Штамм гибридных культивируемых клеток Homo sapiens/Mus musculus 1B9C7 - продуцент человеческих моноклональных антител, специфичных к протеолитическому домену ботулинического токсина типа A Российский патент 2022 года по МПК C07K16/12 C12N5/24 C12N5/28 

Описание патента на изобретение RU2783897C1

Изобретение относится к области биотехнологии, биоинженерии, биохимии, лабораторных медицинских исследований и может быть использовано для получения моноклональных антител к протеолитическому домену (легкой цепи, LC) ботулинического токсина типа A (BoNT/A).

Ботулизм - это тяжелое нейропаралитическое заболевание, которое обусловлено воздействием ботулинических нейротоксинов, секретируемых анаэробными почвенными бактериями Clostridium botulinum. Известно 7 типов ботулотоксинов (BoNT/A-BoNT/G) и множество их подтипов, отличающихся токсичностью и распространением, но именно типы А, В и Е в основном вызывают заболевание у человека. Ботулизм характеризуется более как пищевая интоксикация, нежели инфекция, потому что его возбудитель является строгим анаэробом и не способен производить токсин внутри желудочно-кишечного тракта человека. Исключением считается раневой ботулизм и детский (младенческий) ботулизм. Наибольшим источником рисков является продукция домашнего и фабричного консервирования с нарушением технологий производства [Redel H. Foodborne infections and intoxications // Emerging Infectious Diseases. - 2013. - V. 19. - №12. - P. 371-377.], а также соленая и копченая рыба кустарного производства [Санин Б.И. Ботулизм. В кн.: Избранные лекции по инфекционным болезням и эпидемиологии. Учебно-методическое пособие под ред. Лучшева В.И. и Жарова С.Н. М. ГОУ ВПО РГМУ, МИМСР. 2004; 219-239.]. Также источником инфекции в случае детского ботулизма является мёд, контаминированный спорами C. botulinum.

На территории Российской Федерации в среднем в год регистрируется около 200-300 случаев ботулизма с летальностью в 7-9% [Никифоров В.В. Ботулизм. В кн.: Инфекционные болезни: национальное руководство под ред. Ющука Н.Д., Венгерова Ю.Я. 2-е изд., перераб. и доп. М. ГЭОТАР-Медиа. 2018; 558-568].

Лечение ботулинической токсикоинфекции заключается в симптоматической терапии (подключение к аппарату ИВЛ, поддержание витальных функций организма) до момента ослабления токсического эффекта из-за разрушения ботулотоксина в местах его воздействия, также применяется специфическая терапия - иммуноглобулины, блокирующие токсин еще в кровяном русле и препятствующие проникновению его в нейроны. В РФ специфическая терапия ботулизма предусматривает применение поликлональных лошадиных сывороток к токсинам типов А, В и Е (сыворотка противоботулиническая очищенная концентрированная жидкая типов A, B, E производства АО НПО Микроген, Россия). В США FDA зарегистрированы поливалентный антитоксин (F(ab')2-фрагменты лошадиных антител против семи типов токсина) [https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/approved-blood-products/bat-botulism-antitoxin-heptavalent-b-c-d-e-f-g-equine] и препарат BabyBIG, представляющий собой очищенные человеческие иммуноглобулины [https://www.fda.gov/vaccines-blood-biologics/approved-blood-products/babybig].

Иммуноглобулины являются стандартным и эффективным средством для предотвращения дальнейшего развития ботулинической интоксикации. Однако применение гетерологичных антител (лошадиных) связано с рядом проблем и ограничений: такие препараты нельзя вводить дважды, но даже при однократном введении велика вероятность развития анафилаксии и сывороточной болезни. Применение гомологичных человеческих антител позволит снизить эти риски.

На территории РФ известны мышиные гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к BoNT/B, пригодные для конструирования на их основе тест-систем для выявления возбудителя ботулизма [Патенты RU 2566553 C1, RU 2571208 C1]. Также известны рекомбинантные гуманизированные антигенсвязывающие фрагменты антител против BoNT/C, полученные с целью применения в экспресс-тестах для определения ботулотоксина типа C в объектах окружающей среды и продуктах питания [Патент RU 2623157 C1]. За рубежом известны мышиные гибридомы и продуцируемые ими моноклональные антитела к эпитопам BoNT/А. Описанные антитела рекомендуют для обнаружения BoNT/А, для пассивной иммунизации против ботулинической интоксикации или в качестве терапии ботулизма [Патент US 7879330 B2].

Известны мышиные антитела против BoNT/A, BoNT/B и BoNT/E, полученные посредством технологии фагового дисплея. Изобретение предназначено для нейтрализации ботулотоксинов типов A, B и E. [Патент US 9902780 B2].

Известны человеческие антитела против BoNT/A и BoNT/B, полученные с помощью гетерогибридомы человек/мышь. Изобретение также включает в себя метод детекции и разделения BoNT/A и BoNT/B и способ лечения ботулизма [Патент US 2010/0222555 A1].

В качестве терапевтических средств против BoNT/A рассматривают как антитела, связывающиеся с тяжелой цепью (HC) BoNT/A и способные ингибировать взаимодействие BoNT/A с рецепторами нейронов [Nowakowski A. et al. Potent neutralization of botulinum neurotoxin by recombinant oligoclonal antibody // Proceedings of the National Academy of Sciences. - 2002. - Т. 99. - №. 17. - С. 11346-11350. - doi:10.1073 / pnas. 172229899; Smith T. J. et al. Sequence variation within botulinum neurotoxin serotypes impacts antibody binding and neutralization // Infection and immunity. - 2005. - Т. 73. - №. 9. - С. 5450-5457. - doi:10.1128/IAI.73.9.5450-5457.2005], так и антитела, специфичные к LC BoNT/A и ингибирующие ее протеолитическую активность [Adekar S.P. et al. Neutralization of botulinum neurotoxin by a human monoclonal antibody specific for the catalytic light chain // Plos one. - 2008. - Т. 3. - №. 8. - С. e3023. - doi: 10.1371/journal.pone.0003023].

