Способ получения фармацевтической субстанции растительного происхождения из листьев эвкалипта прутовидного и фармацевтическая субстанция, полученная из листьев эвкалипта прутовидного Российский патент 2022 года по МПК A61K36/61 A61K127/00 B01D11/02 A61P31/04 

Изобретение относится в целом к области медицины, более детально - к химико-фармацевтической промышленности, и касается получения фармацевтической субстанции растительного происхождения, обладающей антибактериальной активностью в отношении Staphylococcus aureus (в том числе метициллинрезистентных штаммов), Streptococcus oralis, Streptococcus sangvinis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus parasangvinus, Streptococcus gordonii, Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius, Streptococcus anginosus. Заявленное изобретение решает проблему нерационального применения антибиотиков как первопричину формирования антибиотикорезистентности бактерий и соответствует приоритетному направлению развития медицины «переход к персонализированной медицине, высокотехнологичному здравоохранению и технологиям здоровьесбережения, в том числе за счет рационального применения лекарственных препаратов (прежде всего антибактериальных).

Изобретение планируется к использованию для разработки технологий лекарственных форм для лечения заболеваний, ассоциированных бактериями Staphylococcus aureus, в том числе метициллинрезистентных штаммов, Streptococcus oralis, Streptococcus sangvinis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus parasangvinus, Streptococcus gordonii, Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius, Streptococcus anginosus, преимущественно инфекционно-воспалительных заболеваний полости рта и горла и может быть использовано при лечении раневых поверхностей.

Большинство известных способов получения лекарственных средств на основе листьев эвкалипта прутовидного включают в себя схемы получения средств в виде жидких лекарственных форм (1% спиртовой раствор «Хлорофиллипта», 2% масляный раствор «Хлорофиллипта», спиртовой раствор для приема внутрь и местного применения «Галенофиллипт») и фармацевтических субстанций («Эвкалимин», «Хлорофиллипт»).

Впервые способ получения лекарственного препарата «Хлорофиллипт» из листьев эвкалипта прутовидного (раствора спиртового 1%) был описан в изобретении по авторскому свидетельстве СССР № 801341. Техническая сущность изобретения заключается в том, что листья эвкалипта прутовидного экстрагируют 96% этиловым спиртом. Обработку полученного спиртового концентрированного экстракта проводят 4% раствором сернокислой меди. Целевой продукт (сумма всех гидрофобных компонентов экстракционной смеси, в том числе медных производных хлорофилла) экстрагируют бензолом трижды с перемешиванием и отстаиванием в течение 5-6 часов. На следующей технологической стадии объединенные бензольные извлечения промывают водой очищенной и упаривают под вакуумом при температуре 40 °C. Затем проводят азеотропную перегонку бензола.

Недостатками известного способа являются: использование для экстрагирования сумм гидрофобных компонентов сырья эвкалипта прутовидного высокотоксичного растворителя бензола, относящегося к 1 классу токсичности согласно ОФС 1.1.0008.15 Государственной Фармакопеи XIV издания «Остаточные органические растворители» (высокотоксичные растворители - генотоксичные канцерогены, применяемые в фармацевтическом производстве в исключительных случаях, когда нельзя отказаться от их использования); многостадийность и длительность производственного цикла. Также авторами способа получения лекарственного препарата основными действующими веществами, ответственными за противомикробный эффект препарата, признаются медные аналоги хлорофиллов, тогда как существенный вклад в оказываемый эффект вносят флороглюциновые производные эвкалипта прутовидного (терпеноидные фенолальдегиды), а также, возможно, ди- и тритерпеновые кислоты и другие биологически активные соединения эвкалипта прутовидного (Зилфикаров И.Н. Новые подходы в разработке и стандартизации фитопрепаратов из эфиромасличного сырья: дис. … д-ра фармац. наук; 15.00.02/ И.Н. Зилфикаров. - Пятигорск, 2008. - 290 с.).

Известно изобретение по патенту RU 2320360 «Способ получения лекарственного препарата, содержащего медные аналоги хлорофилла». Сущностью является способ получения лекарственного препарата, содержащего медные аналоги хлорофилла, путем экстракции листьев эвкалипта прутовидного этанолом и последующей обработкой полученного экстракта солью меди, отличающийся тем, что экстракцию листьев эвкалипта прутовидного проводят 95-96%-ным этанолом в течение 1-2 сут без перемешивания при температуре (18-24)°С при массовом соотношении листьев эвкалипта прутовидного к этанолу 1:(5-6) с отстаиванием полученного продукта в течение 2-3 сут при температуре не выше (6-8)°С, его фильтрацией и последующей обработкой полученного экстракта солью меди в течение 6-24 ч при температуре (18-24)°С, при этом в качестве соли меди используют медь двухлористую 2-водную или 5-10%-ный спиртовой раствор меди двухлористой 2-водной при мольном соотношении хлорофилла, содержащегося в полученном экстракте, к меди двухлористой 2-водной 1:(3-4).

Недостатками известного технического решения является то, что в технологии производства сохраняется подход получения медных аналогов хлорофилла. Также существенным недостатком технологического цикла является его длительность (общая продолжительность составляет около 4 суток).

Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту RU 2572231 «Способ получения антибактериального препарата из листьев эвкалипта прутовидного», сущностью является способ получения антибактериального препарата путем экстракции листьев эвкалипта прутовидного органическим растворителем, отличающийся тем, что экстракцию высушенных измельченных до размера частиц не более 1 мм листьев эвкалипта прутовидного проводят петролейным эфиром с температурой кипения 40-70°C при температуре кипения растворителя, при соотношении 1:50 соответственно дважды по 30 минут, объединяют экстракты, упаривают, высушивают и сухой остаток растворяют в 95% этиловом спирте.

