаяся тем, что гидрофобное поверхностно-активное вещество представляет собой сложный эфир сорбитана, имеющий значение ГЛБ от 4 до 5.
Вариант реализации 42. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 40, отличающаяся тем, что гидрофобное поверхностно-активное вещество представляет собой сложный эфир сорбитана, и указанный сложный эфир сорбитана представляет собой сложный моноэфир сорбитана.
Вариант реализации 43. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 40, отличающаяся тем, что гидрофобное поверхностно-активное вещество представляет собой сложный эфир сорбитана, и указанный сложный эфир сорбитана представляет собой сорбитана моностеарат.
Вариант реализации 44. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 40, отличающаяся тем, что гидрофобное поверхностно-активное вещество представляет собой сложный эфир сорбитана, и указанный сложный эфир сорбитана представляет собой сорбитана моноолеат.
Вариант реализации 45. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 44, отличающаяся тем, что Z-средний диаметр частиц НЛН составляет от приблизительно 40 нм до приблизительно 80 нм.
Вариант реализации 46. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 44, отличающаяся тем, что Z-средний диаметр частиц НЛН составляет от приблизительно 40 нм до приблизительно 60 нм.
Вариант реализации 47. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 46, отличающаяся тем, что молярное отношение масла к поверхностно-активному веществу составляет от приблизительно 0,5 до приблизительно 12, более предпочтительно от приблизительно 0,5 до приблизительно 9.
Вариант реализации 48. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 46, отличающаяся тем, что молярное отношение масла к поверхностно-активному веществу составляет от приблизительно 0,5 до приблизительно 1.
Вариант реализации 49. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 48, отличающаяся тем, что отношение гидрофильного поверхностно-активного вещества к катионному компоненту составляет от приблизительно 0,2 до приблизительно 1,5.
Вариант реализации 50. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 48, отличающаяся тем, что отношение гидрофильного поверхностно-активного вещества к катионному компоненту составляет от приблизительно 0,2 до приблизительно 1.
Вариант реализации 51. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 50, отличающаяся тем, что емкость загрузки РНК составляет по меньшей мере по меньшей мере приблизительно 100 мкг РНК/мл.
Вариант реализации 52. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 51, отличающаяся тем, что гидрофобное поверхностно-активное вещество представляет собой сложный эфир сорбитана, и указанный сложный эфир сорбитана представляет собой сложный триэфир сорбитана.
Вариант реализации 53. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 51, отличающаяся тем, что гидрофобное поверхностно-активное вещество представляет собой сложный эфир сорбитана, и указанный сложный эфир сорбитана представляет собой сорбитана триолеат.
Вариант реализации 54. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 51, содержащая от приблизительно 0,2% до приблизительно 40% (масса/объем) жидкофазного липида, от приблизительно 0,1% до приблизительно 10% (масса/объем) твердофазного липида, от приблизительно 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем) катионного липида, от приблизительно 0,25% до приблизительно 5% (масса/объем) сложного моноэфира сорбитана и от приблизительно 0,5% до приблизительно 10% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества.
Вариант реализации 55. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 51, содержащая от приблизительно 2% до приблизительно 40% (масса/объем) жидкофазного липида, от приблизительно 0,1% до приблизительно 10% (масса/объем) твердофазного липида, от приблизительно 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем) катионного липида, от приблизительно 0,25% до приблизительно 5% (масса/объем) сложного моноэфира сорбитана и от приблизительно 0,5% до приблизительно 10% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества.
Вариант реализации 56. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 53, содержащая от приблизительно 10% до приблизительно 40% (масса/объем) жидкофазного липида, от приблизительно 1% до приблизительно 2% твердофазного липида, от приблизительно 2% до приблизительно 5% катионного липида, от приблизительно 3 до приблизительно 5% (масса/объем) сложного эфира сорбитана и от приблизительно 3% до приблизительно 5% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества.
Вариант реализации 57. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 53, содержащая приблизительно 15% (масса/объем) жидкофазного липида и приблизительно 1% твердофазного липида, или приблизительно 30% (масса/объем) жидкофазного липида и приблизительно 1,8% твердофазного липида, и приблизительно 3% катионного липида, приблизительно 3,7% (масса/объем) сложного эфира сорбитана и приблизительно 3,7% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества.
Вариант реализации 58. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 53, содержащая от приблизительно 2% до приблизительно 6% (масса/объем) жидкофазного липида, от приблизительно 0,1% до приблизительно 1% (масса/объем) твердофазного липида, от приблизительно 0,2% до приблизительно 1% (масса/объем) катионного липида, от приблизительно 0,25% до приблизительно 1% (масса/объем) сложного моноэфира сорбитана и от приблизительно 0,5% до приблизительно 5% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества.
Вариант реализации 59. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 53, содержащая приблизительно 3,75% (масса/объем) жидкофазного липида, приблизительно 0,25% (масса/объем) твердофазного липида, приблизительно 3% (масса/объем) катионного липида, приблизительно 3,7% (масса/объем) сложного эфира сорбитана и приблизительно 3,7% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества.
Вариант реализации 60. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 53, содержащая от приблизительно 0,2% до приблизительно 40% (масса/объем) жидкофазного липида, от приблизительно 0,1% до приблизительно 10% (масса/объем) твердофазного липида, от приблизительно 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем) катионного липида, от приблизительно 0,25% до приблизительно 5% (масса/объем) сложного эфира сорбитана и от приблизительно 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества.
Вариант реализации 61. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 53, содержащая от приблизительно 0,2% до приблизительно 40% (масса/объем) жидкофазного липида, от приблизительно 0,1% до приблизительно 10% (масса/объем) твердофазного липида, от приблизительно 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем) катионного липида, от приблизительно 0,25% до приблизительно 15% (масса/объем) сложного эфира сорбитана и от приблизительно 0,2% или приблизительно 0,5% до приблизительно 15% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества.
Вариант реализации 62. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 53, содержащая от приблизительно 2% до приблизительно 40% (масса/объем) жидкофазного липида, от приблизительно 0,1% до приблизительно 10% (масса/объем) твердофазного липида, от приблизительно 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем) катионного липида, от приблизительно 0,25% до приблизительно 5% (масса/объем) сложного эфира сорбитана и от приблизительно 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества.
Вариант реализации 63. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 53, содержащая от приблизительно 2% до приблизительно 6% (масса/объем) жидкофазного липида, от приблизительно 0,1% до приблизительно 1% (масса/объем) твердофазного липида, от приблизительно 0,2% до приблизительно 1% (масса/объем) катионного липида, от приблизительно 0,25% до приблизительно 1% (масса/объем) сложного моноэфира сорбитана и от приблизительно 0,2% до приблизительно 5% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества.
Вариант реализации 64. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 53, содержащая приблизительно 4% (масса/объем) жидкофазного липида, приблизительно 0,25% (масса/объем) твердофазного липида, приблизительно 0,4% (масса/объем) катионного липида, приблизительно 0,5% (масса/объем) сложного эфира сорбитана и приблизительно 0,5% (масса/объем) гидрофильного поверхностно-активного вещества.
Вариант реализации 65. Композиция, содержащая разбавленную или концентрированную форму композиции согласно любому из вариантов реализации с 54 по 64.
Вариант реализации 66. Композиция согласно варианту реализации 65, отличающаяся тем, что указанная композиция согласно любому из вариантов реализации с 54 по 64 разбавлена в от 2 до 30 раз.
Вариант реализации 67. Композиция согласно варианту реализации 65, отличающаяся тем, что указанная композиция согласно любому из вариантов реализации с 54 по 64 разбавлена в от 2 до 20 раз.
Вариант реализации 68. Композиция согласно варианту реализации 65, отличающаяся тем, что указанная композиция согласно любому из вариантов реализации с 54 по 64 разбавлена в 2 раза.
Вариант реализации 69. Композиция согласно варианту реализации 65, отличающаяся тем, что указанная композиция согласно любому из вариантов реализации с 54 по 64 сконцентрирована в от 2 до 30 раз.
Вариант реализации 70. Композиция согласно варианту реализации 65, отличающаяся тем, что указанная композиция согласно любому из вариантов реализации с 54 по 64 сконцентрирована в от 2 до 10 раз.
Вариант реализации 71. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 54 по 70, отличающаяся тем, что жидкофазный липид представляет собой встречающийся в природе или синтетический терпеноид.
Вариант реализации 72. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 54 по 70, отличающаяся тем, что жидкофазный липид представляет собой встречающийся в природе или синтетический сквален.
Вариант реализации 73. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 54 по 72, отличающаяся тем, что твердофазный липид представляет собой глицеролипид.
Вариант реализации 74. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 54 по 72, отличающаяся тем, что твердофазный липид представляет собой микрокристаллический триглицерид.
Вариант реализации 75. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 54 по 72, отличающаяся тем, что твердофазный липид представляет собой тримиристин.
Вариант реализации 76. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 54 по 75, отличающаяся тем, что катионный липид представляет собой ДОТАП.
Вариант реализации 77. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 54 по 76, отличающаяся тем, что сложный эфир сорбитана представляет собой сорбитана моностеарат.
Вариант реализации 78. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 54 по 76, отличающаяся тем, что сложный эфир сорбитана представляет собой сорбитана моноолеат.
Вариант реализации 79. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 54 по 76, отличающаяся тем, что сложный эфир сорбитана представляет собой сорбитана триолеат.
Вариант реализации 80. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 54 по 77, отличающаяся тем, что гидрофильное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат.
Вариант реализации 81. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 54 по 77, отличающаяся тем, что гидрофильное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80.
Вариант реализации 82. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 20, с 34 по 41, с 45 по 51 и с 54 по 70, отличающаяся тем, что масляная сердцевина содержит встречающийся в природе или синтетический сквален и глицеролипид, что катионный липид представляет собой ДОТАП, что сложный эфир сорбитана представляет собой сорбитана моностеарат или сорбитана моноолеат, и что гидрофильное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат.
Вариант реализации 83. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 20, с 34 по 41, с 45 по 51 и с 54 по 70, отличающаяся тем, что масляная сердцевина содержит сквален и тримиристин, что катионный липид представляет собой ДОТАП, что сложный эфир сорбитана представляет собой сорбитана моностеарат, и что гидрофильное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80.
Вариант реализации 84. Композиция согласно варианту реализации 83, отличающаяся тем, что НЛН содержит от приблизительно 2% до приблизительно 40% (масса/объем) сквалена, от приблизительно 0,1% до приблизительно 10% (масса/объем) тримиристина, от приблизительно 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем) ДОТАП, от приблизительно 0,25% до приблизительно 5% (масса/объем) сорбитана моностеарата и от приблизительно 0,5% до приблизительно 10% (масса/объем) полисорбата 80.
Вариант реализации 85. Композиция согласно варианту реализации 83, отличающаяся тем, что НЛН содержит от приблизительно 2% до приблизительно 6% (масса/объем) сквалена, от приблизительно 0,1% до приблизительно 1% (масса/объем) тримиристина, от приблизительно 0,2% до приблизительно 1% (масса/объем) ДОТАП, от приблизительно 0,25% до приблизительно 1% (масса/объем) сорбитана моностеарата и от приблизительно 0,5% до приблизительно 5% (масса/объем) полисорбата 80.
Вариант реализации 86. Композиция согласно варианту реализации 85, отличающаяся тем, что НЛН содержит приблизительно 3,75% (масса/объем) сквалена, приблизительно 0,25% (масса/объем) тримиристина, приблизительно масса/объем 3% ДОТАП, приблизительно 3,7% (масса/объем) сорбитана моностеарата и приблизительно 3,7% (масса/объем) полисорбата 80.
Вариант реализации 87. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 20, с 34 по 41, с 45 по 51 и с 54 по 70, отличающаяся тем, что масляная сердцевина содержит встречающийся в природе или синтетический сквален и глицеролипид, что катионный липид представляет собой ДОТАП, что сложный эфир сорбитана представляет собой сорбитана моностеарат, или сорбитана моноолеат, или сорбитана триолеат и что гидрофильное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат.
Вариант реализации 88. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 20, с 34 по 41, с 45 по 51 и с 54 по 70, отличающаяся тем, что масляная сердцевина содержит сквален и тримиристин, что катионный липид представляет собой ДОТАП, что сложный эфир сорбитана представляет собой сорбитана моностеарат, или сорбитана моноолеат, или сорбитана триолеат и что гидрофильное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80.
Вариант реализации 89. Композиция согласно варианту реализации 87 или варианту реализации 88, отличающаяся тем, что НЛН содержит от приблизительно 2% до приблизительно 40% (масса/объем) сквалена, от приблизительно 0,1% до приблизительно 10% (масса/объем) тримиристина, от приблизительно 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем) ДОТАП, от приблизительно 0,25% до приблизительно 5% (масса/объем) сорбитана моностеарата, или сорбитана моноолеата, или сорбитана триолеата и от приблизительно 0,2% до приблизительно 10% (масса/объем) полисорбата 80.
Вариант реализации 90. Композиция согласно варианту реализации 87 или варианту реализации 88, отличающаяся тем, что НЛН содержит от приблизительно 2% до приблизительно 6% (масса/объем) сквалена, от приблизительно 0,1% до приблизительно 1% (масса/объем) тримиристина, от приблизительно 0,2% до приблизительно 1% (масса/объем) ДОТАП, от приблизительно 0,25% до приблизительно 1% (масса/объем) сорбитана моностеарата, или сорбитана моноолеата, или сорбитана триолеата и от приблизительно 0,2% до приблизительно 5% (масса/объем) полисорбата 80.
Вариант реализации 91. Композиция согласно варианту реализации 87 или варианту реализации 88, отличающаяся тем, что НЛН содержит приблизительно 4% (масса/объем) сквалена, приблизительно 0,25% (масса/объем) тримиристина, приблизительно масса/объем 0,4% ДОТАП, приблизительно 0,5% (масса/объем) сорбитана моностеарата, или сорбитана моноолеата, или сорбитана триолеата, и приблизительно 0,5% (масса/объем) полисорбата 80.
Вариант реализации 92. Способ выработки иммунного ответа у субъекта, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества композиции согласно любому из вариантов реализации с 1 по 91, отличающийся тем, что биоактивный агент представляет собой белковый антиген или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белковый антиген.
Вариант реализации 93. Способ согласно варианту реализации 92, отличающийся тем, что биоактивный агент представляет собой РНК.
Вариант реализации 94. Способ согласно варианту реализации 92 или 93, отличающийся тем, что введение композиции осуществляют внутримышечным, парентеральным или внутрикожным путем.
Вариант реализации 95. Способ выработки иммунного ответа у субъекта, включающий (a) введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества онколитического вируса, кодирующего белковый антиген, и (b) введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества композиции согласно любому из вариантов реализации с 1 по 91, в которой биоактивный агент представляет собой белковый антиген или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белковый антиген.
Вариант реализации 96. Способ согласно варианту реализации 95, отличающийся тем, что введение (a) и введение (b) осуществляют с интервалом между введениями, составляющим по меньшей мере 1 неделю, по меньшей мере 2 недели, по меньшей мере 3 недели, по меньшей мере 1 месяц, по меньшей мере 6 недель, по меньшей мере два месяца, по меньшей мере три месяца, по меньшей мере 6 месяцев или по меньшей мере 1 год.
Вариант реализации 97. Способ доставки биоактивного агента в клетку, включающий приведение клетки в контакт с композицией согласно любому из вариантов реализации с 1 по 91.
Вариант реализации 98. Способ согласно варианту реализации 97, отличающийся тем, что биоактивный агент представляет собой нуклеиновую кислоту.
Вариант реализации 99. Способ согласно варианту реализации 97 или варианту реализации 98, отличающийся тем, что приведение клетки в контакт с композицией включает введение композиции субъекту, причем клетка находится в организме субъекта.
Вариант реализации 100. Способ оптимизации доставки биоактивного агента в клетку, включающий выбор молярного отношения биоактивного агента к НЛН, который оптимизирует титры антител, продуцируемые у субъекта, содержащего клетку.
Вариант реализации 101. Способ согласно варианту реализации 100, отличающийся тем, что НЛН представляет собой частицу НЛН согласно любому из вариантов реализации с 1 по 91.
Вариант реализации 102. Способ получения композиции согласно любому из вариантов реализации с 1 по 91, включающий:
(a) смешивание твердофазного липида, жидкофазного липида, катионного липида и гидрофобного поверхностно-активного вещества с получением смеси масляной фазы;
(b) смешивание гидрофильного поверхностно-активного вещества и воды с получением смеси водной фазы;
(c) смешивание смеси масляной фазы со смесью водной фазы с получением частиц НЛН; и
(a) необязательно объединение биоактивного агента с частицами НЛН таким образом, что биоактивный агент связывается с поверхностью частиц НЛН посредством нековалентных взаимодействий или посредством обратимых ковалентных взаимодействий.
Вариант реализации 103. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 91, отличающаяся тем, что биоактивный агент представляет собой РНК, и что РНК кодирует один или более антигенов TB.
Вариант реализации 104. Композиция согласно варианту реализации 103, отличающаяся тем, что РНК кодирует один или более антигенов TB, выбранных из Rv3619, Rv2389, Rv3478 и Rv1886.
Вариант реализации 105. Композиция согласно варианту реализации 104, отличающаяся тем, что РНК кодирует антигены TB Rv3619, Rv 2389, Rv3478 и Rv1886.
Вариант реализации 106. Способ согласно любому из вариантов реализации с 92 по 99, отличающийся тем, что биоактивный агент представляет собой РНК, и что РНК кодирует один или более антигенов TB.
Вариант реализации 107. Способ согласно варианту реализации 106, отличающийся тем, что РНК кодирует один или более антигенов TB, выбранных из Rv3619, Rv 2389, Rv3478 и Rv1886.
Вариант реализации 108. Способ согласно варианту реализации 107, отличающийся тем, что РНК кодирует антигены TB Rv3619, Rv 2389, Rv3478 и Rv1886.
Вариант реализации 109. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 1 по 91, отличающаяся тем, что биоактивный агент представляет собой адъювант.
Вариант реализации 110. Композиция согласно варианту реализации 109, отличающаяся тем, что адъювант выбирают из агониста TLR, агониста Rig-I, сапонина, углевода, углеводного полимера, конъюгированного углевода, целой вирусной частицы, подобной вирусу частицы, фрагментов вирусов и фрагментов клеток.
Вариант реализации 111. Композиция согласно варианту реализации 110, отличающаяся тем, что адъювант выбирают из агониста TLR и агониста Rig-I.
Вариант реализации 112. Композиция согласно варианту реализации 111, отличающаяся тем, что агонист TLR представляет собой агонист TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 или TLR9.
Вариант реализации 113. Композиция согласно варианту реализации 111, отличающаяся тем, что агонист TLR представляет собой агонист TLR3.
Вариант реализации 114. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 109 по 112, отличающаяся тем, что биоактивный агент выбирают из двухцепочечной РНК, RIBOXXOL, поли(I:C) и хилтонола®.
Вариант реализации 115. Композиция, содержащая адъювант в стабильной эмульсии, в которой адъювант выбран из агониста TLR3 и агониста Rig-I и которой стабильная эмульсия представляет собой эмульсию типа масло в воде.
Вариант реализации 116. Композиция согласно варианту реализации 115, отличающаяся тем, что указанная эмульсия содержит от 2 до 10% масла.
Вариант реализации 117. Композиция согласно варианту реализации 115 или 116, отличающаяся тем, что масло представляет собой сквален.
Вариант реализации 118. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 115 по 117, отличающаяся тем, что эмульсия типа масло в воде содержит от 0,01% до 0,1% альфа-токоферола.
Вариант реализации 119. Композиция согласно варианту реализации 118, отличающаяся тем, что отношение масла к альфа-токоферолу больше, чем 1.
Вариант реализации 120. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 115 по 118, отличающаяся тем, что эмульсия типа масло в воде содержит от 0,3 по 3% поверхностно-активного вещества.
Вариант реализации 121. Композиция согласно варианту реализации 120, отличающаяся тем, что поверхностно-активное вещество представляет собой полиоксиэтиленсорбитана моноолеат или полоксамер 188 (сополимер полиоксиэтилена и полиоксипропилена).
Вариант реализации 122. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 115 по 121, отличающаяся тем, что эмульсия типа масло в воде содержит приблизительно 1% спана 85.
Вариант реализации 123. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 115 по 121, отличающаяся тем, что эмульсия типа масло в воде содержит от 0,5% до 5%, или от 0,5% до 5%, или от 0,5% до 3%, или от 1% до 3% 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолина (ДМФХ).
Вариант реализации 124. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 115 по 123, отличающаяся тем, что эмульсия типа масло в воде содержит от 0,5% до 5%, или от 0,5% до 5%, или от 0,5% до 3%, или от 1% до 3% глицерина.
Вариант реализации 125. Способ выработки или усиления иммунного ответа, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества композиции согласно любому из вариантов реализации с 109 по 124.
Вариант реализации 126. Способ согласно варианту реализации 125, отличающийся тем, что указанный иммунный ответ больше, чем иммунный ответ, возникающий, когда субъекту вводят адъювант отдельно.
Вариант реализации 127. Способ согласно варианту реализации 125 или варианту реализации 126, отличающийся тем, что введение композиции осуществляют внутримышечным, парентеральным или внутрикожным путем.
Вариант реализации 128. Композиция, содержащая (a) адъювант и (b) эмульсию типа масло в воде или частицы наноструктурированного липидного носителя (НЛН), в которой эмульсия типа масло в воде или частицы НЛН содержат сквален.
Вариант реализации 129. Композиция согласно варианту реализации 128, отличающаяся тем, что адъювант выбирают из агониста TLR, агониста Rig-I, сапонина, углевода, углеводного полимера, конъюгированного углевода, целой вирусной частицы, подобной вирусу частицы, фрагментов вирусов и фрагментов клеток.
Вариант реализации 130. Композиция согласно варианту реализации 129, отличающаяся тем, что адъювант выбирают из агониста TLR и агониста Rig-I.
Вариант реализации 131. Композиция согласно варианту реализации 130, отличающаяся тем, что агонист TLR представляет собой агонист TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8 или TLR9.
Вариант реализации 132. Композиция согласно варианту реализации 131, отличающаяся тем, что агонист TLR представляет собой агонист TLR3.
Вариант реализации 133. Композиция согласно любому из вариантов реализации с 128 по 132, отличающаяся тем, что биоактивный агент выбирают из двухцепочечной РНК, RIBOXXOL, поли(I:C) и хилтонола®.
Вариант реализации 134. Способ выработки или усиления иммунного ответа, включающий введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества композиции согласно любому из вариантов реализации с 128 по 133.
Способ согласно варианту реализации 134, отличающийся тем, что указанный иммунный ответ больше, чем иммунный ответ, возникающий, когда субъекту вводят адъювант отдельно.
Вариант реализации 1. Способ согласно варианту реализации 134 или варианту реализации 135, отличающийся тем, что введение композиции осуществляют внутримышечным, парентеральным или внутрикожным путем.
[00407] Следующие Примеры предложены с целью иллюстрирования, но не с целью ограничения.
ПРИМЕРЫ
Пример 1. Разработка составов НЛН.
[00408] Композиции, содержащие наноструктурированные липидные носители (НЛН), получали, применяя комбинацию эмульгирующих агентов, и стабильность полученных композиций оценивали путем измерения размера частиц при условиях хранения (5°C). Масляная фаза состояла из сквалена - жидкая фаза масляной сердцевины - неионного поверхностно-активного вещества сложного эфира сорбитана, либо сорбитана триолеата (спана® 85), либо сорбитана моностеарата (спана® 60), катионного липида ДОТАП (N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония хлорида) и, в случае составов НЛН, твердого липида (глицерилтримиристата - динасана® 114). Водная фаза представляла собой буфер 10 мМ цитрат натрия трехводный, содержащий неионное пегилированное поверхностно-активное вещество твин® 80.
[00409] Композиции составов, представленных в примерах, показаны ниже в таблице 2:
Таблица 2. Композиции типичных составов.
(масса/объем) жидкого масла
(масса/объем) твердого масла
(КНЭ)
(НЛНv2)
*QG386 представляет собой катионную наноэмульсию известного уровня техники (также называемую в данной заявке КНЭ); указанные составы необязательно содержали буфер 10 мМ цитрат.
