КОМПОЗИЦИЯ ИЛИ СПОСОБ, ВКЛЮЧАЮЩИЕ (T)EW-7197, ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИЛИ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЭНДОТЕЛИЯ РОГОВИЦЫ Российский патент 2023 года по МПК A61K31/444 A61P27/02 

[Область техники]

[0001]

Настоящее изобретение относится к новому применению (T)EW-7197. Более конкретно, настоящее изобретение относится к технологии, способу или агенты для лечения или предотвращения состояния, расстройства или заболевания эндотелия роговицы, включающим (T)EW-7197 (N-((4-([1,2,4]триазоло[1,5-a]пиридин-6-ил)-5-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-имидазол-2-ил)метил)-2-фторанилин) или его производное, или его фармацевтически приемлемую соль, или его сольват, и технологии консервации клеток эндотелия роговицы, применяя данную технологию.

[Уровень техники]

[0002]

Визуальная информация распознается, когда свет, передаваемый в роговицу, которая представляет собой прозрачную ткань в передней части глазного яблока, достигает сетчатки и возбуждает нервные клетки сетчатки, и сгенерированный электрический сигнал передается через зрительный нерв в зрительную кору головного мозга. Для достижения хорошего зрения необходимо, чтобы роговица была прозрачной. Прозрачность роговицы поддерживается за счет поддержания постоянного содержания воды с помощью насоса и защитных функций клеток эндотелия роговицы.

[0003]

Тогда как клетки эндотелия роговицы человека присутствуют при плотности приблизительно 3000 клеток на 1 мм² при рождении, после повреждения способность к регенерации очень ограничена. Одно из эндотелиальных заболеваний роговицы, эндотелиальная дистрофия роговицы Фукса, представляет собой заболевание, вызывающее аномалию эндотелиальных клеток внутри роговицы, что приводит к отеку роговицы. Причина этого неизвестна. При эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса внеклеточный матрикс, такой как коллаген, откладывается на части задней поверхности десцеметовой оболочки в задней части роговицы, что приводит к эндотелиальным изменениям роговицы в виде капель и утолщению десцеметовой оболочки. Эндотелиальные изменения роговицы в виде капель и утолщение десцеметовой оболочки являются причинами бликов или помутнения зрения у пациентов с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса, что ставит под угрозу качество жизни пациентов. Ясно, что не существует эффективного терапевтического способа, кроме трансплантации роговицы при эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса. Однако существует дефицит донорства роговицы в Японии, где количество пациентов, ожидающих трансплантации роговицы, составляет около 2600, тогда как количество трансплантаций роговицы, проводимых в Японии, составляет около 1700 ежегодно.

[Сущность настоящего изобретения]

[Решение проблемы]

[0004]

Изобретатели обнаружили, что (T)EW-7197 (N-((4-([1,2,4]триазоло[1,5-a]пиридин-6-ил)-5-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-имидазол-2-ил)метил)-2-фторанилин) со следующей структурой:

[Химическая формула 1]

проявляет очень хороший эффект подавления клеточных нарушений в клетках модели нарушения эндотелия роговицы. Эффект подавления клеточных нарушений (T) EW-7197 был подтвержден даже при очень низкой концентрации. Кроме того, изобретатели также обнаружили, что (T)EW-7197 может подавлять экспрессию внеклеточного матрикса (ECM), такого как фибронектин, для лечения нарушений ECM при нарушениях эндотелия роговицы в клетках модели нарушения эндотелия роговицы.

[0005]

Следовательно, настоящее изобретение относится, например, к следующим пунктам.

(Пункт 1)

Композиция для лечения или предотвращения состояния, расстройства или заболевания эндотелия роговицы, содержащая (T)EW-7197 (N-((4-([1,2,4]триазоло[1,5-a]пиридин-6-ил)-5-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-имидазол-2-ил)метил)-2-фторанилин) или его производное или его фармацевтически приемлемую соль, или его сольват.

(Пункт 2)

Композиция по пункту 1, где композиция предназначены для подавления снижения плотности эндотелиальных клеток роговицы.

(Пункт 3)

Композиция по пункту 1 или 2, где состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы представляет собой эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса или эндотелиальные изменения роговицы в виде капель.

(Пункт 4)

Композиция по пункту 1, где состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы является результатом сверхэкспресии внеклеточного матрикса (ECM).

(Пункт 5)

Композиция по пункту 4, где внеклеточный матрикс (ECM) выбран из группы, состоящей из коллагена I типа, коллагена IV типа, коллагена V типа и фибронектина.

(Пункт 6)

Композиция по пункту 4 или 5, где состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы выбрано из группы, состоящей из эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, образования капель, утолщения десцеметовой оболочки, утолщения роговицы, непрозрачности роговицы, шрама, помутнения роговицы, желтого пятна роговицы, бельма, бликов, и расфокусированного зрения.

(Пункт 7)

Фармацевтическая композиция по любому из пунктов 1-6, где состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы представляет собой эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса.

(Пункт 8)

Композиция по любому из пунктов 1-7, где (T)EW-7197 или его производное или его фармацевтически приемлемая соль, или его сольват находятся в композиции при концентрации от приблизительно 0,001 мМ до приблизительно 10 мМ.

(Пункт 9)

Композиция по любому из пунктов 1-8, где (T)EW-7197 или его производное, или его фармацевтически приемлемая соль или его сольват находятся в композиции при концентрации от приблизительно 0,01 мМ до приблизительно 5 мМ.

(Пункт 10)

Композиция по любому из пунктов 1-9, которая представляет собой глазные капли.

(Пункт A1)

Способ лечения или предотвращения состояния, расстройства или заболевания эндотелия роговицы у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества (T)EW-7197 (N-((4-([1,2,4]триазоло[1,5-a]пиридин-6-ил)-5-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-имидазол-2-ил)метил)-2-фторанилина) или его производного, или его фармацевтически приемлемой соли или его сольвата.

(Пункт A2)

Способ по пункту A1, где способ подавляет снижение плотности эндотелиальных клеток роговицы.

(Пункт A3)

Способ по пункту A1 или A2, где состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы представляет собой эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса или эндотелиальные изменения роговицы в виде капель.

(Пункт A4)

Способ по пункту A1, где состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы является результатом сверхэкспрессии внеклеточного матрикса (ECM).

(Пункт A5)

Способ по пункту A4, где внеклеточный матрикс (ECM) выбран из группы, состоящей из коллагена I типа, коллагена IV типа, коллагена V типа и фибронектина.

(Пункт A6)

Способ по пункту A4 или A5, где состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы выбран из группы, состоящей из эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, образования капель, утолщения десцеметовой оболочки, утолщения роговицы, непрозрачности роговицы, шрама, помутнения роговицы, желтого пятна роговицы, бельма, бликов, и расфокусированного зрения.

(Пункт A7)

Способ по любому из пунктов A1-A6, где состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы представляет собой эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса.

(Пункт A8)

Способ по любому из пунктов A1-A7, где (T)EW-7197 или его производное или его фармацевтически приемлемую соль, или его сольват вводят при концентрации от приблизительно 0,001 мМ до приблизительно 10 мМ.

(Пункт A9)

Способ по любому из пунктов A1-A8, где (T)EW-7197 или его производное, или его фармацевтически приемлемую соль, или его сольват вводят при концентрации от приблизительно 0,01 мМ до приблизительно 5 мМ.

(Пункт A10)

Способ по любому из пунктов A1-A9, где (T)EW-7197 или его производное, или его фармацевтически приемлемую соль, или его сольват вводят в виде глазных капель.

(Пункт B1)

Применение (T)EW-7197 (N-((4-([1,2,4]триазоло[1,5-a]пиридин-6-ил)-5-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-имидазол-2-ил)метил)-2-фторанилина) или его производного, или его фармацевтически приемлемой соли, или его сольвата в получении лекарственного средства для лечения или предотвращения состояния, расстройства или заболевания эндотелия роговицы.

(Пункт B2)

Применение по пункту B1, где лекарственное средство предназначено для подавления снижения плотности эндотелиальных клеток роговицы.

(Пункт B3)

Применение по пункту B1 или B2, где состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы представляет собой эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса или эндотелиальные изменения роговицы в виде капель.

(Пункт B4)

Применение по пункту B1, где состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы является результатом сверхэкспрессии внеклеточного матрикса (ECM).

(Пункт B5)

Применение по пункту B4, где внеклеточный матрикс (ECM) выбран из группы, состоящей из коллагена I типа, коллагена IV типа, коллагена V типа и фибронектина.

(Пункт B6)

Применение по пункту B4 или B5, где состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы выбрано из группы, состоящей из эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, образования капель, утолщения десцеметовой оболочки, утолщения роговицы, непрозрачности роговицы, шрама, помутнения роговицы, желтого пятна роговицы, бельма, бликов и расфокусированного зрения.

(Пункт B7)

Применение по любому из пунктов B1-B6, где состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы представляет собой эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса.

(Пункт B8)

Применение по любому из пунктов B1-B7, где (T)EW-7197 или его производное, или его фармацевтически приемлемую соль, или его сольват находятся в композиции при концентрации от приблизительно 0,001 мМ до приблизительно 10 мМ.

(Пункт B9)

Применение по любому из пунктов B1-B8, где (T)EW-7197 или его производное, или его фармацевтически приемлемую соль, или его сольват находятся в лекарственном средстве при концентрации от приблизительно 0,01 мМ до приблизительно 5 мМ.

(Пункт B10)

Применение по любому из пунктов B1-B9, где лекарственное средство представляет собой глазные капли.

(Пункт C1)

Соединение для применения в лечении или предотвращении состояния, расстройства или заболевания эндотелия роговицы, где соединение представляет собой (T)EW-7197 (N-((4-([1,2,4]триазоло[1,5-a]пиридин-6-ил)-5-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-имидазол-2-ил)метил)-2-фторанилин) или его производное, или его фармацевтически приемлемую соль, или его сольват.

(Пункт C2)

Соединение по пункту C1, где соединение предназначено для применения в подавлении снижения плотности эндотелиальных клеток роговицы.

(Пункт C3)

Соединение по пункту C1 или C2, где состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы представляет собой эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса или эндотелиальные изменения роговицы в виде капель.

(Пункт C4)

Соединение по пункту C1, где состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы является результатом сверхэкспрессии внеклеточного матрикса (ECM).

(Пункт C5)

Соединение по пункту C4, где внеклеточный матрикс (ECM) выбран из группы, состоящей из коллагена I типа, коллагена IV типа, коллагена V типа и фибронектина.

(Пункт C6)

Соединение по пункту C4 или C5, где состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы выбрано из группы, состоящей из эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, образования капель, утолщения десцеметовой оболочки, утолщения роговицы, непрозрачности роговицы, шрама, помутнения роговицы, желтого пятна роговицы, бельма, бликов, и расфокусированного зрения.

(Пункт C7)

Соединение по любому из пунктов C1-C6, где состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы представляет собой эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса.

