ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее описание относится к новой комбинации терапевтических агентов для лечения опухоли и/или метастаза, предпочтительно метастаза.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Метастатическое распространение основано на способности раковых клеток нарушать межклеточные взаимодействия, мигрировать через внеклеточный матрикс, выживать и размножаться в тканях, отличных от места их происхождения. Физиологический аналог этой сложной программы - известный как «инвазивный рост» - лежит в основе эмбриогенеза и отвечает за заживление ран и регенерацию органов во взрослой жизни. Инвазивный рост жестко регулируется специфическими внеклеточными сигналами, одним из которых является фактор роста гепатоцитов (HGF), лиганд рецептора, кодируемого онкогеном MET. В условиях аберрантной активации передача сигналов HGF/MET управляет возникновением, прогрессированием и метастазированием опухоли в широком спектре злокачественных новообразований человека. В меньшинстве случаев MET ведет себя как «драйвер» онкогена, а рост и выживание опухолевых клеток зависит от конститутивной передачи сигналов MET («зависимость от MET»). Это состояние зависит от наличия генетических повреждений, в основном увеличения числа копий гена или, реже, мутаций², которые приводят к конститутивной лиганд-независимой активации рецептора. В этом контексте лечение ингибиторами МЕТ является высокоэффективным, вызывая блокировку пролиферации клеток и остановку клеточного цикла in vitro и ингибирование роста опухоли in vivo. Совместная экспрессия лиганда и рецептора в одной и той же клетке является другой стратегией, используемой раком для достижения непрерывной активации MET, и она была описана в основном при неэпителиальных раковых заболеваниях человека, таких как остеосаркомы, глиобластомы и множественные миеломы. Однако в большинстве случаев аберрантная активация МЕТ в опухолях происходит из-за сверхэкспрессии рецептора из-за усиления транскрипции гена дикого типа, запускающего сенсибилизацию раковой клетки к стимуляции лигандом³. В последнем случае передача сигналов MET, которая приводит к проинвазивным и антиапоптотическим ответам, используется раковыми клетками в качестве стратегии обхода стрессовых условий и усиления злокачественного фенотипа («уместность MET»⁶). В отсутствие специфических генетических повреждений МЕТ не является строго необходимым для роста опухоли, но присутствие лиганда поддерживает активацию рецептора, усиливая злокачественный фенотип. Наконец, МЕТ действует как функциональный маркер раковых «стволовых клеток-предшественников» в глиобластомах⁸ и поддерживает «стволовой» фенотип при колоректальном раке и раке молочной железы^12,15. Более того, было показано, что происходящий из стромы HGF поддерживает путь самообновления WNT стволовых клеток колоректального рака и способствует пролиферации клеток, инициирующих рак толстой кишки, вызывая устойчивость к терапии против EGFR²⁷.

Был разработан и в настоящее время исследуется ряд стратегий, нацеленных на MET или HGF – низкомолекулярные ингибиторы, антитела или рекомбинантные белки. Среди них антитело MvDN30 представляет собой моновалентный химерный Fab-фрагмент, который связывается с внеклеточным доменом MET, вызывая протеолитическое отщепление («шеддинг») рецептора с поверхности клетки^{21, 28}. DecoyMET представляет собой рекомбинантный растворимый рецептор, охватывающий всю внеклеточную область MET; он связывает HGF с высоким сродством и ингибирует лиганд-зависимую биологическую активность in vitro и in vivo при экспрессии с помощью технологии лентивирусных векторов¹⁷ или в виде слитого с Fc белка^7,26. Как и в большинстве биологических систем, удар по единственному элементу цепи передачи сигнала вряд ли приведет к полному отключению ответа. Таким образом, в случае MET каждая молекула никогда не достигнет 100 % ингибирования, оставляя остаточную активность чувствительной к стимуляции HGF.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Целью настоящего изобретения является создание новой комбинации противоопухолевых агентов, полезных для лечения онкологических пациентов.

В соответствии с изобретением указанная выше цель достигается благодаря предмету, конкретно упомянутому в приложенной формуле изобретения, которая понимается как составляющая неотъемлемая часть настоящего описания.

Настоящее изобретение относится к фрагменту антитела против рецептора фактора роста гепатоцитов (HGFR) в сочетании с внеклеточной частью человеческого HGFR для использования при лечении пациента, страдающего от опухоли и/или метастаза, предпочтительно метастаза, при этом:

(i) фрагмент антитела против HGFR имеет только один паратоп, способный связываться с эпитопом внеклеточной части HGFR человека, и обладает антагонистической активностью в отношении HGFR,

(ii) внеклеточная часть HGFR человека способна стабильно связываться с фактором роста гепатоцитов (HGF) и содержит по крайней мере одну аминокислотную мутацию в эпитопе, распознаваемом фрагментом антитела против HGFR, для предотвращения связывания с ним фрагмента антитела против HGFR, и

(iii) фрагмент антитела против HGFR и внеклеточная часть HGFR человека подходят для введения пациенту (a) в форме белка или (b) в форме нуклеиновой кислоты.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Далее изобретение будет описано подробно исключительно в качестве иллюстративного и неограничивающего примера со ссылкой на прилагаемые фигуры.

Фиг. 1. Создание мутированного рецептора decoyMET, который не связывает антитело DN30.

(А) Сравнение аминокислотных последовательностей третьего и четвертого доменов IPT MET человека, мыши, крысы и собаки. Остатки, которые изменены исключительно в последовательности мыши, выделены жирным шрифтом, белым на черном фоне, аминокислоты, которые также (или только) изменены в последовательностях крысы или собаки, выделены жирным шрифтом. Показаны только границы IPT-3/IPT-4. (B) Рецепторы decoyMET, несущие одиночные аминокислотные замены, инкубировали с антителом DN30. Комплексы подвергали иммунопреципитации с белком А, который связывается с антителом, и выявляли с помощью конъюгированного с HRP стрептактина, который связывается со стреп-меткой в ловушке (левая панель). 30 мкл нормализованных супернатантов, используемых для иммунопреципитации, обрабатывали на SDS PAGE (электрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия) для проверки загрузки рецепторов decoyMET (правая панель). (C) Анализ связывания ELISA (ИФА, иммуноферментный анализ). MAb DN30 находилось в жидкой фазе, decoyMET дикого типа или decoyMET^K842E – в твердой фазе. Связывание антител детектировали с использованием конъюгированного с HRP мышиного антитела. OD, оптическая плотность при 450 нм. Каждая точка представляет собой среднее значение трех измерений ± стандартное отклонение SD.

Фиг. 2. DecoyMET^K842E связывает HGF с высоким сродством и ингибирует HGF-индуцированное фосфорилирование MET.

(A) Анализ связывания ELISA. DecoyMET дикого типа или decoyMET^K842E находились в твердой фазе; увеличивающиеся концентрации HGF добавляли в жидкую фазу. Связывание HGF детектировали с использованием биотинилированного антитела против HGF. Каждая точка представляет собой среднее значение трех измерений ± SD. (B) HGF-индуцированное фосфорилирование МЕТ. Клетки A549 инкубировали с decoyMET дикого типа или decoyMET^K842E (2 мкМ) и стимулировали HGF (50 нг/мл). Тотальные клеточные лизаты подвергали иммуноблоттингу с использованием антифосфоМЕТ (верхняя панель), антител против МЕТ (средняя панель) или антител к винкулину (нижняя панель), p145, зрелой формы MET; p190, одноцепочечного предшественника МЕТ; p117, винкулина.

Фиг. 3. MvDN30 и DecoyMET^K842E совместно вносят вклад в снижение индуцированного HGF фосфорилирования MET и биологической активности, обусловленной MET.

(A) HGF-индуцированное фосфорилирование МЕТ. Клетки аденокарциномы легких человека A549 инкубировали с 2 мкМ decoyMET^K842E, 125 нМ MvDN30 или их комбинацией и стимулировали или не стимулировали 50 нг/мл HGF. Тотальные клеточные лизаты подвергали иммуноблоттингу с использованием антител против фосфоМЕТ (верхняя панель), антител против МЕТ (средняя панель) или антител к винкулину (нижняя панель), p145, зрелой формы MET; p190, одноцепочечного предшественника МЕТ; p117, винкулина. (B) HGF-индуцированное фосфорилирование ERK и AKT. Клетки аденокарциномы легких человека A549 инкубировали с 500 нМ MvDN30, 2 мкМ decoyMET^K842E или их комбинацией и стимулировали или не стимулировали 100 нг/мл HGF. Тотальные клеточные лизаты подвергали иммуноблоттингу с анти-фосфоЕРК, анти-ERK, анти-фосфоАКТ, анти-AKT, анти-GAPDH, p42/44, ERK; р60, АКТ; p36, GAPDH. (C) Независимый от закрепления рост, поддерживаемый аутокринной стимуляцией HGF. Клетки глиобластомы человека U87-MG, экспрессирующие белки HGF и MET, обрабатывали 0,5 мкМ MvDN30 или 1 мкМ decoyMET^K842E по отдельности или их комбинацией. График представляет процент среднего роста колоний для каждой обработки по сравнению с необработанным контролем. (D) Независимый от закрепления рост, поддерживаемый паракринной стимуляцией HGF. Клетки A549 стимулировали 30 нг/мл HGF и обрабатывали 1 мкМ MvDN30 или 1 мкМ decoyMET^K842E, по отдельности или их комбинацией. График показывает процент среднего роста колоний для каждой обработки по сравнению с контролем, стимулированным HGF. (E) Трансвел-анализ инвазии. Клетки аденокарциномы поджелудочной железы человека HPAF-II стимулировали 12,5 нг/мл HGF и обрабатывали 0,5 мкМ MvDN30 или 1 мкМ decoyMET^K842E, по отдельности или их комбинацией. График показывает процент инвазии по сравнению с контролем, стимулированным HGF. Правая панель, одно репрезентативное изображение / группа клеток, мигрировавших через слой матригеля; n.t. - необработанные клетки. Увеличение 200×. Каждая точка представляет собой среднее значение в трех экземплярах ± SD. *** означает P ≤ 0,001; ** означает P ≤ 0,01; * означает P ≤ 0,05.

Фиг. 4. MvDN30 и decoyMET^K842E в комбинации ингибируют HGF-зависимое фосфорилирование MET.

Клетки U87MG (A), A549 (B) и HPAF-II (C) обрабатывали MvDN30, decoyMET^K842E или их комбинацией (COMBO). Клетки HPAF-II и A549 стимулировали или не стримулировали HGF; n.t. - необработанные клетки. Слева: репрезентативные конфокальные срезы, показывающие анти-фосфоМЕТ (верхние ряды) и фаллоидин (нижние ряды). На графиках справа показана средняя интенсивность флуоресценции (MFI) фосфоМЕТ, вычтенная и нормализованная для фаллоидина. Каждая точка представляет собой среднее из 5 значений ± SEM (стандартная ошибка среднего). Масштаб 50 мкм. *** означает P ≤ 0,001; ** означает P ≤ 0,01; * означает P ≤ 0,05.

Фиг. 5. MvDN30 и DecoyMET^K842E действуют синергично, подавляя HGF-зависимое рассеяние клеток.

(А) Анализ подвижности клеток. Клетки HPAF-II предварительно инкубировали с различными концентрациями (0,06, 0,25, 1 или 4 мкМ) MvDN30 или decoyMET^K842E, отдельно или в комбинации 1:1, а затем стимулировали 6,25 нг/мл HGF. Распределение клеток отслеживали в реальном времени с помощью устройства X-CELLigence RTCA и выражали как нормализованный индекс клеток. Каждый график относится к одной концентрации обработки. (B) Репрезентативные изображения клеток HPAF-II, предварительно инкубированных с 1 мкМ MvDN30 или 1 мкМ decoyMET^K842E, отдельно или в комбинации, а затем стимулированных 6,25 нг/мл HGF; n.t. - необработанные клетки. (C) Кривая подвижности клеток. Эффект – это значение индекса клеток, измеренное в конце эксперимента для каждой дозы обработки, нормализованное по значениям, полученным только с HGF, и выраженное как [1-x]. (D) Анализ комбинаций лекарственных средств. Значения кривой подвижности клеток были получены с помощью программного обеспечения Calcusyn для расчета индекса комбинации (CI) для каждой концентрации MvDN30 и decoyMET^K842E. CI = 1, взаимодействие; CI < 1, синергизм; CI > 1, антагонизм.

