ШТАММ БАКТЕРИЙ ЭНТЕРОАГРЕГАТИВНЫХ ДИАРЕЕГЕННЫХ ESCHERICHIA COLI SEROVAR ONT:H30, ДЕПОНИРОВАННЫЙ В ГОСУДАРСТВЕННОЙ КОЛЛЕКЦИИ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ И КЛЕТОЧНЫХ КУЛЬТУР "ГКПМ-ОБОЛЕНСК" ПОД НОМЕРОМ В-8857 Российский патент 2023 года по МПК C12N1/20 

Изобретение относится к областям медицинской микробиологии (бактериологии), а именно к разделу молекулярно-генетическая идентификация штаммов Escherichia coli, вирулентность и патогенность микроорганизмов.

Энтероагрегативные Е. coli (EAgEC) новая, малоизученная патогруппа диареегенных Е. coli (DEC). Штаммы являются возбудителями острых кишечных инфекций (ОКИ) детей и взрослых во всех странах. В настоящее время общепризнано, что EAgEC - инфекция относится к антропонозам, резервуаром и источником инфекции является человек. EAgEC характеризуются специфичным феноменом агрегационной адгезии (АА) к эпителиальным клеткам Нер-2 в виде «сложенных кирпичей/кирпичной кладки». Обнаружение феномена АА in vitro является «золотым стандартом» для детекции штаммов этой патогруппы, но требует специальных средств и занимает много времени. Штаммы EAgEC отличает от других классических патогрупп DEC (энтеропатогенных - ЕРЕС, энтеротоксигенных - ЕТЕС, энтероинвазивных - EIEC, шигатоксинпродуцирующих - STEC) широкая вариабельность антигенных свойств и генетических маркеров вирулентности. Эксперименты in vitro, in vivo и ex vivo убедительно показали, что EAgEC могут адгезироваться с эпителиальными клетками тощей, подвздошной и толстой кишки, образуя прочную биопленку с последующим цитотоксическим и провоспалительным действием. Патогенез заболевания включает три этапа: (а) обильное прилипание к слизистой оболочке кишечника, (б) продукция цитотоксинов и энтеротоксинов, (в) индукция воспаления слизистой оболочки. Для первого этапа необходимо наличие фимбриальных и афимбриальных адгезинов. У штаммов EAgEC идентифицировано несколько факторов колонизации. Этап адгезии характеризуется повышенной секрецией слизи, которая приводит к образованию прочной биопленки, в которую «встроены» EAgEC. На следующем этапе EAgEC оказывают цитотоксическое действие на слизистую оболочку кишечника за счет секреции токсинов, вызывая везикуляцию микроворсинок и экструзию эпителиальных клеток. Воспаление, вызванное EAgEC, является результатом обильной колонизации слизистой оболочки кишечника.

Большое количество штаммов в R-форме среди EAgEC является препятствием при серотипировании, приводящим к большому количеству не типируемых штаммов. Тем не менее, в настоящее время описаны штаммы 11 серологических групп (и серовариантов) EAgEC: O3:Н2; O7:Н-; O15:Н18; O44:Н18; O51:Н11; O77:Н18; O86:Н-; O86:Н2; ОП1:Н21; O126:Н27; O127:Н2; O144:Н49; ONT:H21; ONT:H33, однако они не являются единственными для этой патогруппы DEC.

Исторически сложившимся и традиционным для диагностики ОКИ, обусловленных DEC, в бактериологических лабораториях является культуральный метод микробиологического исследования. Однако его практическая ценность (возможность дальнейшего фенотипического и молекулярного изучения выделенного штамма) имеет ряд принципиальных недостатков, таких как: наличие в пробах испражнений авирулентных штаммов Е. coli, численно превалирующих над DEC, при отсутствии культуральных особенностей колоний DEC от Е. coli - представителей нормобиоты кишечника; отсутствие фенотипических и биохимических признаков, коррелирующих с иатогенностью; длительность исследования и высокая стоимость; требования к профессиональной квалификации специалиста.

