ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI В КАЧЕСТВЕ КОНТРОЛЬНОГО ТЕСТ-ШТАММА ДЛЯ ФЕНОТИПИЧЕСКИХ И МОЛЕКУЛЯРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ЭШЕРИХИЙ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ ГРУППЫ О144 Российский патент 2019 года по МПК C12N1/20 C12Q1/02 A61P1/00 C12R1/19 

Изобретение относится к микробиологии (бактериологии), а именно к разделу биохимическая и серологическая идентификация штаммов Escherichia coli, вирулентность и патогенность микроорганизмов.

Согласно, МУ 04-723/3 по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями, штаммы Е. coli O144 являются возбудителями острых кишечных инфекций (ОКИ), относятся к группе энтероинвазивных Е. coli (EIEC), вызывающих дизентериеподобные заболевания. Эта патогруппа эшерихий характеризуется способностью к эпителиальной инвазии, которая подтверждается тестом Шереня, т.е. по способности вызывать кератоконъюктивит у морских свинок.

По литературным данным известно, что популяция штаммов Е. coli O144 неоднородна по значительному числу свойств: среди них встречаются неподвижные (HNM) и подвижные варианты с Н антигенами 4, 18 и 25), аэрогенные и анаэрогенные, замедленно ферментирующие и не ферментирующие рамнозу, сорбит и дульцит. Штаммы с антигеном Н4 не вызывают кератоконъюнктивит у морских свинок - проба Шереня отрицательная, в отличие от штаммов с антигенами HNM, H18 и Н25. В 1975 году Киселевой Б.С. была предложена схема разделения эшерихий этой серогруппы на биовары по ферментативным свойствам с учетом серотиповой принадлежности и результатов пробы Шереня. В нашей стране, по настоящее время, схема биотипирования в клинико-диагностических лабораториях используется только с учетом ферментативных свойств штаммов.

Важнейшим критерием дифференциации патогенных разновидностей эшерихий от непатогенных служат антигенные свойства их поверхностных структур (О-, К-, Н-антигены), а также наличие или отсутствие генов, кодирующих факторы патогенности и вирулентности. На территории РФ штаммы Escherichia coli O144:Н45, характеризующиеся сероварспецифичными морфологическими и ферментативными свойствами, отсутствием генов, кодирующих факторы патогенности, специфичные для Shigella spp. и энтероинвазивных E.coli (EIEC): плазмидные (ipaH) и хромосомные (ial) гены инвазивности другими авторами ранее не изучены и не депонированы.

Эпидемиологической особенностью современных эшерихиозов, вызванных Е. coli O144, является широкое распространение их среди здоровых лиц, обследованных с профилактической целью.

Отсутствие к настоящему времени контрольных штаммов для фенотипических и молекулярных методов идентификации непатогенных вариантов Escherichia coli, принадлежащих к серологической группе O144, широко распространенных среди здорового населения, обусловило необходимость депонирования контрольного штамма Escherichia coli O144:Н45 В8656.

Полная ферментативная характеристика, расшифровка антигенной формулы, детекция генов и факторов патогенности и вирулентности является необходимым условием правильности эпидемиологических заключений, от которых зависит эффективность профилактической и противоэпидемической работы. Предложенный штамм Escherichia coli O144:Н45 В8656, характеризующийся наличием генов rfb₁₄₄, fliC₄₅, определяющих серотиповую принадлежность, сероварспецифичными морфологическими и ферментативными свойствами и отсутствием генов, кодирующих факторы патогенности, специфичные для Shigella spp. и энтероинвазивных E.coli (EIEC): плазмидные (ipaH) и хромосомные (ial) гены инвазивности может быть использован в качестве контрольного тест-штамма.

Наиболее близким по сущности к заявленному изобретению является штамм Escherichia coli O144:Н4, описанный Киселевой Б.С. в 1975 году [Киселева Б.С., Скибенко Л.В., Гедзе Г.И. и др., Характеристика эшерихий серологической группы O144:К?, выделенных при острых кишечных заболеваниях. // Ж. микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 1975; 5:49-52.], который не обладает инвазивными свойствами, как и штамм, предлагаемый в качестве изобретения.

Изобретение направлено на разработку контрольного тест-штамма Escherichia coli O144:Н45 В8656, необходимого для качественного проведения бактериологических и молекулярно-генетических исследований, необходимых для подтверждения этиологической значимости штаммов, предъявляемых СП 3.1.1.3108-13 «Профилактика острых кишечных инфекций».

Авторами получен контрольный штамм, для бактериологической и молекулярно-генетической идентификации непатогенного варианта Escherichia coli, принадлежащего к серологической группе O144, использование которого поможет минимизировать ошибки при этиологической расшифровке острых кишечных инфекций, а также позволит получить достоверные результаты необходимые для рациональной терапии пациентов, проведения целенаправленных профилактических и противоэпидемических мероприятий.

