ИММУНОКОНЪЮГАТЫ IL2 И МУТАНТНОГО TNF Российский патент 2021 года по МПК C07K14/525 C07K14/55 C07K16/18 C07K19/00 A61K38/20 A61K39/395 A61K47/68 A61P35/00 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к конъюгатам, содержащим интерлейкин 2 (IL2), мутантную форму фактора некроза опухоли, такого как фактор некроза опухоли альфа (TNFα) и молекулу антитела. Молекула антитела предпочтительно связывается с антигеном, ассоциированным с неопластическим ростом опухоли и/или ангиогенезом, таким как экстрадомен A (EDA) и экстрадомен B (EDB) фибронектина. Конъюгаты можно использовать, например, для лечения злокачественной опухоли.

Уровень техники

Многие цитокины продемонстрировали высокую противоопухолевую активность в доклинических экспериментах, и они являются перспективными средствами для терапии злокачественной опухоли. Однако, несмотря на обнадеживающие результаты в моделях на животных, только несколько цитокинов, таких как пролейкин 1 (IL2), роферон A1 (интерферон альфа-2a [IFNα 2a]), интрон A1 (IFNα 2b), беромун 1 (рекомбинантный TNFα) были одобрены в качестве лекарственных средств против злокачественной опухоли. В настоящее время показания для цитокинов включают метастазирующий почечно-клеточный рак, злокачественную меланому, волосатоклеточный лейкоз, хроническую миелоидную лимфому, саркому и множественную миелому. Цитокины можно вводить либо отдельно, либо в комбинации с химиотерапией.

Следующей проблемой провоспалительных цитокинов является, в частности, то, что их применению в терапии часто препятствует значительная токсичность даже в низких дозах, которая препятствует повышению терапевтически активных доз (Hemmerle et al. (2013) Br. J. Cancer 109, 1206-1213).

В попытках увеличить терапевтический индекс определенных цитокинов, были предложены слитые белки антитело-цитокин (также обозначаемые как "иммуноцитокины"). В этих конъюгатах антитело служит в качестве "носителя" для селективного накопления в области заболевания, в то время как цитокиновый груз ответственен за терапевтическую активность (Pasche & Neri, 2012, Drug Discov. Today, 17, 583). Определенные иммуноцитокины на основе провоспалительных грузов (таких как IL2, IL4, IL12 и TNFα) демонстрируют выраженную противоопухолевую активность в моделях на мышах (Hess et al., 2014, Med. Chem. Comm., 5, 408) и дали обнадеживающие результаты у пациентов как с солидными опухолями, так и с гематологическими злокачественными опухолями (Eigentler et al., 2011, Clin. Cancer Res. 17, 7732-7742; Papadia et al., 2013, J. Surg. Oncol. 107, 173-179; Gutbrodt et al., 2013, Sci. Transl. Med. 5, 201-204; Weide et al., 2014, Cancer Immunol. Res. 2, 668-678; Danielli et al., 2015, Cancer Immunol. Immunother. 64, 113-121]. Антитело F8 (специфичное к альтернативно-сплайсированному домену EDA фибронектина, маркеру опухолевого ангиогенеза; Rybak et al. (2007) Cancer Res. 67, 10948-10957) используют для нацеливания на опухоль, как отдельно, так и слитым либо с TNF, либо с IL2 (Villa et al. (2008) Int. J. Cancer 122, 2405-2413; Hemmerle et al. (2013) Br. J. Cancer 109, 1206-1213; Frey et al. (2008) J. Urol. 184, 2540-2548).

Описаны конструкции, которые содержат три копии одного модифицированного цитокина суперсемейства TNF, который имеет сниженную активность в отношении его рецептора (WO2015/007903). Конструкции специфически доставляют к клеткам-мишеням посредством нацеливающей части. Модифицированные цитокины, используемые в этих конструкциях, включают мутантный TNF с активностью в диапазоне от 0,02% до 5% от активности TNF дикого типа, включая мутантные TNF с заменами Y87Q, I97S, Y115A, Y87F, Y115G или I97A. Также описан эффект R32G.

В некоторых случаях иммуноцитокины могут опосредовать устранение опухоли в моделях злокачественной опухоли на мышах при использовании в качестве единственных средств (Gutbrodt et al., 2013, Sci. Transl. Med. 5, 201-204]. Однако в большинстве случаев один продукт-иммуноцитокин не способен индуцировать полное устранение опухоли. Однако излечение злокачественной опухоли описано для комбинаций иммуноцитокинов с цитотоксическими средствами (Moschetta et al., 2012, Cancer Res. 72, 1814-1824], интактными антителами (Schliemann et al., 2009, Blood, 113, 2275-2283] и облучением внешним пучком (Zegers et al., 2015, Clin. Cancer Res., 21, 1151-1160).

Кроме того, несколько комбинаций иммуноцитокинов используются в терапии. Например, конъюгаты L19-IL2 и L19-TNFα были способны излечить нейробластому в модели заболевания на полностью сингенных мышах, в то время отдельные иммуноцитокины, используемые в качестве единственных средств, не приводили к устранению заболевания (Balza et al., 2010, Int. J. Cancer, 127, 101). Комбинация грузов IL2 и TNFα также продемонстрировала перспективные результаты в клинических испытаниях. Было показано, что слитые белки L19-IL2 и L19-TNF обладают высокой синергичностью при внутриочаговом лечении определенных солидных опухолей у мышей (Schwager et al., 2013, J. Invest. Dermatol. 133, 751-758). Соответствующие полностью человеческие слитые белки вводят внутрь очага повреждения пациентам с меланомой стадии IIIC (Danielli et al., 2015, Cancer Immunol. Immunother. 64, 113-121), и они демонстрируют лучшие результаты по сравнению с внутриочаговым введением интерлейкина-2 (Weide et al., 2011, Cancer - 116, 4139-4146) или L19-IL2 (Weide et al., 2014, Cancer Immunol. Immunother. 2, 668-678). Однако генетическое слияние цитокина с антителом не всегда приводит к увеличенной эффективности. Например, слияние интерлейкина-17 с антителом для нацеливания не снижало рост опухоли (Pasche et al., 2012, Angiogenesis 15, 165-169).

Также были предприняты попытки получить "двойные иммуноцитокины", в которых антитело является генетически слитым с двумя различными цитокинами. Например, интерлейкин-12 (IL12) и TNFα были включены в одну молекулярную структуру. Однако эти попытки не были успешными и не привели к программам клинических разработок. В частности, описана тройная слитая конструкция, состоящая из: (i) антитела L19 в формате scFv (специфичного к альтернативно-сплайсированному домену EDB фибронектина, маркеру опухолевого ангиогенеза); (ii) TNFα мыши; и (iii) IL12 мыши в одноцепочечном формате (Halin et al., 2003, Cancer Res., 63, 3202-3210). Этот слитый белок смогли экспрессировать и очистить до однородного состояния. Этот слитый белок также связывался со своим антигеном с высокой аффинностью и специфичностью, однако (в отличие от L19-TNFα и L19-IL12), он не локализовался в солидных опухолях in vivo, о чем свидетельствовали исследования количественного биораспределения у мышей, имеющих опухоль. Таким образом, поведение двойных иммуноцитокинов in vivo является чрезвычайно непредсказуемым.

Также описаны бифункциональные слитые белки цитокинов, в которых цитокины связаны с интактным целым антителом (или Fc-частью антитела) (Gillies et al., 2002, Cancer Immunol. Immunother. 51, 449). Эти слитые белки содержали интерлейкин-2/интерлейкин-12 (IL2/IL12) или интерлейкин-4/гранулолцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (IL4/GM-CSF). Активность цитокинов была сохранена в конструкциях, в которых цитокины были слиты тандемно с С-концом Fc или тяжелой (H) цепи антитела, а также в конструкциях, в которых один цитокин был слит с С-концом H-цепи, в то время как второй цитокин был слит с N-концом вариабельной области либо H, либо легкой (L) цепи. Связывание антигена слитыми белками антитело-цитокин сохранялось. Однако терапевтическая активность in vivo описана только для применений в генной терапии (т.е. опухолевые клетки, трансфицированные соответствующими иммуноцитокинами IL2/IL12), но не для терапевтических белков. Бифункциональные слитые белки цитокинов, содержащие другие типы нацеливающих частей, не описаны.

Имманентная сложность успешной экспрессии иммуноконъюгатов, содержащих два различных цитокина в одной молекуле (также называемых "двойными иммуноцитокинами") и бесперспективные результаты, полученные для таких молекул, как описано выше (например, в Halin et al (2003)), означают, что к этим молекулярным форматам отсутствует интерес в отношении клинических применений.

Сущность изобретения

Авторы настоящего изобретения установили, что применение мутанта фактора некроза опухоли (TNF) со сниженной активностью улучшает переносимость двойного иммуноцитокина, который содержит TNF и IL2, а также нацеливающую молекулу антитела, без изменения эффективности.

Один из аспектов настоящего изобретения относится к конъюгату, содержащему интерлейкин-2 (IL2), мутант TNF, имеющий сниженную активность, и молекулу антитела, которая связывает антиген, ассоциированный с неопластическим ростом и/или ангиогенезом.

Другой аспект изобретения относится к молекуле нуклеиновой кислоты, кодирующей такой конъюгат, а также к экспрессирующему вектору, содержащему такую нуклеиновую кислоту. Также предусматривается клетка-хозяин, содержащая такой вектор.

Другой аспект изобретения относится к конъюгату, описанному в настоящем описании, для применения в способе лечения злокачественной опухоли путем нацеливания IL2 и мутанта TNF, предпочтительно мутанта TNFα, на новообразованные сосуды in vivo, а также к конъюгату, описанному в настоящем описании, для применения в способе доставки IL2 и мутанта TNF, предпочтительно мутанта TNFα, в новообразованные сосуды опухоли у пациента.

Другой аспект изобретения относится к способу лечения злокачественной опухоли путем нацеливания IL2 и мутанта TNF, предпочтительно мутанта TNFα, на новообразованные сосуды у пациента, причем способ включает введение терапевтически эффективного количества конъюгата, описанного в настоящем описании, пациенту, а также к способу доставки IL2 и мутанта TNF, предпочтительно мутанта TNFα, в новообразованные сосуды опухоли у пациента, включающему введение пациенту конъюгата, описанного в настоящем описании.

Кроме того, другой аспект изобретения относится к применению конъюгата, описанного в настоящем описании, для получения лекарственного средства для лечения злокачественной опухоли. Аналогично предусматривается применение конъюгата, описанного в настоящем описании, для получения лекарственного средства для доставки IL2 и мутанта TNF, предпочтительно мутанта TNFα, в новообразованные сосуды опухоли.

Краткое описание чертежей

На фиг.1 представлена активность уничтожения клеток конъюгатом huIL2-F8-huTNFα и конъюгатом huIL2-F8-мутант huTNFα (R32A). Протестированные конъюгаты представляли собой huIL2-F8-huTNFα и huIL2-F8-huTNFα (R32A), которые содержали мутантный TNFα в положении 32, IL2 и антитело F8 против ED-A. Активность уничтожения клеток этим мутантным конъюгатом сравнивали с активностью уничтожения клеток, наблюдаемой в присутствии конъюгата huIL2-F8-huTNFα. Активность уничтожения клеток конъюгатом huIL2-F8-мутант huTNFα (R32A) была более низкой, чем у конъюгата huIL2-F8-huTNFα, как можно видеть из величин EC50. Величины EC50 представляют собой концентрацию лекарственного средства, требуемую для полумаксимальной активности.

На фиг.2 представлена эффективность нацеливания in vivo конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R32A), оцененная посредством анализа биораспределения. Конъюгат huIL2-F8-мутант huTNFα (R32A) селективно накапливался в опухоли в модели тератокарциномы F9 на мышах.

На фиг.3 представлен анализ биологической активности IL2 конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32A) на основе пролиферации клеток CTLL-2.

На фиг.4 представлен анализ биологической активности TNF конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32A) на основе уничтожения клеток HT1080.

На фиг.5 представлен количественный анализ биораспределения меченного радиоактивным йодом конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32A) у иммунокомпетентных мышей, имеющих опухоли тератокарциномы F9.

Подробное описание

Настоящее изобретение относится к конъюгату, содержащему (i) часть, являющуюся интерлейкином-2 (IL2), (ii) часть, которая представляет собой мутант фактора некроза опухоли (TNF), имеющий сниженную активность, и (iii) молекулу антитела, которая связывает антиген, ассоциированный с неопластическим ростом и/или ангиогенезом.

Термин "молекула антитела" описывает иммуноглобулин, как природный, так и частично или полностью синтетический. Также термин относится к любому полипептиду или белку, содержащему антигенсвязывающий центр антитела. Молекулы антител можно выделять или получать путем очистки из природных источников, или в ином случае их можно получать посредством генетической рекомбинации или химического синтеза, и они могут содержать неприродные аминокислоты.

Антитела могут быть модифицированы рядом способов, термин "молекула антитела" следует считать охватывающим какой-либо конкретный связывающий представитель или вещество, имеющие антигенсвязывающий центр антитела с требуемой специфичностью и/или связыванием с антигеном. Таким образом, этот термин охватывает фрагменты антитела, в частности, антигенсвязывающие фрагменты, и производные, включая любой полипептид, содержащий антигенсвязывающий центр антитела, как природный, так и полностью или частично синтетический. Таким образом, он включает химерные молекулы, содержащие антигенсвязывающий центр антитела или эквивалент, слитый с другим полипептидом (например, принадлежащим к другому классу или подклассу антител). Клонирование и экспрессия химерных антител описаны в EP-A-0120694 и EP-A-0125023, и в большом количестве более поздней литературы.

Как упоминалось выше, фрагменты целого антитела могут выполнять функцию связывания антигенов. Примерами связывающих фрагментов являются (i) Fab-фрагмент, состоящий из доменов VL, VH, CL и CH1; (ii) Fd-фрагмент, состоящий из доменов VH и CH1; (iii) Fv-фрагмент, состоящий из доменов VL и VH одного антитела; (iv) dAb-фрагмент (Ward et al. (1989) Nature 341, 544-546; McCafferty et al., (1990) Nature, 348, 552-554; Holt et al. (2003) Trends in Biotechnology 21, 484-490), который состоит из домена VH или VL; (v) выделенные области CDR; (vi) F(ab')2-фрагмент - двухвалентный фрагмент, содержащий два связанных Fab-фрагмента; (vii) одноцепочечные молекулы Fv (scFv), где домен VH и домен VL связаны пептидным линкером, который позволяет связывание двух доменов с образованием антигенсвязывающего центра (Bird et al. (1988) Science, 242, 423-426; Huston et al. (1988) PNAS USA, 85, 5879-5883); (viii) биспецифические одноцепочечные димеры Fv (PCT/US92/09965); (ix) "диантитела" - поливалентные или мультиспецифические фрагменты, сконструированные посредством слияния генов (WO94/13804; Holliger et al. (1993a), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448) и (x) формат одноцепочечных диантител, где каждый из доменов VH и VL в наборе соединен коротким или "негибким" пептидным линкером. Fv, scFv или молекулы диантител можно стабилизировать путем включения дисульфидных мостиков, связывающих доменов VH и VL (Reiter et al. (1996), Nature Biotech, 14, 1239-1245). Одноцепочечный Fv (scFv) может находиться в минииммуноглобулине или малом иммунопротеине (SIP), например, как описано в (Li et al., (1997), Protein Engineering, 10: 731-736). SIP может содержать молекулу scFv, слитую с доменом CH4 секреторной изоформы IgE человека IgE-S2 (ε_S2-CH4; Batista et al., (1996), J. Exp. Med., 184: 2197-205), образующим гомодимерную молекулу минииммуноглобулина. Также можно получать миниантитела, содержащие scFv, связанный с CH3-доменом (Hu et al. (1996), Cancer Res., 56(13):3055-61). Другими примерами связывающихся фрагментов являются Fab', который отличается от Fab-фрагментов присоединением нескольких остатков на С-конце CH1-домена тяжелой цепи, включая один или несколько остатков цистеина из шарнирной области антитела, и Fab'-SH, который представляет собой Fab'-фрагмент, в котором остаток(и) цистеина константных доменов содержат свободную тиольную группу.

Время полужизни молекул антител для применения в конъюгатах, описанных в настоящем описании, может быть увеличено посредством химической модификации, особенно посредством пегилирования, или путем включения в липосому.

Подходящие молекулы антител для применения в конъюгатах, описанных в настоящем описании, включают диантитела или более предпочтительно scFv. Диантитела и scFv не содержат Fc-область антитела, что потенциально снижает эффекты антиидиотипической реакции. Предпочтительно, молекула антитела для применения в конъюгатах, описанных в настоящем описании, представляет собой scFv.

Когда молекула антитела представляет собой scFv, домены VH и VL антитела предпочтительно связаны линкером из 10-20 аминокислот, линкером из 14-20 аминокислот, предпочтительно линкером из 10-14 аминокислот. Подходящие линкеры известны в данной области и доступны квалифицированному специалисту. Например, линкер может иметь последовательность, указанную в SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 50 или SEQ ID NO: 51.

Когда молекула антитела представляет собой диантитело, домены VH и VL могут быть связаны линкером из 5-12 аминокислот. Диантитело содержит две молекулы VH-VL, которые связаны с образованием димера. Домены VH и VL каждой молекулы VH-VL могут быть связаны линкером из 5-12 аминокислот.

Авторы настоящего изобретения показали, что конъюгат, содержащий IL2; мутантный TNFα и молекулу антитела, которая связывает экстрадомен A (ED-A) фибронектина, демонстрирует сниженную токсичность по сравнению с конъюгатом, содержащим IL2; TNFα и молекулу антитела, которая связывает экстрадомен A (ED-A) фибронектина. Более того, авторы настоящего изобретения также показали, что конъюгат, содержащий IL2; мутантный TNFα и молекулу антитела, которая связывает изоформу экстрадомена B (ED-B) фибронектина, демонстрирует сниженную токсичность по сравнению с рекомбинантным TNFα. Другие конъюгаты, содержащие IL2 и мутантный TNF, предпочтительно TNFα, и молекулу антитела, которая связывает антиген, ассоциированный с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, имеют аналогичным образом сниженную токсичность.