(Пункт C8)

Соединение по любому из пунктов C1-C7, где соединение вводят при концентрации от приблизительно 0,001 мМ до приблизительно 10 мМ.

(Пункт C9)

Соединение по любому из пунктов C1-C8, где соединение вводят при концентрации от приблизительно 0,01 мМ до приблизительно 5 мМ.

(Пункт C10)

Соединение по любому из пунктов C1-C9, где соединение вводят в виде глазных капель.

[0006]

Настоящее изобретение предназначено для того, чтобы иметь возможность обеспечить один или несколько из вышеупомянутых признаков в дополнительных комбинациях в дополнение к явно показанным комбинациям. Другие варианты осуществления и преимущества настоящего изобретения будут ясны специалистам в данной области техники при прочтении и понимании следующего подробного описания, при необходимости.

[Полезные эффекты настоящего изобретения]

[0007]

Настоящее изобретение относится к лекарственному средству, которое лечит или предотвращает состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы, содержащему (T)EW-7197 (N-((4-([1,2,4]триазоло[1,5-a]пиридин-6-ил)-5-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-имидазол-2-ил)метил)-2-фторанилин) или его производное, или его фармацевтически приемлемую соль, или его сольват. Кроме того, настоящее изобретение относится к композиции для консервации эндотелиальной клетки роговицы или композиции для стимуляции роста эндотелиальной клетки роговицы, содержащей (T)EW-7197 или его производное, или его фармацевтически приемлемую соль, или его сольват.

[Краткое описание чертежей]

[0008]

Фиг. 1 показывает фазово-контрастные микроскопические снимки иммортализованных клеток эндотелия роговицы, полученных у пациента с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса (iFECD), которые представляют собой модель эндотелиального заболевания роговицы (слева: без добавления TGF-β, справа: с добавлением TGF-β

Фиг. 2 показывает фазово-контрастные микроскопические снимки иммортализованных клеток эндотелия роговицы, полученных у пациента с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса (iFECD), обработанных EW-7197 и SB431542.

Фиг. 3 показывает таблицу, суммирующую оценку эффекта подавления клеточных расстройств в iFECD, наблюдаемого на фигуре 2.

Фиг. 4 показывает фазово-контрастные микроскопические снимки иммортализованных клеток эндотелия роговицы, полученных у пациента с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса (iFECD), которые обрабатывали EW-7197 зависящим от концентрации способом.

Фиг. 5 показывает графики степени выживаемости клеток и активности каспазы 3/7 в iFECD в присутствии SB431542.

Фиг. 6 показывает графики для процента выживаемости клеток и активности каспазы 3/7 в iFECD в присутствии EW-7197.

Фиг. 7 показывает результаты вестерн-блота для фибронектина, расщепленной каспазы 3 и PARP в iFECD.

Фиг. 8 показывает результаты анализа площади экспрессии коллагена I типа и фибронектина в группе с глазными каплями с 0,02% EW-7197 и группе с глазными каплями с основой ("средой"). Вертикальная ось указывает площадь экспрессии (в пикселях).

Фиг. 9 показывает результаты анализа площади экспрессии фибронектина в группах с глазными каплями с 0,02% и 0,1% EW-7197 и группе с глазными каплями с основой ("средой"). Вертикальная ось указывает площадь экспрессии (в пикселях). На левом графике показаны результаты анализа после исключения люминесценции 30000 или менее в поле зрения при увеличении в 40 раз (в центре, в направлении 6 часов и в направлении 9 часов (со стороны уха)). Правый график показывает результаты анализа в поле зрения при увеличении в 100 раз (направление 3 часа (сторона носа)).

[Описание вариантов осуществления]

[0009]

Настоящее изобретение описано далее. Во всем описании, единичное выражение следует понимать как охватывающий его понятие во множественном числе, если специально не указано иное. Таким образом, единичные артикли (например, "a", "an", "the" и подобные в случае английского) также следует понимать как охватывающие их понятие во множественном числе, если специально не указано иное. Кроме того, термины, применяемые в настоящем изобретении, следует понимать как применяемые в значении, которое обычно применяют в данной области техники, если специально не указано иное. Следовательно, если не определено иначе, все термины и научные технические термины, которые применяют в настоящем изобретении, имеют то же значение, как общеизвестно специалистам в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. В случае противоречия настоящее изобретение (включая определения) имеет приоритет.

[0010]

(Определения)

Как применяют в настоящем изобретении, "приблизительно" относится к диапазону±10% последующего числового значения, если специально не указано иное.

[0011]

Как применяют в настоящем изобретении, "субъект" относится к мишени введения (трансплантат) терапевтического или превентативного лекарственного средства или способу настоящего изобретения. Примеры субъектов включают млекопитающих (например, людей, мышей, крыс, хомяков, кроликов, кошек, собак, коров, лошадей, овец, обезьян и подобных), но приматы являются предпочтительными, и люди являются особенно предпочтительной.

[0012]

Как применяют в настоящем изобретении, "EW-7197" и "TEW-7197" применяют взаимозаменяемо, ссылаясь на N-((4-([1,2,4]триазоло[1,5-a]пиридин-6-ил)-5-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-имидазол-2-ил)метил)-2-фторанилин. "EW-7197" и "TEW-7197" также совместно обозначены в настоящем изобретении как "(T)EW-7197".

[0013]

Как применяют в настоящем изобретении, состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы "в результате сверхэкспрессии внеклеточного матрикса (ECM)" в основном представляет собой состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы, связанное с помутнением, отложением, гипертрофией или подобными внеклеточного матрикса, или состояние, которое вызывает снижение зрения из-за капель на поверхности эндотелия роговицы, утолщения десцеметовой оболочки, таких как мутные капли десцеметовой оболочки, или подобные. При заболеваниях эндотелия роговицы, таких как дистрофия роговицы Фукса, перепроизводство внеклеточного матрикса ухудшает зрение или визуальное распознавание даже без снижения количества клеток, в отличие от обострения при состоянии, вызванном смертью (особенно апоптозом) клеток эндотелия роговицы. Таким образом, даже если гибель клеток может быть подавлена, это необходимо решить.

[0014]

Как применяют в настоящем изобретении, "производное" относится к соединению с химической или физической модификацией, такой как функциональная группа, которое имеет ту же или аналогичную основную структуру, как основная структура исходного соединения, но является отличной, или дополнительная функциональная группа. Производное имеет ту же или аналогичную биологическую активностью как исходное соединение.

[0015]

Как применяют в настоящем изобретении, "фармацевтически приемлемая соль" относится к соли присоединения неорганической или органической кислоты соединения настоящего изобретения, которая является относительно нетоксичной. Данные соли можно получить реакцией временно очищенного соединения между окончательным выделением и очисткой соединения или формой свободного основания отдельно с подходящей органической или неорганической солью и выделением соли, образованной таким образом.

[0016]

Примеры фармацевтически приемлемых солей оснований соединения настоящего изобретения включают соли щелочных металлов, такие как соли натрия и соли калия; соли щелочноземельных металлов, такие как соли кальция и соли магния; соли аммония; соли алифатических аминов, такие как соли триметиламина, соли триэтиламина, соли дициклогексиламина, соли этаноламина, соли диэтаноламина, соли триэтаноламина, соли прокаина, соли меглумина, соли диэтаноламина и соли этилендиамина; соли аралкиламина, такие как соли N, N-дибензилэтилендиамина и бенетамина; соли гетероциклического ароматического амина, такие как соли пиридина, соли пиколина, соли хинолина и соли изохинолина; соли четвертичного аммония, такие как соли тетраметиламмония, соль тетраэтиламмония, соли бензилтриметиламмония, соли бензилтриэтиламмония, соли бензилтрибутиламмония, соли метилтриоктиламмония, соли тетрабутиламмония; соли основных аминокислот, такие как соли аргинина и соли лизина; и подобные.

[0017]

Примеры фармацевтически приемлемых солей кислот соединения настоящего изобретения включают соли неорганических кислот, такие как гидрохлориды, сульфаты, нитраты, фосфаты, карбонаты, гидрокарбонаты и перхлораты; соли органических кислот, такие как ацетаты, пропионаты, лактаты, малеаты, фумараты, тартраты, малаты, цитраты и аскорбат; сульфонаты, такие как метансульфонаты, изетионаты, бензолсульфонаты и п-толуолсульфонаты; кислые аминокислоты, такие как аспартаты и глутаматы; и подобные.

[0018]

Как применяют в настоящем изобретении, "сольват" относится к сольвату соединения настоящего изобретения или его фармацевтически приемлемой соли, включая, например, сольват органического растворителя (например, спирта (этанола или подобного), гидрат и подобные. При образовании гидрата соединение может координироваться с любым количеством молекул воды. Примеры гидратов включают моногидраты, дигидраты и подобные.

[0019]

Как применяют в настоящем изобретении, "iFECD" (иммобилизованная эндотелиальная дистрофия роговицы Фукса) представляет собой сокращение для иммортализованных клеток эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса.

[0020]

Как применяют в настоящем изобретении, "HCEC" представляет собой сокращение для человеческих клеток эндотелия роговицы. Кроме того, "iHCEC" представляет собой сокращение для иммортализованных человеческих клеток эндотелия роговицы.

[0021]

Как применяют в настоящем изобретении, "субъект" относится к мишени введения (трансплантату) терапевтического или превентативного лекарственного средства или способу настоящего изобретения. Примеры субъектов включают млекопитающих (например, людей, мышей, крыс, хомяков, кроликов, кошек, собак, коров, лошадей, овец, обезьян и подобных), но приматы являются предпочтительными, и люди являются особенно предпочтительной.

[0022]

Как применяют в настоящем изобретении, "состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы" относится к любому состоянию, расстройству или заболеванию, связанному с эндотелием роговицы. Их репрезентативные примеры включают, но не ограничиваются, эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса, эндотелиальные изменения роговицы в виде капель, нарушение после трансплантации роговицы, эндотелиит роговицы, травму, нарушение после глазной хирургии, нарушение после лазерной глазной хирургии, старение, заднюю полиморфную дистрофию (PPD), врожденную наследственную эндотелиальную дистрофию (CHED), идиопатическое нарушение эндотелия роговицы, цитомегаловирусный эндотелиит роговицы и подобные. В предпочтительном варианте осуществления, состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы включает эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса. В другом варианте осуществления, состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы является результатом сверхэкспрессии внеклеточного матрикса (ECM), например, в результате сверхэкспрессии коллагена I типа, коллагена IV тип, коллагена V типа и фибронектина.

[0023]

Состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы в результате сверхэкспрессии внеклеточного матрикса (ECM) включает любое состояние, расстройство или заболевание со сверхэкспрессией ECM, наблюдаемой в эндотелии роговицы. Их примеры включают, но не ограничиваются, эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса, образование капель, утолщение десцеметовой оболочки, утолщение роговицы, непрозрачность роговицы, шрам, помутнение роговицы, желтое пятно роговицы, бельмо, блики, расфокусированное зрение и подобные.