Таким образом, способ включает в себя двухкратную экстракцию сырья эвкалипта петролейным эфиром с использованием на второй стадии свежей порции экстрагента, вакуум-упаривание органической фазы до «сухого» остатка и растворение полученного продукта в 95% этиловом спирте.

Недостатками известного способа являются использование в качестве экстрагента смеси алифатических углеводородов (петролейного эфира) с нестабильной температурой кипения, расход больших объемов растворителя в одном производственном цикле, отсутствие стадии очистки от органической фазы при получении полупродукта («сухого остатка»).

Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту RU 2032414, «Способ получения препарата эвкалимин», Сущностью является способ получения препарата эвкалимин путем экстракции листьев эвкалипта прутовидного (E.viminalis Labill) органическим растворителем, упаривания экстракта, обработки упаренного экстракта гидроксидом натрия, осаждения соляной кислотой при рН=1.0, фильтрации, промывки осадка и его высушивания, очистки на окиси алюминия при 10 17% насыщения ее водой в соотношении полупродукт сорбент 1 7, элюции целевого продукта спиртом, упаривания, повторного осаждения соляной кислотой, фильтрации, промывки и сушки осадка, отличающийся тем, что в качестве сырья используют шрот после отгонки эфирного масла, а экстракцию сухого сырья проводят С₁,С₃-спиртами или хлорсодержащими углеводородами в соотношении сырье:растворитель (1:7) или С₁,С₃ спиртами в соотношении 1:14 для влажного сырья.

Способ получения включает в себя обработку экстрагентами шрота после получения эвкалиптового масла из листьев и побегов эвкалипта прутовидного методом перегонки с водяным паром. Авторами патента описано, что для влажного шрота в качестве экстрагентов возможно использовать метиловый спирт, 95% этиловый спирт, изопропиловый спирт; для высушенного растительного сырья - хлорсодержащие углеводороды (хлористый метилен, хлороформ, дихлорэтан). Объединенные экстракты упаривают и обрабатывают трижды 2% водным раствором щелочи. Технический эвкалимин получают в виде осадка при рН=1. Очистку технического эвкалимина проводят, пропуская его спиртовый раствор (1:50) через слой окиси алюминия. Принципиальным отличием от рассмотренных ранее способов получения лекарственных средств из листьев эвкалипта прутовидного является выделение суммы терпеноидных фенолальдегидов и контроль качества полученного препарата по данной группе биологически активных веществ эвкалипта.

Основными недостатками известного способа является многостадийность производства, использование в технологии получения субстанции хлорсодержащих растворителей.

Из исследованного уровня техники выявлено изобретение по патенту RU 2700699 «Способ выделения суммы эуглобалей ряда ацилфлороглюцинол-монотерпенов из листьев эвкалипта прутовидного», сущностью является способ выделения эуглобалей ряда ацилфлороглюцинол-монотерпенов из листьев эвкалипта прутовидного, включающий измельчение листьев эвкалипта прутовидного, экстрагирование измельченного сырья органическим растворителем, упаривание растворителя, отличающийся тем, что в качестве органического растворителя используют легкокипящую жидкость - метиловый эфир перфторбутана при соотношении сырье : растворитель 1:3,0-6,0 масс./об., экстрагирование сырья осуществляют в течение 2-3 часов в аппарате «Сокслет», полученный экстракт упаривают под вакуумом при 40 °С до получения суммы эуглобалей ряда ацилфлороглюцинол-монотерпенов.

Способ выделения заключается в экстрагировании измельченного растительного сырья органическим растворителем, упаривании экстракта под вакуумом и конденсации экстрагента. В качестве органического растворителя используется легко кипящая жидкость - метиловый эфир перфторбутана (Novec 7100).

Основным недостаткам получения заявленной суммы эуглобалей является использование в качестве растворителя технического специализированного реагента, предназначенного для иммерсионного охлаждения в инжиринговых системах. Novec 7100 не используется в фармацевтической промышленности в производственных циклах получения лекарственных средств, в фармакопейных документах отсутствуют сведения о растворителе. Также растворитель не включен в ОФС 1.1.0008.15 Государственной Фармакопеи XIV издания «Остаточные органические растворители» для контроля качества субстанции по данному показателю.

Наиболее близким к заявленному техническому решению по технической сущности и достигаемому техническому результату является изобретение по патенту RU 2416423 «Способ получения хлорофиллипта», сущностью которого является способ получения хлорофиллипта из листьев эвкалипта, включающий измельчение листьев, экстракцию этиловым спиртом, разделение твердой и жидкой фаз, упаривание спиртового извлечения, обработку кубового остатка раствором сернокислой меди и органическим растворителем, промывку полученного извлечения водой, упаривание и удаление остатков органического растворителя, отличающийся тем, что обработку кубового остатка осуществляют 8%-ным водным раствором сернокислой меди, а в качестве органического растворителя используют хлороформ, при этом смесь кубового остатка и 8%-ного водного раствора сернокислой меди охлаждают до комнатной температуры, затем в нее подают хлороформ, перемешивают и отстаивают до расслоения на фазы, последние разделяют, а водную фазу экстрагируют, по меньшей мере, четыре раза хлороформом при перемешивании, все хлороформные извлечения объединяют, промывают однократно водой, после этого обрабатывают 8%-ным водным раствором сернокислой меди и затем промывают водой, упаривают до густого состояния, а остатки хлороформа удаляют путем добавления этилового спирта, полученный спиртовой концентрат доупаривают в вакууме до полного удаления этилового спирта. Способ по п.1, отличающийся тем, что измельченное растительное сырье экстрагируют пятикратно 95%- или 80%-ным этиловым спиртом при соотношении сырье: экстрагент при первом контакте фаз 1:(3,6-4,3), при этом первое, второе и третье спиртовые извлечения направляют на упаривание, а четвертое и пятое спиртовые извлечения направляют на экстрагирование свежего растительного сырья.