Токсичность конъюгата, содержащего мутантый TNF, как описано в настоящем описании, может быть снижена по сравнению с соответствующим конъюгатом, содержащим TNF дикого типа. Сниженная токсичность может обеспечивать улучшенную переносимость у пациента, например, снижение одного или нескольких неблагоприятных симптомов, ассоциированных с введением конъюгата(ов) пациенту. Неблагоприятные симптомы, уменьшаемые в результате уменьшения токсичности, могут включать снижение массы тела, тошноту, рвоту, лихорадку, озноб, приливы, крапивницу, сыпь, легочную токсичность, диспноэ, гипотензию, анафилаксию, сывороточную болезнь, повышенный уровень креатинина, головную боль.

Более того, снижение токсичности мутанта TNF в конъюгате повышает синергический эффект части, представляющей собой IL2, которую можно вводить в более высокой дозе вследствие более низкой активности мутантного TNF. Таким образом, цитокины с подобранной эффективностью в конъюгате могут быть пригодными в терапевтических применениях.

Авторы настоящего изобретения также показали, что конъюгат, содержащий IL2 и мутантный TNFα, и молекулу антитела, которая связывает экстрадомен A (ED-A) фибронектина, может успешно нацеливаться на новообразованные сосуды опухоли in vivo. Более того, авторы настоящего изобретения также показали, что конъюгат, содержащий IL2 и мутант TNFα, и молекулу антитела, которая связывает экстрадомен B (ED-B) фибронектина, может успешно нацеливаться на новообразованные сосуды опухоли in vivo. Другие конъюгаты, содержащие IL2 и мутантный TNF, предпочтительно TNFα, и молекулу антитела, которая связывает антиген, ассоциированный с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, аналогично могут быть пригодными для нацеливания IL2 и мутантного TNF на новообразованные сосуды опухоли и, таким образом, применимы для лечения злокачественной опухоли. Также показано, что конъюгат, содержащий IL2; TNFα и молекулу антитела, которая связывает экстрадомен A (ED-A) фибронектина, нацелен на новообразованные сосуды опухоли in vivo (PCT/EP2016/060128).

Многие антигены, ассоциированные с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, известны в данной области в качестве антител, способных связывать такие антигены. Кроме того, антитела против данного антитела можно получать с использованием хорошо известных способов, таких как способы, описанные в настоящей заявке. В некоторых вариантах осуществления антиген может представлять собой компонент внеклеточного матрикса, ассоциированный с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, такой как фибронектины, включая изоформу экстрадомена A (ED-A) фибронектина (A-FN), изоформу экстрадомена B (ED-B) фибронектина (B-FN), тенасцин C, ED-A фибронектина, ED-B фибронектина или домен A1 тенасцина C. Антитела, которые связывают ED-A фибронектина, и таким образом, также A-FN, известны в данной области и включают антитело F8. Антитела, которые связывают ED-B фибронектина, или домен A1 тенасцина C (и, таким образом, также B-FN и тенасцин C), также известны в данной области и включают антитела L19 и F16, соответственно. Было показано, что антитела, которые связывают ED-B фибронектина, или домен A1 тенасцина C, включая антитела L19 и F16, способны к специфическому нацеливанию на новообразованные сосуды опухоли in vivo. Таким образом, конъюгат, описанный в настоящем описании, содержащий IL2, мутант TNF, предпочтительно TNFα, и молекулу антитела, которая связывает антиген, ассоциированный с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, предпочтительно демонстрирует сниженную токсичность при введении пациенту по сравнению с введением конъюгата, содержащего IL2, TNF и молекулу антитела, пациенту.

Другие антигены, которые ассоциированы с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, включают карбоангидразу IX (маркер почечноклеточного рака), A33 и CEA (надежные маркеры рака ободочной и прямой кишки), HER2 (маркер рака молочной железы), PSMA (маркер рака предстательной железы) и белок активации фибробластов (протеаза, присутствующая как в качестве мембраносвязанного белка, так и в качестве отделенного белка, на активированных фибробластах и определенных типах опухолевых клеток). Конъюгаты, содержащие IL2 и мутант TNF, предпочтительно TNFα, и молекулу антитела, которая связывает антигены, такие как карбоангидраза IX, A33, CEA, HER2, PSMA или белок активации фибробластов, аналогичным образом являются пригодными для нацеливания IL2 и TNF на новообразованные сосуды опухоли и, таким образом, применимы для лечения злокачественной опухоли и будут демонстрировать сниженную токсичность.

В некоторых предпочтительных вариантах осуществления молекула антитела для применения, как описано в настоящем описании, может иметь CDR и/или домены VH и/или VL антител F8, L19 или F16, описанных в настоящем описании. Молекула антитела для применения, как описано в настоящем описании, предпочтительно имеет CDR антитела F8, указанные в SEQ ID NO: 6-11. Более предпочтительно, антитело для применения, как описано в настоящем описании, может содержать домены VH и/или VL антитела F8, указанные в SEQ ID NO: 2 и 4. Еще более предпочтительно, антитело для применения, как описано в настоящем описании, содержит домены VH и VL антитела F8, указанные в SEQ ID NO: 2 и 4. Антитело F8 предпочтительно имеет формат scFv или диантитела, наиболее предпочтительно формат scFv. Когда антитело F8 имеет формат scFv, молекула антитела для применения, как описано в настоящем описании, предпочтительно имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 5.

Другая молекула антитела для применения, как описано в настоящем описании, предпочтительно имеет CDR антитела L19, указанные в SEQ ID NO: 18-23. Более предпочтительно, антитело для применения, как описано в настоящем описании, может содержать домены VH и/или VL антитела L19, указанные в SEQ ID NO: 24 и 25. Еще более предпочтительно, антитело для применения, как описано в настоящем описании, содержит домены VH и VL антитела L19, указанные в SEQ ID NO: 24 и 25. Антитело L19 предпочтительно имеет формат scFv или диантитела, наиболее предпочтительно формат scFv. Когда антитело L19 имеет формат scFv, молекула антитела для применения, как описано в настоящем описании, предпочтительно имеет аминокислотную последовательность, указанную в SEQ ID NO: 26.

Молекула антитела для применения, как описано в настоящем описании, может связывать A-FN и/или ED-A фибронектина с той же аффинностью, что и антитело F8 против ED-A, например, в формате scFv, или с лучшей аффинностью. Молекула антитела для применения, как описано в настоящем описании, может связывать B-FN и/или ED-B фибронектина с той же аффинностью, что и антитело L19 против ED-B, например, в формате scFv, или с лучшей аффинностью. Молекула антитела для применения, как описано в настоящем описании, может связывать тенасцин C и/или домен A1 тенасцина C с той же аффинностью, что и у антитела F16 против тенасцина C, например, в формате scFv, или с лучшей аффинностью.

Молекула антитела для применения, как описано в настоящем описании, может связываться с тем же эпитопом на A-FN и/или ED-A фибронектина, что и у антитела F8 против ED-A. Молекула антитела по настоящему изобретению может связываться с тем же эпитопом на B-FN и/или ED-B фибронектина, что и у антитела L19 против ED-B. Молекула антитела молекула по настоящему изобретению может связываться с тем же эпитопом на тенасцине C и/или домене A1 тенасцина C, что и у антитела F16.

В рамках настоящего изобретения можно получать и использовать варианты молекул антител, описанных в настоящем описании. Способы, требуемые для проведения замен в аминокислотных последовательностях CDR, доменах VH или VL антитела, в частности, каркасных областях доменов VH и VL, и молекулах антител, обычно доступны в данной области. Последовательности вариантов можно получать с заменами, для которых может быть предсказано или может не быть предсказано наличие минимального или благоприятного эффекта на активность, и тестировать в отношении способности связывать A-FN и/или ED-A фибронектина, B-FN и/или ED-B фибронектина, тенасцин C и/или домен A1 тенасцина C, и/или в отношении любого другого требуемого свойства.

Предусматривается, что от 1 до 5, например, от 1 до 4, в том числе от 1 до 3, или 1 или 2, или 3 или 4, аминокислотных изменений (вставка, делеция, замена и/или инсерция аминокислотного остатка) может быть внесено в одну или несколько CDR и/или домены VH и/или VL молекулы антитела, как описано в настоящем описании. Таким образом, молекула антитела, которая связывает FN-A, FN-B или тенасцин C, может содержать CDR и/или домен VH и/или VL антитела F8, L19 или F16, описанного в настоящем описании, с 5 или менее, например, 5, 4, 3, 2 или 1 изменением аминокислот в CDR и/или домене VH и/или VL. Например, молекула антитела, которая связывает FN-A, FN-B или тенасцин C, может содержать домен VH и/или VL антитела F8, L19 или F16, описанного в настоящем описании, с 5 или менее, например, 5, 4, 3, 2 или 1 изменением аминокислот в каркасной области домена VH и/или VL. Таким образом, молекула антитела, которая связывает FN-A или ED-A фибронектина, упоминаемая в настоящем описании, может содержать домен VH, представленный в SEQ ID NO: 2, и/или домен VL, представленный в SEQ ID NO: 4, с 5 или менее, например, 5, 4, 3, 2 или 1 изменением аминокислот в каркасной области домена VH и/или VL. Такая молекула антитела может связывать ED-A-изоформу или ED-A фибронектина с той же или по существу той же аффинностью, что и у молекулы антитела, содержащей домен VH, представленный в SEQ ID NO: 2, и домен VL, представленный в SEQ ID NO: 4, или может связывать ED-A-изоформу или ED-A фибронектина с более высокой аффинностью, чем у молекулы антитела, содержащей домен VH, представленный в SEQ ID NO: 2, и домен VL, представленный в SEQ ID NO: 4. Таким образом, молекула антитела, которая связывает FN-B или ED-B фибронектина, упоминаемая в настоящем описании, может содержать домен VH, представленный в SEQ ID NO: 24, и/или домен VL, представленный в SEQ ID NO: 25, с 5 или менее, например, с 5, 4, 3, 2 или 1 изменением аминокислоты в каркасной области домена VH и/или VL. Такая молекула антитела может связывать изоформу ED-B или ED-B фибронектина с такой же или по существу такой же аффинностью, что и у молекулы антитела, содержащей домен VH, представленный в SEQ ID NO: 24, и домен VL, представленный в SEQ ID NO: 25, или может связывать ED-B-изоформу или ED-B фибронектина с более высокой аффинностью, чем у молекулы антитела, содержащей домен VH, представленный в SEQ ID NO: 24, и домен VL, представленный в SEQ ID NO: 25.

Молекула антитела для применения, как описано в настоящем описании, может содержать домен VH и/или VL, который обладает по меньшей мере 70%, более предпочтительно любой из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, идентичностью последовательности с доменом VH и/или VL, в зависимости от ситуации, антитела F8, L19 или F16, указанного в SEQ ID NO: 2, 4, 24, 25, 33 и 34. Молекула антитела для применения, как описано в настоящем описании, может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью антител F8, L19 или F16, указанных в SEQ ID NO: 5, 26, 35 и 46, соответственно.

Антигенсвязывающий центр является частью молекулы, которая распознает и связывает весь антиген-мишень или его часть. В молекуле антитела его называют антигенсвязывающим центром антитела или паратопом, и он содержит часть антитела, которая распознает и связывает весь антиген-мишень или его часть. Когда антиген является большим, антитело может связываться только с конкретной частью антигена, которую называют эпитопом. Антигенсвязывающий центр антитела может быть предоставлен посредством одного или нескольких вариабельных доменов антитела. Предпочтительно антигенсвязывающий центр содержит вариабельную область легкой цепи (VL) антитела и вариабельную область тяжелой цепи (VH) антитела.

Антигенсвязывающий центр может быть предоставлен посредством компоновки определяющих комплементарность областей (CDR). Структурой, содержащей CDR или набор CDR, как правило, является последовательность тяжелой или легкой цепи антитела или значительная ее часть, в которой CDR или набор CDR расположен в области, соответствующей CDR или набору CDR встречающихся в природе вариабельных доменов VH и VL антитела, кодируемых реарранжированными генами иммуноглобулинов. Структуры и положение вариабельных доменов иммуноглобулинов могут быть определены в соответствии с Kabat et al. (1987) (Sequences of Proteins of Immunological Interest. 4^th Edition. US Department of Health and Human Services.) и ее переизданиями, в настоящее время доступной через Интернет (на immuno.bme.nwu.edu или при поиске "Kabat" с использованием любого поискового инструмента).

Под областью CDR, или CDR, подразумевают гипервариабельные области тяжелой и легкой цепей иммуноглобулина в соответствии с определением Kabat et al. (1987) Sequences of Proteins of Immunological Interest, 4^th Edition, US Department of Health and Human Services (Kabat et al., (1991a), Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5^th Edition, US Department of Health and Human Services, Public Service, NIH, Washington и последующие издания). Антитело, как правило, содержит 3 CDR тяжелой цепи и 3 CDR легкой цепи. Термин "CDR" или "несколько CDR" может указывать, в зависимости от ситуации, на одну из этих областей, или несколько или даже все, из этих областей, которые содержат большинство аминокислотных остатков, ответственных за аффинное антитела с антигеном или эпитопом, который оно распознает.

Среди шести коротких последовательностей CDR третья CDR тяжелой цепи (HCDR3) имеет более высокую вариабельность размера (большее разнообразие, в основном вследствие механизмов организации генов, которая его обеспечивает). Ее длина может составлять только 2 аминокислоты, хотя наибольший известный размер составляет 26. Функционально, HCDR3 участвует в определении специфичности антитела (Segal et al., (1974), PNAS, 71:4298-4302; Amit et al., (1986), Science, 233:747-753; Chothia et al., (1987), J. Mol. Biol., 196:901-917; Chothia et al., (1989), Nature, 342:877-883; Caton et al., (1990), J. Immunol., 144:1965-1968; Sharon et al., (1990a), PNAS, 87:4814-4817; Sharon et al., (1990b), J. Immunol., 144:4863-4869; Kabat et al., (1991b), J. Immunol., 147:1709-1719).

Антигенсвязывающий центр молекулы антитела для применения, как описано в настоящем описании, предпочтительно имеет CDR антитела F8, указанные в SEQ ID NO: 6-11, CDR антитела L19, указанные в SEQ ID NO: 18-23, или CDR антитела F16, указанные в SEQ ID NO: 27-32. Наиболее предпочтительно, антигенсвязывающий центр молекулы антитела для применения, как описано в настоящем описании, имеет CDR антитела F8, указанные в SEQ ID NO: 6-11, или CDR антитела L19, указанные в SEQ ID NO: 18-23.

В данной области доступны различные способы получения молекул антител против антигена-мишени. Молекулы антител для применения в конъюгатах, описанных в настоящем описании, предпочтительно представляют собой моноклональные антитела, особенно человека, мыши, химерные или гуманизированные, которые могут быть получены стандартными способами, хорошо известными специалисту в данной области. Наиболее предпочтительно, молекула антитела для применения в конъюгатах, описанных в настоящем описании, представляет собой молекулу антитела человека.

Является возможным использование моноклональных и других антител и технологии рекомбинантных ДНК для получения других антител или химерных молекул, которые связывают антиген-мишень. Такие способы могут вовлекать встраивание ДНК, кодирующей вариабельную область иммуноглобулина или CDR молекулы антитела, в константные области, или константные области плюс каркасные области, другого иммуноглобулина (см., например, EP-A-184187, GB 2188638A или EP-A-239400, и большое количество последующих источников литературы). Гибридому или другую клетку, продуцирующую антитело, также можно подвергать генетической мутации или другим изменениям, которые могут изменять или могут не изменять специфичность продуцированных антител.

Доступные в данной области способы инженерии антител позволили выделить антитела человека и гуманизированные антитела. Например, гибридомы человека можно получать, как описано в Kontermann & Dubel (2001), S, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; ISBN: 3540413545. Фаговый дисплей - другой общеизвестный способ получения специфических связывающих представителей - подробно описан во многих публикациях, таких как WO92/01047 (дополнительно рассмотрена ниже) и патенты США US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160, US6521404 и Kontermann & Dubel (2001), S, Antibody Engineering, Springer-Verlag New York, LLC; ISBN: 3540413545. Для выделения антител человека можно использовать трансгенных мышей, у которых гены антител мыши инактивированы и функционально заменены генами антител человека, в то время как остальные компоненты иммунной системы мыши остаются интактными (Mendez et al., (1997), Nature Genet, 15(2): 146-156).

Как правило, для получения моноклональных антител или их функциональных фрагментов, особенно из мыши, можно использовать способы, которые описаны, в частности, в руководстве "Antibodies" (Harlow and Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor N.Y., pp. 726, 1988), или способ получения из гибридом, описанный Kohler and Milstein, 1975, Nature, 256:495-497.

Моноклональные антитела можно получать, например, из клетки животного, иммунизированного против антигена, ассоциированного с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, такого как A-FN, B-FN, тенасцин C, ED-A фибронектина, ED-B фибронектина или домен A1 тенасцина C, в соответствии с обычными способами, посредством генетической рекомбинации, начинающейся с последовательности нуклеиновой кислоты, содержащейся в последовательности кДНК, кодирующей A-FN, B-FN или тенасцин C, или их фрагмент, или посредством пептидного синтеза, начинающегося с последовательности аминокислот, содержащейся в пептидной последовательности A-FN, B-FN или тенасцина C, и/или их фрагмента.