Техническим результатом предлагаемого изобретения является перевиваемая линия гетерогибридных клеток 1B9C7, производящая человеческие моноклональные антитела (чМКА) 1B9C7, специфичные к LC BoNT/А, способные ингибировать протеолитическую активность LC BoNT/A, которые могут использоваться для накопления моноклонального иммуноглобулинового сырья с целью последующего изготовления терапевтического препарата.

Технический результат достигается тем, что предложен штамм гибридных культивируемых клеток H. sapiens/Mus. musculus 1B9C7 - продуцент чМКА против LC BoNT/A. Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск», коллекционный номер H-96.

Характеристика штамма гетерогибридной клеточной линии 1B9C7.

Видовая принадлежность: гетерогибридома мышь-человек-человек. Материал, используемый для получения гибридомы: плазмобластная фракция из периферической крови донора, иммунизированного коммерческим препаратом BoNT/А (комплексом ботулинический токсин типа А - гемагглютинин). Партнер для гибридизации - клетки гетерогибридомы K6H6/B5 (ATCC® CRL-1823™), полученные слиянием клеток мышиной миеломы P3/NSI/1-Ag4-1 с малигнизированными клетками человека, больного нодулярной лимфомой.

Система селекции гибридных клеток - гипоксантин-аминоптерин-тимидин (HAT). Кратность клонирования - однократно.

Морфологическая характеристика. Культура гетерогибридных клеток 1B9C7 представлена слабо прикрепленными к подложке округлыми клетками размером с исходную гетерогибридому K6H6/B5.

Характер роста на питательных средах: рост суспензионный, культивирование стационарное.

Культуральные свойства. Культивирование в питательной среде Hybridoma-SFM (Gibco, UK) при температуре 37°С, 5% СО2 и влажности 80%. Кратность рассева 1:2 - 1:3, время субкультивирования от 3 до 4 суток, посевная доза 5-10×104 клеток/мл.

Продуктивность гибридной клеточной линии in vitro. Титр иммуноглобулинов в культуральной жидкости после культивации в инкубаторе в колбах 1.6L Optimum Growth™ Flasks (Thomson, США), анализированный с использованием непрямого твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) - не менее 1:160. Концентрация иммуноглобулинов составляет в среднем 0,4-0,8 мг/л.

Контаминация штамма гибридных клеток. Проведено исследование методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) в реальном времени на выявление микоплазмы - не обнаружено; бактериологический посев на выявление бактерий и грибов - не обнаружены; проверка на вирусы - не проводилась.

Способ, условия и состав сред для криоконсервации:

А) среда для криоконсервации - 90% ФБС, 10% диметилсульфоксида;

Б) режим замораживания - пластиковые флаконы (виалы) с культурой клеток, по 2×108 клеток/мл среды для криоконсервации в каждом флаконе. Замораживают в заданном режиме:

1) со скоростью 1°С/мин до -70°С.

2) через сутки виалы перемещают в хранилище с жидким азотом.

В) режим размораживания - выполняют на водяной бане при 37°С в течение 2-3 минут. Виалы асептически вскрывают, содержимое переносят в центрифужную пробирку с 7-8 мл бессывороточной среды, центрифугируют 5 минут при 200×g, супернатант отбрасывают, клетки ресуспендируют в среде культивирования и переносят в лунки 6-луночного планшета или культуральный флакон с суточным фидерным слоем клеток. Жизнеспособность восстанавливаемых гибридом после криоконсервации составляет 75-85%.

Характеристика полезного продукта. Полученный штамм гетерогибридных клеток 1В9С7 производит чМКА, специфичные к белку LC BoNT/A, проявляющие активность в непрямом твердофазном ИФА не менее 1:160. чМКА из культуральной жидкости выделяют путем аффинной хроматографии на колонке с Protein G-сефарозой (HiTrapTM Protein G, Швеция), с последующей гель-фильтрацией на колонке Superdex™ 75 10/300 GL (GE Healthcare Bio-Sciences, Швеция). Чистоту полученных иммуноглобулиновых фракций оценивают методом электрофореза в денатурирующих условиях. Концентрацию иммуноглобулинов определяют методом спектрофотометрии при длине волны 280 нм на спектрофотометре Smart Spec Plus (Bio-Rad, США), а также с использованием инфракрасного спектрометра Direct Detect (Merck, Германия).

Изобретение осуществляют следующим образом:

Из периферической крови людей-доноров, многократно использовавших инъекции препарата BoNT/A - BOTOX® Cosmetic (Allergan Pharmaceuticals Ireland a subsidiary of: Allergan, США) в целях эстетической ботулинотерапии, осуществляют забор сыворотки крови, которую затем тестируют в непрямом твердофазном ИФА в отношении специфичности к LC BoNT/A. Забор периферической крови для последующего выделения субпопуляции плазмобластов и гибридизации с миеломной линией клеток осуществляют на 7 сутки после последней инъекции у доноров, сыворотки крови которых показали наибольшие титры в ИФА в отношении LC BoNT/A.

Для увеличения количества выделенных плазмобластов из периферической крови доноров проводят предварительное обогащение В-клеток с помощью коммерческого набора RosetteSep™ Human B Cell Enrichment Cocktail (Stemcell Technologies, Канада). Последующее фенотипирование плазмобластов и их сортинг осуществляют с использованием панели коммерческих МКА, конъюгированных с флуорохромами, против CD-антигенов (BD Biosciences, США). С помощью настольной системы для клеточного сортинга FACSAria III (Becton Dickinson, США) с использованием программного обеспечения BD FACSDiva (версия 8.0) методом многократного гейтирования выделяют субпопуляцию плазмобластов с фенотипом CD19+CD20loCD27hiCD38hi. Далее по заданному гейту осуществляют сортинг данной субпопуляции в стерильные полипропиленовые пробирки, содержащие 500 мкл ФБС, для последующего элекстрослияния с клетками-партнерами и получения гибридом.

