ПЕРЕКРЕСТНЫЕ ССЫЛКИ НА РОДСТВЕННЫЕ ЗАЯВКИ

Настоящая заявка истребует преимущества патентной заявки Китая 202010351280.6, поданной 28 апреля 2021, содержание которой целиком включено в настоящий документ посредством ссылки.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Настоящее изобретение относится к области противоопухолевых иммунотерапевтических агентов. В частности, настоящее изобретение относится к молекуле TGFβR2 (фактор иммуномодуляции) с укороченным внеклеточным доменом, слитому белку, содержащему молекулу TGFβR2 с укороченным внеклеточным доменом и нацеливающую часть. Настоящее изобретение включает фармацевтические композиции и их применение в качестве противоопухолевых лекарственных средств.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Трансформирующий фактор роста-β (TGF-β) принадлежит к надсемейству TGF-β, которое регулирует рост и дифференцировку клеток, и представляет собой плейотропный и многофункциональный цитокин, который регулирует пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток через сигнальные пути рецепторов клеточной поверхности аутокринным или паракринным образом. Он также играет важную регуляторную роль в синтезе внеклеточного матрикса, восстановлении травм, иммунной функции и т.д. Три изоформы, TGF-β1, TGF-β2 и TGF-β3, присутствуют у млекопитающих, и наиболее распространенной и экспрессируемой изоформой является TGF-β1. TGF-β инициирует классические пути Smad и не-Smad для передачи сигналов вниз по цепочке путем связывания с рецепторами серин-треонинкиназы TGFβR1 и ΤGFβR2 на поверхности клеточной мембраны^[1]. При нормальном гомеостазе in vivo TGF-β регулирует передачу сигналов ключевых процессов, такие как рост, регенерация, дифференцировка и т.д. различных тканей. В иммунной системе TGF-β вызывает толерантность и подавляет воспаление. Генетические мутации могут изменить передачу сигналов TGF-β в клетках, инициирующих опухоль. На начальных стадиях онкогенеза TGF-β играет ключевую роль в ингибировании рака, ингибируя пролиферацию клеток и запуская программу апоптоза. Однако по мере прогрессирования опухоли селективное давление опухолевых клеток приводит к утрате у TGF-β функции подавления опухоли посредством различных механизмов. Приобретенные инактивирующие мутации в сигнальном пути TGF-β позволяют множеству злокачественных клеток расти в среде, обогащенной TGF-β. Дополнительно опухолевые клетки каким-то образом преобразуют проапоптотическую способность TGF-β в проопухолевые функции развития, такие как способность к инвазии и миграции, а также содействие мезенхимальному переходу^[2-4]. TGF-β регулирует различные типы и функции иммунных клеток. TGF-β контролирует адаптивный иммунитет, напрямую стимулируя пролиферацию Treg-клеток, тем самым подавляя продукцию и функцию эффекторных Т-клеток и антигенпрезентирующих дендритных клеток. TGF-β также ингибирует функцию NK-клеток и превращает макрофаги и нейтрофилы в подтипы проопухолевого роста, способствуя формированию опухолевого микроокружения с негативной иммунной регуляцией опухоли^[4]. TGF-β1 часто экспрессируется с более высокими уровнями, чем в нормальной паранеопластической ткани, в различных солидных опухолях, включая EGFR-положительный рак толстой и прямой кишки, немелкоклеточный рак легких, плоскоклеточную карциному головы и шеи. Клинические данные свидетельствуют о том, что блокада пути TGF-β сама по себе недостаточна для полного восстановления иммунной системы для подавления онкогенеза, и поэтому антитела к TGF-β еще не получены.

Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR) представляет собой продукт экспрессии протоонкогена C-ErbB1, и он является рецептором клеточной пролиферации и передачи сигнала эпителиального фактора роста (EGF), членом семейства рецепторов эпидермального фактора роста (HER), и рецептором тирозинкиназы с молекулярной массой 170 кДа^[5]. EGFR состоит из внеклеточного лиганд-связывающего участка, трансмембранного участка и внутриклеточного киназного участка. Внеклеточный домен EGFR трансформируется из мономера в димер после связывания с лигандом, активирует внутриклеточный киназный участок и несколько нижестоящих сигнальных путей и играет важную роль в росте, пролиферации и дифференцировке клеток^[6]. Высокая экспрессия EGFR вызывает усиленную передачу сигналов вниз по цепочке повышенная экспрессия мутантных рецепторов или лигандов EGFR приводит к устойчивой активации EGFR, повышенной активности секреторной петли и нарушению механизма подавления рецептора и т.д., что, в свою очередь, активирует гены, связанные с пролиферацией и дифференцировкой опухоли, и играет важную роль в образовании и развитии опухоли^[7]. Повышенная экспрессия EGFR связана со снижением выживаемости при некоторых типах рака, включая рак головы и шеи, мочевого пузыря, яичников, шейки матки и рак пищевода. Дополнительно было показано, что препараты против EGFR эффективны при лечении нескольких типов солидных опухолей, таких как колоректальные опухоли, опухоли головы и шеи, немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ) и рак поджелудочной железы, включая общую выживаемость, выживаемость без прогрессирования, и общие показатели ответов.^[8] Таким образом, в качестве четкой мишени, связанной с пролиферацией опухоли, агенты, нацеленные на EGFR, стали вариантом лечения первой линии для различных злокачественных новообразований.

Хотя сигналы, инициируемые TGF-β, отличаются от сигналов, инициируемых путем EGF/EGFR, пути передачи сигналов между ними могут взаимодействовать. Было обнаружено, что пути передачи сигналов TGF-β и EGFR взаимодействуют между собой и совместно способствуют прогрессированию опухолей при различных типов. TGF-β может индуцировать транс-активацию EGFR в зависимости от типа клеток и контекста. Например, TGF-β способствует миграции и инвазии клеток рака молочной железы (MDA-МВ-231, T47D, 4Т1) путем активизации EGFR через классические сигнальные пути Smad и ERK/Sp1^[9,10]. В плоскоклеточной карциноме (А431, SCC13), TGF-β активирует путь EGFR через H₂O₂-зависимые механизмы для повышения уровня фосфорилирования Erk1/2^[11]. EGF и связанные с ним нижестоящие сигнальные пути также могут регулировать передачу сигналов TGF-β в различных типах клеток. Например, в клетках первичного рака яичников человека EGF снижает чувствительность клеток рака яичников к антипролиферативному действию TGF-β за счет уменьшения экспрессии мРНК TCF-β-индуцируемого регулятора клеточного цикла p15^INK4B[12].Онкогенный Ras в эпителиальных клетках молочной железы и легких снижает эффект TGF-β по ингибированию роста клеток за счет ингибирования TGF-β-опосредованной передачи сигналов посредством негативной регуляции Smad2 и Smad3^[13,14]. EGF также положительно регулирует передачу сигналов Smad2 в клетках COS7, увеличивая фосфорилирование Smad2 через путь ERK^[15].

TGF-β и EGF синергически способствуют злокачественному фенотипу опухолей, и исследования на различных тканях показали, что EGF в сочетании с TGF-β усиливает эпителиально-мезенхимальный переход (ЭМП). Например, EGF и TGF-β1 способствуют экспрессии ламинина-332 (Laminin-332), что синергетически способствует ЭМП при раке эпителия полости рта^[16]. EGF и TGF-β1 способствуют ЭМП в эпителиальных клетках кишечника путем подавления Е-кадгерина по пути MAPK, а не по пути PI3K, p38MAPK, JNK или AP-1^[17]. EGF и TGF-β1 индуцируют экспрессию Slug и Snail через Smad и MEK1/2-зависимые сигнальные пути, подавляют Е-кадгерин и способствуют ЭМП в эпителиальных клетках яичников^[18]. EGF и TGF-β1 активируют сигнальный путь ERK1/2, синергически усиливают экспрессию белка Snail и способствуют ЭМП и миграции в эпителиальных клетках проксимальных канальцев коры почек человека (HK-2)^[19]. EGF усиливает TGF-β-индуцированный ЭМП в клетках рака легких (Н322, Н358) и рака поджелудочной железы (HPAF-II, CAPAN-2), способствуя связыванию SHP2 с GAB1^[20].

Несколько клинических исследований показали, что повышенные уровни TGF-β тесно связаны с развитием лекарственной устойчивости и неблагоприятным прогнозом. ЭМП, индуцированный TGF-β1, в раковых стволовых клетках остеосаркомы снижает экспрессию miR-499a, что приводит к увеличению экспрессии SHKBP1, происходящему одновременно с TGFβ-индуцированным переключением киназы, связанной с ЕМТ, в АКТ-активируемое EGFR-независимое состояние, тем самым снижая активность EGFR и индуцируя резистентность остеосаркомы к ингибиторам киназы EGFR (Фиг. 5)^[21]. Клетки Treg являются одними из основных клеток, продуцирующих TGF-β. Повышенное количество Treg в опухолях больных плоскоклеточным раком головы и шеи, получавших цетуксимаб, сопровождается повышением содержания TGF-β, в то время как содержание TGF-β у больных с низкой эффективностью цетуксимаба даже выше^[22]. Повышенный уровень TGF-β может индуцировать резистентность к терапии антителами против EGFR путем ингибирования экспрессии соответствующих молекулярных эффекторов эффекторно-клеточной цитотоксичности, активации EGFR-независимого пути АКТ и усиления индукции ЭМП^[23]. В мутантном EGFR немелкоклеточного рака легких классический сигнальный путь TGF-βSmad участвует в развитии PD-L1-индуцированной резистентности опухоли к ингибиторам киназы EGFR^[24]. В тканях рака молочной железы экспрессия TGF-β положительно коррелировала с экспрессией EGFR, а повышенные уровни TGF-β и EGFR были связаны с плохим прогнозом у пациентов с раком молочной железы^[9]. Таким образом, EGFR и TGF-β играют относительно независимые, но близкородственные роли в указанном пути развития опухоли. Дополнительно TGF-β представляет собой ключевую молекулу в развитии приобретенной резистентности опухолей к терапии, направленной на EGFR. Исследования на животных показали, что ингибирование TGF-β улучшает противоопухолевый эффект цетуксимаба in vivo на ксенотрансплантаты плоскоклеточных опухолей головы и шеи^[23]. Эти данные обеспечивают теоретическую основу для комбинированного нацеливания TGF-β для повышения терапевтической эффективности антитела против EGFR в отношении EGFR-положительных опухолей.

Настоящее изобретение обеспечивает новые слитые белки, содержащие укороченный TGFβR2, которые могут специфически нацеливаться как на EGFR, так и на TGF-β, два относительно независимых, но тесно связанных сигнальных пути. Они используются для лечения солидных опухолей, включая рак желудка, но не ограничиваясь им.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ

В одном аспекте настоящее изобретение обеспечивает молекулу TGFβR2 с укороченным внеклеточным доменом, в которой, по сравнению с ее природной формой,

a) по меньшей мере остатки аминокислот в положениях 6-16 удалены, и дополнительно, необязательно, остатки аминокислот в положениях 17-17+n удалены, где n представляет собой целое число от 1 до 10; предпочтительно, n равно 2, 4, 8, 9 или 10; более предпочтительно, n равно 9; или

b) на базе делеции остатков аминокислот в положениях 6-26, в дополнение, остатки аминокислот в положениях 5, 4-5, 3-5, 2-5, 1, 1-2, 1-3, или 1-4 удалены; или

c) остатки аминокислот в положениях 7-26 удалены.

В одном варианте реализации указанная последовательность аминокислот включает любую из последовательностей SEQ ID NO: 48-62.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает слитой белок, содержащий молекулы, описанные выше.

В одном варианте реализации указанный слитой белок содержит

a) указанную молекулу TGFβR2 с укороченным внеклеточным доменом и

b) нацеливающую часть.

В одном варианте реализации указанного слитого белка нацеливающая часть представляет собой специфическую к раковым клеткам нацеливающую часть, выбранную из антитела или его антиген-связывающего фрагмента, функционального лиганда или его слитого белка с Fc, и рецепторного белка или его слитого белка с Fc.

В одном варианте реализации указанного слитого белка нацеливающая часть представляет собой антитело против EGFR или его антиген-связывающий фрагмент.

В одном варианте реализации N-конец указанной молекулы TGFβR2 с укороченным внеклеточным доменом в указанном слитом белке соединен с С-концом указанной тяжелой цепи нацеливающей части, необязательно, посредством линкера.

В одном варианте реализации указанный линкер представляет собой предпочтительно G₄S гибкий пептидный линкер, предпочтительно (G₄S)₄ пептидный линкер.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает выделенное связывающее антитело или его антиген-связывающий фрагмент против EGFR, содержащее

(а) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий домены CDR1 тяжелой цепи, CDR2 тяжелой цепи и CDR3 тяжелой цепи, содержащие SEQ ID NO: 19, 20, и 21, соответственно, и/или

(b) а вариабельный участок легкой цепи, содержащий а домены CDR1 легкой цепи, CDR2 легкой цепи и CDR3 легкой цепи, содержащему SEQ ID NO: 16, 17, и 18, соответственно.

В одном варианте реализации указанное антитело или его антиген-связывающий фрагмент содержит

а) вариабельный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность, содержащую SEQ ID NO: 28 или последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 88%, 90%, 95%, 98%, или 99% идентичность с этой последовательностью; и/или

(b) вариабельный участок легкой цепи, содержащий последовательность, содержащую SEQ ID NO: 29 или последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 88%, 90%, 95%, 98%, или 99% идентичность с этой последовательностью.

В одном варианте реализации указанное антитело дополнительно содержит:

a) константный участок тяжелой цепи, содержащий последовательность, содержащую SEQ ID NO: 30 или последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 88%, 90%, 95%, 98%, или 99% идентичность с этой последовательностью; и/или

b) константный участок легкой цепи, содержащий последовательность, содержащую SEQ ID NO: 31 или последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 88%, 90%, 95%, 98%, или 99% идентичность с этой последовательностью.

В одном варианте реализации нацеливающая часть указанного слитого белка выбрана из антитела против EGFR, трастузумаба, бевацизумаба, рамуцирумаба, ипилимумаба или панитумумаба.

В одном варианте реализации указанный слитой белок содержит

a) последовательность аминокислот тяжелой цепи, содержащую SEQ ID NO: 141 или последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 88%, 90%, 95%, 98%, или 99% идентичность с этой последовательностью; и

b) последовательность аминокислот легкой цепи, содержащую SEQ ID NO: 23 или последовательность, имеющую по меньшей мере 85%, 88%, 90%, 95%, 98%, или 99% идентичность с этой последовательностью,

которые содержат две тяжелых цепи и две легких цепи; дисульфидная связь образована между его первой легкой цепью и первой тяжелой цепью, дисульфидная связь образована между его второй легкой цепью и второй тяжелой цепью, и дисульфидная связь образована между его первой тяжелой цепью и второй тяжелой цепью.

В одном варианте реализации указанный слито белок имеет значение K_D в диапазоне 2,92 пМ - 26,3 пМ, предпочтительно 7 пМ - 9 пМ, более предпочтительно 8,77 пМ, по аффинности связывания с белком EGFR человека; и

имеет значение K_D в диапазоне 23 пМ - 288,3 пМ, предпочтительно 64 пМ - 144 пМ, более предпочтительно 96,1 пМ по аффинности связывания с белком TGF-β1 человека.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает конъюгат, содержащий молекулу TGFβR2 с укороченным внеклеточным доменом, описанную в настоящем документе, слитой белок, описанный в настоящем документе, антитело или его антиген-связывающий фрагмент, описанный в настоящем документе, и дополнительный терапевтический агент, при этом предпочтительно указанное антитело или его антиген-связывающий фрагмент и указанный дополнительный терапевтический агент соединены посредством линкера.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает нуклеиновую кислоту, кодирующую указанную молекулу TGFβR2 с укороченным внеклеточным доменом, описанную в настоящем документе, слитой белок, описанный в настоящем документе, антитело или его антиген-связывающий фрагмент, описанный в настоящем документе, которая представляет собой мРНК и/или ДНК.

