ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

Перечень последовательностей, связанных с настоящей заявкой, представлен в текстовом формате и, таким образом, включается в настоящее описание посредством ссылки. Файл, содержащий перечень последовательностей, называется SL_1541-14.txt. Текстовый файл, созданный 17 марта 2020, имеет размер примерно 66 килобайт и представляется в электронном виде.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии, и может быть использовано для лечения опухолевых заболеваний.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

В последние годы появился ряд значительных достижений в лечении рака, которые предлагают многообещающие решения для ранее неизлечимых заболеваний. Однако, некоторые виды рака, такие как гепатоцеллюлярная карцинома (ГЦК), остаются мало восприимчивыми к текущей терапии. Функциональная активность даже поврежденной печени и отсутствие явных патологических симптомов ГЦК осложняют ее раннюю диагностику (Bialecki E.S., Di Bisceglie A.M. Diagnosis of hepatocellular carcinoma // HPB. 2005. V.7, pp.26-34), что приводит к большому числу неоперабельных пациентов. Кроме того, у многих пациентов развивается резистентность к сорафенибу, еще недавно единственному препарату для терапии ГЦК. В последние годы для лечения ГЦК был одобрен регорафениб - множественный ингибитор киназ, а также два различных ингибитора контрольных точек (вторая линия лечения после появления резистентности к сорафенибу) (Personeni N., Pressiani T., Santoro A., Rimassa L. Regorafenib in hepatocellular carcinoma: latest evidence and clinical implications // Drugs Context. 2018. V.7, p.212533).

На сегодняшний день широко применяются следующие основные средства и способы терапии ГЦК:

1. Низкомолекулярные киназные ингибиторы, подавляющие как внутриклеточные киназы (серин/треонинкиназы c-CRAF, BRAF), так и расположенные на поверхности клеток рецепторные тирозинкиназы (Сорафениб, Сунитиниб, Орантиниб, Бриваниб, Линифаниб, Регорафениб).

2. Ингибиторы контрольных точек иммунного ответа (антитела к PD-1, PD-L1, CTLA-4, например, Ниволумаб, Пембролизумаб).

3. Радиоэмболизация иттрием-90 (⁹⁰Y).

4. Антитела, селективно ингибирующие VEGFR2 (например, Рамуцирумаб).

5. Трансплантация печени или резекция части печени.

Несмотря на некоторые успехи при применении перечисленных подходов, они обладают рядом значительных недостатков, включая резистентность к лечению, недостаточную эффективность и профиль безопасности. Кроме того, медиана выживаемости для неоперабельных пациентов с ГЦК, подвергающихся одному или нескольким из перечисленных выше видов терапии, все еще остается крайне низкой, составляя от 6 до 8 месяцев.

Таким образом, существующие известные средства и способы лечения гепатоцеллюлярной карциномы на сегодняшний день весьма ограничены и малоэффективны. В связи с этим существует необходимость разработки новых лекарственных препаратов и способов терапии.

Терапия с применением малых интерферирующих РНК (миРНК)

РНК-интерференция - это селективное посттранскрипционное подавление экспрессии генов, опосредованное малыми интерферирующими РНК (миРНК, siRNA) в клетках эукариот. Полагают, что этот процесс посттранскрипционного сайленсинга генов является эволюционно консервативным механизмом защиты клеток, используемым для предотвращения экспрессии чужеродных генов. Достижения молекулярной биологии и генной инженерии позволяют синтезировать миРНК, направленные против любой РНК с любой нуклеотидной последовательностью. В настоящее время ряд конструкций миРНК продемонстрировал способность специфично подавлять экспрессию генов в моделях как in vitro, так и in vivo. Часть из этих миРНК проходит оценку в клинических исследованиях, а два препарата одобрены для применения в клинике в США и Евросоюзе. При этом, РНК-интерференцию считают многообещающим способом для лечения опухолей, например, путем выключения генов, характеризующихся повышенной экспрессией в трансформированных клетках, либо генов, принимающих участие в делении клетки. Кроме того, на сегодняшний день важным направлением исследований в области РНК-интерференции для клинического применения является разработка способов безопасной и эффективной доставки малых РНК (Haussecker D. Current issues of RNAi therapeutics delivery and development // Journal of Controlled Release. 2014. V.195, pp.49-54; Mansoori B. et al. RNA Interference and its role in cancer therapy // Adv. Pharm. Bull. 2014. V4(4), pp.313-321).

Недавние разработки на основе РНК-терапии для лечения наследственных и метаболических заболеваний печени привели к созданию эффективных пролонгированных препаратов, которые превосходят низкомолекулярные соединения и антитела (Hu B., Weng Y., Xia X.H., Liang X.J., Huang Y. Clinical advances of siRNA therapeutics // J. Gene Med. 2019. V.21, p.e3097). Однако, РНК после внутривенной или подкожной инъекции быстро выводится почками, что приводит к низкой эффективности доставки в ткани и органы, поэтому существует потребность в разработке новых эффективных систем для адресной доставки миРНК в клетки.

