Область техники, к которой относится изобретение
[0001] Настоящее изобретение относится к иммуногенным и вакцинным композициям, содержащим гликопротеин G вируса Hendra (HeV) и/или вируса Nipah (NiV), и к способам их применения.
Описание известного уровня техники
[0002] Повторяющиеся вспышки NiV, приводящие к значительному числу человеческих смертей, в последнее время стали проблематичными (см., например, Butler (2000) Nature 429, 7). Известно также, что HeV приводит к гибели людей и животных и генетически и иммунологически находится в близком родстве с NiV. В настоящее время отсутствует вакцина или терапевтические средства для предотвращения инфицирования или заболеваний, вызываемых вирусом Nipah или вирусом Hendra. Как вирус Nipah, так и вирус Hendra, Национальным институтом Аллергических и Инфекционных Заболеваний США отнесены к агентам категории С в отношении биозащиты. Кроме того, так как указанные вирусы являются зоонозными агентами 4 уровня биологической безопасности (BSL-4), производство вакцин и/или диагностических средств с указанной безопасностью весьма дорого и затруднительно. Таким образом, существует необходимость в создании вакцин и диагностических средств, относящихся к вирусу Nipah или вирусу Hendra, которые смогут обеспечить высокую производительность вакцин и/или диагностических средств.
[0003] Парамиксовирусы, такие как HeV и NiV, содержат два основных закрепленных на мембране гликопротеина в оболочке вирусной частицы. Один гликопротеин требуется для прикрепления вириона к рецепторам на клетках хозяина и обозначается или как гемагглютинин-нейрамидазный белок (HN), или как гемагглютининовый белок (H), и другой представляет собой гликопротеин (G), который не обладает ни гемагглютиназной, ни нейраминидазной активностями. Гликопротеины присоединения представляют собой мембранные белки II типа, в которых амино (N) конец молекул ориентирован в направлении цитоплазмы, и карбокси (C) конец белков является внеклеточным. Другим основным гликопротеином является слитый гликопротеин (F), который представляет собой трехмерный фьюзогенный оболочечный гликопротеин класса I, содержащий два участка гептадных повторов (HR) и гидрофобный слитый пептид. Инфицированные HeV и NiV клетки за счет pH-независимого процесса мембранного слияния в воспринимающие клетки хозяина за счет согласованного действия их гликопротеина G и гликопротеина F присоединения после рецепторного связывания. Основная функция гликопротеина G присоединения HeV и NiV состоит в ангажировании соответствующих рецепторов на поверхности клеток хозяина, которые для большинства хорошо охарактеризованных парамиксовирусов являются фрагментами сиаловой кислоты. Гликопротеины G HeV и NiV используют рецепторы белков эфрина B2 и/или эфрина B3 клеток хозяина, и были созданы антитела, которые блокируют присоединение вирусов за счет гликопротеина G (WO 2006137931, Bishop (2008) J. Virol. 82: 11398-11409). Кроме того, были созданы вакцины, которые также используют гликопротеин G в качестве средства для выработки иммунозащитной реакции против HeV и NiV инфекции (WO 2009117035).
[0004] Доза-сайт реакционная способность является основной проблемой как в ветеринарии, так и для использования человеком Quil A в препаратах вакцин. Одним из способов, позволяющих избежать указанной токсичности Quil A, является использование иммуностимулирующих комплексов (Rajput (2007) J. Zhejiang Univ. Sci. B, 8: 53-161). Это происходит, главным образом, потому, что Quil A является менее реакционноспособным при включении в иммуностимулирующие комплексы, так как его связь с холестерином в комплексе снижает его способность извлекать холестерин из клеточных мембран, и, следовательно, его клетколитические эффекты. Кроме того, для создания эффекта, аналогичного уровню адъюванта, требуется меньшее количество Quil A. Иммуномодуляторные свойства Quil A сапонинов и дополнительные преимущества, которые можно извлечь из указанных сапонинов, если они включены в иммуностимулирующий комплекс, были раскрыты в WO 2000041720.
[0005] Комбинация гликопротеинов G HeV и/или NiV с иммуностимулирующими комплексами в одной вакцине представляет собой усовершенствование в разработке эффективных HeV и NiV вакцин, создавая потенциал для повышенной иммунореактивности при снижении побочных эффектов адъювантов, если указанные компоненты вводят в комбинации.
Сущность настоящего изобретения
[0006] Настоящее изобретение включает иммуногенную композицию, содержащую белок G вируса Hendra и/или Nipah, иммуностимулирующий комплекс (ISC) и один или более эксципиентов в количестве, эффективном для того, чтобы вызвать продуцирование нейтрализующих антител против вируса Hendra и/или Nipah после введения субъекту. В некоторых вариантах осуществления указанная иммуногенная композиция содержит сапонин, фосфолипид и стероид.
[0007] В некоторых вариантах осуществления растворимый гликопротеин G вируса Hendra состоит из аминокислот 73-604 нативного гликопротеина G Hendra (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах осуществления растворимый гликопротеин G вируса Hendra кодируется нуклеотидной последовательностью, включающей нуклеотиды 64-1662 в последовательности SEQ ID NO: 16. В некоторых вариантах осуществления растворимый белок G вируса Hendra присутствует в димерной форме, где каждая растворимая субъединица димера гликопротеина G вируса Hendra соединена одной или более дисульфидными связями. В некоторых вариантах осуществления растворимый белок G вируса Hendra присутствует в форме тетрамера. В некоторых вариантах осуществления тетрамерная форма представлена в виде димера димеров, нековалентно связанных и/или соединенных одной или более дисульфидными связями. Концентрация растворимого G белка вируса Hendra может составлять от 5 до 100 мкг/мл в иммуногенной композиции.
[0008] В некоторых вариантах осуществления указанный сапонин выделяют из Quillaja saponaria Molina, и может быть выбран из QH-A, QH-B, QH-C или QS21. В некоторых вариантах осуществления указанный фосфолипид выбирают из группы, состоящей из фосфатидилхолина (PC), дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC), фосфатидиновной кислоты (фосфатидата) (PA), фосфатидилэтаноламина (PE), фосфатидилсерина (PS), фосфатидилинозита (PI), фосфатидилинозитфосфата (PIP), фосфатидилинозитбисфосфата (PIP2), фосфатидилинозиттрифосфата (PIP3), фосфорилхолина (SPH), церамидфосфорилэтаноламина (Cer-PE) и церамидфосфорилглицерина. В некоторых вариантах осуществления указанный сапонин представляет собой Quil A, указанный фосфолипид представляет собой DPPC, стероид представляет собой холестерин и отношение Quil A:DPPC:холестерин в указанной композиции составляет 5:1:1 по массе.
[0009] Настоящее изобретение также включает способ выработки у субъекта нейтрализующей реакции антител против вирусов Hendra и/или Nipah, включающий введение указанному субъекту раскрываемой в данном описании указанной иммуногенной композиции в количестве и в течение периода времени, эффективных для выработки нейтрализующей реакции антител. В некоторых вариантах осуществления нейтрализующая реакция антител снижает репродуцирование вирусов Hendra и/или Nipah у субъекта и может также уменьшить шеддинг Hendra и/или Nipah вируса у субъекта. В некоторых вариантах осуществления субъект был подвергнут воздействию вируса Hendra и/или Nipah, тогда как в других вариантах осуществления субъект поражен инфекцией вируса Hendra и/или Nipah. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает способ выработки у субъекта нейтрализующей реакции антител против вируса Hendra, включающий введение указанному субъекту указанной раскрываемой в данном описании иммуногенной композиции, в количестве и в течение периода времени, эффективных для выработки нейтрализующей реакции антител. В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает способ выработки у субъекта нейтрализующей реакции антител против вируса Nipah, включающий введение указанному субъекту раскрываемой в данном описании иммуногенной композиции, в количестве и в течение периода времени, эффективных для выработки нейтрализующей реакции антител.
[0010] В некоторых вариантах осуществления указанную иммуногенную композицию вводят внутримышечно. В некоторых вариантах осуществления указанную иммуногенную композицию вводят в виде множества доз, причем после первой дозы вторую дозу вводят по меньшей мере от около двадцати одного дня до около двадцати восьми дней после первой дозы. В некоторых вариантах осуществления каждая доза содержит около 50 или около 100 мкг растворимого белка G вируса Hendra.
[0011] Настоящее изобретение кроме того включает способ дифференциации субъекта, вакцинированного раскрываемой в данном описании иммуногенной композицией, от субъекта, который был подвергнут воздействию вируса Hendra и/или Nipah, включающий детектирование присутствия антител в биологическом образце, выделенном из субъекта, против по меньшей мере одного из любых следующих вирусных белков HeV и/или NiV, выбранных из группы, состоящей слитого белка (F), матриксного белка (M), фосфопротеина (P), крупного белка (L) и нуклеокапсидного белка (N).
[0012] Иммуногенную композицию и способы настоящего изобретения можно применять в отношении субъектов, таких как человек, лошадь, корова, овца, свинья, коза, курица, собака или кошка.
[0013] Настоящее изобретение также включает способ выработки у человека нейтрализующей реакции антител против вирусов Hendra и/или Nipah, включающий введение указанному субъекту иммуногенной композиции, содержащей растворимый гликопротеин G вируса Hendra в количестве и в течение периода времени, эффективного для выработки нейтрализующей реакции антител. В некоторых вариантах осуществления указанная иммуногенная композиция дополнительно содержит адъювант.
Описание чертежей
[0014] На фиг. 1 показана ректальная температура в течение времени для лошадей, которым вводят растворимый рекомбинантный гликопротеин (sG) вируса Hendra в количестве 50 или 100 мкг/доза с добавлением в качестве адъюванта 250 мкг иммуностимулирующего комплекса, с последующим воздействием живого вируса Hendra в день 0.
[0015] На фиг. 2 показана частота сокращений сердца с течением времени у лошадей, которым вводят растворимый рекомбинантный гликопротеин (sG) вируса Hendra в количестве 50 или 100 мкг/доза с добавлением в качестве адъюванта 250 мкг иммуностимулирующего комплекса, с последующим воздействием живого вируса Hendra в день 0.
[0016] На фиг. 3 схематически показано получение иммуностимулирующего комплекса.
[0017] На фиг. 4 схематически показана диаграмма sGHeV вакцинации и схема заражения NiV. Даты sGHeV вакцинации, NiV заражения и эвтаназии указаны стрелками. Образцы крови и мазков отбирают в дни -42, -7, 0, 3, 5, 7, 10, 14, 21 и 28 после заражения, как указано (*). Серый текст соответствует заражению тимелином (верхний ряд); черный текст соответствует вакцинации тимелином (нижний ряд). Показано число африканских зеленых макак (AGM) в качестве субъектов для каждой группы дозирования вакциной и один контрольный субъект.
[0018] На фиг. 5 показана кривая выживания инфицированных NiV животных. Результаты для контрольных животных (n=2) и вакцинированных sGHeV животных (n=9) используют для построения кривой выживания Каплан-Мейера. Контроль включает результаты для одного дополнительного ретроспективного контрольного животного. Вакцинированные животные получают 10 мкг, 50 мкг или 100 мкг sGHeV, которые дважды вводят подкожно. Среднее время до конечной стадии заболевания составляет 11 дней для контрольных животных, тогда как все вакцинированные субъекты оставались живыми до эвтаназии в конце исследования.
[0019] На фиг. 6 показан NiV- и HeV-специфический иммуноглобулин (Ig) у вакцинированных животных. Сыворотку и назальные мазки отбирают у вакцинированных животных, оценивают реакции IgG, IgA и IgM, используя sGHeV и sGNiV мультиплексный микросферный анализ. Сыворотку или мазки от животных в одной и той же группе вакцинной дозы (n=3) анализируют индивидуально и рассчитывают средние интенсивности флуоресценции микросфер (M.F.I.), которые откладывают на Y-оси. Планки погрешностей представляют собой среднюю стандартную ошибку от среднего. Сывороточный sG-специфический Ig изображен черным (sGHeV (открытые треугольники), sGNiV (затушеванные треугольники)) и мукозальный sG-специфический IgA представлен серыми символами (sGHeV (открытые треугольники), sGNiV (затушеванные треугольники)).
Предпочтительный вариант осуществления настоящего изобретения
Вакцинные и иммуногенные композиции
[0020] Вакцинная и иммуногенная композиция настоящего изобретения вызывает по меньшей мере одну из числа гуморальных и клеточных иммунных реакций у субъекта, которому вводят указанную композицию, или является эффективной для усиления по меньшей мере одной иммунной реакции против по меньшей мере одного штамма HeV и/или NiV, так что их введение пригодно для целей вакцинации и/или предотвращения против HeV и/или NiV инфицирования одним или более штаммами HeV и/или NiV. Указанная композиция настоящего изобретения доставляет нуждающемуся в этом субъекту гликопротеин G, включая растворимые гликопротеины G из HeV и/или NiV и иммуностимулирующий комплекс (ISC), который действует в качестве адъюванта. В некоторых вариантах осуществления количество гликопротеина G включает, но без ограничений, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200 или 250 мкг/мл, которые также могут содержать 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275 или 300 мкг/мл ISC. В некоторых вариантах осуществления количество гликопротеина G составляет 5, 50 или 100, и количество ISC составляет 250 мкг на мл.
A. Белки G HeV и NiV
[0021] В некоторых вариантах осуществления указанные вакцинные и иммуногенные композиции включают один или более гликопротеинов G HeV и/или NiV, как раскрыто в описании. Термин белок в описании используют в широком смысле, и он включает полипептиды или их фрагменты. В качестве примера, но без ограничения, гликопротеин G HeV может быть в растворимой форме и может включать аминокислоты 73-604 аминокислотной последовательности гликопротеина G HeV по Wang (2000) J. Virol. 74, 9972-9979 (см. также Yu (1998) Virology 251, 227-233). Также в качестве примера, но без ограничения, гликопротеин G NiV может быть в растворимой форме и может включать аминокислоты 71-602 аминокислотной последовательности гликопротеина G NiV по Harcourt (2000) Virology 271: 334-349, 2000 (см. также Chua (2000) Science, 288, 1432-1).
[0022] Обычно растворимые формы гликопротеинов G HeV и NiV включают весь или часть эктодомена (например, внеклеточную) гликопротеина G из HeV или NiV, и обычно их получают делецией всего или части трансмембранного домена гликопротеина G и всего или части цитоплазмического концевого сегмента гликопротеина G. В качестве примера, растворимый гликопротеин G может включать полный эктодомен гликопротеина G HeV или NiV. Также в качестве примера, но без ограничений, растворимый гликопротеин G может включать весь или часть эктодомена и часть трансмембранного домена гликопротеина G HeV или NiV.
[0023] Растворимые гликопротеины G HeV или NiV настоящего изобретения, которые обычно сохраняют одну или более из характеристик соответствующего нативного вирусного гликопротеина, такую как способность взаимодействовать или связываться с вирусным рецептором клеток хозяина, могут быть получены в олигомерной форме или формах, или способность вызывать продуцирование антител (включая, но, не ограничиваясь ими, нейтрализующие вирус антитела), способные распознавать нативный гликопротеин G. Примеры дополнительных характеристик включают, но, не ограничиваясь ими, способность блокировать или предотвращать инфицирование клеток хозяина. Обычную методологию можно использовать для оценки растворимых гликопротеинов G HeV или NiV в отношении одной или более указанных характеристик.
[0024] В качестве примера, но без ограничений, полинуклеотид, кодирующий растворимый гликопротеин G HeV, может включать полинуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислоты 73-604 аминокислотной последовательности для гликопротеина G HeV по Wang (2000) J. Virol. 74, 9972-9979 (SEQ ID NO: 2). Также в качестве примера, но без ограничения, полинуклеотид, кодирующий растворимый гликопротеин G HeV, может включать нуклеотиды 9129-10727 полинуклеотидной последовательности для гликопротеина G HeV по Wang (2000) J. Virol. 74, 9972-9979. Кроме того, также можно использовать оптимизированную кодоном полинуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислоты 73-604 аминокислотной последовательности для гликопротеина G HeV (SEQ ID NO: 2). В некоторых вариантах осуществления указанные оптимизированные кодоном последовательности включают или состоят из нуклеотидов 64-1662 из SEQ ID NO: 16. В следующих вариантах осуществления оптимизированные кодоном последовательности включают или состоят из SEQ ID NO: 16, которая включает нуклеотиды, кодирующие Igk лидерную последовательность.
[0025] В качестве примера, но без ограничения, гликопротеин G NiV может существовать в растворимой форме и включает аминокислоты 71-602 аминокислотной последовательности для гликопротеина G NiV по Harcourt (2000) Virology 271, 334-349. Неограничивающие примеры последовательностей, которые можно использовать для конструирования растворимого гликопротеина G NiV, можно найти у Harcourt (2000) Virology 271, 334-349. Как правило, можно использовать, последовательности гликопротеина G из любого изолята или штамма вируса Nipah для получения полинуклеотидов и полипептидов настоящего изобретения.
[0026] В качестве примера, но без ограничения, полинуклеотид, кодирующий растворимый гликопротеин G NiV, может включать полинуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислоты 71-602 аминокислотной последовательности для гликопротеина G NiV по Harcourt (2000) Virology 271, 334-349. Также в качестве примера, но без ограничения, полинуклеотид, кодирующий растворимый гликопротеин G NiV, может включать 234-2042 полинуклеотидной последовательности для гликопротеина G NiV по Harcourt (2000) Virology 271, 334-349 (SEQ ID NO: 4). Кроме того, можно также использовать оптимизированную кодоном полинуклеотидную последовательность, кодирующую аминокислоты 71-602 аминокислотной последовательности для гликопротеина G NiV.
[0027] Функциональные эквиваленты указанных гликопротеинов G можно использовать в иммуногенных и вакцинных композициях настоящего изобретения. В качестве примера, но без ограничения, функционально эквивалентные полипептиды обладают одной или более следующими характеристиками: им присуща способность взаимодействовать или связываться с вирусным рецептором клетки хозяина, их можно получать в димерной или тетрамерной форме или формах, им присуща способность вызывать продуцирование антитела (включая, но, не ограничиваясь ими, нейтрализующие вирусы HeV и/или NiV антитела), способность распознавать нативный гликопротеин G и/или способность блокировать или предотвращать инфицирование клетки хозяина.