[00410] Для того чтобы синтезировать составы НЛН, сначала получали масляную фазу путем смешивания жидкофазного липида, твердофазного липида, положительно заряженного липида и гидрофобного поверхностно-активного вещества в сосуде для смешивания, который помещали в ультразвуковую водяную баню (70 ± 5°C), чтобы облегчить растворение. Получение водной фазы включало растворение гидрофильного поверхностно-активного вещества, предпочтительно твина 80, в ультрачистой воде для инъекций (WFI) или водном буфере, таком как 10 мМ цитрат натрия трехводный, а затем перемешивание до полного растворения. Водную композицию нагревали до 60 - 70°C, например, на ультразвуковой бане, перед смешиванием с масляной фазой. В некоторых случаях обе фазы нагревали отдельно до 60°C на ультразвуковой бане. Применяли смеситель с большим усилием сдвига для объединения масляной и водной фаз путем смешивания с большим усилием сдвига композиционной смеси. Скорость смешивания постепенно увеличивали до 5000 об/мин, или максимум до 10000 об/мин, в высокоскоростном лабораторном устройстве для эмульгирования (Silverson Machines, Inc.), и затем происходило смешивание в течение периода от десяти минут до одного часа с получением неочищенной смеси, содержащей капли масла микронного размера. Положение смешивающего зонда Silverson настраивали при необходимости для однородного диспергирования масла и полного эмульгирования. Дополнительного уменьшения размера частиц добивались путем гомогенизации с большим усилием сдвига в микрофлюидизаторе M-110P (Microfluidics, Corp.). Частицы НЛН получали из неочищенной эмульсии, применяя микрофлюидизатор M-110P Microfluidizer Materials Processor (Microfluidics, Corp.). Каждую эмульсию обрабатывали, приблизительно 5 раз пропуская через микрофлюидизатор при 45°C при 30000 фунтах/кв. дюйм. Конечный pH составлял 6,5 - 6,8. Полученную в результате этого суспензию частиц НЛН фильтровали, применяя стерильный фильтр с диаметром пор 0,2 мкм (например, шприцевой фильтр с мембраной из полиэфирсульфона с диаметром пор 0,2 мкм), чтобы собрать конечный состав НЛН, и хранили при 2 - 8°C, а затем оценивали размер частиц.
[00411] Для того чтобы оценить стабильность НЛН (не связанных в комплекс НЛН), измеряли средний гидродинамический диаметр (Z-средний) и коэффициент полидисперсности (PDI) для каждого состава, применяя динамическое рассеяние света (ДРС) после различных периодов хранения при 5°C (таблица 3).
Таблица 3. Измерение размера частиц и коэффициента полидисперсности типичных составов.
(КНЭ)
(НЛНv2)
[00412] На фигурах 1A - 1E сравнивают z-средний диаметр, измеренный с применением динамического рассеяния света (Zetasizer Nano ZS, Malvern instruments, Ltd.), составов, инкубированных при различных температурах. Составы разбавляли 1:100 водой в трех повторах и проводили измерения в одноразовой полистироловой кювете (параметры стандартной операционной процедуры (СОП): коэффициент преломления материала = 1,59, коэффициент преломления диспергирующего вещества (воды) = 1,33, T = 25°C, вязкость (воды) = 0,887 сП, угол измерения = 173° обратного рассеяния, позиция измерения = 4,65 мм, автоматическая аттенюация). Для измерения дзета-потенциала составы разбавляли 1:100 в трех повторах и загружали в одноразовую изогнутую капиллярную кювету DTS1070 (Malvern instruments, Ltd.). Использовали следующие параметры СОП: коэффициент преломления материала = 1,59, коэффициент преломления диспергирующего вещества (воды) = 1,33, вязкость (воды) = 0,887 сП, T = 25°C, автоматическая аттенюация и выбор напряжения. Взвешенный по интенсивности Z-средний диаметр, PDI и значения дзета-потенциала для каждого состава, усредненные по трем измерениям/повторам (всего 9 измерений), представлены в таблице 3. Размер частиц РНК в составе (комплекс НЛН+РНК или КНЭ+РНК) при различных значениях N:P измеряли в трех повторах, применяя автоматический планшетный пробоотборник Zetasizer (APS, Malvern Instruments, Ltd.) в формате 384-луночного планшета. Дзета-потенциал РНК в составе при различных значениях N:P измеряли в трех повторах, следуя тому же способу, который описан выше для состава отдельно. Связывающую способность НЛН определяли, применяя анализ замедления подвижности в геле. Вкратце, НЛН и рвРНК комплексы получали при различных значениях N:P и подвергали электрофорезу без дополнительной обработки в 1% агарозном геле. Использовали стандартные концентрации для определения количества несвязанной или избыточной рвРНК, мигрирующей в геле.
[00413] На фигуре 16B приведено сравнение распределения частиц по размерам, измеренное с применением динамического рассеяния света (ДРС), между составами НЛН и КНЭ на момент производства. Поскольку длительная коллоидная стабильность была для нас необходимым условием при разработке составов, которые подходят для хранения на складе в сценарии быстрого реагирования, мы отслеживали средний диаметр частиц в составах, которые хранили при 25°C. Диаметр частиц НЛН почти не изменялся (изменение на <3%) в течение по меньшей мере девяти месяцев по сравнению с КНЭ, в которой он увеличисался на 30% после трех месяцев и на 350% после девяти месяцев хранения (ФИГ. 16C). Неионные поверхностно-активные вещества, который включают гидрофобный сложный эфир сорбитана (спан), гидрофильный этоксилированный сложный эфир сорбитана (твин) и катионный липид ДОТАП, необходимы для сохранения коллоидной стабильности, и, вследствие их присутствия между фазами, играют ключевую роль в контроле биофизических взаимодействий. В результате, мы попытались выяснить опытным путем роль поверхностно-активных веществ в опосредовании защиты рвРНК, экспрессии белка и иммуногенности. Синтезировали НЛН с различными физико-химическими свойствами, применяя процесс микрофлюидизации при высоком давлении (см. раздел Методы). Композиции типичных составов НЛН и состава КНЭ, собственного производства в соответствии с ранее опубликованным способом, см. Brito и др. Mol. Ther. 22(12):2118-29 (2014), кратко представлены в таблице 2. Увеличение молярного отношения поверхностно-активного вещества к маслу (S:O) уменьшало размер частиц (ФИГ. 35), что позволяло нам получить однородные НЛН с Z-средним диаметром в диапазоне от 40 нм до 100 нм, который измеряли с помощью ДРС. Дзета-потенциал коррелировал с количеством ДОТАП, возрастая с приблизительно +15 мВ при 0,4% (масса/объем) ДОТАП до +28 мВ при 3,0% (масса/объем) ДОТАП.
[00414] Изменение размера частиц как функция времени дает информацию о коллоидной стабильности. Инкубация при 5°C и 25°C моделирует обычные условия хранения (ФИГ. 1A и 1B), 37°C моделирует физиологическую температуру (ФИГ. 1C), 60°C и 80°C подвергают составы высокотемпературному стессу, чтобы ускорить коллоидную стабильность и помочь понять различия между составами (ФИГ. 1D и 1E). Состав НЛН QG807 стабилен в течение по меньшей мере месяца при 60°C, на основании наиболее свежих результатов, доступных на тот момент. С другой стороны, размер частиц катионной наноэмульсии (КНЭ) QG386 увеличился более чем в 3 раза после лишь 7 дней инкубации при 60°C. Результаты измерения размера частиц при 60°C позволяют предположить, что частицы НЛН обладают значительно лучшей коллоидной стабильностью по сравнению с КНЭ. См. ФИГ. 1D.
Пример 2. Оценка размера частиц НЛН и отношения масло:поверхностно-активное вещество.
[00415] НЛН состоят из гидрофобной сердцевины, содержащей жидкое масло и твердый липид, а также поверхностно-активные вещества (также известные как эмульгаторы или эмульгирующие агенты), из которых состоит граничный слой, отделяющий гидрофобную фазу - жидкое масло и твердый липид, в совокупности называемые в данной заявке маслом, - от водной фазы. Поскольку поверхностно-активные вещества находятся на поверхности наночастиц НЛН, их количество определяет общую доступную площадь поверхности. С другой стороны, масло находится в сердцевине и большей частью вносит вклад в общий доступный объем. Увеличение отношения поверхностно-активного вещества к маслу, следовательно, увеличивает отношение площади поверхности (ПП) к объему (О); таким образом, для фиксированного объема материала увеличение отношения ПП/О означает уменьшение диаметра частиц НЛН. Последнее продемонстрировали опытным путем, см. фигуры 2A - 2B: для НЛН, произведенных при одинаковых условиях обработки, но при различных отношениях масло/поверхностно-активное вещество, выявили увеличение размера частиц при увеличении отношения масло/поверхностно-активное вещество. Размер частиц прямо пропорционален отношению масло/поверхностно-активное вещество (R2 = 0,97); и наоборот, размер частиц обратно пропорционален отношению поверхностно-активное вещество/масло (R2 = 0,97).
Пример 3. Определение отношения N/P.
[00416] Отношение азота к фосфату (N/P) является теоретическим представлением молярной стехиометрии катионных атомов азота (положительный заряд) и анионных фосфатных групп (отрицательный заряд), доступных для образования комплекса РНК-НЛН. Катионный липид ДОТАП хлорид (N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония хлорид), применяемый в частицах НЛН, содержит концевую группу четверичного триметиламмония и несет положительный заряд, который не зависит от pH. Поскольку каждая молекула ДОТАП содержит одну концевую группу триметиламмония, концентрация азота (или количество положительного заряда) по существу равна концентрации ДОТАП. С другой стороны, каждый рибонуклеотидмонофосфат в копии РНК состоит из одного 1, приблизительно пропорционально концентрации РНК, нормированной на среднюю молекулярную массу рибонуклеотидмонофосфатов (339,5 г/моль). Таким образом, 
, где [ДОТАП] и [РНК] представляют собой молярные концентрации ДОТАП и РНК, соответственно.
[00417] Более того, выявляли связывание РНК с НЛН как функцию теоретического отношения N/P, применяя анализ замедления подвижности в геле (GRA). РНК при концентрации 20 мкг/мл смешивали 1:1 (в объемном отношении) с неразбавленным составом или разбавленным составом. Кратность разведения состава находилась в диапазоне от 1/2 до 1/1600. В зависимости от исходной концентрации ДОТАП, отношение N/P находилась в диапазоне от 0,12 (например, при образовании комплекса 20 мкг РНК/мл с QG807 (0,4% (масса/объем) ДОТАП), разбавленным в 800 раз) до приблизительно 750 (при образовании комплекса 20 мкг РНК/мл с неразбавленным QG942 (3% (масса/объем) ДОТАП)). Смесям РНК-НЛН позволяли образовать комплекс в течение 30 минут на льду, а затем подвергали электрофорезу при 120 В в течение приблизительно часа в 1% агарозном геле. Проводили анализ методом оптической денситометрии полос РНК, чтобы определить относительное количество РНК, связанной с составом НЛН, как функцию N/P (ФИГ. 3A). За исключением QG807 и QG911, % РНК, связанной с НЛН, претерпевает резкий переход от 0% при N/P ниже 1 до почти 100% при N/P выше 1. При N/P, равном 1, которое теоретически представляет эквимолярные положительные и отрицательные заряды, приблизительно 50% РНК связано с НЛН. Последнее позволяет предположить, что реакция связывания РНК-НЛН находится в равновесии при N/P около 1 - условии, при котором присутствует приблизительно равное количество связанной и несвязанной РНК.
[00418] Для того чтобы увидеть, как связывание РНК-НЛН коррелирует с доставкой и экспрессией, мы провели эксперимент in vitro, применяя экспрессирующий SEAP репликон. Экспрессирующий SEAP репликон объединяли в комплекс с составом QG807, QG843, QG942 или QG963. Отношение N/P для каждого состава изменяли таким же образом, как показано на фигуре 3A. Результаты SEAP на ФИГ. 3B - 3E, в частности, для QG942, QG963 и QG843, показали, что пиковая экспрессия для каждого состава отлична несмотря на то, что кривые связывания РНК-НЛН практически идентичны.
[00419] Мы также провели эксперимент in vitro, в котором различные разведения НЛНv2 объединяли в комплекс с 20 мкг/мл рвРНК SEAP, что приводило к диапазону молярных отношений N:P. Затем определяли физические и биологические особенности данных комплексов РНК/состав путем измерения in vitro экспрессии SEAP, размера частиц, дзета-потенциала и связывания РНК (ФИГ. 22A - D). Полученные результаты свидетельствовали о том, что существуют отношения N:P, которые приводят к оптимальным уровням экспрессии SEAP, соответствующим максимальному связыванию РНК и постоянному положительному дзета-потенциалу, но минимальному увеличению размера частиц. Учитывая, что для того же состава наблюдается корреляция между экспрессией антигена и иммуногенностью (см. Pepini и др., J. Immonol. 1601877 (2017)), мы предположили, что мы можем ожидать сходные титры нАТ при отношениях N:P (область, заштрихованная серым цветом на ФИГ. 22), которые соответствуют пиковой экспрессии SEAP.
[00420] Для того чтобы охарактеризовать НЛНv2 in vivo в отношении экспрессии белка, реактогенности и иммуногенности, мы выбрали для тестирования отношения N:P от 4 до 5, включая отношения, коррелирующие с активностью SEAP in vitro ≥ 5,8 Log10 ОЕЛ (100, 37, 15, 5,6), и N:P, равное 3, за пределами гипотетической оптимальной зоны. Для того чтобы охарактеризовать экспрессию белка, мышам C57BL/6 вводили путем в/м инъекции дозы рвРНК SEAP 1000, 100 и 10 нг при каждом отношении N:P. Для того чтобы охарактеризовать реактогенность, 50 мкг рвРНК в комплексе с НЛНv2 при каждом N:P также вводили путем в/к инъекции морским свинкам и измеряли диаметр гиперемии. Через двадцать четыре часа после инъекции у мышей брали кровь для измерения активности SEAP в сыворотке и измеряли места инъекции у морских свинок (ФИГ. 22E-H). Для того чтобы охарактеризовать иммуногенность, рвРНК ZIKV объединяли в комплекс с НЛНv2 при каждом N:P, и 1000 нг или 100 нг доставляли мышам в/м путем. У мышей брали кровь спустя 14 дней, чтобы измерить титры нАТ (ФИГ. 22F и 22G).
[00421] Начиная с экспрессии SEAP in vivo, оптимальные отношения N:P зависели от дозы, при этом оптимальное N:P составляло 15 для дозы 1000 нг, 37 для дозы 100 нг и 100 для дозы 10 нг (ФИГ. 22E). Как и ожидали, иммуногенность, похоже, коррелировала с экспрессией SEAP при двух дозах, которые сравнивали (ФИГ. 22F и 22G). При дозе 1000 нг мы не обнаружили значимых различий в титрах нАТ ни для одного из исследованных отношений N:P, аналогично активности SEAP при данных отношениях N:P (ФИГ. 22F). При дозе 100 нг мы не наблюдали значимых различий в титрах нАТ между отношениями N:P 37 и 15 и наблюдали небольшие, но незначимые различия в активности SEAP, тем не менее, значимое снижение титра происходило между отношениями N:P, равными 15 и 5,6, сходным образом с активностью SEAP (ФИГ. 22G). В отношении реактогенности, мы наблюдали значимое уменьшение диаметра гиперемии при уменьшении отношения N:P в 2,5 раза с 37 до 15 (ФИГ. 22H). Важно отметить, что полученные результаты позволяют предположить, что уменьшение N:P в 2,5 раза с 37 до 15 значительно снизит реактогенность, но минимально повлияет на уровни экспрессии антигена и, в результате, на иммуногенность, особенно при более высоких дозах рвРНК. В действительности, при значениях N:P, равных 15 и 37, наблюдали эффект экономии дозы, так как наблюдали незначимое различие в активности SEAP между дозами 1000 и 100 нг (ФИГ. 22E). Наибольшие различия в активности SEAP между дозами наблюдали при низких отношениях N:P (ФИГ. 22E).
[00422] Для того чтобы оценить, можно ли по теоретическому отношению РНК/частицу спрогнозировать физическое состояние комплекса РНК-состав, сравнивали гидродинамический диаметр (z-средний; нм) трех составов QG752, QG768 и QG386, смешанных в различных количествах с фиксированным количеством (1 мкг) модельной РНК длиной 10 т.п.н. Для гидродинамического размера всех составов выявили профиль в форме, приближенной к гауссовой кривой, при увеличении разведения состава, т.е. уменьшении N/P (ФИГ. 4A), или увеличении РНК/частицу (ФИГ. 4B) или уменьшении ДОТАП/РНК (ФИГ. 4C). Несмотря на то, что все составы содержали идентичные количества ДОТАП (0,4% (масса/объем)), пик размера частиц, потенциально свидетельствующий о кластеризации частиц НЛН, поперечно сшитых с РНК, наблюдается при различных соотношениях N/P (ФИГ. 4A): ~3 для QG768 и QG386 (разведение состава в 40 раз или 0,01% (масса/объем) ДОТАП) и ~1 для QG752 (разведение состава в 100 раз или 0,004% (масса/объем) ДОТАП). Данное несоответствие, тем не менее, урегулировали после учета различий в исходном размере частиц и нанесения на график Z-среднего как функции отношения РНК/частицу (ФИГ. 4B): пик размера частиц для всех составов наблюдали приблизительно при 1 - 2 копиях РНК на частицу НЛН. Поскольку исходный средний размер частицы QG752 (75 нм) меньше, чем у обоих QG386 и QG768 (~100 нм), у нее большее отношение площадь поверхности/объем, и, следовательно, требуется большее разведение (более низкое N/P) для получения отношения РНК/частицу, сходного с таковым для QG386 и QG768. Обычно, если химический состав поддерживают постоянным, то уменьшение размера частиц будет увеличивать отношение площадь поверхности/объем и, следовательно, увеличивать концентрацию частиц. Арифметически, последний принцип кратко представляют следующим образом: если составы A и B имеют идентичный химический состав и сферическую геометрию, но различные диаметры dA и dB, соответственно, и если dA > dB, то состав B содержит большую концентрацию частиц, чем состав A, в (dA/dB)3 раз.
[00423] Более того, эти данные о размере частиц РНК-состав коррелируют со способностью состава связывать РНК, которую определяют в анализе замедления подвижности в геле (GRA). GRA основан на принципе, что любая не связанная или свободная РНК будет мигрировать и обнаруживаться вместе с контрольной не находящейся в составе либо голой РНК при разделении в геле под приложенным напряжением; следовательно, в нем оценивают способность состава связываться с РНК и иммобилизовать ее в стандартных условиях электрофореза в геле. GRA проводили в содержащем все необходимое готовом 1,2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием (EtBr) (E-gel®, 1,2% агароза общего назначения, ThermoFisher Scientific). Когда РНК объединяли в комплекс с составом НЛН QG768, она оставалась иммобилизованной при всех отношениях N/P, выше чем 2,3, что соответствует восходящему участку (по ходу слева направо), включающему максимум профиля РНК-размер частиц состава для QG768 (ФИГ. 4A). Количество несвязанной РНК постепенно возрастало при отношении N/P от 0,9 и ниже, что соответствует нисходящему участку (по ходу слева направо) на фигуре 2A. Таким образом, размер частиц коррелирует со способностью к связыванию, и его можно использовать в качестве способа оптимизации образования комплекса РНК и его доставки с применением минимальной дозы состава. Для того чтобы исследовать, как отношение РНК/частицу влияет на иммуногенность, мышам (n = 5/группу) вводили путем в/м инъекции рвРНК ZIKV в комплексе с QG768 при различных соотношениях и измеряли нейтрализующие ZIKV антитела (титры РЗБО80) через 14 дней.
Пример 4. Оценка составов НЛН в качестве потенциально возможных вакцин против вируса Зика.
[00424] Лучшие потенциально подходящие составы НЛН, продемонстрировавшие физическую стабильность, объединяли с синтетической реплицирующейся вирусной РНК (рвРНК), полученной из штамма вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV, штамм TC83), в которой структурные гены VEEV были заменены на кассету ZIKV PrM-E. Системы РНК-репликон были разработаны, чтобы содействовать стратегиям гетерологичных примирования/стимулирования. Находящуюся в составе рвРНК вводили внутримышечным путем, применяя обычную иглу. Некоторые составы НЛН вызывали сильные иммунные ответы in vivo.
Материалы и методы.
Культура клеток.
[00425] Клетки C6/36 (Американская коллекция типовых культур (ATCC), Роквилл, Мэриленд), полученные из комаров A. albopictus, поддерживали при 29°C с 5% CO2 в минимальной эссенциальной среде Игла, модифицированной по способу Дульбекко (DMEM), содержащей 10% (в объемном отношении) инактивированной нагреванием эмбриональной бычьей сыворотки (ЭБС), пируват натрия (1 мМ), пенициллин (100 Ед./мл), стрептомицин (100 мкг/мл) и 1% (в объемном отношении) триптозо-фосфатного бульона (Sigma, Сент-Луис, Миссури). Клетки Vero, BHK-21 и 293T (ATCC, Манассас, Виргиния) размножали при 37°C с 5% CO2 в DMEM, содержащей 10% (в объемном отношении) инактивированной нагреванием ЭБС, пируват натрия (1 мМ), пенициллин (100 Ед./мл), и стрептомицин (100 мкг/мл). Все линии клеток также исследовали на наличие контаминации микоплазмой.
Конструкции плазмид
[00426] Плазмида, кодирующая промотор SP6, за которым следовали 5’- и 3’-нетранслируемые области (НТО) и неструктурные гены штамма TC-83 вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEEV) (ФИГ. 21A), а также усиленный GFP под контролем субгеномного промотора VEEV, названная pSP6-VEE-Rep-GFP, была любезно предоставлена доктором Scott Weaver. Также разработали контрольную репортерную рвРНК, кодирующую секретируемую эмбриональную щелочную фосфатазу человека (SEAP) (ФИГ. 21B).
[00427] Промотор SP6 затем заменили на промотор T7, применяя стандартные методики клонирования, и назвали pT7-VEE-Rep-GFP. Фрагмент, кодирующий кодон-оптимизированные гены prM и E из штамма H/PF/2013 вируса Зика Французской Полинезии (ZIKV), синтезировали и клонировали в pUC57 (Genscript). Применяя набор для мутагенеза Q5 (New England Biolabs), затем встраивали последовательность Козак, за которой следовала либо гетеротипическая сигнальная последовательность (ss) вируса японского энцефалита (JEV), либо находящаяся против хода транскрипции гомотипическая сигнальная последовательность (ss) ZIKV, применяя следующие праймеры: JEVss-FWD (gctggcctccctggctgtggtcattgcctgcgctggagcaGCCGAGGTGACCAGGAGAGG; SEQ ID NO: 13), и JEVss-REV (cacatgattgatccggcactcctcttgcccatggcggcggcGTGAGCTGGCGGCGGGTG; SEQ ID NO: 14), или ZIKVss-FWD (ggaatcgtgggcctgctgctgaccacagcaatggcaGCCGAGGTGACCAGGAGAGG; SEQ ID NO: 15), и ZIKVss-REV (cacggatgtgtctgctcctctccgcatggcggcggcGTGAGCTGGCGGCGGGTG; SEQ ID NO: 16). Данный комбинированный фрагмент, кодирующий либо JEVss, либо ZIKVss, за которым следовали гены prM и E ZIKV, затем амплифицировали с помощью ПЦР с праймерами ZIKV-prM-E-FWD (AATGGACTACgacatagtcgccgccgccatg; SEQ ID NO: 17) и ZIKV-prM-E-REV (GCGGTTTTTGACAccgcggTCAGGCAGACACGGCG; SEQ ID NO: 18) и клонировали между сайтами PflFI и SacII в pT7-VEE-Rep-GFP, применяя смесь ферментов In-Fusion (Clontech), что приводило к получению плазмид pT7-VEE-Rep-JEVss-ZIKV-prM-E или pT7-VEE-Rep-ZIKVss-ZIKV-prM-E. pT7-VEE-Rep-SEAP конструировали путем амплификации с помощью ПЦР и клонировали между сайтами PflFI и SacII в pT7-VEE-Rep-GFP, как описано выше (ФИГ. 21B). Все плазмиды подтверждали секвенированием по Сенгеру.
Получение РНК.
[00428] После трансформации и амплификации в клетках Top10 (Invitrogen) и выделения с применением наборов для выделения большого количества плазмид (Qiagen Plasmid Maxi Kit), плазмиды линеаризовали путем рестрикционного расщепления ферментом NotI (New England Biolabs) и очищали, применяя фенол/хлороформ. РНК затем транскрибировали in vitro, применяя набор T7 MEGAscript (Invitrogen), с последующей преципитацией хлоридом лития и кэпированием с помощью набора с кэпирующим ферментом из вируса коровьей оспы (New England Biolabs). Кэпированные транскрипты затем преципитировали хлоридом лития, ресуспендировали в воде без нуклеазной активности до конечной концентрации 1 мкг/мкл и анализировали с помощью электрофореза в агарозном геле. Все РНК разделяли на аликвоты и хранили при -80°C.
