СОДЕРЖАЩЕЕ ИНГИБИТОР mTOR ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРОФИЛАКТИКИ ГЛАЗНЫХ СИМПТОМОВ, НАРУШЕНИЙ ИЛИ ЗАБОЛЕВАНИЙ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ Российский патент 2022 года по МПК A61K9/08 A61K31/436 A61K31/7088 A61K31/7105 A61K31/711 A61P27/02 

[Область техники]

[0001]

Настоящее изобретение относится к лекарственному средству для лечения или профилактики глазных патологических состояний, нарушений или заболеваний, содержащему ингибитор mTOR (также называемой механистической мишенью рапамицина, мишенью рапамицина млекопитающих), и его применению.

[Уровень техники]

[0002]

Визуальная информация распознается, когда свет, передаваемый в роговицу, которая представляет собой прозрачную ткань в передней части глазного яблока, достигает сетчатки и возбуждает нервные клетки сетчатки, при этом генерируемый электрический сигнал передается через зрительный нерв в зрительную зону коры головного мозга. Для хорошего зрения необходимо, чтобы роговица была прозрачной. Прозрачность роговицы сохраняется за счет поддержания постоянного содержания воды с помощью насосной и барьерной функций эндотелиальных клеток роговицы.

[0003]

Эндотелиальные клетки роговицы человека присутствуют в плотности приблизительно 3000 клеток на 1 мм² при рождении. После повреждения эндотелиальные клетки роговицы человека обладают крайне ограниченной способностью к регенерации. Эндотелиальная дистрофия роговицы Фукса представляет собой заболевание, которое вызывает нарушения в эндотелиальных клетках внутри роговицы и значительно снижает плотность эндотелиальных клеток роговицы, что приводит к отеку роговицы. Этиология этого заболевания неизвестна. При эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса внеклеточный матрикс, такой как коллаген или фибронектин, откладывается на части задней поверхности десцеметовой оболочки в задней части роговицы, что приводит к появлению гутт (гутт роговицы) и гипертрофии десцеметовой оболочки. Гутты (гутты роговицы) и гипертрофия десцеметовой оболочки являются причиной светобоязни или нечеткого зрения у пациентов с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса, что значительно ухудшает качество жизни пациентов. Таким образом, внеклеточный матрикс, такой как фибронектин, ассоциирован с состояниями, которые вызывают снижение остроты зрения, такими как гутты на поверхности эндотелия роговицы или мутные гутты, и может быть основной причиной нарушения эндотелия роговицы, связанного с непрозрачностью роговицы, такой как помутнение, помутнение роговицы или бельмо. Следует понимать, что при эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса не существует эффективного терапевтического метода, кроме трансплантации роговицы. Тем не менее, в Японии существует дефицит донорства роговицы, где число пациентов, ожидающих трансплантации роговицы, составляет около 2600, тогда как количество трансплантаций роговицы, выполняемых в Японии, составляет приблизительно 1700 в год.

[0004]

В случае эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса сообщали о культивировании (Непатентные источники 1 и 3) и иммортализации (Непатентный источник 2) эндотелиальных клеток роговицы от пациентов с дистрофией роговицы Фукса, однако о клетках, пригодных для скрининга терапевтического лекарственного средства или лекарственного средства, препятствующего прогрессированию заболевания, которые сохраняют признаки заболевания, такие как избыточная продукция внеклеточных матриц, не сообщалось. Следовательно, существует ограничение на разработку соответствующего терапевтического лекарственного средства. В настоящее время в клинической практике не существует терапевтического средства, поэтому терапия находится в зависимости от трансплантации роговицы.

[Список источников]

[Непатентные источники]

[0005]

[NPL 1] Zaniolo K, et al. Exp Eye Res.; 94 (1): 22-31. 2012

[NPL 2] Azizi B, et al. Invest Ophthalmol Vis Sci. 2; 52 (13): 9291-9297. 2011

[NPL 3] Kelliher C. et al. Exp Eye Res Vol. 93 (6), 880-888, 2011

[Сущность изобретения]

[Решение задачи]

[0006]

Авторы изобретения обнаружили, что ингибирование mTOR подавляет гибель клеток (апоптоз) глаза, в особенности эндотелиальных клеток роговицы, и может применяться для использования для лечения или профилактики глазных заболеваний, таких как эндотелиальные нарушения роговицы (в особенности эндотелиальные нарушения роговицы при эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса), опосредованные трансформирующим фактором роста β (TGF-β). Кроме того, авторы изобретения неожиданно обнаружили, что суперэкспрессия внеклеточного матрикса (ВКМ), такого как фибронектин, может быть подавлена путем ингибирования mTOR. Авторы изобретения, таким образом, обнаружили, что ингибитор mTOR может использоваться для облегчения, терапии или профилактики заболеваний эндотелия роговицы, опосредованных суперэкспрессией внеклеточного матрикса (например, гутты, гипертрофия десцеметовой оболочки, помутнение роговицы, бельмо, другие патологические состояния, связанные с помутнением, и т.п.). Поскольку гибель клеток и внеклеточный матрикс являются независимыми событиями, предпочтительно, что они оба могут быть подавлены.

[0007]

Таким образом, настоящее изобретение относится, например, к следующим объектам.

(Пункт 1)

Композиция для применения в профилактике или лечении глазного патологического состояния, нарушения или заболевания, включающая ингибитор mTOR.

(Пункт 2)

Композиция по пункту 1, причем глазное патологическое состояние, нарушение или заболевание является патологическим состоянием, нарушением или заболеванием эндотелия роговицы.

(Пункт 3)

Композиция по пункту 1 или 2, причем глазное патологическое состояние, нарушение или заболевание является патологическим состоянием, нарушением или заболеванием эндотелия роговицы, опосредованными трансформирующим фактором роста β (TGF-β).

(Пункт 4)

Композиция по любому из пунктов 1-3, причем патологическое состояние, нарушение или заболевание эндотелия роговицы выбраны из группы, состоящей из эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, нарушения после трансплантации роговицы, эндотелиита роговицы, травмы, глазной хирургии, нарушения после глазной лазерной хирургии, старения, задней полиморфной дистрофии (PPD), врожденной наследственной эндотелиальной дистрофии (CHED), идиопатического эндотелиального нарушения роговицы и цитомегаловирусного эндотелиита роговицы.

(Пункт 5)

Композиция по любому из пунктов 1-4, причем патологическое состояние, нарушение или заболевание эндотелия роговицы опосредованы суперэкспрессией внеклеточного матрикса (ВКМ).

(Пункт 6)

Композиция по пункту 5, причем патологическое состояние, нарушение или заболевание эндотелия роговицы выбраны из группы, состоящей из эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, образования гутт, гипертрофии десцеметовой оболочки, гипертрофии роговицы, мутности, рубца, помутнения роговицы, пятна роговицы, бельма роговицы, светобоязни и нечеткого зрения.

(Пункт 7)

Композиция по любому из пунктов 1-6, причем патологическое состояние, нарушение или заболевание включает эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса.

(Пункт 8)

Композиция по любому из пунктов 1-7, в которой ингибитор mTOR выбран из группы, состоящей из рапамицина, темсиролимуса, эверолимуса, PI-103, CC-223, INK128, AZD8055, KU 0063794, Вокстализиба, Ридафоролимуса, NVP-BEZ235, CZ415, Торкиниба, Торина 1, Омипализиба, OSI-027, PF-04691502, Апитолизиба, WYE-354, Вистусертиба, Торина 2, Такролимуса, GSK1059615, Гедатолизиба, WYE-125132, BGT226, Паломида 529, PP121, WYE-687, CH5132799, WAY-600, ETP-46464, GDC-0349, XL388, Зотаролимуса и хризофановой кислоты.

(Пункт 9)

Композиция по любому из пунктов 1-7, в которой ингибитор mTOR является веществом, подавляющим экспрессию гена mTOR.

(Пункт 10)

Композиция по пункту 9, в которой веществом, подавляющим экспрессию гена mTOR, является миРНК, антисмысловая нуклеиновая кислота или рибозим против гена mTOR.

(Пункт 11)

Композиция по пункту 9 или 10, в которой веществом, подавляющим экспрессию гена mTOR, является миРНК против гена mTOR, где миРНК включает смысловую цепь, состоящую из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 1, или последовательность нуклеиновой кислоты, где 1-3 основания нуклеотидов удалены, заменены, вставлены и/или добавлены, и антисмысловую цепь, состоящую из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 2, или последовательности нуклеиновой кислоты, где 1-3 основания нуклеотидов удалены, заменены, вставлены и/или добавлены.

(Пункт 12)

Композиция по любому из пунктов 1-8, в которой ингибитор mTOR выбран из группы, состоящей из рапамицина, темсиролимуса и эверолимуса.

(Пункт 13)

Композиция по любому из пунктов 1-12, причем композиция представляет собой глазные капли.

(Пункт 14)

Композиция по любому из пунктов 1-8, в которой ингибитор mTOR является рапамицином и присутствует в композиции в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,1 нМ.

(Пункт 15)

Композиция по любому из пунктов 1-8, причем композиция представляет собой глазные капли, где ингибитор mTOR является рапамицином и присутствует в глазных каплях в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,1 мМ.

(Пункт 16)

Композиция по любому из пунктов 1-8, в которой ингибитор mTOR является темсиролимусом и присутствует в композиции в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,01 нМ.

(Пункт 17)

Композиция по любому из пунктов 1-8, причем композиция представляет собой глазные капли, где ингибитор mTOR является темсиролимусом и присутствует в глазных каплях в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,01 мМ.

(Пункт 18)

Композиция по любому из пунктов 1-8, в которой ингибитор mTOR является эверолимусом и присутствует в композиции в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,1 нМ.

(Пункт 19)

Композиция по любому из пунктов 1-8, причем композиция представляет собой глазные капли, где ингибитор mTOR является эверолимусом и присутствует в глазных каплях в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,1 мМ.

(Пункт 1A)

Способ профилактики или лечения глазного патологического состояния, нарушения или заболевания у пациента, где способ включает введение пациенту эффективного количества ингибитора mTOR.

(Пункт 2A)

Способ по пункту 1А, где глазное патологическое состояние, нарушение или заболевание является патологическим состоянием, нарушением или заболеванием эндотелия роговицы.

(Пункт 3A)

Способ по пункту 1A или 2A, где глазное патологическое состояние, нарушение или заболевание является патологическим состоянием, нарушением или заболеванием эндотелия роговицы, опосредованными трансформирующим фактором роста β (TGF-β).

(Пункт 4A)

Способ по любому из пунктов 1А-3А, где патологическое состояние, нарушение или заболевание эндотелия роговицы выбраны из группы, состоящей из эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, нарушения после пересадки роговицы, эндотелиита роговицы, травмы, глазной хирургии, нарушения после глазной лазерной хирургии, старения, задней полиморфной дистрофии (PPD), врожденной наследственной эндотелиальной дистрофии (CHED), идиопатического эндотелиального нарушения роговицы и цитомегаловирусного эндотелиита роговицы.

(Пункт 5A)

Способ по любому из пунктов 1А-4А, где патологическое состояние, нарушение или заболевание эндотелия роговицы опосредовано суперэкспрессией внеклеточного матрикса (ВКМ).

(Пункт 6A)

Способ по пункту 5A, где патологическое состояние, нарушение или заболевание эндотелия роговицы выбраны из группы, состоящей из эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, образования гутт, гипертрофии десцеметовой оболочки, гипертрофии роговицы, мутности, рубца, помутнения роговицы, пятна роговицы, бельма, светобоязни и нечеткого зрения.

(Пункт 7A)

Способ по любому из пунктов 1А-6А, где патологическое состояние, нарушение или заболевание включает эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса.

(Пункт 8A)

Способ по любому из пунктов 1А-7А, где ингибитор mTOR выбран из группы, состоящей из рапамицина, темсиролимуса, эверолимуса, PI-103, CC-223, INK128, AZD8055, KU 0063794, Вокстализиба, Ридафоролимуса, NVP-BEZ235, CZ415, Торкиниба, Торина 1, Омипализиба, OSI-027, PF-04691502, Апитолизиба, WYE-354, Вистусертиба, Торина 2, Такролимуса, GSK1059615, Гедатолизиба, WYE-125132, BGT226, Паломида 529, PP121, WYE-687, CH5132799, WAY-600, ETP-46464, GDC-0349, XL388, Зотаролимуса и хризофановой кислоты.

(Пункт 9A)

Способ по любому из пунктов 1А-7А, где ингибитор mTOR является веществом, подавляющим экспрессию гена mTOR.

(Пункт 10A)

Способ по пункту 9A, где веществом, подавляющим экспрессию гена mTOR, является миРНК, антисмысловая нуклеиновая кислота или рибозим против гена mTOR.

(Пункт 11A)

Способ по пункту 9A или 10A, где веществом, подавляющим экспрессию гена mTOR, является миРНК против гена mTOR, где миРНК включает смысловую цепь, состоящую из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 1, или последовательности нуклеиновой кислоты, где 1-3 основания нуклеотидов удалены, заменены, вставлены и/или добавлены, и антисмысловую цепь, состоящую из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 2, или последовательности нуклеиновой кислоты, где 1-3 основания нуклеотидов удалены, заменены, вставлены и/или добавлены.

(Пункт 12A)

Способ по любому из пунктов 1А-8А, где ингибитор mTOR выбран из группы, состоящей из рапамицина, темсиролимуса и эверолимуса.

(Пункт 13A)

Способ по любому из пунктов 1А-12А, где ингибитор mTOR вводят в форме глазных капель.

(Пункт 14A)

Способ по любому из пунктов 1А-8А, где ингибитор mTOR является рапамицином, и его вводят в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,1 нМ.

(Пункт 15A)

Способ по любому из пунктов 1А-8А, где ингибитор mTOR вводят в форме глазных капель, где ингибитор mTOR является рапамицином и присутствует в глазных каплях в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,1 мМ.

(Пункт 16A)

Способ по любому из пунктов 1А-8А, где ингибитор mTOR является темсиролимусом, и его вводят в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,01 нМ.

(Пункт 17A)

Способ по любому из пунктов 1А-8А, где ингибитор mTOR вводят в форме глазных капель, где ингибитор mTOR является темсиролимусом и присутствует в глазных каплях в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,01 мМ.

(Пункт 18A)

Способ по любому из пунктов 1А-8А, где ингибитор mTOR является эверолимусом, и его вводят в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,1 нМ.

(Пункт 19A)

Способ по любому из пунктов 1А-8А, где ингибитор mTOR вводят в форме глазных капель, где ингибитор mTOR является эверолимусом и присутствует в глазных каплях в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,1 мМ.

(Пункт 20A)

Способ по любому из пунктов 1А-19А, где ингибитор mTOR вводят местно.

(Пункт 21A)

Способ по любому из пунктов 1А-20А, где ингибитор mTOR вводят местно в глаз.

(Пункт 22A)

Способ по любому из пунктов 1А-21А, где ингибитор mTOR вводят так, что он контактирует с роговицей.

(Пункт 1B)

Применение ингибитора mTOR для получения лекарственного средства для профилактики или лечения глазного патологического состояния, нарушения или заболевания.

(Пункт 2B)

Применение по пункту 1B, где глазное патологическое состояние, нарушение или заболевание является патологическим состоянием, нарушением или заболеванием эндотелия роговицы.

(Пункт 3B)

Применение по пункту 1B или 2B, где глазное патологическое состояние, нарушение или заболевание является патологическим состоянием, нарушением или заболеванием эндотелия роговицы, опосредованными трансформирующим фактором роста β (TGF-β).

(Пункт 4B)

Применение по любому из пунктов 1B- 3B, где патологическое состояние, нарушение или заболевание эндотелия роговицы выбраны из группы, состоящей из эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, нарушения после пересадки роговицы, эндотелиита роговицы, травмы, глазной хирургии, нарушения после глазной лазерной хирургии, старения, задней полиморфной дистрофии (PPD), врожденной наследственной эндотелиальной дистрофии (CHED), идиопатического эндотелиального нарушения роговицы и цитомегаловирусного эндотелиита роговицы.

(Пункт 5B)

Применение по любому из пунктов 1B-4B, где патологическое состояние, нарушение или заболевание эндотелия роговицы опосредовано суперэкспрессией внеклеточного матрикса (ВКМ).

(Пункт 6B)

Применение по пункту 5B, где патологическое состояние, нарушение или заболевание эндотелия роговицы выбраны из группы, состоящей из эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, образования гутт, гипертрофии десцеметовой оболочки, гипертрофии роговицы, мутности, рубца, помутнения роговицы, пятна роговицы, бельма, светобоязни и нечеткого зрения.

(Пункт 7B)

Применение по любому из пунктов 1B-6B, где патологическое состояние, нарушение или заболевание включают эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса.

(Пункт 8B)

Применение по любому из пунктов 1B-7B, где ингибитор mTOR выбран из группы, состоящей из рапамицина, темсиролимуса, эверолимуса, PI-103, CC-223, INK128, AZD8055, KU 0063794, Вокстализиба, Ридафоролимуса, NVP-BEZ235, CZ415, Торкиниба, Торина 1, Омипализиба, OSI-027, PF-04691502, Апитолизиба, WYE-354, Вистусертиба, Торина 2, Такролимуса, GSK1059615, Гедатолизиба, WYE-125132, BGT226, Паломида 529, PP121, WYE-687, CH5132799, WAY-600, ETP-46464, GDC-0349, XL388, Зотаролимуса и хризофановой кислоты.

(Пункт 9B)

Применение по любому из пунктов 1B-7B, где ингибитор mTOR является веществом, подавляющим экспрессию гена mTOR.

(Пункт 10B)

Применение по пункту 9B, где веществом, подавляющим экспрессию гена mTOR, является миРНК, антисмысловая нуклеиновая кислота или рибозим против гена mTOR.

(Пункт 11B)

Применение по пункту 9B или 10B, где веществом, подавляющим экспрессию гена mTOR, является миРНК против гена mTOR, где миРНК включает смысловую цепь, состоящую из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 1, или последовательности нуклеиновой кислоты, где 1-3 основания нуклеотидов удалены, заменены, вставлены и/или добавлены, и антисмысловую цепь, состоящую из последовательности нуклеиновой кислоты, представленной в SEQ ID NO: 2, или последовательности нуклеиновой кислоты, где 1-3 основания нуклеотидов удалены, заменены, вставлены и/или добавлены.

(Пункт 12B)

Применение по любому из пунктов 1B-8B, где ингибитор mTOR выбран из группы, состоящей из рапамицина, темсиролимуса и эверолимуса.

(Пункт 13B)

Применение по любому из пунктов 1B-12B, где лекарственное средство является глазными каплями.

(Пункт 14B)

Применение по любому из пунктов 1-8, где ингибитор mTOR является рапамицином и присутствует в лекарственном средстве в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,1 нМ.

(Пункт 15B)

Применение по любому из пунктов 1B-8B, где лекарственное средство является глазными каплями, где ингибитор mTOR является рапамицином и присутствует в глазных каплях в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,1 мМ.

(Пункт 16B)

Применение по любому из пунктов 1B-8B, где ингибитор mTOR является темсиролимусом и присутствует в лекарственном средстве в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,01 нМ.

(Пункт 17B)

Применение по любому из пунктов 1B-8B, где лекарственное средство является глазными каплями, где ингибитор mTOR является темсиролимусом и присутствует в глазных каплях в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,01 мМ.

(Пункт 18B)

Применение по любому из пунктов 1B-8B, где ингибитор mTOR является эверолимусом и присутствует в лекарственном средстве в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,1 нМ.

(Пункт 19B)

Применение по любому из пунктов 1B-8B, где лекарственное средство является глазными каплями, где ингибитор mTOR является эверолимусом и присутствует в глазных каплях в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,1 мМ.

(Пункт 1C)

Ингибитор mTOR для применения в профилактике или лечении глазного патологического состояния, нарушения или заболевания.

(Пункт 2C)

Ингибитор mTOR по пункту 1C, включающий один или более признаков из пунктов выше.

(Пункт 1D)

Композиция для консервации эндотелиальных клеток роговицы, включающая ингибитор mTOR.

(Пункт 2D)

Композиция по пункту 1D, включая один или более признаков пунктов выше.

(Пункт 1E)

Способ консервации эндотелиальных клеток роговицы, включающий контакт эффективного количества ингибитора mTOR с эндотелиальными клетками роговицы.

(Пункт 2E)

Способ по пункту 1E, включающий один или более признаков из пунктов выше.