Однако, данный штамм характеризуется наличием Н45, сероварспецифичными морфологическими и ферментативными свойствами, а также отсутствием генов патогенности. Предлагаемый в качестве изобретения штамм Escherichia coli O144:Н45 В8656 помогает расширить аналитические и диагностические возможности лабораторий, использующих для диагностики не только классические бактериологические, но и современные генетические методы исследования.

Заявляемый штамм выделен от взрослого жителя Санкт-Петербурга без признаков острой кишечной инфекции, обследованного с профилактической целью. Идентифицирован до вида Escherichia coli серогруппы O144 бактериологическим и серологическим методами. Полная антигенная характеристика штамма Escherichia coli O144:Н45 установлена при анализе данных полногеномного секвенировании на приборе MiSeq с использованием наборов реагентов MiSeqReagentKit v2 и Nextera XT (Illumina, США) при помощи веб-базы SerotypeFinder (http://www.genomicepidemiology.org). Маркеры вирулентности выявляли в ПЦР со специфическими праймерами к хромосомным (ial) и плазмидным (ipaH) генам патогенности, кодирующим способность к инвазии. Штамм не вызывал гнойно-язвенного воспаления роговицы и конъюнктивы у морской свинки после введения бактерий в дозе 10⁹ КОЕ в конъюнктивальную полость, что свидетельствовало об отсутствии способности к инвазии и отрицательной пробе Шереня.

Штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-8656.

Характеристика штамма Escherichia coli O144:Н45 В-8656.

Морфологические признаки: грамотрицательные палочки с закругленными концами, не образуют спор, капсулу и пигмент, неподвижные.

Патогенные свойства: штамм патогенный для человека, IV группа патогенности согласно СП 1.2.036-95 и СП 1.3.2322-08.

Культуральные свойства: факультативный анаэроб, каталазоположительный, оксидозоотрицательный, не прихотлив к питательным средам. Температурный оптимум 37°С при рН 7,2…7,4. На жидких средах дает обильный рост при значительном помутнении среды; осадок небольшой, сероватого цвета, легко разбивающийся. Пристеночное кольцо и пленку на поверхности среды не образует. На плотных питательных средах (МПА, Эндо, Плоскирева, Левина) колонии круглые выпуклые, средней величины влажные с гладкой блестящей поверхностью и ровным краем, цвета, соответствующего окраске среды.

Антигенная характеристика: по результатам серологического исследования штамм имеет О - антиген 144, К - антиген, Н - антиген 45. Полная антигенная формула Escherichia coli O144:К:Н45.

Основные свойства штамма:

- характеризуется сероварспецифичными морфологическими и ферментативными свойствами (неподвижный, ферментирует до молочной кислоты без газа глюкозу и сорбит, замедленно ферментирует лактозу, не утилизирует дульцит и салицин, не декарбоксилирует лизин;

- наличие Н-антигена 45;

- не вызывает гнойно-язвенное воспаления роговицы и конъюнктивы у морской свинки- проба Шереня отрицательная;

- не имеет плазмидные (ipaH) и хромосомные (ial) гены инвазивности.

- не является возбудителем острой кишечной инфекции

Изобретение реализуется следующим образом.

Пример 1. Определение сероварспецифичных морфологических и ферментативных свойств бактериологическим методом штаммов Escherichia coli O144:Н45.

Морфологические и ферментативные свойства изучали согласно МУ 04-723/3 Методические указания по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями. При определении подвижности посев производили уколом петли по центру столбика 0,3-0,4% полужидкого агара, не доходя до дна пробирки. Штамм характеризовался ростом строго по уколу без помутнения среды (подвижные штаммы растут диффузно, вызывая помутнение среды, слабоподвижные штаммы вызывают помутнение отдельных участков агара вблизи укола). Для определения ферментации глюкозы и сорбита использовали полужидкие среды Гисса, посев производили уколом петли в центр столбика. Учет результатов проводили по изменению цвета среды, в зависимости от индикатора, после инкубации через 18-20 часов при температуре 37°С. Штамм характеризовался способностью к ферментации глюкозы и сорбита до молочной кислоты без газа. Для определения замедленной ферментации лактозы использовали жидкую среду Гисса. Окончательный учет результатов проводили на 10 сутки после инкубации при температуре 37°С с ежедневным просмотром посевов. Штамм характеризовался замедленной ферментацией лактозы на 6 сутки (лактозоположительные штаммы ферментируют лактозу с изменением цвета среды в течение 16-18 часов, лактозоотрицательные штаммы не изменяют цвет среды до 10 суток при инкубации при температуре 37°С. Для определения утилизационной способности дульцита и салицина использовали жидкие питательные среды. Штамм характеризовался отсутствием изменения цвета среды после инкубации 18-20 часов при температуре 37°С. При определении декарбоксилазы лизина параллельно с посевом в среду с аминокислотой производили посев в контрольную пробирку, содержащую основу без аминокислоты. После посева во все пробирки, вносили стерильное вазелиновое масло слоем 4-5 мм. Учет результатов проводили по изменению цвета среды после инкубации 18-20 часов при температуре 37°С.