Более детально, известный способ заключается в том, что в качестве основного экстрагента используется 96% этиловый спирт, листья эвкалипта пятикратно подвергают настаиванию, полученные спиртовые извлечения упаривают в вакууме до ~ 5% объема от общего объема извлечений. Очистку кубового остатка проводят с помощью 4% водного раствора сернокислой меди, обработки водной фазы хлороформом четырехкратно. Очищенные хлороформные извлечения промывают водой и упаривают до густого состояния («смолки»). Для удаления остаточных количеств хлороформа обрабатывают «смолку» дробно 96% этиловым спиртом. Спиртовой концентрат упаривают и получают густой экстракт - хлорофиллипт. В отличие от способа получения, описанного в авторском свидетельстве СССР № 801341, сумма всех гидрофобных компонентов из суммарного спиртового экстракта извлекается растворителем, относящимся согласно ОФС 1.1.0008.15 Государственной Фармакопеи XIV издания «Остаточные органические растворители» ко 2 классу токсичности растворителей - хлороформом.

Недостатками известного технического решения является многостадийность (состоит из 17 действий) и длительность производственного цикла (не менее чем 36 часов), необходимость использования хлороформа, а также, несмотря на предложенную стандартизацию субстанции, получаемой по известному способу, - по фенолальдегидам (Природные лекарственные препараты: химический анализ и стандартизация / И.Н. Зилфикаров. - МГТУ, ВИЛАР РАСХН, ЗАО «Вифитех». - Москва: СЛОН ПО, 2021. - 712 с.) технология получения сводится к выделению медных производных хлорофилла (феофитинатов меди) как основных биологически активных веществ эвкалипта прутовидного, ответственных за противомикробный эффект препарата.

Таким образом, большинство лекарственных средств на основе листьев эвкалипта получают экстрагированием сырья органическим растворителем с добавлением в последующем медных солей различных концентраций для получения устойчивых форм хлорофиллов. Именно хлорофиллы, выделяемые из неочищенных экстрактов, считались основными действующими веществами лекарственных средств, полученных по описанным выше технологиям, на момент их разработки. При этом на дату подачи настоящей заявки признается, что противомикробный эффект эвкалипта прутовидного связан с флороглюциновыми производными (эуглобалями, макрокарпалями, сидероксоналями) (Quantification and localization of formylated phloroglucinol compounds (FPCs) in Eucalyptus species/ B. M. Santos et al. // Frontiers in Plant Science - 2019. -V.10. - P.186-196). Также не отрицается вклад в противомикробный эффект сырья соединений терпеновой фракции эвкалиптового масла, доминирующим компонентом которого является 1,8-цинеол (эвкалиптон). Все лекарственные средства, полученные из листьев эвкалипта прутовидного, являются суммарными экстракционными препаратами/субстанциями, что не позволяет гарантировать выделение в форме медных комплексов только хлорофиллов: в реакцию комплексообразования с катионами меди (II) могут вступать и флороглюциновые производные, и соединения дитерпеновой и тритерпеновой природы и другие. Также в последнее время высказывается предположение, что комплексы хлорофиллов с катионами натрия и меди, получаемые в промышленных масштабах из различных видов растительного материла (так называемый стабилизированный «натрий-медный хлорофиллин ~ sodium cooper chlorophylinn») обладают противомикробным эффектом в отношении ряда грамположительных бактерий, что подтверждает неуникальность антибиотического действия хлорофиллов эвкалипта прутовидного. В свою очередь антибактериальная активность «Эвкалимина» (очищенной суммы флороглюциновых производных) выше по отношению к «Хлорофиллипту» и «Галенофиллипту», что служит доказательством ведущей роли фенолальдегидов в формировании антибактериального эффекта эвкалипта прутовидного.

Техническим результатом заявленного технического решения является устранение недостатков аналогов путем разработки способа получения фармацевтической субстанции растительного происхождения из листьев эвкалипта прутовидного и разработки фармацевтической субстанции, полученной из листьев эвкалипта прутовидного, при этом достигается:

1 - повышение технологичности способа за счет снижения количества операций;

2 - снижение времени получения заявленной фармацевтической субстанции;

3 - высокий уровень антибактериальной активности фармацевтической субстанции в отношении метициллинчувствительных штаммов золотистого стафилококка (methicillin-sensitive S. aureus) и в отношении метициллинустойчивых штаммов (methicillin-resistant S. aureus);

4 - высокий уровень антибактериальной активности фармацевтической субстанции в отношении бактерий рода Streptococcus spp.;

5 - повышение экологичности производства за счет исключения из технологического цикла хлороформа и замены его на гексан;

6 - повышение количественного содержания суммы фенолальдегидов в пересчете на эвкалимин, %;

7 - разработка технологической схемы получения фармацевтической субстанции, максимально приближенной к технологиям одностадийного производства (технологии «onestep»).

При этом достигается значительное сокращение расхода растворителя в производственном цикле за счет использования экстракторов непрерывного цикла типа Сокслета, а также регенерированного экстрагента.