(Пункт 1F)

Способ выращивания эндотелиальных клеток роговицы или стимуляции роста эндотелиальных клеток роговицы, включающий контакт эффективного количества ингибитора mTOR с эндотелиальными клетками роговицы.

(Пункт 2F)

Способ по пункту 1E, включающий один или более признаков из пунктов выше.

[0008]

Настоящее изобретение предусматривает, что один или более из вышеуказанных признаков могли быть представлены не только в виде конкретно описанных комбинаций, но также и в виде других их комбинаций. Дополнительные варианты осуществления и преимущества настоящего изобретения будут ясны специалистам в данной области при прочтении и понимании следующего подробного описания при необходимости.

[Полезные эффекты изобретения]

[0009]

В настоящем изобретении неожиданно было обнаружено, что ингибитор mTOR может лечить или предотвращать заболевание, вызванное нарушением или заболеванием, опосредованным трансформирующим фактором роста β (TGF-β) при эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса или т.п., и может предоставить лекарственное средство, которое может лечить или предотвращать глазное патологическое состояние, нарушение или заболевание, включая такое заболевание. Настоящее изобретение также относится к лекарственному средству, которое может лечить или предотвращать заболевание, опосредованное эндотелиальным нарушением роговицы, вызванным избыточной продукцией внеклеточного матрикса (например, фибронектина), таким как гутты, гипертрофия десцеметовой оболочки, помутнение роговицы, лейкома или другие состояния, связанные с помутнением. Настоящее изобретение также относится к композиции для консервации эндотелиальных клеток роговицы или композиции для стимуляции роста эндотелиальных клеток роговицы, включающей ингибитор mTOR, а также к способу консервации и/или выращивания или стимуляции роста эндотелиальных клеток роговицы.

[Краткое описание чертежей]

[0010]

[Фигура 1] На Фигуре 1 показаны микроскопические изображения клеток iFECD. На левом верхнем изображении показана контрольная группа, в которой не добавляли TGF-β2, на правом верхнем изображении показана группа, в которой добавляли TGF-β2, на левом нижнем изображении показана группа, в которой добавляли TGF-β2 и рапамицин, и на правом нижнем изображении показана группа, в которой добавляли TGF-β2 и Z-VD-FMK, который является ингибитором каспазы.

[Фигура 2] На Фигуре 2 показаны результаты вестерн-блоттинга общей каспазы 3, расщепленной каспазы 3, PARP и GAPDH. На фигуре показаны, слева направо, контрольная группа, в которой не добавляли TGF-β2, группа, в которой добавляли TGF-β2, группа, в которой добавляли TGF-β2 и рапамицин, и группа, в которой добавляли TGF-β2 и Z-VD-FMK, который является ингибитором каспазы.

[Фигура 3] На Фигуре 3 показаны результаты вестерн-блоттинга Akt, p-Akt, S6K, p-S6K и GAPDH. На фигуре показаны, слева направо, контрольная группа, в которой не добавляли TGF-β2, группа, в которой добавляли TGF-β2, группа, в которой добавляли TGF-β2 и рапамицин, и группа, в которой добавляли TGF-β2 и Z-VD-FMK, который является ингибитором каспазы.

[Фигура 4] На Фигуре 4 показаны результаты вестерн-блоттинга Smad2, p-Smad2, Smad3, p-Smad3 и GAPDH. На фигуре показаны, слева направо, контрольная группа, в которой не добавляли TGF-β2, группа, в которой добавляли TGF-β2, группа, в которой добавляли TGF-β2 и рапамицин, и группа, в которой добавляли TGF-β2 и Z-VD-FMK, который является ингибитором каспазы.

[Фигура 5] На Фигуре 5 показаны результаты вестерн-блоттинга фибронектина и GAPDH (n=3). На фигуре показаны, слева направо, контрольная группа, в которой не добавляли TGF-β2, группа, в которой добавляли TGF-β2, группа, в которой добавляли TGF-β2 и рапамицин, и группа, в которой добавляли TGF-β2 и Z-VD-FMK, который является ингибитором каспазы.

[Фигура 6] На Фигуре 6 показаны результаты электрофореза в агарозном геле и вестерн-блоттинга. На панели сверху показан результат электрофореза в агарозном геле mTOR и GAPDH, а на панели снизу показаны результаты вестерн-блоттинга mTOR, S6K, p-S6K и GAPDH. На фигуре, на каждой панели, слева направо, показаны группа, в которой добавляли случайную миРНК, группа, в которой добавляли TGF-β2+случайную миРНК, группа, в которой добавляли mTOR миРНК, и группа, в которой добавляли TGF-β2+mTOR миРНК.

[Фигура 7] На Фигуре 7 показаны микроскопические изображения клеток iFECD. На верхнем изображении слева показана группа, в которой добавляли случайную миРНК, на верхнем изображении справа показана группа, в которой добавляли mTOR миРНК, на нижнем изображении слева показана группа, в которой добавляли TGF-β2+случайную миРНК, и на нижнем изображении справа показана группа, в которой добавляли TGF-β2+mTOR миРНК.

[Фигура 8] На Фигуре 8 показаны результаты вестерн-блоттинга общей каспазы 3, расщепленной каспазы 3, PARP и GAPDH. На фигуре, слева направо, показана группа, в которой добавляли случайную миРНК, группа, в которой добавляли TGF-β2+случайную миРНК, группа, в которой добавляли mTOR миРНК, и группа, в которой добавляли TGF-β2+mTOR миРНК.

[Фигура 9] На Фигуре 9 показаны результаты вестерн-блоттинга фибронектина и GAPDH. На фигуре, слева направо, показана группа, в которой добавляли случайную миРНК, группа, в которой добавляли TGF-β2+случайную миРНК, группа, в которой добавляли mTOR миРНК, и группа, в которой добавляли TGF-β2+mTOR миРНК.

[Фигура 10] На Фигуре 10 показан график активности каспазы 3/7. На фигуре, слева направо, показана группа, в которой не добавляли TGF-β2, контрольная группа, TGF-β2 (10 нг/мл) + рапамицин (0,00001 нМ, 0,0001 нМ, 0,001 нМ, 0,01 нМ, 0,1 нМ, 1 нМ, 10 нМ, 100 нМ), и TGF-β2 (10 нг/мл) + Z-VD-FMK (10 мкМ). Статистическую значимость проверяли при использовании t-критерия Даннета (* обозначает p<0,05, и ** обозначает p<0,01, n=5).

[Фигура 11] На Фигуре 11 показан график активности каспазы 3/7. На фигуре, слева, показана группа, в которой не добавляли TGF-β2, контрольная группа, TGF-β2 (10 нг/мл) + эверолимус (0,0001 мкМ, 0,001 мкМ, 0,01 мкМ, 0,1 мкМ), и TGF-β2 (10 нг/мл) + Z-VD-FMK (10 мкМ). Статистическую значимость проверяли при использовании t-критерия Даннета (*обозначает p<0,05, и ** обозначает p<0,01, n=5).

[Фигура 12] На Фигуре 12 показан график активности каспазы 3/7. На фигуре, слева направо, показана группа, в которой не добавляли TGF-β2, контрольная группа, TGF-β2 (10 нг/мл) + темсиролимус (0,000001 мкМ, 0,00001 мкМ, 0,0001 мкМ, 0,001 мкМ, 0,01 мкМ, 0,1 мкМ, 1 мкМ, 10 мкМ), и TGF-β2+Z-VD-FMK (10 мкМ). Статистическую значимость проверяли при использовании t-критерия Даннета (*обозначает p<0,05, и ** обозначает p<0,01, n=5).

[Фигура 13] На Фигуре 13 показан график активности каспазы 3/7. На фигуре, слева направо, показана группа, в которой не добавляли TGF-β2, контрольная группа, TGF-β2 (10 нг/мл) + Pl-103 (0,001 мкМ, 0,01 мкМ, 0,1 мкМ, 1 мкМ), и TGF-β2 (10 нг/мл) + Z-VD-FMK (10 мкМ). Статистическую значимость проверяли при использовании t-критерия Даннета (* обозначает p<0,05, и ** обозначает p<0,01, n=5).

[Фигура 14] На Фигуре 14 показан график активности каспазы 3/7. На фигуре показаны, слева направо, группа, в которой не добавляли TGF-β2, контрольная группа, TGF-β2 (10 нг/мл) + CC-223 (0,001 мкМ, 0,01 мкМ, 0,1 мкМ, 1 мкМ), и TGF-β2 (10 нг/мл) + Z-VD-FMK (10 мкМ). Статистическую значимость проверяли при использовании t-критерия Даннета (* обозначает p<0,05, и ** обозначает p<0,01, n=5).

[Фигура 15] На Фигуре 15 показан график активности каспазы 3/7. На фигуре показаны, слева направо, группа, в которой не добавляли TGF-β2, контрольная группа, TGF-β2 (10 нг/мл) + INK128 (0,001 мкМ, 0,01 мкМ, 0,1 мкМ, 1 мкМ), и TGF-β2 (10 нг/мл) + Z-VD-FMK (10 мкМ). Статистическую значимость проверяли при использовании t-критерия Даннета (* обозначает p<0,05, и ** обозначает p<0,01, n=5).

[Фигура 16] На Фигуре 16 показан график активности каспазы 3/7. На фигуре показаны, слева направо, группа, в которой не добавляли TGF-β2, контрольная группа, TGF-β2 (10 нг/мл) + AZD8055 (0,001 мкМ, 0,01 мкМ, 0,1 мкМ, 1 мкМ), и TGF-β (10 нг/мл) 2+Z-VD-FMK (10 мкМ). Статистическую значимость проверяли при использовании t-критерия Даннета (* обозначает p<0,05, и ** обозначает p<0,01, n=5).

[Фигура 17] На Фигуре 17 показан график активности каспазы 3/7. На фигуре показаны, слева направо, группа, в которой не добавляли TGF-β2, контрольная группа, TGF-β2 (10 нг/мл) + KU 0063794 (0,001 мкМ, 0,01 мкМ, 0,1 мкМ, 1 мкМ), и TGF-β2 (10 нг/мл) + Z-VD-FMK (10 мкМ). Статистическую значимость проверяли при использовании t-критерия Даннета (* обозначает p<0,05, и ** обозначает p<0,01, n=5).

[Фигура 18] На Фигуре 18 показана схематическая диаграмма отношения зрения от эндотелиальных клеток роговицы и отложения ВКМ. На диаграмме показано, что зрение ухудшается при отмирании эндотелиальных клеток роговицы и увеличении отложения ВКМ. Гипертрофия десцеметовой оболочки или образование гутт, вызванное отложением ВКМ, обычно начинает развиваться в возрасте 30-40 лет у пациентов с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса и прогрессирует в течение всей жизни пациентов. Прогрессирование приводит к нарушению зрения, такому как размытое зрение, гало, чувствительность к яркому свету или ухудшение зрения. В то время как гибель эндотелиальных клеток роговицы прогрессирует параллельно, прозрачность роговицы поддерживается остающимся эндотелием роговицы, компенсирующим насосную функцию, пока плотность эндотелиальных клеток роговицы не становится ниже чем приблизительно 1000 клеток/мм². Если плотность становится ниже чем приблизительно 1000 клеток/мм², инфильтрация водянистой влаги из переднего сегмента в роговицу приводит к отеку роговицы, приводящему к тяжелому ухудшению зрения. Существующая методика может сохранять зрительную функцию путем подавления отложения ВКМ и гибели эндотелиальных клеток роговицы.

[Фигура 19] На Фигуре 19 показан типичный пример изображения эндотелиальных клеток роговицы, наблюдаемого при контактной эндотелиальной отражательной микроскопии роговицы, с использованием модели FECD на мышах, которым капельно вводили 2 мкл глазных капель ингибитора mTOR (1 мМ) в левый и правый глаза два раза в день, утром и вечером, в течение двух месяцев. Изображение, где капельно вводили физиологический раствор (основа), показано в качестве контроля.

[Фигура 20] На Фигуре 20 показан график плотности эндотелиальных клеток роговицы (клетка/мм²) в модели FECD на мышах, которым капельно вводили глазные капли ингибитора mTOR. График, где капельно вводили физиологический раствор (основа), показан в качестве контроля. Статистическую значимость проверяли при использовании t-критерия Стьюдента (* обозначает p<0,05, n=3).

[Фигура 21] На Фигуре 21 показан график площади (%) гутт в модели FECD на мышах, которым капельно вводили глазные капли ингибитора mTOR. График, где капельно вводили физиологический раствор (основа), показан в качестве контроля. Статистическую значимость проверяли при использовании t-критерия Стьюдента (** обозначает p<0,01, n=3).

[Описание вариантов осуществления]

[0011]

Настоящее изобретение описано ниже. По всему тексту описания выражение в форме единственного числа следует понимать как охватывающее его концепцию во множественном числе, если прямо не указано иное. Таким образом, следует понимать, что формы единственного числа также охватывают их концепцию во множественном числе, если прямо не указано иное. Кроме того, следует понимать, что термины, используемые в рамках изобретения, используются в значении, которое обычно используется в данной области техники, если прямо не указано иное. Таким образом, если не определено иное, все терминологии и научно-технические термины, которые используются в рамках изобретения, имеют значение, которое находится в рамках общих знаний специалистов в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. В случае противоречия настоящее описание (включая определения) имеет преимущественную силу.

[0012]

(Определение)

При использовании в рамках изобретения "приблизительно", перед числовым значением, означает ±10% следующего числового значения.

[0013]

При использовании в рамках изобретения "ингибитор mTOR" относится к любому средству, которое ингибирует сигнализацию mTOR. Ингибитор mTOR предпочтительно является водорастворимым. Это обусловлено тем, что в случае, если ингибитор mTOR не растворяется в воде, может потребоваться использовать растворитель, который не обладает высокой биосовместимостью. Растворимость в воде можно классифицировать на основе определения растворимости в фармакопее. Другими словами, количество растворителя, требуемое для растворения 1 г или 1 мл растворяемого вещества, определяют как высокорастворимое: меньше 1 мл; легкорастворимое: 1 мл или больше и меньше 10 мл; хорошо растворимое: 10 мл или больше и меньше 30 мл; малорастворимое: 30 мл или больше и меньше 100 мл; труднорастворимое: 100 мл или больше и меньше 1000 мл; плохорастворимое: 1000 мл или больше и меньше 10000 мл; и почти нерастворимое: 10000 мл или больше. Растворимость в рамках изобретения оценивают аналогичным образом. Следует понимать, что растворимость в воде означает, что может использоваться вещество с любой растворимостью, при условии, что может быть растворено его эффективное количество, если в качестве растворителя используется вода. Такой водорастворимый компонент предпочтительно используется в форме глазных капель.

[0014]

mTOR (мишень рапамицина млекопитающих) представляет собой серин/треониновую киназу, идентифицированную как молекула-мишень рапамицина, и, как предполагают, играет основную роль в регуляции деления, выживания клеток и т.п. Также mTOR известна как SKS; FRAP; FRAP1; FRAP2; RAFT1; RAPT1, а также 2475 в качестве идентификационного номера гена в NCBI. На основе такой информации специалисты могут разрабатывать и производить различные ингибиторы mTOR.

[0015]

Ингибиторы mTOR, которые могут использоваться в настоящем изобретении, специально не ограничены, при условии, что они являются соединениями, обладающими mTOR-ингибирующей активностью. Соответствующие примеры включают: рапамицин, темсиролимус, эверолимус, PI-103, CC-223, INK128, AZD8055, KU 0063794, Вокстализиб (XL765, SAR245409), Ридафоролимус (Дефоролимус, MK-8669), NVP-BEZ235, CZ415, Торкиниб (PP242), Торин 1, Омипализиб (GSK2126458, GSK458), OSI-027, PF-04691502, Апитолизиб (GDC-0980, RG7422), WYE-354, Вистусертиб (AZD2014), Торин 2, Такролимус (FK506), GSK1059615, Гедатолизиб (PF-05212384, PKI-587), WYE-125132 (УАЙ 132), BGT226 (NVP-BGT226), Паломид 529 (P529), PP121, WYE-687, CH5132799, WAY-600, ETP-46464, GDC-0349, XL388, Зотаролимус (ОКОЛО 578) и хризофановую кислоту.

[0016]

Предпочтительные ингибиторы mTOR включают, без ограничения перечисленными, рапамицин, темсиролимус и эверолимус. Без ограничения какой-либо теорией, это обусловлено тем, что эти лекарственные средтва одобрены FDA, PMDA и т.п., и риски, связанные с аспектами безопасности и токсичности, сведены к минимуму. Еще более предпочтительным ингибитором mTOR является рапамицин. Другим предпочтительным ингибитором mTOR является темсиролимус. Другим предпочтительным ингибитором mTOR, без ограничения, является эверолимус.

[0017]

Другие примеры ингибиторов mTOR, которые могут использоваться в настоящем изобретении, включают нейтрализирующие антитела против mTOR, соединения, ингибирующие активность mTOR, соединения, ингибирующие транскрипцию гена, кодирующего mTOR (например, антисмысловые нуклеиновые кислоты, миРНК, рибозимы), пептиды, соединения с растительным компонентом, компонентом средств народной медицины, такие как средства традиционной медицины Кампо, или другие компоненты, и т.п.

[0018]

Антисмысловые нуклеиновые кислоты, используемые в настоящем изобретении, могут ингибировать экспрессию и/или функцию гена (нуклеиновые кислоты), кодирующего член сигнального пути mTOR и т.п., любым вышеописанным действием. В качестве одного варианта осуществления создание антисмысловой последовательности, комплементарной нетранслируемой области вблизи 5'-конца мРНК гена, кодирующего вышеуказанную mTOR, считается эффективным для ингибирования трансляции гена. Кроме того, также может использоваться последовательность, которая комплементарна нетранслируемой области 3' или кодирующей области. Таким образом, антисмысловые нуклеиновые кислоты, используемые в настоящем изобретении, включают не только область трансляции гена, кодирующего вышеуказанную mTOR или т.п., но также включают нуклеиновые кислоты, содержащие антисмысловую последовательность последовательности нетранслируемой области. Используемую антисмысловую нуклеиновую кислоту помещают после подходящего промотора и, предпочтительно, последовательность, содержащую сигнал терминации транскрипции, соединяют с 3'-концом. Полученная таким способом нуклеиновая кислота может быть превращена в требуемое животное (клетку животного) при использовании известного способа. Последовательность антисмысловой нуклеиновой кислоты предпочтительно является последовательностью, которая комплементарна гену, кодирующему mTOR трансформируемого животного (клетки животного) или ее часть. Однако такая последовательность не должна быть обязательно полностью комплементарной, если экспрессия гена может быть эффективно подавлена. Транскрибируемая РНК предпочтительно обладает комплементарностью, которая составляет 90% или больше, и наиболее предпочтительно 95% или больше, по отношению к транскрипту гена-мишени. Для эффективного ингибирования экспрессии гена-мишени при использовании антисмысловой нуклеиновой кислоты, предпочтительно, чтобы длина антисмысловой нуклеиновой кислоты составляла по меньшей мере 12 оснований и меньше 25 оснований. Однако антисмысловая нуклеиновая кислота согласно настоящему изобретению не должна быть обязательно ограничена этой длиной. Например, длина может составлять 11 оснований или меньше, 100 оснований или больше или 500 оснований или больше. Антисмысловая нуклеиновая кислота может состоять только из ДНК, но может содержать нуклеиновую кислоту, отличную от ДНК, такую как закрытая нуклеиновая кислота (ЗНК). В одном варианте осуществления антисмысловая нуклеиновая кислота, используемая в настоящем изобретении, может представлять собой ЗНК, содержащую антисмысловую нуклеиновую кислоту, включающую ЗНК на 5'-конце или ЗНК на 3'-конце. В варианте осуществления с применением антисмысловой нуклеиновой кислоты в настоящем изобретении антисмысловая последовательность может быть создана на основе последовательности нуклеиновой кислоты mTOR при использовании способа, описанного, например, в Hirashima and Inoue, Shin-seikagaku Jikkenn Kouza 2 [New Biochemical Experiment Course 2] Kakusan IV Idenshi 25 no Fukusei to Hatsugen [Duplication and Expression of Gene of Nucleic Acid IV], Ed. by the Japanese Biochemical Society, Tokyo Kagaku Dojin, 1993, 319-347.