В одном варианте реализации указанная нуклеиновая кислота содержит

любую из последовательностей SEQ ID NO: 32-39;

любую из последовательностей SEQ ID NO: 67-84; или

любую из последовательностей SEQ ID NO: 148-163, или их функциональные варианты.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает вектор экспрессии, содержащий указанную нуклеиновую кислоту, описанную в настоящем документе.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает клетку-хозяина, содержащую указанную нуклеиновую кислоту, описанную в настоящем документе или указанный вектор экспрессии, описанный в настоящем документе.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ получения указанной молекулы TGFβR2 с укороченным внеклеточным доменом, описанной в настоящем документе, слитого белка, описанного в настоящем документе, антитела или его антиген-связывающего фрагмента, описанного в настоящем документе, включающий выращивание указанной клетки-хозяина, описанной в настоящем документе в условиях, подходящих для экспрессии молекулы описанного выше белка, и выделение экспрессированного продукта из культуральной жидкости.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию, содержащую

а) молекулу TGFβR2 с укороченным внеклеточным доменом, описанную в настоящем документе, слитой белок, описанный в настоящем документе, антитело или его антиген-связывающий фрагмент, описанный в настоящем документе, конъюгат, описанный в настоящем документе, нуклеиновую кислоту, описанную в настоящем документе, или вектор экспрессии, описанный в настоящем документе; и

b) фармацевтически приемлемый носитель; необязательно

c) один или более других терапевтических агентов.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложено применение указанной молекулы TGFβR2 с укороченным внеклеточным доменом, описанной в настоящем документе, слитого белка, описанного в настоящем документе, антитела или его антиген-связывающего фрагмента, описанного в настоящем документе, конъюгата описанного в настоящем документе, нуклеиновой кислоты, описанной в настоящем документе, вектора экспрессии, описанного в настоящем документе, или фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе для предотвращения и лечения рака, предпочтительно для лечения рака желудка.

В другом аспекте согласно настоящему изобретению предложено применение указанной молекулы TGFβR2 с укороченным внеклеточным доменом, описанной в настоящем документе, слитого белка, описанного в настоящем документе, антитела или его антиген-связывающего фрагмента, описанного в настоящем документе, конъюгата описанного в настоящем документе, нуклеиновой кислоты, описанной в настоящем документе, вектора экспрессии, описанного в настоящем документе, или фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе для получения лекарственного средства для предотвращения и лечения рака, предпочтительно для лечения рака желудка.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую комбинацию, содержащую молекулу TGFβR2 с укороченным внеклеточным доменом, описанный в настоящем документе, слитой белок, описанный в настоящем документе, антитело или его антиген-связывающий фрагмент, описанный в настоящем документе, конъюгат, описанный в настоящем документе, нуклеиновую кислоту, описанную в настоящем документе, вектор экспрессии, описанный в настоящем документе, или фармацевтическую композицию, описанную в настоящем документе, и один или более дополнительных терапевтических агентов.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает набор, содержащий молекулу TGFβR2 с укороченным внеклеточным доменом, описанный в настоящем документе, слитой белок, описанный в настоящем документе, антитело или его антиген-связывающий фрагмент, описанный в настоящем документе, конъюгат, описанный в настоящем документе, нуклеиновую кислоту, описанную в настоящем документе, вектор экспрессии, описанный в настоящем документе, или фармацевтическую композицию, описанную в настоящем документе, предпочтительно, дополнительно содержащий устройство для введения лекарственного средства.

В другом аспекте настоящее изобретение обеспечивает способ предотвращения и лечения новообразований, включающий введение субъекту указанной молекулы TGFβR2 с укороченным внеклеточным доменом, описанной в настоящем документе, слитого белка, описанного в настоящем документе, антитела или его антиген-связывающего фрагмента, описанного в настоящем документе, конъюгата, описанного в настоящем документе, нуклеиновой кислоты, описанной в настоящем документе, вектора экспрессии, описанного в настоящем документе, или фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ РИСУНКОВ

На Фиг. 1 показан анализ связывания антитела мыши EGFR-mhPA8 с рекомбинантным белком EGFR-His человека.

На Фиг. 2 показана блокировка связывания EGF с EGFR посредством антитела мыши EGFR-mhPA8.

На Фиг. 3 показано ингибирование пролиферации клеток MDA-MB-468 посредством антитела мыши EGFR-mhPA8.

На Фиг. 4 показан анализ связывания гуманизированного антитела EGFR-HPA8 с рекомбинантным белком EGFR-His человека.

На Фиг. 5 показана блокировка связывания EGF с EGFR посредством гуманизированного антитела EGFR-HPA8.

На Фиг. 6 показано ингибирование пролиферации клеток MDA-MB-468 посредством гуманизированного антитела EGFR-HPA8 в различных условиях лиганда.

На Фиг. 7 показано ингибирование пролиферации клеток Fadu посредством гуманизированного антитела EGFR-HPA8 в различных условиях лиганда.

На Фиг. 8 показан эффект ADCC, опосредованный гуманизированным антителом EGFR-HPA8.

На Фиг. 9 показано влияние EGFR-HPA8 на массу тела мышей с подкожно ксенотрансплантрированными клетками рака желудка SNU-5.

На Фиг. 10 показано влияние EGFR-HPA8 на объем опухоли и результаты TGI у мышей с подкожно ксенотрансплантрированными клетками рака желудка SNU-5.

На Фиг. 11 показано влияние EGFR-HPA8 на массу тела у мышей с подкожно ксенотрансплантрированными клетками немелкоклеточного рака легких NCI-H1975.

На Фиг. 12 показано влияние EGFR-HPA8 на объем опухоли и результаты TGI у мышей с подкожно ксенотрансплантрированными клетками немелкоклеточного рака легких NCI-H1975.

На Фиг. 13 показана схематическая структура слитого белка EGFR антитело/TGFβR2.

На Фиг. 14 показана детекция деградации слитого белка EGFR антитело/TGFβR2.

На Фиг. 15 показана детекция склонности к деградации слитого белка EGFR антитело/TGFβR2.

На Фиг. 16 показана детекция способности к связыванию различных укороченных форм слитого белка EGFR антиттело/TGFβR2 с TGF-β1 и EGFR.

На Фиг. 17 показана детекция способности укороченного TGFβR2 слитого белка EGFR антитело/TGFβR2 к нейтрализации TGF-β1.

На Фиг. 18 показана детекция способности укороченного TGFβR2 слитого белка EGFR антитело/TGFβR2 к нейтрализации TGF-β3.

На Фиг. 19 показан анализ способности слитого белка 6 связываться с белками TGF-β1 и TGF-β3, соответственно.

На Фиг. 20 показан анализ способности слитого белка 6 блокировать связывание белка TGF-β1 или белка TGF-β3 с TGFβR2-Fc, соответственно.

На Фиг. 21 показан анализ связывания и способности к конкурированию слитого белка 6.

На Фиг. 22 показан анализ аффинности слитого белка 6 к рекомбинантному белку EGFR человека.

На Фиг. 23 показан анализ аффинности слитого белка 6 к рекомбинантному белок TGF-β1 человека.

На Фиг. 24 показан нейтрализующий эффект TGF-β1 посредством слитого белка 6 на клетках Mv-1-lu.

На Фиг. 25 показан нейтрализующий эффект TGF-β1 посредством слитого белка 6, проанализированный с использованием системы с репортерным геном.

На Фиг. 26 показано ингибирование пролиферации клеток MDA-MB-468 посредством слитого белка 6.

На Фиг. 27 показан эффект ADCC, опосредованной слитым белком 6.

На Фиг. 28 показано влияние слитого белка 6 на массу тела у мышей с подкожно ксенотрансплантрированными клетками немелкоклеточного рака легких NCI-H1975.

На Фиг. 29 показано влияние слитого белка 6 на объем опухоли мышей с подкожно ксенотрансплантрированными клетками немелкоклеточного рака легких NCI-H1975.

На Фиг. 30 показан ультрафильтрационный анализ стабильности слитого белка 6.

На Фиг. 31 показан анализ деградации слитого белка X/TGFβR2.

На Фиг. 32 показан анализ склонности к деградации слитого белка X/TGFβR2.

На Фиг. 33 показан анализ способности связывания слитого белка X/TGFβR2 с TGF-β1.

На Фиг. 34 показан анализ способности слитого белка X/TGFβR2 к нейтрализации TGF-β1 и TGF-β3.

На Фиг. 35 показан анализ связывания слитого белка X/TGFβR2 с мишенью части X.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ

Определения

Если не указано иное, все технические и научные термины, используемые в данном документе, имеют значение, обычно понятное специалистам в данной области техники, к которой относится настоящее изобретение. Для целей настоящего изобретения дополнительно определены следующие термины.

При использовании в настоящем описании и в прилагаемой формуле изобретения формы единственного числа «один», «другой» и «указанный» включают обозначение объекта во множественном числе, если контекст явно не указывает на иное.

Термин «укороченная» форма белковой молекулы означает, что в модифицированном виде отсутствуют один или более остатков аминокислот по сравнению с природной формой белковой молекулы.

Термин «слитой белок» относится к белковой молекуле, объединяющей два или более белков. Обычно ее получают путем экспрессии гибридного гена, объединяющего последовательности двух или более генов, которые встраивают в вектор экспрессии в форме с соответствующей совпадающей рамкой считывания.

Термин «антитело» относится к молекуле иммуноглобулина и относится к любой форме антитела, которая проявляет желаемую биологическую активность. Он включает моноклональное антитело (включая полноразмерное моноклональное антитело), поликлональные антитела и полиспецифическое антитела (например, биспецифические антитела), и даже фрагменты антител, но не ограничивается ими.

Термин «вариабельный участок» относится к участку в тяжелой или легкой цепи антитела, который участвует в связывании антитела с антигеном. Вариабельные участки тяжелой и легкой цепи природного антитела (V_H и V_L, соответственно) в целом имеют сходную структуру и могут дополнительно подразделяться на сильно вариабельные участки (называемые участками, определяющими комплементарность, (CDR)) с вкраплениями более консервативных областей (называемых каркасными участками (FR)).

Участок, определяющий комплементарность, (CDR) и каркасный участок (FR) конкретного антитела могут быть идентифицированы с использованием системы Кабата (Kabat и др.: Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th edition, U.S. Department of Health и Human Services, PHS, NIH, NIH Publication No. 91-3242, 1991).

Термин «константный участок» относится к таким последовательностям аминокислот в легких и тяжелых цепях антитела, которые непосредственно не участвуют в связывании антитела с антигеном, но проявляют различные эффекторные функции, такие как вызываемая антителом цитотоксичность (ADCC).

«Антиген-связывающий фрагмент антитела» включает часть интактной молекулы антитела, которая сохраняет по меньшей мере некоторую специфичность связывания родительского антитела и обычно включает по меньшей мере часть антиген-связывающего участка или вариабельного участка (например, один или более CDR) родительского антитела. Примеры антиген-связывающих фрагментов включают, Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2, Fd фрагменты, Fd' фрагменты, молекулы одноцепочечных антител (например, scFv, ди-scFv или три-scFv, двудольные антитела или scFab), и однодоменные антитела, но не ограничиваются ими.

Термин «конъюгат» относится к биологически активным белковым или пептидным молекулам, образующим ковалентную или нековалентную связь с другой молекулой, будь то малая молекула или биомолекула.

Термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из по существу однородной популяции антител, т.е. популяции, содержащей гомогенные антитела, идентичные друг другу, за исключением возможных мутаций (например, естественных мутаций), которые могут присутствовать в очень малых количествах. Соответственно, термин «моноклональное» указывает на природу указанного антитела, а не на смесь неродственных антител. В отличие от препаратов поликлональных антител, которые обычно включают разные антитела против разных кластеров (эпитопов), каждое моноклональное антитело препарата моноклонального антитела направлено против конкретного кластера антигена. В дополнение к их специфичности препараты моноклонального антитела имеют то преимущество, что они обычно не контаминированы другими антителами. Термин «моноклональное» не следует толковать как требующее какого-либо конкретного метода получения определенного антитела. Термин «моноклональное антитело» конкретно включает химерные антитела, гуманизированные антитела и антитела человека.

Антитело «специфически связывается» с антигеном-мишенью, таким как белок антигена, ассоциированного с опухолью (в данном документе, EGFR), т.е., связывает указанный антиген с достаточной аффинностью, чтобы позволить использовать указанное антитело в качестве терапевтического агента, нацеленного на ткань или клетку, экспрессирующую указанный антиген, и без значительной перекрестной реактивности с другими белками или с белками, отличными от гомологов и вариантов (например, мутантных форм, сплайс-вариантов или гидролизованных укороченных форм белка) антигенов-мишеней, упомянутых выше.

Термин «аффинность связывания» относится к силе суммы нековалентных взаимодействий между отдельными сайтами связывания молекулы и ее партнерами по связыванию. Если не указано иное, термин «аффинность связывания», используемый в настоящем документе, относится к внутренней аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами связывающейся пары (например, антитело и антиген). Такие параметры как «K_D», «константа скорости связывания k_on» и «константа скорости диссоциации k_off» обычно используют для описания сродства между молекулой (например, антителом) и ее партнером по связыванию (например, антигеном, т.е., насколько прочно лиганд связывается с конкретным белком. На аффинность связывания влияют нековалентные межмолекулярные взаимодействия, такие как водородная связь, электростатические взаимодействия, а также гидрофобные и ван-дер-ваальсовые силы между двумя молекулами. Дополнительно на аффинность связывания между лигандом и его молекулой-мишенью может влиять присутствие других молекул. Аффинность может быть проанализирована обычными методами, известными в данной области техники, включая ИФА, описанный в настоящем документе.

Термин «нацеливающая часть» относится к части слитого белка, которая выполняет функцию специфического связывания с клеткой-мишенью. Термин включает антитела и другие природные (например, рецепторы, лиганды) или синтетические (например, DARPin) молекулы, которые специфически связываются с клеткой-мишенью. В настоящем тексте «специфически связывается с клеткой-мишенью» указывает на, что указанная часть предпочтительно связывает клетки-мишени в сложной смеси.

«Выделенная» биомолекула представляет собой биомолекулу, которая была идентифицирована и выделена из клетки, которая естественным образом экспрессирует такие молекулы. Выделенные биомолекулы включают биомолекулы in situ в рекомбинантных клетках, а также биомолекулы, которые обычно получают по меньшей мере за одну стадию очистки.

Термин «рецептор» представляет собой биохимическое понятие, относящееся к классу молекул, которые специфически распознают и связывают внеклеточные сигналы (т.е., термин «лиганд») и производят специфический эффект внутри клетки. Произведенные эффекты могут длиться только в течение короткого периода времени, например, изменение клеточного метаболизма или подвижности клеток. Это также может иметь длительный эффект, такой как повышение или понижение экспрессии гена или генов.

«Антитело-зависимая клеточно-опосредованная цитотоксичность» или «ADCC» относится к форме цитотоксичности, при которой связывание секретируемого Ig с рецепторами Fcγ, присутствующими на некоторых цитотоксических клетках (например, NK-клетках, нейтрофилах и макрофагах), позволяет этим цитотоксическим эффекторным клеткам специфически связываться с клетками-мишенями, несущими антиген, и впоследствии убивать указанные клетки-мишени с использованием, например, цитотоксического агента. Для оценки ADCC-активности целевого антитела может быть проведен анализ ADCC in vitro, такой как анализ ADCC in vitro, задокументированный в патенте США №5,500,362 или 5,821,337 или патенте США №6,737,056 (Presta) и способы, описанные в вариантах осуществления настоящей заявки. Полезные эффекторные клетки для таких анализов включают клетки РВМС и NK-клетки.

Молекула TGFβR2 с укороченным внеклеточным доменом согласно настоящему изобретению, слитые белки, содержащие молекулу TGFβR2 с укороченным внеклеточным доменом и нацеливающую часть

Между сайтами 7-15 N-конца полноразмерного внеклеточного домена TGFβR2 существует множество сайтов чувствительности. Чтобы улучшить структурную стабильность слитого белка, авторы настоящего изобретения модифицировали N-конец последовательности аминокислот внеклеточного домена TGFβR2 путем делеции различного количества аминокислот.Было получено пятнадцать молекул TGFβR2 с укороченным внеклеточным доменом.