Сущностью заявленного технического решения является способ получения фармацевтической субстанции растительного происхождения из листьев эвкалипта прутовидного, заключающийся в том, что берут сырье - листья эвкалипта прутовидного и проводят его предварительное измельчение до размера частиц не более 1 мм, затем укладывают измельченные листья в «патрон» из пористой бумаги, помещают «патрон» в экстрактор Сокслета таким образом, чтобы «патрон» свободно входил в экстрактор и омывался экстрагентом и его парами, заливают в экстракционную колбу н-гексан в качестве экстрагента в соотношении: измельченные листья эвкалипта:н-гексан = 1:50, устанавливают экстрактор Сокслета на экстракционную колбу, сверху экстрактора Сокслета закрепляют обратный холодильник, экстрагируют листья эвкалипта прутовидного посредством рециркуляции н-гексана при температуре кипения в течение 3 часов, получают экстракт листьев эвкалипта прутовидного, проводят упаривание экстракта под вакуумом при температуре кипения н-гексана до густого состояния «смолки»; далее проводят обработку кубового остатка, для чего к кубовому остатку добавляют 95% этиловый спирт, получают спиртовый концентрат целевого продукта, далее упаривают спиртовый концентрат под вакуумом до полного удаления органической фазы, получают густой экстракт, далее проводят вакуумную сушку густого экстракта с получением целевого продукта, проводят контроль целевого продукта на соответствие нормам качества; экстрагент н-гексан регенерируют и используют для экстрагирования новой партии сырья - листьев эвкалипта прутовидного. Фармацевтическая субстанция растительного происхождения из листьев эвкалипта прутовидного, полученная способом по п.1, состоящая из не менее 45% суммы терпеноидных фенолальдегидов в пересчете на эвкалимин и активная в отношении тест-культуры S. aureus АТСС 29213 в концентрации не выше 7.97 мкг/мл.

Заявленное техническое решение поясняется Фиг. 1 - Фиг.4:

На Фиг. 1 представлены электронные УФ-спектры гексановых экстрактов, полученных заявленным способом, в диапазоне длин волн 200-400 нм:

1а - три спектра поглощения аналитических растворов экстрактов, полученных посредством рециркуляции н-гексана в аппарате Сокслета через (1) - 30 мин., (2) - 60 мин., (3) - 180 мин. после начала экстракции.

1б - три спектра поглощения аналитических растворов экстрактов, полученные расчетами отношения оптической плотности к максимальному значению поглощения при λ = 278 нм.

По оси абсцисс на Фиг. 1а, 1б отложена длина волны (λ, нм), по оси ординат (A) на Фиг. 1а - оптическая абсорбция раствора A; по оси ординат (В) на Фиг. 1б - нормированное оптическое поглощение раствора (отношение оптической абсорбции к максимальному оптическому поглощению (Amax)). Максимальное оптическое поглощение (Amax) является нормирующим фактором и наблюдается в серии аналитических опытов при λ = 278 нм.

На Фиг. 2 представлена Таблица 1, в которой приведена антибактериальная активность заявленной фармацевтической субстанции и субстанции-прототипа «Хлорофиллипт», густой экстракт в отношении клинических изолятов Staphylococcus aureus.

На Фиг. 3 представлена Таблица 2, в которой приведена антибактериальная активность заявленной фармацевтической субстанции и субстанции-прототипа «Хлорофиллипт», густой экстракт в отношении клинических изолятов Streptococcus spp.

На Фиг. 4 представлена Таблица 3, в которой приведены основные показатели и нормы качества заявленной фармацевтической субстанции.

Далее заявителем приведено описание заявленного технического решения.

Заявленный технический результат достигается разработкой заявленного способа получения заявленной фармацевтической субстанции из листьев эвкалипта прутовидного, обладающего антибактериальной активностью.

Сырье эвкалипта прутовидного представляет собой высушенные листья старых и молодых ветвей, заготовлено в соответствии с требованиями к заготовке и сушке данного вида лекарственного растительного сырья. Листья эвкалипта прутовидного соответствуют показателям ФС 2.5.01.07.ФС «Эвкалипта прутовидного листья».

Листья эвкалипта измельчались до размера частиц не более 1 мм для максимального увеличения поверхности контакта фаз, уменьшения внутреннего диффузионного сопротивления и, как следствие, снижения длительности процесса экстрагирования (Salamatin A.A, Khaliullina A.S, Khaziev R.S. Extraction of aromatic abietane diterpenoids from Salvia officinalis leaves by petroleum ether: Data resolution analysis//Industrial Crops and Products. - 2020. - Vol.143. - Art. № 111909.).

Далее заявителем представлены для сведения структурные формулы основных действующих веществ листьев эвкалипта, ответственных за антибактериальный эффект экстрактов на основе эвкалипта прутовидного [Природные лекарственные препараты: химический анализ и стандартизация / И.Н. Зилфикаров. - МГТУ, ВИЛАР РАСХН, ЗАО «Вифитех». - Москва: СЛОН ПО, 2021. - 712 с.]:

феофитинат меди (II)

эувималь-1 1,8-цинеол

Заявленный способ осуществляется в целом по следующей последовательности действий:

1 - берут сырье - листья эвкалипта прутовидного и проводят его предварительное измельчение до размера частиц не более 1 мм;

2 - затем укладывают измельченные листья в «патрон» из пористой бумаги;

3 - помещают «патрон» в экстрактор Сокслета таким образом, чтобы «патрон» свободно входил в экстрактор и омывался экстрагентом и его парами;

4 - заливают в экстракционную колбу н-гексан в качестве экстрагента в соотношении: измельченные листья эвкалипта:н-гексан = 1:50;

5 - устанавливают экстрактор Сокслета на экстракционную колбу, сверху экстрактора Сокслета закрепляют обратный холодильник;

6 - экстрагируют сырье листьев эвкалипта прутовидного посредством рециркуляции экстрагента (н-гексана) при температуре кипения в течение 3 часов, получают экстракт листьев эвкалипта прутовидного;

7 - проводят упаривание экстракта под вакуумом при температуре кипения н-гексана до густого состояния «смолки»;

8 - далее проводят обработку кубового остатка, для чего к кубовому остатку добавляют 95% этиловый спирт, получают спиртовый концентрат целевого продукта;

9 - далее упаривают спиртовый концентрат под вакуумом до полного удаления органической фазы, получают густой экстракт;

10 - далее проводят вакуумную сушку густого экстракта с получением целевого продукта;

11 - проводят контроль целевого продукта на соответствие нормам качества;

12 - экстрагент н-гексан регенерируют и используют для экстрагирования новой партии сырья - листьев эвкалипта прутовидного.