Анализ воздействия РНКазой.
[00429] ZIKV-рвРНК объединяли в комплекс с НЛНv1 и НЛНv2 при отношениях N:P, равных 50 и 15, соответственно, и помещали на лед на 30 минут. После разбавления комплекса НЛНv2 с применением воды без нуклеазной активности, комплексы, содержащие 1 мкг рвРНК в концентрации 20 мкг/мл, обрабатывали 50 нг РНКазы A (Thermo Scientific) в течение 30 минут при комнатной температуре, а затем инкубировали с 5 мкг рекомбинантной протеиназы K (Thermo Scientific) в течение 10 минут при 55°C. Затем экстрагировали РНК, применяя равный объем 25:24:1 фенола:хлороформа:изоамилового спирта (Invitrogen). После встряхивания образцы центрифугировали при 17000 g в течение 15 минут. Супернатанты собирали, смешивали 1:1 с загрузочным красителем глиоксалем (Invitrogen) и грели при 50°C в течение 15 минут. Эквивалент 200 нг РНК загружали и разгоняли в 150 мл 1% агарозного геля в денатурирующих условиях в подвижном буфере Northern Max Gly (Invitrogen) при 120 В в течение 45 минут. Гели визуализировали, применяя систему визуализации ChemiDocTM MP (BioRad). Интенсивность полосы интактной рвРНК сравнивали с таковой для РНК, экстрагированной фенолом:хлороформом:изоамилом из комплексов, которые не подвергали обработки РНКазой и протеиназой K. Дополнительные контроли включали рвРНК отдельно с обработкой и без обработки РНКазой и протеиназой K при загрузке 200 нг рвРНК.
Условия образования комплексов для экспериментов in vitro и in vivo.
[00430] В экспериментах по оптимизации N:P готовили серийные разведения НЛНv1 или НЛНv2 в 10 мМ цитратном буфере и объединяли в комплекс 1:1 с рвРНК, разбавленной до 20 мкг/мл в 10% растворе сахарозы без нуклеазной активности (для сохранения изотоничности без применения ионного агента, такого как солевой раствор). рвРНК добавляли в состав и аккуратно пипетировали вверх/вниз, чтобы гарантировать полное смешивание. Комплекс инкубировали в течение 30 мин на льду, в результате чего образовывался диапазон молярных отношений N:P. Данные комплексы затем дополнительно разбавляли в 10% сахарозе, чтобы получить желательные дозы. Для стимуляции МКПК человека in vitro составы комплексов разбавляли 1:125. Для исследований вакцинации с использованием НЛНv1 или КНЭ при N:P, равном 50, рвРНК разбавляли до 40 мкг/мл в 10% сахарозе и объединяли в комплекс 1:1 с составом. Для исследования морских свинок, в котором использовали НЛНv2 при N:P, равном 37, рвРНК разбавляли до 400 мкг/мл в 10% сахарозе и объединяли в комплекс 1:1 с составом. Для исследований вакцин, в которых использовали НЛНv2 при N:P, равном 15, рвРНК разбавляли до 1000 мкг/мл в 10% сахарозе и объединяли в комплекс 1:1 с составом. Комплексы затем использовали неразбавленными или разбавленными в 10% сахарозе до желательных доз.
Определение характеристик VLP ZIKV.
[00431] ZIKV-рвРНК объединяли в комплекс с НЛНv1 при N:P, равном 50, и 100 нг инкубировали на монослое клеток 293T в 6-луночном планшете в средах Optimem в течение 4 часов, с последующей заменой сред на полные среды и окончательной инкубацией в течение 20 часов. Затем собирали супернатанты, наносили их на 20% раствор сахарозы и осаждали путем ультрацентрифугирования при 100000xg в течение 2 часов при 10°C (OPTIMA MAX-XP, Beckman, Индианаполис, Индиана). Осадки затем ресуспендировали в ФБР и анализировали с помощью ПААГ/ДСН и вестерн-блоттинга. Для детектирования белков ZIKV после переноса на нитроцеллюлозную мембрану применяли иммунные асцитические жидкости мышей, направленные против ZIKV (WRCEVA, UTMB), при разведении 1:5000 и разведение 1:4000 вторичного реагента - антител козы против IgG мыши, конъюгированных с пероксидазой хрена (HRP) (Southern Biotech), применяли для визуализации полос белков. Для оценки с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) описанные выше супернатанты 293T осаждали, пропуская через 20% раствор сахарозы, на подушку 70% сахарозы путем ультрацентрифугирования при 100000xg в течение 2 часов при 10°C. Затем собирали интерфазу и заменяли сахарозу на ФБР путем фильтрации через фильтр Amicon с пропускающей способностью 100 кДа (Millipore, Биллерика, Массачусетс). Для того чтобы подтвердить, что наши рвРНК, кодирующие prM/E ZIKV, были функциональны и вызывали секрецию подобных вирусу ZIKV частиц (VLP), каплю неразбавленного фильтрата сушили на дырчатой углеродной сетке с 300 ячейками, окрашенной ацетатом уранила, и исследовали с помощью 200 кВ ПЭМ FEI на присутствие VLP ZIKV с помощью вестерн-блоттинга (ФИГ. 21C) и электронной микроскопии (ФИГ. 21D).
Анализ SEAP.
[00432] Для того чтобы охарактеризовать экспрессию белка с находящейся в составе рвРНК мы использовали репортерную систему SEAP. Через двадцать четыре часа после инкубации клеток BHK с находящейся в составе рвРНК SEAP собирали супернатанты и измеряли активность SEAP с помощью анализа NovaBright™ PhosphA - Light™, следуя инструкциям производителя (ThermoFisher). См. ФИГ. 23D.
Титр нейтрализующего антитела.
[00433] Проводили реакции задержки (нейтрализации) бляшкообразования на восемьдесят процентов (РЗБО80) на клетках Vero, как описано ранее (Beaty и др., Arboviruses, Diagnostic procedures for viral, rickettsial and chlamydial infections, Schmidt NJJ, Emmons RWW, ред., Am. Public Health Assoc., Вашингтон, федеральный округ Колумбия, стр. 797-855 (1989)), применяя штамм FSS 13025 ZIKV в качестве контрольного вируса. Вкратце, исходный раствор FSS 13025 ZIKV разбавляли до ~1×103 бляшкообразующих единиц на миллилитр (БОЕ/мл) и подтверждали титр с помощью анализа образования бляшек на клетках Vero. Образцы инактивировали нагреванием при 56°C в течение 30 мин, а затем готовили серийные разведения в DMEM, содержащей 1% ЭБС. Все разбавленные образцы затем дополнительно разбавляли в 2 раза путем добавления ~200 БОЕ ZIKV, смешивали, и инкубировали при 37°C в течение 1 часа, затем переносили на 90% конфлюэнтные монослои клеток Vero в 6-луночных планшетах (Costar) и инкубировали при 37°C в течение 1 часа. Затем с помощью пипетки в каждую лунку наносили верхний слой, содержащий 1% агарозу в DMEM с 1% заменимых аминокислот, 1% L-глутамина и 1% гентамицина, и планшеты инкубировали в течение 3 дней при 37°C. Клетки затем фиксировали в 10% формальдегиде и бляшки визуализировали после окрашивания кристаллическим фиолетовым красителем.
[00434] Для того чтобы отобрать одну конструкцию рвРНК ZIKV для продолжения разработки, мы сравнили ответы нейтрализующих антител (нАТ) между рвРНК, кодирующими prM/E ZIKV с нативной сигнальной последовательностью, а также с сигнальной последовательностью JEV. Конструкция с нативной сигнальной последовательностью ZIKV вызывала 100% сероконверсию после однократной дозы и значительно более высокие титры нАТ после двух доз по сравнению с рвРНК, кодирующей сигнальную последовательность JEV (ФИГ. 34A - B).
Анализ мононуклеарных клеток периферической крови человека.
[00435] Исследования, вовлекающие доноров-людей, были одобрены Западным Экспертным советом организаций. Гепаринизированную цельную кровь получали из 6 нормальных доноров после подписания информированного согласия и выделяли мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК), как описано ранее. См. Seubert и др., J Immunol. 180(8):5402-12 (2008). Один миллион клеток на объем 150 мкл бессывороточной RPMI высевали в 96-луночные планшеты для культуры клеток с U-образным дном и комплексы состав/рвРНК добавляли к клеткам в объеме 50 мкл и инкубировали при 37°C. Через двадцать четыре часа планшеты центрифугировали в течение 10 мин при 1800 об/мин, собирали супернатанты и хранили при -20 °C. Проводили анализ ELISA Mip-1β, как описано ранее. См. Seubert и др., J Immunol. 180(8):5402-12 (2008).
Исследования на животных.
[00436] Все исследования на животных были одобрены Институциональным комитетом по содержанию и использованию животных Научно-исследовательского института инфекционных болезней. Помещение, в котором проводили исследования на животных, аккредитовано Международной ассоциацией по оценке и аккредитации условий содержания лабораторных животных и соответствует руководящим принципам, описанным в Руководстве по содержанию и использованию лабораторных животных, Национальный совет по научным исследованиям, 2011. Все размеры выборок определяли на основании анализа мощности с учетом провокационных доз LD100 и последующих уровней выживаемости, равных 0,99 по сравнению с 0,01 с α = 0,05, применяя односторонний точный критерий Фишера. Мышей непецифически и вслепую распределяли по соответствующим группам. Перед началом исследований не устанавливали критерии исключения.
[00437] Чтобы оценить иммуногенность и переносимость у морских свинок, морских свинок Хартли (Charles River) массой 400 - 450 г вакцинировали в/м или внутрикожно (в/к) с применением игл Nanopass MicronJet600 (Nanopass Technologies, Ltd.) смесью 1:1, содержащей НЛН и рвРНК, кодирующую prM/E ZIKV, в четырехглавую мышцу бедра в общем объеме 250 мкл. Через двадцать четыре часа измеряли диаметр гиперемии в месте в/к инъекции. Кровь собирали в моменты времени, указанные на фигурах, из бедренной вены и сыворотку получали после низкоскоростного центрифугирования, и хранили при -20°C до момента определения титров РЗБО80, как описано выше.
Статистика.
[00438] Статистический анализ проводили, применяя программное обеспечение GraphPad Prism (версии 7.0c) и RStudio (версии 0.99.491). Распределение данных и дисперсию оценивали на нормальность и подобие с преобразованием или без преобразования с помощью анализов диаграммы квантиль-квантиль и диаграммы размаха. Использовали однофакторный и двухфакторный дисперсионные анализы с критерием множественных сравнений Тьюки.
Пример 5. Анализ цельной крови.
[00439] Для того чтобы оценить способность составов НЛН стимулировать высвобождение хемокинов из клеток цельной крови человека, проводили анализ цельной крови человека. Гепаринизированную цельную кровь получали из восьми нормальных доноров. Указанные составы (исходные с 5% масла) добавляли к цельной крови (конечное содержание масла 0,4%). Цельную кровь инкубировали при 37°C с CO2 в течение 24 часов. Супернатант плазмы аспирировали и анализировали на наличие бета-хемокинов CCL2 и CCL4 и привлекающих нейтрофилы хемокинов CXCL1, CXCL5 и CXCL8. Обнаружили, что Q386 нестабилен в присутствии цельной крови, что привело к отсутствию собранных данных. Клетки цельной крови человека высвобождали более высокие уровни хемокинов в ответ на QG768 по сравнению с другими исследованными составами (ФИГ. 7A - E).
Пример 6. Определение физических свойств комплексов НЛН-рвРНК in vitro.
[00440] Мы инкубировали рвРНК с различными композициями НЛН в присутствии или отсутствие РНКазы A и оценивали целостность экстрагированной РНК, применяя электрофорез в агарозном геле в денатурирующих условиях. Мы установили, что некоторые требования к композиции были необходимы для защиты РНК; в частности, НЛН с относительно высоким содержанием твина 80 (70% от общей массы поверхностно-активного вещества и катионного липида) не защищали от разрушения РНКазой (ФИГ. 36A) и не могли доставлять рвРНК in vivo (ФИГ. 36B). Напротив, НЛН с относительно меньшей фракцией твин 80 в фазе поверхностно-активного вещества (35% от общей массы поверхностно-активного вещества и катионного липида) защищали рвРНК от деградации (ФИГ. 2). В результате, последующие исследования проводили с НЛН, содержащими не более 35% твин 80 от общей фракции поверхностно-активного вещества, впоследствии названными НЛНv1. Далее, мы пытались оптимизировать условия образования комплексов, что измеряли по молярному отношению азота (N) к фосфату (P) (N:P), чтобы максимизировать трансфекцию in vitro. Составы КНЭ или НЛНv1 объединяли в комплекс с рвРНК, кодирующей SEAP, при диапазоне значений N:P, и 100 нг каждого комплекса рвРНК инкубировали с клетками BHK в течение ночи. Мы сравнивали экспрессию SEAP между НЛНv1 и КНЭ как функцию N:P (ФИГ. 2). По мере увеличения N:P мы наблюдали повышающиеся уровни SEAP, при этом значительно более высокая экспрессия наблюдалась для КНЭ по сравнению с НЛНv1 при N:P < 50. Тем не менее, при N:P ~ 50 экспрессия SEAP с КНЭ достигала пика, снижаясь при N:P > 50, потенциально вследствие цитотоксичности, о чем свидетельствовало значительное отсоединение клеток от подложки. Интересно, что при N:P ~ 50 экспрессия SEAP в группе НЛНv1 была сходна с таковой для КНЭ и продолжала повышаться. Для последующих сравнительных исследований между НЛНv1 и КНЭ мы использовали N:P, равное 50, что приводило к сходным уровням экспрессии SEAP in vitro.
Пример 7. Оценка способности выбранных составов доставлять рвРНК и приводить к экспрессии белка.
[00441] В не представленных здесь результатах определяли, что составы QG767 и QG768 можно улучшить путем снижения концентрации твина. Наблюдаемые титры антител при применении данных составов были различными, и было несколько нечувствительных мышей. Уменьшение содержания твина в данных составах (с получением составов QG807, 808 и 906) приводило к повышенным титрам РЗБО80 и 100% сероконверсии.
[00442] В нашей работе по определению свойств НЛНv1 и НЛНv2 мы наблюдали уменьшение оптимального отношения N:P с > 50 до 15 (ФИГ. 23D). Одновременно с таким уменьшением наблюдалось увеличение молярного отношения S:O с 0,18 до 1,68, что уменьшало размер частиц со ~100 нм до ~40 нм (таблица 2). Поскольку общее содержание масла лишь незначительно (~20%) отличается между НЛНv1 и НЛНv2, теоретически уменьшение размера частиц в от приблизительно 2,5 раз до приблизительно 12 раз повышает количество наночастиц, с учетом сферической геометрии. Вероятно, что меньший размер и теоретически большее количество наночастиц в НЛНv2 позволяет распределение связанных с поверхностью копий рвРНК по большему количеству клеток.
[00443] Для того чтобы оценить способность различных составов композиций доставлять рвРНК in vitro, получали репортерную рвРНК, кодирующую секретируемую щелочную фосфатазу (SEAP). Клетки 293T или BHK-21 трансфицировали либо 10 или 100 нг рвРНК, кодирующей SEAP, в составе с КНЭ, QG807, QG808, QG906 или с 10% сахарозой или липофектамином 2000 в качестве отрицательного и положительного контролей, соответственно, и супернатант собирали через 24 часа после трансфекции и анализировали в нем активность SEAP (ФИГ. 8A - B). Опосредованное клетками и дозами влияние на экспрессию SEAP наблюдали в различных составах, при этом клетки 293T были более устойчивы к опосредованной трансфекцией экспрессии SEAP. В клетках BHK 100 нг рвРНК в составе с QG807, QG808 или QG906 приводила к более высоким уровням экспрессии SEAP по сравнению с КНЭ, тогда как при более низкой дозе РНК составы КНЭ и QG906 приводили к большей экспрессии SEAP. Активность SEAP измеряли с помощью анализа NovaBright™ PhosphA - Light™, следуя инструкциям производителя (ThermoFisher).
[00444] Далее, оценивали кинетику экспрессии белка in vivo после внутримышечной инъекции рвРНК, кодирующей SEAP, входящей в состав вместе с КНЭ, QG807, QG808 или 10% сахарозой, и сравнивали уровни экспрессии SEAP с таковыми у мышей, которым вводили ложную инъекцию, в различные моменты времени после инъекции (ФИГ. 9). Для РНК, входящей в состав вместе с КНЭ, QG807 и QG808, продемонстрировали очень сходные профили экспрессии с течением времени с в 33 - 36 раз более высокой активностью SEAP по сравнению с РНК, входящей в состав вместе с 10% сахарозой, в пике через 6 дней после инъекции. Ко дню 21 все группы возвращались к фоновым уровням активности SEAP.
[00445] Наконец, оценивали емкость загрузки РНК на QG807 путем образования комплекса состава 1:1 с различными концентрациями рвРНК. После реакции образования комплекса РНК, находящуюся в составе, затем разбавляли до конечной концентрации 20 или 2 мкг/мл и 50 мкл каждого комплекса вводили путем внутримышечной инъекции мышам C57BL/6 в конечных дозах 1 и 0,1 мкг, соответственно. Затем собирали сыворотку в дни 3 и 8 после инъекции и анализировали в ней активность SEAP (ФИГ. 10). Для дозы 1 мкг наименьшая исследованная концентрация РНК (40 мкг/мл) приводила к наиболее высокому уровню активности SEAP. Более низкие концентрации невозможно было исследовать при данной дозе вследствие ограничений объема инъекции. Эффект более низких концентраций, тем не менее, можно наблюдать для доз 0,1 мкг. По данным результатам можно прийти к заключению, что оптимальная емкость загрузки находится между 40 и 4 мкг РНК/мл.
Пример 8. Составы можно модифицировать, чтобы повысить иммуногенность независимо от доставки.
[00446] Составы можно модифицировать, чтобы повысить иммуногенность независимо от доставки, и такое повышение зависит от присутствия твердого липида. На основании результатов анализа высвобождения хемокинов в цельной крови in vitro после стимуляции различными содержащими высокий процент гидрофильного поверхностно-активного вещества НЛН мы выдвинули гипотезу, что различные гидрофобные поверхностно-активные вещества, присутствующие в НЛН, в композиции с низким процентом гидрофильного поверхностно-активного вещества, могут различным образом модулировать иммунные ответы in vivo. Для проверки данной гипотезы один НЛН с высоким отношением гидрофильного поверхностно-активного вещества (2% твина 80) и три НЛН с низким отношением гидрофильного поверхностно-активного вещества (0,5% твина 80) и различными типами гидрофобных поверхностно-активных веществ (спана 85, спана 80, и спана 60) объединяли в комплекс либо с РНК, кодирующей секретируемую щелочную фосфатазу (SEAP), либо с РНК, кодирующей гены prM и E ZIKV. В результате этого мы не наблюдали никакого неблагоприятного влияния на коллоидную стабильность. Разовую в/м доза 100 нг вводили мышам C57BL/6 и сравнивали с находящейся в составе с КНЭ или не находящейся в составе РНК (ФИГ. 11A). Экспрессия белка, измеренная с помощью анализа SEAP в сыворотке, собранной через 3 дня после инъекции, возрастала свыше 25 раз для РНК, находящейся в составе с НЛН, содержащими низкий процент гидрофильного поверхностно-активного вещества (0,5% твина 80), но уровни экспрессии в сыворотке не различались между РНК, находящейся в составе с НЛН, содержащими различные гидрофобные поверхностно-активные вещества, или РНК, находящейся в составе с КНЭ (ФИГ. 11A).
[00447] Наоборот, мы наблюдали значимые различия в ответах нейтрализующих антител между каждой РНК, находящейся в составе с НЛН (ФИГ. 11B). Хотя слабые ответы нейтрализующих антител, наблюдаемые у мышей, иммунизированных РНК в составе с QG768 (содержащим 2% твина 80), вероятно можно объяснить низкими уровнями экспрессии антигена, различия, наблюдаемые между КНЭ и QG906, QG808 или QG807, вероятно, не являются следствием различий в экспрессии антигена. Так как QG906, QG808 и QG807 отличаются только композицией гидрофобных поверхностно-активных веществ, содержащей либо спан 80, либо спан 85, либо спан 60, соответственно, наблюдаемые различия в иммуногенности могут быть связаны с данным компонентом. Интересно, что КНЭ, который отличается от НЛН по композиции масел, где первый из упомянутых состоит только из сквалена, тогда как последний из упомянутых состоит как из сквалена, так и из динасана, твердого липида, значительно не отличался от QG808, который содержит такое же гидрофобное поверхностно-активное вещество, как и КНЭ (спан 85). Так как КНЭ и QG808 отличаются только по композиции масел, причем последний из упомянутых содержит добавку твердого липида динасана, мы далее исследовали влияние замены спана 85 в КНЭ на спан 60 на иммуногенность РНК в составе. КНЭ либо со спаном 85, либо со спаном 60 объединяли в комплекс с РНК, кодирующей гены prM и E ZIKV, и сравнивали с РНК в составе с НЛН, состоящим либо из спана 85, либо из спана 60, и вводили мышам C57BL/6 путем однократной в/м инъекции 100 нг. К сроку 14 дней после иммунизации значимое повышение титров нейтрализующих антител (нАТ) наблюдали только среди частиц НЛН, в которых спан 85 был заменен на спан 60, что свидетельствует о важности компонента - твердого масла (ФИГ. 11C). Поскольку уровни экспрессии SEAP между различными группами составов были идентичны (ФИГ. 11A), различия в титрах нАТ, вероятно, наблюдались вследствие различий в используемом гидрофобном поверхностно-активном веществе. Для того чтобы подтвердить, что уровни экспрессии белка не изменялись между КНЭ и НЛНv1 с течением времени, мы иммунизировали C57BL/6 100 нг находящейся в составе или не находящейся в составе рвРНК SEAP и измерили активность SEAP в сыворотках, собранных через 3, 7, 14, 21 и 28 дней после инъекции (ФИГ. 25): не наблюдали значимых различий между группами КНЭ и НЛНv1.
Пример 9. РНК, находящаяся в составе с НЛН, обеспечивает иммуногенность и эффективность с однократной дозы.
[00448] На основании приведенных выше результатов мы проводили все последующие эксперименты с QG807 (спан 60). Для проверки эффективности иммунных ответов, вызванных однократной дозой РНК, находящейся в составе с НЛН, мы иммунизировали мышей 1 мкг РНК, находящейся в составе либо с КНЭ, либо с НЛН, и сравнивали иммуногенность и эффективность с таковыми для 10 мкг или 1 мкг РНК, не находящейся в составе. Аналогично наблюдению в наших предыдущих экспериментах, мы увидели значительно более высокий ответ нейтрализующих антител через 14 дней после однократной иммунизации в группах РНК, находящейся в составе с НЛН, по сравнению с группами РНК, находящейся в составе с КНЭ, либо голой РНК (ФИГ. 2A). Тем не менее, доза 1 мкг действительно снижала общие титры нейтрализующих антител по сравнению с дозами 0,1 мкг, что наблюдали в предыдущих экспериментах (ФИГ. 11B). Впоследствии мы повторили данные находки в следующих экспериментах.
[00449] Например, C57BL/6 иммунизировали 1 или 0,1 мкг рвРНК в составе с НЛНv1 (используя спан 60 в качестве гидрофобного поверхностно-активного вещества) и сравнивали с в 10 раз более высокими дозами не находящейся в составе рвРНК в двух отдельных экспериментах, при этом в одном эксперименте оценивали титры нАТ после примирующей иммунизации, тогда как другой включал повторную стимулирующую вакцинацию в день 28. У мышей периодически брали кровь и оценивали титры нАТ с помощью РЗБО80 (ФИГ. 18A - B). В обоих экспериментах мы наблюдали пиковые титры нАТ в день 14, при этом дозы 0,1 мкг находящейся в составе рвРНК вызывали значительно более высокие титры, чем дозы 1 мкг находящейся в составе рвРНК. Тем не менее, ко дню 88 и 156 после однократного введения в группе дозы 0,1 мкг находящейся в составе рвРНК выявили значительный спад титров нАТ по сравнению с пиковыми титрами в день 14, аналогично группам дозы 10 мкг не находящеся в составе рвРНК, тогда как в группе дозы 1 мкг находящейся в составе рвРНК не выявили значительного изменения титра (ФИГ. 18A). После повторной стимулирующей иммунизации мы наблюдали значительный спад титра нАТ между днями 14, 126 и 209 даже с повторной стимулирующей иммунизацией в день 28 в группе дозы 0,1 мкг находящейся в составе рвРНК, тогда как в группе дозы 1 мкг находящейся в составе рвРНК не выявили значительного изменения титра (ФИГ. 18B).