До настоящего времени «золотым стандартом» для определения серологической группы и серологического варианта штаммов Е. coli считали метод серологического типирования с использованием О-, ОК- и Н-агглютинирующих сывороток. В бактериологических лабораториях критерием дифференциации патогенных штаммов Е. coli от непатогенных служат их антигенные свойства. Идентификация штаммов Е. coli ограничивается определением только соматических О- антигенов, т.е. установлением принадлежности к О- группе, что по критериям качества оказания медицинской помощи и принципам доказательной медицины является недостаточным, т.к. каждая О- группа включает большое число сероваров клиническая и эпидемиологическая значимость которых неодинакова. Идентификация выделенного штамма Е. coli только по О-антигену без определения Н-антигена делает невозможным проведение достоверного эпидемиологического расследования. В Российской Федерации серотипирование Е. coli по Н-антигену в рутинной практике не проводят, из-за отсутствия отечественных Н-сывороток. Значимый прогресс в лабораторной диагностике связан с разработкой быстрых и надежных молекулярных методов (молекулярное серотипирование), унифицирует и удешевляет определение антигенной характеристики штаммов Е. coli. К ним относят: метод анализа полиморфизма длин фрагментов рестрикции (RFLP) амплифицированных генов rfb и fliC, контролирующих синтез О - и Н-антигенов и ПЦР с использованием праймеров к известным О- и Н -антигенам.

Отсутствие к настоящему времени контрольных тест-штаммов для фенотинических и молекулярных исследований штаммов Escherichia coli, принадлежащих к патогруппе EAgEC серологическому варианту H30, обусловило необходимость процедуры патентования штамма Е, coli ONT:H30 В-8857.

Антигенная характеристика, детекция генов и факторов патогенности и вирулентности штаммов Е. coli, является необходимым условием правильности интерпретации лабораторного анализа и эпидемиологических заключений, от которых зависит адекватная эффективность профилактических и противоэпидемических мероприятий. Предложенный штамм Escherichia coli serovar ONT:H30 B-8857, характеризующийся наличием генов fliC₃₀, определяющих серотиповую принадлежность, генов аар, aar, aggA, aggB, aggC, capU, кодирующих факторы вирулентности энтероагрегативных Е. coli, может быть использован в качестве контрольного тест-штамма.

Задача изобретения - обеспечение лабораторных работников клинико-диагностических лабораторий, Центров гигиены и эпидемиологии, контрольным тест-штаммом Escherichia coli serovar ONT:H30 B-8857, необходимым для адекватного проведения бактериологических и молекулярно-генетических исследований, предъявляемых СанПиН 3.3686-21 «Санитарно-эпидемиологические требования по профилактике инфекционных болезней» Технический результат предлагаемого изобретения заключается в расширении арсенала средств, используемых при лабораторной диагностике энтероагрегативных Escherichia coli серологического варианта H30.

Сущность изобретения: заключается в том, что получен контрольный тест-штамм для детекции энтероагрегативных диареегенных Escherichia coli и сравнительного изучения генетического родства штаммов данной патогруппы.

Способ получения: Заявляемый штамм выделен от взрослого жителя г. Самара, с гистоморфологически установленным диагнозом «язвенный колит». Идентифицирован до вида Escherichia coli бактериологическим, масс-спектрометрическими и молекулярно-генетическими методами. Антигенная характеристика штамма Escherichia coli ONT:H30 установлена при анализе данных полногеномного секвенирования на приборе MiSeq с использованием наборов реагентов MiSeqReagentKit v2 и Nextera XT (Illumina, США) при помощи веб-базы SerotypeFinder (http://www.genomicepidemiology.org). Генетические маркеры вирулентности, выявляли в ПЦР со специфическими праймерами и подтверждали при анализе данных полногеномного секвенирования, с использованием платформы VirulenceFinder (http://www.genomicepidemiology.org). Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-8857.

Характеристика штамма Escherichia coli serovar ONT:H30 B-8857

Морфологические признаки: подвижные грамотрицательные палочки с закругленными концами, не образуют спор, капсулу и пигмент, неподвижные.

Патогенные свойства: штамм патогенный для человека, IV группа патогенности согласно СанПиН 3.3686-21.

Культуральные свойства: факультативный анаэроб, каталазоположительный, оксидозоотрицательный, не прихотлив к питательным средам. Температурный оптимум 37°С при рН 7,2-7,4. На жидких средах дает обильный рост при значительном помутнении среды. Образует пристеночное кольцо, пленку на поверхности жидкой питательной среды не образует. На плотных питательных средах (МПА, Эндо, Плоскирева, Левина) колонии круглые выпуклые, средней величины влажные с гладкой блестящей поверхностью и ровным краем.