[0024]

(Общая технология)

Молекулярно-биологическая методология, биохимическая методология и микробиологическая методология, применяемые в настоящем изобретении, являются хорошо известными и традиционно применяемыми в данной области техники, которые описаны, например, в Sambrook J. et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor и его 3ье издание (2001); Ausubel, F.M. (1987). Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley−Interscience; Ausubel, F.M. (1989). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley−Interscience; Innis, M.A. (1990). PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academic Press; Ausubel, F.M. (1992). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Ausubel, F.M. (1995). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates; Innis, M.A. et al. (1995). PCR Strategies, Academic Press; Ausubel, F.M. (1999). Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods из Current Protocols in Molecular Biology, Wiley, и ежегодные дополнения; Sninsky, J.J. et al. (1999). PCR Applications: Protocols for Functional Genomics, Academic Press, Gait, M.J. (1985). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Gait, M.J. (1990). Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein, F. (1991). Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Adams, R.L. et al. (1992). The Biochemistry of the Nucleic Acids, Chapman & Hall; Shabarova, Z. et al. (1994). Advanced Organic Chemistry of Nucleic Acids, Weinheim; Blackburn, G.M. et al. (1996). Nucleic Acids in Chemistry и Biology, Oxford University Press; Hermanson, G.T. (1996). Bioconjugate Techniques, Academic Press, Bessatsu Jikken Igaku [Experimental Medicine, Supplemental Volume], Idenshi Donyu & Hatsugen Kaiseki Jikken Ho [Experimental Methods for Transgenesis & Expression Analysis], Yodosha, 1997, или подобные. Сообщения Nancy Joyce et al. {Joyce, 2004 #161} и {Joyce, 2003 #7} являются хорошо известными для клеток эндотелия роговицы. Однако, как описано выше, длительная культура или субкультура приводят к фибробластоподобной трансформации, и в настоящее время продолжаются исследования для эффективного способа культивирования. Соответствующие их части (которые могут быть целым документом) включены в настоящее изобретение с помощью ссылки.

[0025]

(Описание предпочтительных вариантов осуществления)

Предпочтительные варианты осуществления описаны в настоящем изобретении ниже. Ясно, что варианты осуществления являются примером настоящего изобретения, так что объем настоящего изобретения не ограничивается данными предпочтительными вариантами осуществления. Ясно, что специалист в данной области техники может ссылаться на следующие предпочтительные варианты осуществления, легко внося модификации или изменения в пределах объема настоящего изобретения. Любой из данных вариантов осуществления может быть соответствующим образом объединен специалистами в данной области техники.

[0026]

<Композиция>

В одном аспекте, настоящее изобретение относится к композиции для лечения или предотвращения состояния, расстройства или заболевания эндотелия роговицы, содержащей (T)EW-7197 (N-((4-([1,2,4]триазоло[1,5-a]пиридин-6-ил)-5-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-имидазол-2-ил)метил)-2-фторанилин) или его производное, или его фармацевтически приемлемую соль, или его сольват. В некоторых вариантах осуществления, композиция настоящего изобретения предназначена для подавления снижение плотности эндотелиальных клеток роговицы. (T)EW-7197, применяемый в композиции настоящего изобретения, может подавлять нарушения эндотелия роговицы тем же способом, как SB431542, о котором известно, что он подавляет нарушения эндотелия роговицы. Неожиданно, эффект подавления нарушений эндотелия роговицы (T)EW-7197 также наблюдали при очень низких концентрациях. В то время как эффект подавления нарушений эндотелия роговицы не наблюдали для SB431542 при суб-мкМ (от 1 мкМ до 0,1 мкМ), очень сильный эффект подавления нарушений эндотелия роговицы наблюдали для (T) EW-7197 даже при низкой концентрации 0,03 мкМ. Таким образом, (T) EW-7197, применяемый в настоящем изобретении, может оказывать очень высокий терапевтический эффект на эндотелий роговицы. Кроме того, токсичность для клеток едва ли была обнаружена в тесте на выживаемость клеток, так что (T) EW-7197 также превосходен с точки зрения безопасности.

[0027]

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к композиции для подавления снижения плотности эндотелиальных клеток роговицы, содержащей (T)EW-7197 (N-((4-([1,2,4]триазоло[1,5-a]пиридин-6-ил)-5-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-имидазол-2-ил)метил)-2-фторанилин) или его производное, или его фармацевтически приемлемую соль, или его сольват.

[0028]

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к (T)EW-7197 (N-((4-([1,2,4]триазоло[1,5-a]пиридин-6-ил)-5-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-имидазол-2-ил)метил)-2-фторанилину) или его производному, или его фармацевтически приемлемой соли, или его сольвату (далее называют соединением настоящего изобретения или подобным) для лечения или предотвращения состояния, расстройства или заболевания эндотелия роговицы. В некоторых вариантах осуществления, соединение настоящего изобретения или подобное предназначены для подавления снижения плотности эндотелиальных клеток роговицы. (T)EW-7197 в соединении настоящего изобретения или подобном может подавлять нарушения эндотелия роговицы тем же способом, как SB431542, о котором известно, что он подавляет нарушения эндотелия роговицы. Эффект подавления нарушений эндотелия роговицы (T)EW-7197 также наблюдали при очень низких концентрациях. В то время как эффект подавления нарушений эндотелия роговицы не наблюдали для SB431542 при суб-мкМ (от 1 мкМ до 0,1 мкМ), очень сильный эффект подавления нарушений эндотелия роговицы наблюдали для (T) EW-7197 даже при низкой концентрации 0,03 мкМ. Таким образом, (T) EW-7197, применяемый в настоящем изобретении, может оказывать очень высокий терапевтический эффект на эндотелий роговицы. Кроме того, токсичность для клеток едва ли была обнаружена в тесте на выживаемость клеток, так что (T) EW-7197 также превосходен с точки зрения безопасности.

[0029]

Композиция настоящего изобретения может представлять собой фармацевтическую композицию (например, глазные капли, внутрикамерную инъекцию, интравитреальную инъекцию или субконъюнктивальную инъекцию). Фармацевтическая композиция может дополнительно содержать фармацевтически приемлемый носитель. Примеры фармацевтически приемлемых носителей включают, но не ограничиваются, любой растворитель, разбавитель, другие жидкие носители, агенты, улучшающие диспергирование или суспендирование, поверхностные активаторы, изотонизирующие агенты, загустители, эмульгаторы, консерванты, твердые связующие агенты, смазывающие агенты и подобные, которые будут подходить для конкретной требуемой лекарственной формы. Remington's Pharmaceutical Sciences, под редакцией Gennaro, Mack Publishing, Easton, PA, 1995, описывает различные носители, применяемые в известных технологиях для приготовления фармацевтических композиций и их приготовления.

Некоторые примеры материалов, которые могут функционировать в качестве фармацевтически приемлемого носителя, включают, но не ограничиваются, сахара, такие как лактоза, глюкоза и сахароза; крахмалы, такие как кукурузный крахмал и картофельный крахмал; целлюлозу и ее производные, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, этилцеллюлоза и ацетат целлюлозы; порошкообразный трагакант; солод; желатин; тальк; наполнители, такие как какао-порошок и воск для суппозиториев; масло, такое как арахисовое масло, хлопковое масло, сафлоровое масло, кунжутное масло, оливковое масло, кукурузное масло и соевое масло; гликоли, такие как пропиленгликоль; сложные эфиры, такие как этилолеат и этиллауреат; агар; буферные агенты, такие как гидроксид магния и гидроксид алюминия; альгиновую кислоту; апирогенную воду; изотонический солевой раствор; раствор Рингера; этиловый спирт и фосфатный буферный раствор. Другие нетоксичные и совместимые смазывающие вещества, такие как лаурилсульфат натрия и стеаратмагния, а также краситель, антиадгезив, покрывающий агент, подсластитель, ароматизатор, отдушка, консервант и антиоксидант, также могут присутствовать в композиции в соответствии с решением изготовителя.

[0030]

В одном варианте осуществления, композиция настоящего изобретения может лечить или предотвращать состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы из-за снижения плотности эндотелиальных клеток роговицы. Состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы из-за снижения плотности эндотелиальных клеток роговицы выбрано из группы, состоящей из дистрофии эндотелия роговицы Фукса, капель в роговице, задней полиморфной дистрофии, иридокорнеального эндотелиального синдрома, врожденной наследственной эндотелиальной дистрофии, вирусного заболевания (цитомегаловирусного эндотелиита роговицы или эндотелиита роговицы при вирусе простого герпеса), эксфолиативного синдрома, отторжения трансплантата роговицы, буллезной кератопатии, нарушения после трансплантации роговицы, эндотелиита роговицы, травмы, глазной хирургии или нарушения после лазерной хирургии глаз, или старения.

[0031]

В одном варианте осуществления, состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы выбрано из группы, состоящей из эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, эндотелиальных изменений роговицы в виде капель, нарушения после трансплантации роговицы, эндотелиита роговицы, травмы, нарушения после глазной хирургии, нарушения после лазерной хирургии глаз, старения, задней полиморфной дистрофии (PPD), врожденной наследственной эндотелиальной дистрофии (CHED), идиопатического нарушения эндотелия роговицы и цитомегаловирусного эндотелиита роговицы. В другом варианте осуществления, состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы представляет собой эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса или эндотелиальные изменения роговицы в виде капель.

[0032]

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к композиции для лечения или предотвращения состояния, расстройства или заболевания эндотелия роговицы в результате сверхэкспрессии внеклеточного матрикса (ECM), содержащей (T)EW-7197 (N-((4-([1,2,4]триазоло[1,5-a]пиридин-6-ил)-5-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-имидазол-2-ил)метил)-2-фторанилин) или его производное, или его фармацевтически приемлемую соль, или его сольват. В другом аспекте, настоящее изобретение относится к (T)EW-7197 (N-((4-([1,2,4]триазоло[1,5-a]пиридин-6-ил)-5-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-имидазол-2-ил)метил)-2-фторанилину) или его производному, или его фармацевтически приемлемой соли, или его сольвату (далее в настоящем изобретении называют соединением настоящего изобретения или подобным) для лечения или предотвращения состояния, расстройства или заболевания эндотелия роговицы в результате сверхэкспрессии внеклеточного матрикса (ECM). (T)EW-7197 может неожиданно подавлять нарушение (например, сверхэкспрессию) внеклеточного матрикса (ECM), такого как фибронектин, в клетках эндотелия роговицы. Например, нарушение (например, сверхэкспрессию) внеклеточного матрикса (ECM), такого как коллаген I типа, коллаген IV типа или коллаген V типа, также подтверждают при эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса. Композиция настоящего изобретения или соединение настоящего изобретения или подобное может также подавлять нарушение данных внеклеточных матриков (ECM). Примеры состояния, расстройства или заболевания эндотелия роговицы в результате сверхэкспрессии внеклеточного матрикса (ECM) включают эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса, образование капель, утолщение десцеметовой оболочки, утолщение роговицы, непрозрачность роговицы, шрам, помутнение роговицы, желтое пятно роговицы, бельмо, блики, расфокусированное зрение и подобные. Эндотелиальная дистрофия роговицы Фукса представляет собой заболевание, при котором плотность клеток эндотелия роговицы значительно снижается, и внеклеточный матрикс откладывается на десцеметовой оболочке, приводя в результате к эндотелиальным изменениям роговицы в виде капель и утолщению десцеметовой оболочки. По этой причине, подавление сверхэкспрессии внеклеточного матрикса подразумевает, что значительное улучшение и, в некоторых случаях, полное излечение является возможным при лечении или предотвращении эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса. Также возможно улучшить, лечить или предотвращать эндотелиальные изменения роговицы в виде капель и утолщение десцеметовой оболочки, а также другие состояния, связанные с помутнением или отложением (необратимое помутнение стромы роговицы вследствие затяжного отека роговицы или подобного), которые могут возникать из-за перепроизводства внеклеточного матрикса при нарушении эндотелия роговицы, таком как эндотелиальная дистрофия роговицы Фукса. Кроме того, сверхэкспрессия протеогликана, такого как агрин, также подтверждена при эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса. Сверхэкспрессия протеогликана, такого как агрин, может привести к эндотелиальным изменениям роговицы в виде капель и утолщению десцеметовой оболочки, а также к другим состояниям, связанным с помутнением или отложением, описанными выше. Композиция настоящего изобретения или соединение настоящего изобретения или подобное также может подавлять сверхэкспрессию протеогликана, такого как агрин.