[0028] В некоторых вариантах осуществления указанный гликопротеин G может быть в димерной и/или тетрамерной форме. Такие димеры зависят от образования дисульфидных связей, образующихся между цистеиновыми остатками в гликопротеине G. Такие дисульфидные связи могут соответствовать таким, которые образуются в нативном гликопротеине G (например, положение цистеинов остается неизменным), когда экспрессированы в поверхности HeV или NiV или могут быть изменены в присутствии или расположении (например, за счет изменения положения цистеина(ов) в аминокислотной последовательности) гликопротеина G, так что образуются отличающиеся димерная и/или тетрамерная формы гликопротеина G, которые повышают антигенность. Кроме того, недимеризованные и нететрамеризованные формы также включены в объем настоящего изобретения, снова принимая во внимание тот факт, что гликопротеин G присутствует в виде многочисленных конформацинно-зависимых эпитопов (т.е. возникающих за счет третичных трехмерных структур) и что сохранение множества таких природных эпитопов является очень предпочтительным, так как обеспечивает реакцию нейтрализации антител.
[0029] HeV иммуногенные и вакцинные композиции настоящего изобретения могут содержать белки различной длины, но включают аминокислотные остатки 73-604 из SEQ ID NO: 2. В одном варианте настоящего изобретения оболочечные белки настоящего изобретения по меньшей мере на около 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичны гликопротеину HeV SEQ ID NO: 2 (включая аминокислоты 73-604). Соответственно, гликопротеины G HeV настоящего изобретения включают иммуногенные фрагменты нативного гликопротеина G HeV с достаточным количеством аминокислот, чтобы получить конформационные эпитопы. Неограничивающие примеры иммуногенных фрагментов включают аминокислотные последовательности, которые могут быть длиной по меньшей мере 530, 531, 532, 533, 534 или 535, или более аминокислот. В некоторых вариантах осуществления указанный гликопротеин G HeV включает или состоит из SEQ ID NO: 2 или синтетических конструкций, дополнительно включающих Igx лидерную последовательность (SEQ ID NO: 15).
[0030] Указанные NiV иммуногенные и вакцинные композиции настоящего изобретения могут содержать белки различной длины, но включают аминокислотные остатки 71-602 из SEQ ID NO: 4. В одном варианте настоящего изобретения капсульные белки настоящего изобретения по меньшей мере на около 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 или 99% идентичны белкам гликопротеина NiV SEQ ID NO: 4 (включая аминокислоты 71-602). Соответственно, указанные гликопротеины G NiV настоящего изобретения включают иммуногенные фрагменты нативного гликопротеина G NiV с достаточным количеством аминокислот, чтобы обеспечить получение конформационных эпитопов. Неограничивающие примеры иммуногенных фрагментов включают аминокислотные последовательности, которые могут быть длиной по меньшей мере 528, 529, 530, 531, 532 или 533, или более аминокислот. В некоторых вариантах осуществления гликопротеин G NiV включает или состоит из SEQ ID NO: 4 или синтетических конструкций, дополнительно включающих лидерную последовательность.
[0031] Иммуногенные фрагменты, как раскрыто в данном описании, содержат по меньшей мере один эпитоп антигена и проявляют HeV и/или NiV антигенность, и способны повышать иммунную реакцию, если представлены в подходящей конструкции, такой как, например, когда они слиты с другими HeV и/или NiV антигенами или представлены на носителе, причем иммунная реакция направлена против нативного антигена. В одном варианте настоящего изобретения, указанные иммуногенные фрагменты содержат по меньшей мере 20 непрерывных аминокислот из HeV и/или NiV антигена, например, по меньшей мере 50, 75 или 100 непрерывных аминокислот из HeV и/или NiV антигена.
[0032] Варианты осуществления гликопротеина G HeV и NiV кроме того включают изолированный полипептид, включающий аминокислотную последовательность, характеризующуюся по меньшей мере 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 или 100% идентичностью нативным гликопротеинам G HeV или NiV, где указанная полипептидная последовательность может быть идентична нативной аминокислотной последовательности гликопротеина G HeV или NiV или может включать вплоть до некоторого целого числа аминокислотных изменений по сравнению с аминокислотной последовательностью нативного HeV или NiV белка G, где указанные изменения выбирают из группы, состоящей из по меньшей мере одной аминокислотной делеции, замещения, включая консервативное и неконсервативное замещение, или вставки, и где указанные изменения могут происходить по амино- или карбокси-концевым положениям сравнительной полипептидной последовательности, или в любом месте между указанными концевыми положениями, рассеянными вкрапленными или рассеянными индивидуально между аминокислотами в сравнительной последовательности, или в одной или более непрерывных группах внутри аминокислотной последовательности нативного гликопротеина G HeV или NiV.
[0033] Уровень идентичности или гомологичности последовательности по аминокислотной последовательности можно определить, используя BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) анализ (программа для обнаружения сходства последовательностей белков путем их локального выравнивания), при использовании алгоритма, используемого программами blastp, blastn, blastx, tblastn и tblastx (Altschul (1997) Nucleic Acids Res. 25, 3389-3402 и Karlin (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264-2268), которые сконструированы для поиска сходства последовательностей. Подход, который используется в указанной BLAST программе, сводится сначала к поиску аналогичных сегментов, с гэпами (не непрерывными) и без гэпов (непрерывных), между изучаемой последовательностью и последовательностью из базы данных, затем оценивают статистическую значимость всех обнаруженных совпадений и, наконец, суммируют только те совпадения, которые удовлетворяют заранее выбранному порогу значимости. Для обсуждения основных проблем поиска сходства с базой данных последовательностей см. Altschul (1994) Nature Genetics 6, 119-129. Параметры поиска для гистограмм, описаний, выравниваний, предположений (т.е. порога статистической значимости для информированных совпадений против последовательностей базы данных), отсечек, матриц и фильтров (низкая комплексность) установлены по умолчанию. Дефолтная матрица замен, используемая blastp, blastx, tblastn и tblastx, представляет собой BLOSUM62 матрицу (Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919), рекомендуется для изучаемых последовательностей длиной более 85 аминокислот.
[0034] Вакцинные и иммуногенные композиции настоящего изобретения могут дополнительно включать дополнительные белки G HeV и/или NiV из различных штаммов, которые могут далее потенцировать способы иммунизации настоящего изобретения.
B. Иммуностимулирующие комплексы
[0035] Как правило, в настоящем изобретении предложены иммуногенные композиции, включая вакцинные композиции, содержащие растворимые формы гликопротеина G HeV и/или NiV оболочечного белка в комбинации с иммуностимулирующим комплексом (ISC) и к способам применения указанных композиций для предотвращения и лечения HeV и/или NiV инфекций у субъекта. В настоящем изобретении вакцинные и/или иммуногенные композиции включат иммуностимулирующий комплекс, который действует в качестве адъюванта. Как используется в данном описании, термин "адъювант" относится к агентам, которые, хотя сами по себе не обладают каким-либо специфическим антигенным эффектом, может стимулировать иммунную систему, повышая реакцию на антиген.
[0036] ISC обладает рядом отличительных признаков, которые делают его идеальным для некоторых применений:
[0037] Экономия антигена: Как отмечено, например, у Wee (2008) Mucosal Immunol. 1, 489-496, в ситуациях, когда доступность антигена ограничена или стоимость антигена высока, было показано, что ISC позволяют осуществлять 10-100 кратную экономию антигена. Вероятнее всего, это связано с комбинацией повышенной эффективности или более подходящим механизмом действия по сравнению с другими адъювантами.
[0038] Кросс-презентация: Как отмечено, например, у Schnurr (2009) J. Immunol. 182, 1253-1259, предоставление антигена представляющими антиген клетками (APC) обычно происходит по одной из двух схем. Чужой антиген обычно захватывается APC, затем процессируется и снова экспрессируется на поверхность APC в контексте молекул II класса главного комплекса гистосовместимости (MHC). Затем они способны к обнаружению лимфоцитами и, если присутствуют правильные ко-стимуляторные факторы/сигналы, реагировать на них соответствующим образом. Собственные или раковые антигены и вирусные антигены обычно процессируются и экспрессируются в контексте молекул класса I, так как они присутствуют в цитоплазме APC. Эффективный иммунитет в отношении раковых и вирусных антигенов требует доступа к схеме класса I. Это происходит естественным путем в процессе инфицирования вирусом или клеточного гомеостаза (клеточная регенерация внутренних антигенов). Антигенам (вирусным или собственным), введенным в виде вакцины, необходимо попасть с внешней стороны клетки в механизм процессинга антигена указанной клетки из схемы класса II в схему класса I. Это может происходить естественным путем в дендритных клетках (DC-специалисты APC) или этого можно достичь путем вакцинации антигенами, смешанными с ISC в качестве адъюванта. Указанный процесс нахождения пути внешне полученным антигеном в схему презентации антигена класса I называют перекрестной презентацией. Точный механизм, за счет которого ISC достигает перекрестной презентации антигена, полностью не был выяснен, но может быть основан на нарушении структуры мембран ISC компонентов.
[0039] Гуморальные и опосредованные клетками реакции: Как отмечено, например, у Марасковского (2009) Immunol. Cell Biol. 87, 371-376), за счет механизма действия ISC задействованы как гуморальные, так и клеточные "плечи" адаптивной иммунной системы. Для некоторых видов это параллельно профилю цитокинов, стимулированных вакцинацией указанным адъювантом. Иммунные реакции типа 1 характеризуются экспрессией интерлейкина-2 и IFN-гамма и защитой от внутриклеточных патогенов (бактерий, простейших и вирусов), и реакции типа 2 характеризуются экспрессией интерлейкина-4 и выработкой нейтрализующих антител для иммунитета, связанного с антитоксинами и антипатогенами. ISC обеспечивает сбалансированный профиль для цитокинов между указанными двумя крайностями, обеспечивая большую степень свободы иммунной реакции. Кроме того, в ряде исследований было показано, что ISC могут быть эффективными, если вакцины вводят интраназально. Такой способ обеспечивает сенсибилизацию поверхностей слизистых оболочек и, таким образом, обеспечивает соответствующий иммунитет в сайте внедрения патогенна, особенно для указанного случая (защитные свойства слизистых оболочек), см. также Sjolander (2001) Vaccine 19, 4072-4080.
[0040] Критерии стерильного фильтрования и стабильного получения: Размеры ISC частиц обычно составляют 40 нм в диаметре, что позволяет им проходить через фильтры, которые используют для дальнейшей стерилизации препаратов в лекарственной форме. Кроме того, естественную тенденцию для тритерпеноидных сапонинов, как обнаружено в Quil A, ассоциироваться с холестерином и фосфолипидами, рассматривают как преимущество при разработке способов получения ISC. Образцы Quil A, которые не образуют ISC частиц, удаляют диализом из конечного продукта. Регулируя отношения компонентов, однородный продукт получают из гетерогенного спектра Quil А сапонинов. Указанное отношение является важным, так как отклонения приводят к структурам, которые не характеризуются размером частиц 40 нм (спирали, листы и т.д.). Свободно пересыпающийся характер ISC коллоида и возможность его измерения с использованием трансмиссионной электронной микроскопии, ВЭЖХ и других методов, делает указанный адъювант пригодным для разработки оценок выходов и других характеристик качества.
[0041] Таким образом, на основании вышеизложенного, в некоторых вариантах осуществления лекарственная форма иммуностимулирующих комплексов с оптимальным количеством гликопротеина G включает молекулы сапонина, фосфолипида и стероида. В некоторых вариантах осуществления молярное отношение молекул сапонина, фосфолипида и стероида составляет 5:1:1. Иммуностимулирующие комплексы могут содержать, например, 5-10% масс. сапонина, 1-5% молекул стероида и фосфолипида и остальное составляет гликопротеин G. Гликопротеин G можно включать в иммуностимулирующие комплексы или непосредственно, или химическим сочетанием с белком носителя (например, в виде гибридного или слитого белка) после включения белка в иммуностимулирующие комплексы. В ссылках на иммуностимулирующие комплексы следует понимать, что они включают ссылки на их производные, химические эквиваленты и аналоги. В некоторых вариантах осуществления ISC смешивают отдельно от гликопротеинов G HeV и/или NiV и затем примешивают гликопротеины G, с полученным ISC. В некоторых вариантах осуществления гликопротеины G смешивают непосредственно с молекулами сапонина, фосфолипида и стероида.
[0042] В некоторых вариантах осуществления указанный сапонин для использования в настоящем изобретении представляет собой Quil A и/или его производные. Quil A представляет собой препарат сапонина, выделенный из Южноамериканского дерева Quillaja saponaria Molina, и был впервые описан как обладающий адъювантной активностью Dalsgaard (1974) Saponine adjuvants, Archiv. Fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, pp. 243-254. Очищенные фрагменты Quil A были выделены с помощью ВЭЖХ, причем этот метод сохраняет адъювантную активность, но без токсичности, связанной с Quil A (EP 0362278), например, QS7 и QS21 (также известные как QA7 и QA21). QS21 представляет собой природный сапонин, полученный из коры Quillaja saponaria Molina, который индуцирует CD8+ цитотоксичные T клетки (CTL), Th1 клетки и преимущественно реакцию lgG2a антител, и представляет собой сапонин для использования в контексте настоящего изобретения. Другие сапонины, подходящие для использования в ISC, включают, но, не ограничиваясь ими, QH-A, QH-B и QH-C субфракции Quil A, получаемые из видов, отличающихся от Quillaia saponaria, такие, которые получены из рода Panax (женьшень), Astragalus, Achyranthes, соевых бобов, Acacia и Codonopsis. В некоторых вариантах осуществления указанный сапонин выделяют из видов, отличающихся от Quillaia saponaria.
[0043] Неограничивающие примеры фосфолипидов для использования в иммуногенных и вакцинных композициях настоящего изобретения включают молекулы с диацилглицеридными структурами и фосфоспинголипидами. Неограничивающие примеры фосфолипидов с диацилглицеридными структурами включают фосфатидиновую кислоту (фосфатидат) (PA), фосфатидилэтаноламин (цефалин) (PE), фосфатидилхолин (лецитин) (PC), дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC) или фосфатидилсерин (PS). Другой неограничивающий пример фосфолипидов с диацилглицеридными структурами включает фосфоинозитиды. Примеры фосфоинозитидов включают, но, не ограничиваясь ими, фосфатидилинозит (PI), фосфатидилинозитфосфат (PIP), фосфатидилинозитбисфосфат (PIP2) или фосфатидилинозиттрифосфат (PIP3). Неограничивающие примеры фосфоспинголипидов включают, фосфорилхолинцерамид (сфингомиелин) (SPH), фосфорилэтаноламинцерамид (сфингомиелин) (Cer-PE) или фосфорилглицеринцерамид.
[0044] Стероидные молекулы для использования в иммуногенных и вакцинных композициях настоящего изобретения, включают молекулы, которые содержат стероид как часть своей структуры. Неограничивающие примеры стероидных молекул включают холестерин, прегненолон, 17-альфа-гидроксипрегненолон, дегидроэпиандростерон, адростендиол, прогестерон, 17-альфа-гидроксипрогестерон, андростендион, тестостерон, дигидрокситесторон, деоксикортикостерон, 11-деоксикортикостерон, кортизол, кортикостерон, альдостерон, эстрон, эстрадиол или эстриол.
[0045] В некоторых вариантах осуществления иммуностимулирующие комплексы представляет собой как правило, но, не ограничиваясь ими, мелкие кейдж-структуры диаметром 30-40 нм. В некоторых вариантах осуществления образования иммуностимулирующих комплексов они имеют молярное отношение Quil A:холестерин:фосфатидилхолин и гликопротеин G, соответствующее 5:1:1. Иммуностимулирующие комплексы могут содержать, например, 5-10% масс. Quil A, 1-5% холестерина и фосфолипидов, и остальное составляет гликопротеин G. Гликопротеин G может быть включен в иммуностимулирующие комплексы или непосредственно, или путем сочетания с белком носителя (например, гибридным или слитым белком) после включения белка в иммуностимулирующие комплексы. При ссылке на иммуностимулирующие комплексы следует понимать, что они включают также ссылки на производные, химические эквиваленты и аналоги. Например, ссылка на производное иммуностимулирующего комплекса включает ссылку на иммуностимулирующий комплекс, в котором один или более из Quil A, холестерина, фосфатидилхолина или белка, например, исключен, замещен, или какой-либо компонент кроме Quil A, холестерина, фосфатидилхолина или белка добавлен к комплексу. Функциональный эквивалент иммуностимулирующего комплекса может быть иммуностимулирующим комплексом, в котором один или более из его четырех компонентов заменен функциональным эквивалентом. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения G гликопротеиновый компонент иммуностимулирующего комплекса исключен. Такой тип иммуностимулирующего комплекса в описании называют не содержащим белка (безбелковым) иммуностимулирующим комплексом.
[0046] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает, но без ограничений, иммуногенную композицию, содержащую выделенный белок G HeV или NiV, способный вызвать продуцирование перекрестно-реакционной нейтрализующей антисыворотки против многочисленных штаммов HeV и/или NiV in vitro, и адъювант, включающий Quil A, DPPC и холестерин, например, где композиция содержит: 5, 50 или 100 мкг растворимого G белка HeV или NiV, и соответствующие количества Quil A, DPPC, и холестерина. Дополнительные примеры вариантов осуществления иммуностимулирующих комплексов и способов их получения раскрыты в EP 0242380B1 и EP 0180564B1, а также в WO 2000041720 (см., например, стр. 3 и 9, ссылки на: Cox & Coulter (1992) Advances in Adjuvant Technology and Application in Animal Parasite Control Utilizing Biotechnology, Chapter 4, Yong (ed.), CRC Press; Dalsgard (1974) Gesamte Вирус forsch, 44, 243-254; Australian Patent Specification Nos. 558258, 589915, 590904 & 632067. См. также репрезентативные протоколы, раскрытые в патенте США 6506386, и приводимые там ссылки на хорошо известный факт, что иммуностимулирующие комплексы можно использовать, если белковый антиген включен в иммуностимулирующий комплекс при его создании (см. EP 0109942B1), или, альтернативно, предоставлены предварительно полученные иммуностимулирующие комплексы, которые затем смешивают с отдельно добавляемой аликвотой антигена для создания вакцины (см. EP 0436620B1). Как обычно следует понимать, белковый антиген может быть также ковалентно присоединен к иммуностимулирующему комплексу (см. снова EP 0180564B1). Как также должно быть хорошо понятно специалистам в данной области, иммуностимулирующие комплексы можно вводить путем вакцинации через слизистую оболочку (см. Mowat (1991) Immunology 72, 317-322) и иммуностимулирующие комплексы настоящего изобретения можно далее усовершенствовать для вакцинации через слизистую оболочку путем включения в них нацеленные на мембрану белки (WO 9730728).