Антигенная характеристика: штамм имеет неизвестный О - антиген, не идентифицированный в базе содержащей сведения о 188 антигенах, Н - антиген 30. Полная антигенная формула Escherichia coli ONT:H30.

Основные свойства штамма:

- по морфологическим и ферментативным свойствам относится биохимически активному варианту Escherichia coli (подвижный, ферментирует до кислоты и газа глюкозу, лактозу, сахарозу, арабинозу, мальтозу, ксилозу, рамнозу, утилизирует маннит, дульцит, сорбит и салицин, декарбоксилирует орнитин, лизин и аргинин;

- наличие Н-антигена 30;

- имеет семь генов вирулентности: аар, aar, aggA, aggB, aggC, aggD, cap U.

- характеризуется широким спектром множественной лекарственной устойчивости на фоне наличия генетических детерминант резистентности к антибиотикам бета-лактамного ряда - blaCTX-М-15, blaTEM-1В; аминогликозидам: ААС(3)-Ila, ААС(6')-1b-кр, aadAl, aadA5, APH(3'')-Ib, APH(6)-Id, aadA1; макролидам - Mdf(A), mph(A); хлорамфениколу - catB3; сульфаниламидам - sul1, sul2; тетрациклину - Tet(D); триметоприму - dfrA1, dfrA17.

- является возбудителем острой кишечной инфекции.

Изобретение реализуется следующим образом.

Пример 1 Детекция генов, кодирующих синтез антигена H30 методом ПЦР

Выделение бактериальной ДНК для использования в ПЦР с последующим анализом амплификации в агарозном геле проводили с использованием наборов «InstaGeneMatrix» (BioRad, США), «АмплиПраймРИБО-преп» (НекстБио, Россия) согласно инструкциям производителей и методом кипячения. Для детекции гена (fliC), кодирующего Н-антиген 30, использовали ПЦР с последующей электрофоретической детекцией продуктов амплификации с заимствованными опубликованными последовательностями праймеров. Стабильность наличия генов flic₃₀ в геноме подтверждалась повторным проведением «молекулярного серотипирования». Установлено, что штамм Escherichia coli serovar ONT:H30 B-8857 давал стабильные повторные результаты независимо от способа выделения ДНК.

Пример 2. Детекция генов, кодирующих синтез антигенов О- и Н- на основе анализа полногеномного секвенирования (WGS)

Выделение ДНК из исследуемого Escherichia coli serovar ONT:H30 - 8857 проводили с использованием набора QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) согласно инструкции производителя. Качество полученной ДНК оценили путем электрофореза в 0,5хТВЕ-буфере в 1,5% агарозном геле. Количество ДНК (длина волны 260 нм) титровали с помощью спектрофотометра QIAxpert. Подготовку геномных библиотек для WGS проводили путем синтеза с обратным термированием «Illumina», (США), согласно инструкции производителя. Секвенирование геномов выполняли с помощью секвенатора «Miseq», (США). При оценке качества полученных ридов использовали программу FastQC. Для установления серотиповой принадлежности штаммов, полученные нуклеотидные последовательности были анализированы с использованием веб-базы SerotypeFinder (http://www.genomicepidemiology.org).

Стабильность генов, кодирующих продукцию О- и Н- антигенов в геноме Escherichia coli serovar ONT:H30 B-8857 подтверждалась повторным секвенированием ДНК штамма и анализом нуклеотидных последовательностей генов.

Пример 3. Детекция генов аар, aar, aggA, кодирующих факторы вирулентности

Генетические детерминанты аар, aar, aggA выявляли в ПЦР с специфическими опубликованными праймерами. Выделение ДНК штаммов 17-2 (положительный контроль на наличие генов аар и aggA) и контрольного тест-штамма Escherichia coli serovar ONT:H30 B-8857, проводили с использованием наборов «InstaGeneMatrix» (BioRad, США), «АмплиПраймРИБО-преп» (НекстБио, Россия) согласно инструкциям производителей и методом кипячения. Гены аар, aar, aggA амплифицировали с помощью опубликованных специфических праймеров, синтезируемых ЗАО «Евроген», (Россия). В состав 25 мкл ПЦР-смеси входили 10 мкл Taq MasterMix («ThermoFisher», CILIA), по 1 мкл каждого праймера, 8 мкл H₂O и 1 мкл бактериальной ДНК. Амплификацию проводили на приборе CFX-96 (BioRad, США) согласно протоколу: начальная денатурация 95°С - 15 мин; затем 30 циклов: 94°С - 30 сек, 54°С - 40 сек, 72°С - 60 сек; финальная элонгация - 72°С - 10 мин. Продукты амплификации анализировали путем электрофоретического разделения в горизонтальном 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. В качестве маркеров молекулярного веса использовали Gene Ruler 100 bp DNALadder «Fermentas», (Литва). Исследуемый штамм Escherichia coli 17-2 (положительный контроль EAgEC) характеризовался наличием генов аар и aggA, и отсутствием гена aar. Контрольный тест-штамм Escherichia coli serovar ONT:H30 B-8857 характеризовался наличием трех генов аар, aar, aggA. Установлено, что штамм Escherichia coli serovar ONT.TI30 - 8857 давал стабильные повторные результаты независимо от способа выделения ДНК и состава реакционной смеси.