Среди известных систем доставки миРНК следует выделить стабильные липидные наночастицы (ЛНЧ), обеспечивающие эффективную доставку в клетки печени in vivo, что было продемонстрировано при проведении клинических исследований (Tatiparti K., Sau S., Kashaw S.K., Iyer A.K. siRNA delivery strategies: a comprehensive review of recent developments // Nanomaterials (Basel). 2017. V.7, p.77; Zatsepin T.S., Kotelevtsev Y.V., Koteliansky V. Lipid nanoparticles for targeted siRNA delivery - going from bench to bedside // Int. J. Nanomedicine. 2016. V.11, pp.3077-3086; Cullis P.R., Hope M.J. Lipid nanoparticle systems for enabling gene therapies // Mol. Ther. 2017. V.25, pp.1467-1475). Во время циркуляции в кровотоке поверхность ЛНЧ покрывается белками, включая аполипопротеины, которые обеспечивают специфическую рецептор-опосредованную доставку ЛНЧ в гепатоциты (Chen D., Parayath N., Ganesh S., Wang W., Amiji M. The role of apolipoprotein- and vitronectin-enriched protein corona on lipid nanoparticles for in vivo targeted delivery and transfection of oligonucleotides in murine tumor models // Nanoscale. 2019. V.11, pp.18806-18824). Оптимизация композиций липидных наночастиц, содержащих миРНК, для адресной доставки в печень (Kulkarni J.A., Witzigmann D., Chen S., Cullis P.R., van der Meel R. Lipid nanoparticle technology for clinical translation of siRNA therapeutics // Acc. Chem. Res. 2019. V.52, pp.2435-2444) позволила разработать лекарственное средство для транстиретин-опосредованной наследственной амилоидной полинейропатии, одобренное управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) в 2018 году (Adams D., Gonzalez-Duarte A., O'Riordan W.D., Yang C.C., Ueda M., Kristen A.V., Tournev I., Schmidt H.H., Coelho T., Berk J.L., et al. Patisiran, an RNAi therapeutic, for hereditary transthyretin amyloidosis // N. Engl. J. Med. 2018. V.379, pp.11-21). Эта технология также может применяться для подавления любых молекулярных путей в трансформированных клетках, в том числе в клетках гепатоцеллюлярной карциномы.

Протеолитический путь Arg/N-дегрона

В последние годы появились данные, свидетельствующие о том, что протеолитический путь Arg/N-дегрона участвует в процессах связанных с развитием онкологических заболеваний (Brower C.S., Piatkov K.I., Varshavsky A. Neurodegeneration-associated protein fragments as short-lived substrates of the N-end rule pathway // Mol. Cell. 2013. V.50, pp.161-171; Shearer R.F., Iconomou M., Watts C.K., Saunders D.N. Functional roles of the E3 ubiquitin ligase UBR5 in cancer // Mol. Cancer Res. 2015. V.13, pp.1523-1532; Mao J., Liang Z., Zhang B., Yang H., Li X., Fu H., Zhang X., Yan Y., Xu W., Qian H. UBR2 enriched in p53 deficient mouse bone marrow mesenchymal stem cell-exosome promoted gastric cancer progression via Wnt/b-catenin pathway // Stem Cells. 2017. V.35, pp.2267-2279). Регулируя деградацию специфических белков, путь Arg/N-дегрона (ранее известный, как путь Arg/правила N-конца) влияет на большое количество биологических функций (Varshavsky A. N-degron and C-degron pathways of protein degradation // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2019. V.116, pp.358-366; Varshavsky A. The N-end rule pathway and regulation by proteolysis // Protein Sci. 2011. V.20, pp.1298-1345). Недавние исследования выявили основные анти-апоптотические функции пути Arg/N-дегрона - благодаря своей способности избирательно разрушать специфические про-апоптотические фрагменты белков, включая Asp-BRCA1, Arg-BIMEL, Cys-TRAF1 и CysRIPK1 (Piatkov K.I., Brower C.S., Varshavsky A. The N-end rule pathway counteracts cell death by destroying proapoptotic protein fragments // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2012. V.109, pp.E1839-E1847; Xu Z., Payoe R., Fahlman R.P. The C-terminal proteolytic fragment of the breast cancer susceptibility type 1 protein (BRCA1) is degraded by the N-end rule pathway // J. Biol. Chem. 2012. V.287, pp.7495-7502). Поскольку апоптоз имеет решающее значение для удаления ненужных или поврежденных клеток, то блокирование внутриклеточных апоптотических путей важно для выживания раковых клеток. И наоборот, стимулирование гибели клеток является основным подходом к лечению большинства видов рака. Анти-апоптотическое действие пути Arg/N-дегрона позволяет предположить, что его активация может подавлять апоптоз и, тем самым, оказывать влияние на прогрессирование опухолевого заболевания.

Действительно, недавние исследования показали, что внутриклеточный уровень UBR5 (EDD), одной из ключевых убиквитин лигаз этого пути, часто увеличен при карциномах печени, легких и яичников, что также подтверждает возможность уменьшения выживаемости раковых клеток при ингибировании UBR5 (O'Brien P.M., Davies M.J., Scurry J.P., Smith A.N., Barton C.A., Henderson M.J., Saunders D.N., Gloss B.S., Patterson K.I., Clancy J.L., et al. The E3 ubiquitin ligase EDD is an adverse prognostic factor for serous epithelial ovarian cancer and modulates cisplatin resistance in vitro // Br. J. Cancer. 2008. V.98, pp.1085-1093).

Было показано, что другая убиквитин лигаза пути Arg/N-дегрона, UBR2, активируется в опухолях в ответ на кахектические стимулы, включая про-воспалительные цитокины (Zhang G., Lin R.K., Kwon Y.T., Li Y.P. Signaling mechanism of tumor cell-induced up-regulation of E3 ubiquitin ligase UBR2 // FASEB J. 2013. V.27, pp.2893-2901).

Наконец, генетические исследования с удалением генов отдельных Ubr-убиквитиновых лигаз в модельных организмах указывают на то, что этот путь положительно влияет на рост сосудов и подвижность клеток (Kwon Y.T., Kashina A.S., Davydov I.V., Hu R.-G., An J.Y., Seo J.W., Du F., Varshavsky A. An essential role of N-terminal arginylation in cardiovascular development // Science. 2002. V.297, pp.96-99; Kashina A. Protein arginylation, a global biological regulator that targets actin cytoskeleton and the muscle // Anat. Rec. (Hoboken). 2014. V.297, pp.1630-1636; An J.Y., Seo J.W., Tasaki T., Lee M.J., Varshavsky A., Kwon Y.T. Impaired neurogenesis and cardiovascular development in mice lacking the E3 ubiquitin ligases UBR1 and UBR2 of the N-end rule pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2006. V.103, pp.6212-6217).