[0019]

Экспрессию mTOR также можно ингибировать при использовании рибозима или ДНК, кодирующей рибозим. Рибозим относится к молекуле РНК, обладающей каталитической активностью. Хотя существуют рибозимы с различной активностью, исследование, направленное, в особенности, на рибозимы в качестве фермента для расщепления РНК, позволило создать рибозим, который сайт-специфически расщепляет РНК. Существуют рибозимы с размером 400 нуклеотидов или больше, как рибозимы интронов группы I и М1 РНК, содержащиеся в РНКазе Р, однако также существуют рибозимы с активным доменом из приблизительно 40 нуклеотидов, называемые рибозимами hammerhead (со структурой в виде головки молотка) или рибозимами, содержащими шпилечную структуру (Makoto Koizumi and Eiko Otsuka, Protein, 5 Nucleic Acid and Enzyme, 1990, 35, 2191).

[0020]

Например, саморасщепляющийся домен рибозима hammerhead расщепляет 3'-концевую область C15 последовательности, называемой G13U14C15. Образование пар оснований U14 и A9 считается важным для их активности. Также продемонстрировано, что расщепление может быть выполнено в A15 или U15 вместо C15 (Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 228, 228.) РНК-расщепляющие рибозимы, подобные рестриктазам, которые распознают последовательность UC, UU или UA в РНК-мишенях, могут быть созданы путем конструирования их субстратсвязывающих участков, комплементарных последовательности РНК вблизи сайта-мишени (Koizumi, M. et al., FEBS Lett, 1988, 239, 285., Makoto Koizumi и Eiko Otsuka, Protein, Nucleic Acid and Enzyme, 1990, 35, 2191., Koizumi, M. et al., Nucl. Acids Res., 1989, 17, 7059.)

[0021]

Шпилечные рибозимы также могут использоваться в целях настоящего изобретения. Такой рибозим обнаружен, например, в минус-цепи сателлитной РНК вируса кольцевой пятнистости табака (Buzayan, J M., Nature, 1986, 323, 349). Было продемонстрировано, что мишень-специфичные РНК-расщепляющие рибозимы также могут быть созданы из шпилеччных рибозимов (Kikuchi, Y. & Sasaki, N., Nucl. Acids Res, 1991, 19, 6751, Yo Kikuchi, Kagaku to Seibutsu [Chemistry and Biology], 1992, 30, 112). Таким образом, экспрессию гена, кодирующего mTOR и т.п. можно ингибировать при специфичном расщеплении транскрипта гена с помощью рибозима.

[0022]

Экспрессия эндогенного гена mTOR также может быть подавлена с помощью РНК-интерференции (далее сокращенно обозначаемой "РНКи") при использовании двухцепочечной РНК, имеющей последовательность, идентичную или сходную с последовательностью гена-мишени. РНКи представляет собой методику, которая привлекает внимание в настоящее время, которая может подавлять экспрессию гена, имеющего последовательность, которая гомологична двухцепочечной РНК (дцРНК), когда дцРНК попадает непосредственно в клетку. В клетках млекопитающих короткоцепочечная дцРНК (миРНК) может использоваться для индукции РНКи. РНКи имеет много преимуществ по сравнению с нокаутными мышами, такие как стабильное действие, упрощение эксперимента и низкая стоимость. миРНК подробно обсуждаются в других частях описания.

[0023]

При использовании в рамках изобретения "миРНК" представляет собой молекулу РНК, имеющую двухцепочечный участок РНК, состоящий из 15-40 оснований, где миРНК выполняет функцию расщепления мРНК гена-мишени с последовательностью, комплементарной антисмысловой цепи миРНК, для подавления экспрессии гена-мишени. В частности, миРНК в настоящем изобретении представляет собой РНК, содержащую двухцепочечный участок РНК, состоящий из смысловой цепи РНК, состоящей из последовательности, гомологичной последовательно расположенным последовательностям РНК в мРНК mTOR, и антисмысловой цепи РНК, состоящей из последовательности, комплементарной смысловой последовательности РНК. Разработка и производство такой миРНК и мутантной миРНК, обсуждаемые ниже, находятся в рамках технической компетенции специалистов в данной области. Любые последовательные области РНК в мРНК, которые являются транскриптом последовательности mTOR, могут быть соответствующим образом выбраны для получения двухцепочечной РНК, соответствующей этой области, что находится в пределах стандартной процедуры, выполняемой специалистами в данной области. Кроме того, специалисты в данной области техники могут соответствующим образом подобрать последовательность миРНК, обладающую более сильным РНКи эффектом, из последовательностей мРНК, которые являются транскриптами данной последовательности, с помощью известного способа. Кроме того, если определена одна из цепей, специалисты в данной области могут легко найти последовательность оснований другой цепи (комплементарной цепи). МиРНК может быть соответствующим образом получена с применением доступного в продаже синтезатора нуклеиновых кислот. Общедоступная услуга синтеза также может использоваться для синтеза нужной РНК.

[0024]

Что касается оснований, то длина двухцепочечной части РНК составляет от 15 до 40 оснований, предпочтительно от 15 до 30 оснований, более предпочтительно от 15 до 25 оснований, еще более предпочтительно от 18 до 23 оснований и наиболее предпочтительно от 19 до 21 оснований. Следует понимать, что верхние границы и нижние границы не ограничены такими конкретными пределами и могут быть любой комбинацией указанных пределов. Концевая структура смысловой цепи или антисмысловой цепи миРНК конкретно не ограничена и может быть соответствующим образом выбрана в соответствии с целью. Например, такая концевая структура может иметь тупой конец или липкий конец (выступающий конец). Тип, в котором 3'-конец выступающий, является предпочтительным. МиРНК, имеющая выступающий конец, который состоит из нескольких оснований, предпочтительно от 1 до 3 оснований и более предпочтительно из 2 оснований на 3'-конце смысловой цепи РНК и антисмысловой цепи РНК, является предпочтительным, поскольку имеет сильный эффект подавления экспрессии гена-мишени во многих случаях. Тип оснований в выступающем конце специально не ограничен, при этом они могут быть либо основанием, входящим в состав РНК, либо основанием, входящим в состав ДНК. Пример предпочтительной выступающей концевой последовательности включает dTdT на 3'-конце (2 п.н. дезокси-T) и т.п. Примеры предпочтительной миРНК включают, без ограничения перечисленными, все миРНК с dTdT (2 п.н. дезокси-Т) на 3'-конце смысловой или антисмысловой цепей миРНК.

[0025]

Кроме того, также можно использовать миРНК, в которой от одного до нескольких нуклеотидов удалены, заменены, вставлены и/или добавлены в одну или обе из смысловой цепи и антисмысловой цепи миРНК, описанной выше. От одного до нескольких оснований, используемых в данном документе, конкретно не ограничены, но предпочтительно относятся к 1-4 основаниям, более предпочтительно 1-3 основаниям и наиболее предпочтительно 1-2 основаниям. Конкретные примеры таких мутаций включают, без ограничения перечисленными, мутации, дающие 0-3 оснований в 3'-выступающей части, мутации, которые изменяют последовательность оснований 3'-выступающей части с получением другой последовательности оснований, мутации, в которых длины описанной выше смысловой цепи РНК и антисмысловой цепи РНК различаются на 1-3 основания в результате вставки, добавления или удаления оснований, мутаций с заменой основания в смысловой цепи и/или антисмысловой цепи другим основанием и т.п. Однако необходимо, чтобы смысловая цепь и антисмысловая цепь могли гибридизоваться с такими мутантными миРНК, и такие мутантные миРНК обладали способностью подавлять экспрессию генов, которая эквивалентна такой способности миРНК без каких-либо мутаций.

[0026]

МиРНК также может быть молекулой со структурой, в которой один конец закрыт, такой как миРНК со структурой шпильки (короткая шпилечная РНК; мшРНК). МшРНК представляет собой РНК, содержащую РНК смысловой цепи со специфической последовательностью гена-мишени, РНК антисмысловой цепи, состоящую из последовательности, комплементарной последовательности смысловой цепи, и линкерную последовательность для соединения двух цепей, где участок смысловой цепи гибридизуется с антисмысловой цепью с образованием двухцепочечной части РНК.

[0027]

Желательно, чтобы миРНК не проявляла так называемого нецелевого эффекта при клиническом применении. Нецелевой эффект относится к действию подавления экспрессии другого гена кроме гена-мишени, который частично гомологичен используемой миРНК. Чтобы избежать нецелевого эффекта, можно подтвердить, что кандидатная миРНК не обладает перекрестной реактивностью, при использовании ДНК-чипа и т.п. Кроме того, можно избежать нецелевого эффекта при подтверждении присутствия гена, содержащего фрагмент, который обладает высокой гомологией с последовательностью кандидатной миРНК, отличного от гена-мишени, при использовании известной базы данных, предоставленной NCBI (Национальным центром биотехнологической информации США) и т.п.

[0028]

Для получения миРНК в соответствии с настоящим изобретением, можно соответствующим образом использовать известный способ, такой как способ с применением химического синтеза или способ с применением технологии рекомбинации генов. С помощью способа с использованием синтеза, двухцепочечная РНК может быть синтезирована на основе информации о последовательности с применением стандартного способа. С помощью способа с использованием метода рекомбинации генов, миРНК может быть получена путем конструирования вектора экспрессии, кодирующего последовательность смысловой цепи или последовательность антисмысловой цепи, и введения вектора в клетку-хозяина с последующим получением каждой из смысловой цепи РНК и антисмысловой цепи РНК, полученных в результате транскрипции. Также можно получить требуемую двухцепочечную РНК путем экспрессии мшРНК, образующей шпилечную структуру, содержащую смысловую цепь конкретной последовательности гена-мишени, антисмысловую цепь, состоящую из последовательности, комплементарной последовательности смысловой цепи, и линкерную последовательность для соединения двух цепей.

[0029]

В отношении миРНК, вся или часть нуклеиновой кислоты, составляющей миРНК, может быть природной или модифицированной нуклеиновой кислотой, при условии, что такая нуклеиновая кислота обладает активностью, обеспечивающей подавление экспрессии гена-мишени.

[0030]

МиРНК согласно настоящему изобретению не должна обязательно быть парой двухцепочечных РНК к последовательности-мишени. Она может быть смесью множества пар ("множество" специально не ограничено, но предпочтительно относится к небольшому количеству, приблизительно 2-5) двухцепочечных РНК к области, включающей последовательность-мишень. В этом отношении специалисты в данной области могут соответствующим образом получить миРНК в виде смеси нуклеиновых кислот, соответствующих последовательности-мишени, при использовании доступного в продаже синтезатора нуклеиновых кислот и фермента DICER. Общедоступная услуга синтеза также может использоваться для синтеза нужной РНК. Следует отметить, что миРНК согласно настоящему изобретению охватывает так называемую "смесь миРНК". В отношении миРНК согласно настоящему изобретению не все нуклеотиды должны быть рибонуклеотидами (РНК). Другими словами, в настоящем изобретении один или множество рибонуклеотидов, входящих в состав миРНК, могут быть соответствующим дезоксирибонуклеотидом. Данный термин "соответствующий" относится к содержанию такого же типа основания (аденина, гуанина, цитозина, тимина (урацила)), но с другой структурой сахарного остатка. Например, дезоксирибонуклеотид, соответствующий рибонуклеотиду, содержащему аденин, относится к дезоксирибонуклеотиду, содержащему аденин.

[0031]

Кроме того, ДНК (вектор), которая может экспрессировать описанную выше РНК согласно настоящему изобретению, также включена в качестве предпочтительного варианта осуществления нуклеиновой кислоты, которая может подавлять экспрессию mTOR и т.п. Например, ДНК (вектор), которая может экспрессировать описанную выше двухцепочечную РНК согласно настоящему изобретению, представляет собой ДНК, имеющую структуру, в которой ДНК, кодирующая одну из цепей двухцепочечной РНК, и ДНК, кодирующая другую цепь двухцепочечной РНК, соединена с промотором, в результате чего каждая из этих ДНК может экспрессироваться. Вышеописанная ДНК в соответствии с настоящим изобретением может быть надлежащим образом получена специалистами в данной области при использовании стандартной методики генной инженерии. Более конкретно, вектор экспрессии в соответствии с настоящим изобретением может быть получен путем соответствующей вставки ДНК, кодирующей представляющую интерес РНК, в различные известные векторы экспрессии.

[0032]

В настоящем изобретении модифицированная нуклеиновая кислота может использоваться в качестве нуклеиновой кислоты для подавления экспрессии гена-мишени. Модифицированная нуклеиновая кислота относится к нуклеиновой кислоте, которая имеет модификацию нуклеозида (остатка основания, остатка сахара) и/или межнуклеозидного связывающего сайта, и имеет структуру, которая отличается от структуры природной нуклеиновой кислоты. Примеры "модифицированного нуклеозида", входящего в состав модифицированной нуклеиновой кислоты, включают: абазические нуклеозиды; арабинонуклеозид, 2'-дезоксиуридин, α-дезоксирибонуклеозид, β-L-дезоксирибонуклеозид и другие нуклеозиды, содержащие модификацию сахара; пептидо-нуклеиновые кислоты (ПНК), связывающие фосфатную группу пептидо-нуклеиновые кислоты (PHONA), закрытые нуклеиновые кислоты (ЗНК), морфолино-нуклеиновые кислоты и т.п. Вышеуказанные нуклеозиды, имеющие модификацию сахара, включают 2'-O-метилрибозу, 2'-дезокси-2'-фторрибозу, 3'-O-метилрибозу и другие замещенные пентозы; 1',2'-дезоксирибозу; арабинозу; замещенный арабинозный сахар; и нуклеозид, имеющий модификацию сахара альфа-аномера и гексозы. Такие нуклеозиды могут быть модифицированным основанием, в котором остаток основания модифицирован. Примеры таких модифицированных оснований включают пиримидин, такой как 5-гидроксицитозин, 5-фторурацил и 4-тиоурацил; пурин, такой как 6-метиладенин и 6-тиогуанозин; другие гетероциклические основания и т.п.

[0033]

Примеры "модифицированной межнуклеозидной связи", которая входит в состав модифицированной нуклеиновой кислоты, включают алкильный линкер, глицерильный линкер, аминолинкер, поли-(этиленгликолевую) связь, межнуклеозидную метилфосфонатную связь; и связи между неприродными нуклеозидами, такие как метилфосфонотиоат, фосфотриэфир, фосфотиотриэфир, фосфотиоат, фосфодитиоат, триэфирное пролекарство, сульфон, сульфонамид, сульфамат, формацеталь, N-метилгидроксиламин, карбонат, карбамат, морфолино, боранофосфат, и фосфорамидат.

[0034]

Последовательность нуклеиновой кислоты, содержащаяся в двухцепочечной миРНК согласно настоящему изобретению, включает миРНК к mTOR, другим участникам сигнального пути mTOR и т.п.

[0035]

Также нуклеиновую кислоту или средство согласно настоящему изобретению можно ввести в фосфолипидный эндоплазматический ретикулум, такой как липосому, и ввести эндоплазматический ретикулум. Эндоплазматический ретикулум, в котором сохраняется миРНК или мшРНК, может быть введен в заданную клетку с помощью липофекции. Полученную клетку затем вводят системно, например, внутривенно, внутриартериально и т.п. Его также можно вводить местно в нужный участок глаза и т.п. Хотя миРНК демонстрирует очень хорошее специфичное действие после транскрипции in vitro, миРНК быстро разрушается in vivo из-за нуклеазной активности в сыворотке, поэтому продолжительность ее действия ограничена. Таким образом, существует потребность в разработке более совершенной и более эффективной системы доставки. В качестве примера в публикации Ochiya, T et al., Nature Med., 5: 707-710, 1999, Curr. Gene Ther., 1: 31-52, 2001 сообщают, что биосовместимый материал ателоколлаген, при смешивании с нуклеиновой кислотой с образованием комплекса, является носителем, который защищает нуклеиновую кислоту от разрушающего фермента в живом организме и особенно подходит в качестве носителя для миРНК. Хотя такая форма может использоваться, способ введения нуклеиновой кислоты, терапевтического или профилактического лекарственного средства согласно настоящему изобретению не ограничивается этим. Таким образом, благодаря быстрому разложению при воздействии нуклеазы в сыворотке в живом организме становится возможным обеспечить продолжение действия в течение длительного периода времени. Например, в публикации Takeshita F. PNAS, (2003) 102 (34) 12177-82, Minakuchi Y Nucleic Acids Research (2004) 32 (13) e109 сообщают, что ателоколлаген, полученный из кожи коров, образует комплекс с нуклеиновой кислотой, который обеспечивает защиту нуклеиновой кислоты от разрушающего фермента в живом организме и особенно подходит в качестве носителя для миРНК. Такая технология может быть использована.

[0036]

При использовании в рамках изобретения "iFECD" (иммортализованная линия эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса) является сокращенным обозначением иммортализованных клеток эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса. Способ получения iFECD описан, например, в WO 2015/015655.

[0037]

При использовании в рамках изобретения "HCEC" (эндотелиальные клетки роговицы человека) является сокращенным обозначением человеческих эндотелиальных клеток роговицы. Кроме того, "iHCEC" является сокращенным обозначением иммортализованных человеческих эндотелиальных клеток роговицы.

[0038]

При использовании в рамках изобретения "программируемая гибель клеток" относится к феномену, при котором клетки спонтанно погибают в определенное время или в определенном окружении, как будто их гибель была запрограммирована. Программируемая гибель клеток используется в значении, которое включает, например, "апоптоз".

[0039]

При использовании в рамках изобретения "трансформирующий фактор роста β (также указанный сокращением TGF-β)" используется в том же значении, какое используется в уровне техники. Это - гомодимерный многофункциональный цитокин с молекулярной массой 25 кДа, проявляющий разнообразную биологическую активность, например, он отвечает за патогенез различных склеротических заболеваний, ревматоидного артрита и пролиферативной витреоретинопатии, активно участвует в алопеции, подавлении функции иммунокомпетентных клеток с одновременным подавлением избыточной продукции протеазы для профилактики разрушения легочной ткани, приводящего к эмфиземе легких, и в подавлении роста раковых клеток. "Сигнал TGF-β" относится к сигналу, опосредуемому TGF-β, который вызывает TGF-β. Примеры сигналов TGF-β включают сигналы, опосредованные TGF-β2, в дополнение к сигналам, опосредованным TGF-β1, TGF-β3 и т.п. У людей TGF-β имеет три изоформы, TGF-β1 - β3, которые обладают приблизительно 70% гомологией и сходной активностью. TGF-β синтезируется в неактивной латентной форме с молекулярной массой приблизительно 300 кДа, которая неспособна связываться с рецептором. Его действие проявляется при активации на поверхности клетки-мишени или в ее окружении, при этом он переходит в активную форму, которая может связываться с рецептором.

[0040]

Без ограничения какой-либо теорией, действие TGF-β в клетке-мишени, как предполагают, передается путем фосфорилирования ряда белков, ответственных за передачу информации, называемых Smad. Вначале, когда активированный TGF-β связывается с рецептором TGF-β II типа на поверхности клетки-мишени, формируется рецепторный комплекс, состоящий из двух молекул рецепторов II типа и двух молекул рецепторов TGF-β I типа, при этом рецепторы II типа фосфорилируют рецепторы I типа. Необходимо понимать, что когда фосфорилированные рецепторы I типа фосфорилируют Smad2 или Smad3, фосфорилированный Smad2 или Smad3 образует комплекс с Smad4, где комплекс перемещается в ядро и связывается с последовательностью-мишенью, называемой CAGA-бокс, которая присутствует в промоторной области гена-мишени, вызывая индукцию транскрипции и экспрессию гена-мишени с помощью коактиватора.

[0041]

Сигнальный путь трансформирующего фактора роста-β (TGF-β) может модулировать различные клеточные активности, такие как рост и дифференцировку клеток, остановку роста, программируемую гибель клеток и эпителиально-мезенхимальный переход (EMT), путем модуляции гена-мишени. Члены семейства TGF-β, включая сам TGF-β (например, TGF-β1, TGF-β2 и TGF-β3), активин и костный морфогенетический белок (BMP), являются мощными модуляторами роста, дифференцировки, миграции клеток, программируемой гибели клеток и т.п.

[0042]

TGF-β представляет собой белок массой приблизительно 24 кДа, вырабатываемый многими клетками, в том числе B-лимфоцитами, T-лимфоцитами и активированными макрофагами, и многими другими типами клетки. Действие TGF-β на иммунную систему включает индукцию рецептора IL-2, ингибирование вызванного IL-1 роста тимоцитов и блокирование вызванной IFN-γ активации макрофагов. Считается, что TGF-β участвует в различных патологических состояниях (Border et al. (1992) J. Clin. Invest. 90:1) и, как было полностью доказано, функционирует либо как вещество, подавляющее опухоли, либо как фактор, способствующий развитию опухоли.

