Способ идентификации уропатогенных Enterococcus faecalis у детей Российский патент 2023 года по МПК C12Q1/02 C12N1/20 C12R1/01 

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано как в научно-исследовательской, так и в практической работе широкого круга специалистов для оценки и выявления диагностической значимости штаммов фекальных энтерококков.

В последнее время условно-патогенные Enterococcus faecalis все чаще являются причиной гнойно-септических и оппортунистических инфекций. Энтерококки способны вызывать эндокардиты, раневые инфекции, неонатальный сепсис, менингиты, инфекции мочевыделительной системы (ИМС). Анализ отечественных и зарубежных источников отражает высокий уровень высеваемости (от 6,1% до 75%) Е. faecalis из мочи у детей (Михеева Н.М., 2012; Мельникова Е.А., 2015; Raupach Т., 2020). Известно, что уропатогенность - это полидетерминированная характеристика, обусловленная комплексом патогенетически значимых факторов, экспрессия которых меняется в зависимости от стадии инфекционного процесса. Уропатогенные Е. faecalis способны колонизировать очаг инфекции, адаптироваться к изменениям в доступности питательных веществ и уклоняться от защитных механизмов иммунной системы хозяина.

Подтверждение этиологической значимости при выявлении условно-патогенных Е. faecalis в моче у детей представляет собой большую сложность.

На сегодняшний день диагностическое значение в постановке диагноза имеет бактериологического исследования мочи с определением количества выделенных бактерий (моно- или смешанная культура), их титра в моче (Клинические рекомендации «Бактериологическое исследование мочи» Федерация лабораторной медицины, Москва, 2014; Бактериологический анализ мочи: руководство по клинической лабораторной диагностики [Электронный ресурс] / Р.С. Козлов, В.В. Меньшиков, В.С. Михайлова [и др.]. - М., 2013. - 33 с.

Для выделения и идентификации клинически значимых условно-патогенных микроорганизмов (УПМ), в т.ч. Е. faecalis, в микробиологических лабораториях широко используются разнообразные селективные питательные среды отечественного и зарубежного производства:

1) питательная среда для выделения энтерококков (Меджидов М.М. Справочник по микробиологическим питательным средам // Москва: Медицина, 2003, 208 с);

2) хромогенная питательная среда для одноэтапного выделения и идентификации возбудителей уроинфекций (патент РФ №2534342, Горелова В.Г. [и др.], 27.11.2014);

3) питательная среда фирмы "Fluka" - HiCrom UTI Agar/Modified (HiMedia Laboratories, Индия);

4) селективные хромогенные среды ChromIDTMVRE (BioMerieux, Франция), VRESelect(Bio-Rad Laboratories, США), Spectra VRE (Remel, США), желчно-эскулиновый агар (HiMedia Laboratories, Индия), агар BEAV (Bile Esculin Azide agar with 6 or 8 μg/mL of Vancomycin) (Thermo Fisher Scientific, Lenexa, США) и др., которые применяют для скрининга ванкомицинрезистентных энтерококков (VRE) (Федорова А.В., Клясова Г.А. Использование селективной хромогенной среды для детекции ванкомицинорезистентных энтерококков // КМАХ, 2018, т. 20, №1, с. 55-61).

Недостатком этих питательных сред, является то, что при использовании этих сред на одной чашке Петри, можно определить и идентифицировать по различной окраске колоний разнообразные клинически значимые уропатогенные бактерии, без оценки их патогенного потенциала и значимости в инициации данного инфекционного процесса.

Патогенный потенциал описан только для некоторых возбудителей ИМС, без учета значимости Е. faecalis (Gao Q, Zhang D, Ye Z, et al. Virulence traits and pathogenicity of uro-pathogenic Escherichia coli isolates with common and uncommon О serotypes // Microb Pathog, 2017, №104, p.217-224, doi:10.1016/j.micpath.2017.01.027; Жабченко, И. А. Особенности функционирования и факторы вирулентности уропатогенных штаммов Esherichia coli и их значение в клинической практике // Репродуктивное здоровье. Восточная Европа, 2013, №4 (28), с. 74-80). Поэтому дальнейшая оценка диагностической значимости возбудителя проводится лишь по степени бактериурии.