В качестве партнера для гибридизации используют клеточную линию K6H6/B5 (ATCC® CRL-1823™). Плазмобласты с фенотипом CD19+CD20loCD27hiCD38hi и клетки K6H6/B5 смешивают в соотношении 1:2, отмывают чистой культуральной средой RPMI-1640, затем буфером для электрослияния BTXpress Cytofusion Medium C (BTX, Harvard Bioscience, США), в котором впоследствии ресуспендируют клетки. Электрослияние проводят в мультипораторе ECM2001 (BTX, США) с использованием микрослайда для слияния Model 453 (BTX, Harvard Bioscience, США) в режиме, включающем три стадии: выравнивание, импульс, пост-выравнивание.

По окончании процедуры слияния суспензию клеток выдерживают 30 минут в микрослайде при комнатной температуре и далее переносят в питательную среду Hybri-Care (ATCC® 46-X™) с 20% ФБС, однократным раствором HAT (Gibco 21060-017, Thermo Fisher, США) и вносят по 100 мкл полученной суспензии в лунки 96-луночных культуральных планшетов. Инкубируют клетки с заменой селективной культуральной среды раз в трое суток до появления видимого роста гибридных клеток в лунках, а затем и монослоя гибридных клеток.

Культуральную жидкость из лунок, в которых наблюдается рост гибридных клеток, тестируют в ИФА в отношении специфического взаимодействия с рекомбинантной LC BoNT/A. Клетки из лунок, показавших наилучшую активность в отношении антигена, подвергают клонированию методом предельных разведений. Единичные клоны гетерогибридом наращивают в увеличивающихся объемах среды в культуральных флаконах, перманентно тестируя культуральную жидкость на наличие антител, специфически взаимодействующих с рекомбинантными LC BoNT/A.

Для последующего выделения и очистки чМКА стабильные гетерогибридомы адаптировали к бессывороточной среде Hybridoma-SFM (Gibco, UK). Полученные клоны гетерогибридом наращивают с масштабированием: в культуральных флаконах Corning® T-25 и T-75, затем в качалочных колбах 1.6L Optimum Growth™ Flasks (Thomson, США), после чего выделяют из культуральной жидкости фракцию человеческих иммуноглобулинов G (IgG), применяя аффинную хроматографию на сорбенте с Protein G-сефарозой (HiTrapTM Protein G, Швеция), с последующей гель-фильтрацией на колонке Superdex™ 75 10/300 GL (GE Healthcare Bio-Sciences, Швеция).

Выделенные чМКА тестируют на предмет специфической активности в отношении рекомбинантной LC BoNT/A и нативного BoNT/A.

Проверяют отобранные чМКА во FRET анализе по способности ингибировать протеолитическую активность LC BoNT/A с применением коммерческого FRET-субстрата SNAPtide® Botulinum Toxin A Substrate, Fluorogenic (Sigma-Aldrich, США).

Изобретение иллюстрируют следующие графические материалы:

Фиг. 1. Результаты тестирования специфической активности сывороток людей-доноров, многократно получавших инъекции препарата BoNT/A в отношении рекомбинантной LC BoNT/A методом ИФА.

Фиг. 2. Результаты отбора наиболее перспективных клонов гибридом-продуцентов чМКА, специфичных к рекомбинантной LC BoNT/A.

Цветом выделены результаты образцов, показавших наилучший результат и выбранные для дальнейшей работы.

Фиг. 3. Результаты электрофореза в 10%-ом полиакриламидном геле (ПААГ) в денатурирующих условиях образца чМКА 1В9С7, выделенных из культуральной жидкости одноименной гетерогибридомы-продуцента 1В9С7.

Дорожка 1. Маркер молекулярных масс PageRuler™ Prestained Protein Ladder SM0671 (Fermentas, США). Дорожка 2 - образец чМКА в неденатурирующих (без 2-меркаптоэтанола) условиях. Дорожка 3 - образец чМКА в денатурирующих (с 2-меркаптоэтанолом) условиях.

Фиг. 4. Результаты вестерн-блот анализа чМКА 1В9С7 в отношении BoNT/A (А) и BoNT/В (Б).

А. Дорожка М - маркер молекулярных масс Page Ruler™ Prestained Protein Ladder SM0671 (Fermentas, США); Дорожка 1 - нативный BoNT/A, детектированный чМКА 1В9С7; Дорожка 2 - рекомбинантная LC BoNT/A, детектированная чМКА 1В9С7; Дорожка 3 - рекомбинантная HC50 BoNT/A.

Б. Дорожка М - маркер молекулярных масс Page Ruler™ Prestained Protein Ladder SM0671 (Fermentas, США); Дорожка 1 - рекомбинантная LC BoNT/В; Дорожка 2 - рекомбинантная HC50 BoNT/В.

Фиг. 5. Определение способности исследуемых чМКА 1В9С7 ингибировать протеолитическую активность рекомбинантного белка LC BoNT/A.

Примечание: отрицательный контроль 1 - проба, содержащая буфер и белок SNAPtide; отрицательный контроль 2 - проба, содержащая только буфер; отрицательный контроль 3 - проба, содержащая белок SNAPtide и чМКА 1В9С7; положительный контроль - проба, содержащая рекомбинантную LC BoNT/A и белок SNAPtide; чМКА 1B5B11 - проба, содержащая рекомбинатную LC BoNT/A предварительно инкубированную с чМКА 1B5B11 в эквимолярном соотношение 1:3, и белок SNAPtide; чМКА 1В9С7 - проба, содержащая рекомбинатную LC BoNT/A предварительно инкубированную с чМКА 1В9С7 в эквимолярном соотношение 1:3, и белок SNAPtide; чМКА 2C10B8 - проба, содержащая рекомбинатную LC BoNT/A предварительно инкубированную с чМКА 2C10B8 в эквимолярном соотношение 1:3, и белок SNAPtide.