[0033]

В одном варианте осуществления, примеры способа применения настоящего изобретения включают, но не ограничиваются, глазные капли. Его другие примеры включают режимы дозирования (способы введения и дозируемые формы), такие как глазная мазь, внутрикамерная инъекция, импрегнация в агент с замедленным высвобождением, субконъюнктивальная инъекция, системное введение (пероральное введение, внутривенная инъекция) и подобные.

[0034]

Концентрация (T)EW-7197, применяемая в настоящем изобретении, обычно составляет от 0,001 до приблизительно 100 мкМ (мкмоль/л), предпочтительно от приблизительно 0,01 до приблизительно 30 мкМ, более предпочтительно от приблизительно 0,03 до приблизительно 10 мкМ, и еще более предпочтительно от приблизительно 0,03 до приблизительно 1 мкМ. Примеры других диапазонов концентраций включают, но не ограничиваются, обычно от приблизительно 0,01 нМ до приблизительно 100 мкМ, от приблизительно 0,1 нМ до приблизительно 100 мкМ, от приблизительно 0,001 до приблизительно 100 мкМ, от приблизительно 0,01 до приблизительно 75 мкМ, от приблизительно 0,05 до приблизительно 50 мкМ, от приблизительно 1 до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 0,01 до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 0,05 до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 0,075 до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 0,1 до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 0,5 до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 0,75 до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 1,0 до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 1,25 до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 1,5 до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 1,75 до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 2,0 до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 2,5 до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 3,0 до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 4,0 до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 5,0 до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 6,0 до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 7,0 до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 8,0 до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 9,0 до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 0,01 до приблизительно 50 мкМ, от приблизительно 0,05 до приблизительно 5,0 мкМ, от приблизительно 0,075 до приблизительно 5,0 мкМ, от приблизительно 0,1 до приблизительно 5,0 мкМ, от приблизительно 0,5 до приблизительно 5,0 мкМ, от приблизительно 0,75 до приблизительно 5,0 мкМ, от приблизительно 1,0 до приблизительно 5,0 мкМ, от приблизительно 1,25 до приблизительно 5,0 мкМ, от приблизительно 1,5 до приблизительно 5,0 мкМ, от приблизительно 1,75 до приблизительно 5,0 мкМ, от приблизительно 2,0 до приблизительно 5,0 мкМ, от приблизительно 2,5 до приблизительно 5,0 мкМ, от приблизительно 3,0 до приблизительно 5,0 мкМ, от приблизительно 4,0 до приблизительно 5,0 мкМ, от приблизительно 0,01 до приблизительно 3,0 мкМ, от приблизительно 0,05 до приблизительно 3,0 мкМ, от приблизительно 0,075 до приблизительно 3,0 мкМ, от приблизительно 0,1 до приблизительно 3,0 мкМ, от приблизительно 0,5 до приблизительно 3,0 мкМ, от приблизительно 0,75 до приблизительно 3,0 мкМ, от приблизительно 1,0 до приблизительно 3,0 мкМ, от приблизительно 1,25 до приблизительно 3,0 мкМ, от приблизительно 1,5 до приблизительно 3,0 мкМ, от приблизительно 1,75 до приблизительно 3,0 мкМ, от приблизительно 2,0 до приблизительно 3,0 мкМ, от приблизительно 0,01 до приблизительно 1,0 мкМ, от приблизительно 0,05 до приблизительно 1,0 мкМ, от приблизительно 0,075 до приблизительно 1,0 мкМ, от приблизительно 0,1 до приблизительно 1,0 мкМ, от приблизительно 0,5 до приблизительно 1,0 мкМ, от приблизительно 0,75 до приблизительно 1,0 мкМ, от приблизительно 0,09 до приблизительно 35 мкМ, и от приблизительно 0,09 до приблизительно 3,2 мкМ, более предпочтительно от приблизительно 0,01 до приблизительно 10 мкМ, от приблизительно 0,1 до приблизительно 3 мкМ, и от приблизительно 0,1 до приблизительно 1,0 мкМ.

[0035]

При применении в виде глазных капель, концентрацию в составе можно определить приблизительно 1-10000-кратной, предпочтительно приблизительно 100-10000-кратной, такой как приблизительно 1000-кратной эффективной концентрации, описанной выше, в качестве исходной величины, принимая во внимание разведение слезной жидкости и принимая во внимание токсичность. Концентрация может быть установлена на концентрацию, превышающую данную концентрацию. Ее примеры включают от приблизительно 0,01 мкМ (мкмол/л) до приблизительно 1000 мМ (ммол/л), от приблизительно 0,03 мкМ до приблизительно 1000 мМ, от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 0,3 мкМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 3 мкМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 30 мкМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 0,3 мкМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 3 мкМ до приблизительно 30 мМ, от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 10 мМ, от приблизительно 3 мкМ до приблизительно 10 мМ, от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 1 мМ, от приблизительно 30 мкМ до приблизительно 1 мМ, от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 10 мМ, от приблизительно 30 мкМ до приблизительно 10 мМ, от приблизительно 100 мкМ до приблизительно 10 мМ, от приблизительно 300 мкМ до приблизительно 10 мМ, от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 30 мкМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 100 мкМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 300 мкМ до приблизительно 100 мМ, от приблизительно 1 мМ до приблизительно 10 мМ, от приблизительно 1 мМ до приблизительно 50 мМ и от приблизительно 1 мМ до приблизительно 100 мМ. Данные верхние пределы и нижние пределы можно соответствующим образом комбинировать и определять.

[0036]

В одном варианте осуществления, (T)EW-7197 или его производное, или его фармацевтически приемлемая соль, или его сольват может присутствовать в композиции при концентрации от приблизительно 0,03 мкМ до приблизительно 10 мкМ и предпочтительно от приблизительно 0,03 мкМ до приблизительно 1 мкМ.

[0037]

В еще другом варианте осуществления, композицию настоящего изобретения обеспечивают в виде глазных капель, где (T)EW-7197 или его производное, или его фармацевтически приемлемая соль, или его сольват может присутствовать при от приблизительно 0,03 мМ до приблизительно 100 мМ, предпочтительно от приблизительно 0,001 мМ до приблизительно 10 мМ, более предпочтительно от приблизительно 0,05 мМ до приблизительно 10 мМ, еще более предпочтительно от приблизительно 0,01 мМ до приблизительно 5 мМ, и самое предпочтительное от приблизительно 0,1 мМ до приблизительно 5 мМ. В конкретном варианте осуществления, композиция настоящего изобретения, обеспечиваемая в виде глазных капель, может содержать приблизительно 0,5 мМ (T)EW-7197 или его производного, или его фармацевтически приемлемой соли, или его сольвата.

[0038]

Эффективную дозу лекарственного средства настоящего изобретения, которая является эффективной для лечения конкретного заболевания, расстройства или состояния, может варьироваться в зависимости от природы расстройства или состояния, но может быть определена специалистом в данной области с помощью стандартного клинического способа на основе описания, приведенного в настоящем изобретении. Кроме того, анализ in vitro может применять, чтобы помочь в определении диапазона оптимальных доз, при необходимости. Поскольку точная доза, которую будут применять в комбинированном агенте, также может варьироваться в зависимости от пути введения и тяжести заболевания или расстройства, дозу следует определять в соответствии с решением врача или состоянием каждого пациента. Однако доза, хотя конкретно не ограничена, может составлять, например, 0,001, 1, 5, 10, 15, 100 или 1000 мг/кг массы тела на дозировку или значение в диапазоне любых двух из указанных значений. Интервал дозирования конкретно не ограничен, но может составлять, например, 1 или 2 введения в течение 1, 7, 14, 21 или 28 дней, или 1 или 2 введения в сутки в диапазоне любых двух из них. Дозировка, количество доз, интервал дозирования, период дозирования и способ дозирования могут быть соответствующим образом выбраны в зависимости от возраста пациента или массы тела, состояния, режима дозирования, органа-мишени и подобных. Например, настоящее изобретение можно применять в виде глазных капель. Кроме того, лекарственное средство настоящего изобретения можно вводить, в переднюю камеру. Кроме того, терапевтическое лекарственное средство содержит активный ингредиент в терапевтически эффективном количестве или в количестве, эффективном для оказания требуемого действия. Когда терапевтический маркер значительно снижается после введения, можно определить, что был оказан терапевтический эффект. Эффективную дозу можно оценить по кривой доза-ответ, полученной из системы тестирования in vitro или модели на животных.

[0039]

<Терапевтический или превентативный способ>

В одном аспекте, настоящее изобретение представляет собой способ лечения или предотвращения состояния, расстройства или заболевания эндотелия роговицы у субъекта, включающий введение субъекту эффективного количества (T)EW-7197 (N-((4-([1,2,4]триазоло[1,5-a]пиридин-6-ил)-5-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-имидазол-2-ил)метил)-2-фторанилина) или его производного, или его фармацевтически приемлемой соли, или его сольвата. Один или более из вариантов осуществления, описанных выше в параграфе <Композиция> в настоящем изобретении, или подобные можно подходящим образом применять в способе настоящего изобретения.

[0040]

В еще другом аспекте, настоящее изобретение представляет собой способ лечения или предотвращения состояния, расстройства или заболевания эндотелия роговицы в результате сверхэкспрессии внеклеточного матрикса (ECM), включающий введение субъекту эффективного количества (T)EW-7197 (N-((4-([1,2,4]триазоло[1,5-a]пиридин-6-ил)-5-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-имидазол-2-ил)метил)-2-фторанилина) или его производного, или его фармацевтически приемлемой соли, или его сольвата. Один или более из вариантов осуществления, описанных выше в параграфе <Композиция> в настоящем изобретении, или подобные можно подходящим образом применять в способе настоящего изобретения.