Синтетические молекулы антител можно получать посредством экспрессии с генов, полученных синтезом олигонуклеотидов и сборки их в подходящие экспрессирующие векторы, например, как описано Knappik et al. (2000) J. Mol. Biol. 296, 57-86 или Krebs et al. (2001) Journal of Immunological Methods, 254 67-84.

Альтернативно, одну или несколько молекул антител против антигена, ассоциированного с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, такого как A-FN, ED-A, B-FN, ED-B, тенасцин C или домен A1 тенасцина C, можно получать путем приведения в контакт библиотеки молекул антител и антигена или его фрагмента, например, фрагмента, содержащего или состоящего из ED-A, ED-B или домена A1 тенасцина C, или их пептидного фрагмента, и отбора одной или нескольких молекул из библиотеки, способных связываться с антигеном.

Библиотеку антител можно подвергать скринингу с использованием итеративного скрининга колоний на фильтре (ICFS). При ICFS бактерии, содержащие ДНК, кодирующую несколько специфичностей связывания, выращивают в жидкой среде и после достижения стадии экспоненциального роста несколько миллиардов их распределяют на подложку для роста, состоящую из подходящим образом предварительно обработанного мембранного фильтра, который инкубируют до тех пор, пока не появляются полностью смыкающиеся колонии бактерий. Вторая подложка-ловушка состоит из другого мембранного фильтра, предварительно увлажненного и покрытого требуемым антигеном.

Затем мембрану-ловушку помещают на чашку, содержащую подходящую культуральную среду, и накрывают фильтром для роста вверх поверхностью, покрытой бактериальными колониями. Полученный таким образом "сэндвич" инкубируют при комнатной температуре в течение приблизительно 16 ч. Таким образом, является возможной достижение экспрессии генов, кодирующих фрагменты антител, такие как scFv, обладающие распространяющимся действием, так чтобы эти фрагменты, специфически связывающиеся с антигеном, который присутствует на мембране-ловушке, улавливались. Затем мембрану-ловушку можно обрабатывать для идентификации связанных фрагментов антител, таких как scFv, например, с использованием колориметрических способов, обычно используемых для этой цели.

Положение идентифицированных фрагментов, например, в качестве окрашенных пятен, на фильтре-ловушке, позволяет вернуться к соответствующим бактериальным колониям, которые присутствуют на мембране для роста и продуцируют уловленные фрагменты антител. Колонии собирают и выращивают, и бактерии распределяют на новую культуральную мембрану, повторяя методики, описанные выше. Затем проводят аналогичные циклы до тех пор, пока положительные сигналы на мембране-ловушке не будут соответствовать единичным положительным колониям, каждая из которых соответствует потенциальному источнику фрагментов моноклональных антител, направленных против антигена, используемого в селекции. ICFS описан, например, в WO02/46455.

Библиотеку также можно экспонировать на частицах или молекулярных комплексах, например, реплицирующихся генетических упаковках, таких как частицы бактериофага (например, T7), или других системах дисплея in vitro, причем каждая частица или молекулярный комплекс содержит нуклеиновую кислоту, кодирующую вариабельный домен VH антитела, экспонированный на нем, и необязательно также экспонированный домен VL при его наличии. Фаговый дисплей описан в WO92/01047 и, например, в патентах США US5969108, US5565332, US5733743, US5858657, US5871907, US5872215, US5885793, US5962255, US6140471, US6172197, US6225447, US6291650, US6492160 и US6521404.

После селекции молекул антител, способных связывать антиген и экспонироваться на бактериофаге или других частицах библиотеки или молекулярных комплексах, нуклеиновая кислота может быть извлечена из бактериофага или другой частицы или молекулярного комплекса, экспонирующих указанную отобранную молекулу антитела. Такую нуклеиновую кислоту можно использовать для последующей продукции молекулы антитела или вариабельного домена VH или VL антитела посредством экспрессии с нуклеиновой кислоты, имеющей последовательность нуклеиновой кислоты, взятую из бактериофага или другой частицы или молекулярного комплекса, экспонирующих указанную отобранную молекулу антитела.

Способность связывать антиген, ассоциированный с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, такой как A-FN, B-FN, ED-A или ED-B фибронектина, тенасцин C или домен A1 тенасцина C или другой антиген-мишень или изоформа, можно далее тестировать, например, в отношении способности конкурировать с антителом, специфичным к A-FN, B-FN, ED-A или ED-B фибронектина, тенасцину C или домену A1 тенасцина C, таким как антитело F8, L19 или F16.

Новые области VH или VL, содержащие происходящие из CDR последовательности для применения, как описано в настоящем описании, также можно получать с использованием случайного мутагенеза одного или нескольких отобранных генов VH и/или VL для получения мутаций по всему вариабельному домену. В некоторых вариантах осуществления одну или две аминокислотных замены вносят в целый вариабельный домен или набор CDR. Другим способом, который можно использовать, является прямой мутагенез областей CDR генов VH или VL.

Вариабельные домены, используемые, как описано в настоящем описании, можно получать или извлекать из любого вариабельного домена эмбрионального типа или реаранжированного вариабельного домена человека, или они могут представлять собой синтетический вариабельный домен на основе консенсусных или фактических последовательностей известных вариабельных доменов человека. Вариабельный домен может происходить из не являющегося человеческим антитела. Последовательность CDR для применения, как описано в настоящем описании (например, CDR3), можно встраивать в репертуар вариабельных доменов, лишенных CDR (например, CDR3), с использованием технологии рекомбинантных ДНК. Например, в Marks et al. (1992) описаны способы получения репертуаров вариабельных доменов антител, в которых консенсусные праймеры, направленные на 5'-конец или вблизи него области вариабельного домена, используют совместно с консенсусными праймерами к третьей каркасной области генов VH человека с получением репертуара вариабельных доменов VH, лишенных CDR3. Кроме того, в Marks et al. описано, как этот репертуар можно комбинировать с CDR3 конкретного антитела. С использованием аналогичных способов происходящие из CDR3 последовательности по настоящему изобретению можно подвергать шаффлингу с репертуарами доменов VH или VL, лишенных CDR3, и полученные путем шаффлинга полные домены VH или VL комбинировать с совместимыми доменами VL или VH с получением молекул антител для применения, как описано в настоящем описании. Затем репертуар можно экспонировать в подходящей системе-хозяине, такой как система фагового дисплея WO92/01047, или любого из последующих источников литературы, включая Kay, Winter & McCafferty (1996), так что можно отбирать подходящие молекулы антител. Репертуар может состоять из любого числа из 10⁴ индивидуальных представителей и выше, например по меньшей мере 10⁵, по меньшей мере 10⁶, по меньшей мере 10⁷, по меньшей мере 10⁸, по меньшей мере 10⁹ или по меньшей мере 10¹⁰ представителей.

Антиген, ассоциированный с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, такой как A-FN, B-FN, ED-A или ED-B фибронектина, тенасцин C или домен A1 тенасцина C, можно использовать в скрининге молекул антител, например, молекул антител для применения, как описано в настоящем описании. Скрининг может представлять собой скрининг репертуара, как описано в настоящем описании.

Аналогично, одну или несколько, или все три CDR можно пересаживать в репертуар доменов VH или VL, которые затем подвергают скринингу в отношении молекулы антитела или молекул антител в отношении антигена, ассоциированного с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, такого как A-FN, B-FN, ED-A или ED-B фибронектина, тенасцин C или домен A1 тенасцина C. Можно использовать одну или несколько из HCDR1, HCDR2 и HCDR3 антител F8, L19 или F16, или набор HCDR антител F8, L19 или F16, и/или можно использовать одну или несколько из LCDR1, LCDR2 и LCDR3 антител F8, L19 или F16, или набор LCDR антител F8, L19, или F16.

Значительная часть вариабельного домена иммуноглобулина может содержать по меньшей мере три области CDR вместе с встроенными в них каркасными областями. Эта часть также может включать по меньшей мере приблизительно 50% любой или обеих из первой и четвертой каркасных областей, причем 50% представляют собой C-концевые 50% первой каркасной области и N-концевые 50% четвертой каркасной области. Дополнительные остатки на N-конце или C-конце значительной части вариабельного домена могут представлять собой остатки, которые в норме не ассоциированы со встречающимися в природе областями вариабельных доменов. Например, конструкция молекул антител по настоящему изобретению, полученных способами рекомбинантных ДНК, может обеспечивать внесение N- или C-концевых остатков, кодируемых линкерами, внесенными для облегчения клонирования или других стадий манипулирования. Другие стадии манипулирования включают внесение линкеров для связывания вариабельных доменов, описанных в настоящем описании, с другими белковыми последовательностями, включая константные области антител, другие вариабельные домены (например, при получении диантител) или поддающиеся обнаружению/функциональные метки, как более подробно описано в настоящем описании.

Хотя молекулы антител могут содержать пару доменов VH и VL, также можно использовать единичные связывающие домены на основе последовательностей либо домена VH, либо домена VL, как описано в настоящем описании. Известно, что единичные домены иммуноглобулинов, особенно домены VH, способны связывать антигены-мишени специфическим образом. Например, см. обсуждение dAb выше.

В случае любого из единичных связывающих доменов, эти домены можно использовать для скрининга комплементарных доменов, способных образовывать двухдоменную молекулу антитела, способную связывать антиген, ассоциированный с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, такой как A-FN, B-FN, ED-A или ED-B фибронектина, тенасцин C или домен A1 тенасцина C. Этого можно достигать способами скрининга посредством фагового дисплея с использованием так называемого иерархического двойного комбинаторного подхода, как описано в WO92/01047, в котором индивидуальную колонию, содержащую либо H-цепь, либо L-цепь, используют для инфицирования полной библиотеки клонов, кодирующих другую цепь (L или H), и полученную двухцепочечную молекулу антитела подвергают селекции в соответствии со способами фагового дисплея, такими как способы, описанные в указанной ссылке. Этот способ также описан в Marks 1992.

Фрагменты целых антител для применения, как описано в настоящем описании, можно получать, начиная с любых из молекул антител, описанных в настоящем описании, например, молекул антител, содержащих домены VH и/или VL или CDR любых антител, описанных в настоящем описании, способами, такими как расщепление ферментами, такими как пепсин или папаин, и/или расщепление дисульфидных связей посредством химического восстановления. Иным образом, фрагменты антител можно получать способами генетической рекомбинации, аналогично известными специалисту в данной области, или также посредством пептидного синтеза с использованием, например, автоматизированных устройств для синтеза пептидов, таких как устройства, предоставляемые компанией Applied Biosystems, и т.д., или посредством синтеза и экспрессии нуклеиновых кислот.

Конъюгат, как описано в настоящем описании, содержит IL2 и мутантный TNF, предпочтительно TNFα, и молекулу антитела, которая связывает антиген, ассоциированный с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, как описано в настоящем описании. Предпочтительно молекула антитела представляет собой scFv или диантитело, наиболее предпочтительно scFv, как описано в настоящем описании.

Предпочтительно IL2 представляет собой IL2 человека.

Предпочтительно IL2 содержит или состоит из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 12. Как правило, IL2 обладает по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 12. IL2 в конъюгатах по изобретению сохраняет биологическую активность IL2 человека, например, способность ингибировать пролиферацию клеток.

Предпочтительно TNF предпочтительно представляет собой TNF человека. Когда фактор некроза опухоли представляет собой TNFα, TNFα предпочтительно представляет собой TNFα человека.

Мутантный TNF в конъюгатах, описанных в настоящем описании, представляет собой мутант TNF, который сохраняет биологическую функцию TNF человека, например, способность ингибировать клеточную пролиферацию, но сохраняет сниженную активность.

Мутант TNF может содержать одну или несколько мутаций, которые снижают активность относительно TNF дикого типа, который лишен одной или нескольких мутаций, т.е. мутантный TNF является менее эффективным, чем TNF дикого типа. Например, мутант TNF может содержать мутацию в положении, соответствующем положению 32 в SEQ ID NO: 15 или положению 52 в SEQ ID NO: 17. В некоторых вариантах осуществления R в указанном положении может быть замещен другой аминокислотой, предпочтительно аминокислотой, отличной от G, например, неполярной аминокислотой, предпочтительно A, F или V, наиболее предпочтительно A. Последовательности примеров подходящих мутантных TNF указаны в SEQ ID NO: 37, 39, 54-55, 56-57, соответственно.

В настоящем описании показано, что тип остатка в положении мутантного TNF, соответствующем положению 32 в SEQ ID NO: 15 или положению 52 в SEQ ID NO: 17, влияет на выход белка при экспрессии рекомбинантной системы. Например, присутствие W в этом положении приводит по существу к отсутствию экспрессии в рекомбинантной системе и присутствие A в этом положении приводит к неожиданно высоким выходам в рекомбинантной системе.

TNFα человека состоит из цитоплазматического домена из 35 аминокислот, трансмембранного домена из 20 аминокислот и внеклеточного домена из 177 аминокислот. Внеклеточный домен из 177 аминокислот расщепляется с образованием растворимой формы из 157 аминокислот, которая является биологически активной и которая образует нековалентно связанный тример в растворе. В контексте настоящего изобретения TNFα человека представляет собой мутант TNFα, который предпочтительно представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα человека или внеклеточный домен TNFα человека. Последовательность растворимой формы внеклеточного домена TNFα человека представлена в SEQ ID NO: 15. Как правило, мутантный TNFα обладает по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100%, идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 15, с одной или несколькими мутациями, которые снижают активность, например, мутацией в положении, соответствующем положению 32 в SEQ ID NO: 15. Последовательность внеклеточного домена TNFα человека представлена в SEQ ID NO: 17. В этом случае мутантный TNFα может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98%, по меньшей мере 99% или 100% идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 17, с одной или несколькими мутациями, которые снижают активность, например, мутацией в положении, соответствующем положению 52 в SEQ ID NO: 17.

Авторы изобретения показали, что конъюгат по настоящему изобретению, и в частности, TNFα, присутствующий в конъюгате по настоящему изобретению, где остаток аргинина TNFα в положении 32 SEQ ID NO: 15 или в положении 52 SEQ ID NO: 17 замещен аланином, демонстрирует сниженную активность. Таким образом, мутантный TNFα может содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 15 или 17, за исключением того, что остаток в положении 32 SEQ ID NO: 15 или в положении 52 SEQ ID NO: 17 представляет собой остаток аланина, а не остаток аргинина. Эта последовательность представлена в SEQ ID NO: 37 или 39. Таким образом, мутантный TNFα предпочтительно содержит или состоит из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 37. Как правило, мутантный TNFα обладает по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 37, с A в положении, соответствующем положению 32 в SEQ ID NO: 37. Таким образом, альтернативно TNFα может содержать или состоять из последовательности, указанной в SEQ ID NO: 39. В этом случае TNFα может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% или 100%, идентичностью последовательности с аминокислотной последовательностью, указанной в SEQ ID NO: 39, с A в положении, соответствующем положению 52 в SEQ ID NO: 39.

Наиболее предпочтительно, IL2 содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO: 12, и/или TNFα содержит последовательность, указанную в SEQ ID NO: 37.

Мутантные белки TNFα можно тестировать в анализах in vivo и in vitro. Подходящие анализы включают, но не ограничиваются ими, анализы активности и анализы связывания. Замена или делеция остатка аргинина в положении 32 (Arg 32) описана в документах уровня техники. Например, была предложена замена остатка аргинина на серин, глутамин, аспарагин, аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту, гистидин, триптофан, треонин или тирозин (US 7101974; US 5422104; WO1988/006625; Yamagishi et al., Protein Eng. (1990) 3:713-9)). Более того, также была предложена делеция Arg32 в EP158286. Мутанты, в которых Arg 32 заменен триптофаном, продемонстрировали утрату цитотоксической активности (Van Ostade et al.The Embo Journal (1991) 10:827-836). Мутанты, где аргинин в положении 29, и/или 31, и/или 32 заменен на триптофан или тирозин, продемонстрировали значительное отличие аффинности связывания между рецептором p75 TNF человека и рецептором p55-TNF человека (US 5422104). В US 7101974 описаны варианты TNFα, которые взаимодействуют с TNFα дикого типа с образованием смешанных тримеров, неспособных активировать передачу сигнала рецептором. В этом последнем примере Arg32 заменен на аспарагиновую кислоту, глутаминовую кислоту или гистидин.

Предпочтительно, молекула антитела связана с мутантом IL2 и TNF, предпочтительно мутантом TNFα, через линкеры, например, пептидные линкеры. Альтернативно молекула антитела и IL2 и/или мутантный фактор некроза опухоли могут быть соединены прямо, например, через химическую связь. Когда молекула антитела связана с IL2 и мутантом фактора некроза опухоли посредством одного или нескольких пептидных линкеров, конъюгат может представлять собой слитый белок. Под "слитым белком" подразумевают полипептид, который представляет собой продукт трансляции в результате слияния двух или более генов или кодирующих последовательностей нуклеиновых кислот в одну открытую рамку считывания (ORF).

Химическая связь может представлять собой, например, ковалентную или ионную связь. Примеры ковалентных связей включают пептидные связи (амидные связи) и дисульфидные связи. Молекула антитела и мутант IL2 и/или TNF, предпочтительно мутант TNFα, могут быть ковалентно связаны, например, пептидными связями (амидные связи). Таким образом, молекула антитела, в частности, scFv-часть молекулы антитела, и IL2 и/или мутант TNF, предпочтительно мутант TNFα, могут быть получены в качестве слитого белка.

Когда молекула антитела представляет собой двухцепочечную или мультицепочечную молекулу (например, диантитело), IL2 и/или мутант TNF могут быть конъюгированы в качестве слитого белка с одной или несколькими полипептидными цепями в молекуле антитела.