Фиг. 6 Комбинация MvDN30 и decoyMET^K842E снижает инвазивный фенотип подкожных опухолей U87-MG.

Клетки U87-MG вводили подкожно мышам NOD-SCID. Когда опухоли достигли объема 80-100 мм³, мыши были разделены на четыре однородные группы: носитель (n = 10); MvDN30 (n = 9); K842E (n = 9); комбинация двух лекарственных средств (n = 10).(A) Объем опухоли при умерщвлении, выраженный как кратное увеличение. Каждая полоса представляет собой среднее значение группы ± SEM. (B) Гистохимический анализ опухолевой нагрузки. Репрезентативные изображения срезов опухоли, окрашенных гематоксилином-эозином. Стрелки указывают на границу между опухолью и окружающей тканью. Увеличение 100×.

Фиг. 7. Влияние MvDN30 или decoyMET^K842E, по отдельности или в комбинации, на пролиферацию и апоптоз клеток рака поджелудочной железы, ортотопически инъецированных мышам hHGF-Ki.

Клетки HPAF-II, экспрессирующие люциферазу, вводили в поджелудочную железу мышей hHGF-Ki и разделяли на четыре гомогенные группы: носитель (n = 10), MvDN30 (n = 6), decoyMET^K842E (n = 6), комбинация лекарственных средств (n = 6). (A) Биолюминесценция опухоли, обнаруженная IVIS Spectrum. Цифры означают средние значения общего потока биолюминесценции (фотонов/секунду × 10⁸) каждой экспериментальной группы ± SEM. (B) Анализ пролиферации опухолевых клеток, измеренный иммуногистохимическим методом Ki67. Левая панель – репрезентативные изображения каждой экспериментальной группы. Увеличение 200×. График справа показывает средние значения, полученные при анализе пяти изображений на опухоль ± SEM. Индекс пролиферации рассчитывается как отношение Ki67-положительных клеток к общему количеству клеток. (C) Анализ апоптоза опухолевых клеток, измеренный с помощью иммунофлуоресценции расщепленной каспазы-3. Левая панель – репрезентативные изображения каждой экспериментальной группы. Масштаб 50 мкм. График справа показывает средние значения, полученные при анализе 8 изображений на опухоль ± SEM. Индекс апоптоза рассчитывают как отношение количества клеток, положительных на расщепленную каспазу-3, к общему количеству клеток. Масштаб 50 мкм. *** означает значение P < 0,001; ** означает значение P < 0,01; * означает значение P < 0,05.

Фиг. 8. MvDN30 и DecoyMET^K842E снижают фосфорилирование МЕТ и метастатическое распространение раковых клеток поджелудочной железы у мышей hHGF-Ki.

Клетки HPAF-II, экспрессирующие люциферазу, вводили в поджелудочную железу мышей hHGF-Ki и разделяли на четыре гомогенные группы: носитель (n = 10), MvDN30 (n = 6), decoyMET^K842E (n = 6), комбинация лекарственных средств (n = 6). (A) Статус фосфоMET в опухолях, измеренный с помощью иммунофлуоресцентного анализа. Левая панель, репрезентативные конфокальные срезы каждой экспериментальной группы, показывающие антифосфоМЕТ. График справа показывает среднюю интенсивность флуоресценции (MFI) фосфоMET, фон вычтен и нормализован по DAPI. Каждая точка представляет собой среднее из 12 значений ± SEM. Масштаб 50 мкм. (B) Оценка фенотипа EMT опухолей HPAF-II с помощью иммунофлуоресцентного анализа экспрессии E-кадгерина и виментина. Левая панель, репрезентативные изображения каждой экспериментальной группы. Анти-Е-кадгерин (верхний ряд), антивиментин (нижний ряд). Масштаб 50 мкм. График справа показывает средние значения, полученные при анализе 6 изображений на опухоль ± SEM. Фенотип ЕМТ выражается соотношением виментин/Е-кадгерин. (C) Метастатические узелки в легких, оцениваемые с помощью гистохимического окрашивания HE. График слева: количество метастатических очагов; каждая точка представляет количество поражений, оцененных для каждой мыши. График справа: область метастатического поражения; каждая точка представляет собой среднюю площадь метастазов, измеренную для каждой мыши. Было проанализировано десять слайдов/мышь; метастатические поражения оценивали, а их площадь количественно определяли с помощью ImageJ. *** означает P ≤ 0,001; ** означает P ≤ 0,01; * означает P ≤ 0,05.

Фиг. 9. Схематическое изображение одного из вариантов слитых белков, содержащих фрагмент антитела против HGFR и внеклеточную часть HGFR человека.

(A) Изображение молекулы, образованной слиянием в рамке считывания decoyMET^K842E на N-конце и scMvDN30 на C-конце. (B) Изображение молекулы, образованной слиянием в рамке считывания scMvDN30 на N-конце и decoyMET^K842E на C-конце. Между двумя группами был вставлен линкер. Последовательность линкера может быть выбрана из последовательностей, перечисленных в (C). SEMA, PSI, IPT 1-4 представляют собой участки decoyMET. Звездочка в IPT 4 показывает мутацию K→Е в позиции 842. Фрагмент антитела против HGFR состоит из двух цепей, соединенных вторым линкером. VL – вариабельная область легкой цепи; CL – константная область легкой цепи; VH – вариабельная область тяжелой цепи; CH – константная область тяжелой цепи. Черный квадрат представляет собой метки Strept-His, включенные в рекомбинантный белок для целей очистки/обнаружения.

Фиг. 10. Анализ связывания слитых белков, содержащих фрагмент антитела против HGFR и внеклеточную часть HGFR человека, с MET или HGF.

(A) Анализ связывания с HGF с помощью ELISA. Левая панель, связывание слитых белков, содержащих decoyMET^K842E на N-конце и scMvDN30 на C-конце. Правая панель, связывание слитых белков, содержащих scMvDN30 на N-конце и decoyMET^K842E на C-конце. Слитые белки или decoyMET^K842E (положительный контроль) находились в твердой фазе. В жидкую фазу добавляли возрастающие концентрации HGF. Связывание HGF детектировали с использованием биотинилированного антитела против HGF. Каждая точка представляет собой среднее значение в трех экземплярах ± SD. (B) Анализ связывания с MET с помощью ELISA. Левая панель, связывание слитых белков, содержащих decoyMET^K842E на N-конце и scMvDN30 на C-конце. Правая панель, связывание слитых белков, содержащих scMvDN30 на N-конце и decoyMET^K842E на C-конце. DecoyMET дикого типа находился в твердой фазе, а возрастающие концентрации различных слитых белков находились в жидкой фазе; в качестве положительного контроля в анализ был включен scMvDN30. Связывание антител определяли с использованием конъюгированного с HRP антитела против k-цепи человека. OD, оптическая плотность при 450 нм. Каждая точка представляет собой среднее значение в трех измерениях ± SD.

Фиг. 11. Ингибирование роста опухолевых клеток при обработке слитыми белками, содержащими фрагмент антитела против HGFR и внеклеточную часть человеческого HGFR.

(A) Рост клеток карциномы легких EBC-1, обработанных увеличивающимися концентрациями слитых белков, содержащих decoyMET^K842E на N-конце и scMvDN30 на C-конце. (B) Рост клеток карциномы легких EBC-1, обработанных увеличивающимися концентрациями слитых белков, содержащих scMvDN30 на N-конце и decoyMET^K842E на C-конце. В качестве положительного контроля в анализ были включены эквимолярные комбинации scMvDN30 и decoyMET^K842E (Combo). Клетки анализировали через 3 дня после обработки. Образцы представлены в трех экземплярах, столбцы представляют собой стандартное отклонение. (C) Таблица, показывающая значения IC₅₀ для каждого слитого белка, рассчитанные как среднее значение по меньшей мере из трех независимых экспериментов, по сравнению с ингибирующей активностью, проявляемой MvDN30/decoyK842E в комбинации.

Фиг. 12. Ингибирование роста опухолевых клеток при обработке слитыми белками, содержащими фрагмент антитела против HGFR и внеклеточную часть человеческого HGFR.

Клетки HPAF-II предварительно инкубировали с различными слитыми белками (3 мкМ), а затем стимулировали 6,25 нг/мл HGF. Распределение клеток отслеживали в реальном времени с помощью устройства X-CELLigence RTCA и выражали как нормализованный индекс клеток. Испытания образцов проводят в трехкратной повторности. (A) Клетки, обработанные слитыми белками, содержащими decoyMET^K842E на N-конце и scMvDN30 на C-конце. (B) Клетки, обработанные слитыми белками, содержащими scMvDN30 на N-конце и decoyMET^K842E на C-конце. В качестве положительного контроля в анализ были включены эквимолярные комбинации scMvDN30 и decoyMET^K842E (Combo). (C) Таблица, показывающая процент подвижности клеток, рассчитанный как среднее значение из двух независимых экспериментов, по сравнению с клетками, обработанными HGF.

Фиг. 13. Слитые белки, содержащие фрагмент антитела против HGFR и внеклеточную часть человеческого HGFR, уменьшают метастатическое распространение клеток рака поджелудочной железы у мышей hHGF-Ki.

Экспрессирующие люциферазу клетки Capan-1 вводили в поджелудочную железу мышей hHGF-Ki и разделяли на семь гомогенных групп: носитель (n = 14), decoyMET^K842E и scMvDN30 в комбинации 1:1 (две группы) и четыре группы для тестирования различных слитых белков, либо содержащие decoyMET^K842E на N-конце и scMvDN30 на C-конце, либо содержащие scMvDN30 на N-конце и decoyMET^K842E на C-конце. Анализировали два разных линкера (L60 и L134). Combo 1 (n = 4): MvDN30 доставляли 7 раз в неделю, а decoyMET^K842E доставляли 2 раза в неделю; combo 2 (n = 6): MvDN30 доставляли 4 раза в неделю, а decoyMET^K842E доставляли 2 раза в неделю; K842E_scMvDN30_L60 (n = 4); scMvDN30_K842E_L60 (n = 5); K842E_scMvDN30_L134 (n = 5); K842E_scMvDN30_L134 (n = 6). Все слитые белки доставляли 2 раза в неделю. (A) Таблица, показывающая количество мышей, несущих метастазы в печени, по сравнению с общим количеством проанализированных мышей. Мышей считали положительными, когда биолюминесценция, обнаруженная в печени с помощью IVIS Spectrum, превышала 10⁵ фотонов в секунду. (B) График, показывающий процент биолюминесценции, обнаруженной с помощью IVIS Spectrum в печени каждой экспериментальной группы по сравнению с группой, обработанной носителем.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В нижеследующем описании приведены многочисленные конкретные детали изобретения, чтобы обеспечить полное понимание вариантов осуществления. Варианты осуществления могут быть реализованы без одной или нескольких конкретных деталей или с другими методами, компонентами, материалами и т. д. В других случаях хорошо известные структуры, материалы или операции не показаны или не описаны подробно, чтобы не затруднить понимание аспектов изобретения.

Используемая в настоящем документе отсылка на «один вариант осуществления» или «вариант осуществления» означает, что конкретный элемент, признак, структура или характеристика, описанная в связи с вариантом осуществления, включена в по меньшей мере один вариант осуществления. Таким образом, употребление выражения «в соответствии с одним вариантом осуществления» или «в соответствии с вариантом осуществления» в различных местах настоящего описания не обязательно всегда относится к одному и тому же варианту осуществления. Кроме того, отдельные признаки, структуры или характеристики могут быть объединены любым подходящим образом в одном или более вариантах осуществления.