Авторы настоящего изобретения использовали свои недавно выделенные антитела против EGFR EGFR-HPA8, трастузумаб, бевацизумаб, рамуцирумаб, ипилимумаб или панитумумаб в качестве нацеливающей части слитого белка и молекулу белка TGFβR2 с укороченным внеклеточным доменом в качестве иммуномодуляторной части слитого белка. Молекулу белка TGFβR2 с укороченным внеклеточным доменом, соединенную с С-концом тяжелой цепи антитела против EGFR, получали методом гомологичной рекомбинации, то есть получали слитой белок (EGFR/TGFβR2), содержащий две цепи, т.е., легкую цепь и тяжелую цепь антитела против EGFR, и внеклеточный домен TGFβR2, структура которого показана на Фиг. 13. В слитом белке EGFR антитело/TGFβR2, аминокислота тяжелой цепи С-конца антитела против EGFR связана с внеклеточным доменом TGFβR2 с различными формами делеции аминокислот посредством (G₄S)₄ линкера (SEQ ID NO: 66). Дополнительно остаток лизина С-конца тяжелой цепи антитела против EGFR был удален для снижения риска протеолиза.

В одном из предпочтительных вариантов реализации настоящего изобретения, слитой белок 6 сохраняет высокую аффинность связывания с белком EGFR человека, имея значение K_D 8,77 пМ по аффинности связывания с белком EGFR человека, значение константы связывания k_on 1,68Е+06 М^-1 с^-1, и значение константы диссоциации k_dis 1,47Е-05 с^-1. Дополнительно слитой белок 6, который содержит укороченный TGFβR2, обладает схожей аффинностью с белком TGF-β1 человека, что и слитой белок 1, который содержит полноразмерный TGFβR2, со значением K_D 96,1 пМ, значением константы связывания k_on 1,53Е+06 M^-1 с^-1, и значением константы диссоциации k_dis 1,47Е-04 с^-1.

Нуклеиновые кислоты согласно настоящему изобретению

Настоящее изобретение также относится к нуклеиновым кислотам, кодирующим молекулы TGFβR2 с укороченным внеклеточным доменом согласно настоящему изобретению, молекулы, включая слитые белки, содержащие укороченную молекулу и нацеливающую часть, или или их части. Некоторые примеры последовательностей этих нуклеиновых кислот приведены в Перечне последовательностей.

Молекулы нуклеиновых кислот согласно настоящему изобретению не ограничены последовательностями, описанными в настоящем описании, но также включают их варианты и другие соответствующие формы нуклеиновых кислот, такие как мРНК, к ДНК, и их варианты. Варианты согласно настоящему изобретению могут быть описаны со ссылкой на их физические свойства в гибридизации. Специалист в данной области техники понимает, что использование методик гибридизации нуклеиновых кислот может применяться идентифицировать их комплементы, а также их эквиваленты или конгенеры.

Рекомбинантные векторы и экспрессия

Согласно настоящему изобретению также предложены рекомбинантные конструкции, содержащие одну или более последовательностей нуклеотидов согласно настоящему изобретению. Рекомбинантные конструкции согласно настоящему изобретению могут использоваться в векторах, например, плазмидах, фагмидах, фагах, или вирусных векторах, а молекулы нуклеиновых кислот, кодирующих антитела согласно настоящему изобретению, могут вводиться в указанные векторы.

Указанная молекула TGFβR2 с укороченным внеклеточным доменом, нацеливающие части, слитые белки, содержащие указанные укороченную молекулу и нацеливающая часть, могут быть получены посредством рекомбинантной экспрессии последовательности нуклеотидов, кодирующей указанную молекулу или белок в клетке-хозяине. Указанные молекула или белок могут содержать более одной последовательности аминокислот, и для того, чтобы экспрессировать множество последовательностей аминокислот рекомбинантными методами, один или более рекомбинантных векторов экспрессии, содержащих кодирующие последовательности нуклеотидов, могут быть трансфицированы в указанную клетку-хозяина так, что указанное множество последовательностей аминокислот экспрессируется в указанной клетке-хозяине. Стандартные методологии рекомбинантных ДНК используют для получения нуклеиновых кислот, кодирующих указанные молекулы или белки, включают эти нуклеиновые кислоты в рекомбинантные векторы экспрессии и вводят указанные векторы в клетки-хозяева, смотри, например, Sambrook, Fritsch, и Maniatis (eds.), Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel, F. M. и др. (eds.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates, (1989) и методологии, задокументированные в патенте США №4,816,397 (Boss и др.).

Примерами прокариотических клеток-хозяев являются бактерии, а примерами эукариотических клеток-хозяев являются клетки дрожжей, насекомых или млекопитающих. Следует понимать, что на дизайн векторной экспрессии, включая выбор регуляторной последовательности, влияют различные факторы, такие как выбор клетки-хозяина, уровень экспрессии желаемого белка и является ли экспрессия конститутивной или индуцируемой.

Молекулы TGFβR2 с укороченным внеклеточным доменом, нацеливающая часть и слитые белки согласно настоящему изобретению могут быть выделены и очищены от культур рекомбинантных клеток хорошо известными способами, указанные хорошо известные способы включают преципитацию сульфатом аммония или этанолом, кислотную экстракцию, аффинную хроматографию на белке А, аффинную хроматографию на белке G, анионо- или катионообменную хроматографию, хроматографию на фосфатах целлюлозы, хроматографию гидрофобного взаимодействия, аффинную хроматографию, хроматографию на гидроксиапатите, хроматографию на лектинах, но не ограничиваются ими. Высокоэффективная жидкостная хроматография ("ВЭЖХ") также может быть использована для очистки.

Применение

Молекулы TGFβR2 с укороченным внеклеточным доменом, антитела и слитые белки согласно настоящему изобретению могут применяться для лечения рака, такого как рак желудка.

Фармацевтические композиции

Один или более видов укороченного белка(ов), слитые белки, антитела и антиген-связывающий фрагменты, конъюгаты укороченного белка и лекарственного средства, конъюгаты слитого белка лекарственного средства, конъюгаты, нуклеиновые кислоты и носители согласно настоящему изобретению могут быть приготовлены с по меньшей мере одним другим химическим агентом с образованием фармацевтической композиции, содержащей предшествующий активный ингредиент(ы), описанный выше, и один или более фармацевтически приемлемых носителей, разбавителей или вспомогательных веществ; они, необязательно, также могут включать один или более других терапевтических агентов.

Наборы реагентов

Настоящее изобретение также относится к фармацевтическим упаковкам и наборам, содержащим один или более контейнеров, где указанные контейнеры содержат фармацевтические композиции согласно настоящему изобретению, упомянутые выше. Ассоциированные с такими контейнерами, они могут быть представлены в форме, установленной государственным органом, регулирующим производство и использование или распространение лекарственного препарата или биологического продукта, что отражает одобрение для введения их человеку указанным органом государства, в котором указанный продукт производится, используется или распространяется.

Приготовление и хранение

Фармацевтические композиции настоящего изобретения могут быть получены способами, известными в данной области техники, например, с помощью обычных методов смешивания, растворения, гранулирования, измельчения, эмульгирования, инкапсулирования, инкапсулирования или лиофилизации.

После приготовления фармацевтической формы композиция, содержащая соединения согласно настоящему изобретению, изготовленные в виде лекарственной формы в приемлемом носителе, может быть помещена в соответствующие дозаторы и помечена для лечения указанного состояния. Такая маркировка должна включать количество, частоту и способ введения лекарственного средства.

Комбинации лекарственных средств

Комбинации, содержащие антитела согласно настоящему изобретению, описанные выше, также комбинируются с одним или более другими терапевтическими агентами, если при этом полученная комбинация не вызывает неприемлемый неблагоприятный эффект.

Последующие варианты осуществления используются для иллюстрации настоящего изобретения в качестве примеров и не предназначены для ограничения настоящего изобретения.

Примеры

Пример 1: Скрининг антител мыши, блокирующих связывание EGF с EGFR, с использованием фаговой библиотеки антител

1.1 Иммунизация мышей и скрининг фаговой библиотеки антител

Мышей иммунизировали плазмидами pCMV3-mFlt3L (G12FE5S01-D, сконструирована Sinocelltech Limited, SEQ ID NO: 142) и pCMV3-mCSF2 (G12FE5S02-D, сконструирована Sinocelltech Limited, SEQ ID NO: 143), содержащими указанные нуклеиновые кислоты. Конкретный метод заключается в следующем: мышей иммунизировали кардиотоксином 10 M внутримышечно за двое суток до первой иммунизации. Вводили внутримышечно 20 г в ногу смеси pCMV3-mFlt3L и pCMV3-mCSF2 в соотношении 1:1 и внутримышечно 30 г в ногу pGS6-EGFR-TT-WPRE (сконструирована Sinocelltech Limited, SEQ ID NO: 144) через трое суток после иммунизации, внутрибрюшинная инъекция 5×10⁶ клеток насекомых, сверхэкспрессирующих EGFR, для четвертой и пятой иммунизации с интервалами иммунизации 2 недели, 2 недели, 2 недели и 2 недели последовательно. Начиная с третьей иммунизации, кровь собирали через медиальное кантальное сплетение глаза через семь дней после каждой иммунизации. Делали покрытие рекомбинантного белка EGFR человека (источник: Sino Biological, Inc., кат. №10001-Н08В, в дальнейшем то же самое) для определения титра анти-EGFR в сыворотке мышей. Сыворотки пятой иммунизации достигли критериев, при которых титры иммунной сыворотки достигают 8000-кратного значения и титр сыворотки OD>1, затем проводили внутрибрюшинную бустерную инъекцию с использованием 5×10⁶ клеток MDA-MB468 с интервалом 20 дней, через 7 дней мышей умерщвляли, а ткани селезенки замораживали в жидком азоте.

Ткань селезенки мыши экстрагировали реагентом TriPure Isolation Reagent (источник: Roche кат. №11 667 165 001) для экстракции РНК, и кДНК получали обратной транскрипцией с помощью набора для обратной транскрипции TriPure Isolation Reagent (источник: Invitrogen кат.№18080-051), осуществляли ПЦР-амплификацию, в результате чего получали последовательности нуклеотидов, кодирующих вариабельные участки легкой и тяжелой цепи антитела мыши, указанная последовательность нуклеотидов, кодирующих легкую и тяжелую цепь вариабельных участков антитела мыши сплайсировали в последовательность нуклеотидов, кодирующих scFv, путем ПЦР сплайсинга удлинения с перекрытием, вариабельные участки легкой и тяжелой цепи связывали линкером ^[25]:

затем лигировали в фаговый вектор pComb3x (источник: Sino Biological, Inc.) с помощью эндонуклеазы рестрикции SfiI (источник: Fermentas), и библиотеку фагового дисплея антител scFv для иммунизации мышей сконструировали электротрансформацией компетентных клеток X-Blue. Планшет для ИФА покрывали рекомбинантным белком EGFR человека, и фаговую библиотеку, обогащенную положительными антителами против EGFR, получали методом пэннинга фаговых антител. Затем, полученную библиотеку смешивали с клетками MDA-MB-468 (источник: Центр клеточных ресурсов, Шанхайский институт биологических наук, академия наук Китая), и фаговые библиотеки, обогащенные положительными антителами против клеток MDA-MB-468, отбирали из вышеуказанных библиотек методом пэннинга фаговых антител (O'Brien, Р. М., & Aitken, R. (Eds.), Springer Science & Business Media. 2002; ISBN: 9780896037113). Колонии фага выбирали из обогащенной библиотеки, экспрессировали, связывание с рекомбинантным белком EGFR человека выявляли методом ИФА, а клоны с высокосвязывающим антителом EGFR-mhPA8 scFv со специфическим связыванием с рекомбинантным EGFR человека подвергали скринингу и отправляли в компанию, занимающуюся секвенированием, в результате чего получили последовательность нуклеотидов антитела EGFR-mhPA8 scFv (SEQ ID NO: 3).

1.2 Функциональный анализ антител мыши, нацеленных на EGFR

1.2.1 Функции связывания антител мыши и конкурирования лиганда Для определения способности антител мыши связываться с рекомбинантным белком EGFR человека использовали ИФА. Рекомбинантный белок EGFR-His человека (источник: Sino Biological, Inc., в дальнейшем тот же самый) в разных концентрациях (1,37 нг/мл, 4,12 нг/мл, 12,35 нг/мл, 37,04 нг/мл, 111,11 нг/мл, 333,33 нг/мл, 1000 нг/мл и 3000 нг/мл) наносили в 96-луночные планшеты, 100 мкл на лунку, и оставляли в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали на следующий день и блокировали при комнатной температуре в течение 1 ч. EGFR-mhPA8 и антитело H7N9-R1 в качестве отрицательного контроля (источник: Sinocelltech Limited, далее такое же) добавляли в концентрации 13,89 нМ и инкубировали в течение 1 ч, после чего планшеты промывали для удаления несвязавшихся антител. Вторичное антитело козы против hIgG F(ab)2/HRP (источник: Jackson ImmunoResearch, кат. №109-036-006, далее такое же) добавляли и инкубировали в течение 1 ч, планшеты многократно промывали и добавляли раствор хромогенного субстрата для проявления окраски, затем измеряли OD₄₅₀ с помощью микропланшетного ридера после завершения реакции. Используя концентрацию рекомбинантного белка EGFR-His человека в качестве горизонтальной координаты и значение OD₄₅₀ в качестве вертикальной координаты, строили S-образную кривую и ЕС₅₀ связывания антитела с рекомбинантным белком EGFR-His человека анализировали с помощью программного обеспечения GraphPad Prism 6.0. Результаты приведены на Фиг. 1. Химерное антитело EGFR-mhPA8 человека и мыши может эффективно связывать рекомбинантный EGFR-His человека с ЕС₅₀, равной 128,7 нг/мл, и R²=1.000. Отрицательный контроль, H7N9-R1, не связывался с рекомбинантным белком EGFR-His человека.

В этом Примере дополнительно анализировали способность EGFR-mhPA8 блокировать связывание лиганда и рецептора EGFR с помощью FACS. Клетки MDA-MB-468 в количестве 3×10⁵ добавляли к 10 мкл меченого биотином белка EGF-Fc в конечной концентрация 217,1 нМ (источник: Sino Biological, Inc.). Антитела EGFR-mhPA8 в конечных концентрациях 306,74 нМ, 102,25 нМ, 34,08 нМ и 11,36 нМ добавляли после 30 мин инкубации при 2-8°С, и H7N9-R1 использовали в качестве антитела отрицательного контроля. Перемешивали и инкубировали при 2-8°С в течение 20 мин, а затем промывали БСА и центрифугировали для удаления несвязавшихся антител и лигандов. Добавляли вторичное антитело Стрептавидин-488-FITC (источник: Sino Biological, Inc., далее такое же) и инкубировали в течение 1 ч при 2-8°С. Повторяли отмывку и центрифугирование для удаления несвязавшихся вторичных антител. Наконец добавляли 200 мкл БСА к ресуспендированным клеткам и отфильтровывали через фильтр 400 меш в проточную трубку для проточной детекции. Результаты приведены на Фиг. 2, EGFR-mhPA8 может эффективно блокировать связывание белка EGF-Fc с EGFR на клетках MDA-MB-468 в градиенте концентраций.

1.2.2 Ингибирование пролиферации клеток MDA-MB-468 антителами мыши

Клетки рака молочной железы MDA-MB-468 на высоком уровне экспрессируют EGFR, а также различные аутокринные лигандные факторы EGFR. В этом Примере функцию антител мыши по ингибированию роста определяли на клетках MDA-MB-468 с помощью анализа WST-8.