[0047] В некоторых вариантах осуществления настоящее изобретение включает, но без ограничений, иммуногенную композицию, содержащую выделенный белок G HeV или NiV, способный индуцировать продуцирование перекрестно-реактивной нейтрализующей антисыворотки против многочисленных штаммов HeV и/или NiV in vitro, и адъювант, включающий Quil A, DPPC и холестерин, например, где композиция содержит: 5, 50 или 100 мкг растворимого G белка HeV или NiV, и соответствующие количества Quil A, DPPC и холестерина. Дополнительные примеры вариантов осуществления иммуностимулирующих комплексов раскрыты в WO 200004720.
[0048] В следующем варианте осуществления настоящего изобретения указанные вакцинные и иммуногенные композиции могут составлять часть фармацевтической композиции. Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут содержать подходящие фармацевтически приемлемые носители, включающие эксципиенты и вспомогательные вещества, которые облегчают переработку активных соединений в лекарственные препараты, которые можно использовать фармацевтически для доставки их в место действия.
C. Эксципиенты
[0049] Иммуногенные и вакцинные композиции настоящего изобретения могут дополнительно включать фармацевтически приемлемые носители, эксципиенты и/или стабилизаторы (см., например, Remington: The Science and practice of Pharmacy (2005) Lippincott Williams), в форме лиофилизированных лекарственных препаратов или водных растворов. Подходящие носители, эксципиенты или стабилизаторы являются нетоксичными для реципиентов в указанных дозах и концентрациях, и могут включать буферы, такие как фосфат, цитрат и другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консерванты (такие как натриевая соль ртуть(o-карбоксифенил)тио)этила (тиомерсал), октадецилдиметилбензиламмонийхлорид; гексаметонийхлорид; бензалконийхлорид, бензэтонийхлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метилпарабен или пропилпарабен; катехол; резорцин; циклогексанол; 3-пентанол и м-крезол); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидин; аминокислоты, такие как глицин, глутамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстраны; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахара, такие как сахароза, манит, трегалоза или сорбит; образующие соли противоионы, такие как натрий; комплексы металлов (например, комплексы Zn-белок); и/или неионные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (PEG), твин или плуроникс.
[0050] Композиции настоящего изобретения могут быть в дозированной форме, суспендированной в любом подходящем фармацевтическом средстве доставки или носителе, в достаточном объеме, для осуществления дозирования. Как правило, конечный объем, включая носители, адъюванты и т.п., составляет по меньшей мере 1,0 мл. Верхний предел определяется практически количеством, которое необходимо ввести, обычно не более чем от около 0,5 мл до около 2,0 мл.
Способы применения
[0051] Настоящее изобретение включает способы предотвращения и/или лечения вирусной инфекции Hendra и/или Nipah, включающие введение иммуногенных и вакцинных композиций настоящего изобретения любому млекопитающему. Активный иммунитет, вырабатываемый путем вакцинации гликопротеином G HeV и/или NiV с адъювантами, раскрытыми в данном описании, может инициировать или повышать клеточный или гуморальный иммунный ответ. Эффективное количество гликопротеинов G HeV и/или NiV или их антигенных фрагментов могут быть получены в смеси с адъювантом для получения вакцины.
[0052] Настоящее изобретение включает способы предотвращения и/или лечения людей, инфицированных вирусом Hendra и/или Nipah, включающие введение иммуногенных и/или вакцинных композиций, содержащих растворимый гликопротеин G HeV и/или NiV или их комбинации, отдельно или в комбинации с по меньшей мере одним адъювантом, пригодным для использования в медицине. Адъюванты, пригодные для использования в медицине, можно использовать отдельно или в комбинации. Примеры адъювантов, пригодных для использования в медицине, включают, но, не ограничиваясь ими, соли алюминия. Примеры солей алюминия включают, но, не ограничиваясь ими, гидроксид алюминия, гель гидроксида алюминия (Alhydrogel™), фосфат алюминия, алюм (калийалюминийсульфат) или смеси солей алюминия. Дополнительные примеры адъювантов, пригодных для использования в медицине, включают, но, не ограничиваясь ими, эмульсии типа вода-в-масле, эмульсии типа масло-в-воде и AS04 (комбинацию гидроксида алюминия и монофосфориллипида A) и CpG олигодезоксинуклеотиды. CpG олигодезоксинуклеотиды представляют собой синтетические олигонуклеотиды, которые содержат неметилированные CpG динуклеотиды в определенной последовательности контекстов (CpG фрагменты). Указанные фрагменты CpG присутствуют в 20-кратном избытке в бактериальных ДНК по сравнению с ДНК млекопитающих. CpG олигодезоксинуклеотиды распознаются Toll-подобным рецептором 9 (TLR9), что приводит к сильным иммуностимулирующим эффектам.
[0053] Введение вакцины или иммуногенной композиции, содержащей гликопротеин G HeV и/или NiV с одним или более раскрытых в описании адъювантов, может осуществляться или с профилактической, или с терапевтической целью. В одном аспекте настоящего изобретения указанную композицию можно использовать с целью профилактики. Если вакцинную композицию вводят профилактически, ее вводят до обнаружения каких-либо признаков или симптомов инфицирования HeV и/или NiV. Профилактическое введение эффективного количества соединения(ий) служит целям предотвращения или ослабления какого-либо последующего инфицирования HeV и/или NiV.
[0054] Если вакцину вводят с терапевтической целью, тогда указанную вакцину вводят в эффективном количестве после определения симптомов реального инфицирования. Считают, что композиция "фармакологически приемлема", если ее введение переносится реципиентом. Такую композицию следует вводить в "терапевтически или профилактически эффективном количестве", если вводимое количество является физиологически значимым. Вакцинная или иммуногенная композиции настоящего изобретения являются физиологически значимыми, если их присутствие приводит к заметным изменениям в физиологии реципиента, например, повышая высокореакционные гуморальные или клеточные реакции в отношении одного или более из штаммов HeV и/или NiV. Предоставляемая защита не должна быть абсолютной (т.е. HeV или NiV инфицирование не должно быть полностью предотвращено или устранено), при условии, что существует статистически значимое улучшение по сравнению с контрольной популяцией. Защита может быть ограничена ослаблением тяжести заболевания или уменьшением скорости возникновения симптомов заболевания.
[0055] Вакцинная или иммуногенная композиция настоящего изобретения может сообщать устойчивость к многочисленным штаммам HeV и/или NiV. Как использовано в настоящем описании, вакцина предназначена для предотвращения или ослабления инфицирования, если ее введение субъекту приводит или к полному, или частичному ослаблению (т.е. подавлению) симптома или состояния инфекции, или к выработке полного или частичного иммунитета индивидуума к инфицированию.
[0056] По меньшей мере одну вакцинную или иммуногенную композицию настоящего изобретения можно вводить любыми способами, которые достигают поставленной цели, используя фармацевтическую композицию, как раскрыто в данном описании. Например, вводить такую композицию можно различными парентеральными способами, такими как подкожное, внутривенное, чрезкожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, интраназальное, трансдермальное, буккальное введение. В одном варианте осуществления настоящего изобретения указанную композицию вводят подкожно. Парентеральное введение может быть болюсной инъекцией или может осуществляться введение в виде постоянной перфузии в течение некоторого промежутка времени.
[0057] Обычная схема предотвращения, подавления или лечения заболевания или состояния, которые можно ослабить за счет клеточной иммунной реакции, вызванной активной специфической клеточной иммунотерапией, включает введение эффективного количества вакцинной композиции, как указано выше, осуществляемое как отдельное введение или как повторное введение в виде усиливающих или бустерных доз, в течение промежутка времени вплоть до и включая от одной недели до около двадцати четырех месяцев. Неограничивающие примеры включают первую дозу с последующей второй дозой через около по меньшей мере 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23 или 24 дня после первой дозы (день 0). Количество иммуногенной или вакцинной композиции в дозе может быть меньше чем, равно или больше чем в первой дозе, введенной в день 0.
[0058] Согласно настоящему изобретению, "эффективное количество" вакцинной или иммуногенной композиции является таким, которое достаточно для достижения необходимого биологического эффекта, причем в этом случае возникает по меньшей мере одна из клеточных или гуморальных реакций на один или более штаммов HeV и/или NiV. Следует понимать, что величина эффективной дозы будет зависеть от возраста, пола, состояния здоровья и массы субъекта, типа сопутствующего лечения, если оно проводится, частоты введения дозы и характера ожидаемого эффекта. Интервалы эффективных доз, которые приводятся ниже, никоим образом не ограничивают настоящее изобретение, и представляют собой примеры интервалов доз, которые могут оказаться подходящими для введения композиций настоящего изобретения. Однако указанные дозы могут быть подобраны в соответствии с конкретным субъектом, как легко может быть понятно специалистам в данной области, без какого-либо экспериментирования.
[0059] Реципиентами вакцинных и иммуногенных композиций настоящего изобретения могут быть любые субъекты, которые могут приобрести специфический иммунитет за счет клеточной или гуморальной иммунной реакции на HeV и/или NiV, где клеточная реакция опосредована белком MHC класса i или класса ii. Среди млекопитающих реципиентами могут быть млекопитающие ранга приматов, включая людей, шимпанзе, приматов и обезьян). В одном варианте осуществления настоящего изобретения предложен способ лечения людей вакцинными или иммуногенными композициями настоящего изобретения. Субъекты могут быть инфицированы HeV и/или NiV, или могут представлять модель HeV или NiV инфицирования в экспериментальных исследованиях. В некоторых вариантах осуществления субъектом является домашнее млекопитающее, включая, но, не ограничиваясь ими, лошадь, корову, быка, буйвола, овцу, свинью (Mingyi (2010) Vet. Res. 41, 33), козу, собаку (Biosecurity Alert-Hendra Virus Update, 27 July 2011, Press Release, Biosecurity Queensland) или кошку. В некоторых вариантах осуществления субъектом является домашняя птица, включая курицу.
[0060] Вакцины настоящего изобретения также обеспечивают перекрестный иммунитет против инфицирования вирусом Nipah, в дозах, которые используют для защиты против инфицирования вирусом Hendra, а также обеспечивают эффективную вакцинацию против вируса Nipah.
[0061] Ссылка на эффективную иммунную реакцию следует понимать как ссылку на иммунный ответ, который непосредственно или косвенно приводит к благоприятному профилактическому или терапевтическому эффекту. В том случае, если иммуноген включает гликопротеин G HeV или NiV, как раскрыто в данном описании, такая реакция включает снижение или прекращение вирусного репродуцирования и/или вирусного шеддинга, и/или ослабления симптомов заболевания у животного. Следует понимать, что эффективность является функциональной мерой и не определяется только ссылкой на титры анти-HeV и/или анти-NiV антител, так как только присутствие циркулирующих антител не является необходимым показателем эффективности указанных циркулирующих антител в отношении прекращения вирусного репродуцирования и шеддинга.
[0062] Также в качестве примера, но без ограничения, если растворимый G белковый полипептид настоящего изобретения вводят для усиления иммунной ответа у субъекта, инфицированного или подозреваемого в инфицировании Hendra или Nipah, и/или если антитела настоящего изобретения вводят в виде пассивной иммунотерапии, указанные композиции могут дополнительно включать, например, другие терапевтические средства (например, противовирусные средства).
[0063] Пример 4 ниже предлагает информацию о некоторых предпочтительных композициях для применения при вакцинации лошадей. Что касается других животных, которые могут быть инфицированы вирусом Hendra, и которым поэтому требуется вакцинация для защиты как животных, так и людей от инфицирования обоими вирусами Hendra и Nipah, обычно применима следующая информация, которая может быть легко адоптирована специалистами в данной области. Вообще говоря, животным-компаньонам (собакам и кошкам) требуется приблизительно 25 микрограмм антигена Hendra, и может быть благоприятным использование ISC адъюванта в интервале 25-150 микрограмм, при соотношении 5:1:1 сапонина, фосфолипида и стерина, входящих в предпочтительные ISC композиции, причем можно использовать любой из типов компонентов, как раскрыто в данном описании. Для животных-компаньонов предпочтительно, чтобы конечная доза составляла около 1 мл. Polygen™ (MVP Technologies), адъювант на базе сополимера, также можно использовать, предпочтительно в количестве около 5-15% (об/об).
[0064] Вообще говоря, для крупных фермерских животных (овец, коров, свиней и т.д.) применимы дозовые количества антигена и адъюванта (и конечный объем доз), которые отличаются от приведенных в описании для лошадей, то есть, можно использовать около 50-100 микрограмм антигена, и обычно около 250 микрограмм ISC, при конечном объеме, например, 1-3 мл. Что касается свиней, то альтернативная и эффективная композиция адъюванта содержит (приблизительно для такого же количества антигена) смесь ISC и ионного полисахарида, конкретно 100 мг DEAE декстрана и 800 микрограмм ISC в 1-3 мл конечного объема дозы (снова 5:1:1 Quil A:фосфатидилхолин:холестерин (см. WO 2000/41720)).
Дифференциация вакцинированных животных
[0065] Настоящее изобретение также включает способы дифференциации здоровых вакцинированных животных от животных, которые были подвергнуты воздействию или инфицированы HeV и/или NiV. За время инфицирования HeV и NiV экспрессируют дополнительные белки, отличные от гликопротеина G (G), включая слитый белок (F), матриксный белок (M), фосфопротеин (P), крупный белок (L) и нуклеокапсидный белок (N). Указанные дополнительные белки обладают способностью индуцировать у животных иммунные ответы в форме антител, которые связываются с указанными белками, или Т клеточный иммунитет. Уровень реакции антител на указанные другие белки обычно можно измерить, используя анализы, такие как иммуноферментный анализ (EIA). Иммуногенные и вакцинные композиции настоящего изобретения в некоторых вариантах осуществления содержат только гликопротеин G в качестве HeV и/или NiV антигена и поэтому индуцируют иммунные реакции антител только с гликопротеинами G HeV и/или NiV. Животные, вакцинированные раскрытыми в данном описании иммуногенными композициями, которых затем инфицируют HeV или NiV, вырабатывают бустерную иммунную реакцию на гликопротеин G, но также демонстрируют презентацию антител на некоторые другие HeV и NiV белки, отличные от гликопротеина G. Таким образом, присутствие антител к любому из слитого белка (F), матриксного белка (M), фосфопротеина (P), крупного белка (L) и нуклеокапсидного белка (N) можно измерить, используя EIA, для определения присутствия или отсутствия антител, специфических к указанным белкам в образцах сыворотки. Если детектируется антитело к любому их указанных других белков (т.е. отличающихся от гликопротеина G), это означает, что животное было подвергнуто воздействию HeV и/или NiV. Альтернативно, если не детектируется антитело к указанным другим белкам, а детектируются только антитела, связывающие белок G, это означает, что животное было только вакцинировано.
[0066] EIA настоящего изобретения одновременно и высокоспецифичны и высокоселективны при детектировании и дифференцировании между животными, инфицированными HeV и/или NiV и здоровыми животными, которые были вакцинированы раскрытыми в данном описании иммуногенными композициями. В настоящем изобретении можно использовать различные способы анализов, включая ELISA, как в гомогенном, так и в гетерогенном окружении. Указанные способы анализов можно проводить на образцах, таких как кровь, сыворотка, молоко или любые другие жидкости организма, содержащие антитела.
[0067] В некоторых вариантах осуществления антитела, используемые для EIA, могут уникально конкурировать с антителами, вырабатываемыми за счет вакцинации гликопротеином G, но не с антителами, вырабатываемыми у животных в результате инфицирования HeV и/или NiV. Это позволяет не только проводить серологическую диагностику HeV и NiV инфицирования, но и дифференциация вакцинированных от инфицированных животных в одном анализе. Процедуру EIA можно проводить на стандартных образцах сыворотки крови или на любых жидкостях организма или секретах организма, содержащих антитела. В процедурах EIA можно использовать моноклональные и/или поликлональные антитела к гликопротеинам G и любым другим HeV и/или NiV вирусным белкам (например, к слитому белку (F), матриксному белку (M), фосфопротеину (P), крупному белку (L) и нуклеокапсидному белку (N), так как такие белки не присутствуют у вакцинированных здоровых животных, которые не были подвергнуты воздействию HeV и/или NiV). Указанные EIA можно осуществлять на любом из коммерчески доступных стационарных или портативных-ручных, полуавтоматических или роботехнических автоматизированных ELISA установках с программным обеспечением и компьютерной обработкой результатов. В некоторых вариантах осуществления указанные способы дифференциации здоровых вакцинированных животных от животных, подвергнутых воздействию или инфицированных HeV и/или NiV, можно проводить на биологических образцах, выделенных из домашних млекопитающих, включая, но, не ограничиваясь ими, лошадей, коров, овец, свиней, коз, собак или кошек. В некоторых вариантах осуществления субъектом является домашняя птица, включая куриц. В некоторых вариантах осуществления субъектом является человек.
Примеры
[0068] Следующие примеры иллюстрируют только некоторые, но отнюдь не все варианты осуществления настоящего изобретения, и поэтому их не следует рассматривать как ограничивающие объем настоящего изобретения.
Пример 1: Конструкции векторов
[0069] Векторы конструируют для экспрессии HeV G или NiV G с удаленным трансмембранным/цитоплазмическим концом. Клонированную кДНК полной длины белка G HeV или NiV амплифицируют, используя ПЦР (полимеразную цепную реакцию) для создания фрагментов из около 2600 нуклеотидов, кодирующих белок G HeV или NiV с удаленным трансмембранный/цитоплазмический домен/цитоплазмическим концом.
[0070] Для амплификации HeV G синтезируют следующие олигонуклеотидные праймеры
sHGS: 5'-GTCGACCACCATGCAAAATTACACCAGAACGACTGATAAT-3' (SEQ ID NO: 5).
sHGAS: 5-GTTTAAACGTCGACCAATCAACTCTCTGAACATTGGGCAGGTATC-3'. (SEQ ID NO: 6).
[0071] Для амплификации NiV G были синтезированы следующие олигонуклеотидные праймеры.
sNGS: 5'-CTCGAGCACCATGCAAAATTACACAAGATCAACAGACAA-3' (SEQ ID NO: 7).
sNGAS: 5-CTCGAGTAGCAGCCGGATCAAGCTTATGTACATTGCTCTGGTATC-3'. (SEQ ID NO: 8).