Эти и другие данные подтверждают, что путь Arg/N-дегрона играет важную роль в положительной регуляции пролиферации, подвижности и выживаемости раковых клеток. Следовательно, ингибирование этого пути может являться потенциально эффективным подходом для лечения рака.

Компоненты пути Arg/N-дегрона представляют собой специфические убиквитин лигазы Е3 (N-рекогнины), которые могут узнавать дестабилизирующие N-концевые аминокислоты, называемые N-дегронами (Varshavsky A. The N-end rule pathway and regulation by proteolysis // Protein Sci. 2011. V.20, pp.1298-1345; Sriram S.M., Kwon Y.T. The molecular principles of N-end rule recognition // Nat. Struct. Mol. Biol. 2010. V.17, pp.1164-1165; Tasaki T., Zakrzewska A., Dudgeon D.D., Jiang Y., Lazo J.S., Kwon Y.T. The substrate recognition domains of the N-end rule pathway // J. Biol. Chem. 2009. V.284, pp.1884-1895). У человека и мыши есть четыре известных белка пути N-дегрона, UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5, которые являются функционально избыточными (Hwang C.S., Sukalo M., Batygin O., Addor M.C., Brunner H., Aytes A.P., Mayerle J., Song H.K., Varshavsky A., Zenker M. Ubiquitin ligases of the N-end rule pathway: assessment of mutations in UBR1 that cause the Johanson-Blizzard syndrome // PLoS One. 2011. V.6, p.e24925; Kwon Y.T., Xia Z., Davydov I.V., Lecker S.H., Varshavsky A. Construction and analysis of mouse strains lacking the ubiquitin ligase UBR1 (E3alpha) of the N-end rule pathway // Mol. Cell. Biol. 2001. V.21, pp.8007-8021; Sultana R., Theodoraki M.A., Caplan A.J. Specificity in the actions of the UBR1 ubiquitin ligase in the degradation of nuclear receptors // FEBS Open Bio. 2013. V.3, pp.394-397; Tasaki T., Mulder L.C.F., Iwamatsu A., Lee M.J., Davydov I.V., Varshavsky A., Muesing M., Kwon Y.T. A family of mammalian E3 ubiquitin ligases that contain the UBR box motif and recognize N-degrons // Mol. Cell. Biol. 2005. V.25, pp.7120-7136) и важны для раннего эмбрионального развития (Kwon Y.T. et al. Female lethality and apoptosis of spermatocytes in mice lacking the UBR2 ubiquitin ligase of the N-end rule pathway // Mol. Cell. Biol. 2003. V.23, pp.8255-8271; Saunders D.N. et al. Edd, the murine hyperplastic disc gene, is essential for yolk sac vascularization and chorioallantoic fusion // Mol. Cell. Biol. 2004. V.24, pp.7225-7234; Tasaki T. et al. UBR box N-recognin-4 (UBR4), an N-recognin of the N-end rule pathway, and its role in yolk sac vascular development and autophagy // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2013. V.110, pp.3800-3805). Эти белки структурно отличаются и принадлежат к разным семействам убиквитин лигаз, поэтому разработка универсального низкомолекулярного ингибитора для всех четырех белков чрезвычайно сложна, если вообще возможна (Choi W.S. et al. Structural basis for the recognition of N-end rule substrates by the UBR box of ubiquitin ligases // Nat. Struct. Mol. Biol. 2010. V.17, pp.1175-1181; Kitamura K. Inhibition of the Arg/N-end rule pathway-mediated proteolysis by dipeptide-mimetic molecules // Amino Acids. 2016. V.48, pp.235-243; Lee M.J. et al. Synthetic heterovalent inhibitors targeting recognition E3 components of the N-end rule pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V.105, pp.100-105; Matta-Camacho E. et al. Structural basis of substrate recognition and specificity in the N-end rule pathway // Nat. Struct. Mol. Biol. 2010. V.17, pp.1182-1187; Sriram S. et al. Development and characterization of monomeric N-end rule inhibitors through in vitro model substrates // J. Med. Chem. 2013. V.56, pp.2540-2546).

Для регулирования пути N-дегрона малыми молекулами были предложены дипептиды, а также гетеровалентные лиганды, которые имитируют N-дегроны и конкурентно связываются с убиквитин лигазами, предотвращая взаимодействие с их естественными субстратами (Kitamura K. Inhibition of the Arg/N-end rule pathway-mediated proteolysis by dipeptide-mimetic molecules // Amino Acids. 2016. V.48, pp.235-243; Lee M.J. et al. Synthetic heterovalent inhibitors targeting recognition E3 components of the N-end rule pathway // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2008. V.105, pp.100-105; Baker R.T., Varshavsky A. Inhibition of the N-end rule pathway in living cells // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. V.88, pp.1090-1094). В частности, указанные низкомолекулярные ингибиторы могут непосредственно связывать N- и UBR-домены UBR-убиквитин-лигаз (UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5).

Было также обнаружено, что другие соединения, такие как дубильная кислота и мербромин, могут специфически и эффективно подавлять активность белка ATE1 в клетке, который является критическим ферментом пути Arg/N-дегрона, действующим на этапе до E3 лигазы (Saha S. et al. Small molecule inhibitors of arginyltransferase regulate arginylation-dependent protein degradation, cell motility, and angiogenesis // Biochem. Pharmacol. 2012. V.83, pp.866-873).