[0043]

Сигнализация TGF-β опосредована двумя серин/треонинкиназными рецепторами клеточной поверхности, TGF-βRII и ALK5. Сигнализация TGF-β инициируется лиганд-индуцированной димеризацией рецептора, которая позволяет TGF-βRII фосфорилировать рецептор ALK5. Фосфорилирование активирует ALK5-киназную активность, и активированная ALK5 затем фосфорилирует нижестоящий эффекторный белок Smad (гомолог у позвоночных белка MAD или "Матери против DPP (мутации decapentaplegic)"), Smad2 или Smad3. Комплекс p-Smad2/3 с Smad4 проникает в ядро и активирует транскрипцию гена-мишени.

[0044]

Smad3 является членом подгруппы R-Smad (рецептор-активируемого Smad) семейства Smad и прямым медиатором активации транскрипции рецептором TGF-β. Стимуляция TGF-β приводит к фосфорилированию и активации Smad2 и Smad3, которые образуют комплекс с Smad4 ("общий Smad" или "co-Smad" у позвоночных). Он накапливается в ядре и модулирует транскрипцию гена-мишени. R-Smad локализуется в цитоплазме и образует комплекс с co-Smad посредством лиганд-индуцированного фосфорилирования рецептором TGF-β, мигрирует в ядро, где модулирует экспрессию генов, связанных с кооперативным фактором транскрипции и хроматином. Smad6 и Smad7 являются ингибирующими Smad ("I-Smad"), то есть они транскрипционно индуцируются TGF-β и функционируют в качестве ингибитора сигнализации TGF-β (Feng et al. (2005) Annu. Rev. Cell. Dev. Biol 21: 659). Smad6/7 блокирует рецептор-опосредованную активацию R-Smad, в результате которой он оказывает свое ингибирующее действие; и они связываются с рецептором I типа, который конкурентно препятствует мобилизации и фосфорилированию R-Smad. Известно, что Smad6 и Smad7 восполняют убиквитинлигазу E3, которая индуцирует убиквитинирование и деградацию белков, взаимодействующих с Smad6/7.

[0045]

Сигнальные пути TGF-β также включают другие пути, использующие переход при воздействии BMP-7, и т.п., которые идут через ALK-1/2/3/6 для экспрессии функции через Smad1/5/8. По поводу сигнальных путей TGF-β см. J. Massagu'e, Annu. Rev. Biochem. 1998. 67: 753-91; Vilar JMG, Jansen R, Sander C (2006) PLoS Comput Biol 2(1): e3; Leask, A., Abraham, D. J. FASEB J. 18, 816-827 (2004); Coert Margadant & Arnoud Sonnenberg EMBO reports (2010)11, 97-105; Joel Rosenbloom et al., Ann Intern Med. 2010; 152: 159-166 и т.п.

[0046]

При использовании в рамках изобретения термин "глазное патологическое состояние, нарушение или заболевание" относится к любому глазному патологическому состоянию, нарушению или заболеванию. Глазное патологическое состояние, нарушение или заболевание является патологическим состоянием, нарушением или заболеванием, например, в сетчатке, жидкости стекловидного тела, хрусталике, роговице, склере или другой части глаза. Ингибитор mTOR в настоящем изобретении может быть особенно эффективным против патологического состояния, нарушения или заболевания эндотелия роговицы.

[0047]

При использовании в рамках изобретения "патологическое состояние, нарушение или заболевание эндотелия роговицы, опосредованное трансформирующим фактором роста β (TGF-β)" относится к любому патологическому состоянию, нарушению или заболеванию эндотелия роговицы, вызванному TGF-β в эндотелиальных клетках роговицы. В настоящем изобретении воздействие фактора TGF-β2 на эндотелиальные клетки роговицы, такие как клетки в модели эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса (например, iFECD), неожиданно приводило к различным нарушениям (например, программируемой гибели клеток). Это явление не было понято в достаточной мере. Авторы изобретения после дополнительного анализа патологического состояния, нарушения или заболевания эндотелия роговицы, опосредованных сигналом TGF-β, неожиданно обнаружили, что такое нарушение можно подавить ингибитором mTOR. Патологическое состояние, нарушение или заболевание эндотелия роговицы, опосредованные сигналом TGF-β, ассоциированы с другим сигнальным путем mTOR. Примеры патологических состояний, нарушений или заболеваний эндотелия роговицы, опосредованных сигналом TGF-β, включают, без ограничения перечисленными, эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса, нарушение после трансплантации роговицы, эндотелиит роговицы, травму, нарушение после глазной хирургии, нарушение после глазной лазерной хирургии, старение, заднюю полиморфную дистрофию (PPD), врожденную наследственную эндотелиальную дистрофию (CHED), идиопатическое эндотелиальное заболевание роговицы, цитомегаловирусный эндотелиит роговицы и т.п., при которых наблюдается экспрессия TGF-β. Поскольку нарушение, обнаруженное в настоящем изобретении, или нарушение, связанное с ним, считается выраженным или повышенным, особенно в эндотелиальных клетках роговицы или эндотелиальной ткани роговицы с повышенной, по сравнению с нормальной, экспрессией TGF-β2, любое патологическое состояние, нарушение или заболевание эндотелия роговицы, при котором такие наблюдаемые эндотелиальные клетки или эндотелиальная ткань роговицы особенно предназначены в качестве мишени согласно настоящему изобретению.

[0048]

При использовании в рамках изобретения "избыточная экспрессия внеклеточного матрикса в эндотелиальных клетках роговицы" относится к экспрессии внеклеточного матрикса на патологическом уровне по сравнению с внеклеточными уровнями экспрессии матрикса в нормальных эндотелиальных клетках роговицы. "Экспрессия внеклеточного матрикса на патологическом уровне" относится к продукции внеклеточных матриксных белков, таких как фибронектин, в количестве, превышающем количество, образующееся во внеклеточном матриксе в нормальной форме. Статус продкуции не включает стимуляцию, а также повышение уровня экспрессии из-за ответа на трансформирующий фактор роста (TGF) β при необходимости. Например, она может составлять приблизительно 1,1 раза или больше, приблизительно 1,2 раза или больше, приблизительно 1,3 раза или больше, приблизительно 1,4 раза или больше, приблизительно 1,5 раза или больше, приблизительно 1,6 раза или больше, приблизительно 1,7 раза или больше, приблизительно 1,8 раза или больше, приблизительно 1,9 раза или больше, или приблизительно 2,0 раза или больше относительно количества внеклеточного матрикса при нормальных обстоятельствах для эндотелиальных клеток роговицы человека. Оличие от нормальных значений предпочтительно является, но не обязательно, статистически значимым. Достаточно, чтобы различие являлось медицински значимым отличием.

[0049]

При использовании в рамках изобретения "эндотелиальное нарушение роговицы вследствие избыточной экспрессии внеклеточного матрикса (ВКМ)" или соответствующее "состояние" в основном представляет собой нарушение, связанное с гипертрофией, отложением, помутнением, вызванным внеклеточным матриксом и т.п., или соответствующим состоянием, которое приводит к образованию гутт на поверхности эндотелия роговицы, гипертрофии десцеметовой оболочки, такой как мутные гутты десцеметовой оболочки и т.п., и связано с состоянием, которое вызывает ухудшение зрения. При эндотелиальных нарушениях роговицы, таких как дистрофия роговицы Фукса, избыточная продукция внеклеточного матрикса ухудшает зрение или зрительное ощущение даже без уменьшения количества клеток, в отличие от обострения состояния, вызванного гибелью (в особенности апоптозом) эндотелиальных клеток роговицы. Таким образом, даже если гибель клеток может быть подавлена, это необходимо учитывать. "Эндотелиальное нарушение роговицы вследствие избыточной продукции внеклеточного матрикса (ВКМ)" и соответствующее "состояние" включают, без ограничения перечисленными, помутнение, рубец, помутнение роговицы, пятно роговицы, бельмо роговицы и т.п.

[0050]

В предпочтительном варианте осуществления патологического состояния, нарушения или заболевания, являющиеся целью настоящего изобретения, представляют собой нарушения, связанные с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса. Было продемонстрировано, что индукция TGF-β в эндотелиальных клетках роговицы играет роль в развитии эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса. Также было продемонстрировано, что индукция TGF-β может участвовать в потере клеток при FECD. Поэтому ингибирование сигнального пути TGF-β, как естественно ожидают, будет эффективной терапией при FECD. Однако авторы изобретения неожиданно обнаружили, что ингибитор mTOR может подавлять нарушение, опосредованное сигналом TGF-β.

[0051]

Поскольку лекарственное средство согласно настоящему изобретению может лечить повреждение клеток и т.п., которое индуцировано TGF-β2, что может быть одной из основных причин аномалий или нарушений при эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, следует понимать, что лекарственное средство может использоваться для лечения или профилактики эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса. В частности, настоящее изобретение способно подавлять повреждение клеток или программируемую гибель клеток, вызванную TGF-β2, в модели дистрофии роговицы эндотелия Фукса, в Примерах, поэтому настоящее изобретение можно считать подходящим для применения в терапии пациентов с тяжелым TGF-β2-ассоциированным заболеванием в модели дистрофии роговицы эндотелия Фукса. Лекарственное средство согласно настоящему изобретению также может неожиданно подавлять избыточную экспрессию внеклеточного матрикса (ВКМ), поэтому лекарственное средство может лечить или предотвращать нарушение и т.п. в эндотелии роговицы, такое как отложение ВКМ в десцеметовой оболочке. Таким образом, настоящее изобретение может лечить или предотвращать повреждение эндотелиальных клеток роговицы при эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, снижении плотности эндотелия роговицы, образовании гутт, гипертрофии десцеметовой оболочки, гипертрофии роговицы, эпителиальном нарушении роговицы, мутности, рубце, мутности стромы роговицы, светобоязни, размытом зрении, нарушении зрения, офтальмалгии, эпифоре, гиперемии, боли, буллезной кератопатии, ощущении дискомфорта в глазах, уменьшении контрастности зрения, гало, чувствительности к яркому свету, отеке стромы роговицы и т.п.

[0052]

(Общие методики)

Методики молекулярной биологии, методики биохимии, методики микробиологии, используемые в рамках изобретения, хорошо известны и традиционно используются в данной области, и описаны, например, в Sambrook J. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor and 3rd Ed. thereof (2001); Ausubel, F.M. (1987). Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Ausubel, F.M. (1989). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience; Innis, M.A. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F.M. (1992). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F.M. (1995). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M.A. et al. (1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F.M. (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, and annual updates; Sninsky, J.J. et al. (1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press, Gait, M.J. (1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M.J. (1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F. (1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, R.L. et al. (1992). The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall; Shabarova, Z. et al. (1994). Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G.M. et al. (1996). Nucleic Acids in Chemistry and Biology, Oxford University Press; Hermanson, G.T. (1996). Bioconjugate Techniques, Academic Press, Bessatsu Jikken Igaku [Experimental Medicine, Supplemental Volume], Idenshi Donyu & Hatsugen Kaiseki Jikken Ho [Experimental Methods for Transgenesis & Expression Analysis], Yodosha, 1997, и т.п. Сообщения Nancy Joyce с соавт. {Joyce, 2004 #161} и {Joyce, 2003 #7} хорошо известны в области эндотелиальных клеток роговицы. Однако, как обсуждалось выше, длительное культивирование или субкультивирование приводят к фибробластоподобной трансформации, и в настоящее время продолжаются исследования в поисках эффективного метода культивирования. Соответствующие их части (которые могут быть всем документом) включены в настоящий документ посредством отсылки.

[0053]

(Описание предпочтительных вариантов осуществления)

Далее описаны предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения. Следует понимать, что варианты осуществления являются иллюстративными примерами настоящего изобретения, таким образом, объем настоящего изобретения не ограничен такими предпочтительными вариантами осуществления. Нужно понимать, что специалисты в данной области могут обратиться к следующим предпочтительным вариантам осуществления, чтобы с легкостью осуществить модификации или изменения в рамках настоящего изобретения. Специалисты в данной области могут соответствующим образом комбинировать любые из этих вариантов осуществления настоящего изобретения.

[0054]

<Лекарственное средство>

В одном аспекте настоящего изобретения предложена композиция для применения в профилактике или лечении глазного патологического состояния, нарушения или заболевания, включающая ингибитор mTOR. В частности, ингибитор mTOR эффективен против патологического состояния, нарушения или заболевания в эндотелии роговицы.

[0055]

Хотя считается, что mTOR участвует в передаче сигналов внутри клетки и отвечает за регуляцию митоза клетки, выживания клетки и т.п., механизм его действия в эндотелии роговицы не изучен. Таким образом, оказалось неожиданным и удивительным, что ингибитор mTOR эффективен при лечении и профилактике глазных заболеваний, нарушений или патологических состояний, в особенности эндотелия роговицы.

[0056]

В одном варианте осуществления эндотелиальное патологическое состояние, нарушение или заболевание роговицы, опосредованные трансформирующим фактором роста β (TGF-β) в эндотелиальных клетках роговицы, выбрано из группы, состоящей из эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, нарушения после трансплантации роговицы, эндотелиита роговицы, травмы, нарушения после глазной хирургии, нарушения после глазной лазерной хирургии, старения, задней полиморфной дистрофии (PPD), врожденной наследственной эндотелиальной дистрофии (CHED), идиопатического эндотелиального нарушения роговицы и цитомегаловирусного эндотелиита роговицы.

[0057]

В другом предпочтительном варианте осуществления настоящего изобретения предложено лекарственное средство, обладающее действием и эффективностью при лечении или профилактике патологического состояния, вызванного суперэкспрессией внеклеточного матрикса, при эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, для применения при лечении или профилактике такого состояния или в способе лечения или профилактике такого состояния. Примеры такого состояния включают гутты на поверхности эндотелия роговицы, мутные гутты десцеметовой оболочки, гипертрофию десцеметовой оболочки, размытость зрения, гало, чувствительность к яркому свету, ухудшение зрения, помутнение роговицы, бельмо, нарушения зрительного ощущения и т.п. Патологические состояния, вызванные избыточной продукцией внеклеточного матрикса, дополнительно обсуждаются ниже.

[0058]

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к лекарственному средству для лечения или профилактики патологического состояния, нарушения или заболевания эндотелия роговицы, вызванного суперэкспрессией внеклеточного матрикса в клетках эндотелия роговицы, содержащему ингибитор mTOR. Как обсуждалось выше, ингибитор mTOR может лечить или предотвращать эндотелиальное нарушение роговицы и т.п., опосредованное сигналом TGF-β, однако оказалось неожиданным, что ингибитор mTOR также может подавлять избыточную экспрессию внеклеточного матрикса в эндотелиальных клетках роговицы. Это говорит о том, что ингибитор mTOR может одновременно лечить эндотелиальные нарушения роговицы, опосредованные сигналом TGF-β и суперэкспрессией внеклеточного матрикса в эндотелиальных клетках роговицы. В частности, эндотелиальная дистрофия роговицы Фукса представляет собой заболевание, при котором плотность эндотелиальных клеток роговицы значительно снижается из-за сигнала TGF-β, а внеклеточный матрикс откладывается в десцеметовой оболочке, что приводит к образованию гутт роговицы и гипертрофии десцеметовой оболочки. По этой причине подавление избыточной экспрессии внеклеточного матрикса означает, что терапия и профилактика эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса может быть значительно улучшена, и в некоторых случаях возможно полное излечение. Также можно уменьшать, лечить или предотвращать образование гутт роговицы и гипертрофию десцеметовой оболочки, а также другие состояния, связанные с помутнением или отложением (необратимым помутнением стромы роговицы вследствие длительного отека роговицы и т.п.), которые могут возникать вследствие избыточной продукции внеклеточного матрикса при эндотелиальных нарушениях роговицы, таких как эндотелиальная дистрофия роговицы Фукса.

[0059]

В одном варианте осуществления патологическое состояние, нарушение или заболевание эндотелия роговицы, вызванные суперэкспрессией внеклеточного матрикса в эндотелиальных клетках роговицы, могут быть обусловлены суперэкспрессией фибронектина в эндотелиальных клетках роговицы.

[0060]

В одном варианте осуществления патологическое состояние, нарушение или заболевание эндотелия роговицы, вызванное суперэкспрессией внеклеточного матрикса в эндотелиальных клетках роговицы, выбрано из группы, состоящей из эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, образования гутт, гипертрофии десцеметовой оболочки, гипертрофии роговицы, мутности, рубца, мутности в строме роговицы, эпителиального отека роговицы, эпителиального нарушения роговицы, светобоязни и размытого зрения.

[0061]

В другом аспекте настоящего изобретения предложено лекарственное средство для применения в лечении или профилактике эндотелиального патологического состояния, нарушения или заболевания роговицы, опосредованного сигналом TGF-β и суперэкспрессией внеклеточного матрикса в эндотелиальных клетках роговицы, включающее ингибитор mTOR. ингибитор mTOR может одновременно лечить или предотвратить эндотелиальные нарушения роговицы, опосредованные сигналом TGF-β и суперэкспрессией внеклеточного матрикса в эндотелиальных клетках роговицы.

[0062]

В одном варианте осуществления патологическое состояние, нарушение или заболевание эндотелия роговицы, опосредованное сигналом TGF-β и суперэкспрессией внеклеточного матрикса в эндотелиальных клетках роговицы, выбрано из группы, состоящей из эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, другой эндотелиальной дистрофии роговицы и эндотелиального нарушения роговицы, вызванного лекарственным средством, хирургическим вмешательством, травмой, инфекцией, увеитом и т.п.

[0063]

В одном варианте осуществления патологическое состояние, нарушение или заболевание эндотелия роговицы, опосредованное сигналом TGF-β и суперэкспрессией внеклеточного матрикса в эндотелиальных клетках роговицы, включает эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса. Эндотелиальная дистрофия роговицы Фукса является заболеванием, при котором плотность эндотелиальных клеток роговицы значительно снижается из-за сигнала TGF-β, при этом внеклеточный матрикс откладывается в десцеметовой оболочке, приводя к нарушению, такому как гутты роговицы и гипертрофия десцеметовой оболочки. Поэтому супрессия избыточной экспрессии внеклеточного матрикса означает, что терапия может значительно уменьшать эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса и вызывать полное излечение в некоторых случаях. Уменьшение нарушения и т.п., такого как гутты роговицы и гипертрофия десцеметовой оболочки при эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, с применением ингибитора mTOR вызывает качественное уменьшение глазного заболевания и обеспечивает нетрадиционное терапевтическое действие против заболевания, такого как эндотелиальная дистрофия роговицы Фукса, которое представляло угрозу.

[0064]

В одном варианте осуществления примеры способов применения настоящего изобретения включают, без ограничения перечисленным, глазные капли, а также способы введения, такие как инъекция в переднюю камеру глаза, пропитка средства с контролируемым высвобождением, субконъюнктивальную инъекцию и системное введение (прием внутрь и внутривенная инъекция).

[0065]

В одном варианте осуществления ингибитор mTOR, применяемый в настоящем изобретении, может быть любым типом ингибитора mTOR, при условии, что он эффективен при лечении или профилактике данного глазного патологического состояния, нарушения или заболевания (например, эндотелия роговицы). Определенные ингибиторы mTOR включают по меньшей мере один, выбранный из группы, состоящей из рапамицина, темсиролимуса, эверолимуса, PI-103, CC-223, INK128, AZD8055, KU 0063794, Вокстализиба (XL765, SAR245409), Ридафоролимуса (Дефоролимуса, MK-8669), NVP-BEZ235, CZ415, Торкиниба (PP242), Торина 1, Омипализиба (GSK2126458, GSK458), OSI-027, PF-04691502, Апитолизиба (GDC-0980, RG7422), WYE-354, Вистусертиба (AZD2014), Торина 2, Такролимуса (FK506), GSK1059615, Гедатолизиба (PF-05212384, PKI-587), WYE-125132 (УАЙ 132), BGT226 (NVP-BGT226), Паломида 529 (P529), PP121, WYE-687, CH5132799, WAY-600, ETP-46464, GDC-0349, XL388, Зотаролимуса (ОКОЛО 578) и хризофановой кислоты.