Все ПЦР реакции проводят, используя Accupol ДНК полимеразу (PGS Scientifics Corp) в следующем режиме: сначала 94°C в течение 5 минут и затем 94°C в течение 1 минуты, 56°C в течение 2 минут, 72°C в течение 4 минут; 25 циклов. Указанные праймеры создают продукт ПЦР для sHeV G ORF окруженной Sal 1 сайтами и sNiV G ORF окруженной Xho 1 сайтами. ПЦР продукты очищают на геле (Qiagen). После очистки на геле sHeV G и sNiV G субклонируют в TOPO вектор (Invitrogen).
[0072] PSectag2B (Invitrogen) закупают и модифицируют таким образом, чтобы они содержали S-пептидный маркер или myc-эпитопный маркер. Синтезируют перекрывающиеся олигонуклеотиды, которые кодируют последовательность для S-пептида, и переваривают Kpn 1 и EcoR1 выступающие ("липкие") концы.
SPEPS: 5'-CAAGGAGACCGCTGCTGCTAAGTTCGAACGCCAGCACATGGATTCT-3' (SEQ ID NO: 9).
SPEPAS: 5'-AATTAGAATCCATGTGCTGGCGTTCGAACTTAGCAGCAGCGGTCTCCTTGGTAC-3' (SEQ ID NO: 10).
[0073] Синтезируют перекрывающиеся олигонуклеотиды, которые кодируют последовательность для myc-эпитопного маркера и переваривают Kpn 1 и EcoR1 выступающие ("липкие") концы.
MTS: 5'-CGAACAAAAGCTCATCTCAGAAGAGGATCTG-3' (SEQ ID NO: 11).
MTAS: 5 -AATTCAGATCCTCTTCTGAGATGAGCTTTTGTTCGGTAC-3' (SEQ ID NO: 12).
[0074] 64 пмоль SPEPS и 64 пмоль SPEPAS смешивают и нагревают до 65°C в течение 5 минут и медленно охлаждают до 50°C. 64 пмоль MTS и 64 пмоль MTAS смешивают и нагревают до 65°C в течение 5 минут и медленно охлаждают до 50°C. Две полученные смеси разбавляют и клонируют в Kpn1-EcoR1 переваренный pSecTag2B с получением модифицированного S-пептидом pSecTag2B или модифицированного myc-эпитопом pSecTag2B. Все конструкции сначала скринируют, используя фрагменты рестрикции, и затем подтверждают секвенированием.
[0075] TOPO sG конструкцию переваривают, используя Sal 1, очищают на геле (Qiagen) и субклонируют в рамке в сайт Xho 1 модифицированного S-пептидом pSecTag2B или модифицированного myc-эпитопом pSecTag2B. Все конструкции сначала скринируют, используя фрагменты рестрикции, и затем подтверждают секвенированием.
[0076] Создают Igk лидер-S-пептид-s HeVG (sGS-tag) и Igk лидер-myc tag-sHeVG (sGmyc-tag) конструкции, которые затем субклонируют в вакцинный шаттл вектор pMCO2. Синтезируют олигонуклеотид SEQS: 5'-TCGACCCACCATGGAGACAGACACACTCCTGCTA-3' (SEQ ID NO: 13) и используют в комбинации с олигонуклеотидом sHGAS для амплификации с помощью ПЦР sGs-tag и sGmyc-tag. Все ПЦР реакции осуществляют, используя Accupol ДНК полимеразу (PGS Scientifics Corp.) в следующем режиме: 94°C в течение 5 минут сначала и затем 94°C в течение 1 минуты, 56°C в течение 2 минут, 72°C в течение 4 минут; 25 циклов. Указанные праймеры создают ПЦР продукты, фланкированные Sal 1 сайтами. ПЦР продукты очищают на геле (Qiagen). После очистки на геле sGs-tag и sGmyc-tag субклонируют в TOPO вектор (Invitrogen). sG S-маркер и sG myc-маркер переваривают с помощью Sal 1 и субклонируют в Sal 1 сайт pMCO2. Все конструкции вначале скринируют, используя фрагменты рестрикции, и затем подтверждают секвенированием. Затем создают оптимизированную кодоном нуклеотидную последовательность для облегчения продуцирования в эукариотной клеточной линии, которая представлена в SEQ ID NO: 16.
Пример 2: Получение растворимого белка G с использованием вакцин
[0077] Для получения белка генетические конструкции, содержащие оптимизированные кодоном последовательности, используют для создания рекомбинантных поксвирусных векторов (вакцинный вирус, штамм WR). Затем получают рекомбинантный поксвирус, используя стандартные методики, использующие tk-селекцию и окрашивание GUS. Коротко, CV-1 клетки трансфицируют, или используя pMC02 sHeV G слияние или pMC02 sNiV G слияние, используя кальций-фосфатный трансфекционный набор (Promega). Полученные монослои затем инфицируют вакцинным вирусом штаммом дикого типа Western Reserve (WR) при множественности заражения (MOI) 0,05 БОЕ/клетка. Спустя 2 дня клеточный осадок собирают как сырые рекомбинантные вирусные массы. TK клетки инфицируют, используя сырые рекомбинантные вирусные массы в присутствии 25 мкг/мл 5-бром-2'-дезоксиуридина (BrdU) (Calbiochem). Через 2 часа вирус заменяют, нанося верхний слой EMEM-10, содержащий 1% агарозы (Life Technologies) с низкой температурой плавления (LMP) и 25 мкг/мл BrdU. После 2 дней инкубирования добавляют дополнительно верхний слой EMEM-10, содержащий 1% LMP агарозы, 25 мкг/мл BrdU и 0,2 мг/мл 5-бром-4-хлор-3-индолил-P-D-глюкуроновой кислоты (X-GLUC) (Clontech). В течение 24-48 часов становятся видны синие бляшки, которые собирают и осуществляют еще два раунда очистки бляшек за счет двойной селекции. Затем полученные рекомбинантные вакцинные вирусы vKB16 (sHeV G слияние) и vKB22 (sNiV G слияние) амплифицируют и очищают стандартными способами. Коротко, рекомбинантные вакцинные вирусы очищают методом очистки бляшек, амплификации клеточных культур, сахарозного пеллетирования в ультрацентрифуге и титрованием в анализе бляшек. Экспрессию sHeV G проверяют в клеточных лизатах и культуральных супернатантах.
Пример 3: Получение растворимого G белка с использованием 293F клеток
[0078] Генетические конструкции, содержащие оптимизированные кодоном последовательности, используют для трансформации 293F клеток (Invitrogen) для получения стабильной клеточной линии, которая экспрессирует растворимый гликопротеин G HeV. CHO-S клетки (Invitrogen) также можно использовать для трансформации и экспрессии растворимого гликопротеина G HeV. Трансформированные клетки высевают в 162 см2 колбы для культуры тканей, содержащие 35 мл DMEM-10. Клеткам дают возможность прикрепиться и расти при 37°C и 5-8% CO2 в течение нескольких дней. Когда клетки достигают конфлюэнтности, их разделяют на несколько колб с DMEM-10 со 150 мкг/мл гигромицина B (по 30 мл в колбе). Когда клетки достигают 70-80% конфлюэнтности, их дважды промывают 30 мл PBS, затем добавляют 20 мл 293 SFM II (Invitrogen) и клетки инкубируют при 37°C и 5-8% CO2 в течение ночи. На следующий день клетки переносят в колбы Эрленмейера, содержащие 200 мл SFM II среды. Клеткам дают расти при 37°C и 5-8% CO2 при 125 об/мин в течение 5-6 дней до тех пор, пока они не начинают погибать. В это время собирают полученный супернатант.
[0079] Среду из каждой колбы Эрленмейера центрифугируют со скоростью 3500 об/мин в течение 30 минут. Полученный супернатант затем переносят в 250 мл центрифужные колбы и вращают со скоростью 10000 об/мин в течение одного часа. Полученный супернатант собирают, и добавляют ингибитор протеазы в соответствии с рекомендациями изготовителей вместе с Triton X-100 до конечной концентрации 0,1%. Полученный супернатант затем фильтруют через 0,2 мкм мембранный фильтр с низким связыванием белка.
[0080] HeVsG очищают, используя S-белковую агарозную аффинную колонку. 20 мл объема слоя S-протеинагарозы (Novagen) загружают в колонку XK 26 (GE Healthcare). Колонку промывают 10× объемами слоя связывающего/промывочного буфера (0,15M NaCl, 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5 и 0,1% Triton X-100). Полученный супернатант HeV sG вводят в колонку, поддерживая скорость потока 3 мл/мин. Колонку промывают 10× объемами слоя (200 мл) связывающего/промывочного буфера I, затем 6× объемами слоя (120 мл) промывочного буфера, 1× промывочного буфера (0,15M NaCl, и 20 мМ Tris-HCl, pH 7,5).
[0081] Затем насос выключают, и промывочный буфер сливают до тех пор, пока он не достигает поверхности шариков, и тогда добавляют 30 мл элюирующего буфера (0,2M лимонная кислота, pH 2). Собирают первые 10 мл проходящего потока (это все еще должен быть промывочный буфер) и затем элюирующий буфер инкубируют с шариками в течение 10 минут. Затем 15 мл элюата собирают в 50 мл стерильную коническую центрифужную ампулу, содержащую 25 мл нейтрализующего буфера (1M Tris, pH 8). pH доводят до нейтрального значения, и элюирование и инкубирование повторяют трижды. Весь нейтрализующий элюат объединяют и концентрируют до около 4 мл. Собранные HeV sG (4 мл) очищают, используя 0,2 мкм мембранный фильтр с низким связыванием белка (Acrodisc 13 мМ шприцевой фильтр с 0,2 мкм HT Tuffryn мембраной).
[0082] Гельфильтрацию можно использовать для дальнейшей очистки HeV sG. После качественного контрольного анализа и подтверждения чистоты олигомерного статуса, аликвоты HeV sG собранных фракций тетрамер+димер, димера и мономера хранят при -80°C.
Пример 4: Получение вакцинного препарата
[0083] Схема получения препарата ISC представлена далее на фиг. 3 и описана ниже.
[0084] Стадия 1: Раствор 90 г/л деканоил-н-метилглюкамида (Mega-10 детергент) получают в воде для инъекций (WFI). Полученный раствор нагревают для обеспечения полного растворения Mega-10, затем его используют или немедленно на стадии 2, или стерилизуют на фильтре.
[0085] Стадия 2: Получают раствор, содержащий 25 г/л холестерина и 25 г/л дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC), растворяя указанные компоненты в исходном растворе Mega 10 детергента. Полученный раствор нагревают до растворения всех компонентов, затем или используют немедленно на стадии 3, или стерилизуют на фильтре.
[0086] Стадия 3: Получают буферированный изотонический солевой раствор, 10 мМ фосфатный буфер, pH 6,2±1 (BIS) с WFI и используют стерилизующую фильтрацию, если не используют немедленно.
[0087] Стадия 4: Quil A получают в BIS до конечной концентрации 100 г/л и используют стерилизующую фильтрацию, если не используют немедленно.
[0088] Стадия 5: ISC получают в реакторе с регулируемой температурой при перемешивании (22-37°C) путем последовательного добавления предварительно нагретых BIS, холестерин/DPPC в растворе Mega-10 (160 мл/л), и Quil раствора (200 мл/л). Реакционную смесь доводят до нужного объема, добавляя BIS.
[0089] Стадия 6: Всю композицию доводят до состояния равновесия при нужной температуре (целевая 27°C с приемлемым рабочим интервалом 22-37°C), затем инкубируют в течение 15 минут при перемешивании для облегчения образования ISC. Раствор ISC или обрабатывают дополнительно на стадии 7, или используют стерилизующую фильтрацию для промежуточного хранения.
[0090] Стадия 7: ISC реакционную смесь промывают, используя диализ (мембрана: Hydrosart 30 кДа (Sartorius AG Goettingen)) минимум в 20 объемах обменов против BIS при контроле температуры (целевая 27°C с приемлемым рабочим интервалом 22-37°C) для удаления не вошедших в образовавшиеся комплексы компонентов.
[0091] Стадия 8: Диализованные ISC концентрируют приблизительно в два раза путем ультрафильтрации, используя ту же мембрану, которую использовали для диализа. В фильтрационную систему добавляют BIS для восстановления исходного объема ISC.
[0092] Стадия 9: ISC переносят в стерильные контейнеры для хранения, используя стерилизующую фильтрацию через 0,22 мкм целлюлозоацетатный фильтр.
[0093] Стадия 10: ISC адъювант хранят при 2-8°C до реализации для применения в вакцинных композициях.
[0094] Иммуностимулирующую композицию (250 мкг/мл) затем комбинируют с соответствующими количествами растворимого гликопротеина G HeV (например, 5, 50, 100 мкг/мл) и доводят до объема, используя BIS.
Пример 5: Первый клинический эксперимент на лошадях
[0095] Тестируемая вакцина 1: Растворимый рекомбинантный гликопротеин вируса Hendra (sG) в количестве 100 мкг/доза, дополненный адъювантом 250 мкг иммуностимулирующего комплекса; объем доводят до 1 мл/доза при использовании солевого раствора.
[0096] Тестируемая вакцина 2: Растворимый рекомбинантный гликопротеин вируса Hendra (sG) в количестве 50 мкг/доза, дополненный адъювантом 250 мкг иммуностимулирующего комплекса; объем доводят до 1 мл/доза при использовании солевого раствора.
[0097] Тестируемая вакцина 3: Растворимый рекомбинантный гликопротеин вируса Hendra (sG) в количестве 5 мкг/доза, дополненный адъювантом 250 мкг иммуностимулирующего комплекса; объем доводят до 1 мл/доза при использовании солевого раствора.
[0098] Серологические данные и результаты защиты от заражения лошадей собирают для двух групп лошадей, которым вводят вакцины, содержащие более высокие уровни антигена (50 мкг/доза и 100 мкг/доза).
[0099] Серология: Каждую из двух лошадей иммунизируют двумя дозами вакцины (100 мкг sG с ISC) с промежутком в 21 день. Серологические исследования образцов, полученных после примирования и до заражения, подтверждают индуцированную вакциной серологическую конверсию в HeV (таблица 1). До заражения уровни нейтрализующих вирус антител были сравнимы с уровнями, которые, как было обнаружено, являются защитными для кошек, подвергнутых воздействию в противном случае летальной дозы близко родственного вируса Nipah. У лошади, которой вводили только адъювант (негативный контроль), не вырабатывались антитела к HeV до заражения вирусом.
[00100] Соответственно, каждую лошадь подвергают воздействию живого HeV в BSL4, содержащего вспомогательные вещества, через 27 дней после проведения бустерной иммунизации. Вирус вводят интраназально (1×106 TCID50) и перорально (1×106 TCID50). В момент заражения и в течение последующего периода наблюдения, тождественность контрольной лошади не была известна штату, который участвовал в указанной части работы.
[00101] Клинические наблюдения за V1: Указанная лошадь оставалась клинически здоровой на протяжении периода наблюдения после воздействия HeV, если не принимать во внимание, что локализованное инфицирование сайта введения постоянного шейного катетера отмечалось на 8 день после заражения. Это не было связано ни с какими-либо конституциональными признаками заболевания. На 9 день после вирусного заражения осуществляют произвольную эвтаназию лошади. Ненормальности при исследованиях при вскрытии подтверждают наличие 10 см брыжеечной липомы (случайно обнаружена) и умеренное расширение лимфатических сосудов у вентрального конца левой доли застойного легкого, что приписывают действие барбитурата. Первоначальное скринирование тканей не обнаружило каких-либо свидетельств ни о патологических повреждениях, ни о наличии HeV антигена у лошадей.
[00102] Клинические наблюдения за V2: У этой лошади появился слабый кратковременный насморк на 2 день, на 3 день, но затем лошадь остается в остальном здоровой до того как на 6 день наблюдается повышение температуры, связанное с локализацией воспалительной реакции в месте постоянного шейного катетера. Катетер удаляют, но поражение продолжает увеличиваться, и лошадь становится очень возбудимой, так что на следующий день (7 день) кобыле вводят пенициллин длительного действия. Как температура лошади, так и ее темперамент возвращаются к нормальным значениям на 8 день и ее произвольно подвергают эвтаназии. Нарушения при тщательном исследовании при вскрытии ограничиваются небольшим расширением лимфатических сосудов у вентрального конца правой доли застойного легкого, что приписывают барбитуратам. В результате первичного скринирования тканей не было обнаружено каких-либо доказательств ни поражений, ни присутствия HeV антигена у этой лошади; подробное исследование в настоящее время завершается.
[00103] Клинические наблюдения за V3: У этой лошади развились умеренные кратковременные выделения из носа на 4 день, но затем во всем остальном она оставалась здоровой до тех пор, пока на 6 день не повысилась температура без признаков локализации. Частота сердечных сокращений также повысилась, и наблюдалось легкое покраснение кожи, сопровождающееся небольшим обезвоживанием и угнетенным видом. Такая комбинация признаков является типичной для активного HeV инфицирования в лабораторных условиях исследователей. Температура лошади и частота сердечных сокращений продолжали повышаться в течение следующих 12 часов (фиг. 1 и 2), и она была в несколько угнетенном состоянии, и затем ее гуманно подвергают эвтаназии на 7 день. При исследовании при вскрытии обнаружено умеренное расширение лимфатических сосудов в долях застойного легкого, затрагивающее вентральные 8-10 см, сопровождающееся плевральным уплотнением и отеком.
[00104] При гистологическом исследовании обнаружен легочный васкулит с фибриноидным некрозом стенок сосудов, отек интерлобулярной перегородки и фокальный некротизирующий альвеолит. Наблюдается интенсивное отложение HeV антигена в эндотелии и в кровеносных сосудах легкого; в оболочках головного мозга; в паренхиме головного мозга; в тригеминальном ганглии; в подчелюстных, бронхиальных, паховых и почечных лимфатических узлах; в селезенке; печени; сердце; мягком небе; надпочечниках; почечных клубочках; тонком и толстом кишечнике; яичках; в глотке и носовых раковинах, а также в зародышевых центрах в селезенке и в случайных сердечных миоцитах. Спинной мозг, карманы евстахиевой трубы, мочевой пузырь и обонятельный центр мозга дали отрицательный результат. Результаты гистологических и иммуногистологических исследований соответствуют острому HeV инфицированию.
[00105] Молекулярный анализ клинических образцов. Не наблюдается признаков шеддинга HeV ни в одном из биологических образцов, полученных от иммунизированных лошадей V1 и V2 на протяжении периода клинических наблюдений. Более определенно, из глубоких носовых мазков или из крови ни в один из дней после воздействия не был выделен какой-либо геном.