Примеры получения и использования чМКА, синтезируемых штаммом гетерогибридной клеточной линии 1В9С7.

Пример 1. Получение сывороток крови людей-доноров, многократно использующих инъекции препарата BoNT/А.

От 3 людей-доноров, многократно (не менее 5 раз) использующих инъекции препарата BoNT/A в целях эстетической ботулинотерапии методом венозной пункции получают образцы крови. Образцы объемом 20 мл собирают в центрифужные пробирки и отстаивают при комнатной температуре в течение 30 мин до полного образования тромба. Центрифугируют пробирки при 1200×g в течение 10 минут, после чего отбирают сыворотку крови в чистые пробирки. При необходимости повторяют центрифугирование.

Пример 2. Тестирование специфической активности сывороток людей-доноров, в отношении рекомбинантной LC BoNT/A методом непрямого твердофазного ИФА.

На поверхности лунок поликарбонатного планшета для иммуноферментного анализа иммобилизуют рекомбинантную LC BoNT/A в количестве 1 мкг/лунку в объеме 100 мкл фосфатно-солевого буфера (ФСБ) и инкубируют в течение 2 часов при температуре 37°С и перемешивании на орбитальном шейкере на скорости 300 об/мин. По окончании инкубации проводят трехкратную отмывку лунок планшета ФСБ с добавлением 0,05% Tween-20 (ФСБ-Tw). Свободные валентности пластика блокируют обезжиренным (м.д.ж. не более 0,5%) молоком, внося его в объеме 200 мкл в лунку. Блокировку проводят в течение 40 мин при температуре 37°С и перемешивании, после чего трехкратно отмывают с использованием ФСБ-Tw. Сыворотки доноров разводят в ФСБ в соотношениях от 1:5 до 1:640 с двукратным шагом разведения по вертикали и инкубируют в течение 1 ч на шейкере при температуре 37°C, затем трехкратно промывают ФСБ-Tw. В качестве отрицательного контроля выступают лунки с чистым ФСБ; в качестве положительного лунки с коммерчески доступными кроличьими поликлональными антителами к LC BoNT/A C. botulinum (Clostridium botulinum Type A Neurotoxin Light Chain polyclonal antibody, PAB13914, Abnova, Тайвань) в концентрации 0,1 мкг/лунку. В лунки планшета добавляют по 100 мкл конъюгата: в лунки, инкубированные с чМКА, вносят кроличьи антитела против цельной молекулы IgG человека, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США) в разведении 1:20000; в лунки, инкубированные с кроличьими антителами, вносят козьи антитела против цельной молекулы IgG кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена (Sigma, США) в разведении 1:10000. После часовой инкубации и четырехкратной отмывки планшета во все лунки вносят по 100 мкл субстратной смеси - готового раствора 3,3′,5,5′-тетраметилбензидина (Termo Fisher Scientific, США). Планшет помещают на 3-5 минут в темное место, затем останавливают реакцию 4N серной кислотой (50 мкл/лунку). Учет результатов проводят с помощью планшетного спектрофотометра xMark (Bio-Rad, США) при длине волны 450 нм. Положительным считают результат, превышающий показатели оптической плотности отрицательного контроля не менее, чем в 2 раза.

По результатам ИФА на основании полученных данных о специфической активности образцов сывороток людей-доноров, многократно получавших инъекции препарата BoNT/A, для дальнейшей работы отобрали образец крови донора 3, сыворотка которого демонстрировала наивысший титр антител к рекомбинантной LC BoNT/А. Результаты представлены на Фиг. 1.

Пример. 3. Получение и подготовка плазмобластной фракции из цельной венозной крови донора, многократно получавшего инъекции препарата BoNT/A.

Для получения плазмобластной фракции крови у избранных доноров отбирают свежую порцию периферической крови на 7 день после последней инъекции препарата BoNT/A, полученной донором.

Для увеличения количества выделенных плазмобластов из периферической крови доноров проводят предварительное обогащение В-клеток с помощью коммерческого набора RosetteSep™ Human B Cell Enrichment Cocktail (Stemcell Technologies, Канада) путем негативной селекции В-лимфоцитов с помощью комплекса тетрамерных антител, распознающих мембранные маркеры моноцитов и Т-клеток. Для этого гепаринизированную кровь инкубируют в пробирках в течение 20 мин с RosetteSep™ Human B Cell Enrichment Cocktail из расчета 50 мкл реактива на 1 мл цельной крови. Затем кровь разводят в 2 раза ФСБ с 2% ФБС, наслаивают на градиент плотности RosetteSep™ DM-L Density (Stemcell Technologies, Канада) в соотношении 1:1, и центрифугируют в течение 30 мин при 1200×g с выключенным тормозом при комнатной температуре. Полученное опалесцирующее кольцо на границе раздела двух сред отбирают и дважды отмывают в среде RPMI 1640 при 300×g в течение 10 мин, а затем ресуспендируют в полной питательной среде RPMI 1640, содержащей 2 мМ глутамина («ПанЭко»,Россия), 10 мМ HEPES (Sigma, США), 25 мкМ 2-меркаптоэтанола (Sigma, США) и 2% ФБС (TermoFisher Scientific, США). Жизнеспособность клеток оценивают на автоматическом счетчике ТС-20 (Bio-Rad, США) после окрашивания клеток трипановым синим (Invitrogen, США).

Для выявления субпопуляции плазмобластов выделенные В-лимфоциты окрашивают следующей комбинацией МКА, конъюгированных с флуорохромами: anti-CD19 APC (клон HIB19), anti-CD20 BV421 (клон 2H7), anti-CD38 PE-cy7 (клон HIT2), anti-CD27 BB515 (клон M-T271). Для этого В-лимфоциты (5×106 клеток/мл) инкубируют с МКА в темноте в течение 20 мин при температуре 20°С в соответствии с инструкцией производителя. Затем клетки дважды отмывают избытком ФСБ с 2% ФБС и осаждают центрифугированием 10 мин при 200×g.