[0066]

Вышеуказанные ингибиторы mTOR могут использоваться отдельно или в комбинации в лекарственном средстве настоящего изобретения. Концентрация ингибитора mTOR, применяемого в настоящем изобретении, может быть соответствующим образом изменена в зависимости от типа ингибитора mTOR. Например, концентрация может составлять, без ограничения, по меньшей мере приблизительно 0,0001 нМ (нмоль/л), по меньшей мере приблизительно 0,001 нМ, по меньшей мере приблизительно 0,01 нМ, по меньшей мере приблизительно 0,1 нМ, по меньшей мере приблизительно 1 нМ, по меньшей мере приблизительно 10 нМ, по меньшей мере приблизительно 100 нМ или по меньшей мере приблизительно 1000 нМ. Верхний предел концентрации mTOR, применяемого в настоящем изобретении, включает, без ограничения, приблизительно 100 мкМ (мкмоль/л), приблизительно 10 мкМ, приблизительно 1 мкМ или приблизительно 0,5 мкМ. Примеры диапазона концентраций ингибитора mTOR, применяемого в настоящем изобретении, включают, без ограничения, от приблизительно 0,01 нМ до приблизительно 100 мкМ, от приблизительно 0,1 нМ до приблизительно 100 мкМ, от приблизительно 1 нМ до приблизительно 100 мкМ, от приблизительно 10 нМ до приблизительно 100 мкМ, от приблизительно 100 нМ до приблизительно 100 мкМ, от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 100 мкМ, от приблизительно 0,01 нМ до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 0,1 нМ до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 1 нМ до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 10 нМ до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 100 нМ до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 0,01 нМ до приблизительно 1 мкМ, от приблизительно 0,1 нМ до приблизительно 1 мкМ, от приблизительно 1 нМ до приблизительно 1 мкМ, от приблизительно 10 нМ до приблизительно 1 мкМ, от приблизительно 100 нМ до приблизительно 1 мкМ, от приблизительно 0,01 нМ до приблизительно 100 нМ, от приблизительно 0,1 нМ до приблизительно 100 нМ, от приблизительно 1 нМ до приблизительно 100 нМ и от приблизительно 10 нМ до приблизительно 100 нМ. При использовании двух или более типов ингибиторов mTOR в комбинации, концентрация каждого ингибитора mTOR может быть соответствующим образом изменена.

[0067]

В предпочтительном варианте осуществления ингибитор mTOR выбран из группы, состоящей, например, из рапамицина, темсиролимуса, эверолимуса и их солей. Без ограничения какой-либо теорией, это обусловлено тем, что было обнаружено, что лечение ингибиторами mTOR, такими как рапамицин, темсиролимус и эверолимус, показало значительно лучший терапевтический результат по сравнению с другими ингибиторами mTOR, и, в особенности, результаты излечения эндотелиального заболевания или нарушения роговицы, ассоциированного с трансформирующим фактором роста β2 (TGF-β2), такого как эндотелиальная дистрофия Фукса, или эндотелиального заболевания или нарушения роговицы, ассоциированного с суперэкспрессией внеклеточного матрикса (ВКМ), были значительно улучшены. Кроме того, это обусловлено тем, что эти ингибиторы mTOR уже одобрены FDA, PMDA и т.п., и, как ожидают, их можно будет применять в качестве глазного лекарственного средства, в виде фармацевтического продукта, даже с учетом таких аспектов, как безопасность.

[0068]

Вышеуказанные соединения могут использоваться отдельно или в комбинации в лекарственном средстве настоящего изобретения. Концентрация соединения, применяемого в настоящем изобретении, составляет приблизительно от 0,01 нМ до 100 мкМ (мкмоль/л), или приблизительно от 0,1 нМ до 100 мкМ, обычно приблизительно от 1 нМ до 100 мкМ, приблизительно от 10 нМ до 100 мкМ, предпочтительно приблизительно от 0,1 до 30 мкМ и более предпочтительно приблизительно от 1 до 10 мкМ. Верхние границы и нижние границы указанных диапазонов могут быть соответствующим образом установлены в комбинации, и при использовании двух или более типов соединений в комбинации, концентрация может быть соответствующим образом изменена. Примеры других диапазонов концентраций включают, без ограничения, обычно приблизительно от 0,01 нМ до 100 мкМ, приблизительно от 0,1 нМ до 100 мкМ или приблизительно от 0,001 до 100 мкМ, предпочтительно приблизительно от 0,01 до 75 мкМ, приблизительно от 0,05 до 50 мкМ, приблизительно от 1 до 10 мкМ, приблизительно от 0,01 до 10 мкМ, приблизительно от 0,05 до 10 мкМ, приблизительно от 0,075 до 10 мкМ, приблизительно от 0,1 до 10 мкМ, приблизительно от 0,5 до 10 мкМ, приблизительно от 0,75 до 10 мкМ, приблизительно от 1,0 до 10 мкМ, приблизительно от 1,25 до 10 мкМ, приблизительно от 1,5 до 10 мкМ, приблизительно от 1,75 до 10 мкМ, приблизительно от 2,0 до 10 мкМ, приблизительно от 2,5 до 10 мкМ, приблизительно от 3,0 до 10 мкМ, приблизительно от 4,0 до 10 мкМ, приблизительно от 5,0 до 10 мкМ, приблизительно от 6,0 до 10 мкМ, приблизительно от 7,0 до 10 мкМ, приблизительно от 8,0 до 10 мкМ, приблизительно от 9,0 до 10 мкМ, приблизительно от 0,01 до 50 мкМ, приблизительно от 0,05 до 5,0 мкМ, приблизительно от 0,075 до 5,0 мкМ, приблизительно от 0,1 до 5,0 мкМ, приблизительно от 0,5 до 5,0 мкМ, приблизительно от 0,75 до 5,0 мкМ, приблизительно от 1,0 до 5,0 мкМ, приблизительно от 1,25 до 5,0 мкМ, приблизительно от 1,5 до 5,0 мкМ, приблизительно от 1,75 до 5,0 мкМ, приблизительно от 2,0 до 5,0 мкМ, приблизительно от 2,5 до 5,0 мкМ, приблизительно от 3,0 до 5,0 мкМ, приблизительно от 4,0 до 5,0 мкМ, приблизительно от 0,01 до 3,0 мкМ, приблизительно от 0,05 до 3,0 мкМ, приблизительно от 0,075 до 3,0 мкМ, приблизительно от 0,1 до 3,0 мкМ, приблизительно от 0,5 до 3,0 мкМ, приблизительно от 0,75 до 3,0 мкМ, приблизительно от 1,0 до 3,0 мкМ, приблизительно от 1,25 до 3,0 мкМ, приблизительно от 1,5 до 3,0 мкМ, приблизительно от 1,75 до 3,0 мкМ, приблизительно от 2,0 до 3,0 мкМ, приблизительно от 0,01 до 1,0 мкМ, приблизительно от 0,05 до 1,0 мкМ, приблизительно от 0,075 до 1,0 мкМ, приблизительно от 0,1 до 1,0 мкМ, приблизительно от 0,5 до 1,0 мкМ, приблизительно от 0,75 до 1,0 мкМ, приблизительно от 0,09 до 35 мкМ, приблизительно от 0,09 до 3,2 мкМ, более предпочтительно приблизительно от 0,05 до 1,0 мкМ, приблизительно от 0,075 до 1,0 мкМ, приблизительно от 0,1 до 1,0 мкМ, приблизительно от 0,5 до 1,0 мкМ, приблизительно от 0,75 до 1,0 мкМ.

[0069]

В случае применения в форме глазных капель, концентрация композиции может быть определена при использовании приблизительно 1-10000-кратной, предпочтительно приблизительно 100-10000-кратной, такой как приблизительно 1000-кратная концентрации, относительно указанной выше эффективной концентрации в качестве референсной, с учетом разбавления слезной жидкостью и т.п., и обращая внимание на токсичность. Также можно установить более высокую концентрацию. Например, концентрация составляет приблизительно от 0,01 мкМ (мкмоль/л) до 1000 мМ (ммоль/л), приблизительно от 0,1 мкМ до 100 мМ, приблизительно от 1 мкМ до 100 мМ, приблизительно от 10 мкМ до 100 мМ или приблизительно от 0,1 мкМ до 30 мМ, приблизительно от 1 мкМ до 30 мМ, более предпочтительно приблизительно от 1 мкМ до 10 мМ, приблизительно от 10 мкМ до 10 мМ, приблизительно от 100 мкМ до 10 мМ, приблизительно от 10 мкМ до 100 мМ, приблизительно от 100 мкМ до 100 мМ, или может составлять приблизительно от мМ до 10 мМ, приблизительно от 1 мМ до 100 мМ. Верхние границы и нижние границы указанных диапазонов могут быть соответствующим образом установлены в комбинации, и когда два или более типов соединений используются в комбинации, концентрация может быть соответствующим образом изменена.

[0070]

В другом варианте осуществления ингибитором mTOR является рапамицин. Концентрация рапамицина, которая будет использоваться, составляет по меньшей мере приблизительно 0,1 нМ, по меньшей мере приблизительно 1 нМ, по меньшей мере приблизительно 10 нМ, предпочтительно приблизительно 100 нМ. В предпочтительном варианте осуществления рапамицин используется в форме глазных капель, и концентрация рапамицина, которая будет использоваться в таком случае, составляет по меньшей мере приблизительно 0,1 мМ, по меньшей мере приблизительно 1 мМ, по меньшей мере приблизительно 10 мМ, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 100 мМ. Насыщающее количество 1000 мМ представлено в качестве примера верхней границы концентрации.

[0071]

В другом варианте осуществления ингибитором mTOR является темсиролимус. Концентрация темсиролимуса, которая будет использоваться, составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 нМ, по меньшей мере приблизительно 0,1 нМ, предпочтительно приблизительно 1 нМ, предпочтительно приблизительно 10 нМ, более предпочтительно приблизительно 100 нМ, более предпочтительно приблизительно 1 мкМ, более предпочтительно приблизительно 10 мкМ. Темсиролимус используется в форме глазных капель, при этом концентрация темсиролимуса, которая будет использоваться в таком случае, составляет по меньшей мере приблизительно 0,01 мМ, по меньшей мере приблизительно 0,1 мМ, по меньшей мере приблизительно 1 мМ, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 10 мМ. Насыщающее количество 1000 мМ представлено в качестве примера верхней границы концентрации. В другом варианте осуществления ингибитором mTOR является эверолимус. Концентрация эверолимуса, которая будет использоваться, составляет по меньшей мере приблизительно 0,1 нМ, по меньшей мере приблизительно 1 нМ, по меньшей мере приблизительно 10 нМ, предпочтительно приблизительно 100 нМ. Эверолимус используется в форме глазных капель, при этом концентрация эверолимус, которая будет использоваться в таком случае, составляет по меньшей мере приблизительно 0,1 мМ, по меньшей мере приблизительно 1 мМ, по меньшей мере приблизительно 10 мМ, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 100 мМ. Насыщающее количество 1000 мМ представлено в качестве примера верхней границы концентрации.

[0072]

В одном варианте осуществления терапевтическое или профилактическое лекарственное средство согласно настоящему изобретению может быть предназначено для любого животного с эндотелием роговицы, такого как млекопитающие. Такое лекарственное средство предпочтительно предназначено для лечения или профилактики эндотелия роговицы примата. Объектом терапии или профилактики предпочтительно является эндотелий роговицы человека.

[0073]

В другом варианте осуществления ингибитор mTOR может быть веществом, подавляющим экспрессию гена mTOR. Примеры вещества, подавляющего экспрессию гена mTOR, включают, без ограничения, миРНК, антисмысловую нуклеиновую кислоту или рибозим.

[0074]

В определенном варианте осуществления ингибитор mTOR представляет собой миРНК против гена mTOR. Типичные примеры миРНК, применяемой в настоящем изобретении, включают, без ограничения:

смысловую цепь, представленную в

CAUUCGCAUUCAGUCCAUAtt (SEQ ID NO: 1); и

антисмысловую цепь, представленную в

UAUGGACUGAAUGCGAAUGat (SEQ ID NO: 2).

Любая последовательность является приемлемой, при условии присутствия антисмыслового эффекта или смыслового эффекта РНКи против гена mTOR. 1-3 основания нуклеотидов могут быть удалены, заменены, вставлены и/или добавлены в такие смысловую цепь и антисмысловые цепи.

[0075]

В другом аспекте настоящего изобретения предложен способ лечения или профилактики глазного (например, эндотелия роговицы) патологического состояния, нарушения или заболевания (патологического состояния, нарушения или заболевания эндотелия роговицы, опосредованного сигналом TGF-β и/или суперэкспрессией внеклеточного матрикса в эндотелиальных клетках роговицы), включающий введение эффективного количества ингибитора mTOR нуждающемуся в этом пациенту.

[0076]

При использовании в рамках изобретения "пациент" относится к объекту применения (трансплантации) терапевтического или профилактического лекарственное средства или способа настоящего изобретения. Примеры пациентов включают млекопитающих (например, человека, мышь, крысу, хомяка, кролика, кошку, собаку, корову, лошадь, овцу, обезьяну и т.п.), однако приматы являются предпочтительными, а люди являются наиболее предпочтительными.

[0077]

Эффективное количество лекарственного средства согласно настоящему изобретению, которое является эффективным при лечении конкретного заболевания, нарушения или патологического состояния, может изменяться в зависимости от свойств нарушения или патологического состояния, при этом такое эффективное количество может определить специалист в данной области с помощью стандартных клинических методик на основе сведений в настоящем описании. Также при необходимости можно использовать анализ in vitro для определения оптимального диапазона дозы. Поскольку точная доза, которая должна использоваться в композиции, может изменяться в зависимости от пути введения и тяжести заболевания или нарушения, доза должна определяться в соответствии с решением врача и состоянием каждого пациента. Однако доза, хотя и не ограничена конкретным образом, может составлять, например, 0,001, 1, 5, 10, 15, 100 или 1000 мг/кг массы тела, или соответствовать значению между любыми двумя такими значениями на дозу. Интервал введения, хотя и не ограничен конкретным образом, может составлять, например, одну или две дозы раз в 1, 7, 14, 21 или 28 дней или одну или две дозы в течение некоторого количества дней между любыми двумя такими значениями. Доза, количество доз, интервал введения и способ введения могут быть соответствующим образом выбраны в зависимости от возраста или массы тела пациента, состояния, лекарственной формы, целевого органа и т.п. Например, настоящее изобретение может использоваться в форме глазных капель. Лекарственное средство согласно настоящему изобретению также можно вводить в переднюю камеру глаза. Терапевтическое лекарственное средство предпочтительно содержит терапевтически эффективное количество или эффективное количество активных веществ, в котором проявляется требуемое действие. Присутствие терапевтического эффекта можно определить, когда терапевтический маркер значительно уменьшается после введения. Эффективное количество можно оценить по кривой доза-эффект, полученной с помощью системы исследования in vitro или в модели на животных.

[0078]

<Консервация и рост эндотелиальных клеток роговицы>

В другом аспекте настоящего изобретения предложена композиция для консервации эндотелиальных клеток роговицы, включающая ингибитор mTOR. В настоящем изобретении также предложен способ консервации эндотелиальных клеток роговицы, включающий контакт эффективного количества ингибитора mTOR с эндотелиальными клетками роговицы. Следует понимать, что вариант осуществления ингибитора mTOR и т.п., применяемого для консервации эндотелиальных клеток роговицы, может использовать любой вариант осуществления, описанный в разделе <Лекарственное средство> в настоящем описании. Контакт с эндотелиальными клетками роговицы могут проводить in vivo, ex vivo или in vitro, и может использоваться в производстве композиции клеток.

[0079]

В другом аспекте настоящего изобретения предложена композиция для выращивания или стимуляции роста эндотелиальных клеток роговицы, включающая ингибитор mTOR. В настоящем изобретении также предложен способ выращивания или стимуляции роста эндотелиальных клеток роговицы, включающий контакт эффективного количества ингибитора mTOR с эндотелиальными клетками роговицы. Следует понимать, что вариант осуществления ингибитора mTOR и т.п., используемый для выращивания или стимуляции роста эндотелиальных клеток роговицы, может использовать любой вариант осуществления, описанный в разделе <Лекарственное средство> в настоящем описании. Контакт с эндотелиальными клетками роговицы могут проводить in vivo, ex vivo или in vitro, и может использоваться в производстве композиции клеток.

[0080]

Справочная литература, такая как научная литература, патенты и заявки на патент, цитируемые в рамках изобретения, включена в рамках изобретения посредством отсылки в той же степени, в которой каждый документ конкретно описан во всей полноте.

[0081]

Настоящее изобретение было описано посредством предпочтительных вариантов осуществления для облегчения понимания. Настоящее изобретение далее поясняется на основе Примеров. Представленное выше описание и следующие примеры приведены не для ограничения настоящего изобретения, а с единственной целью пояснения. Таким образом, объем настоящего изобретения не ограничен вариантами осуществления и примерами, которые конкретно раскрыты в рамках изобретения, а ограничен только объемом формулы изобретения.

[Примеры]

[0082]

Далее описаны примеры настоящего изобретения. Биологические образцы и т.п., в соответствующих случаях, обрабатывали в соответствии со стандартами, принятыми Министерством здравоохранения, труда и социального обеспечения, Министерством образования, культуры, спорта, науки и техники и т.п., и, в соответствующих случаях, на основе Хельсинкской декларации или этических норм, подготовленных на ее основе. Для донорства глаз, используемых в исследовании, было получено согласие от близких родственников всех умерших доноров. Настоящее исследование было одобрено комитетом по этике или соответствующим органом Университета Эрлангена-Нюрнберга (Германия) и глазного банка SightLife^™ (Сиэтл, Вашингтон).

[0083]

(Пример получения: Получение модели на основе линии иммортализованных эндотелиальных клеток роговицы, полученных от пациентов с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса (iFECD))

В данном примере линия иммортализованных эндотелиальных клеток роговицы (iFECD) была получена из эндотелиальных клеток роговицы от пациентов с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса.

[0084]

(Метод культивирования)

Эндотелиальные клетки роговицы механически отделяли с базальной мембраной от роговицы для исследований, полученной из Сиэтлского глазного банка. После применения коллагеназы для отделения и сбора эндотелиальных клеток роговицы от базальной мембраны клетки подвергали первичному культивированию. Что касается среды, среду Opti-MEM I с пониженным содержанием сыворотки, жидкую (номер по каталогу INVITROGEN: 31985-070), в которую добавляли 8% FBS (номер по каталогу BIOWEST: S1820-500), 200 мг/мл CaCl₂⋅2H₂O (номер по каталогу SIGMA: C7902-500G), 0,08% хондроитина сульфата (номер по каталогу SIGMA: C9819-5G), 20 мкг/мл аскорбиновой кислоты (номер по каталогу SIGMA: A4544-25G), 50 мкг/мл гентамицина (номер по каталогу INVITROGEN: 15710-064) и 5 нг/мл EGF (номер по каталогу INVITROGEN: PHG0311) и кондиционированную для фидерных клеток 3T3, использовали в качестве базальной среды. Кроме того, клетки культивировали в базальной среде, в которую добавляли SB431542 (1 мкмоль/л) и SB203580 (4-(4-фторфенил)-2-(4-метилсульфонилфенил)-5-(4-пиридил)имидазол<4-[4-(4-фторфенил)-2-(4-метилсульфинилфенил)-1Н-имидазол-5-ил]пиридин) (1 мкмоль/л) (также называемой в рамках изобретения "кондиционированной средой SB203580+SB431542+3T3").

[0085]

(Метод анализа изображений)

Эндотелиальные клетки роговицы были получены с одобрения комитета по этике и письменного согласия 3 пациентов, которые страдали буллезной кератопатией в соответствии с клиническим диагнозом эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса и перенесли трансплантацию эндотелия роговицы (эндотелиальную кератопластику десцеметовой оболочки=DMEK). Для DMEK патологические эндотелиальные клетки роговицы механически отслаивали с базальной мембраной, то есть десцеметовой оболочкой, и погружали в раствор для консервации роговицы Optisol-GS (Bausch&Lomb). Затем применяли обработку коллагеназой для ферментативного сбора эндотелиальных клеток роговицы и культивировали клетки в кондиционированной среде SB203580+SB431542+3T3. Для культивируемых эндотелиальных клеток роговицы от пациента с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса, большой T-антиген SV40 и ген hTERT амплифицировали с помощью ПЦР и вводили в лентивирусный вектор (pLenti6.3_V5-TOPO; Life Technologies Inc). Затем лентивирусный вектор использовали для инфицирования клеток 293T (RCB2202; Riken Bioresource Center, Ibaraki, Japan) с использованием реагента для трансфекции (Fugene HD; Promega Corp., Madison, WI) и трех типов хелперных плазмид (pLP1, pLP2, pLP/VSVG; Life Technologies Inc.). Культуральный супернатант, содержащий вирусы, собирали через 48 часов после инфицирования. Использовали 5 мкг/мл полибрена, который добавляли в культуральный раствор культивируемых эндотелиальных клеток роговицы от пациента с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса, и вводили большой Т-антиген SV40 и ген hTERT. Исследовали изображения иммортализованной линии эндотелиальных клеток роговицы (iFECD) пациентов с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса, полученные с помощью фазово-контрастного микроскопа. Культивируемые эндотелиальные клетки роговицы из исследуемой роговицы, полученной из Сиэтлского глазного банка, были иммортализованы таким же методом с получением иммортализованной клеточной линии нормальных эндотелиальных клеток роговицы (iHCEC) в качестве контроля. При исследовании изображений иммортализованной линии эндотелиальных клеток роговицы (iFECD) и иммортализованной линии эндотелиальных клеток роговицы здорового донора (iHCEC) с помощью фазово-контрастного микроскопа, клетки iHCEC, как и iFECD, имели слой полигональной формы, как в нормальных эндотелиальных клетках роговицы. IHCEC и iFECD поддерживали и культивировали в модифицированной по методу Дульбекко среде Игла (DMEM) +10% эмбриональной бычьей сыворотки (FBS).