Названия, представленные здесь, предназначены только для удобства и не интерпретируют объем или значение вариантов осуществления.

Настоящее описание относится к новой комбинации терапевтических агентов для лечения опухоли и/или метастаза, предпочтительно метастаза.

Настоящее изобретение основывается на идее, что более высокая терапевтическая устойчивость при лечении опухолей и/или метастаза, предпочтительно метастаза, может быть достигнута за счет воздействия как на HGF, так и на HGFR. Экспериментальные данные, представленные здесь, на самом деле показывают, что вертикальное ингибирование оси MET/HGF эффективно препятствует росту, подвижности и инвазии опухолевых клеток in vitro и значительно снижает метастатическое распространение in vivo, обеспечивая комбинированную таргетную терапию для широкого спектра раковых заболеваний, экспрессирующих MET дикого типа.

В одном из вариантов осуществления настоящее изобретение относится к комбинации фрагмента антитела против рецептора фактора роста гепатоцитов (HGFR) с внеклеточной частью человеческого HGFR для использования в лечении пациента, страдающего от опухоли и/или метастаза, предпочтительно метастаза, при этом:

(i) фрагмент антитела против HGFR имеет только один паратоп, способный связываться с эпитопом внеклеточной части HGFR человека, и обладает антагонистической активностью в отношении HGFR,

(ii) внеклеточная часть человеческого HGFR способна стабильно связываться с фактором роста гепатоцитов (HGF) и содержит по крайней мере одну аминокислотную мутацию в эпитопе, распознаваемом фрагментом антитела против HGFR, для предотвращения связывания с ним фрагмента антитела против HGFR, и

(iii) фрагмент антитела против HGFR и внеклеточная часть HGFR человека подходят для введения пациенту (а) в форме белка или (b) в форме нуклеиновой кислоты.

В предпочтительном варианте осуществления пациент, подвергаемый терапевтическому лечению с помощью описанной здесь комбинированной терапии, несет онкоген MET дикого типа (т. е. он/она не несет генетических изменений в онкогене MET).

В одном или нескольких вариантах реализации фрагмент антитела против HGFR содержит один вариабельный домен легкой цепи (VL) и один вариабельный домен тяжелой цепи (VH), причем вариабельные домены легкой цепи и тяжелой цепи являются нечеловеческими или гуманизированными, и где вариабельный домен легкой цепи (VL) содержит области, определяющие комплементарность (CDR), имеющие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 1-3, и вариабельный домен тяжелой цепи (VH) содержит CDR, имеющие аминокислотные последовательности, указанные в SEQ ID NO: 4-6.

В еще одном варианте осуществления фрагмент антитела против HGFR дополнительно содержит один константный домен легкой цепи человека (CL) и один константный домен CH1 тяжелой цепи человека (CH1), причем вариабельный домен легкой цепи (VL) слит с константным доменом легкой цепи человека (CL) в направлении от N- к C-концу (таким образом образуя легкую цепь VL-CL), причем вариабельный домен тяжелой цепи (VH) слит с константным доменом CH1 тяжелой цепи человека в направлении от N- к C-концу (образуя таким образом тяжелую цепь VH-CH1). В предпочтительном варианте осуществления легкая цепь VL-CL содержит, предпочтительно состоит из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 7, а тяжелая цепь VH-CH1 содержит, предпочтительно состоит из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 8.

В различных вариантах осуществления, охватываемых настоящим изобретением, фрагмент антитела против HGFR находится в форме нуклеиновой кислоты. В таком случае фрагмент антитела против HGFR кодируется первой и второй молекулами нуклеиновой кислоты, где:

(i) первая молекула нуклеиновой кислоты кодирует один вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий CDR, имеющие последовательности нуклеиновой кислоты, указанные в SEQ ID NO: 9, 10 и 11, и где легкая цепь является нечеловеческой или гуманизированной; и

(ii) вторая молекула нуклеиновой кислоты кодирует один вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий CDR, имеющие последовательности нуклеиновой кислоты, указанные в SEQ ID NO: 12, 13 и 14, и где тяжелая цепь является нечеловеческой или гуманизированной.

В еще одном предпочтительном варианте осуществления фрагмент антитела против HGFR кодируется первой и второй молекулами нуклеиновой кислоты, где:

(i) первая молекула нуклеиновой кислоты кодирует (а) один вариабельный домен легкой цепи (VL), содержащий CDR, имеющие последовательности нуклеиновой кислоты, указанные в SEQ ID NO: 9, 10 и 11, где легкая цепь является нечеловеческой или гуманизированной, и (b) один константный домен легкой цепи человека (CL) в направлении от 5'- к 3'-концу (т. е. легкую цепь VL-CL); и

(ii) вторая молекула нуклеиновой кислоты кодирует (а) один вариабельный домен тяжелой цепи (VH), содержащий CDR, имеющие последовательности нуклеиновой кислоты, указанные в SEQ ID NO: 12, 13 и 14, где тяжелая цепь является нечеловеческой или гуманизированной, и (b) один константный домен CH1 тяжелой цепи человека (CH1) в направлении от 5'- к 3'-концу (т. е. тяжелую цепь VH-CH1).

В предпочтительном варианте осуществления первая молекула нуклеиновой кислоты (кодирующая легкую цепь VL-CL) содержит, предпочтительно состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO: 15, и вторая молекула нуклеиновой кислоты (кодирующая тяжелую цепь VH-CH1) содержит, предпочтительно состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO: 16.

В дополнительном варианте осуществления, охватываемом настоящим изобретением, фрагмент антитела против HGFR представляет собой одноцепочечный Fab-фрагмент против HGFR. Одноцепочечный Fab-фрагмент против HGFR содержит, предпочтительно состоит из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 17, или одноцепочечный Fab-фрагмент против HGFR кодируется молекулой нуклеиновой кислоты, содержащей, предпочтительно состоящей из последовательности нуклеиновой кислоты, указанной в SEQ ID NO: 18.

В одном или нескольких вариантах осуществления настоящее изобретение относится к внеклеточной части человеческого HGFR, содержащей домены SEMA, PSI, IPT-1, IPT-2, IPT-3 и IPT-4.

В предпочтительном варианте осуществления внеклеточная часть человеческого HGFR содержит, предпочтительно состоит из аминокислотной последовательности, указанной в SEQ ID NO: 19, где одна или несколько аминокислот между положениями 797 и 875, указанными в SEQ ID NO: 19, мутированы. Согласно настоящему описанию внеклеточная часть человеческого HGFR имеет последовательность, мутированную в соответствии со знаниями, касающимися антител против HGFR и сайтов связывания HGF на HGFR, таким образом, что антитело не взаимодействует с HGFR, в то время как HGF сохраняет свою способность связывания с внеклеточной частью HGFR человека. В другом предпочтительном варианте осуществления внеклеточная часть человеческого HGFR имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 20.

В дополнительном варианте осуществления, охватываемом настоящим изобретением, внеклеточная часть человеческого HGFR находится в форме молекулы нуклеиновой кислоты, которая содержит, предпочтительно состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, как указано в SEQ ID NO: 21, где одна или несколько нуклеиновых кислот между положениями 2391 и 2625, указанными в SEQ ID NO: 21, являются мутированными. Согласно настоящему описанию молекула нуклеиновой кислоты кодирует внеклеточную часть человеческого HGFR, которая имеет последовательность, мутированную в соответствии со знаниями, касающимися антител против HGFR и сайтов связывания HGF на HGFR, таким образом, что антитело не взаимодействует с HGFR, в то время как HGF сохраняет свою способность связывания с внеклеточной частью HGFR человека. В другом предпочтительном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая мутированную внеклеточную часть человеческого HGFR, имеет последовательность, указанную в SEQ ID NO: 22.

В различных вариантах осуществления, охватываемых настоящим изобретением, фрагмент антитела против HGFR конъюгирован с помощью линкера с внеклеточной частью HGFR человека в направлении от N- к C-концу, таким образом образуя слитый белок фрагмент антитела против HGFR – линкер – внеклеточная часть HGFR человека. Альтернативно, внеклеточная часть человеческого HGFR конъюгирована с помощью линкера с фрагментом антитела против HGFR в направлении от N- к C-концу, таким образом образуя слитый белок внеклеточная часть HGFR человека – линкер – фрагмент антитела против HGFR.

В различных вариантах осуществления, охватываемых настоящим изобретением, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая фрагмент антитела против HGFR, связана с помощью молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей линкер, с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей внеклеточную часть HGFR человека, в направлении от 5'- к 3'-концу, таким образом кодируя слитый белок фрагмент антитела против HGFR – линкер – внеклеточная часть HGFR человека. Альтернативно, молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая внеклеточную часть HGFR человека, связана посредством молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующей линкер, с молекулой нуклеиновой кислоты, кодирующей фрагмент антитела против HGFR, в направлении от 5'- к 3'-концу, таким образом кодируя слитый белок внеклеточная часть HGFR человека – линкер – фрагмент антитела против HGFR.

Таким образом, в настоящем изобретении предложен слитый белок, содержащий в направлении от N- к C-концу:

(i) фрагмент антитела против HGFR, линкер и внеклеточную часть HGFR человека; или

(ii) внеклеточную часть HGFR человека, линкер и фрагмент антитела против HGFR.

В предпочтительном варианте осуществления слитый белок, как определено выше, содержит, предпочтительно состоит из аминокислотной последовательности, выбранной из любой из SEQ ID NO: 23-28.

Таким образом, настоящее изобретение охватывает молекулы нуклеиновой кислоты, кодирующие слитый белок, содержащий в направлении от N- к C-концу:

(i) фрагмент антитела против HGFR, линкер и внеклеточную часть HGFR человека; или

(ii) внеклеточную часть HGFR человека, линкер и фрагмент антитела против HGFR.

В предпочтительном варианте осуществления молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок, как определено выше, содержит, предпочтительно состоит из последовательности нуклеиновой кислоты, выбранной из любой из SEQ ID NO: 29-34.

В дополнительном варианте осуществления настоящее описание касается фармацевтического продукта, содержащего в одном флаконе или в двух флаконах (а) фрагмент антитела против рецептора фактора роста гепатоцитов (HGFR) и фармацевтически приемлемый носитель, и (б) внеклеточную часть человеческого HGFR и фармацевтически приемлемый носитель, где:

(i) фрагмент антитела против HGFR имеет только один паратоп, способный связываться с эпитопом внеклеточной части HGFR человека, и обладает антагонистической активностью в отношении HGFR,

(ii) внеклеточная часть человеческого HGFR способна стабильно связываться с фактором роста гепатоцитов (HGF) и содержит по крайней мере одну аминокислотную мутацию в эпитопе, распознаваемом фрагментом антитела против HGFR, для предотвращения связывания фрагмента антитела против HGFR с эпитопом,

(iii) фрагмент антитела против HGFR и внеклеточная часть человеческого HGFR находятся либо в форме белка, либо в форме нуклеиновой кислоты.

Таким образом, фармацевтический продукт содержит фрагмент антитела против HGFR и внеклеточную часть HGFR человека, имеющую признаки, отдельные или в любой соответствующей комбинации, описанные выше.

В одном аспекте изобретение относится к способу лечения опухоли и/или метастаза у субъекта, который включает введение субъекту эффективного количества комбинации фрагмента антитела против HGFR и внеклеточной части HGFR человека, посредством чего лечат указанное состояние.

В одном аспекте изобретение обеспечивает способ ингибирования роста клетки, экспрессирующей HGFR, который включает контактирование указанной клетки с комбинацией фрагмента антитела против HGFR и внеклеточной части человеческого HGFR по изобретению, вызывая тем самым ингибирование роста указанной клетки.