Клетки MDA-MB-468 равномерно инокулировали в 96-луночные планшеты в количестве 5×10³ на лунку. Клетки инкубировали в инкубаторе с СО₂ в течение 3 ч и добавляли различные концентрации антител мыши EGFR-mhPA8 (66,7 нМ, 22,2 нМ, 7,4 нМ, 2,5 нМ, 0,82 нМ, 0,27 нМ, 0,093 нМ, 0,033 нМ и 0,013 нМ). Также использовали группу M отрицательного контроля (содержащую клетки) и контрольную группу В (только среда без клеток). Клетки инкубировали в инкубаторе с СО₂ при 37°С и 5% СО₂ _{в течение 5 суток, а затем добавляли WST-8 в количестве 15 мкл на лунку. Через 240 мин инкубации измеряли OD₄₅₀-OD₆₃₀ с помощью микропланшетного ридера и степень ингибирования полученного из мыши антитела рассчитывали путем вычитания детектированного значения показаний лунки контроля группы В. Степень ингибирования=(OD группы M - OD образца)/(OD группы М) × 100%, количественную кривую эффективности анализировали и строили с помощью программного обеспечения GraphPad Prism, где горизонтальной координатой являлась концентрация антитела и вертикальной координатой являлась степень ингибирования. Как показано на Фиг. 3, EGFR-mhPA8 эффективно ингибировал пролиферацию MDA-MB-468 и степень ингибирования повышалась с повышением концентрации лекарственного средства на S-образной кривой. EGFR-mhPA8 ингибировал клетки MDA-MB-468 с EC₅₀, равной 2,78 hM и R²=0,991.}

Пример 2: Гуманизация антитела мыши EGFR-mhPA8 и определение характеристик гуманизированного антитела ex vivo

2.1 Гуманизация и получение антитела мыши mhPA8

Последовательность нуклеотидов антитела EGFR-mhPA8 была определена, в результате чего получили последовательность аминокислот тяжелой цепи (SEQ ID NO: 8) и вариабельного участка легкой цепи (SEQ ID NO: 9) антитела EGFR-mhPA8 scFv. Последовательность аминокислот каждого из трех CDR для легкой и тяжелой цепей EGFR-mhPA8 scFv определили со ссылкой на подходы Кабата [26] и нумерацию IMGT, смотрите SEQ ID NO: 10-15. Согласно нумерации Кабата, за исключением мутации N на D в положении 52 в LCDR2, соответствующие три CDR вышеупомянутых легких и тяжелых цепей были трансплантированы на последующем этапе гуманизации и сохранены в конечном гуманизированном антителе EGFR-HPA8 scFv.

Гуманизацию антител мыши осуществляли с использованием классического метода трансплантации CDR^[27,28]. Антитела, у которых имеется более чем 50% сходство последовательности аминокислот с вариабельными участками как легкой цепи, так и тяжелой цепи антитела мыши и более чем 50% сходство последовательности аминокислот с каркасными участками вариабельных участков легкой цепи и тяжелой цепи антитела мыши, которые предполагалось модифицировать, соответственно, были выбраны в качестве библиотеки шаблонов для гуманизации. Антитело человека с наивысшим пространственным сходством с указанным вариабельным участком антитела, которые предполагалось модифицировать, было выбрано в качестве матрицы для гуманизации. Тремя последовательностями CDR легкой или тяжелой цепи антитела мыши были заменены соответствующие последовательности аминокислот CDR в матрице гуманизации и аминокислоты NG, NS, NA и NT, которые подвергаются высокому риску дезамидирования в мутированной последовательности, подверглись мутации с целью улучшения химической стабильности и сохранения биологической функции указанного антитела. Аффинность гуманизированного антитела определяют с помощью ИФА и отбирают гуманизированные антитела, чья аффинность сохранена. Матрицей для гуманизации, используемой для трансплантации вариабельного участка легкой цепи из EGFR-mhPA8, в этом примере является IGKV1-NL1*01, который имеет 68,4% гомологии с легкой цепью EGFR-mhPA8, а матрицей для гуманизации, используемой для трансплантации вариабельного участка тяжелой цепи, является IGHV1-69-2*01, который имеет 64,9% гомологии с тяжелой цепью EGFR-mhPA8. N52 вариабельного участка LCDR2 гуманизированного антитела EGFR-HPA8, склонный к дезамидированию, мутирован в D.

Поскольку ключевой сайт каркасного участка антитела мыши необходим для поддержания стабильности пространственной структуры CDR, ключевой сайт должен быть обратно мутирован в соответствующие аминокислоты антитела мыши. По нумерации Кабата легкая цепь была обратно мутирована в Q в положении 45, в I в положении 48, в К в положении 74 и в D в положении 76, а тяжелая цепь была обратно мутирована в К в положении 38, в I в положении 48 и в L в положении 70. Гуманизированное антитело EGFR-HPA8 получали посредством гуманизационной трансплантации CDR и реверсивных мутаций каркасной области, а последовательности аминокислот его тяжелой цепи и легкой цепь показаны в SEQ ID NO: 22/23, соответственно; последовательности аминокислот его тяжелой цепь и легкой цепи, содержащих сигнальный пептид, показаны в SEQ ID NO: 24/25, соответственно, содержащих последовательности аминокислот сигнального пептида, последовательно соединенного с тяжелой цепью/легкой цепью, показаны в (SEQ ID NO: 26/27), вариабельный участок тяжелой цепи/легкой цепи гуманизированного антитела (SEQ ID NO: 28/29) и константный участок гуманизированного антитела, а именно константный участок тяжелой цепи/ константный участок легкой цепи каппа IgG1 человека (SEQ ID NO: 30/31); и последовательности его гуманизированных CDR показаны в Таблице 2.

Последовательность нуклеотидов, содержащую сигнальный пептид легкой цепи антитела EGFR-HPA8 (SEQ ID NO: 33), последовательно соединенную с последовательностью нуклеотидов легкой цепи (SEQ ID NO: 35), последовательность нуклеотидов вариабельного участка легкой цепи гуманизированного антитела (SEQ ID NO: 37) и последовательность нуклеотидов константного участка легкой цепи каппа человека (SEQ ID NO: 39) амплифицировали путем сплайсинга ПЦР. Указанный выше продукт ПЦР вставляли в вектор pSTEP2 (источник: сконструирована Sinocelltech Limited, такая же далее) инфузионным методом (двойное расщепление HindIII+XbaI), и правильность последовательности плазмиды проверяли секвенированием. Последовательность нуклеотидов вариабельного участка тяжелой цепи антитела EGFR-НРА8 (SEQ ID NO: 36) получали путем синтеза полного гена и вставляли в вектор pSTEP2 (после двойного расщепления SeaI+NheI), содержащий последовательность нуклеотидов сигнального пептида тяжелой цепи (SEQ ID NO: 34) и последовательность нуклеотидов константного участка тяжелой цепи IgGl человека (SEQ ID NO: 38) инфузионным методом и правильность последовательности вектора экспрессии легкой и тяжелой цепей EGFR-HPA8 проверяли секвенированием. После выделения плазмиды и трансфекции клеток HEK-293 (нокаут по fut8), указанные клетки культивировали и экспрессировали в течение 7 суток, клеточный супернатант очищали с использованием аффинной хроматографии после центрифугирования, при этом хроматографическая среда представляла собой упаковку белка А, которой взаимодействует с Fc. После уравновешивания хроматографической колонки с белком А буфером состава 50 мМ Трис, 10 мМ NaCl, рН 8,0 5-10 объемами колонки, отфильтрованный культуральный супернатант добавляли в хроматографическую колонку для связывания, и колонку наполняли буфером состава 20 мМ Трис, 0,3 M Arg, рН 6,5 5-10 объемами колонки, а затем колонку промывали элюирующим буфером состава 0,1 M Gly, 10 мМ NaCl, рН 3,5, а собранные образцы нейтрализовали 2 M Трис (рН 8,0), в результате чего получали высокочистое и высококачественное ADCC-усиленное антитело EGFR-HPA8.

Последовательности праймеров для сплайсинга для ПЦР-амплификации легкой цепи антитела EGFR-HPA8, содержащей сигнальный пептид:

Последовательности праймеров для полногеномного синтеза вариабельного участка тяжелой цепи антитела EGFR-HPA8:

2.2. Определение характеристик гуманизированного антитела EGFR-HPA8 in vitro

2.2.1. Анализ специфичности гуманизированного антитела и конкурентности лиганда

Ссылаясь на Пример 1.2.1, связывающая способность антитела человека с рекомбинантным белком EGFR человека была обнаружена методом ИФА с использованием SCT200 (задокументировано в CN200610012002.8, далее так же), Erbitux (MERCK, 201621, далее так же) и отрицательного контроля. Как показано на Фиг. 4, ЕС₅₀ для гуманизированного антитела EGFR-HPA8 специфическое связывание с рекомбинантным EGFR-His человека составляла 116,6 нг/мл, R²=1,000; ЕС₅₀ для SCT200 составляла 166,5 нг/мл, R²=1,000; ЕС₅₀ для Erbitux составляла 253,6 нг/мл, R²=1,000; отрицательный контроль H7N9-R1 не связывался. Эти результаты указывают на то, что EGFR-HPA8 обладает лучшей способностью блокировать рекомбинантный EGFR-his человека, чем SCT200 и Erbitux.

В то же время, способность гуманизированного антитела EGFR-HPA8 блокировать связывание лиганда и рецептора EGFR анализировали с помощью FACS со ссылкой на Пример 1.2.1, используя SCT200, Erbitux и отрицательный контроль. Результаты приведены на Фиг. 5, способность EGFR-HPA8 блокировать связывание белка EGF-Fc с EGFR на клетках MDA-MB-468 является более сильной, чем у SCT200 и Erbitux.

2.2.2. Ингибирование пролиферации различных опухолевых клеток гуманизированными антителами

2.2.2.1. Способность гуманизированных антител ингибировать пролиферацию клеток MDA-MB-468

Клетки MDA-MB-468 равномерно инокулировали в 96-луночные планшеты в количестве 5×10³ на лунку. Клетки инкубировали в инкубаторе с СО₂ в течение 3 ч, и добавляли различные концентрации гуманизированного антитела EGFR-HPA8 (666,7 нМ, 222,2 нМ, 74,1 нМ, 24,7 нМ, 8,23 нМ, 2,74 нМ, 0,91 нМ, 0,31 нМ и 0,1 нМ), a SCT200 и Erbitux использовали в качестве контроля. Затем добавляли лиганды HB-EGF (источник: Sino Biological, Inc., далее такой же) в конечной концентрации 8 нг/мл, BTC-Fc (источник: Sino Biological, Inc., далее такой же) в конечной концентрации 200 нг/мл или Fc-EREG (источник: Sino Biological, Inc., далее такой же) в конечной концентрации 1 мкг/мл, соответственно. Клетки инкубировали в инкубаторе с СО₂ при 37°С и 5% СО₂ в течение 5 суток, затем добавляли WST-8 в количестве 15 мкл на лунку. Через 240 минут инкубации измеряли OD₄₅₀-OD₆₃₀ с помощью микропланшетного ридера, и рассчитывали рост степени ингибирования клеток антителом. Добавление лиганда без антитела использовали в качестве группы М. Степень ингибирования=(OD группы M - OD образца)/(OD группы M) × 100%, а количественную кривую эффективности анализировали и строили с помощью программного обеспечения GraphPad Prism, горизонтальной координатой являлась концентрация антитела, а вертикальной координатой являлась степень ингибирования. Результаты приведены на Фиг. 6А и в Таблице 3. EGFR-HPA8 показало лучшее ингибирование роста клеток MDA-MB-468, чем контрольные антитела SCT200 и цетуксимаб в условиях без лиганда. EGFR-FJPA8 обладает максимальной степенью ингибирования, схожей с SCT200, но имеет меньшую ЕС₅₀ ингибирования роста. Результаты Примера 2.2.1 демонстрируют, что способность EGFR-HPA8 блокировать связывание белка EGF-Fc с EGFR на клетках MDA-MB-468 была более сильной, чем у SCT200 и Erbitux. В этом Примере добавляли различные лиганды EGFR в анализе ингибирования роста клеток MDA-MB-468, чтобы дополнительно оценить способность EGFR-HPA8 блокировать связывание лиганда и рецептора EGFR на клеточном функциональном уровне. Результаты приведены на Фиг. 6B-6D и в Таблице 3. EGFR-HPA8 ингибировало пролиферацию клеток MDA-MB-468 лучше, чем SCT200 и цетуксимаб в условиях с различными лигандами.

2.2.2.2. Способность гуманизированных антител ингибировать пролиферацию клеток Fadu

Fadu представляют собой штамм клеток плоскоклеточной карциномы глотки человека, которые сильно экспрессируют EGFR, а также аутокринирует различные лигандные факторы EGFR. Со ссылкой на Пример 2.2.2.1, ингибирование пролиферации клеток Fadu (источник: Центр клеточных ресурсов, Шанхайский институт биологических наук, академия наук Китая) антителом EGFR-HPA8 в условиях с различными лигандами измеряли с помощью метода WST-8. Результаты приведены на Фиг. 7 и в Таблице 4. Способность EGFR-HPA8 ингибировать рост клеток Fadu была сходной с SCT200 и лучшей, чем у цетуксимаба в условиях без лиганда, в то время как способность EGFR-НРА8 ингибировать рост клеток Fadu была значительно лучшей, чем у SCT200 и цетуксимаба в условиях с различными лигандами. Эти результаты продемонстрировали, что антитело EGFR-HPA8 обладало лучшей способностью к ингибированию связывания лиганда с рецептором EGFR по сравнению с SCT200 и цетуксимабом.

2.2.3. Действие гуманизированного антитела ADCC

В этом Примере использована система с рекомбинантным репортерным геном CD16a для определения эффектов ADCC, опосредованных гуманизированным антителом EGFR-HPA8. Система с рекомбинантным репортерным геном CD16a включает эффекторные клетки Jurkat-NFAT-Luc2p-CD16A и целевые клетки, экспрессирующие EGFR. При совместном культивировании двух типов клеток и одновременном добавлении Fab-фрагмента антитела EGFR, антитело EGFR связывается с EGFR, экспрессируемым на поверхности клеток-мишеней, а его Fc-фрагмент может связываться с эффектором клетки, сверхэкспрессирующей FCy рецептор CD16a, тем самым активируя эффекторные клетки Jurkat-NFAT-Luc2p-CD16A и стимулируя NFAT-RE-опосредованную биолюминесценцию.

Целевые клетки А431 (источник: Центр клеточных ресурсов, Шанхайский институт биологических наук, академия наук Китая) равномерно инокулировали в 96-луночные планшеты в количестве 1×10⁴ на лунку. После инкубации в течение ночи добавляли различные концентрации антител (2,67 нМ, 0,53 нМ, 0,11 нМ, 0,021 нМ, 0,0043 нМ, 0,00085 нМ, 0,00017 нМ и 0,000034 нМ) в количестве 40 мкл на лунку, а затем 1×10⁵эффекторных клеток Jurkat-NFAT-Luc2p-CD16A (Источник: Sinocelltech Limited, далее тот же), 40 мкл на лунку, для каждого анализа использовали 3 повторные лунки. Также использовали лунки с целевыми клетками, эффекторными клетками и антителом отрицательного контроля. Клетки инкубировали в течение 4 ч в инкубаторе с СО₂ при 37°С и 5% СО₂, и добавляли 5 х буфер пассивного лизирования, 20 мкл на лунку. Клетки один раз замораживали и оттаивали, и 20 мкл супернатанта из каждой лунки переносили в 96-луночный планшет с белым дном, затем встряхивали планшет и перемешивали, детекцию люминесценции осуществляли с помощью детектора LB960-Microplate Luminol Detector. Количественные кривые эффективности были проанализированы и построены с использованием программного обеспечения GraphPad Prism, где горизонтальная координата представляла собой концентрацию образца, а вертикальная координата представляла собой значение RLU. Множитель индукции интенсивности биолюминесценции = RLU образца/отрицательный контроль RLU. Результаты приведены на Фиг. 8, EGFR-HPA8, положительные контроли Erbitux и SCT200 могут опосредовать эффективное действие ADCC на опухолевые клетки А431, экспрессирующие EGFR. Среди них, EGFR-HPA8 имело преимущество в полуэффективной концентрации и индукционной кратности с ЕС₅₀, равной 0,008 нМ и R²=0,999 в отношении индукции ADCC.