[00106] Напротив, у неиммунизированной лошади V3 вирусный геном был обнаружен в мазках из носа, начиная с 3 дня после заражения. Снижение значений Ct в последующие дни отбора проб предполагает вирусную репликацию в верхней части дыхательного пути и согласуется с более ранними лабораторными наблюдениями авторов после воздействия на здоровых лошадей HeV Redlands 2008. Обнаружение вирусного генома в крови непосредственно перед наступлением лихорадки и во всех секретах после, совпадающее с ранним распознаванием других клинических симптомов, таких как депрессия, также согласуется с более ранними наблюдениями.
[00107] Образцы при вскрытии. TaqMan ПЦР (HeV N-ген) подтверждают репликацию инфицирующего вируса у V3 (контроль), сопровождающуюся распространением инфицирования в многочисленные ткани (таблица 3). Наивысшие уровни репликации, по-видимому, наблюдаются в тканях легких, селезенки, почек, миокарда и лимфоидных тканях, связанных с верхними и нижними дыхательными путями, как сообщалось ранее. Не наблюдалось репликации вируса в тканях иммунизированных лошадей (V1 и V2).
[00108] Серологические исследования после заражения. У иммунизированных лошадей V1 и V2 отсутствует рост в титрах после HeV заражения (таблица 4). Это свидетельствует об отсутствии значительной репликации инфицирующего вируса у указанных животных. У контрольной лошади V3 в момент эвтаназии на 7 день после заражения не детектируются какие-либо антитела. Предполагают, что прошло недостаточно времени между воздействием вируса и смертью животного для выработки детектируемого количества антител, и это совпадает с более ранними наблюдениями в лаборатории авторов для HeV Redlands инфицирования лошадей.
[00109] Две лошади (V1 и V2), которые были вакцинированы 100 мкг sG+ISC адъювантом в режиме "прайм-буст" были сероконвертированы к HeV перед воздействием HeV. Одна лошадь (V3), которой ввели только ISC, оставалась серонегативной к инфицирующему вирусу.
[00110] После заражения летальной в других случаях дозой HeV, иммунизированные лошади оставались клинически здоровыми на протяжении периода наблюдений, что превышало время наступления всех экспериментально вызванных случаев HeV у лошадей. Лошадей с отсутствием серологических проявлений иммунитета (V3) подвергали эвтаназии после развития клинических симптомов, соответствующих острому HeV. Какого-либо увеличения титра антител не наблюдалось после заражения у иммунизированных лошадей, что соответствовало отсутствию репликации инфицирующего вируса у указанных животных.
[00111] Отсутствуют свидетельства о наличии шеддинга у иммунизированных лошадей, что отражено в результатах ПЦР негативного теста во всех ежедневных клинических образцах. У неиммунизированных контрольных животных вирусный геном детектировался в мазках из носа, начиная с 3 дня после воздействия вируса, в крови непосредственно перед появления насморка, и во всех клинических образцах с момента появления насморка. Такая схема шеддинга совпадает со схемой, наблюдаемой у здоровых лошадей, подвергнутых воздействию HeV в ранних исследованиях по указанной схеме.
[00112] Не обнаружено какой-либо HeV вирусной репликации ни в каких-либо тканях иммунизированных лошадей, полученных при исследовании при вскрытии, после эвтаназии спустя время, которое, как ожидалось, должно было быть периодом острого инфицирования. Напротив, HeV геном и антиген были распространены во всех тканях контрольной лошади таким образом, что соответствует острому HeV инфицированию, а также была идентифицирована васкулопатия, типичная для HeV инфицирования.
Пример 6: Вторые клинические испытания для лошадей
[00113] Каждую из трех лошадей иммунизируют двумя дозами вакцины (50 мкг sG с ISC) с промежутком в 21 день. Серологические исследования после примирования и до заражения подтверждают индуцированную вакциной сероконверсию в HeV (таблица 5). Уровни нейтрализующих антител до заражения вирусом были сравнимы с уровнями, которые, как считают, являются защитными для кошек, подвергнутых воздействию смертельных в других случаях доз близко родственного вируса Nipah, для лошадей, подвергнутых воздействию HeV в раскрытом в данном описании первом клиническом исследовании. У лошади, которой ввели только адъювант, не вырабатывались антитела к HeV до вирусного заражения иммунизированных лошадей (результаты не представлены).
[00114] Соответственно, каждую из иммунизированных лошадей подвергали воздействию живого HeV в BSL4, содержащем вспомогательные вещества, через 27 дней после проведения бустерной иммунизации. Вирус вводят интраназально (1×106 TCID50) и перорально (1×106 TCID50). В этом исследовании используют четыре морские свинки для контроля патогеничности, с ожиданием, что по меньшей мере одна из них погибнет от HeV заболевания. Морских свинок подвергают воздействию 50000 TCID50 HeV внутрибрюшинной инъекцией.
[00115] Клинические наблюдения за V4: Указанная лошадь остается клинически здоровой на протяжении периода наблюдения после воздействия HeV, и температура и частота сердечных сокращений остаются в нормальных пределах. Лошадь подвергают эвтаназии на 8 день после вирусного заражения. При тщательном исследовании при вскрытии каких-либо нарушений вообще не было отмечено. Первичное скринирование тканей не обнаружило каких-либо признаков ни поражений, ни HeV антигена у указанной лошади; подробное исследование в настоящее время завершается.
[00116] Клинические наблюдения за V5: Эта лошадь оставалась клинически здоровой на протяжении периода наблюдений после воздействия HeV, и температура и частота сердечных сокращений оставались в нормальных пределах (фиг. 2). Указанную лошадь подвергают эвтаназии на 7 день после заражения вирусом. Каких-либо нарушений не было обнаружено при подробном исследовании при вскрытии. Первичное скринирование тканей не обнаружило каких-либо признаков ни поражений, ни HeV антигена у этой лошади; подробное исследование в настоящее время завершается.
[00117] Клинические наблюдения для V6: Эта лошадь оставалась клинически здоровой на протяжении периода наблюдений после воздействия HeV, и температура и частота сердечных сокращений оставались в нормальных пределах (фиг. 2). Указанную лошадь подвергают эвтаназии на 9 день после вирусного заражения. Каких-либо нарушений не было обнаружено при подробном исследовании при вскрытии. Первичное скринирование тканей не обнаружило каких-либо признаков ни поражений, ни HeV антигена у этой лошади; подробное исследование в настоящее время завершается.
[00118] Морские свинки: Одна из 4 морских свинок (№3) начинает терять массу на 3 день после HeV заражения. Потеря массы прогрессирует до 5 дня, когда у животного проявляются неврологические симптомы (патологический наклон головы, тремор) и свинку подвергают эвтаназии. Нарушения при исследовании при вскрытии ограничивались отеком ретроперитонеальных соединительных тканей.
[00119] При гистологическом исследовании обнаружен пульмонарный васкулит, васкулит периферических кровеносных сосудов, оофорит и негнойный энцефалит, связанные с отложениями HeV антигенов. Гистологические и иммунологические исследования согласуются с острым HeV инфицированием и подтверждают патогенность указанного инфицирующего вируса.
[00120] Не существует доказательств шеддинга HeV ни в одном из биологических образцов, полученных от лошадей V4, V5 или V6, на протяжении периода клинических наблюдений, не считая результата для ректального мазка у лошади V6 на 3 день, в котором наблюдалось Ct значение (HeV N ген) равное 36,2, полученное в TaqMan ПЦР, в одной из двух лунок, причем во второй лунке амплификация не наблюдалась (таблица 6). Более определенно, ни в одном из глубоких назальных мазков или в образцах крови не наблюдался геном ни в один из дней после воздействия.
[00121] Образцы, отобранные при вскрытии. В тканях иммунизированных лошадей V4, V5 или V6 отсутствуют свидетельства вирусной репликации. У одной морской свинки (№3) был обнаружен вирусный геном в крови (Ct 34,2), мозге, легких и селезенке на 5 день после заражения, что согласуется с клиническими, гистологическими и иммунологическими данными для острого HeV инфицирования у указанного животного (таблица 7).
[00122] Серологические исследования после заражения. У иммунизированных лошадей V4, V5 и V6 не наблюдается увеличения титра после HeV заражения (таблица 8). Это свидетельствует об отсутствии репликации инфицирующего вируса у указанных животных.
[00123] Трех лошадей (V4, V5 и V6), которые были вакцинированы 50 мкг sG+ISC адъювант в "прайм-буст" режиме, подвергают сероконвертированию к HeV до HeV воздействия. Одна лошадь, которой вводили только ISC, остается серонегативной по отношению к инфицирующему вирусу.
[00124] После заражения в других случаях летальной дозой HeV, иммунизированные лошади оставались клинически здоровыми на протяжении всего периода наблюдений, которое превышало время наступления всех экспериментально индуцированных случаев заражения лошадей HeV. Одну морскую свинку, использованную для контроля патогеничности, подвергают эвтаназии после развития клинических симптомов, соответствующих острой инфекции HeV. У иммунизированных лошадей не обнаруживается какого-либо увеличения титров антител после заражения, что свидетельствует об отсутствии репликации инфицирующего вируса у указанных животных.
[00125] Отсутствуют свидетельства о проявлении вирусного шеддинга у иммунизированных лошадей, что отражается отрицательными результатами ПЦР теста во всех клинических образцах, отбираемых ежедневно, за исключением результатов для ректального мазка, взятого на 3 день у лошади V6. Указанный тест повторяют; если бы аналогичные результаты повторились, единственным объяснением было то, что это вызвано низким уровнем остаточного инокулюма. У одной неиммунизированной морской свинки вирусный геном детектировался в основных органах и в крови на 5 день после воздействия вируса.
[00126] Отсутствуют свидетельства HeV вирусной репликации во всех тканях иммунизированных лошадей, полученных при вскрытии исследованиях после эвтаназии, на протяжении промежутка времени, который, как ожидалось, должен был быть периодом инфицирования. Напротив, HeV геном и антиген были распространены во всех тканях восприимчивой морской свинки таким образом, что соответствует острому HeV инфицированию, и у указанного животного была также идентифицирована васкулопатия, типичная для HeV инфицирования.
Пример 7: Клинические исследования на приматах для Nipah вируса
[00127] Статистика. При проведении исследований на животных, в частности исследований на нечеловеческих приматах, на биобезопасном уровне 4 (BSL-4) встречаются серьезные ограничения по числу подопытных животных, объему биологических образцов, которые можно получить, и по способности проведения независимых повторных анализов, что ограничивает статистический анализ. Соответственно, результаты, представленные как средние или средние, рассчитанные из данных для повторяющихся образцов, неповторяющихся образцов, и планки погрешностей представляют собой стандартные отклонения для повторов.
[00128] Вирусы. NiV-Малазия (код доступа в GenBank No. AF212302) получают из специальной линии патогенов Центров контроля и профилактики заболеваний Атланты, Джорджии. NiV размножают и титруют на Vero клетках, как описано для HeV у Rockx et al. (2010) J. Virol. 84, 9831.
[00129] Композиция вакцины. Используют три вакцинные композиции sGHeV (10 мкг, 50 мкг или 100 мкг). Получение и очистку sGHeV осуществляют, как описано ранее у Pallister (2011) Vaccine 29, 5623. Каждая вакцинная композиция также содержит Allhydrogel™ (Accurate Chemical & Scientific Corporation) и CpG олигодезоксинуклеотид (ODN) 2006 (Invivogen), содержащий полностью фосфоротиолатную основную цепь. Вакцинные дозы, содержащие фиксированное количество ODN 2006, варьируемые количества sGHeV и ионы алюминия (в массовом отношении 1:25) получают следующим образом: для дозы 100 мкг: 100 мкг sGHeV, 2,5 мг ионов алюминия и 150 мкг ODN 2006; для дозы 50 мкг: 50 мкг sGHeV, 1,25 мг ионов алюминия и 150 мкг ODN 2006; и для дозы 10 мкг: 5 мкг sGHeV, 250 мкг ионов алюминия и 150 мкг ODN 2006. Для всех доз, Alhydrogel™ и sGHeV сначала смешивают перед тем, как добавляют ODN 2006. Каждую вакцинную дозу доводят до 1 мл добавлением PBS, и смеси инкубируют на карусельной качалке при комнатной температуре в течение по меньшей мере двух-трех часов перед инъекциями. Каждый субъект получает одинаковую дозу 1 мл для примирования и усиления, и все вакцинные дозы вводят путем внутримышечных инъекций.
[00130] Животные. Десять молодых взрослых Африканских зеленых макак (African Green Monkeys (AGM)) (Chlorocebus aethiops), массой 4-6 кг (Three Springs Scientific Inc.) содержат в клетках индивидуально. Макак анестезируют путем внутримышечных инъекций кетамина (10-15 мг/кг) и вакцинируют, используя sGHeV в день -42 (прайм) и день -21 (буст). Трем животным вводят две дозы по 10 мкг (AGM 16, AGM 17, AGM 18), трем животным вводят две дозы по 50 мкг (AGM 13, AGM 14, AGM 15), трем животным вводят две дозы по 100 мкг (AGM 10, AGM 11, AGM 12) и одному животному (AGM 9) вводят только один адъювант. В день 0 животных анестезируют и им инокулируют интратрахеально 1×105 TCID50 (средняя инфекционная доза для тканевых культур) NiV в 4 мл минимальной поддерживающей среды Дюльбекко (DMEM) (Sigma-Aldrich). Животных анестезируют для клинических исследований, включающих температуру, частоту дыхания, радиографию груди, образцы крови и мазки назальной, оральной и ректальной слизистой в дни 0, 3, 5, 7, 10, 14, 21 и 28 после инфицирования (p.i.). Контрольное животное (AGM 9) необходимо гуманно подвергнуть эвтаназии на 10 день после инфицирования. Все остальные животные выживают до конца исследований, и их подвергают эвтаназии на 28 день после инфицирования. После вскрытия различные ткани отбирают для вирологических и гистологических исследований. Образцы тканей включают: конъюнктиву, миндалины, носоглоточную полость, назальную слизь, трахею, правый бронх, левый бронх, верхнюю долю левого легкого, середину правого легкого, нижнюю долю правого легкого, верхнюю долю левого легкого, среднюю долю левого легкого, нижнюю долю левого легкого, бронхиальный лимфатический узел (LN), сердце, печень, селезенка, почки, надпочечники, поджелудочная железа, тощая кишка, поперечная ободочная кишка, мозг (фронтальный), мозг (церебеллум), ствол головного мозга, затылочный спинной мозг, гипофиз, мандибулярные LN, LN слюнных желез, паховые LN, подмышечные LN, брыжжеечные LN, мочевой пузырь, яички или яичники, феморальный костный мозг. Вакцинацию проводят с BSL-2. Временная схема вакцинации, заражение и отбор биологических образцов в определенные дни представлены на фиг. 4.
[00131] Вакцинация и заражение NiV. Ранее авторы продемонстрировали, что интратрахеальная инокуляция, AGM с использованием 105 TCID50 (средняя инфекционная доза для тканевых культур) NiV вызывает одинаковый летальный исход (Rockx et al. (2010) J. Virol. 84, 9831). В указанных исследованиях отмечалось быстрое развитие клинического заболевания; клинические симптомы включают тяжелую депрессию, респираторные заболевания, приводящие к острой респираторной недостаточности, тяжелые неврологические заболевания и серьезные ограничения подвижности; и время до достижения критерия доказанной гуманной конечной точки для эвтаназии составляет интервал от 7 до 12 дней. Дальнейшая задача состоит в определении того, может ли вакцинация с использованием sGHeV предотвратить NiV инфицирование и заболевание у AGM. Дозы 10, 50 или 100 мкг sGHeV смешивают с квасцами и CpG фрагментами, как описано в разделе Способы. Каждую вакцинную композицию вводят подкожно трем субъектам в день 0 (прайм) и снова в день 21 (буст) и один контрольный субъект (AGM 9) получает только один адъювант как прайм и буст в те же дни. На 42 день всем животным инокулируют интратрахеально 105 TCID50 NiV. Контрольное животное (AGM 9) демонстрирует потерю аппетита, серьезные длительные изменения поведения (депрессию, пониженную активность, сутулость), снижение количества тромбоцитов и постепенное повышение частоты дыхания на конечной стадии заболевания. Соответственно, у AGM 9 развивается острый респираторный дистресс, и животное приходится гуманно подвергнуть эвтаназии на 10 день после инфицирования. Напротив, ни у одного из вакцинированных животных не появились признаки клинического заболевания, и все они выжили к концу исследований. График выживания Каплан-Мейра представлен на фиг. 5.
[00132] NiV-опосредованное заболевание у контрольного животного. Значительные патологические изменения у контрольного животного согласуются с теми изменениями, которые были обнаружены ранее у NiV-инфицированных AGM (Geisbert et al. (2010) PLoS one 5, e10690). Наблюдаются спленомегалия и закупорка кровеносных сосудов на поверхности мозга, и все доли легких были влажными и тяжелыми. РНК NiV и инфекционный вирус не были выделены из образцов крови AGM 9, и не было обнаружено виремии. AGM 9 содержала значительные уровни NiV-специфических IgM и детектируемых NiV-специфических IgG и IgA. Дальнейший анализ образцов тканей выявил повсеместный NiV тропизм к ткани, сходный с широко распространенным NiV инфицированием, наблюдавшимся ранее у AGM (Geisbert et al. (2010) PLoS One 5, e10690). AGM 9, как показано, содержит РНК NiV в большинстве тканей, и инфекционный вирус был выделен из многочисленных тканей. Значительные патологические подтверждения включают интерстициальную пневмонию, подострый энцефалит и некроз и кровоизлияния белой пульпы селезенки. Альвеолярные пространства заполнены отечной жидкостью, фибрином, кариоректичными и клеточными осколками и альвеолярными макрофагами. Многоочаговый энцефалит характеризуется увеличением пространства Вирхова-Робинса за счет умеренного числа лимфоцитов и меньшего числа нейтрофилов. Меньшее число указанных воспалительных клеток простирается в прилегающую паренхиму. Многочисленные нейроны были набухшими и вакуолезированными (дегенерация) или были фрагментированы за счет кариолиза (некроза). Мультифокальные герминальные центры фолликул в белой пульпе селезенки были уничтожены за счет кровотечения и фибрина, а также небольшим числом нейтрофилов и клеточных и кариорексичных осколков. Полученные результаты соответствуют некрозу и утрате герминальных центров в селезенке. Большие количества вирусных антигенов, присутствующих в стволовой области мозга, подчеркивает значительные повреждения, которые NiV вызывает в центральной нервной системе.