миРНК также использовались для подавления индивидуальных белков пути Arg/N-дегрона in vitro, что позволило изучить роли индивидуальных белков в деградации конкретных мишеней (Rageul J. et al. Conditional degradation of SDE2 by the Arg/N-End rule pathway regulates stress response at replication forks // Nucleic Acids Res. 2019. V.47, pp.3996-4010; Cipolla L. et al. UBR5 interacts with the replication fork and protects DNA replication from DNA polymerase h toxicity // Nucleic Acids Res. 2019. V.47, pp.11268-11283; Kim S.T. et al. The N-recognin UBR4 of the N-end rule pathway is required for neurogenesis and homeostasis of cell surface proteins // PLoS ONE. 2018. V.13, p.e0202260). Однако, все эти исследования по временному или частичному ингибированию пути N-дегрона проводились только на перевиваемых клеточных линиях in vitro.

На основании вышеизложенного можно заключить, что протеолитический путь Arg/N-дегрона является новой мишенью для противоопухолевой терапии, поскольку может положительно регулировать многие процессы, сопровождающие развитие онкологических заболеваний, включая ангиогенез, пролиферацию клеток, их подвижность и выживание. Следовательно, ингибирование пути Arg/N-дегрона может стать высокоэффективным подходом для терапии ряда онкологических заболеваний.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение основано на новом подходе, использующем в качестве мишеней для терапии рака UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона, с применением клинически апробированной технологии РНК-интерференции, при этом ингибирование данного пути также может усиливать действие химиотерапевтических, цитостатических, проапоптических или таргетных препаратов, например, при лечении гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.

Указанный подход принципиально отличается от уже существующих средств и способов терапии ГЦК, поскольку обладает иным механизмом действия (РНК-интерференция), обеспечивающим подавление экспрессии целевых белков UBR-убиквитин-лигаз, относящихся к протеолитическому пути Arg/N-дегрона, что, в свою очередь, приводит к индукции спонтанного апоптоза в трансформированной клетке.

Кроме того, предложенный подход также отличается от вариантов комбинаторного лечения, применяющих миРНК в сочетании с химиотерапией или ингибиторами иммунных контрольных точек, поскольку такие комбинации, во-первых, не нацелены на путь Arg/N-дегрона, а, во-вторых, не предназначены для терапии ГЦК.

Кроме того, из уровня техники не известны специфические ингибиторы пути Arg/N-дегрона, нацеленные сразу на все четыре UBR-убиквитин-лигазы (UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5). Ранее описанные низкомолекулярные ингибиторы, нацеленные на UBR-убиквитин-лигазы, ингибируют не только N-дегроновые убиквитин-лигазы, но и любые другие убиквитин-лигазы, которые содержат UBR-домен. Следует отметить, что существует семь известных убиквитин-лигаз, содержащих UBR-домен, при этом три из них не являются частью пути Arg/N-дегрона. Кроме того, указанные низкомолекулярные ингибиторы обладают иным механизмом действия, требуют больших доз и не позволяют реализовать адресную доставку в печень.

Таким образом, с учетом существующей потребности в разработке новых препаратов, методов или оптимизации известных схем лечения ГЦК, настоящее изобретение направлено на расширение арсенала доступных терапевтических средств, а также усовершенствование способов их адресной доставки в орган-мишень, с устранением одного или более недостатков согласно предшествующему уровню техники.

Целью настоящего изобретения является создание новых средств, композиций и способов для ингибирования протеолитического пути аргинин/N-дегрона с применением технологий РНК-интерференции, для обеспечения индукции апоптоза клеток злокачественной опухоли, расширения арсенала способов и средств для лечения онкологических заболеваний, а также для повышения эффективности действия химиотерапевтических цитостатических, проапоптических или таргетных препаратов, применяющихся для терапии указанных онкологических заболеваний.

Авторы настоящего изобретения обнаружили, что ингибирование по меньшей мере трех UBR-убиквитин-лигаз пути Arg/N-дегрона (UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5) с применением молекул малых интерферирующих РНК (миРНК) обеспечивает эффективное повреждение или по меньшей мере частичное разрушение трансформированных клеток вследствие индуцированного апоптоза, а также увеличивает чувствительность указанных трансформированных клеток к действию химиотерапевтических, цитостатических, проапоптических и таргетных агентов, что в свою очередь приводит к увеличению эффективности указанных агентов, а также позволяет применять их в более низких дозах, тем самым улучшая профиль безопасности лечения и уменьшая побочные эффекты.

Согласно одному варианту реализации изобретения предложена молекула миРНК, снижающая уровень мРНК убиквитин лигаз в клетке, при этом указанная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит область комплементарности, длиной по меньшей мере 15 последовательных нуклеотидов, и отличающуюся не более чем на 3 нуклеотида от последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs. 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82.

Согласно предпочтительному варианту реализации, указанная антисмысловая цепь содержит область комплементарности, идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82.

Согласно одному варианту реализации изобретения указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона.

Согласно одному варианту реализации изобретения в предложенной молекуле миРНК по меньшей мере один нуклеотид из последовательности содержит химическую модификацию. В предпочтительном варианте реализации указанная химическая модификация выбрана из 2'-O-метилнуклеотида, 3'-межнуклеотидного тиофосфата и их комбинаций.

Согласно еще одному конкретному варианту реализации изобретения предложенная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит последовательность SEQ ID NO 14.

Согласно еще одному конкретному варианту реализации изобретения предложенная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит последовательность SEQ ID NO 40.

Согласно еще одному конкретному варианту реализации изобретения предложенная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит последовательность SEQ ID NO 56.

Согласно еще одному конкретному варианту реализации изобретения предложенная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит последовательность SEQ ID NO 70.

Согласно дополнительному варианту реализации изобретения, указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, более предпочтительно клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.

Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложена липидная наночастица, содержащая одну или более молекул миРНК согласно изобретению.

В предпочтительном варианте реализации указанная липидная наночастица содержит одну или более молекул миРНК, содержащих последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 56 и SEQ ID NO. 70.