Целевой продукт представляет собой заявленную фармацевтическую субстанцию растительного происхождения из листьев эвкалипта прутовидного в виде густого смолистого экстракта желтого цвета со специфическим запахом эвкалипта, состоящего из не менее 45% суммы терпеноидных фенолальдегидов в пересчете на эвкалимин и активную в отношении тест-культуры S. aureus АТСС 29213 в концентрации не выше 7.97 мкг/мл. Заявленный состав фармацевтической субстанции доказан проведенным количественным анализом содержания терпеноидных фенолальдегидов, в пересчете на эвкалимин методом УФ-спектрофотометрии (см. Таблица 3 на Фиг.4) и оценкой антибактериальной активности в отношении тест-культуры S. aureus АТСС 29213 (Пример 2, Таблица 1 на Фиг.2).

Заявленный способ позволяет получить стабильную фармацевтическую субстанцию растительного происхождения из листьев эвкалипта прутовидного с высокими выходом флороглюциновых производных и уровнем антибактериальной активности, не требует специализированного дорогостоящего оборудования, исключает стадии длительной многостадийной очистки, что позволяет сократить время производственного цикла до 3 часов обработки растительного сырья органическим растворителем против «не менее 36 часов» у прототипа. Таким образом, заявленное техническое решение сокращает временной интервал получения по сравнению с прототипом до 12 раз при одновременном исключении многостадийности производства, а также сокращаются и эксплуатационные расходы по сравнению с описанными традиционными решениями получения фармацевтических субстанций из листьев эвкалипта прутовидного.

Заявленный способ получения фармацевтической субстанции из листьев эвкалипта прутовидного может быть масштабирован в условиях массового (серийного) фармацевтического производства на традиционном для химико-фармацевтических предприятий оборудовании и с применением стандартных исходных материалов и технологий, при соблюдении надлежащих технологических режимов и условий, идентичных лабораторным.

Далее заявителем приведены примеры осуществления заявленного технического решения.

Пример 1. Получение заявленной фармацевтической субстанции растительного происхождения из листьев эвкалипта прутовидного по заявленному способу.

1 - берут сырье - листья эвкалипта прутовидного в количестве, например, 10 г и проводят его предварительное измельчение до размера частиц, например, не более 1 мм;

2 - затем укладывают измельченные листья, например, массой 10 грамм в «патрон» из пористой (например, фильтровальной) бумаги;

3 - помещают «патрон» в экстрактор Сокслета таким образом, чтобы «патрон» свободно входил в экстрактор и омывался экстрагентом и его парами;

4 - заливают в экстракционную колбу объемом, например, 1000 мл н-гексан в качестве экстрагента в количестве, например, 500 мл в соотношении: измельченные листья эвкалипта:н-гексан = 1:50;

5 - устанавливают экстрактор Сокслета на экстракционную колбу, сверху экстрактора Сокслета закрепляют обратный холодильник;

6 - экстрагируют сырье листьев эвкалипта прутовидного посредством рециркуляции экстрагента н-гексана при температуре кипения н-гексана (~69 °С) в течение 3 часов, получают экстракт листьев эвкалипта прутовидного;

7 - проводят упаривание экстракта под вакуумом при температуре кипения н-гексана (~69 °С) до густого состояния «смолки»;

8 - далее проводят обработку кубового остатка, для чего к кубовому остатку добавляют 95% этиловый спирт, например, тремя равными порциями общим объемом ~30 мл, получают спиртовой концентрат целевого продукта;

9 - упаривают спиртовой концентрат под вакуумом до полного удаления органической фазы, получают густой экстракт;

10 - проводят вакуумную сушку густого экстракта с получением целевого продукта;

11 - проводят контроль целевого продукта на соответствие нормам качества;

12 - экстрагент н-гексан регенерируют и используют для экстрагирования новой партии сырья - листьев эвкалипта прутовидного.

Результаты контроля заявленной фармацевтической субстанции на соответствие нормам качества представлены на Фиг.1 и Фиг. 4.

Так, на Фиг.1 представлены электронные УФ-спектры гексановых экстрактов, полученных заявленным способом, в диапазоне длин волн 200-400 нм, отражающие проведение количественного анализа фенолальдегидов в заявленной фармацевтической субстанции (метод УФ-спектрофотометрии при длине волны 278 нм).

Далее заявителем выполнен анализ полученных результатов, представленных на Фиг.1, а именно:

- проанализированы электронные спектры гексановых экстрактов, полученных заявленным способом, в диапазоне длин волн 200-400 нм. УФ-спектры имеют максимум при λ = 278 ± 3 нм и совпадают с УФ-спектром эвкалимина, представленного в литературе (Зилфикаров И.Н. Новые подходы в разработке и стандартизации фитопрепаратов из эфиромасличного сырья: дис. … д-ра фармац. наук; 15.00.02/ И.Н. Зилфикаров. - Пятигорск, 2008. - 290 с.).

- выполнено нормирование спектров поглощения на максимальное поглощение: УФ-спектры были идентичны в диапазоне длин волн 250-300 нм, что свидетельствует о равномерном переходе флороглюциновых производных из растительного сырья в раствор. Заявленный интервал времени экстракции (3 ч) обеспечивает заданный уровень извлечения флороглюцинов из листьев эвкалипта прутовидного (~96% к 180 мин экстрагирования).

Проведен расчет количественного содержания суммы фенолальдегидов в заявленной фармацевтической субстанции в пересчете на эвкалимин и сухое вещество с использованием удельного поглощения эвкалимина - 417 дл/см⋅г. В результате установлено, что содержание суммы фенолоальдегидов в пересчете на эвкалимин и сухое вещество в заявленной фармацевтической субстанции в серии экспериментов составило от 46,5±1,52% до 51,2±1,64%, из чего заявитель делает вывод, что сумма фенолоальдегидов в пересчете на эвкалимин и сухое вещество должна быть не менее 45,0 %, что приведено в формуле изобретения.