2.3 Эффективность EGFR-HPA-8 в отношении подкожно ксенотрансплантированных опухолей линии клеток рака желудка человека SNU-5 и линии немелкоклеточного рака легких человека NCI-H1975 у мышей

Клетки SNU-5 на логарифмической стадии роста (банк клеток АТСС) промывали PBS и расщепляли 0,25% трипсином, продукт расщепления собирали с последующим центрифугированием при 800 об/мин в течение 5 мин. Клетки ресуспендировали в PBS, и концентрацию клеток доводили до 5,0×10⁷ клеток/мл (с 50% матриксным гелем). Мышам Balb/c-nude (Beijing Viton Lever Laboratory Animal Technology Co.) подкожно иннокулировали суспензию клеток SNU-5 в количестве 5,0×10⁶ в правую часть спины, 100 мкл на мышь. После того как объем опухоли достигал примерно 170 мм³, мышей случайным образом делили на семь групп в соответствии с объемом опухоли, по пять мышей в каждой из групп. Лекарственное средство вводили внутрибрюшинно (IP) в день разделения на группы, а затем два раза в неделю в виде 7 последовательных доз. Конкретный режим дозирования показан в Таблице 5 ниже.

Примечание: Объем введения рассчитывали на основе массы тела мышей в количестве 10 мл/кг.

Значение ингибирования роста опухоли (TGI) рассчитывали следующим образом: Т/С(%)=T_RTV/C_RTV×100% (Trtv представляет собой RTV группы, получавшей лечения; C_RTV представляет собой RTV группы отрицательного контроля), относительный объем опухоли (RTV)=V_T/V₀, V₀ - объем опухоли, измеренный в день 0 (D₀), а именно день распределения на группы и начала введения дозы, V_T - объем опухоли, измеряемый за определенное время. TGI(%)=1-Т/С(%).

Все подопытные животные были в хорошем состоянии и показали некоторую прибавку массы тела на протяжении всего курса введения. Существенной разницы в массе тела мышей в каждой из групп, получавшей дозу лекарственного средства, не было по сравнению с контрольной группой, получавшей растворитель (Р>0,05). Изменения массы тела всех животных показаны на Фиг. 9 и в Таблице 6.

Объем опухоли и результаты TGI для каждой из групп в этом исследовании показаны в Таблице 7 и на Фиг. 10. Через 31 сутки введения доз средний объем опухоли в группе, получавшей носитель, составлял 559,9±144,9 мм³ и в группе положительного контроля с низкой дозой SCT200 5 мг/кг составлял 317,1±197,6 мм³ со значением TGI, равным 44,3%, которое не сильно отличалось группы, получавшей носитель, (Р=11,28%). Группа, получавшая низкую дозу EGFR-HPA8 в 5 мг/кг показала лучшую эффективность в отношении объема опухоли, равной 113,8±74,0 мм³ и TGI 80,0%, это значительная разница по сравнению с группой, получавшей носитель, (Р<0,05), что указывает на то, что EGFR-HPA8 продемонстрировало несколько лучшие свойства ингибирования опухоли, чем положительный контроль SCT200 при этой дозе (Р=0,09). Объем опухоли в группе положительного контроля SCT200 20 мг/кг составлял 191,8±189,1 мм³ со значением TGI, равным 66,5%, что существенно отличалось от группы, получавшей носитель (Р<0,05). Объем опухоли в группе, получавшей большую дозу EGFR-HPA8 20 мг/кг, составлял 175,0±175,0 мм³ со значением TGI, равным 68,9%, что существенно отличалось от группы, получавшей носитель (Р<0,05). Группы, получавшие EGFR-HPA8 и положительный контроль SCT200 20 мг/кг, показали существенный эффект по ингибированию опухоли, и не было существенной разницы в объеме опухолей между двумя группами, получавшими лечение (Р=0,9). В заключение, молекулы EGFR-HPA8 продемонстрировали значительную противоопухолевую эффективность в модели ксенотрансплантированной опухоли рака желудка человека SNU-5 как при уровне дозировки 5 мг/кг, так и 20 мг/кг, и эффект по ингибированию опухоли был немного лучше, чем у SCT200 при низких дозах.

EGFR-HPA8 также показало значительное ингибирующее действие на клеточную линию NCI-H1975 опухоли немелкоклеточного рака легкого человека, в модели подкожной ксенотрансплантации на мышах. Мышам Balb/c-nude подкожно инокулировали клетки NCI-H1975 в правую сторону спины (Центр клеточных ресурсов, Шанхайский институт биологических наук, академия наук Китая), и распределяли по группам и вводили дозы как показано в Таблице 8.

Все подопытные животные были в хорошем состоянии и показали некоторое увеличение массы тела на протяжении всего курса введения, и не было значимой разницы в массе тела мышей в каждой группе введения по сравнению с контрольной группой, получавшей растворитель (Р>0,05). Изменения массы тела всех животных показаны на Фиг. 11 и в Таблице 9.

Объем опухоли и результаты TGI для каждой из групп в этом исследовании показаны в Таблице 10 и на Фиг. 12. Через 18 суток после распределения по группам и введения доз, группы положительного контроля SCT200 и группы EGFR-HPA8 с высокой и низкой дозировкой показали существенные эффекты по ингибированию роста опухоли и статистически значимые различия в объеме опухоли между каждой из групп, получавшей лечение, и группой, получавшей носитель. Средний объем опухоли в группе, получавшей носитель, на 18 сутки составлял 1564,3±529,0 мм³. Объем опухолей после лечения SCT200 5 мг/кг и EGFR-HPA8 5 мг/кг составлял 151,9±99,1 мм³ и 86,5±107,5 мм³, со значениями TGI, равными 90,4% и 94,5%, соответственно. Объем опухолей после лечения SCT200 20 мг/кг и EGFR-HPA8 20 мг/кг составлял 289,8±321,4 мм³ и 149,3±94,9 мм³, со значениями TGI, равными 81,8% и 90,4%, соответственно. EGFR-HPA8 как в дозировке 5 мг/кг, так и 20 мг/кг показало несколько лучший противоопухолевой эффект, чем положительный контроль SCT200, но статистически значимой разницы не было. В совокупности эти результаты позволяют предположить, что молекула EGFR-HPA8 обладает значительной противоопухолевой эффективностью в модели ксенотрансплантированной опухоли немелкоклеточного рака легких человека NCI-H1975.

Пример 3: Конструирование и исследование слитых белков EGFR антитело/TGFβR2, содержащего различные укороченные формы TGFβR2

3.1 Конструирование векторов экспрессии слитого белка EGFR антитело/TGFβR2 с различными укороченными формами TGFβR2, экспрессия белка и очистка

В этом варианте осуществления использовали антитело против EGFR в качестве нацеливающей части слитого белка и внеклеточный домен TGFβR2 в качестве иммуномодуляторной части слитого белка. Внеклеточный домен TGFβR2 соединен с С-концом тяжелой цепи антитела EGFR посредством гомологичной рекомбинации, а слитой белок EGFR антитело/внеклеточный домен TGFβR2 (EGFR/TGFβR2) образован двумя цепями, легкой цепью и тяжелой цепью. Структура слитого белка показана на Фиг. 13. Результаты масс-спектрометрии показали наличие множества сайтов чувствительности между сайтами 7-15 N-конца полноразмерного внеклеточного домена TGFβR2. Чтобы улучшить структурную стабильность белка, последовательность аминокислот N-конца внеклеточного домена TGFβR2 модифицировали делециями аминокислот в различных количествах аминокислот в этом Примере (SEQ ID NO: 47-65). В слитом белке EGFR антитело/TGFβR2 аминокислота С-конца тяжелой цепи антитела EGFR связаны с внеклеточным доменом TGFβR2 с различными формами делегированных аминокислот посредством линкера (G₄S)₄ (SEQ ID NO: 66). Дополнительно лизин С-конца тяжелой цепи антитела EGFR удаляли для снижения риска протеолиза. Конкретный протокол конструирования слитого белка EGFR антитело/TGFβR2 показан в Таблице 11.

В приведенном выше протоколе целевой ген амплифицировали с помощью ПЦР или ПЦР с перекрытием, лигировали в вектор экспрессии путем инфузии, а плазмиды экстрагировали отдельно после проверки последовательностей и транзиентно переносили в клетки HEK-293 (нокаут fut8) и культивировали до 7-го дня. Центрифугировали и собрали супернатант.Клеточный супернатант после центрифугирования очищали с помощью аффинной хроматографии с белком А, в результате чего получали слитой белок EGFR антитело/ТСРβR2 с усиленной ADCC.

3.2 Расщепление слитых белков EGFR антитело/TGFβR2, содержащих различные укороченные формы TGFβR2

Чистоту, а также расщепление продуктов экспрессии анализировали с помощью SDS-ПААГ в восстанавливающих условиях. Различные укороченные слитые белки EGFR антитело/TGFβR2 1-16, очищенные в Примере 3.1, использовали в SDS- ПААГ в восстанавливающих условиях. Конкретные стадии SDS- ПААГ в восстанавливающих условиях: (1) подготовка SDS- ПААГ: 3,9% концентрирующий гель, 13% разделяющий гель; (2) образцы кипятили при 100°С в течение 2 мин, центрифугировали, а затем наносили образцы в количестве 8 мкг; (3) постоянный ток 40 мА, время электрофореза -1 ч. Результаты приведены на Фиг. 14. Молекулярная масса указанной легкой цепи слитого белка EGFR антитело/TGFβR2 составляла примерно 25 кДа, молекулярная масса указанной тяжелой цепи составляла примерно 66 кДа, и молекулярная масса укороченных вариантов была в диапазоне 45-66 кДа. Результаты показали, что во внеклеточном домене TGFβR2 присутствовали явные расщепленные фрагменты, в то время как у различных укороченных форм слитых белков TGFβR2 внеклеточный домен имел значительно меньшее количество полос его расщепления, чем у полноразмерных форм внеклеточного домена TGFβR2 в слитом белке. Соответственно, различные укороченные формы внеклеточного домена TGFβR2, полученные в настоящем изобретении, существенно повышали стабильность слитого белка, содержащего рецептор TGF-β и антитело.

3.3 тенденция к деградации слитых белков EGFR антитело/TGFβR2, содержащих различные укороченные формы TGFβR2

Супернатант клеток 293Е, который ускоряет процессинг слитых белков, дополнительно использовали для оценки стабильности различных укороченных форм слитых белков EGFR антитело/TGFβR2. Система клеточной экспрессии 293Е, которую часто используют для экспрессии антитела, экспрессирует различные белки клетки-хозяина (НСР) и протеазы, необходимые для роста клеток. Таким образом, устойчивость антител можно оценить, наблюдая за склонностью к деградации слитого белка в супернатанте клеток 293Е.

Очищенный слитой белок смешивали с супернатантом клеток 293Е, культивированных в течение 10 дней при объемном соотношении 1:0,3, и конечная концентрация слитого белка составляла примерно 1 мг/мл. Смешанные образцы встряхивали и хорошо перемешивали и инкубировали при 37°С в течение 48 часов. Также использовали контроль инкубации без супернатанта клеток. Чистоту образцов и содержание укороченных форм определяли с помощью SDS- ПААГ, а чистоту тяжелой цепи слитого белка определяли с помощью программного обеспечения BandScan.

Результаты анализа показаны на Фиг. 15, а процент расщепления в каждом образце показан в Таблице 12. Результаты показали, что процент расщепленных форм TGFβR2 укороченной формы слитого белка (слитые белки 2-16) во всех контрольных группах был менее 4,0%, что значительно ниже, чем у полноразмерной формы TGFβR2 слитого белка (слитой белок 1), у которой этот процент составлял 24,8%. После инкубации с тем же клеточным супернатантом в течение 48 часов при 37°С все полноразмерные формы TGFβR2 слитого белка (слитой белок 1) в экспериментальной группе оказались чувствительными с процентом 100%. Укороченные формы TGFβR2 слитых белков (слитые белки 2-16) содержали различный процент расщепленных форм, но они были значительно лучше, чем полноразмерный контрольный белок, при этом слитой белок 2, слитой белок 6, слитой белок 9, слитой белок 10 и слитой белок 13 продемонстрировали наилучшие качества с процентом содержания расщепленных форм менее 3,0%.

Показанные выше результаты указывают на то что слитые белки EGFR антитело/TGFβR2 с различными укороченными формами TGFβR2 являются более устойчивыми к расщеплению протеазами, чем слитой белок 1 с полноразмерной формой TGFβR2.

3.4 Анализ связывания слитого белка EGFR антитело/TGFβR2 с различными укороченными формами TGFβR2 с TGF-β

100 нг/мл белка TGF-β1 и 40 нг/мл белка EGFR-His наносили в 96-луночные планшеты в количестве 100 мкл на лунку, соответственно, и выдерживали в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали на следующий день, блокировали при комнатной температуре в течение 1 ч, и добавляли 2 мкг/мл слитого белка EGFR антитело/TGFβR2 с различными укороченными формами TGFβR2 в количестве 100 мкл на лунку. Планшеты промывали после инкубации в течение 1 часа для удаления несвязавшихся антител, добавляли вторичное антитело козы против hIgG Fc/HRP, инкубировали и повторяли отмывку. Наконец, добавляли раствор хромогенного субстрата для развития окраски, и значение OD₄₅₀ считывали с помощью микропланшетного ридера после окончания реакции. Результаты приведены на Фиг. 16. Способность к связыванию слитого белка EGFR антитело/TGFβR2 с различными укороченными формами TGFβR2 с TGF-β1 была разной, но способность к связыванию с EGFR была одинаковой.

3.5 Анализ нейтрализации TGF-β слитым белком EGFR антитело/TGFβR2 с различными укороченными формами TGFβR2

TGF-β регулирует клеточные функции, регулируя транскрипцию нескольких генов-мишеней. Ингибитор активатора плазминогена 1 (PAI-1) представляет собой важную мишень нижестоящего сигнального пути TGF-β1/Smad и активирует связывание Smad3 с цис-действующим элементом промоторной области PAI-1, чтобы регулировать экспрессию PAI-1. Элемент, содержащий участок промоторной области PAI-1, встраивали в специфической форме в вектор, содержащий люциферазу, и переносили в клетки HepG2. В этой системе репортерных генов добавление экзогенного белка TGF-β инициирует экспрессию репортерного гена люциферазы и люминесценцию в присутствии субстрата. При добавлении экзогенного антитела TGF-β оно нейтрализует белок TGF-β, блокирует связывание TGF-β с TGFβR2, ингибирует нижестоящий сигнальный путь и, наконец, ингибирует экспрессию репортерного гена люциферазы. Следовательно, эффективность in vitro TGF-β антитела, нейтрализующего TGF-β, может быть определена путем определения интенсивности светового сигнала.