С помощью системы для клеточного сортинга FACSAria III (Becton Dickinson, США), оснащенной тремя лазерами с длинами волн излучения 405, 488 и 633 нм и с использованием программного обеспечения BD FACSDiva (версия 8.0) методом многократного гейтирования выделяют фракцию плазмобластов с фенотипом CD19+CD20loCD27hiCD38hi. Далее по заданному гейту осуществляют сортинг данной субпопуляции в пробирку с 500 мкл ФБС.

Выделенные плазмобласты отмывают ФСБ с 2% ФБС двукратно в течение 10 мин при 300×g. Отмытый клеточный осадок ресуспендируют в 1 мл среды RPMI-1640, проводят подсчет концентрации клеток с применением автоматического счетчика клеток TC-20 (Bio-Rad, США), доводят концентрацию чистой культуральной средой до 1×106 кл/мл.

Пример. 4. Получение гетерогибридом-продуцентов чМКА, специфичных к LC BoNT/A.

В качестве партнера для гибридизации с плазмобластами используют линейную культуру гетерогибридомы K6H6/B5 (ATCC® CRL-1823™), полученную слиянием клеток мышиной миеломы P3/NSI/1-Ag4-1 с малигнизированными клетками человека, больного нодулярной лимфомой. Клетки K6H6/B5 культивируют в среде RPMI-1640 с содержанием 2 мМ L-глутамина и ФБС 10 %. Выращивание клеточной линии осуществляют в культуральных флаконах Corning® T-150 с поверхностью роста 150 см2 при температуре 37°С во влажной атмосфере с 5% СО2. Для процедуры электрослияния данную клеточную линию используют в экспоненциальной фазе роста.

Гибридизацию плазмобластов и клеток партнеров K6H6/B5 осуществляют в соотношении 1:2, соответственно, с помощью системы для электрослияния клеток, состоящей из генератора электрических импульсов BTX ECM 2001 и микрослайда Model 453 (BTX, Harvard Bioscience, США). Полученные коктейли клеток дважды отмывают центрифугированием при 400×g в течение 5 мин в избытке буфера для электрослияния BTXpress Cytofusion Medium C (BTX, Harvard Bioscience, США). После отмывки клетки подсчитывают на автоматическом счетчике клеток ТС-20 (Bio-Rad, США), одновременно определяя жизнеспособность с помощью 0,4 % раствора трипанового синего. Далее коктейль клеток ресуспендируют в 500 мкл буфера BTXpress Cytofusion Medium C, вносят в кювету для электрослияния и подвергают электропорации при следующих значения электрических параметров: напряженность поля - 1560 V/см, длительность диэлектрофореза клеток - 60 с; параметры электрического импульса - двукратный импульс амплитудой 500 V и длительностью 30 мкс. После электрослияния содержимое микрослайда оставляют на 30 мин при комнатной температуре, а затем переносят в 60 мл среды Hybri-Care (ATCC® 46-X™), содержащей 20% ФБС, однократным раствором HAT (Gibco2, ThermoFisher, США) и вносят по 100 мкл полученной суспензии в лунки 96-луночных культуральных планшетов.

Таким образом, в результате гибридизации получают десять 96-луночных планшетов, содержащих по 60 лунок с клетками.

Пример 5. Культивирование гетерогибридных клеток и получение клонов гетерогибридом, продуцирующих чМКА, специфичных к рекомбинантной LC BoNT/A.

Слитые клетки, распределенные по лункам культурального планшета, культивируют при 37°C в 5% CO2. Через 3-4 дня проводят замену питательной среды в каждой лунке. Контролируют рост колоний клеток визуально с использованием светового микроскопа. Селекцию гетерогибридных колоний проводят с помощью селективных добавок HAT и HT (Thermo Fisher, США). На 14 день HAT среду заменяют на среду с HT, на 20 сутки - на обычную питательную среду.

После образования монослоя гибридных клеток при замене среды в лунках культуральную жидкость в объеме 100 мкл отбирают для анализа специфической активности антител, наработанных гетерогибридомами, в отношении рекомбинантной легкой цепи BoNT/A методом ИФА. Для этого используют планшет с иммобилизованным рекомбинантным белком легкой цепи BoNT/A (методика подготовки планшета соответствует описанной выше, в примере 2), в который вносят культуральную жидкость по 100 мкл на лунку. В качестве отрицательного контроля используют лунку А1, в которую вносят чистый ФСБ. Коммерческие антитела к LC BoNT/A (Clostridium botulinum Type A Neurotoxin Light Chain polyclonal antibody, PAB13914, Abnova, Тайвань) в концентрации 0,1 мкг/лунку используют как положительный контроль. Методика проведения ИФА описана в примере 2.

На основании полученных данных для дальнейшей работы выделяют те лунки планшета, культуральная жидкость из которых в ИФА показывает стабильный результат, превышающий значения отрицательного контроля не менее чем в 2 раза.

Клонирование гетерогибридных клеток-продуцентов специфических чМКА проводят методом предельных разведений. Для этого клетки в лунке ресуспендируют, подсчитывают концентрацию клеток в суспензии на счетчике клеток TC-20, затем делают разведения суспензии в среде Hybri-Care из расчета 2 кл. на лунку (в 100 мкл), 1 кл. на лунку и 0,5 кл. на лунку. Каждым вариантом разведенной суспензии заполняют 60 лунок 96-луночного планшета. Культивируют до образования визуально различимых колоний. Для тестирования в ИФА (аналогично описанному выше) отбирают культуральную жидкость из лунок, в которых наблюдают единичные сформированные хорошо растущие колонии гетерогибридных клеток.