В одном из вариантов реализации изобретения предложенная липидная наночастица имеет размер, составляющий от 60 до 140 нм. Согласно другому варианту реализации предложенная липидная наночастица характеризуется дзета-потенциалом, составляющим от -15 до +15 мВ.

Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложена фармацевтическая композиция для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложена фармацевтическая композиция для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

Согласно другому варианту реализации изобретения предложена комбинация для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и по меньшей мере один химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент. В предпочтительном варианте реализации указанный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин.

Согласно другому варианту реализации изобретения предложена комбинация для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и по меньшей мере один дополнительный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент. В предпочтительном варианте реализации указанный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин.

Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложено применение молекулы миРНК согласно изобретению для получения лекарственного средства для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта.

Согласно другому варианту реализации изобретения предложено применение молекулы миРНК согласно изобретению для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта.

Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложено применение липидной наночастицы согласно изобретению для получения лекарственного средства для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта.

Согласно другому варианту реализации изобретения предложено применение липидной наночастицы согласно изобретению для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта.

Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложено применение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта.

Согласно другому варианту реализации изобретения предложено применение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта.

Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложено применение комбинации, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и по меньшей мере один дополнительный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент, для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин.

Согласно другому варианту реализации изобретения предложено применение комбинации, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и по меньшей мере один дополнительный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент, для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин.

В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.

Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с молекулой миРНК согласно изобретению в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.

Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с липидной наночастицей согласно изобретению в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.

Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с фармацевтической композицией, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы

Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с фармацевтической композицией, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляет собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.

Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с комбинацией, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и по меньшей мере один химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент, в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляет собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы и холангиокарциномы.

Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в трансформированной клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с комбинацией, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и по меньшей мере один химиотерапевтический цитостатический, проапоптотический или таргетный агент, в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляет собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы и холангиокарциномы.

Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, включающий введение указанному субъекту терапевтически эффективного количества молекулы миРНК согласно изобретению, липидной наночастицы согласно изобретению, фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество или фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

Согласно некоторым вариантам реализации, указанное введение осуществляют посредством внутривенной инъекции. В другом варианте реализации указанное введение осуществляют в дозе, составляющей от 0,1 мг/кг до 5 мг/кг.

В другом варианте реализации указанное введение осуществляют один раз в неделю.

В еще одном варианте реализации указанное введение осуществляют два раза в неделю.

Согласно некоторым вариантам реализации, указанное введение осуществляют на протяжении периода, составляющего 4 недели.

Согласно некоторым вариантам реализации, указанное введение осуществляют на протяжении периода, составляющего не более 5 недель.

Согласно дополнительному варианту реализации, указанное введение осуществляют на протяжении периода, составляющего не более 12 недель.

Согласно некоторым вариантам реализации, указанный способ включает введение по меньшей мере одного дополнительного терапевтического агента, который может представлять собой химиотерапевтический, цитостатический, проапоптический или таргетный агент. В предпочтительном варианте реализации указанный дополнительный терапевтический агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.

Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ индукции апоптоза в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с молекулой миРНК согласно изобретению в количестве, эффективном для снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке, где указанная клетка подвергается действию химиотерапевтического, цитостатического, таргетного или проапоптического агента. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, таргетный или проапоптический агент выбирают из доксорубицина или стауроспорина. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно - клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.

Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ индукции апоптоза в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с липидной наночастицей согласно изобретению в количестве, эффективном для снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке, где указанная клетка подвергается действию химиотерапевтического, цитостатического, таргетного или проапоптического агента. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, таргетный или проапоптический агент выбирают из доксорубицина или стауроспорина. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно - клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.

Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ индукции апоптоза в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с фармацевтической композицией, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, в количестве, эффективном для снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке, где указанная клетка подвергается действию химиотерапевтического, цитостатического, таргетного или проапоптического агента. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, таргетный или проапоптический агент выбирают из доксорубицина или стауроспорина. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно - клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы

Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ индукции апоптоза в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с фармацевтической композицией, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, в количестве, эффективном для снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке, где указанная клетка подвергается действию химиотерапевтического, цитостатического, таргетного или проапоптического агента. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, таргетный или проапоптический агент выбирают из доксорубицина или стауроспорина. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно - клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1. Отбор миРНК в экспериментах in vitro и in vivo. (А) Оценка уровня мРНК в культуре клеток Hepa1-6 после трансфекции 1 нМ миРНК, специфичными к Ubr1, Ubr2, Ubr4 и Ubr5. Уровень мРНК анализировали через 24 часа после трансфекции. (Б) Кривые зависимости уровня мРНК Ubr1, Ubr2, Ubr4 и Ubr5 в культуре клеток Hepa1-6 от концентрации миРНК. Уровень мРНК анализировали через 24 часа после трансфекции (среднее значение ± SD). Р-критерий определяли методом однофакторного дисперсионного анализа, по сравнению с контролем. (*P <0,05, ** P< 0,005, *** P< 0,0005, **** P 0,0001). (В) Оценка уровня Ubr мРНК в печени через 3 дня после инъекции соответствующих миРНК в составе липидных наночастиц (ЛНЧ). (Г) Зависимость уровня мРНК в клетках печени от дозы миРНК через 3 дня после инъекции ЛНЧ. (Д) Восстановление уровня мРНК и белка Ubr убиквитин лигаз в печени через 3, 5, 7, 10 или 15 дней после однократных инъекций соответствующих миРНК в составе ЛНЧ. (Е) Оценка тканеспецифической активности миРНК через 3 дня при системном введении в составе ЛНЧ. Для всех экспериментов in vivo количество повторов n=3 и результаты представлены в виде среднего ± SEM. Р-критерий определяли методом однофакторного дисперсионного анализа, по сравнению с контролем (*P <0,05, ** P< 0,005, *** P< 0,0005, **** P< 0,0001).