Пептидный линкер, соединяющий молекулу антитела и IL2 и/или мутант TNF, может представлять собой гибкий пептидный линкер. Подходящие примеры последовательностей пептидных линкеров известны в данной области. Линкер может иметь длину 10-20 аминокислот, предпочтительно 10-15 аминокислот. Наиболее предпочтительно, линкер имеет длину 11-15 аминокислот. Линкер может иметь последовательность, указанную в SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14 или SEQ ID NO: 49. В некоторых предпочтительных вариантах осуществления IL2 и мутант TNF могут быть связаны с молекулой антитела линкерами, указанными в SEQ ID NO: 13 и SEQ ID NO: 14, соответственно. В других предпочтительных вариантах осуществления IL2 и мутант TNF могут быть связаны с молекулой антитела линкерами, указанными в SEQ ID NO: 49 и SEQ ID NO: 14, соответственно.

Например, в конъюгатах, проиллюстрированных в примере 2, IL2 конъюгирован с доменом VH scFv F8 и TNFα или мутант TNFα конъюгирован с доменом VL scFv F8, каждый через пептидный линкер, как показано в SEQ ID NO: 1 и SEQ ID NO: 36, соответственно. В конъюгате, проиллюстрированном в примере 4, IL2 конъюгирован с доменом VH scFv L19 и TNFα или мутант TNFα конъюгирован с доменом VL scFv L19, каждый через пептидный линкер, как показано в SEQ ID NO: 70 и SEQ ID NO: 44, соответственно.

Однако ожидается, что конъюгат, содержащий IL2 и мутант TNF, предпочтительно мутант TNFα, и молекулу антитела, которая связывает антиген, ассоциированный с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, может продемонстрировать такие же или сходные свойства нацеливания на опухоль, и/или терапевтическую эффективность, что и фактор некроза опухоли и IL2, конъюгированные с молекулой антитела. Таким образом, когда молекула антитела представляет собой или содержит scFv, IL2 может быть связан с N-концом домена VH scFv через пептидный линкер и мутантный TNF может быть связан с C-концом домена VL scFv через пептидный линкер. Альтернативно, когда молекула антитела представляет собой или содержит scFv, мутантный TNF может быть связан с N-концом домена VH scFv через пептидный линкер и IL2 может быть связан с C-концом домена VL scFv через пептидный линкер. Ожидается, что конъюгат может иметь такие же или сходные свойства нацеливания на опухоль, и/или терапевтическую эффективность, и/или активность уничтожения клеток, как если бы как IL2, так и мутантный TNF, предпочтительно TNFα, были конъюгированы с доменом VH антитела. В качестве следующей альтернативы, IL2 и мутантный TNF, предпочтительно мутантный TNFα, могут, таким образом, быть связаны с C-концом домена VL антитела, например, в формате scFv, через пептидный линкер. В качестве еще одной альтернативы, IL2 и мутантный TNF, предпочтительно мутантный TNFα, могут быть связаны с N-концом домена VH антитела, например, в формате scFv, через пептидный линкер. В последних двух конъюгатах, IL2 и TNF могут быть расположены в любом порядке и/или необязательно могут быть связаны друг с другом через пептидный линкер. Подходящие пептидные линкеры описаны в настоящем описании.

Конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 36, или могут представлять собой ее вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью, например, аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 36. Предпочтительно, остаток в положении варианта, соответствующем положению 432 SEQ ID NO: 36 представляет собой A. Например, конъюгат, который представляет собой вариант SEQ ID NO: 36, может содержать остаток A в положении 432.

Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 1, с мутацией R на A в положении 432 или SEQ ID NO: 16 с мутацией R на A в положении 452, или они могут представлять собой варианты одной из этих последовательностей. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью, например, аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 16. Предпочтительно, остаток в положении, соответствующем положению 432 в варианте SEQ ID NO: 1 is A и остаток в положении, соответствующем положению 452 в варианте SEQ ID NO: 16, представляет собой A. Например, конъюгат, который представляет собой вариант SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 16, может содержать остаток A в положении 432 или 452 соответственно.

Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 38, или могут представлять собой ее вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью, например, аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 38. Предпочтительно, остаток в положении варианта, соответствующем положению 452 SEQ ID NO: 38, представляет собой A. Например, конъюгат, который представляет собой вариант SEQ ID NO: 38, может содержать остаток A в положении 452.

Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из одной из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 58-63, или могут представлять собой ее вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью, например, одной из аминокислотных последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 58-63. Предпочтительно, остаток в положении, соответствующем положению 432 в варианте SEQ ID NO: 58, 60 или 62, представляет собой W, F или V, соответственно. Предпочтительно, остаток в положении, соответствующем положению 452 в варианте SEQ ID NO: 59, 61 или 63, представляет собой W, F или V, соответственно.

Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 40, или могут представлять собой ее вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности c аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 40. Предпочтительно, остаток в положении варианта, соответствующем положению 427 SEQ ID NO: 40, представляет собой A. Например, конъюгат, который представляет собой вариант SEQ ID NO: 40, может содержать остаток A в положении 427.

Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 41, или могут представлять собой ее вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичностью последовательности с эталонной последовательностью, например, аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 41. Предпочтительно, остаток в положении варианта, соответствующем положению 447 SEQ ID NO: 41, представляет собой A. Например, конъюгат, который представляет собой вариант SEQ ID NO: 41, может содержать остаток A в положении 447.

Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 42, или могут представлять собой ее вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичностью последовательности c аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 42. Предпочтительно, остаток в положении варианта, соответствующем положению 428 SEQ ID NO: 42, представляет собой A. Например, конъюгат, который представляет собой вариант SEQ ID NO: 42, может содержать остаток A в положении 428.

Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 43, или могут представлять собой ее вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичностью последовательности c аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 43. Предпочтительно, остаток в положении варианта, соответствующем положению 448 SEQ ID NO: 43, представляет собой A. Например, конъюгат, который представляет собой вариант SEQ ID NO: 43, может содержать остаток A в положении 448.

Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 44, или могут представлять собой ее вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичностью последовательности c аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 44. Предпочтительно, остаток в положении варианта, соответствующем положению 430 SEQ ID NO: 44, представляет собой A. Например, конъюгат, который представляет собой вариант SEQ ID NO: 44, может содержать остаток A в положении 430.

Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 45, или могут представлять собой ее вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичностью последовательности c аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 45. Предпочтительно, остаток в положении варианта, соответствующем положению 450 SEQ ID NO: 45, представляет собой A. Например, конъюгат, который представляет собой вариант SEQ ID NO: 45, может содержать остаток A в положении 450.

Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 70 с мутацией R на A в положении 430 или SEQ ID NO: 71 с мутацией R на A в положении 450, или могут представлять собой вариант одной из этих последовательностей. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности с эталонной последовательностью, например, аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 70 или SEQ ID NO: 71. Предпочтительно, остаток в положении, соответствующем положению 430 в варианте SEQ ID NO: 70, представляет собой A и остаток в положении, соответствующем положению 450 в варианте SEQ ID NO: 71, представляет собой A. Например, конъюгат, который представляет собой вариант SEQ ID NO: 70 или SEQ ID NO: 71, может содержать остаток A в положении 430 или 450 соответственно.

Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 64-69, или могут представлять собой их вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичностью последовательности с аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 64-69. Предпочтительно, остаток в положении, соответствующем положению 430 в варианте SEQ ID NO: 64, 66 или 68 представляет собой W, F или V, соответственно. Предпочтительно, остаток в положении, соответствующем положению 450 в варианте SEQ ID NO: 65, 67 или 69, представляет собой W, F или V, соответственно.

Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 47, или могут представлять собой ее вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно по меньшей мере 75%, по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% идентичностью последовательности c аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 47. Предпочтительно, остаток в положении варианта, соответствующем положению 431 SEQ ID NO: 47, представляет собой A. Например, конъюгат, который представляет собой вариант SEQ ID NO: 47, может содержать остаток A в положении 431.

Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательности, представленной в SEQ ID NO: 48, или могут представлять собой ее вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичностью последовательности с эталонной последовательностью, например, аминокислотной последовательностью, представленной в SEQ ID NO: 48. Предпочтительно, остаток в положении варианта, соответствующем положению 451 SEQ ID NO: 48, представляет собой A. Например, конъюгат, который представляет собой вариант SEQ ID NO: 48, может содержать остаток A в положении 451.

Альтернативно конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут содержать или состоять из последовательностей, представленных в SEQ ID NO: 72-77, или могут представлять собой их вариант. Вариант может обладать по меньшей мере 70%, более предпочтительно одной из по меньшей мере 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% или 99%, идентичностью последовательности с эталонной последовательностью, например, аминокислотными последовательностями, представленными в SEQ ID NO: 72-77. Предпочтительно, остаток в положении, соответствующем положению 431 в варианте SEQ ID NO: 72, 74 или 76, представляет собой W, F или V, соответственно. Предпочтительно, остаток в положении, соответствующем положению 451 в варианте SEQ ID NO: 73, 75 или 77, представляет собой W, F или V, соответственно.

Не ограничиваясь каким-либо теоретическим объяснением, конъюгат, описанный в настоящем описании, содержащий мутантный TNF, может образовывать гомотример в растворе. Такой тримерный конъюгат может содержать три молекулы активного IL2 на одну молекулу активного TNF со сниженной активностью (в тримерной структуре). Это может быть преимущественным, поскольку иммуноцитокины на основе IL2 обычно используют в клинике в более высоких дозах по сравнению с иммуноцитокинами на основе TNFα. Например, было обнаружено, что рекомендованная доза L19-IL2 составляет 4 мг у пациентов со злокачественной опухолью [Johannsen et al. (2010) Eur. J. Cancer], в то время как рекомендованная доза L19-TNFα находится в диапазоне доз 1-1,5 мг [Spitaleri et al. (2012) J. Clin. Oncol. Cancer Res.]. Более того, можно использовать более высокие дозы конъюгатов, описанных в настоящем описании, поскольку мутант TNF имеет сниженную активность по сравнению с конъюгатом, содержащим TNF дикого типа и IL2. Таким образом, конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут иметь преимущественные свойства в отношении режимов введения.

Также предусматривается выделенная молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая конъюгат, как описано в настоящем описании. Молекулы нуклеиновых кислот могут содержать ДНК и/или РНК и могут быть частично или полностью синтетическими. Отсылка к нуклеотидной последовательности, указанной в настоящем описании, охватывает молекулу ДНК с указанной последовательностью и охватывает молекулу РНК с указанной последовательностью, в которой U заменен на T, если контекст не требует иного.

Кроме того, предусматриваются конструкции в форме плазмид, векторов (например, экспрессирующих векторов), кассет транскрипции или экспрессирующих кассет, которые содержат такие нуклеиновые кислоты. Могут быть выбраны или сконструированы подходящие векторы, содержащие надлежащие регуляторные последовательности, включая промоторные последовательности, последовательности терминаторов, последовательности полиаденилирования, энхансерные последовательности, маркерные гены и другие последовательности в зависимости от ситуации. Векторы могут представлять собой плазмиды, например фагмиду, или могут быть вирусными, например, фаговыми, в зависимости от ситуации. Для дальнейших деталей см., например, Sambrook & Russell (2001) Molecular Cloning: a Laboratory Manual: 3rd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Многие известные способы и протоколы для манипулирования нуклеиновыми кислотами, например, в препарате конструкций нуклеиновых кислот, мутагенеза, секвенирования, введения ДНК в клетки и экспрессии генов, и анализа белков подробно описаны в Ausubel et al. (1999) 4^th eds., Short Protocols in Molecular Biology: A Compendium of Methods from Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons.

Также предусматривается рекомбинантная клетка-хозяин, которая содержит одну или несколько конструкций, как описано выше. Подходящие клетки-хозяева включают бактерии, клетки млекопитающих, клетки растений, нитчатые грибы, дрожжевые и бакуловирусные системы и трансгенные растения и животные.

Конъюгаты, описанные в настоящем описании, можно получать с использованием такой рекомбинантной клетки-хозяина. Способ получения может включать экспрессию нуклеиновой кислоты или конструкции, как описано выше. Экспрессию удобно осуществлять культивированием рекомбинантной клетки-хозяина в условиях, подходящих для продуцирования конъюгата. После продуцирования конъюгат можно выделять и/или очищать с использованием любого подходящего способа, а затем использовать надлежащим образом. Конъюгат может быть составлен в виде композиции, включающей по меньшей мере один дополнительный компонент, такой как фармацевтически приемлемый эксципиент.

Системы для клонирования и экспрессии полипептида в множестве различных клеток-хозяев хорошо известны. Экспрессия антител, включая их конъюгаты, в прокариотических клетках является общеизвестной в данной области. Для обзора см., например, Plückthun (1991), Bio/Technology 9: 545-551. Обычным бактериальным хозяином является E.coli.

Экспрессия в эукариотических клетках в культуре также доступна специалистам в данной области в качестве возможности продуцирования конъюгатов, например, Chadd et al. (2001), Current Opinion in Biotechnology 12: 188-194); Andersen et al. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13: 117; Larrick & Thomas (2001) Current Opinion in Biotechnology 12:411-418. клеточные линии млекопитающих, доступные в данной области для экспрессии гетерологичного полипептида, включают клетки яичника китайского хомячка (CHO), клетки HeLa, клетки почки детеныша хомячка, клетки миеломы мыши NS0, клетки миеломы крысы YB2/0, клетки почки эмбриона человека, клетки сетчатки эмбриона человека и многие другие.

Также описан способ, включающий введение нуклеиновой кислоты или конструкции, описанной в настоящем описании, в клетку-хозяина. Для введения можно использовать любой доступный способ. Для эукариотических клеток доступные способы могут включать трансфекцию с фосфатом кальция, способ с DEAE-декстраном, электропорацию, опосредуемую липосомами трансфекцию и трансдукцию с использованием ретровируса или другого вируса, например, вируса коровьей оспы, или, для клеток насекомых, бакуловируса. Для введения нуклеиновой кислоты в клетку-хозяина, в частности, эукариотическую клетку можно использовать вирусную систему или систему на основе плазмиды. Плазмидная система может поддерживаться эписомно, или может быть встроена в хромосому клетки хозяина или в искусственную хромосому. Включение может осуществляться либо путем случайного, либо путем направленного встраивания одной или нескольких копий в один или несколько локусов. Для бактериальных клеток подходящие способы могут включать трансформацию с хлоридом кальция, электропорацию и трансфекцию с использованием бактериофага.

Нуклеиновая кислота или конструкция может встраиваться в геном (например, хромосому) клетки-хозяина. Встраивание можно обеспечивать включением последовательностей, которые осуществляют рекомбинацию с геномом, в соответствии со стандартными способами.

Термин "выделенный" относится к состоянию, когда конъюгаты, описанные в настоящем описании, антитела для применения, как описано в настоящем описании, или нуклеиновая кислота, кодирующая такие конъюгаты, в основном являются соответствующими настоящему изобретению. Таким образом, конъюгаты, описанные в настоящем описании, антитела для применения, как описано в настоящем описании, или нуклеиновая кислота, кодирующая такие конъюгаты, могут быть предоставлены в выделенной и/или очищенной форме, например, из среды, в которой они получены (такой как культура клеток), в по существу чистой или однородной форме, или, в случае нуклеиновой кислоты, свободными или по существу свободными от нуклеиновых кислот с последовательностью, отличной от последовательности, кодирующей полипептид с требуемой функцией. Выделенные представители и выделенные нуклеиновые кислоты свободны или по существу свободны от материала, с которым они встречаются в среде, в которой они получены (например, клеточной культуре), когда такое получение осуществляется посредством технологии рекомбинантных ДНК, практикуемой in vitro или in vivo. Конкретные конъюгаты и нуклеиновые кислоты могут быть составлены с разбавителями или адъювантами, и, тем не менее, для практических целей быть выделенными, например, представители могут быть смешаны с фармацевтически приемлемыми носителями или разбавителями при использовании в терапии. Конкретные конъюгаты могут быть гликозилированными, либо естественным образом, либо посредством систем гетерологичных эукариотических клеток (например, клетки CHO или NS0 (ECACC 85110503), или они могут быть негликозилированными (например, если получены посредством экспрессии в прокариотической клетке).

Также можно использовать гетерогенные препараты конъюгатов, как описано в настоящем описании. Например, такие препараты могут представлять собой смеси конъюгатов, содержащих молекулы антител с полноразмерными тяжелыми цепями или тяжелыми цепями, лишенными C-концевого лизина, с различной степенью гликозилирования и/или с дериватизированными аминокислотами, такими как аминокислоты, образованные в результате циклизации N-концевой глутаминовой кислоты с образованием остатка пироглутаминовой кислоты.

Фибронектин представляет собой антиген, являющийся результатом альтернативного сплайсинга, и известен ряд альтернативных форм фибронектина, включая альтернативно сплайсированные изоформы фибронектина, включая альтернативно сплайсированные изоформы A-FN и B-FN, содержащие домены ED-A или ED-B, соответственно, которые являются известными маркерами ангиогенеза. Молекула антитела, описанная в настоящем описании, может селективно связываться с изоформами фибронектина, селективно экспрессируемыми в новообразованных сосудах. Молекула антитела может связывать изоформу A-FN фибронектина, например, она может связывать домен ED-A (экстрадомен A). Молекула антитела может связывать ED-B (экстрадомен B).

Экстрадомен-A (EDA или ED-A) фибронектина также известен как ED, экстраповтор A типа III (EIIIA) или EDI. Последовательность ED-A человека опубликована Kornblihtt et al. (1984), Nucleic Acids Res. 12, 5853-5868 и Paolella et al. (1988), Nucleic Acids Res. 16, 3545-3557. Последовательность ED-A человека также доступны в базе данных SwissProt в качестве аминокислот 1631-1720 (фибронектин типа Ill 12; экстрадомен 2) аминокислотной последовательности, депонированной под номером доступа P02751. Последовательность ED-A мыши доступна в базе данных SwissProt в качестве аминокислот 1721-1810 (фибронектин типа Ill 13; экстрадомен 2) аминокислотной последовательности, депонированной под номером доступа P11276.