[00133] Защита sGHeV-вакцинированных животных. Все биологические образцы, включая все образцы крови, собранные после заражения, и все ткани, полученные после аутопсии, были отрицательными в отношении РНК NiV, и инфекционный вирус не был выделен ни из одного образца. После более тщательного исследования срезов тканей от вакцинированных животных, строение тканей казалась нормальным, и NiV антиген не был детектирован ни в одной из тканей при исследовании с помощью иммуногистохимических методов. Для дальнейшего раскрытия вызываемых вакциной механизмов защиты, сывороточные и мукозальные и sGNiV- и sGHeV-специфические IgM, IgG и IgA, а также NiV и HeV титры нейтрализации сыворотки, измеряют у вакцинированных животных. Как продемонстрировано на фиг. 6, за семь дней до заражения субъекты, которым ввели наименьшую дозу sGHeV, имели детектируемый антиген-специфический сывороточный IgM и наивысший уровень sGHeV-специфического сывороточного IgG. Субъекты, которым вводили 50 мкг sGHeV, также имели детектируемые уровни сывороточного IgM и наивысшие уровни сывороточного IgG за семь дней до заражения. Субъекты с высокой дозой не имели детектируемых уровней сывороточного IgM, и уровни сывороточного IgG были значительно ниже на 7 день по сравнению с другими двумя группами. Ко дню NiV заражения уровни сывороточного IgG у животных, которым вводили высокие дозы, имели повышенные уровни, и все вакцинированные субъекты имели аналогичные уровни IgG. Уровни сывороточных IgM не изменились ни у одного из животных после NiV заражения. Уровни сывороточного IgG понижены у животных со средней дозой в день NiV заражения, и уровни IgG понижены у животных, которым вводили низкие дозы после NiV заражения. Интересно, что уровни IgG повышены у обеих указанных групп ко дню 3 и дню 5 после инфицирования, но никогда не подавлены уровни IgG, присутствующие за семь дней до заражения, и у обеих групп титр заметно понижается к 28 дню после инфицирования.
[00134] Напротив, уровни сывороточного IgG у группы с высокой дозой остаются высокими и были наивысшими на 28 день после инфицирования. Антиген-специфические сывороточные IgA детектировали у всех животных после вакцинации; однако, уровни были очень низкими, и уровни до и после заражения, по-видимому, заметно не отличались (фиг. 6). Минимальное повышение мукозальных антиген-специфических IgA детектировали в назальных мазках у животных с низкой дозой на 14 день после заражения. Однако указанные уровни оказались столь низкими, что указанные мукозальные антитела, по-видимому, не играют какой-либо роли в предотвращении распространения NiV после заражения. Результаты тестов по нейтрализации сыворотки (SNT) представлены в таблице 9. Для всех вакцинированных субъектов титры HeV-специфической нейтрализации остаются теми же или снижаются к 28 дню после заражения, и титры NiV-специфической нейтрализации заметно не изменяются к 7 дню после заражения, даже у животных, которые имели самые низкие титры до заражения. Один субъект с низкой дозой и один субъект с высокой дозой имели логарифмическое повышение NiV SNT титра к 14 дню после заражения, и один субъект со средней дозой имеет логарифмическое повышение NiV SNT к 21 дню после заражения. Для всех остальных вакцинированных животных изменения в титрах SNT были или неопределенными (титр повышается и затем снижается), или незначительными (титр повышается в 3-4 раза, но не более чем log). И наконец, у вакцинированных животных сероконверсию в оболочечный гликопротеин NiV слияния (F) измеряют у вакцинированных животных после NiV заражения. Минимальные уровни сывороточного анти-NiV F IgM детектируют у животных с низкой и средней дозами в день 10 и день 21 после заражения, соответственно, и указанные низкие M.F.I, значения предполагают слабую первичную реакцию антител после NiV заражения. Сывороточный анти-NiV-F IgM не детектируется у животных с высокой дозой, что предполагает, что у указанных животных мало или вообще нет циркулирующих вирусов после заражения.
Пример 8: Клинические исследования вируса Hendra в опытах на приматах
[00135] Вторые клинические исследования проводят с AGM для оценки вакцинации и заражения вирусом Hendra. В качестве вакцины используют те же самые композиции, как описано выше в примере 7, но результаты также сравнивают с другой группой, которой вводят sGHeV только с Alhydrogel™ в качестве адъюванта (ODN 2006 отсутствует). Животных вакцинируют в день -21, бустерную инъекцию вводят в день 0, и заражение осуществляют в день 21. Если не указано иное, все условия соответствуют условиям, описанным в примере 7. Экспериментальные результаты суммированы ниже:
[00136] Результат: Все животные (n=4) в обеих группах (A и B) пережили заражение вирусом Hendra после того, как им интратрахеально было инокулировано 105 TCID50 вируса Hendra. Контрольные животные погибли на 8 день. Ни у одного из вакцинированных животных не наблюдались признаки заболевания, и они оставались здоровыми до конца испытаний.
[00137] Другие варианты и применения настоящего изобретения будут очевидны специалистам в данной области после изучения представленного описания и практической части настоящего изобретения. Все цитированные ссылки, включая все публикации, патенты и патентные описания США и других стран, конкретно и полностью включены в настоящее описание посредством ссылки. Важно понимать, что описание и примеры следует рассматривать только как приведенные в качестве примеров, и объем и суть настоящего изобретения определяются только приведенной ниже следующей формулой изобретения.
--->
СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ
<110> Elhay, Martin
Broder, Christopher
<120> ИММУНОГЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ ГЛИКОПРОТЕИНА G ВИРУСОВ HENDRA И NIPAH
<130> 013306-5006
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1815
<212> ДНК
<213> Вирус Hendra
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1815)
<400> 1
atg atg gct gat tcc aaa ttg gta agc ctg aac aat aat cta tct ggt 48
Met Met Ala Asp Ser Lys Leu Val Ser Leu Asn Asn Asn Leu Ser Gly
1 5 10 15
aaa atc aag gat caa ggt aaa gtt atc aag aat tat tac ggc aca atg 96
Lys Ile Lys Asp Gln Gly Lys Val Ile Lys Asn Tyr Tyr Gly Thr Met
20 25 30
gac atc aag aaa att aac gat ggg tta tta gat agt aag ata ctt ggg 144
Asp Ile Lys Lys Ile Asn Asp Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu Gly
35 40 45
gcg ttt aac aca gtg ata gct ttg ttg gga tca atc atc atc att gtg 192
Ala Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Ile Ile Ile Val
50 55 60
atg aat atc atg ata att caa aat tac acc aga acg act gat aat cag 240
Met Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Thr Thr Asp Asn Gln
65 70 75 80
gca cta atc aaa gag tca ctc cag agt gta cag caa caa atc aaa gct 288
Ala Leu Ile Lys Glu Ser Leu Gln Ser Val Gln Gln Gln Ile Lys Ala
85 90 95
tta aca gac aaa atc ggg aca gag ata ggc ccc aaa gtc tca cta att 336
Leu Thr Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile
100 105 110
gac aca tcc agc acc atc aca att cct gct aac ata ggg tta ctg gga 384
Asp Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly
115 120 125
tcc aag ata agt cag tct acc agc agt att aat gag aat gtt aac gat 432
Ser Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ser Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Asp
130 135 140
aaa tgc aaa ttt act ctt cct cct tta aag att cat gag tgt aat atc 480
Lys Cys Lys Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile
145 150 155 160
tct tgt ccg aat cct ttg cct ttc aga gaa tac cga cca atc tca caa 528
Ser Cys Pro Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Ile Ser Gln
165 170 175
ggg gtg agt gat ctt gta gga ctg ccg aac cag atc tgt cta cag aag 576
Gly Val Ser Asp Leu Val Gly Leu Pro Asn Gln Ile Cys Leu Gln Lys
180 185 190
aca aca tca aca atc tta aag ccc agg ctg ata tcc tat act cta cca 624
Thr Thr Ser Thr Ile Leu Lys Pro Arg Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro
195 200 205
att aat acc aga gaa ggg gtt tgc atc act gac cca ctt ttg gct gtt 672
Ile Asn Thr Arg Glu Gly Val Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Val
210 215 220
gat aat ggc ttc ttc gcc tat agc cat ctt gaa aag atc gga tca tgt 720
Asp Asn Gly Phe Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Lys Ile Gly Ser Cys
225 230 235 240
act aga gga att gca aaa caa agg ata ata ggg gtg ggt gag gta ttg 768
Thr Arg Gly Ile Ala Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu
245 250 255
gat agg ggt gat aag gtg cca tca atg ttt atg acc aat gtt tgg aca 816
Asp Arg Gly Asp Lys Val Pro Ser Met Phe Met Thr Asn Val Trp Thr
260 265 270
cca ccc aat cca agc acc atc cat cat tgc agc tca act tac cat gaa 864
Pro Pro Asn Pro Ser Thr Ile His His Cys Ser Ser Thr Tyr His Glu
275 280 285
gat ttt tat tac aca ttg tgc gca gtg tcc cat gtg gga gat cct atc 912
Asp Phe Tyr Tyr Thr Leu Cys Ala Val Ser His Val Gly Asp Pro Ile
290 295 300
ctt aac agt act tcc tgg aca gag tca ctg tct ctg att cgt ctt gct 960
Leu Asn Ser Thr Ser Trp Thr Glu Ser Leu Ser Leu Ile Arg Leu Ala
305 310 315 320
gta aga cca aaa agt gat agt gga gac tac aat cag aaa tac atc gct 1008
Val Arg Pro Lys Ser Asp Ser Gly Asp Tyr Asn Gln Lys Tyr Ile Ala
325 330 335
ata act aaa gtt gaa aga ggg aag tac gat aag gtg atg cct tac ggt 1056
Ile Thr Lys Val Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly
340 345 350
cca tca ggt atc aag caa ggg gat aca ttg tac ttt ccg gcc gtc ggt 1104
Pro Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly
355 360 365
ttt ttg cca agg acc gaa ttt caa tat aat gac tct aat tgt ccc ata 1152
Phe Leu Pro Arg Thr Glu Phe Gln Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile
370 375 380
att cat tgc aag tac agc aaa gca gaa aac tgt agg ctt tca atg ggt 1200
Ile His Cys Lys Tyr Ser Lys Ala Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly
385 390 395 400
gtc aac tcc aaa agt cat tat att ttg aga tca gga cta ttg aag tat 1248
Val Asn Ser Lys Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr
405 410 415
aat cta tct ctt gga gga gac atc ata ctc caa ttt atc gag att gct 1296
Asn Leu Ser Leu Gly Gly Asp Ile Ile Leu Gln Phe Ile Glu Ile Ala
420 425 430
gac aat aga ttg acc atc ggt tct cct agt aag ata tac aat tcc cta 1344
Asp Asn Arg Leu Thr Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asn Ser Leu
435 440 445
ggt caa ccc gtt ttc tac cag gca tca tat tct tgg gat acg atg att 1392
Gly Gln Pro Val Phe Tyr Gln Ala Ser Tyr Ser Trp Asp Thr Met Ile
450 455 460
aaa tta ggc gat gtt gat acc gtt gac cct cta aga gta cag tgg aga 1440
Lys Leu Gly Asp Val Asp Thr Val Asp Pro Leu Arg Val Gln Trp Arg
465 470 475 480
aat aac agt gtg att tct aga cct gga cag tca cag tgt cct cga ttt 1488
Asn Asn Ser Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe
485 490 495
aat gtc tgt ccc gag gta tgc tgg gaa ggg aca tat aat gat gct ttt 1536
Asn Val Cys Pro Glu Val Cys Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Asp Ala Phe
500 505 510
cta ata gac cgg cta aac tgg gtt agt gct ggt gtt tat tta aac agt 1584
Leu Ile Asp Arg Leu Asn Trp Val Ser Ala Gly Val Tyr Leu Asn Ser
515 520 525
aac caa act gca gag aac cct gtg ttt gcc gta ttc aag gat aac gag 1632
Asn Gln Thr Ala Glu Asn Pro Val Phe Ala Val Phe Lys Asp Asn Glu
530 535 540
atc ctt tac caa gtt cca ctg gct gaa gat gac aca aat gca caa aaa 1680
Ile Leu Tyr Gln Val Pro Leu Ala Glu Asp Asp Thr Asn Ala Gln Lys
545 550 555 560
acc atc aca gat tgc ttc ttg ctg gag aat gtc ata tgg tgt ata tca 1728
Thr Ile Thr Asp Cys Phe Leu Leu Glu Asn Val Ile Trp Cys Ile Ser
565 570 575
cta gta gaa ata tac gat aca gga gac agt gtg ata agg cca aaa cta 1776
Leu Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Ser Val Ile Arg Pro Lys Leu
580 585 590
ttt gca gtc aag ata cct gcc caa tgt tca gag agt tga 1815
Phe Ala Val Lys Ile Pro Ala Gln Cys Ser Glu Ser
595 600
<210> 2
<211> 604
<212> PRT
<213> Вирус Hendra
<400> 2
Met Met Ala Asp Ser Lys Leu Val Ser Leu Asn Asn Asn Leu Ser Gly
1 5 10 15
Lys Ile Lys Asp Gln Gly Lys Val Ile Lys Asn Tyr Tyr Gly Thr Met
20 25 30
Asp Ile Lys Lys Ile Asn Asp Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu Gly
35 40 45
Ala Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Ile Ile Ile Val
50 55 60
Met Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Thr Thr Asp Asn Gln
65 70 75 80
Ala Leu Ile Lys Glu Ser Leu Gln Ser Val Gln Gln Gln Ile Lys Ala
85 90 95
Leu Thr Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile
100 105 110
Asp Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly
115 120 125
Ser Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ser Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Asp
130 135 140
Lys Cys Lys Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile
145 150 155 160
Ser Cys Pro Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Ile Ser Gln
165 170 175
Gly Val Ser Asp Leu Val Gly Leu Pro Asn Gln Ile Cys Leu Gln Lys
180 185 190
Thr Thr Ser Thr Ile Leu Lys Pro Arg Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro
195 200 205
Ile Asn Thr Arg Glu Gly Val Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Val
210 215 220
Asp Asn Gly Phe Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Lys Ile Gly Ser Cys
225 230 235 240
Thr Arg Gly Ile Ala Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu
245 250 255
Asp Arg Gly Asp Lys Val Pro Ser Met Phe Met Thr Asn Val Trp Thr
260 265 270
Pro Pro Asn Pro Ser Thr Ile His His Cys Ser Ser Thr Tyr His Glu
275 280 285
Asp Phe Tyr Tyr Thr Leu Cys Ala Val Ser His Val Gly Asp Pro Ile
290 295 300
Leu Asn Ser Thr Ser Trp Thr Glu Ser Leu Ser Leu Ile Arg Leu Ala
305 310 315 320
Val Arg Pro Lys Ser Asp Ser Gly Asp Tyr Asn Gln Lys Tyr Ile Ala
325 330 335
Ile Thr Lys Val Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly
340 345 350
Pro Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly
355 360 365
Phe Leu Pro Arg Thr Glu Phe Gln Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile
370 375 380
Ile His Cys Lys Tyr Ser Lys Ala Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly
385 390 395 400
Val Asn Ser Lys Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr
405 410 415
Asn Leu Ser Leu Gly Gly Asp Ile Ile Leu Gln Phe Ile Glu Ile Ala
420 425 430
Asp Asn Arg Leu Thr Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asn Ser Leu
435 440 445
Gly Gln Pro Val Phe Tyr Gln Ala Ser Tyr Ser Trp Asp Thr Met Ile
450 455 460
Lys Leu Gly Asp Val Asp Thr Val Asp Pro Leu Arg Val Gln Trp Arg
465 470 475 480
Asn Asn Ser Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe
485 490 495
Asn Val Cys Pro Glu Val Cys Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Asp Ala Phe
500 505 510
Leu Ile Asp Arg Leu Asn Trp Val Ser Ala Gly Val Tyr Leu Asn Ser
515 520 525
Asn Gln Thr Ala Glu Asn Pro Val Phe Ala Val Phe Lys Asp Asn Glu
530 535 540
Ile Leu Tyr Gln Val Pro Leu Ala Glu Asp Asp Thr Asn Ala Gln Lys
545 550 555 560
Thr Ile Thr Asp Cys Phe Leu Leu Glu Asn Val Ile Trp Cys Ile Ser
565 570 575
Leu Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Ser Val Ile Arg Pro Lys Leu
580 585 590
Phe Ala Val Lys Ile Pro Ala Gln Cys Ser Glu Ser
595 600
<210> 3
<211> 1809
<212> ДНК
<213> Вирус Nipah
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1809)
<400> 3
atg ccg gca gaa aac aag aaa gtt aga ttc gaa aat act act tca gac 48
Met Pro Ala Glu Asn Lys Lys Val Arg Phe Glu Asn Thr Thr Ser Asp
1 5 10 15
aaa ggg aaa att cct agt aaa gtt att aag agc tac tac gga acc atg 96
Lys Gly Lys Ile Pro Ser Lys Val Ile Lys Ser Tyr Tyr Gly Thr Met
20 25 30