Стабильность морфологических и ферментативных свойств штамма Escherichia coli O144:Н45 проверялась путем трехкратного повторения с питательными средами различных производителей: ФБУН ГНЦ ПМБ (Россия), НИЦФ (Россия), Oxoid (Великобритания), BioRad (США), установлено, что штамм давал стабильные результаты на питательных средах всех производителей.

Пример 2. Определение антигена Н45 фенотипическим методом в реакции агглютинации на стекле.

Идентификацию жгутикового (Н45) антигена штамма Escherichia coli O144 В8656 проводили согласно МУ 3214-85 Методические указания по серотипированию бактерий Escherichia coli по жгутиковому (Н) антигену упрощенным, ускоренным способом.

Штамм O144:Н45 по морфологическим признакам неподвижный. Для повышения флагеллированности (Н-агглютинабельности) проводили многократное последовательное пассирование через полужидкий агар в V-образных пробирках Крейджи с добавлением глицерина и глюкозы. Исследуемый штамм при первом пассаже в пробирку Крейджизасевали глубоким уколом петли до дна пробирки. Повторные пассажи делали на глубину 10 мм. Восстановление подвижности (помутнение всей среды, в т.ч. снаружи от внутренней трубки в пробирке Крейджи) удалось в результате 8 пассажей. Подвижные клетки пересевали на скошенный агар с глицерином, инкубировали при 30°С в течение 24 часов. Выросший газон смывали изотоническим раствором, содержащим 0,5% формалина. Подготовленную бактериальную взвесь исследовали в реакции агглютинации на стекле моновалентной Н- сывороткой 45 Statens serum institute, Дания. При смешивании равных объемов сыворотки и бактериальной взвеси (0,05 мл) в течение 1 минуты наблюдалось формирование хорошо различимого агглютината.

Стабильность полученных результатов определения антигена Н45 штамма Escherichia coli O144:К:Н45 В8656 проверялась путем трехкратного восстановления подвижности. Установлено, что штамм давал стабильные результаты независимо от кратности последовательного пассирования через полужидкий агар.

Пример 3. Определение антигена Н45 молекулярным методом.

Выделение ДНК из исследуемого штамма Escherichia coli O144:К:Н45 В8656 проводили с использованием набора QIAampDNAMiniKit (QIAGEN) согласно инструкции производителя. Качество полученной ДНК оценили путем электрофореза в 0,5×ТВЕ-буфере в 1,5% агарозном геле. Количество ДНК (длина волны 260 нм) титровали с помощью спектрофотометра QIAxpert. Подготовку геномных библиотек для полногеномногосеквенирования проводили путем синтеза с обратным термированием «Illumina», (США), согласно инструкции производителя. Секвенирование геномов проводили с помощью секвенатора «Miseq», (США). Оценку качества полученных ридов проводили с помощью программы FastQC. Для установления серотиповой принадлежности штаммов, полученные нуклеотидные последовательности были анализированы с использованием веб-базы SerotypeFinder (http://www.genomicepidemiology.org).

Стабильность наличия гена fliC₄₅, кодирующего продукцию антигена Н45 в геноме Escherichia coli O144:Н45 В8656 подтверждалась повторным секвенированием ДНК штамма и анализом нуклеотидной последовательности.

Пример 4. Определение вирулентности штаммов Escherichia coli O144 на экспериментальных животных.

Для определения пенетрационной (инвазивной) способности штаммов Escherichia coli O144 и Shigella sp.и спользовали экспериментальную модель предложенную Sereny, 1956.

Суточную агаровую культуру бактерий платиновой петлей диаметром 5 мм вводили под нижнее веко правого глаза морской свинки массой тела 200 г. Левый глаз не заражали, использовали как отрицательный внутренний контроль. В качестве положительного контроля использовали штамм Shigella flexneri 2а и Escherichia coli O144:К:Н25. Все свинки находились изолированно друг от друга. Через 2-4 суток оценивали выраженность кератоконъюнктивита по наличию помутнения роговицы, нагноения и изъязвления. Правая роговица и конъюнктива морских свинок, зараженных Escherichia coli O144:К:Н45 В8656, на протяжении всего периода наблюдения (7 дней), оставались без изменений, так же как и левая роговица и конъюнктива. Правая роговица морских свинок, зараженных Shigella flexneri 2а, на первые сутки помутнела, появились признаки гнойного конъюнктивита. На вторые сутки наблюдалось выраженное гнойно-язвенное воспаление роговицы и конъюнктивы. Левый глаз, на протяжении всего периода наблюдения оставался без патологических изменений. Правая роговица морских свинок, зараженных Escherichia coli O144:К:Н25, на первые сутки помутнела, появилось обильное слезотечение без признаков гнойного конъюнктивита. На вторые сутки наблюдалось выраженное гнойное воспаление конъюнктивы. Левый глаз, на протяжении всего периода наблюдения оставался без патологических изменений.