Изоформа ED-A фибронектина (A-FN) содержит экстрадомен-A (ED-A). Последовательность A-FN человека может быть определена из соответствующей последовательности предшественника фибронектина человека, которая доступна в базе данных SwissProt под номером доступа P02751. Последовательность A-FN мыши может быть определена из соответствующей последовательности предшественника фибронектина мыши, которая доступна в базе данных SwissProt под номером доступа P11276. A-FN может представлять собой изоформу ED-A фибронектина человека. ED-A может представлять собой экстрадомен A фибронектина человека.

ED-A представляет собой последовательность из 90 аминокислот, которая встроена в фибронектин (FN) посредством альтернативного сплайсинга и расположена между доменами 11 и 12 FN (Borsi et al. (1987), J. Cell. Biol., 104, 595-600). ED-A в основном отсутствует в плазматической форме FN, но в большом количестве присутствует в ходе эмбриогенеза, ремоделирования тканей, фиброза, трансплантации сердца и роста солидной опухоли.

Изоформа B-FN фибронектина является одним из наиболее известных маркеров ангиогенеза (US 10/382107, WO01/62298). Экстрадомен "ED-B" из 91 аминокислоты встречается в изоформе B-FN и идентичен у мыши, крысы, кролика, собаки и человека. B-FN накапливается вокруг структур новообразованных сосудов в агрессивных опухолях и других тканях, претерпевающих ангиогенез, таких как эндометрий в пролиферативной фазе и некоторые глазные структуры в патологических условиях, но в остальных случаях не поддается обнаружению в нормальных тканях взрослого организма.

Тенасцин-C представляет собой большой гексамерный гликопротеин внеклеточного матрикса, который модулирует адгезию клеток. Он вовлечен в такие процессы, как пролиферация клеток и миграция клеток, и ассоциирован с изменениями архитектуры тканей, происходящими в ходе морфогенеза и эмбриогенеза, а также в процессе образования опухоли или ангиогенеза. В результате альтернативного сплайсинга может образовываться несколько изоформ тенасцина-C, что может приводить к включению (множества) доменов в центральной части этого белка, в диапазоне от домена A1 до домена D (Borsi L et al Int J Cancer 1992; 52:688-692, Carnemolla B et al. Eur J Biochem 1992; 205:561-567, WO2006/050834). Молекула антитела, описанная в настоящем описании, может связывать тенасцин-C. Молекула антитела может связывать домен A1 тенасцина-C.

Злокачественная опухоль, упоминаемая в настоящем описании, может представлять собой злокачественную опухоль, которая экспрессирует или для которой показана экспрессия антигена, ассоциированного с неопластическим ростом и/или ангиогенезом, такого как компонент внеклеточного матрикса, ассоциированный с неопластическим ростом и/или ангиогенезом.

Предпочтительно, злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль, которая экспрессирует или для которой показана экспрессия изоформы ED-A фибронектина, изоформы ED-B фибронектина и/или альтернативно сплайсированного тенасцина C. Более предпочтительно злокачественная опухоль экспрессирует изоформу ED-A фибронектина. Например, злокачественная опухоль может представлять собой любой тип солидной или несолидной злокачественной опухоли или злокачественной лимфомы. Злокачественная опухоль может быть выбрана из группы, состоящей из рака кожи (в частности, меланомы), рака головы и шеи, рака почки, саркомы, герминомы (такой как тератокарцинома), рака печени, лимфомы (такой как лимфома Ходжкина или неходжскинская лимфома), лейкоза (например, острого миелоидного лейкоза), рака кожи, рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака тела матки, рака яичника, рака предстательной железы, рака легкого, рака ободочной и прямой кишки, рака шейки матки, рака пищевода, рака поджелудочной железы, рака желудка и рака головного мозга. Злокачественные опухоли могут быть семейными или спорадическими. Злокачественные опухоли могут быть метастазирующими или не метастазирующими. Предпочтительно, злокачественная опухоль представляет собой злокачественную опухоль, выбранную из группы, состоящей из меланомы, рака головы и шеи, рака почки и саркомы. Указание на злокачественную опухоль, упоминаемую выше, обычно относится к злокачественной трансформации рассматриваемых клеток. Таким образом, рак почки, например, относится к злокачественной трансформации клеток почки. Рак может находиться в первичном расположении, таком как почка в случае рака почки, или в отдаленном положении в случае метастазов. Опухоль, упоминаемая в настоящем описании, может быть результатом любой из злокачественных опухолей, упоминаемых выше. Предпочтительно, опухоль является результатом меланомы, рака головы и шеи, рака почки или саркомы. Опухоль, которая является результатом конкретной злокачественной опухоли, включает как первичную опухоль, так и метастазы указанной злокачественной опухоли. Таким образом, опухоль, которая является результатом рака головы и шеи, например, включает как первичную опухоль головы и шеи, так и метастазы рака головы и шеи, находящиеся в других частях тела пациента.

Конъюгаты, описанные в настоящем описании, могут обладать противоопухолевой активностью и, таким образом, применимы для лечения злокачественной опухоли. Не ограничиваясь каким-либо теоретическим объяснением, ожидается, что конъюгаты будут демонстрировать мощную противоопухолевую активность в результате превосходных свойств нацеливания на опухоль, как продемонстрировано в примерах 3 и 4 ниже. Таким образом, конъюгаты, описанные в настоящем описании, конструируют для применнеия в способах лечения пациентов, предпочтительно пациентов-людей. Конъюгаты по настоящему изобретению, в частности, можно использовать для лечения злокачественной опухоли.

Таким образом, изобретение относится к способам лечения, включающим введение конъюгата, описанного в настоящем описании, к фармацевтическим композициям, содержащим такие конъюгаты, и к применению таких конъюгатов для изготовления лекарственного средства для введения, например, в способе получения лекарственного средства или фармацевтической композиции, включающем составление конъюгата с фармацевтически приемлемым эксципиентом. Фармацевтически приемлемые носители хорошо известны и могут быть приспособлены специалистом в данной области в зависимости от природы и способа введения выбранного активного соединения(ий).

Конъюгаты, описанные в настоящем описании, обычно вводят в форме фармацевтической композиции, которая может содержать по меньшей мере один компонент в дополнение к молекуле антитела. Таким образом, фармацевтические композиции, описанные в настоящем описании, и для применения в соответствии с настоящим изобретением, могут содержать, в дополнение к активному ингредиенту, фармацевтически приемлемый эксципиент, носитель, буфер, стабилизатор или другие материалы, хорошо известные специалистам в данной области. Такие материалы должны быть нетоксичными и не должны препятствовать эффективности активного ингредиента. Точная природа носителя или другого материала зависит от пути введения, который может представлять собой инъекцию, например, внутривенную, внутриопухолевую или подкожную. Предпочтительно, конъюгат по настоящему изобретению вводят внутрь опухоли.

Жидкие фармацевтические композиции обычно содержат жидкий носитель, такой как вода, вазелин, животные или растительные масла, минеральное масло или синтетическое масло. Могут быть включены физиологический солевой раствор, декстроза или другой раствор сахаридов или гликоли, такие как этиленгликоль, пропиленгликоль или полиэтиленгликоль.

Для внутривенной инъекции или инъекции в пораженную область, активный ингредиент может иметь форму парентерально приемлемого водного раствора, который является свободным от пирогенов и имеет подходящее значение pH, изотоничность и стабильность. Специалисты в данной области способны получить подходящие растворы с использованием, например, изотонических носителей, таких как хлорид натрия инъекционный, раствор Рингера инъекционный, лактатный раствор Рингера инъекционный. При необходимости можно добавить консерванты, стабилизаторы, буферы, антиоксиданты и/или другие добавки. Специалистам в данной области известно множество способов получения фармацевтических составов. См. например Robinson ed., Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

Композицию, содержащую конъюгат, описанный в настоящем описании, можно вводить отдельно или в комбинации с другими способами лечения злокачественной опухоли, одновременно или последовательно, или в качестве комбинированного препарата с другим терапевтическим средством или средствами, для лечения злокачественной опухоли. Например, конъюгат по изобретению можно использовать в комбинации с существующим терапевтическим средством от злокачественной опухоли.

Конъюгат, описанный в настоящем описании, можно использовать для производства лекарственного средства. Лекарственное средство может быть предназначено для раздельного или комбинированного введения индивидууму и, таким образом, может содержать конъюгат и дополнительный компонент в качестве комбинированного препарата или в качестве раздельных препаратов. Раздельные препараты можно использовать для облегчения раздельного и последовательного или одновременного введения, и они позволяют введение компонентов различными путями.

Композиции, описанные в настоящем описании, можно вводить млекопитающим, предпочтительно людям. Введение может осуществляться в "терапевтически эффективном количестве", являющемся достаточным для того, чтобы демонстрировать пользу для пациента. Такая польза может представлять собой по меньшей мере смягчение по меньшей мере одного симптома. Таким образом, "лечение" определенного заболевания относится к смягчению по меньшей мере одного симптома. Фактическое вводимое количество и скорость и расписание введений, будут зависеть от природы и тяжести подвергаемого лечению заболевания, конкретного подвергаемого лечению пациента, клинического состояния отдельного пациента, причины нарушения, области доставки композиции, типа конъюгата, способа введения, расписания введения и других факторов, известных медицинским специалистам. Ответственность за назначение лечения, например, решение о дозировке и т.д. несут врачи общей практики и другие медицинские врачи, и оно может зависеть от тяжести симптомов и/или прогрессирования заболевания, подвергаемого лечению. Подходящие дозировки антитела хорошо известны в данной области (Ledermann et al. (1991) Int. J. Cancer 47: 659-664; и Bagshawe et al. (1991) Antibody, Immunoconjugate and Radiopharmaceuticals 4: 915-922). Можно использовать конкретные дозировки, указанные в настоящем описании или в Physician's Desk Reference (2003) в зависимости от типа вводимого лекарственного средства. Терапевтически эффективное количество или подходящую дозу конъюгата для применения, как описано в настоящем описании, можно определять путем сравнения его активности in vitro и активности in vivo в модели на животных. Известны способы экстраполяции эффективных дозировок у мышей и других исследуемых животных для человека. Точная доза зависит от ряда факторов, включая то, предназначено ли антитело для диагностики, предупреждения или лечения, размер и положение области, подлежащей лечению, точную природу конъюгата. Для системного применения типичная доза конъюгата находится в диапазоне от 10 мкг до 500 мкг/кг. Можно вводить изначальную более высокую нагрузочную дозу, за которой следует одна или несколько более низких доз. Она представляет собой дозу для однократного лечения взрослого пациента, которую можно пропорционально корректировать для детей и младенцев, а также корректировать в зависимости от формата конъюгата пропорционально молекулярной массе. Лечение можно повторять с интервалами раз в сутки, два раза в неделю, раз в неделю или месяц по усмотрению врача. Лечение может осуществляться каждые от двух до четырех недель для подкожного введения и каждые от четырех до восьми недель для внутривенного введения. В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения лечение является периодическим и период между введениями составляет две недели или более, например, приблизительно три недели или более, приблизительно четыре недели или более, или приблизительно один месяц. В других вариантах осуществления изобретения лечение можно проводить до и/или после хирургической операции и можно проводить или применять непосредственно в анатомической области хирургического лечения.

Следующие аспекты и варианты осуществления изобретения станут понятными специалистам в данной области с учетом настоящего описания, включающего следующий экспериментальный раздел.

Все документы, упоминаемые в настоящем описании, включены в настоящее описание в качестве ссылок в полном объеме для всех целей.

"И/или", когда используется в настоящем описании, следует понимать как конкретное описание каждого из двух указанных признаков или компонентов с или без другого. Например, "A и/или B" следует понимать как конкретное описание каждого из (i) A, (ii) B и (iii) A и B, как если бы каждый из них был указан в настоящем описании индивидуально.

Если контекст не указывает на иное, описание и определение признаков, как указано выше, не ограничивается каким-либо конкретным аспектом или вариантом осуществления изобретения и применим в равной степени ко всем аспектам и вариантам осуществления, которые описаны.

Определенные аспекты и варианты осуществления изобретения далее проиллюстрированы в качестве примера и с отсылкой на чертежи, описанные выше.

Примеры

Пример 1 - Получение и анализ конъюгата huIL2-F8-huTNFα, конъюгатов huIL2-F8-мутант huTNFα, конъюгата huIL2-L19-huTNFα и конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα.

Различные конъюгаты с мутантами TNFα человека получали и охарактеризовывали посредством FPLC, SDS-PAGE и MS. Результаты обобщенно представлены в таблице 1. Небольшая экспрессия или отсутствие экспрессии мутанта R32W наблюдали в случае любого из иммуноцитокинов IL2-L19-TNFα или IL2-F8-TNFα. Выход мутанта R32A был неожиданно высоким для обоих иммуноцитокинов.

Белок Мутация Буфер для диализа Выход
(мг/л) Профиль FPLC SDS-PAGE MS SEQ ID NO 1 IL2-L19-TNF α - PBS 1,6 Π Π Π 70 2 IL2-L19-TNF α R32W PBS 0,4 Π Π Π 64 3 IL2-L19-TNF α R32A PBS 2,2 Π Π Π 44 4 IL2-F8-TNF α - PBS 1,4 Π Π Π 1 5 IL2-F8-TNF α R32W PBS - Ο Ο Ο 58 6 IL2-F8-TNF α R32A PBS 3,4 Π Π Π 36 7 IL2-F8-TNF α R32F MES 1,9 Π Π Π 60 8 IL2-F8-TNF α R32V MES 3,2 Π Π Π 62

Таблица 1

Пример 2 - Эффект формата конъюгата на активность уничтожения клеток

Слитые белки смогли экспрессировать и очистить до однородного состояния. Очищенный конъюгат huIL2-F8-huTNFα (SEQ ID NO: 1) и конъюгат huIL2-F8-мутант huTNFα (R32A) (SEQ ID NO: 36) анализировали с использованием стандартного эксперимента на системе ÄKTA-FPLC с колонкой Superdex 200 HR 10/30 и охарактеризовывали посредством анализа SDS-PAGE в не восстанавливающих и восстанавливающих условиях.

Для тестирования значимости мутации TNFα в конъюгате активности уничтожения клеток активность двух слитых белков тестировали в анализе уничтожения клеток с использованием клеточной линии фибробластов L M. Анализ проводили в присутствии 2 мкг/мл актиномицина D (Sigma-Aldrich). Клетки высевали в 96-луночные планшеты в культуральную среду, дополненную возрастающими концентрациями huIL2-F8-huTNFα (SEQ ID NO: 1) или huIL2-F8-huTNFα (R32A) (SEQ ID NO: 36), как указано на фиг.1. Антитело F8 имело формат scFv во всех протестированных конъюгатах. Результаты представлены на фиг.1. Результаты выражены в качестве процента жизнеспособности клеток по сравнению с клетками, обработанными только актиномицином D (использованным в качестве отрицательного контроля). Результаты демонстрируют, что активность уничтожения клеток конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R32A) была более низкой по сравнению с конъюгатом huIL2-F8-huTNFα, как можно видеть из величин EC50, приведенных на фиг.1. Величина EC50 отражает концентрацию лекарственного средства, требуемую для полумаксимальной активности.

Пример 3 - Анализ биораспределения конъюгата huIL2-F8- мутант huTNF (R32A)

Эффективность нацеливания in vivo конъюгата huIL2-F8-мутант huTNF (R32A) оценивали посредством анализа биораспределения. Слитый белок очищали эксклюзионной хроматографией, а затем метили радиоактивным йодом посредством йода-125. Всего 12 мкг (~9,6 мКи) препарата слитого белка инъецировали в хвостовую вену иммунокомпетентных мышей 129Sv, имеющих подкожно имплантированные тератокарциномы мыши F9. Через 24 ч после инъекции мышей умерщвляли. Органы взвешивали и определяли радиоактивность с использованием гамма-счетчика Packard Cobra. Уровень радиоактивности в соответствующих органах регистрировали и выражали в качестве процента инъецированной дозы на грамм ткани (%ID/г). Результаты демонстрируют предпочтительное и селективное накопление конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R32A) в опухоли (фиг.2).

Пример 4 - Получение и анализ конъюгатов huIL2-L19-мутант huTNFα (R32A)

Охарактеризация белка

Слитый белок huIL2-L19-huTNFα (R32A) (SEQ ID NO: 44) очищали из клеточной культуральной среды до однородного состояния посредством хроматографии с белком A и анализировали посредством SDS-PAGE, ESI-MS и эксклюзионной хроматографии (Superdex200 10/300GL, GE Healthcare).

Биологическую активность TNF и IL2 определяли на клетках HT1080 и CTLL2, соответственно.

Конъюгат huIL2-L19-мутант huTNFα (R32A) имел хорошие характеристики в биохимических анализах, селективно локализовался в солидных опухолях in vivo и проявлял согласованную активность in vitro частей IL2 и TNF при использовании клеточных анализов на основе пролиферации лимфоцитов CTLL-2 мыши (фиг.3) и на основе уничтожения опухолевой клеточной линии человека HT-1080 (фиг.4).

Исследования биораспределения

Эффективность нацеливания на EDB in vivo конъюгата huIL2-L19-мутант huTNF (R32A) оценивали посредством анализа биораспределения. 10 мкг меченного радиоактивным йодом слитого белка инъецировали в латеральную хвостовую вену мышей, имеющих опухоль F9. Мышей умерщвляли через 24 ч после инъекции, органы извлекали, взвешивали и определяли радиоактивность органов и опухолей с использованием счетчика Cobra γ и выражали в качестве процента от исходной дозы на грамм ткани (%ID/г±SEM), (n=3 мыши на группу). Результаты демонстрируют предпочтительное и селективное накопление конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32A) в опухоли (фиг.5).