gac att aag aaa ata aat gaa gga tta ttg gac agc aaa ata tta agt 144
Asp Ile Lys Lys Ile Asn Glu Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu Ser
35 40 45
gct ttc aac aca gta ata gca ttg ctt gga tct atc gtg atc ata gtg 192
Ala Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Val Ile Ile Val
50 55 60
atg aat ata atg atc atc caa aat tac aca aga tca aca gac aat cag 240
Met Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Ser Thr Asp Asn Gln
65 70 75 80
gcc gtg atc aaa gat gcg ttg cag ggt atc caa cag cag atc aaa ggg 288
Ala Val Ile Lys Asp Ala Leu Gln Gly Ile Gln Gln Gln Ile Lys Gly
85 90 95
ctt gct gac aaa atc ggc aca gag ata ggg ccc aaa gta tca ctg att 336
Leu Ala Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile
100 105 110
gac aca tcc agt acc att act atc cca gct aac att ggg ctg tta ggt 384
Asp Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly
115 120 125
tca aag atc agc cag tcg act gca agt ata aat gag aat gtg aat gaa 432
Ser Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ala Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Glu
130 135 140
aaa tgc aaa ttc aca ctg cct ccc ttg aaa atc cac gaa tgt aac att 480
Lys Cys Lys Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile
145 150 155 160
tct tgt cct aac cca ctc cct ttt aga gag tat agg cca cag aca gaa 528
Ser Cys Pro Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Gln Thr Glu
165 170 175
ggg gtg agc aat cta gta gga tta cct aat aat att tgc ctg caa aag 576
Gly Val Ser Asn Leu Val Gly Leu Pro Asn Asn Ile Cys Leu Gln Lys
180 185 190
aca tct aat cag ata ttg aag cca aag ctg att tca tac act tta ccc 624
Thr Ser Asn Gln Ile Leu Lys Pro Lys Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro
195 200 205
gta gtc ggt caa agt ggt acc tgt atc aca gac cca ttg ctg gct atg 672
Val Val Gly Gln Ser Gly Thr Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Met
210 215 220
gac gag ggc tat ttt gca tat agc cac ctg gaa aga atc gga tca tgt 720
Asp Glu Gly Tyr Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Arg Ile Gly Ser Cys
225 230 235 240
tca aga ggg gtc tcc aaa caa aga ata ata gga gtt gga gag gta cta 768
Ser Arg Gly Val Ser Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu
245 250 255
gac aga ggt gat gaa gtt cct tct tta ttt atg acc aat gtc tgg acc 816
Asp Arg Gly Asp Glu Val Pro Ser Leu Phe Met Thr Asn Val Trp Thr
260 265 270
cca cca aat cca aac acc gtt tac cac tgt agt gct gta tac aac aat 864
Pro Pro Asn Pro Asn Thr Val Tyr His Cys Ser Ala Val Tyr Asn Asn
275 280 285
gaa ttc tat tat gta ctt tgt gca gtg tca act gtt gga gac cct att 912
Glu Phe Tyr Tyr Val Leu Cys Ala Val Ser Thr Val Gly Asp Pro Ile
290 295 300
ctg aat agc acc tac tgg tcc gga tct cta atg atg acc cgt cta gct 960
Leu Asn Ser Thr Tyr Trp Ser Gly Ser Leu Met Met Thr Arg Leu Ala
305 310 315 320
gtg aaa ccc aag agt aat ggt ggg ggt tac aat caa cat caa ctt gcc 1008
Val Lys Pro Lys Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Asn Gln His Gln Leu Ala
325 330 335
cta cga agt atc gag aaa ggg agg tat gat aaa gtt atg ccg tat gga 1056
Leu Arg Ser Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly
340 345 350
cct tca ggc atc aaa cag ggt gac acc ctg tat ttt cct gct gta gga 1104
Pro Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly
355 360 365
ttt ttg gtc agg aca gag ttt aaa tac aat gat tca aat tgt ccc atc 1152
Phe Leu Val Arg Thr Glu Phe Lys Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile
370 375 380
acg aag tgt caa tac agt aaa cct gaa aat tgc agg cta tct atg ggg 1200
Thr Lys Cys Gln Tyr Ser Lys Pro Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly
385 390 395 400
att aga cca aac agc cat tat atc ctt cga tct gga cta tta aaa tac 1248
Ile Arg Pro Asn Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr
405 410 415
aat cta tca gat ggg gag aac ccc aaa gtt gta ttc att gaa ata tct 1296
Asn Leu Ser Asp Gly Glu Asn Pro Lys Val Val Phe Ile Glu Ile Ser
420 425 430
gat caa aga tta tct att gga tct cct agc aaa atc tat gat tct ttg 1344
Asp Gln Arg Leu Ser Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asp Ser Leu
435 440 445
ggt caa cct gtt ttc tac caa gcg tca ttt tca tgg gat act atg att 1392
Gly Gln Pro Val Phe Tyr Gln Ala Ser Phe Ser Trp Asp Thr Met Ile
450 455 460
aaa ttt gga gat gtt cta aca gtc aac cct ctg gtt gtc aat tgg cgt 1440
Lys Phe Gly Asp Val Leu Thr Val Asn Pro Leu Val Val Asn Trp Arg
465 470 475 480
aat aac acg gta ata tca aga ccc ggg caa tca caa tgc cct aga ttc 1488
Asn Asn Thr Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe
485 490 495
aat aca tgt cca gag atc tgc tgg gaa gga gtt tat aat gat gca ttc 1536
Asn Thr Cys Pro Glu Ile Cys Trp Glu Gly Val Tyr Asn Asp Ala Phe
500 505 510
cta att gac aga atc aat tgg ata agc gcg ggt gta ttc ctt gac agc 1584
Leu Ile Asp Arg Ile Asn Trp Ile Ser Ala Gly Val Phe Leu Asp Ser
515 520 525
aat cag acc gca gaa aat cct gtt ttt act gta ttc aaa gat aat gaa 1632
Asn Gln Thr Ala Glu Asn Pro Val Phe Thr Val Phe Lys Asp Asn Glu
530 535 540
ata ctt tat agg gca caa ctg gct tct gag gac acc aat gca caa aaa 1680
Ile Leu Tyr Arg Ala Gln Leu Ala Ser Glu Asp Thr Asn Ala Gln Lys
545 550 555 560
aca ata act aat tgt ttt ctc ttg aag aat aag att tgg tgc ata tca 1728
Thr Ile Thr Asn Cys Phe Leu Leu Lys Asn Lys Ile Trp Cys Ile Ser
565 570 575
ttg gtt gag ata tat gac aca gga gac aat gtc ata aga ccc aaa cta 1776
Leu Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Asn Val Ile Arg Pro Lys Leu
580 585 590
ttc gcg gtt aag ata cca gag caa tgt aca taa 1809
Phe Ala Val Lys Ile Pro Glu Gln Cys Thr
595 600
<210> 4
<211> 602
<212> PRT
<213> Вирус Nipah
<400> 4
Met Pro Ala Glu Asn Lys Lys Val Arg Phe Glu Asn Thr Thr Ser Asp
1 5 10 15
Lys Gly Lys Ile Pro Ser Lys Val Ile Lys Ser Tyr Tyr Gly Thr Met
20 25 30
Asp Ile Lys Lys Ile Asn Glu Gly Leu Leu Asp Ser Lys Ile Leu Ser
35 40 45
Ala Phe Asn Thr Val Ile Ala Leu Leu Gly Ser Ile Val Ile Ile Val
50 55 60
Met Asn Ile Met Ile Ile Gln Asn Tyr Thr Arg Ser Thr Asp Asn Gln
65 70 75 80
Ala Val Ile Lys Asp Ala Leu Gln Gly Ile Gln Gln Gln Ile Lys Gly
85 90 95
Leu Ala Asp Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile
100 105 110
Asp Thr Ser Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly
115 120 125
Ser Lys Ile Ser Gln Ser Thr Ala Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Glu
130 135 140
Lys Cys Lys Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile
145 150 155 160
Ser Cys Pro Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Gln Thr Glu
165 170 175
Gly Val Ser Asn Leu Val Gly Leu Pro Asn Asn Ile Cys Leu Gln Lys
180 185 190
Thr Ser Asn Gln Ile Leu Lys Pro Lys Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro
195 200 205
Val Val Gly Gln Ser Gly Thr Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Met
210 215 220
Asp Glu Gly Tyr Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Arg Ile Gly Ser Cys
225 230 235 240
Ser Arg Gly Val Ser Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu
245 250 255
Asp Arg Gly Asp Glu Val Pro Ser Leu Phe Met Thr Asn Val Trp Thr
260 265 270
Pro Pro Asn Pro Asn Thr Val Tyr His Cys Ser Ala Val Tyr Asn Asn
275 280 285
Glu Phe Tyr Tyr Val Leu Cys Ala Val Ser Thr Val Gly Asp Pro Ile
290 295 300
Leu Asn Ser Thr Tyr Trp Ser Gly Ser Leu Met Met Thr Arg Leu Ala
305 310 315 320
Val Lys Pro Lys Ser Asn Gly Gly Gly Tyr Asn Gln His Gln Leu Ala
325 330 335
Leu Arg Ser Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly
340 345 350
Pro Ser Gly Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly
355 360 365
Phe Leu Val Arg Thr Glu Phe Lys Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile
370 375 380
Thr Lys Cys Gln Tyr Ser Lys Pro Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly
385 390 395 400
Ile Arg Pro Asn Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr
405 410 415
Asn Leu Ser Asp Gly Glu Asn Pro Lys Val Val Phe Ile Glu Ile Ser
420 425 430
Asp Gln Arg Leu Ser Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asp Ser Leu
435 440 445
Gly Gln Pro Val Phe Tyr Gln Ala Ser Phe Ser Trp Asp Thr Met Ile
450 455 460
Lys Phe Gly Asp Val Leu Thr Val Asn Pro Leu Val Val Asn Trp Arg
465 470 475 480
Asn Asn Thr Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe
485 490 495
Asn Thr Cys Pro Glu Ile Cys Trp Glu Gly Val Tyr Asn Asp Ala Phe
500 505 510
Leu Ile Asp Arg Ile Asn Trp Ile Ser Ala Gly Val Phe Leu Asp Ser
515 520 525
Asn Gln Thr Ala Glu Asn Pro Val Phe Thr Val Phe Lys Asp Asn Glu
530 535 540
Ile Leu Tyr Arg Ala Gln Leu Ala Ser Glu Asp Thr Asn Ala Gln Lys
545 550 555 560
Thr Ile Thr Asn Cys Phe Leu Leu Lys Asn Lys Ile Trp Cys Ile Ser
565 570 575
Leu Val Glu Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Asn Val Ile Arg Pro Lys Leu
580 585 590
Phe Ala Val Lys Ile Pro Glu Gln Cys Thr
595 600
<210> 5
<211> 40
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 5
gtcgaccacc atgcaaaatt acaccagaac gactgataat 40
<210> 6
<211> 45
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 6
gtttaaacgt cgaccaatca actctctgaa cattgggcag gtatc 45
<210> 7
<211> 39
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 7
ctcgagcacc atgcaaaatt acacaagatc aacagacaa 39
<210> 8
<211> 45
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Праймер
<400> 8
ctcgagtagc agccggatca agcttatgta cattgctctg gtatc 45
<210> 9
<211> 46
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 9
caaggagacc gctgctgcta agttcgaacg ccagcacatg gattct 46
<210> 10
<211> 54
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 10
aattagaatc catgtgctgg cgttcgaact tagcagcagc ggtctccttg gtac 54
<210> 11
<211> 31
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 11
cgaacaaaag ctcatctcag aagaggatct g 31
<210> 12
<211> 39
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 12
aattcagatc ctcttctgag atgagctttt gttcggtac 39
<210> 13
<211> 34
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетический олигонуклеотид
<400> 13
tcgacccacc atggagacag acacactcct gcta 34
<210> 14
<211> 1662
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Последовательность вируса HeV sG
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1662)
<400> 14
atg gaa acc gac acc ctg ctg ctg tgg gtg ctg ctc ctg tgg gtc ccc 48
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
ggc agc aca ggc gac tac acc aga acg act gat aat cag gca cta atc 96
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Thr Arg Thr Thr Asp Asn Gln Ala Leu Ile
20 25 30
aaa gag tca ctc cag agt gta cag caa caa atc aaa gct tta aca gac 144
Lys Glu Ser Leu Gln Ser Val Gln Gln Gln Ile Lys Ala Leu Thr Asp
35 40 45
aaa atc ggg aca gag ata ggc ccc aaa gtc tca cta att gac aca tcc 192
Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile Asp Thr Ser
50 55 60
agc acc atc aca att cct gct aac ata ggg tta ctg gga tcc aag ata 240
Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly Ser Lys Ile
65 70 75 80
agt cag tct acc agc agt att aat gag aat gtt aac gat aaa tgc aaa 288
Ser Gln Ser Thr Ser Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Asp Lys Cys Lys
85 90 95
ttt act ctt cct cct tta aag att cat gag tgt aat atc tct tgt ccg 336
Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile Ser Cys Pro
100 105 110
aat cct ttg cct ttc aga gaa tac cga cca atc tca caa ggg gtg agt 384
Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Ile Ser Gln Gly Val Ser
115 120 125
gat ctt gta gga ctg ccg aac cag atc tgt cta cag aag aca aca tca 432
Asp Leu Val Gly Leu Pro Asn Gln Ile Cys Leu Gln Lys Thr Thr Ser
130 135 140
aca atc tta aag ccc agg ctg ata tcc tat act cta cca att aat acc 480
Thr Ile Leu Lys Pro Arg Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro Ile Asn Thr
145 150 155 160
aga gaa ggg gtt tgc atc act gac cca ctt ttg gct gtt gat aat ggc 528
Arg Glu Gly Val Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Val Asp Asn Gly
165 170 175
ttc ttc gcc tat agc cat ctt gaa aag atc gga tca tgt act aga gga 576
Phe Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Lys Ile Gly Ser Cys Thr Arg Gly
180 185 190
att gca aaa caa agg ata ata ggg gtg ggt gag gta ttg gat agg ggt 624
Ile Ala Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp Arg Gly
195 200 205
gat aag gtg cca tca atg ttt atg acc aat gtt tgg aca cca ccc aat 672
Asp Lys Val Pro Ser Met Phe Met Thr Asn Val Trp Thr Pro Pro Asn
210 215 220
cca agc acc atc cat cat tgc agc tca act tac cat gaa gat ttt tat 720
Pro Ser Thr Ile His His Cys Ser Ser Thr Tyr His Glu Asp Phe Tyr
225 230 235 240
tac aca ttg tgc gca gtg tcc cat gtg gga gat cct atc ctt aac agt 768
Tyr Thr Leu Cys Ala Val Ser His Val Gly Asp Pro Ile Leu Asn Ser
245 250 255
act tcc tgg aca gag tca ctg tct ctg att cgt ctt gct gta aga cca 816
Thr Ser Trp Thr Glu Ser Leu Ser Leu Ile Arg Leu Ala Val Arg Pro
260 265 270
aaa agt gat agt gga gac tac aat cag aaa tac atc gct ata act aaa 864
Lys Ser Asp Ser Gly Asp Tyr Asn Gln Lys Tyr Ile Ala Ile Thr Lys
275 280 285
gtt gaa aga ggg aag tac gat aag gtg atg cct tac ggt cca tca ggt 912
Val Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro Ser Gly
290 295 300
atc aag caa ggg gat aca ttg tac ttt ccg gcc gtc ggt ttt ttg cca 960
Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe Leu Pro
305 310 315 320
agg acc gaa ttt caa tat aat gac tct aat tgt ccc ata att cat tgc 1008
Arg Thr Glu Phe Gln Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile Ile His Cys
325 330 335
aag tac agc aaa gca gaa aac tgt agg ctt tca atg ggt gtc aac tcc 1056
Lys Tyr Ser Lys Ala Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly Val Asn Ser
340 345 350
aaa agt cat tat att ttg aga tca gga cta ttg aag tat aat cta tct 1104
Lys Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr Asn Leu Ser
355 360 365
ctt gga gga gac atc ata ctc caa ttt atc gag att gct gac aat aga 1152
Leu Gly Gly Asp Ile Ile Leu Gln Phe Ile Glu Ile Ala Asp Asn Arg
370 375 380
ttg acc atc ggt tct cct agt aag ata tac aat tcc cta ggt caa ccc 1200
Leu Thr Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asn Ser Leu Gly Gln Pro
385 390 395 400
gtt ttc tac cag gca tca tat tct tgg gat acg atg att aaa tta ggc 1248
Val Phe Tyr Gln Ala Ser Tyr Ser Trp Asp Thr Met Ile Lys Leu Gly
405 410 415
gat gtt gat acc gtt gac cct cta aga gta cag tgg aga aat aac agt 1296
Asp Val Asp Thr Val Asp Pro Leu Arg Val Gln Trp Arg Asn Asn Ser
420 425 430
gtg att tct aga cct gga cag tca cag tgt cct cga ttt aat gtc tgt 1344
Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe Asn Val Cys
435 440 445
ccc gag gta tgc tgg gaa ggg aca tat aat gat gct ttt cta ata gac 1392
Pro Glu Val Cys Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Asp Ala Phe Leu Ile Asp
450 455 460
cgg cta aac tgg gtt agt gct ggt gtt tat tta aac agt aac caa act 1440
Arg Leu Asn Trp Val Ser Ala Gly Val Tyr Leu Asn Ser Asn Gln Thr
465 470 475 480
gca gag aac cct gtg ttt gcc gta ttc aag gat aac gag atc ctt tac 1488
Ala Glu Asn Pro Val Phe Ala Val Phe Lys Asp Asn Glu Ile Leu Tyr
485 490 495
caa gtt cca ctg gct gaa gat gac aca aat gca caa aaa acc atc aca 1536
Gln Val Pro Leu Ala Glu Asp Asp Thr Asn Ala Gln Lys Thr Ile Thr
500 505 510
gat tgc ttc ttg ctg gag aat gtc ata tgg tgt ata tca cta gta gaa 1584
Asp Cys Phe Leu Leu Glu Asn Val Ile Trp Cys Ile Ser Leu Val Glu
515 520 525
ata tac gat aca gga gac agt gtg ata agg cca aaa cta ttt gca gtc 1632
Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Ser Val Ile Arg Pro Lys Leu Phe Ala Val
530 535 540
aag ata cct gcc caa tgt tca gag agt tga 1662
Lys Ile Pro Ala Gln Cys Ser Glu Ser
545 550
<210> 15
<211> 553
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 15