[0086]

(Пример 1: Эффект подавления рапамицином повреждения клеток, вызванного TGF-β2)

Данный Пример продемонстрировал действие рапамицина, который является типичным примером ингибитора mTOR, при повреждении клеток.

[0087]

(Материалы и методы)

Среду удаляли из чашки для культивирования, в которой культивировали iFECD, добавляли к клеткам 1×PBS (-), который предварительно нагревали до 37°C, и промывали. Это повторяли два раза. К клеткам снова добавляли 1×PBS (-) и инкубировали в течение 3 минут при 37°C (5% CO₂). После удаления PBS (-) к клеткам добавляли 0,05% трипсина-ЭДТА (Nacalai Tesque, 32778-34) и инкубировали в течение 5 минут при 37°C (5% CO₂). Затем клетки суспендировали в среде и собирали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 3 минут. В качестве среды использовали DMEM (Nacalai Tesque, 08456-36) +10% FBS (Biowest, S1820-500) +1% P/S (Nacalai Tesque, 26252-94).

[0088]

iFECD сеяли в 12-луночный планшет в соотношении 1×10⁵ клеток на лунку и культивировали в течение 24 часов при 37°C (5% CO₂) (в качестве среды использовали DMEM +10% FBS +1% P/S). Через 24 часа среду удаляли. Рапамицин добавляли для культивирования клеток в течение 24 часов (в качестве среды использовали DMEM +2% FBS +1% P/S). Через 24 часа среду удаляли. Среду, содержащую 10 нг/мл рекомбинантного человеческого TGF-β2 (Wako, 200-19911) и добавляли рапамицин для культивирования клеток в течение 24 часов (в качестве среды использовали DMEM +2% FBS +1% P/S). Через 24 часа морфологию и апоптоз клеток наблюдали с помощью фазово-контрастного микроскопа.

[0089]

(Результаты)

(Рапамицин подавляет повреждение клетки, вызванное TGF-β2),

На Фигуре 1 показаны результаты. При стимуляции клеток iFECD рекомбинантным человеческим TGF-β2 без рапамицина, клетки, как обнаруживали, были значительно повреждены. С другой стороны, наблюдали, что повреждение эндотелиальных клеток роговицы было подавлено в случае предварительной обработки рапамицином. Поэтому рапамицин, как было обнаружено, подавлял повреждение клеток, вызванное рекомбинантным человеческим TGF-β2.

[0090]

(Пример 2: Эффект подавления рапамицином активности каспазы, индуцированной TGF-β2)

Данный Пример продемонстрировал действие рапамицина, который является типичным примером ингибитора mTOR, в отношении активности каспазы.

[0091]

(Материалы и методы)

Среду удаляли из чашки для культивирования, в которой культивировали iFECD, добавляли к клеткам 1×PBS (-), который предварительно нагревали до 37°C, и промывали. Это повторяли два раза. К клеткам снова добавляли 1×PBS (-) и инкубировали в течение 3 минут при 37°C (5% CO₂). После удаления PBS (-) к клеткам добавляли 0,05% трипсина-ЭДТА (Nacalai Tesque, 32778-34) и инкубировали в течение 5 минут при 37°C (5% CO₂). Затем клетки суспендировали в среде и собирали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 3 минут. В качестве среды использовали DMEM (Nacalai Tesque, 08456-36) +10% FBS (Biowest, S1820-500) +1% P/S (Nacalai Tesque, 26252-94).

[0092]

iFECD сеяли в 12-луночный планшет в соотношении 1×10⁵ клеток на лунку и культивировали в течение 24 часов при 37°C (5% CO₂) (в качестве среды использовали DMEM +10% FBS +1% P/S). Через 24 часа среду удаляли. Рапамицин добавляли для культивирования клеток в течение 24 часов (в качестве среды использовали DMEM +2% FBS +1% P/S). Через 24 часа среду удаляли. Среду, содержащую 10 нг/мл рекомбинантного человеческого TGF-β2 (Wako, 200-19911) и рапамицин, добавляли для культивирования клеток в течение 24 часов (в качестве среды использовали DMEM +2% FBS +1% P/S). Через 24 часа морфологию и апоптоз клеток наблюдали с помощью фазово-контрастного микроскопа.

[0093]

После микроскопии проводили вестерн-блоттинг белков согласно следующей методике.

[0094]

1) Сбор белка

Среду собирали на льду для сбора свободных и мертвых клеток. Также собирали раствор после двухкратной промывки клеток 1×PBS (-). Центрифугировали при 800 g и 4°C в течение 12 минут. Супернатант отбирали для получения осадков. К промытым клеткам добавляли буфер для выделения белка (RIPA; 50 мМ Трис-HCl (рН 7,4), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,1% SDS, 0,5% DOC, 1% NP-40) на льду для выделения белков. Осадки после центрифугирования свободных и мертвых клеток также затем суспендировали вместе для экстракции. Собранный раствор три раза обрабатывали ультразвуком в течение 30 секунд в холодной воде с помощью ультразвукового дезинтегратора (BIORUPTOR, TOSHO DENKI) и центрифугировали в течение 10 мин при 4°C и 15000 об/мин для сбора супернатанта белков.

[0095]

2) Вестерн-блоттинг

8 мкг выделенного белка разделяли с помощью ДСН-ПААГЭ и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. В качестве первичных антител использовали кроличье антитело против каспазы 3 (Cell Signaling, 9662), кроличье антитело против PARP (Cell Signaling, 9542) и мышиное антитело против GAPDH (MBL, M171-3). В качестве вторичных антител использовали меченные пероксидазой антитело против иммуноглобулина кролика и антитело против иммуноглобулина мыши (GE Healthcare Biosciences, NA931V, NA934V). Что касается первичных антител, кроличьи антитела против каспазы 3: 1000-кратное разведение, кроличьи антитела против PARP: 2000-кратное разведение и мышиные против GAPDH-антитела: 5000-кратное разведение, тогда как вторичные антитела разбавляли в 5000 раз. Для детектирования использовали Chemi Lumi ONE Ultra (Nacalai Tesque, 11644-40). Интенсивность детектированных полос определяли с помощью анализатора изображений Lumino LAS-4000 mini (Fuji Film) и программы ImageQuant^™ (GE Healthcare).

[0096]

(Результаты)

(Рапамицин подавляет активность каспазы, индуцированную TGF-β2)

Результаты Вестерн-блоттинга каспазы показаны на Фигуре 2. При стимуляции клеток iFECD рекомбинантным человеческим TGF-β2 без рапамицина, наблюдали присутствие расщепленной каспазы 3 (приблизительно 17 кДа), которая является активной формой. С другой стороны, активированная форма расщепленной каспазы 3 почти отсутствовала в группе с добавкой рапамицина. Таким образом, как было обнаружено в анализе, рапамицин подавлял активацию каспазы рекомбинантным человеческим TGF-β2. mTOR не связана с сигналом каспазы, при этом также не известно, что ингибитор mTOR подавляет активность каспазы. Таким образом, оказалось неожиданным, что рапамицин мог подавлять активность каспазы.

[0097]

(Пример 3: Эффект подавления рапамицином активности фосфорилирования S6K, индуцируемой рекомбинантным человеческим TGF-β2)

Данный Пример продемонстрировал действие рапамицина, который является типичным примером ингибитора mTOR, в отношении активности фосфорилирования S6K, индуцируемой рекомбинантным человеческим TGF-β2.

[0098]

(Материалы и методы)

Среду удаляли из чашки для культивирования, в которой культивировали iFECD, к клеткам добавляли 1×PBS (-), который предварительно нагревали до 37°C, и промывали. Это повторяли два раза. К клеткам снова добавляли 1×PBS (-) и инкубировали в течение 3 минут при 37°C (5% CO₂). После удаления PBS (-) к клеткам добавляли 0,05% трипсина-ЭДТА (Nacalai Tesque, 32778-34) и инкубировали в течение 5 минут при 37°C (5% CO₂). Затем клетки суспендировали в среде и собирали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 3 минут. В качестве среды использовали DMEM (Nacalai Tesque, 08456-36) +10% FBS (Biowest, S1820-500) +1% P/S (Nacalai Tesque, 26252-94).

[0099]

Клетки iFECD сеяли в 12-луночный планшет при отношении 7×10⁴ клеток на лунку и культивировали в течение 24 часов при 37°C (5% CO₂) (в качестве среды использовали DMEM +10% FBS +1% P/S). Через 24 часа среду удаляли. Рапамицин добавляли для культивирования клеток в течение 24 часов (в качестве среды использовали DMEM +2% FBS +1% P/S). Через 24 часа среду удаляли. Среду, содержащую 10 нг/мл рекомбинантного человеческого TGF-β2 (Wako, 200-19911) и рапамицин, добавляли для культивирования клеток в течение 24 часов (в качестве среды использовали DMEM +2% FBS +1% P/S). Через 24 часа морфологию и апоптоз клеток наблюдали с помощью фазово-контрастного микроскопа.

[0100]

После микроскопии проводили вестерн-блоттинг белков согласно следующей методике.

[0101]

1) Сбор белка

Среду собирали на льду для сбора свободных и мертвых клеток. Также собирали раствор после двухкратной промывки клеток 1×PBS (-). Центрифугировали при 800 g и 4°C в течение 12 минут. Супернатант отбирали для получения осадков. К промытым клеткам добавляли буфер для выделения белка (RIPA; 50 мМ Трис-HCl (рН 7,4), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,1% SDS, 0,5% DOC, 1% NP-40) на льду для выделения белков. Осадки после центрифугирования свободных и мертвых клеток также затем суспендировали вместе для экстракции. Собранный раствор три раза обрабатывали ультразвуком в течение 30 секунд в холодной воде с помощью ультразвукового дезинтегратора (BIORUPTOR, TOSHO DENKI) и центрифугировали в течение 10 мин при 4°C и 15000 об/мин для сбора супернатанта белков.

[0102]

2) Вестерн-блоттинг

8 мкг выделенного белка разделяли с помощью ДСН-ПААГЭ и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. В качестве первичных антител использовали кроличье антитело против Akt1 (Cell Signaling, 2938), мышиное антитело против фосфо-Akt (Cell Signaling, 4051), кроличье антитело против S6K (Cell Signaling, 9202), кроличье антитело против фосфо-S6K (Cell Signaling, 9204) и мышиное антитело против GAPDH (MBL, M171-3). В качестве вторичных антител использовали меченные пероксидазой антитело против иммуноглобулина кролика и антитело против иммуноглобулина мыши (GE Healthcare Biosciences, NA931V, NA934V). Что касается первичных антител, кроличье антитело против Akt: 1000-кратное разведение, мышиное антитело против фосфо-Akt: 1000-кратное разведение, кроличье антитело против S6K: 1000-кратное разведение, кроличье антитело против фосфо-S6K: 1000-кратное разведение и мышиное антитело против GAPDH: 5000-кратное разведение, тогда как вторичное антитело разбавляли в 5000 раз. Для детектирования использовали Chemi Lumi ONE Ultra (Nacalai Tesque, 11644-40). Интенсивность детектированных полос определяли с помощью анализатора изображений Lumino LAS-4000 mini (Fuji Film) и программы ImageQuant^™ (GE Healthcare).

[0103]

(Результаты)

(Рапамицин подавляет активность фосфорилирования S6K, индуцированную TGF-β2)

Результаты показаны на Фигуре 3. При стимуляции клеток iFECD рекомбинантным человеческим TGF-β2 без рапамицина была обнаружена активность фосфорилирования Akt. С другой стороны, активность фосфорилирования S6K была подавлена в группе с добавкой рапамицина. Рапамицин, как было обнаружено, обладал ингибирующим действием в отношении пути сигнала mTOR согласно вестерн-блот анализу в присутствии рапамицина. Akt проявляет активность перед mTOR, и S6K действует после mTOR. Таким образом, с учетом того, что вышестоящая Akt была фосфорилирована, тогда как фосфорилирование нижестоящей S6K было подавлено ингибитор mTOR, рапамицин, как обнаружили, ингибировал путь mTOR.

[0104]

(Пример 4: Эффект подавления рапамицином активности фосфорилирования Smad2/3, индуцированной TGF-β2)

Данный Пример продемонстрировал эффект подавления рапамицином, который является типичным примером ингибитора mTOR, активности фосфорилирования Smad2/3, индуцированной TGF-β2.

[0105]

(Материалы и методы)

Среду удаляли из чашки для культивирования, в которой культивировали iFECD, добавляли к клеткам 1×PBS (-), который предварительно нагревали до 37°C, и промывали. Это повторяли два раза. К клеткам снова добавляли 1×PBS (-) и инкубировали в течение 3 минут при 37°C (5% CO₂). После удаления PBS (-) к клеткам добавляли 0,05% трипсина-ЭДТА (Nacalai Tesque, 32778-34) и инкубировали в течение 5 минут при 37°C (5% CO₂). Затем клетки суспендировали в среде и собирали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 3 минут. В качестве среды использовали DMEM (Nacalai Tesque, 08456-36) +10% FBS (Biowest, S1820-500) +1% P/S (Nacalai Tesque, 26252-94).

[0106]

iFECD сеяли в 12-луночный планшет в соотношении 8×10⁴ клеток на лунку и культивировали в течение 24 часов при 37°C (5% CO₂) (в качестве среды использовали DMEM +10% FBS +1% P/S). Через 24 часа среду удаляли. Рапамицин добавляли для культивирования клеток в течение 24 часов (в качестве среды использовали DMEM +2% FBS +1% P/S). Через 24 часа среду удаляли. Среду, содержащую 10 нг/мл рекомбинантного человеческого TGF-β2 (Wako, 200-19911) и рапамицин, добавляли для культивирования клеток в течение 24 часов (в качестве среды использовали DMEM +2% FBS +1% P/S). Через 24 часа морфологию и апоптоз клеток наблюдали с помощью фазово-контрастного микроскопа.

[0107]

После микроскопии проводили вестерн-блоттинг белков согласно следующей методике.

[0108]

1) Сбор белка

Среду собирали на льду для сбора свободных и мертвых клеток. Также собирали раствор после двухкратной промывки клеток 1×PBS (-). Центрифугировали при 800 g и 4°C в течение 12 минут. Супернатант отбирали для получения осадков. К промытым клеткам добавляли буфер для выделения белка (RIPA; 50 мМ Трис-HCl (рН 7,4), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,1% SDS, 0,5% DOC, 1% NP-40) на льду для выделения белков. Осадки после центрифугирования свободных и мертвых клеток также затем суспендировали вместе для экстракции. Собранный раствор три раза обрабатывали ультразвуком в течение 30 секунд в холодной воде с помощью ультразвукового дезинтегратора (BIORUPTOR, TOSHO DENKI) и центрифугировали в течение 10 мин при 4°C и 15000 об/мин для сбора супернатанта белков.

[0109]

2) Вестерн-блоттинг

8 мкг выделенного белка разделяли с помощью ДСН-ПААГЭ и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. В качестве первичных антител использовали кроличье антитело против Smad2 (Cell Signaling, 5339), мышиное антитело против фосфо-Smad2 (Cell Signaling, 3108), кроличье антитело против Smad3 (Cell Signaling, 9523), кроличье антитело против фосфо-Smad3 (Cell Signaling, 9520) и мышиное антитело против GAPDH (MBL, M171-3). В качестве вторичных антител использовали меченные пероксидазой антитело против иммуноглобулина кролика и антитело против иммуноглобулина мыши (GE Healthcare Biosciences, NA931V, NA934V). Что касается первичных антител, кроличье антитело против Smad2: 1000-кратное разведение, мышиное антитело против фосфо-Smad2: 1000-кратное разведение, кроличье антитело против Smad3: 1000-кратное разведение, кроличье антитело против фосфо-Smad3: 1000-кратное разведение и мышиное антитело против GAPDH: 5000-кратное разведение, тогда как вторичное антитело разбавляли в 5000 раз. Для детектирования использовали Chemi Lumi ONE Ultra (Nacalai Tesque, 11644-40). Интенсивность детектированных полос определяли с помощью анализатора изображений Lumino LAS-4000 mini (Fuji Film) и программы ImageQuant^™ (GE Healthcare).

[0110]

(Результаты)

(Рапамицин не подавляет активность фосфорилирования Smad2/3, индуцированную TGF-β2)

Результаты показаны на Фигуре 4. При стимуляции рекомбинантным человеческим TGF-β2 без рапамицина была обнаружена активность фосфорилирования Smad2 и Smad3. Таким образом, как было обнаружено в вестерн-блот анализе, рапамицин не подавлял активность фосфорилирования Smad2/3, индуцированную рекомбинантным человеческим TGF-β2. Было показано, что подавление рапамицином повреждения клеток происходит не в результате ингибирования сигнала TGF-β, поскольку действие TGF-β, как предположили, передавалось путем фосфорилирования Smad. Это указывает на то, что рапамицин подавляет эндотелиальное нарушение роговицы и т.п. из-за сигнала TGF-β без прямого ингибирования сигнала TGF-β, что оказалось неожиданным результатом.

[0111]

(Пример 5: Эффект подавления рапамицином продукции фибронектина, индуцированной TGF-β2)

Данный Пример продемонстрировал эффект подавления рапамицином, который является типичным примером ингибитора mTOR, продукции фибронектина, индуцированной TGF-β2.

[0112]

(Материалы и методы)

Среду удаляли из чашки для культивирования, в которой культивировали iFECD, добавляли к клеткам 1×PBS (-), который предварительно нагревали до 37°C, и промывали. Это повторяли два раза. К клеткам снова добавляли 1×PBS (-) и инкубировали в течение 3 минут при 37°C (5% CO₂). После удаления PBS (-) к клеткам добавляли 0,05% трипсина-ЭДТА (Nacalai Tesque, 32778-34) и инкубировали в течение 5 минут при 37°C (5% CO₂). Затем клетки суспендировали в среде и собирали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 3 минут. В качестве среды использовали DMEM (Nacalai Tesque, 08456-36) +10% FBS (Biowest, S1820-500) +1% P/S (Nacalai Tesque, 26252-94).

[0113]

Клетки iFECD сеяли в 6-луночный планшет в отношении 2×10⁵ клеток на лунку и культивировали в течение 24 часов при 37°C (5% CO₂) (в качестве среды использовали DMEM +10% FBS +1% P/S). Через 24 часа среду удаляли. Рапамицин добавляли для культивирования клеток в течение 24 часов (в качестве среды использовали DMEM +2% FBS +1% P/S). Через 24 часа среду удаляли. Среду, содержащую 10 нг/мл рекомбинантного человеческого TGF-β2 (Wako, 200-19911) и рапамицин, добавляли для культивирования клеток в течение 24 часов (в качестве среды использовали DMEM +2% FBS +1% P/S). Через 24 часа морфологию и апоптоз клеток наблюдали с помощью фазово-контрастного микроскопа.

[0114]

После микроскопии проводили вестерн-блоттинг белков согласно следующей методике.

[0115]

1) Сбор белка

Среду собирали на льду для сбора свободных и мертвых клеток. Также собирали раствор после двухкратной промывки клеток 1×PBS (-). Центрифугировали при 800 g и 4°C в течение 12 минут. Супернатант отбирали для получения осадков. К промытым клеткам добавляли буфер для выделения белка (RIPA; 50 мМ Трис-HCl (рН 7,4), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,1% SDS, 0,5% DOC, 1% NP-40) на льду для выделения белков. Осадки после центрифугирования свободных и мертвых клеток также затем суспендировали вместе для экстракции. Собранный раствор три раза обрабатывали ультразвуком в течение 30 секунд в холодной воде с помощью ультразвукового дезинтегратора (BIORUPTOR, TOSHO DENKI) и центрифугировали в течение 10 мин при 4°C и 15000 об/мин для сбора супернатанта белков.