На Фиг. 4 представлены нормы качества заявленной субстанции (органолептические показатели, растворимость, подлинность, количественное определение).

Пример 2. Исследование антибактериальной активности заявленной фармацевтической субстанции.

Антибактериальная активность заявленной фармацевтической субстанции из листьев эвкалипта прутовидного оценивалась в сравнении с субстанцией-прототипом по патенту RU 2416423 - хлорофиллиптом, согласно разделу «Антибактериальная активность» ФСП ЗАО «Вифитех» «Хлорофиллипт, экстракт густой», Рекомендациям по определению чувствительности к антимикробным препаратам и Национальному стандарту Российской Федерации «Клинические лабораторные исследования и диагностические тест-системы in vitro: исследование чувствительности инфекционных агентов и оценка функциональных характеристик изделий для исследования чувствительности к антимикробным средствам.

Способ получения субстанции-прототипа хлорофиллипта был полностью воспроизведен в условиях лаборатории, получена субстанция-прототип хлорофиллипт, соответствующая нормируемым в патенте RU 2416423 показателям качества.

В экспериментах использовали суточные культуры бактерий Staphylococcus aureus АТСС 29213, а также клинические изоляты (в том числе метициллинрезистентных штаммов), Streptococcus oralis, Streptococcus sangvinis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus parasangvinus, Streptococcus gordonii, Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius, Streptococcus anginosus, выращенных в термостате при температуре ~ 35 °С в течение 18-24 ч.

Коллекция используемых в экспериментальной линии культур Staphylococcus aureus состояла из 10 клинических изолятов.

Для испытания штаммов золотистого стафилококка использовали бульон Мюллер-Хинтона (Mueller-Hinton) как стандартную среду для оценки чувствительности к антибиотикам. При испытании бактерий рода Streptococcus к среде бульона Мюллер-Хинтона была добавлена дефибринированная лошадиная кровь до концентрации 5.0 % в общем объеме. Инокулюм готовили путем разведения суспензии колоний бактерий, взятых из ночной культуры, в бульоне Мюллер-Хинтона. Окончательный состав инокулюма доводили до эквивалента 0.5 стандарта McFarland, что соответствует 1-5х108 КОЕ/мл.

Нормирование концентрации культур проводили с помощью измерения оптической плотности (длина волны 625 нм, кюветы с толщиной слоя 1 см). При этом адсорбция инокулюма должна составлять 0,08 - 0,13. Приведение бульонной культуры к диапазону оптической плотности проводили с помощью разбавления средой Мюллер-Хинтона.

Исследования антибактериальной активности фармацевтических субстанций проводили микрометодом серийных разведений в среде на 96-луночных планшетах для иммунологических исследований (с плоским дном) со стерильными крышками (величина конечного объема в первой лунке планшета составляла 200 мкл; в остальных по 100 мкл).

Рабочие растворы тестируемых субстанций из листьев эвкалипта получали растворением полученных густых экстрактов в 95% этиловом спирте до получения растворов с концентрацией 20,4 мг/мл (нормирование по количеству полученной новой субстанции при обработке 10 г листьев эвкалипта прутовидного).

Рабочие растворы вносили в первую лунку планшетов по 20 мкл. Далее последовательно готовили серийные разведения, из последней лунки планшета удаляли 100 мкл смеси бульона с антибактериальным агентом. В лунки с разведениями субстанций вносили по 100 мкл инокулюма, разведенного таким образом, чтоб лунки планшета содержали приблизительно 5×10⁵ КОЕ/мл. Бактериальные культуры вносились в лунки планшета не позднее 30 минут с момента их приготовления.

Параллельно с опытными линиями ставили контроль антибактериальной активности растворителя для фармацевтических субстанций (95% этилового спирта) и контроль роста культуры (лунки с серийными разведениями инокулюма в среде).

Планшеты для микроразведений плотно прижимали крышками, заклеивали клейкой пленкой с целью предотвращения высушивания. Для равномерного нагревания в термостате складывали стопками не более пяти штук. Инкубировали в термостате при ~ 35°С в течение (18±2) ч.

Результаты оценивали визуально по видимому росту бактерий, а также с помощью резазурин-теста (Alamar Blue-теста). Для этого в каждую лунку планшета добавляли по 20 мкл 0,01% резазуринового красителя. Метод визуализации результатов по оценке активности антибактериальных агентов основан на способности живых клеток бактерий, а именно митохондриальных дегидрогеназ, цитохромов и других ферментов, восстанавливать голубой нефлуоресцирующий резазурин до розового флуоресцентного резоруфина.

В Таблице 1 на Фиг. 2 представлены результаты по оценки антибактериальной активности заявленной фармацевтической субстанции и субстанции-прототипа хлорофиллипт (густой экстракт) в отношении клинических изолятов Staphylococcus aureus.

В столбцах Таблицы 1 представлено:

в первом - номера клинических изолятов Staphylococcus aureus по порядку;

во втором - характеристики штаммов по лекарственной устойчивости,

в третьем и четвертым столбцах - количественные значения минимальной подавляющей концентрации (МПК, мкг/мл) фармацевтической субстанции из листьев эвкалипта прутовидного и субстанции-прототипа соответственно.

МПК отражает минимальную концентрацию активных фармацевтических субстанций, необходимую для подавления видимого роста клинических изолятов Staphylococcus aureus in vitro.

Результаты, представленные в Таблице 1, демонстрируют, что антибактериальная активность заявленной фармацевтической субстанции прутовидного выше антибактериальной активности субстанции-прототипа. Минимальная подавляющая концентрация (МПК) колебалась в пределах от 7.97 до 15.94 мкг/мл для клинических изолятов S.aureus. При этом 64% исследуемых клинических изолятов относились к MRSA (methicillin-resistant S. aureus) - метициллинустойчивым штаммам золотистого стафилококка.