Список последовательностей

1. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-huTNFα [растворимая форма] (SEQ ID NO: 1)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-huTNFα [раствориая форма] (IL2 человека - линкер - VH F8 - линкер - VL F8 - линкер - TNFα человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты. TNFα человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

2. Аминокислотная последовательность домена VH F8 (SEQ ID NO: 2)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSS

3. Аминокислотная последовательность линкера, связывающего домен VH с доменом VL антитела (SEQ ID NO: 3)

GGGGSGGGGSGGGG

4. Аминокислотная последовательность домена VL F8 (SEQ ID NO: 4)

EIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIK

5. Аминокислотная последовательность scFv F8 (SEQ ID NO: 5)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIK

6. Аминокислота последовательности CDR F8

CDR1 VH F8- LFT (SEQ ID NO: 6)

CDR2 VH F8 - SGSGGS (SEQ ID NO: 7)

CDR3 VH F8 - STHLYL (SEQ ID NO: 8)

CDR1 VL F8 - MPF (SEQ ID NO: 9)

CDR2 VL F8 - GASSRAT (SEQ ID NO: 10)

CDR3 VL F8 - MRGRPP (SEQ ID NO: 11)

7. Аминокислотная последовательность IL2 человека (huIL2) в конъюгатах (SEQ ID NO: 12)

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT

8. Аминокислотная последовательность линкера, связывающего молекулу антитела и IL2 и/или мутант TNF (SEQ ID NO: 13)

GDGSSGGSGGAS

9. Аминокислотная последовательность линкера, связывающего молекулу антитела и IL2 и/или мутант TNF (SEQ ID NO: 14)

SSSSGSSSSGSSSSG

10. Аминокислотная последовательность растворимой формы внеклеточного домена TNFα человека (huTNFα) (SEQ ID NO: 15)

VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

11. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-huTNFα [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 16)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-huTNFα [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер- VH F8- линкер - VL F8 - линкер - TNFα человека [внеклеточный домен]) представлена ниже. Линкерные последовательности почеркнуты. TNFα человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

12. Аминокислотная последовательность внеклеточного домена TNFα человека (huTNFα) (SEQ ID NO:17)

GPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

13. Аминокислотная последовательность CDR L19

CDR1 VH L19 - Ser Phe Ser Met Ser (SEQ ID NO: 18)

CDR2 VH L19 - Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys (SEQ ID NO: 19)

CDR3 VH L19 - Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr (SEQ ID NO: 20)

CDR1 VL L19 - Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Phe Leu Ala (SEQ ID NO: 21)

CDR2 VL L19 - Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr (SEQ ID NO: 22)

CDR3 VL L19 - Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro Pro Thr (SEQ ID NO: 23)

14. Аминокислотная последовательность домена VH L19 (SEQ ID NO: 24)

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

Thr Val Ser Ser

15. Аминокислотная последовательность домена VL L19 (SEQ ID NO: 25)

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro

Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

16. Аминокислотная последовательность scFv(L19) (SEQ ID NO: 26)

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro

Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

17. Аминокислотная последовательность CDR F16

CDR1 VH F16- RYGMS (SEQ ID NO: 27)

CDR2 VH F16- AISGSGGSTYYADSVKG (SEQ ID NO: 28)

CDR3 VH F16- AHNAFDY (SEQ ID NO: 29)

CDR1 VL F16- QGDSLRSYYAS (SEQ ID NO: 30)

CDR2 VL F16- GKNNRPS (SEQ ID NO: 31)

CDR3 VL F16- NSSVYTMPPVV (SEQ ID NO: 32)

18. Аминокислотная последовательность домена VH F16 (SEQ ID NO: 33)

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSR

19. Аминокислотная последовательность домена VL F16 (SEQ ID NO: 34)

SSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLG

20. Аминокислотная последовательность scFv(F16) (SEQ ID NO: 35)

Линкерная последовательность доменов VH и VL показана подчеркиванием

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGSGGGSGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLG

21. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R32A) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 36)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R32A) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH F8 - линкер - VL F8 - линкер - мутант TNFα (R32A) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32A подчеркнута и выделена полужирным шрифтом. Мутант TNFα (R32A) человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRAANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

22. Аминокислотная последовательность растворимой формы внеклеточного домена мутанта TNFα человека (R32A) (huTNFα R32A) (SEQ ID NO: 37). R32A подчеркнут полужирным шрифтом.

VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRAANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

23. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R52A) (huTNFα R52A) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 38)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R52A) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH F8 - линкер - VL F8 - линкер - мутант TNFα (R52A) человека [внеклеточный домен]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52A выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα (R52A) человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRAANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

24. Аминокислотная последовательность внеклеточного домена мутанта TNFα (R52A) человека (huTNFα R52A) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 39). R52A подчеркнут и выделен полужирным шрифтом.

GPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRAANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

25. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R32A) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 40)

Аминокислотная последовательность конъюгатаа huIL2-F16-мутант huTNFα (R32A) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер -VH F16 - линкер -VL F16 - линкер - мутант TNFα (R32A) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32A подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGSGGGSGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLGSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRAANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

26. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R52A) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 41)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R52A) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер -VH F16 - линкер -VL F16 - линкер - мутант TNFα (R52A) человека) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52A подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGSGGGSGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLGSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRAANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

27. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32A) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 42)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32A) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер -VH L19 - линкер -VL L19 - линкер - мутант TNFα (R32A) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32A подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRAANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

28. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R52A) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 43)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R52A) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH L19 - линкер - VL L19 - линкер - мутант TNFα (R52A) человека) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52A подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRAANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

29. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32A) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 44)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32A) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH L19 - линкер - VL L19 - линкер - мутант TNFα (R32A) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32A подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRAANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

30. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R52A) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 45)

Аминокислотная последовательность huIL2-L19-мутант huTNFα (R52A) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH L19 - линкер - VL L19 - линкер - мутант TNFα (R52A) человека) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52A подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRAANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

31. Аминокислотная последовательность scFv(F16) (SEQ ID NO: 46)

Линкерная последовательность доменов VH и VL показана подчеркиванием

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLG

32. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R32A) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 47)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R32A) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH F16 - линкер - VL F16 - линкер - мутант TNFα (R32A) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32A подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLGSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRAANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

33. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R52A) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 48)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R52A) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH F16 - линкер - VL F16 - линкер - мутант TNFα (R52A) человека) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52A подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLGSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRAANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

34. Аминокислотная последовательность линкера, связывающего молекулу антитела и IL2 и/или мутант TNF (SEQ ID NO: 49)

GGGGSGGGGSGGGG

35. Аминокислотная последовательность линкера, связывающего домен VH с доменом VL антитела (SEQ ID NO: 50)

GDGSSGGSGGAS

36. Аминокислотная последовательность линкера, связывающего домен VH с доменом VL антитела (SEQ ID NO: 51)

GGGSGGGSGG

37. Аминокислотная последовательность растворимой формы внеклеточного домена мутанта TNFα человека (R32W) (huTNFα R32W) (SEQ ID NO: 52). R32W подчеркнут и выделен полужирным шрифтом.

VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRWANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

38. Аминокислотная последовательность внеклеточного домена мутанта TNFα (R52W) человека (huTNFα R52W) (SEQ ID NO: 53). R52W подчеркнут и выделен полужирным шрифтом.

GPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRWANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

39. Аминокислотная последовательность растворимой формы внеклеточного домена мутанта TNFα (R32F) человека (huTNFα R32F) (SEQ ID NO: 54). R32F подчеркнут и выделен полужирным шрифтом.

VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRFANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

40. Аминокислотная последовательность внеклеточного домена мутанта TNFα (R52F) человека (huTNFα R52F) (SEQ ID NO: 55). R52F подчеркнут и выделен полужирным шрифтом.

GPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRFANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

41. Аминокислотная последовательность растворимой формы внеклеточного домена мутанта TNFα (R32V) человека (huTNFα R32V) (SEQ ID NO: 56). R32V подчеркнут и выделен полужирным шрифтом.

VRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRVANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

42. Аминокислотная последовательность внеклеточного домена мутанта TNFα (R52V) человека (huTNFα R52V) (SEQ ID NO: 57). R52V подчеркнут и выделен полужирным шрифтом.

GPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRVANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

43. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R32W) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 58)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R32W) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH F8 - линкер - VL F8 - линкер - мутант TNFα (R32W) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32W подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα (R32W) человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRWANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

44. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R52W) (huTNFα R52W) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 59)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R52W) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH F8 - линкер - VL F8 - линкер - мутант TNFα (R52W) человека [внеклеточный домен]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52W подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα (R52W) человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRWANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

45. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R32F) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 60)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R32F) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH F8 - линкер - VL F8 - линкер - мутант TNFα (R32F) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32F подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα (R32F) человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRFANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

46. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R52F) (huTNFα R52F) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 61)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R52F) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH F8 - линкер - VL F8 - линкер - мутант TNFα (R52F) человека [внеклеточный домен]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52F подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα (R52F) человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRFANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

47. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R32V) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 62)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R32V) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH F8 - линкер - VL F8 - линкер - мутант TNFα (R32V) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32V подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα (R32V) человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRVANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

48. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R52V) (huTNFα R52V) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 63)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант huTNFα (R52V) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH F8 - линкер - VL F8 - линкер - мутант TNFα (R52V) человека [внеклеточный домен]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52V подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα (R52V) человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSLFTMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSTHLYLFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSMPFLAWYQQKPGQAPRLLIYGASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQMRGRPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRVANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

49. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32W) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 64)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32W) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH L19 - линкер - VL L19 - линкер - мутант TNFα (R32W) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32W подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRWANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

50. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R52W) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 65)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R52W) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH L19 - линкер - VL L19 - линкер - мутант TNFα (R52W) человека) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52W подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRWANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

51. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32F) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 66)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32F) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH L19 - линкер - VL L19 - линкер - мутант TNFα (R32F) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32F подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRFANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

52. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R52F) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 67)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R52F) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH L19 - линкер - VL L19 - линкер - мутант TNFα (R52F) человека) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и the R52F подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. The human TNFα mutant в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRFANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

53. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32V) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 68)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R32V) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH L19 - линкер - VL L19 - линкер - мутант TNFα (R32V) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32V подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRVANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

54. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R52V) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 69)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант huTNFα (R52V) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH L19 - линкер - VL L19 - линкер - мутант TNFα (R52V) человека) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52V подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRVANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

55. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-huTNFα [растворимая форма] (SEQ ID NO: 70)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-huTNFα [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH L19 - линкер - VL L19 - линкер - TNFα человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты. TNFα человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

56. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-huTNFα [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 71)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-huTNFα [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH L19 - линкер - VL L19 - линкер -TNFα человека) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты. TNFα человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGGGGSGGGGSGGGGEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSFSMSWVRQAPGKGLEWVSSISGSSGTTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPFPYFDYWGQGTLVTVSSGDGSSGGSGGASEIVLTQSPGTLSLSPGERATLSCRASQSVSSSFLAWYQQKPGQAPRLLIYYASSRATGIPDRFSGSGSGTDFTLTISRLEPEDFAVYYCQQTGRIPPTFGQGTKVEIKSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRRANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

57. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R32W) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 72)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R32W) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH F16 - линкер - VL F16 - линкер - мутант TNFα (R32W) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32W подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLGSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRWANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

58. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R52W) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 73)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R52W) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH F16 - линкер - VL F16 - линкер - мутант TNFα (R52W) человека) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52W подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLGSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRWANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

59. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R32F) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 74)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R32F) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH F16 - линкер - VL F16 - линкер - мутант TNFα (R32F) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32F подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLGSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRFANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

60. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R52F) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 75)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R52F) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH F16 - линкер - VL F16 - линкер - мутант TNFα (R52F) человека) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52F подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLGSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRFANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

61. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R32V) [растворимая форма] (SEQ ID NO: 76)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R32V) [растворимая форма] (IL2 человека - линкер - VH F16 - линкер - VL F16 - линкер - мутант TNFα (R32V) человека [растворимая форма]) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R32V подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой растворимую форму внеклеточного домена TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLGSSSSGSSSSGSSSSGVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRVANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

62. Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R52V) [внеклеточный домен] (SEQ ID NO: 77)

Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант huTNFα (R52V) [внеклеточный домен] (IL2 человека - линкер - VH F16 - линкер - VL F16 - линкер - мутант TNFα (R52V) человека) представлена ниже. Линкерные последовательности подчеркнуты и R52V подчеркнут и выделен полужирным шрифтом. Мутант TNFα человека в этом конъюгате представляет собой внеклеточный домен TNFα.

APTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLTGDGSSGGSGGASEVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSRYGMSWVRQAPGKGLEWVSAISGSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKAHNAFDYWGQGTLVTVSRGGGGSGGGGSGGGGSSELTQDPAVSVALGQTVRITCQGDSLRSYYASWYQQKPGQAPVLVIYGKNNRPSGIPDRFSGSSSGNTASLTITGAQAEDEADYYCNSSVYTMPPVVFGGGTKLTVLGSSSSGSSSSGSSSSGGPQREEFPRDLSLISPLAQAVRSSSRTPSDKPVAHVVANPQAEGQLQWLNRVANALLANGVELRDNQLVVPSEGLYLIYSQVLFKGQGCPSTHVLLTHTISRIAVSYQTKVNLLSAIKSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQLEKGDRLSAEINRPDYLDFAESGQVYFGIIAL

--->

СПИСОК ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> PHILOGEN S.P.A.

<120> Иммуноконъюгаты IL2 и мутантного TNF

<130> NRS/FP7322332

<150> GB1618888.0

<151> 2016-11-09

<150> GB1712916.4

<151> 2017-08-11

<160> 77

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 557

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-huTNF-альфа

[растворимая форма]

<400> 1

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu

165 170 175

Phe Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

260 265 270

Ser Gly Gly Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu

275 280 285

Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln

290 295 300

Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

305 310 315 320

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile

325 330 335

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

340 345 350

Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

355 360 365

Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

370 375 380

Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly

385 390 395 400

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val

405 410 415

Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg

420 425 430

Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu

435 440 445

Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe

450 455 460

Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile

465 470 475 480

Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala

485 490 495

Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys

500 505 510

Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys

515 520 525

Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe

530 535 540

Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

545 550 555

<210> 2

<211> 118

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность домена VH F8

<400> 2

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Phe

20 25 30

Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 3

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность линкера, связывающего домен

VH с доменом VL антитела

<400> 3

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10

<210> 4

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность домена VL F8

<400> 4

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Met Pro

20 25 30

Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met Arg Gly Arg Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 5

<211> 240

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность scFv F8

<400> 5

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu Phe

20 25 30

Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

100 105 110

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser

115 120 125

Gly Gly Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser

130 135 140

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser

145 150 155 160

Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

165 170 175

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro

180 185 190

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

195 200 205

Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Met

210 215 220

Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

225 230 235 240

<210> 6

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VH F8

<400> 6

Leu Phe Thr

1

<210> 7

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VH F8

<400> 7

Ser Gly Ser Gly Gly Ser

1 5

<210> 8

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 VH F8

<400> 8

Ser Thr His Leu Tyr Leu

1 5

<210> 9

<211> 3

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VL F8

<400> 9

Met Pro Phe

1

<210> 10

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL F8

<400> 10

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 11

<211> 6

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 VL F8

<400> 11

Met Arg Gly Arg Pro Pro

1 5

<210> 12

<211> 133

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность IL2 человека (huIL2) в

конъюгатах

<400> 12

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr

130

<210> 13

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность линкера, связывающего молекулу

антитела и IL2 и/или мутанта TNF

<400> 13

Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser

1 5 10

<210> 14

<211> 15

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность линкера, связывающего молекулу

антитела и IL2 и/или мутанта TNF

<400> 14

Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly

1 5 10 15

<210> 15

<211> 157

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность растворимой формы внеклеточного

домена TNF-альфа человека (huTNF-альфа)

<400> 15

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val

1 5 10 15

Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg

20 25 30

Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu

35 40 45

Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe

50 55 60

Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile

65 70 75 80

Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala

85 90 95

Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys

100 105 110

Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys

115 120 125

Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe

130 135 140

Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

145 150 155

<210> 16

<211> 577

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-huTNF-альфа

[внеклеточный домен]

<400> 16

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu

165 170 175

Phe Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

260 265 270

Ser Gly Gly Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu

275 280 285

Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln

290 295 300

Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

305 310 315 320

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile

325 330 335

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

340 345 350

Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

355 360 365

Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

370 375 380

Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly

385 390 395 400

Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro

405 410 415

Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro

420 425 430

Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp

435 440 445

Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg

450 455 460

Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser

465 470 475 480

Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu

485 490 495

Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn

500 505 510

Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly

515 520 525

Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe

530 535 540

Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp

545 550 555 560

Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala

565 570 575

Leu

<210> 17

<211> 177

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность внеклеточного домена TNF-альфа

(huTNF-альфа)

<400> 17

Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro

1 5 10 15

Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro

20 25 30

Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp

35 40 45

Leu Asn Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg

50 55 60

Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser

65 70 75 80

Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu

85 90 95

Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn

100 105 110

Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly

115 120 125

Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe

130 135 140

Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp

145 150 155 160

Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala

165 170 175

Leu

<210> 18

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VH L19

<400> 18

Ser Phe Ser Met Ser

1 5

<210> 19

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VH L19

<400> 19

Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly

1 5 10 15

<210> 20

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 VH L19

<400> 20

Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr

1 5

<210> 21

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VL L19

<400> 21

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Phe Leu Ala

1 5 10

<210> 22

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL L19

<400> 22

Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr

1 5

<210> 23

<211> 9

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 VL L19

<400> 23

Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro Pro Thr

1 5

<210> 24

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность домена VH L19

<400> 24

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser

115

<210> 25

<211> 108

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность домена VL L19

<400> 25

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro

85 90 95

Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 26

<211> 236

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность scFv(L19)