[0041]

<Применение>

В одном аспекте, настоящее изобретение относится к применению (T)EW-7197 (N-((4-([1,2,4]триазоло[1,5-a]пиридин-6-ил)-5-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-имидазол-2-ил)метил)-2-фторанилина) или его производного, или его фармацевтически приемлемой соли, или его сольвата в получении лекарственного средства для лечения или предотвращения состояния, расстройства или заболевания эндотелия роговицы. Один или более из вариантов осуществления, описанных выше в параграфе <Композиция> в настоящем изобретении, или подобные можно подходящим образом применять в применении настоящего изобретения.

В еще другом аспекте, настоящее изобретение относится к применению (T)EW-7197 (N-((4-([1,2,4]триазоло[1,5-a]пиридин-6-ил)-5-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-имидазол-2-ил)метил)-2-фторанилина) или его производного, или его фармацевтически приемлемой соли, или его сольвата в получении лекарственного средства для лечения или предотвращения состояния, расстройства или заболевания эндотелия роговицы в результате сверхэкспрессии внеклеточного матрикса (ECM). Один или более из вариантов осуществления, описанных выше в параграфе <Композиция> в настоящем изобретении, или подобные можно подходящим образом применять в применении настоящего изобретения.

[0042]

<Композиция для консервации и способ консервации >

В другом аспекте, настоящее изобретение относится к композиция для консервации эндотелиальной клетки роговицы, содержащей (T)EW-7197 или его производное, или его фармацевтически приемлемую соль, или его сольват. В предпочтительном варианте осуществления, консервация представляет собой криоконсервацию. Ясно, что (T)EW-7197, применяемый в настоящем изобретении, можно применять в любой форме, описанной в настоящем изобретении, такой как форма, которая является пригодной в качестве композиции для консервации среди вариантов осуществления, описанных в качестве лекарственного средства. Как применяют в настоящем изобретении, "композиция для консервации" представляет собой композицию для консервации фрагмента роговицы, полученного у донора в период времени до того, как фрагмент не будет трансплантирован реципиенту, или для консервации эндотелиальной клетки роговицы до роста или выращивания эндотелиальной клетки роговицы.

[0043]

В одном аспекте, настоящее изобретение относится к применению (T)EW-7197 или его производного, или его фармацевтически приемлемой соли, или его сольвата в получении композиции для консервации эндотелиальной клетки роговицы. В другом аспекте, настоящее изобретение относится к (T)EW-7197 или его производному, или его фармацевтически приемлемой соли, или его сольвату для применения в консервации эндотелиальной клетки роговицы. В еще другом аспекте, настоящее изобретение относится к способу консервации эндотелиальной клетки роговицы, включающему консервацию, применяя композицию для консервации эндотелиальной клетки роговицы, содержащую (T)EW-7197 или его производное, или его фармацевтически приемлемую соль, или его сольват.

[0044]

В одном варианте осуществления, композицию для консервации настоящего изобретения можно получить добавлением (T)EW-7197 настоящего изобретения к обычно применяемому агенту для консервации или раствору для консервации. Примеры данного раствора для консервации роговицы включают растворы для консервации, которые обычно применяют для трансплантата роговицы (раствор для консервации фрагмента фиброзной наружной оболочки глаза, состоящей из склеры и роговицы (Optisol GS®) или раствор для консервации глазного яблока для трансплантата роговицы (EPII®)), соляной раствор, забуференный фосфатом соляной раствор (PBS) и подобные.

[0045]

Композицию для консервации настоящего изобретения применяют для консервации роговицы, которую применяют в трансплантации органа или подобных. Композицию для консервации настоящего изобретения также применяют в качестве раствора для консервации для криоконсервации клетки эндотелия роговицы или в качестве его компонента.

[0046]

В другом варианте осуществления композиции для консервации настоящего изобретения, применяемой для криоконсервации, существующий раствор для криоконсервации можно применять добавлением композиции для консервации, содержащей (T)EW-7197 или его производное, или его фармацевтически приемлемую соль, или его сольват настоящего изобретения. Примеры раствора для криоконсервации включают, но не ограничиваются, CELLBANKER® серию, предоставляемую Takara Bio (CELL BANKER PLUS (каталожный номер: CB021), CELL BANKER 2 (каталожный номер: CB031), STEM-CELLBANKER (каталожный номер: CB043) и подобные), KM BANKER (Kohjin Bio, каталожный номер: KOJ-16092005), и Freezing Medium, Animal Component Free, CRYO Defined (также обозначенную как Cnt-CRYO) (CELLNTEC, каталожный номер: CnT-CRYO-50). В еще другом варианте осуществления, применяемый раствор для криоконсервации представляет собой KM BANKER. Ясно, что специалист в данной области техники может применять подходящим образом модифицированный раствор для криоконсервации подходящим изменением составляющего компонента раствора для криоконсервации, описанного выше, или добавлением дополнительного составляющего компонента. Глицерин, диметилсульфоксид, полиэтиленгликоль, ацетамид или подобные можно дополнительно добавлять к раствору для консервации настоящего изобретения для криоконсервации.

[0047]

Справочная литература, такая как научная литература, патенты и патентные заявки, процитированные в настоящем изобретении, включены в настоящее изобретение с помощью ссылки в той же степени, в которой конкретно описан полный текст каждого документа.

[0048]

Как описано выше, описано настоящее изобретение, показывая предпочтительные варианты осуществления для облегчения понимания. Настоящее изобретение описано далее на основе примеров. Вышеприведенное описание и следующие примеры не предназначены для ограничения настоящего изобретения, а предназначены только для примера. Таким образом, объем настоящего изобретения не ограничивается вариантами осуществления, приведенными в примерах, конкретно описанными в настоящем изобретении, и ограничен только объемом формулы изобретения.

[Примеры]

[0049]

Далее описаны примеры настоящего изобретения. С биологическими образцами или подобными, где это применимо, обращались в соответствии со стандартами, принятыми Министерством здравоохранения, труда и социального обеспечения, Министерством образования, культуры, спорта, науки и технологий и подобными и, где это применимо, на основе Хельсинкской декларации или этических кодексов, подготовленных на их основе. Что касается донорства глаз, применяемых для исследования, согласие было получено от ближайших родственников всех умерших доноров. Настоящее исследование было одобрено комитетом по этике Университета Эрланген-Нюрнберг (Германия) и банка глаз SightLife™ (Сиэтл, Вашингтон) или его соответствующим органом.

[0050]

(Пример получения: получение модели иммортализованной линии (iFECD) эндотелиальных клеток роговицы, полученных у пациента с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса)

В данном примере, иммортализованную линию эндотелиальных клеток роговицы (iFECD) получали из клеток эндотелия роговицы пациентов с эндотелиальной дистрофией роговицы.

[0051]

(Способ культивирования)

Клетки эндотелия роговицы механически отделяли с базальной мембраной от роговицы для исследования, приобретенной в глазном банке Сиэтла. После того, как коллагеназу применяли для отделения и сбора эндотелиальных клеток роговицы с базальной мембраны, клетки подвергали первичному культивированию. Что касается среды, Opti-MEM I Reduced-Serum Medium, Liquid (INVITROGEN каталожный номер: 31985-070), к которой добавляли 8% FBS (BIOWEST, каталожный номер: S1820-500), 200 мг/мл CaCl₂•2H₂O (SIGMA каталожный номер: C7902-500G), 0,08% хондроитинсульфат (SIGMA каталожный номер: C9819-5G), 20 мкг/мл аскорбиновой кислоты (SIGMA каталожный номер: A4544-25G), 50 мкг/мл гентамицин (INVITROGEN каталожный номер: 15710-064) и 5 нг/мл EGF (INVITROGEN каталожный номер: PHG0311), и кондиционировали для 3T3 клетки фидера, применяли в качестве базальной среды. Кроме того, клетки выращивали в базальной среде, к которой добавляли SB431542 (1 мкмоль/л) и SB203580 (4−(4−фторфенил)−2−(4−метилсульфонилфенил)−5(4−пиридил)имидазол-4−[4−(4−фторфенил)−2−(4−метилсульфинилфенил)−1H−имидазол−5−ил]пиридин) (1 мкмоль/л) (также называемая в настоящем изобретении "SB203580+SB431542+3T3 кондиционированная среда").

[0052]

(Способ сбора)

Клетки эндотелия роговицы получали с одобрения комитета по этике и письменного согласия 3 пациентов, которые страдали от буллезной кератопатии в соответствии с клиническим диагнозом эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса и перенесли трансплантацию эндотелия роговицы (эндотелиальная кератопластика десцеметовой оболочки=DMEK). Для ДМЭК патологические клетки эндотелия роговицы механически отслаивали с базальной мембраной, т.е., с десцеметовой оболочки, и погружали в раствор для консервации роговицы Optisol-GS (Bausch & Lomb). Затем применяли обработку коллагеназой для ферментативного сбора клеток эндотелия роговицы, и клетки культивировали в кондиционированной среде SB203580+SB431542+3T3. Для культивируемых клеток эндотелия роговицы пациента с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса, большой Т-антиген SV40 и ген hTERT амплифицировали ПЦР и вводили в лентивирусный вектор (pLenti6,3_V5-TOPO; Life Technologies Inc). Затем лентивирусный вектор применяли для инфицирования клеток 293T (RCB2202; Riken Bioresource Center, Ibaraki, Japan) реагентом для трансфекции (Fugene HD; Promega Corp., Madison, WI) и тремя типами вспомогательных плазмид (pLP1, pLP2, pLP/VSVG; Life Technologies Inc.). Культуральный супернатант, содержащий вирусы, собирали через 48 часов после заражения. Применяли 5 мкг/мл полибрен и добавляли в культуральный раствор культивируемых клеток эндотелия роговицы пациента с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса, и вводили большой T-антиген SV40 и ген hTERT. Были изучены изображения иммортализованной линии эндотелиальных клеток роговицы (iFECD) пациентов с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса фазово-контрастного микроскопа. Культивируемые клетки эндотелия роговицы из исследуемой роговицы, импортированные из банка глаз Сиэтла, были иммортализованы тем же способом для получения иммортализованной линии клеток нормальных клеток эндотелия роговицы (iHCEC) в качестве контроля. При изучении изображений линии иммортализованных эндотелиальных клеток (iFECD) и линии иммортализованных эндотелиальных клеток от здорового донора (iHCEC) фазово-контрастного микроскопа, как iHCEC, так и iFECD имели слой полигональной формы, как в нормальных клетках эндотелия роговицы. iHCEC и iFECD поддерживали и культивировали на модифицированной Дульбекко среде Игла (DMEM)+10% эмбриональная бычья сыворотка (FBS).