Таким образом, заявленная фармацевтическая субстанция проявляет более высокую антибактериальную активность в отношении клинических изолятов S.aureus, чем субстанция-прототип и соответствует установленным нормам качества по антибактериальной активности «субстанция должна подавлять рост тест-культуры S. aureus АТСС 29213 в концентрации не выше 7.97 мкг/мл»

В Таблице 2 на Фиг. 3 представлены результаты по оценке антибактериальной активности заявленной фармацевтической субстанции и субстанции-прототипа хлорофиллипт (густой экстракт) в отношении клинических изолятов Streptococcus spp.

В столбцах Таблицы 2 представлено:

в первом - номера клинических изолятов Streptococcus spp. по порядку;

в третьем и четвертым столбцах - количественные значения (МПК, мкг/мл) заявленной фармацевтической субстанции и субстанции-прототипа соответственно.

МПК отражает минимальную концентрацию активных фармацевтических субстанций, необходимую для подавления видимого роста клинических изолятов Streptococcus spp.in vitro.

Таким образом, Таблица 2 демонстрирует антибактериальную активность заявленной фармацевтический субстанции в отношении клинических изолятов Streptococcus spp. в диапазоне от 0.13 до 0.51 мг/мл.

Полученные результаты является доказательством получения фармацевтической субстанции, соответствующей заявленной в формуле изобретения.

Также из Примеров можно сделать вывод, что заявленная фармацевтическая субстанция на основе листьев эвкалипта прутовидного, стандартизированная по сумме терпеноидных фенолальдегидов в пересчете на эвкалимин, может быть использована в медицине и фармации для получения антибактериальных лекарственных препаратов.

Техническая сущность заявленной фармацевтической субстанции характеризуется следующими показателями качествами (Таблица 3 на Фиг. 4):

- описание,

- растворимость,

- определение основной группы биологически активных веществ - «фенолальдегидов» (подлинность субстанции),

- антибактериальная активность в отношении тестового штамма S. aureus,

- количественное определение суммы фенолальдегидов в пересчете на эвкалимин.

В Таблице 3 представлены нормируемые показатели качества заявленной фармацевтической субстанции.

В столбцах Таблицы 3 представлено:

в первом - показатель качества;

во втором - используемые для анализа методы,

в третьем - установленные в серии аналитических опытов нормы качества.

Таким образом, заявленная фармацевтическая субстанция из листьев эвкалипта прутовидного соответствует требованиям лабораторного регламента к целевому продукту.

С точки зрения технологического решения заявленный способ получения заявленной фармацевтической субстанции демонстрирует следующие преимущества:

- сокращение длительности производственного цикла (с не менее 36 ч до ~ 3 часов на весь цикл производства),

- сокращение количества стадий технологического процесса (исключение многократного экстрагирования методом мацерации; операций, связанных с обработкой раствором сульфата меди (II); извлечения медных комплексов соединений эвкалипта хлороформом) (вместо 17 операций у прототипа выполняется 12),

- повышение экологичности производственного процесса (предельная допустимая концентрация в воздухе рабочей зоны составляет 10 мг/м³ и 900 мг/м³ для хлороформа и гексана соответственно; по классу опасности хлороформ относится к 2 классу; гексан - к 4 классу опасности. (таким образом, повышение экологичности производственного процесса достигается за счет исключения их технологического цикла хлороформа, относящегося ко 2 классу токсичности на гексан, относящегося 4 классу токсичности),

- повышение уровня нормируемого показателя качества субстанции «количественное определение суммы фенолальдегидов в пересчете на эвкалимин, %» на ~ 30% (с «не менее 35%» у прототипа до «не менее 45%» у заявленного технического решения),

- повышение уровня антибактериальной активности в отношении Staphylococcus aureus (в том числе метициллинрезистентных штаммов), Streptococcus oralis, Streptococcus sangvinis, Streptococcus sobrinus, Streptococcus parasangvinus, Streptococcus gordonii, Streptococcus mutans, Streptococcus salivarius, Streptococcus anginosus (достигаемое за счет повышения количественного содержания суммы фенолальдегидов в пересчете на эвкалимин,%). Субстанция должна подавлять рост тест-культуры S. aureus АТСС 29213 в концентрации не выше 7.8 мкг/мл с 35% у прототипа до 45% у заявленного технического решения).

Таким образом, изобретение позволяет получать стабильную фармацевтическую субстанцию растительного происхождения из листьев эвкалипта прутовидного с помощью циркуляционной экстракции н-гексаном при минимальных энергозатратах с использованием стандартного экстракционного оборудования и оборудования для вакуум-упаривания (традиционного для химико-фармацевтических предприятий) со значительными преимуществами как в отношении длительности экстракционного цикла, так и суммарного содержания действующих веществ и уровня антибактериальной активности.

Основываясь на изложенном выше, представляется возможным сделать вывод о том, что заявителем достигнуты все заявленные технические результаты путем разработки способа получения фармацевтической субстанции растительного происхождения из листьев эвкалипта прутовидного и разработки фармацевтической субстанции, полученной из листьев эвкалипта прутовидного, при этом:

1 - достигнуто повышение технологичности способа за счет снижения количества операций;

2 - достигнуто снижение времени получения заявленной фармацевтической субстанции;

3 - достигнут высокий уровень антибактериальной активности фармацевтической субстанции в отношении метициллинчувствительных штаммов золотистого стафилококка (methicillin-sensitive S. aureus) и в отношении метициллинустойчивых штаммов (methicillin-resistant S. aureus);

4 - достигнут высокий уровень антибактериальной активности фармацевтической субстанции в отношении бактерий рода Streptococcus spp.;

5 - повышена экологичность производства за счет исключения из технологического цикла хлороформа и замены его на гексан;

6 - повышено количественное содержание суммы фенолальдегидов в пересчете на эвкалимин, %;

7 - разработана технологическая схема получения фармацевтической субстанции, максимально приближенная к технологиям одностадийного производства (технологии «onestep»).