[0116]

2) Вестерн-блоттинг

5 мкг выделенного белка разделяли с помощью ДСН-ПААГЭ и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. В качестве первичных антител использовали мышиное антитело против фибронектина (BD Bioscience, 610077) и мышиное антитело против GAPDH (MBL, M171-3). В качестве вторичных антител использовали меченные пероксидазой антитело против иммуноглобулина кролика и антитело против иммуноглобулина мыши (GE Healthcare Biosciences, NA931V, NA934V). В отношении мышиного антитела против фибронектина: 15000-кратное разведение, и мышиного антитела против GAPDH: 5000-кратное разведение, тогда как вторичное антитело разбавляли в 5000 раз. Для детектирования использовали Chemi Lumi ONE Ultra (Nacalai Tesque, 11644-40). Интенсивность детектированных полос определяли с помощью анализатора изображений Lumino LAS-4000 mini (Fuji Film) и программы ImageQuant^™ (GE Healthcare).

[0117]

(Результаты)

(Рапамицин подавляет продукцию фибронектина, индуцированную TGF-β2)

Результаты показаны на Фигуре 5. При стимуляции рекомбинантным человеческим TGF-β2 без рапамицина в iFECD наблюдали продукцию фибронектина. С другой стороны, продукцию фибронектина почти не наблюдали в группе с добавкой рапамицина. Таким образом, уровень экспрессии фибронектина, индуцированной рекомбинантным человеческим TGF-β2, как было обнаружено в вестерн-блот анализе, был подавлен рапамицином. Не было известно, что ингибитор mTOR участвует в продукции внеклеточного матрикса, такого как фибронектин. Таким образом, было неожиданно, что mTOR способна подавлять продукцию внеклеточного матрикса.

[0118]

При эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса избыточная продукция внеклеточного матрикса, такого как фибронектин, и его отложение на десцеметовой оболочке приводят к нарушению, такому как гипертрофия десцеметовой оболочки или образование гутт. Такое нарушение у пациентов с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса обычно начинает развиваться в 30-40 лет и прогрессирует в течение всей жизни пациента. Прогрессирование приводит к нарушению зрения, такому как размытое зрение, гало, чувствительность к яркому свету или ухудшение зрения. В то время как эндотелиальные клетки роговицы при эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса постоянно разрушаются, прозрачность роговицы поддерживается остающимся эндотелием роговицы, компенсирующим насосную функцию, пока плотность эндотелиальных клеток роговицы не становится ниже чем приблизительно 1000 клеток/мм². Если плотность становится ниже чем приблизительно 1000 клеток/мм², инфильтрация водянистой влаги из переднего сегмента глаза в роговицу приводит к отеку роговицы, приводящему к тяжелому нарушению зрения (Фигура 18). Таким образом, пациенты с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса страдают от нарушения зрительной функции в основном по двум причинам, а именно, избыточной продукции внеклеточного матрикса и гибели эндотелиальных клеток роговицы. Ингибитор каспазы в настоящем изобретении участвует как в подавлении продукции внеклеточного матрикса, так и в подавлении гибели эндотелиальных клеток роговицы, что особенно полезно при терапии эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса.

[0119]

(Пример 6: Эффект подавления под действием mTOR миРНК экспрессии mTOR и фосфорилирования S6K)

Данный Пример продемонстрировал эффект подавления под действием mTOR миРНК, которая является другим типичным примером ингибитора mTOR, экспрессии mTOR и фосфорилирования S6K.

[0120]

(Материалы и методы)

Среду удаляли из чашки для культивирования, в которой культивировали iFECD, добавляли к клеткам 1×PBS (-), который предварительно нагревали до 37°C, и промывали. Это повторяли два раза. К клеткам снова добавляли 1×PBS (-) и инкубировали в течение 3 минут при 37°C (5% CO₂). После удаления PBS (-) к клеткам добавляли 0,05% трипсина-ЭДТА (Nacalai Tesque, 32778-34) и инкубировали в течение 5 минут при 37°C (5% CO₂). Затем клетки суспендировали в среде и собирали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 3 минут. В качестве среды использовали DMEM (Nacalai Tesque, 08456-36) +10% FBS (Biowest, S1820-500) +1% P/S (Nacalai Tesque, 26252-94).

[0121]

iFECD сеяли в 12-луночный планшет в соотношении 3×10⁴ клеток на лунку и культивировали в течение 24 часов при 37°C (5% CO₂) (среда: DMEM +10% FBS +1% P/S). Через 24 часа среду удаляли. Липофектамин (Invitrogen, 92008) и 3 пмоль mTOR миРНК (Ambion, AS026M0L) добавляли для культивирования клеток в течение 24 часов (среда: OptiMEM-I (Invitrogen, 31985-088)). Используемая mTOR миРНК имела смысловую цепь, представленную в SEQ ID NO: 1, и антисмысловую цепь, представленную в SEQ ID NO: 2. Через 24 часа среду удаляли и культивировали клетки в течение 72 часов при 37°C (5% CO₂) (среда: DMEM +10% FBS +1% P/S). Через 72 часа среду удаляли. Среды, содержащие 10 нг/мл рекомбинантного человеческого TGF-β2 (Wako, 200-19911), добавляли для культивирования клеток в течение 24 часов (среда: DMEM +2% FBS +1% P/S). Через 24 часа морфологию и апоптоз клеток наблюдали с помощью фазово-контрастного микроскопа.

[0122]

После микроскопии амплификацию последовательности оснований кДНК проводили с помощью метода ПЦР согласно следующей методике.

[0123]

1) Сбор суммарной РНК

Среду удаляли из чашки для культивирования, в которой культивировали клетки iFECD, к клеткам добавляли 350 мкл лизисного буфера RLT из набора RNeasy miniKit (QIAGEN, M610A) и элюировали. К клеткам добавляли 350 мкл 70% EtOH и переносили в центрифужную мини-колонку RNeas (QIAGEN), которую затем центрифугировали в течение 15 секунд при 10000 об/мин для удаления проскока. Затем 30 мкл воды без РНКаз RNeasy (QIAGEN) добавляли в центрифужную мини-колонку RNeasy с последующим центрифугированием в течение 1 минуты при 10000 об/мин для выделения суммарной РНК.

[0124]

2) Синтез кДНК

Выделенную суммарную РНК 450 нг, Rever Tra Ace (TOYOBO), 10 мМ смеси дНТФ (TOYOBO), 5×RT буфер (TOYOBO) и случайный праймер (Invitrogen) добавляли для синтеза кДНК при использовании амплификатора T3000 (biometra). Условия реакции включали проведение реакции отжига в течение 10 минут при 30°C, реакции обратной транскрипции в течение 60 минут при 42°C и реакции термической денатурации в течение 5 минут при 99°C.

[0125]

3) Метод ПЦР

1 мкл синтезированной комплементарной ДНК, 5 мкл 2×GO Taq GreenMaster Mix (Promega), 1 мкл синтезированного на заказ Прямого праймера (Invitrogen) к mTOR, 1 мкл синтезированного на заказ Обратного праймера (Invitrogen) и 2 мкл H₂O смешивали для амплификации последовательности оснований комплементарной ДНК при использовании амплификатора T3000 (biometra). Условия реакции включали проведение начальной реакции термической денатурации в течение 2 минут при 94°C, затем 26 циклов реакции термической денатурации в течение 30 секунд при 95°C, реакции отжига в течение 20 секунд при 53°C и реакции элонгации в течение 25 секунд при 72°C. Затем проводили реакцию элонгации в течение 5 минут при 72°C. После амплификации проводили детектирование с помощью УФ-облучения при использовании визуализатора Amersham^™ 600 (GE Healthcare Japan) и электрофореза в агарозном геле.

[0126]

Затем, после визуализации, проводили вестерн-блоттинг белков согласно следующей методике.

[0127]

1) Сбор белка

Среду собирали на льду для сбора свободных и мертвых клеток. Также собирали раствор после двухкратной промывки клеток 1×PBS (-). Центрифугировали при 800 g и 4°C в течение 12 минут. Супернатант отбирали для получения осадков. К промытым клеткам добавляли буфер для выделения белка (RIPA; 50 мМ Трис-HCl (рН 7,4), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,1% SDS, 0,5% DOC, 1% NP-40) на льду для выделения белков. Осадки после центрифугирования свободных и мертвых клеток также затем суспендировали вместе для экстракции. Собранный раствор три раза обрабатывали ультразвуком в течение 30 секунд в холодной воде с помощью ультразвукового дезинтегратора (BIORUPTOR, TOSHO DENKI) и центрифугировали в течение 10 мин при 4°C и 15000 об/мин для сбора супернатанта белков.

[0128]

2) Вестерн-блоттинг

5 мкг выделенного белка разделяли с помощью ДСН-ПААГЭ и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. В качестве первичных антител использовали кроличье антитело против mTOR (Cell Signaling, 2972), кроличье антитело против S6K (Cell Signaling, 9202), кроличье антитело против фосфо-S6K (CellSignaling, 9204), и мышиное антитело против GAPDH (MBL, M171-3). В качестве вторичных антител использовали меченные пероксидазой антитело против иммуноглобулина кролика и антитело против иммуноглобулина мыши (GE Healthcare Biosciences, NA931V, NA934V). Что касается первичных антител, кроличье антитело против mTOR: 1000-кратное разведение, кроличье антитело против S6K: 1000-кратное разведение, кроличье антитело против фосфо-S6K: 1000-кратное разведение и мышиное антитело против GAPDH: 5000-кратное разведение, тогда как вторичное антитело разбавляли в 5000 раз. Для детектирования использовали Chemi Lumi ONE Ultra (Nacalai Tesque, 11644-40). Интенсивность детектированных полос определяли с помощью анализатора изображений Lumino LAS-4000 mini (Fuji Film) и программы ImageQuant^™ (GE Healthcare).

[0129]

(Результаты)

(mTOR миРНК подавляет экспрессию mTOR и фосфорилирование S6K)

Результаты показаны на Фигуре 6. При проведении РНКи против mTOR в клетках iFECD, подавление экспрессии mTOR было обнаружено как на уровне РНК, так и на уровне белка. Кроме того, фосфорилирование S6K, как было обнаружено, было подавлено mTOR миРНК на уровне белка. Таким образом, было обнаружено, что экспрессия mTOR и фосфорилирование S6K были подавлены mTOR миРНК в анализах методом ПЦР и вестерн-блоттинга.

[0130]

(Пример 7: Эффект подавления под действием mTOR миРНК повреждения клеток, вызванного TGF-β2)

Среду удаляли из чашки для культивирования, в которой культивировали iFECD, добавляли к клеткам 1×PBS (-), который предварительно нагревали до 37°C, и промывали. Это повторяли два раза. К клеткам снова добавляли 1×PBS (-) и инкубировали в течение 3 минут при 37°C (5% CO₂). После удаления PBS (-) к клеткам добавляли 0,05% трипсина-ЭДТА (Nacalai Tesque, 32778-34) и инкубировали в течение 5 минут при 37°C (5% CO₂). Затем клетки суспендировали в среде и собирали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 3 минут. В качестве среды использовали DMEM (Nacalai Tesque, 08456-36) +10% FBS (Biowest, S1820-500) +1% P/S (Nacalai Tesque, 26252-94).

[0131]

iFECD сеяли в 12-луночный планшет в соотношении 3×10⁴ клеток на лунку и культивировали в течение 24 часов при 37°C (5% CO₂) (среда: DMEM +10% FBS +1% P/S). Через 24 часа среду удаляли. Липофектамин (Invitrogen, 92008) и 3 пмоль mTOR миРНК (Ambion, AS026M0L) добавляли для культивирования клеток в течение 24 часов (среда: OptiMEM-I (Invitrogen, 31985-088)). Используемая mTOR миРНК имела смысловую цепь, представленную в SEQ ID NO: 1, и антисмысловую цепь, представленную в SEQ ID NO: 2. Через 24 часов среду удаляли и культивировали клетки в течение 72 часов при 37°C (5% CO₂) (среда: DMEM +10% FBS +1% P/S). Через 72 часа среду удаляли. Среды, содержащие 10 нг/мл рекомбинантного человеческого TGF-β2 (Wako, 200-19911), добавляли для культивирования клеток в течение 24 часов (среда: DMEM +2% FBS +1% P/S). Через 24 часа морфологию и апоптоз клеток наблюдали с помощью фазово-контрастного микроскопа.

[0132]

(Результаты)

(mTOR миРНК подавляет повреждение клеток, вызванное TGF-β2)

Результаты показаны на Фигуре 7. При стимуляции iFECD рекомбинантным человеческим TGF-β2 без использования mTOR миРНК было обнаружено, что клетки были значительно повреждены. С другой стороны было отмечено, что повреждение эндотелиальных клеток роговицы было подавлено при использовании mTOR миРНК. Поэтому подавление экспрессии mTOR, как было обнаружено, подавляло повреждение клеток, вызываемое TGF-β2.

[0133]

(Пример 8: Эффект подавления под действием mTOR миРНК активации каспазы, индуцированной TGF-β2)

Данный Пример продемонстрировал эффект подавления под действием mTOR миРНК, которая является другим типичным примером ингибитора mTOR, активации каспазы, индуцированной TGF-β2.

[0134]

(Материалы и методы)

Среду удаляли из чашки для культивирования, в которой культивировали iFECD, добавляли к клеткам 1×PBS (-), который предварительно нагревали до 37°C, и промывали. Это повторяли два раза. К клеткам снова добавляли 1×PBS (-) и инкубировали в течение 3 минут при 37°C (5% CO₂). После удаления PBS (-) к клеткам добавляли 0,05% трипсина-ЭДТА (Nacalai Tesque, 32778-34) и инкубировали в течение 5 минут при 37°C (5% CO₂). Затем клетки суспендировали в среде и собирали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 3 минут. В качестве среды использовали DMEM (Nacalai Tesque, 08456-36) +10% FBS (Biowest, S1820-500) +1% P/S (Nacalai Tesque, 26252-94).

[0135]

iFECD сеяли в 12-луночный планшет в соотношении 3×10⁴ клеток на лунку и культивировали в течение 24 часов при 37°C (5% CO₂) (среда: DMEM +10% FBS +1% P/S). Через 24 часа среду удаляли. Липофектамин (invitrogen, 92008) и 3 пмоль mTOR миРНК (Ambion, AS026M0L) добавляли для культивирования клеток в течение 24 часов (среда: OptiMEM-I (invitrogen, 31985-088)). Используемая mTOR миРНК имела смысловую цепь, представленную в SEQ ID NO: 1, и антисмысловую цепь, представленную в SEQ ID NO: 2. Через 24 часа среду удаляли и культивировали клетки в течение 72 часов при 37°C (5% CO₂) (среда: DMEM +10% FBS +1% P/S). Через 72 часа среду удаляли. Среды, содержащие 10 нг/мл рекомбинантного человеческого TGF-β2 (Wako, 200-19911), добавляли для культивирования клеток в течение 24 часов (среда: DMEM +2% FBS +1% P/S). Через 24 часа морфологию и апоптоз клеток наблюдали с помощью фазово-контрастного микроскопа.

[0136]

Затем после микроскопии проводили вестерн-блоттинг белков согласно следующей методике.

[0137]

1) Сбор белка

Среду собирали на льду для сбора свободных и мертвых клеток. Также собирали раствор после двухкратной промывки клеток 1×PBS (-). Центрифугировали при 800 g и 4°C в течение 12 минут. Супернатант отбирали для получения осадков. К промытым клеткам добавляли буфер для выделения белка (RIPA; 50 мМ Трис-HCl (рН 7,4), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,1% SDS, 0,5% DOC, 1% NP-40) на льду для выделения белков. Осадки после центрифугирования свободных и мертвых клеток также затем суспендировали вместе для экстракции. Собранный раствор три раза обрабатывали ультразвуком в течение 30 секунд в холодной воде с помощью ультразвукового дезинтегратора (BIORUPTOR, TOSHO DENKI) и центрифугировали в течение 10 мин при 4°C и 15000 об/мин для сбора супернатанта белков.

[0138]

2) Вестерн-блоттинг

6 мкг выделенного белка разделяли с помощью ДСН-ПААГЭ и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. В качестве первичных антител использовали кроличье антитело против каспазы 3 (Cell Signaling, 9662), кроличье антитело против PARP (Cell Signaling, 9542), и мышиное антитело против GAPDH (MBL, M171-3). В качестве вторичных антител использовали меченные пероксидазой антитело против иммуноглобулина кролика и антитело против иммуноглобулина мыши (GE Healthcare Biosciences, NA931V, NA934V). Что касается первичных антител, кроличье антитело против каспазы 3: 1000-кратное разведение, кроличье антитело против PARP: 2000-кратное разведение и мышиное антитело против GAPDH: 5000-кратное разведение, тогда как вторичное антитело разбавляли в 5000 раз. Для детектирования использовали Chemi Lumi ONE Ultra (Nacalai Tesque, 11644-40). Интенсивность детектированных полос определяли с помощью анализатора изображений Lumino LAS-4000 mini (Fuji Film) и программы ImageQuant^™ (GE Healthcare).

[0139]

(Результаты)

(mTOR миРНК подавляет активацию каспазы, индуцированную TGF-β2)

Результаты показаны на Фигуре 8. При стимуляции клеток iFECD рекомбинантным человеческим TGF-β2 без использования mTOR миРНК, в iFECD наблюдали приблизительно 17 кДа расщепленную каспазу 3, которая является активной формой. С другой стороны, активированную форму расщепленной каспазы 3 почти не наблюдалась в группе с добавкой mTOR миРНК. Таким образом, в вестерн-блот анализе было продемонстрировано, что активация каспазы, индуцированная TGF-β2, подавлена в условиях супрессии сигнала mTOR.

[0140]

(Пример 9: Эффект подавления под действием mTOR миРНК продукции фибронектина, индуцированной TGF-β2)

Данный Пример продемонстрировал эффект подавления под действием mTOR миРНК, которая является другим типичным примером ингибитора mTOR, продукции фибронектина, индуцированной TGF-β2

[0141]

(Материалы и методы)

Среду удаляли из чашки для культивирования, в которой культивировали iFECD, добавляли к клеткам 1×PBS (-), который предварительно нагревали до 37°C, и промывали. Это повторяли два раза. К клеткам снова добавляли 1×PBS (-) и инкубировали в течение 3 минут при 37°C (5% CO₂). После удаления PBS (-) к клеткам добавляли 0,05% трипсина-ЭДТА (Nacalai Tesque, 32778-34) и инкубировали в течение 5 минут при 37°C (5% CO₂). Затем клетки суспендировали в среде и собирали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 3 минут. В качестве среды использовали DMEM (Nacalai Tesque, 08456-36) +10% FBS (Biowest, S1820-500) +1% P/S (Nacalai Tesque, 26252-94).

[0142]

iFECD сеяли в 12-луночный планшет в соотношении 3×10⁴ клеток на лунку и культивировали в течение 24 часов при 37°C (5% CO₂) (среда: DMEM +10% FBS +1% P/S). Через 24 часа среду удаляли. Липофектамин (invitrogen, 92008) и 3 пмоль mTOR миРНК (Ambion, AS026M0L) добавляли для культивирования клеток в течение 24 часов (среда: OptiMEM-I (invitrogen, 31985-088)). Используемая mTOR миРНК имела смысловую цепь, представленную в SEQ ID NO: 1, и антисмысловую цепь, представленную в SEQ ID NO: 2. Через 24 часа среду удаляли и культивировали клетки в течение 48 часов при 37°C (5% CO₂) (среда: DMEM +10% FBS +1% P/S). Через 48 часов среду удаляли. Среды, содержащие 10 нг/мл рекомбинантного человеческого TGF-β2 (Wako, 200-19911), добавляли для культивирования клеток в течение 24 часов (среда: DMEM +2% FBS +1% P/S). Через 24 часа морфологию и апоптоз клеток наблюдали с помощью фазово-контрастного микроскопа.

[0143]

Затем после микроскопии проводили вестерн-блоттинг белков согласно следующей методике.