Стабильность отсутствия инвазивной способности в экспериментальной модели (отрицательная проба Шереня) штамма Escherichia coli O144:К:Н45 проверялась путем повторного заражения морских свинок. Установлено, что штамм Escherichia coli O144:К:Н45 В8656 может использоваться как отрицательный контрольный тест-штамм при проведении данной экспериментальной модели.

Пример 5. Детекция генов, вирулентности методом ПЦР с электрофоретической подвижностью.

Маркеры вирулентности выявляли в ПЦР со специфическими праймерами к хромосомным (ial) и плазмидным (ipaH) генам патогенности, кодирующим способность к инвазии. Выделение ДНК из исследуемых штаммов Escherichia coli O144:К:Н25, Shigellaflexneri 2а и контрольного тест-штамма Escherichia coli O144:К:Н45 В8656 проводили с использованием наборов «InstaGeneMatrix» (BioRad, США), «АмплиПраймРИБО-преп» (НексБио, Россия) согласно инструкциям производителей и методом кипячения. Хромосомные (ial) и плазмидные (ipaH) гены патогенности амплифицировали с помощью специфических праймеров PR1/PR2 и IpaH14a/IpaH14b, синтезируемые ЗАО «Евроген», (Россия). В состав 25 мкл ПЦР-смеси входили 10 мкл Taq MasterMix («ThermoFisher», США), по 1 мкл каждого праймера, 9 мкл Н₂О и 2 мкл бактериальной ДНК. Амплификацию проводили на приборе CFX-96 (BioRad, США) согласно протоколу: начальная денатурация 95°С - 15 мин; затем 35 циклов: 95°С - 15 сек, 55°С - 20 сек; финальная инкубация - 37°С - 3 мин. Продукты амплификации анализировали путем электрофоретического разделения в горизонтальном 2% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием. В качестве маркеров молекулярного веса использовали GeneRuler 100 bp DNALadder «Fermentas», (Литва). Исследуемые штаммы Escherichia coli O144:К:Н25 и Shigella flexneri 2а имели плазмидные и хромосомные гены инвазивности, контрольный тест-штамм Escherichia coli O144:К:Н45 В8656 характеризовался отсутствием генов инвазивности.

Стабильность отсутствия хромосомных (ial) и плазмидных (ipaH) генов патогенности, кодирующих способность к инвазии у контрольного тест-штамма Escherichia coli O144:К:Н45 В8656 подтверждалась повторным проведением исследования Escherichia coli O144:К:Н45 В8656 с использованием набора реагентов для выявления и дифференциации ДНК диареегенных E.coli методом РВ-ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной детекцией «АмплиСенс® Эшерихиозы-FL» (Россия).

Установлено, что штамм Escherichia coli O144:К:Н45 В8656 давал стабильные результаты независимо от способа выделения ДНК, состава реакционной смеси и метода ПЦР.

Для обеспечения достоверной лабораторной диагностики эшерихиозов необходимо проводить контроль качества на каждом этапе исследования. Предлагаемый штамм Escherichia coli O144:К:Н45 В8656 обладает стабильными свойствами, позволяющими контролировать бактериологические (определение морфологичеких, ферментативных, серологических и вирулентных свойств штамма) и молекулярные исследования (определение генов, кодирующих серотиповую принадлежность и патогенность штамма).

Изобретение относится к микробиологии, в частности к бактериологии. Штамм Escherichia coli O144:Н45, характеризующийся отсутствием генов, кодирующих факторы патогенности, специфичных для Shigella spp. и энтероинвазивных E. coli (EIEC) - плазмидных (ipaH) и хромосомных (ial) генов инвазивности, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-8656. Штамм Escherichia coli O144:Н45 может использоваться в качестве контрольного штамма для фенотипических и молекулярных исследований эшерихий серологической группы О144. Изобретение обеспечивает выполнение идентификации штаммов Escherichia coli. 5 пр.

Штамм бактерий Escherichia coli О144:Н45, депонированный в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-8656, используемый в качестве контрольного штамма для фенотипических и молекулярных исследований эшерихий серологической группы O144.