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Thr Arg Thr Thr Asp Asn Gln Ala Leu Ile
20 25 30
Lys Glu Ser Leu Gln Ser Val Gln Gln Gln Ile Lys Ala Leu Thr Asp
35 40 45
Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile Asp Thr Ser
50 55 60
Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly Ser Lys Ile
65 70 75 80
Ser Gln Ser Thr Ser Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Asp Lys Cys Lys
85 90 95
Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile Ser Cys Pro
100 105 110
Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Ile Ser Gln Gly Val Ser
115 120 125
Asp Leu Val Gly Leu Pro Asn Gln Ile Cys Leu Gln Lys Thr Thr Ser
130 135 140
Thr Ile Leu Lys Pro Arg Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro Ile Asn Thr
145 150 155 160
Arg Glu Gly Val Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Val Asp Asn Gly
165 170 175
Phe Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Lys Ile Gly Ser Cys Thr Arg Gly
180 185 190
Ile Ala Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp Arg Gly
195 200 205
Asp Lys Val Pro Ser Met Phe Met Thr Asn Val Trp Thr Pro Pro Asn
210 215 220
Pro Ser Thr Ile His His Cys Ser Ser Thr Tyr His Glu Asp Phe Tyr
225 230 235 240
Tyr Thr Leu Cys Ala Val Ser His Val Gly Asp Pro Ile Leu Asn Ser
245 250 255
Thr Ser Trp Thr Glu Ser Leu Ser Leu Ile Arg Leu Ala Val Arg Pro
260 265 270
Lys Ser Asp Ser Gly Asp Tyr Asn Gln Lys Tyr Ile Ala Ile Thr Lys
275 280 285
Val Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro Ser Gly
290 295 300
Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe Leu Pro
305 310 315 320
Arg Thr Glu Phe Gln Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile Ile His Cys
325 330 335
Lys Tyr Ser Lys Ala Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly Val Asn Ser
340 345 350
Lys Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr Asn Leu Ser
355 360 365
Leu Gly Gly Asp Ile Ile Leu Gln Phe Ile Glu Ile Ala Asp Asn Arg
370 375 380
Leu Thr Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asn Ser Leu Gly Gln Pro
385 390 395 400
Val Phe Tyr Gln Ala Ser Tyr Ser Trp Asp Thr Met Ile Lys Leu Gly
405 410 415
Asp Val Asp Thr Val Asp Pro Leu Arg Val Gln Trp Arg Asn Asn Ser
420 425 430
Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe Asn Val Cys
435 440 445
Pro Glu Val Cys Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Asp Ala Phe Leu Ile Asp
450 455 460
Arg Leu Asn Trp Val Ser Ala Gly Val Tyr Leu Asn Ser Asn Gln Thr
465 470 475 480
Ala Glu Asn Pro Val Phe Ala Val Phe Lys Asp Asn Glu Ile Leu Tyr
485 490 495
Gln Val Pro Leu Ala Glu Asp Asp Thr Asn Ala Gln Lys Thr Ile Thr
500 505 510
Asp Cys Phe Leu Leu Glu Asn Val Ile Trp Cys Ile Ser Leu Val Glu
515 520 525
Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Ser Val Ile Arg Pro Lys Leu Phe Ala Val
530 535 540
Lys Ile Pro Ala Gln Cys Ser Glu Ser
545 550
<210> 16
<211> 1662
<212> ДНК
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Млекопитающее – Кодон, оптимизированный вирусом Hendra sG
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1662)
<400> 16
atg gaa acc gac acc ctg ctg ctg tgg gtg ctg ctc ctg tgg gtc ccc 48
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
ggc agc aca ggc gac tac acc cgg acc acc gac aac cag gcc ctg atc 96
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Thr Arg Thr Thr Asp Asn Gln Ala Leu Ile
20 25 30
aaa gag tcc ctg cag agc gtc cag cag cag atc aag gcc ctg acc gac 144
Lys Glu Ser Leu Gln Ser Val Gln Gln Gln Ile Lys Ala Leu Thr Asp
35 40 45
aag atc ggc acc gag atc ggc ccc aaa gtg tcc ctg atc gac acc agc 192
Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile Asp Thr Ser
50 55 60
agc acc atc acc atc ccc gcc aac atc ggg ctg ctg ggc tcc aag atc 240
Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly Ser Lys Ile
65 70 75 80
agc cag agc acc agc tcc atc aac gag aac gtg aac gac aag tgc aag 288
Ser Gln Ser Thr Ser Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Asp Lys Cys Lys
85 90 95
ttc acc ctg ccc ccc ctg aag atc cac gag tgc aac atc agc tgc ccc 336
Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile Ser Cys Pro
100 105 110
aac ccc ctg ccc ttc cgg gag tac cgg ccc atc agc cag ggc gtg agc 384
Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Ile Ser Gln Gly Val Ser
115 120 125
gac ctg gtg ggc ctg ccc aac cag atc tgc ctg cag aaa acc acc tcc 432
Asp Leu Val Gly Leu Pro Asn Gln Ile Cys Leu Gln Lys Thr Thr Ser
130 135 140
acc atc ctg aag ccc cgg ctg atc agc tac acc ctg ccc atc aac acc 480
Thr Ile Leu Lys Pro Arg Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro Ile Asn Thr
145 150 155 160
cgg gag ggc gtg tgc atc acc gac cct ctg ctg gcc gtg gac aac ggc 528
Arg Glu Gly Val Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Val Asp Asn Gly
165 170 175
ttc ttc gcc tac agc cac ctg gaa aag atc ggc agc tgc acc cgg ggc 576
Phe Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Lys Ile Gly Ser Cys Thr Arg Gly
180 185 190
att gcc aag cag cgg atc atc ggc gtg ggc gag gtg ctg gac cgg ggc 624
Ile Ala Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp Arg Gly
195 200 205
gac aag gtg ccc agc atg ttc atg acc aac gtg tgg acc ccc ccc aac 672
Asp Lys Val Pro Ser Met Phe Met Thr Asn Val Trp Thr Pro Pro Asn
210 215 220
ccc agc aca atc cac cac tgc agc agc acc tac cac gag gac ttc tac 720
Pro Ser Thr Ile His His Cys Ser Ser Thr Tyr His Glu Asp Phe Tyr
225 230 235 240
tac acc ctg tgc gcc gtg agc cac gtg ggc gac ccc atc ctg aac agc 768
Tyr Thr Leu Cys Ala Val Ser His Val Gly Asp Pro Ile Leu Asn Ser
245 250 255
acc agc tgg acc gag agc ctg agc ctg atc cgg ctg gcc gtg cgg ccc 816
Thr Ser Trp Thr Glu Ser Leu Ser Leu Ile Arg Leu Ala Val Arg Pro
260 265 270
aag agc gac agc ggc gac tac aac cag aag tat atc gcc atc acc aag 864
Lys Ser Asp Ser Gly Asp Tyr Asn Gln Lys Tyr Ile Ala Ile Thr Lys
275 280 285
gtg gag cgg ggc aag tac gac aaa gtg atg ccc tac ggc ccc agc ggc 912
Val Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro Ser Gly
290 295 300
atc aag cag ggc gac aca ctg tac ttc ccc gcc gtg ggc ttc ctg ccc 960
Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe Leu Pro
305 310 315 320
cgg acc gag ttc cag tac aac gac agc aac tgc ccc atc atc cac tgc 1008
Arg Thr Glu Phe Gln Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile Ile His Cys
325 330 335
aag tac agc aag gcc gag aac tgc aga ctg agc atg ggc gtg aac agc 1056
Lys Tyr Ser Lys Ala Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly Val Asn Ser
340 345 350
aag agc cac tac atc ctg cgg agc ggc ctg ctg aag tac aac ctg tcc 1104
Lys Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr Asn Leu Ser
355 360 365
ctg ggc ggc gac atc atc ctg cag ttc atc gag atc gcc gac aac cgg 1152
Leu Gly Gly Asp Ile Ile Leu Gln Phe Ile Glu Ile Ala Asp Asn Arg
370 375 380
ctg acc atc ggc agc ccc agc aag atc tac aac agc ctg ggc cag ccc 1200
Leu Thr Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asn Ser Leu Gly Gln Pro
385 390 395 400
gtg ttc tac cag gcc agc tac agc tgg gac acc atg atc aag ctg ggg 1248
Val Phe Tyr Gln Ala Ser Tyr Ser Trp Asp Thr Met Ile Lys Leu Gly
405 410 415
gac gtg gac acc gtg gac ccc ctg cgg gtg cag tgg cgg aac aac agc 1296
Asp Val Asp Thr Val Asp Pro Leu Arg Val Gln Trp Arg Asn Asn Ser
420 425 430
gtg atc agc aga ccc ggc cag agc cag tgc ccc cgg ttc aac gtg tgc 1344
Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe Asn Val Cys
435 440 445
ccc gaa gtg tgc tgg gag ggc acc tac aac gac gcc ttt ctg atc gac 1392
Pro Glu Val Cys Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Asp Ala Phe Leu Ile Asp
450 455 460
cgg ctg aac tgg gtg tcc gcc gga gtg tac ctg aac tcc aac cag acc 1440
Arg Leu Asn Trp Val Ser Ala Gly Val Tyr Leu Asn Ser Asn Gln Thr
465 470 475 480
gcc gag aac ccc gtg ttc gcc gtg ttc aag gac aac gag atc ctg tac 1488
Ala Glu Asn Pro Val Phe Ala Val Phe Lys Asp Asn Glu Ile Leu Tyr
485 490 495
cag gtg ccc ctg gcc gag gac gac acc aac gcc cag aaa acc atc acc 1536
Gln Val Pro Leu Ala Glu Asp Asp Thr Asn Ala Gln Lys Thr Ile Thr
500 505 510
gac tgc ttt ctg ctg gaa aac gtg atc tgg tgc atc agc ctg gtg gag 1584
Asp Cys Phe Leu Leu Glu Asn Val Ile Trp Cys Ile Ser Leu Val Glu
515 520 525
atc tac gac acc ggc gac tcc gtg atc cgg ccc aag ctg ttt gcc gtg 1632
Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Ser Val Ile Arg Pro Lys Leu Phe Ala Val
530 535 540
aag atc ccc gcc cag tgc agc gag agc tga 1662
Lys Ile Pro Ala Gln Cys Ser Glu Ser
545 550
<210> 17
<211> 553
<212> PRT
<213> Искусственная последовательность
<220>
<223> Синтетическая конструкция
<400> 17
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Asp Tyr Thr Arg Thr Thr Asp Asn Gln Ala Leu Ile
20 25 30
Lys Glu Ser Leu Gln Ser Val Gln Gln Gln Ile Lys Ala Leu Thr Asp
35 40 45
Lys Ile Gly Thr Glu Ile Gly Pro Lys Val Ser Leu Ile Asp Thr Ser
50 55 60
Ser Thr Ile Thr Ile Pro Ala Asn Ile Gly Leu Leu Gly Ser Lys Ile
65 70 75 80
Ser Gln Ser Thr Ser Ser Ile Asn Glu Asn Val Asn Asp Lys Cys Lys
85 90 95
Phe Thr Leu Pro Pro Leu Lys Ile His Glu Cys Asn Ile Ser Cys Pro
100 105 110
Asn Pro Leu Pro Phe Arg Glu Tyr Arg Pro Ile Ser Gln Gly Val Ser
115 120 125
Asp Leu Val Gly Leu Pro Asn Gln Ile Cys Leu Gln Lys Thr Thr Ser
130 135 140
Thr Ile Leu Lys Pro Arg Leu Ile Ser Tyr Thr Leu Pro Ile Asn Thr
145 150 155 160
Arg Glu Gly Val Cys Ile Thr Asp Pro Leu Leu Ala Val Asp Asn Gly
165 170 175
Phe Phe Ala Tyr Ser His Leu Glu Lys Ile Gly Ser Cys Thr Arg Gly
180 185 190
Ile Ala Lys Gln Arg Ile Ile Gly Val Gly Glu Val Leu Asp Arg Gly
195 200 205
Asp Lys Val Pro Ser Met Phe Met Thr Asn Val Trp Thr Pro Pro Asn
210 215 220
Pro Ser Thr Ile His His Cys Ser Ser Thr Tyr His Glu Asp Phe Tyr
225 230 235 240
Tyr Thr Leu Cys Ala Val Ser His Val Gly Asp Pro Ile Leu Asn Ser
245 250 255
Thr Ser Trp Thr Glu Ser Leu Ser Leu Ile Arg Leu Ala Val Arg Pro
260 265 270
Lys Ser Asp Ser Gly Asp Tyr Asn Gln Lys Tyr Ile Ala Ile Thr Lys
275 280 285
Val Glu Arg Gly Lys Tyr Asp Lys Val Met Pro Tyr Gly Pro Ser Gly
290 295 300
Ile Lys Gln Gly Asp Thr Leu Tyr Phe Pro Ala Val Gly Phe Leu Pro
305 310 315 320
Arg Thr Glu Phe Gln Tyr Asn Asp Ser Asn Cys Pro Ile Ile His Cys
325 330 335
Lys Tyr Ser Lys Ala Glu Asn Cys Arg Leu Ser Met Gly Val Asn Ser
340 345 350
Lys Ser His Tyr Ile Leu Arg Ser Gly Leu Leu Lys Tyr Asn Leu Ser
355 360 365
Leu Gly Gly Asp Ile Ile Leu Gln Phe Ile Glu Ile Ala Asp Asn Arg
370 375 380
Leu Thr Ile Gly Ser Pro Ser Lys Ile Tyr Asn Ser Leu Gly Gln Pro
385 390 395 400
Val Phe Tyr Gln Ala Ser Tyr Ser Trp Asp Thr Met Ile Lys Leu Gly
405 410 415
Asp Val Asp Thr Val Asp Pro Leu Arg Val Gln Trp Arg Asn Asn Ser
420 425 430
Val Ile Ser Arg Pro Gly Gln Ser Gln Cys Pro Arg Phe Asn Val Cys
435 440 445
Pro Glu Val Cys Trp Glu Gly Thr Tyr Asn Asp Ala Phe Leu Ile Asp
450 455 460
Arg Leu Asn Trp Val Ser Ala Gly Val Tyr Leu Asn Ser Asn Gln Thr
465 470 475 480
Ala Glu Asn Pro Val Phe Ala Val Phe Lys Asp Asn Glu Ile Leu Tyr
485 490 495
Gln Val Pro Leu Ala Glu Asp Asp Thr Asn Ala Gln Lys Thr Ile Thr
500 505 510
Asp Cys Phe Leu Leu Glu Asn Val Ile Trp Cys Ile Ser Leu Val Glu
515 520 525
Ile Tyr Asp Thr Gly Asp Ser Val Ile Arg Pro Lys Leu Phe Ala Val
530 535 540
Lys Ile Pro Ala Gln Cys Ser Glu Ser
545 550
<---
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| Вакцина против герпеса | 2019 |
|
RU2731073C1 |
| КОНСТРУКЦИИ НУКЛЕИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ВЕКТОРЫ ДЛЯ ГЕНОТЕРАПИИ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ БОЛЕЗНИ ВИЛЬСОНА И ДРУГИХ СОСТОЯНИЙ | 2015 |
|
RU2745567C2 |
| БИОСЕНСОРНАЯ СИСТЕМА ДЛЯ БЫСТРОГО ОБНАРУЖЕНИЯ ОПРЕДЕЛЯЕМЫХ КОМПОНЕНТОВ | 2016 |
|
RU2717658C2 |
| МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РЕСПИРАТОРНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ У СОБАК | 2020 |
|
RU2811752C2 |
| КОМПОЗИЦИИ И СПОСОБЫ ДЛЯ БИОЛОГИЧЕСКОГО ПОЛУЧЕНИЯ ЛАКТАТА ИЗ С1-СОЕДИНЕНИЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ ТРАНСФОРМАНТОВ ЛАКТАТ ДЕГИДРОГЕНАЗЫ | 2014 |
|
RU2710714C2 |
| СПОСОБ ПРОДУЦИРОВАНИЯ ПОЧЕЧНЫХ КЛЕТОК-ПРЕДШЕСТВЕННИКОВ | 2016 |
|
RU2730861C2 |
| ВИРУС ГРИППА, СПОСОБНЫЙ ИНФИЦИРОВАТЬ СОБАЧЬИХ, И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ | 2020 |
|
RU2802222C2 |
| ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ И/ИЛИ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ЗЛОКАЧЕСТВЕННОЙ ОПУХОЛИ | 2016 |
|
RU2714205C2 |
| СПОСОБ УПРАВЛЕНИЯ РИТМОМ СЕРДЦА И СОКРАЩЕНИЕМ ОТДЕЛЬНЫХ КАРДИОМИОЦИТОВ ПРИ ПОМОЩИ ТЕРМОГЕНЕТИКИ | 2022 |
|
RU2802995C1 |
| ИММУНОИНДУЦИРУЮЩЕЕ СРЕДСТВО | 2016 |
|
RU2744843C2 |
Группа изобретений относится к области медицины, а именно к ветеринарии, иммунологии и инфектологии, и предназначена для предотвращения инфекции, вызванной вирусом Hendra и/или Nipah, у лошади или свиньи. Вакцина содержит 50-100 мкг растворимого фрагмента гликопротеина G вируса Nipah, состоящего из аминокислот 71-602 SEQ ID NO: 4 или последовательности, по меньшей мере на 95% ей идентичной, а также иммуностимулирующий комплекс и один или более эксципиентов. Кроме того, представлен способ предотвращения инфекции, вызванной вирусом Hendra и/или Nipah, у лошади или свиньи, включающий введение первой дозы и второй дозы указанной вакцины. Использование группы изобретений обеспечивает эффективное предотвращение инфекции, вызванной вирусом Hendra и/или Nipah, у лошади или свиньи. 2 н. и 7 з.п. ф-лы, 6 ил., 9 табл., 8 пр.
1. Вакцина для предотвращения инфекции, вызванной вирусом Hendra и/или Nipah, у лошади или свиньи, содержащая
а. 50-100 мкг растворимого фрагмента гликопротеина G вируса Nipah, при этом указанный фрагмент состоит из аминокислот 71-602 SEQ ID NO: 4 или последовательности, по меньшей мере на 95% ей идентичной,
b. иммуностимулирующий комплекс (ISC), при этом ISC содержит сапонин, фосфолипид, выбранный из группы, состоящей из фосфатидилхолина (PC), дипальмитоилфосфатидилхолина (DPPC), фосфатидиновой кислоты (фосфатидат) (PA), фосфатидилэтаноламина (PE), фосфатидилсерина (PS), фосфатидилинозита (PI), фосфатидилинозитфосфата (PIP), фосфатидилинозитбисфосфата (PIP2), фосфатидилинозиттрифосфата (PIP3), фосфорилхолина (SPH), церамидфосфорилэтаноламина (Cer-PE) и церамидфосфорилглицерина, и холестерин, и
с. один или более эксципиентов.
2. Вакцина по п. 1, где вакцина содержит 100 мкг указанного растворимого фрагмента гликопротеина G вируса Nipah.
3. Вакцина по п. 1 или 2, где растворимый гликопротеин G вируса Nipah присутствует в димерной форме.
4. Вакцина по п. 1 или 2, где растворимый гликопротеин G вируса Nipah присутствует в форме тетрамера.
5. Вакцина по любому из пп. 1-4, где вакцина содержит 250 мкг ISC.
6. Вакцина по любому из пп. 1-5, где указанный сапонин представляет собой Quil A, и указанный фосфолипид представляет собой DPPC.
7. Вакцина по п. 6, где отношение Quil A:DPPC:холестерин в композиции составляет 5:1:1 по массе.
8. Способ предотвращения инфекции, вызванной вирусом Hendra и/или Nipah, у лошади или свиньи, включающий введение первой дозы и второй дозы вакцины по любому из пп. 1-7.
9. Способ по п. 8, где вторую дозу вводят через около 21-28 дней после первой дозы.
| US 2009041772 A1, 12.02.2009 | |||
| US 2002081329 A1, 27.06.2002 | |||
| WO 2006115548 A2, 02.11.2006 | |||
| MUNGALL BA et al | |||
| Feline model of acute nipah virus infection and protection with a soluble glycoprotein-based subunit vaccine | |||
| J Virol, 2006 Dec; 80(24): 12293-12302 | |||
| WANG CY et al | |||
| Synthetic peptide-based vaccine and diagnostic system for effective control |