[0053]

(Пример наблюдения с фазово-контрастным микроскопом)

Среду удаляли из культуральной чашки, в которой культивировали иммортализованные человеческие клетки эндотелия роговицы пациента с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса (iFECD), и добавляли и промывали 1×PBS (-), предварительно нагретый до 37°C. Это повторяли дважды. Снова добавляли 1×PBS (-), и среду инкубировали в течение 5 минут при 37°C (5% CO₂). После удаления PBS (-), добавляли 0,05% трипсин-ЭДТА (Nacalai Tesque, 32778-34) и инкубировали в течение 5 минут при 37°C (5% CO₂). Затем среду суспендировали и центрифугировали в течение 3 минут при 1500 об/мин для извлечения клеток. DMEM (Nacalai Tesque, 08456-36)+10% FBS (Biowest, S1820-500)+1% P/S (Nacalai Tesque, 26252-94) применяли в качестве среды.

[0054]

Иммортализованные человеческие клетки эндотелия роговицы пациента с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса (iFECD) высевали на 12-луночный планшет при соотношении 8,0×10⁴ клеток на лунку и культивировали в течение 24 часов при 37°C (5% CO₂). DMEM+10% FBS+1% P/S применяли в качестве среды.

[0055]

Через 24 часа среду заменяли и снова культивировали в течение 24 часов. DMEM+2% FBS+1% P/S применяли в качестве среды.

[0056]

Через 24 часа среду удаляли. Добавляли 10 нг/мл человеческого рекомбинантного трансформирующего фактора роста-β2 (WAKO, 200-19911), и среду культивировали в течение 24 часов. В качестве среды применяли DMEM+2% FBS+1% P/S. Через 24 часа морфологию и апоптоз клеток наблюдали под фазово-контрастным микроскопом.

[0057]

Иммортализованные человеческие клетки эндотелия роговицы пациента с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса (iFECD) были повреждены, когда клетки стимулировали TGF-β, как показано на фигуре 1.

[0058]

Пример 1: эффект подавления расстройства эндотелиальной клетки роговицы EW-7197

В данном примере, эффект подавления расстройств эндотелиальной клетки роговицы EW-7197 наблюдали, применяя иммортализованные человеческие клетки эндотелия роговицы пациента с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса (iFECD). Клетки наблюдали способом, основанным на примере наблюдения, описанном выше. В качестве мишени применяли SB431542, который, как известно, подавлял расстройства эндотелиальных клеток роговицы (см. международную публикацию № WO 2015/064768).

[0059]

(Материалы и способы)

После того как iFECD высевали на 12-луночный планшет и культивировали в течение 24 часов, среду удаляли. SB431542 (WAKO, 192-16541) и EW-7197 (Selleck Chemicals, S7530) добавляли так, чтобы конечная концентрация каждого составляла 0,1, 0,3, 1, 3 или 10 мкМ, и среду культивировали в течение 24 часов. DMEM+2% FBS+1% P/S применяли в качестве среды.

[0060]

Через 24 часа среду удаляли. 10 нг/мл человеческого рекомбинантного трансформирующего фактора роста-β2 (WAKO, 200-19911), а также SB431542 и EW-7197, добавляли так, чтобы конечная концентрация каждого составляла 0,1, 0,3, 1, 3 или 10 мкМ, и среду культивировали в течение 24 часов. DMEM+2% FBS+1% P/S применяли в качестве среды.

[0061]

Через 24 часа, клеточную морфологию и апоптоз наблюдали на фазово-контрастном микроскопе.

(Результаты)

Результаты показаны в фигурах 2 и 3. Наблюдали, что при предварительной обработке SB431542 расстройство эндотелиальных клеток роговицы подавлялось при 3 мкМ и 10 мкМ, особенно при 10 мкМ, и расстройство эндотелиальных клеток роговицы эффективно подавлялось, особенно при 10 мкМ. Между тем, наблюдали, что при предварительной обработке EW-7197 расстройство эндотелиальных клеток роговицы эффективно подавлялось, особенно при 0,1, 0,3 и 1 мкМ. Эффект подавления расстройства эндотелиальных клеток роговицы также подтверждали при 3 мкМ и 10 мкМ. Было неожиданно обнаружено, что EW-7197 может подавлять нарушения эндотелиальных клеток роговицы даже при очень низких концентрациях по сравнению с SB431542, который, как известно, способен подавлять нарушения эндотелиальных клеток роговицы.

[0062]

Пример 2: исследование концентрации EW-7197

В данном примере изучена концентрация EW-7197, при которой эффективно наблюдается эффект подавления расстройств эндотелиальных клеток роговицы. Эффект подавления расстройств эндотелиальных клеток роговицы наблюдали тем же способом, как в примере 1.

[0063]

(Материалы и способы)

После того, как iFECD высевали на 12-луночный планшет в соотношении 7,0×10⁴ клеток и культивировали в течение 24 часов, среду удаляли. EW-7197 (Selleck Chemicals, S7530) добавляли так, чтобы конечная концентрация составляла 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0,3, 1, 3, 10 или 30 мкМ, и среду культивировали в течение 24 часов. DMEM+2% FBS+1% P/S применяли в качестве среды.

[0064]

Через 24 часа среду удаляли. 10 нг/мл человеческого рекомбинантного трансформирующего фактора роста-β2 (WAKO, 200-19911) и EW-7197 добавляли так, чтобы конечная концентрация составляла 0,001, 0,003, 0,01, 0,03, 0,1, 0, 3, 1, 3, 10 или 30 мкМ, и среду культивировали в течение 24 часов. DMEM+2% FBS+1% P/S применяли в качестве среды.

[0065]

Через 24 часа, клеточную морфологию и апоптоз наблюдали на фазово-контрастном микроскопе.

[0066]

(Результаты)

Результаты показаны на фигуре 4. Значительное повреждение клеток наблюдали, когда иммортализованные человеческие клетки эндотелия роговицы пациента с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса (iFECD) стимулировали TGF-β. В группе с добавлением EW-7197 наблюдали особенно превосходный эффект подавления расстройств эндотелиальных клеток роговицы, особенно при 0,03, 0,1, 0,3 и 1 мкМ. Было также подтверждено, что нарушения эндотелиальных клеток роговицы эффективно подавляли при 3 мкМ и 10 мкМ. Таким образом, было обнаружено, что EW-7197 эффективно подавляет нарушения эндотелиальных клеток роговицы в широком диапазоне концентраций.

[0067]

Пример 3: Степень выживаемости клеток и активность каспазы 3/7

В данном примере анализируют степень выживаемости клеток и активность каспазы 3/7 в присутствии EW-7197. SB431542 применяли в качестве контроля для сравнения.

[0068]

(Материалы и способы)

(анализ степени выживаемости клеток)

iFECD высевали на 96-луночный планшет в соотношении 3×10³ клеток на лунку и культивировали до достижения слияния при 37°С (5% СО₂). DMEM+10% FBS+1% P/S применяли в качестве среды.

[0069]

Через 24 часа среду удаляли. SB431542 (WAKO, 192-16541) и EW-7197 (Selleck Chemicals, S7530) добавляли так, чтобы конечная концентрация каждого составляла 0,01, 0,1, 1 или 10 мкМ, и среду культивировали в течение 48 часов. DMEM+2% FBS+1% P/S применяли в качестве среды.

[0070]

Через 24 часа, клеточную морфологию наблюдали под фазово-контрастным микроскопом.

[0071]

После наблюдения, степень выживаемости клеток анализировали, применяя Cell Titer-Glo люминесцентный анализ жизнеспособности клеток с помощью следующих способов. Среду удаляли так, чтобы количество составляло 50 мкл на лунку, и раствор для Cell Titer-Glo люминесцентного анализа жизнеспособности клеток (Promega, G7572) добавляли при 50 мкл/лунка так, чтобы отношение к среде было 1:1. В дальнейшем способ проводился без воздействия света. Смесь тщательно перемешивали, применяя шейкер, в течение 2 минут при приблизительно 120 минут^-1 и инкубировали в течение 10 минут. После инкубации 80 мкл переносили на планшет для анализа (Corning, 3912, планшет для анализа 96 лунок, белый полистирол) и измеряли оптическую плотность, применяя систему детекции GloMax-Multi (Promega, E7051).

[0072]

(Анализ каспазы 3/7)

iFECD высевали на 96-луночный планшет в соотношении 3×10³ клеток на лунку и культивировали до достижения слияния при 37°С (5% СО₂). DMEM+10% FBS+1% P/S применяли в качестве среды.

[0073]

Через 24 часа, среду удаляли. SB431542 (WAKO, 192-16541) и EW-7197 (Selleck Chemicals, S7530) добавляли так, чтобы конечная концентрация каждого составляла 0,01, 0,1, 1, или 10 мкМ, и среду культивировали в течение 24 часов. DMEM+2% FBS+1% P/S применяли в качестве среды.

[0074]

[0075]

Через 24 часа, клеточную морфологию наблюдали под фазово-контрастным микроскопом.

[0076]:

После наблюдения, активность каспазы 3/7 измеряли, применяя Caspase-Glo 3/7 анализ, с помощью следующих способов. Среду удаляли так, чтобы количество составляло 50 мкл на лунку, и раствор реагента для анализа Caspase Glo 3/7 (смесь буфера для анализа Caspase-Glo 3/7 и субстрата для анализа Caspase-Glo 3/7) (Promega, G8091) добавляли при 50 мкл/лунку так, чтобы его отношение к среде составляло 1:1. Затем, способ проводился без воздействия света. Смесь тщательно перемешивали, применяя шейкер, в течение 2 минут при приблизительно 120 минут^-1 и инкубировали в течение 40 минут при комнатной температуре. После инкубации 80 мкл переносили на планшет для анализа (Corning, 3912, планшет для анализа на 96 лунок, белый полистирол) и измеряли поглощение, применяя систему детекции GloMax-Multi (Promega, E7051)

[0077]

Ингибитор каспазы, т.е., 10 мкМ MZ-VD-FMK (WAKO, 262-0206I) применяли в качестве положительного контроля.

[0078]

(Результаты)

(анализ степени выживаемости клеток)

Результаты показаны на фигурах 5 и 6. В результате измерения степени выживаемости клеток, применяя люминесцентный анализ жизнеспособности клеток Cell Titer-Glo, не было обнаружено существенного различия в степени выживаемости клеток при добавлении SB431542 по сравнению с контрольной группой при всех концентрациях 0,01, 0,1, 1 и 10 мкМ. Ввиду вышесказанного, добавление SB431542 не приводит к нарушению работы клеток при концентрациях 0,01, 0,1, 1 и 10 мкМ. Аналогичным образом, значительную разницу не обнаруживали в степени выживаемости клеток при добавлении EW-7197 по сравнению с контрольной группой при всех концентрациях 0,01, 0,1, 1 и 10 мкМ. Ввиду вышесказанного, добавление EW-7197 не приводит к нарушению работы клеток при концентрациях 0,01, 0,1, 1 и 10 мкМ.