При этом достигнуто значительное сокращение расхода растворителя в производственном цикле за счет использования экстракторов непрерывного цикла типа Сокслета, а также регенерированного экстрагента.

Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «новизна» предъявляемого к изобретениям, т.к. из исследованного уровня техники не выявлена заявленная совокупность признаков, приведенная в независимых пунктах формулы изобретения.

Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «изобретательский уровень», предъявляемого к изобретениям, т.к. заявленное техническое решение не является очевидным для специалиста вследствие того, что заявитель обеспечил возможность разрешения казалось бы неразрешимых противоречий, а именно при одновременном снижении количества операций удалось на порядок снизить время получения фармацевтической субстанции и одновременно повысить экологичность производства и качество фармацевтической субстанции.

Заявленное техническое решение соответствует условию патентоспособности «промышленная применимость», предъявляемого к изобретениям, т.к. заявленное техническое решение может быть реализовано в условиях промышленного производства с применением известного оборудования и известных материалов и технологий.

Группа изобретений относится к химико-фармацевтической промышленности и касается получения фармацевтической субстанции растительного происхождения, обладающей антибактериальной активностью. Способ получения фармацевтической субстанции растительного происхождения из листьев эвкалипта прутовидного, заключающийся в том, что берут сырьё – листья эвкалипта прутовидного и проводят его предварительное измельчение до размера частиц не более 1 мм, затем укладывают измельченные листья в «патрон» из пористой бумаги, помещают «патрон» в экстрактор Сокслета таким образом, чтобы «патрон» свободно входил в экстрактор и омывался экстрагентом и его парами, заливают в экстракционную колбу н-гексан в качестве экстрагента в соотношении: измельченные листья эвкалипта:н-гексан=1:50, устанавливают экстрактор Сокслета на экстракционную колбу, сверху экстрактора Сокслета закрепляют обратный холодильник, экстрагируют сырье листьев эвкалипта прутовидного посредством рециркуляции экстрагента н-гексана при температуре кипения н-гексана в течение 3 часов, получают экстракт листьев эвкалипта прутовидного, проводят упаривание экстракта под вакуумом при температуре кипения н-гексана до густого состояния «смолки»; далее проводят обработку кубового остатка, для чего к кубовому остатку добавляют 95% этиловый спирт, получают спиртовой концентрат целевого продукта, далее упаривают спиртовой концентрат под вакуумом до полного удаления органической фазы, получают густой экстракт, далее проводят вакуумную сушку густого экстракта с получением целевого продукта, проводят контроль целевого продукта на соответствие нормам качества; экстрагент н-гексан регенерируют и используют для экстрагирования новой партии сырья – листьев эвкалипта прутовидного. Фармацевтическая субстанция растительного происхождения из листьев эвкалипта прутовидного, полученная вышеописанным способом, состоящая из не менее 45% суммы терпеноидных фенолальдегидов в пересчёте на эвкалимин и активная в отношении тест-культуры S. aureus АТСС 29213 в концентрации не выше 7.97 мкг/мл. Вышеописанный способ позволяет повысить технологичность способа за счёт снижения количества операций; снизить время получения заявленной фармацевтической субстанции; повысить экологичность производства; повысить количественное содержание суммы фенолальдегидов в пересчёте на эвкалимин, %; субстанция, полученная вышеописанным способом, обладает высоким уровнем антибактериальной активности в отношении метициллинчувствительных штаммов золотистого стафилококка (methicillin-sensitive S. aureus) и метициллинустойчивых штаммов (methicillin-resistant S. aureus). 2 н.п. ф-лы, 4 ил., 2 пр.

1. Способ получения фармацевтической субстанции растительного происхождения из листьев эвкалипта прутовидного, заключающийся в том, что берут сырьё – листья эвкалипта прутовидного и проводят его предварительное измельчение до размера частиц не более 1 мм, затем укладывают измельченные листья в «патрон» из пористой бумаги, помещают «патрон» в экстрактор Сокслета таким образом, чтобы «патрон» свободно входил в экстрактор и омывался экстрагентом и его парами, заливают в экстракционную колбу н-гексан в качестве экстрагента в соотношении: измельченные листья эвкалипта:н-гексан=1:50, устанавливают экстрактор Сокслета на экстракционную колбу, сверху экстрактора Сокслета закрепляют обратный холодильник, экстрагируют сырье листьев эвкалипта прутовидного посредством рециркуляции экстрагента н-гексана при температуре кипения н-гексана в течение 3 часов, получают экстракт листьев эвкалипта прутовидного, проводят упаривание экстракта под вакуумом при температуре кипения н-гексана до густого состояния «смолки»; далее проводят обработку кубового остатка, для чего к кубовому остатку добавляют 95% этиловый спирт, получают спиртовой концентрат целевого продукта, далее упаривают спиртовой концентрат под вакуумом до полного удаления органической фазы, получают густой экстракт, далее проводят вакуумную сушку густого экстракта с получением целевого продукта, проводят контроль целевого продукта на соответствие нормам качества; экстрагент н-гексан регенерируют и используют для экстрагирования новой партии сырья – листьев эвкалипта прутовидного.

2. Фармацевтическая субстанция растительного происхождения из листьев эвкалипта прутовидного, полученная способом по п.1, состоящая из не менее 45% суммы терпеноидных фенолальдегидов в пересчёте на эвкалимин и активная в отношении тест-культуры S. aureus АТСС 29213 в концентрации не выше 7.97 мкг/мл.