В настоящее время в лабораторной практике при бактериологическом исследовании дючи широко используются способы оценки степени микробной обсемененности мочи (Клинические рекомендации «Бактериологическое исследование мочи» ФЛМ, Москва, 2014; Бактериологический анализ мочи: руководство по клинической лабораторной диагностики [Электронный ресурс] / Р. С.Козлов, В. В. Меньшиков, В. С.Михайлова [и др.]. - М., 2013. - 33 с.:

а) микроскопические (микроскопия окрашенного по Граму осадка мочи с использованием предметного стекла и с использованием слайд-планшетов);

б) обнаружения продуктов метаболизма бактерий (нитритный тест и тест с хлористым трифенилтетразолием).

При этом микроскопические методы используются только для качественной оценки (подтверждения наличия или отсутствия) микробиоты, и, чем ниже титр микроба в моче, тем ниже чувствительность и специфичность данных методов.

Обнаружение в моче продуктов метаболизма бактерий (Метод обнаружения нитритов) - тест, который служит косвенным подтверждением наличия у пациента бактериурии, но не дает оснований для постановки, окончательного диагноза, не используется для энтерококков, так как эти микроорганизмы такой способностью не обладают, что ограничивает информативность теста.

Известен способ дифференциации микрофлоры урогенитального тракта человека (патент РФ №2260054, Иванов Ю.Б. [и др.], 10.09.2005), который осуществляют путем забора исследуемого материала, его посева на селективные питательные среды (Columbia-agar, среда Эндо, желточно-солевой агар), выделения и идентификации чистых культур микроорганизмов, определения у выделенных микроорганизмов способности к инактивации антимикробного белка тромбоцитов.

Недостатком данного способа является то, что необходимо выделять у каждого вида микроорганизма антимикробный фактор тромбоцитов и по наличию его в определенной концентрации в каждом из микробов или отсутствии можно судить о том, агрессивен ли микроб или он относится к нормальной флоре. Методика сложная, трудоемкая и не применима в широкой практике клинических лабораторий, и можно использовать ее только в научно-исследовательских целях.

Существует метод диагностики определения бактериологической обсемененности мочи, секрета предстательной железы и эякулята (патент РФ №2452774, Набока Ю.Л. [и др.], 10.06.2012), который включает в себя забор материала, его посева на селективные питательные среды (хромогенный селективный агар для энтерококков (HiMedia, Индия)), выделения и идентификации культур микроорганизмов. Использование хромогенной среды позволяет быстро дифференцировать энтерококки в моче, секрете предстательной железы, эякуляте, так как они специфически, расщепляют присутствующие в среде хромо-генного субстрата углеводы и по цвету колоний достаточно быстро и просто определить наиболее значимые роды (Enterococcus faecium, Е. faecalis, Е. hirae).

Недостатком данного способа является то, что выявляется лишь сам факт присутствия некоторых наиболее значимых родов энтерококка в моче, без оценки его клинической (диагностической) значимости.

Наиболее близких аналогов заявленному способу из уровня техники не выявлено.

Разработанный нами способ определения диагностической значимости фекальных энтерококков, участвующих в развитии и хронизации ИМС у детей, направлен на комплексное определение некоторых, потенциально важных биологических свойств возбудителя: ферментативной активности, связанной с патогенностью и биохимической активностями, антибиотикорезистентностью не только на фенотипическом, но и на генетическом уровне, что в свою очередь приведет к снижению процента неадекватной антибактериальной терапии при транзиторной бактериурии / случайном попадании энтерококка в мочу, и значительно снизит сроки пребывания пациента в стационаре, уменьшит затраты и повысит качество оказываемой медицинской помощи.

Задачи, решаемые изобретением: разработка способа оценки диагностической значимости фекальных энтерококков, участвующих в формировании инфекционной патологи мочевых путей у детей.