[0079]

(анализ каспазы 3/7)

Результаты показаны на фигурах 5 и 6. Анализ Caspase-Glo 3/7 может измерять активность каспазы 3/7, связанной с индукцией апоптоза. Конкретно, более высокая активность каспазы 3/7 указывает на то, что индуцируется клеточное расстройство. Из фигуры 5 было установлено, что при стимуляции TGF-β каспаза 3/7 значительно активируется по сравнению с отсутствием стимуляции. Между тем, при добавлении SB431542 активность каспазы 3/7 снижалась в ряду 0,01, 0,1, 1 и 10 мкМ. В частности, при 10 мкМ значение было сходным со значением в контрольной группе без стимуляции TGF-β. Соответственно, SB431542 ингибирует активность каспазы 3/7 в зависимости от концентрации. Его эффект наиболее эффективно проявляется при 10 мкМ. При добавлении EW-7197 каспаза 3/7 значительно ингибировалась при 0,01 мкМ. Значение было аналогично контрольной группе без симуляции с TGF-β, особенно при 0,1, 1 и 10 мкМ. Было обнаружено, что EW-7197 также может ингибировать каспазу 3/7 таким же способом, как SB431542. В частности, более высокий ингибирующий эффект наблюдался для EW-7197 по сравнению с SB431542 даже при 0,1 мкМ.

[0080]

Пример 4: вестерн-блот

В данном примере тестировали экспрессию фибронектина (около 240 кДа), активированной формы расщепленной каспазы 3 (около 17 кДа) и PARP (около 89 кДа) в iFECD при добавлении EW-7197 вестерн-блотом.

[0081]

(Материалы и способы)

iFECD высевали на 12-луночный планшет в соотношении 8×10⁴ клеток на лунку и культивировали при 37°С (5% СО₂) в течение 24 часов. DMEM+10% FBS+1% P/S применяли в качестве среды.

[0082]

Через 24 часа, среду удаляли. EW-7197 (Selleck Chemicals, S7530) добавляли так, чтобы конечная концентрация составляла 0,1, 1, или 10 мкМ, и SB431542 (WAKO, 192-16541) добавляли так, чтобы конечная концентрация составляла 10 мкМ, и среду культивировали в течение 24 часов. DMEM+2% FBS+1% P/S применяли в качестве среды.

[0083]

Через 24 часа, среду удаляли и культивировали в течение 24 часов так, чтобы конечная концентрация 10 нг/мл человеческого рекомбинантного трансформирующего ростового фактора-β2 (WAKO, 200-19911) и EW-7917 составляла 0,1, 1, и 10 мкМ, и конечная концентрация SB431542 составляла 10 мкМ. DMEM+2% FBS+1% P/S применяли в качестве среды.

[0084]

Через 24 часа, клеточную морфологию и апоптоз наблюдали на фазово-контрастном микроскопе.

[0085]

После наблюдения, вестерн-блот проводили на белках с помощью следующих способов.

[0086]

1) извлечение белка

Для извлечения плавающих и мертвых клеток среду извлекали на льду, клетки дважды промывали 1×PBS (-) и также извлекали их раствор. Раствор центрифугировали в течение 5 мин при 4°С и 800 g, и супернатант выбрасывали, получая осадок.

[0087]

Буфер для экстракции белка (RIPA; 50 мМ Tris-HCl (pH 7,4), 150 мМ NaCl, 1 мМ EDTA, 0,1% SDS, 0,5% DOC, 1% NP-40) добавляли к промытым клеткам на льду для экстракции белка.

[0088]

Затем описанный выше осадок плавающих и мертвых клеток после центрифугирования также суспендировали и извлекали вместе. Извлеченный раствор трижды измельчали в течение 30 секунд в охлажденной воде с помощью ультразвукового аппарата (BIORUPTOR, TOSHO DENKI), и затем центрифугировали в течение 10 минут при 4°С и 15000 об/мин. Извлекали супернатант белка.

[0089]

2) Вестерн-блоттинг

Экстрагированный белок отделяли SDS-PAGE и транскрибировали на нитроцеллюлозную мембрану. Количество белка составляло 4 мкг для фибронектина, PARP и GAPDH, и 10 мкг для каспазы 3. Мышиное анти-фибронектиновое антитело (BD Biosciences, 610077), кроличье антитело на каспазу 3 (Cell Signaling, 9662), кроличье анти-PARP-антитело (Cell signaling, 9542) и мышиное анти-GAPDH-антитело (MBL, M171-3) применяли в качестве первичного антитела.

[0090]

В качестве вторичного антитела применяли меченное пероксидазой анти-кроличье антитело и анти-мышиное антитело (GE Healthcare Biosciences, NA931V, NA934V). Для первичного антитела мышиное анти-фибронектиновое антитело разбавляли 20000-кратно, кроличье анти-PARP-антитело разбавляли 1000-кратно, кроличье антитело на каспазу 3 разбавляли 1000-кратно, и мышиное анти-GAPDH-антитело разбавляли 3000-кратно. Все вторичные антитела разбавляли 5000 кратно. Chemi Lumi ONE Ultra (Nacalai Tesque, 11644-40) применяли для детекции. Обнаруженные интенсивности полос анализировали Lumino Image анализатором LAS-4000 mini (Fuji Film) и программным обеспечением ImageQuantTM (GE Healthcare).

[0091]

(Результаты)

Результаты показаны на фигуре 7. Когда iFECD стимулировали TGF-β, наблюдали экспрессию фибронектина (около 240 кДа), активированной формы расщепленной каспазы 3 (около 17 кДа) и PARP (около 89 кДа). Между тем, экспрессия фибронектина подавлялась в той же степени, что и в контрольной группе без стимуляции TGF-β или 10 мкМ SB431542 при любой концентрации в присутствии EW-7197. Активированная форма расщепленной каспазы 3 и активность PARP также подавлялись в той же степени, что и в контрольной группе без стимуляции TGF-β или 10 мкМ SB431542. Следовательно, анализ вестерн-блотом показал, что EW-7197 подавляет экспрессию фибронектина так же, как SB431542.

[0092]

Пример 5: оценка эффективности лекарственного средства в виде глазных капель EW-7197 при эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, применяя мышей с нокином Col8a2

В данном примере оценивали эффективность глазных капель EW-7197 при эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, применяя животную модель с эндотелиальной дистрофией роговицы Фукса, мышей с нокином Col8a2. Мыши с нокином Col8a2, являются установленными животными моделями эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса (ссылка: Jun et al., Hum Mol Genet. 2012 Jan 15; 21(2): 384-93).

[0093]

5 мкл 0,02% (приблизительно 0,5 мМ) EW-7197 глазных капель или агента основы (PBS, содержащий 7% DMSO) вводили в виде глазных капель в оба глаза 4-месячных мышей, с нокином по гену альфа 2 коллагена 8 (Col8a2), 4 раза в день в течение 8 недель. Плотность эндотелиальных клеток роговицы измеряли, применяя зеркальный микроскоп KS3M (Konan Medical, Inc.), до глазных капель и через 2, 4, 6 и 8 недель после глазных капель. Мышей умерщвляли внутрибрюшинным введением чрезмерного количества (200 мг/кг массы тела или более) инъекции анестетика сомнопентил (Kyoritsu Seiyaku Corporation) через 8 недель после инъекции. После подтверждения остановки сердца собирали оба глазных яблока. Собранные глазные яблоки надрезали для получения фрагмента роговицы. Иммуноокрашивание коллагена I типа и фибронектина проводили следующим образом. Image-Pro (Nippon Roper K.K.) применяли для анализа области экспрессии коллагена I типа и фибронектина.

[0094]

(способ иммуноокрашивания коллагена I типа и фибронектина)

После иммобилизации фрагмента роговицы мыши в течение 10 минут при комнатной температуре в 4% параформальдегиде добавляли 0,5% TritonX-100 и позволяли ему проникнуть в течение 5 минут. Добавляли 1% бычий сывороточный альбумин (BSA), и фрагмент инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем фрагмент роговицы погружали в раствор первичного антитела, и они реагировали в течение ночи при 4°С. В качестве первичного антитела применяли разбавленный раствор 1:200 поликлонального антитела коллагена I типа (Rockland Immunochemicals) и разбавленный раствор 1:250 поликлонального антитела фибронектина (abcam). Затем фрагмент роговицы погружали в смесь раствора вторичного антитела и раствора DAPI (Dojindo Laboratories), и они реагировали в течение 1 часа при комнатной температуре вдали от света. Разбавленный раствор 1:2000 Alexa Fluor® 488-меченного козьего анти-кроличьего IgG (Life Technologies) применяли в качестве вторичного антитела. Применяли разбавленный раствор 1:1000 DAPI. Фрагмент роговицы растягивали и помещали на предметное стекло и накрывали покровным стеклом. Подготовленный образец наблюдали, применяя конфокальный лазерный сканирующий микроскоп Olympus FV1000 FLUOVIEW (Olympus Corporation).

[0095]

(Результаты)

В таблице 1 показаны результаты величины изменения плотности эндотелиальных клеток роговицы, начиная с применения глазных капель до 4 недель и 8 недель после глазных каплей у мышей с нокином Col8a2 (ΔECD (клеток/мм²)). Снижение плотности эндотелиальных клеток роговицы 51,5 клеток/мм² наблюдали через 4 недели, и снижение плотности эндотелиальных клеток роговицы 123,6 клеток/мм² наблюдали через 8 недель у нормальных мышей без введения гена Col8a2. Ясно, что небольшое уменьшение плотности эндотелиальных клеток роговицы у нормальных мышей является следствием снижения количества клеток эндотелия роговицы вследствие старения.

[Таблица 1]

Таблица 1. Величина изменения плотности эндотелиальных клеток роговицы у мышей с нокином Col8a2 (ΔECD (клеток/мм²))

неделя 0 (перед глазными каплями) 4 8 Агент основы 0 -227,667 -401,889 0,02% TEW 0 -121,4 -284,5

[0096]

Как очевидно из таблицы 1, снижение плотности эндотелиальных клеток роговицы в группе с введением глазных капель с 0,02% EW-7197 значительно подавлялось по сравнению с группой с введением агента основы. Значительное увеличение экспрессии коллагена I типа и фибронектина наблюдали при иммуноокрашивании у мышей с нокином Col8a2. Фигура 8 показывает результаты анализа площади экспрессии коллаген I типа и фибронектин. Экспрессия коллагена I типа и фибронектина имела тенденцию к снижению в группе с введением глазных капель с 0,02% EW-7197 по сравнению с группой, которой вводили агент основы.

[0097]

Таким образом, было выявлено, что EW-7197 в достаточной степени мигрировал в эндотелий роговицы и эффективно подавлял снижение количества клеток эндотелия роговицы (апоптоз клеток эндотелия роговицы и подобные) и/или нарушения эндотелия роговицы, представленные сверхэкспрессией внеклеточного матрикса (коллагена I типа, фибронектина и подобных) глазными каплями EW-7197.

[0098]

Пример 6: оценка эффективности глазных капель EW-7197 с различными концентрациями на эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса, применяя мышей с нокином Col8a2

В данном примере оценивали эффективность глазных капель EW-7197 при различных концентрациях на эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса, применяя мышей с нокином Col8a2.