Колонии, показывающие хороший рост и стабильные высокие показатели оптической плотности в ИФА, при наработке монослоя подвергают пересеву в 24-луночные планшеты. Полученные клоны гетерогибридом адаптируют к бессывороточной среде Hybridoma-SFM (Gibco, UK) и наращивают с маштабированием в культуральных флаконах Corning® T-25 и T-75, затем в качалочных колбах 1.6L Optimum Growth™ Flasks (Thomson, США) при температуре 37°C в атмосфере, содержащей 5% углекислого газа. Результаты представлены на Фиг. 2. Количество клеток при субкультивировании в культуральных флаконах поддерживают в диапазоне между 1×105 и 1×106 кл/мл культуральной среды. Замену культуральной среды производят каждые 2-3 дня.

Антитела выделяют из культуральной жидкости путем аффинной хроматографии на колонке с Protein G-сефарозой (HiTrapTM Protein G, Швеция). Колонку, упакованную сорбентом Protein G-сефарозой (HiTrapTM Protein G, Швеция) уравновешивают буфером нанесения (50 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCl, pH 7.4), промывают элюирующим буфером (50 мМ Трис-HCl, 100 мМ NaCl, 50 мМ глицина, pH 2,4) и вновь уравновешивают буфером нанесения. Наносят образец на колонку со скоростью 1 мл/мин при постоянном охлаждении колонки и образца. Отмывают колонку буфером нанесения до достижения состояния равновесия. Элюируют белок, нанося буфер для элюции на скорости 1 мл/мин. Собирают очищенный образец IgG в пробирку и немедленно доводят pH раствора до 7.4-7.6 добавлением 1М раствора Трис, pH 11.0.

Выделенные IgG переводят в ФСБ и доочищают методом гель-фильтрации на сорбенте Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare, Великобритания). Хранят раствор иммуноглобулинов в ФСБ с добавлением 0,1% NaN3 при температуре 4-8°С.

Чистоту полученных иммуноглобулиновых фракций оценивают в SDS-PAGE-электрофорезе в денатурирующих условиях по методу Лэммли (Фиг. 3). Концентрацию иммуноглобулинов определяют спектрофотометрически при длине волны 280 нм (спектрофотометр Smart Spec Plus, Bio-Rad, США).

Пример 5. Тестирование специфической и ингибирующей активности выделенных чМКА 1В9С7 в отношении рекомбинантного белка LC BoNT/A.

Специфическую активность определяют в отношении рекомбинантных белков LC и рецептор связывающего домена тяжелой цепи (HC50) BoNT/A и BoNT/В, а также в отношении нативного BoNT/A. Для этого используют метод вестерн-блот анализа. Рекомбинантные белки: HC50 BoNT/A (аминокислоты R861 - L1296 белка-предшественника ботулотоксина А) и домен HC50 BoNT/B (аминокислоты N853 - E1291 белка-предшественника ботулотоксина А (были получены из базы данных GenBank)), а также протеазы LC BoNT/A (аминокислоты P2 - N418 белка-предшественника ботулотоксина А; UniProtKB - P0DPI1 (BXA1_CLOBH)) и LC BoNT/В (аминокислоты P2 - K441 белка-предшественника ботулотоксина B; UniProtKB - B1INP5 (BXB_CLOBK)), нарабатывают в плазмидах pET-HCA, pET-HCB, pET-LCA и pET-LCB, соответственно. Плазмиды были сконструированы на основе модифицированного коммерческого вектора pET-22b(+) (Invitrogen). Все четыре рекомбинантных белка, полученных в результате экспрессии с вышеупомянутых плазмид, содержат полигистидиновый (6×His) тэг на N-конце, за которым следует тандем из двух c-myc эпитопов. Рекомбинантные белки экспрессируют в штамме E. coli BL21(DE3) (NEB). Компетентные клетки E. coli BL21(DE3) трансформируют в одной из экспрессионных плазмид. Очистку осветленного центрифугированием лизата проводят на колонке с сорбентом cOmplete His-Tag (Roche, Germany) на высокоэффективном жидкостном хроматографе AKTA Pure (Cytiva, Sweden). Полученные белки подвергают последующей доочистке на гель-фильтрационной колонке Superdex 75 10/300 GL (GE Healthcare, USA).

Нативный токсин выделяют из осадка, содержащего концентрированный комплекс белков, включая BoNT/A, полученный путем кислотного осаждения культуральной жидкости после культивирования Clostridium botulinum ATCC 19397 в токсинпродуцирующих условиях. Токсинокомплекс извлекают из осадка ренатурацией в натрий-фосфатном буфере (0,2М; pH6.0) с последующим концентрированием полученных белков при помощи высаливания насыщенным раствором сульфата аммония. В качестве отрицательного контроля по той же схеме культивировали непатогенный штамм Clostridium difficile ATCC 43255. Полученный после применения сульфата аммония осадок отделяют центрифугированием в течение 10 минут при 10000×g, затем растворяют в натрий-цитратном буфере (0,05М; pH5.5) в объеме, составляющем 1/10 от исходного объема культуральной токсинсодержащей жидкости, взятой в работу. Выдерживают при комнатной температуре в течение 10 минут. После этого доводят объем до исходного, соответствующего начальному объему, взятому в работу, при помощи ФСБ.

Рекомбинантные LC и HC50 BoNT/A и BoNT/В в количестве 0,5 мкг на дорожку и 10 мкл раствора нативного BoNT/A подвергают ПААГ электрофорезу в денатурирующих условиях, после чего осуществляют горизонтальный перенос белка из геля на нитроцеллюлозную мембрану Hybond-C Extra (GE Healthcare, Великобритания) методом полусухого переноса на приборе Trans-Blot Turbo Transfer System (Bio-Rad, США). Мембрану по окончании переноса погружают в обезжиренное (м.д.ж. не более 0,5 %) молоко для блокировки свободных валентностей нитроцеллюлозы, инкубируют в течение часа при покачивании и температуре 37°С. Промывают мембрану ФСБ-Тв трижды, после чего погружают в раствор чМКА с концентрацией 10 мкг/мл в ФСБ. Инкубируют час при 37°С с орбитальным перемешиванием, затем отмывают трижды ФСБ-Тв. Детектируют антитела на мембране козьими антителами против IgG человека, конъюгированными с пероксидазой хрена. Для этого конъюгат с пероксидазой хрена (Sigma, США) разводят в ФСБ 1:10000, погружают в него нитроцеллюлозную мембрану и инкубируют 40 мин при покачивании и температуре 37°С. Мембрану отмывают ФСБ-Тв не менее шести раз и проявляют 1% раствором диаминобензидина в ФСБ с добавлением хлоридов никеля и кобальта, а также 33 % перекиси водорода в количестве 1 мкл на 1 мл красящего раствора. После развития окраски реакцию останавливают, ополаскивая мембрану водой и высушивая (Фиг. 4.).