В одном аспекте изобретение обеспечивает способ терапевтического лечения млекопитающего, имеющего злокачественную опухоль и/или метастаз, где способ включает введение указанному млекопитающему эффективного количества комбинации фрагмента антитела против HGFR и внеклеточной части HGFR человека, обеспечивая тем самым эффективное лечение указанного млекопитающего.

В одном аспекте изобретение обеспечивает способ лечения нарушения пролиферации клеток, который включает введение субъекту, нуждающемуся в таком лечении, эффективного количества комбинации фрагмента анти-HGFR-антитела и внеклеточной части человеческого HGFR, обеспечивая тем самым эффективное лечение или профилактику указанного нарушения пролиферации клеток.

В одном аспекте изобретение обеспечивает способ терапевтического лечения опухоли и/или метастазов у млекопитающего, где рост указанной опухоли по меньшей мере частично зависит от потенцирующего рост эффекта системы HGFR/HGF, обеспечивая таким образом либо увеличение пролиферации клеток, либо защиту от апоптоза, либо и то, и другое. Указанный способ включает контактирование опухолевой клетки с эффективным количеством фрагмента анти-HGFR-антитела в комбинации с эффективным количеством внеклеточной части человеческого HGFR по изобретению, обеспечивая таким образом эффективное лечение указанной опухоли и/или метастаза.

Опухоль, которую можно эффективно лечить с помощью комбинированной терапии по настоящему изобретению, выбирают из опухоли молочной железы, толстой и/или прямой кишки, легких, толстой кишки, поджелудочной железы, предстательной железы, яичников, шейки матки, центральной нервной системы, почек, гепатоцеллюлярной системы, мочевого пузыря, желудка, клетки опухоли головы и шеи, папиллярной карциномы (например, щитовидной железы), меланомы, лимфомы, миеломы, глиомы/глиобластомы (например, анапластической астроцитомы, мультиформной глиобластомы, анапластической олигодендроглиомы, анапластической олигодендроастроцитомы), лейкемической клетки, саркомы, рабдомиосаркомы или опухоли неизвестного первичного происхождения (CUP).

В одном варианте осуществления клетка, которая является терапевтической мишенью в способе по изобретению, представляет собой гиперпролиферативную и/или гиперпластическую клетку. В одном варианте осуществления клетка, на которую нацелен способ по изобретению, представляет собой диспластическую клетку. В еще одном варианте осуществления клетка, на которую нацелен способ по настоящему изобретению, представляет собой метастатическую клетку. В другом варианте осуществления клетка, на которую нацелен способ по настоящему изобретению, представляет собой экспрессирующую HGFR клетку, принадлежащую к микроокружению, поддерживающему опухоль и/или метастаз.

Терапевтические способы по изобретению могут дополнительно включать дополнительные этапы лечения. Например, в одном варианте осуществления терапевтический способ дополнительно включает этап, на котором целевую опухолевую клетку и/или ткань подвергают лучевой терапии или химиотерапевтическому лечению. В дополнительном варианте осуществления в дополнение к фрагменту антитела против HGFR в комбинации с внеклеточной частью человеческого HGFR по изобретению целевую опухолевую клетку и/или ткань обрабатывают молекулами, специфически поражающими другие мишени, имеющие отношение к поддержанию трансформированного фенотипа (т. е. молекулы против EGFR).

Выражение «антагонистическая активность» фрагмента антитела против HGFR в контексте настоящего описания относится к антителу, которое способно гасить внутриклеточную передачу сигналов, вызванную в клетке при активации HGFR. Антагонистическая активность указанного антитела может быть измерена путем оценки уровня экспрессии и/или фосфорилирования HGFR обычными методами, такими как вестерн-блоттинг, иммунофлуоресценция, иммуногистохимия, ELISA, цитофлуориметрический анализ или любой другой метод, который включает использование антитела, которые специфически распознают HGFR, или остатки HGFR Tyr^1234-1235, если они фосфорилированы (то есть основной сайт фосфорилирования MET⁹, или остатки HGFR Tyr^1349/1356, если они фосфорилированы (то есть сайт стыковки MET²²).

Используемое здесь выражение «внеклеточная часть человеческого HGFR способна стабильно связываться с человеческим HGF» означает, что внеклеточная часть человеческого HGFR связывается с HGF с расчетной Kd не выше 100 нМ.

Выражение «внеклеточная часть человеческого HGFR содержит по меньшей мере одну аминокислотную мутацию в эпитопе, распознаваемом фрагментом антитела против HGFR» в контексте настоящего описания означает наличие одной или нескольких мутаций (т. е. аминокислотных замен, и/или делеций, и/или вставки) во внеклеточной части HGFR, способной индуцировать модификацию во внеклеточной части HGFR, которая предотвращает вовлечение вышеуказанной области вариабельными доменами антитела. Специалист с учетом его общих знаний (представленных, в частности, возможностью создания кДНК, включая изменение одного нуклеотида в заданной последовательности ДНК с использованием специфических праймеров во время дупликации ДНК, см. Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory (1982)) не нуждается в дополнительных подробностях отностиельно реализации мутантной формы внеклеточной части HGFR человека, сохраняющей способность связываться с HGF человека, но не с фрагментом антитела против HGFR.

Таким образом, настоящее изобретение не следует интерпретировать как охватывающее только мутированную внеклеточную часть человеческого HGFR, как раскрыто в данном документе (т. е. SEQ ID NO: 8), поскольку квалифицированный специалист с точки зрения общих знаний может получить дополнительные мутированные версии внеклеточной части человеческого HGFR, содержащие SEQ ID NO: 19, что предотвращает связывание с ним антитела против HGFR.

Используемый здесь термин «одноцепочечный Fab-фрагмент» относится к одноцепочечному полипептиду, кодирующему домены VL, CL, VH, CH1 антитела, где VL и CL могут быть расположены на N-конце указанного полипептида и присоединены к доменам VH и CH1 с помощью гибкого линкера, или домены VH и CH1 могут быть расположены на N-конце указанного полипептида и связаны с доменами VL и CL гибким линкером.

Термины «SEMA», «PSI», «IPT-1», «IPT-2», «IPT-3» и «IPT-4» относятся к доменам HGFR, составляющим внеклеточную область HGFR. Такие доменные имена лежат в рамках общих знаний специалиста, например, ^{4, 13}. Домен SEMA представляет собой модуль взаимодействия с белками, общий для семафоринов и плексинов, охватывающий область, заключенную между аминокислотами 25-516 MET (SEQ ID NO: 19); PSI является общим доменом с плексинами, семафоринами, интегринами, охватывающим область между аминокислотами 519-561 MET (SEQ ID NO: 19); домен IPT, повторяющийся четыре раза, представляет собой область иммуноглобулина, как и в целом с плексинами и факторами транскрипции, охватывающую область, содержащуюся между аминокислотами 563-934 MET (SEQ ID NO: 19). Более подробно, повтор IPT-1 охватывает аминокислотные положения 563-656 в SEQ ID NO: 19, повтор IPT-2 охватывает аминокислотные положения 657-740 в SEQ ID NO: 19, повтор IPT-3 охватывает аминокислотные положения 741-837 в SEQ ID NO: 19, повтор IPT-4 охватывает аминокислотные положения 838-934 в SEQ ID NO: 19.

Слитые белки, раскрытые в данном документе, могут быть легко изготовлены квалифицированным специалистом либо в форме белков, либо в форме молекул нуклеиновых кислот, кодирующих указанные слитые белки, с учетом общих знаний в области, связанной с технологией рекомбинантной ДНК, как представлено, например, в Maniatis T. Molecular cloning: A laboratory manual Cold Spring Harbor Laboratory (1982). В качестве примера можно использовать следующую стандартную процедуру: (i) синтез соответствующей последовательности кДНК, (ii) вставка кДНК в плазмиду, подходящую для экспрессии у млекопитающих, с помощью обычных методов рекомбинантной ДНК, (iii) временная или стабильная трансфекция линии клеток млекопитающих с помощью упомянутой выше плазмиды, (iv) сбор культурального супернатанта, (v) очистка слитого белка с помощью аффинной хроматографии. Линкеры, используемые для конъюгирования двух белковых последовательностей, то есть фрагмента антитела против HGFR и внеклеточной части человеческого HGFR, могут иметь разную длину и/или аминокислотный состав, быть гибкими, жесткими или представлять собой комбинацию гибких и жестких областей. Линкеры, используемые в получении слитых белков, могут быть выбраны, но не ограничиваются ими, из любой из аминокислотных последовательностей, указанных в SEQ ID NO: 35, 36 и 37. Линкеры, используемые для получения молекул нуклеиновых кислот, кодирующих слитые белки, могут быть выбраны, но не ограничиваются ими, из любой из последовательностей нуклеиновых кислот, указанных в SEQ ID NO: 38, 39 и 40.

Далее настоящее изобретение будет проиллюстрировано ссылкой на комбинацию фрагмента антитела против HGFR, содержащего CDR с SEQ ID NO: 1-6, принадлежащих моноклональному антителу DN30, раскрытому в WO 2007/090807, и внеклеточной части HGFR, содержащей домены SEMA, PSI, IPT-1 - IPT-4, кратко далее обозначенные DecoyMET.

Авторы настоящего изобретения неожиданно обнаружили, что моновалентный фрагмент антитела DN30 (MvDN30) и DecoyMET, используемые в комбинации, позволяют осуществлять двойное нацеливание на лиганд и рецептор, действуя одновременно на MET-экспрессирующие раковые клетки и на секретирующую HGF строму опухоли и оказывая синергетический эффект в лечении опухолей и/или метастаза.

Фармакологическое ингибирование рецептора тирозинкиназы MET в раковых клетках, «зависимых» от онкогенов, подавляет пролиферацию и инвазию клеток. Соответственно, пациенты с усиленным метастазирующим NSCLC (немелкоклеточный рак легких), метастатическим раком желудка или пищевода реагируют на анти-MET терапию^{5, 14, 19}. С другой стороны, раковые клетки без генетических изменений MET используют «физиологическую» программу, запускаемую онкогеном, как «средство» для усиления злокачественного фенотипа⁶. «Уместность» требует стимуляции МЕТ дикого типа его лигандом HGF. В этом отношении вклад микросреды опухоли в прогрессирование и метастазирование рака становится все более актуальным, поскольку экспериментальные данные показывают, что злокачественный фенотип развивается не строго клеточно-автономным образом, а в довольно сложном взаимодействии между раковыми клетками и стромой хозяина. Микроокружение опухоли является важным источником HGF, секретируемого стромальными клетками мезенхимального происхождения в качестве неактивного предшественника (proHGF). Последний запасается во внеклеточном матриксе благодаря своей авидности к гепарансульфатам и активируется специфическими протеазами, продуцируемыми опухолевыми или стромальными клетками. Следовательно, избыток биологически активного лиганда легко доступен для связывания рецептора MET и запускает инвазивный сигнальный каскад роста в «независимых» клетках. Приведенные здесь данные показывают, что в условиях «уместности» МЕТ сопутствующее вмешательство, затрагивающее обе стороны оси МЕТ/HGF, приводит к улучшенной ингибирующей активности. Одновременное нацеливание было достигнуто путем комбинирования моновалентного антитела против MET, MvDN30, с рекомбинантным растворимым рецептором, decoyMET^K842E. Приведенные здесь данные указывают на отсутствие избыточности нацеливания взаимодополняющих средств на один и тот же путь. Два ингибитора были выбраны с учетом их механизмов действия: антитело индуцирует физическое удаление МЕТ с поверхности клетки путем «отщепления» эктодомена. Последний выпускается во внеклеточную среду и действует как «ловушка» для HGF. Экзогенная поставка рекомбинантного decoyMET усиливает HGF-связывающую активность эндогенного decoyMET, генерируемого MvDN30. Чтобы сделать возможным одновременное использование MvDN30 и decoyMET, был создан модифицированный растворимый рецептор (decoyMET^K842E), дефицитный по взаимодействию с MvDN30, но наделенный высокими аффинными свойствами связывания с HGF. Эти два агента в комбинации взаимодействуют в различных раковых клетках, что снижает эффективную терапевтическую дозу. Более того, эта «двойная стратегия» демонстрирует сильный синергетический эффект, потенциально проявляя превосходную противоопухолевую эффективность. Экспрессия MET в субпопуляции стволовых/предшественников раковых клеток была определена как «естественная роль» MET, то есть физиологический (естественно присутствующий) HGF-индуцированный внутриклеточный ответ, активированный в раковых стволовых клетках, в отсутствие генетических повреждений ответственен за устойчивость к таргетным способам лечения, таким как использование ингибиторов рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) при колоректальном раке. Идея связи раковых стволовых клеток и резистентности к традиционным способам лечения в широко признана, и роль HGF в микросреде в поддержании стволового фенотипа клеток-предшественников, экспрессирующих MET, становится все более и более установленной. Эффективное лечение, нацеленное на MET, в виде комбинации MvDN30 и decoyMET^K842E представляет собой терапевтическую поддержку для ослабления раковых стволовых клеток и противодействия возникновению устойчивости к таргетным способам лечения.