[0144]

1) Сбор белка

Среду собирали на льду для сбора свободных и мертвых клеток. Также собирали раствор после двухкратной промывки клеток 1×PBS (-). Центрифугировали при 800 g и 4°C в течение 12 минут. Супернатант отбирали для получения осадков. К промытым клеткам добавляли буфер для выделения белка (RIPA; 50 мМ Трис-HCl (рН 7,4), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 0,1% SDS, 0,5% DOC, 1% NP-40) на льду для выделения белков. Осадки после центрифугирования свободных и мертвых клеток также затем суспендировали вместе для экстракции. Собранный раствор три раза обрабатывали ультразвуком в течение 30 секунд в холодной воде с помощью ультразвукового дезинтегратора (BIORUPTOR, TOSHO DENKI) и центрифугировали в течение 10 мин при 4°C и 15000 об/мин для сбора супернатанта белков.

[0145]

2) Вестерн-блоттинг

7 мкг выделенного белка разделяли с помощью ДСН-ПААГЭ и переносили на нитроцеллюлозную мембрану. В качестве первичных антител использовали мышиное антитело против фибронектина (BDBioscience, 610077) и мышиное антитело против GAPDH (MBL, M171-3). В качестве вторичных антител использовали меченные пероксидазой антитело против иммуноглобулина кролика и антитело против иммуноглобулина мыши (GE Healthcare Biosciences, NA931V, NA934V). Что касается первичных антител, кроличье антитело против каспазы 3: 1000-кратное разведение, кроличье антитело против PARP: 2000-кратное разведение и мышиное антитело против GAPDH: 5000-кратное разведение, тогда как вторичное антитело разбавляли в 5000 раз. Для детектирования использовали Chemi Lumi ONE Ultra (Nicolai tissue, 11644-40). Интенсивность детектированных полос определяли с помощью анализатора изображений Lumino LAS-4000 mini (Fuji Film) и программы ImageQuant^™ (GE Healthcare).

[0146]

(Результаты)

(mTOR миРНК подавляет продукцию фибронектина, индуцированную Рекомбинантным человеческим TGF-β2),

Результаты показаны на Фигуре 9. При стимуляции клеток iFECD рекомбинантным человеческим TGF-β2 без использования mTOR миРНК, в iFECD наблюдали продукцию фибронектина. С другой стороны, продукция фибронектина почти не наблюдалась в группе с добавкой mTOR миРНК. Таким образом, с помощью вестерн-блот анализа было обнаружено, что в присутствии mTOR миРНК экспрессия фибронектина подавлена.

[0147]

(Пример 10: Эффект подавления активности каспазы, индуцированной TGF-β2, каждого ингибитора mTOR)

Данный Пример продемонстрировал эффект ингибитора mTOR каждого типа при подавлении активности каспазы, индуцированной TGF-β2.

[0148]

(Материалы и методы)

Среду удаляли из чашки для культивирования, в которой культивировали iFECD, добавляли к клеткам 1×PBS (-), который предварительно нагревали до 37°C, и промывали. Это повторяли два раза. К клеткам снова добавляли 1×PBS (-) и инкубировали в течение 3 минут при 37°C (5% CO₂). После удаления PBS (-) к клеткам добавляли 0,05% трипсина-ЭДТА (Nacalai Tesque, 32778-34) и инкубировали в течение 5 минут при 37°C (5% CO₂). Затем клетки суспендировали в среде и собирали центрифугированием при 1500 об/мин в течение 3 минут. В качестве среды использовали DMEM (Nacalai Tesque, 08456-36) +10% FBS (Biowest, S1820-500) +1% P/S (Nacalai Tesque, 26252-94).

[0149]

Эндотелиальные клетки роговицы из иммортализованных FECD пациентов (партия: iFECD3-5) сеяли в 96-луночный планшет в отношении 4×10³ клеток на лунку и культивировали в течение 24 часов при 37°C (5% CO₂) (среда: DMEM +10% FBS +1% P/S). Через 24 часа среду удаляли. Каждый ингибитор mTOR добавляли в культуру клеток в течение 24 часов (среда: DMEM +2% FBS +1% P/S). Через 24 часа среду удаляли. Среды, содержащие 10 нг/мл рекомбинантного человеческого TGF-β2 (Wako, 200-19911) и каждый ингибитор mTOR, добавляли для культивирования клеток в течение 24 часов (среда: DMEM +2% FBS +1% P/S). Через 24 часа морфологию и апоптоз клеток наблюдали с помощью фазово-контрастного микроскопа.

[0150]

После микроскопии проводили измерение активности каспазы 3/7 с помощью анализа Caspase-Glo® 3/7 согласно следующей методике.

[0151]

Среду отбрасывали до получения 50 мкл на лунку. Добавляли 50 мкл/лунка реагента для анализа Caspase Glo® 3/7 (смесь буфера для анализа Caspase-Glo® 3/7 и субстрата для анализа Caspase-Glo® 3/7) (Promega, G8091) с получением отношения 1:1 со средой. Последующие операции проводили в темноте. Шейкер использовали для тщательного перемешивания содержимого в течение двух минут при 120 об/мин, затем оставляли на 40 минут при комнатной температуре. После выдерживания 80 мкл переносили в планшет для анализа (Corning, 3912, планшет для анализа, 96-лунок, белый полистирол) и измеряли оптическую плотность при использовании системы GloMax-Multi Detection System (Promega, E7051).

[0152]

В данном Примере использовали следующие ингибиторы mTOR.

*Рапамицин (Wako, #53123-88-9)

*Эверолимус (Cayman Chemical, #11597)

*Темсиролимус (Tocris Bioscience, #5264)

*PI-103 (Cayman Chemical, #10009209)

*CC-223 (Cayman Chemical, #19917)

*INK128 (Cayman Chemical, #11811)

*AZD8055 (Cayman Chemical, #16978)

*KU 0063794 (Tocris Bioscience, #3725)

[0153]

(Результаты)

(Рапамицин)

Результаты показаны на Фигуре 10. Анализ Caspase-Glo® 3/7 позволяет измерять активность каспазы 3/7, которая участвует в индукции апоптоза. Чем выше активность каспазы 3/7, тем большее повреждение клеток она вызывает. На Фигуре 10 не было обнаружено значимого отличия в активности каспазы 3/7 по сравнению с контролем при добавлении 0,00001, 0,0001, 0,001 и 0,01 нМ рапамицина. С другой стороны было обнаружено, что активность каспазы 3/7 была значительно подавлена по сравнению с контрольной группой при добавлении 0,1, 1, 10 и 100 нМ рапамицина. Было показано, что даже в концентрации 0,1 нМ, которая является очень низкой, рапамицин значимо подавляет активность каспазы 3/7.

[0154]

(Эверолимус)

Результаты показаны на Фигуре 11. Было обнаружено, что активность каспазы 3/7 была значимо подавлена по сравнению с контролем при добавлении 0,0001, 0,001, 0,01 мкМ и 0,1 мкМ эверолимуса. Было показано, что даже в концентрации 0,0001 мкМ, которая является очень низкой, эверолимус значимо подавляет активность каспазы 3/7.

[0155]

(Темсиролимус)

Результаты показаны на Фигуре 12. Значимое отличие в активности каспазы 3/7 по сравнению с контролем не было обнаружено при добавлении 0,000001 мкМ темсиролимуса. С другой стороны было обнаружено, что активность каспазы 3/7 была значимо подавлена по сравнению с контролем при добавлении 0,00001, 0,0001, 0,001, 0,01, 0,1, 1 и 10 мкМ темсиролимуса. Было показано, что даже в концентрации 0,00001 мкМ, которая является очень низкой, эверолимус значимо подавляет активность каспазы 3/7.

[0156]

(PI-103)

Результаты показаны на Фигуре 13. Значимое отличие в активности каспазы 3/7 по сравнению с контролем не было обнаружено при добавлении 1 мкМ PI-103. С другой стороны было обнаружено, что активность каспазы 3/7 была значимо подавлена по сравнению с контролем при добавлении 0,001, 0,01, и 0,1 мкМ PI-103.

[0157]

(CC-223)

Результаты показаны на Фигуре 14. Было обнаружено, что активность каспазы 3/7 была значимо подавлена по сравнению с контролем при добавлении 0,001, 0,01, 0,1 и 1 мкМ CC-223.

[0158]

(INK128)

Результаты показаны на Фигуре 15. Было обнаружено, что активность каспазы 3/7 была значимо подавлена по сравнению с контролем при добавлении 0,001, 0,01, 0,1 и 1 мкМ INK128.

[0159]

(AZD8055)

Результаты показаны на Фигуре 16. Было обнаружено, что активность каспазы 3/7 была значимо подавлена по сравнению с контролем при добавлении 0,01, 0,1 и 1 мкМ AZD8055.

[0160]

(KU 0063794)

Результаты показаны на Фигуре 17. Значимое отличие в активности каспазы 3/7 по сравнению с контролем не было обнаружено при добавлении 0,001 и 0,01 мкМ KU 0063794. С другой стороны было обнаружено, что активность каспазы 3/7 была значимо подавлена по сравнению с контролем при добавлении 0,1 и 1 мкМ KU 0063794.

[0161]

(Пример 11: Оценка in vivo в модели на мышах)

Данный Пример продемонстрировал in vivo эффект ингибитора mTOR в системе оценки с использованием модели эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса на мышах.

В частности, в данном Примере капельно вводили ингибитор mTOR мыши, имеющей коллаген 8 типа (Col8a2 Q455K/Q455K), которая является моделью эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса на мышах, для подтверждения эффекта in vivo.

[0162]

(Материалы и методы)

Оценку in vivo проведили при использовании мыши с нокаутом по альфа-2 коллагену VIII (Col8a2) Q455K (Hum Mol Genet. 2012 Jan 15; 21 (2): 384-93.), которая является моделью эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса. Отложение внеклеточного матрикса (коллагена, фибронектина и т.п.) на базальной мембране эндотелия роговицы (десцеметовой оболочке), называемое гуттами, и снижение плотности клеток в результате повреждения эндотелия роговицы были обнаружены в этой модели на мышах аналогично проявлениям эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса у человека. Таким образом, эта модель на мышах считается хорошей моделью дистрофии роговицы эндотелия Фукса.

[0163]

Можно лечить или предотвращать возникновение эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса или задерживать прогрессирование патологии путем ингибирования пути mTOR эндотелия роговицы посредством проведения капельного введения в переднюю камеру глаза, интравитреального введения, субконъюнктивального введения или системного введения ингибитора mTOR или проведения генной терапии у такой мыши. Таким образом, в данном примере использовали такую мышь для подтверждения эффекта.

[0164]

(Получение глазных капель ингибитора mTOR)

Торизел® 25 мг в форме раствора для внутривенной инфузии (Pfizer Inc.) (темсиролимус) использовали в качестве глазной капли ингибитора mTOR. Данный продукт и растворитель, прилагаемый к этому продукту, смешивали в отношении 2:3, с получением 92,78 мкл 9,7 мМ смеси. Затем 9,7 мМ смесь разбавляли 807,22 мкл физиологического раствора OTSUKA (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) с получением 900 мкл 1 мМ смеси в 1,5 мл пробирке. Затем приготавливали 900 мкл 10 мкМ смеси при использовании 9 мкл приготовленной 1 мМ смеси и 891 мкл физиологического раствора OTSUKA. После приготовления 1,5 мл пробирку накрывали алюминиевой фольгой для создания темноты и затем хранили в холодильнике при 4°C.

[0165]

(Тест с инстилляцией на мыши)

Использовали мышь, имеющую коллаген 8 типа (Col8a2Q455K/Q455K), которая является моделью эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса (FECD) на мышах (полученную из Университета Джонса Хопкинса). Тяжесть FECD классифицировали по изображению эндотелиаля роговицы перед инстилляцией с использованием мышей в модели FECD, которые имели возраст 20-24 недель с одной и той же степенью состояния. 2 мкл приготовленной глазной капли ингибитора mTOR (1 мМ, 10 мкМ) капельно вводили в каждый левый и правый глаз 45 мышам, два раза в день, утром и вечером. Физиологический раствор OTSUKA использовали для контроля. Период инстилляции составлял 3 месяца, в течение которых ответственное за эксперименты лицо проводило исследование в условиях маскирования относительно глазной капли ингибитора mTOR и контрольной глазной капли (физиологический раствор OTSUKA).

[00166]

(Оценка эффективности глазной капли)

Перед началом теста с инстилляцией визуально исследовали изображения эндотелия роговицы с помощью контактного отражения эндотелия роговицы (широкопольного контактного зеркального микроскопа со щелевым сканированием KSSP (Konan medical Inc., Hyogo, Japan)) для оценки степени. После начала теста с инстилляцией изображения эндотелия роговицы мышей наблюдали один раз в 4 недели с помощью контактного отражения эндотелия роговицы для оценки эффективности глазной капли ингибитора mTOR.

[0167]

(Результаты)

На Фигуре 19 показан типичный пример изображения клеток эндотелия роговицы, наблюдаемый с помощью контактного отражения эндотелия роговицы у мыши в модели FECD, которой капельно вводили 2 мкл глазной капли ингибитора mTOR (1 мМ) в каждый левый и правый глаз два раза в день, утром и вечером, в течение 2 месяцев. Изображение клеток эндотелия роговицы у мыши в модели FECD, которой капельно вводили физиологический раствор, показано в качестве контроля. По сравнению с контролем размер эндотелиальных клеток роговицы меньше, а плотность клеток выше у индивида, которому капельно вводили глазную каплю ингибитора mTOR. Кроме того, образование наростов внеклеточного матрикса, называемых гуттами, которые можно наблюдать на изображении в виде черных пятен с помощью контактного отражения эндотелия роговицы, было подавлено (Фигура 19).

[0168]

Плотность эндотелиальных клеток роговицы в контроле составляла в среднем 1558 клеток/мм², тогда как в группе введения глазной капли ингибитора mTOR среднее значение составляло 1957 клеток/мм², что было значительно выше, таким образом, отражая подавление снижения плотности эндотелиальных клеток роговицы, обнаруженное в модели FECD на мышах (Фигура 20). Это указывает на то, что возникновение отека стромы роговицы, отека эпителия роговицы и т.п., который часто встречается, если плотность эндотелиальных клеток роговицы обычно составляет около 1000 клеток/мм² или меньше, может быть предотвращено при подавления уменьшения количества эндотелиальных клеток роговицы путем капельного введения ингибитора mTOR пациенту с FECD.

[0169]

Кроме того, что касается диапазона гутт, контроль имел среднее значение 3,02%, тогда как в группе с инстилляцией ингибитора mTOR среднее значение составляло 0,58%, что было значительно ниже, таким образом, отражая подавление образования гутт, обнаруженных у мыши в модели FECD (Фигура 21). Когда такой же анализ проводили на 15 мышах, были обнаружены статистически значимые различия в отношении диапазона гутт. Известно, что гутты вызывают снижение зрительной функции из-за неравномерного отражения света и т.п., даже у пациента с FECD на ранней стадии, у которого нет отека стромы роговицы или эпителия роговицы. Таким образом, данный результат указывает, что снижение зрительной функции вследствие нерегулярного отражения света может быть подавлено посредством подавления образования гутт путем инстилляционного введения ингибитора mTOR пациенту с FECD.

[0170]

(Пример 12: Диагноз и пример терапии)

Настоящее изобретение применяется при диагностике эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса или подобного эндотелиального заболевания роговицы (конкретные примеры включают: 1) наблюдение образования гутт, гипертрофии десцеметовой оболочки, отека эпителия роговицы или отека стромы роговицы с помощью микроскопии со щелевой лампой, 2) наблюдение изображений гутт или эндотелиального нарушения роговицы с помощью отражательного микроскопа, 3) наблюдение отека роговицы с помощью Pentacam, ОКТ, ультразвукового измерителя толщины роговицы и т.п., и 4) при определении высокого риска с помощью генетической диагностики). Настоящее изобретение может использоваться в терапии в виде глазных капель, инъекции в переднюю камеру глаза, введении с применением средства с контролируемым высвобождением, интравитреальной инъекции, субконъюнктивальной инъекции и т.п.

[0171]

Доступное в продаже вещество, которое соответствует требованиям Японской Фармакопеи, эквивалентный ему продукт и т.п., может использоваться в качестве любого другого компонента кроме действующего вещества.

[0172]

(Пример 13: Пример изготовления глазных капель)

В качестве примера изготовления композиции, в данном Примере описано производство глазной капли, содержащей ингибитор mTOR, следующим образом.

[0173]

Композиция тестируемых веществ в каждой концентрации показана ниже.

[0174]

Рапамицин Эффективное количество (например, конечная концентрация 0,1 мМ) Натрия хлорид Натрия дигидрофосфат дегидрат (Необязательно) Бензалкония хлорид Натрия гидроксид Оптимальная доза Очищенная вода Оптимальная доза Общее количество 100 мл (pH 7,0)

Концентрация может быть разбавлена при использовании основы, состоящей из следующих компонентов.

[0175]

Натрия хлорид Натрия дигидрофосфат дегидрат (Необязательно) Бензалкония хлорид Натрия гидроксид Оптимальная доза Очищенная вода Оптимальная доза Общее количество 100 мл (pH 7,0)

[0176]

(Пример 14: Тест инстилляции на мыши)

Инстилляцию ингибитора mTOR делали мыши, имеющей коллаген 8 типа (Col8a2 Q455K/Q455K), которая является мышью в модели эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса в данном Примере. Эта используемая в модели мышь демонстрирует отложение внеклеточного матрикса (коллагена, фибронектина и т.п.), характерное для эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса.

(Материалы и методы)

[0177]

Как раскрыто выше, настоящее изобретение проиллюстрировано с использованием его предпочтительных вариантов осуществления. Однако необходимо понимать, что объем настоящего изобретения нужно интерпретировать исключительно на основании Формулы изобретения. Также подразумевается, что любой патент, любая заявка на патент и любые источники, цитируемые в рамках изобретения, должны быть включены в него посредством отсылки таким же образом, как содержимое, конкретно описанное в рамках изобретения. Настоящая заявка испрашивает приоритет по заявке на патент Японии 2017-118619 (поданной 16 июня 2017 года). Все ее содержание включено в настоящий документ посредством отсылки.

[Промышленная применимость]

[0178]

Настоящее изобретение относится к лекарственному средству для применения в лечении или профилактике эндотелиального нарушения роговицы, опосредованного трансформирующим фактором роста β (TGF-β) и/или суперэкспрессией внеклеточного матрикса в клетках эндотелия роговицы, в особенности лекарственное средство для применения в лечении или профилактике эндотелиального нарушения роговицы при эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса. В настоящем изобретении представлена технология, доступная для отраслей промышленности (фармацевтической или подобной), использующих технологии, связанные с производством фармацевтических композиций и т.п., на основе такой технологии.

[Список последовательностей в форме открытого текста]

[0179]

SEQ ID NO: 1: Смысловая цепь mTOR миРНК

SEQ ID NO: 2: Антисмысловая цепь mTOR миРНК

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> The Doshisha

<120> СОДЕРЖАЩЕЕ ИНГИБИТОР mTOR ЛЕКАРСТВЕННОЕ СРЕДСТВО ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ

ИЛИ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ГЛАЗНЫХ СИМПТОМОВ, НАРУШЕНИЙ ИЛИ ЗАБОЛЕВАНИЙ

И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ

<130> DU004

<150> JP 2017-118619

<151> 2017-06-16

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> Смысловая цепь миРНК

<400> 1

cauucgcauu caguccauat t 21

<210> 2

<211> 21

<212> ДНК

<213> искусственная последовательность

<220>

<223> Антисмысловая цепь миРНК

<400> 2

uauggacuga augcgaauga t 21

<---

Группа изобретений относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и предназначена для профилактики или лечении патологического состояния эндотелия роговицы. Применяют композицию, включающую рапамицин в качестве единственного активного ингредиента, в профилактике или лечении эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса. Также, представлено применение композиции, включающей рапамицин, для консервации и/или роста или поддержания роста эндотелиальных клеток роговицы. Использование группы изобретений обеспечивает профилактику или лечение эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, а также консервацию и/или рост или поддержание роста эндотелиальных клеток роговицы. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 21 ил., 14 пр.

1. Применение композиции, включающей рапамицин в качестве единственного активного ингредиента, в профилактике или лечении эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса.

2. Применение по п. 1, причем композиция представляет собой глазные капли.

3. Применение по п. 1 или 2, где рапамицин присутствует в композиции в концентрации по меньшей мере приблизительно 0,1 нМ.

4. Применение композиции, включающей рапамицин, для консервации и/или роста или поддержания роста эндотелиальных клеток роговицы.