В 96-луночные планшеты равномерно наносили клетки HepG2-3TP-Luc2p-puro (источник: Sinocelltech Limited, далее такой же) в количестве 30,000 клеток на лунку. После выдерживания монослойной культуры в течение ночи питательную среду удаляли из 96-луночного планшета и замещали средой DMEM, содержащей 0,5% ФБС, и инкубировали в течение 6 часов при 37°С с инкубаторе с 5% СО₂. Среду в 96-луночном планшете удаляли и добавляли 4 нг/мл белка TGF-β1 вместе со слитым белком EGFR антитело/TGFβR2 в конечной концентрации 0,.02 мкг/мл и инкубировали в течение 18 ч при 37°С в инкубаторе с 5% СО₂. Одновременно использовали группу отрицательного контроля M (содержащую клетки и TGF-β1) и группу отрицательного контроля М' (содержащую клетки без TGF-β1). Наконец добавляли 5х лизирующий буфер и отбирали 10 мкл образцов клеток для определения значения интенсивности биолюминесценции (RLU) и рассчитывали степень нейтрализации слитого белка EGFR антитело/TGFβR2. Степень нейтрализации, %=(значение RLU группы Μ - значение RLU образца)/(значение OD группы M - значение OD группы М') × 100%. В качестве горизонтальной координаты использовали концентрацию антител, а в качестве вертикальной координаты использовали уровень нейтрализации антителом, и количественные кривые эффективности были проанализированы и построены с использованием программного обеспечения GraphPad Prism. Как показано на Фиг. 17, слитой белок EGFR антитело/TGFβR2 2, слитой белок 6, слитой белок 8, слитой белок 13, слитой белок 14 и слитой белок 16, содержащие укороченные формы TGFβR2 обладали определенной способностью к нейтрализации TGF-β1, среди которых слитой белок 2 имел сходную нейтрализующую способность со слитым белком 1, содержащим полноразмерную форму TGFβR2, в то время как слитой белок 5, слитой белок 6 и слитой белок 8 показали лучшую нейтрализующую способность, чем слитой белок 1 при такой же концентрации. Слитой белок 6 продемонстрировал наиболее сильную способность к нейтрализации TGF-β1. Оставшиеся слитые белки EGFR антитело/TGFβR2, содержащие укороченные формы TGFβR2, по существу не обладали или обладали слабой нейтрализующей способностью.

Белок TGF-β3 обладает высокой аффинностью к TGFβR2 и может активировать нижестоящую передачу сигналов TGF-β. Способность слитого белка к нейтрализации TGF-β3 (конечная концентрация 20 нг/мл) была проанализирована с применением системы репортерного гена в этом примере. Результаты представлены на Фиг. 18. Слитой белок 2, слитой белок 4 и слитой белок 13 обладали такой же способностью к нейтрализации TGF-β3, как и слитой белок 1, в то время как слитой белок 3, слитой белок 5, слитой белок 6 и слитой белок 8 обладали лучшей склонностью к нейтрализации TGF-β3, чем слитой белок 1. Слитой белок 6 также показал самую высокую способность к нейтрализации TGF-β3.

Основываясь на приведенном выше анализе состава и способности к нейтрализации слитых белков, содержащих укороченные формы TGFβR2, в настоящем изобретении предпочтительными оказались формы слитого белка 2 ~ 6, 8, 13, 14 и 16 с укороченным TGFβR2, более предпочтительными - формы слитого белка 2, 5, 6 и 8 с укороченным TGFβR2, и наиболее предпочтительной - форма слитого белка 6 с укороченным TGFβR2.

Пример 4: In vitro биологические свойства слитого белка 6, слитого белка EGFR антитело/TGFβR2 с укороченной формой TGFβR2

4.1 Анализ связывающей способности слитого белка EGFR антитело/TGFβR2 4.1.1 Свойства слитого белка EGFR антитело/TGFβR2 по связыванию и конкуренции с TGF-β

Белок TGF-β1 и белок TGF-β3 в конечной концентрации 2 мкг/мл вносили в 96-луночные планшеты в количестве 100 мкл на лунку, соответственно, и оставляли образовывать покрытие в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали на следующий день, блокировали при комнатной температуре в течение 1 часа и инкубировали с различными концентрациями (1,22 пМ, 4,88 пМ, 19,53 пМ, 78,13 пМ, 312,5 пМ, 1250 пМ, 500 пМ, 2000 пМ) слитого белка EGFR антитело/TGFβR2 6 в течение 1 часа. После этого планшеты промывали для удаления несвязавшихся антител, и инкубировали со вторичным антителом козы против hIgG₅₀²F(ab)₂/HRP и повторно промывали, добавляли раствор хромогенного субстрата для развития окраски, и считывали значение OD₄₅₀ с помощью микропланшетного ридера после окончания реакции. Результаты приведены на Фиг. 19. Способность к связыванию слитого белка 6 с белками TGF-β1 и TGF-β3 была сходной со способностью слитого белка 1, с ЕС₅₀, равной 91 пМ и R²=0,998 по связыванию с белком TGF-β1, и с ЕС₅₀, равной 102 пМ и R²=0,998 по связыванию с белком TGFβ3.

В этом Примере дополнительно анализировали способность слитого белка 6 конкурировать с белком TGF-β1 или белком TGF-β3 за связывание с белком TGFβR2-Fc на уровне белка.

Белок TGF-β1 в конечной концентрации 0,2 мкг/мл или белок TGF-β3 в концентрации 0,5 мкг/мл наносили на 96-луночный планшет в количестве 100 мкл на лунку и инкубировали в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали на следующий день, блокировали при комнатной температуре в течение 1 часа, и добавляли 100 мкл слитого белка EGFR антитело/TGFβR2 в разных концентрациях (0,05 нМ, 0,14 нМ, 0,42 нМ, 1,25 нМ, 3,75 нМ, 11,24 нМ, 33,71 нМ, 101,12 нМ) со 100 мкл конечной концентрации 0,2 мкг/мл (конкуренция с TGF-β1) или 1 мкг/мл (конкуренция с TGF-β3) меченого биотином белка TGFβR2-Fc (источник белка: Sino Biological, Inc., а меченого биотином белка: Sinocelltech Limited, далее такой же). Также использовали лунки с белком TGFβR2-Fc в качестве положительного контроля. Планшет промывали после 1 часа инкубации, а затем планшет несколько раз промывали после инкубации в течение 1 часа после добавления вторичного детектирующего антитела стрептавидин/пероксидаза хрена. Наконец, добавляли раствор хромогенного субстрата для развития окраски, и после окончания реакции, микропланшетный ридер считывал значение OD₄₅₀. Степень конкуренции ингибирования PI% слитого белка рассчитывали на основании значения OD₄₅₀, и степень ингибирования PI(%)=(значение OD₄₅₀ лунки с положительным контролем - значение OD₄₅₀ лунки с образцом)/значение OD₄₅₀ лунки с положительным контролем × 100%. Результаты приведены на Фиг. 20, а слитой белок 6 обладал схожей способностью блокировать связывание белка TGF-β1 или белка TGF-β3 с TGFβR2-Fc, что и слитой белок 1.

4.1.2. Связывающие свойства слитого белка EGFR антитело/TGFβR2 с EGFR

Со ссылкой на Пример 1.2.1. способность к связыванию слитого белка с рекомбинантным белок EGFR человека измеряли с помощью ИФА. Как показано на Фиг. 21, способность к связыванию слитого белка 6 с EGFR и способность конкурировать с EGF в связывании с EGFR была схожей с такой способностью у EGFR-HPA8, когда ЕС₅₀ была равной 133,1 нг/мл и R²=1,000.

4.2 Анализ аффинности связывания слитого белка EGFR антитело/TGFβR2

В этом Примере аффинность слитого белка EGFR антитело/TGFβR2 в связывании биотинилированного рекомбинантного белка EGFR человека и белка TGF-β1 определяли с помощью системы анализа биомолекулярных взаимодействий (модель: OctetRED96e, производитель: Fortebio) с EGFR-HPA8 и H7N9-R1, соответственно, в качестве отрицательных контролей. Параметры аффинности были получены путем подгонки кривых связывания и диссоциации множества точек концентрации, результаты представлены в Таблицах 13 и 14, а специфические кривые параметров кинетических характеристик показаны на Фиг. 22 и 23.

Эти результаты показывают, что слитой белок 6 сохранил высокую аффинность связывания с белком EGFR человека по сравнению с моноклональным антителом EGFR-НРА8, со значением K_D, равным 8,77 пМ, и значением константы связывания k_on, равным 1,68Е+06 М^-1 с^-1, и значением константы диссоциации k_dis, равным 1,47Е-05 с^-1. В дополнение, слитой белок 6 с укороченной формой TGFβR2 обладает схожей аффинностью с белком EGFR человека, что и слитой белок 1 с полноразмерной формой TGFβR2 со значение K_D, равным 96,1 пМ, значением константы связывания k_on, равным 1,53Е+06 M с^-1, и значением константы диссоциации k_dis, равным 1,47Е-04 с^-1.

Приведенные выше результаты показывают, что слитой белок 6 имеет хорошее сродство как с EGFR человека, так и с TGF-β1.

4.3. Анализ слитого белка EGFR антитело/TGFβR2 по нейтрализации TGF-β

TGF-β1 может ингибировать пролиферацию клеток Mv-1-lu, поэтому способность слитого белка EGFR антитело/TGFβR2 по нейтрализации TGF-β1 может быть обнаружена с помощью анализа WST-8.

Клетки Mv-1-lu (источник: Центр клеточных ресурсов, Шанхайский институт биологических наук, академия наук Китая) равномерно инокулировали в количестве 50 мкл на лунку в 96-луночный планшет при плотности клеток 1×10³ на лунку. Клетки инкубировали в инкубаторе с СО₂ в течение примерно 3 ч для их прилипания к стенкам лунки, а затем образцы слитого белка EGFR антитело/TGFβR2 в разных концентрациях (0,0078 нМ, 0,0156 нМ, 0,0313 нМ, 0,0625 нМ, 0,125 нМ, 0,25 нМ, 0,5 нМ, 1 нМ, 2 нМ), разбавленных в среде 1640, содержащей 10% ФБС, добавляли в количестве 50 мкл на лунку. Наконец, добавляли фактор TGF-β1 в конечной концентрации 1 нг/мл в количестве 10 мкл на лунку. Также использовали группу M в качестве положительного контроля (содержащую клетки и TGF-β1), группу М' в качестве отрицательного контроля (содержащую клетки без TGF-β1), и группу В в качестве пустого контроля (содержащую только питательную среду без клеток). Клетки инкубировали в инкубаторе с СО₂ при 37°С и 5% СО₂ в течение 5 суток, а затем добавляли WST-8 в количестве 10 мкл на лунку. Образцы оставляли в течение 180 мин и значение OD₄₅₀-OD₆₃₀ измеряли с помощью микрогшаншетаого ридера, а степень нейтрализации слитого белка EGFR антитело/TGFβR2 рассчитывали путем вычитания значения пустого контроля В. Степень нейтрализации, %=(OD группы М' - OD образца)/(OD группы М' - OD группы M) × 100%, и количественную кривую эффективности анализировали и построили с помощью программного обеспечения GraphPad Prism, горизонтальной координатой являлась концентрация антитела и вертикальной координатой являлась степень ингибирования. Как показано на Фиг. 24, как слитой белок 6, так и контрольный продукт H7N9-R1-43-IgG1 (L9) для TGFβR2 (источник: Sinocelltech Limited для мечения биотином, далее такой же) могли эффективно нейтрализовать ингибирование пролиферации Mv-1-lu посредством TGF-β1 в дозозависимом виде, а полуэффективная концентрация слитого белка 6 была меньше, чем у контрольного продукта H7N9- R1-43-IgG1 (L9), что указывает на лучшую нейтрализующую активность указанной молекулы. EGFR-HPA8 не нейтрализовал TGF-β1, что позволяет предположить, что именно часть TGFβR2 слитого белка 6 проявляет нейтрализующее действие в отношении TGF-β1.

Способность слитого белка 6 к нейтрализации TGF-β была дополнительно проанализирована с использованием системы репортерного гена в этом Примере, со ссылкой на Пример 3.5. Результаты приведены на Фиг. 25, и как слитой белок 6, так и контрольный продукт H7N9-R1-43-IgG1 (L9) для TGFβR2 может эффективно нейтрализовать TGF-β1 в дозозависимом виде, а максимальная скорость нейтрализации слитого белка 6 (74,8%) значительно выше, чем у контрольного продукта H7N9-R1-43-IgG1 (L9) (55.3%), что дополнительно указывает на превосходную нейтрализующую активность слитого белка 6.

4.4. Анализ активности слитого белка EGFR антитело/TGFβR2 по ингибированию пролиферации клеток

Ингибирование слитым белком EGFR антитело/TGFβR2 роста клеток MDA-MB-468 анализировали с помощью метода WST-8, в соответствии с Примером 1.2.2 для определения свойств части EGFR. Как показано на Фиг. 26, способность слитого белка 6 ингибировать пролиферацию клеток MDA-MB-468 была сходной с EGFR-HPA8, а степень ингибирования повышалась с повышением концентрации лекарственного средства по S-образной кривой. Контрольный продукт H7N9-R1-43-IgG1 (L9) с функцией в отношении TGFβR2 не ингибировал пролиферацию клеток MDA-MB-468, указывая на то, что слитой белок 6 ингибировал пролиферацию опухолевых клеток посредством его части EGFR.

4.5. Влияние слитого белка EGFR антитело/TGFβR2 на ADCC

Влияние на ADCC, опосредованное слитым белком EGFR антитело/TGFβR2, клеток, экспрессирующих EGFR,- анализировали со ссылкой на Пример 2.2.3. Результаты приведены на Фиг. 27. В диапазоне концентраций 0,00004-3 нМ, слитой белок 6 и антитело против EGFR EGFR-HPA8 могут вызывать сходные эффекты ADCC на опухолевые клетки А431, экспрессирующие EGFR. Контрольный продукт H7N9-R1-43-IgG1 (L9) с функцией в отношении TGFβR2 на оказывал влияния на ADCC клеток А431, указывая на то, что именно часть EGFR слитого белка 6 вызывала ADCC в этой экспериментальной системе.

Пример 5: Фармакодинамическое исследование слитого белка EGFR антитело/TGFβR2 с укороченной формой TGFβR2 (слитой белок 6) в модели опухоли подкожного трансплантата NCI-H1975

Мышах Balb/c-nu подкожно вводили 1×10⁶ клеток NCI-H1975 в правую сторону грудной клетки. Когда объем опухоль достиг примерно 300 мм³, животных случайным образом группировали по объему опухоли по 6 животных в каждой группе и вводили дозу. Вводить дозу начинали в день распределения по группам, препарат вводили посредством внутрибрюшинной инъекцией (LP) дважды в неделю в течение 10 последовательных доз и прекращали введение после последней дозы для наблюдения за рецидивом опухоли. Конкретный режим дозирования введения показан в Таблице 15 ниже.

Животные в каждой группе находились в хорошем общем состоянии, таком как активность и питание в течение курса введения, масса тела у них несколько увеличилась. Не было существенной разницы в массе тела между группой, которой вводили дозы, и контрольной группой, получавшей растворитель, после введенных доз (Р>0,05). Изменение массы тела всех животных показаны в Таблице 16 и на Фиг. 28.

Результаты измерения объема опухоли для каждой из групп в этом исследовании показаны в Таблице 17 и на Фиг. 29. Через 35 суток лечения в группах, средний объем опухоли контрольной группе, получавшей растворитель, был 7150,78±780,4 мм³. У пяти из шести мышей, которым вводили слитой белок 6, опухоль полностью исчезла (CR) с средним объемом опухоли 4,55±4,55 мм³ и TGI, равным 99,9%, что значимо отличалось от такового у контрольной группы, получавшей растворитель (Р<0,001). В противоположность этому, только у одной мыши из группы, получавшей EGFR-HPA8, обнаружилось полное исчезновение опухоли, со средним объемом опухоли 79,44±28,65 мм³ и TGI, равным 98,9%. Результаты показали, что слитой белок 6 оказывает значительное ингибирующее действие на опухоли немелкоклеточного рака легких NCI-Н1975, трансплантированные подкожно, и эффект ингибирования опухоли превосходит эффект EGFR-HPA8 при той же молярной дозе (Р=0,237).

Пример 6: Анализ стабильности слитого белка EGFR антитело/TGFβR2 с укороченной формой TGFβR2 (слитой белок 6)

6.1. Ультрафильтрационный анализ стабильности слитого белка EGFR антитело/TGFβR2

Образцы слитого белка EGFR антитело/TGFβR2 концентрировали до концентрации примерно 10 мг/мл посредством ультрафильтрации в буфере 100 мМ глицина, 10 мМ NaCl, 50 мМ Трис, рН 7.5. Концентрированные образцы проверяли на чистоту и стабильность ультрафильтрованных образцов методами SDS-ПААГ в восстанавливающих условиях и молекулярно-ситовой хроматографии (SEC-ВЭЖХ, система жидкостной хроматографии Agilent 1260, колонка TSK-G3000SWXL). Стадии SEC-ВЭЖХ: (1) подвижная фаза: 200 мМ NaH₂PO₄, 100 мМ аргинин, рН 6.5; (2) объем загрузки 80 мкг; (3) время анализа - 30 мин, скорость потока - 0,5 мл/мин, и температура колонки 25°С; (4) чистоту рассчитывали по методу нормализации площади пика.