<400> 26

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe

20 25 30

Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser

115 120 125

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

130 135 140

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

145 150 155 160

Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

165 170 175

Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

180 185 190

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

195 200 205

Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile Pro

210 215 220

Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

225 230 235

<210> 27

<211> 5

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VH F16

<400> 27

Arg Tyr Gly Met Ser

1 5

<210> 28

<211> 17

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VH F16

<400> 28

Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 29

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 VH F16

<400> 29

Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr

1 5

<210> 30

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR1 VL F16

<400> 30

Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser

1 5 10

<210> 31

<211> 7

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR2 VL F16

<400> 31

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser

1 5

<210> 32

<211> 11

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> CDR3 VL F16

<400> 32

Asn Ser Ser Val Tyr Thr Met Pro Pro Val Val

1 5 10

<210> 33

<211> 116

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность домена VH F16

<400> 33

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Arg

115

<210> 34

<211> 109

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность домена VL F16

<400> 34

Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln

1 5 10 15

Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala

20 25 30

Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr

35 40 45

Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser

50 55 60

Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu

65 70 75 80

Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr Met Pro Pro

85 90 95

Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

100 105

<210> 35

<211> 235

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность scFv(F16)

<400> 35

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser Ser

115 120 125

Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr Val

130 135 140

Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser Trp

145 150 155 160

Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly Lys

165 170 175

Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser Ser

180 185 190

Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp Glu

195 200 205

Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr Met Pro Pro Val Val

210 215 220

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

225 230 235

<210> 36

<211> 557

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант

huTNF-альфа (R32A) [растворимая форма]

<400> 36

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu

165 170 175

Phe Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

260 265 270

Ser Gly Gly Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu

275 280 285

Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln

290 295 300

Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

305 310 315 320

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile

325 330 335

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

340 345 350

Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

355 360 365

Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

370 375 380

Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly

385 390 395 400

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val

405 410 415

Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Ala

420 425 430

Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu

435 440 445

Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe

450 455 460

Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile

465 470 475 480

Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala

485 490 495

Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys

500 505 510

Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys

515 520 525

Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe

530 535 540

Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

545 550 555

<210> 37

<211> 157

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность растворимая форма внеклеточного

домена мутанта TNF-альфа (R32A) человека (huTNF-альфа R32A)

<400> 37

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val

1 5 10 15

Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Ala

20 25 30

Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu

35 40 45

Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe

50 55 60

Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile

65 70 75 80

Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala

85 90 95

Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys

100 105 110

Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys

115 120 125

Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe

130 135 140

Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

145 150 155

<210> 38

<211> 577

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант

huTNF-альфа (R52A) (huTNF-альфа R52A) [внеклеточный домен]

<400> 38

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu

165 170 175

Phe Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

260 265 270

Ser Gly Gly Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu

275 280 285

Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln

290 295 300

Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

305 310 315 320

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile

325 330 335

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

340 345 350

Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

355 360 365

Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

370 375 380

Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly

385 390 395 400

Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro

405 410 415

Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro

420 425 430

Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp

435 440 445

Leu Asn Arg Ala Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg

450 455 460

Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser

465 470 475 480

Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu

485 490 495

Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn

500 505 510

Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly

515 520 525

Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe

530 535 540

Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp

545 550 555 560

Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala

565 570 575

Leu

<210> 39

<211> 177

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность внеклеточного домена мутанта

TNF-альфа (R52A) человека (huTNF-альфа R52A) [внеклеточный домен]

<400> 39

Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro

1 5 10 15

Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro

20 25 30

Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp

35 40 45

Leu Asn Arg Ala Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg

50 55 60

Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser

65 70 75 80

Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu

85 90 95

Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn

100 105 110

Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly

115 120 125

Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe

130 135 140

Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp

145 150 155 160

Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala

165 170 175

Leu

<210> 40

<211> 552

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант

huTNF-альфа (R32A) [растворимая форма]

<400> 40

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg

165 170 175

Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

245 250 255

Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser

260 265 270

Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr

275 280 285

Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser

290 295 300

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly

305 310 315 320

Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser

325 330 335

Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp

340 345 350

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr Met Pro Pro Val

355 360 365

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Ser Ser Ser

370 375 380

Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Val Arg Ser Ser Ser

385 390 395 400

Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln

405 410 415

Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Ala Ala Asn Ala Leu Leu

420 425 430

Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu

435 440 445

Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys

450 455 460

Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val

465 470 475 480

Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys

485 490 495

Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro

500 505 510

Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser

515 520 525

Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln

530 535 540

Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

545 550

<210> 41

<211> 572

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант

huTNF-альфа (R52A) [внеклеточный домен]

<400> 41

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg

165 170 175

Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

245 250 255

Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Ser

260 265 270

Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu Gly Gln Thr

275 280 285

Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr Tyr Ala Ser

290 295 300

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val Ile Tyr Gly

305 310 315 320

Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Ser

325 330 335

Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln Ala Glu Asp

340 345 350

Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr Met Pro Pro Val

355 360 365

Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Ser Ser Ser Ser

370 375 380

Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly Pro Gln Arg Glu

385 390 395 400

Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala Val

405 410 415

Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val

420 425 430

Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Ala Ala

435 440 445

Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val

450 455 460

Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys

465 470 475 480

Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser

485 490 495

Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile

500 505 510

Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro

515 520 525

Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly

530 535 540

Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala

545 550 555 560

Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

565 570

<210> 42

<211> 553

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант

huTNF-альфа (R32A) [растворимая форма]

<400> 42

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser

165 170 175

Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

245 250 255

Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala

260 265 270

Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro

275 280 285

Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser

290 295 300

Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu

305 310 315 320

Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe

325 330 335

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu

340 345 350

Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile

355 360 365

Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ser

370 375 380

Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Val Arg Ser Ser

385 390 395 400

Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala Asn Pro

405 410 415

Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Ala Ala Asn Ala Leu

420 425 430

Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser

435 440 445

Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly

450 455 460

Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala

465 470 475 480

Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro

485 490 495

Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu

500 505 510

Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu

515 520 525

Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly

530 535 540

Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

545 550

<210> 43

<211> 573

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность мутанта huIL2-L19-huTNF-альфа

(R52A) [внеклеточный домен]

<400> 43

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser

165 170 175

Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

245 250 255

Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala

260 265 270

Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro

275 280 285

Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser

290 295 300

Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu

305 310 315 320

Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe

325 330 335

Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu

340 345 350

Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly Arg Ile

355 360 365

Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser Ser Ser

370 375 380

Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly Pro Gln Arg

385 390 395 400

Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala Gln Ala

405 410 415

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val

420 425 430

Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Ala

435 440 445

Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu

450 455 460

Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe

465 470 475 480

Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile

485 490 495

Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala

500 505 510

Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys

515 520 525

Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys

530 535 540

Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe

545 550 555 560

Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

565 570

<210> 44

<211> 555

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант

huTNF-альфа (R32A) [растворимая форма]

<400> 44

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

165 170 175

Ser Ser Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala

195 200 205

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

210 215 220

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu

275 280 285

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val

290 295 300

Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

305 310 315 320

Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp

325 330 335

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

340 345 350

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly

355 360 365

Arg Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser

370 375 380

Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Val Arg

385 390 395 400

Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala

405 410 415

Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Ala Ala Asn

420 425 430

Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val

435 440 445

Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly

450 455 460

Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg

465 470 475 480

Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys

485 490 495

Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp

500 505 510

Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp

515 520 525

Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu

530 535 540

Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

545 550 555

<210> 45

<211> 575

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант

huTNF-альфа (R52A) [внеклеточный домен]

<400> 45

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

165 170 175

Ser Ser Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala

195 200 205

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

210 215 220

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu

275 280 285

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val

290 295 300

Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

305 310 315 320

Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp

325 330 335

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

340 345 350

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly

355 360 365

Arg Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser

370 375 380

Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly Pro

385 390 395 400

Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala

405 410 415

Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala

420 425 430

His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn

435 440 445

Arg Ala Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn

450 455 460

Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val

465 470 475 480

Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His

485 490 495

Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu

500 505 510

Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu

515 520 525

Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu

530 535 540

Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu

545 550 555 560

Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

565 570 575

<210> 46

<211> 239

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность scFv(F16)

<400> 46

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr

20 25 30

Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val

100 105 110

Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly

115 120 125

Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala Leu

130 135 140

Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser Tyr

145 150 155 160

Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu Val

165 170 175

Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

180 185 190

Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala Gln

195 200 205

Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr Met

210 215 220

Pro Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

225 230 235

<210> 47

<211> 556

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант

huTNF-альфа (R32A) [растворимая форма]

<400> 47

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg

165 170 175

Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

245 250 255

Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala

275 280 285

Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser

290 295 300

Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu

305 310 315 320

Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe

325 330 335

Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala

340 345 350

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr

355 360 365

Met Pro Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

370 375 380

Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Val

385 390 395 400

Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val

405 410 415

Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Ala Ala

420 425 430

Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val

435 440 445

Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys

450 455 460

Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser

465 470 475 480

Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile

485 490 495

Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro

500 505 510

Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly

515 520 525

Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala

530 535 540

Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

545 550 555

<210> 48

<211> 576

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант

huTNF-альфа (R52A) [внеклеточный домен]

<400> 48

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg

165 170 175

Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

245 250 255

Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala

275 280 285

Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser

290 295 300

Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu

305 310 315 320

Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe

325 330 335

Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala

340 345 350

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr

355 360 365

Met Pro Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

370 375 380

Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly

385 390 395 400

Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu

405 410 415

Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val

420 425 430

Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu

435 440 445

Asn Arg Ala Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp

450 455 460

Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln

465 470 475 480

Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr

485 490 495

His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu

500 505 510

Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala

515 520 525

Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln

530 535 540

Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr

545 550 555 560

Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

565 570 575

<210> 49

<211> 14

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность линкера, связывающего молекулу

антитела и IL2 и/или мутант TNF

<400> 49

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

1 5 10

<210> 50

<211> 12

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность линкер, связывающего домен

VH с доменом VL антитела

<400> 50

Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala Ser

1 5 10

<210> 51

<211> 10

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность линкера, связывающего домен

VH с доменом VL антитела

<400> 51

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly

1 5 10

<210> 52

<211> 157

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность растворимой формы внеклеточного

домена мутанта TNF-альфа (R32W) человека (huTNF-альфа R32W)

<400> 52

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val

1 5 10 15

Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Trp

20 25 30

Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu

35 40 45

Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe

50 55 60

Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile

65 70 75 80

Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala

85 90 95

Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys

100 105 110

Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys

115 120 125

Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe

130 135 140

Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

145 150 155

<210> 53

<211> 177

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность внеклеточного домена мутанта

TNF-альфа (R52W) человека (huTNF-альфа R52W)

<400> 53

Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro

1 5 10 15

Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro

20 25 30

Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp

35 40 45

Leu Asn Arg Trp Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg

50 55 60

Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser

65 70 75 80

Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu

85 90 95

Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn

100 105 110

Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly

115 120 125

Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe

130 135 140

Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp

145 150 155 160

Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala

165 170 175

Leu

<210> 54

<211> 157

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность растворимой формы внеклеточного

домена мутанта TNF-альфа (R32F) человека (huTNF-альфа R32F)

<400> 54

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val

1 5 10 15

Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Phe

20 25 30

Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu

35 40 45

Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe

50 55 60

Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile

65 70 75 80

Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala

85 90 95

Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys

100 105 110

Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys

115 120 125

Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe

130 135 140

Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

145 150 155

<210> 55

<211> 177

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность внеклеточного домена мутанта

TNF-альфа (R52F) человека (huTNF-альфа R52F)

<400> 55

Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro

1 5 10 15

Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro

20 25 30

Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp

35 40 45

Leu Asn Arg Phe Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg

50 55 60

Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser

65 70 75 80

Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu

85 90 95

Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn

100 105 110

Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly

115 120 125

Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe

130 135 140

Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp

145 150 155 160

Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala

165 170 175

Leu

<210> 56

<211> 157

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность растворимая форма внеклеточного

домена мутанта TNF-альфа (R32V) человека (huTNF-альфа R32V)

<400> 56

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val

1 5 10 15

Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Val

20 25 30

Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu

35 40 45

Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe

50 55 60

Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile

65 70 75 80

Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala

85 90 95

Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys

100 105 110

Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys

115 120 125

Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe

130 135 140

Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

145 150 155

<210> 57

<211> 177

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность внеклеточного домена мутанта

TNF-альфа (R52V) человека (huTNF-альфа R52V)

<400> 57

Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro

1 5 10 15

Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro

20 25 30

Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp

35 40 45

Leu Asn Arg Val Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg

50 55 60

Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser

65 70 75 80

Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu

85 90 95

Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn

100 105 110

Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly

115 120 125

Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe

130 135 140

Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp

145 150 155 160

Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala

165 170 175

Leu

<210> 58

<211> 557

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант

huTNF-альфа (R32W) [растворимая форма]

<400> 58

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu

165 170 175

Phe Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

260 265 270

Ser Gly Gly Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu

275 280 285

Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln

290 295 300

Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

305 310 315 320

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile

325 330 335

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

340 345 350

Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

355 360 365

Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

370 375 380

Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly

385 390 395 400

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val

405 410 415

Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Trp

420 425 430

Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu

435 440 445

Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe

450 455 460

Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile

465 470 475 480

Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala

485 490 495

Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys

500 505 510

Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys

515 520 525

Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe

530 535 540

Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

545 550 555

<210> 59

<211> 577

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант

huTNF-альфа (R52W) (huTNF-альфа R52W) [внеклеточный домен]

<400> 59

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu

165 170 175

Phe Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

260 265 270

Ser Gly Gly Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu

275 280 285

Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln

290 295 300

Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

305 310 315 320

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile

325 330 335

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

340 345 350

Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

355 360 365

Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

370 375 380

Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly

385 390 395 400

Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro

405 410 415

Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro

420 425 430

Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp

435 440 445

Leu Asn Arg Trp Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg

450 455 460

Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser

465 470 475 480

Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu

485 490 495

Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn

500 505 510

Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly

515 520 525

Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe

530 535 540

Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp

545 550 555 560

Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala

565 570 575

Leu

<210> 60

<211> 557

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант

huTNF-альфа (R32F) [растворимая форма]

<400> 60

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu

165 170 175

Phe Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

260 265 270

Ser Gly Gly Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu

275 280 285

Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln

290 295 300

Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

305 310 315 320

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile

325 330 335

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

340 345 350

Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

355 360 365

Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

370 375 380

Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly

385 390 395 400

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val

405 410 415

Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Phe

420 425 430

Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu

435 440 445

Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe

450 455 460

Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile

465 470 475 480

Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala

485 490 495

Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys

500 505 510

Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys

515 520 525

Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe

530 535 540

Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

545 550 555

<210> 61

<211> 577

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант

huTNF-альфа (R52F) (huTNF-альфа R52F) [внеклеточный домен]

<400> 61

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu

165 170 175

Phe Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

260 265 270

Ser Gly Gly Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu

275 280 285

Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln

290 295 300

Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

305 310 315 320

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile

325 330 335

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

340 345 350

Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

355 360 365

Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

370 375 380

Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly

385 390 395 400

Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro

405 410 415

Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro

420 425 430

Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp

435 440 445

Leu Asn Arg Phe Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg

450 455 460

Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser

465 470 475 480

Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu

485 490 495

Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn

500 505 510

Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly

515 520 525

Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe

530 535 540

Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp

545 550 555 560

Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala

565 570 575

Leu

<210> 62

<211> 557

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант

huTNF-альфа (R32V) [растворимая форма]

<400> 62

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu

165 170 175

Phe Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

260 265 270

Ser Gly Gly Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu

275 280 285

Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln

290 295 300

Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

305 310 315 320

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile

325 330 335

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

340 345 350

Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

355 360 365

Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

370 375 380

Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly

385 390 395 400

Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val

405 410 415

Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Val

420 425 430

Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu

435 440 445

Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe

450 455 460

Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile

465 470 475 480

Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala

485 490 495

Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys

500 505 510

Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys

515 520 525

Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe

530 535 540

Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

545 550 555

<210> 63

<211> 577

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F8-мутант

huTNF-альфа (R52V) (huTNF-альфа R52V) [внеклеточный домен]

<400> 63

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Leu

165 170 175

Phe Thr Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Lys Ser Thr His Leu Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

260 265 270

Ser Gly Gly Gly Gly Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu

275 280 285

Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln

290 295 300

Ser Val Ser Met Pro Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

305 310 315 320

Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile

325 330 335

Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

340 345 350

Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln

355 360 365

Met Arg Gly Arg Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile

370 375 380

Lys Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly

385 390 395 400

Gly Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro

405 410 415

Leu Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro

420 425 430

Val Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp

435 440 445

Leu Asn Arg Val Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg

450 455 460

Asp Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser

465 470 475 480

Gln Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu

485 490 495

Thr His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn

500 505 510

Leu Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly

515 520 525

Ala Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe

530 535 540

Gln Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp

545 550 555 560

Tyr Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala

565 570 575

Leu

<210> 64

<211> 555

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант

huTNF-альфа (R32W) [растворимая форма]

<400> 64

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

165 170 175

Ser Ser Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala

195 200 205

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

210 215 220

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu

275 280 285

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val

290 295 300

Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

305 310 315 320

Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp

325 330 335

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

340 345 350

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly

355 360 365

Arg Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser

370 375 380

Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Val Arg

385 390 395 400

Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala

405 410 415

Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Trp Ala Asn

420 425 430

Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val

435 440 445

Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly

450 455 460

Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg

465 470 475 480

Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys

485 490 495

Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp

500 505 510

Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp

515 520 525

Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu

530 535 540

Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

545 550 555

<210> 65

<211> 575

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант

huTNF-альфа (R52W) [внеклеточный домен]

<400> 65

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

165 170 175

Ser Ser Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala

195 200 205

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

210 215 220

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu

275 280 285

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val

290 295 300

Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

305 310 315 320

Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp

325 330 335

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

340 345 350

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly

355 360 365

Arg Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser

370 375 380

Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly Pro

385 390 395 400

Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala

405 410 415

Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala

420 425 430

His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn

435 440 445

Arg Trp Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn

450 455 460

Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val

465 470 475 480

Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His

485 490 495

Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu

500 505 510

Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu

515 520 525

Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu

530 535 540

Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu

545 550 555 560

Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

565 570 575

<210> 66

<211> 555

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант

huTNF-альфа (R32F) [растворимая форма]