Фиг. 2. Эффект подавления экспрессии Ubr-убиквитин лигаз пути Arg/N-дегрона in vitro. (А) Анализ уровня белков UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 методом иммуноблоттинга в клеточных культурах Hepa 1-6 и AML-12 через 72 часа после трансфекции 1 нМ миРНК siUbrs. (Б) Количественная оценка уровня экспрессии UBR белков в клеточных культурах Hepa 1-6 и AML-12 через 72 часа после трансфекции 1 нМ миРНК. (В) Asp¹¹¹⁹-BRCA1^f (образующийся из ^fDHFR-Ub^R48-Asp¹¹¹⁹-BRCA1^f) и Val¹¹¹⁹-BRCA1^f экспрессировали в культуре клеток Hepa 1-6, трансфицированных миРНК. Образцы клеточных лизатов анализировали методом гель-электрофореза по Лэммли и визуализировали иммуноблоттингом антителами к FLAG. (Г) Анализ уровня пролиферации клеток при окрашивании красителем нейтральным красным в культуре Hepa 1-6 через 72 часа после трансфекции 10 нМ миРНК. (Д) Анализ уровня клеточной смерти методом TUNEL в культуре клеток Hepa 1-6 через 72 часа после трансфекции 10 нМ миРНК. Клетки с окрашенными в красный цвет ядрами считались TUNEL-положительными клетками. Шкала 100 мкм. (Е) Тест на миграцию клеток проводили на культуре клеток Hepa 1-6 через 72 часа после трансфекции миРНК UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5. Результаты представлены как среднее значение ± SD. P-критерий определяли по критерию Стьюдента (*P 0,01).

Фиг. 3. Фенотип, наблюдаемый in vitro при подавлении экспрессии Ubr убиквитин лигаз является результатом прямого специфичного действия миРНК. (А) Анализ миграции клеток Hepa 1-6 через 72 часа после трансфекции двумя различными смесями миРНК, специфичных к Ubr убиквитин лигазам (10 нМ). (Б) Анализ уровня клеточной смерти методом TUNEL в культуре клеток Hepa 1-6 через 72 часа после трансфекции двумя различными смесями миРНК (10 нМ). Клетки с окрашенными в красный цвет ядрами считались TUNEL-позитивными клетками. Шкала -100 мкм. Результаты представлены как среднее значение ± SD. P-критерий определяли по тесту Манна-Уитни (*Р <0,05).

Фиг. 4. Подавление Ubr убиквитин лигаз приводит к активации апоптоза. Анализ уровня гибели клеток методом проточной цитометрии при окрашивании Аннексином V /7AAD культуры клеток Hepa 1-6 через 72 часа после трансфекции 1 нМ миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5. Результаты представлены как среднее значение ± SD. P-критерий определяли по тесту Манна-Уитни (*Р <0,05).

Фиг. 5. Продолжительное подавление экспрессии Ubr-убиквитин лигаз в печени вызывает воспаление. В течение 4 недель дважды в неделю мыши получали инъекцию миРНК в липидных наночастицах. Комбинированная доза липидных частиц содержала по 0,3 мг/кг миРНК UBR1, UBR2 и UBR5 и 0,5 мг/кг миРНК UBR4, общая доза по всем миРНК 1,4 мг/кг. Контрольные мыши получали инъекцию липидных частиц LNP-siCtrl с контрольной миРНК к люциферазе в дозе 1,4 мг/кг. (А) Уровень мРНК и (Б) уровень белков UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 в печени мышей после инъекции липидных частиц. Уровень UBR5 в печени не определялся. (В) Кривая массы тела животных, получавших инъекции ЛНЧ. Масса животных измерялась перед каждой инъекцией ЛНЧ и усреднялась по группе. Изменения массы животного выражались в процентах от исходной массы животного в начальный день эксперимента (0 день). (Г) Анализ уровня клеточной смерти методом TUNEL в клетках печени мышей, получавших инъекции ЛНЧ. Клетки с окрашенными в красный цвет ядрами считались TUNEL-положительными клетками. Масштаб 100 мкм. P-критерий определяли по тесту Манна-Уитни (*P 0,02). (Д) Окрашивание гематоксилином и эозином тканей печени мышей, получавших инъекции ЛНЧ. Масштаб 200 мкм (10x) и 100 мкм (20x). (Е) Анализ представленности популяций нейтрофилов, макрофагов и эозинофилов в печени мышей, получавших инъекции ЛНЧ, методом проточной цитометрии. (Ж) % нейтрофилов, Ly6C^high макрофагов или эозинофилов в печени мышей, получавших инъекции ЛНЧ или носителя, гейтированные на CD45⁺ клетки. Результаты представлены как среднее значение ± SEM. n=5 мышей на группу.

Фиг. 6. Характеристика селезенки при хроническом подавлении экспрессии Ubr-убиквитин лигаз. (А) Уровни мРНК Ubr1, Ubr2, Ubr4 и Ubr5 в селезенке мышей, после инъекций смеси ЛНЧ-миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5. (Б) Анализ представленности популяций нейтрофилов, макрофагов и эозинофилов в селезенке мышей, получавших инъекции ЛНЧ, методом проточной цитометрии. (В) % нейтрофилов, Ly6Chigh макрофагов и эозинофилов в селезенке мышей, получавших инъекции ЛНЧ, нормированных на CD45+ клетки Результаты представлены как среднее значение ± SEM. n=5 мышей на группу. Р-критерий определяли методом однофакторного дисперсионного анализа, по сравнению с контролем (*P <0,05, ***P< 0,0005, ****P< 0,0001).