[00450] Чтобы оценить ответы T-клеток после сокращения после повторной стимулирующей иммунизации, мы повторно стимулировали подгруппу из каждой группы мышей соответствующими составами вакцин и собирали селезенки через 46 дней и стимулировали спленоциты пулом пептидов, соответствующих эпитопам CD8 в prM и E ZIKV (Muthumani и др., 2016; Elong Ngono и др., 2017) (ФИГ. 12B - F). Хотя не наблюдали значительных различий для активированных CD4 T-клеток (ФИГ. 12B, 12C), РНК, находящаяся в составе с НЛН, вызывала значительно более высокие уровни IFNγ+ и CD107a+ CD8+ T-клеток по сравнению с РНК, находящейся в составе с КНЭ, или РНК, не находящейся в составе (ФИГ. 12D, 12E). Хотя РНК, находящаяся в составе с НЛН, не вызывала значительно более высокие уровни TNF-α+ CD8+ T-клеток по сравнению с РНК, находящейся в составе с КНЭ, уровни данных активированных CD8+ T-клеток были значительно выше, чем в группах с РНК, не находящейся в составе (ФИГ. 12F). Оставшихся мышей, которых повторно не стимулировали, затем сенсибилизировали через 30 дней после однократной иммунизации. Используемая модель провокации была описана ранее (Smith и др., 2017) и включала введение моноклонального антитела, блокирующего рецептор интерферона альфа (IFNAR), за 1 день до и через 1 и 4 дня после сенсибилизации, чтобы повысить восприимчивость данных иммунокомпетентных мышей к штамму 41525 ZIKV Дакар.
[00451] Для того чтобы оценить иммуногенность и эффективность нашей оптимизированной платформы вакцины, НЛНv2 объединяли в комплекс с рвРНК при минимально реактивном, но иммуногенном отношении N:P, и использовали для иммунизации мышей C57BL/6 в/м путем 100, 30, 10 и 3 нг рвРНК в комплексе с НЛНv2 при N:P, равном 15 (n = 14/группу), и мы сравнивали ответы с таковыми для мышей, иммунизированных 100 нг находящейся в составе с НЛНv1 (n = 14) или КНЭ (n = 4) рвРНК при одинаковом N:P, которое субоптимально для данных композиций. Отдельное исследование, в котором сравнивали НЛНv1 и КНЭ при оптимальных N:P, кратко представлено на ФИГ. 28. Дозы 100 и 10 нг не находящейся в составе рвРНК вводили наряду с ложной вакцинацией в качестве контролей (n = 14/группу). Через две недели после однократного введения у мышей брали кровь, чтобы измерить титры нАТ с помощью РЗБО80, по 4 мыши на группу умерщвляли, выделяли спленоциты, стимулировали их пулом пептидов, соответствующих эпитопам CD8+ T-клеток мышей в prM/E ZIKV (34,50), и измеряли ответы T-клеток с помощью проточной цитометрии (ФИГ. 20A - B).
[00452] Мы наблюдали 100% сероконверсию только в группах с НЛНv в составе, получивших дозы 100, 30 и 10 нг со средними титрами РЗБО80, равными 1:604, 1:302 и 1:113, соответственно. Мы наблюдали 25% сероконверсию в группе с дозой 3 нг, аналогично таковой для группы 100 нг НЛНv в составе с субоптимальным отношением N:P. Группа с КНЭ в составе была значительно эффективнее, чем с НЛНv1, при N:P, равном 15, что коррелировало с повышенной экспрессией SEAP in vitro при меньших отношениях N:P (ФИГ. 3C), тем не менее, та же доза в составе с НЛНv2 при таком же N:P приводила к повышению титров нАТ в ~13 раз (среднее РЗБО80 равно 1:604 по сравнению с 1:48, p < 0,0001).
[00453] Что касается ответов CD8+ T-клеток, мы наблюдали значительные проценты B220loCD8+IFNγ+ T-клеток по сравнению с ложной вакцинацией у мышей, получивших однократную дозу 100 и 30 нг в составе с НЛНv2. Данные ответы были значительно слабее по сравнению с 2 дозами 1 мкг в составе с НЛНv1 при N:P, равном 50 (ФИГ. 28E), подтверждая, что формат примирования/стимулирования может усилить клеточные иммунные ответы, что продемонстрировали ранее. См. Knudsen и др., J Virol. 88(21):12438-51 (2014).
[00454] Наконец, оставшихся 10 мышей на группу сенсибилизировали через 30 дней после однократного введения, как описано выше, и брали кровь спустя 4 дня, чтобы определить виремию с помощью анализа образования бляшек (ФИГ. 20C). У мышей ежедневно отслеживали признаки заболевания и потери массы тела (ФИГ. 20D-E). Всех мышей, которые потеряли более 20% от массы тела до провокации или выглядели умирающими, умерщвляли в указанные моменты времени (ФИГ. 20D). Все мыши, вакцинированные ложной вакциной и 100 нг не находящейся в составе рвРНК испытывали высокие уровни виремии (между 2,6 и 5,8 log10 БОЕ/мл), тогда как 1 из 10 мышей в группе, которой вводили 10 нг не находящейся в составе рвРНК, была защищена от детектируемой виремии (предел обнаружения = 50 БОЕ/мл). В группах НЛНv2 дозы 100, 30 и 10 нг на 100% защищали от детектируемой виремии и доза 3 нг защищала 6 из 10 мышей. Одно животное из 10 в группе, которой вводили 100 нг НЛНv1 в составе при субоптимальном N:P, не было защищено от виремии. Все группы НЛНv1 и НЛНv2 были защищены от значительной потери массы тела и смерти, включая дозу 3 нг в составе с НЛНv2. Группы не находящейся в составе рвРНК испытывали значительную потерю массы тела, причем только 10% и 20% пережили провокацию до 30 дней после провокации в группах, которым вводили дозы 100 и 10 нг, соответственно, по сравнению со 100% смертностью в группе с ложной вакцинацией через 10 дней после провокации.
[00455] Хотя не входящая в состав РНК в обеих дозах была неспособна полностью защитить всех мышей от виремии, для РНК, входящей в состав как с КНЭ, так и с НЛН, продемонстрировали полную защиту от детектируемой виремии (предел обнаружения = 50 бляшкообразующих единиц/мл) (ФИГ. 12G). В отношении выживаемости, все дозы 1 мкг (не входящие в состав, входящие в состав с КНЭ или НЛН) защищали 100% мышей от смерти, тогда как 80% мышей, вакцинированных 10 мкг РНК, не находящейся в состава, выживали, по сравнению с выживаемостью 17% ложно вакцинированных мышей.
Иммуногенность у иммунокомпетентных мышей.
[00456] Для того чтобы оценить экспрессию белка или иммуногенность в иммунокомпетентной модели на мышах, пять самок мышей C57BL/6 (Charles River) в возрасте 4 недель на группу вакцинировали составом для внутримышечного (в/м) введения в четырехглавую мышцу бедра смесью 1:1, содержащей РНК, в общем объеме 50 мкл. В различные моменты времени кровь собирали ретроорбитальным путем, получали сыворотку после низкоскоростного центрифугирования и хранили при -20°C до момента определения титров РЗБО80, как описано выше. После однократной внутримышечной иммунизации у мышей, которым вводили путем инъекции указанные составы (/QG767 и /QG768), обнаружили высокий титр нейтрализующего ZIKV антитела через 14 дней после иммунизации, который измеряли с помощью анализа реакции задержки (нейтрализации) бляшкообразования (РЗБО80), по сравнению с мышами, иммунизированными контрольными или другими составами, в которых не содержится сложный моноэфир сорбитана (например, спан).
[00457]
Пример 10. Дополнительные модификации НЛН для увеличения емкости загрузки и улучшения доставки.
[00458] Ранее продемонстрировали, что сквален, компонент жидкого масла НЛН, активирует воспалительные пути, включая зависимую от каспазы и IL-18 активацию инфламмасомы (Desbien и др., 2015; неопубликованные данные). Так как данные события оказывают отрицательное влияние на репликацию вируса (Chen и др., 2015), мы попытались уменьшить содержание сквалена, при этом увеличивая концентрации ДОТАП, чтобы увеличить емкость загрузки РНК у наших НЛН. Для проверки этого in vivo мы получили 4 дополнительных состава с высокой нагрузкой РНК: QG924, QG925, QG941 и QG942, все из которых содержали одинаковую высокую концентрацию ДОТАП, но более высокую, чем в QG807, и в которых уменьшалась концентрация сквалена от состава к составу. Затем мы получали комплекс экспрессирующего SEAP репликона с QG807 при 40 мкг/мл и сравнивали экспрессию SEAP в день 3 после 1 мкг в/м дозы с QG807, QG924, QG925, QG941 и QG942 в комплексе с РНК при в 10 раз более высокой концентрации - 400 мкг/мл, доставленными в такой же в/м дозе - 1 мкг (ФИГ. 13A). Хотя QG807 в комплексе с РНК при 400 мкг/мл был неспособен доставлять эффективную дозу 1 мкг, по сравнению с QG807 в комплексе с РНК при 40 мкг/мл, QG942 в комплексе с 400 мкг РНК/мл вызывал сходные уровни экспрессии SEAP после дозы 1 мкг по сравнению с такой же дозой, доставленной с помощью QG807 в комплексе с 40 мкг РНК/мл.
[00459] В описанных выше экспериментах НЛНv1 или КНЭ смешивали 1:1 с 40 мкг РНК/мл (N:P = 50), которая представляла собой наиболее низкую концентрацию, которая 1) позволяла уместить дозу 1 мкг РНК в объем инъекции 50 мкл, и 2) приводила к оптимальной экспрессии SEAP in vitro (ФИГ. 3C) и in vivo (ФИГ. 26). Тем не менее, значение N:P, равное 50, приводит к относительно большому избытку состава, что связано с рисками переносимости, связанной с составом, с требованиями увеличения доза; эмульгированный сквален и ДОТАП (катионные липиды в целом) представляют собой иммуностимуляторы, и их большие количества могут вызвать воспалительную и местную реактогенность. См. Lv и др. J Control Release. 114(1):100-9 (2006); Desbien и др., Eur J Immunol. 45(2):407-17 (2015). В результате, мы пытались разработать и синтезировать состав НЛН, который может доставлять высокую дозу РНК при значительно более низких значениях N:P. Полученный в результате этого состав был производным, хотя и физико-химически отличным вариантом НЛНv1, его впоследствии обозначили НЛН v2; его физико-химические свойства кратко представлены в таблице 2. Перед созданием НЛН v2 мы произвели высоко концентрированные варианты НЛН v1, чтобы увеличить емкость загрузки РНК: некоторые содержали настолько много как 30% (масса/объем) сквалена и 1,8% (масса/объем) динасана 114, но имели идентичные отношения S:O. Последнее позволяло нам сохранять размер наночастиц и химический состав постоянными, при этом повышая емкость загрузки РНК благодаря повышенной концентрации наночастицы. Хотя данный подход позволил преодолеть практическое ограничение загрузки больших количеств РНК, он не обошел применение избыточного состава. В результате, в последующих вариантах мы уменьшили количество сквалена и динасана 114 до всего лишь 3,75% (масса/объем) сквалена и 0,24% динасана 114, соответственно, при этом сохраняя общую композицию поверхностно-активных веществ ([ДОТАП]+[спан 60]+[твин 80]) и отношение ([ДОТАП]:[спан 60]:[твин 80]) постоянными, эффективно увеличив отношение S:O в 9 раз (от 0,18 до 1,68) в НЛНv2 по сравнению с НЛН v1. Интересно, что когда мы подвергали скринингу данные составы в комплексе с рвРНК SEAP in vivo, мы наблюдали возрастающую экспрессию SEAP при снижении концентрации сквалена (ФИГ. 27). В результате такого относительно высокого отношения S:O НЛНv2 имел средний диаметр ~40 нм, практически в 2 раза меньший размер частицы по сравнению с НЛНv1 (ФИГ. 23A), что измеряли с помощью ДРС. Аналогично НЛНv1, НЛНv2 защищала рвРНК от разрушения РНКазой (ФИГ. 23B). Для того чтобы подтвердить повышенную емкость загрузки у НЛНv2, мы получили комплексы возрастающих концентраций рвРНК с НЛНv1 или НЛНv2 (1:1 в объемном отношении) и провели количественный анализ не связанный РНК с помощью электрофоретического анализа замедления подвижности в геле (ФИГ. 23C). Хотя 100% РНК было связано с НЛНv1 при концентрации рвРНК менее 100 мкг/мл (N:P > 20), выявили 100% связывание РНК с НЛНv2 при концентрациях рвРНК вплоть до 10 мг/мл.
[00460] Для проверки влияния уменьшения количества сквалена на гибель клеток мы инкубировали клетки BHK в течение ночи при разведении 1:20 каждого состава с высокой нагрузкой РНК в течение 4 часов, затем анализировали гибель клеток путем окрашивания йодидом пропидия (PI) и аннексином, чтобы определить количество живых клеток, с помощью проточной цитометрии, которые не претерпевали апоптоз (ФИГ. 13B). Мы наблюдали наибольшее количество живых клеток среди обработанных QG942 клеток, что коррелирует с наименьшей концентрацией сквалена, причем все остальные компоненты оставались идентичными между составами.
[00461] Для того чтобы оценить оптимальное N:P, которое приведет к максимальной экспрессии SEAP in vitro, мы получили комплекс НЛНv2 с SEAP-рвРНК при различных отношениях N:P и инкубировали дозы 100 нг рвРНК с клетками BHK в течение ночи, как описано выше. Мы наблюдали уменьшение оптимального N:P по меньшей мере в ~5 раз для НЛНv2 по сравнению с НЛНv1: от >100 для НЛНv1 до между 15 и 37 для НЛНv2 (ФИГ. 23D). Интересно, что максимальный уровень экспрессии SEAP для НЛНv2 также увеличивался в ~2,5 раза по сравнению с НЛНv1. Наконец, по сравнению с КНЭ (ФИГ. 3C), НЛНv2 обеспечивал повышение максимальной экспрессии SEAP практически в 10 раз при приблизительно 1/3 от значения N:P.
[00462] Затем мы продвинули QG942 на этап исследования иммуногенности, используя морских свинок Хартли (Charles River) массой 400 - 450 г, чтобы посмотреть, можем ли мы вызвать нейтрализующие антитела против ZIKV в модели больших грызунов. В данном исследовании мы нагружали QG942 (НЛНv2) РНК при концентрации 400 мкг/мл (в 10 раз более высокой концентрации) и сравнивали дозы 50, 5 и 0,5 мкг, вводимые в/м путем или внутрикожным (в/к) путем с применением игл Nanopass MicronJet600 (Nanopass Technologies, Ltd.), с дозами 5 и 0,5 мкг РНК, нагруженной на QG807 при 40 мкг/мл РНК со смесью 1:1, содержащей НЛН и рвРНК, кодирующую prM/E ZIKV, в четырехглавую мышцу бедра в общем объеме 250 мкл. Мы также включали 50 мкг РНК, не находящейся в составе, в качестве контроля. Через двадцать четыре часа измеряли диаметр гиперемии в месте в/м или в/к инъекции. Кровь собирали в моменты времени, указанные на подписях к фигурам, из бедренной вены, получали сыворотку после низкоскоростного центрифугирования и хранили при -20°C до момента определения титров РЗБО80, как описано выше. К 14 дню после однократной иммунизации мы наблюдали зависимый от дозы ответ нейтрализующих антител, свидетельствующий о том, что мы успешно доставили наибольшую дозу 50 мкг РНК, чего невозможно было добиться с использованием QG807. Кроме того, мы не наблюдали никаких значимых различий между дозами 5 и 0,5 мкг, доставленными с помощью QG942 или QG807, при анализе через 28 дней, хотя небольшая тенденция в пользу QG942 позволяла предположить, что снижение концентрации сквалена может быть предпочтительным. Мы наблюдали тенденцию ответа на дозу, хотя не было значимых различий между дозами, причем в/м введение доз 50, 5 и 0,5 мкг приводило к средним титрам РЗБО80, равным 1:761, 1:452 и 1:226, соответственно, тогда как в/к введение доз приводило к средним титрам РЗБО80, равным 1:905, 1:380 и 1:269, соответственно. См. ФИГ. 23E. Интересно отметить, что значимые различия наблюдали между группами, которым вводили рвРНК при дозе 5 мкг в составе с НЛНv1 и НЛНv2, причем рвРНК, находящаяся в составе с НЛНv2, вызывала в ~4 или ~8 раз более высокие титры нАТ при в/к или в/м пути введения, соответственно. Для сравнения, экспрессия SEAP in vitro при данных отношениях N:P увеличивалась в ~8,4 раза (ФИГ. 23D) в НЛНv2 по сравнению с НЛНv1. Для того чтобы охарактеризовать НЛНv2 in vivo в отношении экспрессии белка, реактогенности и иммуногенности, мы выбрали для тестирования от 4 до 5 отношений N:P, включая отношения, коррелирующие с активностью SEAP in vitro ≥ 5,8 Log10 ОЕЛ (100, 37, 15, 5,6), и N:P, равное 3, вне гипотетического оптимального диапазона. Для того чтобы охарактеризовать экспрессию белка, мышам C57BL/6 вводили путем в/м инъекции дозы 1000, 100, и 10 нг рвРНК SEAP при каждом отношении N:P. Для того чтобы охарактеризовать реактогенность, 50 мкг рвРНК в комплексе с НЛНv2 при каждом N:P также вводили путем в/к инъекции морским свинкам и измеряли диаметр гиперемии. Через двадцать четыре часа после инъекции у мышей брали кровь для измерения активности SEAP в сыворотке и измеряли гиперемированные места инъекции у морских свинок (ФИГ. 22E - H). Для того чтобы охарактеризовать иммуногенность, рвРНК ZIKV объединяли в комплекс с НЛНv2 при каждом N:P, и 1000 нг или 100 нг доставляли мышам в/м путем. У мышей затем брали кровь спустя 14 дней, чтобы измерить титры нАТ (ФИГ. 22F - G).
[00463] Начиная с экспрессии SEAP in vivo, оптимальные отношения N:P зависели от дозы, при этом оптимальное N:P составляло 15 для дозы 1000 нг, 37 для дозы 100 нг и 100 для дозы 10 нг (ФИГ. 22E). Как и ожидали, иммуногенность, похоже, коррелировала с экспрессией SEAP при двух дозах, которые сравнивали (ФИГ. 22F - G). При дозе 1000 нг мы не обнаружили значимых различий в титрах нАТ для любых исследованных отношений N:P, аналогично активности SEAP при данных отношениях N:P (ФИГ. 22F). При дозе 100 нг мы не наблюдали значимых различий в титрах нАТ между отношениями N:P, равными 37 и 15, и наблюдали небольшие, но незначимые различия в активности SEAP, тем не менее, происходило значимое снижение титра между отношениями N:P, равными 15 и 5,6, аналогично активности SEAP (ФИГ. 22G). В отношении реактогенности, мы наблюдали значимое уменьшение в диаметре гиперемии, когда отношение N:P снижалось в 2,5 раза с 37 до 15 (ФИГ. 22H). Важно то, что полученные результаты позволяют предположить, что уменьшение N:P в 2,5 раза с 37 до 15 значительно снизит реактогенность, но окажет минимальное влияние на уровни экспрессии антигена и последующую иммуногенность, особенно при более высоких дозах рвРНК. В действительности, при значениях N:P, равных 15 и 37, наблюдали эффект экономии дозы, так как не было значимого различия между активностями SEAP при дозах 1000 и 100 нг (ФИГ. 22E). Наибольшие различия в активности SEAP между дозами наблюдали при низких отношениях N:P (ФИГ. 22E).
Пример 11. Емкость загрузки и доставка РНК.
[00464] Для того чтобы доставить 10 мкг РНК в объеме инъекции 50 мкл (концентрация 200 мкг РНК/мл), мы получили НЛН с повышенной емкостью загрузки, по сравнению с QG807. На фигуре 14 показано, что получение комплекса 400 мкг РНК/мл 1:1 (в объемном отношении) с QG807 (N/P ~ 4,8) значительно не улучшало экспрессию SEAP in vivo по сравнению с голой РНК или РНК, не находящейся в составе. С другой стороны, QG807 обеспечивают хорошую экспрессию SEAP, когда находится в комплексе 1:1 (в объемном отношении) с 40 мкг РНК/мл (N/P ~ 48) при 1 или 0,1 мкг РНК - доза 10 мкг. Это позволило предположить, что для доставки 10 мкг РНК нам необходимо увеличить емкость загрузки у НЛН.
[00465] Чтобы увеличить емкости загрузки, мы выдвинули гипотезу, что уменьшение среднего размера частиц НЛН при поддержании общего объема постоянным теоретически должно увеличить общее количество частиц НЛН, что, таким образом, приведет к увеличению количества сайтов связывания РНК. В результате, мы изготовили QG911, у которого был состав, относительно сходный с таковым у QG807, за исключением того, что при производстве добавляли 10 мМ цитрат и подвергали микрофлюидизации с 10 пропусканиями при 30000 фунтах/кв. дюйм (по сравнению с 5 пропусканиями при 30000 фунтах/кв. дюйм для QG807), чтобы получить меньший средний диаметр частиц. Конечный Z-средний диаметр частиц QG911 составлял 87 нм, что на ~17% меньше, чем диаметр частиц QG807 (Z-средний = 105 нм).
[00466] Чтобы дополнительно уменьшить размер частиц, мы изготовили QG912 с половиной от отношения масло/поверхностно-активное вещество у QG911. Уменьшение количество масла по отношению к общему количеству поверхностно-активного вещества увеличивает отношение площади поверхности (ПП) к объему (О) у частиц НЛН и, следовательно, уменьшает размер частиц. Данный принцип подтверждали опытным путем на фигурах 2A - B: частицы НЛН с различными отношениями масло/поверхностно-активное вещество подвергали микрофлюидизации с 10 пропусканиями при 30000 фунтах/кв. дюйм. Более низкое отношение масло/поверхностно-активное вещество у QG912 помогло уменьшить Z-средний диаметр до 63 нм.
[00467] Результаты экспрессии SEAP in vitro (результаты не представлены) показали, что как QG911, так и QG912 имели более высокую емкость загрузки РНК, чем QG807: оптимальная экспрессия SEAP для QG911 и QG912 составляла приблизительно 100 мкг РНК/мл по сравнению с 40 мкг/мл для QG807. Для того чтобы загрузить более 100 мкг РНК/мл, мы увеличили общую концентрацию НЛН и изготовили QG924 (Z-средний = 110,6 нм) и QG925 (Z-средний = 58,6 нм). В обоих QG924 и QG925 было такое же отношение масло/поверхностно-активное вещество, как и в QG911 и QG912, соответственно, но они было приблизительно в 7,4 раз более концентрированные. Экспрессия SEAP in vitro показала, что увеличение концентрации НЛН в 7,4 раза привело к дополнительному повышению емкости загрузки РНК (исследование N1006-214): оптимальная емкость загрузки для QG924 составляла приблизительно 200 мкг/мл и для QG925 - составляла приблизительно 400 мкг/мл или выше. Поскольку QG925 содержит половину от сквалена, содержащегося в QG924, и меньший средний размер частиц, мы выдвинули гипотезу, что уменьшение содержания сквалена или размера частиц, или их комбинация, стимулировали более высокую экспрессию. Для дополнительного подтверждения данной гипотезы мы изготовили QG941 и QG942, которые содержали 7,5% (масса/объем) сквалена (масло/поверхностно-активное вещество = 1,2) и 3,75% (масса/объем) сквалена (масло/поверхностно-активное вещество = 0,6), соответственно. Эксперимент по экспрессии SEAP in vivo с помощью QG924, QG925, QG941 и QG942 показал, что уменьшение отношения масло/поверхностно-активное вещество коррелировало с увеличением экспрессии при дозе 1 мкг РНК.
Пример 12. Анализ цельной крови с различными SPAN.