Роль микроокружения хозяина трудно исследовать в ксенотрансплантатах мыши из-за ограниченной перекрестной реактивности между факторами, происходящими из стромы мыши, и специфическими мишенями на раковых клетках человека. Это особенно важно в случае системы HGF/MET, поскольку мышиный HGF не активирует человеческий MET. Разработка генетически модифицированных линий мышей, экспрессирующих нокин-ген HGF человека (мыши hHGF-Ki), решила эту проблему. В этой трансгенной модели показано, что сопутствующее нацеливание HGF из окружающей среды и его рецептора на раковые клетки может быть эффективной терапевтической стратегией для предотвращения злокачественного прогрессирования и метастазирования.

Ксенотрансплантаты аденокарциномы поджелудочной железы характеризуются преждевременным метастатическим распространением, возникающим на очень ранней стадии развития опухоли, и поддерживаются обильным стромальным компартментом. Недавно HGF, секретируемый звездчатыми клетками поджелудочной железы, был идентифицирован как фактор, играющий важную роль во взаимодействии опухоль-строма при этом типе злокачественных новообразований. В ортотопической мышиной модели аденокарциномы поджелудочной железы человека, трансплантированной мышам hHGF-Ki, комбинация MvDN30 и decoyMET^K842E немного задерживала рост опухоли, как и ожидалось в модели «уместности», где МЕТ не является драйверным онкогеном. С другой стороны, комбинированное лечение оказалось очень эффективным в уменьшении метастатического распространения, что предполагает возможное терапевтическое применение в раковых клетках, независимых от МЕТ, где МЕТ представлен диким типом. Эпидемиологические данные показывают, что только 2-3 % эпителиальных раковых заболеваний основаны на онкогенной зависимости от МЕТ вследствие амплификации, перестройки или мутации генов²⁹. По этой причине ряд клинических испытаний, направленных на неотобранные группы больных раком, провалился. С другой стороны, подавляющее большинство карцином используют лиганд-зависимую активацию МЕТ дикого типа, чтобы запустить инвазивный метастатический фенотип в ответ на гипоксию, ионизирующее излучение или химиотерапию. Таким образом, эти результаты предполагают, что большая группа пациентов, которые в настоящее время не подходят для таргетной терапии MET из-за отсутствия специфического генетического поражения, должны получать пользу от лечения, включающего стратегию двойного антитела-ловушки, которая позволяет оптимально блокировать передачу сигналов MET, управляемую HGF.

Терапевтические композиции, содержащие активные ингредиенты по настоящему изобретению, то есть фрагмент антитела против HGFR и внеклеточную часть человеческого HGFR, могут быть приготовлены либо в виде одного препарата, содержащего два активных ингредиента, смешанных вместе, либо в виде отдельных препаратов, один из которых содержит фрагмент антитела против HGFR и другой - внеклеточный фрагмент человеческого HGFR. Активные ингредиенты готовят для хранения путем смешивания активного ингредиента (-ов), имеющего желаемую степень чистоты, с физиологически приемлемыми носителями, эксципиентами или стабилизаторами (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)) в форме водных растворов, лиофилизированных или других высушенных составов. Приемлемые носители, эксципиенты или стабилизаторы нетоксичны для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях и включают буферы; антиоксиданты; консерванты; полипептиды с низкой молекулярной массой (менее примерно 10 остатков); белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты; моносахариды, дисахариды и другие углеводы; хелатирующие агенты; сахара; солеобразующие противоионы; комплексы металлов и/или неионные поверхностно-активные вещества. Составы, раскрытые в настоящем документе, могут также содержать другое активное соединение (-я), если это необходимо для конкретного показания, подлежащего лечению, предпочтительно соединения с комплементарной активностью, которые не оказывают негативного влияния на терапевтическую активность фрагмента антитела против HGFR и внеклеточной части человеческого HGFR. Такие молекулы соответственно присутствуют в комбинации в количествах, эффективных для предполагаемого назначения.

Активный (-е) ингредиент (-ы) также может быть заключен в микрокапсулы, полученные с помощью методик, раскрытых, например, в Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980).

Составы для введения in vivo должны быть стерильными.

Можно приготовить препараты с замедленным высвобождением. Подходящие примеры препаратов с замедленным высвобождением включают полупроницаемые матрицы твердых гидрофобных полимеров, содержащие активные ингредиенты по изобретению, причем эти матрицы имеют форму изделий определенной формы, например пленок или микрокапсул.

Активные ингредиенты по настоящему изобретению можно использовать либо отдельно, либо в комбинации с другим антителом, химиотерапевтическим агентом (-ми) (включая коктейли химиотерапевтических агентов), другим цитотоксическим агентом (-ми), антиангиогенным агентом (-ми), цитокинами и/или агентом (-ы), ингибирующим рост. Такие комбинированные способы лечения, указанные выше, включают комбинированное введение (когда два или более агента включены в один и тот же или отдельные составы) и раздельное введение, и в этом случае введение антитела по изобретению может происходить до и/или после введения дополнительной терапии или способов лечения.

Активные ингредиенты по настоящему изобретению (и дополнительное терапевтическое средство (-а)) вводят любыми подходящими способами, включая парентеральный, подкожный, внутрибрюшинный, внутрилегочный и интраназальный, и внутриочаговое введение, если это желательно для местного лечения. Активные ингредиенты по настоящему изобретению можно подходящим образом вводить пульсирующей инфузией, особенно с уменьшающимися дозами активных ингредиентов. Введение дозы может быть осуществлено любым пригодным способом, например, с помощью инъекций, таких как внутривенные или подкожные инъекции, частично в зависимости от того, является ли введение кратковременным или длительным. Активные ингредиенты по изобретению также можно доставлять путем переноса генов с помощью вирусных векторов (т. е. лентивирусных векторов), вводить местно или системно, или посредством клеточной терапии, то есть путем внутривенной местной инъекции клеток человека, генетически модифицированных с помощью трансдукции вирусными векторами (т. е. лентивирусными векторами) для экспрессии фрагмента антитела против HGFR и внеклеточной части HGFR человека.

Активные ингредиенты по изобретению будут составляться, дозироваться и вводиться в соответствии с надлежащей медицинской практикой. Факторы, которые следует учитывать в данном контексте, включают конкретное заболевание, подлежащее лечению, конкретное млекопитающее, подлежащее лечению, клиническое состояние отдельного пациента, причину заболевания, область доставки агента, способ введения, схему введения и другие факторы, известные врачам-практикам. Активные ингредиенты по изобретению необязательно могут быть включены в фармацевтический состав вместе с одним или несколькими агентами, используемых в настоящее время для предотвращения или лечения рассматриваемого заболевания. Эффективное количество таких других агентов зависит от количества активных ингредиентов по изобретению, присутствующих в составе, типа заболевания или лечения и других факторов, обсуждаемых выше. Их обычно используют в тех же дозах и с путями введения, которые были указаны здесь ранее, или примерно от 1 до 99 % от используемых до настоящего момента дозировок.

Для лечения заболевания подходящая дозировка активных ингредиентов по изобретению (при использовании отдельно или в комбинации с другим агентом (-ми), таким как химиотерапевтический агент (-а)), будет зависеть от типа заболевания, подлежащего лечению, степени тяжести и течения заболевания, независимо от того, вводятся ли активные ингредиенты в профилактических или терапевтических целях, при этом должным образом принимается во внимание история болезни пациента и реакция на активные ингредиенты по изобретению, и на усмотрение лечащего врача.

Антитело или иммуноконъюгат соответствующим образом вводят пациенту однократно или в ходе серии сеансов лечения. В зависимости от типа и тяжести заболевания от около 1 до 15 мг/кг антитела является начальной тестовой дозой для введения пациенту, например, путем одного или нескольких отдельных введений или путем непрерывной инфузии. Типичная ежедневная доза может находиться в диапазоне от около 1 до 100 мг/кг или более в зависимости от вышеупомянутых факторов. При повторном введении в течение нескольких дней или дольше, в зависимости от состояния, лечение обычно следует продолжать до желаемого подавления симптомов заболевания. Одна типичная дозировка фрагмента антитела находится в диапазоне от около 0,05 до около 20 мг/кг. Так, пациенту можно вводить одну или более из доз, составляющих около 0,5 мг/кг, 2,0 мг/кг, 4,0 мг/кг или 10 мг/кг (или любые их комбинации). Такие дозы можно вводить с перерывами, например, каждую неделю или каждые три недели (например, таким образом, что пациент получает от приблизительно двух до приблизительно двадцати, например, приблизительно шесть доз антитела). Можно вводить начальную повышенную нагрузочную дозу, за которой следует одна или более пониженные дозы. Типичный режим дозирования включает введение начальной нагрузочной дозы около 4 мг/кг с последующей еженедельной поддерживающей дозой около 2 мг/кг антитела. Однако, могут быть пригодны другие схемы лечения. Ход такого лечения можно контролировать с помощью обычных методик и анализов. Внеклеточная часть человеческого HGFR должна доставляться одновременно с фрагментом антитела и должна быть дозирована пропорционально фрагменту антитела, предпочтительно, но не ограничиваясь, с молярным соотношением фрагмента антитела к decoyMET 1:1, в зависимости от типа и тяжести заболевания.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Сайт-направленный мутагенез ДН30-связывающего эпитопа в decoyMET.

Чтобы использовать активность антитела MvDN30 и decoyMET совместно, необходимо предотвратить взаимодействие между двумя молекулами, которое могло бы привести к взаимной нейтрализации. Ранее было показано, что MvDN30 распознает эпитоп в домене IPT-4 внеклеточной области MET на границе с доменом IPT-3²⁸. Предыдущие исследования показали, что исходное антитело DN30, которое связывает человеческий рецептор с пикомолярным сродством, также взаимодействует с МЕТ собак и крыс^11,23, хотя оно не реагирует перекрестно с мышью²¹. После выравнивания аминокислотных последовательностей IPT-3 и IPT-4 вышеупомянутых видов млекопитающих был идентифицирован ряд остатков, которые избирательно изменены у мышей (фиг. 1A). Чтобы проверить, может ли замена отдельных аминокислотных остатков от человека к мыши нарушать связывание антитела, были созданы растворимые рецепторы, несущие точечные мутации в домене IPT 3-4, и протестированы против антитела DN30. Замена лизина 842 на глутаминовую кислоту привела к образованию decoyMET^K842E, модифицированного растворимого рецептора, больше не распознаваемого антителами, в то время как все другие мутации не влияли на взаимодействие (фиг. 1B). Неспособность антитела взаимодействовать с decoyMET^K842E была подтверждена в анализах ELISA, проведенных с афинно очищенными ловушками в твердой фазе и антителом DN-30 в жидкой фазе (фиг. 1С). Таким образом, замена основной аминокислоты в положении 842 на кислотный остаток приводила к критическому нарушению сайта связывания, препятствуя взаимодействию decoyMET^K842E с антителом.