Тестирование способности чМКА ингибировать протеолитическую активность рекомбинантного белка LC BoNT/A проводят с помощью FRET-анализа с применением коммерческого FRET-субстрата SNAPtide® Botulinum Toxin A Substrate, Fluorogenic (Calbiochem 567333 Sigma-Aldrich, Millipore). Для этого готовят стоковый 5 мМ раствор субстрата в диметилсульфоксиде. Затем из стока получают 250 мкМ раствора с использованием рабочего буферного раствора состава 20 мМ HEPES pH 8.0, 5 мМ ДТТ, 0,3 мМ ZnSO4, 0,1% полисорбата-20. Реакцию проводят в 96-луночном планшете OptiPlate-96 (Perkin Elmer). Общий объем раствора в каждой лунке составляет 250 мкл. Рабочая концентрация FRET-субстрата в лунке 10 мкМ. В лунки планшета помещают по 10 мкг рекомбинантного белка LC BoNT/A и по 60 мкг чМКА, объем доводят до 240 мкл рабочим буфером и инкубируют на термостатируемом шейкере при 37°С в течении 60 мин. Непосредственно перед помещением планшета в анализатор EnSpire (Perkin Elmer) в лунки добавляют по 10 мкл 250 мкМ раствора FRET-субстрата. В качестве отрицательного контроля используют лунки: 1) содержащие только буфер; 2) содержащие буфер и белок SNAPtide; 3) содержащие буфер и чМКА 1B9C7. Считывание флуоресцентного сигнала проводят раз в 10 мин при Ex/Em = 320 нм/420 нм. Ингибирующую способность исследуемых чМКА 1В9С7 рассчитывают по формуле:

Ингибирующая активность (%) =

,

где ОЕФ (исследуемого чМКА) - относительные единицы флуоресценции пробы с исследуемым чМКА; ОЕФ (отрицательного контроля 1) - относительные единицы флуоресценции пробы, содержащие буфер и белок SNAPtide; ОЕФ (LC BoNT/А+ SNAPtide) - относительные единицы флуоресценции пробы, содержащей фрагмент LC BoNT/A и белок SNAPtide.

По результатам тестирования определили наиболее эффективное для ингибирования протеолитической активности рекомбинантного белка LC BoNT/A чМКА - 1В9С7, ингибирующая активность которого составила 48,6%. Результаты тестирования чМКА 1В9С7 представлены на Фиг. 5.