Материалы:
[00468] Составы разбавляли 1:10 чистым для промывания солевым раствором. 50 мкл x 16 каждого разведения наносили на 96-луночные планшеты для культуры тканей с U-образным дном. 200 мкл гепаринизированной цельной крови из 8 доноров, в двух повторах, добавляли в каждый состав. После инкубации в течение 24 ч при 37°C-CO2, отбирали супернатанты плазмы и анализировали в них IL-6, IL-8 (CXCL8), MCP-1 (CCL2) и Mip-1b (CCL4).
[00469] Состав НЛН, содержащий спан 60 (сорбитана моностеарат) - QG863 - вызывал значительно более высокие титры хемокинов, чем все группы, кроме QG983 (НЛН со спаном 65) и QG987 (КНЭ со спаном 65) (p < 0,0001; однофакторный дисперсионный анализ и критерий множественных сравнений Тьюки). Спан 65 представляет собой сорбитана тристеарат, который является триацилированным вариантом спан 60. Полученные результаты позволяют предположить, что сложные эфиры сорбитана, содержащие полностью насыщенные ацильные цепи C18 (стеаратные группы) наиболее предпочтительны, в частности, моноацилированный вариант (спан 60), в композиции НЛН для стимуляции высвобождения множества хемокинов (см. ФИГ. 15A - D).
Пример 13. Оценка однократной иммунизации.
[00470] РНК-репликон VEEV, экспрессирующий ZIKV-PrM-E, включали в состав с QG807 (смесь 1:1, концентрация РНК 400 нг/мкл) и применяли для иммунизации мышей C57BL/6 (n = 5/группу) внутримышечным путем (50 мкл РНК в составе/инъекцию/мышь). Сыворотки собирали в указанные моменты времени после инъекции и анализировали нейтрализующий ZIKV титр с помощью анализа РЗБО.
[00471] После однократной инъекции у животных, иммунизированных рвРНК отдельно (дозой либо 10 мкг, либо 1 мкг), наблюдали максимальные титры в день 14 (Д14) после инъекции, которые впоследствии спадали и не детектировались в Д85. Наоборот, у животных, иммунизированных рвРНК в составе с QG807, наблюдали постоянные титры, которые были измеримы в Д85, и, в случае животных, получивших 1 мкг рвРНК, не спадали относительно титров, измеренных в Д14. Аналогичный паттерн наблюдали у животных, получивших две инъекции РНК: у животных, получивших рвРНК отдельно (в 10% сахарозе), наблюдали увеличение титров, которые достигали пика в Д42 и спадали до недетектируемых уровней ко Д120. Наоборот, у животных, получивших у животных, получивших рвРНК в составе с QG807, были постоянные титры, сравнимые с таковыми, наблюдаемыми в Д42 (ФИГ. 18A - B).
Пример 14. Индукция CD8 T-клеток.
[00472] Мышей иммунизировали вакциной VEEV-TC83 РНК, экспрессирующей ZIKV-PrM-E, в составе с QG807 дважды (Д0, Д28) внутримышечным путем. Мышей (n = 3/группу) умерщвляли через 14 или 49 дней после повторной стимуляции и окрашивали спленоциты для выявления ZIKV-специфичных CD8+ T-клеток, применяя проточную цитометрию. Индукцию B220loCD8+ T-клеток, экспрессирующих интерферон γ (IFNγ+) или CD107a, наблюдали через 14 дней после повторной стимуляции во всех животных, которым вводили путем инъекции рвРНК. В день 49 у животных, иммунизированных РНК в составе с QG807, наблюдали значительно более высокие уровни CD8+ T-клеток по сравнению с иммунизацией только РНК (**** p < 0,0001, однофакторный дисперсионный анализ, ФИГ. 19A - B).
Пример 15. Защита низкой дозой РНК.
[00473] Мышей C57Bl/6 иммунизировали реплицирующейся рвРНК, экспрессирующей ZIKV-PrM-E. РНК вводили путем инъекции в комбинации с QG942 или в 10% сахарозе при указанных дозах. Через двадцать восемь дней после инъекции анализировали титры нейтрализующего ZIKV антитела в сыворотке периферической крови и анализировали присутствие антигенспецифических CD8+ T-клеток в спленоцитах после повторной стимуляции. Зависящие от состава значимые повышения титров можно было наблюдать при 100 нг РНК (однофакторный дисперсионный анализ); находящаяся в составе РНК вызывала значительно более высокие титры нейтрализующих антител и CD8+ T-клеток, чем РНК отдельно при такой же дозе. Значимые повышения по сравнению с ложной иммунизацией контрольных животных также можно было наблюдать при 30 нг РНК. Индукцию антител также наблюдали при 10 нг, но она не была значимой по сравнению с контролями (ФИГ. 20A - B).
Пример 16. Доставка антитела.
[00474] Доставляющие антитело клоны в остове репликона получали путем встраивания последовательностей антитела по ходу транскрипции от промотора. Вариабельные и константные области IgVH и IgVL можно разделить либо последовательностью 2A, либо участком внутренней посадки рибосомы (IRES). Трансфекция кэпированных РНК, содержащих тяжелую и легкую цепи антитела, приводила к получению функционального связывающего антитела. Данные концентрации наблюдали при дозах РНК/лунку между 10 мкг и 100 мкг.
[00475] После детектирования антител in vitro проводили эксперимент на мышах. Вкратце, конструкция с антителом, в которой гены IgVH и IgVL были разделены IRES, объединяли в комплекс с QG942 при отношении N:P, равном 15. Дозу 5 мкг или 50 мкг вводили путем внутримышечной инъекции в общем объеме 100 мкл (по 50 мкл на заднюю лапу). Сыворотку собирали через 7 дней после инъекции и анализировали присутствие в ней антигенспецифических антител, применяя количественный анализ ELISA. Инъекция 50 мкг рвРНК в составе с QG942 приводила к большим титрам антител, чем инъекция 5 мкг голой РНК.
Пример 17. Индукция нейтрализующих антител и CD4+ T-клеток.
[00476] Репликон ID91 (фигура 29) в комбинации с прототипом состава НЛН QG807 сравнивали с субъединичной вакциной ID91+GLA-СЭ у мышей, которым вводили низкую дозу аэрозоля Mycobacterium tuberculosis (mtb) H37Rv. Когорты мышей C57BL/6 (n = 3/группу) иммунизировали дважды в/м с интервалом в три недели (примирование/повторная стимуляция) либо вакциной с 0,5 мкг белка ID91 и 5 мкг GLA-СЭ, либо вакциной с 1 мкг ID91-РНК на остове альфа-вируса и QG807. Спленоциты выделяли через две недели после последней иммунизации и повторно стимулировали in vitro в течение 6 часов, применяя среду отдельно, полноразмерный белок ID91, один из десяти различных пептидов ID91 с объединенными перекрывающимися пептидами ID91 или P + I (всего = 16) на одном полном 96-луночном планшете. См. таблицу 4 ниже. Затем проводили внутриклеточное окрашивание цитокинов (ICS).
Таблица 4.
[00477] У мышей, иммунизированных вакцинами с рвРНК и белком ID91, индуцировались ответы CD8+ или CD4+ T-клеток (ФИГ. 30A - B, 31A - D и 32A - D). Продемонстрировали сильную экспрессию антигена с распознаванием различных доминантных эпитопов ID91 в зависимости от иммунизации белком ID91 с адъювантом GLA-СЭ или рвРНК ID91. Id. Для вакцины белок ID91/GLA-СЭ, идентифицировали оба эпитопа CD4 и CD8. Пулы пептидов № 2, 4, 10, 12 и 13 индуцировали хорошо пролиферирующие и продуцирующие цитокины CD4+ T-клетки в иммунизированных белком ID91/GLA-СЭ мышах C57BL/6. Между тем, пулы пептидов № 3, 4, 10, 11 и 12 индуцировали хорошо пролиферирующие и продуцирующие цитокины CD8+ T-клетки в иммунизированных белком ID91/GLA-СЭ мышах C57BL/6. Субъединица Rv3478 вакцины ID91 возможно содержит доминантные эпитопы как для CD4, так и для CD8 T-клеток. Вакцина РНК ID91 + QG807 вызывала образование преимущественно эпитопов CD8, а не эпитопов CD4. Пулы пептидов № 8, 9, 10, 12, 13 индуцировали хорошо пролиферирующие и продуцирующие цитокины CD8+ T-клетки в иммунизированных РНК ID91 + QG807 мышах C57BL/6. Субъединица Rv1886 вакцины ID91 содержит наиболее доминантные эпитопы для CD8+ T-клеток.
[00478] В таблице 5 представлено картирование 15-мерных эпитопов ID91, причем 8 последовательностей аминокислот перекрываются (эпитопы с последовательностями SEQ ID NO: 19 - 133, соответственно).
Таблица 5 (SEQ ID NO см. в таблице 1).
[00479] Когорты самок мышей C57BL/6 (n = 4/группу) однократно иммунизировали в/м путем солевым раствором, ID91+GLA-СЭ или вакциной ID91-РНК и собирали селезенки через 3 недели для оценки фенотипов T-клеток. Результаты представлены в виде процента CD4+/CD44+, или процента CD8+ T-клеток, экспрессирующих IFNγ, IL-2 и TNF (ФИГ. 33A). Статистическую значимость на уровне p < 0,05 анализировали, применяя двухфакторный дисперсионный анализ, и обозначили звездочкой. После однократной иммунизации вакцина ID91+GLA-СЭ (белок) вызывала ответ TH1 CD4 T-клеток, для которого характерна индукция IFNα, TNF и IL-2, тогда как вакцина ID91-РНК была способна вызывать значительный ответ IL-2 CD4+ T-клеток. Ни одна из вакцин не вызывала значительный ответ CD8+ T-клеток после однократной иммунизации в данном эксперименте.
[00480] Эффективность против H37Rv Mtb также продемонстрировали in vivo. Когорты самок мышей C57BL/6 (n = 7/группу) иммунизировали однократно 1 мкг ID91+GLA-СЭ, конструкции ID91-РНК на остове альфа-вируса или солевым раствором за 3 недели до провокации H37Rv Mtb. Бактериальную нагрузку оценивали в гомогенатах легких через 3 недели после провокации H37Rv Mtb (ФИГ. 33B). Результаты представлены в виде Log10 количества бактерий (колониеобразующих единиц; КОЕ) внутри легких мышей через 3 недели после сенсибилизации. Значимость P < 0,05 по сравнению с солевым раствором анализировали, применяя однофакторный дисперсионный анализ с критерием множественных сравнений Даннета, и обозначили звездочкой. Как ID91+GLA-СЭ, так и вакцина ID91-РНК были эффективны после однократной иммунизации против инфекции H37Rv Mtb, что измерили по снижению бактериальной нагрузки внутри легкого через три недели после инфекции.
Пример 18. Стимуляция in vitro лигандами в составе НЛН для рецепторов нуклеиновых кислот.
[00481] Агонисты на основе нуклеиновых кислот, сконструированные для имитации вирусного генетического материала, являются эффективными стимуляторами врожденного иммунитета и могут запускать смещенный в сторону TH1 приобретенный иммунный ответ против рака и инфекционных заболеваний. См.Temizoz и др., Curr Opin Pharmacol 41:104-113 (2018); Iurescia и др., Front Immunol 9:711 (2018); Reed и др., Nat Med 19(12):1597-608 (2013). В зависимости от структуры и локализации, агонисты на основе нуклеиновых кислот связываются либо с эндосомальными (TLR3, TLR7/8, TLR9), либо с цитозольными (RLR, STING-I) рецепторами и стимулируют продукцию интерферона и других хемотаксических цитокинов. Также известно, что рецепторы TLR3 и RIG-I вызывают перекрестное представление антигенов на белках ГКГС I, тем самым активируя CD8+ T-клетки, которые созревают с образованием антигенспецифических цитотоксических T-лимфоцитов (CTL). См. Jelinek и др., J Immunol 186(4):2422-9 (2011); Hochheiser и др., J Immunol 196(6):2439-43 (2016); Schmidt и др., Front Immunol 9:898 (2018). Здесь мы продемонстрировали, что агонисты TLR3 (дцРНК) и RIG-I (дцРНК с трифосфатом на 5’-конце) в составе с наноструктурированными липидными носителями (НЛН) значительно повышали индукцию хемокинов in vitro по сравнению с голым агонистом как в первичных клетках, так и в дендритных клетках, полученных из МКПК человека, а также в линии клеток Mono-Mac-6 (MM6).
[00482] Материалы. Поли(I:C):HMW представляет собой синтетический аналог дцРНК, который может активировать пути TLR3 и RIG-I/MDA5 и был приобретен у Invivogen. Riboxxol представляет собой синтетический агонист TLR3 на основе дцРНК длиной 50 п.о., приобретенный у Riboxx GmBH. SEVDI (дефектный интерферирующий вирус Sendai) представляет собой дцРНК - агонист Rig-I с 5’-трифосфатной концевой группой, и его синтезировали согласно ранее опубликованному протоколу. Martinez-Gil и др., J Virol 87(3):1290-300 (2013). Состав НЛН произвели в Научно-исследовательском институте инфекционных заболеваний (IDRI), применяя доступные для приобретения реагенты, включая ДОТАП (N-[1-(2,3-диолеоилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония хлорид) от Corden Pharma, динасан® 114 (глицерилтримиристат) от Sasol Limited и следующие реагенты от Sigma-Aldrich: сквален, спан® 60 (сорбитана моностеарат), твин® 80 (этоксилированный сорбитана моноолеат) и цитрат натрия двухводный.
[00483] Способ производства НЛН. Масляную фазу, состоящую из сквалена, твердого липида глицерилтримиристата (динасан® 114), неионного поверхностно-активного вещества сорбитана моностеарата (спан® 60) и катионного липида ДОТАП, готовили в стакане емкостью 100 мл и нагревали до 60°C на заранее нагретой водяной бане. Водную фазу, состоящую из 10 мМ цитрата натрия двухводного и неионного поверхностно-активного вещества твин® 80, получали в отдельном стакане емкостью 100 мл и доводили до 60°C. После полного растворения твердых компонентов масляную и водную фазы объединяли путем добавления водной фазы в масляную фазу. Полученную двухфазную смесь гомогенизовали с помощью высокоскоростного лабораторного устройства для эмульгирования (Silverson Machines, Inc.) для получения микронного размера капель НЛН. Неочищенную смесь НЛН затем обрабатывали в микрофлюидизаторе M-110P (Microfluidics, Corp.) с помощью 10 отдельных пропусканий при 30000 фунтах/кв. дюйм. Конечный размер частиц, измеренный с помощью динамического рассеяния света (ДРС), составлял от 40 до 50 нм (z-средний диаметр), при этом коэффициент полидисперсности (PDI) составлял 0,1 - 0,2. Подвергнутый микрофлюидизации состав окончательно фильтровали с помощью шприцевого фильтра с мембраной из полиэфирсульфона с диаметром пор 0,2 мкм и хранили при 2 - 8°C. Физико-химические свойства типичного состава НЛН (QG942) представлены в таблице 6.
Таблица 6.
[00484] Способ стимуляции МКПК-ДК: РНК-адъюванты смешивали с НЛН при различных отношениях азот:фосфат (N:P) и позволяли образоваться удерживаемому электростатическими взаимодействиями комплексу путем инкубации в течение 30 минут на льду. Высеянные клетки стимулировали материалом комплекса при различных дозах РНК для получения кривой зависимости доза-эффект. На фигурах 39A - E МКПК-ДК из шести доноров-людей стимулировали поли-IC:HMW, Riboxxol или SEVDI, либо в составе с НЛН («в составе с QG942»), либо голыми («не входящие в состав»). Контроль только состав обозначен «контроль средой». Через 24 часа инкубации при 37°C и в атмосфере 5% CO2 анализировали концентрацию в супернатантах маркеров врожденного иммунитета, применяя доступные для приобретения наборы для ELISA. Статистический анализ проводили с помощью 2-факторного дисперсионного анализа с критерием множественного сравнения Сидака. P-значения: * p < 0,05, ** p < 0,005, *** p < 0,0005, **** p < 0,0001.
[00485] Скрининг составов в клетках MM6. Riboxxol и pIC:HMW объединяли в комплекс с типичными катионными составами из таблицы 7 при N:P, равном 15, и инкубировали в течение ночи с клетками MM6, после чего супернатанты собирали и анализировали присутствие в них IFNα/β (фигура 40). В клетках MM6, стимулированных Riboxxol, находящимся в составе с НЛН, вызывалась в 20 - 30 раз большая секреция IFNα/β по сравнению с нестимулированным контролем. Подробный анализ индукции IFNα/β с помощью Riboxxol, находящегося в составе с НЛН, кратко представлен на тепловой карте (фигура 41).
Таблица 7.
[00486] Адъюванты на основе двухцепочечной РНК (дцРНК) улучшали путем включения в состав с частицами НЛН (WG942). РНК-репликон (оцРНК), кодирующий SEAP, включали в состав с дцРНК (исследованные дцРНК включали лиганды Toll-подобного рецептора 3 (TLR3), такие как поли(IC) (синтетический аналог дцРНК длиной 1,5 - 1,8 т.п.н. от Invivogen), Riboxxol (синтетическая дцРНК длиной 50 п.о. от Riboxx), SEVDI (транскрибированная in vitro РНК дефектного интерферирующего вируса Sendai длиной приблизительно 550 п.о.)) или контроля средой, чтобы оценить влияние стимуляции адъювантом на экспрессию белка (ФИГ. 35 и 36).
[00487] Было обнаружено, что адъюванты дцРНК снижают экспрессию SEAP в клетках HEK293. См., например, ФИГ. 37 (репликон вируса венесуэльского энцефалита лошадей (VEE) (VEErep), кодирующий SEAP + лиганд TLR3 + НЛН). Кроме того, трансляция VEErep в ДК человека, трансфицированных in vitro в среде с пониженным содержанием сыворотки (10%), продемонстрировала повышенную экспрессию SEAP и IP-10 (ФИГ. 38A - B).
Пример 19. Усиление иммуногенных ответов.
[00488] Иммуногенные ответы на адъюванты, такие как лиганды TLR3, также можно усилить, отдельно или дополнительно к применению НЛН, путем включения в состав со стабильными эмульсиями типа масло в воде, такими как эмульсии, содержащие сквален. В следующих экспериментах исследовали влияние состава на иммуногенные ответы, поддерживаемые хилтонолом®. Хилтонол® (поли-ICLC) представляет собой синтетический комплекс карбоксиметилцеллюлозы, полиинозиновой/полицитидиловой кислоты двухцепочечной РНК и поли-L-лизина.
[00489] По 5 мышей на группу состава в таблице 8 использовали для выработки антигенспецифических гуморальных иммунных ответов (выраженных в виде конечного титра) и антигенспецифического вторичного иммунного ответа клеток селезенки (определяли с помощью ELISA цитокинов после 4 дней инкубации с антигеном). Производное синтетического липида-A (SLA), родственное с глюкопиранозил-липидом A (GLA), было ранее описано в Coler и др., PloS One 6(1):e16333 (2011). SLA объединяли со стабильной эмульсией типа масло в воде (СЭ), см. Van Hoeven и др., PLoS One. 11(2): e0149610 (2016), с получением SLA-СЭ, содержащего сквален.
Таблица 8.
SLA = синтетический липид A; СЭ = стабильная эмульсия; nanoAlum2/ПЭГ = nAlum ПЭГ200-ДФЭА (дистеароилфосфатидилэтаноламин).
[00490] Стабильная эмульсия (СЭ) из таблицы 8 выше и таблиц 10 - 13 ниже имела типичный состав, описанный в таблице 9 ниже, и ее получали, как описано далее. СЭ состояла из метаболизируемого масла (сквалена), эмульгированного димиристоилфосфатидилхолином и полоксамером. Капли эмульсии были ~100 нм в диаметре и были монодисперсными. Получение 5x концентрата позволяло смешивание с антигеном вакцины непосредственно перед иммунизацией. Для производства СЭ масляную и водную фазы получали отдельно. Для получения масляной фазы 0,76 г порошка димиристоилфосфатидилхолина (ДМФХ) добавляли в 3,4 г сквалена. Бутыль, содержащую ДМФХ и масло, помещали на ультразвуковую водяную баню, грели при 70°C до тех пор, пока ДМФХ не диспергировался в масле. Для получения водной фазы одноосновный фосфат аммония, двухосновный фосфат аммония, полоксамер 188 и глицерин добавляли в ультрачистую воду и разрушали ультразвуком с получением водной фазы, содержащей 27 мМ аммоний-фосфатный буфер, 25 мг/мл глицерин и 0,4 мг/мл полоксамера 188, с pH 6,25. Масляную (10% в объемном отношении) и водную (90% в объемном отношении) фазы затем объединяли и обрабатывали путем смешивания с большим усилием сдвига в течение 10 мин при 7000 - 10000 об/мин (применяя Silverson L5M-A с трубчатым смесительным модулем диаметром ¾ дюйма и смешивающей головкой с ситом с большим усилием сдвига с квадратными отверстиями) с получением неочищенной эмульсии. Неочищенную эмульсию затем обрабатывали путем 16 циклов гомогенизации высокого давления при 30000 фунтах/кв. дюйм (например, применяя устройство для обработки M-110P Microfluidics®) и охлаждали водой с помощью рециркуляционного охлаждающего устройства, установленного на 10°C. Конечный состав фильтровали при постоянном потоке, поддерживаемом перистальтическим насосом, через поливинилиденфторидную (ПВДФ) мембрану с диаметром пор 0,2 мкм и помещали во флаконы. Анализ включал определение количества сквалена с помощью газовой хроматографии, определение количества ДМФХ с помощью ВЭЖХ с детектированием заряженного аэрозоля, измерение размера частиц с помощью динамического рассеяния света, измерение pH и оценку внешнего вида. Все значения находились в рамках ожидаемых диапазонов. Состав разбавляли с 10% до 2% для инъекции.
Таблица 9.
[00491] Мышей иммунизировали рекомбинантным белком LEISH-F2 плюс адъювантный состав в общем объеме 0,1 мл. Мышей иммунизировали подкожно два раза с интервалом в три недели между инъекциями. Инъекции осуществляли в основание хвоста в общем количестве 1 мкг белка/дозу и 10 мкг хилтонола®/дозу. После иммунизации собирали кровь, получали сыворотку и анализировали в ней антигенспецифические гуморальные иммунные ответы, чтобы определить, вызвала ли иммунизация ответ. Сыворотку из иммунизированных мышей титровали, чтобы найти конечный титр (последнее значение оптической плотности (ОП), большее чем порог, определенный по сывороткам из неиммунизированных мышей). Антигенспецифический гуморальный иммунный ответ анализировали по общему IgG против специфического антигена, а также по изотипам IgG2 и IgG1, чтобы выявить какое-либо смещение иммунного ответа (в связи с тем, что IFNγ стимулирует ответы IgG2a/c, тогда как IL-4/5 стимулирует ответы IgG1) (ФИГ. 45).
[00492] Через двадцать один день после заключительной иммунизации животных умерщвляли и удаляли из них селезенки. Готовили суспензии отдельных клеток, и 2×105 клеток/лунку инкубировали с 10 мг/мл рекомбинантного антигена (антигена LEISH-F2), чтобы оценить антигенспецифические вторичные иммунные ответы. Секрецию цитокинов в культуральный супернатант через 4 дня определяли путем анализа цитокинов с помощью ELISA, согласно инструкциям производителя (eBioScience)). См. IL-5 на ФИГ. 46A и ФИГ. 47A. Для профиля Tхелпер1 характерна секреция IFNγ (ФИГ. 46B и ФИГ. 47B). См. также IFNγ+TNFa+ на ФИГ. 47C, CD154+ на ФИГ. 47C и гранзим B+ на ФИГ. 47E.
[00493] После примирования, в отличие от хилтонола® отдельно, смешанный состав хилтонола® в СЭ или nanoalum вызывал продукцию антиген-специфических антител. После повторной стимуляции хилтонол®/СЭ вызывал наиболее сильные антигенспецифические ответы IgG2c. Кроме того, смешанный состав хилтонола® в СЭ или nanoalum вызывал вторичные антигенспецифические иммунные ответы IFNγ.
[00494] Сходные результаты продемонстрировали в другом исследовании 7 самок мышей на группу состава, см. таблицу 10, применяемого для выработки антигенспецифических гуморальных иммунных ответов (выраженных в виде конечного титра) и антигенспецифических вторичных иммунных ответов клеток селезенки (определяли после инкубации с антигеном в течение 4 дней с последующим анализом цитокинов с помощью ELISA, результаты не представлены).
Таблица 10.
(мкл)
Хилтонол® (10 мкг) 2 мг/мл, Alum = (100 мкг) AL007 2 мг/мл, nanoAlum = (100 мкг) nAlum ПЭГ-2000-ДФЭА 4 мг/мл.