Фиг. 7. Экспрессия уровня Ubr-убиквитин лигаз в печени мышей с ГЦК. Уровни мРНК Ubr1, Ubr2, Ubr4 и Ubr5 в печени здоровых мышей и мышей с ГКК определяли после инъекций ЛНЧ-миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5 в течение 5 недель. Инъекции проводили дважды в неделю, суммарная доза миРНК в смеси составляла 1,4 мг/кг. (***Р< 0,0005, ****Р< 0,0001).

Фиг. 8. Подавление экспрессии Ubr-убиквитин лигаз пути Arg/N-дегрона в модели гепатоклеточной карциномы (ГЦК) увеличивает опухолевую нагрузку и воспаление. Схема эксперимента: временная шкала индукции опухоли (инъекция онкоген-кодирующих плазмид) и режим инъекций ЛНЧ-миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5. Инъекции ЛНЧ-миРНК проводили в течение 4 недель (А) или в течение 5 недель (Б), один или два раза в неделю. Образцы ткани для анализа извлекали на 66 день после индукции опухоли. (В-Г) Анализ соотношения массы печени к массе тела животных с индуцированной гепатоклеточной карциномой и получавших инъекции ЛНЧ-миРНК в течение 4 недель (В) или 5 недель (Г). Соотношение масса печени/масса тела в каждой группе соотносили к контрольной группе мышей с ГЦК. (Д) Анализ представленности популяций нейтрофилов, и Ly6C^high макрофагов в селезенке мышей с ГЦК, получавших инъекции ЛНЧ, методом проточной цитометрии. (Е) % нейтрофилов and Ly6C^high макрофагов в селезенке мышей с ГЦК, получавших инъекции ЛНЧ-миРНК, нормированных на CD45⁺ клетки. Результаты представлены как среднее значение ± SEM. n=3-10 мышей на группу. P-критерий определяли по тесту Манна-Уитни (*P <0,05).

Фиг. 9. Подавление экспрессии UBR-убиквитиновых лигаз пути Arg/N-дегрона усиливает действие препаратов, индуцирующих апоптоз in vitro. (А) Анализ пролиферации клеток Hepa 1-6 cells после ко-трансфекции миРНК и добавления доксорубицина (левая панель) или только доксорубицина (правая панель). (Б-В) Анализ уровня клеточной смерти методом TUNEL в культуре клеток Hepa 1-6 через 72 часа после трансфекции 1 нМ миРНК к UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 и 48-часовой инкубации в присутствии доксорубицина. Клетки с окрашенными в красный цвет ядрами считались TUNEL-положительными клетками. Масштаб 100 мкм. Результаты представлены как среднее значение ± SD. P-критерий определяли методом однофакторного дисперсионного анализа (****P <0,0001).

Фиг. 10. Нокдаун UBR-убиквитин лигаз пути Arg/N-дегрона усиливает действие препаратов, индуцирующих апоптоз in vitro. (А) Анализ пролиферации клеток Hepa 1-6 cells после ко-трансфекции миРНК и добавления стауроспорина (левая панель) или только стауроспорина (правая панель). (Б) Анализ уровня клеточной смерти методом TUNEL в культуре клеток Hepa 1-6 через 72 часа после трансфекции 1 нМ миРНК UBR1, UBR2, UBR4 и UBR5 и 24-часовой инкубации в присутствии 50 нМ стауроспорина. Результаты представлены как среднее значение ± стандартное отклонение. P-критерий определяли методом однофакторного дисперсионного анализа (**Р <0,001, ****Р <0,0001).

Фиг. 11. Химиотерапия при ГЦК эффективнее в условиях подавления пути Arg/N-дегрона. (А) Схема эксперимента: хронология индукции опухоли (инъекция онкоген-кодирующих плазмид) и инъекций миРНК в составе ЛНЧ (черная шкала) и доксорубицина (серая шкала). Ткани для анализа извлекали на 68-й день после индукции опухоли. (Б) Окрашивание гематоксилином и эозином срезов тканей печени мышей с ГЦК, получавших инъекции ЛНЧ и доксорубицина. Шкала 100 мкм. (В) Анализ методом проточной цитометрии нейтрофилов, макрофагов и дендритных клеток в селезенке мышей с ГЦК, получавших инъекции ЛНЧ-миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5 и доксорубицина.

Фиг. 12. Химиотерапия гепатоклеточной карциномы проходит эффективнее в условиях подавления пути Arg/N-дегрона. (А) Анализ соотношения массы печени к массе тела животных с индуцированной гепатоклеточной карциномой и получавших в течение 4 недель инъекции ЛНЧ с дозой 1 мг/кг и дополнительно получавших или не получавших доксорубицин. n=10-18 мышей на группу. Результаты представлены как среднее значение ± SEM. (Б) Кривая массы тела животных, получавших инъекции ЛНЧ. Масса животных измерялась перед каждой инъекцией ЛНЧ и усреднялась по группе. Изменения массы животного выражались в процентах от исходной массы животного в день первой инъекции. (В) Срезы печени прокрашивали антителами к маркеру пролиферации Ki67 n=4 мыши на группу. (Г) Анализ уровня клеточной смерти методом TUNEL в срезах печени. Клетки с окрашенными в красный цвет ядрами считались TUNEL-положительными клетками Шкала 100 мкм. n=2-3 мыши на группу. Результаты представлены как среднее значение ± SD. P-критерий определяли по тесту Манна-Уитни (*P <0,05, ***P<0,001, ****P< 0,0001).

Фиг. 13. Распределение липидных частиц по размерам, полученное методом динамического светорассеяния. (А) ЛНЧ с миРНК UBR1; (Б) ЛНЧ с миРНК UBR2; (В) ЛНЧ с миРНК UBR4; (Г) ЛНЧ с миРНК UBR5; (Д) ЛНЧ с миРНК UBR1, UBR2, UBR4, UBR5 (миРНК siUbr); (Е) ЛНЧ с контрольной миРНК, специфичной к мРНК люциферазы (миРНК Ctrl).