Пример 4. Детекция генов вирулентности аар, aar, aggA, aggB, aggC, aggD, capUn резистентности blaCTX-М-15, blaTEM-1B, AAC(3)-Ila, AAC(6')-Ib-кр, aadAl, aadA5, APH(3'') - Ib, APH(6)-Id, aadAl, Mdf(A), mph(A), catB3, sull, sul2, Tet(D), dfrA1, dfrA17 методом анализа полногеномного секвенирования

Выделение ДНК из исследуемого штамма Escherichia coli serovar ONT:H30 B-8857 проводили с использованием набора QIAamp DNA Mini Kit (QIAGEN) согласно инструкции производителя. Качество полученной ДНК оценили путем электрофореза в 0,5хТВЕ-буфере в 1,5% агарозном геле. Количество ДНК (длина волны 260 нм) титровали с помощью спектрофотометра QIAxpert. Подготовку геномных библиотек для полногеномного секвенирования проводили путем синтеза с обратным термированием «Illumina», (США), согласно инструкции производителя. Секвенирование геномов проводили с помощью секвенатора «Miseq», (США). Оценку качества полученных ридов проводили с помощью программы FastQC. Наличие генов вирулентности аар, aar, aggA, aggB, aggC, aggD, cap U устанавливали при анализе данных полногеномного секвенирования, с использованием платформы VirulenceFinder (http://www.genomicepidemiology.org), генов резистентности blaCTX-М-15, blaTEM-1В, ААС(3)-Ila, ААС(6')-Ib-кр, aadA1, aadA5, APH(3'')-Ib, APH(6)-Id, aadAl, Mdf(A), mph(A), catB3, sull, sul2, Tet(D), dfrA1, dfrA17 с использованием платформы ResFinder (http://genepi.food.dtu.dk/resFinder)

Выделение энтероагрегативного штамма с новым вариантом О-антигена не аннотированного в базах данных позволит расширить спектр контрольных тест штаммов DEC-группы, встречающийся у пациентов разного профиля. Эпидемическая настороженность важна не только при расследовании «классических» вспышек инфекционных заболеваний, но и при работе с пациентами, имеющими полиэтиологичное заболевание, например - язвенный колит, для исключения факта вторичной инфекции.

Изобретение относится к области биотехнологии. Предложен штамм Escherichia coli serovar ONT:H30 В-8857, характеризующийся наличием генов: определяющих серотиповую принадлежность (flicC₃₀), кодирующих синтез антиагрегационного белка - дисперзина (аар), регулятора транскрипционного активатора (aar), большой субъединицы адгезивно-агрегационных фимбрий типа I (aggA), афимбриально-адгезивной оболочки энтеробактерий (aggB), периплазматического шаперона начального этапа адгезионно-агрегационных фимбрий типа I (aggC), шаперона адгезионно-агрегационных фимбрий типа I (aggD) и гомолога гексозилтрансферазы {capU). Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск». Предложенный штамм может быть использован в качестве: контрольного тест-штамма при детекции энтероагрегативных Escherichia coli (EAgEC); контрольного тест-штамма для индикации антигена Н30 молекулярным методом (детекция гена fliC₃₀); для сравнительного изучения генетического родства и дифференциации штаммов EAgEC, вызывающих кишечные инфекции и заболевания внекишечной локализации. 4 пр.

Штамм бактерий патогруппы энтероагрегативных диареегенных Escherichia coli serovar ONT:H30, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-8857, используемый в качестве контрольного тест-штамма, для детекции EAgEC и сравнительного изучения генетического родства штаммов данной патогруппы.