[00495] Мышей C75BL/6 (5 на группу) также иммунизировали рекомбинантным белком LEISH-F3+ плюс адъювантный состав в общем объеме 0,1 мл. Мышей однократно иммунизировали путем подкожной инъекции 100 мкл в заднюю часть шеи общим количеством белка 1 мг/дозу и либо 50, либо 10, либо 2 мг хилтонола®/дозу в различных составах, представленных в таблице 11.
Таблица 11.
(отрицательный контроль)
(белковый контроль)
(контроль с максимальным количеством хилтонола®)
(контроль со средним количеством хилтонола®)
(контроль с низким количеством хилтонола®)
(контроль составом)
(контроль составом)
[00496] После иммунизации собирали кровь, получали сыворотку и анализировали в ней антигенспецифические гуморальные иммунные ответы, чтобы определить, вызвала ли иммунизация ответ. Сыворотку из иммунизированных мышей титровали, чтобы найти конечный титр (последнее значение оптической плотности (ОП), большее, чем порог, определенный по сывороткам из неиммунизированных мышей). Антигенспецифический гуморальный иммунный ответ анализировали по общему IgG против антигена LEISH-F3+ (ФИГ. 48 - 49).
[00497] После примирования смешанный состав хилтонола® в СЭ или nanoalum вызывал больший антигенспецифический гуморальный иммунный ответ, чем антиген (АГ) хилтонол® отдельно, и смешанный состав хилтонола® в СЭ усиливал антигенспецифические вторичные иммунные ответы IFNg по сравнению с АГ в хилтоноле® и АГ/хилтонол®/nanoalum. В данном исследовании также продемонстрировали, что CD8 T-клетки могут образоваться в результате примирования АГ/хилтонолом®/СЭ, наблюдается экономия дозы >25 раз, и 2 мкг хилтонола® в СЭ вызывает ответы, большие чем 50 мкг не входящего в состав хилтонола® (ФИГ. 48 - 51).
[00498] В другом исследовании изучали влияние доставки антигенной вакцины на иммуногенные реакции при однократном введении (примировании) состава, описанного в таблице 12, мышам C75BL/6. См. ФИГ. 50.
Таблица 12.
(отрицательный контроль)
(белковый контроль)
(контроль поли-I:C HMW)
(низкая доза поли-I:C)
(низкая доза поли-I:C)
(контроль составом)
[00499] В другом исследовании мышам C75BL/6 (5 на группу, 5 для иммунных ответов после примирующей иммунизации, 5 - после повторной стимуляции) вводили один из составов, представленных в таблице 13, чтобы изучить влияние доставки антигенной вакцины на иммуногенные ответы.
Таблица 13.
Состав СЭ хилтонола® привел к экономии дозы при антигенспецифической индукции IFNγ с подавлением ответа IL-5 (ФИГ. 51 - 52). Ответы на рестриктированные по ГКГС I класса пептиды (C+B) не наблюдали (ФИГ. 52B).
--->
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Infectious Disease Research Institute
<120> НАНОСТРУКТУРИРОВАННЫЕ ЛИПИДНЫЕ НОСИТЕЛИ И СТАБИЛЬНЫЕ
ЭМУЛЬСИИ, И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ
<130> 01211-0018-00PCT
<150> US 62/520,204
<151> 2017-06-15
<150> US 62/540,973
<151> 2017-08-03
<150> US 62/556,291
<151> 2017-09-08
<150> US 62/563,544
<151> 2017-09-26
<150> US 62/582,859
<151> 2017-11-07
<150> US 62/622,748
<151> 2018-01-26
<150> US 62/622,755
<151> 2018-01-26
<150> US 62/669,262
<151> 2018-05-09
<150> US 62/677,336
<151> 2018-05-29
<150> US 62/680,454
<151> 2018-06-04
<160> 143
<170> PatentIn версии 3.5
<210> 1
<211> 877
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок ID91
<400> 1
Met Thr Ile Asn Tyr Gln Phe Gly Asp Val Asp Ala His Gly Ala Met
1 5 10 15
Ile Arg Ala Gln Ala Gly Ser Leu Glu Ala Glu His Gln Ala Ile Ile
20 25 30
Ser Asp Val Leu Thr Ala Ser Asp Phe Trp Gly Gly Ala Gly Ser Ala
35 40 45
Ala Cys Gln Gly Phe Ile Thr Gln Leu Gly Arg Asn Phe Gln Val Ile
50 55 60
Tyr Glu Gln Ala Asn Ala His Gly Gln Lys Val Gln Ala Ala Gly Asn
65 70 75 80
Asn Met Ala Gln Thr Asp Ser Ala Val Gly Ser Ser Trp Ala Asp Asp
85 90 95
Ile Asp Trp Asp Ala Ile Ala Gln Cys Glu Ser Gly Gly Asn Trp Ala
100 105 110
Ala Asn Thr Gly Asn Gly Leu Tyr Gly Gly Leu Gln Ile Ser Gln Ala
115 120 125
Thr Trp Asp Ser Asn Gly Gly Val Gly Ser Pro Ala Ala Ala Ser Pro
130 135 140
Gln Gln Gln Ile Glu Val Ala Asp Asn Ile Met Lys Thr Gln Gly Pro
145 150 155 160
Gly Ala Trp Pro Lys Cys Ser Ser Cys Ser Gln Gly Asp Ala Pro Leu
165 170 175
Gly Ser Leu Thr His Ile Leu Thr Phe Leu Ala Ala Glu Thr Gly Gly
180 185 190
Cys Ser Gly Ser Arg Asp Asp Val Val Asp Phe Gly Ala Leu Pro Pro
195 200 205
Glu Ile Asn Ser Ala Arg Met Tyr Ala Gly Pro Gly Ser Ala Ser Leu
210 215 220
Val Ala Ala Ala Lys Met Trp Asp Ser Val Ala Ser Asp Leu Phe Ser
225 230 235 240
Ala Ala Ser Ala Phe Gln Ser Val Val Trp Gly Leu Thr Val Gly Ser
245 250 255
Trp Ile Gly Ser Ser Ala Gly Leu Met Ala Ala Ala Ala Ser Pro Tyr
260 265 270
Val Ala Trp Met Ser Val Thr Ala Gly Gln Ala Gln Leu Thr Ala Ala
275 280 285
Gln Val Arg Val Ala Ala Ala Ala Tyr Glu Thr Ala Tyr Arg Leu Thr
290 295 300
Val Pro Pro Pro Val Ile Ala Glu Asn Arg Thr Glu Leu Met Thr Leu
305 310 315 320
Thr Ala Thr Asn Leu Leu Gly Gln Asn Thr Pro Ala Ile Glu Ala Asn
325 330 335
Gln Ala Ala Tyr Ser Gln Met Trp Gly Gln Asp Ala Glu Ala Met Tyr
340 345 350
Gly Tyr Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala Thr Glu Ala Leu Leu Pro Phe
355 360 365
Glu Asp Ala Pro Leu Ile Thr Asn Pro Gly Gly Leu Leu Glu Gln Ala
370 375 380
Val Ala Val Glu Glu Ala Ile Asp Thr Ala Ala Ala Asn Gln Leu Met
385 390 395 400
Asn Asn Val Pro Gln Ala Leu Gln Gln Leu Ala Gln Pro Ala Gln Gly
405 410 415
Val Val Pro Ser Ser Lys Leu Gly Gly Leu Trp Thr Ala Val Ser Pro
420 425 430
His Leu Ser Pro Leu Ser Asn Val Ser Ser Ile Ala Asn Asn His Met
435 440 445
Ser Met Met Gly Thr Gly Val Ser Met Thr Asn Thr Leu His Ser Met
450 455 460
Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala Ala Ala Gln Ala Val Glu Thr Ala Ala
465 470 475 480
Glu Asn Gly Val Trp Ala Met Ser Ser Leu Gly Ser Gln Leu Gly Ser
485 490 495
Ser Leu Gly Ser Ser Gly Leu Gly Ala Gly Val Ala Ala Asn Leu Gly
500 505 510
Arg Ala Ala Ser Val Gly Ser Leu Ser Val Pro Pro Ala Trp Ala Ala
515 520 525
Ala Asn Gln Ala Val Thr Pro Ala Ala Arg Ala Leu Pro Leu Thr Ser
530 535 540
Leu Thr Ser Ala Ala Gln Thr Ala Pro Gly His Met Leu Gly Gly Leu
545 550 555 560
Pro Leu Gly His Ser Val Asn Ala Gly Ser Gly Ile Asn Asn Ala Leu
565 570 575
Arg Val Pro Ala Arg Ala Tyr Ala Ile Pro Arg Thr Pro Ala Ala Gly
580 585 590
Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro
595 600 605
Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Asn Asn
610 615 620
Ser Pro Ala Val Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Tyr
625 630 635 640
Asn Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Tyr Gln Ser
645 650 655
Gly Leu Ser Ile Val Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser
660 665 670
Asp Trp Tyr Ser Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys
675 680 685
Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gln Trp Leu Ser Ala Asn
690 695 700
Arg Ala Val Lys Pro Thr Gly Ser Ala Ala Ile Gly Leu Ser Met Ala
705 710 715 720
Gly Ser Ser Ala Met Ile Leu Ala Ala Tyr His Pro Gln Gln Phe Ile
725 730 735
Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala Leu Leu Asp Pro Ser Gln Gly Met Gly
740 745 750
Pro Ser Leu Ile Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala
755 760 765
Ala Asp Met Trp Gly Pro Ser Ser Asp Pro Ala Trp Glu Arg Asn Asp
770 775 780
Pro Thr Gln Gln Ile Pro Lys Leu Val Ala Asn Asn Thr Arg Leu Trp
785 790 795 800
Val Tyr Cys Gly Asn Gly Thr Pro Asn Glu Leu Gly Gly Ala Asn Ile
805 810 815
Pro Ala Glu Phe Leu Glu Asn Phe Val Arg Ser Ser Asn Leu Lys Phe
820 825 830
Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Ala Gly Gly His Asn Ala Val Phe Asn Phe
835 840 845
Pro Pro Asn Gly Thr His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn
850 855 860
Ala Met Lys Gly Asp Leu Gln Ser Ser Leu Gly Ala Gly
865 870 875
<210> 2
<211> 94
<212> ПРТ
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 2
Met Thr Ile Asn Tyr Gln Phe Gly Asp Val Asp Ala His Gly Ala Met
1 5 10 15
Ile Arg Ala Gln Ala Gly Ser Leu Glu Ala Glu His Gln Ala Ile Ile
20 25 30
Ser Asp Val Leu Thr Ala Ser Asp Phe Trp Gly Gly Ala Gly Ser Ala
35 40 45
Ala Cys Gln Gly Phe Ile Thr Gln Leu Gly Arg Asn Phe Gln Val Ile
50 55 60
Tyr Glu Gln Ala Asn Ala His Gly Gln Lys Val Gln Ala Ala Gly Asn
65 70 75 80
Asn Met Ala Gln Thr Asp Ser Ala Val Gly Ser Ser Trp Ala
85 90
<210> 3
<211> 105
<212> ПРТ
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 3
Asp Asp Ile Asp Trp Asp Ala Ile Ala Gln Cys Glu Ser Gly Gly Asn
1 5 10 15
Trp Ala Ala Asn Thr Gly Asn Gly Leu Tyr Gly Gly Leu Gln Ile Ser
20 25 30
Gln Ala Thr Trp Asp Ser Asn Gly Gly Val Gly Ser Pro Ala Ala Ala
35 40 45
Ser Pro Gln Gln Gln Ile Glu Val Ala Asp Asn Ile Met Lys Thr Gln
50 55 60
Gly Pro Gly Ala Trp Pro Lys Cys Ser Ser Cys Ser Gln Gly Asp Ala
65 70 75 80
Pro Leu Gly Ser Leu Thr His Ile Leu Thr Phe Leu Ala Ala Glu Thr
85 90 95
Gly Gly Cys Ser Gly Ser Arg Asp Asp
100 105
<210> 4
<211> 393
<212> ПРТ
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 4
Val Val Asp Phe Gly Ala Leu Pro Pro Glu Ile Asn Ser Ala Arg Met
1 5 10 15
Tyr Ala Gly Pro Gly Ser Ala Ser Leu Val Ala Ala Ala Lys Met Trp
20 25 30
Asp Ser Val Ala Ser Asp Leu Phe Ser Ala Ala Ser Ala Phe Gln Ser
35 40 45
Val Val Trp Gly Leu Thr Val Gly Ser Trp Ile Gly Ser Ser Ala Gly
50 55 60
Leu Met Ala Ala Ala Ala Ser Pro Tyr Val Ala Trp Met Ser Val Thr
65 70 75 80
Ala Gly Gln Ala Gln Leu Thr Ala Ala Gln Val Arg Val Ala Ala Ala
85 90 95
Ala Tyr Glu Thr Ala Tyr Arg Leu Thr Val Pro Pro Pro Val Ile Ala
100 105 110
Glu Asn Arg Thr Glu Leu Met Thr Leu Thr Ala Thr Asn Leu Leu Gly
115 120 125
Gln Asn Thr Pro Ala Ile Glu Ala Asn Gln Ala Ala Tyr Ser Gln Met
130 135 140
Trp Gly Gln Asp Ala Glu Ala Met Tyr Gly Tyr Ala Ala Thr Ala Ala
145 150 155 160
Thr Ala Thr Glu Ala Leu Leu Pro Phe Glu Asp Ala Pro Leu Ile Thr
165 170 175
Asn Pro Gly Gly Leu Leu Glu Gln Ala Val Ala Val Glu Glu Ala Ile
180 185 190
Asp Thr Ala Ala Ala Asn Gln Leu Met Asn Asn Val Pro Gln Ala Leu
195 200 205
Gln Gln Leu Ala Gln Pro Ala Gln Gly Val Val Pro Ser Ser Lys Leu
210 215 220
Gly Gly Leu Trp Thr Ala Val Ser Pro His Leu Ser Pro Leu Ser Asn
225 230 235 240
Val Ser Ser Ile Ala Asn Asn His Met Ser Met Met Gly Thr Gly Val
245 250 255
Ser Met Thr Asn Thr Leu His Ser Met Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala
260 265 270
Ala Ala Gln Ala Val Glu Thr Ala Ala Glu Asn Gly Val Trp Ala Met
275 280 285
Ser Ser Leu Gly Ser Gln Leu Gly Ser Ser Leu Gly Ser Ser Gly Leu
290 295 300
Gly Ala Gly Val Ala Ala Asn Leu Gly Arg Ala Ala Ser Val Gly Ser
305 310 315 320
Leu Ser Val Pro Pro Ala Trp Ala Ala Ala Asn Gln Ala Val Thr Pro
325 330 335
Ala Ala Arg Ala Leu Pro Leu Thr Ser Leu Thr Ser Ala Ala Gln Thr
340 345 350
Ala Pro Gly His Met Leu Gly Gly Leu Pro Leu Gly His Ser Val Asn
355 360 365
Ala Gly Ser Gly Ile Asn Asn Ala Leu Arg Val Pro Ala Arg Ala Tyr
370 375 380
Ala Ile Pro Arg Thr Pro Ala Ala Gly
385 390
<210> 5
<211> 285
<212> ПРТ
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 5
Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro
1 5 10 15
Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Asn Asn
20 25 30
Ser Pro Ala Val Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Tyr
35 40 45
Asn Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Tyr Gln Ser
50 55 60
Gly Leu Ser Ile Val Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser
65 70 75 80
Asp Trp Tyr Ser Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys
85 90 95
Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gln Trp Leu Ser Ala Asn
100 105 110
Arg Ala Val Lys Pro Thr Gly Ser Ala Ala Ile Gly Leu Ser Met Ala
115 120 125
Gly Ser Ser Ala Met Ile Leu Ala Ala Tyr His Pro Gln Gln Phe Ile
130 135 140
Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala Leu Leu Asp Pro Ser Gln Gly Met Gly
145 150 155 160
Pro Ser Leu Ile Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala
165 170 175
Ala Asp Met Trp Gly Pro Ser Ser Asp Pro Ala Trp Glu Arg Asn Asp
180 185 190
Pro Thr Gln Gln Ile Pro Lys Leu Val Ala Asn Asn Thr Arg Leu Trp
195 200 205
Val Tyr Cys Gly Asn Gly Thr Pro Asn Glu Leu Gly Gly Ala Asn Ile
210 215 220
Pro Ala Glu Phe Leu Glu Asn Phe Val Arg Ser Ser Asn Leu Lys Phe
225 230 235 240
Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Ala Gly Gly His Asn Ala Val Phe Asn Phe
245 250 255
Pro Pro Asn Gly Thr His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn
260 265 270
Ala Met Lys Gly Asp Leu Gln Ser Ser Leu Gly Ala Gly
275 280 285
<210> 6
<211> 880
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вектор pET29
<400> 6
His Met Thr Ile Asn Tyr Gln Phe Gly Asp Val Asp Ala His Gly Ala
1 5 10 15
Met Ile Arg Ala Gln Ala Gly Ser Leu Glu Ala Glu His Gln Ala Ile
20 25 30
Ile Ser Asp Val Leu Thr Ala Ser Asp Phe Trp Gly Gly Ala Gly Ser
35 40 45
Ala Ala Cys Gln Gly Phe Ile Thr Gln Leu Gly Arg Asn Phe Gln Val
50 55 60
Ile Tyr Glu Gln Ala Asn Ala His Gly Gln Lys Val Gln Ala Ala Gly
65 70 75 80
Asn Asn Met Ala Gln Thr Asp Ser Ala Val Gly Ser Ser Trp Ala Asp
85 90 95
Asp Ile Asp Trp Asp Ala Ile Ala Gln Cys Glu Ser Gly Gly Asn Trp
100 105 110
Ala Ala Asn Thr Gly Asn Gly Leu Tyr Gly Gly Leu Gln Ile Ser Gln
115 120 125
Ala Thr Trp Asp Ser Asn Gly Gly Val Gly Ser Pro Ala Ala Ala Ser
130 135 140
Pro Gln Gln Gln Ile Glu Val Ala Asp Asn Ile Met Lys Thr Gln Gly
145 150 155 160
Pro Gly Ala Trp Pro Lys Cys Ser Ser Cys Ser Gln Gly Asp Ala Pro
165 170 175
Leu Gly Ser Leu Thr His Ile Leu Thr Phe Leu Ala Ala Glu Thr Gly
180 185 190
Gly Cys Ser Gly Ser Arg Asp Asp Val Val Asp Phe Gly Ala Leu Pro
195 200 205
Pro Glu Ile Asn Ser Ala Arg Met Tyr Ala Gly Pro Gly Ser Ala Ser
210 215 220
Leu Val Ala Ala Ala Lys Met Trp Asp Ser Val Ala Ser Asp Leu Phe
225 230 235 240
Ser Ala Ala Ser Ala Phe Gln Ser Val Val Trp Gly Leu Thr Val Gly
245 250 255
Ser Trp Ile Gly Ser Ser Ala Gly Leu Met Ala Ala Ala Ala Ser Pro
260 265 270
Tyr Val Ala Trp Met Ser Val Thr Ala Gly Gln Ala Gln Leu Thr Ala
275 280 285
Ala Gln Val Arg Val Ala Ala Ala Ala Tyr Glu Thr Ala Tyr Arg Leu
290 295 300
Thr Val Pro Pro Pro Val Ile Ala Glu Asn Arg Thr Glu Leu Met Thr
305 310 315 320
Leu Thr Ala Thr Asn Leu Leu Gly Gln Asn Thr Pro Ala Ile Glu Ala
325 330 335
Asn Gln Ala Ala Tyr Ser Gln Met Trp Gly Gln Asp Ala Glu Ala Met
340 345 350
Tyr Gly Tyr Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala Thr Glu Ala Leu Leu Pro
355 360 365
Phe Glu Asp Ala Pro Leu Ile Thr Asn Pro Gly Gly Leu Leu Glu Gln
370 375 380
Ala Val Ala Val Glu Glu Ala Ile Asp Thr Ala Ala Ala Asn Gln Leu
385 390 395 400
Met Asn Asn Val Pro Gln Ala Leu Gln Gln Leu Ala Gln Pro Ala Gln
405 410 415
Gly Val Val Pro Ser Ser Lys Leu Gly Gly Leu Trp Thr Ala Val Ser
420 425 430
Pro His Leu Ser Pro Leu Ser Asn Val Ser Ser Ile Ala Asn Asn His
435 440 445
Met Ser Met Met Gly Thr Gly Val Ser Met Thr Asn Thr Leu His Ser
450 455 460
Met Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala Ala Ala Gln Ala Val Glu Thr Ala
465 470 475 480
Ala Glu Asn Gly Val Trp Ala Met Ser Ser Leu Gly Ser Gln Leu Gly
485 490 495
Ser Ser Leu Gly Ser Ser Gly Leu Gly Ala Gly Val Ala Ala Asn Leu
500 505 510
Gly Arg Ala Ala Ser Val Gly Ser Leu Ser Val Pro Pro Ala Trp Ala
515 520 525
Ala Ala Asn Gln Ala Val Thr Pro Ala Ala Arg Ala Leu Pro Leu Thr
530 535 540
Ser Leu Thr Ser Ala Ala Gln Thr Ala Pro Gly His Met Leu Gly Gly
545 550 555 560
Leu Pro Leu Gly His Ser Val Asn Ala Gly Ser Gly Ile Asn Asn Ala
565 570 575
Leu Arg Val Pro Ala Arg Ala Tyr Ala Ile Pro Arg Thr Pro Ala Ala
580 585 590
Gly Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser
595 600 605
Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Asn
610 615 620
Asn Ser Pro Ala Val Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp
625 630 635 640
Tyr Asn Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Tyr Gln
645 650 655
Ser Gly Leu Ser Ile Val Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr
660 665 670
Ser Asp Trp Tyr Ser Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr
675 680 685
Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gln Trp Leu Ser Ala
690 695 700
Asn Arg Ala Val Lys Pro Thr Gly Ser Ala Ala Ile Gly Leu Ser Met
705 710 715 720
Ala Gly Ser Ser Ala Met Ile Leu Ala Ala Tyr His Pro Gln Gln Phe
725 730 735
Ile Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala Leu Leu Asp Pro Ser Gln Gly Met
740 745 750
Gly Pro Ser Leu Ile Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys
755 760 765
Ala Ala Asp Met Trp Gly Pro Ser Ser Asp Pro Ala Trp Glu Arg Asn
770 775 780
Asp Pro Thr Gln Gln Ile Pro Lys Leu Val Ala Asn Asn Thr Arg Leu
785 790 795 800
Trp Val Tyr Cys Gly Asn Gly Thr Pro Asn Glu Leu Gly Gly Ala Asn
805 810 815
Ile Pro Ala Glu Phe Leu Glu Asn Phe Val Arg Ser Ser Asn Leu Lys
820 825 830
Phe Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Ala Gly Gly His Asn Ala Val Phe Asn
835 840 845
Phe Pro Pro Asn Gly Thr His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu
850 855 860
Asn Ala Met Lys Gly Asp Leu Gln Ser Ser Leu Gly Ala Gly Lys Leu
865 870 875 880
<210> 7
<211> 2637
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Слитый белок ID91
<400> 7
accatcaact atcaattcgg ggacgtcgac gctcacggcg ccatgatccg cgctcaggcc
60
gggtcgctgg aggccgagca tcaggccatc atttctgatg tgttgaccgc gagtgacttt
120
tggggcggcg ccggttcggc ggcctgccag gggttcatta cccagctggg ccgtaacttc
180
caggtgatct acgagcaggc caacgcccac gggcagaagg tgcaggctgc cggcaacaac
240
atggcacaaa ccgacagcgc cgtcggctcc agctgggccg acgacatcga ttgggacgcc
300
atcgcgcaat gcgaatccgg cggcaattgg gcggccaaca ccggtaacgg gttatacggt
360
ggtctgcaga tcagccaggc gacgtgggat tccaacggtg gtgtcgggtc gccggcggcc
420
gcgagtcccc agcaacagat cgaggtcgca gacaacatta tgaaaaccca aggcccgggt
480
gcgtggccga aatgtagttc ttgtagtcag ggagacgcac cgctgggctc gctcacccac
540
atcctgacgt tcctcgcggc cgagactgga ggttgttcgg ggagcaggga cgatgtggtg
600
gatttcgggg cgttaccacc ggagatcaac tccgcgagga tgtacgccgg cccgggttcg
660
gcctcgctgg tggccgccgc gaagatgtgg gacagcgtgg cgagtgacct gttttcggcc
720
gcgtcggcgt ttcagtcggt ggtctggggt ctgacggtgg ggtcgtggat aggttcgtcg
780
gcgggtctga tggcggcggc ggcctcgccg tatgtggcgt ggatgagcgt caccgcgggg
840
caggcccagc tgaccgccgc ccaggtccgg gttgctgcgg cggcctacga gacagcgtat
900
aggctgacgg tgcccccgcc ggtgatcgcc gagaaccgta ccgaactgat gacgctgacc
960
gcgaccaacc tcttggggca aaacacgccg gcgatcgagg ccaatcaggc cgcatacagc
1020
cagatgtggg gccaagacgc ggaggcgatg tatggctacg ccgccacggc ggcgacggcg
1080
accgaggcgt tgctgccgtt cgaggacgcc ccactgatca ccaaccccgg cgggctcctt
1140
gagcaggccg tcgcggtcga ggaggccatc gacaccgccg cggcgaacca gttgatgaac
1200
aatgtgcccc aagcgctgca acagctggcc cagccagcgc agggcgtcgt accttcttcc
1260
aagctgggtg ggctgtggac ggcggtctcg ccgcatctgt cgccgctcag caacgtcagt
1320
tcgatagcca acaaccacat gtcgatgatg ggcacgggtg tgtcgatgac caacaccttg
1380
cactcgatgt tgaagggctt agctccggcg gcggctcagg ccgtggaaac cgcggcggaa
1440
aacggggtct gggcgatgag ctcgctgggc agccagctgg gttcgtcgct gggttcttcg
1500
ggtctgggcg ctggggtggc cgccaacttg ggtcgggcgg cctcggtcgg ttcgttgtcg
1560
gtgccgccag catgggccgc ggccaaccag gcggtcaccc cggcggcgcg ggcgctgccg
1620
ctgaccagcc tgaccagcgc cgcccaaacc gcccccggac acatgctggg cgggctaccg
1680
ctggggcact cggtcaacgc cggcagcggt atcaacaatg cgctgcgggt gccggcacgg
1740
gcctacgcga taccccgcac accggccgcc ggattctccc ggccggggct gccggtcgag
1800
tacctgcagg tgccgtcgcc gtcgatgggc cgcgacatca aggttcagtt ccagagcggt
1860
gggaacaact cacctgcggt ttatctgctc gacggcctgc gcgcccaaga cgactacaac
1920
ggctgggata tcaacacccc ggcgttcgag tggtactacc agtcgggact gtcgatagtc
1980
atgccggtcg gcgggcagtc cagcttctac agcgactggt acagcccggc ctgcggtaag
2040
gctggctgcc agacttacaa gtgggaaacc ttcctgacca gcgagctgcc gcaatggttg
2100
tccgccaaca gggccgtgaa gcccaccggc agcgctgcaa tcggcttgtc gatggccggc
2160
tcgtcggcaa tgatcttggc cgcctaccac ccccagcagt tcatctacgc cggctcgctg
2220
tcggccctgc tggacccctc tcaggggatg gggcctagcc tgatcggcct cgcgatgggt
2280
gacgccggcg gttacaaggc cgcagacatg tggggtccct cgagtgaccc ggcatgggag