DecoyMET^K842E связывает HGF с высоким сродством

Затем авторы настоящего изобретения исследовали, мешает ли аминокислотная замена K842E связыванию HGF. В анализах связывания ELISA константа аффинности decoyMET^K842E к HGF (K_d = 1,04 ± 0,05 нМ) совмещалась с K_d = 1,44 ± 0,07 нМ, измеренной для decoyMET дикого типа (фиг. 2A). Наконец, ингибирующая активность decoyMET^K842Eбыла протестирована с помощью анализа HGF-индуцированного фосфорилирования МЕТ. Как показано на фиг. 2B, decoyMET дикого типа и decoyMET^K842E ингибировали HGF-зависимое фосфорилирование MET в клетках рака легкого A549 с сопоставимой эффективностью. Таким образом, замена K842E не препятствует образованию стабильного комплекса с HGF и не влияет на ингибирующую активность ловушки.

MvDN30 и decoyMET^K842E взаимодействуют при ингибировании фосфорилирования MET и последующих биологических ответов

Для оценки ингибирующей активности, вызываемой одновременным нацеливанием лиганда и рецептора на трансдукцию сигнала MET, фосфорилирование MET тестировали в присутствии MvDN30 и decoyMET^K842E, по отдельности или в комбинации. С этой целью клетки A549, экспрессирующие МЕТ-рецептор дикого типа, стимулировали наномолярными концентрациями HGF, а активацию МЕТ измеряли с помощью антител к фосфоМЕТ. Обе молекулы проявляли ингибирующую активность, и их комбинация была более эффективной (фиг. 3А). Анализ последующих сигнальных трансдукторов подтвердил, что эта комбинация обеспечивает наиболее эффективное ингибирование активации ERK и AKT (фиг. 3B).

С биологической точки зрения, комбинация MvDN30 и decoyMET^K842E сильно ингибировала безъякорный рост колоний в клеточных моделях как аутокринной, так и паракринной стимуляции HGF. В первом случае клетки глиобластомы U87-MG, демонстрирующие очень эффективный рост колоний на мягком агаре за счет аутокринной петли MET/HGF, подавлялись на 75 %, когда MvDN30 и decoyMET^K842E использовались в комбинации, тогда как подавление роста колоний никогда не превышало 40 %, когда две молекулы были использованы как отдельные агенты (фиг. 3B). Аналогичным образом, комбинированная обработка полностью блокировала образование колоний A549 на мягком агаре, вызванное наномолярными концентрациями экзогенно введенного HGF, в то время как только MvDN30 и decoyMET^K842E обеспечивали частичное, хотя и значительное ингибирование роста колоний (65 % и 74 % соответственно, фиг. 3C). Аналогичные результаты были получены в анализах инвазии, проведенных в камерах, покрытых матригелем: комбинация MvDN30 и decoyMET^K842E снижала вызванную HGF инвазию в клетки аденокарциномы поджелудочной железы человека HPAF-II на 85 %, в то время как в качестве отдельных агентов было достигнуто только 59 % и 52 % ингибирования соответственно (фиг. 3D). Во всех этих биологических системах комбинация MvDN30 и decoyMET^K842E нарушала фосфорилирование МЕТ более эффективно, чем обработка по отдельности (фиг. 4).

Чтобы оценить, является ли эффект двух ингибиторов аддитивным или синергетическим, был проведен количественный анализ подвижности. Клетки аденокарциномы поджелудочной железы человека HPAF-II, экспрессирующие МЕТ дикого типа, индуцировали для рассеяния действием HGF. Рассеяние клеток определяли количественно путем измерения вариаций электрического импеданса покрытых ячейками электродов (X-CELLigence Real Time Cell Analyzer). Комбинация двух молекул снижала HGF-зависимое рассеяние клеток дозозависимым образом, начиная ингибирование при 250 нМ и достигая полного блокирования в микромолярном диапазоне (фиг. 5 A и B). Значения индекса клеток, измеренные в конце эксперимента (время - 48 ч), были нормализованы по HGF (фиг. 5C) и обработаны с помощью программного обеспечения CalcuSYN для оценки синергизма (фиг. 5D): для всех исследованных концентраций рассчитанный индекс комбинации (CI) был значительно ниже 0,5 (CI = 0,1, 0,09, 0,17 и 0,38 для 0,06, 0,25, 1 и 4 мкМ, соответственно), что указывает на синергетическое отношение MvDN30 и decoyMET^K842E10.

MvDN30 и decoyMET^K842E ослабляют инвазивный фенотип и уменьшают распространение метастазов

Ингибирующую активность комбинации MvDN30 и decoyMET^K842E оценивали in vivo на мышиных моделях лиганд-управляемой стимуляции MET.

Исследовали модель аутокринной стимуляции HGF ксенотрансплантата глиобластомы U87-MG. Клетки вводили подкожно мышам NOD-SCID; когда объем опухолей достигал 80-100 мм³, мышей разделяли на гомогенные группы и случайным образом распределяли по 4 группам обработки: носитель, MvDN30, decoyMET^K842E или комбинация последних. После 22 дней обработки мышей умерщвляли и вырезали первичные опухоли для гистологического исследования. В то время как комбинированная обработка вызывала только краевое ингибирование роста (фиг. 6A), наблюдали снижение фенотипических признаков опухолевой инвазии (фиг. 6B).

Комбинированная обработка также была проверена на паракринной модели стимуляции HGF. Как сообщалось ранее, мышиный HGF не активирует человеческий рецептор МЕТ^{24, 30}. Следовательно, чтобы проверить ингибирующую активность decoyMET^K842E в ксенотрансплантатах опухолей человека, мы использовали трансгенную мышь SCID, у которой ген HGF мыши был заменен геном человека (hHGF-Ki)²⁰. Клетки аденокарциномы поджелудочной железы человека (HPAF-II) метили путем трансдукции геном люциферазы и вводили ортотопически в поджелудочную железу мышей hHGF-Ki. Приживление проверяли анализом общей люминесценции тела; мышей разделяли на гомогенные группы на основе значений биолюминесценции и случайным образом распределяли на 4 группы обработки: носитель, MvDN30, decoyMET^K842E или их комбинация. Рост опухоли контролировали по общей люминесценции тела (фиг. 7A). При умерщвлении через 5 недель после инъекции клетки опухоли вырезали и анализировали на фосфорилирование МЕТ, пролиферацию, апоптоз и экспрессию виментина/Е-кадгерина (маркеры эпителиально-мезенхимального перехода). Одновременно собирали легкие для гистохимической оценки метастатических узелков. Фосфорилированный статус MET по тирозинам 1234-1235 ингибировался обоими агентами, и комбинированная обработка вызывала драматический эффект (фиг. 8A). Как и ожидалось в этой модели «уместности» онкогена MET (т. е. экспрессии MET дикого типа), пролиферация, а также апоптоз были умеренно затронуты, и только при комбинированной обработке (фиг. 7B и C). Анализ соотношения между виментином и Е-кадгерином показал, что комбинированная обработка подтолкнула раковые клетки к более эпителиальному фенотипу (фиг. 8B). Соответственно, одновременное введение MvDN30 и decoyMET^K842E значительно ингибировало опосредованное MET метастатическое распространение метастазов в легкие (фиг. 8C).

Создание панели слитых белков, содержащих фрагмент антитела против HGFR и внеклеточную часть HGFR человека

Для создания одной кДНК, кодирующей слитые белки, содержащие фрагмент антитела против HGFR и внеклеточную часть человеческого HGFR, авторы настоящего изобретения сначала разработали одноцепочечный MvDN30 (ScMvDN30), внедрив линкер между легкой цепью (VL-CL) и тяжелая цепь (VH-CH1). Линкер был гибким, богатым остатками глицина/серина и имел длину, которая позволяла предпочтительно генерировать мономерные молекулы, состоящие из ассоциации легкой и тяжелой цепей антитела, принадлежащих одному и тому же полипептиду, а не из отдельных полипепдитов, таким образом генерируя димеры и/или мультимеры. Предпочтительная аминокислотная последовательность линкера представлена в SEQ ID NO: 36; соответствующая нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 39. Затем кДНК ScMvDN30 сливали в одной рамке считывания с DecoyMET^K842E. Были созданы две группы слитых белков: i) decoyMET^K842E был расположен на N-конце, а ScMvDN30 - на C-конце, и ii) scMvDN30 был расположен на N-конце, а decoyMet^K842E - на C-конце. Чтобы гарантировать высокую степень свободы для всей структуры, авторы настоящего изобретения ввели второй линкер между двумя группами. Использовали три разных линкера, модифицированных по аминокислотному составу и/или длине: i) L45: жесткий линкер из 45 аминокислот, состоящий из двух повторов последовательности, богатой аланином и заряженными остатками, SEQ ID NO: 35, соответствующая нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 38; ii) L60, гибкий линкер, богатый остатками глицина/серина из 60 аминокислот SEQ ID NO: 36, соответствующая нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 39; iii) L134, комбинация гибких и жестких областей из 134 аминокислот SEQ ID NO: 37, соответствующая нуклеотидная последовательность представлена в SEQ ID NO: 40. Схематическое изображение слитых белков представлено на фиг. 9.

Слитые белки, содержащие scMvDN30 на N-конце и decoyMET^K842E на C-конце, связываются с высокой аффинностью как с MET, так и с HGF.

Авторы настоящего изобретения исследовали с помощью анализов ELISA, сохраняют ли новые созданные гибридные белки способность связывать как HGF, так и MET. Все слитые белки взаимодействовали с HGF с аффинностью, совпадающей с аффинностью decoyMET^K842E (фиг. 10A), в то время как слитые белки, содержащие scMvDN30 на С-конце, распознавали MET с более низким сродством по сравнению со слитыми белками с антителом, расположенным на N-конце. Значения Kd, измеренные для этой последней группы молекул, были сопоставимы со значениями, измеренными для одного scMvDN30 (фиг. 10B).

Слитые белки эффективно ингибировали рост опухолевых клеток.

Авторы настоящего изобретения оценивали ингибирующие свойства слитых белков, измеряя нарушение роста клеток после трех дней обработки, по сравнению с scMvDN30 в сочетании с decoyMET^K842E в эквимолярном соотношении. Все слитые белки проявляли ингибирующие свойства в зависимости от дозы. В описанном эксперименте слитые с линкером L60 белки были менее эффективны, чем другие молекулы, тогда как белки L45 и L134 проявляли активность, аналогичную комбинации scMvDN30-decoyMET^K842E (фиг. 11).

Слитые белки эффективно ингибировали индуцированную HGF подвижность клеток.

Чтобы оценить влияние слитых белков на ингибирование подвижности клеток, управляемой HGF, авторы настоящего изобретения выполнили количественный анализ подвижности с помощью анализатора клеток в реальном времени X-CELLigence, используя в качестве модели клетки аденокарциномы поджелудочной железы человека HPAF-II, обработанные HGF. Все слитые белки были способны снижать HGF-зависимое распространение клеток (фиг. 12).