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к использованию в качестве мишеней для терапии рака UBR-убиквитин-лигаз пути Arg/N-дегрона, с применением клинически апробированной технологии РНК-интерференции, при этом ингибирование данного пути также может усиливать действие химиотерапевтических, цитостатических, проапоптических или таргетных препаратов, при лечении опухолевых заболеваний.

Согласно одному варианту реализации изобретения предложены молекулы миРНК, снижающие уровень мРНК убиквитин лигаз в клетке, при этом указанные молекулы миРНК содержат смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит область комплементарности, длиной по меньшей мере 15 последовательных нуклеотидов, и отличающуюся не более чем на 3 нуклеотида от последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NOs. 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82.

Согласно предпочтительному варианту реализации, указанная антисмысловая цепь содержит область комплементарности, идентичную последовательности, выбранной из группы, состоящей из SEQ ID NO. 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 44, 46, 48, 50, 52, 54, 56, 58, 60, 62, 64, 66 68, 70, 72, 74, 76, 78, 80, 82.

Согласно одному варианту реализации изобретения указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона.

Согласно одному варианту реализации изобретения в предложенной молекуле миРНК по меньшей мере один нуклеотид из последовательности содержит химическую модификацию. В предпочтительном варианте реализации указанная химическая модификация выбрана из 2'-O-метилнуклеотида, 3'-межнуклеотидного тиофосфата и их комбинаций.

Согласно еще одному конкретному варианту реализации изобретения предложенная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит последовательность SEQ ID NO 14.

Согласно еще одному конкретному варианту реализации изобретения предложенная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит последовательность SEQ ID NO 40.

Согласно еще одному конкретному варианту реализации изобретения предложенная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит последовательность SEQ ID NO 56.

Согласно еще одному конкретному варианту реализации изобретения предложенная молекула миРНК содержит смысловую цепь и антисмысловую цепь, где указанная антисмысловая цепь содержит последовательность SEQ ID NO 70.

Согласно дополнительному варианту реализации изобретения, указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку. Более предпочтительно указанная опухолевая клетка представляет собой клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.

Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложена липидная наночастица, содержащая одну или более молекул миРНК согласно изобретению.

В предпочтительном варианте реализации указанная липидная наночастица содержит одну или более молекул миРНК, содержащих последовательности, выбранные из группы, состоящей из SEQ ID NO. 14, SEQ ID NO. 40, SEQ ID NO. 56 и SEQ ID NO. 70.

В одном из вариантов реализации изобретения предложенная липидная наночастица имеет размер, составляющий от 60 до 140 нм.

Согласно еще одному варианту реализации предложенная липидная наночастица характеризуется дзета-потенциалом, составляющим от -15 до +15 мВ.

Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложена фармацевтическая композиция для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.

Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложена фармацевтическая композиция для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.

Согласно другому варианту реализации изобретения предложена комбинация для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и по меньшей мере один химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент. В предпочтительном варианте реализации указанный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В еще одном предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.

Согласно другому варианту реализации изобретения предложена комбинация для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта, содержащая эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и по меньшей мере один дополнительный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент. В предпочтительном варианте реализации указанный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В еще одном предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.

Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложено применение молекулы миРНК согласно изобретению для получения лекарственного средства для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.

Согласно другому варианту реализации изобретения предложено применение молекулы миРНК согласно изобретению для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.

Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложено применение липидной наночастицы согласно изобретению для получения лекарственного средства для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому и холангиокарциному.

Согласно другому варианту реализации изобретения предложено применение липидной наночастицы согласно изобретению для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому или холангиокарциному.

Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложено применение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому или холангиокарциному.

Согласно другому варианту реализации изобретения предложено применение фармацевтической композиции, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому или холангиокарциному.

Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложено применение комбинации, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и по меньшей мере один дополнительный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент, для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому или холангиокарциному.

Согласно другому варианту реализации изобретения предложено применение комбинации, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и по меньшей мере один дополнительный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент, для лечения онкологического заболевания у нуждающегося в этом субъекта. В предпочтительном варианте реализации указанный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В предпочтительном варианте реализации указанное онкологическое заболевание представляет собой гепатоцеллюлярную карциному, гепатобластому или холангиокарциному.

Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с молекулой миРНК согласно изобретению в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.

Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с липидной наночастицей согласно изобретению в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.

Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с фармацевтической композицией, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.

Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с фармацевтической композицией, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы или холангиокарциномы.

Согласно другому варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с комбинацией, содержащей эффективное количество молекул миРНК согласно изобретению и по меньшей мере один химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент, в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы и холангиокарциномы.

Согласно еще одному варианту реализации изобретения предложен способ снижения уровня мРНК убиквитин лигаз в трансформированной клетке, включающий приведение указанной клетки в контакт с комбинацией, содержащей эффективное количество липидных наночастиц согласно изобретению и по меньшей мере один химиотерапевтический цитостатический, проапоптотический или таргетный агент, в количестве, эффективном для снижения указанного уровня мРНК убиквитин лигаз в указанной клетке. Согласно предпочтительному варианту реализации указанные убиквитин лигазы представляют собой UBR-убиквитин-лигазы пути Arg/N-дегрона. В предпочтительном варианте реализации указанный химиотерапевтический, цитостатический, проапоптотический или таргетный агент представляет собой доксорубицин или стауроспорин. В предпочтительном варианте реализации указанная клетка представляет собой трансформированную клетку. В еще более предпочтительном варианте реализации указанная трансформированная клетка представляет собой опухолевую клетку, еще более предпочтительно, клетку гепатоцеллюлярной карциномы, гепатобластомы и холангиокарциномы.