Похожие патенты RU2783897C1

название год авторы номер документа
Штамм гибридных культивируемых клеток Homo sapiens/Mus musculus Hu-C6D7-RBD - продуцент человеческих моноклональных антител, специфичных к RBD домену S белка вируса SARS-CoV-2 2022
  • Романенко Яна Олеговна
  • Силкина Марина Владимировна
  • Карцева Алена Сергеевна
  • Марьин Максим Александрович
  • Конышкова Дарья Андреевна
  • Макарова Мария Александровна
  • Шкуратова Мария Андреевна
  • Шемякин Игорь Георгиевич
  • Фирстова Виктория Валерьевна
RU2788359C1
Штамм гибридных культивируемых клеток H.sapiens/Mus musculus 8D4E9-Ba-LF-продуцент человеческих моноклональных антител против летального фактора возбудителя сибирской язвы 2018
  • Рябко Алена Константиновна
  • Марьин Максим Александрович
  • Карцева Алена Сергеевна
  • Зенинская Наталья Алексеевна
  • Силкина Марина Владимировна
  • Мунтян Яна Олеговна
  • Фирстова Виктория Валерьевна
  • Шемякин Игорь Георгиевич
RU2699193C1
ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ Mus musculus 3F11 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К БОТУЛИНИЧЕСКОМУ ТОКСИНУ ТИПА B 2014
  • Иващенко Татьяна Александровна
  • Белова Елена Валентиновна
  • Мицевич Ирина Петровна
  • Мицевич Евгений Викторович
  • Козырь Арина Владимировна
  • Колесников Александр Владимирович
  • Дятлов Иван Алексеевич
  • Шемякин Игорь Георгиевич
RU2566553C1
ШТАММ ГИБРИДНЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ Mus musculus 1G7 - ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ, СПЕЦИФИЧНЫХ К БОТУЛИНИЧЕСКОМУ ТОКСИНУ ТИПА В 2014
  • Иващенко Татьяна Александровна
  • Белова Елена Валентиновна
  • Мицевич Ирина Петровна
  • Мицевич Евгений Викторович
  • Козырь Арина Владимировна
  • Колесников Александр Владимирович
  • Дятлов Иван Алексеевич
  • Шемякин Игорь Георгиевич
RU2571208C1
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДНК-АПТАМЕРОВ, СВЯЗЫВАЮЩАЯСЯ С ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОЙ СУБЪЕДИНИЦЕЙ НЕЙРОТОКСИНА ТИПА A CLOSTRIDIUM BOTULINUM 2014
  • Рябко Алена Константиновна
  • Колесников Александр Владимирович
  • Лунева Нина Михайловна
  • Лебедева Валентина Николаевна
  • Шемякин Игорь Георгиевич
  • Дятлов Иван Алексеевич
  • Козырь Арина Владимировна
RU2571210C1
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БОТУЛИНИЧЕСКОГО НЕЙРОТОКСИНА ТИПА А НА ОСНОВЕ ИММУНОДЕТЕКЦИИ, СОПРЯЖЕННОЙ С ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИЕЙ 2013
  • Рябко Алена Константиновна
  • Хлынцева Анна Евгеньевна
  • Колесников Александр Владимирович
  • Шемякин Игорь Георгиевич
  • Дятлов Иван Алексеевич
  • Лунева Нина Михайловна
  • Козырь Арина Владимировна
RU2549463C1
Способ определения активности ботулотоксина с использованием клеток 2019
  • Лее, Чее Гун
  • Оум, Йи Хюн
  • Ажай, Вижаякумар
  • Гуи, Ксиангаи
RU2803123C2
УЧАСТОК СВЯЗЫВАНИЯ АНТИГЕНА (Fab), В ТОМ ЧИСЛЕ ГУМАНИЗИРОВАННЫЙ Fab, ПРОТИВ БОТУЛИНИЧЕСКОГО НЕЙРОТОКСИНА С (ВАРИАНТЫ), СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ Fab С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ДРОЖЖЕЙ, СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ БОТУЛИНИЧЕСКОГО НЕЙРОТОКСИНА С 2016
  • Беневоленский Сергей Владимирович
  • Боков Максим Николаевич
  • Зацепин Сергей Сергеевич
  • Клячко Елена Витальевна
  • Позднякова Любовь Петровна
  • Свешников Петр Георгиевич
  • Солопова Ольга Николаевна
  • Чулкин Андрей Михайлович
RU2623157C1
ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ ДНК-АПТАМЕРОВ, СВЯЗЫВАЮЩАЯ ШИГА-ТОКСИН ТИПА 2 2014
  • Козырь Арина Владимировна
  • Лунева Нина Михайловна
  • Колесников Александр Владимирович
  • Рябко Алена Константиновна
  • Красавцева Ольга Николаевна
  • Гусарова Валентина Павловна
  • Шемякин Игорь Георгиевич
  • Дятлов Иван Алексеевич
RU2566552C1
Экспрессионный вектор на основе аденоассоциированного вируса, обладающий защитными свойствами против интоксикации, вызванной ботулиническим нейротоксином типа А 2021
  • Есмагамбетов Ильяс Булатович
  • Рябова Екатерина Игоревна
  • Деркаев Артем Алексеевич
  • Довгий Михаил Андреевич
  • Бырихина Дарья Валерьевна
  • Носков Анатолий Николаевич
  • Чемоданова Ирина Петровна
  • Государев Андрей Игоревич
  • Щебляков Дмитрий Викторович
  • Народицкий Борис Савельевич
  • Логунов Денис Юрьевич
  • Гинцбург Александр Леонидович
RU2768044C1

Иллюстрации к изобретению RU 2 783 897 C1

Реферат патента 2022 года Штамм гибридных культивируемых клеток Homo sapiens/Mus musculus 1B9C7 - продуцент человеческих моноклональных антител, специфичных к протеолитическому домену ботулинического токсина типа A

Изобретение относится к области биотехнологии. Описан штамм гибридных культивируемых клеток Homo sapiens/Mus musculus 1B9C7, продуцирующий человеческие моноклональные антитела, специфичные к домену ботулиническому токсину типа A (LC BoNT/A) Clostridium botulinum. Штамм депонирован в государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур “ГКПМ-Оболенск”, коллекционный номер Н-96. Изобретение расширяет арсенал средств для получения моноклональных антител, способных нейтрализовать протеолитическую активность LC BoNT/A, что может быть использовано для последующего изготовления терапевтического препарата. 5 ил., 5 пр.

Формула изобретения RU 2 783 897 C1

Штамм гибридных культивируемых клеток Homo sapiens/Mus musculus 1B9C7 - продуцент человеческих моноклональных антител, специфичных к протеолитическому домену ботулинического токсина типа A, депонированный в государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск», коллекционный номер H-96.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2022 года RU2783897C1

Штамм гибридных культивируемых клеток H.sapiens/Mus musculus 8D4E9-Ba-LF-продуцент человеческих моноклональных антител против летального фактора возбудителя сибирской язвы 2018
  • Рябко Алена Константиновна
  • Марьин Максим Александрович
  • Карцева Алена Сергеевна
  • Зенинская Наталья Алексеевна
  • Силкина Марина Владимировна
  • Мунтян Яна Олеговна
  • Фирстова Виктория Валерьевна
  • Шемякин Игорь Георгиевич
RU2699193C1
TORRES S
et al., Neutralizing antibodies to botulinum neurotoxin type A in aesthetic medicine: five case reports, Clin Cosmet Investig Dermatol, 2013, V
Способ использования делительного аппарата ровничных (чесальных) машин, предназначенных для мериносовой шерсти, с целью переработки на них грубых шерстей 1921
  • Меньщиков В.Е.
SU18A1
Походная разборная печь для варки пищи и печения хлеба 1920
  • Богач Б.И.
SU11A1
FAN Y
et al., Monoclonal Antibodies that Inhibit the Proteolytic Activity of Botulinum Neurotoxin Serotype/B, Toxins, 2015, V.7, N
Разборный с внутренней печью кипятильник 1922
  • Петухов Г.Г.
SU9A1

RU 2 783 897 C1

Авторы

Рябко Алена Константиновна

Силкина Марина Владимировна

Карцева Алена Сергеевна

Зенинская Наталья Алексеевна

Макарова Мария Александровна

Мицевич Ирина Петровна

Хлынцева Анна Евгеньевна

Марьин Максим Александрович

Рогозин Метхун Мадибрович

Романенко Яна Олеговна

Шемякин Игорь Георгиевич

Фирстова Виктория Валерьевна

Даты

2022-11-21Публикация

2021-12-07Подача