Результаты теста на чистоту после концентрирования образцов показаны на Фиг. 30, а чистота образцов и соотношение фрагментов показаны в Таблице 18. Результаты показали, что слитой белок 6 с укороченным TGFβR2 с меньшей вероятностью разрушался после концентрирования и имел более высокую степень ультрафильтрации по сравнению со слитым белком с полноразмерным TGFβR2.

6.2. Анализ термической стабильности слитого белка EGFR антитело/TGFβR2

Термическую стабильность образцов измеряли методом дифференциальной сканирующей флуориметрии (ДСФ) с использованием системы UNcle (Unchained Labs, модель: UNCLE-0330). Стадии процесса: (1) объем образца составлял 9 мкл; (2) экспериментальные параметры установлены следующими: диапазон температур с 25°С по 95°С, а скорость нагревания составляла 0,3°С/мин; (3) для анализа данных использовали программное обеспечение UNcle Analysis, среднее значение кривой изменения внутренней флуоресценции под УФ266 принимали за Tm, а температуру начала агрегации кривой изменения агрегации, формируемой сигналом статического светорассеяния под действием УФ266/Синий473, принимали за Tagg266 и Tagg473.

В Таблице 19 показаны результаты анализа термической стабильность слитого белка 6, который показал хорошую термическую стабильность.

6.3. Анализ термоускоренной стабильности слитого белка EGFR антитело/TGFβR2

После хранения образцов при 45°С в течение 1 недели, термоускоренную стабильность образцов анализировали с помощью SEC-ВЭЖХ и SDS-ПААГ, и процедура была такой же, как и в 6.1.

Результаты анализа термоускоренной стабильности слитого белка 6 показаны в Таблице 20. После 1 недели хранения при 45°С, SEC чистота слитого белка 6 снизилась на 0,7%, но чистота осталась высокой, уровень агрегатов увеличился в меньшей степени, а уровень фрагментов не изменился, что показало хорошую термоускоренную стабильность.

6.4. Анализ стабильности при замораживании/оттаивании слитого белка EGFR антитело/TGFβR2

Образцы хранили при -80°С в течение 3 часов, а затем помещали при 45°С на 1 час для оттаивания, и так осуществляли пять повторных замораживаний и оттаиваний. Стабильность образцов при замораживании/оттаивании анализировали с помощью SEC-ВЭЖХ, и процедура была такой же как и в 6.1.

Результаты стабильности слитого белка 6 при замораживании/оттаивании показаны в Таблице 21. После пяти последовательных замораживаний/оттаиваний, SEC чистота слитого белка 6 существенно не изменилась, а уровни агрегатов и фрагментов существенно не повысился, что продемонстрировало хорошую стабильность при замораживании/оттаивании.

6.5. Стабильность слитого белка EGFR антитело/TGFβR2 при встряхивании Образцы помещали в глубоколуночные планшеты и встряхивали на вортексном шейкере при 800 об./мин в течение 24 часов. Образцы анализировали с помощью SEC-ВЭЖХ по той же методике, что и в 6.1. Результаты приведены в Таблице 22, которые показывают, что чистота SEC образцов в отношении мономеров существенно не изменилась после 24 часов встряхивания, и уровни агрегатов и фрагментов существенно не изменились, указывая на то, что слитой белок 6 обладает хорошей стабильностью при встряхивании.

Пример 7: Конструирование и анализ свойств слитых белков антител X, направленных на антигены солидных опухолей, и TGFβR2, где часть TGFβR2 представляет собой укороченную форму TGFβR2 (слитой белок 6)

7.1 Конструирование вектора экспрессии слитого белка антитело Х/укороченный TGFβR2, экспрессия и очистка

Чтобы дополнительно оценить структурную стабильность и способность к нейтрализации TGF-β1 выбранных укороченных форм TGFβR2 в Примере 3.2, в этом Примере использовали различные антигены твердых опухолей в качестве нацеливающей части слитого белка и внеклеточный домен TGFβR2 (полноразмерный и делегированный ECD (6-26), слитой белок 6) в качестве иммуномодуляторной части слитого белка для образования слитого белка антитело Х/внеклеточный домен TGFβR2 (слитой белок X/TGβPR2). Аналогично описанному выше, в слитом белке X/TGFβR2 С-концевая аминокислота тяжелой цепи антитела X связана с внеклеточным доменом TGFβR2 посредством линкера (G₄S)₄. Дополнительно С-концевой лизин тяжелой цепи антитела X удаляли для снижения риска протеолитического расщепления. Протокол конструирования слитого белка X/TGFβR2 показан в Таблице 23.

С помощью ПЦР или ПЦР с перекрыванием амплифицировали целевой ген и лигировали его в указанный вектор экспрессии путем инфузии. Правильность последовательности рекомбинантного вектора экспрессии подтверждали секвенированием, плазмиды экстрагировали, транзиентно переносили в клетки HEK-293 (нокаут fut8), культивировали в течение 7 суток и супернатант собирали центрифугированием. Полученный клеточный супернатант очищали с помощью аффинной хроматографии с белком А для очистки слитого белка.

7.2. Деградация слитых белков антитело Х/укороченный TGFβR2

Чистоту, а также деградацию слитого белка X/TGFβR2 оценивали с помощью SDS-ПААГ в восстанавливающих условиях. Результаты приведены на Фиг. 31. Различные экспрессированные образцы слитых белков X/TGFβR2 с выбранными укороченными формами внеклеточного домена TGFβR2 были существенно более стабильными и имели намного меньше полос деградировавших продуктов, чем контрольные образцы с полноразмерным внеклеточным доменом TGFβR2. Следует признать, что стабильность образцов обусловлена присутствующими укороченными формами внеклеточного домена TGFβR2, независимо от того, какие виды нацеливающей части, т.е. антител, используются.

7.3. Тенденция деградации слитого белка антитело Х/укороченный TGFβR2

В этом Примере, супернатант клеток 293Е использовали для ускоренной обработки слитого белка, и стабильность в условиях деградации слитого белка X/TGFβR2 с выбранным укороченным внеклеточным доменом TGFβR2 дополнительно определяли как в Примере 3.3. Результаты анализа чистоты образца показаны на Фиг. 32, а чистота образца и процент отщепленных частей показаны в Таблице 24. Результаты указывают на то, что слитые белки X/TGFβR2 с предпочтительной укороченной формой внеклеточного домена TGFβR2 являются более устойчивыми к протеазной деградации, чем слитой белок с полноразмерной формой TGFβR2.

Для оценки стабильности слитых белков X/TGFβR2 с выбранным укороченным внеклеточным доменом TGFβR2 в условиях определенных концентраций, их стабильность при ультрафильтрации анализировали с использованием метода из Примера 6.1. Результаты приведены в Таблице 25. Слитой белок X/TGFβR2 с предпочтительным укороченным внеклеточным доменом TGFβR2 меньше подвержен деградации. После концентрирования процентное содержание отщепленных частей было менее 4,0% (чистота по SDS-ПААГ), что говорит о более высокой стабильности при ультрафильтрации, чем слитой белок X/TGFβR2 с полноразмерным внеклеточным доменом TGFβR2.

Таким образом, отличная стабильность слитого белка, содержащего предпочтительный укороченный внеклеточный домен TGFβR2, была дополнительно подтверждена с использованием слитых белков с несколькими типами антител против антигенов солидных опухолей в качестве нацеливающей части.

Пример 8: Биологические свойства in vitro слитых белков X/TGFβR2 с нацеливающими на антигены солидных опухолей антителами в качестве нацеливающей части и укороченным TGFβR2 (слитой белок 6)

8.1. Анализ связывания слитого белка X/TGFβR2

Способность к связыванию слитых белков X/TGFβR2 с TGF-β1 измеряли с помощью ИФА в соответствии с методом из Примера 3.4. Как показано на Фиг. 33, способность слитых белков X/TGFβR2 с предпочтительной укороченной формой TGFβR2 блокировать TGF-β1 была немного ниже, чем у слитого белка X/TGFβR2 с полноразмерной формой TGFβR2.

8.2. Анализ слитого белка X/TGFβR2 в нейтрализации TGF-β

Способность слитого белка X/TGFβR2 к нейтрализации TGF-β1 и TGF-β3 проверяли со ссылкой на Пример 3.5. Как показано на Фиг. 34, способность слитого белка X/TGFβR2 с предпочтительной укороченной формой TGFβR2 к нейтрализации как TGF-β1, так и TGF-β3 была выше, чем у слитого белка X/TGFβR2 с полноразмерной формой

8.3. Анализ связывания слитого белка X/TGFβR2 с мишенью части X

Антигены ERBB2-his, VEGF165, VEGFR2-His, CTLA4-his и EGFR-His, которые являются мишенью для нацеливающих частей X, в конечных концентрациях 10 нг/мл, 5 нг/мл, 80 нг/мл, 80 нг/мл, и 40 нг/мл, соответственно, наносили на 96-луночные планшеты в количестве 100 мкл на лунку. Планшеты покрывали ими в течение ночи при 4°С. Планшеты промывали на следующий день, блокировали при комнатной температуре в течение 1 часа и инкубировали с 100 мкл слитого белка X-TGFβR2 в конечной концентрации 13,89 нМ в течение 1 часа. Планшеты промывали для удаления несвязавшихся антител, инкубировали со вторичным антителом козы против hIgG Fc/HRP и повторяли отмывку. Наконец, раствор хромогенного субстрата добавляли для развития окраски, и считывали OD₄₅₀ с помощью микропланшетного ридера после окончания реакции. Как показано на Фиг. 35, слитой белок X/TGFβR2 с выбранным укороченным TGFβR2 обладал схожей способностью к блокированию соответствующего антигена со стороны части X в слитом белке X/TGFβR2, содержащем полноразмерную форму TGFβR2.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

ССЫЛОЧНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

1. Xie, E, и др. TGF-beta signaling in cancer metastasis. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2018. 50(1): p. 121-132.

2. Colak, S. и P. Ten Dijke. Targeting TGF-beta Signaling in Cancer. Trends Cancer, 2017. 3(1): p. 56-71.

3. Fabregat, I. и др. TGF-beta signaling in cancer treatment. Curr Pharm Des, 2014. 20(17): p. 2934-47.

4. Batlle, E. и J. Massague, Transforming Growth Factor-beta Signaling in Immunity and Cancer. Immunity, 2019. 50(4): p. 924-940.

5. Laskin, J.J. и A.B. Sandler, Epidermal growth factor receptor: a promising target in solid tumours. Cancer treatment reviews, 2004. 30(1): p. 1-17.

6. Hynes, N. и др. The ErbB receptor tyrosine family as signal integrators. Endocrine-related cancer, 2001. 8(3): p. 151-159.

7. Zandi, R. и др. Mechanisms for oncogenic activation of the epidermal growth factor receptor. Cellular signalling, 2007. 19(10): p. 2013-2023.

8. Seshacharyulu, P. и др. Targeting the EGFR signaling pathway in cancer therapy. Expert opinion on therapeutic targets, 2012. 16(1): p. 15-31.

9. Zhao, Y. и др. TGF -β transactivates EGFR and facilitates mammary cancer migration and invasion through canonical Smad3 and ERK/Sp1 signaling pathways. Molecular oncology, 2018.12(3): p. 305-321.

10. Wendt, M.K., J. A. Smith, и W.P. Schiemann, Transforming growth factors-induced epithelial-mesenchymal transition facilitates epidermal growth factor-dependent mammary cancer progression. Oncogene, 2010. 29(49): p. 6485.

11. Lee, E., и др. Transforming growth factorβ1 transactivates EGFR via an H₂O₂-dependent mechanism in squamous carcinoma cell line. Cancer letters, 2010. 290(1): p. 43-48.

12. Dunfield, L.D. и M.W. Nachtigal, Inhibition of the antiproliferative effect of TGFβ by EGF in primary human ovarian cancer cells. Oncogene, 2003. 22(30): p. 4745.

13. Kretzschmar, M. и др. A mechanism of repression of TGFβ/Smad signaling by oncogenic Ras. Genes & development, 1999. 13(7): p. 804-816.

14. ten Dijke, P., K. Miyazono, и C.-H. Heldin, Signaling inputs converge on nuclear effectors in TGF-β signaling. Trends in biochemical sciences, 2000. 25(2): p. 64-70.

15. Funaba, M., CM. Zimmerman, и L.S. Mathews, Modulation of Smad2-mediated signaling by extracellular signal-regulated kinase. Journal of Biological Chemistry, 2002. 277(44): p. 41361-41368.

16. Richter, P. и др. EGF/TGFbeta1 co-stimulation of oral squamous cell carcinoma cells causes an epithelial-mesenchymal transition cell phenotype expressing laminin 332. J Oral Pathol Med, 2011. 40(1): p. 46-54.

17. Uttamsingh, S. и др. Synergistic effect between EGF and TGF-beta1 in inducing oncogenic properties of intestinal epithelial cells. Oncogene, 2008. 27(18): p. 2626-34.

18. Xu, Z. и др. TGFbeta and EGF synergistically induce a more invasive phenotype of epithelial ovarian cancer cells. Biochem Biophys Res Commun, 2010. 401(3): p. 376-81.

19. Xiong, J. и др. Epidermal growth factor promotes transforming growth factor-beta 1-induced epithelial-mesenchymal transition in HK-2 cells through a synergistic effect on Snail. Mol Biol Rep, 2014. 41(1): p. 241-50.

20. Buonato, J.M., I.S. Lan, и M.J. Lazzara, EGF augments TGFbeta-induced epithelial-mesenchymal transition by promoting SHP2 binding to GAB1. J Cell Sci, 2015. 128(21): p. 3898-909.

21. Wang, Т. и др. The TGFβ-miR-499a-SHKBP1 pathway induces resistance to EGFR inhibitors in остеосаркома cancer stem cell-like cells. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2019. 38(1): p. 226.

22. Jie, H.B. и др. CTLA-4(+) Regulatory T Cells Increased in Cetuximab-Treated Head and Neck Cancer Patients Suppress NK Cell Cytotoxicity and Correlate with Poor Prognois. Cancer Res, 2015. 75(11): p. 2200-10.

23. Bedi, A. и др. Inhibition of TGF-beta enhances the in vivo antitumor efficacy of EGF receptor-targeted therapy. Mol Cancer Ther, 2012. 11(11): p. 2429-39.

24. Zhang, Y. и др. The canonical TGF-beta/Smad signalling pathway is involved in PD-L1-induced primary resistance to EGFR-TKIs in EGFR-mutant non-small-cell lung cancer. Respir Res, 2019. 20(1): p. 164.

25. Jones, S.T. и M.M. Bendig, Rapid PCR-cloning of full-length mouse immunoglobulin variable regions. Biotechnology (N Y), 1991. 9(6): p. 579.

26. Kabat, E.A. и др. Sequences of proteins of immunological interest. 1992: DIANE publishing.

27. Jones, P.T. и др. Replacing the complementarity-determining regions in a human antibody with those from a mouse. Nature, 1986. 321(6069): p. 522.

28. Verhoeyen, M. и L. Riechmann, Engineering of antibodies. BioEssays, 1988. 8(2 - 3): p. 74-78.

--->

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ

<110> SinoCellTech Ltd.