<400> 66

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

165 170 175

Ser Ser Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala

195 200 205

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

210 215 220

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu

275 280 285

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val

290 295 300

Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

305 310 315 320

Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp

325 330 335

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

340 345 350

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly

355 360 365

Arg Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser

370 375 380

Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Val Arg

385 390 395 400

Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala

405 410 415

Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Phe Ala Asn

420 425 430

Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val

435 440 445

Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly

450 455 460

Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg

465 470 475 480

Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys

485 490 495

Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp

500 505 510

Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp

515 520 525

Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu

530 535 540

Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

545 550 555

<210> 67

<211> 575

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант

huTNF-альфа (R52F) [внеклеточный домен]

<400> 67

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

165 170 175

Ser Ser Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala

195 200 205

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

210 215 220

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu

275 280 285

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val

290 295 300

Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

305 310 315 320

Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp

325 330 335

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

340 345 350

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly

355 360 365

Arg Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser

370 375 380

Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly Pro

385 390 395 400

Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala

405 410 415

Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala

420 425 430

His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn

435 440 445

Arg Phe Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn

450 455 460

Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val

465 470 475 480

Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His

485 490 495

Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu

500 505 510

Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu

515 520 525

Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu

530 535 540

Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu

545 550 555 560

Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

565 570 575

<210> 68

<211> 555

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант

huTNF-альфа (R32V) [растворимая форма]

<400> 68

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

165 170 175

Ser Ser Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala

195 200 205

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

210 215 220

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu

275 280 285

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val

290 295 300

Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

305 310 315 320

Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp

325 330 335

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

340 345 350

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly

355 360 365

Arg Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser

370 375 380

Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Val Arg

385 390 395 400

Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala

405 410 415

Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Val Ala Asn

420 425 430

Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val

435 440 445

Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly

450 455 460

Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg

465 470 475 480

Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys

485 490 495

Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp

500 505 510

Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp

515 520 525

Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu

530 535 540

Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

545 550 555

<210> 69

<211> 575

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-мутант

huTNF-альфа (R52V) [внеклеточный домен]

<400> 69

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

165 170 175

Ser Ser Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala

195 200 205

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

210 215 220

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu

275 280 285

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val

290 295 300

Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

305 310 315 320

Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp

325 330 335

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

340 345 350

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly

355 360 365

Arg Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser

370 375 380

Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly Pro

385 390 395 400

Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala

405 410 415

Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala

420 425 430

His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn

435 440 445

Arg Val Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn

450 455 460

Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val

465 470 475 480

Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His

485 490 495

Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu

500 505 510

Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu

515 520 525

Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu

530 535 540

Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu

545 550 555 560

Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

565 570 575

<210> 70

<211> 555

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-huTNF-альфа [растворимая форма]

<400> 70

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

165 170 175

Ser Ser Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala

195 200 205

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

210 215 220

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu

275 280 285

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val

290 295 300

Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

305 310 315 320

Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp

325 330 335

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

340 345 350

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly

355 360 365

Arg Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser

370 375 380

Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Val Arg

385 390 395 400

Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val Ala

405 410 415

Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Arg Ala Asn

420 425 430

Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val Val

435 440 445

Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys Gly

450 455 460

Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser Arg

465 470 475 480

Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile Lys

485 490 495

Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro Trp

500 505 510

Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly Asp

515 520 525

Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala Glu

530 535 540

Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

545 550 555

<210> 71

<211> 575

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-L19-huTNF-альфа [внеклеточный домен]

<400> 71

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

145 150 155 160

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

165 170 175

Ser Ser Phe Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

180 185 190

Glu Trp Val Ser Ser Ile Ser Gly Ser Ser Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala

195 200 205

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

210 215 220

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

225 230 235 240

Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Phe Pro Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

245 250 255

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Ala Ser Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu

275 280 285

Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val

290 295 300

Ser Ser Ser Phe Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

305 310 315 320

Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp

325 330 335

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

340 345 350

Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gly

355 360 365

Arg Ile Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Ser

370 375 380

Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly Pro

385 390 395 400

Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu Ala

405 410 415

Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala

420 425 430

His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn

435 440 445

Arg Arg Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn

450 455 460

Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val

465 470 475 480

Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His

485 490 495

Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu

500 505 510

Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu

515 520 525

Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu

530 535 540

Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu

545 550 555 560

Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

565 570 575

<210> 72

<211> 556

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант

huTNF-альфа (R32W) [растворимая форма]

<400> 72

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg

165 170 175

Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

245 250 255

Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala

275 280 285

Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser

290 295 300

Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu

305 310 315 320

Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe

325 330 335

Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala

340 345 350

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr

355 360 365

Met Pro Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

370 375 380

Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Val

385 390 395 400

Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val

405 410 415

Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Trp Ala

420 425 430

Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val

435 440 445

Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys

450 455 460

Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser

465 470 475 480

Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile

485 490 495

Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro

500 505 510

Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly

515 520 525

Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala

530 535 540

Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

545 550 555

<210> 73

<211> 576

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант

huTNF-альфа (R52W) [внеклеточный домен]

<400> 73

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg

165 170 175

Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

245 250 255

Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala

275 280 285

Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser

290 295 300

Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu

305 310 315 320

Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe

325 330 335

Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala

340 345 350

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr

355 360 365

Met Pro Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

370 375 380

Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly

385 390 395 400

Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu

405 410 415

Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val

420 425 430

Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu

435 440 445

Asn Arg Trp Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp

450 455 460

Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln

465 470 475 480

Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr

485 490 495

His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu

500 505 510

Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala

515 520 525

Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln

530 535 540

Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr

545 550 555 560

Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

565 570 575

<210> 74

<211> 556

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант

huTNF-альфа (R32F) [растворимая форма]

<400> 74

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg

165 170 175

Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

245 250 255

Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala

275 280 285

Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser

290 295 300

Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu

305 310 315 320

Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe

325 330 335

Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala

340 345 350

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr

355 360 365

Met Pro Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

370 375 380

Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Val

385 390 395 400

Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val

405 410 415

Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Phe Ala

420 425 430

Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val

435 440 445

Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys

450 455 460

Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser

465 470 475 480

Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile

485 490 495

Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro

500 505 510

Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly

515 520 525

Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala

530 535 540

Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

545 550 555

<210> 75

<211> 576

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант

huTNF-альфа (R52F) [внеклеточный домен]

<400> 75

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg

165 170 175

Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

245 250 255

Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala

275 280 285

Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser

290 295 300

Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu

305 310 315 320

Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe

325 330 335

Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala

340 345 350

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr

355 360 365

Met Pro Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

370 375 380

Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly

385 390 395 400

Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu

405 410 415

Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val

420 425 430

Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu

435 440 445

Asn Arg Phe Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp

450 455 460

Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln

465 470 475 480

Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr

485 490 495

His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu

500 505 510

Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala

515 520 525

Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln

530 535 540

Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr

545 550 555 560

Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

565 570 575

<210> 76

<211> 556

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант

huTNF-альфа (R32V) [растворимая форма]

<400> 76

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg

165 170 175

Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

245 250 255

Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala

275 280 285

Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser

290 295 300

Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu

305 310 315 320

Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe

325 330 335

Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala

340 345 350

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr

355 360 365

Met Pro Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

370 375 380

Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Val

385 390 395 400

Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val Ala His Val Val

405 410 415

Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu Asn Arg Val Ala

420 425 430

Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp Asn Gln Leu Val

435 440 445

Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln Val Leu Phe Lys

450 455 460

Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr His Thr Ile Ser

465 470 475 480

Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu Leu Ser Ala Ile

485 490 495

Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala Glu Ala Lys Pro

500 505 510

Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln Leu Glu Lys Gly

515 520 525

Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr Leu Asp Phe Ala

530 535 540

Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

545 550 555

<210> 77

<211> 576

<212> БЕЛОК

<213> Искусственная последовательность

<220>

<223> Аминокислотная последовательность конъюгата huIL2-F16-мутант

huTNF-альфа (R52V) [внеклеточный домен]

<400> 77

Ala Pro Thr Ser Ser Ser Thr Lys Lys Thr Gln Leu Gln Leu Glu His

1 5 10 15

Leu Leu Leu Asp Leu Gln Met Ile Leu Asn Gly Ile Asn Asn Tyr Lys

20 25 30

Asn Pro Lys Leu Thr Arg Met Leu Thr Phe Lys Phe Tyr Met Pro Lys

35 40 45

Lys Ala Thr Glu Leu Lys His Leu Gln Cys Leu Glu Glu Glu Leu Lys

50 55 60

Pro Leu Glu Glu Val Leu Asn Leu Ala Gln Ser Lys Asn Phe His Leu

65 70 75 80

Arg Pro Arg Asp Leu Ile Ser Asn Ile Asn Val Ile Val Leu Glu Leu

85 90 95

Lys Gly Ser Glu Thr Thr Phe Met Cys Glu Tyr Ala Asp Glu Thr Ala

100 105 110

Thr Ile Val Glu Phe Leu Asn Arg Trp Ile Thr Phe Cys Gln Ser Ile

115 120 125

Ile Ser Thr Leu Thr Gly Asp Gly Ser Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ala

130 135 140

Ser Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly

145 150 155 160

Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg

165 170 175

Tyr Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp

180 185 190

Val Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser

195 200 205

Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu

210 215 220

Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr

225 230 235 240

Cys Ala Lys Ala His Asn Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu

245 250 255

Val Thr Val Ser Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly

260 265 270

Gly Gly Gly Ser Ser Glu Leu Thr Gln Asp Pro Ala Val Ser Val Ala

275 280 285

Leu Gly Gln Thr Val Arg Ile Thr Cys Gln Gly Asp Ser Leu Arg Ser

290 295 300

Tyr Tyr Ala Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Val Leu

305 310 315 320

Val Ile Tyr Gly Lys Asn Asn Arg Pro Ser Gly Ile Pro Asp Arg Phe

325 330 335

Ser Gly Ser Ser Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Thr Gly Ala

340 345 350

Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Ser Val Tyr Thr

355 360 365

Met Pro Pro Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly

370 375 380

Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Ser Ser Ser Ser Gly Gly

385 390 395 400

Pro Gln Arg Glu Glu Phe Pro Arg Asp Leu Ser Leu Ile Ser Pro Leu

405 410 415

Ala Gln Ala Val Arg Ser Ser Ser Arg Thr Pro Ser Asp Lys Pro Val

420 425 430

Ala His Val Val Ala Asn Pro Gln Ala Glu Gly Gln Leu Gln Trp Leu

435 440 445

Asn Arg Val Ala Asn Ala Leu Leu Ala Asn Gly Val Glu Leu Arg Asp

450 455 460

Asn Gln Leu Val Val Pro Ser Glu Gly Leu Tyr Leu Ile Tyr Ser Gln

465 470 475 480

Val Leu Phe Lys Gly Gln Gly Cys Pro Ser Thr His Val Leu Leu Thr

485 490 495

His Thr Ile Ser Arg Ile Ala Val Ser Tyr Gln Thr Lys Val Asn Leu

500 505 510

Leu Ser Ala Ile Lys Ser Pro Cys Gln Arg Glu Thr Pro Glu Gly Ala

515 520 525

Glu Ala Lys Pro Trp Tyr Glu Pro Ile Tyr Leu Gly Gly Val Phe Gln

530 535 540

Leu Glu Lys Gly Asp Arg Leu Ser Ala Glu Ile Asn Arg Pro Asp Tyr

545 550 555 560

Leu Asp Phe Ala Glu Ser Gly Gln Val Tyr Phe Gly Ile Ile Ala Leu

565 570 575

<---

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к конъюгатам, содержащим интерлейкин 2 (IL2), мутант фактора некроза опухоли альфа (TNFальфа) и молекулу антитела, которая связывает фибронектин, и может быть использовано в медицине для лечения злокачественной опухоли. Изобретение обеспечивает улучшение переносимости двойного иммуноцитокина без изменения эффективности за счет применения мутанта TNFальфа со сниженной активностью. 5 н. и 10 з.п. ф-лы, 5 ил., 1 табл., 4 пр.

1. Слитый белок для лечения злокачественной опухоли, содержащий интерлейкин-2 (IL2), мутант фактора некроза опухоли (TNFα) человека и молекулу антитела, которая связывает фибронектин,

где последовательность IL2 имеет по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности IL2, указанной в SEQ ID NO: 12;

где мутант TNFα человека имеет сниженную активность относительно TNFα человека дикого типа и содержит аминокислотную последовательность, имеющую по меньшей мере 90% идентичность последовательности SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO:17 с заменой R в положении, соответствующем R32 SEQ ID NO: 15 или R52 SEQ ID NO: 17, на A, F или V;

где молекула антитела представляет собой одноцепочечный Fv (scFv) или диантитело и содержит антигенсвязывающий центр, имеющий определяющие комплементарность области (CDR) антитела F8, указанные в SEQ ID NO 6-11, или содержит антигенсвязывающий центр, имеющий определяющие комплементарность области (CDR) L19, указанные в SEQ ID NO 18-23.

2. Слитый белок по п.1, где мутант TNFα человека имеет мутацию R на A в указанном положении.

3. Слитый белок по п.1, где TNFα человека содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 37 или SEQ ID NO: 39.

4. Слитый белок по п.1, где антитело связывает экстрадомен-A (ED-A) фибронектина и

(i) молекула антитела содержит антигенсвязывающий центр, имеющий определяющие комплементарность области (CDR) антитела F8, указанные в SEQ ID NO: 6-11,

(ii) молекула антитела содержит домены VH и VL антитела F8, указанные в SEQ ID NO: 2 и 4; и/или

(iii) где молекула антитела содержит аминокислотную последовательность scFv F8, указанную в SEQ ID NO: 5.

5. Слитый белок по п.1, где антиело связывает экстрадомен-B (ED-B) фибронектина и

(i) молекула антитела содержит антигенсвязывающий центр, имеющий определяющие комплементарность области (CDR) антитела L19, указанные в SEQ ID NO: 18-23,

(ii) молекула антитела содержит домены VH и VL антитела L19, указанные в SEQ ID NO: 24 и 25, и/или

(iii) молекула антитела содержит аминокислотную последовательность scFv L19, указанную в SEQ ID NO: 26.

6. Слитый белок по любому из пп.1-5, где молекула антитела представляет собой одноцепочечный Fv (scFv).

7. Слитый белок по п.6, где

(i) IL2 связан с N-концом домена VH scFv через пептидный линкер и мутант TNF связан с C-концом домена VL scFv через пептидный линкер,

(ii) мутант TNF связан с N-концом домена VH scFv через пептидный линкер и IL2 связан с C-концом домена VL scFv через пептидный линкер, или

(iii) IL2 и мутант TNF связаны с C-концом домена VL scFv через пептидный линкер или IL2 и TNFα связаны с N-концом scFv через пептидный линкер;

и где последовательность пептидного линкера имеет по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности, указанной в одной из SEQ ID NO: 13, 14 или 49.

8. Слитый белок по п.4, где

(i) слитый белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 1 с мутацией R на A в положении 432 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 16 с мутацией R на A в положении 452 или

(ii) слитый белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 36 или SEQ ID NO: 38.

9. Слитый белок по п. 5, где

(i) слитый белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 70 с мутацией R на A в положении 430 или аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 71 с мутацией R на A в положении 450, или

(ii) слитый белок содержит аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 42, SEQ ID NO: 43, SEQ ID NO: 44 или SEQ ID NO: 45.

10. Молекула нуклеиновой кислоты, кодирующая слитый белок по любому из пп.1-9.

11. Экспрессирующий вектор, содержащий нуклеиновую кислоту, кодирующую слитый белок по любому из пп.1-9.

12. Способ лечения злокачественной опухоли путем нацеливания IL2 и TNF на новообразованные сосуды in vivo, включающий введение слитого белка пациенту;

где слитый белок содержит интерлейкин-2 (IL2), мутант фактора некроза опухоли (TNFα) человека и молекулу антитела, которая связывает фибронектин,

где последовательность IL2 имеет по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности IL2, указанной в SEQ ID NO: 12;

где мутант TNFα человека имеет сниженную активность относительно TNFα человека дикого типа и имеет по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO:17 с заменой R в положении, соответствующем R32 SEQ ID NO: 15 или R52 SEQ ID NO: 17, на A, F или V; и

где молекула антитела содержит антигенсвязывающий центр, имеющий определяющие комплементарность области (CDR) антитела F8, указанные в SEQ ID NO 6-11, или содержит антигенсвязывающий центр, имеющий определяющие комплементарность области (CDR) L19, указанные в SEQ ID NO 18-23.

13. Способ по п. 12, где злокачественная опухоль представляет собой меланому, рак головы и шеи, рак почки или саркому.

14. Способ доставки IL2 и TNF в новообразованные сосуды опухоли у пациента, включающий введение слитого белка пациенту;

где слитый белок содержит интерлейкин-2 (IL2), мутант фактора некроза опухоли (TNFα) человека и молекулу антитела, которая связывает фибронектин,

где последовательность IL2 имеет по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности IL2, указанной в SEQ ID NO: 12;

где мутант TNFα человека имеет сниженную активность относительно TNFα человека дикого типа и имеет по меньшей мере 90% идентичность аминокислотной последовательности SEQ ID NO: 15 или SEQ ID NO:17 с заменой R в положении, соответствующем R32 SEQ ID NO: 15 или R52 SEQ ID NO: 17, на A, F или V; и

где молекула антитела содержит антигенсвязывающий центр, имеющий определяющие комплементарность области (CDR) антитела F8, указанные в SEQ ID NO 6-11, или содержит антигенсвязывающий центр, имеющий определяющие комплементарность области (CDR) L19, указанные в SEQ ID NO 18-23.

15. Способ по п. 14, где опухоль является результатом меланомы, рака головы и шеи, рака почки или саркомы.