Слитые белки снижали распространение метастазов сильнее, чем комбинация MvDN30 и decoyMET^K842E

Ингибирующую активность слитых белков оценивали in vivo на мышиной модели hHGF-Ki SCID. Клетки аденокарциномы поджелудочной железы человека (Capan-I) метили путем трансдукции геном люциферазы и вводили ортотопически в поджелудочную железу мышей. Приживление проверяли анализом общей люминесценции тела; мыши были разделены на гомогенные группы на основе значений биолюминесценции и обработаны слитыми белками, включающими линкеры L60 или L134. В качестве референсов в экспериментальные группы были включены MvDN30 и decoyMET^K842E в комбинации 1:1 и носитель. При умерщвлении через 5 недель после инъекции клеток вырезали печень и анализировали с помощью IVIS Spectrum для подсчета метастазов. Одновременное введение MvDN30 и decoyMET^K842E значительно ингибировало метастатическое распространение метастазов в печень; была отмечена высокая эффективность, если введение MvDN30 проводилось ежедневно (группа COMBO 1), тогда как терапевтический ответ был значительно снижен, если применялись менее частые введения (группа COMBO 2). Это ограничение не оценивалось у мышей, получавших слитые белки. Фактически, все они с высокой эффективностью снижали метастатическое распространение в печень, даже если доставку проводили дважды в неделю (фиг. 13).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Культура клеток

Клетки аденокарциномы легких человека A549, клетки аденокарциномы поджелудочной железы человека HPAF-II и Capan-1 и клетки глиобластомы человека U87-MG были получены от ATCC/LGC Standards S.r.l. (Sesto San Giovanni, Италия); клетки карциномы легких человека EBC-1 были из японской исследовательской коллекции биоресурсов. Все клетки культивировали в соответствии с рекомендациями поставщика. Все клеточные культуры были протестированы на заражение микоплазмами.

Создание, экспрессия и очистка фрагмента антитела против HGFR

КДНК, кодирующие легкую цепь (VL-CL) и тяжелую цепь (VH-CH1) фрагмента антитела против HGFR, способного распознавать эпитоп внеклеточной части HGFR, были получены путем синтеза генов, выполненного на аутсорсинге Invitrogen GeneArt. Синтез гена (ThermoFisher) в соответствии с последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 7 и SEQ ID NO: 8. Фрагменты антител получали временной трансфекцией клеток HEK-293T плазмидами pcDNA3.1 (кат.# V79020 Invitrogen Corporation, Camarillo, CA), экспрессирующими кДНК, кодирующие легкую цепь (VL-CL) и тяжелую цепь (VH-CH1). Трансфицированные клетки подвергали голоду в течение трех дней и собирали супернатанты клеточных культур, содержащие растворимые рецепторы. Очистку рекомбинантных белков проводили аффинной хроматографией с использованием колонок HisTrap HP (кат.# 17524701 GE Healthcare, Freiburg, Germany) в соответствии с инструкциями производителя. Крупномасштабное производство и очистку белка выполняла компания U-Protein Express BV (Утрехт, Нидерланды).

Создание, экспрессия и очистка мутированных эктодоменов MET

Последовательности кДНК эктодоменов человеческого MET (decoyMET), несущие одиночные аминокислотные замены, были получены с использованием набора для сайт-направленного мутагенеза QuickChange II (кат.# 200524 Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния) в соответствии с инструкциями производителя. Процедура требует разработки смысловых и антисмысловых олигонуклеотидов, которые включают желаемую точечную мутацию. Были задействованы следующие олигонуклеотиды:

- мутация K842E:

sn. (смысловой)5'-gtacataatcctgtgtttgagccttttgaaaagccagtg-3' (SEQ ID NO: 41)

as. (антисмысловой) 5'-cactggcttttcaaaaggctcaaacacaggattatgtac-3' (SEQ ID NO: 42)

- мутация Q807K:

sn. 5'-ccactccttccctgaaacagctgaatctgcaactcc-3' (SEQ ID NO: 43)

as. 5'-ggagttgcagattcagctgtttcagggaaggagtgg-3' (SEQ ID NO: 44)

- мутация D864N:

sn. 5'-ctggaaattaagggaaataatattgaccctgaagcagttaaagg-3' (SEQ ID NO: 45)

as. 5'-cctttaactgcttcagggtcaatattatttcccttaatttccag-3' (SEQ ID NO: 46).

Сконструированные растворимые рецепторы были получены путем временной трансфекции клеток HEK-293T плазмидами pcDNA3.1 (кат.# V79020 Invitrogen Corporation, Camarillo, CA), экспрессирующие кДНК, кодирующие мутанты decoyMET или decoyMET дикого типа. Трансфицированные клетки подвергали голоду в течение трех дней и собирали супернатанты клеточных культур, содержащие растворимые рецепторы. Очистку рекомбинантных белков проводили аффинной хроматографией с использованием колонок HisTrap HP (кат.# 17524701 GE Healthcare, Freiburg, Germany) в соответствии с инструкциями производителя. Крупномасштабное производство и очистку белка выполняла компания U-Protein Express BV (Утрехт, Нидерланды).

Анализы фосфорилирования МЕТ

A549 после сывороточного голодания инкубировали в течение 24 ч с 125 нМ MvDN30 или 2 мкМ decoyMET^K842E, отдельно или в комбинации, а затем стимулировали 50 нг/мл HGF (кат.# 294-HG-025 R&D Systems) в течение 2 часов при 4 °C. Общие клеточные лизаты анализировали с помощью вестерн-блоттинга с использованием следующих первичных антител: фосфо-Tyr^1234/1235 против MET (D26, кат.# 3077 Cell Signaling Technology, Беверли, Массачусетс); anti-MET (3D4, кат.№ 08-1366 Invitrogen Corporation); антивинкулин (клон hVIN-1, кат.# V9131 Sigma Life Science, Сент-Луис, Миссури). IgG1 против мыши (кат.# JI115035003) и IgG против кролика (кат.# JI111035003) вторичные антитела, конъюгированные с HRP, были получены от Jackson ImmunoResearch. (West Grove, PA).

Анализы связывания ELISA

Для анализа взаимодействия между decoyMET и mAb DN30 очищенные аффинно-очищенные растворимые рецепторы (decoyMET дикого типа или decoyMET^K842E, 100 нг/лунку) иммобилизовали на планшетах для ELISA и добавляли возрастающие концентрации антитела (0-100 нМ) в жидкую фазу. Связывание выявляли с использованием конъюгированных с HRP антител против мыши (кат.# NA931 GE Healthcare). Для анализа взаимодействия между ними и слитыми белками аффинно очищенный decoyMET дикого типа (100 нг/лунку) иммобилизовали на планшетах для ELISA и добавляли возрастающие концентрации слитых белков или scMvDN30 (0-1000 нМ) в жидкой фазе. Связывание выявляли с использованием конъюгированного с HRP антитела против k-цепи человека (кат.# A7164 Sigma-Aldrich). Для анализа связывания decoyMET или слитых белков с HGF растворимые рецепторы (100 нг/лунку) иммобилизовали на планшетах для ELISA и инкубировали с возрастающими концентрациями HGF (0-11 нМ) в растворе. Связывание детектировали с использованием биотинилированного антитела против HGF (кат.# BAF294 R&D Systems) и выявлено с помощью конъюгированного с стрептавидином HRP (кат.№ RPN 1231 GE Healthcare).

Колориметрический анализ был проведен с помощью считывающего устройства для планшетов с несколькими метками VICTOR-X4 (Perkin Elmer Instruments INC., Whaltman, MA). Данные были проанализированы и аппроксимированы с использованием программного обеспечения Prism (GraphPad).

Биологические анализы in vitro

Для анализов роста, не зависящего от закрепления, клетки суспендировали в соответствующей культуральной среде с добавлением 2 % FBS (фетальная бычья сыворотка) и 0,5 % агарозы Seaplaque (кат.# 50100 BMA, Rockland, ME) и высевали в 48-луночные планшеты (500 клеток/лунку) поверх 1 % агарозы. Свежую среду, содержащую препараты, вносили дважды в неделю. Клетки A549 обрабатывали 1 мкМ MvDN30 или 1 мкМ decoyMET^K842E, отдельно или в комбинации, в присутствии 30 нг/мл HGF. Клетки U87-MG обрабатывали 0,5 мкМ MvDN30 или 1 мкМ decoyMET^K842E, отдельно или в комбинации. Колонии окрашивали солями тетразолия (кат.# T01380 Sigma-Aldrich) через 12 дней культивирования. Рост колоний определяли с использованием программного обеспечения Metamorph (Molecular Devices, Саннивейл, Калифорния). Для анализа клеточной инвазии клетки HPAF-II (1,5 × 10⁵/на лунку) суспендировали в бессывороточной культуральной среде в присутствии 0,5 мкМ MvDN30 или 1 мкМ decoyMET^K842E, отдельно или в комбинации, и высевали в верхний отсек камер системы Трансвелл, предварительно покрытых 30 мкг/лунку Matrigel Matrix (кат.# 354234 Corning Incorporated, Нью-Йорк). Культуральная среда с добавлением 2 % FBS и 12,5 нг/мл HGF была добавлена в нижнее отделение камеры. Через 24 ч клетки на верхней стороне фильтров трансвелл механически удаляли, в то время как клетки, мигрировавшие через мембрану, фиксировали 11 % глутаральдегидом (кат.# 340855 Sigma-Aldrich) и окрашивали 0,1 % кристаллическим фиолетовым (кат. # C3886 Sigma-Aldrich). Инвазию клеток количественно оценивали с помощью программного обеспечения Image-J. Для анализа клеточного рассеяния клетки HPAF-II (8000 на лунку) высевали в 96-луночные планшеты в полную культуральную среду. Через 6 ч добавляли увеличивающиеся концентрации (0-4 мкМ) MvDN30 или decoyMET^K842E, отдельно или в комбинации 1:1. Еще через 24 часа клетки стимулировали 6,25 нг/мл HGF в течение 20 часов. Клетки фиксировали 11 % глутаровым альдегидом и окрашивали 0,1 % кристаллическим фиолетовым. Для анализа подвижности клеток в реальном времени клетки HPAF-II высевали в E-планшеты (8000 на лунку; Roche Diagnostics, Mannheim, Germany) и обрабатывали, как указано выше; при нанесении слитые белки тестировали в концентрации 3 мкМ. Электрический импеданс контролировали непрерывно в течение 48 часов с записью данных каждые десять минут с использованием устройства X-Celligence RTCA (Roche Diagnostic). Значения выражены в виде индекса клеток, нормализованного в момент добавления HGF.

Для роста клеток, зависимого от закрепления, клетки EBC-1 высевали по 2000 клеток/лунку в 96-луночный планшет в 5 % культуральной среде FBS. Через 24 часа среду заменяли свежей средой с 5 % FBS и тестируемыми молекулами (возрастающие концентрации - от 0,001 до 3 мкМ). Жизнеспособность клеток оценивали через 72 часа с помощью CellTiter-Glo (кат.# G7573 Promega Corp., Мэдисон, Висконсин) в соответствии с инструкциями производителя. Хемолюминесценцию детектировали с помощью VICTOR X4.

Иммунофлуоресцентный анализ

Иммунофлуоресцентный анализ опухолевых клеток и тканей выполняли, как описано^16,25. Окрашивание проводили первичным антителом против фосфо-Tyr^1234/1235 против MET (D26) и выявляли вторичным антителом, конъюгированным с Alexa Fluor 555 (кат.# A31570 Thermo Fisher Scientific). Клетки контрастировали с 488-конъюгированным фаллоидином (кат.# A12379 Thermo Fisher Scientific). Все изображения были получены с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа Leica TCS SP5 AOBS (Leica Microsystems). Параметры получения иммунофлуоресценции оставались постоянными для каждой клеточной линии или опухолевой ткани. Средняя интенсивность флуоресценции (MFI) оценивалась с помощью программного обеспечения ImageJ, измеряли среднюю интенсивность пикселей в каждом канале, за вычетом фона. Для клеточных линий MFI фосфоМЕТ нормализовали по фаллоидину, тогда как для опухолей все сигналы нормализовали по DAPI.

Эксперименты in vivo

Все процедуры на животных выполнялись в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по этике экспериментов на животных Fondazione Piemontese per la Ricerca sul Cancro и Министерством здравоохранения Италии. Мыши NOD-SCID были приобретены у Charles River (Calco, Италия); hHGF-Ki SCID мышей) были получены от AVEO Pharmaceuticals, Кембридж, Массачусетс.