Поставленные задачи решаются следующим образом:

1) отбор исследуемого материала (мочи),

2) его посев на селективные питательные среды (хромогенные агары, используемые в работе практической микробиологической лаборатории),

3) выделение чистых культур микроорганизмов,

4) идентификация фекальных энтерококков по фенотипическим свойствам (оценка ферментативной активности) - определение биохимической активности (в отношении лактозы, маннита, рамнозы), гемолитической и протеолитической (в отношении ферментации молока) активностей, которые проводят классическими микробиологическими методами, коммерческими тест-системами, автоматическими микробиологическими анализаторами или масс-спектрометрическим анализом, внедренными в повседневную практику работы лабораторий;

5) определение с помощью диско-диффузионного метода чувстительности Е. faecalis к антимикробным препаратам из групп аминогликозидов (гентамицину), фторхи-нолонам (норфлоксацину и/или левофлоксацину), сульфаниламидам (тримето-прим/сульфаметоксазолу);

6) определение с помощью полимеразной цепной реакции наличие генов пато-генности (aggA, су/А) и антибиотикорезистентности (aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia).

Существенным отличием предлагаемого технического решения является:

- комплексная оценка микробиологических свойств выделенного фекального энтерококка на фенотипическом и генетическом уровнях;

- возможность определения диагностической значимости Е. faecalis, выделенных у детей при инфекции мочевыводящих путей.

В результате этого достигается:

- правильная оценка этиологической значимости Е. faecalis, выделенных из мочи у детей с ИМС;

- снижение процента неадекватной антибактериальной терапии при транзиторной бактериурии / случайном попадании энтерококка в мочу,

- уменьшение затрат и повышение качества оказываемой медицинской помощи. Пример выполнения технического решения.

В работе была исследована коллекция фекальных энтерококков (n=51), полученных из мочи у детей при ИМС, с целью выявления особенностей проявления биологических свойств на фено- и генетическом уровне (фиг. 1, 2).

Были определены фенотипические особенности проявлений биологических свойств фекальных энтерококков, полученных из мочи у детей при ИМС: наличие ферментации маннита, ее отсутствие в отношении рамнозы, наличие/отсутствие ферментации лактозы, наличие/отсутствие гемолитической и протеолитической активностей.

С помощью ПЦР коллекция изучаемых Е. faecalis была протестирована на наличие наиболее изученных генов, участвующих на разных этапах инфекционного процесса (кодирующих адгезию и инвазию (aggA, esp, efaA), синтез желатиназы (gelE), активатор цитолизина (су/А) и усилитель экспрессии феромона (esp)).

С помощью ПЦР коллекция мочевых изолятов Е. faecalis была протестирована на наличие генов, кодирующих адгезию и инвазию (aggA, esp, efaA), синтез желатиназы (gelE), активатор цитолизина (су/А) и усилитель экспрессии феромона (esp), а также на наличие шести генов (tetM, tetL, ermB, ant(6')-Ia, aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia и vanB), кодирующие резистентность к антибактериальным препаратам, ответственные за различные механизмы устойчивости.

Используя статистические методы анализа (STATISTICA 13 (StatSoft, Inc., США) и Excel (Microsoft Office 2010) были установлены значимые связи между наличием генов патогенности, антибиотикорезистентности и фенотипическими проявлениями биологических свойств у мочевых изолятов Е. faecalis (фиг. 3).

Для оценки этиологической значимости и выявления высоковирулентных Е. faecalis было проведено мультилокусное сиквенс типирование (MLST) изучаемой коллекции. Принадлежность энтерококков к определенным дискретным линиям ассоциируется с повышенной вирулентностью, антибиотикорезистентностью и риском распространения их в больничной среде (Freitas A. R., 2009, A. Kuch, 2012).

Отмечено, что уроштаммы Е. faecalis определенного сиквенс-типа или клонального комплекса характеризуются особенностями фенотипических проявлений биологических свойств и наличием определенных генов (табл. 1).

Учитывая, что среди мочевых изолятов Е. faecalis превалируют определенные сиквенс-типы с характерными проявлениями биологических свойств, способствующих развитию инфекции в уротракте, мы отнесли их к этиологически значимым при ИМС у детей - ST179, ST16 и ST537 (входящие в СС16), ST6 и ST774.