2340
cgcaacgacc ctacgcagca gatccccaag ctggtcgcaa acaacacccg gctatgggtt
2400
tattgcggga acggcacccc gaacgagttg ggcggtgcca acatacccgc cgagttcttg
2460
gagaacttcg ttcgtagcag caacctgaag ttccaggatg cgtacaacgc cgcgggcggg
2520
cacaacgccg tgttcaactt cccgcccaac ggcacgcaca gctgggagta ctggggcgct
2580
cagctcaacg ccatgaaggg tgacctgcag agttcgttag gcgccggctg aaagctt
2637
<210> 8
<211> 279
<212> ДНК
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 8
accatcaact atcaattcgg ggacgtcgac gctcacggcg ccatgatccg cgctcaggcc
60
gggtcgctgg aggccgagca tcaggccatc atttctgatg tgttgaccgc gagtgacttt
120
tggggcggcg ccggttcggc ggcctgccag gggttcatta cccagctggg ccgtaacttc
180
caggtgatct acgagcaggc caacgcccac gggcagaagg tgcaggctgc cggcaacaac
240
atggcacaaa ccgacagcgc cgtcggctcc agctgggcc 279
<210> 9
<211> 315
<212> ДНК
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 9
gacgacatcg attgggacgc catcgcgcaa tgcgaatccg gcggcaattg ggcggccaac
60
accggtaacg ggttatacgg tggtctgcag atcagccagg cgacgtggga ttccaacggt
120
ggtgtcgggt cgccggcggc cgcgagtccc cagcaacaga tcgaggtcgc agacaacatt
180
atgaaaaccc aaggcccggg tgcgtggccg aaatgtagtt cttgtagtca gggagacgca
240
ccgctgggct cgctcaccca catcctgacg ttcctcgcgg ccgagactgg aggttgttcg
300
gggagcaggg acgat 315
<210> 10
<211> 1179
<212> ДНК
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 10
gtggtggatt tcggggcgtt accaccggag atcaactccg cgaggatgta cgccggcccg
60
ggttcggcct cgctggtggc cgccgcgaag atgtgggaca gcgtggcgag tgacctgttt
120
tcggccgcgt cggcgtttca gtcggtggtc tggggtctga cggtggggtc gtggataggt
180
tcgtcggcgg gtctgatggc ggcggcggcc tcgccgtatg tggcgtggat gagcgtcacc
240
gcggggcagg cccagctgac cgccgcccag gtccgggttg ctgcggcggc ctacgagaca
300
gcgtataggc tgacggtgcc cccgccggtg atcgccgaga accgtaccga actgatgacg
360
ctgaccgcga ccaacctctt ggggcaaaac acgccggcga tcgaggccaa tcaggccgca
420
tacagccaga tgtggggcca agacgcggag gcgatgtatg gctacgccgc cacggcggcg
480
acggcgaccg aggcgttgct gccgttcgag gacgccccac tgatcaccaa ccccggcggg
540
ctccttgagc aggccgtcgc ggtcgaggag gccatcgaca ccgccgcggc gaaccagttg
600
atgaacaatg tgccccaagc gctgcaacag ctggcccagc cagcgcaggg cgtcgtacct
660
tcttccaagc tgggtgggct gtggacggcg gtctcgccgc atctgtcgcc gctcagcaac
720
gtcagttcga tagccaacaa ccacatgtcg atgatgggca cgggtgtgtc gatgaccaac
780
accttgcact cgatgttgaa gggcttagct ccggcggcgg ctcaggccgt ggaaaccgcg
840
gcggaaaacg gggtctgggc gatgagctcg ctgggcagcc agctgggttc gtcgctgggt
900
tcttcgggtc tgggcgctgg ggtggccgcc aacttgggtc gggcggcctc ggtcggttcg
960
ttgtcggtgc cgccagcatg ggccgcggcc aaccaggcgg tcaccccggc ggcgcgggcg
1020
ctgccgctga ccagcctgac cagcgccgcc caaaccgccc ccggacacat gctgggcggg
1080
ctaccgctgg ggcactcggt caacgccggc agcggtatca acaatgcgct gcgggtgccg
1140
gcacgggcct acgcgatacc ccgcacaccg gccgccgga 1179
<210> 11
<211> 855
<212> ДНК
<213> Mycobacterium tuberculosis
<400> 11
ttctcccggc cggggctgcc ggtcgagtac ctgcaggtgc cgtcgccgtc gatgggccgc
60
gacatcaagg ttcagttcca gagcggtggg aacaactcac ctgcggttta tctgctcgac
120
ggcctgcgcg cccaagacga ctacaacggc tgggatatca acaccccggc gttcgagtgg
180
tactaccagt cgggactgtc gatagtcatg ccggtcggcg ggcagtccag cttctacagc
240
gactggtaca gcccggcctg cggtaaggct ggctgccaga cttacaagtg ggaaaccttc
300
ctgaccagcg agctgccgca atggttgtcc gccaacaggg ccgtgaagcc caccggcagc
360
gctgcaatcg gcttgtcgat ggccggctcg tcggcaatga tcttggccgc ctaccacccc
420
cagcagttca tctacgccgg ctcgctgtcg gccctgctgg acccctctca ggggatgggg
480
cctagcctga tcggcctcgc gatgggtgac gccggcggtt acaaggccgc agacatgtgg
540
ggtccctcga gtgacccggc atgggagcgc aacgacccta cgcagcagat ccccaagctg
600
gtcgcaaaca acacccggct atgggtttat tgcgggaacg gcaccccgaa cgagttgggc
660
ggtgccaaca tacccgccga gttcttggag aacttcgttc gtagcagcaa cctgaagttc
720
caggatgcgt acaacgccgc gggcgggcac aacgccgtgt tcaacttccc gcccaacggc
780
acgcacagct gggagtactg gggcgctcag ctcaacgcca tgaagggtga cctgcagagt
840
tcgttaggcg ccggc 855
<210> 12
<211> 2643
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Вектор pET29
<400> 12
catatgacca tcaactatca attcggggac gtcgacgctc acggcgccat gatccgcgct
60
caggccgggt cgctggaggc cgagcatcag gccatcattt ctgatgtgtt gaccgcgagt
120
gacttttggg gcggcgccgg ttcggcggcc tgccaggggt tcattaccca gctgggccgt
180
aacttccagg tgatctacga gcaggccaac gcccacgggc agaaggtgca ggctgccggc
240
aacaacatgg cacaaaccga cagcgccgtc ggctccagct gggccgacga catcgattgg
300
gacgccatcg cgcaatgcga atccggcggc aattgggcgg ccaacaccgg taacgggtta
360
tacggtggtc tgcagatcag ccaggcgacg tgggattcca acggtggtgt cgggtcgccg
420
gcggccgcga gtccccagca acagatcgag gtcgcagaca acattatgaa aacccaaggc
480
ccgggtgcgt ggccgaaatg tagttcttgt agtcagggag acgcaccgct gggctcgctc
540
acccacatcc tgacgttcct cgcggccgag actggaggtt gttcggggag cagggacgat
600
gtggtggatt tcggggcgtt accaccggag atcaactccg cgaggatgta cgccggcccg
660
ggttcggcct cgctggtggc cgccgcgaag atgtgggaca gcgtggcgag tgacctgttt
720
tcggccgcgt cggcgtttca gtcggtggtc tggggtctga cggtggggtc gtggataggt
780
tcgtcggcgg gtctgatggc ggcggcggcc tcgccgtatg tggcgtggat gagcgtcacc
840
gcggggcagg cccagctgac cgccgcccag gtccgggttg ctgcggcggc ctacgagaca
900
gcgtataggc tgacggtgcc cccgccggtg atcgccgaga accgtaccga actgatgacg
960
ctgaccgcga ccaacctctt ggggcaaaac acgccggcga tcgaggccaa tcaggccgca
1020
tacagccaga tgtggggcca agacgcggag gcgatgtatg gctacgccgc cacggcggcg
1080
acggcgaccg aggcgttgct gccgttcgag gacgccccac tgatcaccaa ccccggcggg
1140
ctccttgagc aggccgtcgc ggtcgaggag gccatcgaca ccgccgcggc gaaccagttg
1200
atgaacaatg tgccccaagc gctgcaacag ctggcccagc cagcgcaggg cgtcgtacct
1260
tcttccaagc tgggtgggct gtggacggcg gtctcgccgc atctgtcgcc gctcagcaac
1320
gtcagttcga tagccaacaa ccacatgtcg atgatgggca cgggtgtgtc gatgaccaac
1380
accttgcact cgatgttgaa gggcttagct ccggcggcgg ctcaggccgt ggaaaccgcg
1440
gcggaaaacg gggtctgggc gatgagctcg ctgggcagcc agctgggttc gtcgctgggt
1500
tcttcgggtc tgggcgctgg ggtggccgcc aacttgggtc gggcggcctc ggtcggttcg
1560
ttgtcggtgc cgccagcatg ggccgcggcc aaccaggcgg tcaccccggc ggcgcgggcg
1620
ctgccgctga ccagcctgac cagcgccgcc caaaccgccc ccggacacat gctgggcggg
1680
ctaccgctgg ggcactcggt caacgccggc agcggtatca acaatgcgct gcgggtgccg
1740
gcacgggcct acgcgatacc ccgcacaccg gccgccggat tctcccggcc ggggctgccg
1800
gtcgagtacc tgcaggtgcc gtcgccgtcg atgggccgcg acatcaaggt tcagttccag
1860
agcggtggga acaactcacc tgcggtttat ctgctcgacg gcctgcgcgc ccaagacgac
1920
tacaacggct gggatatcaa caccccggcg ttcgagtggt actaccagtc gggactgtcg
1980
atagtcatgc cggtcggcgg gcagtccagc ttctacagcg actggtacag cccggcctgc
2040
ggtaaggctg gctgccagac ttacaagtgg gaaaccttcc tgaccagcga gctgccgcaa
2100
tggttgtccg ccaacagggc cgtgaagccc accggcagcg ctgcaatcgg cttgtcgatg
2160
gccggctcgt cggcaatgat cttggccgcc taccaccccc agcagttcat ctacgccggc
2220
tcgctgtcgg ccctgctgga cccctctcag gggatggggc ctagcctgat cggcctcgcg
2280
atgggtgacg ccggcggtta caaggccgca gacatgtggg gtccctcgag tgacccggca
2340
tgggagcgca acgaccctac gcagcagatc cccaagctgg tcgcaaacaa cacccggcta
2400
tgggtttatt gcgggaacgg caccccgaac gagttgggcg gtgccaacat acccgccgag
2460
ttcttggaga acttcgttcg tagcagcaac ctgaagttcc aggatgcgta caacgccgcg
2520
ggcgggcaca acgccgtgtt caacttcccg cccaacggca cgcacagctg ggagtactgg
2580
ggcgctcagc tcaacgccat gaagggtgac ctgcagagtt cgttaggcgc cggctgaaag
2640
ctt 2643
<210> 13
<211> 60
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> JEVss-FWD
<400> 13
gctggcctcc ctggctgtgg tcattgcctg cgctggagca gccgaggtga ccaggagagg
60
<210> 14
<211> 59
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> JEVss-REV
<400> 14
cacatgattg atccggcact cctcttgccc atggcggcgg cgtgagctgg cggcgggtg
59
<210> 15
<211> 56
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ZIKVss-FWD
<400> 15
ggaatcgtgg gcctgctgct gaccacagca atggcagccg aggtgaccag gagagg 56
<210> 16
<211> 54
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ZIKVss-REV
<400> 16
cacggatgtg tctgctcctc tccgcatggc ggcggcgtga gctggcggcg ggtg 54
<210> 17
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ZIKV-prM-E-FWD
<400> 17
aatggactac gacatagtcg ccgccgccat g 31
<210> 18
<211> 35
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> ZIKV-prM-E-REV
<400> 18
gcggtttttg acaccgcggt caggcagaca cggcg 35
<210> 19
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 1 Id91
<400> 19
His Met Thr Ile Asn Tyr Gln Phe Gly Asp Val Asp Ala His Gly
1 5 10 15
<210> 20
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 2 Id91
<400> 20
Phe Gly Asp Val Asp Ala His Gly Ala Met Ile Arg Ala Gln Ala
1 5 10 15
<210> 21
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 3 Id91
<400> 21
Gly Ala Met Ile Arg Ala Gln Ala Gly Ser Leu Glu Ala Glu His
1 5 10 15
<210> 22
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 4 Id91
<400> 22
Ala Gly Ser Leu Glu Ala Glu His Gln Ala Ile Ile Ser Asp Val
1 5 10 15
<210> 23
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 5 Id91
<400> 23
His Gln Ala Ile Ile Ser Asp Val Leu Thr Ala Ser Asp Phe Trp
1 5 10 15
<210> 24
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 6 Id91
<400> 24
Val Leu Thr Ala Ser Asp Phe Trp Gly Gly Ala Gly Ser Ala Ala
1 5 10 15
<210> 25
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 7 Id91
<400> 25
Trp Gly Gly Ala Gly Ser Ala Ala Cys Gln Gly Phe Ile Thr Gln
1 5 10 15
<210> 26
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 8 Id91
<400> 26
Ala Cys Gln Gly Phe Ile Thr Gln Leu Gly Arg Asn Phe Gln Val
1 5 10 15
<210> 27
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 9 Id91
<400> 27
Gln Leu Gly Arg Asn Phe Gln Val Ile Tyr Glu Gln Ala Asn Ala
1 5 10 15
<210> 28
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 10 Id91
<400> 28
Val Ile Tyr Glu Gln Ala Asn Ala His Gly Gln Lys Val Gln Ala
1 5 10 15
<210> 29
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 11 Id91
<400> 29
Ala His Gly Gln Lys Val Gln Ala Ala Gly Asn Asn Met Ala Gln
1 5 10 15
<210> 30
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 12 Id91
<400> 30
Ala Ala Gly Asn Asn Met Ala Gln Thr Asp Ser Ala Val Gly Ser
1 5 10 15
<210> 31
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 13 Id91
<400> 31
Gln Thr Asp Ser Ala Val Gly Ser Ser Trp Ala Asp Asp Ile Asp
1 5 10 15
<210> 32
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 14 Id91
<400> 32
Ser Ser Trp Ala Asp Asp Ile Asp Trp Asp Ala Ile Ala Gln Cys
1 5 10 15
<210> 33
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 15 Id91
<400> 33
Asp Trp Asp Ala Ile Ala Gln Cys Glu Ser Gly Gly Asn Trp Ala
1 5 10 15
<210> 34
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 16 Id91
<400> 34
Cys Glu Ser Gly Gly Asn Trp Ala Ala Asn Thr Gly Asn Gly Leu
1 5 10 15
<210> 35
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 17 Id91
<400> 35
Ala Ala Asn Thr Gly Asn Gly Leu Tyr Gly Gly Leu Gln Ile Ser
1 5 10 15
<210> 36
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 18 Id91
<400> 36
Leu Tyr Gly Gly Leu Gln Ile Ser Gln Ala Thr Trp Asp Ser Asn
1 5 10 15
<210> 37
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 19 Id91
<400> 37
Ser Gln Ala Thr Trp Asp Ser Asn Gly Gly Val Gly Ser Pro Ala
1 5 10 15
<210> 38
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 20 Id91
<400> 38
Asn Gly Gly Val Gly Ser Pro Ala Ala Ala Ser Pro Gln Gln Gln
1 5 10 15
<210> 39
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 21 Id91
<400> 39
Ala Ala Ala Ser Pro Gln Gln Gln Ile Glu Val Ala Asp Asn Ile
1 5 10 15
<210> 40
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 22 Id91
<400> 40
Gln Ile Glu Val Ala Asp Asn Ile Met Lys Thr Gln Gly Pro Gly
1 5 10 15
<210> 41
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 23 Id91
<400> 41
Ile Met Lys Thr Gln Gly Pro Gly Ala Trp Pro Lys Cys Ser Ser
1 5 10 15
<210> 42
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 24 Id91
<400> 42
Gly Ala Trp Pro Lys Cys Ser Ser Cys Ser Gln Gly Asp Ala Pro
1 5 10 15
<210> 43
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 25 Id91
<400> 43
Ser Cys Ser Gln Gly Asp Ala Pro Leu Gly Ser Leu Thr His Ile
1 5 10 15
<210> 44
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 26 Id91
<400> 44
Pro Leu Gly Ser Leu Thr His Ile Leu Thr Phe Leu Ala Ala Glu
1 5 10 15
<210> 45
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 27 Id91
<400> 45
Ile Leu Thr Phe Leu Ala Ala Glu Thr Gly Gly Cys Ser Gly Ser
1 5 10 15
<210> 46
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 28 Id91
<400> 46
Glu Thr Gly Gly Cys Ser Gly Ser Arg Asp Asp Val Val Asp Phe
1 5 10 15
<210> 47
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 29 Id91
<400> 47
Ser Arg Asp Asp Val Val Asp Phe Gly Ala Leu Pro Pro Glu Ile
1 5 10 15
<210> 48
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 30 Id91
<400> 48
Phe Gly Ala Leu Pro Pro Glu Ile Asn Ser Ala Arg Met Tyr Ala
1 5 10 15
<210> 49
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 31 Id91
<400> 49
Ile Asn Ser Ala Arg Met Tyr Ala Gly Pro Gly Ser Ala Ser Leu
1 5 10 15
<210> 50
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 32 Id91
<400> 50
Ala Gly Pro Gly Ser Ala Ser Leu Val Ala Ala Ala Lys Met Trp
1 5 10 15
<210> 51
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 33 Id91
<400> 51
Leu Val Ala Ala Ala Lys Met Trp Asp Ser Val Ala Ser Asp Leu
1 5 10 15
<210> 52
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 34 Id91
<400> 52
Trp Asp Ser Val Ala Ser Asp Leu Phe Ser Ala Ala Ser Ala Phe
1 5 10 15
<210> 53
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 35 Id91
<400> 53
Leu Phe Ser Ala Ala Ser Ala Phe Gln Ser Val Val Trp Gly Leu
1 5 10 15
<210> 54
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 36 Id91
<400> 54
Phe Gln Ser Val Val Trp Gly Leu Thr Val Gly Ser Trp Ile Gly
1 5 10 15
<210> 55
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 37 Id91
<400> 55
Leu Thr Val Gly Ser Trp Ile Gly Ser Ser Ala Gly Leu Met Ala
1 5 10 15
<210> 56
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 38 Id91
<400> 56
Gly Ser Ser Ala Gly Leu Met Ala Ala Ala Ala Ser Pro Tyr Val
1 5 10 15
<210> 57
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 39 Id91
<400> 57
Ala Ala Ala Ala Ser Pro Tyr Val Ala Trp Met Ser Val Thr Ala
1 5 10 15
<210> 58
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 40 Id91
<400> 58
Val Ala Trp Met Ser Val Thr Ala Gly Gln Ala Gln Leu Thr Ala
1 5 10 15
<210> 59
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 41 Id91
<400> 59
Ala Gly Gln Ala Gln Leu Thr Ala Ala Gln Val Arg Val Ala Ala
1 5 10 15
<210> 60
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 42 Id91
<400> 60
Ala Ala Gln Val Arg Val Ala Ala Ala Ala Tyr Glu Thr Ala Tyr
1 5 10 15
<210> 61
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 43 Id91
<400> 61
Ala Ala Ala Tyr Glu Thr Ala Tyr Arg Leu Thr Val Pro Pro Pro
1 5 10 15
<210> 62
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 44 Id91
<400> 62
Tyr Arg Leu Thr Val Pro Pro Pro Val Ile Ala Glu Asn Arg Thr
1 5 10 15
<210> 63
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 45 Id91
<400> 63
Pro Val Ile Ala Glu Asn Arg Thr Glu Leu Met Thr Leu Thr Ala
1 5 10 15
<210> 64
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 46 Id91
<400> 64
Thr Glu Leu Met Thr Leu Thr Ala Thr Asn Leu Leu Gly Gln Asn
1 5 10 15
<210> 65
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 47 Id91
<400> 65
Ala Thr Asn Leu Leu Gly Gln Asn Thr Pro Ala Ile Glu Ala Asn
1 5 10 15
<210> 66
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 48 Id91
<400> 66
Asn Thr Pro Ala Ile Glu Ala Asn Gln Ala Ala Tyr Ser Gln Met
1 5 10 15
<210> 67
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 49 Id91
<400> 67
Asn Gln Ala Ala Tyr Ser Gln Met Trp Gly Gln Asp Ala Glu Ala
1 5 10 15
<210> 68
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 50 Id91
<400> 68
Met Trp Gly Gln Asp Ala Glu Ala Met Tyr Gly Tyr Ala Ala Thr
1 5 10 15
<210> 69
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 51 Id91
<400> 69
Ala Met Tyr Gly Tyr Ala Ala Thr Ala Ala Thr Ala Thr Glu Ala
1 5 10 15
<210> 70
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 52 Id91
<400> 70
Thr Ala Ala Thr Ala Thr Glu Ala Leu Leu Pro Phe Glu Asp Ala
1 5 10 15
<210> 71
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 53 Id91
<400> 71
Ala Leu Leu Pro Phe Glu Asp Ala Pro Leu Ile Thr Asn Pro Gly
1 5 10 15
<210> 72
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 54 Id91
<400> 72
Ala Pro Leu Ile Thr Asn Pro Gly Gly Leu Leu Glu Gln Ala Val
1 5 10 15
<210> 73
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 55 Id91
<400> 73
Gly Gly Leu Leu Glu Gln Ala Val Ala Val Glu Glu Ala Ile Asp
1 5 10 15
<210> 74
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 56 Id91
<400> 74
Val Ala Val Glu Glu Ala Ile Asp Thr Ala Ala Ala Asn Gln Leu
1 5 10 15
<210> 75
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 57 Id91
<400> 75
Asp Thr Ala Ala Ala Asn Gln Leu Met Asn Asn Val Pro Gln Ala
1 5 10 15
<210> 76
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 58 Id91
<400> 76
Leu Met Asn Asn Val Pro Gln Ala Leu Gln Gln Leu Ala Gln Pro
1 5 10 15
<210> 77
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 59 Id91
<400> 77
Ala Leu Gln Gln Leu Ala Gln Pro Ala Gln Gly Val Val Pro Ser
1 5 10 15
<210> 78
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 60 Id91
<400> 78
Pro Ala Gln Gly Val Val Pro Ser Ser Lys Leu Gly Gly Leu Trp
1 5 10 15
<210> 79
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 61 Id91
<400> 79
Ser Ser Lys Leu Gly Gly Leu Trp Thr Ala Val Ser Pro His Leu
1 5 10 15
<210> 80
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 62 Id91
<400> 80
Trp Thr Ala Val Ser Pro His Leu Ser Pro Leu Ser Asn Val Ser
1 5 10 15
<210> 81
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 63 Id91
<400> 81
Leu Ser Pro Leu Ser Asn Val Ser Ser Ile Ala Asn Asn His Met
1 5 10 15
<210> 82
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 64 Id91
<400> 82
Ser Ser Ile Ala Asn Asn His Met Ser Met Met Gly Thr Gly Val
1 5 10 15
<210> 83
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 65 Id91
<400> 83
Met Ser Met Met Gly Thr Gly Val Ser Met Thr Asn Thr Leu His
1 5 10 15
<210> 84
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 66 Id91
<400> 84
Val Ser Met Thr Asn Thr Leu His Ser Met Leu Lys Gly Leu Ala
1 5 10 15
<210> 85
<211> 16
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 67 Id91
<400> 85
His Ser Met Leu Lys Gly Leu Ala Pro Ala Ala Ala Gln Ala Val Glu
1 5 10 15
<210> 86
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 68 Id91
<400> 86
Pro Ala Ala Ala Gln Ala Val Glu Thr Ala Ala Glu Asn Gly Val
1 5 10 15
<210> 87
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 69 Id91
<400> 87
Glu Thr Ala Ala Glu Asn Gly Val Trp Ala Met Ser Ser Leu Gly
1 5 10 15
<210> 88
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 70 Id91
<400> 88
Val Trp Ala Met Ser Ser Leu Gly Ser Gln Leu Gly Ser Ser Leu
1 5 10 15
<210> 89
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 71 Id91
<400> 89
Gly Ser Gln Leu Gly Ser Ser Leu Gly Ser Ser Gly Leu Gly Ala
1 5 10 15
<210> 90
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 72 Id91
<400> 90
Leu Gly Ser Ser Gly Leu Gly Ala Gly Val Ala Ala Asn Leu Gly
1 5 10 15
<210> 91
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 73 Id91
<400> 91
Ala Gly Val Ala Ala Asn Leu Gly Arg Ala Ala Ser Val Gly Ser
1 5 10 15
<210> 92
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 74 Id91
<400> 92
Gly Arg Ala Ala Ser Val Gly Ser Leu Ser Val Pro Pro Ala Trp
1 5 10 15
<210> 93
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 75 Id91
<400> 93
Ser Leu Ser Val Pro Pro Ala Trp Ala Ala Ala Asn Gln Ala Val
1 5 10 15
<210> 94
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 76 Id91
<400> 94
Trp Ala Ala Ala Asn Gln Ala Val Thr Pro Ala Ala Arg Ala Leu
1 5 10 15
<210> 95
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 77 Id91
<400> 95
Val Thr Pro Ala Ala Arg Ala Leu Pro Leu Thr Ser Leu Thr Ser
1 5 10 15
<210> 96
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 78 Id91
<400> 96