Клетки U87-MG вводили подкожно (2 × 10⁶/мышь) в правый бок самок мышей NOD-SCID. Рост опухоли контролировали измерением штангенциркулем дважды в неделю. Объем опухоли рассчитывали по формуле: V = 4/3 π (x/2)(y/2)(z/2), где x, y и z - высота, ширина и глубина опухолевой массы. Когда опухоли достигли объема 80-100 мм³ (день 0), мышей разделяли на четыре гомогенные группы и дважды в неделю вводили внутриопухолевую инъекцию: носитель (n = 10); MvDN30, 12,5 мкг (n = 9); K842E, 125 мкг (n = 9); комбинация последних (n = 10). После 22 дней обработки мышей умерщвляли, опухоли вырезали и заливали парафином для гистологического анализа. Кратное увеличение объема опухоли рассчитывали как отношение между значением на 22 день и значением на 0 день.

Клетки HPAF-II или Capan-1 трансдуцировали 100 нг/мл p24 лентивирусных векторов, несущих ген люциферазы под контролем промотора CMV, как описано¹. Экспрессирующие люциферазу клетки HPAF-II (10⁴/мышь) инъецировали в поджелудочную железу самок мышей hHGF-KI SCID в возрасте от 4 до 6 недель. Через два дня мышам внутрибрюшинно вводили XenoLight D-люциферин (150 мг/кг; кат.# 122799 Perkin Elmer), разделенных на гомогенные группы на основе сигнала биолюминесценции с использованием аппарата IVIS Spectrum CT (Perkin Elmer) и случайным образом распределенных по 4 группам обработки: носитель (n = 10); MvDN30 (10 мг/кг, n = 6); decoyMET^K842E (10 мг/кг, n = 6); MvDN30 + decoyMET^K842E (10 + 10 мг/кг, n = 6). Обработку проводили ежедневно (MvDN30) или каждые два дня (decoyMET^K842E) путем внутрибрюшинной инъекции. При умерщвлении после пяти недель обработки опухоли и легкие были эксплантированы. Опухоли помещали в парафин или реагент ОСТ и обрабатывали для иммуногистохимического или иммунофлуоресцентного анализа соответственно. Пролиферацию опухолевых клеток определяли с использованием моноклонального антитела против Ki67 (MIB-1, кат.# M724001-2 Agilent Technologies), как описано ранее¹⁸. Легкие обрабатывали для гистохимического анализа, а микрометастазы оценивали с помощью световой микроскопии на залитых парафином и окрашенных НЕ непоследовательных срезах. Для каждой мыши было проанализировано десять срезов; подсчитывали метастатические очаги и их площадь количественно определяли с помощью программного обеспечения ImageJ.

Экспрессирующий люциферазу Capan-1 (10⁶/мышь) инъецировали в поджелудочную железу самок мышей SCID hHGF-Ki в возрасте от 4 до 6 недель. Стратификацию мышей проводили, как указано выше. Группы обработки: носитель (n= 14), MvDN30 и decoyMET^K842E в комбинации (10 + 10 мг/кг; группа 1, n = 4; группа 2, n = 6), scMvDN30_ K842E_L60 (10 мг/кг; n= 5), K842E scMvDN30_L60 (10 мг/кг; n = 4), scMvDN30_K842E_L134 (10 мг/кг; n= 6), K842E_scMvDN30_L134 (10 мг/кг; n = 5). Обработку проводили ежедневно (MvDN30) или каждые два дня (decoyMET^K842E) путем внутрибрюшинной инъекции. После пяти недель обработки животных умерщвляли и собирали печень для измерения сигналов биолюминесценции по спектру IVIS. Мышей считали метастазоположительными, когда биолюминесценция, обнаруженная в печени с помощью IVIS Spectrum, превышала 10⁵ фотонов в секунду.

Статистический анализ

Среднее, стандартное отклонение (SD) и стандартная ошибка среднего (SEM) были рассчитаны с использованием программного обеспечения Microsoft Office Excel 2010 (Microsoft Corporation, Редмонд, Вашингтон). Для расчета значений K_d данные анализов ELISA были проанализированы и подогнаны в соответствии с нелинейной регрессией, кривой гиперболы связывания одного сайта, с использованием программного обеспечения GraphPad Prism (GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния). Для расчета значений IC₅₀ данные анализов пролиферации были проанализированы и подогнаны в соответствии с нелинейной регрессией, сигмоидальной кривой зависимости реакции от дозы, с использованием программного обеспечения GraphPad Prism. Статистическую значимость определяли с использованием двустороннего парного критерия Стьюдента. Все эксперименты повторяли не менее трех раз (биологические повторы). Эксперименты in vivo повторяли дважды. На фигурах показан один репрезентативный эксперимент.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> МЕТИС ПРИСИЖН МЕДСИН СБ С.Р.Л.

<120> КОМБИНАЦИЯ АНТИТЕЛА ПРОТИВ HGFR И HEGFR ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ОПУХОЛИ

И/ИЛИ МЕТАСТАЗА

<130> BIT20544-CF

<150> IT 102018000003875

<151> 2018-03-22

<160> 46

<170> PatentIn версия 3.5

<210> 1

<211> 10

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR1

<400> 1

Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Gly Ser Tyr

1 5 10

<210> 2

<211> 3

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR2

<400> 2

Ala Ala Ser

1

<210> 3

<211> 9

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> VL-CDR3

<400> 3

Gln Gln Ser Tyr Glu Asp Pro Leu Thr

1 5

<210> 4

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR1

<400> 4

Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp

1 5

<210> 5

<211> 8

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR2

<400> 5

Ile Asn Pro Ser Ser Gly Arg Thr

1 5

<210> 6

<211> 5

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> VH-CDR3

<400> 6

Ala Ser Arg Gly Tyr

1 5

<210> 7

<211> 238

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность легкой цепи VL-CL

<400> 7

Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Asp Tyr Asp Gly Gly Ser Tyr Met Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

65 70 75 80

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln Gln Ser Tyr Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

165 170 175

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

195 200 205

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

210 215 220

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230 235

<210> 8

<211> 281

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность тяжелой цепи VH-CH1

<400> 8

Met Gly Trp Ser Tyr Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Asp

1 5 10 15

Gly His Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Thr Glu Leu Val Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser Gly Arg Thr Asn Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Asn Lys Val Thr Val Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Asn Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg Gly Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr

115 120 125

Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro

130 135 140

Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val

145 150 155 160

Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala

165 170 175

Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly

180 185 190

Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly

195 200 205

Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys

210 215 220

Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Gly

225 230 235 240

Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala Trp Ser His

245 250 255

Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys

260 265 270

Gly Ala Ala His His His His His His

275 280

<210> 9

<211> 30

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность VL-CDR1

<400> 9

caaagtgttg attatgatgg tggtagttat 30

<210> 10

<211> 9

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность VL-CDR2

<400> 10

gctgcatcc 9

<210> 11

<211> 27

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность VL-CDR3

<400> 11

cagcaaagtt atgaagaccc gctcacg 27

<210> 12

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность VH-CDR1

<400> 12

ggctacacct tcaccagtta ctgg 24

<210> 13

<211> 24

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность VH-CDR2

<400> 13

attaatccta gcagcggtcg tact 24

<210> 14

<211> 15

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность VH-CDR3

<400> 14

gcaagtaggg gctac 15

<210> 15

<211> 717

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность легкой цепи VL-CL

<400> 15

atggagacag acacaatcct gctatgggtg ctgctgctct gggttccagg ctccactggt 60

gacattgtgc tgacccaatc tccagcttct ttggctgtgt ctctagggca gagggccacc 120

atctcctgca aggccagcca aagtgttgat tatgatggtg gtagttatat gagttggttc 180

caacagagac caggacagcc acccaaactc ctcatctctg ctgcatccaa ccttgaatct 240

ggcatcccag ccaggtttag tggcagtggc tctgggacag acttcaccct caatatccat 300

cctgtggagg aggaggatgt tgcaacctat tactgtcagc aaagttatga agacccgctc 360

acgttcggtg ctggtaccaa ggtggagatc aaacgaactg tggctgcacc atctgtcttc 420

atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg 480

aataacttct atcccagaga ggccaaagta cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg 540

ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc 600

agcaccctga cgctgagcaa agcagactac gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc 660

acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca aagagcttca acaggggaga gtgttaa 717

<210> 16

<211> 846

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность тяжелой цепи VH-CH1

<400> 16

atgggatgga gctatatcat cctctttttg gtagcaacag ctacagatgg ccactcccag 60

gtccaactgc aacagcctgg gactgaactg gtgaagcctg gggcttcagt gaagctgtcc 120

tgcaaggctt ctggctacac cttcaccagt tactggatac actgggtgaa gcagaggcct 180

ggacaaggcc ttgagtggat tggagagatt aatcctagca gcggtcgtac taactacaac 240

gagaaattca agaacaaggt cacagtgact gtagacaaat cttccaccac agcctacatg 300

caactcagca acctgacatc tgaggactct gcggtctatt actgtgcaag taggggctac 360

tggggccaag gcaccactct cacagtctcc tcagctagca cgaagggccc atcggtcttc 420

cccctggcac cctcctccaa gagcacctct gggggcacag cggccctggg ctgcctggtc 480

aaggactact tccccgaacc ggtgacggtg tcgtggaact caggcgccct gaccagcggc 540

gtgcacacct tcccggctgt cctacagtcc tcaggactct actccctcag cagcgtggtg 600

accgtgccct ccagcagctt gggcacccag acctacatct gcaacgtgaa tcacaagccc 660

agcaacacca aggtggacaa gaaagttgag cccaaatctt gtgacaaaac tcacacaggt 720

gccgcatgga gccaccccca gttcgaaaaa ggggccgcat ggagccaccc ccagttcgaa 780

aaaggggccg catggagcca cccccagttc gaaaaagggg ccgcacacca tcaccatcac 840

cattag 846

<210> 17

<211> 562

<212> ПРТ

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> scFab

<400> 17

Met Glu Thr Asp Thr Ile Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro

1 5 10 15

Gly Ser Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala

20 25 30

Val Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Asp Tyr Asp Gly Gly Ser Tyr Met Ser Trp Phe Gln Gln Arg Pro

50 55 60

Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Ser Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser

65 70 75 80

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr

85 90 95

Leu Asn Ile His Pro Val Glu Glu Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys

100 105 110

Gln Gln Ser Tyr Glu Asp Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Val

115 120 125

Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu

145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn

165 170 175

Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala

195 200 205

Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly

210 215 220

Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys Gly Gly

225 230 235 240

Ser Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Thr Gly Thr Ser Ser Ser Gly Thr

245 250 255

Gly Thr Ser Ala Gly Thr Thr Gly Thr Ser Ala Ser Thr Ser Gly Ser

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Gly Gly

275 280 285

Thr Ala Thr Ala Gly Ala Ser Ser Gly Ser Gln Leu Gln Gln Pro Gly

290 295 300

Thr Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala

305 310 315 320

Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp Ile His Trp Val Lys Gln Arg

325 330 335

Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Glu Ile Asn Pro Ser Ser Gly

340 345 350

Arg Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asn Lys Val Thr Val Thr Val

355 360 365

Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Asn Leu Thr Ser

370 375 380

Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ser Arg Gly Tyr Trp Gly Gln

385 390 395 400

Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val

405 410 415

Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala

420 425 430

Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser

435 440 445

Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

450 455 460

Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro

465 470 475 480

Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys

485 490 495

Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp

500 505 510

Lys Thr His Thr Thr Gly Thr Arg Gly Ala Ala Trp Ser His Pro Gln

515 520 525

Phe Glu Lys Gly Ala Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala

530 535 540

Ala Trp Ser His Pro Gln Phe Glu Lys Gly Ala Ala His His His His

545 550 555 560

His His

<210> 18

<211> 1692

<212> ДНК

<213> Искуственная последовательность

<220>

<223> Нуклеотидная последовательность scFv

<400> 18