<120> МОЛЕКУЛА TGFбетаR2 С УКОРОЧЕННЫМ ВНЕКЛЕТОЧНЫМ ДОМЕНОМ, СЛИТОЙ БЕЛОК

МОЛЕКУЛЫ TGFбетаR2 С УКОРОЧЕННЫМ ВНЕКЛЕТОЧНЫМ ДОМЕНОМ И АНТИТЕЛА ПРОТИВ EGFR, И

ПРОТИВООПУХОЛЕВОЕ ПРИМЕНЕНИЕ СЛИТОГО БЕЛКА

<130> PCT69149SXB

<160> 190

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 645

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 1

Met Arg Pro Ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala

1 5 10 15

Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gln

20 25 30

Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gln Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe

35 40 45

Leu Ser Leu Gln Arg Met Phe Asn Asn Cys Glu Val Val Leu Gly Asn

50 55 60

Leu Glu Ile Thr Tyr Val Gln Arg Asn Tyr Asp Leu Ser Phe Leu Lys

65 70 75 80

Thr Ile Gln Glu Val Ala Gly Tyr Val Leu Ile Ala Leu Asn Thr Val

85 90 95

Glu Arg Ile Pro Leu Glu Asn Leu Gln Ile Ile Arg Gly Asn Met Tyr

100 105 110

Tyr Glu Asn Ser Tyr Ala Leu Ala Val Leu Ser Asn Tyr Asp Ala Asn

115 120 125

Lys Thr Gly Leu Lys Glu Leu Pro Met Arg Asn Leu Gln Glu Ile Leu

130 135 140

His Gly Ala Val Arg Phe Ser Asn Asn Pro Ala Leu Cys Asn Val Glu

145 150 155 160

Ser Ile Gln Trp Arg Asp Ile Val Ser Ser Asp Phe Leu Ser Asn Met

165 170 175

Ser Met Asp Phe Gln Asn His Leu Gly Ser Cys Gln Lys Cys Asp Pro

180 185 190

Ser Cys Pro Asn Gly Ser Cys Trp Gly Ala Gly Glu Glu Asn Cys Gln

195 200 205

Lys Leu Thr Lys Ile Ile Cys Ala Gln Gln Cys Ser Gly Arg Cys Arg

210 215 220

Gly Lys Ser Pro Ser Asp Cys Cys His Asn Gln Cys Ala Ala Gly Cys

225 230 235 240

Thr Gly Pro Arg Glu Ser Asp Cys Leu Val Cys Arg Lys Phe Arg Asp

245 250 255

Glu Ala Thr Cys Lys Asp Thr Cys Pro Pro Leu Met Leu Tyr Asn Pro

260 265 270

Thr Thr Tyr Gln Met Asp Val Asn Pro Glu Gly Lys Tyr Ser Phe Gly

275 280 285

Ala Thr Cys Val Lys Lys Cys Pro Arg Asn Tyr Val Val Thr Asp His

290 295 300

Gly Ser Cys Val Arg Ala Cys Gly Ala Asp Ser Tyr Glu Met Glu Glu

305 310 315 320

Asp Gly Val Arg Lys Cys Lys Lys Cys Glu Gly Pro Cys Arg Lys Val

325 330 335

Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser Leu Ser Ile Asn

340 345 350

Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser Ile Ser Gly Asp

355 360 365

Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr

370 375 380

Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys Thr Val Lys Glu

385 390 395 400

Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu Asn Arg Thr Asp

405 410 415

Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly Arg Thr Lys Gln

420 425 430

His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn Ile Thr Ser Leu

435 440 445

Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp Val Ile Ile Ser

450 455 460

Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn Trp Lys Lys Leu

465 470 475 480

Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser Asn Arg Gly Glu

485 490 495

Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala Leu Cys Ser Pro

500 505 510

Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val Ser Cys Arg Asn

515 520 525

Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn Leu Leu Glu Gly

530 535 540

Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile Gln Cys His Pro

545 550 555 560

Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr Gly Arg Gly Pro

565 570 575

Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly Pro His Cys Val

580 585 590

Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn Thr Leu Val Trp

595 600 605

Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys His Pro Asn Cys

610 615 620

Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys Pro Thr Asn Gly

625 630 635 640

Pro Lys Ile Pro Ser

645

<210> 2

<211> 54

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 2

tctagtggtg gcggtggttc gggcggtggt ggaggtggta gttctagatc ttcc 54

<210> 3

<211> 732

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 3

gatatccaga tgacccagtc tccagcctcc ctggctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60

atcacatgtc gagcaagtga gaacatttac tacagtttag cttggtatca gcagaaggaa 120

gggaaatctc ctcagctcct gatctatatt acaaacggct tggcagatgg tgtcccatcg 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacacag tattctatga agatcgacag catgcagcct 240

gaagataccg caacttattt ctgtaaacag tcttatgacg ttccgctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagatgaa atctagtggt ggcggtggtt cgggcggtgg tggaggtggt 360

agttctagat cttcccaggt gcagctgcag caatctggac ctgatttggt gaagcctggg 420

gcttcagtga ggatatcttg caaggtttct ggctacacct tcacaaccta ctatacacac 480

tgggtgaagc agaggcctgg acggggactt gaatggattg gatggattta tcctggagat 540

gttaatacga agtacaatga gaaattcaag ggcaaggcca cactgactgc agacaaaacc 600

tccagcacag cctacatgca gctcagcagc ctgacctctg aggactctgc ggtctatttc 660

tgtgcaagag aagaccccgg tagtaactac tttgactact ggggccaagg caccactctc 720

acagtctcct ca 732

<210> 4

<211> 357

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 4

caggtgcagc tgcagcaatc tggacctgat ttggtgaagc ctggggcttc agtgaggata 60

tcttgcaagg tttctggcta caccttcaca acctactata cacactgggt gaagcagagg 120

cctggacggg gacttgaatg gattggatgg atttatcctg gagatgttaa tacgaagtac 180

aatgagaaat tcaagggcaa ggccacactg actgcagaca aaacctccag cacagcctac 240

atgcagctca gcagcctgac ctctgaggac tctgcggtct atttctgtgc aagagaagac 300

cccggtagta actactttga ctactggggc caaggcacca ctctcacagt ctcctca 357

<210> 5

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 5

gatatccaga tgacccagtc tccagcctcc ctggctgcat ctgtgggaga aactgtcacc 60

atcacatgtc gagcaagtga gaacatttac tacagtttag cttggtatca gcagaaggaa 120

gggaaatctc ctcagctcct gatctatatt acaaacggct tggcagatgg tgtcccatcg 180

aggttcagtg gcagtggatc tgggacacag tattctatga agatcgacag catgcagcct 240

gaagataccg caacttattt ctgtaaacag tcttatgacg ttccgctcac gttcggtgct 300

gggaccaagc tggagatgaa a 321

<210> 6

<211> 993

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 6

gcaagcacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60

ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180

ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240

tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300

aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360

ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420

gaggtcacgt gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ccgaggtcaa gttcaactgg 480

tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540

agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600

gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660

aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720

ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780

gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840

ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900

cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960

cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tga 993

<210> 7

<211> 324

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 7

cgtacggtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60

ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120

tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240

aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300

agcttcaaca ggggagagtg ttag 324

<210> 8

<211> 119

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 8

Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Arg Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Tyr Thr His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Arg Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Thr Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Asp Pro Gly Ser Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser

115

<210> 9

<211> 107

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 9

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Tyr Ser

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Glu Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ile Thr Asn Gly Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Met Lys Ile Asp Ser Met Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Lys Gln Ser Tyr Asp Val Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Met Lys

100 105

<210> 10

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 10

Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Tyr Ser Leu Ala

1 5 10

<210> 11

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 11

Ile Thr Asn Gly Leu Ala Asp

1 5

<210> 12

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 12

Lys Gln Ser Tyr Asp Val Pro Leu Thr

1 5

<210> 13

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 13

Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Tyr Thr His

1 5 10

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 14

Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 15

<211> 12

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 15

Ala Arg Glu Asp Pro Gly Ser Asn Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 16

<211> 11

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 16

Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Tyr Ser Leu Ala

1 5 10

<210> 17

<211> 7

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 17

Ile Thr Asp Gly Leu Ala Asp

1 5

<210> 18

<211> 9

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 18

Lys Gln Ser Tyr Asp Val Pro Leu Thr

1 5

<210> 19

<211> 10

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 19

Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr Tyr Thr His

1 5 10

<210> 20

<211> 17

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 20

Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys

1 5 10 15

Gly

<210> 21

<211> 12

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 21

Ala Arg Glu Asp Pro Gly Ser Asn Tyr Phe Asp Tyr

1 5 10

<210> 22

<211> 449

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 22

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Tyr Thr His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Asp Pro Gly Ser Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe

115 120 125

Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu

130 135 140

Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp

145 150 155 160

Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu

165 170 175

Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser

180 185 190

Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro

195 200 205

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys

210 215 220

Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro

225 230 235 240

Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser

245 250 255

Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp

260 265 270

Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn

275 280 285

Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val

290 295 300

Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu

305 310 315 320

Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys

325 330 335

Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr

340 345 350

Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr

355 360 365

Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu

370 375 380

Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu

385 390 395 400

Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys

405 410 415

Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu

420 425 430

Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly

435 440 445

Lys

<210> 23

<211> 214

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 23

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Tyr Ser

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ile Thr Asp Gly Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Lys Ile Asp Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Asp Val Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala

100 105 110

Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly

115 120 125

Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala

130 135 140

Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln

145 150 155 160

Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser

165 170 175

Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr

180 185 190

Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser

195 200 205

Phe Asn Arg Gly Glu Cys

210

<210> 24

<211> 468

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 24

Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg

1 5 10 15

Val Leu Ser Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Thr Tyr Tyr Thr His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Ile Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Val Asn Thr Lys Tyr Asn

65 70 75 80

Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Asp Pro Gly Ser Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp

115 120 125

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

130 135 140

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr

145 150 155 160

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

165 170 175

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

180 185 190

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

195 200 205

Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn

210 215 220

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser

225 230 235 240

Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu

245 250 255

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

260 265 270

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

275 280 285

His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

290 295 300

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr

305 310 315 320

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

325 330 335

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro

340 345 350

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

355 360 365

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val

370 375 380

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

385 390 395 400

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

405 410 415

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr

420 425 430

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

435 440 445

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

450 455 460

Ser Pro Gly Lys

465

<210> 25

<211> 233

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 25

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala

20 25 30

Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile

35 40 45

Tyr Tyr Ser Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln

50 55 60

Leu Leu Ile Tyr Ile Thr Asp Gly Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg

65 70 75 80

Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Lys Ile Asp Ser

85 90 95

Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Asp

100 105 110

Val Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr

115 120 125

Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu

130 135 140

Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro

145 150 155 160

Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly

165 170 175

Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr

180 185 190

Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His

195 200 205

Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val

210 215 220

Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

225 230

<210> 26

<211> 19

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 26

Met Gly Trp Ser Leu Ile Leu Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Thr Arg

1 5 10 15

Val Leu Ser

<210> 27

<211> 19

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 27

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser

<210> 28

<211> 119

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 28

Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala

1 5 10 15

Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Thr Tyr

20 25 30

Tyr Thr His Trp Val Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Trp Ile Tyr Pro Gly Asp Val Asn Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe

50 55 60

Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Asp Pro Gly Ser Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly

100 105 110

Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

<210> 29

<211> 107

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 29

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Tyr Ser

20 25 30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile

35 40 45

Tyr Ile Thr Asp Gly Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly

50 55 60

Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Lys Ile Asp Ser Leu Gln Pro

65 70 75 80

Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Lys Gln Ser Tyr Asp Val Pro Leu

85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

100 105

<210> 30

<211> 330

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 30

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys

1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr

65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

85 90 95

Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys

100 105 110

Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro

115 120 125

Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys

130 135 140

Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp

145 150 155 160

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu

165 170 175

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu

180 185 190

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn

195 200 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

210 215 220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

245 250 255

Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

260 265 270

Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

275 280 285

Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

290 295 300

Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

305 310 315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330

<210> 31

<211> 107

<212> PRT

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 31

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1 5 10 15

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

20 25 30

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

35 40 45

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

50 55 60

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

65 70 75 80

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

85 90 95

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

100 105

<210> 32

<211> 1407

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 32

atgggctggt ccctgattct gctgttcctg gtggctgtgg ctaccagggt gctgagtgag 60

gtccaacttg tccagtctgg agcagaggtg aagaagcctg gagccacagt gaagatttcc 120

tgtaaggtgt ctggctacac cttcaccacc tactacaccc actgggtgaa gcaggctcct 180

ggcaagggat tggagtggat tggctggatt taccctggag atgtgaacac caaatacaat 240

gagaagttca agggcagggt gaccctgaca gcagacacca gcacagacac agcctatatg 300

gaactgtcct ccctgaggtc tgaggacaca gcagtctact actgtgccag ggaggaccct 360

ggcagcaact actttgacta ctggggacaa ggcaccctgg tgacagtgtc cagcgcaagc 420

accaagggcc catcggtctt ccccctggca ccctcctcca agagcacctc tgggggcaca 480

gcggccctgg gctgcctggt caaggactac ttccccgaac cggtgacggt gtcgtggaac 540

tcaggcgccc tgaccagcgg cgtgcacacc ttcccggctg tcctacagtc ctcaggactc 600

tactccctca gcagcgtggt gaccgtgccc tccagcagct tgggcaccca gacctacatc 660

tgcaacgtga atcacaagcc cagcaacacc aaggtggaca agaaagttga gcccaaatct 720

tgtgacaaaa ctcacacatg cccaccgtgc ccagcacctg aactcctggg gggaccgtca 780

gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga tctcccggac ccctgaggtc 840

acgtgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa gaccccgagg tcaagttcaa ctggtacgtg 900

gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 960

taccgtgtgg tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 1020

aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1080

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1140

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1200

gagtgggaga gcaatgggca gccggagaac aactacaaga ccacgcctcc cgtgctggac 1260

tccgacggct ccttcttcct ctacagcaag ctcaccgtgg acaagagcag gtggcagcag 1320

gggaacgtct tctcatgctc cgtgatgcat gaggctctgc acaaccacta cacgcagaag 1380

agcctctccc tgtctccggg taaatga 1407

<210> 33

<211> 702

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 33

atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggagt gcatagtgac 60

atccagatga cccagagccc atcctccctg tctgcctctg tgggagacag ggtgaccatc 120

acttgtaggg catctgagaa catctactac tccctggctt ggtatcaaca gaagcctggc 180

aaggctccac agctgctgat ttacatcacc gacggactgg ctgatggagt gccaagcagg 240

ttctctggct ctggctctgg cacagactac accctgaaga tcgactccct ccaacctgag 300

gactttgcca cctactactg taagcagtcc tatgatgtgc cactgacctt tggaggaggc 360

accaaggtgg agattaagcg tacggtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct 420

gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc 480

agagaggcca aagtacagtg gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag 540

agtgtcacag agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 600

agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg 660

agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt ga 702

<210> 34

<211> 57

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 34

atgggctggt ccctgattct gctgttcctg gtggctgtgg ctaccagggt gctgagt 57

<210> 35

<211> 57

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 35

atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggagt gcatagt 57

<210> 36

<211> 357

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 36

gaggtccaac ttgtccagtc tggagcagag gtgaagaagc ctggagccac agtgaagatt 60

tcctgtaagg tgtctggcta caccttcacc acctactaca cccactgggt gaagcaggct 120

cctggcaagg gattggagtg gattggctgg atttaccctg gagatgtgaa caccaaatac 180

aatgagaagt tcaagggcag ggtgaccctg acagcagaca ccagcacaga cacagcctat 240

atggaactgt cctccctgag gtctgaggac acagcagtct actactgtgc cagggaggac 300

cctggcagca actactttga ctactgggga caaggcaccc tggtgacagt gtccagc 357

<210> 37

<211> 321

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 37

gacatccaga tgacccagag cccatcctcc ctgtctgcct ctgtgggaga cagggtgacc 60

atcacttgta gggcatctga gaacatctac tactccctgg cttggtatca acagaagcct 120

ggcaaggctc cacagctgct gatttacatc accgacggac tggctgatgg agtgccaagc 180

aggttctctg gctctggctc tggcacagac tacaccctga agatcgactc cctccaacct 240

gaggactttg ccacctacta ctgtaagcag tcctatgatg tgccactgac ctttggagga 300

ggcaccaagg tggagattaa g 321

<210> 38

<211> 993

<212> ДНК

<213> Искусственная

<220>

<223> Последовательность синтезирована искусственно

<400> 38