Leu Pro Leu Thr Ser Leu Thr Ser Ala Ala Gln Thr Ala Pro Gly
1 5 10 15
<210> 97
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 79 Id91
<400> 97
Ser Ala Ala Gln Thr Ala Pro Gly His Met Leu Gly Gly Leu Pro
1 5 10 15
<210> 98
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 80 Id91
<400> 98
Gly His Met Leu Gly Gly Leu Pro Leu Gly His Ser Val Asn Ala
1 5 10 15
<210> 99
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 81 Id91
<400> 99
Pro Leu Gly His Ser Val Asn Ala Gly Ser Gly Ile Asn Asn Ala
1 5 10 15
<210> 100
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 82 Id91
<400> 100
Ala Gly Ser Gly Ile Asn Asn Ala Leu Arg Val Pro Ala Arg Ala
1 5 10 15
<210> 101
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 83 Id91
<400> 101
Ala Leu Arg Val Pro Ala Arg Ala Tyr Ala Ile Pro Arg Thr Pro
1 5 10 15
<210> 102
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 84 Id91
<400> 102
Ala Tyr Ala Ile Pro Arg Thr Pro Ala Ala Gly Phe Ser Arg Pro
1 5 10 15
<210> 103
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 85 Id91
<400> 103
Pro Ala Ala Gly Phe Ser Arg Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu
1 5 10 15
<210> 104
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 86 Id91
<400> 104
Pro Gly Leu Pro Val Glu Tyr Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met
1 5 10 15
<210> 105
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 87 Id91
<400> 105
Leu Gln Val Pro Ser Pro Ser Met Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln
1 5 10 15
<210> 106
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 88 Id91
<400> 106
Met Gly Arg Asp Ile Lys Val Gln Phe Gln Ser Gly Gly Asn Asn
1 5 10 15
<210> 107
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 89 Id91
<400> 107
Gln Phe Gln Ser Gly Gly Asn Asn Ser Pro Ala Val Tyr Leu Leu
1 5 10 15
<210> 108
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 90 Id91
<400> 108
Asn Ser Pro Ala Val Tyr Leu Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp
1 5 10 15
<210> 109
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 91 Id91
<400> 109
Leu Asp Gly Leu Arg Ala Gln Asp Asp Tyr Asn Gly Trp Asp Ile
1 5 10 15
<210> 110
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 92 Id91
<400> 110
Asp Asp Tyr Asn Gly Trp Asp Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp
1 5 10 15
<210> 111
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 93 Id91
<400> 111
Ile Asn Thr Pro Ala Phe Glu Trp Tyr Tyr Gln Ser Gly Leu Ser
1 5 10 15
<210> 112
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 94 Id91
<400> 112
Trp Tyr Tyr Gln Ser Gly Leu Ser Ile Val Met Pro Val Gly Gly
1 5 10 15
<210> 113
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 95 Id91
<400> 113
Ser Ile Val Met Pro Val Gly Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp
1 5 10 15
<210> 114
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 96 Id91
<400> 114
Gly Gln Ser Ser Phe Tyr Ser Asp Trp Tyr Ser Pro Ala Cys Gly
1 5 10 15
<210> 115
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 97 Id91
<400> 115
Asp Trp Tyr Ser Pro Ala Cys Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr
1 5 10 15
<210> 116
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 98 Id91
<400> 116
Gly Lys Ala Gly Cys Gln Thr Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr
1 5 10 15
<210> 117
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 99 Id91
<400> 117
Tyr Lys Trp Glu Thr Phe Leu Thr Ser Glu Leu Pro Gln Trp Leu
1 5 10 15
<210> 118
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 100 Id91
<400> 118
Thr Ser Glu Leu Pro Gln Trp Leu Ser Ala Asn Arg Ala Val Lys
1 5 10 15
<210> 119
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 101 Id91
<400> 119
Leu Ser Ala Asn Arg Ala Val Lys Pro Thr Gly Ser Ala Ala Ile
1 5 10 15
<210> 120
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 102 Id91
<400> 120
Lys Pro Thr Gly Ser Ala Ala Ile Gly Leu Ser Met Ala Gly Ser
1 5 10 15
<210> 121
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 103 Id91
<400> 121
Ile Gly Leu Ser Met Ala Gly Ser Ser Ala Met Ile Leu Ala Ala
1 5 10 15
<210> 122
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 104 Id91
<400> 122
Ser Ser Ala Met Ile Leu Ala Ala Tyr His Pro Gln Gln Phe Ile
1 5 10 15
<210> 123
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 105 Id91
<400> 123
Ala Tyr His Pro Gln Gln Phe Ile Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala
1 5 10 15
<210> 124
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 106 Id91
<400> 124
Ile Tyr Ala Gly Ser Leu Ser Ala Leu Leu Asp Pro Ser Gln Gly
1 5 10 15
<210> 125
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 107 Id91
<400> 125
Ala Leu Leu Asp Pro Ser Gln Gly Met Gly Pro Ser Leu Ile Gly
1 5 10 15
<210> 126
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 108 Id91
<400> 126
Gly Met Gly Pro Ser Leu Ile Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly
1 5 10 15
<210> 127
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 109 Id91
<400> 127
Gly Leu Ala Met Gly Asp Ala Gly Gly Tyr Lys Ala Ala Asp Met
1 5 10 15
<210> 128
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 110 Id91
<400> 128
Gly Gly Tyr Lys Ala Ala Asp Met Trp Gly Pro Ser Ser Asp Pro
1 5 10 15
<210> 129
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 111 Id91
<400> 129
Met Trp Gly Pro Ser Ser Asp Pro Ala Trp Glu Arg Asn Asp Pro
1 5 10 15
<210> 130
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 112 Id91
<400> 130
Pro Ala Trp Glu Arg Asn Asp Pro Thr Gln Gln Ile Pro Lys Leu
1 5 10 15
<210> 131
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 113 Id91
<400> 131
Pro Thr Gln Gln Ile Pro Lys Leu Val Ala Asn Asn Thr Arg Leu
1 5 10 15
<210> 132
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 114 Id91
<400> 132
Leu Val Ala Asn Asn Thr Arg Leu Trp Val Tyr Cys Gly Asn Gly
1 5 10 15
<210> 133
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 115 Id91
<400> 133
Leu Trp Val Tyr Cys Gly Asn Gly Thr Pro Asn Glu Leu Gly Gly
1 5 10 15
<210> 134
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 116 Id91
<400> 134
Gly Thr Pro Asn Glu Leu Gly Gly Ala Asn Ile Pro Ala Glu Phe
1 5 10 15
<210> 135
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 117 Id91
<400> 135
Gly Ala Asn Ile Pro Ala Glu Phe Leu Glu Asn Phe Val Arg Ser
1 5 10 15
<210> 136
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 118 Id91
<400> 136
Phe Leu Glu Asn Phe Val Arg Ser Ser Asn Leu Lys Phe Gln Asp
1 5 10 15
<210> 137
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 119 Id91
<400> 137
Ser Ser Asn Leu Lys Phe Gln Asp Ala Tyr Asn Ala Ala Gly Gly
1 5 10 15
<210> 138
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 120 Id91
<400> 138
Asp Ala Tyr Asn Ala Ala Gly Gly His Asn Ala Val Phe Asn Phe
1 5 10 15
<210> 139
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 121 Id91
<400> 139
Gly His Asn Ala Val Phe Asn Phe Pro Pro Asn Gly Thr His Ser
1 5 10 15
<210> 140
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 122 Id91
<400> 140
Phe Pro Pro Asn Gly Thr His Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln
1 5 10 15
<210> 141
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 123 Id91
<400> 141
Ser Trp Glu Tyr Trp Gly Ala Gln Leu Asn Ala Met Lys Gly Asp
1 5 10 15
<210> 142
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 124 Id91
<400> 142
Gln Leu Asn Ala Met Lys Gly Asp Leu Gln Ser Ser Leu Gly Ala
1 5 10 15
<210> 143
<211> 15
<212> ПРТ
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Эпитоп 125 Id91
<400> 143
Ala Met Lys Gly Asp Leu Gln Ser Ser Leu Gly Ala Gly Lys Leu
1 5 10 15
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| СЛИТЫЕ БЕЛКИ FMDV-E2 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2016 |
|
RU2714428C2 |
| ВАКЦИНЫ НА ОСНОВЕ ВИРУСОПОДОБНЫХ ЧАСТИЦ (VLP) СОБАЧЬЕГО ПАРВОВИРУСА (CPV) И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2016 |
|
RU2710854C1 |
| РЕКОМБИНАНТНЫЕ ВАКЦИНЫ ОТ FMDV И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ | 2015 |
|
RU2745373C2 |
| ХИМЕРНЫЕ КОНСТРУКЦИИ АНТИТЕЛО/Т-КЛЕТОЧНЫЙ РЕЦЕПТОР И ИХ ПРИМЕНЕНИЯ | 2016 |
|
RU2767209C2 |
| Модифицированные клетки с химерным антигеновым рецептором для лечения рака, экспрессирующего CLDN6 | 2020 |
|
RU2826058C2 |
| ПОЛИВАЛЕНТНАЯ ВАКЦИНА ДЛЯ ЖИВОТНЫХ СЕМЕЙСТВА КОШАЧЬИХ | 2018 |
|
RU2797538C2 |
| СЛИТАЯ КОНСТРУКЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ПРОНИКАЮЩИЙ В КЛЕТКУ ПЕПТИД, ПОЛИЭПИТОП И ПЕПТИДНЫЙ АГОНИСТ TLR, ПРЕДНАЗНАЧЕННАЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА | 2017 |
|
RU2807135C2 |
| СОСТАВЫ ВАКЦИН ПРОТИВ НЕОПЛАЗИИ И СПОСОБЫ ИХ ПОЛУЧЕНИЯ | 2016 |
|
RU2753246C2 |
| ВАКЦИНА ПРОТИВ БЕШЕНСТВА | 2014 |
|
RU2712743C2 |
| ВАКЦИНА ПРОТИВ КОШАЧЬЕГО КАЛИЦИВИРУСА | 2018 |
|
RU2792898C2 |
Изобретение относится к области биотехнологии. Описана группа изобретений, включающая композицию для доставки биоактивного агента в клетку (варианты), способ выработки иммунного ответа у субъекта, способ доставки биоактивного агента в клетку и способ получения композиции для включения биоактивного агента. В одном из вариантов реализации композиция для доставки биоактивного агента в клетку содержит частицы наноструктурированного липидного носителя (НЛН), где частицы НЛН содержат: масляную сердцевину, содержащую смесь жидкофазного липида и твердофазного липида; катионный компонент; гидрофобное поверхностно-активное вещество, и гидрофильное поверхностно-активное вещество. Изобретение расширяет арсенал средств для доставки биоактивного компонента в клетку. 5 н. и 30 з.п. ф-лы, 52 ил., 13 табл., 19 пр.
1. Композиция для доставки биоактивного агента в клетку, содержащая терапевтически эффективное количество частиц наноструктурированного липидного носителя (НЛН) и фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, причем частицы НЛН содержат:
(a) масляную сердцевину, содержащую смесь жидкофазного липида и твердофазного липида,
(b) катионный компонент,
(c) гидрофобное поверхностно-активное вещество, и
(d) гидрофильное поверхностно-активное вещество.
2. Композиция для доставки биоактивного агента в клетку, включающая композицию по п. 1 и биоактивный агент, связанный с частицами НЛН.
3. Композиция по п. 2, отличающаяся тем, что указанная композиция доставляет биоактивный агент в клетку.
4. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что гидрофобное поверхностно-активное вещество представляет собой сложный эфир сорбитана, присутствующий в количестве, достаточном для повышения способности композиции доставлять биоактивный агент в клетку по сравнению с сопоставимой композицией без сложного эфира сорбитана.
5. Композиция по п. 2, отличающаяся тем, что биоактивный агент представляет собой белок, биоактивный агент, кодирующий белок, белковый антиген, или биоактивный агент, кодирующий белковый антиген.
6. Композиция по п. 2, отличающаяся тем, что клетка находится в организме субъекта, причем указанный биоактивный агент представляет собой антиген, и при этом указанная композиция вызывает иммунный ответ у субъекта против указанного антигена.
7. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что гидрофобное поверхностно-активное вещество представляет собой сложный эфир сорбитана, причем указанный биоактивный агент представляет собой белковый антиген, и при этом указанный сложный эфир сорбитана присутствует в количестве, достаточном для повышения способности композиции вызывать иммунный ответ к белковому антигену по сравнению с сопоставимой композицией без сложного эфира сорбитана.
8. Композиция по п. 7, отличающаяся тем, что гидрофобное поверхностно-активное вещество представляет собой сложный эфир сорбитана, причем указанный биоактивный агент представляет собой белковый антиген и при введении в эффективном количестве субъекту указанная композиция вызывает образование титров антител к белковому антигену на более высоком уровне, чем титры антител, полученные в случае, когда сопоставимую композицию, не содержащую сложный эфир сорбитана, вводят субъекту.
9. Композиция по п. 7, отличающаяся тем, что гидрофобное поверхностно-активное вещество представляет собой сложный эфир сорбитана, и композиция вызывает образование титров нейтрализующих антител у субъекта на более высоком уровне, чем титры нейтрализующих антител, вызванные у субъекта сопоставимой композицией, не содержащей сложного эфира сорбитана.
10. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что биоактивный агент представляет собой РНК, мРНК, онколитическую вирусную РНК, некодирующую РНК, самореплицирующуюся РНК или ДНК.
11. Композиция по п. 10, отличающаяся тем, что РНК кодирует антиген или антитело.
12. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что жидкофазный липид содержит растительное масло, подсолнечное масло, соевое масло, оливковое масло, виноградное масло, животное масло, полученное синтетическим путем масло, каприновый/каприловый триглицерид, витамин E, лауроилполиоксилглицерид, моноацилглицерин, соевый лецитин, сквален, сквалан, встречающийся в природе или синтетический терпеноид.
13. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что твердофазный липид содержит глицеролипид, микрокристаллический триглицерид или тримиристин.
14. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что катионный компонент представляет собой катионный липид, выбранный из: 1,2-диолеоилокси-3-(триметиламмонио)пропана (ДОТАП), 3β-[N—(N′,N′-диметиламиноэтан)-карбамоил]холестерина (ДК-холестерина), диметилдиоктадециламмония (ДДА), 1,2-димиристоил-3-триметиламмоний-пропана (ДМТАП), дипальмитоил(C16:0)-триметиламмоний-пропана (ДПТАП), дистеароилтриметиламмоний-пропана (ДСТАП), N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония хлорида (ДОТМА), N,N-диолеоил-N,N-диметиламмония хлорида (ДОДАХ), 1,2-диолеоил-sn-глицеро-3-этилфосфохолина (ДОЭФХ), 1,2-диолеоил-3-диметиламмоний-пропана (ДОДАП) и 1,2-дилинолеилокси-3-диметиламинопропана (ДЛинДМА), полиэтиленгликоля, сложного эфира полиоксиэтиленсорбитана и их комбинаций.
15. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что гидрофильное поверхностно-активное вещество представляет собой полиэтиленгликоль, сложный эфир полиоксиэтиленсорбитана, полисорбат или полисорбат 80.
16. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что средний коэффициент полидисперсности частиц НЛН составляет от 0,1 до приблизительно 0,5.
17. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что гидрофобное поверхностно-активное вещество представляет собой сложный эфир сорбитана, имеющий значение гидрофильно-липофильного баланса (ГЛБ), равное от 1 до 5.
18. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что гидрофобное поверхностно-активное вещество представляет собой сложный эфир сорбитана, и указанный сложный эфир сорбитана представляет собой сложный моноэфир сорбитана, сложный триэфир сорбитана, сорбитана моностеарат, сорбитана моноолеат или сорбитана триолеат.
19. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что Z-средний диаметр частиц НЛН составляет от приблизительно 40 нм до приблизительно 80 нм.
20. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что Z-средний диаметр частиц НЛН составляет от приблизительно 40 нм до приблизительно 60 нм.
21. Композиция по п. 1 или 2, имеющая молярное соотношение масла к поверхностно-активному веществу от приблизительно 0,5 до приблизительно 12.
22. Композиция по п. 1 или 2, имеющая молярное соотношение гидрофильного поверхностно-активного вещества к катионному компоненту от приблизительно 0,2 до приблизительно 1,5.
23. Композиция по п. 1 или 2, содержащая от приблизительно 0,2% до приблизительно 40% масс./об. жидкофазного липида, от приблизительно 0,1% до приблизительно 10% масс./об. твердофазного липида, от приблизительно 0,2% до приблизительно 10% масс./об. катионного компонента, представляющего собой катионный липид, от приблизительно 0,25% до приблизительно 15% масс./об. гидрофобного поверхностно-активного вещества, представляющего собой сложный эфир сорбитана, и от приблизительно 0,2% до приблизительно 15% масс./об. поверхностно-активного вещества, представляющего собой гидрофильное поверхностно-активное вещество.
24. Композиция по п. 1 или 2, где масляная сердцевина содержит встречающийся в природе или синтетический сквален и глицеролипид, где катионный компонент представляет собой ДОТАП, где гидрофобное поверхностно-активное вещество представляет собой сорбитана моностеарат или сорбитана моноолеат, или сорбитана триолеат, и где гидрофильное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат.
25. Композиция по п. 1 или 2, где масляная сердцевина содержит сквален и тримиристин, где катионный компонент представляет собой ДОТАП, где указанное гидрофобное поверхностно-активное вещество представляет собой сорбитана моностеарат или сорбитана моноолеат, или сорбитана триолеат, и где гидрофильное поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат 80.
26. Композиция по п. 10, отличающаяся тем, что биоактивный агент представляет собой РНК, и при этом РНК кодирует один или более антигенов TB.
27. Композиция по п. 1 или 2, отличающаяся тем, что биоактивный агент представляет собой адъювант.
28. Композиция по п. 27, отличающаяся тем, что адъювант выбран из агониста TLR, агониста Rig-I, сапонина, углевода, углеводного полимера, конъюгированного углевода, целой вирусной частицы, подобной вирусу частицы, фрагментов вирусов и фрагментов клеток.
29. Композиция по п. 27, отличающаяся тем, что биоактивный агент выбран из двухцепочечной РНК, riboxxol, поли(I:C) и поли-ICLC.
30. Способ выработки иммунного ответа у субъекта, включающий:
(a) введение нуждающемуся в этом субъекту терапевтически эффективного количества онколитического вируса, кодирующего белковый антиген, и
(b) введение указанному субъекту композиции по п. 2, причем биоактивный агент представляет собой белковый антиген или молекулу нуклеиновой кислоты, кодирующую белковый антиген.
31. Способ по п. 30, отличающийся тем, что введение (a) и введение (b) осуществляют с интервалом между введениями, составляющим по меньшей мере 1 неделю, по меньшей мере 2 недели, по меньшей мере 3 недели, по меньшей мере 1 месяц, по меньшей мере 6 недель, по меньшей мере два месяца, по меньшей мере три месяца, по меньшей мере 6 месяцев или по меньшей мере 1 год.
32. Способ по п. 30, отличающийся тем, что биоактивный агент представляет собой РНК, и при этом РНК кодирует один или более антигенов TB.
33. Способ доставки биоактивного агента в клетку, включающий приведение клетки в контакт с композицией по п. 2.
34. Способ получения композиции по п. 1, включающий:
(a) смешивание твердофазного липида, жидкофазного липида, катионного компонента и гидрофобного поверхностно-активного вещества с получением смеси масляной фазы;
(b) смешивание гидрофильного поверхностно-активного вещества и воды с получением смеси водной фазы; и
(c) смешивание смеси масляной фазы со смесью водной фазы с получением частиц НЛН.
35. Способ по п. 34, дополнительно включающий:
(d) объединение биоактивного агента с частицами НЛН таким образом, что биоактивный агент связывается с поверхностью частиц НЛН посредством нековалентных взаимодействий или посредством обратимых ковалентных взаимодействий.
| WO 2013006834 A1 10.01.2013 | |||
| WO 2012006380 A2 12.01.2012 | |||
| US 9770463 B2 26.09.2017 | |||
| WO 2009067734 A1 04.06.2009 | |||
| ЭМУЛЬСИИ ТИПА "МАСЛО В ВОДЕ", КОТОРЫЕ СОДЕРЖАТ НУКЛЕИНОВЫЕ КИСЛОТЫ | 2012 |
|
RU2606846C2 |
| WO 2013006837 A1 10.01.2013 | |||
| Neda Naseri et al | |||
| Solid Lipid Nanoparticles and Nanostructured Lipid Carriers: Structure, Preparation and Application | |||
| Adv Pharm Bull | |||
| Устройство для закрепления лыж на раме мотоциклов и велосипедов взамен переднего колеса | 1924 |
|
SU2015A1 |