Таким образом, определены диагностические микробиологические биомаркеры, характерные для этиологически значимых и высоковирулентных штаммов Е. faecalis (фиг. 4):

1) для этиологически значимых Е. faecalis - ферментация маннита, лактозы, и ее отсутствие в отношении рамнозы, желатины, наличие гемолитической активности, чувствительность к фторхинолонам II и III поколения (норфлоксацину, левофлоксацину), детекция cylA и отсутствие aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia генов;

2) для высоковирулентных штаммов - расщепление маннита, отсутствие ферментации рамнозы и гемолитической активности, наличие гистоповреждающих субстанций (протеаз), резистентность к трем классам АБП (фторхинолонам, аминогликозидам, сульфаниламидам), детекция aggA и отсутствие cylA генов.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 1.

На фиг. 1 изображена ферментативная активность, связанная с биохимической активностью, у Е. faecalis (n=51), выделенных из мочи детей с ИМС.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 2.

На фиг. 2 изображена ферментативная активность, связанная с патогенностью, у Е. faecalis, выделенных из мочи детей с ИМС.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 3.

На фиг. 3 изображена связь фенотипических и генетических свойств Е. faecalis, изолированных из мочи детей с ИМС

Примечание: *р<0.0005; **р<0.005; ***р<0.05.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг. 4.

На фиг. 4 показан алгоритм оценки этиологически значимых и высоковирулентных Е. faecalis.

Изобретение относится к медицинской микробиологии. Предложен способ идентификации уропатогенных Enterococcus faecalis, выделенных из мочи у детей при инфекциях мочевыделительной системы, включающий отбор исследуемого материала, выделение чистых культур микроорганизмов посевом на селективные питательные среды и при сравнении проявлений биологических свойств определение диагностических биомаркеров, характерных для этиологически значимых или высоковирулентных штаммов Е. faecalis: для этиологически значимых Е. faecalis - ферментация маннита, лактозы, ее отсутствие в отношении рамнозы, желатины, наличие гемолитической активности, чувствительность к фторхинолонам II и III поколения, детекция cylA и отсутствие aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia генов; для высоковирулентных штаммов - расщепление маннита, отсутствие ферментации рамнозы и гемолитической активности, наличие гистоповреждающих субстанций, резистентность к трем классам АБП (фотохинолонам, аминогликозидам, сульфаниламидам), детекция aggA и отсутствие cylA генов. Способ обеспечивает оценку этиологической значимости Е. faecalis, выделенных из мочи у детей, и адекватность антибактериальной терапии. 4 ил., 1 табл., 1 пр.

Способ идентификации уропатогенных Enterococcus faecalis, выделенных из мочи у детей при инфекциях мочевыделительной системы, включающий отбор исследуемого материала, выделение чистых культур микроорганизмов посевом на селективные питательные среды, определение ферментативной гемолитической и протеолитический активности, связанной с патогенностью, биохимической активности в отношении лактозы, маннита, рамнозы, оценку чувствительности/резистентности с помощью диско-диффузионного метода к антимикробным препаратам из групп аминогликозидов (гентамицину), фторхинолонам (норфлоксацину и/или левофлоксацину), сульфаниламидам (тримето-прим/сульфаметоксазолу), определение с помощью полимеразной цепной реакции наличия генов патогенности aggA, cylA и антибиотикорезистентности - aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia и при сравнении проявлений биологических свойств определение диагностических биомаркеров, характерных для этиологически значимых или высоковирулентных штаммов Е. faecalis:

- для этиологически значимых Е. faecalis - ферментация маннита, лактозы и ее отсутствие в отношении рамнозы, желатины, наличие гемолитической активности, чувствительность к фторхинолонам II и III поколения (норфлоксацину, левофлоксацину), детекция cylA и отсутствие aac(6')-Ie-aph(2'')-Ia генов;

- для высоковирулентных штаммов - расщепление маннита, отсутствие ферментации рамнозы и гемолитической активности, наличие гистоповреждающих субстанций (протеаз), резистентность к трем классам АБП (фотохинолонам, аминогликозидам, сульфаниламидам), детекция aggA и отсутствие cylA генов.