[0099]

(Способ)

5 мкл глазных капель с 0,02% (приблизительно 0,5 мМ) EW-7197, глазных капель с 0,1% (приблизительно 2,5 мМ) EW-7197 или агент основы (фосфатный буфер, содержащий DMSO) вводили в виде глазных капель в оба глаза 4-месячных мышей, с нокином гена альфа 2 коллагена 8 (Col8a2), 4 раза в день в течение 12 недель. Поверхностно-активное вещество добавляли к агенту основы по мере необходимости. Специалист в данной области может применять подходящее и пригодное поверхностно-активное вещество (Kenji Motose (1984). "Tenganzai" [Eye drops] Nanzando; International Pharmaceutical Excipients Council Japan (2016). "Iyakuhin Tenkabutsu Jiten" [Pharmaceutical Excipient Encyclopedia] Yakuji Nippo, Limited). Плотность эндотелиальных клеток роговицы измеряли зеркальным микроскопом KS3M (Konan Medical, Inc.) до глазных капель и через 3, 6, 9 и 12 недель после глазных капель. Мышей умерщвляли внутрибрюшинным введением чрезмерного количества (200 мг/кг массы тела или более) анестезирующей инъекции сомнтпентила (Kyoritsu Seiyaku Corporation) через 12 недель после инъекции. После подтверждения остановки сердца собирали оба глазных яблока. Собранные глазные яблоки разрезали для получения фрагмента роговицы. Выполняли иммуноокрашивание фибронектина. Способ иммуноокрашивания был следующим. Image-Pro (Nippon Roper K.K.) применяли для анализа области экспрессии фибронектина

[0100]

(Способ иммуноокрашивания фибронектина)

После иммобилизации фрагмента роговицы мыши в течение 10 минут при комнатной температуре в 4% параформальдегиде добавляли 0,5% TritonX-100, и позволяли ему проникнуть в течение 5 минут. Добавляли 1% бычий сывороточный альбумин (BSA), и фрагмент инкубировали в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем фрагмент роговицы погружали в раствор первичного антитела, и они реагировали в течение ночи при 4°С. Разбавленный раствор 1:250 поликлонального антитела фибронектина (abcam) применяли в качестве первичного антитела. Затем фрагмент роговицы погружали в смесь раствора вторичного антитела и раствора DAPI (Dojindo Laboratories), и они реагировали в течение 1 часа при комнатной температуре вдали от света. Разбавленный раствор 1:2000 Alexa Fluor® 488-меченного козьего анти-кроличьего IgG (Life Technologies) применяли в качестве вторичного антитела. Применяли разбавленный раствор 1:1000 DAPI. Фрагмент роговицы растягивали и помещали на предметное стекло и накрывали покровным стеклом. Подготовленный образец наблюдали, применяя конфокальный лазерный сканирующий микроскоп Olympus FV1000 FLUOVIEW (Olympus Corporation) или конфокальный лазерный сканирующий микроскоп LSM880 (Carl Zeiss Microscopy Co., Ltd.). Центральную секцию, области роговицы в 6-часовом направлении, 9-часовом направлении (сторона уха) и 3-часовом направлении (сторона носа) наблюдали с полем зрения 40-кратного увеличения или 100-кратного увеличения.

[0101]

(Результаты)

Тенденция к подавлению снижения плотности эндотелия роговицы в центральной части роговицы наблюдали в группе с глазными каплями EW-7197 вплоть до 6 недели, но значительного различия в плотности эндотелия роговицы в центральной части роговицы не наблюдали между группой с глазными каплями EW-7197 и группой с глазными каплями агента основы на 12 неделе. Поскольку капли имели тенденцию быть больше в периферическом отделе роговицы, чем в центральном отделе роговицы, ясно, что существенной разницы в плотности эндотелия роговицы не наблюдали в центральной части роговицы между группой с глазными каплями EW-7197 и группой с глазными каплями агента основы на 12 неделе. Действительно, уровни экспрессии фибронектина имели тенденцию быть выше в периферическом отделе, чем в центральном отделе (Фигура 9). Как показано на фигуре 9, явное подавление экспрессии фибронектина наблюдали в группах с глазными каплями 0,02% и 0,1% EW-7197. Когда тот же эксперимент проводили с концентрацией 0,004% (0,1 мМ), которая составляла 1/5 от концентрации глазных капель с 0,02% EW-7197, чтобы проверить фармакологический эффект при низкой концентрации, наблюдали тенденцию подавления экспрессии фибронектина. Это показало, что EW-7197 эффективен в широком диапазоне концентраций.

[0102]

Пример 7: способ формулирования раствора для консервации роговицы, содержащий EW-7197

В данном примере получают раствор для консервации роговицы, содержащий EW-7197, следующим способом в качестве примера формулирования.

[0103]

Раствор для консервации, показанный ниже, получают общепринятым способом.

[0104]

EW-7197 эффективное количество (например, 0,1 мкМ)

Optisol-GS (Bausch-Lomb) подходящее количество

Суммарное количество 100 мл

Пример 8: пример получения глазных капель

Композиция испытуемого соединения при каждой концентрации показана ниже.

[0105]

EW-7197 0,1 мМ

Хлорид натрия 0,85 г

Дигидрат дигидрофосфата натрия 0,1 г

(необязательно) хлорид бензалкония 0,005 г

Гидроксид натрия подходящее количество

Очищенная вода подходящее количество

Суммарное количество: 100 мл (pH 7,0)

Концентрация может быть разбавлена, применяя агент основы, состоящий из следующих компонентов.

[0106]

Хлорид натрия 0,85 г

Дигидрат дигидрофосфата натрия 0,1 г

(необязательно) хлорид бензалкония 0,005 г

Гидроксид натрия подходящее количество

Очищенная вода подходящее количество

Суммарное количество 100 мл (pH 7,0)

Например, коммерчески доступные компоненты, которые соответствуют японской фармакопее или ее эквивалентам, можно применять в качестве каждого компонента, отличного от активного ингредиента.

[0107]

Пример 9: пример диагностики и терапии

Настоящее изобретение применяют при диагнозе эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса или аналогичного заболевания эндотелия роговицы (его конкретные примеры включают 1) наблюдение образования капель, утолщения десцеметовой оболочки, отека эпителия роговицы или отека стромы роговицы с помощью щелевой микроскопии, 2) наблюдение изображений капель или нарушения эндотелия роговицы с помощью зеркального микроскопа, 3) наблюдение отека роговицы с помощью Pentacam, OCT, ультразвукового измерителя толщины роговицы и подобных, и 4) при определении высокого риска генетической диагностикой). Его можно лечить, применяя композицию настоящего изобретения в виде глазных капель, внутрикамерной инъекции, введения, применяя агент с замедленным высвобождением, интравитреальной инъекции или субконъюнктивальной инъекции.

[0108]

Например, коммерчески доступные компоненты, которые соответствуют японской фармакопее или ее эквивалентам, можно применять в качестве каждого компонента, отличного от активного ингредиента

[0109]

Как описано выше, настоящее изобретение иллюстрируется применением его предпочтительных вариантов осуществления. Однако ясно, что объем настоящего изобретения следует интерпретировать исключительно на основании формулы изобретения. Также подразумевается, что любой патент, любая заявка на патент и любые ссылки, цитируемые в настоящем изобретении, должны быть включены в настоящее изобретение с помощью ссылки таким же способом, как если бы содержимое было конкретно описано в настоящем изобретении. Настоящая заявка испрашивает приоритет по заявке на патент Японии № 2017-239049 (поданной 13 декабря 2017 г.) и заявке на патент Японии № 2018-184783 (поданной 28 сентября 2018 г.). Их содержание включено в настоящее изобретение с помощью ссылки.

[Промышленная применимость]

[0110]

Обеспечивают лекарственное средство для лечения или предотвращения состояния, расстройства или заболевания эндотелия роговицы, содержащее (T)EW-7197. В частности, обеспечивают лекарственное средство для лечения или предотвращения нарушения эндотелия роговицы при эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса. Обеспечивают технологию, которая доступна в отраслях (фармацевтической промышленности и подобных), связанных с технологиями, связанными с разработкой лекарственных средств, или подобными, основанными на данной технологии.

Изобретение относится к области медицины, а именно к офтальмологии, и предназначено для лечения или предотвращения состояния, расстройства или заболевания эндотелия роговицы. Для лечения или предотвращения состояния, расстройства или заболевания эндотелия роговицы применяют соединение (T)EW-7197 (N-((4-([1,2,4]триазоло[1,5-a]пиридин-6-ил)-5-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-имидазол-2-ил)метил)-2-фторанилин) или его производное, или его фармацевтически приемлемую соль, или его сольват. Использование изобретения обеспечивает эффективное лечение или предотвращение состояния, расстройства или заболевания эндотелия роговицы. 9 з.п. ф-лы, 9 ил., 1 табл., 9 пр.

1. Применение соединения для лечения или предотвращения состояния, расстройства или заболевания эндотелия роговицы, где соединение представляет собой (T)EW-7197 (N-((4-([1,2,4]триазоло[1,5-a]пиридин-6-ил)-5-(6-метилпиридин-2-ил)-1H-имидазол-2-ил)метил)-2-фторанилин) или его производное, или его фармацевтически приемлемую соль, или его сольват.

2. Применение по п. 1, где соединение предназначено для подавления снижение плотности эндотелиальных клеток роговицы.

3. Применение по п. 1 или 2, где состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы представляет собой эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса или эндотелиальные изменения роговицы в виде капель.

4. Применение по п. 1, где состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы является результатом сверхэкспрессии внеклеточного матрикса (ECM).

5. Применение по п. 4, где внеклеточный матрикс (ECM) выбирают из группы, состоящей из коллагена I типа, коллагена IV типа, коллагена V типа и фибронектина.

6. Применение по п. 4 или 5, где состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы выбирают из группы, состоящей из эндотелиальной дистрофии роговицы Фукса, образования капель, утолщения десцеметовой оболочки, утолщения роговицы, непрозрачности роговицы, шрама, помутнения роговицы, желтого пятна роговицы, бельма, бликов, и расфокусированного зрения.

7. Применение по любому из пп. 1-6, где состояние, расстройство или заболевание эндотелия роговицы представляет собой эндотелиальную дистрофию роговицы Фукса.

8. Применение по любому из пп. 1-7, где (T)EW-7197 или его производное, или его фармацевтически приемлемая соль, или его сольват находятся в составе композиции при концентрации от приблизительно 0,001 мМ до приблизительно 10 мМ, где "приблизительно" относится к диапазону ±10% последующего числового значения.

9. Применение по любому из пп. 1-8, где (T)EW-7197 или его производное, или его фармацевтически приемлемая соль, или его сольват находятся в составе композиции при концентрации от приблизительно 0,01 мМ до приблизительно 5 мМ, где "приблизительно" относится к диапазону ±10% последующего числового значения.

10. Применение по любому из пп. 1-9, где соединение вводится в форме глазных капель.